WO2014028997A1 - Peptídeo sintético pntx(19), composições farmacêuticas e uso - Google Patents

Peptídeo sintético pntx(19), composições farmacêuticas e uso Download PDF

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Paulo Sérgio LACERDA BEIRÃO
Fernanda SILVA TORRES
Adriano MONTEIRO DE CASTRO PIMENTA
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Definitions

  • the present invention relates to a 19 amino acid synthetic peptide called PnTx (19), constructed from the native toxin sequence PnTx2-6 of the Phoneutria nigriventer spider. It also relates to pharmaceutical compositions containing such a peptide and their use in treating erectile dysfunction and / or enhancing erectile function.
  • the Phoneutria nigriventer spider venom is rich in bioactive polypeptides with different pharmacological effects, acting mainly on ion channels and receptors.
  • the predominant symptoms caused by its venom result from general hyperexcitability.
  • PnTx2-6 potentiates erection in normotensive rats, restores erectile function in hypertensive animals (DOCA-salt) and also in diabetic mice or aged rats (for review see: NUNES, KP CARDOSO, F. L, CARDOSO-Jr., H.
  • Nitric Oxide Synthase NOS
  • NO Nitric Oxide
  • YONAMINE CM. Et al. Toxicon 44, 169- 172, 2004; NUNES et al., 2008, 2009
  • VILLANOVA FE, et al. Toxicon. 54 (6), 793-801 , 2009.
  • Nitric oxide (NO) a product of hydrolysis of L-arginine by nitric oxide synthase (NOS), is an essential mediator of the erection process [LEWIS, RW et al. A. Definitions, classification, and epidemiology of sexual dysfunction. In: sexual Medicine. Sexual Disfuntion in Men and Women, Lue, TF; Basson, R .; Rosen, R .; Giuliano, F .; Khoury, S .; Montorsi, F., (Publishers.) International for Sexual Medicine, Paris, p. 39-72, 2004].
  • GCs soluble guanylate cyclase
  • TODA cyclic guanosine monophosphate
  • TODA N. et al. Pharmacol. Ther. 106 (2), 233-266, 2005
  • PRIETO D. Int. J. Impot. Res. 20 (1) , 17-29, 2008.
  • cGMP cGMP induces a decrease in intracellular calcium levels, leading to the relaxation of smooth muscle cells with subsequent penile tumescence (TODA et al., 2005). Erection terminates due to hydrolysis of cGMP by the enzyme phosphodiesterase type 5 (PDE-5), forming GMP (IGNARRO, LJ et al. Biochem Biophys Res Commun., 170, 843-50, 1990; RAJFER, J. et al. N Engl. J. Med. 326 (2), 90-94, 1992; LEE, MRJ Biol. Chem. 272, 5063-5068, 1997; BIVALACQUA, TJet., Trends Pharmacol. Sci., 21 (12), 484. -489, 2000).
  • PDE-5 phosphodiesterase type 5
  • PDE-5 inhibitors such as sildenafil (Viagra), taladafil (Cialis®) and vardenafil (Levitra®) (MORELAND, RB et al. Trends Endocrinol. Metab. 10 (3) , 97-104, 1999, PRIVIERO, FB et al Acta Pharmacol, Sin 28 (6), 751-755, 2007; Milk, R. et al., Recent Pat. Cardiovasc. Drug Discov 2 (2), 19 -132, 2007).
  • PDE-5 inhibitors are not effective in treating patients with vascular diseases where NO production is impaired.
  • this toxin enables the production of effective drugs for patients with erectile dysfunction who cannot be treated with drugs. currently available.
  • PnTx2-6 Another important effect of PnTx2-6 refers to the stimulation of glutamate release from rat cerebral cortical synaptosomes [SILVA, 2012 -com. personal - SILVA, C.N. Analysis of the release of L-glutamate from rat cerebral cortex synaptosomes by the toxin PnTx2-6 from the arming spider venom (Phoneutria nigriventer). Initial evaluation of synthetic peptide (PnTx-19) activity in glutamate release and as an erectile function enhancer. Master thesis to be presented on 31 -08-12. Department of Biochemistry and Immunology, Federal University of Minas Gerais. Belo Horizonte, Minas Gerais, 120 p., 2012]. Yonamine et al.
  • L-glutamate L-glutamate or L-glu
  • L-glu Glutamate
  • Glutamate is the major and most abundant excitatory neurotransmitter of the mammalian CNS. It plays a crucial role in mechanisms underlying synaptic plasticity, which form part of the physiological basis of behavioral processes such as cognition and memory. L-glu also plays relevant roles in nervous system development such as formation, remodeling, synapse elimination, migration, proliferation, neuronal differentiation, and cell death (PRYBYLOWSKI, K. et al. J Biol Chem. 279, 9673-6, 1994; MCKINNEY, RA. Journal Physiology. 588 (1), 107-116, 2010; MANENT, JB, DAM, A.
  • glutamate may facilitate penile erection by activating some brain areas that are involved in the control of erectile function, such as the paraventricular nucleus (PVN), tegmented ventral area (VTA), the hippocampus, among others (ARGIOLAS, A. , MELIS, MR Prog.Neurobiol 47, 235-255, 1995; SONG, Y., RAJASEKARAN, M.
  • PVN paraventricular nucleus
  • VTA tegmented ventral area
  • ARGIOLAS A.
  • MELIS MR Prog.Neurobiol 47, 235-255, 1995
  • SONG Y., RAJASEKARAN, M.
  • PnTx2-6 is likely to have an effect on this system in the brain, since the first toxicity tests with this toxin were via intracerebral injection when it was found to cause erection (for review see NUNES et al., 2009). .
  • other in vivo toxin tests aiming at the study of erectile function potentiation were based on subcutaneous or intravenous injections, which resulted in positive responses (NUNES, 2008b, NUNES et al., 2008a).
  • Yonamine et al. (2005) found that iodinated PnTx2-6 can penetrate the blood brain barrier and thus exert some effects directly on the CNS.
  • a concrete result of the peripheral action of the toxin on the erection refers to the relaxation of cavernous body slices when the toxin is directly applied on this preparation in vitro (NUNES et al., 2010a; 2010b; 2012).
  • Matavel et al. (2009), using molecular modeling tools, indicated some amino acids of PnTx2-6, in discontinuous epitope, which supposedly interact with the sodium channel.
