WO2014069537A1 - Ｄ－アロースの生産方法 - Google Patents

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WO2014069537A1
WO2014069537A1 PCT/JP2013/079450 JP2013079450W WO2014069537A1 WO 2014069537 A1 WO2014069537 A1 WO 2014069537A1 JP 2013079450 W JP2013079450 W JP 2013079450W WO 2014069537 A1 WO2014069537 A1 WO 2014069537A1
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psicose
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enzyme
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知也 新谷
幸史 西本
幸一 原園
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Nagase Chemtex Corp
Nagase and Co Ltd
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Matsutani Chemical Industries Co Ltd
Nagase Chemtex Corp
Nagase and Co Ltd
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    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells

Definitions

  • the present invention relates to a novel use of a protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 derived from a microorganism belonging to the genus Streptomyces , that is, an enzyme for isomerizing D-psicose to D-allose.
  • the present invention clarifies the catalytic function that catalyzes the sugar isomerization reaction of the above-mentioned enzyme produced by a microorganism belonging to the genus Streptomyces , and D-allose is produced using the novel catalytic function. It relates to the technology to produce.
  • Monosaccharides are aldose (sugar having aldehyde group as carbonyl group), ketose (sugar having ketone group as carbonyl group), sugar alcohol (also known as polyol, sugar without carbonyl group) depending on the state of reducing group (carbonyl group) It is divided roughly into. Some monosaccharides are called “rare sugars”. Rare sugars are defined as sugars that rarely exist in nature according to the definition of the International Society of Rare Sugars, and depending on the type, rare yields are often low in organic chemical synthesis methods. Therefore, the present situation is that the development of an efficient production method of aldhexose (aldose) rare sugar including allose and its unique properties are being sought.
  • Patent Document 1 an antitumor agent containing a derivative of D-allose as an active ingredient is disclosed (Patent Document 1), and those utilizing the property of saccharides against active oxygen contain, for example, polysaccharides having the property of suppressing active oxygen.
  • Known active oxygen production inhibitors are known (Patent Document 2).
  • Psicose is a hexose having a ketone group as a reducing group, and is a sugar that has become relatively easily available in recent years due to the appearance of epimerase. It has been suggested that D-psicose can be effectively used as a sweetener, a carbon source for fermentation, a reagent, a raw material / intermediate for cosmetics / pharmaceuticals and the like.
  • psicose as an intermediate raw material for reagents and pharmaceuticals
  • a synthesis example of a hydantoin derivative using D-psicose as a raw material has been reported (Non-patent Document 1).
  • D-allose can be produced from D-psicose.
  • patent literature relating to the production of D-allose using isomerase which is an enzyme capable of producing D-allose from D-psicose, describes, for example, the target rare sugar from the substrate rare sugar by the action of an enzyme that catalyzes isomerization.
  • a method for mass production of purified rare sugars characterized in that the stock solution obtained by converting into sugars is chromatographed continuously as a target rare sugar fraction using a simulated moving bed.
  • Patent Document 3 a method for producing D-allose that causes isomerization to D-allose by acting a protein having L-rhamnose isomerase activity derived from Pseudomonas stutzeri (IPOD FERM BP-08593) (Patent Document 4). Proposed.
  • D-xylose isomerase is allowed to act on a solution containing D-psicose and / or L-psicose, so that D-psose is used for D-allose and D-altrose, and L-psicose is used for L-altrose.
  • a method for producing aldhexose has been proposed in which one or more aldohexose selected from these D-allose, D-altrose and L-altrose is collected (Patent Document 5).
  • Japanese Patent Publication No.59-40400 Japanese Patent Application Laid-Open No. 07-285871 JP 2006-153591 A JP 2008-109933 A JP 2002-17392 A International Publication No. WO2007-058086 US Patent 5,620,960 (1999) JP 2009-153516 A
  • the present invention is a bacterial species that is included in the list of items in the existing additive list that is approved for use in the production of food and has toxicity.
  • An object of the present invention is to obtain an isomerase that catalyzes the isomerization of D-psicose to D-allose with high yield from a bacterial species that can be presumed to be hardly present, and to provide a method for producing D-allose using the enzyme It is what.
  • the present invention also provides a method for producing D-allose with a novel enzyme obtained from actinomycetes, which is likely to be used as an existing additive without problems in the production of food.
