WO2013166833A1 - 包含有人环氧酶及阿霉素或类阿霉素的药用组合物、其制备方法及在制备多种药物的应用 - Google Patents

包含有人环氧酶及阿霉素或类阿霉素的药用组合物、其制备方法及在制备多种药物的应用 Download PDF

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    • C12Y114/99001—Prostaglandin-endoperoxide synthase (1.14.99.1), i.e. cyclooxygenase

Definitions

  • composition comprising human cyclooxygenase and doxorubicin or doxorubicin, preparation method thereof and application thereof in preparing medicine
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for extracting from a natural plant, in particular to a natural human cyclooxygenase
  • composition of (COX-2), natural doxorubicin (atm) or natural doxorubicin material such a pharmaceutical combination containing natural human cyclooxygenase, natural doxorubicin or natural doxorubicin material
  • Method for preparing the same and the use of the pharmaceutical composition containing the natural human epoxidase, the natural doxorubicin or the natural doxorubicin substance in the preparation of a medicament for treating nephritis, in the preparation of a treatment for cholecystitis and bile polyps
  • Use in medicine in the preparation of a medicament for treating tumors, or in the preparation of an anti-inflammatory drug.
  • RNA has a broad anti-tumor spectrum, and has a role in various tumors. It is a non-specific periodic drug and has a killing effect on various growth cycles. It is mainly suitable for acute leukemia and is effective for acute lymphocytic leukemia and leukemia. Malignant lymphoma can be used as the first drug to be used interchangeably.
  • Breast cancer, _ ⁇ , lung cancer, bladder cancer and other various cancers have a certain effect, and are often used in combination with other 3 ⁇ 4 ⁇ .
  • This product is a broad-spectrum anti-tumor drug that produces a wide range of biochemical effects on the body and has a strong cytotoxic effect.
  • the mechanism of action is mainly that the product is embedded in DNA to inhibit the synthesis of nucleic acids.
  • COX Cyclooxygenase
  • PGHS rostagierinhypcroxidesynthase PGHS
  • COX-1 Human cyclooxygenase
  • COX-2 Human cyclooxygenase
  • Natural human cyclooxygenase is a protein, also an inducible enzyme that acts as an enzyme to accelerate the production of certain chemical signals that are active in inflammation and pain. When the activity of COX-2 is inhibited, the pain is alleviated.
  • COX-2 can produce arachidonic acid, produce a variety of prostaglandins, and participate in a variety of physiological and pathological processes in the body.
  • the current consensus is that COX-2 can pass It promotes cell proliferation, inhibits apoptosis, promotes angiogenesis, and suppresses immune function, and participates in the occurrence and development of tumors.
  • a pharmaceutical composition comprising natural human cyclooxygenase (COX-2), natural doxorubicin (atm) or natural doxorubicin material, Method for preparing a pharmaceutical composition containing natural human epoxidase, natural doxorubicin or natural doxorubicin material, and the like containing natural human epoxidase, natural doxorubicin or natural doxorubicin.
  • COX-2 natural human cyclooxygenase
  • natural doxorubicin atm
  • natural doxorubicin material Method for preparing a pharmaceutical composition containing natural human epoxidase, natural doxorubicin or natural doxorubicin material, and the like containing natural human epoxidase, natural doxorubicin or natural doxorubicin
  • a pharmaceutical composition for the treatment of nephritis, for the preparation of a medicament for treating cholecystitis and bile polyp
  • the invention provides a pharmaceutical composition prepared by medicinal natural plant rich in human cyclooxygenase (COX-2) and natural doxorubicin or doxorubicin, which can realize natural mold by using traditional Chinese medicine.
  • COX-2 human cyclooxygenase
  • COX-2 natural doxorubicin or doxorubicin
  • a technical solution for accomplishing the above inventive task is a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising natural human cyclooxygenase (COX-2), natural doxorubicin (atm) or natural doxorubicin material, characterized in that the composition
  • the raw material is Qizhen Grass (or Guizhou Qizhen Grass).
  • the "raw material of the composition” in the above technical solution means: a powder obtained by dehydrating, drying, or pulverizing the whole plant (color roots) of Qizheng grass; or fresh of the rare grass Or its extract.
  • the extract of the exotic grass refers to one of the following forms of extract:
  • the alcohol extract obtained by ethanol extraction is concentrated and dried to obtain a powder
  • An extract obtained by extracting the whole plant of Qizhencao or Qizhencao decoction by an organic solvent obtained by extracting the whole plant of Qizhencao or Qizhencao decoction by an organic solvent
  • the pharmaceutical composition containing natural human cyclooxygenase (COX-2), natural doxorubicin (atm) or natural doxorubicin may also contain pharmaceuticals in addition to the raw material Qizhencao or its extract.
  • Excipients allowed in the field.
  • the exotic grass is a one-year or perennial herb, roots, roots erect or vines rising, stalks have rooting at nodes, solitary or clumped, stems blunt-square (square), grooved, densely short Fur.
  • the seeds of the Qizhencao (tentative name) were deposited with the China Center for Type Culture Collection of Wuhan University on April 2, 2011, and the deposit number is CCTCC No: P201102 (see attached sheet 1 of the manual).
  • the plant has applied to the United States for the right to new plant varieties; the acceptance number is: 12/215.016. US trademark acceptance number: 77633688.
  • the plant variety has been submitted to the Ministry of Agriculture and the materials have been added.
  • a technical solution for accomplishing the second invention task of the present application is a method for preparing a pharmaceutical composition containing the natural human cyclooxygenase (COX-2), natural doxorubicin (atm) or natural doxorubicin material,
  • COX-2 natural human cyclooxygenase
  • atm natural doxorubicin
  • natural doxorubicin material natural doxorubicin material
  • Step (1) to obtain a powder obtained by dehydrating, drying and pulverizing the whole plant of Qizheng grass
  • the step (2) or extracting the extract of the grass using one of the following steps:
  • the solution for accomplishing the third invention task of the present application is: the above-mentioned pharmaceutical composition containing natural human cyclooxygenase (COX-2), natural doxorubicin (atm) or natural doxorubicin material in the preparation of therapeutic nephritis and Application in medicine.
  • COX-2 natural human cyclooxygenase
  • atm natural doxorubicin
  • doxorubicin material in the preparation of therapeutic nephritis and Application in medicine.
  • the solution to accomplish the fourth inventive task of the present application is: The above pharmaceutical composition containing natural human cyclooxygenase (COX-2), natural doxorubicin (atm) or natural doxorubicin material is prepared for the treatment of cholecystitis and The application of drugs for bile polyps.
  • the solution to accomplish the fifth inventive task of the present application is: the above-mentioned pharmaceutical composition containing natural human cyclooxygenase (COX-2), natural doxorubicin (atm) or natural doxorubicin substances in the preparation of a medicament for treating tumors Application in .
  • the solution to accomplish the sixth inventive task of the present application is: the above pharmaceutical composition containing natural human cyclooxygenase (COX-2), natural doxorubicin (atm) or natural doxorubicin material in the preparation of an anti-inflammatory drug application.
  • COX-2 natural human cyclooxygenase
  • atm natural doxorubicin
  • doxorubicin material in the preparation of an anti-inflammatory drug application.
  • the administration method is: oral tablets, capsules, oral liquid or syrup, oral steaming liquid, topical eye drops, topical eye ointment, external application of bruises Analgesic ointment, topical anti-inflammatory, hemostasis, stimulating, analgesic powder, do not rule out injection administration.
  • the dosage to be administered is:
  • the daily measurement of the adult is equivalent to the raw material of Guizhou Qizheng grass powder 5g-6g, and the recommended amount of this application is 5.4g. That is, three times a day, 1.8 g each time.
  • the treatment period (treatment) is 7 days. It takes two courses to treat general inflammation; six courses are required to treat chronic inflammation. It usually takes 6 courses to treat nephritis, cholecystitis and tumors.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can rapidly treat inflammation, eliminate swelling, and relieve pain; it can also remove viruses, inhibit tumor cells, and activate the vital system of the body. Therefore, the pharmaceutical composition of the present invention is useful for treating various nephropathy such as chronic nephritis, acute cholecystitis (including bile reflux cholecystitis), human lymph, lung, liver, stomach, breast, fibroid, leukemia and the like.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can also be used for the treatment of trachoma and fire eyes.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be used as a topical drug to rub, and can treat bruises, water and fire, and sore pain and pus.
  • the fresh product of the raw material of the pharmaceutical composition of the invention, the external application of erosion can promote fracture healing.
  • the pharmaceutical composition of the present invention also has a cosmetic effect and can be used for the development of a cosmetic product.
  • a pharmaceutical composition containing natural human cyclooxygenase (COX-2), natural doxorubicin (atm) or natural doxorubicin is used in the preparation of a medicament for treating nephritis
  • the diagnosis of nephritis patients is as usual.
  • Standards are diagnosed; standards such as "effective”, “effective”, and “healed” are also in accordance with traditional standards.
  • the dose of the medicament of the present invention is: Adults three times a day, 1.8 g each time.
  • the treatment is 7 days. When the treatment is more than 6 courses, the treatment results are compared as follows:
  • Cure time 7-15 days £ When a pharmaceutical composition containing natural human cyclooxygenase (COX-2), natural doxorubicin (atm) or natural doxorubicin is used in the preparation of a medicament for treating cholecystitis, The diagnosis of patients with cholecystitis is diagnosed according to the usual criteria; the criteria for "effective", “effective", “healing”, etc. are also in accordance with traditional standards. The dose of the medicament of the present invention is: 1.8 g per adult three times a day. The treatment lasts for 7 days. When the treatment is more than 6 courses, the treatment results are compared as follows:
  • the dose of the medicament of the present invention is: Adult three times a day, each time 1.8 go for 7 days. When the treatment is more than 8 courses, the treatment results are compared as follows:
  • the extract of traditional Chinese medicine has obvious inhibitory effect on the proliferation of fine fetuses in A549 cells, and the inhibitory effect is drug concentration-dependent.
  • the extract of traditional Chinese medicine has a significant inhibitory effect on cell proliferation in HT1080 cells, and the inhibitory effect is drug concentration.
  • the extract of traditional Chinese medicine has a significant inhibitory effect on cell proliferation in Hela cells, and the inhibitory effect is drug concentration dependent.
  • the extract of traditional Chinese medicine has a significant inhibitory effect on cell proliferation in MDA-MB-231 cells, and the inhibitory effect is drug-dependent.
  • the extract of traditional Chinese medicine is made from 8 grams of dry medicine and 120 grams of medicinal juice.
  • the concentration of 1 to 15 is 55.56ug/ml. It has obvious toxic effects on cells. Under the toxic effect, it migrates to the lower chamber due to the death of upper chamber cells or low activity. The number of cells is reduced. When the drug concentration is lower than 55.56 ug/ml, there is substantially no toxic effect on the cells. (Experimental test data attached).
  • the invention provides a pharmaceutical composition prepared by medicinal natural plant rich in human cyclooxygenase (COX-2) and natural doxorubicin or doxorubicin, which can realize natural mold by using traditional Chinese medicine.
  • COX-2 human cyclooxygenase
  • COX-2 natural doxorubicin or doxorubicin
  • Figure 1 is a curve showing the inhibition of proliferation and inhibition of A549 cell line in vitro by Chinese herbal extracts
  • Figure 2 is a curve showing the inhibition of proliferation and inhibition of HT29 cell line in vitro by traditional Chinese medicine extract
  • Figure 3 is a curve showing the inhibition of proliferation and inhibition of PC3 cell line in vitro by Chinese herbal extracts
  • Figure 4 is a curve showing the inhibition of proliferation and inhibition of HT1080 cell line in vitro by traditional Chinese medicine extract
  • Figure 5 is a curve showing the inhibition of proliferation and inhibition of Hela cell line in vitro by Chinese herbal extract
  • Figure 6 is a curve showing the inhibition of proliferation and inhibition of MDA-MB-231 cell line in vitro by traditional Chinese medicine extract
  • Figure 7 is a curve showing the inhibition of proliferation and inhibition of HepG2 cell line in vitro by traditional Chinese medicine extract
  • Map Figure 9 is a graph showing the inhibition effect of the extract of traditional Chinese medicine on the migration ability of A549 cell line in vitro;
  • Figure 10 is a graph showing the inhibition effect of the extract of traditional Chinese medicine on the migration ability of PC3 cell line in vitro;
  • Figure 11 is a graph showing the inhibition effect of Chinese herbal extracts on the migration ability of HT1080 cell line in vitro;
  • Figure 12 is a graph showing the inhibitory effect of Chinese herbal extracts on the migration ability of HeLa cell lines in vitro;
  • Figure 13 is a graph showing the inhibitory effect of Chinese herbal extracts on the migration ability of MDA-MB-231 cells in vitro
  • Figure 14 is a graph showing the inhibitory effect of Chinese herbal extracts on the migration ability of HepG2 cells in vitro;
  • Figure 15 is a curve showing the migration ability of HT29 cell line in vitro
  • Figure 16 is a real-time cell analyzer
  • Figure 17 and Figure 18 are measurement curves reflecting the beating characteristics of myocardial cells and their cell status
  • Figure 19 shows the parameters and data analysis page in the cardiomyocyte model
  • Figure 20 is a graph showing the effect of Chinese herbal extract on the activity of primary cardiomyocytes in neonatal rats;
  • Figure 21 shows the changes in the beat curve of primary cardiomyocytes with time after dosing
  • Figure 22 is a graph showing the effect of Chinese herbal extract on the beating rate
  • Figure 23 is a graph showing the effect of Chinese herbal extract on the amplitude of the beat (Amplitude);
  • Figure 24 shows the IC50 curve of Chinese herbal extracts affecting the frequency and amplitude of primary cardiomyocytes in neonatal rats.
  • Example 1 A mixed pharmaceutical composition containing a natural human cyclooxygenase (COX-2), a natural doxorubicin (atm) or a natural doxorubicin substance, a preparation method and a clinical use of a tablet.
  • COX-2 a natural human cyclooxygenase
  • atm a natural doxorubicin
  • doxorubicin substance a preparation method and a clinical use of a tablet.
  • the extract of the preparation will be cleaned and sterilized, and the ratio of 10 kg of water of 1 kg of medicinal material is extracted by steam distillation to obtain volatile oil and distillate, and the volatile oil is reserved.