  • the chemical synthesis of a partial PnTx2-6 peptide sequence that encompasses these amino acids opens new perspectives for structural and pharmacological characterizations of the interaction of molecules with their receptors.
  • the relatively simple and high-yield peptide synthesis could provide material needed for pharmacological study in different tissues, circumventing the limitation observed with material obtained by venom purification or even by heterologous expression, which is difficult and costly (MATAVEL, A. et al. Biochemistry. 48 (14), 3078-3088, 2009).
  • the modified synthetic peptide PnTx (19) has been developed which has a short 19 amino acid polypeptide chain, the which allows its easy obtainment for commercial purposes, favoring the development of pharmaceutical compositions for use in the treatment of erectile dysfunction and / or in the potentiation of erectile function.
  • this peptide induces glutamate release in rat cortical brain synaptosomes, stimulates relaxation of mouse and rat cavernous body slices, has less toxic effect with respect to the native toxin, of which it is derivative, and yet, does not present cardiac toxicity, unlike Viagra, present in the market; It is also effective in hypertensive animals and has low immunogenicity.
  • FIG. 1 HPLC reverse phase chromatography of PnTx peptide synthesis products (19).
  • Preparative column Sephasil peptide C8 5 ⁇ ST 4.6 / 100, equilibrated with Milli-Q 0.1% TFA water (by volume) eluted with a gradient 0 to 25% solution B (0.1% TFA / acetonitrile v / v) in 3 minutes, 25 to 35% B in 30 minutes and 35 to 100% solution B in 5 minutes at a flow rate of 2.0 ml / min.
  • Figure 3 Synaptosomal viability - verified by the activity of the enzyme lactate dehydrogenase, which oxidizes NADH to NAD +. This determines a reading reduction (339nm) that allows quantifying the enzymatic activity.
  • Figure 4 Effect of different concentrations of PnTx (19) on the release of L-glutamate - Elisa plate containing 300 l / well of synaptosome (10% final vol) and NADP + (final concentration 1 mM) mixture in KRH with Calcium (2mM) maintained at 37 ° C under constant agitation was monitored. Fluorescence reading was performed on the spectrofluorometer for 2460 seconds. GDH enzyme (35 units for the final volume of 300 ⁇ ) was added to the wells at 60 seconds; At 660 seconds, in different wells, different concentrations of PnTx (19) ("10-5M, 3x10-5 M, 10-6 M and 3x10-6 M”) and KCI (33 mM) were added.
  • Figure 6- Effects of PnTx-19 Peptide and PnTx2-6 toxin on cardiac sodium current.
  • A- Effect of PnTx2-6 toxin on peak sodium current (black arrow) and inactivation current (gray arrow).
  • C- Effect of PnTx-19 peptide on peak sodium current and inactivation current.
  • Each black circle indicates the amplitude of INa, measured every 1s at a -20mV membrane potential. Gray bars indicate when the cell was exposed to PnTx2-6 or PnTx -19 (peptide).
  • Figure 8 Analysis of antibody titer.
  • the present invention comprises the peptide PnTx (19), NH3.
  • GERRQYFWIAWYKLANSKK-COOH (SEQ ID NO: 1), chemically synthesized using the Fmoc / t-butyl strategy of solid support synthesis (MERRIFIELD, RB Solid-phase peptide synthesis. Adv. Enzymol. Report Areas Mol. Biol. (32) , 221-296.1969).
  • the Peptide has 19 amino acid residues, is linear and was designed from the probable three-dimensional structure of PnTx2-6 proposed after bioinformatics analysis and modeling studies. molecular. This encompasses the hydrophobic core and positively charged residues surrounding this region which, according to molecular modeling studies, are responsible for the interaction of the toxin with the sodium channel (MATAVEL et al., 2009).
  • sequence (discontinuous epitope) developed from these molecular modeling studies underwent crucial modifications to the present invention so that its activity on erectile function was maintained: the amino acid cysteine at position 17 was exchanged for Serine, and the peptide was amidated at C-terminal portion and acetylated in the N-terminal portion, aiming to increase its solubility.
  • compositions are characterized in that they comprise a synthetic peptide and a pharmaceutically acceptable excipient or mixture of excipients, wherein the peptide may be present in free form or coupled to controlled release systems.
  • Controlled release systems may include liposomes, cyclodextrins, biodegradable polymers, capsules, micro- and nano-capsules, micro- and nano-particles, bolus preparations, osmotic pumps, diffusion devices, lipospheres, transdermal and / or liquid delivery systems which, when subjected to temperature changes, form a solid or gel in situ.
  • the pharmaceutical compositions may be administered by oral, topical, intramuscular, intravenous, subcutaneous, inhalation or implantable device routes.
  • PnTx (19) (NH 3- GlyGluArgArgGInTyrPheTrpIleAlaTrpTyrLysLeuAlaAsnSerLysLys-COOH) was partially designed using the PEPOP bioinformatics program.
  • PEPOP bioinformatics program a discontinuous epitope containing 19 amino acids for the PnTx2-6 toxin has been proposed (FLEURY, Cecile. Bioinformatics tools dedicated to the study of the structure-function-antigenicity relationship in animal peptide toxins. Federal University of Minas Gerais, Belo Horizonte, Minas Gerais, 180 p., 2009).
  • PnTx peptide (19) was purified by reverse phase chromatography ( ⁇ KTA Explorer 10 HPLC).
  • the chromatographic profile shown in Figure 1 demonstrates the presence of synthesis byproducts and the PnTx fraction (19), which elutes with 29% buffer B.
  • mass spectrometric analysis MALDI-TOF
  • Figure 2 mass spectrometric analysis
  • Example 2- Synaptosomal Viability Test
  • lactate dehydrogenase enzyme activity tests were performed, according to Kubowistz, Ott, 1943 (KUBOWISTZ, F., OTT, C. Biochem Z. 319, 94 17, 1943).
  • Triton X-00 100% lysis
  • PnTx (19) in the following concentrations : 0 "5 M, 3x10" 5 M; 10-6 M; 3x10 "6 M.
  • mice were sacrificed by decapitation, the penises surgically removed and placed on a petri dish containing Krebs Ringer bicarbonate - (NaCI, 11.1, 1; KCI, 4.7; KH2PO4, 1.0; MgSO4, 1.0; NaHCO3 25.0; CaCl2 2.5; and Glucose 11.1mM), bubbled with a mixture of 95% O2 and 5% CO2.
