WO2014036726A1 - 人乳微小核糖核酸及其应用 - Google Patents

人乳微小核糖核酸及其应用 Download PDF

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milk
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斯琴
锡林其其格
陈熹
张骑鹏
曾科
乌兰
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    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
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    • A23C9/00—Milk preparations; Milk powder or milk powder preparations
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    • C12N15/117—Nucleic acids having immunomodulatory properties, e.g. containing CpG-motifs
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    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/30—Special therapeutic applications

Definitions

  • the present invention is in the field of biological products, and in particular, the present invention relates to human milk microRNA and its use. Background technique
  • breast milk is recognized as the most ideal food for infants and young children.
  • the World Health Organization also pointed out that breast milk is an ideal food for healthy growth and development of infants and young children. Because breast milk contains all kinds of nutrients suitable for the growth and development of infants, the nutrients are comprehensive and more easily absorbed.
  • breast milk also contains nutrients that enhance immunity, such as lactoferrin (which inhibits iron-deficient bacteria), as well as anti-infective active white blood cells, immune antibodies, and other immune factors.
  • Colostrum contains a large amount of immunoglobulin, which protects infants from bacterial infections and is less prone to pneumonia.
  • breast milk substitutes such as infant formula
  • the formula is made on the basis of breast milk. By improving the milk, the formula is made to be close to the breast milk to meet the digestion and absorption needs of the infant.
  • existing formulas compared with breast milk, existing formulas not only lack important components such as hydroxy acid, various minerals, hormones, non-protein nitrogens including amino acids and nucleotides, but also contain mainly Protein, fat, vitamins and other types are not rich enough, and it is not conducive to digestion and absorption of infants. In short, the existing formula is close to breast milk as much as possible, but it is still far from breast milk.
  • One of the objects of the present invention is to provide a new collection of microRNAs which can be used to formulate infant food or food additives or supplements.
  • Another object of the present invention is to provide a series of microRNA expression profiles and applications thereof, including expression profiles of human milk microRNAs and their uses, specific microRNA expression profiles in human colostrum, and their use, expression profiles of specific microRNAs in human milk And its use, etc.
  • an artificial dairy product comprising one or more microRNA derived from human milk added exogenously, the human milk comprising human colostrum or a human Milk formation.
  • microRNA is selected from the group consisting of:
  • the dairy product comprises a colostrum product, a dairy product.
  • the dairy product includes milk powder, liquid milk, cheese, yogurt, and the like.
  • the dairy product further comprises one or more exogenously added microRNAs selected from the group consisting of: (e) the microRNAs listed in Table E; the table E as "microRNA” The expression spectrum is described in the section.
  • the dairy product has one or more of the following characteristics:
  • the two or more kinds are 2 to 500, preferably 3 to 300, more preferably 3 to 200.
  • the artificial dairy product is a dairy product suitable for infants from 0 to 24 months.
  • the artificial dairy product is a dairy product suitable for use in a population over 2 years of age.
  • an artificial food supplement comprising a food acceptable carrier and one or more microRNAs derived from human milk selected from the group consisting of :
  • the food supplement further comprises one or more microRNAs selected from the group consisting of: (e) the microRNAs listed in Table E.
  • the food supplement has one or more of the following characteristics:
  • microRNA expression profile of human colostrum The type and content of the exogenously added microRNA described in (a2) are similar to or the same as the microRNA expression profile of human colostrum;
  • a method of identifying a dairy product comprising the steps of:
  • step (3) comparing the microRNA species and its content measured in step (2) with the expression profile of the microRNA in the colostrum sample as a control and the milk-forming sample (ie, the type and content of the microRNA);
  • the dairy product is identified as a colostrum product; if the measured microRNA species and content thereof are compared with the milk-forming sample The microRNA expression profiles are similar or identical, and the dairy product is identified as a dairy product.
  • the dairy product (e.g., milk powder) comprises milk or a derivative thereof, goat milk or a derivative thereof, and human milk.
  • the expression profile of the microRNA in the milk or colostrum is obtained by detecting the type and amount of the microRNA in the milk or colostrum.
  • the microRNA expression profile in the colostrum comprises two or more microRNAs listed in Tables A and C; and the microRNA expression profile in the milk comprises Table B and The microRNAs listed in Table C.
  • a method of making a dairy product comprising the steps of:
  • step (3) comparing the microRNA species and its content measured in step (2) with the microRNA expression profile in the colostrum sample or the milk-forming sample as a control;
  • microRNA expression profile is closer or identical to the expression profile of the microRNA in the colostrum sample or the milk-forming sample as a control.
  • the dairy material is milk, goat milk, or a combination thereof.
  • a method of making a dairy product comprising the steps of:
  • microRNA expression profile in the dairy product It is closer or consistent with the expression profile of microRNAs in colostrum or milk.
  • the colostrum or milk is human colostrum or human milk.
  • a method of making a food supplement comprising the steps of:
  • the formulating step comprises mixing a food acceptable carrier with one or more artificially synthesized microRNAs to form a food supplement.
  • an isolated set of microRNAs consisting of two or more microRNAs derived from human milk selected from the group consisting of:
  • the microRNA collection comprises from 2 to 500 (preferably from 5 to 300, more preferably from 5 to 100) microRNA f j hook j3 ⁇ 4.
  • an artificial dairy, food or food supplement comprising the isolated microRNA collection of the seventh aspect of the invention as an active ingredient.
  • the microRNA expression profile of the artificial dairy product or food supplement is similar or identical to the microRNA expression profile in a normal human colostrum sample or a human milk sample.
  • Figure 1 is a differential analysis of microRNA expression in human colostrum and milk formation.
  • Figure 2 shows the luciferase activity of HEK-293 cells transfected with Pre-miR-19a and 3'-ESR1-wt.
  • Figure 3 shows the results of Western blot analysis of ESR1 expression in GFP-positive SK-N-BE (2) cells transfected with lentiviral expression vector (Lenti-ESR1) and blank control.
  • Figure 4 is a flow cytometric analysis of cell proliferation after Lenti-ESR1, blank control transfected cells. detailed description
  • microRNAs in human milk and milk or human milk secreted at different times ie, colostrum and milk.
  • MicroRNAs are non-coding single-stranded small RNA molecules of about 19 to 23 nucleotides in length. They are widely found in animal and plant cells and are highly conservative in evolution. MicroRNAs do not fully complement the 3' untranslated sequence of the target messenger RNA (mRNA), thereby inhibiting translation of the corresponding protein. As a potent regulator of mRNA, microRNAs are closely related to physiological or pathological activities. It involves various life activities such as biological individual development, tissue differentiation, cell apoptosis and energy metabolism, and is also closely related to the occurrence and development of many diseases. Human milk microRNA
  • microRNAs that are stably present in human milk are mostly involved in the immune system and neurodevelopment.
  • the immune-related microRNAs in human milk include miR-181a, mi-223, miR-146a, etc.
  • miR-181a is involved in the development of B cells, activation of T cells, and development of immunity.
  • miR181a promotes the development of B cells and the selection, activation, and sensitivity of CD4+ T cells.
  • Increased expression of miR181a in mature T cells enhances peptide antigen sensitivity.
  • miR-223 participates in defense by negatively regulating the proliferation and activation of neutrophils.
  • Mi-223 also actively regulates granulocyte differentiation, and miR-223 negatively regulates inflammatory responses.
  • miR-146a participates in defense through negative regulation of innate immunity. The expression of miR-146a in the alveolar epithelium is increased, negatively regulating IL-1B-induced IL-8 and RANTES, thereby activating and regulating the expression and secretion of normal T cells.
  • microRNAs associated with nerves in human milk include miR-140-3p, mi-107, miR-19a, etc.
  • miR-140-3p is involved in fetal neural stem cell development.
  • miR-107 directly targets the 3' non-coding region of CDK5R1 and affects neuronal migration by modulating CDK5R1 expression.
  • miR-19a is up-regulated in neuroblastoma cells, targeting and inhibiting estrogen receptor a (ESR1), a ligand-inducible expression transcription factor involved in neural cell differentiation.
  • ESR1 estrogen receptor a
  • the tiny ribonucleic acid present in human colostrum has some tiny ribonucleic acids, such as miR-33a*, mi-326, miR-488, etc., which participate in other physiological/pathological activities.
  • miR-33a members of the miR-33 family (hsa-miR-33a and hsa-miR-33b) regulate the metabolism of cholesterol and fatty acids.
  • members of the miR-33 family also regulate gene expression involved in cell cycle regulation and cell proliferation.
  • miR-33 inhibits the expression of cyclin-dependent kinase 6 (CDK6) and cyclin D1 (CCND1 protein), thereby reducing cell proliferation and cell cycle progression.
  • CDK6 cyclin-dependent kinase 6
  • CCND1 protein cyclin D1
  • mi-33a regulates the expression of ATP-binding transporter (ABCA1), cholesterol accumulation and insulin secretion.
  • miR-326 prevents and resists multidrug resistance during breast cancer chemotherapy by regulating the expression of multidrug resistance-associated protein 1 (MRP-1/ABCC1).
  • miR-488 is overexpressed in androgen-dependent and androgen-independent prostate cancer cells, downregulates the transcriptional activity of androgen receptors, and inhibits the production of androgen receptor proteins. miR-488 It blocks the spread of prostate cancer cells and promotes apoptosis of prostate cancer cells.
  • new guidelines can be provided for the formulation of infant foods (such as dairy products); It can detect the type and expression level of tiny ribonucleic acid present in the milk secreted by mothers in different periods (such as colostrum or milk), and form the microRNA expression spectrum unique to human milk in different periods, which can be used to guide infant food. Scientific segmentation.
  • the inventors can selectively increase and/or decrease the specific amount of microRNA in the dairy product according to the human milk microRNA expression profile, thereby making food, food supplements and new nutrition for special infants and young children. Products; can also be used to guide the development of new standards for dairy products.
  • the inventors examined the type and content of microRNAs in human milk, and screened and compared the test results to establish a human milk microRNA expression profile; and further examined the secretion of mothers at different times.
  • the types and contents of microRNAs in milk including colostrum and milk
  • screening and comparison of the test results thereby establishing a microRNA expression spectrum unique to colostrum and/or milk.
  • the inventors have determined a series of methods for efficiently and stably detecting human milk microribonucleic acid through a series of studies on the detection and application of human milk microRNA, the method for detecting microRNA in human milk, including (but not limited to): Solexa sequencing technology, RT-PCR, Real-time PCR, Northern Blotting, Western Blotting, etc.
  • microRNAs in human milk at different periods There are differences in expression. Therefore, microRNAs in human milk at different stages may have different effects on the growth and development of infants and young children in different periods, thus forming a series of microRNA expressions specific for milk or colostrum. Spectrum. microRNA expression profile
  • the microRNA expression profile may be a microRNA expression profile of a prior human milk sample or a human colostrum sample for use in a control, such as the microRNA expression profile shown in Table E;
  • microRNA expression profile described above can also be Invented microRNA expression profile.
  • the "microRNA expression profile of the present invention" described above is preferably an expression profile as follows:
  • the microRNA expression profile peculiar to human colostrum includes miRs numbered 1 to 42 in Table A.
  • microRNA expression profile specific to 61 mi -937 human milk is more preferably miR numbered 1 to 11 in Table B.
  • microRNAs listed in the table means one or more of the microRNAs listed in the table.
  • microRNA of the invention refers to a microRNA of one or more selected from the microRNA expression profiles of the invention.
  • the present invention provides an isolated microRNA set consisting of two or more (eg, 2 to 500, preferably 5 to 300, more preferably 5 to 100).
  • a microRNA selected from the group consisting of: (a) the microRNA specific to human colostrum listed in Table A; (b) the microRNA specific to human milk listed in Table B; (c) Table C Listed microRNAs shared by human colostrum and milk; (d) listed in Table D MicroRNAs that are not present in milk but are present in human colostrum or human milk.
  • the microRNA set is used as an active ingredient. It can be used to prepare artificial dairy products, food or food supplements, more preferably, microRNA expression profiles of the artificial dairy products or food supplements and microRNA expression in normal human colostrum samples or normal human milk samples. The spectrum is similar or the same.
  • the microRNA of the present invention is a small ribonucleic acid related to immunity, nervous system, etc., and plays a key role in infant immunity and neurodevelopment.
  • the microRNA of the invention or the microRNA expression profile of the invention has a multifaceted use: preferably as follows:
  • the present invention provides an artificial dairy product comprising one or more exogenously added microRNAs selected from the group consisting of: (a) a human colostrum-specific microRNA as listed in Table A; b) MicroRNAs specific to human milk listed in Table B; (c) MicroRNAs shared by human colostrum and milk formed in Table C; (d) listed in Table D, not in milk MicroRNAs present but present in human colostrum or human milk.
  • the dairy product further comprises one or more exogenously added microRNAs selected from the group consisting of: (e) the microRNAs listed in Table E.
  • the microRNAs listed in Table E are known microRNAs in human milk that have been reported in the literature.
  • the artificial dairy product may be a dairy product suitable for infants aged 0-24 months; or a dairy product suitable for people over 2 years of age.
  • the dairy product comprises a colostrum product, a dairy product.
  • the dairy product may also preferably comprise milk powder, liquid milk, cheese, yoghurt or the like.
  • the dairy product may have one or more of the following characteristics: (al) two or more of the exogenously added microRNAs (eg, 2 to 500, preferably 3 to 300, more preferably 3-200 species) from Table A; the type and content of the exogenously added microRNA described in (a2) are similar or identical to the microRNA expression profile of human colostrum; (b 1) among the exogenously added microRNAs Two or more kinds (such as 2-500, preferably 3-300, more preferably 3-200) are from Table B; (b2) The type and content of the exogenously added microRNA are different from those of humans.
  • the exogenously added microRNAs eg, 2 to 500, preferably 3 to 300, more preferably 3-200 species
  • microRNA expression profiles of the milk are similar or identical; (cl) two or more of the exogenously added microRNAs (eg, 2-500, preferably 3-300, more preferably 3-200) From the table C; (dl), two or more of the exogenously added microRNAs (e.g., 2 to 500, preferably 3 to 300, more preferably 3 to 200) are from Table D.
  • the present invention provides an artificial food supplement comprising a food acceptable carrier and one or more microRNAs selected from the group consisting of: (a) Human colostrums listed in Table A Specific microRNAs; (b) MicroRNAs specific to human milk listed in Table B; (c) MicroRNAs shared by human colostrum and milk in Table C; (d) listed in Table D MicroRNA that does not exist in milk but is present in human colostrum or human milk o
  • the food supplement further comprises one or more microRNAs selected from the group consisting of: (e) the microRNAs listed in Table E as described above.
