WO2014057893A1 - 検出方法、マイクロアレイの解析方法および蛍光読取装置 - Google Patents

検出方法、マイクロアレイの解析方法および蛍光読取装置 Download PDF

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fluorescence
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薙野　邦久
俊平 吉川
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Toray Industries Inc
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    • G01N2021/6441—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes" with indicators, stains, dyes, tags, labels, marks with two or more labels
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    • G01N2201/04—Batch operation; multisample devices
    • G01N2201/0461—Simultaneous, e.g. video imaging

Definitions

  • the present invention relates to a detection method for detecting a difference in height of uneven shapes on the surface of a microarray, a microarray analysis method, and a fluorescence reader.
  • microarray is a substrate in which tens to tens of thousands of probes are fixed on a substrate such as glass or plastic.
  • a sample (target) labeled with a fluorescent molecule is applied to the substrate, and the probe and This is for detecting the binding reaction by fluorescence or the like.
  • Microarrays are capable of comprehensive measurements at once, and are expected to become essential for tailor-made medicine in the future.
  • a DNA microarray (hereinafter referred to as a DNA chip) in which DNA is immobilized on a substrate as a probe, a protein microarray in which protein is immobilized on a substrate as a probe, a tissue microarray in which a large number of minute specimens are immobilized on a substrate as a probe, a large number of small molecules
  • a DNA chip a DNA microarray in which DNA is immobilized on a substrate as a probe
  • a protein microarray in which protein is immobilized on a substrate as a probe
  • a tissue microarray in which a large number of minute specimens are immobilized on a substrate as a probe
  • a large number of small molecules A compound microarray in which a compound is immobilized on a substrate as a probe is known.
  • the DNA chip is most practically used, and research for searching for a gene related to a disease, and testing and diagnosis using the gene is actively conducted. Has been.
  • a DNA chip is obtained by spotting (immobilizing) DNA in a grid shape on a substrate made of glass or resin.
  • DNA probe single-stranded DNA
  • a DNA probe having a known sequence is used.
  • a DNA sample (single-stranded DNA) of an unknown sequence to be analyzed is attached with a luminescent or fluorescent mark that can be detected optically. In this way, when a DNA sample of an unknown sequence to be analyzed is poured onto a DNA chip, if the DNA sample sequence is complementary to the DNA probe sequence, the DNA probe and the DNA sample are linked together. It becomes strand DNA.
  • FIG. 13 shows details of a series of processing steps of DNA chip analysis.
  • a DNA sample provided with a fluorescent mark is dropped on the substrate of a DNA chip on which various types of DNA probes are mounted.
  • the DNA sample has a complementary relationship with the spotted DNA probe, they are combined into a double strand (step S202).
  • the hybridized DNA chip is washed with a predetermined washing solution (step S203). As a result, all DNA samples that are not linked to the DNA probes arranged in a grid are washed away.
  • the cleaned DNA chip is scanned by irradiating light (step S204).
  • the DNA chip is irradiated with a laser beam having a wavelength suitable for exciting the fluorescent mark, and fluorescence from the DNA sample respectively linked (hybridized) to each DNA probe is acquired as an electrical signal.
  • the light emission amount of the fluorescent mark given to the DNA sample bound to each spotted DNA probe (gene) is measured, and based on this, fluorescent image data to be analyzed can be obtained.
  • the fluorescence intensity of each spot is calculated using the template for the obtained fluorescence image data, and various analyzes are executed (step S205).
  • FIG. 14 shows an example of a DNA chip 100 used for DNA chip analysis.
  • a DNA chip 100 shown in FIG. 14 has a rectangular plate shape having an uneven shape.
  • the DNA chip 100 has a plurality of blocks 101 having a plate surface divided into a lattice shape.
  • a plurality of DNA probes corresponding to individual genes are fixed on the top surface of the block 101 and arranged in a matrix in a predetermined number in the row and column directions.
  • a plurality of spots 102 are formed.
  • the plurality of blocks 101 are formed at the bottom of the recess 103 that is cut out in a prismatic shape.
  • the DNA probes arranged on the spot 102 correspond to different genes whose base sequences have already been decoded, and their arrangement positions on the block 101 are predetermined.
  • FIG. 15 shows an example of a template applied to the fluorescence image data of the DNA chip.
  • the template is divided into a plurality of blocks (for example, 32 blocks in FIG. 15) (corresponding to the block 101), and m rows and n columns (22 ⁇ 22 in FIG. 15) are included in each block. ) Arranged in a matrix (corresponding to the individual spots 102 of the DNA chip 100).
  • the detection area of the template provided by the analysis tool is applied to each spot 102 in the fluorescence image data of the read DNA chip (alignment), and the fluorescence intensity of each spot 102 is calculated in the detection area. To do.
  • This alignment method includes a pattern matching method and a projection method for performing alignment in block units. And like the technique which patent document 1 discloses, it tries to perform alignment correctly using the chip
  • the method of spotting and arranging fluorescent substances has the advantage that alignment can be performed even if there are few spots that emit sufficiently intense fluorescence, but the number of DNAs that can be placed on the spots 102 is reduced, and chip manufacturing is possible. There are problems such as cost increase at the time.
  • a fluorescent substance when spotted, it may be released during hybridization, contaminating the periphery of the positive control, and data may not be obtained.
  • the present invention has been made in view of the above, and provides a detection method, a microarray analysis method, and a fluorescence reading apparatus capable of acquiring an image capable of accurately detecting a difference in substrate height. Objective.
  • a detection method irradiates a substrate having a concavo-convex shape with laser light condensed by a lens, and reflects light from the substrate and / or
  • a detection method for detecting a difference in height of the concavo-convex shape by acquiring light intensity of scattered light as image data, wherein the light irradiation surface of the substrate is disposed at a position closer to the lens than a focal position of the lens. Then, reflected light and / or scattered light from the light irradiation surface is received as detection light, and a difference in height of the substrate is detected based on a change in intensity of the received light.
  • the detection method in the above invention, when the light irradiation surface of the substrate is disposed at the focal position, an optical system that separates specularly reflected light from the light irradiation surface from the detection light is provided. And detecting the height of the substrate.
  • ⁇ / f when the focal length of the lens is f and the distance that brings the substrate closer to the lens from the focal position is ⁇ , ⁇ / f is within a predetermined range.
  • the light irradiation surface of the substrate is arranged at a position corresponding to ⁇ set so as to be.
  • the microarray analysis method provides an excitation wavelength of the fluorescent label via an objective lens with respect to a microarray in which a concavo-convex shape is formed and a plurality of probes each capable of binding to a fluorescently labeled sample are arranged.
  • the detecting step detects three or more reference points based on a change in the light intensity in the alignment image data, and the correcting step. Is characterized in that the distortion of the fluorescence image data is corrected based on the detected reference point.
  • the correction step acquires the inclination angles ⁇ x and ⁇ y of the image data for alignment based on the reference point, and the inclination angles ⁇ x and ⁇ y and The shear deformation distortion of the fluorescent image data is corrected based on the following formulas (1) and (2).
  • the focal length of the objective lens is f
  • the distance to bring the microarray closer to the objective lens from the focal position is ⁇ .
  • the alignment image data is obtained by arranging the surface of the microarray at a position corresponding to ⁇ set so that ⁇ / f is within a predetermined range.
  • microarray analysis method is characterized in that, in the above invention, the microarray is a DNA microarray.
  • the fluorescence reading apparatus receives light including fluorescence of the fluorescent label from a substrate on which a plurality of probes that can be combined with a fluorescently labeled sample are formed.
  • a fluorescence reading apparatus that acquires image data based on the received light, a light source that emits illumination light including excitation light of at least a predetermined wavelength, and the substrate that is irradiated with the illumination light.
  • An objective lens that receives light from the surface of the substrate, and an image that detects the light received by the objective lens and acquires fluorescence image data based on the detected fluorescence and substrate image data based on the light from the substrate Based on the acquisition unit, the substrate image data acquired by the image acquisition unit, a detection unit that detects a difference in height of the concavo-convex shape, and the depression detected by the detection unit Based on the difference in shape height, a correction unit that corrects the fluorescence image data, a holding unit that holds the substrate, a driving unit that moves the holding unit along the optical axis of the objective lens,
  • the drive unit includes the holding unit so as to arrange the substrate at a position close to the objective lens with respect to a focal position of the objective lens when the substrate image data is acquired by the image acquisition unit. It is made to move.
  • the holding means is moved so as to place the substrate at a position corresponding to ⁇ set so that / f is within a predetermined range.
  • the present invention by acquiring an image capable of accurately detecting a difference in substrate height, analysis of a DNA chip without a positive control or analysis of a chip with a small amount of DNA contained in a sample can be performed. Even in this case, alignment processing can be performed appropriately and analysis can be performed.
  • FIG. 1 is a schematic diagram illustrating an example of an optical system of a scanner according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 2 is a diagram schematically illustrating an example of an image of a DNA chip read by the scanner according to the present embodiment.
  • FIG. 3 is a schematic diagram showing a configuration of a main part of the optical system of the scanner according to the embodiment of the present invention.
  • FIG. 4A is a schematic diagram illustrating a configuration of a main part of the optical system of the scanner according to the embodiment of the present invention.
  • FIG. 4B is a schematic diagram of the configuration of the main part of the optical system of the scanner according to the embodiment of the present invention.
  • FIG. 5A is a diagram for explaining an image of the DNA chip read by the scanner according to the embodiment of the present invention.
  • FIG. 5A is a diagram for explaining an image of the DNA chip read by the scanner according to the embodiment of the present invention.
  • FIG. 5-2 is a diagram for explaining an image of the DNA chip read by the scanner according to the embodiment of the present invention.
  • FIG. 5C is a diagram for explaining an image of the DNA chip read by the scanner according to the embodiment of the present invention.
  • FIG. 6 is a flowchart showing image alignment processing according to the embodiment of the present invention.
  • FIG. 7 is a schematic diagram showing a configuration of a main part of the optical system of the scanner according to the embodiment of the present invention.
  • FIG. 8 is a schematic diagram showing an image of the DNA chip read by the scanner according to the embodiment of the present invention.
  • FIG. 9A is a diagram for explaining an image of the DNA chip read by the scanner according to the embodiment of the present invention.
  • FIG. 9-2 is a diagram for explaining an image of the DNA chip read by the scanner according to the embodiment of the present invention.
  • FIG. 9-3 is a diagram for explaining an image of the DNA chip read by the scanner according to the embodiment of the present invention.
  • FIG. 10 is a schematic diagram illustrating another example of the optical system of the scanner according to the embodiment of the present invention.
  • FIG. 11A is a diagram showing an image of the DNA chip according to the example of the present invention.
  • FIG. 11-1B is a graph of light intensity change in the DNA chip according to the working example.
  • FIG. 11-2A is a diagram illustrating an image of the DNA chip according to the example of the present invention.
  • FIG. 11-2B is a graph of light intensity change in the DNA chip according to the working example.
  • FIG. 11-3A is a diagram illustrating an image of the DNA chip according to the example of the present invention.
  • FIG. 11-3B is a graph of light intensity change in the DNA chip according to the working example.
  • FIG. 11-4A is a diagram illustrating an image of the DNA chip according to the example of the present invention.
  • FIG. 11-4B is a graph of light intensity change in the DNA chip according to the working example.
  • FIG. 11-5A is a diagram illustrating an image of the DNA chip according to the example of the present invention.
  • FIG. 11-5B is a graph of light intensity change in the DNA chip according to the working example.
  • FIG. 11-6A is a diagram illustrating an image of the DNA chip according to the example of the present invention.
  • FIG. 11-6B is a graph of light intensity change in the DNA chip according to the working example.
  • FIG. 11-7A is a diagram showing an image of the DNA chip according to the example of the present invention.
  • FIG. 11-7B is a graph of light intensity change in the DNA chip according to the working example.
  • FIG. 11-8A is a diagram showing an image of the DNA chip according to the example of the present invention.
  • FIG. 11-8B is a graph of light intensity change in the DNA chip according to the working example.
  • FIG. 11-9A is a diagram showing an image of the DNA chip according to the example of the present invention.
  • FIG. 11-9B is a graph of light intensity change in the DNA chip according to the working example.
  • FIG. 11-10A is a diagram showing an image of the DNA chip according to the example of the present invention.
  • FIG. 11-10B is a graph of light intensity change in the DNA chip according to the working example.
  • FIG. 11-11A is a diagram showing an image of the DNA chip according to the example of the present invention.
  • FIG. 11-11B is a graph of light intensity change in the DNA chip according to the working example.
  • FIG. 11-12A is a diagram showing an image of the DNA chip according to the example of the present invention.
  • FIG. 11-12B is a graph of light intensity change in the DNA chip according to the working example.
  • FIG. 12A is a diagram of an image of the slide glass according to the example of the present invention.
  • FIG. 12-2 is a graph showing a change in light intensity between arrows P 13 and P 13 ′ in the image of FIG. 12-1.
  • FIG. 12-3 is a graph showing a difference in height on the slide glass between arrows P 13 and P 13 ′ in the image of FIG. 12-1.
  • FIG. 13 is a flowchart showing details of a series of processing steps of conventional DNA chip analysis.
  • FIG. 14 is a schematic diagram showing an example of a DNA chip used for conventional DNA chip analysis.
  • FIG. 15 is a schematic diagram showing an example of a template applied to fluorescence image data of a conventional DNA chip.
  • a microarray fluorescence reader scans a light beam of an excitation wavelength and / or a microarray one-dimensionally or two-dimensionally to detect fluorescence from a specimen on a substrate, and images the data. Based on the image, the amount of fluorescence from each probe (fluorescent label labeled on the sample) is obtained.