  • the glans, the cancellous body and the urethra were removed and the corpora cavernosa dissected with removal of the albuginic tunic and separated by cutting the fibrous septum between them.
  • the cavernous body strips measuring approximately 1 * 1 * 7 mm were mounted separately in a chamber, one end attached to an electrode and the other attached to a transducer.
  • the chambers contained Krebs (pH 7.4) at 37 ° C, equilibrated with 95% O2 and 5% CO2.
  • the tissue was stretched to a passive force of 2.0 mN and stabilized for 60 minutes and the solution replaced every 15 minutes. Changes in isometric force were recorded using an isometric force transducer (World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL, USA) connected to an amplifier (TBM-4 model; World Precision Instruments, Inc., USA) using WinDaq software. Data Acquisition (Dataq® Instruments, USA).
  • a KCI solution 120 mM was added to the corpora cavernosa slices and then the preparation was washed with Krebs three times.
  • FIG. 4 shows that PnTx2-6 toxin (5x10 "8 M) and the peptide PnTx (19) (10 -6 M) induced relaxation of 83%, whereas the control with acetylcholine (10 -4 M) induced 81 6 % relaxation in corpus cavernosum strips of phenylephrine pre-contracted mice (10 "5 M).
  • L-glutamate release was analyzed as proposed by Nicholls, et al. 1987 (NICHOLLS, D. et al. J. Neurochem. 49, 50-57, 1987).
  • NICHOLLS Nicholls, et al. 1987
  • the rats were maintained under a 12 hr Light / dark controlled cycle at stable temperature with free access to water and food. They were decapped 10 to 15 minutes after intraperitoneal injection of Heparin (200 IU).
  • the chest was opened, the heart carefully dissected and perfused through a aortic tip with Krebs-Ringer's solution (KRS) containing (in mmol / L) NaCI (11.4), KCI (4.7), KH2PO4 (1, 2), MgSO4.7H2O (1.2), CaCl2.2 H2O (1.25), glucose (11.7) and NaHCO3 (26.5).
  • KRS Krebs-Ringer's solution
  • the perfusion flow was kept constant (10ml_ / min) at 37 ° C and under constant oxygenation (5% CO2 and 95% O2).
  • a balloon connected to a pressure transducer was inserted into the right ventricle and ventricular pressure, heart rate, and derivative ⁇ dP / dt were monitored (Figure 7).
  • the balloon volume was adjusted to a final diastolic pressure of about 10mm Hg.
  • 100 ⁇ _ vehicle (Control) toxin at concentrations of 37.8 nmol / L - 3.78 pmol / L or peptide at concentrations of 37.8 nmol / L - 37.8 pmol / were injected.
  • L in infusion buffer was used toxin at concentrations of 37.8 nmol / L - 3.78 pmol / L or peptide at concentrations of 37.8 nmol / L - 37.8 pmol / were injected.
  • L in infusion buffer was used toxin at concentrations of 37.8 nmol / L - 3.78 pmol / L or peptide at concentrations of 37.8 nmol / L
  • mice Male Swiss mice, 20-23 gr, were divided into 2 groups (Control-Adjuvant: aluminum hydroxide- Figure 8 A and PnTx-19 -10pG- Figure 8B), each group containing 4 animals. The mice were immunized subcutaneously. At 21, 35 and 49 days of the first inoculation, the mice received a reinforcement of the preparations mentioned above.
  • serum collected from the tails of mice was evaluated 15, 30, 40 and 60 days after first inoculation by the indirect enzyme immunoassay (ELISA) as described for other preparations ( DEL PINO, FAB, BRANDELLI, A., GONZALES, JC, HENRIQUES, JAP, DEWES, H .. Effect of antibodies against N-acetylglucosaminidase on reproductive efficiency of Boophilus microplus tick Vet Parasitol 79, 247- 255, 1998).
  • ELISA indirect enzyme immunoassay
  • the immunogenicity of PnTx19 was evaluated after 10 g subcutaneous injection of it (Figure 8B). No hypersensitivity reactions or death of animals were observed during the trials. There was a small increase in antibody titer in group 2 (PnTx-9-10 pg) 60 days after the first inoculation of the peptide ( Figure 8B). Importantly, the peptide dose of 10 pg is approximately 12.5 times higher than the estimated LD 5 for PnTx2-6 (0.79 pg / mouse) toxin (MN, DINIZ CR, VALENTIM AC, VON EICKSTEDT , GILROY J., RICHARDSON M. Purification and amino acid sequences of four Tx2 neurotoxins from the venom of the Brazilian armed spider Phoneutria nigriventer (Keys) FEBS Lett. 310, 153-156, 1992).

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Description

PEPTÍDEO SINTÉTICO PnTx(19), COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS E
USO
A presente invenção refere-se a um peptídeo sintético de 19 aminoácidos, denominado PnTx(19), construído a partir da sequência da toxina nativa PnTx2-6, da aranha Phoneutria nigriventer. Refere-se também a composições farmacêuticas contendo tal peptídeo e ao seu uso no tratamento da disfunção erétil e/ou na potencialização da função erétil.
A peçonha da aranha Phoneutria nigriventer, conhecida popularmente como "aranha armadeira", é rica em polipeptídios bioativos com diferentes efeitos farmacológicos, atuando principalmente em canais e receptores iónicos. Os sintomas predominantes causados por sua peçonha resultam de um hiperexcitabilidade geral. Estudos demonstraram que a toxicidade da peçonha provém em grande parte dos efeitos da fração PhTx2 (para revisão ver: BORGES, M. H., et al. In: Animal Toxin: State of the Art. Perspectives in Health and Biotecnology. Maria Elena de Lima, Adriano Monteiro de Castro Pimenta, Marie France Martin-Eauclaire, Russolina Benedeta Zingali e Hervé Rochat (organizadores), Belo Horizonte-MG. Editora UFMG. 800p. 2009, GOMEZ, M.V. et al. Cellular and Molecular Neurobiology, 22: 5/6, 2002). A toxina PnTx2-6 (MM 5.291.3 Da), purificada desta fração, reproduz os efeitos sintomáticos da fração total após injeção intracerebral em camundongos (LE SUEUR, L.P.et al. Acta Neuropathol. 105, 125- 134, 2003). Sua ação pode ser atribuída ao retardamento da corrente de inativação dos canais para sódio tendo também efeito na ativação, em alguns sub-tipos destes canais, deslocando a ativação para potenciais mais negativos (MATAVEL, A. et al. Biochemistry. 48(14), 3078-3088, 2009; CASSOLI et al., com. pessoal, 2012).