  • the food supplement may have one or more of the following characteristics: (al) two or more of the exogenously added microRNAs (eg, 2-500, preferably 3-300, more preferably 3-200 species) from Table A; (a2) the type and content of the exogenously added microRNA are similar or identical to the microRNA expression profile of human colostrum; (bl) the exogenously added microRNA is Two or more species (e.g., 2-500, preferably 3-300, more preferably 3-200) are from Table B; (b2) The type and content of the exogenously added microRNA are different from those of the human.
  • the exogenously added microRNAs eg, 2-500, preferably 3-300, more preferably 3-200 species
  • microRNA expression profiles of the milk are similar or identical; (cl) two or more of the exogenously added microRNAs (eg, 2-500, preferably 3-300, more preferably 3-200) Two or more of exogenously added microRNAs as described in Table C; (dl) (e.g., 2 to 500, preferably 3 to 300, more preferably 3 to 200) are from Table D.
  • the present invention provides a method of identifying a dairy product, the method comprising the steps of:
  • a dairy product e.g., milk powder
  • a dairy product e.g., milk powder
  • milk powder preferably, including milk or a derivative thereof, goat milk or a derivative thereof, human milk, etc.
  • step (3) comparing the microRNA species and its content measured in step (2) with the expression profile of the microRNA in the colostrum sample as a control and the milk-forming sample (ie, the type and content of the microRNA);
  • the dairy product is identified as a colostrum product; if the measured microRNA species and content thereof are compared with the milk-forming sample The microRNA expression profiles are similar or identical, and the dairy product is identified as a dairy product.
  • the microRNA expression profile in a milk-forming sample or a colostrum sample is obtained as a control by detecting the type and amount of microRNA in the milk or colostrum.
  • the microRNA expression profile of the control milk-forming sample or colostrum sample may comprise a microRNA of the invention, and may also comprise a microRNA known in the art (such as the microRNAs listed in Table E). More preferably, the microRNA expression profile in the colostrum sample of the control comprises: two or more microRNAs listed in Table A and Table C; and the microRNA expression profile in the milk sample of the control Includes the microRNAs listed in Tables B and C. 3, according to the human milk microRNA expression profile, can selectively increase and / or reduce the content of specific types of microRNA in infant foods (such as dairy products), thus making food for special infants (including dairy products) ), food supplements and new nutritional products.
  • infant foods such as dairy products
  • the present invention provides a method of making a dairy product, the method comprising the steps of:
  • dairy raw material including: milk, goat's milk, or a combination thereof
  • step (3) comparing the microRNA species and its content measured in step (2) with the microRNA expression profile in the colostrum sample or the milk-forming sample as a control;
  • microRNA expression profile is closer or identical to the expression profile of the microRNA in the colostrum sample or the milk-forming sample as a control.
  • the microRNA expression profile of the control milk-forming sample or colostrum sample, the method of obtaining the microRNA contained therein and the microRNA contained therein are as described above.
  • the present invention also provides a method of making a dairy product, the method comprising the steps of:
  • microRNA expression profile in the dairy product It is closer or consistent with the microRNA expression profile in colostrum or milk.
  • the colostrum or milk is human colostrum or human milk.
  • microRNAs may comprise a microRNA of the invention, and may also comprise a microRNA known in the art (such as the microRNAs listed in Table E). More preferably, the microRNA of the invention is included: one or more of the microRNAs listed in Table A, Table B, Table C and/or Table D.
  • the present invention also provides a method of making a food supplement, the method comprising the steps of:
  • the formulating step comprises mixing a food acceptable carrier with one or more artificially synthesized microRNAs to form a food supplement.
  • the microRNA expression profile in a control normal colostrum sample or a normal milk-forming sample is obtained by detecting the type and amount of microRNA in normal or normal colostrum.
  • the normal milk-forming sample or the normal colostrum sample refers to the milk-forming or colostrum, and for infants, the microRNA containing sufficient growth (including species and content).
  • the main advantages of the invention include: 1.
  • the present invention provides a new collection of microRNAs that can be used to prepare artificial dairy products, food or food supplements, and the like.
  • the present invention establishes a series of human milk microRNA expression profiles, including human milk (broad-spectrum-containing or unique) microRNA expression profiles, specific microRNA expression profiles in human colostrum, or expression profiles of specific microRNAs in human milk. And, and the use of the microRNA expression profile, the microRNA expression profile can be used to guide the preparation of artificial dairy products, food or food supplements; it can also be used to identify dairy products as dairy or colostrum products.
  • the invention will be further elucidated below in conjunction with specific implementations. It is to be understood that the examples are merely illustrative of the invention and are not intended to limit the scope of the invention.
  • Solexa sequencing technology is used to detect a large number of tiny ribonucleic acids that are stably present in human milk.
  • the specific steps include:
  • Table 1 shows the sequencing results of microRNAs in human milk. It can be seen from the sequencing results that a large number of tiny ribonucleic acids are stably present in human milk.
  • miR- 136 miR-196b miR-29b-2* miR-342-5p miR-454 miR-582-3p
  • miR-140-3p miR- 197 miR-29c miR-34a miR-454* miR-582-5p
  • This example combines the Solexa sequencing results of microRNAs in human milk and colostrum to establish a uniform standard for detection of human milk microRNAs.
  • the detection results are classified as follows in the range of copy number of colostrum and milk (in other examples, the classification of the detection results is the same as this method). Copy number content classification
  • Table 2 is a table showing the difference in expression of microRNAs in human milk and colostrum. As can be seen from the results, most of the microRNAs can be detected in human milk and colostrum, and only a small part of microRNA is specifically expressed in human milk or colostrum. The microRNAs expressed in human milk are not much different in type from colostrum, but many microRNAs have different expression levels (eg let-7a* let-7b* let -7d* and so on).
  • T ⁇ 233 mi -409-3p is less miR- 148b*
  • Example 3 MicroRNAs with different expression in human milk and colostrum
  • This example combines the results of Solexa sequencing of microRNAs with different expression in human milk and colostrum to establish a perfect human milk microRNA expression profile.
  • Table 3 shows the microRNAs that differ in expression between human milk and colostrum. It can be seen from the results that 115 miRNAs are differentially expressed, 94 miRNAs are more abundant in human colostrum, and 21 miRNAs are less abundant in human colostrum. The results showed that the content of most microRNAs in human milk decreased with the lactation process. Table 3 MicroRNAs with different expression in human fox colostrum
  • T 73 mi -383 less T miR- 136* less less 74 mi -3909 less less mi -140-3p ⁇ higher 75 mi -3913 less less miR- 143* less less less 76 mi -410 less miR- 147b less less 77 mi -423-5p less by
  • T is higher 82 mi -499-3p less mi -181d less ⁇ 83 mi -501-3p less ⁇ miR- 185* less less less 84 mi -502-3p less less miR- 18a T less 85 Mi-505 less less miR- 195* less less less 86 mi -511 ⁇ less miR- 196b ⁇ less 87 mi -512-3p less miR- 197 less
  • ESR1 is a ligand-inducible expression transcription factor involved in neural cell differentiation. The reintroduction of the ESR1 gene causes a significant block in the cell cycle in neuroblastoma cells, which is not conducive to the differentiation of nerve cells.
  • the luciferase assay was used to verify that miR-19a negatively regulates estrogen receptor a (ESR1).
  • the specific steps are as follows: (1) Construction of a 3' non-coding region fluorescent reporter gene structure containing Pre-miR-19a and ESR1, respectively (3) '-ESR1-wt) and 3'-ESR1-wt luciferase expression plasmid;
  • HEK-293 cells were cultured and seeded in 24-well plates for 10-24 hours;
  • luciferase expression plasmid co-transfecting the luciferase expression plasmid with HEK-293 cells; (6) The luciferase substrate is added, luciferase reacts with the substrate to produce fluorescein, and the activity of the luciferase can be determined by detecting the intensity of the fluorescence.
  • Figure 2 shows the luciferase activity of HEK-293 cells transfected with Pre-miR-19a and 3'-ESR1-wt.
  • *** indicates P ⁇ 0.1%.
  • ES 1 is a ligand-inducible expression transcription factor involved in neural cell differentiation. miR-19a negatively regulates the expression of ESR1, and next studies the role of ESR1 expression in neural cells.
  • a lentiviral expression vector (Lenti-ESR1) was constructed, and the ESR1 cDNA was expressed using a lentivirus structure, and then transfected into human neuroblastoma cells __ SK-N-BE(2) cells.
  • the specific steps are:
  • Electrophoresis Separation by electrophoresis on a 10% SDS-polyacrylamide gel (SDS-PAGE);
  • PVDF polyvinylidene fluoride
  • HRP horseradish peroxidase
  • Protein detection Proteins were detected using enhanced chemiluminescence reagents; Bandscan software was used to scan and quantify the autoradiography intensity of each band. Cell proliferation after Lenti-ESR1, Lenti-EmptyVector transfected cells was detected by flow cytometry analysis. The specific steps are:
  • FIG 3 shows the results of Western blot analysis of ESR1 expression in GFP-positive SK-N-BE(2) cells transfected with Lenti-ESRl Lenti-Empty Vector.
  • ESR1 was hardly expressed in GFP-positive SK-N-BE(2) cells transfected with Lenti-Empty Vector.
  • the cells transfected with Lenti-Empty Vector were used as blank controls, and ESR1 was significantly increased in GFP-positive SK-N-BE(2) cells transfected with Lenti-ESR1.
  • Figure 4 shows the results of flow cytometry analysis of cell proliferation after transfection of Lenti-ESR1 Lenti-Empty Vector cells.
  • *** indicates P ⁇ 0.1%.
  • the expression of ESR1 in SK-N-BE(2) cells transfected with Lenti-ESR1 resulted in a markedly significant decrease in cell proliferation.
  • miR-19a inhibits the expression of ESR1, and inhibition of ESR1 contributes to the differentiation of nerve cells. It can be seen that miR-19a is beneficial to the differentiation of nerve cells.
  • the results indicate that human milk microRNA is involved in the nervous system.
  • Example 5 Human milk microRNA expression profile
  • This embodiment detects the type and content of microRNA in milk, and screens and compares the results of the milk (such as colostrum and milk) secreted in different periods in Example 2, thereby forming human milk.
  • microRNA expression profile peculiar to human milk refers to microRNAs present in human milk and/or human colostrum, but not present in cow's milk, as shown in Table 4.
  • ⁇ is higher 167 mi -548k less T mi -181a-2* higher higher 168 mi -548n less mi -181c* by
  • the microRNA expression profile peculiar to human colostrum is: (1) a microRNA having a higher content in human colostrum than human milk, or (2) being detected in human colostrum , but not detected or absent in human milk; as shown in Table 5.
  • Number mi species mi content mi content number mi species mi content mi content
  • T is higher 57 mi -296-5p less less
  • T is higher 58 mi -29a* less less
  • T is higher 59 mi -3158 less less
  • T is higher 60 mi -3182 less less
  • T is higher 61 mi -320b less less
  • T is higher 62 mi -320c less less
  • microRNA expression profile peculiar to the human milk is: (1) a microRNA having a higher content in human milk than in human colostrum, or (2) being detected in human milk. , but not detected or absent in human colostrum; as shown in Table 6.
  • microRNA described in Table 5 which is high in human colostrum, is added to the dairy product and can be used in baby foods from 0-1 months ago. 2. Add the microRNA described in Table 6 with high content in human milk to dairy products for infant foods from 1 to 24 months.
  • Mi -148, mi -138, miR-146-5p, mi -523-5p, mi -523-3p, miR-885-3p, mi -935, mi -1308, miR-1306 are present in cow's milk, in human Does not exist in milk. However, most of these microRNAs are up-regulated in cancer patients and play a negative role in cancer regulation.

