WO2014009330A1 - Nouvelle souche de lactobacillus crispatus - Google Patents

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    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/225—Lactobacillus

Definitions

  • the present invention relates to a novel strain specific for Lactobacillus crispatus, isolated from healthy tissue samples, and any strain having the same characteristics, as well as compositions comprising them.
  • the urogenital flora includes nearly 50 different species of microorganisms.
  • 95% of the population consists of various strains of lactobacilli, including the "Döderlein bacillus".
  • lactobacilli play a protective role against pathogens by various mechanisms: production of hydrogen peroxide, production of lactic acid, production of bacteriocins, inhibition of adhesion and expansion of pathogens.
  • these lactobacilli maintain an acid pH by the production of lactic acid from the glycogen present in the vaginal mucus.
  • the normal vaginal flora is thus mainly composed of lactobacilli forming a protective biofilm on the surface of the mucosa.
  • lactobacilli found in the vagina include Lactobacillus crispatus, Lactobacillus jensenii, Lactobacillus vaginalis, Lactobacillus iners and Lactobacillus gasseri.
  • Vulvovaginal candidiasis affects 70-75% of women during genital activity at least once in their lifetime; about 40-50% of them will present a second episode.
  • the incidence of recurrent vulvovaginal candidiasis (defined as the occurrence of at least 4 episodes per year, two of which have been proven by mycological examination) has been estimated at 5-8%.
  • This benign condition has a very negative impact on the quality of life of the patients and generates significant health expenses. To treat such a pathology is difficult because of the multifactorial pathogenesis of this affection.
  • Bacterial vaginosis is due to a qualitative and quantitative imbalance of the normal vaginal flora which can lead to an almost complete disappearance of lactobacilli in favor of anaerobic flora and also the emergence of germs such as Gardnerella vaginalis and Atopobium vaginae involved in bacterial vaginosis.
  • Bacterial vaginosis is one of the most common vaginal infections with a frequency of 10 to 15. This benign pathology in women can be serious during pregnancy, because it can lead to premature delivery, low birth weights, and spontaneous abortions.
  • Bacterial vaginosis and other imbalances in the vaginal microflora are commonly treated with antibiotics. This treatment has the usual disadvantages of antibiotic treatments and proves less and less effective. In addition, it aims to eliminate pathogenic flora but also destroys beneficial natural flora.
  • lactobacilli are Lactobacillus rhamnosus and Doderlein bacillus (Lactobacillus acidophilus vaginalis).
  • strains of Lactobacillus crispatus Strains of Lactobacillus crispatus deposited with the DSMZ (Germany) under deposit numbers DSM 16735, 16736, 16738, 16739, 16740, 16741,
  • these strains are capable of colonizing the vaginal mucosa, and thus of promoting vaginal health; they also have good adhesion properties to epithelial cells;
  • the strain of Lactobacillus crispatus P-17631 as described in the patent application EP 949 330 is capable of fermenting glycogen, and of inhibiting the growth of Candida.
  • vaginal pH is a parameter that varies significantly during the life of the woman: the physiological pH is 7 in prepubescent girls, down to 3.8 in pubescent women, and is greater than 5.5 during the menopause, in the absence of hormone replacement therapy. These variations are related to multiple factors such as the presence of estrogen and colonization by lactobacilli.
  • the present invention relates to a new isolated strain of Lactobacillus crispatus, identified as IP174178, deposited at the CNCM on June 22, 2012 under accession number CNCM I-4646, and to any strain of L. crispatus having the same characteristics. .
  • any reference to Lactobacillus crispatus IP174178 will target this strain as well as any strain of L. crispatus having the same characteristics.
  • This new strain IP174178 has the following structural characteristics: - it grows under aerobic-anaerobic conditions;
  • Lactobacillus crispatus strain IP174178 has resistance to acidic pH.
  • strain Lactobacillus crispatus IP174178 exhibits resistance to bile and acidic pH.
  • strain Lactobacillus crispatus IP174178 exhibits resistance to bile and acidic pH, and is capable of metabolizing glycogen.
  • the invention also relates to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising at least 10 9 CFU of this strain Lactobacillus crispatus IP174178, alone or in combination with other probiotic strains or other active ingredients.
  • the invention also relates to the use of this strain IP174178 for the prevention and treatment of genital and urogenital infections, recidivating or not.
  • the present invention relates to a new isolated strain Lactobacillus crispatus identified IP174178, ef filed with the CNCM under accession number I-4646, and to any isolated strain of L. crispatus having the same characteristics as this isolated strain.
  • lactobacilli refers to all lactobacilli bacteria, gram-positive, immobile bacteria of varying shapes and sizes, and facultative anaerobes. Most lactobacilli convert lactose and other simple sugars into lactic acid. They are found in the vagina and the gastrointestinal tract and are an important part of the intestinal and vaginal flora. The genus “Lactobacillus crispatus” is one of the predominant species of vaginal flora in Europe, the United States and Japan (Antonio, MAD et al., 1999).
  • the isolated strain Lactobacillus crispatus IP174178 has the following functional characteristics:
  • the ability to withstand acidic pH is a very interesting characteristic, because it allows the strain according to the invention on the one hand to withstand gastric pH if it is administered orally, on the other hand to reproduce in the female genital tract even in cases of abnormally acidic secretions.
  • the invention also relates to a pharmaceutical composition comprising the strain Lactobacillus crispatus IP174178.
  • the number of bacteria per gram of composition is preferably greater than 10 8 , and is in particular between 10 8 and 10 10 .
  • the composition comprises at least 10 9 CFU of the Lactobacillus crispatus strain.
  • CFU means "Colony Forming Unit” and is the unit of measurement generally recognized by those skilled in the art for quantifying bacteria capable of founding a colony.
  • the Lactobacillus crispatus strain is in lyophilized form.
  • the strain may be the only freeze-dried element of the composition, but preferably the strain is lyophilized in a medium comprising additional components, which will be added before or after the lyophilization step.
  • the pharmaceutical composition further comprises a preservation matrix and / or excipients well known to those skilled in the art, and optionally other active ingredients having a complementary action.
  • the composition is in the form of a powder, which can be placed in a capsule, or which can be integrated into any kind of suitable vehicle such as a cream or a nutraceutical composition.