O efeito de PnTx2-6 na função erétil de ratos foi descrito anteriormente no pedido de patente PI0800596, intitulado "Método para a potencialização da função erétil através do uso das composições farmacêuticas de toxina Tx2-6 da aranha Phoneutria nigriventer", depositado no Brasil em 2008. A toxina doravente denominada PnTx2-6, potencializa a ereção em ratos normotensos, restaura a função erétil em animais hipertensos (DOCA-sal) e também em camundongos diabéticos ou ratos idosos (para revisão ver: NUNES, K. P. CARDOSO, F. L, CARDOSO-Jr., H. C, PIMENTA, A. M. C, De LIMA, M. E. Animal toxins as potential pharmacological tools for treatment of erectile dysfunction. In: Animal Toxin: State of the Art. Perspectives in Health and Biotecnology. Maria Elena de Lima, Adriano Monteiro de Castro Pimenta, Marie France Martin-Eauclaire, Russolina Benedeta Zingali e Hervé Rochat (editores), 759p. , 2009; NUNES, K.P. et al. Tx2-6 Toxicon, 51 (7): 1 197-206, 2008; NUNES, K.P et al. The Journal of Urology,9(10):2574-81 , 2012). Estes efeitos parecem ser mediados pela ativação da enzima Óxido Nítrico Sintase (NOS) e liberação de óxido nítrico (NO) (YONAMINE, CM. et al. Toxicon 44, 169- 172, 2004; NUNES et al., 2008, 2009). Além disso, sugere-se que alguns genes envolvidos na via do óxido nítrico têm sua expressão aumentada no tecido erétil de camundongos após tratamento com a toxina PnTx2-6 (VILLANOVA, F.E., et al. Toxicon. 54(6), 793-801 , 2009).
O óxido nítrico (NO), produto da hidrólise de L-arginina pela óxido nítrico sintase (NOS), é um mediador essencial do processo da ereção [LEWIS, R.W. et al. A. Definitions, classification, and epidemiology of sexual dysfunction. In: Sexual Medicine. Sexual Disfuntion in Men and Women, Lue, T. F.; Basson, R.; Rosen, R.; Giuliano, F.; Khoury, S.; Montorsi, F., (Editores.) International for Sexual Medicine, Paris, p. 39-72, 2004]. Após a sua liberação pelos nervos não-adrenérgicos-não-colinérgicos (NANC), nervos nitrérgicos e células endoteliais, o NO difunde-se para a vizinhança trabecular e vascular do músculo liso do pênis para estimular a atividade da guanilato ciclase solúvel (GCs), aumentando a concentração de guanosina monofosfato cíclica (GMPc) (TODA, N. et al. Pharmacol. Ther.106 (2), 233-266, 2005; PRIETO, D. Int. J. Impot. Res. 20(1 ), 17-29, 2008). A formação de GMPc induz a diminuição dos níveis de cálcio intracelulares, levando ao relaxamento das células musculares lisas com subsequente tumescência peniana (TODA et al., 2005). A ereção termina devido à hidrólise do GMPc pela enzima fosfodiesterase tipo 5 (PDE- 5), formando GMP (IGNARRO, L.J. et al. Biochem Biophys Res Commun., 170, 843-50, 1990; RAJFER, J. et al. N. Engl. J. Med. 326(2), 90-94, 1992; LEE, M.R. J. Biol. Chem. 272, 5063-5068, 1997; BIVALACQUA, T.J.et al. Trends Pharmacol. Sei., 21 (12), 484-489, 2000). Atualmente, a principal farmacoterapia utilizada para disfunção erétil são inibidores de PDE-5, tais como sildenafil (Viagra), taladafil (Cialis®) e vardenafil (Levitra®) (MORELAND, R.B et al. Trends Endocrinol. Metab. 10(3), 97-104, 1999; PRIVIERO, F.B. et al Acta Pharmacol. Sin. 28(6), 751 -755, 2007; LEITE, R. at al. Recent Pat. Cardiovasc. Drug Discov. 2(2), 1 19-132, 2007). Entretanto, inibidores de PDE-5 não são eficientes no tratamento de pacientes com doenças vasculares, onde a produção de NO é prejudicada. Desta forma, visto que o efeito de relaxamento do músculo liso do corpo cavernoso induzido por PnTx2-6 é independente da inibição da enzima PDE-5, essa toxina permite a produção de medicamentos efetivos para pacientes com disfunção erétil que não podem ser tratados pelos medicamentos atualmente disponíveis.
Outro efeito importante de PnTx2-6 refere-se ao estímulo da liberação de glutamato de sinaptossomas cérebro-corticais de rato [SILVA, 2012 -com. pessoal - SILVA, C.N. Análise da liberação de L-glutamato de sinaptosomas de córtex cerebral de rato pela toxina PnTx2-6 da peçonha da aranha armadeira (Phoneutria nigriventer). Avaliação inicial da atividade do peptídeo sintético (PnTx-19) na liberação de glutamato e como potenciador da função erétil. Dissertação de mestrado a ser apresentada no dia 31 -08-12. Departamento de Bioquímica e Imunologia da Universidade Federal de Minas Gerais. Belo Horizonte, Minas Gerais, 120 p., 2012]. Yonamine et al. (2005) verificaram que PnTx2-6 iodada pode penetrar a barreira hematoencefálica e assim poderia exercer alguns efeitos diretamente sobre o SNC, o que foi confirmado por Nunes et al. 2010 (NUNES, K.P., et al. J Sex Med, 7: 3879-88, 2010).