  • the evaporating liquid is filtered for a period of more than 24 hours, and the supernatant is filtered.
  • the ethanol is recovered to a non-alcoholic mash, concentrated into a thick paste, dried, pulverized, and the extract powder is taken, and the volatile oil and the precipitate are uniformly sprayed on the extract powder, and the micropowder is added with calcium citrate, lactose, de-lighted starch, and stearic acid.
  • Pharmaceutical excipients such as magnesium sulfate are prepared in the corresponding dosage forms.
  • the method of preparing the extracting powder tablet the dry extract is first pulverized into a fine powder, passed through a 5-6 mesh sieve, wetted by ethanol, and tableted.
  • Spray rotary granulation method adding calcium citrate, lactose, luminescent starch, and placing the dry extract fine powder in a coating pan, and also spraying the mist into the mist while rotating, gradually granulating the wet powder.
  • Powder powder preparation method medicinal materials are washed, sterilized, dried, and dried, processed micron Chinese medicine powder, particle size 10um (l-20um) over 300 mesh sieve, can be made into tablets;
  • Capsule preparation method The ratio of 1 kg of medicine to 10 kg of water 3, plastic film preparation method: medicinal material processing: net, processing, purification, sterilization, crushing particle size 75um4.1 over 200um mesh sieve, filling capsules;
  • Solvent extraction method Qizhen herbal materials, appropriate crushing, using 1 kg of medicinal materials 10 kg of water ratio, using impregnation method, percolation method, decoction method; optional ester esterity: petroleum ether. benzene. >ether>acetic acid B Ester>Acetone>Ethanol>Methanol>Water (hydrophilic), etc., organic solvent during extraction.
  • the plant was screened and tested in Shanghai Testing and Screening Center of Shanghai New Drug Screening Center in 2006. The results showed that the plant contained natural human cyclooxygenase-2 ( COX -2) activity and immune biological activity, anti-inflammatory treatment. Has a very good effect. At the same time, it has a good inhibitory effect on lymphatic 1 ⁇ B cells and has a good application prospect. Attachment - 1 (Saving proof 1 page)
  • the viability of the culture was monitored by the collection on March 26, 2011 and the result was survival.
  • Cyclooxygenase produces prostaglandins and oxygen free radicals (ROS) by metabolizing arachidonic acid (AA). Cyclooxygenase
  • C0X2 Cyclooxygenase 1
  • C0X1 mainly regulates physiological functions.
  • the xCELLigence real-time cell analysis system was used to detect the inhibition of cell proliferation by Chinese herbal extracts, and to detect the 1C50 of drug inhibition of cell proliferation.
  • the cells used were A549, HT1 080, Hel. a, MDA-MB-231, HT29, HepG2 and PC3 cells.
  • This experiment uses the xCELLigence real-time cell analysis system jointly developed by Essen and Roche.
  • DMEM medium Item No. SH30022. 01B, Hyc] one (China).
  • MEM medium Article number SH30024. 01B, Hyclone (China).
  • F12 medium Item No. SH30526. 01 , Hyclone (China).
  • MyCOA's 5A medium Item No. GNM 16600, Gino (China).
  • PBS Item No. SH30256. 01B, Hyclone (China).
  • Centrifuge tube article number 430791 , Corningo
  • A549 non-small cell lung cancer cell line
  • PC3 human prostate cancer cell line
  • HT1080 human fibrosarcoma cell line
  • Hela human cervical cancer cell line
  • MDA MB-231 human breast cancer cell line
  • HepG2 human liver cancer cell line
  • the extract of Chinese medicine is 20 grams of medicine to get 125ml of medicine, the concentration is 160tng I ml.
  • Figure 1 shows the effect of Chinese herbal extract on the proliferation and inhibition of A549 cell proliferation in vitro.
  • A is a real-time dynamic map of cell growth and drug action.
  • the abscissa indicates cell proliferation and drug action time;
  • the ordinate indicates standardized cell index (NCI).
  • NCI standardized cell index
  • the cell index indicates the state of cell growth. The higher the value, the more living cells are reflected.
  • the arrow indicates the dosing time, and the dosing concentration is shown in the figure.
  • the figure shows the drug concentration-dependent dynamic response curve of the cells under the action of the Chinese herbal extract, and controll is a negative control, showing a normal cell growth dynamic curve.
  • B is the IC50 value and IC50 fit curve of the drug at 12, 24, and 48 hours after the addition of the Chinese herbal extract to the A549 cells automatically calculated by the real-time cell analysis system. It can be seen from the figure that the extract of traditional Chinese medicine has a significant inhibitory effect on cell proliferation in A549 cells, and the inhibitory effect is drug-dependent.
  • Figure 2 shows that the Chinese herbal extract inhibits the proliferation and inhibition of HT29 cell line in vitro.
  • A is a real-time dynamic map of cell growth and drug action.
  • B is the IC50 value and IC50 fit curve of the drug at 48 and 72 hours after the addition of the traditional Chinese medicine extract to the HT29 cells calculated by the real-time cell analysis system. It can be seen from the figure that the extract of traditional Chinese medicine has obvious inhibitory effect on cell proliferation of HT29 cells, and the inhibitory effect is drug concentration-dependent.
  • FIG. 3 Chinese herbal extracts inhibit the proliferation of PC3 cell lines in vitro and observe the inhibitory effect.
  • A is a real-time dynamic map of cell growth and drug action.
  • B is the IC50 value and IC50 fit curve of the drug at 24, 48 and 72 hours after the addition of the traditional Chinese medicine extract to PC3 cells calculated by the real-time cell analysis system. It can be seen from the figure that the extract of traditional Chinese medicine has obvious inhibitory effect on cell proliferation in PC3 cells, and the inhibitory effect is drug concentration-dependent.
  • Figure 4 shows that the Chinese herbal extract inhibits the proliferation and inhibition of HT1080 cell line in vitro.
  • A is a real-time dynamic map of cell growth and drug action.
  • B is the IC50 value and IC50 fit curve of the drug at 12, 24, and 48 hours after the addition of the Chinese herbal extract to the HT1080 cells, which was automatically detected by the real-time cell analysis system. It can be seen from the figure that the Chinese herbal extract has a significant inhibitory effect on cell proliferation in HT1080 cells, and the inhibitory effect is drug-dependent.
  • Figure 5 shows the effect of Chinese herbal extract on the inhibition of proliferation and inhibition of Hda cell line in vitro.
  • A is a real-time dynamic map of cell growth and drug action.
  • B is the IC50 value and IC50 fit curve of the drug at 12, 24, and 48 hours after the addition of the Chinese herbal extract to the Hda cells automatically calculated by the real-time cell analysis system. It can be seen from the figure that the extract of traditional Chinese medicine has obvious inhibitory effect on cell proliferation of Hela cells, and the inhibitory effect is drug concentration dependent.
  • Figure 6 shows that the Chinese herbal extract inhibits the proliferation and inhibition of MDA-MB-231 cell line in vitro.
  • A is a real-time dynamic map of cell growth and drug action.
  • B is the IC50 value and IC50 fit curve of the drug at 24, 48 and 72 hours after the addition of the Chinese herbal extract to the MDA-MB-231 cells, which was automatically detected by the real-time cell analysis system. It can be seen from the figure that the extract of traditional Chinese medicine has obvious inhibitory effect on cell proliferation of MDA-MB-231 cells, and the inhibitory effect is drug-dependent.
  • FIG. 7 Chinese herbal extracts inhibited the proliferation and inhibition of HepG2 cell line in vitro.
  • A is a real-time dynamic map of cell growth and drug action.
  • B is the IC50 value and IC50 fit curve of the drug at 48 and 72 hours after the addition of the Chinese herbal extract to HepG2 cells, which was automatically detected by the real-time cell analysis system. It can be seen from the figure that the Chinese herbal extract has a significant inhibitory effect on cell proliferation in HepG2 cells, and the inhibitory effect is drug-dependent.
  • the extract of traditional Chinese medicine has inhibitory effect on the proliferation of the selected 7 cell lines, showing a good concentration gradient, which has stronger effect on HT1080, HeLa, MDA-MB-231 and A549 cells, and on HepG2 and HT29.
  • the role of PC3 cells is weak.
  • Figure 8 Compound specificity map.
  • the real-time impedance data obtained from the xCELLigence system yields compound-specific profiles that depend on the biological mechanism of action of the compound.
  • specific compounds can be generated by adding compounds with different biological mechanisms of action and target specificity. For compounds that do not have a specific effect, these maps can be used to set some verifiable hypotheses in a predictive manner.
  • the xCELLigence real-time cell analysis system was used to detect the inhibition of cell migration by a Chinese herbal extract provided by Guizhou traditional Chinese medicine.
  • the cells used were A549, PC3, HT1080, Hela, MDA-MB-23 HepG2.
  • This experiment uses the xCELLigence DP real-time cell analysis system jointly developed by Essen and Roche.
  • DMEM medium Item No. SH30022.08B, Hyclone (China).
  • MEM medium Item No. SH30024.01B, Hyclone (China).
  • F12 medium Catalog No. SH30526.01, Hyclone (China). Serum: Cat. No. 16000-044, Gibco (USA).
  • Centrifuge tube Item No. 430791, Corning.
  • A549 non-small cell lung cancer cell line
  • PC3 human prostate cell line
  • HT1080 human fibrosarcoma cell line
  • Hela human cervical cancer cell line
  • MDA-MB-231 human breast cancer cell line
  • HepG2 human liver cancer cell line
  • the Chinese herbal extract is 20 g of the drug to obtain 125 ml of the drug juice, and the concentration is 160 mg/ml.
  • a drug containing 10% serum medium was added according to Layout, and a drug prepared in serum-free medium was added to the upper chamber, and the baseline was detected on the DP system.
  • Cells that were resuspended in serum-free medium and had been incubated with each compound for 1 h were then added to the upper chamber and detected on DP for 24 h to 48 h.
  • a proliferation control of the cells was set up in parallel on the 96x E-plate.
  • Baseline was tested on SP by adding a drug containing 10% serum medium according to Layout. Cells that had been resuspended in 10% serum medium and had been incubated with each compound for 1 h were then added and assayed on SP for 24h-48h.
  • the acquisition signal settings are as follows:
  • Fig. 9 shows the inhibitory effect of Chinese herbal extracts on the migration ability of A549 cells in vitro.
  • the left panel shows the drug-inhibiting cell migration curve
  • the right panel shows the real-time dynamic map of the effects of drugs on cell proliferation in parallel.
  • the abscissa indicates cell culture and drug action time
  • the ordinate indicates standardized cell index (NCI).
  • NCI standardized cell index
  • the cell index indicates the state of cell growth. In cell migration experiments, the higher the value, the greater the number of cells that migrate to the lower chamber; in cell proliferation experiments, the higher the value, the more living cells. Dosing concentrations are shown in the figure.
  • the left panel shows the response curve of the drug concentration-dependent cell migration ability of the cells under the action of the traditional Chinese medicine extract
  • Control is a negative control, showing the normal cell migration dynamic curve.
  • the picture on the right is the concentration-dependent cell proliferation inhibition of cells under the action of traditional Chinese medicine extract.
  • Control is a negative control, showing the normal fine Hangzhou Qualcomm New Drug Screening Center Essen Bio
  • the concentration of the added drug is higher than 55.56 ug/ml, it has obvious toxic effects on the cells. Under the toxic effect, the number of cells migrating to the lower chamber is reduced due to the death or activity of the upper chamber cells.
  • the drug concentration is lower than 55.56 ug/ml, there is almost no toxic effect on the cells, and the migration of the cells is also inhibited, and when the inhibition is drug-dependent, the drug has a certain inhibition on the migration of A549 cells. effect.
  • Figure 10 shows the inhibitory effect of Chinese herbal extracts on the migration ability of PC3 cell lines in vitro.
  • the left panel shows the drug-inhibiting cell migration curve, and the right panel shows the real-time dynamic map of the effect of the drug on cell proliferation in parallel. Dosing concentrations are shown in the figure.
  • the left panel shows the response curve of the drug concentration-dependent cell migration ability of the cells under the action of the Chinese herbal extract, and Control is a negative control, showing a normal cell migration dynamic curve.
  • Control is a negative control, showing a normal cell proliferation dynamic curve.
  • Fig. 11 shows the inhibitory effect of Chinese herbal extract on the migration ability of HT1080 cell line in vitro.
  • the left panel shows the drug-inhibiting cell migration curve
  • the right panel shows the real-time dynamic map of the effects of drugs on cell proliferation in parallel. Dosing concentrations are shown in the figure.
  • the left panel shows the response curve of the drug concentration-dependent cell migration ability of the cells under the action of the Chinese herbal extract, and Control is a negative control, showing a normal cell migration dynamic curve.
  • Control is a negative control, showing a normal cell proliferation dynamic curve.
  • the concentration of the added drug is higher than 18.52 ug/ml, it has obvious toxic effects on the cells. Under the toxic effect, the number of cells migrating to the lower chamber is reduced due to the death or activity of the upper chamber cells.
  • the drug concentration is lower than or equal to 18.52 ug/ml, there is almost no toxic effect on the cells, and the migration of the cells is also inhibited, and when the inhibition is drug concentration dependent, the drug has a certain migration to A549 cells. Inhibition.
  • Figure 12 shows the inhibitory effect of Chinese herbal extracts on the migration ability of HeLa cell lines in vitro.
  • the left panel shows the drug-inhibiting cell migration curve, and the right panel shows the real-time dynamic map of the effects of drugs on cell proliferation in parallel. Dosing concentrations are shown in the figure.
  • the left panel shows the response curve of the drug concentration-dependent cell migration ability of the cells under the action of the Chinese herbal extract, and Control is a negative control, showing a normal cell migration dynamic curve.
  • Control is a negative control, showing a normal cell proliferation dynamic curve.
  • the added drug has a significant toxic effect on the cells. Under this toxic effect, the number of cells migrating to the lower chamber is reduced due to the death or activity of the upper chamber cells. The drug has no significant inhibitory effect on cell migration.
  • Figure 13 shows the inhibitory effect of Chinese herbal extracts on the migration ability of MDA-MB-231 cells in vitro.
  • the left panel shows the drug-inhibiting cell migration curve
  • the right panel shows the real-time dynamic map of the effects of drugs on cell proliferation in parallel. Dosing concentrations are shown in the figure.