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Description

人乳微小核糖核酸及其应用
技术领域
本发明属于生物制品领域， 具体地， 本发明涉及人乳微小核糖核酸及其应用。 背景技术
母乳被公认为是婴幼儿最理想的食物。 世界卫生组织也指出， 母乳是婴幼儿健康 生长发育的理想食物。 因为母乳含有适合婴儿生长发育需要的各类营养物质， 营养成 分全面且更易被吸收。另外，母乳还含有利于增强免疫的营养成分，例如，乳铁蛋白 (其 能抑制需铁有害菌)， 以及抗感染的活性白细胞、 免疫抗体和其他免疫因子。 初乳中尤 其含有大量免疫球蛋白， 可保护婴儿免受细菌感染， 从而不易发生肺炎等疾病。
当母亲因不能哺乳或泌乳不佳等原因不能进行母乳喂养时， 则需选用母乳替代品 (如婴儿配方奶)。配方奶的制作是以母乳为标准， 通过对牛奶进行改良， 使配方奶最大 程度地接近母乳， 从而符合婴幼儿的消化吸收和营养需要。
国际母乳会指出， 与母乳相比， 现有的配方奶不仅缺少如羟酸、 多种矿物质、 激 素、包括氨基酸和核苷酸在内的非蛋白质含氮物等重要成分， 而且主要含有的蛋白质、 脂肪、 维生素等种类不够丰富， 且也不利于婴儿消化吸收。 总之， 现有的配方奶在尽 量接近母乳， 但是与母乳还是相差甚远。
因此， 本领域仍需要开发一种营养物质更接近母乳的乳制品。 发明内容
本发明的目的之一是提供一种新的 microRNA集合， 所述的 microRNA可用于配 制婴幼儿食品或食品添加剂或补充剂。
本发明的另一目的是提供一系列 microRNA表达谱及其应用，包括人乳 microRNA 的表达谱及其用途， 人初乳中特有的 microRNA表达谱及其用途， 人成乳中特有 microRNA的表达谱及其用途等。
在本发明第一方面中， 提供了一种人工的乳制品， 所述的乳制品中含有外源添加 的一种或多种源自人奶的 microRNA, 所述人奶包括人初乳或人成乳。
在另一优选例中， 所述的 microRNA选自下组：
(a)表 A中所列出的人初乳特有的 microRNA;
(b)表 B中所列出的人成乳特有的 microRNA;
(c)表 C中所列出的人初乳和成乳共有的 microRNA; 和
(d)表 D中所列出的、 牛奶中不存在但在人初乳或人成乳中存在的 microRNA; 所述的表 、 表8、 表 C和表 D如 "microRNA表达谱"一节中所述。
在另一优选例中， 所述的乳制品包括初乳制品、 成乳制品。 所述的乳制品包括奶粉、 液态奶、 奶酪、 酸奶等。
在另一优选例中， 所述的乳制品还含有外源添加的一种或多种选自下组的 microRNA: (e)表 E中所列出的 microRNA; 所述的表 E如 "microRNA表达谱"一节 中所述。
在另一优选例中， 所述的乳制品具有以下一个或多个特征：
(al) 所述的外源添加的 microRNA中有两种或多种来自表 A;
(a2) 所述的外源添加的 microRNA的种类和含量与人初乳的 microRNA表达谱相 近或相同；
(bl)所述的外源添加的 microRNA中有两种或多种来自表 B;
(b2)所述的外源添加的 microRNA的种类和含量与人成乳的 microRNA表达谱相 近或相同；
(cl)所述的外源添加的 microRNA中有两种或多种来自表 C;
(dl)所述的外源添加的 microRNA中有两种或多种来自表 D。
在另一优选例中， 所述的两种或多种为 2-500种， 较佳地 3-300种， 更佳地 3-200 种。
在另一优选例中， 所述的人工的乳制品是适用于 0-24个月婴幼儿的乳制品。
在另一优选例中， 所述的人工的乳制品是适用于 2周岁以上人群的乳制品。
在本发明第二方面中， 提供了一种人工的食品补充剂， 所述的食品补充剂含有食 品学上可接受的载体以及一种或多种选自下组的、 源自人奶的 microRNA:
(a)表 A中所列出的人初乳特有的 microRNA;
(b)表 B中所列出的人成乳特有的 microRNA;
(c)表 C中所列出的人初乳和成乳共有的 microRNA; 和
(d)表 D中所列出的、 牛奶中不存在但在人初乳或人成乳中存在的 microRNA; 所述的表 、 表^ 表 C和表 D同本发明第一方面中所述。
在另一优选例中，所述的食品补充剂还含有一种或多种选自下组的 microRNA: (e) 表 E中所列出的 microRNA。
在另一优选例中， 所述的食品补充剂具有以下一个或多个特征：
(al) 所述的外源添加的 microRNA中有两种或多种来自表 A;
(a2)所述的外源添加的 microRNA的种类和含量与人初乳的 microRNA表达谱相 近或相同；
(bl) 所述的外源添加的 microRNA中有两种或多种来自表 B;
(b2)所述的外源添加的 microRNA的种类和含量与人成乳的 microRNA表达谱相 近或相同；
(cl)所述的外源添加的 microRNA中有两种或多种来自表 C; (dl) 所述的外源添加的 microRNA中有两种或多种来自表 D。
在本发明第三方面中， 提供了一种鉴别乳制品的方法， 所述方法包括步骤：
(1)提供一乳制品样品；
(2)检测所述乳制品样品中 microRNA的种类及其含量；
(3)将步骤 (2)测得的 microRNA种类及其含量， 与作为对照的初乳样品以及成乳 样品中 microRNA的表达谱 (即 microRNA种类及其含量)进行比较；
其中， 如果测得的 microRNA的种类及其含量与初乳样品的 microRNA表达谱相 近或相同， 则鉴定所述乳制品为初乳制品； 如果测得的 microRNA的种类及其含量与 成乳样品的 microRNA表达谱相近或相同， 则鉴定所述乳制品为成乳制品。
在另一优选例中，所述的乳制品 (如奶粉)包括牛奶或其衍生乳制品、羊奶或其衍生 乳制品、 人奶。
在另一优选例中， 通过检测成乳或初乳中 microRNA的种类及其含量， 获得成乳 或初乳中 microRNA的表达谱。
在另一优选例中， 所述的初乳中的 microRNA表达谱包括表 A和表 C中所列出的 两种或多种 microRNA; 并且所述的成乳中的 microRNA表达谱包括表 B和表 C中所 列出的 microRNA。
在本发明第四方面中， 提供了一种制造乳制品的方法， 包括步骤：
(1)提供一乳制品原料；
(2)检测所述乳制品原料中 microRNA的种类及其含量，得到第一 microRNA表达 谱；
(3) 将步骤 (2)测得的 microRNA种类及其含量， 与作为对照的初乳样品或成乳样 品中 microRNA表达谱进行比较；
(4) 基于比较结果， 向所述乳制品原料中添加一种或多种 microRNA和 /或从所述 乳制品原料中去除一种或多种 microRNA，从而制得乳制品，其中所述乳制品 microRNA 表达谱与作为对照的初乳样品或成乳样品中 microRNA的表达谱更接近或一致。
在另一优选例中， 所述的乳制品原料是牛奶、 羊奶、 或其组合。
在本发明第五方面中， 提供了一种制造乳制品的方法， 包括步骤：
(1)提供一乳制品原料；
(2) 向所述乳制品原料中添加一种或多种 microRNA和 /或从所述乳制品原料中去 除一种或多种 microRNA,从而制得乳制品，其中所述乳制品中 microRNA表达谱与初 乳或成乳中 microRNA的表达谱更接近或一致。
在另一优选例中， 所述的初乳或成乳是人初乳或人成乳。
在本发明第六方面中， 提供了一种制造食品补充剂的方法， 包括步骤：
(1) 检测某一对象的母乳中 microRNA 的种类及其含量， 从而获得该对象的第一 microRNA表达谱；
(2)将测得的第一表达谱的 microRNA种类及其含量，与作为对照的正常初乳样品 或正常成乳样品中 microRNA 表达谱进行比较， 从而确定第一表达谱中所缺乏的 microRNA或含量不足因而需要部分补充的 microRNA;
(3) 配制食品补充剂，其中所述的食品补充剂含有上一步骤中所确定的第一表达谱 中所缺乏的 microRNA或含量不足因而需要部分补充的 microRNA。
在另一优选例中， 在配制步骤中， 包括将食品学上可接受的载体与一种或多种人 工合成的 microRNA进行混合， 从而形成食品补充剂。
在本发明第七方面中， 提供了一种分离的 microRNA集合 (set), 所述的 microRNA 集合由二种或多种选自下组的、 源自人奶的 microRNA所构成：
(a)表 A中所列出的人初乳特有的 microRNA;
(b)表 B中所列出的人成乳特有的 microRNA;
(c)表 C中所列出的人初乳和成乳共有的 microRNA; 和
(d)表 D中所列出的、 牛奶中不存在但在人初乳或人成乳中存在的 microRNA; 所述的表 、 表^ 表 C和表 D同本发明第一方面中所述。
在另一优选例中，所述的 microRNA集合由 2-500种 (较佳地 5-300种，更佳地 5- 100 禾中) microRNA f 卞勾 j¾。
在本发明第八方面中， 提供了一种人工的乳制品、 食品或食品补充剂， 含有本发 明第七方面所述的分离的 microRNA集合作为有效成分。
在另一优选例中， 所述的人工的乳制品或食品补充剂的 microRNA表达谱与正常 的人初乳样品或人成乳样品中的 microRNA表达谱相近或相同。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文 (如实施例)中具体 描述的各技术特征之间都可以互相组合， 从而构成新的或优选的技术方案。 限于篇幅， 在此不再 累述。 附图说明
图 1是人初乳、 成乳中 microRNA表达差异分析。
图 2是转染 Pre-miR-19a和 3'-ESRl-wt的 HEK-293细胞的荧光素酶活性。
图 3是 ESR1在转染慢病毒表达载体 (Lenti-ESRl)、空白对照的 GFP阳性 SK-N-BE (2)细胞中表达的 Western blot结果。
图 4是 Lenti-ESR1、 空白对照转染细胞后的细胞增殖的流式细胞仪分析结果。 具体实施方式
本发明人通过长期而深入的研究， 意外地发现人乳和牛乳中或者人于不同时期所 分泌的乳汁 (即初乳与成乳)中的微小核糖核酸的种类或含量存在着差异。发明人通过对 牛乳、 人初乳与人成乳的微小核糖核酸的种类或含量的筛选和比对， 形成了多种人乳 微小核糖核酸表达谱， 在配制婴幼儿食品配方或分段等方面具有很好的指导意义。 在 此基础上， 发明人完成了本发明。 微小核糖核酸
微小核糖核酸 (microRNA, 简写为 miRNA或 miR)， 是一类长约 19至 23个核苷 酸的非编码单链小核糖核酸分子。它们广泛存在于动植物细胞中， 在进化上高度保守。 MicroRNA通过识别靶信使 RNA (mRNA)的 3'端非翻译序列， 与之不完全互补， 从而 抑制相应蛋白质的翻译。 作为 mRNA强有力的调节因子， microRNA与生理或病理活 动密切相关。 其涉及生物个体发育、 组织分化、 细胞调亡及能量代谢等多种生命活动， 也与许多疾病的发生和发展紧密联系。 人乳微小核糖核酸
发明人通过研究证实： 人乳中存在着这种极其重要的因子 __微小核糖核酸。 并且发现稳定存在于人乳中的微小核糖核酸大多与免疫系统和神经发育有关。 人乳中与免疫有关的微小核糖核酸包括 miR-181a、 mi -223, miR-146a等， 例如， miR-181a与 B细胞的发育、 T细胞的活化， 以及免疫的发育有关。 miR181a促进 B细 胞的发育和 CD4+T细胞的选择、 激活、 敏感性。 在成熟 T细胞增加 miR181a的表达 可增强肽抗原的敏感性。 miR-223 通过负调控中性粒细胞的增殖和活化， 参与防御。 mi -223还积极调控粒细胞的分化， miR-223负调控炎症反应。 miR-146a通过负调控 先天免疫参与防御。 miR-146a在肺泡上皮表达增加， 负调控 IL-1B 诱导的 IL-8 和 RANTES, 从而激活调节正常 T细胞表达和分泌。
人乳中与神经有关的微小核糖核酸包括 miR-140-3p、 mi -107, miR-19a等，例如， miR-140-3p与胎儿神经干细胞发育有关。 miR-107直接靶向 CDK5R1的 3'非编码区， 通过调节 CDK5R1 表达影响神经细胞迁移。 miR-19a在神经瘤母细胞中表达上调， 靶 向、抑制雌激素受体 a(ESRl)， ES 1是与神经细胞分化有关的配体诱导表达转录因子。
人初乳中存在的微小核糖核酸除了与免疫和神经系统有关外， 还有些微小核糖核 酸， 比如 miR-33a*、 mi -326, miR-488等， 参与其他的生理 /病理活动。例如， miR-33 家族成员 (hsa-miR-33a和 hsa-miR-33b)调节胆固醇和脂肪酸的代谢。 miR-33家族成员 还调节参与细胞周期调控和细胞增殖的基因表达。 miR-33抑制细胞周期蛋白依赖激酶 6(CDK6)和 cyclin D1(CCND1 蛋白）的表达， 从而减少细胞增殖和细胞周期的进程。 mi -33a在胰岛素细胞中， 调节 ATP结合转运体 (ABCA1)的表达， 胆固醇的积累及胰 岛素分泌。 miR-326通过调节多药耐药相关蛋白 1(MRP-1/ABCC1)的表达，在乳腺癌化 疗过程中预防和抵抗多药耐药性。 miR-488 在雄激素依赖和雄激素非依赖的前列腺癌 细胞中过表达， 下调雄激素受体的转录活性， 抑制雄激素受体蛋白的产生。 miR-488 阻碍前列腺癌细胞的扩散， 促进前列腺癌细胞的凋亡。
因此， 若能检测母乳中存在的微小核糖核酸的种类及表达水平， 形成人乳或其特 异的微小核糖核酸表达谱，则可为婴幼儿食品 (如乳制品)配方提供新的指导标准； 若能 检测母亲在不同时期所分泌乳汁 (如初乳或成乳)中存在的微小核糖核酸的种类和表达 水平， 形成不同时期的人乳特有的微小核糖核酸表达谱， 则可用于指导婴幼儿食品的 科学分段。 另外， 发明人还可根据人乳微小核糖核酸表达谱， 选择性地升高和 /或降低 乳品中特定种类微小核糖核酸的含量， 从而制成针对特殊婴幼儿的食品、 食品补充剂 和新型营养品； 还可用于指导制定乳制品新标准的方法等。
为此， 发明人检测人乳中的微小核糖核酸的种类和含量， 并对检测结果进行筛选 和比对， 从而建立了人乳微小核糖核酸表达谱； 并进一步检测了母亲于不同时期所分 泌的乳汁 (包括初乳与成乳)中的微小核糖核酸的种类和含量，并对检测结果进行筛选和 比对， 从而建立了初乳和 /或成乳特有的微小核糖核酸表达谱。 这些技术进步在本技术 领域尚属首次。 检测
发明人通过一系列对人乳微小核糖核酸的检测及其应用的研究， 确定了一系列高 效、 稳定地检测人乳微小核糖核酸的方法， 所述的检测人乳中微小核糖核酸的方法， 包括 (但不限于)： Solexa测序技术、 RT-PCR、 Real-time PCR、 Northern Blotting、 Western Blotting等。
此外，对人乳微小核糖核酸 (包括种类及其含量)的检测结果表明：人乳中大量存在 着与免疫和神经系统有关的微小核糖核酸， 人乳微小核糖核酸可能在婴儿的免疫及神 经发育发挥关键作用， 从而形成了一系列人乳或其特异的微小核糖核酸表达谱。另外， 发明人对母亲于不同时期所分泌的乳汁 (包括初乳和 /或成乳)中的微小核糖核酸 (包括 种类及其含量)的检测结果表明： 不同时期的人乳中微小核糖核酸的表达存在着差异， 因此， 不同时期的人乳中微小核糖核酸很有可能会对不同时期的婴幼儿的生长和发育 产生不同影响， 从而形成了一系列成乳或初乳特异的微小核糖核酸表达谱。 microRNA表达谱
所述的 microRNA表达谱可以是现有的用于对照的人成乳样品或人初乳样品中 microRNA表达谱， 例如表 E所示的 microRNA表达谱；
表 E
Figure imgf000007_0001
let-7f mi -125b miR-146a miR-182 mi -204 mi -221 mi -345 mi -484 mi -874 let-7i miR-126 miR-150 miR-183 mi -205 mi -222 mi -365 mi -497 mi -877 mi -1 miR-128 miR-152 miR-184 mi -21 mi -223 mi -375 mi -503 mi -92a mi -98 mi -96 mi -93 所述的 microRNA表达谱也可以是本发明的 microRNA表达谱。所述的"本发明的 microRNA表达谱"优选为如下表达谱：
1. 人初乳特有的 microRNA表达谱， 例如表 A所示。
表 A
Figure imgf000008_0001
人初乳特有的 microRNA表达谱更优选包括表 A中编号为 1〜42的 miR。
2. 人成乳特有的 microRNA表达谱， 如表 B所示;
表 B
编号 mi 种类 编号 mi 种类 编号 mi 种类 编号 mi 种类
1 let-7g 16 miR- 153 31 mi -376a 46 mi -548v
2 mi -30b 17 mi -19b-l* 32 mi -411 47 mi -552