O glutamato (L-glutamato ou L-glu) é o principal e mais abundante neurotransmissor excitatório do SNC dos mamíferos. Ele exerce um papel crucial em mecanismos subjacentes à plasticidade sináptica, os quais fazem parte da base fisiológica de processos comportamentais como cognição e memória. O L- glu também desempenha funções relevantes no desenvolvimento do sistema nervoso como a formação, o remodelamento, a eliminação de sinapses, a migração, a proliferação, a diferenciação neuronal e a morte celular (PRYBYLOWSKI, K. et al. J Biol Chem. 279, 9673-6, 1994; MCKINNEY, RA. Journal Physiology. 588 (1 ), 107-1 16, 2010; MANENT, J.B., REPRESA, A. The Neuroscientist,13 (3), 268-279, 2007; SCHLETT, K. Current Topics Medicinal Chemistry. 6(10), 949-960, 2006; VECINO, E. et al. The International Journal of Developmental Biology. 48 (8-9), 965-974, 2004). Além disso, o glutamato, pode facilitar a ereção peniana, ativando algumas áreas cerebrais que estão envolvidas no controle da função erétil, como o núcleo paraventricular (PVN), área ventral tegmentada (VTA), o hipocampo, entre outras (ARGIOLAS, A., MELIS, M.R.. Prog. Neurobiol. 47, 235-255, 1995; SONG, Y. , RAJASEKARAN, M. Urology. 64(6), 1250-1254, 2004; MELIS M.R., ARGIOLAS A. Neuroscience and Biobehavioral. Reviews 35, 939-955, 201 1 ; SUCCU, S. et al. Neuropharmacology. 61 (1-2), 181 -188, 201 1 ).
É provável que PnTx2-6 tenha ação sobre este sistema no cérebro, uma vez que os primeiros testes de toxicidade com esta toxina foram via injeção intracerebral, quando verificou-se que a mesma causava ereção (para revisão ver NUNES et al., 2009). Por outro lado outros testes in vivo realizados com a toxina visando-se o estudo da potenciação da função erétil foram a partir de injeções subcutâneas, ou intra-venosas, que resultaram em respostas positivas (NUNES, 2008b, NUNES et al., 2008a). Além disso, Yonamine et al., (2005) verificaram que PnTx2-6 iodada pode penetrar a barreira hematoencefálica e assim exercer alguns efeitos diretamente sobre o SNC. Nosso grupo também mostrou que PnTx-6 marcada pelo tecnécio e injetada perifericamente, embora se concentre no pênis, aparece também em pequena quantidade no tecido nervoso, levando a crer que pelo menos parte dela atravessa a barreira hematoencefálica (NUNES et al., 2010a). Estudos sobre a ação da toxina na barreira hematoencefálica estão em fase inicial, visando-se entender a possível entrada desta toxina no SNC. O que se sabe é que a toxina PnTx2-6 injetada tanto pela via periférica, como central, é capaz de induzir ereção. Cabe averiguar os mecanismos pelos quais esta ação ocorre. Um resultado concreto da ação periférica da toxina sobre a ereção, refere-se ao relaxamento de fatias do corpo cavernoso quando a toxina é diretamente aplicada sobre esta preparação in vitro (NUNES et al., 2010a ; 2010b; 2012) Matavel et al. (2009), utilizando ferramentas de modelagem molecular, indicaram alguns aminoácidos da PnTx2-6, em epitopo descontínuo, que supostamente interagem com o canal para sódio. Neste contexto, a síntese química de uma sequência peptídica parcial da PnTx2-6 que englobe estes aminoácidos abre novas perspectivas para caracterizações estruturais e farmacológicas da interação das moléculas com seus receptores. Além disto, a síntese peptídica, relativamente simples e com possibilidade de alto rendimento, poderia proporcionar material necessário para o estudo farmacológico em diferentes tecidos, contornando-se a limitação observada com material obtido por purificação da peçonha ou mesmo por expressão heteróloga, que é difícil e onerosa (MATAVEL, A. et al. Biochemistry. 48(14), 3078-3088, 2009).Assim, na presente tecnologia foi desenvolvido o peptídeo sintético modificado PnTx(19) que apresenta uma curta cadeia polipeptídica de 19 aminoácidos, o que permite sua fácil obtenção para fins comerciais, propiciando o desenvolvimento de composições farmacêuticas para uso no tratamento de disfunção erétil e/ou na potencialização da função erétil. Além disso, na presente tecnologia foi demonstrado que esse peptídeo induz a liberação de glutamato em sinaptosomas cérebro corticais de ratos, estimula o relaxamento de fatias de corpos cavernosos de camundongos e de ratos, apresenta menor efeito tóxico com relação à toxina nativa, da qual é derivado, e ainda, não apresenta toxicidade cardíaca, ao contrário do Viagra, presente no mercado; é efetivo também em animais hipertensos e apresenta baixa imunogenicidade.
No estado da técnica, encontram-se novas formulações baseadas em polipeptídeos derivados de peçonhas de aranha, como no pedido de patente WO2009083808, intitulado "COMPOSITIONS AND METHODS FOR TREATING ERECTILE DYSFUNCTION", que descreve composições compreendendo um polipeptídeo isolado do veneno da aranha viúva negra, Latrodectus mactans, e fragmentos biologicamente ativos do mesmo. Entretanto, não foi encontrado peptídeo semelhante ao da presente invenção para o tratamento da disfunção erétil. BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
Figura 1 - Cromatografia de fase reversa em sistema HPLC dos produtos da síntese do peptídeo PnTx(19). Coluna preparativa Sephasil peptide C8 5μ ST 4.6/100, equilibrada com água Milli-Q 0, 1 % TFA (em volume) eluído com um gradiente 0 a 25 % de solução B (0, 1 % TFA/acetonitrila v/v) em 3 minutos, 25 a 35% de B em 30 minutos e 35 a 100% de solução B em 5 minutos, a um fluxo de 2,0 ml/ minuto.
Figura 2 - Espectrometria de massa da fração contendo o peptídeo sintético PnTx(19). A massa molecular do PnTx(19) de 2484,9 Da foi determinada por MALDI-TOF.
Figura 3 - Viabilidade sinaptosomal - verificada pela atividade da enzima lactato desidrogenase, que oxida o NADH a NAD+. Este determina uma redução da leitura (339nm) que permite quantificar a atividade enzimática. A mistura de reação foi incubada por 60 min com PnTx(19) (10-5 M; 3x10-5 M; 10-6 M; 3x10-6 M) e a porcentagem de atividade avaliada em relação à lise desencadeada pelo Triton X-100, considerada = 100% de lise. Atividade desta enzima é proporcional ao rompimento dos sinaptosomas, considerando-se que esta é uma enzima do compartimento intracelular.