  • the present inventors arrived at the present invention by researching for microorganisms that produce D-allose without safety concerns, which is a problem of the prior art, that is, the enzymes produced by the microorganisms. is there. That is, the present invention is based on the discovery of an enzyme capable of converting D-psicose to D-allose by isolating actinomycetes from soil to prepare a library. Since actinomycetes are highly likely to be used as a source microorganism for existing additive enzymes without problems in food production, isomerase obtained from actinomycetes can be a very useful means for mass production of D-allose.
  • the gist of the present invention is a protein having the activity described in the following (1) to (3).
  • (1) The CHO group of aldose C1 and the OH group of C2 described in any one of (a) to (c) below are recognized and reacted, and the CHO group of C1 is converted to an OH group, and the OH group of C2 is converted to A protein having an activity of converting into a group or reacting by recognizing the C1 OH group of Cetose and the CO group of C2, and converting the C1 OH group into a CHO group and the C2 CO group into an OH group.
  • a protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2.
  • (B) a protein comprising an amino acid sequence in which one or several amino acid residues are substituted, added, inserted or deleted in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2;
  • (C) A protein comprising an amino acid sequence having 60% or more homology with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2.
  • the present invention also provides the DNA described in (4) below, the recombinant vector described in (5), the host cell described in (6), and the method for producing the recombinant protein described in (7).
  • a recombinant vector comprising the DNA according to (4) above.
  • a host cell comprising an expression system capable of expressing the protein according to (1), (2) or (3).
  • Host cells containing the expression system according to (6) above are cultured in a medium, and the recombinant protein according to (1), (2), or (3) is collected from the obtained culture
  • a method for producing a recombinant protein comprising:
  • the gist of the present invention is the following (8) to (12) D-allose production method.
  • (8) A method for producing D-allose, wherein the protein described in (1), (2) or (3) is allowed to act on D-psicose to isomerize to D-allose.
  • (9) The method for producing D-allose according to (8) above, wherein the D-psicose is produced by epimerizing D-fructose.
  • the CHO group of aldose C1 and the OH group of C2 are recognized and reacted, and the CHO group of C1 is converted into an OH group.
  • the C2 OH group is converted into a CO group, or the C1 OH group of the ketose reacts with the C2 CO group, and the C1 OH group is converted into a CHO group, and the C2 CO group is converted into an OH group. It was possible to convert, preferably to produce D-allose from D-psicose.
  • the CHO group of C1 is converted to OH
  • the OH group of C2 is converted into a CO group, or the C1 OH group of Cetose and the C2 CO group are recognized and reacted, and the C1 OH group is converted into a CHO group and the C2 CO group is converted into an OH group. It is possible to provide an enzyme that isomerizes D-psicose into D-allose, and it has become possible to produce D-allose by using it.
  • the present invention it is a great technological advance that bacteria having a very high cell culture can be used, and the establishment of an enzyme that isomerizes D-psicose to produce D-allose and its production method Industrial significance not only in the industry but also in the food, cosmetics and pharmaceutical industries related to this is extremely large.
  • the present invention makes it possible to produce D-allose via D-psicose using D-glucose which can be obtained in large quantities at the lowest cost and fructose as a raw material.
  • D-allose is one of the very useful rare sugars and plays an important role in suppressing the growth of cancer cells. Arnold and Silady have reported that D-allose substantially inhibits the production of segmental neutrophils and lowers the platelet count without affecting other harmful clinical effects (Patent Literature). 7) There is also a report that inhibits the production of active oxygen (Non-patent Document 3). With regard to D-allose, many studies have been made in recent years, particularly regarding anticancer effects. Accordingly, the present inventors, as a method for safely producing a large amount of this useful D-allose, an enzyme that converts D-psicose into D-allose from a safe bacterial species that can be used in food production.
  • L-rhamnose isomerase L-rhamnose isomerase
  • the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 derived from a microorganism belonging to the genus Streptomyces or the SEQ ID NO: 2 derived from a microorganism is used.
  • a protein having an activity of converting D-psicose having D-allose into D-allose is used.
  • the target enzyme can be extracted from the obtained cultured cells and used in the reaction as it is, but is preferably used in an immobilized form.
  • the enzyme itself having the above-mentioned activity to be immobilized does not necessarily have to be purified with a high purity according to the purpose of use, and can be a crude enzyme.
  • a microorganism itself having the above-mentioned activity and the ability to produce an enzyme, or a culture of the microorganism or a partially purified culture can be used.