  • the left panel shows the response curve of the drug concentration-dependent cell migration ability of the cells under the action of the Chinese herbal extract, and Control is a negative control, showing a normal cell migration dynamic curve.
  • Control is a negative control, showing a normal cell proliferation dynamic curve.
  • the addition of drugs had a certain stimulating effect on the migration of MDA-MB-231 cells.
  • the drug concentration is lower than 0.15 mg/ml, there is no obvious toxic effect on the cells.
  • the higher the amount of the drug added the stronger the stimulation effect on cell migration.
  • the concentration of the added drug is higher than 0.4 mg/ml, the cells have a relatively obvious toxic effect. Under the toxic effect, the number of cells migrating to the lower chamber is reduced due to the death or activity of the upper chamber cells.
  • Fig. 14 shows the inhibitory effect of the Chinese herbal extract on the migration ability of HepG2 cell line in vitro.
  • the left picture shows the drug inhibition cell migration curve
  • the right picture shows A real-time dynamic map of the effects of drugs on cell proliferation in parallel. Dosing concentrations are shown in the figure.
  • the left panel shows the response curve of the drug concentration-dependent cell migration ability of the cells under the action of the traditional Chinese medicine extract.
  • Control is a negative control, showing the normal cell migration dynamic curve.
  • Control is a negative control, showing a normal cell proliferation dynamic curve.
  • the added drug has a significant toxic effect on the cells. Under this toxic effect, the number of cells migrating to the lower chamber is reduced due to the death or activity of the upper chamber cells. The drug has no significant inhibitory effect on cell migration.
  • Figure 15 Detection of migration ability of HT29 cell line in vitro. As shown in the figure, when the cell concentrations were 80k/well, 40k/well, 20k/well, and l Ok/well, HT29 had no obvious cell migration ability, so it was impossible to detect the inhibition of cell migration ability.
  • the Chinese herbal extract has obvious toxic effects on HeLa and HepG2 cells. Under the toxic effect, the number of cells migrating to the lower chamber is reduced due to the death or activity of the upper chamber cells. At low concentrations, the drug did not significantly inhibit cell migration. The drug has no inhibitory effect on cell migration.
  • a real-time cardiomyocyte analysis system was used to detect and evaluate the drug heart safety of traditional Chinese medicine extracts provided by Guizhou traditional Chinese medicine on primary neonatal rat cardiomyocytes.
  • the parameters used in this experiment were time-dependent in vitro myocardial cell beating frequency, myocardial cell beat amplitude, and myocardial cell beat rhythm and wave pattern.
  • Essen Bio is a high-tech biotechnology company dedicated to the development and manufacture of our own proprietary impedance-based real-time cell detectors.
  • Essen's innovative micro-electrode sensor mounted on the bottom of the microplate can be used for real-time, label-free cell detection with high throughput, high accuracy, high sensitivity and quantitative detection.
  • the real-time cardiomyocyte system (XCELLigence RTCA Cardio System) developed by Essen Bio and Roche can dynamically monitor the excitatory contraction coupling reaction of cardiomyocytes, and detect and record the electrical signals of cardiomyocytes in real-time short-term/long-term time.
  • Real-time monitoring can be performed by a real-time cardiomyocyte analysis system when the compound acts on cardiomyocytes to affect cell morphology and activity, or to cause changes in the degree of openness of the relevant channels, or to cause changes in contractile excitatory conductance.
  • the system can be used to screen for drugs that affect changes in contractile excitatory conductance in cardiomyocytes, including ion channel and non-ion channel target drugs.
  • Essen uses mouse embryonic stem cell-induced cardiomyocytes (CorAt, Axiogenesis) and human iPS-induced cardiomyocytes to validate more than 50 known compounds, and later supplemented with primary rat cardiomyocytes. .
  • the results show that the real-time cardiomyocyte analysis system reliably and quantitatively detects the effects of arrhythmia compounds and non-ERG channels and voltage-gated calcium channel compounds on cardiomyocytes. Therefore, the system can be used as a tool for cardiotoxicity screening of compounds in early drug development, for high-throughput screening and drug toxicity studies.
  • Work content :
  • the goal of this project is to use an impedance detection system to perform drug heart safety testing and evaluation, to evaluate and identify the compounds caused by the original The ability to change the beating rate of rat cardiomyocytes.
  • the real-time cardiomyocyte analysis system (xCELLigence RTCA Cardio System) continues Eisen's existing proprietary cell-based microelectronic impedance detection system (including RTCA SP, MP, DP system) for functional detection of myocardium Cellular beating and testing for drug cardiomyocyte cytotoxicity.
  • RTCA SP RTCA SP
  • MP MP
  • DP DP system
  • RTCA cardiomyocyte analysis system can also detect myocardial cells for excitement. The cells formed by contraction coupling are beating.
  • the RTCA cardiomyocyte analysis system consists of the following components (see figure below):
  • the cells were seeded into a 96-well cardiomyocyte assay plate to attach the cells to the surface of the electronic sensor.
  • the RTCA test bench was placed in a carbon dioxide cell incubator (5% CO 2 , 37 ° C), and the cardiomyocyte test plate was placed on the RTCA test bench and connected to the analyzer and real-time cell analysis system console.
  • the electrical impedance signal of the sensor surface can be detected in real time through the test bench and the analyzer.
  • the measured electrical impedance signal is analyzed by RTCA real-time cell analysis system console and Cardio software to provide real-time quantitative information on the biological state of the cell, including cells. Information on quantity, vigor, morphology, and changes in cytoskeletal dynamics.
  • Primary rat cardiomyocyte primary rat cardiomyocyte model can be used for many myocardial cell morphology, biochemistry, electrophysiology and pharmacology research. This model is a mature way to study drug transport, toxicity, and electrophysiological properties. Ten rats in the newborn 24 hours, 75% of the ethanol was disinfected and cut along the sternum, taking care to avoid cutting the digestive tract to prevent contamination.
  • tissue block of the size is placed in a small glass bottle, and 1.5 ml of 0.07% trypsin and 0.07% collagenase I are added for digestion, and the digested supernatant is collected, and the appropriate amount (equal volume with the supernatant) is included.
  • the DMEM medium of 10% fetal bovine serum terminates the action of the digestive enzyme, and the above digestion step is repeated until the tissue block disappears.
  • the undigested tissue was filtered through a 200-mesh aperture mesh sieve.
  • the supernatant was centrifuged for 5 min (800 r/min), the supernatant was discarded, and the precipitated cells were blown off with DMEM medium containing 10% fetal bovine serum, and inoculated into the culture flask.
  • Carbon dioxide cell incubator (5% CO2, Hangzhou Qualcomm New Drug Screening Center Essen Bio
  • the cells were statically cultured for 60 min (differential adherence), and the unattached cells were collected and inoculated into a gelatin-treated 96-well cardiomyocyte assay plate at a density of 15,000 cells per well. Detection is performed on the system.
  • This experiment uses a real-time cardiomyocyte analysis system jointly developed by Essen and Roche.
  • DMEM medium Item No. SH30022.08B, Hyclone (China).
  • Collagenase Cat. No. 17101-015, Gibco (USA).
  • HBSS solution 14175, Gibco (USA).
  • the Chinese herbal extract is 20 g of the drug to obtain 125 ml of the drug juice, and the concentration is 160 mg/ml. During the experiment, it was diluted with the medium according to the actual concentration required, and then added to the cells.
  • the primary neonatal rat cardiomyocytes were cultured, and 17000 cells were inoculated per well. After inoculation, they were placed in the real-time cardiomyocyte analysis system according to the following steps and parameters (see the acquisition signal setting table), and 48 hours. After changing the solution, the solution was changed for 2 hours, and after the cell signal was stabilized, it was added to the cell well according to the corresponding concentration of the compound. After the drug is added, the cell resetting detection system is used to collect the myocardial cell beating signal in real time. Two or more duplicate wells are used per compound.
  • Each cell beat corresponds to the excitation and contraction of the muscle cells of the cardiomyocytes.
  • the jitter includes positively occurring positive peaks (+P) and negative peaks (-P).
  • the values of positive and negative peaks per unit time reflect the beating characteristics of cardiomyocytes and Cell state.
  • the number of positive peaks in the Sweep Duration is m (+P1, +P2, +P3, +PmX
  • the number of negative peaks is n (-P1, -P2, -P3, ..., - ⁇ , ⁇
  • the time between a positive and negative peak is defined as the Beatins Period.
  • the rising and falling processes of the jitter are described by parameters such as Rising Tine, Falling Time ⁇ IBD 50 , Rising Slope, and Falling Slope.
  • the RTCA cardiomyocyte analysis software provides 12 parameters for analyzing the beating properties of cardiomyocytes. In this report, select the applicable parameters Hangzhou Qualcomm New Drug Screening Center Aisen Bio
  • Ed NP-Negative Peak Standardized jitter amplitude is the beat amplitude of the selected time point Amplitude The ratio of the degree to the beat amplitude of the normalized time point.
  • the Chinese herbal extract had an effect on cell viability only at a concentration of 16 mg/ml, and other concentrations had no effect on cell viability.
  • the effect of the extract on myocardial cell beating is: There is no significant effect on the frequency, amplitude and rhythm of rat primary ventricular myocytes in a short period of time. After a long period of action, it has a certain cardiotoxic effect on ventricular myocytes. Especially at high concentration (16mg/ml), it can cause myocardial cell parameters after 2 hours of action.
  • the low concentration of the drug (5.33 and lJ8mg/ml) caused a slight decrease in the frequency of myocardial cell beating and increased in the interval of 2-12 hours after dosing, and the beating returned to normal at 12 hours.
  • the drug concentration below 0.59 mg/ml had no significant effect on myocardial cell beating.
  • Chinese herbal extract (H20 ctrl, blank et, 7.32ug/ml, 21.95ug/ml, 65.84ug/ml, 0.20mg/ml,
  • the above figure shows the real-time dynamic map of cell growth and drug action.
  • the abscissa indicates cell culture and drug action time;
  • the ordinate indicates standardized cell index (NCI).
  • NCI standardized cell index
  • the cell index indicates the state of cell growth. The higher the value, the more living cells are reflected.
  • the arrow refers to the dosing period, and the dosing concentration is shown in the figure.
  • the figure shows the drug concentration-dependent dynamic response curve of the cells under the action of the drug, and Ctrl is a negative control, showing a normal cell growth dynamic curve. (Note: H20 Ctrl control well added 10% (the same amount as the highest concentration of drug stock) H20)
  • the figure shows the dose-effect relationship between drug concentration and time-dependent change of traditional Chinese medicine extracts of myocardial cell beat frequency.
  • the parameter used is the Normalized Beating Rate (NBR).
  • the parameter calculation method is the ratio of the beating frequency at the selected time point to the beating frequency of the normalized time point (Omin).
  • Figure A shows the change of cell beating frequency within 1 h of dosing
  • Figure B shows the change of cell beating frequency between lOmin before dosing and 24 h after dosing.
  • the cell beating frequency is consistent within lOmin before dosing and the homogeneity is good.
  • the drug had no obvious effect on cell beating.
  • the high-concentration drug caused the cell beating frequency to decrease, and the jitter completely stopped after 6 hr. 5.
  • 33ing/rnl drug caused a slight decrease in the beating frequency in a period of time, drug concentration Less than 1.78 mg/ml had no significant effect on cell beating. It indicates that the high concentration of the drug has a significant effect on the heartbeat, and the low concentration has no serious effect on the heartbeat.
  • This figure shows the drug concentration and time-dependent changes in the amplitude of myocardial cell pulsation.
  • the parameter used is the normalized runout amplitude (Normal ized
  • the parameter calculation method is to select the ratio of the jitter amplitude at the time point to the jitter frequency of the normalized time point (Omin).
  • Figure A shows the change of cell beating amplitude within 1 h of dosing
  • Figure B shows the change of cell beating amplitude between lOmin before dosing and 24 h after dosing.
  • the cell beating amplitude is stable within 10 min before dosing, and the drug has no significant effect on the cell beating amplitude in the short-term after dosing.
  • the high concentration of 16 mg/ml drug causes the cell beating frequency to decrease, and the beating completely stops after 6 hr. 5.
  • 33mg/ml drug caused a slight decrease in the frequency of beating, and the drug concentration was less than 1.78mg/ml had no significant effect on cell beating. It indicates that the high concentration of the drug has a significant effect on the heartbeat, and the low concentration has no serious effect on the heartbeat.
  • the three time point IC50 values (beating rate/Amplitude) were calculated according to the cell beat frequency and amplitude. 5.
  • the drug rapidly affects cell viability at high concentrations (16 mg/ml), leading to cell death.
  • the Chinese medicine affects the frequency and amplitude of myocardial cell beating in primary neonatal rats in a concentration-dependent manner. High concentration (16mg/ml) will cause the cells to stop beating after about 6hr ; while medium concentration (5.33mg Ail ; 1.78mg/ml) can cause the cells to jump slightly slower after 6hr, slightly increasing the amplitude. . It indicates that the high concentration of the drug has a significant effect on the heartbeat, and the low concentration has no serious effect on the heartbeat.