Figura 4 - Efeito de diferentes concentrações da PnTx(19) na liberação de L- glutamato - Placa de Elisa contendo 300 l/poço da mistura de sinaptosomas (10% vol. final) e NADP+(concentração final de 1 mM) em KRH com cálcio (2mM), mantida à 37° C sob agitação constante foi monitorada. Realizou-se leitura da fluorescência no espectrofluorímetro durante 2460 segundos. A enzima GDH (35 unidades para o volume final de 300μΙ) foi adicionada aos poços aos 60 segundos; aos 660 segundos, em diferentes poços, foram adicionadas diferentes concentrações de PnTx(19) ("10-5M, 3x10-5 M, 10-6 M e 3x10-6 M") e o KCI (33 mM). Como controles negativos foram utilizados poços contendo sinaptosomas não tratados com a toxina. Os resultados apresentam a média e o erro padrão de dois experimentos independentes, realizados em triplicata. * P<0,05 representam os níveis de significância de ensaios comparados com o controle - representado pelos sinaptosomas não tratados.
Figura 5 - Efeitos da toxina PnTx2-6 e do peptídeo PnTx(19) (1x10-6M) sobre o relaxamento de tiras de corpos cavernosos de camundongos. As tiras foram pré contraídas com fenilefrina (10-5 M) e relaxadas com acetilcolina (10-4M)- controle, PnTx2-6 (5x10-8M) e PnTx(19) (1x10-6 M) (n=3).
Figura 6- Efeitos do Peptídeo PnTx-19 e da toxina PnTx2-6 na corrente para sódio cardíaca. A- Efeito da toxina PnTx2-6 no pico de corrente de sódio (seta preta) e na corrente de inativação (seta cinza). C- Efeito do peptídeo PnTx-19 no pico de corrente de sódio e na corrente de inativação. (B) e (D) curso de tempo de pico da corrente de sódio, durante a perfusão de PnTx-19 e PnTx2-6. Cada círculo preto indica a amplitude da INa, medido a cada 1s em um potencial de membrana de -20mV. As barras cinzas indicam o momento em que a célula foi exposta a PnTx2-6 ou PnTx -19 (peptídeo). Os gráficos de barras resumem ós efeitos da PnTx2-6 500 nM (n = 7) e do peptídeo PnTx-19 (peptídeo) 1 μΜ (n = 12) na constante de decaimento (E) e redução da corrente de sódio (F). Barras indicam média ± SEM, * p <0,05 em relação aos controles. Figura 7- Curva dose resposta do peptídeo PnTx-19 e da Toxina PnTx2-6 na pressão ventricular direita (A) e esquerda (B), derivada ±dP/dt (C e D) e taxa cardíaca (E) de ratos.
Figura 8- Análise do título de anticorpo. A) Controle: adjuvante (hidróxido de alumínio). B) Título de anticorpos após a administração do peptídeo PnTx-19 (10 pG) em diferentes dias.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA TECNOLOGIA
A presente invenção compreende o peptídeo PnTx(19), NH3.
GERRQYFWIAWYKLANSKK-COOH (SEQ ID N°1), sintetizado quimicamente utilizando a estratégia Fmoc/t-butila de síntese em suporte sólido (MERRIFIELD, R.B. Solid-phase peptide synthesis. Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol. (32), 221-296,1969). O Peptídeo possui 19 resíduos de aminoácidos, é linear e foi desenhado a partir da estrutura tridimensional provável da PnTx2- 6 proposta após análises por bioinformática e estudos de modelagem molecular. Este engloba o "core" hidrofóbico e os resíduos carregados positivamente que rodeiam esta região que, de acordo com os estudos de modelagem molecular, são responsáveis pela interação da toxina com o canal para sódio (MATAVEL et al., 2009). A sequência (epitopo descontínuo) desenvolvida a partir destes estudos de modelagem molecular sofreu modificações cruciais na presente invenção, para que sua atividade na função erétil fosse mantida: o aminoácido cisteina, na posição 17, foi trocado por Serina, e o peptídeo foi amidado na porção C- terminal e acetilado na porção N-terminal, visando-se o aumento da solubilidade do mesmo.
Os testes de atividade demonstraram que PnTx(19), assim como PnTx2-
6, interfere no sistema glutamatérgico em sinaptosomas cérebro corticais de ratos. Concentrações diferentes do peptídeo foram utilizadas e verificou-se que, na dose de 3x10"5M, PnTx(19) induz um aumento na liberação de glutamato em sinaptosomas cérebro corticais de ratos (Figura 4).
A ação do peptídeo na ereção foi verificada utilizando-se tiras de corpo cavernoso isolado de camundongos. 1 μΜ PnTx(19) propiciou um significativo relaxamento da tira cavernosal de camundongos, aproximadamente 80% (Figura 5), ação semelhante à evocada por 50nM de PnTx2-6 e 100 μΜ de acetilcolina. Provavelmente, o relaxamento do corpo cavernoso deve-se à ligação do peptídeo linear aos canais para sódio no corpo cavernoso, desencadeando os eventos subsequentes na via da ereção.
O desenvolvimento do peptídeo sintético PnTx(19) permite a obtenção de maiores quantidades da molécula ativa, com a possibilidade de diminuição dos efeitos tóxicos com relação à toxina nativa PnTx2-6; o que propicia o desenvolvimento de composições farmacêuticas para o tratamento da disfunção erétil e/ou na potencialização da função erétil.
Tais composições farmacêuticas são caracterizadas por compreender um peptídeo sintético e um excipiente ou uma mistura de excipientes farmaceuticamente aceitáveis, sendo que o peptídeo pode estar presente na forma livre ou acoplado a sistemas de liberação controlada. Os sistemas de liberação controlada podem incluir lipossomas, ciclodextrinas, polímeros biodegradáveis, cápsulas, micro- e nano-cápsulas, micro- e nano-partículas, preparações de bolus, bombas osmóticas, dispositivos de difusão, lipoesferas, sistemas de administração transdérmicos e/ou líquidos que, quando submetidos a mudanças de temperatura, formam um sólido ou um gel in situ. Desta forma, as composições farmacêuticas podem ser administradas pelas vias oral, tópica, intramuscular, intravenosa, subcutânea, via de inalação ou por dispositivo implantável.
A presente invenção pode ser melhor entendida pelos seguintes exemplos, que não são limitantes da tecnologia.