  • FIG. 1 is a schematic diagram illustrating an example of an optical system of a scanner according to an embodiment of the present invention.
  • the scanner 1 shown in FIG. 1 includes a laser light source, an objective optical system, an optical filter, an image acquisition unit that acquires fluorescence image data and alignment image data (substrate image data), and the scanner 1 includes the above-described DNA.
  • a scanning mechanism for scanning the chip 100 (microarray) in two directions (not shown, and in this specification, in the main surface of the DNA chip 100, the longitudinal direction of the substrate is the y-axis, and the direction orthogonal thereto is the x-axis)
  • an autoloader mechanism (not shown) for mounting a plurality of DNA chips 100.
  • the scanner 1 includes laser light sources 11 and 12 that emit illumination light including at least excitation light of a specific wavelength to the substrate surface, and an objective lens 13 that converts fluorescence from a probe that has received the excitation light into parallel light.
  • an objective lens 13 Provided between the laser light sources 11 and 12 and the objective lens 13, and is a hole through which the illumination light emitted from the laser light sources 11 and 12 and traveling on the optical path N1 passes to the objective lens 13 side. 140 is formed, and a perforated mirror 14 that bends at least a part of the light emitted from the DNA chip 100 to the optical path N2 side, and light having a wavelength corresponding to the excitation light emitted from the laser light source 11 is cut.
  • An excitation light cut filter 15a that transmits only light having a wavelength corresponding to the fluorescence from the sample hybridized with the DNA probe;
  • a cut filter having an excitation light cut filter 15b that transmits only light having a wavelength according to fluorescence from a sample hybridized with a DNA probe while cutting light having a wavelength according to excitation light emitted from the laser light source 12.
  • 15 and an imaging lens 16 that forms an image of fluorescence from the sample hybridized with the DNA probe; and fluorescence image data is obtained by receiving fluorescence from the sample hybridized with the DNA probe;
  • an image acquisition unit 17 that receives reflected light and acquires the uneven shape of the surface of the block 101 of the DNA chip 100 as alignment image data that can be detected from the received light intensity.
  • the excitation light cut filters 15 a and 15 b are provided so as to be detachable with respect to the optical path N ⁇ b> 2 connecting the perforated mirror 14 and the image acquisition unit 17.
  • the holed mirror 14 is usually provided with a hole 140 at the center for allowing excitation light to enter the DNA chip 100 (objective lens 13). Further, as shown in FIG. 1, the hole 140 of the perforated mirror 14 is configured to transmit fluorescence or excitation light so as not to guide specularly reflected light from the substrate that becomes noise to the image acquisition unit 17 side during optical reading. It has a function of geometrically separating the reflected light (detection light) and the regular reflection light from the substrate.
  • the excitation light from the laser light sources 11 and 12 is refracted by the mirrors 18 and 19 to reach the DNA chip 100 in order to reduce the size of the apparatus.
  • the reference axes of the scanning mechanism are orthogonal to obtain an image without distortion.
  • a scanning mechanism it is generally preferable to use a slider for both axes.
  • control unit 20 that controls the entire scanner 1 and the holding unit 104 (holding means) that holds the DNA chip 100 are arranged.
  • the main surface of the DNA chip 100 (block 101) is the light of the objective lens 13.
  • a drive unit 21 that performs control to move along an optical path N1 parallel to the axis. Under the control of the drive unit 20, the DNA chip 100 approaches or separates from the objective lens 13.
  • control unit 20 detects a difference in height of the concavo-convex shape on the surface of the DNA chip 100 (hereinafter referred to as a height difference) and a difference in height detected by the detection unit 20a. Further, the position of the spot 102 of the DNA chip 100 is determined by referring to the analysis definition file recorded in advance based on the correction unit 20b for correcting the image acquired by the image acquisition unit 17 and the image corrected by the correction unit 20b. And a determination unit 20c for determining.
  • the laser light sources 11 and 12 that emit light having wavelengths corresponding to the two types of fluorescent marks are emitted.
  • Excitation light cut filters 15a and 15b respectively corresponding to the wavelengths of the excitation light are provided.
  • it may be a device that attaches only one kind of fluorescent mark to a sample and reads it, or a device that attaches three or more kinds of fluorescent marks and reads them.
  • a laser light source and an excitation light cut filter corresponding to the fluorescent mark (fluorescent dye) to be used may be provided.
  • a method for acquiring fluorescence image data with the scanner 1 will be described.
  • a method for acquiring fluorescence image data will be described with reference to FIG.
  • the aspect using Cy5 and Cy3 as a fluorescent dye is demonstrated below, either one may be sufficient as the fluorescent dye for labeling a sample, and it is not limited to these.
  • the fluorescent dye include Fluorescein, FITC, Alexa Fluor 555, Rhodamine, Cy3.5, Texas Red, TAMRA, Oyster 650, and Cy5.5.
  • laser light that is, excitation light of the fluorescent dye Cy5
  • the Cy5 laser light source 11 for example, a laser light source that emits light having a wavelength of 635 nm.
  • the laser light is applied to the DNA chip 100 through the perforated mirror 14 and the objective lens 13.
  • the fluorescence from the fluorescent molecules excited and emitted by the irradiated laser light and the laser light reflected and / or scattered on the chip surface are made substantially parallel light by the objective lens 13 and travel in the direction of the arrow in the figure on the optical path N1.
  • the fluorescence and the laser light are reflected by the perforated mirror 14, travel on the optical path N2, and enter the excitation light cut filter 15a for Cy5 disposed on the optical path N2.
  • the laser light regularly reflected on the surface of the DNA chip 100 passes through the hole 140 of the perforated mirror 14. Fluorescence from the excited fluorescent molecules passes through the excitation light cut filter 15 a and is collected by the imaging lens 16.
  • the excitation light (light reflected and / or scattered on the chip surface) reaching the excitation light cut filter 15a is cut.
  • the fluorescence condensed by the imaging lens 16 enters the image acquisition unit 17.
  • the image acquisition unit 17 performs photoelectric conversion processing on the received light data and outputs an electrical signal (analog signal) corresponding to the intensity of light. While repeating these steps by scanning the DNA chip 100 in two directions, the electrical signal output from the image acquisition unit 17 is A / D converted to create fluorescent image data.
  • the fluorescent dye Cy3 is read. Reading the fluorescent dye Cy3 replaces the Cy5 laser light source 11 with a Cy3 laser light source 12 (for example, a laser light source that emits light having a laser wavelength of 532 nm), and the Cy5 excitation light cut filter 15a is excited with Cy3 excitation light. Except for the replacement with the cut filter 15b, the reading may be performed in the same manner as the reading of the fluorescent dye Cy5. That is, the laser light (that is, the excitation light of the fluorescent dye Cy3) is irradiated from the Cy3 laser light source 12, and the excitation light (that is, the chip surface) that has reached the excitation light cut filter 15b by the Cy3 excitation light cut filter 15b. In this manner, fluorescence image data is created in the same manner as the fluorescent dye Cy5.
  • a Cy3 laser light source 12 for example, a laser light source that emits light having a laser wavelength of 532 nm
  • the Cy5 excitation light cut filter 15a is excited with Cy3 excitation light.
  • FIG. 2 is a diagram schematically showing an example of an image of the DNA chip 100 read by the scanner 1 according to the present embodiment.
  • the scanning mechanism of the scanner is provided with two sliders, these sliders are not necessarily orthogonal to each other.
  • the image of the DNA chip 100 read by the scanner 1 may also be inclined with respect to the x axis as shown in FIG. 2A, for example.
  • the scanning direction of the scanning mechanism in the acquired image does not coincide with the x axis and / or the y axis, the obtained fluorescent image data is distorted, and the template detection area is correctly aligned with the obtained image.
  • the x-axis and y-axis of the slider are mechanically orthogonal, the x-axis and y-axis of the fluorescent image are not orthogonal to the slider axis. As a result, the fluorescent image may be rotated as a result. In these cases, the template detection area cannot be correctly aligned with the obtained image.
  • the fluorescence image data is projected in the y-axis direction with respect to the x-axis, and the integrated intensity for each coordinate X (the integrated value of each pixel value) is calculated. This process is repeated by rotating the fluorescent image data by a preset angle around the coordinate origin.
  • the integrated intensity graph when the projection direction and the arrangement direction of the spot in the y-axis direction are shifted is a graph having a small amplitude as shown in FIG.
  • the amplitude changes at regular intervals, and the signal amplitude becomes maximum.
  • the array angle of the spot 102 with respect to the y-axis can be detected.
  • the array direction of the spots can be made orthogonal by obtaining the array angle with respect to the x-axis and performing image processing such as shear deformation.
  • FIG. 3 is a schematic diagram illustrating a configuration of a main part of the optical system of the scanner 1 according to the present embodiment.
  • 4A and 4B are schematic diagrams illustrating the configuration of the main part of the optical system of the scanner 1 according to the present embodiment.
  • FIG. 4A is a plan view of the concave portion 103 of the DNA chip 100.
  • FIG. 4B is a diagram showing a case where the concave portion 103 of the DNA chip 100 does not have an inclination.
  • FIG. 3 shows a state in which incident light is incident on the surface (light irradiation surface) of the block 101 of the DNA chip 100 through the perforated mirror 14.
  • Incident light is parallel light represented by laser light.
  • the specularly reflected light is collected by the objective lens 13 and is ideal.
  • the same diameter as the incident light, and most specularly reflected light passes through the hole 140 of the perforated mirror 14 and is hardly guided to the image acquisition unit 17 side (solid arrow Y1 in FIG. 3).
  • the specularly reflected light from the surface is viewed from the objective lens 13 from the focal position (surface position P0). Is regarded as a point light source emitted from a distant part. Therefore, the reflected light is focused on the incident light side of the objective lens (dashed line arrow Y2 in FIG. 3). Therefore, at the position of the perforated mirror 14, the diameter of light is smaller than the diameter of light from the surface at the surface position P0. Therefore, most of the specularly reflected light passes through the hole 140 of the perforated mirror 14 and therefore is not guided to the image acquisition unit 17 side and becomes darker.
  • alignment image data is acquired at a position (surface position P2) where the imaging target surface of the DNA chip 100 is closer to the objective lens 13 than the focal position (surface position P0). Then, as indicated by the dotted arrow Y4 in FIG. 3, the specularly reflected light is regarded as a point light source that emits from a portion closer to the focal length when viewed from the objective lens 13, and therefore diverges even when passing through the objective lens 13. Reflected by the perforated mirror 14 toward the image acquisition unit 17. For this reason, the influence of irregularly reflected light (for example, broken line arrow Y3) is reduced, and only the step (edge) portion of the substrate is darkened.
  • irregularly reflected light for example, broken line arrow Y3
  • the surface position P2 of the imaging target surface may be set using a relationship ⁇ / f between the focal length f of the objective lens 13 and the distance ⁇ that brings the DNA chip 100 closer to the objective lens 13 from the focal position (surface P0).
  • the preferable range of ⁇ / f is 0.017 to 0.17, and more preferably 0.033 to 0.17.
  • the drive unit 21 performs control to move the holding unit 104 so that the imaging target surface of the DNA chip 100 is disposed at the set ⁇ position.
  • the reflected light is directed in another direction.
  • angle ⁇ 90 degrees
  • the reflected light returning to the lens is reflected twice. If the reflection is twice, the light becomes very weak (normally, the reflectance of the transparent body is about 4%, so the light quantity of the reflection twice is 1/25 of the intensity of the reflection once). Therefore, the step portion of the substrate becomes dark.
  • the preferable range of the angle ⁇ of the recess 103 is 20 degrees to 90 degrees. If it is greater than 90 degrees, it is difficult to produce a substrate, and if it is less than 20 degrees, the stepped portion may not be recognized by the image data.
  • the DNA chip 100 as shown in FIG. 14 is preferably manufactured by injection molding a resin from the viewpoint of productivity. In this case, the angle ⁇ is more preferably 20 degrees to 80 degrees from the viewpoint of ease of molding (easy removal from the mold).
  • FIGS. 5A to 5C are diagrams for explaining microarray images read by the scanner according to the present embodiment.
  • FIG. 5A is a diagram illustrating an alignment image.
  • FIG. 5B is a graph showing a change in light intensity between the arrows P-P ′ in the alignment image of FIG.
  • FIG. 5C is a graph showing a difference in height of the DNA chip 100 between the arrows P-P ′ in the alignment image of FIG. From FIG. 5-2, it can be confirmed that the amount of reflected light is reduced at the position corresponding to the side surface of the recess 103 of the DNA chip 100, and the uneven shape on the substrate can be imaged. Based on this, the position of the concave portion 103 of the DNA chip 100 in the alignment image can be determined, and the fluorescent image can be aligned.
  • a laser light source for example, wavelengths of 405 nm, 532 nm, and 635 nm
  • a laser light source since it is parallel light, the edge (light intensity difference) can be clearly detected in the image data for alignment by the phenomenon described with reference to FIG.
  • the excitation light cut filter 15b In general, a band-pass filter that transmits 550 to 600 nm is often used as the excitation light cut filter 15b for Cy3.
  • the excitation light cut filter 15b generally uses light having a wavelength of excitation light of Cy5 ( 635 nm) is slightly transmitted (for example, the OD value of light of 635 nm is about 5), so that the uneven shape of the DNA chip 100 can be imaged as shown in FIG. That is, it is possible to receive the reflected light or scattered light from the surface of the substrate, not the fluorescence from the fluorescent molecules excited and emitted by the light of a specific wavelength, and image the uneven shape of the substrate itself.
  • the DNA chip 100 When acquiring the alignment image data, it is preferable to place the DNA chip 100 closer to the objective lens 13 than the focal position.