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Description

包含人环氧酶和阿霉素或类阿霉素的药物组合物、 其制备方法及其在制备药物中的应用 技术领域
本发明涉及从一种自然植物提取的药用组合物， 具体涉及一种含有天然人环氧酶
(COX-2)、天然阿霉素（atm)或天然类阿霉素物质的药用组合物、这种含有天然人环氧酶、 天然阿霉素或天然类阿霉素物质的药用组合物的制备方法， 以及这种含有天然人环氧酶、 天 然阿霉素或天然类阿霉素物质的药用组合物在制备治疗肾炎的药物中的应用、 在制备治疗胆 囊炎和胆息肉的药物中的应用、 在制备治疗肿瘤的药物中的应用， 或在制备消炎药物中的应 用。
背景技术
阿霉素 （Doxorubicin) 化学名称： o-2,5,12-trihydroxy-7-methoxynaphthacene-6, 11-dione, 是一种抗肿瘤抗生素， 可抑制 RNA禾口
DNA的合成， 对 RNA的抑制作用最强， 抗瘤谱较广， 对多种肿瘤均有作用， 属周期非特异 性药物， 对各种生长周期的 I 都有杀灭作用。 主要适用于急性白血病， 对急性淋巴细 胞白血病及 白血病均有效。 恶性淋巴瘤可作为交替使用的首先药物。 乳腺癌、 _Μ、 肺癌、 膀胱癌等其他各种癌症都有一定疗效， 多与其他 ¾β联合使用。
该品为广谱抗肿瘤药， 对机体可产生广泛的生物化学效应， 具有强烈的细胞毒性作用。 其作用机理主要是该品嵌入 DNA而抑制核酸的合成。 临床上用于治疗急性淋巴细胞白血病、 急性粒细胞性白血病、 何杰金和非何杰金淋巴瘤、 乳腺癌、 肺癌、 卵巢癌、 软组织肉瘤、 成 骨肉瘤、 横纹肌肉瘤、 肾母细胞瘤、 神经母细胞瘤、 膀胱瘤、 甲状腺瘤、 絨毛膜上皮癌、 蓝 列腺癌、 睾丸癌、 胃癌、 肝癌等。
人环氧酶 （cyclooxygenase COX) ， 也称为前列腺素过氧化物合成酶
( rostaglandenhypcroxidesynthase PGHS) ，是花生四烯酸转化为前列腺素与二十烯类的限速 酶。其中包括 COX -1和 COX-2两种不同结构和不同生理功能的环氧酶。人环氧酶（COX-2) 于 1988年被发现； 天然的人环氧酶于 1991年被从植物中分离出来。 天然人环氧酶是一种蛋 白质， 也是一种诱导型酶， 能够起到酶的作用来加速某种化学信号的产生， 在发炎和疼痛时 活跃。 当 COX-2的活性被抑制时， 疼痛就减轻。 活化后的 COX-2可以催生花生四烯酸， 产 生多种前列腺素， 参与机体多种生理和病理过程。 目前比较认同的观点是， COX-2可以通过 促进细胞增殖、 抑制细胞凋亡、 促进血管形成、 抑制免疫功能等机制， 参与肿瘤的发生和发 展。
虽然对人环氧酶 （COX-2) 进行的研究文件众多， 但是现有技术中始终没有找到一种富 含人环氧酶（COX-2) 的药用天然植物， 能够采用传统中药的方式实现天然阿霉素 （atm)与 人环氧酶 （COX-2) 的医药产业化。 参考文献：
薛佩妮、 常小红、 杨丽嵘， 延安大学学报 （医学科学版） 2011年 09卷 03期： 《COX-2 与
非小细胞肺癌相关性的研究进展》 ；
邹英鹰、 姚楠、 王芳、 高倩、 宋精玲， 昆明医学院学报 2010年 31卷 01期： 《CDX2和 COX2在人大肠肿瘤中的表达特点及与转移的关系》 ；
张慧峰、高晓琴、李荣山： 山西医科大学学报 2009年 40卷 12期： 《P_(38)MAPK/COX— 2 信号转导通路在大鼠肾脏缺血预处理第二窗保护效应的实验研究》 ；
施柏年、 刘江、 何建方、 戴利成、 周建方、 赵卫锋、 甘建和， 中原医刊 2007年 34卷 09 期： 《环氧化酶 2在肝衰竭模型肝损伤中的表达》 ； 发明内容
为了弥补现有技术的上述不足， 本发明的目的是提供一种含有天然人环氧酶（COX-2) 、 天然阿霉素（atm)或天然类阿霉素物质的药用组合物、 这种含有天然人环氧酶、天然阿霉素 或天然类阿霉素物质的药用组合物的制备方法， 以及这种含有天然人环氧酶、 天然阿霉素或 天然类阿霉素物质的药用组合物在治疗肾炎的药物中的应用、 在制备治疗胆囊炎及胆息肉的 药物中的应用、 在制备治疗肿瘤的药物中的应用， 或在制备消炎药物中的应用。 本发明提供 了富含人环氧酶 （COX-2) 及天然阿霉素或类阿霉素的药用天然植物制备的药用组合物， 该 组合物能够采用传统中药的方式实现天然阿霉素（atm)与人环氧酶（COX-2)的医药产业化。 可以避免化学合成药物的很多副作用， 并且具有良好的治疗效果。
完成上述发明任务的技术方案是，一种含有天然人环氧酶（COX-2)、天然阿霉素（atm) 或天然类阿霉素物质的药用组合物， 其特征在于， 该组合物的原料为奇珍草 （或称贵州奇珍 草） 。 以上技术方案中所述的"该组合物的原料为奇珍草"， 是指： 可以采用奇珍草全株 (色括根 部)脱水、 干燥、 粉碎得到的粉末； 或者该奇珍草的鲜品或其提取物。
所述的奇珍草的提取物是指以下形式的提取物中的一种：
奇珍草鲜品捣制成絨；
奇珍草水煎液；
奇珍草水煎液浓缩、 干燥得到的粉末；
奇珍草水煎液， 经乙醇提取得到的醇提液；
奇珍草水煎液， 经乙醇提取得到的醇提液浓缩、 干燥得到的粉末；
奇珍草全株或奇珍草水煎液经有机溶剂萃取得到的萃取液；
奇珍草全株或奇珍草水煎液经有机溶剂萃取得到的萃取液再浓缩、 干燥得到的粉末； 奇珍草全株或奇珍草水煎液经二氧化碳超临界萃取得到的萃取液；
奇珍草全株或奇珍草水煎液经二氧化碳超临界萃取得到的萃取液浓缩、干燥得到的粉末； 奇珍草全株提取的挥发油。
除所述原料奇珍草或其提取物以外， 该含有天然人环氧酶（COX-2)、天然阿霉素（atm) 或天然类阿霉素物质的药用组合物中还可以含有制药领域所允许的辅料。 例如： 作为片剂时 的赋形剂、 调味剂或抗氧化剂， 作为胶囊时的抗氧化剂或稳定剂； 作为口服液或糖浆时的调 味剂、稳定剂或抗氧化剂， 作为外用药的膏剂时的乳化剂或凡士林； 作为注射剂时的乳化剂、 溶剂或稳定剂， 等等。
以上技术方案中所述的奇珍草 (暂定名)的植物分类位置如下：
贵州奇珍草 Guizhoutreasuresgrass：
长冠鼠尾草 Saivia plectranthoides Griff系
被子植物门 Angiospermae
双子叶植物纲 Dicotyledoneae
合辨花亚纲 Sympetalae
管花 Tubiflorae
马鞭草亚目 Verbenineae
唇形科 Labiatae
鼠尾草属 Salvia linn。
该奇珍草为一年或多年生草本， 须根根系， 根茎直立或葡匐上升， 葡匐茎在节处有生根， 单生或丛生， 茎钝四棱形 (方形)， 具槽， 密被短柔毛。 该奇珍草 (暂定名)的种子已经于 2011年 4月 2日， 交设在武汉大学的中国典型培养物 保藏中心保藏， 保藏编号： CCTCC No: P201102 (见说明书附页 1 ) 。 该植物已向美国申请 植物新品种权； 受理号为： 12/215.016 。 美国商标受理号： 77633688 。
经国家新药筛中心： 样品编号、 nc00168954、 含阿霉素 （或含有类阿霉素物质， 即具有 阿霉素抗性）有效 （见说明书附页 2) 。 经国家新药中心筛选中心： 人环氧酶 -2(COX-2)活性 抑制报告。 经国家新药筛中心： 抗肿瘤生物经国家新筛选中心： 对免疫生物活性， T、 Β淋巴 细胞的增殖及细胞毒性实验结果评定 (见说明书附页 2)。经杭州高通量新药筛选中心筛选出该 植物含有抑制癌细胞活性物 7种 (见说明书附页 3)。
该植物品种已向农业部递交资料， 材料已补充完毕。
完成本申请第 2个发明任务的技术方案是， 上述含有天然人环氧酶 （COX-2) 、 天然阿霉素 (atm) 或天然类阿霉素物质的药用组合物的制备方法， 其特征在于， 步骤如下：
0). 奇珍草全株洗净；
(2).将步骤 (1)得到干净奇珍草全株脱水、 干燥、 粉碎得到的粉末；
所述的步骤 (2)或者采用以下各步骤之一提取奇珍草的提取物：
(2)-1.奇珍草水煎液， 或其再浓缩、 干燥得到粉末；
(2)-2.奇珍草水煎液， 经乙醇提取得到的醇提液， 或其再浓缩、 干燥得到的粉末； (2)-3.奇珍草全株或奇珍草水煎液经有机溶剂萃取得到的萃取液， 或其再浓縮、 干燥得到 的粉末；
(2)·4.奇珍草全株或奇珍草水煎液经二氧化碳超临界萃取得到的萃取液， 或其再浓缩、 干 燥得到的粉末；
(2) -5.奇珍草全株提取挥发油；
(3) .将步骤 (2)、步骤 (2)-1、步骤 (2)-2、步骤 (2)-3、步骤 (2)-4或 (2)-5.得到的粉末和 /或挥发油， 与药用辅料混合； 分别制成所需要的剂型；
(4) . 杀菌；
(5) . 检验；
(6) . 包装。
完成本申请第 3个发明任务的方案是： 上述含有天然人环氧酶 （COX-2) 、 天然阿霉素 (atm) 或天然类阿霉素物质的药用组合物在制备治疗肾炎及的药物中的应用。
完成本申请第 4个发明任务的方案是： 上述含有天然人环氧酶 （COX-2) 、 天然阿霉素 (atm) 或天然类阿霉素物质的药用组合物在制备治疗胆囊炎及胆息肉的药物中的应用。 完成本申请第 5个发明任务的方案是： 上述含有天然人环氧酶 （COX-2) 、 天然阿霉素 (atm) 或天然类阿霉素物质的药用组合物在制备治疗肿瘤的药物中的应用。
完成本申请第 6个发明任务的方案是： 上述含有天然人环氧酶 （COX-2) 、 天然阿霉素 (atm) 或天然类阿霉素物质的药用组合物在制备消炎药物中的应用。
以上所说的含有天然人环氧酶（COX-2) 、 天然阿霉素（atm)或天然类阿霉素物质的药 用组合物在制备治疗肾炎的药物、 在制备治疗胆囊炎的药物、 在制备治疗肿瘤的药物， 或在 制备消炎药物中的应用时， 其给药方式是： 口服片剂、 胶囊、 口服液或糖浆、 口服蒸熘液、 外用眼药水、 外用眼药膏、 外敷炀伤止痛膏剂、 外用消炎、 止血、 散激、 止痛粉、 不排除注 射给药。
其给药剂量是： 成人每天计量相当于原料贵州奇珍草粉末 5g-6g， 本申请推荐量为 5.4g。 即每日三次， 每次 1.8 g。
其治疗周期 （疗程） 是 7天。 用于治疗一般炎症需两个疗程； 治疗慢性炎症需要 6个疗 程。 治疗肾炎、 胆囊炎、 肿瘤一般需要 6个疗程以上。
本发明的药用组合物可以迅速治疗炎症、 消除肿胀， 和缓解疼痛； 还可以去除病毒， 抑 制肿瘤细胞， 激活肌体免疫系统的活力。 因此， 本发明的药用组合物对治疗慢性肾炎、 急性 胆囊炎 （包括胆汁反流性胆囊炎） ， 人体淋巴、 肺、 肝、 胃、 乳腺、 纤维瘤、 白血病 等多种肿瘤疾病。 本发明的药用组合物还可以用于沙眼、 火眼的治疗。
本发明的药用组合物作为外用药涂擦， 可以治疗跌打损伤， 水火烫伤， 疮痛溃破流脓。 本发明的药用组合物原料植物的鲜品， 捣烂外敷可以促进骨折愈合。
本发明的药用组合物还具有美容功效， 可以用于美容产品的开发。
以下是本发明用于制备治疗肾炎的药物、 制备治疗胆嚢炎及胆息肉的药物， 或制备治疗 肿瘤的药物时的效果证明：
含有天然人环氧酶（COX-2) 、 天然阿霉素 （atm)或天然类阿霉素物质的药用组合物在 制备治疗肾炎的药物中的应用时， 肾炎患者的确诊是按照通常的标准确诊； "有效"、 "显效"、 "治愈"等的标准也按照传统标准。 本发明药物的给药剂量是： 成人每日三次， 每次 1.8 g。 疗 程 7天。 6个疗程以上时， 治疗效果对比如下表：
表 1
Figure imgf000006_0001
Figure imgf000007_0001
本发明药物组
治愈时间 7— 15天£ 含有天然人环氧酶（COX-2) 、 天然阿霉素（atm)或天然类阿霉素物质的药用组合物在 制备治疗胆囊炎的药物中的应用时， 胆囊炎患者的确诊是按照通常的标准确诊； "有效"、 "显 效"、 "治愈"等的标准也按照传统标准。本发明药物的给药剂量是：成人每日三次，每次 1.8 g。 疗程 7天。 6个疗程以上时， 治疗效果对比如下表：
表 2
Figure imgf000007_0003
含有天然人环氧酶（COX-2) 、 天然阿霉素 （atm)或天然类阿霉素物质的药用组合物在 制备治疗肿瘤的药物中的应用时，肿瘤（淋巴癌）患者的确诊是按照通常的标准确诊； "有效"、 "显效"、 "治愈"等的标准也按照传统标准。 本发明药物的给药剂量是： 成人每日三次， 每次 1.8 go 疗程 7天。 8个疗程以上时， 治疗效果对比如下表：
表 3
Figure imgf000007_0004
含有天然人环氧酶（COX-2) 、 天然阿霉素（atm)或天然类阿霉素物质的药用组合物作 为一般消炎止痛药物应用时， 一般炎症患者的确诊是按照通常的标准确诊； "有效"、 "显效"、 "治愈"等的标准也按照传统标准。 本发明药物的给药剂量是： 成人每日三次， 每次 1.8 g。 疗 程 7天。 两个疗程以上时， 治疗效果对比如下表：
表 3
Figure imgf000007_0002
本发明药物组 97.6% 92.9% 90%
链霉素组 14.29% 78.57% 7.14%
关于本发明的药物应用的技术效果，请参照说明书附页 2、说明书附页 3与说明书附页 4。 其中杭州高通量新药筛选中的实验报告 （说明书附页 3) ：
提供奇珍草药物筛选， 对细胞肺癌、 纡维肉瘤、 宫颈癌、 肝癌、 4个项目有较强抑制作 用； 大肠癌、 前列腺癌、 乳脉癌三项抑制作用较弱。
(1) 中药提取液对 A549细胞有明显的抑制细胎增殖作用， 抑制作用呈药物浓度依赖性。
(2) 中药提取液抑制 HT29细胞有明细显的抑制胞增殖作用， 抑制作用呈药物浓度依性。
(3) 中药提取液对 PC3细胞有明细显的抑制胞增殖作用， 抑制作用呈药物浓度依赖性。
(4) 中药提取液对 HT1080细胞有明细显的抑制胞增殖作用， 抑制作用呈药物浓度依性。
(5) .中药提取液对 Hela细胞有明细显的抑制胞增殖作用， 抑制作用呈药物浓度依赖性。
(6) .中药提取液对 MDA-MB-231细胞有明细显的抑制胞增殖作用， 抑制作用呈药物浓度 依赖性。
(7) 中药提取液对 Hepc2细胞有明细显的抑制胞增殖作用， 抑制作用呈药物浓度依赖性。 实验结果：
中药提取液由干药 8克制成药汁 120克 1比 15浓度， 55.56ug/ml时， 对细胞有明显的毒 性作用， 这种毒性作用下由于上室细胞死亡或者活性隆低， 迁移至下室的细胞数量减少。 而 当药物浓度低于 55.56ug/ml时对细胞基本没有毒性作用。 （实验检测资料附后） 。
本发明提供了富含人环氧酶 （COX-2) 及天然阿霉素或类阿霉素的药用天然植物制备的 药用组合物， 该组合物能够采用传统中药的方式实现天然阿霉素（atm)与人环氧酶（COX-2) 的医药产业化。 可以避免化学合成药物的很多副作用， 并且具有良好的治疗效果。
附图说明
图 1为中药提取液抑制 A549细胞株体外增殖动态检测及抑制效果观察曲线；
图 2为中药提取液抑制 HT29细胞株体外增殖动态检测及抑制效果观察曲线；
图 3为中药提取液抑制 PC3细胞株体外增殖动态检测及抑制效果观察曲线；