Exemplo 1- Síntese química em fase sólida e purificação do peptídeo PnTx (19)
O peptídeo sintético denominado PnTx(19) (NH3- GlyGluArgArgGInTyrPheTrpIleAlaTrpTyrLysLeuAlaAsnSerLysLys-COOH) foi parcialmente desenhado utilizando-se o programa de bioinformática PEPOP. Desta forma, foi proposto um epítopo descontínuo contendo 19 aminoácidos para a toxina PnTx2-6 (FLEURY, Cécile. Bioinformatics tools dedicated to the study of the structure-function-antigenicity relationship in animal peptide toxins.Tese de doutorado. Departamento de Bioquímica e Imunologia da Universidade Federal de Minas Gerais. Belo Horizonte, Minas Gerais, 180 p., 2009).
Visando o aumento da solubilidade do peptídeo, na presente tecnologia sintetizou-se o PnTx(19) com modificações na porção N-terminal (acetilação) e C- terminal (amidação). O peptídeo PnTx(19)-acetilado e amidado mostrou-se solúvel em água.
O peptídeo PnTx(19) foi purificado por cromatografia de fase reversa (HPLC ÀKTA Explorer 10). O perfil cromatográfico apresentado na Figura 1 demonstra a presença de subprodutos da síntese e a fração referente à PnTx(19), que elui com 29% de tampão B. Após purificação, a análise por espectrometria de massas (MALDI-TOF) mostrou apenas um grupo de espécie molecular no espectro, cuja massa molecular foi de 2484.970 Da (Figura 2), compatível com a massa esperada para o peptídeo PnTx(19).
Exemplo 2- Teste de viabilidade sinaptosomal Ratos adultos (240-300g) foram decaptados, os cérebros rapidamente removidos, imersos em solução de homogeneização (sacarose 0,32 M, EDTA 1 mM e Dithiotreitol (DTT) 0,25 mM, pH=7,4) e mantidos no gelo, em seguida foram utilizados no preparo dos sinaptosomas, como previamente descrito por Dunkley et al 1988 (DUNKLEY, P R. ; Brain Research. 441 , 59-71 , 1988).
Como controle da viabilidade dos sinaptosomas e também para averiguar uma possível atividade lítica do peptídeo, realizaram-se testes de atividade da enzima lactato desidrogenase, segundo Kubowistz, Ott, 1943 (KUBOWISTZ, F., OTT, C. Biochem Z. 319, 94-1 17, 1943).
A atividade de LDH foi avaliada em condições controle, na presença de
1 % de Triton X- 00 (100% de lise) e na presença de PnTx(19) nas seguintes concentrações 0"5 M; 3x10"5 M; 10_6 M; 3x10"6 M.
Os resultados da Figura 3 demonstram que o peptídeo não afeta a viabilidade sinaptosomal e/ou maquinaria exocitótica, uma vez que os valores obtidos foram 3,4% de lise para a concentração de 0"5 M; 2% de lise para a concentração de 3x10"5 M; 6% de lise para a concentração de 10"6 M; 9 % de lise para a concentração de 3x10"6 M, valores comparáveis ao controle (ausência do peptídeo).
Exemplo 3- Efeitos da toxina PnTx2-6 e do peptídeo PnTx(19) em tiras cavernosais de camundongos
Camundongos foram sacrificados por decaptação, os pênis removidos cirurgicamente e colocados sobre uma placa de Petri, contendo Krebs Ringer bicarbonato - (NaCI, 1 18, 1 ; KCI, 4,7; KH2PO4, 1 ,0; MgSO4, 1 ,0; NaHCO3, 25,0; CaCI2, 2,5; e Glicose, 11 , 1mM), borbulhados com uma mistura de 95% de O2 e 5% CO2. A glande, o corpo esponjoso e a uretra foram retirados e os corpos cavernosos dissecados com remoção da túnica albugínea e separados por corte do septo fibroso entre eles. As tiras de corpos cavernosos medindo aproximadamente 1 *1 *7 mm foram montadas separadamente em uma câmara, sendo uma extremidade presa a um eletrodo e a outra ligada à um transdutor. As câmaras continham Krebs (pH 7,4) a 37°C, equilibrado com 95% de O2 e 5% CO2. O tecido foi estirado a uma força passiva de 2,0 mN e estabilizado durante 60 minutos, sendo a solução substituída a cada 15 minutos. As mudanças na força isométrica foram registradas utilizando um transdutor de força isométrica (World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL, USA) conectado a um amplificador (TBM-4 model; World Precision Instruments, Inc., USA) usando um software WinDaq Data Acquisition (Dataq® Instruments, USA). Para avaliar a capacidade contrátil das preparações, uma solução de KCI (120 mM) foi adicionada às fatias de corpos cavernosos e posteriormente a preparação foi lavada com Krebs por três vezes.
As fatias de corpo cavernoso foram pré-contraídas com fenilefrina (10-5
M) e o relaxamento foi evocado por acetilcolina 10"4M (controle), PnTx2-6 (5x10-8M) e o peptídeo PnTx(19) (1x10'6M).
A Figura 4 mostra que a toxina PnTx2-6 (5x10"8 M) e o peptídeo PnTx(19) (10 6 M) induzem um relaxamento de 83% , enquanto o controle com acetilcolina (10~4 M) induziu 81 ,6% de relaxamento em tiras de corpos cavernosos de camundongos pré-contraídas por fenilefrina (10"5M). Esses resultados indicam que, tanto a toxina PnTx2-6, quanto o peptídeo PnTx(19) são ativos no relaxamento de fatias de corpos cavernosos de camundongos.
Exemplo 4- Efeito do peptídeo sintético PnTx(19) na liberação de L- glutamato
A liberação de L-glutamato foi analisada conforme proposto por Nicholls, et al1987 (NICHOLLS, D. et al. J. Neurochem. 49, 50-57, 1987). Para avaliar se o peptídeo era capaz de induzir a liberação de L-glutamato em sinaptosomas cérebro-corticais de rato, assim como a toxina nativa, foi analisado o seu efeito nas seguintes concentrações: 10"5M, 3x10"5 M, 10"6 M e 3x10"6 M, Figura 5.
A partir destes resultados observa-se que, nas condições experimentais, apenas na concentração de 3x10"5M o peptídeo foi capaz de induzir liberação significativa de L-glutamato, quando comparado ao controle (ausência de PnTx19).