3 mi -200a* 18 miR-2110 33 mi -4297 48 mi -589*
4 mi -200c 19 miR-2116* 34 mi -488 49 mi -641 mi -18a 20 mi -2277-3p 35 mi -491-5p 50 mi -643 mi -196b 21 mi -3065-3p 36 mi -514 51 mi -95 mi -200b* 22 mi -3074 37 mi -516b 52 mi -3200-3p mi -224 23 mi -3115 38 mi -517c 53 mi -339-5p mi -511 24 mi -3174 39 mi -518e 54 mi -499-3p mi -99a* 25 mi -3190 40 mi -519a* 55 mi -512-3p mi -3656 26 mi -3200-5p 41 mi -519b-3p 56 mi -517a mi -1228* 27 mi -326 42 mi -520a-5p 57 mi -517b mi -1249 28 mi -3617 43 mi -520f 58 mi -519a mi -1276 29 mi -3620 44 mi -522 59 mi -519c-3p mi -1283 30 mi -3654 45 mi -524-3p 60 mi -671 -3p
61 mi -937 人成乳特有的 microRNA表达谱更优选为表 B中编号为 1〜11的 miR。
3. 人初乳和成乳共有的 microRNA表达谱， 如表 C所示；
表 C
mi 种类 编号 mi 种类 编号 mi 种类 编号 mi 种类 let-7a* 87 miR- 190 173 mi -3196 259 mi -500b let-7b* 88 miR- 190b 174 mi -32 260 mi -501-3p let-7d* 89 miR- 191 175 mi -32* 261 mi -501-5p let-7e* 90 miR- 192* 176 mi -3200-3p 262 mi -502-3p let-7f-l* 91 mi -193a-3p 177 mi -320a 263 mi -502-5p let-7f-2* 92 mi -193a-5p 178 mi -320b 264 mi -504 let-7g 93 miR- 193b 179 mi -320c 265 mi -505 let-7g* 94 miR- 194 180 mi -320d 266 miR-511 let-7i* 95 miR- 195* 181 mi -324-3p 267 mi -512-3p miR- 100* 96 miR- 196a 182 mi -324-5p 268 mi -515-5p mi -101* 97 miR- 196a* 183 mi -330-3p 269 mi -517a miR- 103-2* 98 miR- 196b 184 mi -330-5p 270 mi -517b miR- 106a 99 miR- 197 185 mi -331-3p 271 mi -519a miR- 106b 100 mi -199a-3p 186 mi -331-5p 272 mi -519c-3p miR- 106b* 101 mi -199b-3p 187 mi -335 273 mi -520a-3p miR- 10a 102 mi -199b-5p 188 mi -335* 274 mi -532-3p miR- 10a* 103 miR- 19a 189 mi -338-3p 275 mi -532-5p miR- 10b 104 miR- 19b 190 mi -339-3p 276 mi -542-3p miR- 1246 105 mi -200a 191 mi -339-5p 277 mi -548c-5p miR- 1251 106 mi -200a* 192 mi -33a 278 mi -548d-5p mi -125a-3p 107 mi -200b 193 mi -33a* 279 mi -548e mi -125a-5p 108 mi -200b* 194 mi -33b 280 mi -548h miR- 125b- 1* 109 mi -200c 195 mi -33b* 281 mi -548i mi -125b-2* 110 mi -200c* 196 mi -340* 282 mi -548j miR- 126* 111 mi -20a 197 mi -342-3p 283 mi -548k miR- 1260 112 mi -20a* 198 mi -342-5p 284 mi -548n miR- 1260b 113 mi -20b 199 mi -34a 285 mi -548o miR- 1262 114 mi -21 * 200 mi -34a* 286 mi -548p miR- 1266 115 mi -2114 201 mi -34b* 287 mi -548y
Figure imgf000010_0001
76 mi -181c 162 mi -30e 248 mi -454 334 mi -92a-l*
77 mi -181c* 163 mi -30e* 249 mi -454* 335 mi -92b
78 mi -181d 164 mi -3116 250 mi -455-3p 336 mi -93*
79 mi -182* 165 mi -3127 251 mi -455-5p 337 mi -934
80 mi -183* 166 mi -3130-3p 252 mi -486-5p 338 mi -937
81 mi -185* 167 mi -3130-5p 253 mi -489 339 mi -941
82 mi -187 168 mi -3133 254 mi -493 340 mi -944
83 mi -188-3p 169 mi -3144-3p 255 mi -499-3p 341 mi -99a
84 mi -188-5p 170 mi -3158 256 mi -499-5p 342 mi -99a*
85 mi -18a 171 mi -3182 257 mi -500a 343 mi -99b
86 mi - 18a* 172 mi -3194 258 mi -500a* 344 mi -99b*
4. 牛奶中不存在、 但在人初乳或成乳存在的 microRNA表达谱， 如表 D所示。
表 D
编号 mi 种类 编号 mi 种类 编号 mi 种类 编号 mi 种类
1 let-7a* 61 mi -200c* 121 mi -3664 181 mi -589
2 let-7b* 62 mi -20a* 122 mi -3677 182 mi -590-3p
3 let-7d* 63 mi -20b 123 mi -3688 183 mi -590-5p
4 let-7e* 64 mi -21* 124 mi -374a* 184 mi -597
5 let-7f-l* 65 mi -2114 125 mi -374b* 185 mi -598
6 let-7f-2* 66 miR-2114* 126 mi -377 186 mi -616*
7 let-7g* 67 miR-2115 127 mi -378* 187 mi -618
8 let-7i* 68 miR-2115* 128 mi -3909 188 mi -624*
9 miR- 100* 69 miR-2116 129 mi -3912 189 mi -625
10 mi -101* 70 mi -22* 130 mi -3913 190 mi -625*
11 miR- 103-2* 71 mi -221* 131 mi -3919 191 mi -627
12 miR- 106b* 72 mi -223* 132 mi -3920 192 mi -629
13 miR- 10a* 73 mi -224* 133 mi -3942 193 mi -629*
14 miR- 1251 74 mi -2277-5p 134 mi -409-3p 194 mi -642a
15 miR- 125b- 1* 75 mi -2355-3p 135 mi -410 195 mi -651
16 mi -125b-2* 76 mi -2355-5p 136 mi -422a 196 mi -708*
17 miR- 126* 77 mi -24-2* 137 mi -425* 197 mi -7- 1 *
18 miR- 1260b 78 mi -26a-l* 138 mi -4284 198 mi -744*
19 miR- 1262 79 mi -26b* 139 mi -4286 199 mi -766
20 miR- 1266 80 mi -27a* 140 mi -4326 200 mi -769-3p
21 miR- 1271 81 mi -27b* 141 mi -449b 201 mi -769-5p
22 miR- 1275 82 mi -28-3p 142 miR-454 202 mi -873
23 miR- 1280 83 mi -296-5p 143 miR-454* 203 mi -889
24 miR- 1287 84 mi -29a* 144 miR-489 204 mi -891a
25 miR- 1294 85 mi -29b-2* 145 miR-493 205 mi -92a-l*
26 miR- 1299 86 mi -29c* 146 mi -499-3p 206 mi -93*
27 miR- 1301 87 mi -301b 147 mi -500a 207 miR-934
28 miR- 1303 88 mi -30a* 148 mi -500a* 208 miR-937
29 miR- 130b* 89 mi -30b* 149 mi -500b 209 miR-941
30 miR- 132* 90 mi -30c-l* 150 mi -501-5p 210 miR-944 31 mi -135b 91 mi -30c-2* 151 mi -502-5p 211 mi -99a*
32 mi -136* 92 mi -30d* 152 mi -504 212 mi -99b*
33 mi -141* 93 mi -30e* 153 mi -511 213 miR- 10b
34 mi -143* 94 mi -3116 154 mi -512-3p 214 miR- 1260
35 mi -144* 95 mi -3127 155 mi -515-5p 215 mi -140-5p
36 mi -1468 96 mi -3130-3p 156 mi -517a 216 miR- 147b
37 mi -146b-3p 97 mi -3130-5p 157 mi -517b 217 mi -181c
38 mi -148a* 98 mi -3133 158 mi -519a 218 miR- 187
39 mi -148b* 99 mi -3144-3p 159 mi -519c-3p 219 mi -188-3p
40 mi -1537 100 mi -3158 160 mi -520a-3p 220 mi -188-5p
41 mi -155* 101 mi -3182 161 mi -548c-5p 221 miR- 18a
42 mi -15a* 102 mi -3194 162 mi -548d-5p 222 miR- 190
43 mi -15b* 103 mi -3196 163 mi -548e 223 miR- 190b
44 mi -16-1* 104 mi -32 164 mi -548h 224 miR- 19a
45 mi -16-2* 105 mi -32* 165 mi -548i 225 mi -219-l-3p
46 mi -17* 106 mi -3200-3p 166 mi -548j 226 mi -219-5p
47 mi -181a* 107 mi -335* 167 mi -548k 227 mi -301a
48 mi -181a-2* 108 mi -339-3p 168 mi -548n 228 mi -330-5p
49 mi -181c* 109 mi -33a* 169 mi -548o 229 mi -338-3p
50 mi -182* 110 mi -33b* 170 mi -548p 230 mi -34c-5p
51 mi -183* 111 mi -340* 171 mi -548y 231 mi -381
52 mi -185* 112 mi -342-5p 172 mi -548z 232 mi -383
53 mi - 18a* 113 mi -34a* 173 mi -550a* 233 mi -424
54 mi -192* 114 mi -34b* 174 mi -551a 234 mi -449a
55 miR- 193b 115 mi -3605-5p 175 mi -576-3p 235 mi -450a
56 miR- 195* 116 mi -3613-5p 176 mi -576-5p 236 mi -455-5p
57 miR- 196a* 117 mi -3614-5p 177 mi -577 237 mi -501-3p
58 mi -199b-5p 118 mi -3615 178 mi -579 238 mi -505
59 mi -200a* 119 mi -365* 179 mi -580 239 mi -542-3p
60 mi -200b* 120 mi -3656 180 mi -582-3p 240 mi -582-5p
241 mi -9 应理解， 对于表 A、 表8、 表 C和表 D而言， 术语 "表中所列出的 microRNA" 表示一种或多种该表中所列出的 microRNA。 microRNA集合
如本文所用， "本发明 microRNA"是指选自本发明的 microRNA表达谱中的一种或 多种的 microRNA。
优选地，本发明提供了一种分离的 microRNA集合 (set),所述的 microRNA集合由 二种或多种 (如 2-500种， 较佳地 5-300种， 更佳地 5-100种)选自下组的 microRNA所 构成： （a)表 A中所列出的人初乳特有的 microRNA; (b)表 B中所列出的人成乳特有 的 microRNA; (c) 表 C中所列出的人初乳和成乳共有的 microRNA; (d)表 D中所列 出的、 牛奶中不存在但在人初乳或人成乳中存在的 microRNA。
以所述的 microRNA集合作为有效成分。 可用于制备人工的乳制品、 食品或食品 补充剂， 更优选地， 所述的人工的乳制品或食品补充剂的 microRNA表达谱与正常的 人初乳样品或正常的人成乳样品中 microRNA表达谱相近或相同。 应用
本发明 microRNA为与免疫、 神经系统等有关的微小核糖核酸， 在婴儿的免疫及 神经发育发挥关键作用。 因此， 本发明 microRNA或本发明 microRNA表达谱具有多 方面的用途： 优选如下：
1、 用于指导婴幼儿食品 (如乳制品)或食品补充剂的配方
优选地， 本发明提供了一种人工的乳制品， 其中含有外源添加的一种或多种选自 下组的 microRNA: (a) 表 A中所列出的人初乳特有的 microRNA; (b) 表 B中所列出 的人成乳特有的 microRNA; (c)表 C中所列出的人初乳和成乳共有的 microRNA; (d) 表 D中所列出的、 牛奶中不存在但在人初乳或人成乳中存在的 microRNA。
在另一优选例中， 所述的乳制品还含有外源添加的一种或多种选自下组的 microRNA: (e)表 E中所列出的 microRNA。 所述的表 E中列出的 microRNA是文献 中已报道的人乳中的已知 microRNA。
所述的人工的乳制品可为适用于 0-24个月婴幼儿的乳制品； 或适用于 2周岁以上 人群的乳制品。
优选地， 所述的乳制品包括初乳制品、 成乳制品。 所述的乳制品也可优选包括奶 粉、 液态奶、 奶酪、 酸奶等。