图 4为中药提取液抑制 HT1080细胞株体外增殖动态检测及抑制效果观察曲线； 图 5为中药提取液抑制 Hela细胞株体外增殖动态检测及抑制效果观察曲线；
图 6为中药提取液抑制 MDA-MB-231细胞株体外增殖动态检测及抑制效果观察曲线； 图 7为中药提取液抑制 HepG2细胞株体外增殖动态检测及抑制效果观察曲线； 图 8为化合物特异性图谱； 图 9为中药提取液对 A549细胞株体外迁移能力的抑制作用检测曲线；
图 10为中药提取液对 PC3细胞株体外迁移能力的抑制作用检测曲线；
图 11为中药提取液对 HT1080细胞株体外迁移能力的抑制作用检测曲线；
图 12为中药提取液对 HeLa细胞株体外迁移能力的抑制作用检测曲线；
图 13为中药提取液对 MDA-MB-231细胞株体外迁移能力的抑制作用检测曲线； 图 14为中药提取液对 HepG2细胞株体外迁移能力的抑制作用检测曲线；
图 15为 HT29细胞株体外迁移能力检测曲线；
图 16为实时细胞分析仪；
图 17、 图 18为反映心肌细胞跳动特性及其细胞状态的测定曲线；
图 19为心肌细胞模型中参数和数据分析页面；
图 20为中药提取液对新生大鼠原代心肌细胞活性影响曲线；
图 21为原代心肌细胞随加药后时间的跳动曲线变化；
图 22为中药提取液影响跳动频率 （Beating rate) 的作用曲线；
图 23为中药提取液影响跳动幅度 （Amplitude) 的作用曲线；
图 24为中药提取液影响新生大鼠原代心肌细胞跳动频率和幅度的 IC50曲线。
具体实施方式
实施例 1、 含有天然人环氧酶 （COX-2) 、 天然阿霉素 （atm) 或天然类阿霉素物质的混合药 用组合物， 片剂的制备方法及临床用。
天然阿霉素 （或天然类阿霉素物质） 与人环氧酶药物片剂制备方法- 蒸汽蒸熘液制法：
制剂提取物将奇珍草： 浄洗、 灭菌、 用 1斤药材 10斤水的比例， 提取蒸汽蒸馏取得挥发 油和蒸馏液， 挥发油备用， 蒸留液经低温 24小时以上， 滤取上凊液、 回收乙醇至无醇咮， 浓 缩成稠膏， 于燥、 粉碎、 得浸膏粉、 取挥发油和沉淀物均匀喷洒于浸膏粉， 微粉加入磷酉酸 钙、 乳糖、 去光淀粉、 和硬脂酸镁等药物辅料、 制成相应剂型， 即得。
浸膏粉片剂制法；干浸膏先粉碎成细粉，过 5— 6目筛，用乙醇润湿制粒，在进行压片。 喷雾转动制粒法： 加入磷酉酸钙、 乳糖、 泡光淀粉、 将干浸膏细粉置包衣锅中， 也转动 边将润湿以雾喷入， 逐渐地湿粉成粒。
药粉制片法： 药材浄洗、 灭菌、燥制、和干燥， 加工微米中药粉， 粒径 10um(l— 20um) 过 300目筛、 可制成片剂；
胶囊制备方法： 用 1斤药材 10斤水的比例 3、 胶襄制法： 药材处理： 净制、 炮制、 提纯、 灭菌、 粉碎粒径 75um4.1过 200um目筛、 灌装胶囊；
溶剂提取法： 奇珍草药材， 适当粉碎， 用 1斤药材 10斤水的比例， 使用浸渍法， 渗漉 法、 煎者法； 可选用亲酯性： 石油醚.苯. >乙醚 >乙酸乙酯>丙酮 >乙醇 >甲醇 >水 (亲水性)等， 提 取过程中有机溶剂。
该奇珍草植物制剂在 2006年经送上海家新药筛选中心检测筛选中心检测筛选， 结果表 明， 该植物含有天然人环氧酶 -2(COX-2)活性及免疫生物活性， 对抗炎治疗有很好的作用。 同 时对淋巴1\ B细胞有很好的抑制作用， 具有很好的应用前景。 附页- 1 (保存证明 1页）
附页 -2 (国家新药筛选证明 3 页）
附页 -3 (杭州筛选证明 23页）
说明书附页 - 1
中 国 典 型 培 养 物 保 藏 中 心 用于专利程序的培养物保藏受理通知书 （收据） 地址： 中国.武汉.武汉大学 邮编： 430072 电话： （027 ) 68752319 传真（027) 68754733 E-mail::ccrcc@whu.ecu, cn
请求保藏人及其代理人：
请求保藏人： 林秀英
专利代理人：
专利申请号：
您 （们） 请求保藏的培养物名称 本保藏中心保藏编号 及注明的鉴别特征 CCTCC NO : 201 1 02
贵州珍奇草种子
上述请求保藏的培养物附有
□ 科学描述
□ 提议的分类命名
注- 在框内打 V号的表示有， 打 X号的表示没有。 该培养物已于 2011 年 2月 22 日由本保藏中心收到， 并登记入册。
根据您 （们） 的请求， 自该日起保存 30年。 在届满前收到提供培养物样品的 请求后再继续保存 5年。
该培养物的存活性本保藏中心于 2011年 3月 26日监测完毕， 结果为 存活。
中 国 典 型 负 ΪΗ人 （签名）
Figure imgf000011_0001
2011年 4 2 说明书附页 -2 国 家 新 药 筛 选 中 心
The national Conter for Crug Screening 抗肿瘤生物活性体外筛选试验 筛选方法： 四氮唑盐 （Methy-Thiazol-Tetrozoliur^MTT)
还原法
细胞株： HL-60人白血病
作用时间： 72小时
结果评定： 无活性： lmg ml<50%;
有活性： lmg/ml>50%; 对肿瘤细胞生长的抑制率％ 浓度 0.5 0.25 0.13 0.063 0.031 评价 备注 样品编号
NC00168954 41.8 55.9 72.2 72.9 38.9
浓度 （M) 10-4 10-5 10"6 10-7 10"8
阿霉素 70.0 81.6 79.0 57.6 0 有效
设原液浓度为 10
難者 承粹:；:;： ： B/ ^：' 2(>11.:;12 ：
上海浦东张江 ¾科技园区郭守敬路 189号
189 Guo Shou Jing Rood Zhnagjiang Hi-Tcch.Park Shanghai 201203 china
电话 (Tel): +86(0)21 50801313 传真 (Fax): +S6(0)21 50800721 网址 ( cdslt): www.screcn ora.cn 国 家 新 药 筛 选 中 心
The national Conter for Crug Screening
人环氧酶一 2 (COX— 2)活性抑制报告 实验目的：
环加氧酶通过代谢花生四烯酸 （AA) 生成前列腺素和氧自由基 （ROS)。 环加氧酶
(C0X2), 是炎症发生发展的关键因子之一。 而环加氧酶 1 (C0X1 ) 则主要调控生 理功能。 C0X2选择性抑制剂在抗炎的同时， 避免干扰生理功能， 是抗炎治疗的很好 的靶点， 筛选它的抑制剂具有明显的应用情景。 测试原理：
C0X2代谢花生四烯酸， 生成前列腺素和 R0S。 测量 R0S荧光或 PGE2生成， 以确 定酶活性。 实验结果:
样品对 COX— 2酶的抑制率 （％)
Figure imgf000013_0001
Figure imgf000013_0002
实验人： 金道忠
2006年 06月 11日
上海浦东张江髙科技 S区郭守敬路 189号
189 Guo Shou Jing Rood Zhnagjiang Hi- Tech .Park Shanghai 201203 china
电话 (Tel): +86(0)21 50801313 传真 (Fax): +86(0)21 50800721 网址 (Wcdslt): www.screcn ora.cn 国 家 新 药 筛 选 中 心
The national Conter for Crug Screening 免疫生物活性筛选实验
模型名称： Τ Β淋巴细胞的增值反应及细胞毒性实验
筛选方法： BALB/C小鼠脾脏淋巴细胞在有丝分裂原 ConA,LPS的刺激下， 细胞的形态和代谢可发生一系列的变化， 转化 为母细胞， 并分化增殖， 加入 LPS (脂多糖） lOmg/ml诱导 B淋巴细胞增殖， 以 3H-TdR 掺入法定量测定细胞 的增殖。 活细胞内线粒体脱氧酶能将 ινπτ由黄色还原成蓝色的甲肽， 甲肽产量与活细胞成正比。 用有机溶剂溶 解后， 可用酶标仪检测 OD值。 测试体系： 体外
结果评定： 淋巴细胞的增值采用被测样品 CPM值减对照孔 CPM值， 除对照孔 CPM值乘以％。
百分比前有负号表示此样品对1\ Β细胞有抑制作用。
百分比前没有负号表示此样品对 Τ Β细胞有增值作用。
淋巴细胞毒性的判断 "有" "无"
在无细胞毒的情况下 Τ Β淋巴细胞的增值、 抑制百分比在 15%以上， 表示有作用。
Figure imgf000014_0002
实验者：
实验负责人:
曰期：
Figure imgf000014_0001
上海浦东张江高科技园区郭守敬路 189号
189 Guo Shou Jing Rood Zhnagjiang Hi-Tcch.Paric Shanghai 201203 china
电话 (Tel): +86(0)21 50801313 传真 (Fax): +86(0)21 50800721 网址 (Wedslt): www.screcn ora.cn 说明书附页 -3 杭州高通新药筛选中心 艾森生物
Hangshou high Throughput crug screening center
委托服务项目
基于 xCELLigence无标记动态实时细胞信号
与功能分析系统 (RTCA)技术研究
1.由中药提取液介导的细胞毒性作用检测
2. 中筠提取液对细胞的迂移影响的检测
基于 xCELLigence无标记动态实吋心肌细胞分析系统
(RTCA Cardio System)技术进行
3.中药提取物对心肌细胞的影响检测
实验报告
客户名称： 林秀英
报告单位： 杭州高通新药筛选中心
艾森生物 (杭州）有限公司
报告发布日期： 2012年 2月 14日 杭州高通新药筛选中心 艾森生物
Hangzhou high Throughput crug screening center
1.由中药提取液介导的细胞毒性作用检测
(一)项目简介
本实验采用 xCELLigence实时细胞分析系统， 检测中药提取液对细胞增殖的抑制作用， 并检 测药物抑制细胞增殖的 1C50, 采用的细胞为 A549、 HT1 080、 Hel. a、 MDA- MB- 231、 HT29、 HepG2 及 PC3细胞。
(二)实验仪器：
本实验采用艾森和罗氏共同开发的 xCELLigence实时细胞分析系统。
(三)实验试剂、 耗材：
DMEM培养基： 货号 SH30022. 01B, Hyc] one (中国）。
改良型 RPMI- 1640培养基： 货号 SH30809. 01B， Hyclone (中国）。
MEM培养基: 货号 SH30024. 01B, Hyclone (中国）。
F12培养基: 货号 SH30526. 01 , Hyclone (中国）。
MyCOA' s 5A培养基： 货号 GNM 16600, 吉诺（中国）。
血清： 货号 16000-044， Gibco (美国）。
胰酶： 货号 27250~018, 6ibco (美国）。
PBS: 货号 SH30256. 01B, Hyclone (中国）。
移液管： 货号 4487， Costar。
离心管： 货号 430791 , Corningo
96x E- plate: ACEA。
A549 (非小细胞肺癌细胞株）、 PC3 (人前列腺癌细胞株）、 HT1080 (人成纤维肉瘤细胞株）、 Hela (人宫颈癌细胞株）、 MDA MB— 231 (人乳腺癌细胞株）、 HepG2 (人肝癌细胞株)细胞：
ATCCo
中药提取液： 林秀英提供。
(四)药品配置方法
根据客广提供的信息， 中药提取液为 20克药物得到 125ml药汁， 浓度为 160tng I ml。
实验过程中根据实际需要的浓度， 用培养基稀释后， 加入细胞中。 杭州高通新药筛选中心 艾森生物
Hangzhou high Throughput crug screening center
(五）试验设计及方案
实验方法- 在 96x E-plate上按照 Layout接种细胞， A549 (5000个 /孔）、 Hela (2500个 /孔）、 HT1080 (2500个 /孔）、 MDA-MB-231 (4000个 /孔）、 HT29 ( 10000个 /孔） HepG2 ( 10000个 /孔）、 PC3 ( 10000个 /孔）待细胞增 殖过夜后， 按照 Layout加入药物后， 继续检测 72h 实验 Layout如下:
Plate 1
Figure imgf000017_0001
Plate2
Figure imgf000017_0002
杭州高通新药筛选中心 艾森生物
Hangzhou high Throughput crug screening center 釆集信号设置如下:
Figure imgf000018_0001
(六） 实验结果
l.RTCA Plot
( 1) 中药提取液抑制 A549细胞株体外增殖动态检测及抑制效果
(见图 1 )
图 1中药提取液抑制 A549细胞株体外增殖动态检测及抑制效果观察。 A为细胞生长及药物作用实时动态 图。 其中， 横坐标表示细胞增殖及药物作用时间； 纵坐标表示标准化细胞指数 （NCI)。 细胞指数提示细 胞生长状态。 其值越高反映活细胞越多。 箭头所指为加药时间， 加药浓度见图中所示。 该图显示细胞在 中药提取液作用下的药物浓度依赖性动态反应曲线， controll为阴性对照，显示正常的细胞生长动态曲线。 B为由实时细胞分析系统自动检测计算的 A549细胞中加入中药提取液后，药物在作用 12,24和 48小时吋 间点的 IC50值及 IC50拟合曲线。从图中可见， 中药提取液对 A549细胞有明显的抑制细胞增殖作用， 抑 制作用呈现药物浓度依赖性。
(2) 中药提取液抑制 HT29细胞株体外增殖动态检测及抑制效果
(见图 2)
图 2中药提取液抑制 HT29细胞株体外增殖动态检测及抑制效果观察。 A为细胞生长及药物作用实时动态 图。 B为由实时细胞分析系统自动检测计算的 HT29细胞中加入中药提取液后， 药物在作用 48和 72小时 时间点的 IC50值及 IC50拟合曲线。 从图中可见， 中药提取液对 HT29细胞有明显的抑制细胞增殖作用， 抑制作用呈现药物浓度依赖性。
(3) 中药提取液抑制 PC3细胞株体外增殖动态检测及抑制效果
(见图 3) 杭州高通新药筛选中心 艾森生物
Hangzhou high Throughput crug screening center 图 3中药提取液抑制 PC3细胞株体外增殖动态检测及抑制效果观察。 A为细胞生长及药物作用实时动态图。 B为由实时细胞分析系统自动检测计算的 PC3细胞中加入中药提取液后， 药物在作用 24， 48和 72小时时 间点的 IC50值及 IC50拟合曲线。从图中可见， 中药提取液对 PC3细胞有明显的抑制细胞增殖作用， 抑制 作用呈现药物浓度依赖性。
(4) 中药提取液抑制 HT1080细胞株体外增殖动态检测及抑制效果
(见图 4)
图 4中药提取液抑制 HT1080细胞株体外增殖动态检测及抑制效果观察。 A为细胞生长及药物作用实时动 态图。 B为由实时细胞分析系统自动检测计算的 HT1080细胞中加入中药提取液后， 药物在作用 12， 24和 48小时时间点的 IC50值及 IC50拟合曲线。从图中可见， 中药提取液对 HT1080细胞有明显的抑制细胞增 殖作用， 抑制作用呈现药物浓度依赖性。