  • this composition may comprise the following active ingredients: hormones and / or anti-inflammatory agents and / or bactericidal agents and / or anti-fungal agents.
  • active ingredients hormones and / or anti-inflammatory agents and / or bactericidal agents and / or anti-fungal agents.
  • the composition comprises sodium thiosulfate, preferably in a concentration of at least 100 mg / gram of powder comprising between 10 8 and 10 0 CFU of Lactobacillus crispatus IP174178.
  • the following examples illustrate a composition called "Formulation A" which comprises 1 13 g / l of sodium thiosulfate before lyophilization, and finally 230 mg of sodium thiosulfate / g of powder.
  • the presence of sodium thiosulfate makes it possible to potentiate the presence of sodium thiosulfate. anti-pathogenic effect of strain IP174178 (see Table 6C).
  • composition according to the invention may also comprise other strains of
  • the pharmaceutical composition can be formulated for vaginal or oral administration.
  • the bacteria intended to be administered orally have been tested for their resistance to bile, their resistance to acidic pH and their capacity for growth in the presence of bile.
  • the strain IP174178 of the invention has these characteristics allowing it to be administered orally.
  • compositions for oral administration include tablets, capsules, powders, granules, solutions and oral suspensions.
  • compositions for vaginal administration include creams, capsules, as well as suppositories, ova and vaginal tampons.
  • composition according to the invention is in particular intended to be used in the treatment of genital and urogenital infections, such as vaginosis and candidiasis.
  • 'Vaginosis means an imbalance of the microbial flora of the vagina. It is characterized by the disappearance of lactobacilli and the multiplication of pathogenic germs as listed above.
  • Candidiasis is a vaginal infection caused by yeasts of the genus Candida. These infections are related to the presence of pathogens, particularly belonging to the family Candida albicans, Gardnerella vaginalis, mycoplasma or Mobiluncus.
  • Candida albicans is the most important and best known yeast species of the genus Candida. It causes fungal infections (candidiasis, also called candidiasis) mainly in the digestive and genital mucosa.
  • Gardnerella vaginalis is a bacterium presenting as pleomorphic rods or coccobacilli. It is a bacterium found frequently in cases of vaginosis (non-specific vaginitis), either as sole pathogen or in combination with other bacteria. It produces a perforating toxin that only affects human cells.
  • mycoplasmas refers to a family of more than 100 species of bacteria, which are insensitive to antibiotic families targeting cell walls (penicillin or beta-lactams).
  • Mycoplasma genitalium is responsible for genital and urogenital infections (urethritis, cervicitis, vaginitis, salpingitis) and sterility problems.
  • Mobiluncus is a gram positive, anaerobic bacterium, often found associated with Gardnerella vaginalis in bacterial vaginosis.
  • the invention also relates to a nutraceutical composition
  • a nutraceutical composition comprising the strain Lactobacillus crispatus IP174178, or a strain having similar characteristics.
  • Such a nutraceutical composition will be in the form of a food composition or a food supplement.
  • a food composition will be composed of the strain Lactobacillus crispatus IP174178, preferably lyophilized, mixed with food products such as dairy products, fats, cereal products, confectionery, beverages.
  • the dietary supplement may in particular be in the form of capsules or soft capsules made of gelatin or plant material, in the context of the present invention.
  • the invention also relates to a medical device comprising one of the compositions as described above, this medical device can be in particular a vaginal tampon, a spatula, a sanitary napkin, a soap for personal use, etc.
  • the invention also relates to the use of the isolated strain Lactobacillus crispatus IP174178 for the prevention and treatment of genital and urogenital infections such as vaginosis and candidiasis.
  • the modes of administration, the dosages and the optimal dosage forms of the compositions according to the invention can be determined according to the criteria generally taken. in the establishment of a pharmaceutical treatment adapted to a patient, such as age or body weight of the patient, the severity of his general condition, tolerance to treatment, side effects noted.
  • the isolated strain Lactobacillus crispatus IP174178 will be used both for topical (vaginal) administration and oral administration, both types of administration being considered alone or in combination.
  • the isolated strain Lactobacillus crispatus IP174178 is used to maintain a beneficial vaginal flora in a non-infected woman.
  • the isolated strain Lactobacillus crispatus IP174178 is used for the restoration of a beneficial vaginal flora following antibiotic treatment.
  • the invention thus relates to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising the isolated strain Lactobacillus crispatus IP174178, for its use in maintaining or restoring a beneficial vaginal flora.
  • Figure 1 Graphical representation as a dendrogram of the comparison of genotypic profiles by rep-PCR.
  • Figure 2 Graphical representation as a similarity matrix of the comparison of genotypic profiles by rep-PCR.
  • Figure 3 Adhesion test of the strain IP174178 to vaginal epithelial cells.
  • H 2 0 2 Eight tests were applied to 10 strains isolated from healthy women, and preselected for their ability to produce hydrogen peroxide (H 2 0 2 ). These tests are: growth in MRS medium (Man JC et al., 1960) modified, the ability to produce ⁇ 2 0 2 , the ability to produce lactic acid, adhesion to cells of the vaginal line, the ability to inhibit certain genital pathogens (inhibited disks method) and resistance to metronidazole.
  • biochemical profiles are obtained from the VITEK II compact equipment (Biomérieux) which is an automaton for the bacterial identification by comparison of the fermentation capacities of specific sugars. We obtain the following biochemical profile: 1 1033303414010.
  • the genotypic profile of the strain IP174178 was established on the DIVERSILAB equipment (Biomérieux). It corresponds to the amplification of the DNA within non-coding repetitive sequences of the genome. The arrangement and the size of these fragments are unique for each strain and thus make it possible to establish unique profiles for each one of them: see figure 1.
  • strain IP174178 is able to grow on glycogen alone, which is advantageous for its implantation in the vaginal mucosa, and has a high production rate of H 2 0 2 and lactic acid.
  • the strain IP174178 is cultured in the following culture medium:
  • the culture is agitated strongly to break the curd and the following lyophilization adjuvants are added: 1 10 g / l of milk, 101.5 g / l FOS, 9.5 ml / l of sodium glutamate, 5.25 g / l ascorbic acid, 13 g / l sodium thiosulfate.