所述的乳制品可具有以下一个或多个特征： （al) 所述的外源添加的 microRNA中 有两种或多种 (如 2-500种， 较佳地 3-300种， 更佳地 3-200种)来自表 A; (a2)所述的 外源添加的 microRNA的种类和含量与人初乳的 microRNA表达谱相近或相同；（b 1)所 述的外源添加的 microRNA中有两种或多种 (如 2-500种，较佳地 3-300种，更佳地 3-200 种)来自表 B ; (b2) 所述的外源添加的 microRNA的种类和含量与人成乳的 microRNA 表达谱相近或相同； （cl)所述的外源添加的 microRNA中有两种或多种 (如 2-500种， 较佳地 3-300种， 更佳地 3-200种)来自表 C; (dl) 所述的外源添加的 microRNA中有 两种或多种 (如 2-500种， 较佳地 3-300种， 更佳地 3-200种)来自表 D。 优选地， 本发明提供了一种人工的食品补充剂， 其中含有食品学上可接受的载体 以及一种或多种选自下组的 microRNA: (a)表 A中所列出的人初乳特有的 microRNA; (b)表 B中所列出的人成乳特有的 microRNA; (c)表 C中所列出的人初乳和成乳共有 的 microRNA; (d) 表 D 中所列出的、 牛奶中不存在但在人初乳或人成乳中存在的 microRNA o 在另一优选例中，所述的食品补充剂还含有一种或多种选自下组的 microRNA: (e) 如上所述的表 E中所列出的 microRNA。
所述的食品补充剂可具有以下一个或多个特征: (al)所述的外源添加的 microRNA 中有两种或多种 (如 2-500种， 较佳地 3-300种， 更佳地 3-200种)来自表 A; (a2)所述 的外源添加的 microRNA的种类和含量与人初乳的 microRNA表达谱相近或相同；（bl) 所述的外源添加的 microRNA中有两种或多种 (如 2-500种， 较佳地 3-300种， 更佳地 3-200 种)来自表 B ; (b2) 所述的外源添加的 microRNA 的种类和含量与人成乳的 microRNA表达谱相近或相同； （cl) 所述的外源添加的 microRNA中有两种或多种 (如 2-500种，较佳地 3-300种，更佳地 3-200种)来自表 C; (dl)所述的外源添加的 microRNA 中有两种或多种 (如 2-500种， 较佳地 3-300种， 更佳地 3-200种)来自表 D。
2、 可用于指导婴幼儿食品 (包括乳制品)的科学分段
优选地， 本发明提供了一种鉴别乳制品的方法， 所述方法包括步骤：
(1)提供一乳制品 (如奶粉)样品 (优选地，包括牛奶或其衍生乳制品、羊奶或其衍生 乳制品、 人奶等)；
(2)检测所述乳制品样品中 microRNA的种类及其含量；
(3)将步骤 (2)测得的 microRNA种类及其含量， 与作为对照的初乳样品以及成乳 样品中 microRNA的表达谱 (即 microRNA种类及其含量)进行比较；
其中， 如果测得的 microRNA的种类及其含量与初乳样品的 microRNA表达谱相 近或相同， 则鉴定所述乳制品为初乳制品； 如果测得的 microRNA的种类及其含量与 成乳样品的 microRNA表达谱相近或相同， 则鉴定所述乳制品为成乳制品。
在另一优选例中， 通过检测成乳或初乳中 microRNA的种类及其含量， 获得作为 对照的成乳样品或初乳样品中 microRNA表达谱。
所述的对照的成乳样品或初乳样品中 microRNA 表达谱可以包含本发明 microRNA , 也可以包含现有技术中已知的 microRNA (如所述的表 E 中所列出的 microRNA)。 更佳地， 所述的对照的初乳样品中的 microRNA表达谱包括： 表 A和表 C中所列出的两种或多种 microRNA;并且所述的对照的成乳样品中的 microRNA表达 谱包括表 B和表 C中所列出的 microRNA。 3、 可根据人乳微小核糖核酸表达谱， 选择性地升高和 /或降低婴幼儿食品 (如乳品) 中特定种类微小核糖核酸的含量，从而制成针对特殊婴幼儿的食品 (包括乳制品)、食品 补充剂和新型营养品等。
优选地， 本发明提供了一种制造乳制品的方法， 所述方法包括步骤：
(1)提供一乳制品原料 (包括： 牛奶、 羊奶、 或其组合)；
(2)检测所述乳制品原料中 microRNA的种类及其含量，得到第一 microRNA表达 谱；
(3) 将步骤 (2)测得的 microRNA种类及其含量， 与作为对照的初乳样品或成乳样 品中 microRNA表达谱进行比较；
(4) 基于比较结果， 向所述乳制品原料中添加一种或多种 microRNA和 /或从所述 乳制品原料中去除一种或多种 microRNA，从而制得乳制品，其中所述乳制品 microRNA 表达谱与作为对照的初乳样品或成乳样品中 microRNA的表达谱更接近或一致。
在另一优选例中， 所述的对照的成乳样品或初乳样品中 microRNA表达谱， 其获 得方法以及其所包含的 microRNA如前所述。 优选地， 本发明还提供了一种制造乳制品的方法， 所述方法包括步骤：
(1)提供一乳制品原料；
(2) 向所述乳制品原料中添加一种或多种 microRNA和 /或从所述乳制品原料中去 除一种或多种 microRNA,从而制得乳制品，其中所述乳制品中 microRNA表达谱与初 乳或成乳中 microRNA表达谱更接近或一致。
在另一优选例中， 所述的初乳或成乳是人初乳或人成乳。
其中，所述的一种或多种 microRNA可以包含本发明 microRNA,也可以包含现有 技术中已知的 microRNA (如所述的表 E中所列出的 microRNA)。 更佳地， 包括本发明 microRNA: 表 A、 表 B、 表 C和 /或表 D中列出的一种或多种 microRNA。 优选地， 本发明还提供了一种制造食品补充剂的方法， 所述方法包括步骤：
(1) 检测某一对象的母乳中 microRNA 的种类及其含量， 从而获得该个体的第一 microRNA表达谱；
(2)将测得的第一表达谱的 microRNA种类及其含量，与作为对照的正常初乳样品 或正常成乳样品中 microRNA 表达谱进行比较， 从而确定第一表达谱中所缺乏的 microRNA或含量不足因而需要部分补充的 microRNA;
(3) 配制食品补充剂，其中所述的食品补充剂含有上一步骤中所确定的第一表达谱 中所缺乏的 microRNA或含量不足因而需要部分补充的 microRNA。
在另一优选例中， 在配制步骤中， 包括将食品学上可接受的载体与一种或多种人 工合成的 microRNA进行混合， 从而形成食品补充剂。
在另一优选例中， 通过检测正常成乳或正常初乳中 microRNA的种类及其含量， 获得对照的正常初乳样品或正常成乳样品中 microRNA表达谱。
其中， 所述的正常成乳样品或正常初乳样品是指所述的成乳或初乳中， 对于婴幼 儿而言， 含有足够 (包括种类和含量)其生长发育的 microRNA。 本发明的主要优点包括： 1. 本发明提供了一种新的 microRNA集合， 所述集合中的 microRNA可用于制备 人工的乳制品、 食品或食品补充剂等。
2. 本发明建立了一系列人乳 microRNA 表达谱， 包括人乳 (广谱含有或特有 的) microRNA 的表达谱， 人初乳中特有的 microRNA 表达谱， 或人成乳中特有 microRNA的表达谱等， 以及所述 microRNA表达谱的用途，所述 microRNA表达谱可 用于指导制备人工的乳制品、 食品或食品补充剂； 也可用于鉴别乳制品为成乳制品或 初乳制品。 下面结合具体实施， 进一步阐述本发明。 应理解， 这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。 下列实施例中未注明具体条件的实验方法， 通常按照常 规条件， 例如 Sambrook等人， 分子克隆： 实验室手册 (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件， 或按照制造厂商所建议的条件。 除非另外说明， 否则百分比和份数按重量计算。 GFP表示绿色荧光蛋白 (Green Fluorescent Protein)。 实施例 1: 人乳中稳定存在微小核糖核酸
利用 Solexa测序技术检测人乳中稳定存在的大量微小核糖核酸。
具体步骤包括：
(1) 收集人乳样本；
(2)通过 Trizol试剂提取样本总 RNA;
(3)进行 PAGE电泳回收 17-27nt RNA分子；
(4)将接头引物 (adaptor primer)酶联在小 RNA分子的 3'与 5 '端；
(5) 纯化的 DNA直接用于集群生成，利用 Illumina Genome Analyzer进行测序分析。 具体结果见表 1。 表 1是人乳中微小核糖核酸的测序结果。 从测序结果可以看出， 人乳中稳定存在大量微小核糖核酸。
表 1 人乳中含有的 microRNA
let-7a* miR- 141* miR-199b-3p miR-301a miR-34b* miR-455-5p miR-590-3p let-7b* miR-143* miR-199b-5p miR-301b miR-34c-5p miR-486-5p miR-590-5p let-7d* miR- 144* miR- 19a miR-30a miR-3605-5p miR-489 miR-597 let-7e* miR- 145 miR-19b miR-30a* miR-3613-5p miR-493 miR-598 let-7f-l* miR-1468 miR-200a miR-30b miR-361-3p miR-499-3p miR-616* let-7f-2* miR-146b-3p miR-200a* miR-30b* miR-3614-5p miR-499-5p miR-618 let-7g miR-146b-5p miR-200b miR-30c miR-3615 miR-500a miR-624* let-7g* miR-147b miR-200b* miR-30c-l* miR-361-5p miR-500a* miR-625 let-7i* miR- 148a miR-200c miR-30c-2* miR-362-3p miR-500b miR-625* miR-100* miR- 148a* miR-200c* miR-30d miR-362-5p miR-501-3p miR-627 miR-101* miR- 148b miR-20a miR-30d* miR-363 miR-501-5p miR-628-3p miR- 103-2* miR-148b* miR-20a* miR-30e miR-365* miR-502-3p miR-628-5p miR-106a miR-151-3p miR-20b miR-30e* miR-3656 miR-502-5p miR-629 miR- 106b miR-151-5p miR-21* miR-3116 miR-3664 miR-504 miR-629* miR-106b* miR-1537 miR-2114 miR-3127 miR-3677 miR-505 miR-642a miR- 10a miR- 155* miR-2114* miR-3130-3p miR-3688 miR-511 miR-651 miR- 10a* miR- 15a miR-2115 miR-3130-5p miR-369-3p miR-512-3p miR-660 miR- 10b miR- 15 a* miR-2115* miR-3133 miR-374a miR-515-5p miR-671-3p miR- 1246 miR- 15b miR-2116 miR-3144-3p miR-374a* miR-517a miR-671-5p miR- 1251 miR- 15b* miR-215 miR-3158 miR-374b miR-517b miR-7 miR-125a-3p miR-16-1* miR-219-l-3p miR-3182 miR-374b* miR-519a miR-708* miR-125a-5p miR-16-2* miR-219-5p miR-3194 miR-377 miR-519c-3p miR-7- 1* miR- 125b- 1* miR- 17* t miR-22* miR-3196 miR-378* miR-520a-3p miR-720 miR-125b-2* miR-181a* miR-221* miR-32 miR-381 miR-532-3p miR-744 miR- 126* miR-223* miR-32* miR-382 miR-532-5p miR-744* miR-1260 miR-181c miR-224 miR-3200-3p miR-383 miR-542-3p miR-766 miR-1260b miR-181c* miR-224* miR-320a miR-3909 miR-548c-5p miR-769-3p miR- 1262 miR-181d miR-2277-5p miR-320b miR-3912 miR-548d-5p miR-769-5p miR- 1266 miR- 182* miR-2355-3p miR-320c miR-3913 miR-548e miR-873 miR-1271 miR- 183* miR-2355-5p miR-320d miR-3919 miR-548h miR-885-5p miR-127-3p miR- 185* miR-23a miR-324-3p miR-3920 miR-548i miR-889 miR-1274b miR- 187 miR-23b miR-324-5p miR-3942 miR-548j miR-891a miR- 1275 miR-188-3p miR-24-2* miR-330-3p miR-409-3p miR-548k miR-9 miR- 1280 miR-188-5p miR-26a miR-330-5p miR-410 miR-548n miR-92a-l* miR- 1287 miR- 18a miR-26a-l* miR-331-3p miR-421 miR-548o miR-92b miR-1294 miR- 18a* miR-26b miR-331-5p miR-422a miR-548p miR-93* miR-1296 miR-190 miR-26b* miR-335 miR-423-3p miR-548y miR-934 miR-1299 miR-190b miR-27a miR-335* miR-423-5p miR-548z miR-937 miR- 1301 miR- 191 miR-27a* miR-338-3p miR-424 miR-550a* miR-941 miR- 1303 miR- 192* miR-27b miR-339-3p miR-425* miR-551a miR-944 miR- 130a miR-193a-3p miR-27b* miR-339-5p miR-4284 miR-574-3p miR-99a miR- 130b miR-193a-5p miR-28-3p miR-33a miR-4286 miR-574-5p miR-99a* miR- 130b* miR-193b miR-28-5p miR-33a* miR-4326 miR-576-3p miR-99b miR- 132 miR- 194 miR-296-5p miR-33b miR-449a miR-576-5p miR-99b* miR- 132* miR- 195* miR-29a miR-33b* miR-449b miR-577
miR- 135a miR- 196a miR-29a* miR-340* miR-450a miR-579
miR-135b miR- 196a* miR-29b miR-342-3p miR-450b-5p miR-580
miR- 136* miR-196b miR-29b-2* miR-342-5p miR-454 miR-582-3p
miR-140-3p miR- 197 miR-29c miR-34a miR-454* miR-582-5p
miR-140-5p miR-199a-3p miR-29c* miR-34a* miR-455-3p miR-589 实施例 2: 人成乳和初乳中微小核糖核酸表达分析
本实施例结合人成乳和初乳中微小核糖核酸的 Solexa测序结果， 建立人乳微小核 糖核酸检测的统一标准。
Solexa测序具体步骤如实施例 1所述， 不同的是， 收集的样本分别为人成乳和初 乳。
以初乳和成乳的拷贝数范围， 对检测结果进行如下分类 (其它实施例中， 对检测结 果的分类同此法)。 拷贝数 含量分类
0 不存在 /未检出 （用 "UD"表示）
1-10 少
11-100 较少
101-1,000 由
T
1,001-10,000 较高
10,001-100,000
具体结果见表 2和图 1。 表 2是人成乳和初乳中微小核糖核酸的表达差异分析表。 从结果可以看出， 大多数的微小核糖核酸在人成乳和初乳中都能检测到， 而只有少部 分微小核糖核酸特异表达在人成乳或初乳中。 人成乳中表达的微小核糖核酸与初乳相 比， 在种类上没有太大的区别， 但许多微小核糖核酸的表达量在两者之间有差异 (如 let-7a* let-7b* let-7d*等等)。
表 2 人成乳或初乳中含有的 microRNA
编号 mi 种类 mi 含量 mi 含量 编号 mi 种类 mi 含量 mi 含量
(人成乳） (人初乳） (人成乳） (人初乳）