  • the focal position the height of the objective lens 13 is fixed, the DNA chip 100 is changed in the height direction (the optical axis direction of the objective lens 13), and the amount of fluorescence from each DNA probe is measured. It can be obtained by measuring the height.
  • the height of the DNA chip 100 can be fixed and the height of the objective lens 13 can be raised or lowered.
  • the position of the surface of the DNA chip 100 (imaging target surface) may be brought closer to the lens side by 100 ⁇ m or more from the focal position based on the relationship of ⁇ / f described above. preferable.
  • the upper limit of the approaching distance is not particularly limited as long as the DNA chip 100 and the objective lens 13 do not collide, but in an apparatus such as the scanner 1, it is usually 3000 ⁇ m or less.
  • the light source for acquiring the alignment image data it is preferable to use a light source that emits excitation light for exciting fluorescent molecules because the number of parts of the scanner can be reduced. It does not matter if it is provided.
  • a method that does not use a filter when acquiring alignment image data can be adopted.
  • the filter when the filter is not used, the amount of light entering the image acquisition unit becomes too large, which may damage the light detection mechanism of the image acquisition unit. Therefore, as described above, when irradiating laser light from the Cy5 laser light source 11, it is preferable to use a filter that slightly transmits the wavelength of the irradiating light source, such as using the excitation light cut filter 15b.
  • the excitation light cut filter 15a may be used by irradiating laser light from the Cy3 laser light source 12.
  • an ND filter is used in place of the excitation light cut filters 15a and 15b, or the laser light output itself is weakened without using the excitation light cut filters 15a and 15b and the ND filter, thereby obtaining alignment image data. It doesn't matter. Of course, combinations of these can also be applied.
  • the substrate (DNA chip 100) was obtained from the focal position close to the 250 ⁇ m lens side.
  • the image for alignment in which the edge shape of the substrate surface appears as shown in FIG. 5-1 by actively bringing the substrate closer to the lens side from the focal position and actively receiving the reflected light of the laser beam. Data is obtained.
  • FIG. 6 is a flowchart showing image alignment processing according to the present embodiment.
  • the DNA chip 100 is set in the scanner 1, and the fluorescence image data of the fluorescent dyes Cy5 and Cy3 is read by the image acquisition unit 17 as described above (step S101). Subsequently, while the DNA chip 100 is set, the laser light is irradiated from the Cy5 laser light source 11 and the excitation image cut filter 15b for Cy3 is used, and the image data for alignment is read by the image acquisition unit 17 (step) S102). At this time, as described above, the DNA chip 100 is disposed at a position closer to the objective lens 13 than the focal position. In step S102, the laser light from the laser light source 12 for Cy3 may be irradiated and the excitation light cut filter 15a for Cy5 may be used.
  • step S103 the position of each DNA probe in the fluorescence image data is determined and analyzed using the alignment image data.
  • At least three reference points in the alignment image data are detected (step S103).
  • at least three reference points for example, as shown in FIG. 7, the coordinates of the four corners in the alignment image can be cited.
  • Such a method of detecting the coordinates of the four corners is performed by the detection unit 20a, and includes the above-described position determination of the recess 103 by edge detection using light and dark information.
  • regions Ea1 to Ea4 and Eb1 to Eb4 in which the outer edge of the recess 103 can be detected by the detection unit 20a are set in advance, and in each region, as shown in FIG. A change in light intensity between the arrows PP ′ is measured, and a difference in height of the DNA chip 100 is detected. Thereafter, the detection unit 20a linearly connects the center position of the region Ea1 and the center position of the region Ea2 using the center positions of the height differences detected in the regions Ea1 to Ea4 and Eb1 to Eb4. One side of the outer edge 103.
  • the center position of the region Ea3 and the center position of the region Ea4 are respectively straight lines. Tie. Thereby, the outer edge of the recess 103 in the alignment image obtained by the image acquisition unit 17 is formed. Further, by obtaining the intersections (coordinates) of the straight lines formed by being connected to each other, the four corners of the recess 103 can be obtained as the reference points 110a to 110d.
  • steps S104 and S105 the distortion of the fluorescence image data is corrected based on the reference point.
  • the correction unit 20b detects, for example, the inclination angle ⁇ x with respect to the x-axis of each side of the outer edge of the recess 103 and the inclination angle ⁇ y with respect to the y-axis from the coordinates of the reference points 110a to 110d (step S104). ). It is desirable that the inclination angles ⁇ x and ⁇ y take an average value of the angles of the two line segments in the corresponding direction (facing) with respect to the four line segments connecting the coordinates of the four corners. Note that the inclination angles ⁇ x and ⁇ y can be calculated even when there are three reference points. Then, as shown in FIGS.
  • the correction unit 20b uses the array angle ⁇ y of the side corresponding to the y-axis (the edge of the outer edge of the recess 103) with respect to the y-axis as the correction angle.
  • the data is rotated so that the side corresponding to the y axis of the recess 103 is parallel to the y axis.
  • the correction unit 20b uses the array angle ⁇ x of the side corresponding to the x axis (side of the outer edge of the recess 103) with respect to the x axis as a correction angle, and uses the fluorescent image.
  • the data is rotated so that the side corresponding to the x-axis of the recess 103 is parallel to the x-axis.
  • the correction unit 20b applies the above-described inclination angles ⁇ x and ⁇ y and the following formulas (1) and (2) to the spots 102 regularly arranged in the two directions detected as described above. Based on 2), conversion (shear deformation) is performed (step S105). Thereby, the shear deformation distortion of the image is corrected.
  • (x, y) in the following formula (1) is coordinates before conversion
  • (X, Y) is coordinates after conversion.
  • ⁇ xy corresponding to the deviation of the scanning mechanism of the scanner is obtained by subtracting the inclination angle ⁇ y from the inclination angle ⁇ x as shown in the following formulas (1) and (2).
  • the resin may expand due to moisture absorption or temperature change in the hybridization process or the washing process. Although it depends on the processing time in each process, it may expand several tens of ⁇ m, which affects the alignment accuracy.
  • the correction unit 20b calculates the chip lengths in the x-axis direction and the y-axis direction from the coordinates of the four corners described above, and performs contraction / expansion correction on the fluorescence image data so as to match the design value. (Steps S106, S107).
  • the determination unit 20c refers to the analysis definition file for the fluorescence image data subjected to the angle correction, the shear deformation correction, and the contraction / expansion correction by the correction unit 20b as described above. To do.
  • the position information of each spot in the template stored in the analysis definition file in advance is, for example, the center coordinates of each spot with the upper left corner (reference point 110a) as the origin. Therefore, the determination unit 20c determines the position of each spot (probe) by calculating each spot frame with respect to the image after the shrinkage correction in step S107, for example, using the coordinates of the upper left corner as the origin, and FIG. Alignment as shown in 1 to 9-3 is performed (step S108).
  • FIG. 9A is an image showing the result of alignment on the Cy3 fluorescence image data
  • FIG. 9B is an image showing the result of alignment on the Cy5 fluorescence image data.
  • a template (see FIG. 15) corresponding to each spot 102 can be applied to each spot 102 and associated with the detection area.
  • FIG. 9-3 shows the result of alignment performed on alignment image data for confirmation.
  • FIG. 9C it can be seen that the straight line portion at one corner of the outer edge of the recess 103 of the DNA chip 100 is orthogonal at the reference point 1101 by the alignment process.
  • steps S101 and S102 and the order of steps S106 and S107 may be interchanged.
  • the fluorescent image data obtained based on the hybridization of the DNA sample to the DNA probe in this way is processed to obtain desired numerical data.
  • it is used to analyze the presence of a desired gene, whether or not a certain gene is expressed, and how much it is expressed.
  • the image is corrected and aligned using the unevenness formed on the DNA chip 100. For this reason, the sample extracted from the specimen is arranged on the DNA chip 100 even for an image with a small amount of DNA probe that emits less DNA probes, and an image obtained by a reading device with poor scanning mechanism accuracy.
  • the detection area positioning process can be executed with high accuracy.
  • the image data for alignment is acquired at a position (surface position P2) where the imaging target surface of the DNA chip 100 is closer to the objective lens 13 than the focal position (surface position P0).
  • An image capable of accurately detecting a difference in height of the substrate can be acquired.
  • FIG. 10 shows another embodiment of an optical system suitable for the scanner used in the present invention.
  • the scanner 2 shown in FIG. 10 uses the micro mirror 14a instead of the perforated mirror 14 of the scanner 1 so that the excitation light is reflected by the micro mirror 14a and is incident on the DNA chip 100. It has a function of geometrically separating the reflected light (detection light) of fluorescent light or excitation light and the regular reflected light so as not to guide the regular reflected light from the DNA chip 100 as noise to the image acquisition unit 17 side. Thereby, regular reflection light is separable from the optical path N3. Even in this configuration, the same effect as the scanner 1 described above can be obtained.
  • the present invention is also applicable to a chip spotted with RNA, protein, minute sample, low molecular weight compound, cell, etc. Is possible.
  • a similar method is used even when a protein (antibody) is immobilized instead of a DNA probe and the presence or absence of a reaction with a sample or quantification is detected by fluorescence.
  • the protein present in the sample cell lysate is labeled with Cy5 and the protein present in the control cell lysate is labeled with Cy3 and the two are mixed and reacted with the antibody array, or the protein is labeled with biotin instead of fluorescently labeling.
  • biotin instead of fluorescently labeling.
  • RNA array this technique can be used when detecting hybridization of RNA immobilized on a substrate having a concavo-convex shape (spot 102) and fluorescently labeled DNA or RNA by fluorescence.
  • spot 102 a concavo-convex shape
  • the present invention can be applied when detecting a binding reaction between a micro sample or a cell immobilized on a substrate having an uneven shape and a fluorescent labeled specimen (for example, an antibody) by fluorescence. Is possible.
  • a die corresponding to a substrate having a shape like the DNA chip 100 shown in FIG. 14 is manufactured by ultraprecision machining, and a substrate made of PMMA (polymethyl methacrylate) is formed by injection molding using this die. 100.
  • the mold had a trace of cutting by the tool, and therefore, the tool cutting trace was transferred to the substrate.
  • the substrate height disturbance due to the cutting trace was measured to be 1 ⁇ m or less.
  • a DNA probe is fixed to the upper surface of the convex portion (spot 102) of the manufactured DNA chip 100, hybridization is performed, and a fluorescence image and an alignment image are obtained with a DNA chip scanner (3D-Gene Scanner (3D-Gene (registered trademark))).
  • a DNA chip scanner (3D-Gene Scanner (3D-Gene (registered trademark))
  • the apparatus configuration and conditions for acquiring the fluorescence image and the alignment image are as follows (1) to (4).
  • the optical system of the scanner 1 shown in FIG. 1 was used as the optical system of the scanner. That is, it has a perforated mirror 14 for allowing laser light to enter the DNA chip 100 and allowing regular reflection light from the substrate to pass therethrough.
  • the height of the DNA chip 100 (distance between the objective lens 13 and the DNA chip 100) was changed, and the height position where the fluorescence intensity was strongest was set to zero.
  • This position is the focal position (surface position P0) of the laser beam.
  • a laser having a wavelength of 635 nm and a bandpass filter for Cy5 were used.
  • This scanner has a function that can adjust the distance between the substrate and the lens.
  • a laser (wavelength 635 nm) for measuring the fluorescence of Cy5 was used, and the same filter as the bandpass filter used when measuring Cy3 was used.
  • the filter for Cy3 used in this example has an OD value of about 5 at 635 nm, and transmits a wavelength of 635 nm.
  • the offset position (distance from the focal position to the substrate surface) was changed from ⁇ 500 ⁇ m to +1500 ⁇ m, and the images of reflected and scattered light were compared (FIG. 3).
  • the expression that the offset position is 0 indicates that the substrate is at the focal position (surface position P0) of the laser beam focused by the objective lens.
  • the sign of the offset position is negative, the substrate is at a position far away from the objective lens (surface position P1) with reference to the focal position.
  • the sign is positive, the substrate is close to the objective lens with reference to the focal position. It shows that it exists in a position (surface position P2).
  • FIG. 11 is an image (A) of the DNA chip 100 (substrate) read by the scanner 1 according to the example of the present invention and a graph (B) of the light intensity change.
  • FIG. 11A is a graph showing an image when the offset position is 0 and a change in light intensity between the arrows P 1 -P 1 ′ in the image.
  • FIGS. 11-2 to 11-9 illustrate images when the offset positions are +100, +200, +300, +400, +500, +750, +1000, and +1500, and an arrow P 3 between the arrows P 2 and P 2 ′ in the image.
  • FIGS. 11-10 to 11-12 show images when the offset positions are ⁇ 100, ⁇ 200, and ⁇ 500, and arrows P 10 to P 10 ′, arrows P 11 to P 11 ′, and arrows in the image. it is a graph showing the light intensity change between P 12 -P 12 '. Note that the image shown in FIG. 11 is an image corresponding to the alignment image data corrected by the correction unit 20b described above.
  • the offset position when acquiring the alignment image is changed to ⁇ 500 ⁇ m, 0 ⁇ m, +100 ⁇ m, +200 ⁇ m, +500 ⁇ m, +1000 ⁇ m, +1250 ⁇ m, and +1500 ⁇ m to determine whether the image alignment processing can be performed appropriately.
  • the evaluation was performed by the following procedures (1) ′ to (5) ′.
  • a total of 20 DNA chips that had been subjected to the hybridization treatment were prepared.
  • the shape of the DNA chip substrate is as shown in FIG.
  • the difference in height between the edge portions is 90 ⁇ m, and the angle ⁇ shown in FIG. 4A is 70 degrees.