  • Freeze-drying is then carried out according to the standard conditions well known to those skilled in the art: the bacteria are distributed aseptically in stainless steel trays, are frozen rapidly at -40 ° C. and then subjected to a sublimation operation at -22 ° C. vs. Steaming at 37 ° C. is then carried out. The resulting product is then milled and sieved under a controlled atmosphere.
  • the powder obtained can be advantageously mixed with 1% magnesium stearate in order to facilitate the filling of the capsules / capsules.
  • the powder thus obtained is distributed in capsules of size No. 0 at a rate of 350 mg of powder per capsule.
  • strain identified as IP174178 alone or in Formulation A as shown in Example 5 were tested in parallel to determine their functional characteristics.
  • the term "pure strain” or “strain alone” or “strain IP174178” is understood to mean the strain IP174178 without any adjuvant, and in particular without the compounds of Formulation A, resulting from colonies isolated on agar after preservation in a cryotube. in a classic conservation environment. Antimicrobial activities
  • the lactic acid bacteria are cultured in an MRS medium supplemented with vitamin B12, peroxidase and tetramethylbenzidine. After incubation for 48 hours in anaerobiosis, the dishes are placed in contact with the ambient oxygen and the colonies producing hydrogen peroxide blue quickly.
  • the strain uses, almost equivalently, with both glucose and glycogen, metabolic pathways for the synthesis of D- and L-lactates. Since glycogen is one of the main sources of carbon in a vaginal environment, this strain possesses the properties necessary for the production of lactic acid in vivo.
  • the culture broth of the test is a homogeneous mixture of the culture medium of the pathogen and the culture medium of the probiotic.
  • Candida albicans Sabouraud broth culture - 0.3 ml in 30 ml at 37 ° C for 48h.
  • Formulation A Place 0.35 g of Formulation A powder in 10 ml of MRS broth in an oven at 37 ° C. for 48 hours.
  • Pure strain IP174178 0.2 ml of pure strain, isolated from colonies isolated on agar, previously stored in a cryotube in a preservation medium, is placed in 10 ml of MRS broth in an oven at 37 ° C. for 48 hours. Preparation of the Candida control:
  • Formulation A1 and Formulation A2 were prepared as for Formulation A, except Formulation A1 does not contain sodium thiosulfate and Formulation A2 contains only 50 g / liter. Inhibition of growth of C. albicans was measured in all three cases. Decrease in loc 10
  • results are expressed as the decimal logarithmic decrease (Iog10) in the number of CFU between the count at T0 and the different sampling points (T4h, T24h and T28h).
  • the gastric pH varies between 2.5 and 5.
  • the resistance of the strain IP174178, alone or in the formulation A, was tested in media at pH 2.5, 3 and 4. The results are expressed as a decrease in the amount of bacteria over time.
  • Bile resistance was also tested over time (60, 120, 180 and 240 minutes) in the presence of 3% bile. The results are expressed by comparing the amount of surviving bacteria in the control medium without bile, and in the medium comprising 3% of bile.
  • IP174178 IP174178

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Description

NOUVELLE SOUCHE DE LACTOBACILLUS CRISPATUS
DOMAINE DE L'INVENTION
La présente invention concerne une nouvelle souche spécifique de Lactobacillus crispatus, isolée à partir d'échantillons tissulaires sains, et toute souche présentant les mêmes caractéristiques, ainsi que des compositions les comprenant.
Chez une femme saine, la flore urogénitale comprend près de 50 espèces différentes de microorganismes. Parmi ces microorganismes, 95% de la population sont constitués de diverses souches de lactobacilles, dont le « bacille de Dôderlein ». Ces lactobacilles jouent un rôle de protection contre les pathogènes par divers mécanismes : production de peroxyde d'hydrogène, production d'acide lactique, production de bactériocines, inhibition de l'adhésion et de l'expansion des pathogènes. En particulier, ces lactobacilles maintiennent un pH acide par la production d'acide lactique à partir du glycogène présent dans le mucus vaginal. Ainsi, la croissance de nombreux pathogènes de la flore vaginale, tels que Gardnerella vaginalis, Prevotella bivia, Neisseria gonorrhoeae, les mycoplasmes, Mobiluncus et surtout Candida albicans, est inhibée.
La flore vaginale normale est ainsi principalement composée de lactobacilles formant un biofîlm protecteur à la surface de la muqueuse. Les lactobacilles les plus fréquemment observés dans le vagin sont notamment Lactobacillus crispatus, Lactobacillus jensenii, Lactobacillus vaginalis, Lactobacillus iners et Lactobacillus gasseri.
La candidose vulvovaginale touche 70-75% des femmes en période d'activité génitale au moins une fois dans leur vie ; environ 40-50% d'entre elles présenteront un deuxième épisode. L'incidence de la candidose vulvovaginale récidivante (définie par la survenue d'au moins 4 épisodes par an, dont deux prouvés par l'examen mycologique) a été estimée à 5- 8%. Cette affection bénigne a un impact très négatif sur la qualité de vie des patientes et engendre des dépenses de santé importantes. Traiter une telle pathologie est difficile du fait de la pathogénèse multifactorielle de cette affection.
Le traitement d'entretien traditionnel par antifongique oral ou vaginal doit être de 6 mois au moins, mais le taux de rechutes reste élevé avec 60-70% des femmes présentant une récidive dans les deux mois suivant l'arrêt du traitement. De plus, les effets secondaires des antifongiques sont fréquents et leur utilisation au long cours peut favoriser la survenue d'une vaginose bactérienne.
La vaginose bactérienne est due à un déséquilibre qualitatif et quantitatif de la flore vaginale normale pouvant aboutir à une disparition quasi complète des lactobacilles au profit de la flore anaérobie et aussi à l'émergence de germes tels que Gardnerella vaginalis et Atopobium vaginae impliqués dans la vaginose bactérienne.
La vaginose bactérienne est une des infections vaginales les plus fréquentes avec un taux de fréquence de 10 à 15. Cette pathologie bénigne chez la femme peut être grave pendant la grossesse, car pouvant entraîner un accouchement prématuré, des petits poids de naissance, ainsi que des avortements spontanés.
La vaginose bactérienne ainsi que les autres déséquilibres de la microflore vaginale sont communément traités par antibiothérapie. Ce traitement présente les inconvénients habituels des traitements antibiotiques et s'avère de moins en moins efficace. En outre, il vise à éliminer la flore pathogène mais détruit également la flore normale bénéfique.