1 let-7a* 较少 由
τ 173 mi -3196 少 少
2 let-7b* 较少 由
T 174 mi -32 较少 较少
3 let-7d* 较少 由
T 175 mi -32* 少 少
4 let-7e* 少 少 176 mi -3200-3p 较少 少
5 let-7f-l* 较少 由
T 177 mi -320a 由
τ 较高
6 let-7f-2* 较少 由
T 178 mi -320b 少 较少
7 let-7g 间 较高 179 mi -320c 少 较少
8 let-7g* 较少 由
T 180 mi -320d 少 较少
9 let-7i* 较少 较少 181 mi -324-3p 较少 较少
10 miR- 100* 少 少 182 mi -324-5p 少 少
11 mi -101* 少 少 183 mi -330-3p 少 少
12 miR- 103-2* 少 少 184 mi -330-5p 少 少
13 miR- 106a 少 少 185 mi -331-3p 少 较少
14 miR- 106b 由 由
τ T 186 mi -331-5p 少 少
15 miR- 106b* 较高 较高 187 mi -335 由 由
T τ
16 miR- 10a 较高 较高 188 mi -335* 较高 较高
17 miR- 10a* 少 少 189 mi -338-3p 少 较少
18 miR- 10b 少 较少 190 mi -339-3p 少 少
19 miR- 1246 较少 由
T 191 mi -339-5p 较少 少
20 miR- 1251 较少 较少 192 mi -33a 由
T T
21 mi -125a-3p 少 少 193 mi -33a* 少 少
22 mi -125a-5p 较少 较少 194 mi -33b τ τ
23 miR- 125b- 1* 少 少 195 mi -33b* 少 少
24 mi -125b-2* τ τ 196 mi -340* 少 少
25 miR- 126* 较少 τ 197 mi -342-3p 由
T τ mi -1260 较少 τ 198 mi -342-5p 较少 由
T
mi - 1260b 较少 τ 199 mi -34a 由
T 较高 mi -1262 少 少 200 mi -34a* 少 较少 miR- 1266 少 少 201 mi -34b* 少 较少 miR- 1271 少 少 202 mi -34c-5p 少 较少 mi -127-3p 少 少 203 mi -3605-5p 少 少 miR- 1274b T T 204 mi -3613-5p 少 少 miR- 1275 少 较少 205 mi -361-3p 少 较少 miR- 1280 较高 较高 206 mi -3614-5p 少 少 miR- 1287 较少 较少 207 mi -3615 少 少 miR- 1294 少 少 208 mi -361-5p τ τ miR- 1296 少 少 209 mi -362-3p 较少 较少 miR- 1299 少 较少 210 mi -362-5p 少 少 miR- 1301 少 少 211 mi -363 较少 较少 miR- 1303 少 少 212 mi -365* 少 少 miR- 130a 较少 T 213 mi -3656 T 少 miR- 130b 由
T τ 214 mi -3664 少 少 miR- 130b* 较少 较少 215 mi -3677 少 少 miR- 132 由 由
T T 216 mi -3688 少 少 miR- 132* 较少 由
T 217 mi -369-3p 少 少 mi -135a 较少 较少 218 mi -374a τ τ miR- 135b 少 少 219 mi -374a* T T miR- 136* 少 较少 220 mi -374b τ τ mi -140-3p τ 较高 221 mi -374b* 少 少 mi -140-5p 较少 较少 222 mi -377 少 少 mi -141* 较高 较高 223 mi -378* 较少 较少 miR- 143* 少 较少 224 mi -381 少 少 miR- 144* 少 少 225 mi -382 少 少 miR- 145 较少 较少 226 mi -383 少 τ miR- 1468 少 少 227 mi -3909 少 较少 mi -146b-3p 较高 较高 228 mi -3912 较少 较少 mi -146b-5p 冋 冋 229 mi -3913 少 较少 miR- 147b 少 较少 230 mi -3919 少 少 miR- 148a 间 冋 231 mi -3920 少 少 miR- 148a* 较高 冋 232 mi -3942 少 少 miR- 148b 由
T τ 233 mi -409-3p 少 少 miR- 148b* 由
T T 234 mi -410 少 较少 mi -151-3p 较高 较高 235 mi -421 τ 由
T
mi -151-5p 由
T τ 236 mi -422a 较少 较少 miR- 1537 较少 T 237 mi -423-3p 较高 较高 miR- 155* 少 少 238 mi -423-5p 较少 由
T - -
Figure imgf000020_0001
9M180/ZT0ZN3/X3d 9ZL9 0in0Z OAV - -
Figure imgf000021_0001
9ΜΪ80/ΖΪ0ΖΝ3/Χ3<1 9 9εθ/ ΟΖ OAV 149 mi -29c 较高 较高 321 mi -708* 少 少
150 mi -29c* 少 少 322 mi -7- 1 * 较少 较少
151 mi -301a T τ 323 mi -720 少 较少
152 mi -301b 较少 较少 324 mi -744 少 少
153 mi -30a 冋 间 325 mi -744* 少 少
154 mi -30a* 较高 较高 326 mi -766 少 较少
155 mi -30b 冋 较高 327 mi -769-3p 少 少
156 mi -30b* 少 少 328 mi -769-5p τ τ
157 mi -30c 较高 较高 329 mi -873 少 较少
158 mi -30c-l* 少 少 330 mi -885-5p 较少 较少
159 mi -30c-2* 较少 较少 331 mi -889 少 少
160 mi -30d 间 冋 332 mi -891a 少 少
161 mi -30d* 较少 T 333 mi -9 少 少
162 mi -30e 较高 间 334 mi -92a-l* 较少 较少
163 mi -30e* 较高 较高 335 mi -92b 由 由
T T
164 mi -3116 少 少 336 mi -93* 少 较少
165 mi -3127 少 少 337 mi -934 少 较少
166 mi -3130-3p 少 少 338 mi -937 较少 少
167 mi -3130-5p 少 少 339 mi -941 由
T T
168 mi -3133 少 少 340 mi -944 少 较少
169 mi -3144-3p 少 少 341 mi -99a 较高 间
170 mi -3158 少 较少 342 mi -99a* 由
T 较少
171 mi -3182 少 较少 343 mi -99b 较高 较高
172 mi -3194 少 少 344 mi -99b* 较少 较少 图 1是初乳、 成乳中 microRNA表达差异分析， 其中 R2=0.8897(远小于 0.99)， 说 明初乳和成乳中 microRNA表达谱存在差异。 因此， 结合人成乳和初乳中微小核糖核 酸的检测结果， 可建立人乳微小核糖核酸检测的统一标准。 实施例 3: 人成乳和初乳中表达有差异的微小核糖核酸
本实施例结合人成乳和初乳中表达有差异的微小核糖核酸 Solexa测序结果， 建立 完善的人乳微小核糖核酸表达谱。
Solexa测序具体步骤如实施例 1所述， 不同的是， 收集的样本为人成乳和初乳。 具体结果如下：
表 3 是人成乳和初乳中表达有差异的微小核糖核酸。 从结果可以看出， 115 种 miRNA有差异表达， 94种 miRNA是在人初乳中含量较多， 而 21种 miRNA在人初乳 中含量较少。 结果表明， 人乳中大部分微小核糖核酸的含量随着哺乳过程而减少。 表 3 人成孚 口初乳中表达有差异的微小核糖核酸
mi 种类 mi 含量 mi 含量 编号 mi 种类 mi 含量 mi 含量
(人成乳） (人初乳） (人成乳） (人初乳） let-7a* 较少 由
τ 58 mi -3200-3p 较少 少 let-7b* 较少 由
T 59 mi -320a 由
τ 较高 let-7d* 较少 由
T 60 mi -320b 少 较少 let-7f-l* 较少 由
T 61 mi -320c 少 较少 let-7f-2* 较少 由
T 62 mi -320d 少 较少 let-7g 间 较高 63 mi -331-3p 少 较少 let-7g* 较少 由
T 64 mi -338-3p 少 较少 miR- 10b 少 较少 65 mi -339-5p 较少 少 miR- 1246 较少 由
T 66 mi -342-5p 较少 由
τ miR- 126* 较少 由 由
T 67 mi -34a Τ 较高 miR- 1260 较少 由
T 68 mi -34a* 少 较少 miR- 1260b 较少 由
T 69 mi -34b* 少 较少 miR- 1275 少 较少 70 mi -34c-5p 少 较少 miR- 1299 少 较少 71 mi -361-3p 少 较少 miR- 130a 较少 由
T 72 mi -3656 τ 少 miR- 132* 较少 由
T 73 mi -383 少 T miR- 136* 少 较少 74 mi -3909 少 较少 mi -140-3p τ 较高 75 mi -3913 少 较少 miR- 143* 少 较少 76 mi -410 少 较少 miR- 147b 少 较少 77 mi -423-5p 较少 由
T
miR- 148a* 较高 冋 78 mi -424 少 较少 miR- 1537 较少 τ 79 mi -450a 少 较少 miR- 16-2* 较少 τ 80 mi -450b-5p 少 较少 miR- 17* 较少 τ 81 mi -454* 较少 由
T
mi -181a* 由
T 较高 82 mi -499-3p 较少 少 mi -181d 较少 τ 83 mi -501-3p 较少 τ miR- 185* 少 较少 84 mi -502-3p 少 较少 miR- 18a T 较少 85 mi -505 少 较少 miR- 195* 少 较少 86 mi -511 τ 较少 miR- 196b τ 较少 87 mi -512-3p 较少 少 miR- 197 较少 由
T 88 mi -517a 较少 少 mi -199b-5p 少 较少 89 mi -517b 较少 少 miR- 19a 较高 冋 90 mi -519a 较少 少 miR- 19b 较高 冋 91 mi -519c-3p 较少 少 mi -200a* 较高 τ 92 mi -548c-5p 少 较少 mi -200b* 由
T 较少 93 mi -548d-5p 少 较少 mi -200c 较高 T 94 mi -548i 较少 由
T
mi -21 * 较高 间 95 mi -548k 较少 由
T 39 mi -2115 少 较少 96 mi -548o 少 较少
40 mi -2115* 少 较少 97 mi -551a 少 较少
41 mi -224 T 较少 98 mi -574-5p 少 较少
42 mi -2355-3p 少 较少 99 mi -576-3p 少 较少
43 mi -2355-5p 少 较少 100 mi -616* 少 较少
44 mi -23a τ 较高 101 mi -618 少 较少
45 mi -23b T 较高 102 mi -625* 少 较少
46 mi -26b* 较少 由
Τ 103 mi -627 少 较少
47 mi -27a 由
Τ 较高 104 mi -629 较少 由
T
48 mi -27a* 较少 由
Τ 105 mi -629* 少 较少
49 mi -27b 较高 间 106 mi -671-3p 较少 少
50 mi -27b* 少 较少 107 mi -720 少 较少
51 mi -296-5p 少 较少 108 mi -766 少 较少
52 mi -29a* 少 较少 109 mi -873 少 较少
53 mi -30b 间 较高 110 mi -93* 少 较少
54 mi -30d* 较少 由
Τ 111 mi -934 少 较少
55 mi -30e 较高 间 112 mi -937 较少 少
56 mi -3158 少 较少 113 mi -944 少 较少
57 mi -3182 少 较少 114 mi -99a 较高 冋
115 mi -99a* 由 τ 较少 人成乳和初乳中存在的微小核糖核酸多数与免疫和神经系统有关。 从结果可以看 出，人乳中尤其是初乳中那些拷贝数高的微小核糖核酸几乎都是与免疫或神经有关的， 例如： miR-181a mi -223, miR-146a miR-16 miR-21 mi -30a, miR-19a mi -19b 等。 提示人乳中尤其是初乳中那些拷贝数高的微小核糖核酸可能对婴儿的免疫及神经 系统发育中发挥生物学功能。 实施例 4: 人乳 microRNA与神经系统的关系
本实施例证明了人乳 microRNA (如 miR-19a)在神经系统 (如神经细胞)中的作用。 ESR1是与神经细胞分化有关的配体诱导表达转录因子。 ESR1基因的再引进， 在 神经母细胞瘤细胞中导致细胞周期显著阻滞， 不利于神经细胞的分化。
4.1 miR-19a负调控雌激素受体 a(ESRl)
采用荧光素酶检测方法验证 miR-19a负调控雌激素受体 a(ESRl)， 具体步骤为： (1) 构建分别包含 Pre-miR-19a 和 ESR1 的 3' 非编码区荧光报告基因结构 (3'-ESRl-wt)和 3'-ESRl-wt的荧光素酶表达质粒；
(2)筛选阳性克隆， 测序；
(3)扩增克隆并提纯质粒备用；
(4) 培养 HEK-293细胞， 并接种于 24孔板中， 生长 10-24小时；
(5)将荧光素酶表达质粒与 HEK-293细胞共转染； (6) 加入荧光素酶底物， 荧光素酶与底物反应， 产生荧光素， 通过检测荧光的强度 可以测定荧光素酶的活性。
具体结果见图 2。 图 2是转染 Pre-miR-19a和 3'-ESRl-wt的 HEK-293细胞的荧光 素酶活性。 图中， ***表示 P<0.1 %。
从图 2可以看出， 与对照组相比， 转染 Pre-miR-19a和 3'-ESRl-wt的 HEK-293细 胞的荧光素酶活性极其显著地降低， mi -19a降低 3'-ESRl-wt的荧光素酶活性约 40%。 结果表明， miR-19a减少 ESR1的荧光素酶活性，抑制 ESR1表达。 miR-19a负调控 ESR1 的表达。 4.2 ESR1表达在神经细胞中的作用
ES 1是与神经细胞分化有关的配体诱导表达转录因子。 miR-19a负调控 ESR1的 表达， 接下来研究 ESR1表达在神经细胞中的作用。
首先， 构建慢病毒表达载体 (Lenti-ESR1)， 利用慢病毒结构表达 ESRl cDNA, 然 后转染人神经母细胞瘤细胞 __ SK-N-BE(2)细胞。 具体步骤为：
(1) 根据 ESR1序列， 构建慢病毒表达载体 (Lenti-ESRl);
(2)对于测序正确的重组质粒， 提取和纯化高质量的不含内毒素的重组质粒；
(3) 使用高效重组慢病毒表达载体 (Lenti-ESR1)、 慢病毒包装空质粒载体 (Lenti-Empty Vector)共转染 SK-N-BE(2)细胞， 进行病毒包装和生产， 收集病毒液；
(4)浓缩、 纯化病毒液；
(5) 高质量的病毒液用于后续 Western blot实验和细胞增殖测定。 利用 Western blot 方法检测 ESR1 在转染 Lenti-ESRl、 Lenti-Empty Vector 的 SK-N-BE(2)细胞中的表达。 具体步骤为：
(1) 收集蛋白样品：使用裂解液裂解培养的细胞样本，超声处理， 4 °C， 12000xg离 心 10分钟。 去除上清， 用 BCA法测定蛋白浓度；
(2) 电泳： 用 10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶 (SDS-PAGE)电泳分离；
(3) 转膜： 使用聚偏二氟乙烯 (PVDF)膜；
(4)封闭： 使用 5%Tris缓冲生理盐水 (TBS)加吐温 20(TBST)， 在 4°C 封闭过夜。 然后用 TBST洗膜 3次， 每次 10分钟。