(5) 中药提取液抑制 HeLa细胞株体外增殖动态检测及抑制效果
(见图 5)
图 5中药提取液抑制 Hda细胞株体外增殖动态检测及抑制效果观察。 A为细胞生长及药物作用实时动态图。 B为由实时细胞分析系统自动检测计算的 Hda细胞中加入中药提取液后，药物在作用 12， 24和 48小时时 间点的 IC50值及 IC50拟合曲线。从图中可见， 中药提取液对 Hela细胞有明显的抑制细胞增殖作用，抑制 作用呈现药物浓度依赖性。
(6) 中药提取液抑制 MDA-MB-231细胞株体外增殖动态检测及抑制效果
(见图 6)
图 6中药提取液抑制 MDA-MB-231细胞株体外增殖动态检测及抑制效果观察。 A为细胞生长及药物作用 实时动态图。 B为由实时细胞分析系统自动检测计算的 MDA-MB-231细胞中加入中药提取液后， 药物在 作用 24, 48和 72小时时间点的 IC50值及 IC50拟合曲线。 从图中可见， 中药提取液对 MDA-MB-231细 胞有明显的抑制细胞增殖作用， 抑制作用呈现药物浓度依赖性。
(7) 中药提取液抑制 HepG2细胞株体外增殖动态检测及抑制效果
(见图 7) 杭州高通新药筛选中心 艾森生物
Hangzhou high Throughput crug screening center 图 7中药提取液抑制 HepG2细胞株体外增殖动态检测及抑制效果观察。 A为细胞生长及药物作用实时动态 图。 B为由实时细胞分析系统自动检测计算的 HepG2细胞中加入中药提取液后， 药物在作用 48和 72小时 时间点的 IC50值及 IC50拟合曲线。 从图中可见， 中药提取液对 HepG2细胞有明显的抑制细胞增殖作用， 抑制作用呈现药物浓度依赖性。
2.中药提取液对细胞株的细胞毒作用
Figure imgf000020_0001
(七）实验预示的结论及可能的问题和建议
1.实验检验了中药提取液对人非小细胞肺癌细胞株 （A549)， 人大肠癌细胞株 （HT29), 人前列腺细胞株 (PC3), 人成纤维肉瘤细胞株 （HT1080)， 人宫颈癌细胞株（Hela), 人乳腺癌细胞株 （MDA-MB-231 )， 人肝癌细胞株 （HepG2) 7个不同器官细胞株的细胞毒作用。
2.由于药物在不同细胞株上的作用情况不同， 选择 4个时间点 （加药后 12hr, 24hr， 48hr, 72hr), 根据各 个细胞的具体状况， 获得了相应时间点的 IC50值。
3.中药提取液对所选的 7个细胞株的增殖都有抑制作用， 呈现很好的浓度梯度， 其中对 HT1080、 HeLa, MDA-MB-231、 A549细胞的作用较强， 对 HepG2、 HT29、 PC3细胞的作用较弱。
4.从药物开发的角度， 可继续该药物对肺癌， 宫颈癌， 乳腺癌等癌症治疗方面的研究， 同时可以考虑实验 该药物对非肿瘤细胞的细胞株是否存在细胞毒性作用。 杭州高通新药筛选中心 艾森生物
Hangzhou high Throughput crug screening center
5. 化合物机理探讨：根据化合物特异性反应图谱， 中药提取液在这几个细胞株上都表现出明显的细胞毒作 用， 在 H 29和 PC3细胞上的图谱显示出 DNA Damage的细胞毒性作用特征。
(见图 8)
图 8化合物特异性图谱。 从 xCELLigence系统获得的实时阻抗数据可以得到化合物特异性图谱， 这些图谱 依赖于化合物的生物学作用机理。 在这个例子中， 加入不同生物学作用机理和靶点特异性的化合物， 可以 产生特殊的化合物图谱。 针对不具有特异性作用的化合物， 这些图谱可以用于以预测的方式设定一些可验 证的假设。 实验记录信息
保存于艾森生物 （杭州） 有限公司客户数据库。
编号： 1112051511P3, 1112081603P3, 1112141440P5, 1112201057P5
2.中药提取液对细胞的迁移影响的检测
(一）项目简介
本实验采用 xCELLigence实时细胞分析系统,检测由贵州中药提供的某中药提取液对细胞迁移的抑制作用， 采用的细胞为 A549、 PC3、 HT1080、 Hela、 MDA-MB-23 HepG2
(二） 实验仪器
本实验采用艾森和罗氏共同开发的 xCELLigence DP实时细胞分析系统。
(三） 实验试剂、 耗材
DMEM培养基： 货号 SH30022.08B， Hyclone (中国）。
改良型 RPMI-1640培养基： 货号 SH30809.01B, Hyclone (中国）。
MEM培养基： 货号 SH30024.01B, Hyclone (中国）。
F12培养基： 货号 SH30526.01 , Hyclone (中国）。 血清： 货号 16000-044， Gibco (美国）。
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Hangzhou high Throughput crug screening center 胰酶： 货号 27250-018， Gibco (美国）。
DMSO: 货号 D2650, Sigma (美国）。
PBS: 货号 SH30256.01B, Hyclone (中国）。
移液管： 货号 4487， Costar。
离心管： 货号 430791， Corning。
96x E-plate: ACEA
CIM plate: ACEA
A549 (非小细胞肺癌细胞株）、 PC3 (人前列腺细胞株）、 HT1080 (人成纤维肉瘤细胞株）、 Hela (人宫颈 癌细胞株）、 MDA-MB-231 (人乳腺癌细胞株）、 HepG2 (人肝癌细胞株） 细胞： ATCC。
中药提取液： 林秀英提供。
(四）药品配制方法
根据客户提供的信息， 中药提取液为 20克药物得到 125ml药汁， 浓度为 160mg/ml。
实验过程中根据实际需要的浓度， 用培养基稀释后使用。
(五） 实验设计及方案
实验方法：
在 CIM plate下室按照 Layout加入用含 10%血清培养基配制的药物， 在上室加入用无血清培养基配制的 药物， 于 DP系统上检测基线。 然后在上室中加入用无血清培养基重悬并且已经与各化合物共孵肓 lh的 细胞， 于 DP上检测 24h-48h。
同时在 96x E-plate上平行设立细胞的增殖对照。 按照 Layout加入含 10%血清培养基配制的药物， 于 SP 上检测基线。 然后加入用 10%血清培养基重悬并且己经与各化合物共孵育 lh的细胞， 于 SP上检测 24h-48h。
使用的细胞浓度： A549 (60k/well)、 PC3 (40k/well)、 HT1080 (30k/well), Hela (30k/well)、 MDA-MB-231 (80k/well)、 HepG2 (80k/well) 实验 Layout如下: 杭州高通新药筛选中心 艾森生物
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Figure imgf000023_0001
细胞迁移 细胞增 照
I.inel I.inc2 I.inel [.i '2
ΗΓ画 30k well ΠΤ睡蕭 well
Figure imgf000024_0001
Figure imgf000024_0002
(ί ( ontrol CON CON
(1 Scrum Irec SF CON SF CON
Figure imgf000025_0001
采集信号设置如下:
Figure imgf000025_0002
实验结果
l.RTCA Plot
( 1 )中药提取液对 A549细胞株体外迁移能力的抑制作用检测。
(见图 9)
图 9中药提取液对 A549细胞株体外迁移能力的抑制作用检测。
左图为药物抑制细胞迁移曲线， 右图为平行进行的药物对细胞增殖影响的实时动态图。 其中， 横坐标表示 细胞培养及药物作用时间； 纵坐标表示标准化细胞指数（NCI)。 细胞指数提示细胞生长状态。 在细胞迁移 实验中， 其值越高， 反应迁移至下室的细胞数越多； 在细胞增殖实验中， 其值越高反映活细胞越多。 加药 浓度见图中所示。
左图显示细胞在中药提取液作用下的药物浓度依赖性细胞迁移能力的反应曲线， Control为阴性对照，显示 正常的细胞迁移动态曲线。 右图是细胞在中药提取液作用下的药物浓度依赖性细胞增殖抑制作用， Control为阴性对照， 显示正常的细 杭州高通新药筛选中心 艾森生物
Hangzhou high Throughput crug screening center 胞增殖动态曲线。
加入的药物浓度高于 55.56ug/ml时， 对细胞有明显的毒性作用， 这种毒性作用下由于上室细胞死亡或者活 性降低， 迁移至下室的细胞数量减少。 而当药物浓度低于 55.56ug/ml时， 对细胞基本没有毒性作用， 细胞 的迁移却也受到一定的抑制， 且当抑制作用呈药物浓度依赖性， 因此该药物对 A549细胞迁移有一定的抑 制作用。
(2) 中药提取液对 PC3细胞株体外迁移能力的抑制作用检测。
(见图 10)
图 10中药提取液对 PC3细胞株体外迁移能力的抑制作用检测。 左图为药物抑制细胞迁移曲线， 右图为平 行进行的药物对细胞增殖影响的实时动态图。 加药浓度见图中所示。
左图显示细胞在中药提取液作用下的药物浓度依赖性细胞迁移能力的反应曲线， Control为阴性对照，显示 正常的细胞迁移动态曲线。
右图是细胞在中药提取液作用下的药物浓度依赖性细胞增殖抑制作用， Control为阴性对照，显示正常的细 胞增殖动态曲线。
该实验说明加入不同浓度的细胞提取液， 对细胞有明显的毒性作用， 这种毒性作用下由于上室细胞死亡或 者活性降低， 迁移至下室的细胞数量减少。 但在中药提取液浓度低于 7.11mg/ml时， 在药物的作用下， 细 胞迁移量高于 control, 有刺激迁移的作用。
(3) 中药提取液对 HT1080细胞株体外迁移能力的抑制作用检测。
(见图 11 )
图 11中药提取液对 HT1080细胞株体外迁移能力的抑制作用检测。
左图为药物抑制细胞迁移曲线， 右图为平行进行的药物对细胞增殖影响的实时动态图。 加药浓度见图中所 示。
左图显示细胞在中药提取液作用下的药物浓度依赖性细胞迁移能力的反应曲线， Control为阴性对照，显示 正常的细胞迁移动态曲线。
右图是细胞在中药提取液作用下的药物浓度依赖性细胞增殖抑制作用， Control为阴性对照， 显示正常的细 胞增殖动态曲线。
加入的药物浓度高于 18.52ug/ml时， 对细胞有明显的毒性作用， 这种毒性作用下由于上室细胞死亡或者活 性降低，迁移至下室的细胞数量减少。而当药物浓度低于或等于 18.52ug/ml时，对细胞基本没有毒性作用， 细胞的迁移却也受到一定的抑制， 且当抑制作用呈药物浓度依赖性， 因此该药物对 A549细胞迁移有一定 的抑制作用。
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(4) 中药提取液对 HeLa细胞株体外迁移能力的抑制作用检测。
(见图 12)
图 12中药提取液对 HeLa细胞株体外迁移能力的抑制作用检测。 左图为药物抑制细胞迁移曲线， 右图为 平行进行的药物对细胞增殖影响的实时动态图。 加药浓度见图中所示。
左图显示细胞在中药提取液作用下的药物浓度依赖性细胞迁移能力的反应曲线， Control为阴性对照，显示 正常的细胞迁移动态曲线。
右图是细胞在中药提取液作用下的药物浓度依赖性细胞增殖抑制作用， Control为阴性对照，显示正常的细 胞增殖动态曲线。
加入的药物对细胞有明显的毒性作用， 这种毒性作用下由于上室细胞死亡或者活性降低， 迁移至下室的细 胞数量减少。 该药物对细胞迁移无明显的抑制作用。
(5) 中药提取液对 MDA-MB-231细胞株体外迁移能力的抑制作用检测。
(见图 13)
图 13中药提取液对 MDA-MB-231细胞株体外迁移能力的抑制作用检测。 左图为药物抑制细胞迁移曲线， 右图为平行进行的药物对细胞增殖影响的实时动态图。 加药浓度见图中所示。
左图显示细胞在中药提取液作用下的药物浓度依赖性细胞迁移能力的反应曲线， Control为阴性对照，显示 正常的细胞迁移动态曲线。
右图是细胞在中药提取液作用下的药物浓度依赖性细胞增殖抑制作用， Control为阴性对照， 显示正常的细 胞增殖动态曲线。
在实验前期 （20hr前）， 加入药物对 MDA-MB-231细胞的迁移有一定的刺激作用。 且当药物浓度低于 0.15mg/ml时， 对细胞没有明显的毒性作用， 此时， 加入药物量越高， 对细胞迁移的刺激作用越强。 加入 的药物浓度高于 0.4mg/ml时，对细胞有比较明显的毒性作用，这种毒性作用下由于上室细胞死亡或者活性 降低， 迁移至下室的细胞数量减少。
(6) 中药提取液对 HepG2细胞株体外迁移能力的抑制作用检测。
(见图 14)
图 14中药提取液对 HepG2细胞株体外迁移能力的抑制作用检測。左图为药物抑制细胞迁移曲线， 右图为 平行进行的药物对细胞增殖影响的实时动态图。 加药浓度见图中所示。
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Hangzhou high Throughput crug screening center 左图显示细胞在中药提取液作用下的药物浓度依赖性细胞迁移能力的反应曲线， Control为阴性对照，显示 正常的细胞迁移动态曲线。
右图是细胞在中药提取液作用下的药物浓度依赖性细胞增殖抑制作用， Control为阴性对照，显示正常的细 胞增殖动态曲线。
加入的药物对细胞有明显的毒性作用， 这种毒性作用下由于上室细胞死亡或者活性降低， 迁移至下室的细 胞数量减少。 该药物对细胞迁移无明显的抑制作用。
(7) HT29细胞株体外迁移能力检测。
(见图 15)
图 15 HT29细胞株体外迁移能力检测。 如图所示， 细胞浓度分别为 80k/well， 40k/well,20k/well,l Ok/well 时， HT29没有明显的细胞迁移能力， 因此无法进行药物对细胞迁移能力的抑制作用检测。
(七） 实验预示的结论及可能的问题和建议
1.实验检验了中药提取液对人非小细胞肺癌细胞株 （A549)， 人大肠癌细胞株 （HT29)， 人前列腺细胞株 (PC3 ), 人成纤维肉瘤细胞株 （HT1080)， 人宫颈癌细胞株 （HeLa)， 人乳腺癌细胞株（MDA-MB-231 )， 人肝癌细胞株 （HepG2) 7个不同器官细胞株体外迁移能力的抑制作用， 同时平行检测药物对细胞增殖的 影响作用， 检测细胞增殖的目的是检测药物对细胞迁移能力的抑制不是由其细胞毒性引起的。
2.高浓度的中药提取液对 A549和 HT1080细胞有明显的毒性作用，这种毒性作用下由于上室细胞死亡或者 活性降低， 迁移至下室的细胞数量减少。 而低浓度时， 药物对细胞迁移有一定的抑制作用。
3.中药提取液对 HeLa和 HepG2细胞有明显的毒性作用，这种毒性作用下由于上室细胞死亡或者活性降低， 迁移至下室的细胞数量减少。 而低浓度时， 药物对细胞迁移无明显的抑制作用。 该药物对细胞迁移无抑制 作用。