ETAT DE LA TECHNIQUE
L'administration de lactobacilles bénéfiques, par voie orale ou vaginale, a été décrite pour promouvoir la santé vaginale et pour traiter les infections génitales. En particulier, les demandes de brevet WO 84/04675, WO 2000/035465, US 2002/0044926 et WO 2006/045475 décrivent l'administration par voie orale ou vaginale de bactéries lactiques pour promouvoir la santé vaginale et pour prévenir les récidives de la candidose vulvovaginale.
Les lactobacilles préférés sont Lactobacillus rhamnosus et le bacille de Dôderlein (Lactobacillus acidophilus vaginalis). Les brevets US 6.093.394, US 6.468.526 et US 7.807.440, ainsi que la demande de brevet US 2010/0151026, décrivent l'administration de souches spécifiques de Lactobacillus crispatus.
Parmi ces souches, on pourra citer les souches de Lactobacillus crispatus suivantes : - Les souches de Lactobacillus crispatus déposées auprès de la DSMZ (Allemagne) sous les numéros de dépôt DSM 16735, 16736, 16738, 16739, 16740, 16741 ,
16742 et 16743, telles que décrites dans la demande de brevet EP 1 824 500 ;ces souches sont capables de coloniser les muqueuses vaginales, et ainsi de favoriser la santé vaginale ; elles ont également de bonnes propriétés d'adhésion aux cellules épithéliales ;
- Les souches de Lactobacillus crispatus déposées auprès de la CNCM (France) sous les numéros de dépôt I-3483, I-3484 et I-3486, telles que décrites dans la demande de brevet EP 1 812 023 ; ces souches ont été sélectionnées pour leur capacité d'adhérence aux cellules épithéliales ; elles présentent une bonne résistance aux pH acides de l'environnement gastrique, ainsi qu'un effet anti- pathogène avéré ; - La souche de Lactobacillus crispatus déposée auprès de la BCCM/LMG (Belgique) sous le numéro de dépôt P-20558 telle que décrite dans le brevet EP 1 427 808 B1 ; cette souche est utilisée en combinaison avec d'autres souches lactiques, pour être administrée à l'aide d'un tampon, cette souche présentant la capacité de pouvoir coloniser la cavité vaginale, y compris pendant la menstruation ; et
- La souche de Lactobacillus crispatus déposée auprès de l'ATCC (USA) sous le numéro de dépôt 202225, telle que décrite dans le brevet EP 1 01 1 721 B1 ; cette souche présente une bonne adhérence aux cellules épithéliales, une viabilité de longue durée, notamment en présence de la matrice de conservation décrite dans ce document, ainsi qu'une bonne production d'acide lactique et de H202.
La souche de Lactobacillus crispatus P-17631 telle que décrite dans la demande de brevet EP 949 330 est capable de fermenter le glycogène, et d'inhiber la croissance des Candida.
La plupart de ces souches probiotiques, isolées à partir de prélèvements vaginaux de femmes saines, ne sont pas capables de survivre dans un milieu présentant un pH acide, ni de survivre à un contact prolongé avec de la bile.
Le pH vaginal est un paramètre qui varie de manière significative durant la vie de la femme : le pH physiologique est de 7 chez les filles prépubères, descend jusqu'à 3,8 chez les femmes pubères, et est supérieur à 5,5 pendant la ménopause, en absence de traitement substitutif hormonal. Ces variations sont liées à de multiples facteurs tels que la présence d'oestrogènes et la colonisation par les lactobacilles.
Il est donc important pour les souches probiotiques administrées de façon exogène de pouvoir résister aux pH acides physiologiques de la cavité vaginale, et de plus de pouvoir résister au pH de la cavité gastrique lors d'une administration par voie orale.
Par ailleurs, nombre de ces souches ne sont pas capables d'utiliser le glycogène comme source de carbone fermentable (Martin R. et al., 2008). Or, cette propriété est avantageuse, car il est fréquent que la muqueuse vaginale soit dépourvue de glucose, et le maintien de la production d'acide lactique par la souche probiotique ne peut se faire qu'en présence d'une source de carbone fermentable.
EXPOSE DE L'INVENTION
La présente invention est relative à une nouvelle souche isolée de Lactobacillus crispatus, identifiée IP174178, déposée à la CNCM en date du 22 Juin 2012 sous le numéro d'accès CNCM I-4646, et à toute souche de L. crispatus présentant les mêmes caractéristiques. Dans la suite de la présente description, toute référence à Lactobacillus crispatus IP174178 visera aussi bien cette souche que toute souche de L. crispatus ayant les mêmes caractéristiques.
Cette nouvelle souche IP174178 présente les caractéristiques structurelles suivantes : - elle pousse en conditions aérobie-anaérobie;
- son profil rep-PCR est présenté en figure 1 ;
la séquence de son ADN ribosomal 16S est présentée en SEQ ID N°1.
Ses caractéristiques fonctionnelles principales sont :
- son fort taux de production de H202 et d'acide lactique (plus de 7 g/litre) ;
- sa capacité à croître sur du glycogène comme seul substrat carboné ;
- sa résistance à la bile ;
- sa résistance à des pH acides (notamment à des pH compris entre 2,5 et 4) ;
- sa capacité à inhiber le développement de pathogènes de la zone urogénitale.
La souche Lactobacillus crispatus IP174178 présente en particulier une résistance aux pH acides.
Plus particulièrement, la souche Lactobacillus crispatus IP174178 présente une résistance à la bile et aux pH acides.
Plus particulièrement, la souche Lactobacillus crispatus IP174178 présente une résistance à la bile et aux pH acides, et est capable de métaboliser le glycogène.
L'invention est également relative à une composition pharmaceutique comprenant au moins 109 UFC de cette souche Lactobacillus crispatus IP174178, seule ou en combinaison avec d'autres souches probiotiques ou d'autres principes actifs.
L'invention est également relative à l'utilisation de cette souche IP174178 pour la prévention et le traitement d'infections génitales et urogénitales, récidivantes ou non.
DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION
La présente invention est relative à une nouvelle souche isolée Lactobacillus crispatus identifiée IP174178, ef déposée à la CNCM sous le numéro d'accès I-4646, et à toute souche isolée de L. crispatus présentant les mêmes caractéristiques que cette souche isolée.