(5) 孵育抗体： 先用适当比例的 TBST稀释， 洗膜彻底； 然后在室温， 用适当比例 稀释的辣根过氧化物酶 (HRP)标记二抗；
(6) 蛋白检测： 使用增强的化学发光试剂检测蛋白； 使用 Bandscan软件扫描和量 化每个波段的放射自显影强度。 利用流式细胞仪分析检测 Lenti-ESRl、Lenti-EmptyVector转染细胞后的细胞增殖。 具体步骤为：
(1) 收集 Lenti-ESRl Lenti-Empty Vector转染的细胞培养液至流式专用管；
(2) 加 1ml PBS 缓冲液清洗一次， 清洗液加入管中；
(3) 再用 1ml PBS 缓冲液清洗剩余细胞一次， 清洗液加入离心管；
(4) 离心， 去上清； 加入 lml PBS 缓冲液重悬细胞， 再次离心弃上清；
(5) 最后重悬细胞于 500微升的 PBS 缓冲液中；
(6) 在细胞悬液中加入核酸染料， 轻轻混匀， 避光冰上孵育 10分钟， 用流式细胞 仪检测细胞增殖。
具体结果见图 3和图 4
图 3是 ESR1在转染 Lenti-ESRl Lenti-Empty Vector的 GFP阳性 SK-N-BE(2)细 胞中表达的 Western blot结果。以 β-actin作为内参， ESR1在转染 Lenti-Empty Vector 的 GFP阳性 SK-N-BE(2)细胞中， 几乎不表达。 以转染 Lenti-Empty Vector的细胞为空白 对照， ESR1在转染 Lenti-ESRl的 GFP阳性 SK-N-BE(2)细胞中表达显著增加。
图 4是 Lenti-ESR1 Lenti-Empty Vector转染细胞后的细胞增殖的流式细胞仪分析 结果。 图中， ***表示 P<0.1 %。 以转染 Lenti-Empty Vector的细胞为空白对照， ESR1 在转染 Lenti-ESRl的 SK-N-BE(2)细胞中的表达， 导致细胞增殖极其显著地降低。
综上所述， miR-19a抑制 ESR1的表达， 而 ESR1受抑制后将有助于神经细胞的分 化。可见， miR-19a有利于神经细胞的分化。结果表明人乳 microRNA与神经系统有关。 实施例 5: 人乳微小核糖核酸表达谱
本实施例检测了牛乳中微小核糖核酸的种类和含量， 并与实施例 2中对不同时期 所分泌的乳汁 (如初乳与成乳)的检测结果进行筛选和比对，从而形成了人乳中特有的微 小核糖核酸表达谱， 以及不同时期的人乳中微小核糖核酸差异表达谱。
Solexa测序具体步骤如实施例 1所述， 不同的是， 收集的样本分别为人成乳、 初 乳， 以及牛乳。
根据检测结果， 形成如下不同的微小核糖核酸表达谱。
5.1 人乳中特有的微小核糖核酸表达谱
所述的人乳中特有的微小核糖核酸表达谱是指在人成乳和 /或人初乳中存在， 但是 在牛乳中不存在的 microRNA, 如表 4所示。
表 4
Figure imgf000026_0001
let-7e* 少 少 124 mi -374a* T T let-7f-l* 较少 T 125 mi -374b* 少 少 let-7f-2* 较少 T 126 mi -377 少 少 let-7g* 较少 T 127 mi -378* 较少 较少 let-7i* 较少 较少 128 mi -3909 少 较少 mi -100* 少 少 129 mi -3912 较少 较少 mi -101* 少 少 130 mi -3913 少 较少 mi - 103-2* 少 少 131 mi -3919 少 少 mi -106b* 较高 较高 132 mi -3920 少 少 mi -lOa* 少 少 133 mi -3942 少 少 mi -1251 较少 较少 134 mi -409-3p 少 少 mi -125b-l* 少 少 135 mi -410 少 较少 mi -125b-2* T T 136 mi -422a 较少 较少 mi -126* 较少 T 137 mi -425* 由 由 τ T mi - 1260b 较少 T 138 mi -4284 少 少 mi -1262 少 少 139 mi -4286 较少 较少 miR- 1266 少 少 140 mi -4326 少 少 miR- 1271 少 少 141 mi -449b 少 少 miR- 1275 少 较少 142 mi -454 较少 较少 miR- 1280 较高 较高 143 mi -454* 较少 由
T
miR- 1287 较少 较少 144 mi -489 少 少 miR- 1294 少 少 145 mi -493 少 少 miR- 1299 少 较少 146 mi -499-3p 较少 少 miR- 1301 少 少 147 mi -500a 少 少 miR- 1303 少 少 148 mi -500a* 较少 较少 miR- 130b* 较少 较少 149 mi -500b 少 少 miR- 132* 较少 由
T 150 mi -501-5p 少 少 miR- 135b 少 少 151 mi -502-5p 少 少 miR- 136* 少 较少 152 mi -504 少 少 mi -141* 较高 较高 153 mi -511 T 较少 miR- 143* 少 较少 154 mi -512-3p 较少 少 miR- 144* 少 少 155 miR- 515- 5p 少 少 miR- 1468 少 少 156 mi -517a 较少 少 mi -146b-3p 较高 较高 157 mi -517b 较少 少 miR- 148a* 较高 冋 158 mi -519a 较少 少 miR- 148b* 由
T T 159 mi -519c-3p 较少 少 miR- 1537 较少 T 160 mi -520a-3p 少 少 miR- 155* 少 少 161 mi -548c-5p 少 较少 miR- 15 a* 少 少 162 mi -548d-5p 少 较少 mi -15b* 少 少 163 mi -548e 少 少 mi - 16-1* 少 少 164 mi -548h 少 少 mi -16-2* 较少 由
Τ 165 mi -548i 较少 T miR- 17* 较少 由
Τ 166 mi -548j 少 少 mi -181a* 由
τ 较高 167 mi -548k 较少 T mi -181a-2* 较高 较高 168 mi -548n 少 少 mi -181c* 由 由
Τ Τ 169 mi -548o 少 较少 miR- 182* 少 少 170 mi -548p 较少 较少 miR- 183* 少 少 171 mi -548y 少 少 miR- 185* 少 较少 172 mi -548z 少 少 miR- 18a* 较少 较少 173 mi -550a* 少 少 miR- 192* 少 少 174 mi -551a 少 较少 miR- 193b 较高 较高 175 mi -576-3p 少 较少 miR- 195* 少 较少 176 mi -576-5p 较少 较少 miR- 196a* 少 少 177 mi -577 由 由 τ T mi -199b-5p 少 较少 178 mi -579 少 少 mi -200a* 较高 由
Τ 179 mi -580 少 少 mi -200b* 由
Τ 较少 180 mi -582-3p T T mi -200c* 少 少 181 mi -589 少 少 mi -20a* 较少 较少 182 mi -590-3p T T mi -20b 少 少 183 mi -590-5p 较少 较少 mi -21* 较高 冋 184 mi -597 少 少 mi -2114 少 少 185 mi -598 T T miR-2114* 少 少 186 mi -616* 少 较少 miR-2115 少 较少 187 mi -618 少 较少 miR-2115* 少 较少 188 mi -624* 少 少 miR-2116 少 少 189 mi -625 少 少 mi -22* 较少 较少 190 mi -625* 少 较少 mi -221* 较少 较少 191 mi -627 少 较少 mi -223* 较少 较少 192 mi -629 较少 由
T
mi -224* 少 少 193 mi -629* 少 较少 mi -2277-5p 少 少 194 mi -642a 少 少 mi -2355-3p 少 较少 195 mi -651 较少 较少 mi -2355-5p 少 较少 196 mi -708* 少 少 mi -24-2* 较少 较少 197 mi -7-1* 较少 较少 mi -26a-l* 少 少 198 mi -744* 少 少 mi -26b* 较少 τ 199 mi -766 少 较少 mi -27a* 较少 τ 200 mi -769-3p 少 少 mi -27b* 少 较少 201 mi -769-5p T T - -
Figure imgf000029_0001
9M180/ZT0ZN3/X3d 9 9£0/ 0Z OAV 241 mi -9 少 少 在牛奶乳品中添加这些特定微小核糖核酸的含量， 可制作婴幼儿食品补充剂。
5.2 人初乳中特有的微小核糖核酸表达谱
所述的人初乳中特有的微小核糖核酸表达谱是指: (1)在人初乳中的含量比人成乳 中的含量高的 microRNA, 或者 (2) 在人初乳中被检测到， 而在人成乳中未检测到或不 存在； 如表 5所示。 编号 mi 种类 mi 含量 mi 含量 编号 mi 种类 mi 含量 mi 含量
(人成乳） (人初乳） (人成乳） (人初乳）
1 mi -148a* 较高 冋 49 miR- 185* 少 较少
2 miR- 19a 较高 冋 50 miR- 195* 少 较少
3 miR- 19b 较高 冋 51 mi -199b-5p 少 较少
4 mi -21 * 较高 冋 52 mi -2115 少 较少
5 mi -27b 较高 冋 53 miR-2115* 少 较少
6 mi -30e 较高 冋 54 mi -2355-3p 少 较少
7 mi -99a 较高 间 55 mi -2355-5p 少 较少
8 mi -140-3p 由 τ 较高 56 mi -27b* 少 较少
9 mi -181a* 由
T 较高 57 mi -296-5p 少 较少
10 mi -23a 由
T 较高 58 mi -29a* 少 较少
11 mi -23b 由
T 较高 59 mi -3158 少 较少
12 mi -27a 由
T 较高 60 mi -3182 少 较少
13 mi -320a 由
T 较高 61 mi -320b 少 较少
14 mi -34a 由
T 较高 62 mi -320c 少 较少
15 let-7a* 较少 由 τ 63 mi -320d 少 较少
16 let-7b* 较少 由
T 64 mi -331-3p 少 较少
17 let-7d* 较少 由
T 65 mi -338-3p 少 较少
18 let-7f-l* 较少 由
T 66 mi -34a* 少 较少
19 let-7f-2* 较少 由
T 67 mi -34b* 少 较少
20 let-7g* 较少 由
T 68 mi -34c-5p 少 较少
21 miR- 1246 较少 由
T 69 mi -361-3p 少 较少
22 miR- 126* 较少 由
T 70 mi -3909 少 较少
23 miR- 1260 较少 由
T 71 mi -3913 少 较少
24 miR- 1260b 较少 由
T 72 mi -410 少 较少
25 miR- 130a 较少 由
T 73 mi -424 少 较少
26 miR- 132* 较少 由
T 74 mi -450a 少 较少
27 miR- 1537 较少 由
T 75 mi -450b-5p 少 较少
28 miR- 16-2* 较少 由
T 76 mi -502-3p 少 较少
29 miR- 17* 较少 由
T 77 mi -505 少 较少
30 mi -181d 较少 由
T 78 mi -548c-5p 少 较少 31 mi -197 较少 τ 79 mi -548d-5p 少 较少
32 mi -26b* 较少 τ 80 mi -548o 少 较少
33 mi -27a* 较少 τ 81 mi -551a 少 较少
34 mi -30d* 较少 T 82 mi -574-5p 少 较少
35 mi -342-5p 较少 τ 83 mi -576-3p 少 较少
36 mi -423-5p 较少 τ 84 mi -616* 少 较少
37 mi -454* 较少 T 85 mi -618 少 较少
38 mi -501-3p 较少 τ 86 mi -625* 少 较少
39 mi -548i 较少 τ 87 mi -627 少 较少
40 mi -548k 较少 T 88 miR-629* 少 较少
41 mi -629 较少 τ 89 mi -720 少 较少
42 mi -383 少 τ 90 mi -766 少 较少
43 mi -lOb 少 较少 91 mi -873 少 较少
44 mi -1275 少 较少 92 mi -93* 少 较少
45 mi -1299 少 较少 93 mi -934 少 较少
46 mi -136* 少 较少 94 mi -944 少 较少
47 mi -143* 少 较少 95 mi -145* UD 较少
48 mi -147b 少 较少 96 mi -146a* UD 较少
5.3 人成乳中特有的微小核糖核酸表达谱
所述的人成乳中特有的微小核糖核酸表达谱是指: (1) 在人成乳中的含量比人初乳 中的含量高的 microRNA, 或者 (2)在人成乳中被检测到， 而在人初乳中未检测到或不 存在； 如表 6所示。
表 6
mi 含量 mi 含量 mi 含量 mi 含量 编号 mi 种类 编号 mi 种类
(人成乳） (人初乳） (人成乳） (人初乳）
1 let-7g 冋 较高 31 mi -376a 少 UD
2 mi -30b 间 较高 32 mi -411 少 UD
3 mi -200a* 较高 由
τ 33 mi -4297 少 UD
4 mi -200c 较高 由
T 34 mi -488 少 UD
5 miR- 18a 由
τ 较少 35 mi -491-5p 少 UD
6 miR- 196b 由
T 较少 36 mi -514 少 UD
7 mi -200b* 由
T 较少 37 mi -516b 少 UD
8 mi -224 由
T 较少 38 mi -517c 少 UD
9 mi -511 由
T 较少 39 mi -518e 少 UD
10 mi -99a* 由
T 较少 40 mi -519a* 少 UD
11 mi -3656 由
T 少 41 mi -519b-3p 少 UD
12 mi -1228* 少 UD 42 mi -520a-5p 少 UD
13 miR- 1249 少 UD 43 mi -520f 少 UD
14 miR- 1276 少 UD 44 mi -522 少 UD 15 mi -1283 少 UD 45 mi -524-3p 少 UD
16 mi -153 少 UD 46 mi -548v 少 UD
17 mi -19b-l* 少 UD 47 mi -552 少 UD
18 mi -2110 少 UD 48 mi -589* 少 UD
19 mi -2116* 少 UD 49 mi -641 少 UD
20 mi -2277-3p 少 UD 50 mi -643 少 UD
21 mi -3065-3p 少 UD 51 mi -95 少 UD
22 mi -3074 少 UD 52 mi -3200-3p 较少 少
23 mi -3115 少 UD 53 mi -339-5p 较少 少
24 mi -3174 少 UD 54 mi -499-3p 较少 少
25 mi -3190 少 UD 55 mi -512-3p 较少 少
26 mi -3200-5p 少 UD 56 mi -517a 较少 少
27 mi -326 少 UD 57 mi -517b 较少 少
28 mi -3617 少 UD 58 mi -519a 较少 少
29 mi -3620 少 UD 59 mi -519c-3p 较少 少
30 mi -3654 少 UD 60 mi -671-3p 较少 少
61 mi -937 较少 少 根据 5.2和 5.3的微小核糖核酸表达谱的特点， 可指导婴儿食品的科学分段， 制成 不同配方的乳品， 用于不同阶段的婴幼儿食品。 1. 在乳品中添加在人初乳中含量高的 表 5所述的 microRNA, 可用于 0-1个月前的婴儿食品中。 2. 在乳品中添加在人成乳 中含量高的表 6所述的 microRNA, 用于 1-24个月的婴幼儿食品。
5.4 牛乳中特有的微小核糖核酸表达谱
mi -148, mi -138, miR-146-5p、 mi -523-5p, mi -523-3p, miR-885-3p、 mi -935, mi -1308, miR-1306在牛乳中存在， 在人乳中不存在。 但是这些微小核糖核酸中， 大 部分 microRNA在癌症患者体内表达上调， 对癌症起到负调控的作用，