  • the offset position was set to ⁇ 100 ⁇ m, 0 ⁇ m, +100 ⁇ m, +200 ⁇ m, +500 ⁇ m, +750 ⁇ m, +1000 ⁇ m, +1250 ⁇ m, and +1500 ⁇ m, and alignment images were obtained at each position.
  • a laser wavelength 635 nm
  • the same filter as the band-pass filter used when measuring Cy3 was used.
  • Reference points corresponding to the reference points 110a to 110d in FIG. 7 were detected by an edge detection method using light / dark information based on the respective alignment image data.
  • the alignment reliability is clearly increased by bringing the DNA chip closer to the objective lens with respect to the focal position when acquiring the alignment image.
  • the reliability is greatly increased by setting the substrate closer to the +200 ⁇ m objective lens side than the focal position when acquiring the alignment image.
  • the f value of the objective lens mounted on the scanner 1 according to this example was 6.0 mm. Therefore, from the above results, when the offset position ( ⁇ ) is in the range of +100 to +1000, the preferable range of ⁇ / f is in the range of 0.017 (100/6000) to 0.17 (1000/6000). . In this range, the success probability is 95% or more. More preferably, the offset position is in the range of +200 to +1000, and the range of ⁇ / f is 0.033 (200/6000) to 0.17 (1000/6000). Within this range, the success probability of alignment is 100%.
  • FIGS. 12-1 to 12-3 are graphs of an image and fluorescence intensity of the slide glass according to this example.
  • FIG. 12A is an image obtained by the scanner 1.
  • FIG. 12-2 is a graph showing a change in light intensity between arrows P 13 and P 13 ′ in the image of FIG. 12-1.
  • FIG. 12-3 is a graph showing a difference in height on the slide glass between arrows P 13 and P 13 ′ in the image of FIG. 12-1.
  • the detection method, the microarray analysis method, and the fluorescence reading apparatus according to the present invention are suitable for acquiring an image capable of accurately detecting a difference in substrate height and appropriately performing alignment processing.

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Abstract

　基板の高さの差異を正確に検出可能な画像を取得することが可能な検出方法、マイクロアレイの解析方法および蛍光読取装置を提供すること。レンズによって集光されたレーザー光を、凹凸形状を有する基板に照射し、基板からの反射光および／または散乱光の受光強度を画像データとして取得して凹凸形状の高さの差異を検出する検出方法であって、レンズの焦点位置よりもレンズに近い位置に基板の光照射面を配置し、光照射面からの反射光および／または散乱光を検出光として受光し、受光した光の強度の変化に基いて基板の高さの差異を検出する。

Description

検出方法、マイクロアレイの解析方法および蛍光読取装置
　本発明は、マイクロアレイの表面における凹凸形状の高さの差異を検出する検出方法、マイクロアレイの解析方法および蛍光読取装置に関する。
　１９９０年以降、生物学、医学、薬学方面でマイクロアレイと呼ばれる技術の開発が進み利用されるようになってきた。マイクロアレイは、ガラスやプラスチックなどの基板上に、数十から数万のプローブを固定したものであって、蛍光分子などで標識されたサンプル（ターゲット）をこの基板にアプライし、プローブとサンプルとの結合反応を蛍光などで検出するためのものである。マイクロアレイは一度に網羅的な測定が可能であり、今後テーラーメード医療に必須のものになると期待されている。
　従来、ＤＮＡをプローブとして基板に固定したＤＮＡマイクロアレイ（以下、ＤＮＡチップ）や、タンパク質をプローブとして基板に固定したタンパク質マイクロアレイ、多数の微小標本をプローブとして基板に固定化した組織マイクロアレイ、多数の低分子化合物をプローブとして基板に固定化した化合物マイクロアレイなどが知られている。
　このうち、ＤＮＡチップは、最も実用化が進んでおり、疾患に関連する遺伝子の探索や、その遺伝子を用いて検査、診断を行おうとする研究が活発に行われており、一部は実用化されている。
　以下にマイクロアレイの一形態であるＤＮＡチップについて、詳細に説明する。
　ＤＮＡチップは、ガラスや樹脂等からなる基板の上にＤＮＡをグリッド状にスポット（固定化）したものである。ＤＮＡチップ上には、標識されるＤＮＡサンプルと特異的に反応可能なプローブとして、一本鎖のＤＮＡ（ＤＮＡプローブ）がスポットされている。なお、ＤＮＡプローブは、配列が既知のものが用いられる。一方、解析すべき未知配列のＤＮＡサンプル（一本鎖ＤＮＡ）には、光学的に検出可能な発光又は蛍光マークを付けておく。こうすると、解析すべき未知配列のＤＮＡサンプルをＤＮＡチップ上に流し込んだ場合、該ＤＮＡサンプルの配列がＤＮＡプローブの配列と相補的な関係にあれば、ＤＮＡプローブとＤＮＡサンプルとが結びついて二本鎖のＤＮＡになる。したがって、ＤＮＡプローブと結びつかなかったＤＮＡサンプルをすべて洗い流し、ＤＮＡチップ上に残存する判定したいＤＮＡサンプルを発光させ、この発光を読取り装置（スキャナー）により読みとると、二本鎖となったＤＮＡの状況を画像として観察することができる。すなわち、ＤＮＡチップ上で発光するマークの分布を解析することで、求める遺伝子の存在や、ある遺伝子が発現しているか否か、またはどの程度発現しているかを解析することができる。このように、ＤＮＡチップ上に既知の配列を有するＤＮＡプローブセットを構成し、それぞれ異なる配列のＤＮＡプローブをＤＮＡチップ上に搭載することで、遺伝子の変異や遺伝子の発現量などを検出することができる。
　以下、図１３に、ＤＮＡチップ解析の一連の処理工程の詳細を示す。
　図１３に示す前処理工程においては、検体から抽出したＤＮＡサンプル中に含まれる未知のＤＮＡを増幅し、これらのＤＮＡに蛍光マーク（例えば、Ｃｙ３，Ｃｙ５など）を付与する（ステップＳ２０１）。
　次にハイブリダイゼーション工程において、多種類のＤＮＡプローブが搭載されたＤＮＡチップの基板上に、蛍光マークを付与したＤＮＡサンプルを滴下する。ここで、ＤＮＡサンプルがスポットされたＤＮＡプローブと相補的な関係にあれば、結びついて二本鎖になる（ステップＳ２０２）。
　次に、洗浄工程において、所定の洗浄液により、ハイブリダイズされたＤＮＡチップを洗浄する（ステップＳ２０３）。これにより、グリッド状に配置されたＤＮＡプローブと結びつかなかったＤＮＡサンプルがすべて洗い流される。
　続いて、洗浄されたＤＮＡチップに対し、光を照射してスキャニングする（ステップＳ２０４）。スキャニング工程においては、蛍光マークを励起するのに適した波長のレーザー光をＤＮＡチップに照射し、各ＤＮＡプローブにそれぞれ結びついた（ハイブリダイズした）ＤＮＡサンプルからの蛍光を電気信号として取得する。これにより、スポットされた各ＤＮＡプローブ（遺伝子）と結合したＤＮＡサンプルに付与された蛍光マークの発光量が測定され、それに基づいて解析処理を行う蛍光画像データを得ることができる。
　解析工程においては、得られた蛍光画像データに対してテンプレートを利用して各スポットの蛍光強度を算出し、各種の解析を実行する（ステップＳ２０５）。
　ここで、図１４に、ＤＮＡチップ解析に用いられるＤＮＡチップ１００の一例を示す。図１４に示すＤＮＡチップ１００は、凹凸形状を有する矩形の板状をなす。ＤＮＡチップ１００は、板面が格子状に分割されてなる複数のブロック１０１を有する。このブロック１０１の上面には、略円柱状または円錘台状をなして設けられ、個々の遺伝子に対応するＤＮＡプローブを複数固定し、行方向および列方向に所定数、マトリクス状に配列された複数のスポット１０２が形成されている。また、複数のブロック１０１は、角柱状に切り欠かれてなる凹部１０３の底部に形成されている。なお、スポット１０２上に配置されるＤＮＡプローブは、既にその塩基配列が解読されている互いに異なる遺伝子にそれぞれ対応するものであり、ブロック１０１上におけるその配置位置は予め定められている。
　また、図１５に、ＤＮＡチップの蛍光画像データに対して適用されるテンプレートの一例を示す。図１５に示すように、テンプレートは、複数（例えば、図１５では３２個）のブロック（ブロック１０１に対応）に分割されており、各ブロック内においてはｍ行ｎ列（図１５では２２×２２）のマトリクス状に配置された検出エリア（ＤＮＡチップ１００の個々のスポット１０２に対応する）が設けられている。
　上記の解析工程においては、読みとったＤＮＡチップの蛍光画像データ中の個々のスポット１０２に、解析ツールが提供するテンプレートの検出エリアを当てはめ（アライメント）、当該検出エリアにおいて各スポット１０２の蛍光強度を算出する。このとき、正確な解析を実行するためには画像上の個々のスポット１０２に対してテンプレートの個々の検出エリアが正しく設定されるよう、アラインメント処理が正確に実行される必要がある。
　このアライメントの方法としては、ブロック単位でアライメントを行うパターンマッチング法や投影法などがある。そして、特許文献１が開示する技術のように、ポジティブコントロールと呼ばれる蛍光物質やどのような検体にでも含まれているハウスキーピング遺伝子をスポットしたチップを使用して、アライメントを正確に行なおうとする試みもなされている。
　さらには、特許文献２が開示する技術のように、基板からの反射光や散乱光で凹凸形状を画像化し、この画像からアライメントを行う方法も考案されている。
特開２００５－１７２８４０号公報 特開２００５－２４５３２号公報
　しかしながら、ブロック単位でアライメントを行う典型的なパターンマッチング法や投影法は、いずれも、ハイブリダイズしたサンプルＤＮＡの量が多く、各ブロック１０１において十分な強さの蛍光を発するスポット１０２が１／４から半数程度存在しないと、正しくアライメント出来ない。そのため、検体から抽出したサンプル中に含まれるＤＮＡ量が少ない場合、アライメントが正常に行えない場合がある。
　一方、蛍光物質をスポットして配置する方法では、十分な強さの蛍光を発するスポットが少なくてもアライメントが行えるという利点があるものの、スポット１０２上に配置可能なＤＮＡ数が減少し、チップ製造時におけるコストアップ等の問題がある。また、蛍光物質をスポットした場合、ハイブリダイゼーション中に、それが遊離し、ポジティブコントロールの周辺を汚染してしまい、データを得られないおそれもある。
　本発明は、上記に鑑みてなされたものであり、基板の高さの差異を正確に検出可能な画像を取得することが可能な検出方法、マイクロアレイの解析方法および蛍光読取装置を提供することを目的とする。
　上述した課題を解決し、目的を達成するために、本発明にかかる検出方法は、レンズによって集光されたレーザー光を、凹凸形状を有する基板に照射し、該基板からの反射光および／または散乱光の光強度を画像データとして取得して前記凹凸形状の高さの差異を検出する検出方法であって、前記レンズの焦点位置よりも前記レンズに近い位置に前記基板の光照射面を配置し、該光照射面からの反射光および／または散乱光を検出光として受光し、該受光した光の強度の変化に基いて前記基板の高さの差異を検出することを特徴とする。