Le terme «lactobacilles » désigne l'ensemble des bactéries lactobacilles, bactéries à gram positif, immobiles, de formes et dimensions variables, et anaérobies facultatives. La plupart des lactobacilles convertissent le lactose et d'autres sucres simples en acide lactique. On les trouve dans le vagin et le tractus gastro-intestinal et ils constituent un élément important de la flore intestinale et vaginale. Le genre « Lactobacillus crispatus » est une des espèces prédominantes de la flore vaginale en Europe, aux Etats-Unis et au Japon (Antonio, MAD et al., 1999).
La souche isolée Lactobacillus crispatus IP174178 présente les caractéristiques fonctionnelles suivantes :
- Forte production d'H202 et d'acide lactique (plus de 7 g/litre);
- Capacité à croître sur du glycogène, substrat endogène sécrété par la muqueuse vaginale ;
Résistance aux pH acides ainsi qu'à la bile ;
- Capacité à inhiber le développement de pathogènes ;
- Adhésion aux cellules épithéliales vaginales.
Cette capacité à croître sur du glycogène est relativement rare, et revêt un intérêt particulier pour des souches destinées à se développer dans le tractus génital, où le glucose est souvent absent, et où la seule source de carbone est le glycogène. La production d'acide lactique par cette souche est donc maintenue même en absence de glucose (voir tableau 5).
La capacité à résister à des pH acides est une caractéristique très intéressante, car elle permet à la souche selon l'invention d'une part de résister au pH gastrique si celle-ci est administrée par voie orale, d'autre part de se reproduire dans le tractus génital féminin même en cas de sécrétions anormalement acides.
La capacité à résister à la bile permet d'envisager une administration de cette souche par voie orale, et non uniquement en administration vaginale.
L'invention est également relative à une composition pharmaceutique comprenant la souche Lactobacillus crispatus IP174178.
Dans la composition selon l'invention, le nombre de bactéries par gramme de composition est de préférence supérieur à 108, et est notamment compris entre 108 et 1010. Selon un aspect particulier de l'invention, la composition comprend au moins 109 UFC de la souche de Lactobacillus crispatus. Le terme « UFC » signifie « Unité Formant Colonie » et est l'unité de mesure généralement reconnue par l'homme du métier pour quantifier les bactéries capables de fonder une colonie.
De préférence, la souche de Lactobacillus crispatus est sous forme lyophilisée. La souche peut être le seul élément lyophilisé de la composition, mais de préférence la souche est lyophilisée dans un milieu comprenant des constituants additionnels, qui seront ajoutés avant ou après l'étape de lyophilisation.
Selon un autre aspect particulier de l'invention, la composition pharmaceutique comprend de plus une matrice de conservation et/ou des excipients bien connus de l'homme du métier, et optionnellement d'autres principes actifs ayant une action complémentaire. Selon un aspect particulier de l'invention, la composition est sous forme de poudre, qui peut être placée dans une capsule, ou qui peut être intégrée à toute sorte de véhicule approprié tel qu'une crème ou une composition nutraceutique.
En particulier, cette composition peut comprendre les principes actifs suivants : des hormones et/ou des agents anti-inflammatoires et/ou des agents bactéricides et/ou des agents anti-fongiques. L'homme du métier saura déterminer quels sont les principes actifs qui peuvent être avantageusement couplés à la souche Lactobacillus crispatus IP174178.
Selon un aspect préféré de l'invention, la composition comprend du thiosulfate de sodium, de préférence dans une concentration d'au moins 100 mg/gramme de poudre comprenant entre 108 et 10 0 UFC de Lactobacillus crispatus IP174178. Les exemples ci- après illustrent une composition dénommée « Formulation A » qui comprend 1 13 g/l de thiosulfate de sodium avant lyophilisation, et au final 230 mg de thiosulfate de sodium/g de poudre La présence de thiosulfate de sodium permet de potentialiser l'effet anti-pathogène de la souche IP174178 (voir tableau 6C).
La composition selon l'invention peut également comprendre d'autres souches de
Lactobacillus.
Selon l'invention, la composition pharmaceutique peut être formulée pour une administration par voie vaginale ou par voie orale. En particulier, les bactéries destinées à être administrées par voie orale ont été testées pour leur résistance à la bile, leur résistance aux pH acides et pour leur capacité de croissance en présence de bile. La souche IP174178 de l'invention présente ces caractéristiques lui permettant d'être administrée par voie orale.
Pour des compositions pharmaceutiques pour administration orale, les formulations appropriées sont notamment les comprimés, les gélules, les poudres, les granules, les solutions et les suspensions orales.
Pour des compositions pharmaceutiques pour administration vaginale, les formulations appropriées sont notamment les crèmes, les gélules, ainsi que les suppositoires, ovules et tampons vaginaux.
La composition selon l'invention est en particulier destinée à être utilisée dans le traitement d'infections génitales et urogénitales, telles que les vaginoses et les candidoses.
On entend par 'vaginose' un déséquilibre de la flore microbienne du vagin. Elle se caractérise par la disparition des lactobacilles et la multiplication de germes pathogènes tels que listés ci-dessus.
On entend par 'candidose' une infection vaginale causée par des levures du genre Candida. Ces infections sont liées à la présence de pathogènes, en particulier appartenant à la famille des Candida albicans, des Gardnerella vaginalis, des mycoplasmes ou des Mobiluncus.
Candida albicans est l'espèce de levure la plus importante et la plus connue du genre Candida. Elle provoque des infections fongiques (candidose, aussi appelée candidiase) essentiellement au niveau des muqueuses digestives et génitales.
Gardnerella vaginalis est une bactérie se présentant comme des bâtonnets pléomorphes ou des coccobacilles. C'est une bactérie retrouvée fréquemment en cas de vaginose (vaginite non spécifique), soit comme seul germe pathogène soit en association avec d'autres bactéries. Elle produit une toxine perforante qui n'affecte que les cellules humaines.
Le terme mycoplasmes désigne une famille de plus de 100 espèces de bactéries, qui sont insensibles aux familles antibiotiques ciblant les parois cellulaires (pénicilline ou bêta- lactames). En particulier, Mycoplasma genitalium est responsable d'infections génitales et urogénitales (urétrite, cervicite, vaginite, salpingite) et de problèmes de stérilité.