因此， 敲除这些微小核糖核酸能抑制癌基因的发展。 在乳品中去除这些微小核糖 核酸， 制成不会对基因产生影响的特种乳品， 或用做癌症患者的新型营养品等。 在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考， 就如同每一篇文献被单独 引用作为参考那样。 此外应理解， 在阅读了本发明的上述讲授内容之后， 本领域技术 人员可以对本发明作各种改动或修改， 这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书 所限定的范围。

Claims

权 利 要 求
1. 一种人工的乳制品， 其特征在于， 所述的乳制品中含有外源添加的一种或多 种源自人奶的 microRNA, 所述人奶包括人初乳或人成乳。
2. 如权利要求 1所述的人工的乳制品， 其特征在于， 所述的 microRNA选自下 组：
(a) 表 A中所列出的人初乳特有的 microRNA;
表 A
Figure imgf000033_0001
(b) 表 B中所列出的人成乳特有的 microRNA;
表 B
编号 mi 种类 编号 mi 种类 编号 mi 种类 编号 mi 种类
1 let-7g 16 miR- 153 31 mi -376a 46 mi -548v
2 mi -30b 17 mi -19b-l* 32 mi -411 47 mi -552
3 mi -200a* 18 miR-2110 33 mi -4297 48 mi -589*
4 mi -200c 19 miR-2116* 34 mi -488 49 mi -641
5 miR- 18a 20 mi -2277-3p 35 mi -491-5p 50 mi -643
6 miR- 196b 21 mi -3065-3p 36 mi -514 51 mi -95 7 mi -200b* 22 mi -3074 37 mi -516b 52 mi -3200-3p
8 mi -224 23 mi -3115 38 mi -517c 53 mi -339-5p
9 mi -511 24 mi -3174 39 mi -518e 54 mi -499-3p
10 mi -99a* 25 mi -3190 40 mi -519a* 55 mi -512-3p
11 mi -3656 26 mi -3200-5p 41 mi -519b-3p 56 mi -517a
12 mi -1228* 27 mi -326 42 mi -520a-5p 57 mi -517b
13 mi -1249 28 mi -3617 43 mi -520f 58 mi -519a
14 mi -1276 29 mi -3620 44 mi -522 59 mi -519c-3p
15 mi -1283 30 mi -3654 45 mi -524-3p 60 mi -671 -3p
61 mi -937
(c) 表 C中所列出的人初乳和成乳共有的 microRNA; 和
表 C
编号 mi 种类 编号 mi 种类 编号 mi 种类 编号 mi 种类
1 let-7a* 87 miR- 190 173 mi -3196 259 mi -500b
2 let-7b* 88 miR- 190b 174 mi -32 260 mi -501-3p
3 let-7d* 89 miR- 191 175 mi -32* 261 mi -501-5p
4 let-7e* 90 miR- 192* 176 mi -3200-3p 262 mi -502-3p
5 let-7f-l* 91 mi -193a-3p 177 mi -320a 263 mi -502-5p
6 let-7f-2* 92 mi -193a-5p 178 mi -320b 264 mi -504
7 let-7g 93 miR- 193b 179 mi -320c 265 mi -505
8 let-7g* 94 miR- 194 180 mi -320d 266 miR-511
9 let-7i* 95 miR- 195* 181 mi -324-3p 267 mi -512-3p
10 miR- 100* 96 miR- 196a 182 mi -324-5p 268 mi -515-5p
11 mi -101* 97 miR- 196a* 183 mi -330-3p 269 mi -517a
12 miR- 103-2* 98 miR- 196b 184 mi -330-5p 270 mi -517b
13 miR- 106a 99 miR- 197 185 mi -331-3p 271 mi -519a
14 miR- 106b 100 mi -199a-3p 186 mi -331-5p 272 mi -519c-3p
15 miR- 106b* 101 mi -199b-3p 187 mi -335 273 mi -520a-3p
16 miR- 10a 102 mi -199b-5p 188 mi -335* 274 mi -532-3p
17 miR- 10a* 103 miR- 19a 189 mi -338-3p 275 mi -532-5p
18 miR- 10b 104 miR- 19b 190 mi -339-3p 276 mi -542-3p
19 miR- 1246 105 mi -200a 191 mi -339-5p 277 mi -548c-5p
20 miR- 1251 106 mi -200a* 192 mi -33a 278 mi -548d-5p
21 mi -125a-3p 107 mi -200b 193 mi -33a* 279 mi -548e
22 mi -125a-5p 108 mi -200b* 194 mi -33b 280 mi -548h
23 miR- 125b- 1* 109 mi -200c 195 mi -33b* 281 mi -548i
24 mi -125b-2* 110 mi -200c* 196 mi -340* 282 mi -548j
25 miR- 126* 111 mi -20a 197 mi -342-3p 283 mi -548k
26 miR- 1260 112 mi -20a* 198 mi -342-5p 284 mi -548n
27 miR- 1260b 113 mi -20b 199 mi -34a 285 mi -548o
28 miR- 1262 114 mi -21 * 200 mi -34a* 286 mi -548p
29 miR- 1266 115 mi -2114 201 mi -34b* 287 mi -548y
30 miR- 1271 116 miR-2114* 202 mi -34c-5p 288 mi -548z
31 mi -127-3p 117 mi -2115 203 mi -3605-5p 289 mi -550a*
32 miR- 1274b 118 miR-2115* 204 mi -3613-5p 290 mi -551a
Figure imgf000035_0001
79 mi -182* 165 mi -3127 251 mi -455-5p 337 mi -934
80 mi -183* 166 mi -3130-3p 252 mi -486-5p 338 mi -937
81 mi -185* 167 mi -3130-5p 253 mi -489 339 mi -941
82 mi -187 168 mi -3133 254 mi -493 340 mi -944
83 mi -188-3p 169 mi -3144-3p 255 mi -499-3p 341 mi -99a
84 mi -188-5p 170 mi -3158 256 mi -499-5p 342 mi -99a*
85 mi -18a 171 mi -3182 257 mi -500a 343 mi -99b
86 mi - 18a* 172 mi -3194 258 mi -500a* 344 mi -99b*
(d) 表 D中所列出的、 牛奶中不存在但在人初乳或人成乳中存在的 microRNA。
表 D
Figure imgf000036_0001
33 mi -141* 93 mi -30e* 153 mi -511 213 miR- 10b
34 mi -143* 94 mi -3116 154 mi -512-3p 214 miR- 1260
35 mi -144* 95 mi -3127 155 mi -515-5p 215 mi -140-5p
36 mi -1468 96 mi -3130-3p 156 mi -517a 216 miR- 147b
37 mi -146b-3p 97 mi -3130-5p 157 mi -517b 217 mi -181c
38 mi -148a* 98 mi -3133 158 mi -519a 218 miR- 187
39 mi -148b* 99 mi -3144-3p 159 mi -519c-3p 219 mi -188-3p
40 mi -1537 100 mi -3158 160 mi -520a-3p 220 mi -188-5p
41 mi -155* 101 mi -3182 161 mi -548c-5p 221 miR- 18a
42 mi -15a* 102 mi -3194 162 mi -548d-5p 222 miR- 190
43 mi -15b* 103 mi -3196 163 mi -548e 223 miR- 190b
44 mi -16-1* 104 mi -32 164 mi -548h 224 miR- 19a
45 mi -16-2* 105 mi -32* 165 mi -548i 225 mi -219-l-3p
46 mi -17* 106 mi -3200-3p 166 mi -548j 226 mi -219-5p
47 mi -181a* 107 mi -335* 167 mi -548k 227 mi -301a
48 mi -181a-2* 108 mi -339-3p 168 mi -548n 228 mi -330-5p
49 mi -181c* 109 mi -33a* 169 mi -548o 229 mi -338-3p
50 mi -182* 110 mi -33b* 170 mi -548p 230 mi -34c-5p
51 mi -183* 111 mi -340* 171 mi -548y 231 mi -381
52 mi -185* 112 mi -342-5p 172 mi -548z 232 mi -383
53 mi - 18a* 113 mi -34a* 173 mi -550a* 233 mi -424
54 mi -192* 114 mi -34b* 174 mi -551a 234 mi -449a
55 miR- 193b 115 mi -3605-5p 175 mi -576-3p 235 mi -450a
56 miR- 195* 116 mi -3613-5p 176 mi -576-5p 236 mi -455-5p
57 miR- 196a* 117 mi -3614-5p 177 mi -577 237 mi -501-3p
58 mi -199b-5p 118 mi -3615 178 mi -579 238 mi -505
59 mi -200a* 119 mi -365* 179 mi -580 239 mi -542-3p
60 mi -200b* 120 mi -3656 180 mi -582-3p 240 mi -582-5p
241 mi -9
3. 如权利要求 1 所述的人工的乳制品， 其特征在于， 所述的乳制品包括初乳制
PR、 成乳制
4. 如权利要求 1 所述的人工的乳制品， 其特征在于， 所述的乳制品具有以下一 个或多个特征：
(al) 所述的外源添加的 microRNA中有两种或多种来自表 A;
(a2) 所述的外源添加的 microRNA的种类和含量与人初乳的 microRNA表达谱相 近或相同；
(bl) 所述的外源添加的 microRNA中有两种或多种来自表 B;
(b2) 所述的外源添加的 microRNA的种类和含量与人成乳的 microRNA表达谱相 近或相同；
(cl) 所述的外源添加的 microRNA中有两种或多种来自表 C; (dl) 所述的外源添加的 microRNA中有两种或多种来自表 D。
5. 一种人工的食品补充剂， 其特征在于， 所述的食品补充剂含有食品学上可接 受的载体以及一种或多种选自下组的、 源自人奶的 microRNA:
(a) 表 A中所列出的人初乳特有的 microRNA;
(b) 表 B中所列出的人成乳特有的 microRNA;
(c) 表 C中所列出的人初乳和成乳共有的 microRNA; 和
(d) 表 D中所列出的、 牛奶中不存在但在人初乳或人成乳中存在的 microRNA。
6. 如权利要求 5所述的人工的食品补充剂， 其特征在于， 具有以下一个或多个 特征：
(al) 所述的外源添加的 microRNA中有两种或多种来自表 A;
(a2) 所述的外源添加的 microRNA的种类和含量与人初乳的 microRNA表达谱相 近或相同；
(bl) 所述的外源添加的 microRNA中有两种或多种来自表 B;
(b2) 所述的外源添加的 microRNA的种类和含量与人成乳的 microRNA表达谱相 近或相同；
(cl) 所述的外源添加的 microRNA中有两种或多种来自表 C;
(dl) 所述的外源添加的 microRNA中有两种或多种来自表 D。
7. 一种鉴别乳制品的方法， 其特征在于， 所述方法包括步骤：
(1) 提供一乳制品样品；
(2) 检测所述乳制品样品中 microRNA的种类及其含量；
(3) 将步骤 (2)测得的 microRNA种类及其含量， 与作为对照的初乳样品以及成乳 样品中 microRNA的表达谱进行比较；
其中，如果测得的 microRNA的种类及其含量与初乳样品的 microRNA表达谱相 近或相同， 则鉴定所述乳制品为初乳制品； 如果测得的 microRNA的种类及其含量与 成乳样品的 microRNA表达谱相近或相同， 则鉴定所述乳制品为成乳制品。
8. 如权利要求 7所述的方法， 其特征在于， 所述的乳制品包括牛奶或其衍生乳 制品、 羊奶或其衍生乳制品、 人奶。
9. 一种制造乳制品的方法， 其特征在于， 包括步骤：
(1) 提供一乳制品原料；
(2) 检测所述乳制品原料中 microRNA的种类及其含量， 得到第一 microRNA表 达谱；
(3) 将步骤 (2)测得的 microRNA种类及其含量， 与作为对照的初乳样品或成乳样 品中 microRNA表达谱进行比较；
(4) 基于比较结果， 向所述乳制品原料中添加一种或多种 microRNA和 /或从所述 乳制品原料中去除一种或多种 microRNA , 从而制得乳制品， 其中所述乳制品 microRNA表达谱与作为对照的初乳样品或成乳样品中 microRNA的表达谱更接近或 一致。
10. 一种制造乳制品的方法， 其特征在于， 包括步骤：
(1) 提供一乳制品原料；
(2) 向所述乳制品原料中添加一种或多种 microRNA和 /或从所述乳制品原料中 去除一种或多种 microRNA, 从而制得乳制品， 其中所述乳制品中 microRNA表达谱 与初乳或成乳中 microRNA的表达谱更接近或一致。
11.一种制造食品补充剂的方法， 其特征在于， 包括步骤：
(1) 检测某一对象的母乳中 microRNA的种类及其含量， 从而获得该对象的第一 microRNA表达谱；
(2) 将测得的第一表达谱的 microRNA种类及其含量， 与作为对照的正常初乳样 品或正常成乳样品中 microRNA 表达谱进行比较， 从而确定第一表达谱中所缺乏的 microRNA或含量不足因而需要部分补充的 microRNA;
(3) 配制食品补充剂， 其中所述的食品补充剂含有上一步骤中所确定的第一表达 谱中所缺乏的 microRNA或含量不足因而需要部分补充的 microRNA。
12. 一种分离的 microRNA集合 (set), 其特征在于， 所述的 microRNA集合由二 种或多种选自下组的、 源自人奶的 microRNA所构成：
(a) 表 A中所列出的人初乳特有的 microRNA;
(b) 表 B中所列出的人成乳特有的 microRNA;
(c) 表 C中所列出的人初乳和成乳共有的 microRNA; 和
(d) 表 D中所列出的、 牛奶中不存在但在人初乳或人成乳中存在的 microRNA。
13. 一种人工的乳制品、 食品或食品补充剂， 其特征在于， 含有权利要求 12所 述的分离的 microRNA集合作为有效成分。
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