　また、本発明にかかる検出方法は、上記の発明において、前記基板の光照射面を前記焦点位置に配置した場合に、該光照射面からの正反射光を前記検出光から分離する光学系を用いて前記基板の高さの検出を行なうことを特徴とする。
　また、本発明にかかる検出方法は、上記の発明において、前記レンズの焦点距離をｆ、前記基板を前記焦点位置から前記レンズに近づける距離をαとしたとき、α／ｆが所定の範囲内となるように設定されるαに応じた位置に前記基板の光照射面を配置することを特徴とする。
　また、本発明にかかるマイクロアレイの解析方法は、凹凸形状が形成され、各々蛍光標識されたサンプルと結合可能な複数のプローブが配置されたマイクロアレイに対し、対物レンズを介して前記蛍光標識の励起波長を含む光を照射し、かつ前記マイクロアレイからの光を受光して、該受光した光に基づく画像をもとに前記マイクロアレイの解析を行うマイクロアレイの解析方法であって、前記蛍光標識からの蛍光を検出して蛍光画像データを取得する蛍光画像データ取得ステップと、前記マイクロアレイの表面からの光を検出して、前記蛍光画像データのアライメントを行うアライメント用画像データを取得するアライメント用画像データ取得ステップと、前記アライメント用画像データの光強度の変化をもとに、前記凹凸形状の高さの差異を検出する検出ステップと、前記検出ステップによって検出された前記凹凸形状の高さの差異に基づいて前記蛍光画像データを補正する補正ステップと、前記補正ステップによって補正された前記蛍光画像データにおける各プローブの位置を決定する位置決定ステップと、を含み、前記アライメント用画像データ取得ステップは、前記マイクロアレイの表面を、前記対物レンズの焦点位置に対して該対物レンズに近い位置に配置した状態で、前記アライメント用画像データを取得することを特徴とする。
　また、本発明にかかるマイクロアレイの解析方法は、上記の発明において、前記検出ステップは、前記アライメント用画像データにおいて、前記光強度の変化に基づいて３つ以上の基準点を検出し、前記補正ステップは、検出した基準点を基に前記蛍光画像データの歪みを補正することを特徴とする。
　また、本発明にかかるマイクロアレイの解析方法は、上記の発明において、前記補正ステップは、前記基準点に基づく前記アライメント用画像データの傾斜角度θｘ，θｙを取得して、該傾斜角度θｘ，θｙおよび下記式（１），（２）をもとに、前記蛍光画像データの剪断変形歪みを補正することを特徴とする。
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　また、本発明にかかるマイクロアレイの解析方法は、上記の発明において、前記アライメント用画像データ取得ステップは、前記対物レンズの焦点距離をｆ、前記マイクロアレイを前記焦点位置から前記対物レンズに近づける距離をαとしたとき、α／ｆが所定の範囲内となるように設定されるαに応じた位置に前記マイクロアレイの表面を配置して前記アライメント用画像データを取得することを特徴とする。
　また、本発明にかかるマイクロアレイの解析方法は、上記の発明において、前記マイクロアレイは、ＤＮＡマイクロアレイであることを特徴とする。
　また、本発明にかかる蛍光読取装置は、凹凸形状が形成され、各々蛍光標識されたサンプルと結合可能な複数のプローブが配置された基板から、前記蛍光標識の蛍光を含む光を受光して、該受光した光に基づく画像データを取得する蛍光読取装置であって、少なくとも所定波長の励起光を含む照明光を出射する光源と、前記照明光を前記基板に照射するとともに、該照明光が照射された前記基板の表面からの光を受光する対物レンズと、前記対物レンズが受光した光を検出して、該検出した蛍光による蛍光画像データおよび前記基板からの光による基板画像データを取得する画像取得部と、画像取得部によって取得された前記基板画像データをもとに、前記凹凸形状の高さの差異を検出する検出部と、前記検出部によって検出された前記凹凸形状の高さの差異をもとに、前記蛍光画像データを補正する補正部と、前記基板を保持する保持手段と、前記保持手段を前記対物レンズの光軸に沿って移動させる駆動部と、を備え、前記駆動部は、前記画像取得部により前記基板画像データを取得する際、前記対物レンズの焦点位置に対して、前記対物レンズに近い位置に前記基板を配置するように前記保持手段を移動させることを特徴とする。
　また、本発明にかかる蛍光読取装置は、上記の発明において、前記駆動部は、前記対物レンズの焦点距離をｆ、前記マイクロアレイを前記焦点位置から前記対物レンズに近づける距離をαとしたとき、α／ｆが所定の範囲内となるように設定されるαに応じた位置に前記基板を配置するように前記保持手段を移動させることを特徴とする。
　本発明によれば、基板の高さの差異を正確に検出可能な画像を取得することで、ポジティブコントロールを配置していないＤＮＡチップの解析や、サンプルに含まれるＤＮＡ量が少ないチップの解析の場合にも、アライメント処理を適切に行うことができ、解析が可能となる。
図１は、本発明の実施の形態にかかるスキャナーの光学系の一例を示す模式図である。 図２は、本実施の形態にかかるスキャナーで読み取ったＤＮＡチップの画像の一例を模式的に示す図である。 図３は、本発明の実施の形態にかかるスキャナーの光学系の要部の構成を示す模式図である。 図４－１は、本発明の実施の形態にかかるスキャナーの光学系の要部の構成を示す模式図である。 図４－２は、本発明の実施の形態にかかるスキャナーの光学系の要部の構成を示す模式図である。 図５－１は、本発明の実施の形態にかかるスキャナーで読み取ったＤＮＡチップの画像を説明する図である。 図５－２は、本発明の実施の形態にかかるスキャナーで読み取ったＤＮＡチップの画像を説明する図である。 図５－３は、本発明の実施の形態にかかるスキャナーで読み取ったＤＮＡチップの画像を説明する図である。 図６は、本発明の実施の形態にかかる画像のアライメント処理を示すフローチャートである。 図７は、本発明の実施の形態にかかるスキャナーの光学系の要部の構成を示す模式図である。 図８は、本発明の実施の形態にかかるスキャナーで読み取ったＤＮＡチップの画像を示す模式図である。 図９－１は、本発明の実施の形態にかかるスキャナーで読み取ったＤＮＡチップの画像を説明する図である。 図９－２は、本発明の実施の形態にかかるスキャナーで読み取ったＤＮＡチップの画像を説明する図である。 図９－３は、本発明の実施の形態にかかるスキャナーで読み取ったＤＮＡチップの画像を説明する図である。 図１０は、本発明の実施の形態にかかるスキャナーの光学系の他の例を示す模式図である。 図１１－１Ａは、本発明の実施例にかかるＤＮＡチップの画像を示す図である。 図１１－１Ｂは、本発明の実施例にかかるＤＮＡチップにおける光強度変化のグラフである。 図１１－２Ａは、本発明の実施例にかかるＤＮＡチップの画像を示す図である。 図１１－２Ｂは、本発明の実施例にかかるＤＮＡチップにおける光強度変化のグラフである。 図１１－３Ａは、本発明の実施例にかかるＤＮＡチップの画像を示す図である。 図１１－３Ｂは、本発明の実施例にかかるＤＮＡチップにおける光強度変化のグラフである。 図１１－４Ａは、本発明の実施例にかかるＤＮＡチップの画像を示す図である。 図１１－４Ｂは、本発明の実施例にかかるＤＮＡチップにおける光強度変化のグラフである。 図１１－５Ａは、本発明の実施例にかかるＤＮＡチップの画像を示す図である。 図１１－５Ｂは、本発明の実施例にかかるＤＮＡチップにおける光強度変化のグラフである。 図１１－６Ａは、本発明の実施例にかかるＤＮＡチップの画像を示す図である。 図１１－６Ｂは、本発明の実施例にかかるＤＮＡチップにおける光強度変化のグラフである。 図１１－７Ａは、本発明の実施例にかかるＤＮＡチップの画像を示す図である。 図１１－７Ｂは、本発明の実施例にかかるＤＮＡチップにおける光強度変化のグラフである。 図１１－８Ａは、本発明の実施例にかかるＤＮＡチップの画像を示す図である。 図１１－８Ｂは、本発明の実施例にかかるＤＮＡチップにおける光強度変化のグラフである。 図１１－９Ａは、本発明の実施例にかかるＤＮＡチップの画像を示す図である。 図１１－９Ｂは、本発明の実施例にかかるＤＮＡチップにおける光強度変化のグラフである。 図１１－１０Ａは、本発明の実施例にかかるＤＮＡチップの画像を示す図である。 図１１－１０Ｂは、本発明の実施例にかかるＤＮＡチップにおける光強度変化のグラフである。 図１１－１１Ａは、本発明の実施例にかかるＤＮＡチップの画像を示す図である。 図１１－１１Ｂは、本発明の実施例にかかるＤＮＡチップにおける光強度変化のグラフである。 図１１－１２Ａは、本発明の実施例にかかるＤＮＡチップの画像を示す図である。 図１１－１２Ｂは、本発明の実施例にかかるＤＮＡチップにおける光強度変化のグラフである。 図１２－１は、本発明の実施例にかかるスライドガラスの画像を示す図である。 図１２－２は、図１２－１の画像における矢印Ｐ１３－Ｐ１３’間における光強度変化を示すグラフである。 図１２－３は、図１２－１の画像における矢印Ｐ１３－Ｐ１３’間におけるスライドガラス上の高さの差異を示すグラフである。 図１３は、従来のＤＮＡチップ解析の一連の処理工程の詳細を示すフローチャートである。 図１４は、従来のＤＮＡチップ解析に用いられるＤＮＡチップの一例を示す模式図である。 図１５は、従来のＤＮＡチップの蛍光画像データに対して適用されるテンプレートの一例を示す模式図である。
　以下、本発明を実施するための形態を詳細に説明する。なお、以下の実施の形態により本発明が限定されるものではない。また、以下の説明において参照する各図は、本発明の内容を理解でき得る程度に形状、大きさ、および位置関係を概略的に示してあるに過ぎない。従って、本発明は各図で例示された形状、大きさ、および位置関係のみに限定されるものではない。
　一般的にマイクロアレイの蛍光読取装置（スキャナー）は、励起波長の光ビームおよび／またはマイクロアレイを一次元的または二次元的に走査して、基板上の検体からの蛍光を検出し、そのデータを画像化し、その画像を元に、各プローブ（サンプルに標識された蛍光標識）からの蛍光量を求める。本発明で用いるスキャナーの好ましい光学系を図１に示す。図１は、本発明の実施の形態にかかるスキャナーの光学系の一例を示す模式図である。
　例えば図１に示すスキャナー１は、レーザー光源、対物光学系、光学フィルタ、蛍光画像データおよびアライメント用画像データ（基板画像データ）を取得する画像取得部等から構成され、スキャナー１は、上述したＤＮＡチップ１００（マイクロアレイ）を二方向に走査するための走査機構（図示しない、また本明細書ではＤＮＡチップ１００の主面において、基板の長手方向をｙ軸、それに直交する方向をｘ軸とする）と、ＤＮＡチップ１００を複数載置するオートローダー機構（図示しない）と、を有する。
　具体的に、スキャナー１は、それぞれ特定波長の励起光を少なくとも含む照明光を基板表面に出射するレーザー光源１１，１２と、該励起光を受光したプローブからの蛍光を平行光にする対物レンズ１３と、レーザー光源１１，１２および対物レンズ１３の間に設けられ、レーザー光源１１，１２からそれぞれ出射された照明光であって、光路Ｎ１上を進行する照明光を対物レンズ１３側に通過させる穴１４０が形成されるとともに、ＤＮＡチップ１００から発せられた光の少なくとも一部を光路Ｎ２側に折り曲げる穴あきミラー１４と、レーザー光源１１から発せられた励起光に応じた波長の光をカットしつつＤＮＡプローブとハイブリダイズしたサンプルからの蛍光に応じた波長の光のみを透過させる励起光カットフィルタ１５ａ、およびレーザー光源１２から発せられた励起光に応じた波長の光をカットしつつ、ＤＮＡプローブとハイブリダイズしたサンプルからの蛍光に応じた波長の光のみを透過させる励起光カットフィルタ１５ｂを有するカットフィルタ１５と、ＤＮＡプローブとハイブリダイズしたサンプルからの蛍光を結像する結像レンズ１６と、ＤＮＡプローブとハイブリダイズしたサンプルからの蛍光を受光することによって蛍光画像データを取得するとともに、基板表面からの反射光を受光し、その受光強度からＤＮＡチップ１００のブロック１０１表面の凹凸形状を検出可能なアライメント用画像データとして取得する画像取得部１７と、を備えている。なお、励起光カットフィルタ１５ａ，１５ｂ（カットフィルタ１５）は、穴あきミラー１４と画像取得部１７とを結ぶ光路Ｎ２に対して挿脱自在に設けられる。
　穴あきミラー１４は、励起光をＤＮＡチップ１００（対物レンズ１３）に入射させるための穴１４０が通常中央に設けられている。また、穴あきミラー１４の穴１４０は、図１に示すように、光読み取りの際に、ノイズとなる基板からの正反射光を画像取得部１７側に導かないように、蛍光または励起光の反射光（検出光）と、基板からの正反射光とを幾何学的に分離する機能を有する。
　なお、図１に示す態様においては、装置を小さくするために、レーザー光源１１，１２からの励起光をミラー１８，１９により屈折させてＤＮＡチップ１００に到達させる。
　また、走査機構の基準軸は、歪みの無い画像を得るために、直交していることが好ましい。走査機構としては、一般的に二軸共、スライダーを用いることが好ましい。
　さらに本実施の形態では、スキャナー１全体の制御を行う制御部２０と、ＤＮＡチップ１００を保持する保持部１０４（保持手段）を、ＤＮＡチップ１００（ブロック１０１）の主面が対物レンズ１３の光軸と平行な光路Ｎ１に沿うように移動させる制御を行う駆動部２１と、を備える。駆動部２０の制御によって、ＤＮＡチップ１００は、対物レンズ１３に対して近接または離間する。