Mobiluncus est une bactérie gram positive, anaérobie, souvent retrouvée associée à Gardnerella vaginalis dans des vaginoses bactériennes.
L'invention est également relative à une composition nutraceutique comprenant la souche Lactobacillus crispatus IP174178, ou une souche présentant des caractéristiques similaires. Une telle composition nutraceutique se présentera sous la forme d'une composition alimentaire ou d'un complément alimentaire.
Une composition alimentaire sera composée de la souche Lactobacillus crispatus IP174178, lyophilisée de préférence, mélangée à des produits alimentaires tels que des produits laitiers, des matières grasses, des produits à base de céréales, des confiseries, des boissons.
Le complément alimentaire peut en particulier se présenter sous forme de gélules ou de capsules molles en gélatine ou matière végétale, dans le cadre de la présente invention.
L'invention se rapporte également à un dispositif médical comprenant l'une des compositions telles que décrites ci-dessus, ce dispositif médical pouvant être en particulier un tampon vaginal, une spatule, une serviette hygiénique, un savon à usage intime, etc.
L'invention se rapporte également à l'utilisation de la souche isolée Lactobacillus crispatus IP174178, pour la prévention et le traitement d'infections génitales et urogénitales telles que les vaginoses et les candidoses.
Les modes d'administration, les posologies et les formes galéniques optimales des compositions selon l'invention peuvent être déterminés selon les critères généralement pris en compte dans l'établissement d'un traitement pharmaceutique adapté à un patient, comme par exemple l'âge ou le poids corporel du patient, la gravité de son état général, la tolérance au traitement, les effets secondaires constatés. La souche isolée Lactobacillus crispatus IP174178 sera utilisée à la fois en administration locale (vaginale) ou en administration orale, les deux types d'administration étant envisagés seuls ou en combinaison.
Selon un autre aspect de l'invention, la souche isolée Lactobacillus crispatus IP174178 est utilisée pour maintenir une flore vaginale bénéfique chez une femme ne présentant pas d'infections.
Selon encore un autre aspect de l'invention, la souche isolée Lactobacillus crispatus IP174178 est utilisée pour la restauration d'une flore vaginale bénéfique suite à un traitement antibiotique.
L'invention se rapporte donc à une composition pharmaceutique comprenant la souche isolée Lactobacillus crispatus IP174178, pour son utilisation dans le maintien ou la restauration d'une flore vaginale bénéfique.
DESCRIPTION DES FIGURES
Figure 1 : Représentation graphique sous forme de dendrogramme de la comparaison des profils génotypiques par rep-PCR.
Figure 2 : Représentation graphique sous forme de matrice de similarité de la comparaison des profils génotypiques par rep-PCR.
Figure 3 : Test d'adhérence de la souche IP174178 à des cellules épithéliales vaginales.
EXEMPLES
Exemple 1 - isolement et sélection de la souche L. crispatus IP174178
Sept tests ont été appliqués à 10 souches isolées à partir de femmes saines, et présélectionnées pour leur capacité à produire du peroxyde d'hydrogène (H202). Ces tests sont : la croissance en milieu MRS (Man JC et al., 1960) modifié, la capacité à produire de ΓΗ202, la capacité à produire de l'acide lactique, l'adhésion à des cellules de lignée vaginale, la capacité à inhiber certains pathogènes génitaux (méthode des disques inhibés) et la résistance au métronidazole. A la suite de ces premiers tests, trois souches identifiées comme particulièrement intéressantes, notamment pour leur importante production d'H202 et d'acide lactique, ont fait l'objet d'un test de croissance en présence de glycogène, la souche IP174178 ayant seule la capacité d'utiliser le glycogène comme source de carbone, qui est un substrat endogène sécrété par la muqueuse vaginale. Cette souche présente par ailleurs la meilleure croissance en présence de bile.
Les résultats obtenus sont les suivants : Tableau 1 - Dernier test de sélection de la souche IP174178
Figure imgf000010_0001
Exemple 2- Profil biochimique
Les profils biochimiques sont obtenus à partir de l'équipement VITEK II compact (Biomérieux) qui est un automate pour l'identification bactérienne par comparaison des capacités de fermentation de sucres spécifiques. Nous obtenons le profil biochimique suivant : 1 1033303414010.
Tableau 2. Profil biochimique de la souche IP174178
Détails biochimiques
2 APPA + 4 dGAL - 5 ODC - 8 Phe A + 7 ARG 8 PVATE -
9 BGAL - 10 PYRA - 1 1 SUCT 12 TyrA + 13 îGLU 17 BGLU -
18 ci MAL + 19 d AN + 21 BXYL 22 0/129 R 23 ProA + 26 LiP -
2? AMAN 30 dMLZ - 31 URE 33 SAC + 35 dTRE + 36 CiT -
37 BGURi - 40 ILATk - 41 AGLU + 43 dSOR + 44 AGAL - 46 GlyA
4? dMLT - 50 d IB - 51 TE + 52 IGLM 53 OPS <+) 54 BdFUC
56 CMT + 59 2 KG - 61 ESC - 62 ELLM 64 CJXYL Exemple 3- Profil génotypique
Le profil génotypique de la souche IP174178 a été établi sur l'équipement DIVERSILAB (Biomérieux). Il correspond à l'amplification de l'ADN au sein de séquences répétitives non codantes du génome. La disposition et la taille de ces fragments sont uniques pour chaque souche et permettent ainsi d'établir des profils uniques pour chacune d'entre elles : voir figure 1.
Nous avons alors comparé ce profil rep-PCR à celui de 26 souches de Lactobacillus crispatus dont 1 1 souches conservées à l'Institut Pasteur afin de s'assurer du caractère unique de la souche (cf. figure 2). La souche IP174178 comporte à chaque fois des différences fortes, preuve de son unicité.
De plus, la souche IP174178 est capable de croître sur du glycogène seul, ce qui présente un avantage pour son implantation dans la muqueuse vaginale, et présente un fort taux de production d'H202 et d'acide lactique.
Exemple 4- Séquençage et identification d'oligonucléotides spécifiques
Le séquençage de la souche IP174178 a été réalisé par la technique 454 ROCHE. Suite à ce travail, une annotation a été réalisée. Au final, 1982 gènes codant pour des protéines ont été identifiés.