4. 高浓度的中药提取液对 PC3和 MDA-MB-231细胞有明显的毒性作用， 这种毒性作用下由于上室细胞死 亡或者活性降低， 迁移至下室的细胞数量减少。 而低浓度时， 药物对细胞迁移有一定的刺激作用。 实验记录信息
保存于艾森生物 （杭州） 有限公司客户数据库。 编号： 1112211551D12, 1112211605P4,1112271558D12,1112271559P4,1112311454P6,
1112311452D12, 1201101537D12, 1201101540P2,1202021535D12,1202021539P1
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4.中药提取物对心肌细胞的影响检测
1.项目简介
本实验采用实时心肌细胞分析系统， 在原代新生大鼠心肌细胞上， 对贵州中药提供的中药提取液进行 药物心脏安全性的检测及评估。 本实验所采用的评估参数为时间依赖性的体外心肌细胞跳动频率、 心肌细 胞跳动幅度以及心肌细胞跳动节律和波型。
2.背景介绍
2.1.研究背景
艾森生物是一家致力于研发和制造本公司拥有自主专利的以阻抗技术为基础的实时细胞检测仪的高 科技生物公司。 艾森公司所创新设计的安装于微孔板底部的微电极传感器， 可用于实时、 无标记检测细胞 状态， 具有高通量、 高精确度、 高灵敏度及可定量检测等优点。
由心脏疾病或药物心脏毒性引起的心脏功能损伤威胁着人类的健康和安全。 深入揭示重大心脏疾病发 生机制， 并在此基础上探讨新的有效防治措施， 以及在新药开发过程中， 揭示部分药物心脏毒性是心脏硏 究工作者面临的重大挑战。艾森生物与罗氏共同开发的实时心肌细胞分析系统（xCELLigence RTCACardio System), 可动态监测心肌细胞兴奋收缩偶联反应， 并实时短时程 /长时程检测并记录心肌细胞跳动电信号。 当化合物作用于心肌细胞影响细胞形态和活性， 或者导致相关通道开放程度改变， 或者引起收缩兴奋传导 性发生变化时， 可以通过实时心肌细胞分析系统进行实时监测。
该系统可用于筛选影响心肌细胞收縮兴奋传导性变化的药物， 包括离子通道和非离子通道靶点药物。 艾森公司使用小鼠胚胎干细胞诱导的心肌细胞（CorAt, Axiogenesis)和人 iPS细胞诱导的心肌细胞对超过 50种已知化合物进行了验证， 稍后又用原代大鼠心肌细胞做了补充验证。研究结果表明， 实时心肌细胞分 析系统能够可靠和定量检测心律失常化合物以及非 ERG通道和电压门控性钙通道化合物对心肌细胞的作 用。 因此， 本系统可作为一个早期药物开发过程中的化合物的心脏毒性筛査的工具， 进行相关药物高通量 筛选和药物毒性研究。 工作内容：
本项目的目标是使用阻抗检测系统， 进行药物心脏安全性的检测及评估， 评估和鉴定化合物引起的原 代大鼠心肌细胞跳动率变化的能力。
本项目中每种化合物使用 7个不同浓度进行测试， 在检测前后选定不同时间点监测细胞跳动状态， 通 过观察中药提取液对原代大鼠心肌细胞的剂量依赖性作用来评估其对原代心肌细胞跳动的影响作用。
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2.2.系统介绍
实时心肌细胞分析系统 （xCELLigence RTCA Cardio System) 延续了艾森生物现有的自主专利产权的 基于细胞的微电子阻抗检测系统（包括 RTCA SP, MP, DP系统）功能， 可用于功能性地检测心肌细胞跳 动和进行药物心肌细胞毒性检测。 该系统的核心是将微电子细胞传感器陈列集成到 96孔培养板
(Cardio-Plate 96) 的底部， 它大大提高了数据采集率， RTCA心肌细胞分析系统除了拥有类似 RTCA SP, MP和 DP系统的长时间检测细胞生长增殖的功能以外， 还能够检测心肌细胞进行兴奋收缩偶联形成的细 胞跳动。
RTCA心肌细胞分析系统由下列部件构成 （见下图）：
• A: 实时细胞分析系统控制台 （RTCA Cardio Control Unit)
• B: 实时细胞分析仪 （RTCACardio Analyzer)
• C: 细胞检测工作台 （RTCACardio Station)
• D: 检测板 （Cardio-Plate %)
(见图 16)
将细胞接种至 96孔心肌细胞检测板中，使细胞贴附于电子传感器表面。 RTCA检测工作台放在二氧化 碳细胞培养箱中（5%C02， 37°C ), 心肌细胞检测板置于 RTCA检测工作台上， 并与分析仪和实时细胞分 析系统控制台接通。 通过检测工作台和分析仪可实时地检测传感器表面的电阻抗信号， 测得的电阻抗信号 由 RTCA实时细胞分析系统控制台和 Cardio软件进行分析，实时定量地提供细胞的生物学状态，包括细胞 数量、 活力、 形态以及细胞骨架动力学变化等信息。 原代大鼠心肌细胞 原代大鼠心肌细胞模型， 可用于许多心肌细胞形态、 生化、 电生理以及药理学方面的研究。 该模型是 一种成熟的用于研究药物转运、毒性以及电生理特性的方式。将新生 24h内的大鼠 10只， 75%的乙醇消毒 后沿胸骨正中入剪， 注意避免剪破消化道以预防污染。 无菌剪取心室部位， 仔细玻璃心房及大血管组织， 迅速置于预冷的无血清 DMEM中， 反复冲洗 3遍， 洗去残留的血细胞， 将其剪成 0.5mmx0.5mmx0.5mmx 大小的组织块， 放入小玻璃瓶中， 加入 1.5ml的 0.07%的胰蛋白酶和 0.07%的胶原酶 I进行消化， 收集消化 后的上清液， 加适量 （与上清液等体积） 含 10%胎牛血清的 DMEM培养基终止消化酶的作用， 重复上述 消化步骤直至组织块消失。 经 200目孔径网筛滤除未消化组织， 上清液离心 5min ( 800r/min)， 弃上清液， 用含 10%胎牛血清的 DMEM培养基吹散沉淀细胞， 接种于培养瓶中， 二氧化碳细胞培养箱中 （5%C02, 杭州高通新药筛选中心 艾森生物
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37 °C )中静置培养 60min (差速贴壁）， 收集未贴壁的细胞， 将其以每孔 15000个细胞的密度接种至明胶处 理过的 96孔心肌细胞检测板中， 置于 Cardio系统上进行检测。
3.实验设计与方案
4.
3丄实验仪器：
本实验采用艾森和罗氏共同开发的实时心肌细胞分析系统。
Figure imgf000032_0001
3.2.实验试剂、 耗材：
DMEM培养液： 货号 SH30022.08B, Hyclone (中国）。
血清： 货号 16000-044， Gibco (美国）。
胰酶： 货号 27250-018， Gibco (美国）。
胶原酶： 货号 17101-015， Gibco (美国）。
DMSO: 货号 D2650, Sigma (美国）。
HBSS solution: 14175， Gibco (美国）。
明胶： 货号 48732， Sigma (美国）。
PBS: 货号 SH30256.01B, Hyclone (中国）。 3.3.药品配制方法
根据客户提供的信息， 中药提取液为 20克药物得到 125ml药汁， 浓度为 160mg/ml。 实验过程中根据 实际需要的浓度， 用培养基稀释后， 加入细胞中。 杭州高通新药筛选中心 艾森生物
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3.4.实验设计及方案 培养原代新生大鼠心肌细胞， 每孔接种 17000个细胞， 接种后置于实时心肌细胞分析系统中按照以下 步骤和参数检测 （见采集信号设置表)， 并于 48小时换液， 换液 2小时待细胞信号稳定后， 按化合物相应 浓度加入细胞孔内。 加药后将细胞重置检测系统中进行实时采集心肌细胞跳动信号。 每个化合物采用 2个 或 2个以上复孔。
Figure imgf000033_0001
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Hangzhou high Throughput crug screening center 采集信号设置如下:
Figure imgf000033_0002
5 12 5分钟 20秒
6 100 15分钟 20秒
7 50 1小时 20秒
3.5.数据分析 杭州高通新药筛选中心 艾森生物
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3.5.1计算各个吋间点的细胞跳动频率 （ beating rate )， 并绘制跳动曲线 （ beating rate vs.time ) 3.5.2分析用参数包括：
參 时间依赖性跳动频率 Time dependent beating rate
• 标准化跳动频率 Normalized beating rate
• 时间依赖性跳动幅度 Time dependent amplitude
• 标准化跳动幅度 Normalized amplitude
• 加药前后细胞整体活性状态 Cell Index
• 时间依赖性跳动节律异常 Time dependent beating rhythm irregularity
• 时间依赖性跳动相 4以率 Time dependent beating similarity 分析参数定义
每一个细胞跳动相对应一次心肌细胞的肌肉细胞兴奋收缩偶联。 该跳动包括顺序出现的正性波峰 (Positive Peaks, +P )和负性波峰（Negative Peaks， -P), 单位时间内出现正性波峰和负性波峰的值反映 了心肌细胞的跳动特性及其细胞状态。
(见图 17) 心肌细胞跳动模式及相关主要参数说明:
幅度 (Amplitude)
负性波峰和正性波峰之间的细胞指数差值 (图中所示 Amp— 1， Amp— 2, Amp— 3, -, Amp—m 拱动期 (Beating Period):
如上图所示, 在一次扫描期（Sweep Duration )中正性波峰数目为 m (+P1 , +P2 , +P3, +PmX 负性 波峰数目为 n (-P1 , -P2, -P3, …， -Ρη, λ 一个正性波峰和负性波峰之间的时间被定义为跳动期（Beatins Period )。 对于每一次跳动， 用上升期 (Rising Tine), 下降时间 (Falling Time λ IBD50,上升斜率 (Rising Slope ), 和 下降斜率 (Falling Slope)等参数来描述跳动的上升和下降过程。
(见图 18)
3.5.3心肌细胞模型中参数和数据分析方法
RTCA心肌细胞分析软件提供有 12个用于分析心肌细胞跳动特性的参数。 在本报告中， 选取适用 参数杭州高通新药筛选中心 艾森生物
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(见图 19)
参数 单位 方法 参数描述
Positive Peak Counts
一分钟内所有正性波峰数
计算正性波峰
Negative Peak Counts
一分钟内所有负性波峰数
计算负性波峰
跳动频率
beatings/ Positive Peak Period
(Beating
min Based 计算每个正性 -正性波峰之间的跳动频率 Rate)
基于正性波峰期
Negative Peak Period
Based 计算每个负性 -负性波峰之间的跳动频率 基于负性波峰期
Positive Peak Counts
计算正性波峰
Negative Peak Counts
标准化跳动
计算负性波峰 当选择标准化跳动频率时， 出现下拉菜 频率
Positive Peak Period 单， 从中选择标准化时间点。
(Normaliz N/A
Based 标准化跳动频率为选择时间点的跳动频 ed Beating
基于正性波峰期 率与标准化时间点的跳动频率的比值。
Rate )
Negative Peak Period
Based
基于负性波峰期
从一个负性波峰到下一个正性波峰的跳 幅度 WP-Whole Peak
Same as 动幅度
(Amplitud
Cell Index PP-Positive Peak 从基线到正性波峰的幅度
e)
NP- Negative Peak 从基线到负性波峰的幅度
标准化幅度 WP-Whole Peak 当选择标准化跳动幅度时， 出现下拉菜 ( Normaliz N/A PP-Positive Peak 单， 从中选择标准化时间点。
ed NP-Negative Peak 标准化跳动幅度为选择时间点的跳动幅 Amplitude ) 度与标准化时间点的跳动幅度的比值。
4实验结果 中药提取液仅在 16mg/ml的浓度下对细胞活性产生影响， 其它浓度对细胞活性无影响。 该提取液对心肌细 胞跳动的影响为： 短期内对大鼠原代心室肌细胞跳动频率、 幅度和节律没有明显的影响作用， 作用时间较 长后对心室肌细胞有一定的心脏毒性作用。 尤其在高浓度（16mg/ml)， 在作用 2小时后会可引起心肌细胞 参数杭州高通新药筛选中心 艾森生物
Hangzhou high Throughput crug screening center 跳动频率降低， 作用 6小时后引起细胞跳动完全停止。
低浓度的药物 （5.33和 lJ8mg/ml ) 在加药后 2-12小时区间内引起心肌细胞跳动频率略降低并幅度增大， 12小时候跳动恢复正常。
药物浓度低于 0.59mg/ml对心肌细胞跳动无明显影响。
4.1中药提取液对新生大鼠原代心肌细胞活性影响
(见图 20)
中药提取液： （H20 ctrl， blank et, 7.32ug/ml, 21.95ug/ml,65.84ug/ml,0.20mg/ml,
0.59mg/ml, 1 ,78,mg/ml5.33mg/ml,16.00mg/ml )
中药提取液抑制原代心肌细胞活性动态检测。 上图为细胞生长及药物作用实时动态图。 其中， 横坐标表示 细胞培养及药物作用时间； 纵坐标表示标准化细胞指数（NCI)。 细胞指数提示细胞生长状态。 其值越高反 映活细胞越多。 箭头所指为加药吋间， 加药浓度见图中所示。 该图显示细胞在药物作用下的药物浓度依赖 性动态反应曲线， Ctrl为阴性对照， 显示正常的细胞生长动态曲线。 （注： H20 Ctrl对照孔加入 10% (与最 高浓度的药物原液量相同） 的 H20)
从中药提取液对新生大鼠原代心肌细胞活性影响的结果可见， 当给予高浓度药物时（16mg/ml)， 一段时间 后细胞指数迅速下降， 反映高浓度药物具有明显细胞毒性， 可导致细胞形态变化、 贴壁不良甚至死亡。 而当药物浓度低于 5.32mg/ml时， 药物对细胞活性的影响不明显。 但是此浓度的药物却会引起心肌细胞在 跳动频率和跳动幅度上一定程度的变化。
4.2原代心肌细胞随加药后时间的跳动曲线变化
(见图 21 ) 4.3中药提取液对新生大鼠原代心肌细胞毒性作用小结
Figure imgf000037_0001
注： 药物对细胞跳动的影响， XX， 无跳动； X， 明显异常； V， 正常跳动.