　また、制御部２０は、ＤＮＡチップ１００の表面における凹凸形状の高さの差異（以下、高さの差異という）を検出する検出部２０ａと、検出部２０ａが検出した高さの差異をもとに、画像取得部１７が取得した画像を補正する補正部２０ｂと、補正部２０ｂが補正した画像に基づき、予め記録されている解析定義ファイルを参照して、ＤＮＡチップ１００のスポット１０２の位置を決定する決定部２０ｃと、を有する。
　本実施の形態では、サンプルに２種の蛍光マークを付け、それらの読み取りを行う装置としたため、当該２種の蛍光マークに対応した波長の光を出射するレーザー光源１１，１２と、出射される励起光の波長にそれぞれ対応した励起光カットフィルタ１５ａ，１５ｂとを備えている。しかしながら、サンプルに一種のみの蛍光マークをつけ、その読みとりを行う装置としてもよいし、３種以上の蛍光マークを付け、それらの読み取りを行う装置としてもよい。いずれの場合も、用いる蛍光マーク（蛍光色素）に対応したレーザー光源と励起光カットフィルタを設ければよい。
　次にスキャナー１での蛍光画像データの取得方法について述べる。まず、図１を用いて蛍光画像データの取得方法について説明する。なお、以下では蛍光色素としてＣｙ５、Ｃｙ３を用いた態様を説明するが、サンプルを標識するための蛍光色素はいずれか一方でもよいし、またこれらに限定されるものではない。蛍光色素としては例えば、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ、ＦＩＴＣ、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　５５５、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ、Ｃｙ３．５、Ｔｅｘａｓ　Ｒｅｄ、ＴＡＭＲＡ、Ｏｙｓｔｅｒ　６５０、Ｃｙ５．５などを用いることができる。
　例えば、最初に蛍光色素Ｃｙ５を読み取るために、Ｃｙ５用のレーザー光源１１（例えば波長６３５ｎｍの光を発するレーザー光源）からレーザー光（すなわち蛍光色素Ｃｙ５の励起光）を照射する。レーザー光は、穴あきミラー１４および対物レンズ１３を介してＤＮＡチップ１００に照射される。照射されたレーザー光により励起発光した蛍光分子からの蛍光ならびにチップ表面で反射および／または散乱したレーザー光は、対物レンズ１３で互いに略平行光にされ、光路Ｎ１において図中矢印方向に進行する。
　その後、蛍光ならびにレーザー光は、穴あきミラー１４で反射されて光路Ｎ２上を進行し、光路Ｎ２上に配置されたＣｙ５用の励起光カットフィルタ１５ａに入射する。なお、ＤＮＡチップ１００の表面で正反射したレーザー光は、穴あきミラー１４の穴１４０を通過する。励起発光した蛍光分子からの蛍光は、この励起光カットフィルタ１５ａを透過し、結像レンズ１６で集光される。
　一方、励起光カットフィルタ１５ａに到達した励起光（チップ表面で反射および／または散乱した光）はカットされる。結像レンズ１６で集光された蛍光は、画像取得部１７に入射する。画像取得部１７は、受光した光データに対して光電変換処理を施して、光の強弱に応じた電気信号（アナログ信号）を出力する。このような工程を、ＤＮＡチップ１００を二方向に走査させて繰り返しつつ、画像取得部１７から出力された電気信号をＡ／Ｄ変換して蛍光画像データを作成する。
　続いて、蛍光色素Ｃｙ３の読み込みを行う。蛍光色素Ｃｙ３の読み込みは、Ｃｙ５用のレーザー光源１１をＣｙ３用のレーザー光源１２（例えばレーザー波長５３２ｎｍの光を発するレーザー光源）に置き換えるとともに、Ｃｙ５用の励起光カットフィルタ１５ａをＣｙ３用の励起光カットフィルタ１５ｂに置き換える以外は、蛍光色素Ｃｙ５の読み込みと同様に行えばよい。すなわち、Ｃｙ３用のレーザー光源１２からレーザー光（すなわち蛍光色素Ｃｙ３の励起光）を照射するとともに、Ｃｙ３用の励起光カットフィルタ１５ｂにて該励起光カットフィルタ１５ｂに到達した励起光（すなわちチップ表面で反射および／または散乱した光）を除去することで、蛍光色素Ｃｙ５と同様に蛍光画像データを作成する。
　図２は、本実施の形態にかかるスキャナー１で読み取ったＤＮＡチップ１００の画像の一例を模式的に示す図である。ここで、スキャナーの走査機構が２つのスライダーを備えたものである場合、これらスライダーが必ずしも直交しているとは限らない。装置組み立て時、もしくは時間の経過等に伴って、ずれてしまう場合がある。そのため、スキャナー１で読み取ったＤＮＡチップ１００の画像も、例えば図２（ａ）に示すようにｘ軸に対して傾いている可能性がある。このように、取得した画像における走査機構の走査方向がｘ軸および／またはｙ軸と一致しない場合は得られた蛍光画像データが歪んでしまい、テンプレートの検出エリアを得られた画像に正しく位置合わせすることが出来ない。また、スライダーのｘ軸、ｙ軸が機械的に直交していた場合でも、蛍光画像のｘ軸、ｙ軸と、スライダーの軸とが直交していないため、ＤＮＡチップ１００をセットした際に回転してしまい、結果的に蛍光画像が回転している場合もある。これらの場合も、テンプレートの検出エリアを得られた画像に正しく位置合わせすることができない。
　このため、画像から直交度のズレを検出して、スライダーが直交する走査機構で得られる画像と同等になるように補正することが好ましい。より具体的には、蛍光画像データをｘ軸に対してｙ軸方向に投影し、座標Ｘ毎の積算強度（各画素値の積算値）を算出する。この処理を、座標原点周りに蛍光画像データを予め設定した角度ずつ回転させて繰り返す。例えば、投影方向とスポットのｙ軸方向の配列方向がずれている場合の積算強度グラフは、図２（ｂ）に示すように振幅の小さいグラフになる。
　一方、投影方向とスポットのｙ軸方向の配列方向が一致した場合の積算強度グラフは、図２（ｃ）に示すように、一定の間隔で振幅に変化が生じ、信号の振幅が最大となる。投影データのこのような特徴を利用し、積算強度の標準偏差が最大値をとる角度を求めることで、スポット１０２のｙ軸に対する配列の角度を検出することができる。同様にｘ軸に対する配列の角度を求め、せん断変形等の画像処理を施すことでスポットの配列方向を直交させることが可能である。
　以上のようにして蛍光画像データを取得する場合、検体が非常に少ないと、蛍光色素Ｃｙ５、Ｃｙ３ともに、蛍光を発するＤＮＡプローブ（ＤＮＡサンプルとハイブリダイズしたＤＮＡプローブ）数が少なくなるためブロックの境界がわからず、また画像の直交度補正も出来ないため、アライメント処理が不可能となる。
　そこで、本発明においては、上記のような蛍光画像データのほかにＤＮＡチップ１００を再セットすることなく、アライメント用画像データも取得する。アライメント用画像データの取得の際には、対物レンズ１３でレーザー光が集光された焦点位置よりも、ＤＮＡチップ１００を対物レンズ１３側に近づけて設置し、アライメント用画像データを取得することが好ましい。図３は、本実施の形態にかかるスキャナー１の光学系の要部の構成を示す模式図である。図４－１，４－２は、本実施の形態にかかるスキャナー１の光学系の要部の構成を示す模式図であって、図４－１はＤＮＡチップ１００の凹部１０３において、傾斜を有する場合を示す図であり、図４－２はＤＮＡチップ１００の凹部１０３において、傾斜を有しない場合を示す図である。
　図３は、入射光が穴あきミラー１４を通してＤＮＡチップ１００のブロック１０１の表面（光照射面）に入射される様子を示している。入射光はレーザー光に代表される平行光である。入射光が対物レンズ１３で集光された焦点位置（ジャストフォーカス位置、表面位置Ｐ０）にブロック１０１の表面があると仮定した場合、その正反射光は、対物レンズ１３で集光され、理想的には入射光と同じ径となり、大部分の正反射光は、穴あきミラー１４の穴１４０を通過し、画像取得部１７側にはほとんど導かれない（図３中実線矢印Ｙ１）。但し、対物レンズ１３の収差（球面収差、コマ収差、非点収差など）により、一部の反射光が穴あきミラー１４で反射し、画像取得部１７に導かれるが、その強度は小さい。
　一方、焦点位置よりも遠い位置（表面位置Ｐ１）にＤＮＡチップ１００のブロック１０１の表面がある場合、その表面からの正反射光は、対物レンズ１３から見ると、焦点位置（表面位置Ｐ０）よりも遠い部分から発せられた点光源とみなされる。そのため、その反射光は対物レンズの入射光側で焦点を結ぶ（図３中一点鎖線矢印Ｙ２）。よって、穴あきミラー１４の位置で、光の径が表面位置Ｐ０における表面からの光の径と比較して小さくなる。よって、大部分の正反射光は、穴あきミラー１４の穴１４０を通過するため、画像取得部１７側に導かれずさらに暗くなる。
　このような理由により、ＤＮＡチップ１００の反射光を画像化すると、例えば、ブロック１０１の上面（対物レンズに近い部分）が明るく、凹部１０３の底部（対物レンズから遠い部分）が暗い画像を得ることができる。
　しかしながら、ＤＮＡチップ１００の表面に微細な傷や付着物があった場合、そこで乱反射が生じる。その乱反射の光路を図３の破線矢印Ｙ３で示す。この乱反射した光は、穴あきミラー１４で反射し、画像取得部１７側に入る。このため、ＤＮＡチップ１００の表面に微細な傷や付着物がある場合、乱反射による画像乱れが生じ、基板の凹凸を画像化出来ない場合が生じる。特に基板が樹脂製の場合、金型による成型で作製する場合が多いが、加工工具による金型の切削跡がそのまま基板に転写され、乱反射による画像乱れが生じる場合が多い。
　以上の不具合を解消するために、ＤＮＡチップ１００の撮像対象表面を焦点位置（表面位置Ｐ０）よりも対物レンズ１３に近づけた位置（表面位置Ｐ２）でアライメント用画像データを取得する。そうすると、図３の点線矢印Ｙ４で示すように、正反射光は、対物レンズ１３から見て焦点距離よりも近い部分から発する点光源とみなされるので、対物レンズ１３を通過しても発散し、穴あきミラー１４で、画像取得部１７側に反射する。このために、乱反射光（例えば、破線矢印Ｙ３）の影響が少なくなり、基板の段差（エッジ）部分のみが暗くなる。
　撮像対象表面の表面位置Ｐ２は、対物レンズ１３の焦点距離ｆと、ＤＮＡチップ１００を焦点位置（表面Ｐ０）から対物レンズ１３に近づける距離αとの関係α／ｆを用いて設定されることが好ましい。このα／ｆの好ましい範囲は、０．０１７～０．１７であり、更に好ましくは、０．０３３～０．１７である。駆動部２１は、制御部２０の制御のもと、設定されたαの位置にＤＮＡチップ１００の撮像対象面が配置されるように、保持部１０４を移動する制御を行う。
　ここで、図４－１に示すように、ＤＮＡチップ１００の凹部１０３の側面が角度θで傾斜している場合、その反射光は別の方向にけられる。また、凹部１０３の側面が垂直（角度θ＝９０度）に切り立っている場合（図４－２）、レンズに戻る反射光は、２回反射となる。２回反射であると非常に光が弱くなる（通常、透明体の反射率は４％程度なので、２回反射の光量は、１回反射に対して１／２５の強度となる）。そのため基板の段差部分が暗くなる。
　凹部１０３の角度θの好ましい範囲は、２０度から９０度である。９０度より大きいと基板の作成が困難であり、２０度未満であると、段差部分が画像データで認識できないことがある。図１４のようなＤＮＡチップ１００は、生産性の観点から樹脂を射出成形することで作製することが好ましい。その場合、成型の容易さ（金型からの抜きやすさ）という点から、角度θは、２０度から８０度であることが更に好ましい。
　このようにして得られたアライメント用画像の例を図５－１～５－３に示す。図５－１～５－３は、本実施の形態にかかるスキャナーで読み取ったマイクロアレイの画像を説明する図である。図５－１は、アライメント用画像を示す図である。図５－２は、図５－１のアライメント用画像における矢印Ｐ－Ｐ’間における光強度変化を示すグラフである。図５－３は、図５－１のアライメント用画像における矢印Ｐ－Ｐ’間におけるＤＮＡチップ１００の高さの差異を示すグラフである。図５－２より、ＤＮＡチップ１００の凹部１０３の側面に対応する位置において反射光量が減っており、基板上の凹凸形状を画像化できていることが確認できる。これを元にアライメント用画像中のＤＮＡチップ１００の凹部１０３の位置を判断し、蛍光画像をアライメントすることが可能となる。
　アライメント用画像データ取得用の光源については、好ましくはレーザー光源（例えば波長４０５ｎｍ、５３２ｎｍ、６３５ｎｍ）を用いることが出来る。レーザー光源の場合は、平行光であるために、図３で説明した現象により、アライメント用画像データにおいてエッジ（光強度差）を明確に検出可能である。
　ここで、具体的に上記の装置構成においてアライメント用画像データを取得するには、Ｃｙ５用のレーザー光源１１からレーザー光を照射するとともに、Ｃｙ３用の励起光カットフィルタ１５ｂを使用することが好ましい。Ｃｙ３用の励起光カットフィルタ１５ｂには一般的に５５０～６００ｎｍを透過するバンドパスフィルタを用いることが多いが、該励起光カットフィルタ１５ｂは、一般的に、Ｃｙ５の励起光の波長の光（６３５ｎｍ）をわずかに透過するので（例えば、６３５ｎｍの光のＯＤ値が約５）、図５－１に示すように、ＤＮＡチップ１００の凹凸形状を画像化することが可能である。すなわち、特定波長の光によって励起発光した蛍光分子からの蛍光ではなく、基板表面からの反射光や散乱光を受光して、該基板そのものの凹凸形状を画像化することができる。