Exemplo 5- Efeitos do Peptídeo PnTx-19 no coração
Efeitos na corrente de sódio Experimentos de "Patch-clamp" foram realizados objetivando a análise dos efeitos da toxina PnTx2-6 e do peptídeo PnTx-19 em canais para sódio Nav1.5, presentes em cardiomiócitos. Registros evidenciam que a toxina PnTx2-6 provoca uma diminuição no pico de corrente de sódio retardando a corrente de inativação. Estes efeitos não foram observados para PnTx-19 (Figura 6 A e C). Na Figura 6 B observa-se que PnTx2-6 promoveu uma redução da densidade da corrente de sódio e este fenómeno também não foi observado na presença do peptídeo (Figura 6 D).
Efeito na pressão ventricular , taxa cardíaca e derivada ±dP/dt
Os ratos foram mantidos sob um ciclo controlado de 12 hr Luz/escuro à temperature estável com acesso livre à água e alimento. Eles foram decaptados 10 a 15 minutos após a injeção intraperitoneal de Heparina (200 IU). O tórax foi aberto, o coração cuidadosamente dissecado e perfundido através de uma ponta aórtica com solução Krebs-Ringer (KRS) contendo (em mmol/L) NaCI (1 18,4), KCI (4,7), KH2PO4 (1 ,2), MgSO4.7H2O (1 ,2), CaCI2.2 H2O (1 ,25), glicose (1 1 ,7) e NaHCO3 (26,5). O fluxo da perfusão foi mantido constante (10ml_/min) a 37°C e sob constante oxigenação (5% CO2 e 95% O2). Um balão conectado a um transdutor de pressão foi inserido dentro do ventrículo direito e foram monitoradas a pressão ventricular, taxa cardíaca e derivada ±dP/dt (Figura 7). O volume do balão foi ajustado para uma pressão diastólica final de cerca de 10mm Hg. Após período para atingir o equilíbrio (30 a 40 minutos), foram injetados 100 μΙ_ de veículo (Controle), toxina nas concentrações de 37.8 nmol/L - 3.78 pmol/L ou o peptídeo nas concentrações de 37.8 nmol/L - 37.8 pmol/L em tampão de perfusão.
Como pode observar na Figura 7, a toxina induziu um aumento, dependente da concentração, na pressão ventricular sistólica final direita (PSFVD) e no +dP/dt, e -dP/dt, no máximo em 66.7 ± 10.57 %, 85.9 ± 13.55 %, e 61.6 ± 9.89 %, respectivamente (Figura 7 A; C e D). No entanto, a toxina não alterou a pressão diastólica final e a taxa cardíaca. Em contraste o peptídeo não alterou nenhum desses parâmetros mesmo a altas concentrações (Figura 7 B e E). Os resultados são a média ± SEM. Análises de variância one-way (ANOVA) seguida pelo pós teste Newman-Keuks foram usadas para analisar os parâmetros em corações isolados. Foi considerado para análises estatísticas p< 0,05. Exemplo 6- Imunogenicidade do peptídeo PnTx-19
Camundongos Swiss, machos, 20-23 gr, foram divididos em 2 grupos (Controle- Adjuvante: hidróxido de alumínio- Figura 8 A e PnTx-19 -10pG- Figura 8B), contendo cada grupo 4 animais. Os camundongos foram imunizados por via subcutânea. Aos 21 , 35 e 49 dias da primeira inoculação, os camundongos receberam um reforço dos preparativos mencionados acima. Para verificar a presença de anticorpos contra o PnTx-19, o soro colhido a partir das caudas dos camundongos foi avaliado 15, 30, 40 e 60 dias após a primeira inoculação através do ensaio imunoenzimático indireto (ELISA), como descrito para outras preparações (DEL PINO, F.A.B., BRANDELLI, A., GONZALES, J.C., HENRIQUES, J.A.P., DEWES, H.. Effect of antibodies against _-N-acetylglucosaminidase on reproductive efficiency of the bovine tick Boophilus microplus. Vet. Parasitol. 79, 247-255, 1998).
A imunogenicidade de PnTx19 foi avaliada após a injeção subcutânea de 10 g do mesmo (Figura 8B). Não foram observadas reações de hipersensibilidade ou morte dos animais durante os ensaios. Verificou-se um pequeno aumento no título de anticorpos no grupo 2 ( PnTx- 9 - 10 pg) 60 dias após a primeira inoculação do peptídeo (Figura 8B). É importante ressaltar que a dose de peptídeo de 10 pg, é aproximadamente 12,5 vezes maior que a DL5o estimada para toxina PnTx2-6 (0,79 pg/camundongo) (CORDEIRO M.N., DINIZ C.R., VALENTIM A.C., VON EICKSTEDT , GILROY J., RICHARDSON M. The purification and amino acid sequences of four Tx2 neurotoxins from the venom of the brasilian 'armed' spider Phoneutria nigriventer (Keys). FEBS Lett. 310, 153-156, 1992).

Claims

REIVINDICAÇÕES
1. PEPTÍDEO SINTÉTICO, caracterizado por compreender a sequência GERRQYFWIAWYKLANSKK (SEQ ID N°1).
2. PEPTÍDEO SINTÉTICO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por apresentar modificações na porção N-terminal (acetilação) e
C- terminal (amidação).
3. USO DO PEPTÍDEO SINTÉTICO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por ser na preparação de um medicamento para o tratamento de indivíduos acometidos por disfunção erétil e/ou para a potencialização da função erétil.
4. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, caracterizada por compreender o peptídeo sintético representado pela sequência SEQ ID N°1 ; e um excipiente ou uma mistura de excipientes farmaceuticamente aceitáveis.
5. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo peptídeo estar presente na forma livre ou acoplado a sistemas de liberação controlada, selecionados do grupo que compreende lipossomas, ciclodextrinas, polímeros biodegradáveis, cápsulas, micro- e nano- cápsulas, micro- e nano-partículas, preparações de bolus, bombas osmóticas, dispositivos de difusão, lipoesferas, sistemas de administração transdérmicos e/ou líquidos que, quando submetidos a mudanças de temperatura, formam um sólido ou um gel in situ.
6. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, de acordo com a reivindicação 4, caracterizada por poder ser administrada pelas vias oral, tópica, intramuscular, intravenosa, subcutânea, via inalação ou por dispositivo implantável.
7. USO DA COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, de acordo com a reivindicações de 4 a 6, caracterizado por ser na preparação de um medicamento para o tratamento de indivíduos acometidos por disfunção erétil e/ou para a potencialização da função erétil.
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