Tableau 3. Gènes annotés dans la souche IP174178
Figure imgf000011_0001
L'opération de séquençage a permis de mener un travail complémentaire de biologie moléculaire sur la souche afin de lui définir des couples d'amorces PCR spécifiques. Au final trois amorces PCR ont été retenues et sont spécifiques à la souche lors d'une amplification comprenant 30 cycles. Ces amorces permettent d'identifier aisément et de façon très spécifique la souche de L. crispatus IP174178 dans un échantillon biologique, par exemple.
Tableau 4. Séquences des amorces PCR spécifiques de la souche IP174178
Figure imgf000012_0001
Exemple 5- Préparation de la « formulation A »
La souche IP174178 est cultivée dans le milieu de culture suivant :
1 16 g/l de lait, 15 g/l de dextrose, 10 g/l d'autolysat de levure, 2 ml/l de Tween. Après inoculation du milieu de culture, la fermentation est maintenue à une température de 37°C par un dispositif thermostaté approprié pendant 48 à 72 heures. En fin de fermentation, la culture, ayant atteint une numération supérieure ou égale à 108 UFC/ml, est versée dans une cuve de mélange. La culture est agitée fortement pour briser le caillé et les adjuvants de lyophilisation suivants sont ajoutés : 1 10 g/l de lait, 101 ,5 g/l FOS, 9,5 ml/l glutamate de sodium, 5,25 g/l acide ascorbique, 1 13 g/l thiosulfate de sodium.
La lyophilisation est ensuite réalisée selon les conditions classiques bien connues de l'homme du métier : les bactéries sont réparties aseptiquement dans des plateaux en acier inoxydable, sont congelées rapidement à -40°C, puis soumises à une opération de sublimation à -22°C. Un étuvage à 37°C est ensuite réalisé. Le produit résultant est ensuite broyé et tamisé sous atmosphère contrôlée. La poudre obtenue peut être avantageusement mélangée avec 1 % de stéarate de magnésium afin de faciliter le remplissage des capsules / gélules. La poudre ainsi obtenue est répartie dans des gélules de taille n° 0 à raison de 350 mg de poudre par gélule.
Exemple 6 - Caractéristiques fonctionnelles de la souche IP174178 et de la 'formulation A'
La souche identifiée IP174178 seule ou dans sa 'formulation A' telle que présentée dans l'exemple 5 ont été testées en parallèle pour déterminer leurs caractéristiques fonctionnelles. Dans la suite des exemples, on entend par 'souche pure' ou 'souche seule' ou 'souche IP174178' la souche IP174178 sans aucun adjuvant, et notamment sans les composés de la Formulation A, issue de colonies isolées sur gélose après conservation en cryotube dans un milieu de conservation classique. Activités antimicrobiennes
Mise en évidence de la production de peroxyde d'hydrogène :
Les bactéries lactiques sont mises en culture dans un milieu MRS gélosé additionné de vitamine B12, de peroxydase et de tétraméthylbenzidine. Après incubation pendant 48h en anaérobiose, les boîtes sont mises en contact avec l'oxygène ambiant et les colonies produisant du peroxyde d'hydrogène bleuissent rapidement. Une échelle arbitraire de 0 à 5, permet de noter l'intensité de la production d'H202.
Tableau 5. Caractéristiques fonctionnelles de la souche IP174178
Production d'acide lactique en g/litre
Production H202
Glucose source Glycogen source
D-LACT: 3,69 D-LACT: 3,91
Formulation A 5
L-LACT: 4,88 L-LACT: 4,74
D-LACT: 5,90 D-LACT: 5,65
Souche IP174178 5
L-LACT: 3, 10 L-LACT: 3,16 Les résultats rapportés ci-dessus illustrent que :
• La production de peroxyde d'hydrogène est maximale selon l'échelle arbitraire utilisée ;
• La souche utilise de façon quasi-équivalente, aussi bien avec du glucose que du glycogène, les voies métaboliques permettant la synthèse des D-et L-lactates. Or le glycogène étant une des principales sources de carbone en milieu vaginal, cette souche possède les propriétés nécessaires à la production d'acide lactique in vivo.
Inhibition de la croissance de C. albicans et de G. vaginalis
Objectif : Evaluer la capacité de souches de lactobacilles à inhiber la croissance d'une souche pathogène : Candida albicans ; le même protocole est appliqué pour G. vaginalis, adapté à ce pathogène. Descriptif du protocole :
Suivre la croissance des pathogènes seuls et en présence d'une culture d'une souche de lactobacille avec détermination du titre de T0 à T28h.
Milieux de culture utilisés pour préparation des inocula et la lecture des titres :
- bouillon Sabouraud et gélose Sabouraud pour Candida albicans (à 37°C)
- bouillon/gélose de MRS pour les souches de Lactobacilles.
Le bouillon de culture de l'essai est un mélange homogène du milieu de culture du pathogène et du milieu de culture du probiotique.
Préparation de l'essai :
Préparation des inocula :
Candida albicans: culture sur bouillon Sabouraud - 0,3 ml dans 30 ml à 37°C pendant 48h.
- Souche probiotique :
• Formulation A : on place 0,35g de poudre de Formulation A dans 10 ml de bouillon MRS - à l'étuve à 37°C pendant 48h.
• souche pure IP174178 : 0,2 ml de souche pure, issue de colonies isolées sur gélose, préalablement conservée en cryotube dans un milieu de conservation, est placée dans 10 ml de bouillon MRS - à l'étuve à 37°C pendant 48h. Préparation du témoin Candida :
Pour la fabrication du témoin Candida, on place 5 ml de bouillon Sabouraud inoculé avec la souche pathogène (titre proche de 1 ,108 UFC/ml) et 5 ml de bouillon MRS non inoculé.
Mise en contact des inocula :
Placer 5 ml de la souche pathogène avec 5 ml de la souche selon l'invention dans différentes configurations.
On réalise les prélèvements et les déterminations du titre à T0, T4h, T24h et T28h. Les résultats sont exprimés en UFC / ml. La concentration en UFC à T0 n'est certes pas la même dans les trois cas comparés (cela tient aux conditions de travail) mais les valeurs au T0 sont du même ordre de grandeur, de sorte que la différence est sans effet sur le résultat.