　アライメント用画像データを取得する際には、焦点位置よりもＤＮＡチップ１００を対物レンズ１３に近い場所に配置することが好ましい。焦点位置は、対物レンズ１３の高さを固定しＤＮＡチップ１００を高さ方向（対物レンズ１３の光軸方向）に変化させて各ＤＮＡプローブからの蛍光量を測定し、その値が最も大きくなる高さを実測することにより求めることが出来る。逆にＤＮＡチップ１００の高さを固定し、対物レンズ１３の高さを上下することも可能である。ＤＮＡチップ１００の表面の反射光や散乱光を受光する際、上述したα／ｆの関係に基づき、ＤＮＡチップ１００の表面（撮像対象面）の位置を焦点位置から１００μｍ以上レンズ側に近づけることが好ましい。より好ましくは２００μｍ以上である。近づける距離の上限については、ＤＮＡチップ１００と対物レンズ１３とが衝突しない程度であれば、特段の制限は無いが、スキャナー１のような装置においては通常３０００μｍ以下である。アライメント用画像データ取得用の光源については、スキャナーの部品点数を少なくできることから、蛍光分子を励起するための励起光を出射する光源を用いることが好ましいが、別途、アライメント用画像データ取得用光源を設けてもかまわない。
　また、アライメント用画像データの取得時にフィルタを使わない方法も採用しうる。しかしながら、フィルタを用いない場合は、画像取得部に入る光量が大きくなりすぎるために画像取得部の光検出機構を損傷する可能性がある。よって、上記したように、Ｃｙ５用のレーザー光源１１からレーザー光を照射する場合には励起光カットフィルタ１５ｂを使用するなど、照射する光源の波長をわずかに透過するフィルタを用いることが好ましい。反対に、Ｃｙ３用のレーザー光源１２からレーザー光を照射して励起光カットフィルタ１５ａを用いてもよい。また、励起光カットフィルタ１５ａ，１５ｂの代わりにＮＤフィルタを用いたり、励起光カットフィルタ１５ａ，１５ｂやＮＤフィルタを使用せずにレーザー光の出力自体を弱くしてアライメント用画像データを得たりしても構わない。もちろん、これらの組み合わせも適用できる。
　なお、図５－１～５－３では、焦点位置から基板（ＤＮＡチップ１００）を２５０μｍレンズ側に近づけて取得した。このように、積極的に焦点位置から基板をレンズ側に近づけ、レーザー光の反射光を積極的に受光することで、図５－１のような、基板表面のエッジ形状が表れたアライメント用画像データが得られる。
　このようにして取得したアライメント用画像データを用いると、基板のエッジ（凹部１０３の外縁）を正確に検出することが可能である。以下、ＤＮＡチップ１００を用いた場合の、上記の方法を含んだアライメントの具体的な手順例を記す。図６は、本実施の形態にかかる画像のアライメント処理を示すフローチャートである。
　まず、スキャナー１にＤＮＡチップ１００をセットし、前述のとおり、画像取得部１７によって蛍光色素Ｃｙ５およびＣｙ３の蛍光画像データを読み込む（ステップＳ１０１）。続いて、ＤＮＡチップ１００をセットしたまま、Ｃｙ５用のレーザー光源１１からレーザー光を照射するとともに、Ｃｙ３用の励起光カットフィルタ１５ｂを使用し、画像取得部１７によってアライメント用画像データを読み込む（ステップＳ１０２）。この際、ＤＮＡチップ１００は、上述したように、焦点位置よりも対物レンズ１３に近い位置に配置される。なお、ステップＳ１０２においては、Ｃｙ３用のレーザー光源１２からレーザー光を照射するとともにＣｙ５用の励起光カットフィルタ１５ａを使用してもよい。
　そして、ステップＳ１０３以降で、アライメント用画像データを使用して蛍光画像データにおける各ＤＮＡプローブの位置を決定し、解析する。
　具体的には、まず、アライメント用画像データにおける少なくとも３つの基準点を検出する（ステップＳ１０３）。ここで、少なくとも３つの基準点としては、例えば図７に示すとおり、アライメント用画像での四隅の座標を挙げることができる。かかる四隅の座標の検出方法は、検出部２０ａによって行なわれ、明暗情報を用いたエッジ検出による上述した凹部１０３の位置判断が挙げられる。
　図７に示すように、ＤＮＡチップ１００において、検出部２０ａによって凹部１０３の外縁が検出され得る領域Ｅａ１～Ｅａ４，Ｅｂ１～Ｅｂ４を予め設定し、それぞれの領域において、図５－１に示すような矢印Ｐ－Ｐ’間における光強度の変化を測定し、ＤＮＡチップ１００の高さの差異を検出する。その後、検出部２０ａは、各領域Ｅａ１～Ｅａ４，Ｅｂ１～Ｅｂ４で検出された高さの差異の中心位置を用いて、領域Ｅａ１の中心位置と領域Ｅａ２の中心位置とを直線的に結んで凹部１０３の外縁の一辺とする。凹部１０３の外縁のその他の三辺についても、領域Ｅａ３の中心位置および領域Ｅａ４の中心位置、領域Ｅｂ１の中心位置および領域Ｅｂ２の中心位置、領域Ｅｂ３の中心位置および領域Ｅｂ４の中心位置をそれぞれ直線的に結ぶ。これにより、画像取得部１７によって得られたアライメント画像における凹部１０３の外縁を形成する。また、それぞれ結ばれて形成された直線同士の交点（座標）を求めることにより、凹部１０３の４隅を基準点１１０ａ～１１０ｄとして得ることができる。
　続いて、ステップＳ１０４，Ｓ１０５において、基準点に基づいて蛍光画像データの歪みを補正する。
　具体的には、補正部２０ｂは、例えば前述の基準点１１０ａ～１１０ｄの座標から、凹部１０３の外縁における各辺のｘ軸に対する傾斜角度θｘ、およびｙ軸に対する傾斜角度θｙを検出する（ステップＳ１０４）。傾斜角度θｘ，θｙは、四隅の座標を結んだ４本の線分について、該当方向の（対向する）２本の線分の角度の平均値を取ることが望ましい。なお、基準点が３点であっても、傾斜角度θｘ，θｙを算出可能である。そして、補正部２０ｂは、図８（ａ），（ｂ）に示すように、ｙ軸に応じた辺（凹部１０３の外縁の辺）のｙ軸に対する配列角度θｙを補正角度として用い、蛍光画像データを回転させて、凹部１０３のｙ軸に応じた辺をｙ軸に対して平行にする。また、補正部２０ｂは、図８（ｂ），（ｃ）に示すように、ｘ軸に応じた辺（凹部１０３の外縁の辺）のｘ軸に対する配列角度θｘを補正角度として用い、蛍光画像データを回転させて、凹部１０３のｘ軸に応じた辺をｘ軸に対して平行にする。変換後は、図８（ｃ）に示すように、ｘ軸、ｙ軸に対して外縁がそれぞれ平行な画像を得ることができる。
　さらに、補正部２０ｂは、回転後の画像に対して、上述のように検出した二方向に規則的に配列されているスポット１０２について、上述した傾斜角度θｘ，θｙおよび下記式（１），（２）に基づいて、変換（せん断変形）を実施する（ステップＳ１０５）。これにより、画像のせん断変形歪みを補正する。ここで、下記式（１）の（ｘ，ｙ）は変換前の座標、（Ｘ，Ｙ）は変換後の座標である。また、スキャナーの走査機構のずれ（走査機構の基準軸の直交度）に相当するθｘｙは、下記式（１），（２）に示すように、傾斜角度θｘから傾斜角度θｙを減じて求める。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000003
　さらに、ＤＮＡチップ１００が樹脂成型品である場合、ハイブリダイゼーション工程や洗浄工程での吸湿や温度変化により樹脂が膨張する場合がある。各工程での処理時間にもよるが、数十μｍ膨張する場合があり、アライメントの精度に影響を与える。
　このため、補正部２０ｂは、例えば上述した四隅の座標からｘ軸方向およびｙ軸方向のチップ長さを算出するとともに、設計値と一致するように、蛍光画像データに対して収縮膨張補正を行う（ステップＳ１０６，Ｓ１０７）。
　続いて、上記のようにして、補正部２０ｂによって角度補正、せん断変形補正、収縮膨張補正が施された蛍光画像データに対して、決定部２０ｃが、解析定義ファイルを参照して蛍光画像のアライメントを行なう。予め解析定義ファイルに保存しているテンプレートにおける各スポットの位置情報は、例えばチップ左上の隅（基準点１１０ａ）を原点とした、各スポットの中心座標となっている。このため、決定部２０ｃは、ステップＳ１０７で収縮補正した後の画像について、例えば左上隅の座標を原点として、各スポット枠を計算することで各スポット（プローブ）の位置を決定し、図９－１～９－３に示すようなアライメントを行う（ステップＳ１０８）。なお、図９－１がＣｙ３の蛍光画像データに対してアライメントを行った結果を示す画像、図９－２がＣｙ５の蛍光画像データに対してアライメントを行った結果を示す画像である。これにより、各スポット１０２に対して、各スポット１０２に応じたテンプレート（図１５参照）を当てはめて、検出エリアと対応付けることができる。また、一例として、確認のためにアライメント用画像データに対してアライメントを行った結果を図９－３に示す。図９－３に示すように、アライメント処理によって、ＤＮＡチップ１００の凹部１０３の外縁の一角における直線部分が、基準点１１０１において直交していることが分かる。
　その後、ステップＳ１０８で求めた各スポットの中心座標から、スポット半径内の画素の信号強度について、平均値、メディアン値、標準偏差等の統計量を算出し、スポットの属するブロック番号、スポットの行列番号、配置されているＤＮＡプローブ名と合わせて、各種数値データをファイルとして出力する（ステップＳ１０９）。上述した処理によって、得られた蛍光画像データに対して歪み等の修正を行い、平均値、メディアン値、標準偏差等の正確な統計量を算出する。
　なお、上記ステップＳ１０１，Ｓ１０２の順序、およびステップＳ１０６，Ｓ１０７の順序は入れ替わってもよい。
　本発明においては、このようにしてＤＮＡサンプルのＤＮＡプローブへのハイブリダイズに基づいて得られた蛍光画像データを処理して所望の数値データを取得するが、得られる各種の数値データは、検体内で、求める遺伝子の存在や、ある遺伝子が発現しているか否か、またはどの程度発現しているかを解析するため等に用いられる。
　また、以上のようなＤＮＡチップ１００の解析においては、ＤＮＡチップ１００に形成された凹凸を利用して画像の補正、アライメントを行う。そのため、検体から抽出したサンプル中に含まれるＤＮＡ量が少なく発光するＤＮＡプローブが少ない画像、さらに、走査機構の精度が悪い読取り装置によって得られた画像に対しても、ＤＮＡチップ１００上に配置された検出エリアの位置決め処理を高精度に実行可能となる。
　上述した実施の形態によれば、ＤＮＡチップ１００の撮像対象表面を焦点位置（表面位置Ｐ０）よりも対物レンズ１３に近づけた位置（表面位置Ｐ２）でアライメント用画像データを取得するようにしたので、基板の高さの差異を正確に検出可能な画像を取得することができる。これにより、ポジティブコントロールを配置していないＤＮＡチップの解析や、サンプルに含まれるＤＮＡ量が少ないチップの解析の場合にも、アライメント処理を適切に行うことができ、解析が可能となる。
　ここで、図１０に本発明で使用するスキャナーに好適な光学系の他の態様を示す。なお、図１０において、図１に示すスキャナー１の構成要素と同一のものには同一の符号が付してある。図１０に示すスキャナー２は、スキャナー１の穴あきミラー１４に代えて微小ミラー１４ａを用いることにより、微小ミラー１４ａにて励起光を反射させてＤＮＡチップ１００に入射させるとともに、光読み取りの際、ノイズとなるＤＮＡチップ１００からの正反射光を画像取得部１７側に導かないように、蛍光または励起光の反射光（検出光）と正反射光とを幾何学的に分離する機能を有する。これにより、正反射光を光路Ｎ３から分離することができる。この構成においても、上述したスキャナー１と同様の効果を得ることができる。
　上記実施形態においては、基板にＤＮＡプローブがスポットされたＤＮＡチップの実施形態を説明したが、本発明は、ＲＮＡ、タンパク質、微小標本、低分子化合物、細胞等をスポットしたチップに対しても適用可能である。
　例えば、上記で説明した凹凸形状を有するＤＮＡチップ１００において、ＤＮＡプローブの代わりにタンパク質（抗体）を固定化し、検体との反応の有無や定量化を蛍光にて検出する場合でも、同様な方法を用いることができる。試料細胞の溶解液に存在するタンパク質をＣｙ５、コントロール細胞溶解液に存在するタンパク質をＣｙ３で標識して、両者を混合して抗体アレイと反応する場合や、タンパク質を蛍光標識する代わりにビオチン標識し、抗体アレイに結合後、酵素標識アビジンを用いてシグナルを増感する手法などがある。このような場合でも、本発明により、精度よくアライメントが可能となり、蛍光強度の各種数値データをファイルとして出力可能である。ＲＮＡアレイの場合でも、凹凸形状を有する基板（スポット１０２）上に固定化されたＲＮＡと、蛍光標識したＤＮＡやＲＮＡとのハイブリダイゼーションを蛍光で検出する場合に本手法を用いることができる。微小標本・細胞アレイにおいても、凹凸形状を有する基板上に固定化された微小標本や細胞と蛍光標識検体（例えば抗体）との結合反応を蛍光により検出する際に、本発明を適応することが可能である。
　以下実施例等をあげて本発明を説明するが、本発明はこれらの例によって限定されるものではない。
　超精密機械加工により、図１４に示すＤＮＡチップ１００のような形状の基板に対応する金型を作製し、この金型を用いて射出成型により、ＰＭＭＡ（ポリメチルメタクリレート）からなる基板をＤＮＡチップ１００として製作した。金型には、工具による切削跡があり、そのため、基板にも工具切削跡が転写されている状態であった。切削跡による基板高さの乱れは、実測したところ１μｍ以下であった。
　製作したＤＮＡチップ１００の凸部（スポット１０２）上面にＤＮＡプローブを固定し、ハイブリダイゼーションまで行い、ＤＮＡチップスキャナー（３Ｄ－Ｇｅｎｅ　Ｓｃａｎｎｅｒ（３Ｄ－Ｇｅｎｅ（登録商標）））で蛍光画像およびアライメント用画像の取得を行った。蛍光画像とアライメント用画像の取得にかかる装置構成および条件は以下（１）～（４）の通りである。
（１）スキャナーの光学系は、図１に示すスキャナー１の光学系を用いた。すなわち、ＤＮＡチップ１００へレーザー光を入射し、かつ、基板からの正反射光を通過するための穴あきミラー１４を有しているものである。