4. 4中药提取液影响跳动频率 （Beating rate ) 的作用
(见图 22)
该图为心肌细胞跳动频率的中药提取物药物浓度和时间依赖性变化量效关系。使用的参数为标准化跳动频 率 （Normal ized Beat ing Rate, NBR) , 参数计算方法为选择时间点的跳动频率与标准化时间点 （Omin ) 的跳动频率的比值。
其中图 A为加药 lh以内细胞跳动频率的变化过程； 图 B为药物在加药前 lOmin至加药后 24h之间全程细 胞跳动频率变化过程。
从图中可见， 加药前 lOmin内细胞跳动频率一致， 均一性好。 加药后短期内药物对细胞跳动无明显影响， 2hr后高浓度药物引起细胞跳动频率降低， 直至 6hr后跳动完全停止， 5. 33ing/rnl药物在一段时间段内引 起跳动频率略降低， 药物浓度小于 1. 78mg/ml对细胞跳动则无明显影响。 说明该药物高浓度时对有明显的 影响心脏跳动作用， 低浓度对心脏跳动作用无严重影响。
4. 5中药提取液影响跳动幅度 （Ampl itude) 的作用
(见图 23)
该图为心肌细胞跳动幅度的药物浓度和时间依赖性变化。 使用的参数为标准化跳动幅度 （ Normal ized
Ampl i tude, NA)， 参数计算方法为选择时间点的跳动幅度与标准化时间点 （Omin ) 的跳动频率的比值。 其中图 A为加药 lh以内细胞跳动幅度的变化过程； 图 B为药物在加药前 lOmin至加药后 24h之间全程细 胞跳动幅度变化过程。
从图中可见， 加药前 lOmin内细胞跳动幅度稳定， 加药后短期内药物对细胞跳动幅度无明显影响， 2hr后 高浓度 16mg/ml药物引起细胞跳动频率降低， 直至 6hr后跳动完全停止， 5. 33mg/ml药物引起跳动频率略 降高， 药物浓度小于 1. 78mg/ml对细胞跳动则无明显影响。 说明该药物高浓度时对有明显的影响心脏跳动 作用， 低浓度对心脏跳动作用无严重影响。 杭州高通新药筛选中心 艾森生物
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4. 6中药提取液影响新生大鼠原代心肌细胞跳动频率和幅度的 IC50
(见图 24)
上图 4个时间点的 IC50拟合曲线 （beating rate/Ampl itude )
Figure imgf000038_0001
根据细胞跳动频率和幅度计算 3个时间点 IC50值 （beating rate/Amplitude)。 5.实验预示的结论及可能的问题和建议
5. 1该药物在高浓度时 （16mg/ml) 迅速影响细胞活性， 导致细胞死亡。
5. 2该中药以浓度依赖的方式影响原代新生大鼠心肌细胞跳动的频率和幅度。高浓度（16mg/ml)时会导致 细胞在 6hr左右以后停止跳动； 而中等浓度（5. 33mgAil ; 1. 78mg/ml ) 时可以引起细胞在 6hr左右以后跳 动频率略变慢， 幅度略增大。 说明该药物高浓度时对有明显的影响心脏跳动作用， 低浓度对心脏跳动作用 无严重影响。
5. 3未见药物引起的特异性离子通道相关心肌细胞跳动波形。 以上结果仅供参考， 具体机制还需进一步筛选研究。 实验记录信息
保存于艾森生物 （杭州） 有限公司客户数据库。 编号： 1112121715CD。
ZB12-04F
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1-3-1 保藏单位名称 CCTCC 中国典型培养物保藏中心
1-3-2 保藏单位地址 中国湖北省武汉市武汉大学， 邮政编码: 430072, Hube i
(GN)。
1-3-3 保藏日期 201 1年 4月 02日 (02. 04. 201 1)
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1-5 本说明是对下列指定国 所有指定国 由受理局填写
0-4 本表格与国际申请一起收到： i
(是或否）
0-4-1 受权官员 由国际局填写
0-5 国际局收到本表格曰期：
0-5-1 受权官员

Claims

权利 要 求
1. 一种含有天然人环氧酶及天然阿霉素或类阿霉素的药用组合物， 其特征在于， 该组合物的 原料为奇珍草。
2. 根据权利要求 1所述的含有天然人环氧酶及天然阿霉素或类阿霉素的药用组合物， 其特征 在于， 所述的"该组合物的原料为奇珍草， 是指： 采用奇珍草全株脱水、 干燥、 粉碎得到的粉 末； 或者该奇珍草的提取物。
3. 根据权利要求 2所述的含有天然人环氧酶及天然阿霉素或类阿霉素的药用组合物， 其特征 在于， 所述的该奇珍草的提取物是指以下方式得到的提取物中的一种：
奇珍草水煎液， 浓缩、 干燥得到的粉末；
奇珍草水煎液， 经乙醇提取得到的醇提液， 或其再浓缩、 干燥得到的粉末；
奇珍草全株或奇珍草水煎液经有机溶剂萃取得到的萃取液， 或其再浓缩、 干燥得到的粉末； 奇珍草全株或奇珍草水煎液经二氧化碳超临界萃取得到的萃取液， 或其再浓缩、 干燥得到的 粉末；
奇珍草全株或奇珍草水液提取得到挥发油。
4. 根据权利要求 1或 2或 3所述的含有天然人环氧酶及天然阿霉素或类阿霉素的药用组合物， 其特征在于， 所述的含有天然阿霉素与人环氧酶的药用组合物中， 还含有制药领域所允许的 辅料。
5. 根据权利要求 4所述的含有天然人环氧酶及天然阿霉素或类阿霉素的药用组合物， 其特征 在于， 所述的制药领域所允许的辅料是指： 作为片剂时的赋形剂、 调味剂或抗氧化剂， 作为 胶囊时的抗氧化剂或稳定剂； 作为口服液或糖浆时的调味剂、 稳定剂或抗氧化剂， 作为外用 药的膏剂时的乳化剂或凡士林； 作为注射剂时的乳化剂、 溶剂或稳定剂。
6. 权利要求 1所述的含有天然人环氧酶及天然阿霉素或类阿霉素的药用组合物的制备方法， 其特征在于， 步骤如下：
(1) . 奇珍草全株洗净；
(2) .将步骤 (1)得到干净奇珍草全株脱水、 千燥、 粉碎得到的粉末；
所述的粉末的粒度为 125um, 5.8um, 120目的细筛；
所述的步骤 (2)或者采用以下各步骤之一提取奇珍草的提取物：
(2)-1.奇珍草水煎液， 或其再浓缩、 干燥得到粉末； （2)-2.奇珍草水煎液， 经
乙醇提取得到的醇提液， 或其再浓缩、 干燥得到的粉末 (2)-3.奇珍草全株或奇珍草水煎液经有 机溶剂萃取得到的萃取液， 或其再浓缩、 干燥得到的粉末； (2)·4.奇珍草全株或奇珍草水煎液经二氧化碳超临界萃取得到的萃取液， 或其再浓缩、 干燥得 到的粉末；
(2) -5.奇珍草全株提取挥发油；
(3) .将步骤 (2)、 步骤 (2)-1、 步骤 (2)-2、 步骤 (2)-3、 步骤 (2)-4或 (2)-5.得到的粉末和 /或挥发油， 与 药用辅料混合； 分别制成所需要的剂型；
(4) . 杀菌；
(5) . 检验；
(6) . 包装。
7. 权利要求 1所述的含有天然人环氧酶及天然阿霉素或类阿霉素的药用组合物在制备治疗肾 炎的药物中的应用。
8. 权利要求 1所述的含有天然人环氧酶及天然阿霉素或类阿霉素的药用组合物在制备治疗胆 囊炎及胆息肉的药物中的应用。
9. 权利要求 1所述的含有天然人环氧酶及天然阿霉素或类阿霉素的药用组合物在制备治疗肿 瘤的药物中的应用。
10. 权利要求 1 所述的含有天然人环氧酶及天然阿霉素或类阿霉素的药用组合物在制备治疗 消炎止痛的药物中的应用。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108159308A (zh) * 2017-11-24 2018-06-15 花泽燕 一种胆囊息肉专用中药及其制备方法
CN108157727A (zh) * 2017-11-30 2018-06-15 慈中华 用于保持平和体质的固体饮料及其加工方法
CN117721171A (zh) * 2024-01-04 2024-03-19 中国人民解放军总医院第一医学中心 在细胞增殖过程中的氯化钴的加入方法

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1174065A (zh) * 1997-07-16 1998-02-25 迟经惠 障碍贫血针剂
CN101181349B (zh) * 2007-11-13 2012-02-22 中国人民解放军第二军医大学 甘西鼠尾草提取物在制备治疗肾小球肾炎药物中的应用

Non-Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
LIU, XIAOLONG ET AL.: "Development and Utilization of Medicinal Plant Resources of Salvia in Anhui", CHINA JOURNAL OF CHINESE MATERIA MEDICA, vol. 21, no. 2, February 1996 (1996-02-01), pages 73, XP008175500 *
See also references of EP2851079A4 *
SHI BAINIAN; LIU JIANG; HE JIANGFANG; DAI LICHENG; ZHOU JIANFANG; ZHAO WEIFENG; GAN JIANHE: "Expression of epoxidation enzyme 2 in liver injury of hepatic failure model", ZHONGYUAN MEDICAL JOURNAL, vol. 34, 2007
WANG, XIAOMING ET AL.: "Studies on the Chemical Constituents from Salvia Plectranthoides Griff", JOURNAL OF HUAZHONG UNIVERSITY OF SCIENCE AND TECHNOLOGY, vol. 31, no. 3, June 2002 (2002-06-01), pages 254, XP008175501 *
XUE PEINI; CHANG XIAOHONG; YANG LIRONG: "Progress in research of correlation between COX-2 and non-small cell carcinoma of the lung", JOURNAL OFYANAN UNIVERSITY, vol. 09, 2011
ZHANG HUIFENG; GAO XIAOQIN; LI RONGSHAN: "P_(38)MAPK/COX 2 Experimental research in protection effect of signal transduction path in second window of pre-treatment of rat kidney ischemia", JOURNAL OF SHANXI MEDICAL UNIVERSITY, vol. 40, 2009
ZOU YINGYING; YAO NAN; WANG FANG; GAO QIAN; SONG JINGLIN: "Characteristics of expression ofCDX2 and COX2 in human large intestine cancer and their relation with metastasis", JOURNAL OFKUNMING MEDICAL COLLEGE, vol. 31, 2010

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