Tableau 6A. Inhibition Candida albicans
Figure imgf000015_0001
Tableau 6B. Inhibition Gardnerella vaginalis
Figure imgf000015_0002
Tableau 6C- Inhibition Candida albicans - influence de la concentration en thiosulfate de sodium dans la formulation de la souche IP174-178
Il a été préparé une Formulation A1 et une Formulation A2 en procédant comme pour la Formulation A, à cela près que la Formulation A1 ne contient pas de thiosulfate de sodium et que la Formulation A2 n'en contient que 50 g/l. L'inhibition de la croissance de C. albicans a été mesurée dans les trois cas. Diminution en loc 10
4h 24h 28h
Formulation A 1 (0 g/1 thiosulfate) 0 1 2
Formulation A2 (50 g/1 thiosulfate) 0 3 3
Formulation A (113 g/1 thiosulfate) 0 6 7
Dans ce tableau, les résultats sont exprimés comme la diminution logarithmique décimale (Iog10) du nombre d'UFC entre la numération à T0 et aux différents points de prélèvement (T4h, T24h et T28h).
Les résultats présentés ci-dessus, dans les Tableaux 6A-6C, indiquent que :
• L'inhibition de la croissance du pathogène C. albicans est réelle dès 24h, que ce soit par la souche pure ou par la souche en Formulation A. Cependant seule la Formulation A permet d'atteindre une inhibition complète au bout de 24 heures. ;
• L'inhibition de la croissance du pathogène G. vaginalis est complète au bout de 24 heures de co-culture, en présence de la souche seule ou dans sa Formulation A ; l'inhibition de la croissance du pathogène est néanmoins plus rapide avec la souche dans sa Formulation A (dès 4h).
« La présence de thiosulfate de sodium dans la formulation A permet de potentialiser l'effet anti-pathogène de la souche IP 174178. En effet, plus la concentration de thiosulfate de sodium est importante, plus l'inhibition observée à 24h est forte.
Résistances gastriques
Suivant les individus et surtout le moment de la journée, le pH gastrique varie entre 2,5 et 5. La résistance de la souche IP174178, seule ou dans la formulation A, a été testée dans des milieux à pH=2,5, 3 et 4. Les résultats sont exprimés en diminution de la quantité de bactéries, au cours du temps. Tableau 7. Résistance de la souche seule ou dans sa formulation A, à des pH faibles Résistance à pH 2,5 Résistance à pH 3 Résistance à pH 4 Réduction en Log10 Réduction en Log 10 Réduction en Log 10
45 min 90 min 45 min 90 min 45 min 90 min
Formulation A -1 ,12 log -4,36 log -0,18 log -0,72 log -0,02 log -0,15 log
Souche
IP174178 -0,73 log -2,59 log -0,51 log -0,58 log -0,68 log -0,80 log
Les résultats montrent qu'au bout de 90 minutes, à pH=3 ou 4, la perte de bactéries est faible, de moins d'un logarithme 10. La résistance à pH=2,5 est plus faible, notamment lorsque la souche est utilisée dans sa formulation A.
La résistance à la bile a également été testée, au cours du temps (60, 120, 180 et 240 minutes), en présence de 3% de bile. Les résultats sont exprimés en comparant la quantité de bactéries survivantes dans le milieu témoin sans bile, et dans le milieu comportant 3% de bile.
Tableau 8. Résistance de la souche seule ou dans sa formulation A, à la présence de bile
Figure imgf000017_0001
Au bout de 240 minutes, soit 4 heures, la différence entre le témoin cultivé sans bile et le milieu avec bile est de moins d'un logarithme décimal, ce qui signifie que la croissance de la bactérie IP174178 est peu affectée par la présence de bile.
Résistance aux antibiotiques
Tableau 9. Résistance aux antibiotiques de la souche seule ou dans sa formulation A Souche Souche
Antibiotiques Formulation Antibiotiques Formulation
pure pure testés A testés A
IP174178 IP174178
Acide
Tétracycline Sensible Sensible Résistant Résistant
nalidixique
Colistine Résistant Résistant Erythromycine Sensible Sensible
Acide fusidique Résistant Résistant Polymyxine Résistant Résistant
Acide
Chloramphénicol Sensible Sensible Résistant Résistant
pipémidique
Clindamycine
Streptomycine Résistant Résistant Sensible Sensible
25Mg
Triméthoprim Clindamycine
Résistant Résistant Sensible Sensible sulfaméthoxazole
Métronidazole
Résistant Résistant
50Mg
Les gènes suivants, connus pour être impliqués dans la résistance aux antibiotiques listés dans la tableau 10 ci-dessous, ont été identifiés comme étant exprimés dans la souche L. crispatus :
Figure imgf000018_0001
Adhésion aux cellules épithéliales vaginales CRL-2616
Les résultats sont présentés en figure 3, et ne concernent que la souche seule IP174178. Au cours du temps, le pourcentage d'adhésion des bactéries IP174178 aux cellules CRL-2616 augmente et atteint 15% d'adhésion au bout de 3 heures, lorsque la multiplicité de l'infection est de 10 ou 1. REFERENCES DOCUMENTS BREVETS
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Claims

REVENDICATIONS
1. Souche isolée de Lactobacillus crispatus, identifiée IP174178 et déposée à la CNCM sous le numéro d'accès I-4646.
2. Composition pharmaceutique comprenant une souche selon la revendication 1.
3. Composition pharmaceutique selon la revendication 2, comprenant au moins 109 CFU de ladite souche.
4. Composition pharmaceutique selon l'une des revendications 2 ou 3, comprenant, en outre, une matrice de conservation et optionnellement d'autres principes actifs.
5. Composition pharmaceutique selon l'une quelconque des revendications 2 à 4, comprenant, en outre, du thiosulfate de sodium.
6. Composition pharmaceutique selon l'une quelconque des revendications 2 à 5, formulée pour une administration par voie vaginale ou par voie orale.
7. Composition selon l'une quelconque des revendications 2 à 6, pour son utilisation dans le traitement et la prévention d'infections génitales et urogénitales telles que les vaginoses et les candidoses.
8. Dispositif médical, notamment tampon vaginal, renfermant une composition selon la revendication 7.
9. Composition nutraceutique comprenant une souche selon la revendication 1.
10. Composition pharmaceutique selon l'une quelconque des revendications 2 à 6, pour son utilisation dans le maintien ou la restauration d'une flore vaginale bénéfique.
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