（２）スポット１０２からの蛍光取得時に、ＤＮＡチップ１００の高さ（対物レンズ１３とＤＮＡチップ１００との距離）を変化させ、蛍光強度が最も強くなる高さ位置を０とした。この位置が、レーザー光の焦点位置（表面位置Ｐ０）である。本実施例では、Ｃｙ５で標識化したＤＮＡサンプルを用いたので、波長６３５ｎｍのレーザーとＣｙ５用のバンドパスフィルタを用いた。なお、本スキャナーには、基板とレンズとの距離を調整できる機能がついている。
（３）Ｃｙ５の蛍光を測定するレーザー（波長６３５ｎｍ）を使用し、フィルタとしてはＣｙ３を測定する際に使用するバンドパスフィルタと同じものを用いた。本実施例で使用したＣｙ３用のフィルタは、６３５ｎｍでＯＤ値が約５であり、わずかに６３５ｎｍの波長を透過する。レーザー光とフィルタの組合せを上述した組合せとすることにより、基板表面からの反射・散乱光を取得し画像データ化が可能である。
（４）オフセット位置（焦点位置から基板表面までの距離）は、－５００μｍから＋１５００μｍまで変化させ、反射・散乱光の画像の比較を行った（図３）。なお、オフセット位置が０との表現は、基板が対物レンズで絞られたレーザー光の焦点位置（表面位置Ｐ０）にあることを示す。また、オフセット位置の符号がマイナスの場合は、焦点位置を基準として基板が対物レンズから遠い位置（表面位置Ｐ１）にあり、符号がプラスの場合は、基板が焦点位置を基準として対物レンズに近い位置（表面位置Ｐ２）にあることを示す。
　図１１（図１１－１～図１１－１２）は、本発明の実施例にかかるスキャナー１で読み取ったＤＮＡチップ１００（基板）の画像（Ａ）および光強度変化のグラフ（Ｂ）である。ここで、図１１－１は、オフセット位置が０の場合の画像、および画像中の矢印Ｐ１－Ｐ１’間における光強度変化を示すグラフである。図１１－２～図１１－９は、オフセット位置が＋１００、＋２００、＋３００、＋４００、＋５００、＋７５０、＋１０００、＋１５００の場合の画像、および画像中の矢印Ｐ２－Ｐ２’間、矢印Ｐ３－Ｐ３’間、矢印Ｐ４－Ｐ４’間、矢印Ｐ５－Ｐ５’間、矢印Ｐ６－Ｐ６’間、矢印Ｐ７－Ｐ７’間、矢印Ｐ８－Ｐ８’間、矢印Ｐ９－Ｐ９’間における光強度変化を示すグラフである。図１１－１０～図１１－１２は、オフセット位置が－１００、－２００、－５００の場合の画像、および画像中の矢印Ｐ１０－Ｐ１０’間、矢印Ｐ１１－Ｐ１１’間、矢印Ｐ１２－Ｐ１２’間における光強度変化を示すグラフである。なお、図１１に示す画像は、上述した補正部２０ｂによって補正されたアライメント用画像データに応じた画像である。
　図１１に示すように、オフセット位置が＋２００μｍ以上の場合は、基板のエッジ部分（実際の高さの差９０μｍ、図４－１で示す傾斜角度θは７０度）に対応した明確なコントラストのついた画像および光強度変化のグラフが得られた（図１１－３Ａ，１１－３Ｂ～図１１－９Ａ，１１－９Ｂ）。一方、オフセット位置が０μｍでは、切削痕による、基板表面のあれ（高さ１μｍ以下）が原因で、乱反射が生じ、９０μｍの凹凸形状とは一致しないが、切削痕と一致する反射強度の乱れを生じていた（図１１－１Ｂ）。オフセット位置が＋１００μｍの場合は、０μｍと比較し、切削痕の影響は小さくなるものの、その影響は残っていた（図１１－２Ｂ）。また、オフセット位置が－１００μｍ、－２００μｍでは、切削痕による、基板表面のあれ（高さ１μｍ以下）が原因で、乱反射が生じ、反射強度の乱れが生じていた（図１１－１０Ｂ、図１１－１１Ｂ）。オフセット位置が－５００μｍでは、基板表面の画像が取得できなかった（図１１－１２Ａ）。
　以上の結果により、オフセット位置が＋２００μｍ以上、＋１０００μｍ以下の間で、基板のエッジ部分が暗い特に好ましい画像が得られた。なお、オフセット位置が＋１５００μｍでは、エッジ部分が認識できるものの全体的に暗くなる傾向が見られた。オフセット位置がマイナスの場合はエッジが全く認識できない画像しか得られなかった。
　また、これらの結果に基づき、アライメント用画像を取得する際のオフセット位置を－５００μｍ、０μｍ、＋１００μｍ、＋２００μｍ、＋５００ｕｍ、＋１０００μｍ、＋１２５０μｍ、＋１５００μｍと変化させ、画像のアライメント処理が適切に行えるかどうかの評価を次の手順（１）’～（５）’で行った。
（１）’ハイブリダイゼーション処理済みのＤＮＡチップを合計２０枚用意した。なお、ＤＮＡチップの基板の形状は図１４に示すとおりである。エッジ部分の高さの差は９０μｍであり、図４－１で示す角度θは７０度である。
（２）’それぞれのＤＮＡチップについて、オフセット位置が０μｍ（焦点位置）でＣｙ５の蛍光画像を取得した。
（３）’オフセット位置を－１００μｍ、０μm、＋１００μｍ、＋２００μｍ、＋５００μｍ、＋７５０μｍ、＋１０００μｍ、＋１２５０μｍ、＋１５００μｍとし、各位置においてアライメント用画像をそれぞれ取得した。このとき、Ｃｙ５の蛍光を測定するレーザー（波長６３５ｎｍ）を使用し、フィルタとしてはＣｙ３を測定する際に使用するバンドパスフィルタと同じものを用いた。
（４）’図７の基準点１１０ａ～１１０ｄに相当する基準点を、それぞれのアライメント用画像データに基づいて、明暗情報を用いたエッジ検出法により検出した。
（５）’図６のステップＳ１０４～Ｓ１０８の工程まで行い、オフセット位置が－１００μｍ、０μm、＋１００μｍ、＋２００μｍ、＋５００μｍ、＋１０００μｍ、＋１２５０μｍ、＋１５００μｍである位置において、それぞれ２０枚のＤＮＡチップに対し、蛍光画像が正しくアライメントされているかどうかを確認した。その結果を表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　以上のように、アライメント用画像を取得する際に、ＤＮＡチップを焦点位置に対して対物レンズに近づけることにより、明らかにアライメントの信頼性が増しているのが分かる。上記の実施例ではアライメント用画像を取得する際、焦点位置よりも基板を＋２００μｍ対物レンズ側に近づけて設置することにより、信頼性が大きく増していることが分かる。
　なお、本実施例にかかるスキャナー１に搭載されている対物レンズのｆ値は６．０ｍｍであった。したがって、上記の結果から、オフセット位置（α）が＋１００～＋１０００の範囲において、α／ｆの好ましい範囲は、０．０１７（１００／６０００）から０．１７（１０００／６０００）の範囲であった。この範囲では、成功確率が９５％以上である。更に好ましくは、オフセット位置が＋２００～＋１０００の範囲であって、α／ｆの範囲は、０．０３３（２００／６０００）から０．１７（１０００／６０００）である。この範囲であるとアライメントの成功確率は１００％である。
（参考例）
　平らなスライドガラスの上に厚さ１５０μｍのテープをはり、それを上記のスキャナー１にセットした。オフセット量＋２５０μｍの状態で、Ｃｙ５の蛍光を測定するレーザー（波長６３５ｎｍ）を使用し、フィルタとしてはＣｙ３を測定する際に使用するバンドパスフィルタと同じものを用いて、アライメント用画像に相当する画像データを得た。この条件は図４－１で示す角度θが９０度に相当する。その結果を図１２－１～１２－３に示す。
　図１２－１～１２－３は、本実施例にかかるスライドガラスの画像および蛍光強度のグラフである。図１２－１は、スキャナー１により得られた画像である。図１２－２は、図１２－１の画像における矢印Ｐ１３－Ｐ１３’間における光強度変化を示すグラフである。図１２－３は、図１２－１の画像における矢印Ｐ１３－Ｐ１３’間におけるスライドガラス上の高さの差異を示すグラフである。これにより、スライドガラスに貼付されたテープであっても、光の強度変化から高さの差異を把握することができることがわかった。なお、エッジに相当する部分が暗くなっており、角度θが９０度でも問題ないと考えられる。
　本発明にかかる検出方法、マイクロアレイの解析方法および蛍光読取装置は、基板の高さの差異を正確に検出可能な画像を取得し、アライメント処理を適切に行うのに好適である。
　１，２　スキャナー
　１１，１２　レーザー光源
　１３　対物レンズ
　１４　穴あきミラー
　１４ａ　微小ミラー
　１５　カットフィルタ
　１５ａ，１５ｂ　励起光カットフィルタ
　１６　結像レンズ
　１７　画像取得部
　１８，１９　ミラー
　２０　制御部
　２０ａ　検出部
　２０ｂ　補正部
　２０ｃ　決定部
　２１　駆動部
　１００　ＤＮＡチップ
　１０１　ブロック
　１０２　スポット
　１０３　凹部
　１０４　保持部
　１４０　穴

Claims (10)

  1. 　レンズによって集光されたレーザー光を、凹凸形状を有する基板に照射し、該基板からの反射光および／または散乱光の光強度を画像データとして取得して前記凹凸形状の高さの差異を検出する検出方法であって、
    　前記レンズの焦点位置よりも前記レンズに近い位置に前記基板の光照射面を配置し、該光照射面からの反射光および／または散乱光を検出光として受光し、該受光した光の強度の変化に基いて前記基板の高さの差異を検出することを特徴とする検出方法。
  2. 　前記基板の光照射面を前記焦点位置に配置した場合に、該光照射面からの正反射光を前記検出光から分離する光学系を用いることを特徴とする請求項１に記載の検出方法。
  3. 　前記レンズの焦点距離をｆ、前記基板を前記焦点位置から前記レンズに近づける距離をαとしたとき、α／ｆが所定の範囲内となるように設定されるαに応じた位置に前記基板の光照射面を配置することを特徴とする請求項１または２に記載の検出方法。
  4. 　凹凸形状が形成され、各々蛍光標識されたサンプルと結合可能な複数のプローブが配置されたマイクロアレイに対し、対物レンズを介して前記蛍光標識の励起波長を含む光を照射し、かつ前記マイクロアレイからの光を受光して、該受光した光に基づく画像をもとに前記マイクロアレイの解析を行うマイクロアレイの解析方法であって、
    　前記蛍光標識からの蛍光を検出して蛍光画像データを取得する蛍光画像データ取得ステップと、
    　前記マイクロアレイの表面からの光を検出して、前記蛍光画像データのアライメントを行うアライメント用画像データを取得するアライメント用画像データ取得ステップと、
    　前記アライメント用画像データの光強度の変化をもとに、前記凹凸形状の高さの差異を検出する検出ステップと、
    　前記検出ステップによって検出された前記凹凸形状の高さの差異に基づいて前記蛍光画像データを補正する補正ステップと、
    　前記補正ステップによって補正された前記蛍光画像データにおける各プローブの位置を決定する位置決定ステップと、
    　を含み、
    　前記アライメント用画像データ取得ステップは、前記マイクロアレイの表面を、前記対物レンズの焦点位置に対して該対物レンズに近い位置に配置した状態で、前記アライメント用画像データを取得することを特徴とするマイクロアレイの解析方法。
  5. 　前記検出ステップは、前記アライメント用画像データにおいて、前記光強度の変化に基づいて３つ以上の基準点を検出し、
    　前記補正ステップは、検出した基準点を基に前記蛍光画像データの歪みを補正することを特徴とする請求項４に記載のマイクロアレイの解析方法。
  6. 　前記補正ステップは、前記基準点に基づく前記アライメント用画像データの傾斜角度θｘ，θｙを取得して、該傾斜角度θｘ，θｙおよび下記式（１），（２）をもとに、前記蛍光画像データの剪断変形歪みを補正することを特徴とする請求項５に記載のマイクロアレイの解析方法。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-M000001
  7. 　前記アライメント用画像データ取得ステップは、前記対物レンズの焦点距離をｆ、前記マイクロアレイを前記焦点位置から前記対物レンズに近づける距離をαとしたとき、α／ｆが所定の範囲内となるように設定されるαに応じた位置に前記マイクロアレイの表面を配置して前記アライメント用画像データを取得することを特徴とする請求項４～６のいずれか一つに記載のマイクロアレイの解析方法。
  8. 　前記マイクロアレイは、ＤＮＡマイクロアレイであることを特徴とする請求項４～７のいずれか一つに記載のマイクロアレイの解析方法。
  9. 　凹凸形状が形成され、各々蛍光標識されたサンプルと結合可能な複数のプローブが配置された基板から、前記蛍光標識の蛍光を含む光を受光して、該受光した光に基づく画像データを取得する蛍光読取装置であって、
    　少なくとも所定波長の励起光を含む照明光を出射する光源と、
    　前記照明光を前記基板に照射するとともに、該照明光が照射された前記基板の表面からの光を受光する対物レンズと、
    　前記対物レンズが受光した光を検出して、該検出した蛍光による蛍光画像データおよび前記基板からの光による基板画像データを取得する画像取得部と、
    　画像取得部によって取得された前記基板画像データをもとに、前記凹凸形状の高さの差異を検出する検出部と、
    　前記検出部によって検出された前記凹凸形状の高さの差異をもとに、前記蛍光画像データを補正する補正部と、
    　前記基板を保持する保持手段と、
    　前記保持手段を前記対物レンズの光軸に沿って移動させる駆動部と、
    　を備え、
    　前記駆動部は、前記画像取得部により前記基板画像データを取得する際、前記対物レンズの焦点位置に対して、前記対物レンズに近い位置に前記基板を配置するように前記保持手段を移動させることを特徴とする蛍光読取装置。
  10. 　前記駆動部は、前記対物レンズの焦点距離をｆ、前記基板を前記焦点位置から前記対物レンズに近づける距離をαとしたとき、α／ｆが所定の範囲内となるように設定されるαに応じた位置に前記基板を配置するように前記保持手段を移動させることを特徴とする請求項９に記載の蛍光読取装置。
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