  • the immobilized enzyme can be used, for example, by immobilizing the target enzyme of the present invention by a conventional method such as a carrier binding method, a crosslinking method, or a comprehensive method. This is not limited to enzymes, but can be obtained by immobilizing bacterial cells themselves or crude enzymes on a carrier such as a resin. By immobilization, it is possible to obtain an immobilized enzyme which has been stable for about a week so far and has a stability of several months. For example, D-psicose containing 50% ethanol in an immobilized enzyme and / or immobilized microorganism obtained by immobilizing an enzyme and / or microorganism targeted by the present invention by a covalent bonding method which is one of the carrier binding methods.
  • D-allose crystals By passing the solution through, D-allose crystals can be continuously produced by controlling the temperature such as 42 ° C. during the reaction and 4 ° C. during the crystallization. Further, D-allose can be continuously produced again by passing the filtrate after crystallization again through the above-mentioned immobilized enzyme and / or immobilized microorganism without removing and concentrating the ethanol. .
  • This is an epoch-making method in which only D-allose can be separated by adding ethanol to a mixed solution of D-psicose and D-allose, and it is necessary to remove the buffer used for the enzyme reaction. In addition, there is a very great merit that the separation process can be greatly labor-saving and efficient.
  • the product is obtained as a mixed solution of 35% D-psicose and 15% D-allose.
  • -It is possible to obtain high-purity D-allose by separating psicose and D-allose.
  • the enzyme reaction for producing D-allose from D-psicose is usually carried out under the following conditions.
  • an aqueous solution is usually used as a solution containing D-psicose as a substrate, and the concentration of the substrate is 1 to 60 w / v%, preferably 10 to 50 w / v%, more preferably 20 to 40 w / v%. It is suitably selected from the range.
  • the enzyme reaction temperature is selected from temperatures at which the enzyme is not inactivated, for example, 10 to 85 ° C., desirably 40 to 80 ° C., more desirably optimum temperature 60 ° C.
  • the enzyme reaction pH is selected from 6.0 to 11.0, more preferably from the optimum pH 9.0.
  • the enzyme activity is selected from the range of 1 unit or more, preferably 50 to 5,000 units per gram of substrate.
  • the reaction time varies depending on the base mass used, the amount of enzyme, temperature, pH conditions, and the like, but considering the case of adopting a batch system instead of an immobilized enzyme, about 2 It is desirable to carry out in the range of ⁇ 100 hours, preferably about 5 to 50 hours.
  • the present invention relates to a method for producing D-allose, characterized in that D-psicose is allowed to act on a protein having the activity described in any of (a) to (c) below to isomerize to D-allose.
  • D-allose is produced from D-psicose by an enzyme that produces D-allose from D-psicose produced from highly safe actinomycetes.
  • the L-rhamnose isomerase activity of the protein is specified by the following physicochemical properties (d) to (f).
  • the enzyme activity of the present invention is specified by the following physicochemical properties (d) to (f).
  • D-psicose used in the present invention can be produced by various methods.
  • D-fructose is produced by epimerization, D-glucose is isomerized to D-fructose, and the D-fructose is converted to D-fructose.
  • D-psicose obtains D-glucose from unused resources, isomerizes the D-glucose to lead to D-fructose, and produces by epimerizing the D-fructose be able to.
  • Each cell is suspended in 2 mL of 40 mM Tris-maleic acid buffer (pH 7.0), and is subjected to HEAT SYSTEM Astrason ultrasonic cell crusher (W385), DUTY CYCLE 50%, output control scale 5 over 20 seconds twice. Sonication was performed. The disrupted solution was centrifuged at 9000 rpm for 10 minutes, and each supernatant was recovered to obtain a crude enzyme solution. What adjusted this protein concentration of this crude enzyme liquid to become 0.10 mg / 50 microliter was set to "enzyme sample", and decided to use it for an enzyme activity measurement hereafter.
  • [Production medium composition] Sugar medium (1.0% D-psicose, 0.1% D-tagatose, 0.1% glycerol) and mineral medium (0.26% ammonium sulfate, 0.24% potassium dihydrogen phosphate, 0.56% phosphorus) Each of dipotassium oxyhydrogen, 0.01% magnesium sulfate heptahydrate, 0.05% yeast extract (pH 7.0) is sterilized at 121 ° C. for 20 minutes and aseptically mixed and prepared.
  • the HPLC sample is applied to a CK08EC column (80 ° C.) manufactured by Mitsubishi Chemical Corporation and eluted with pure water having a flow rate of 0.4 mL / min, and the sugar composition produced by the detector RI-8020 manufactured by Tosoh Corporation is obtained. It was measured.
  • Cysteine carbazole method After reacting with the composition shown in Table 2, the reaction solution was stopped by treatment at 100 ° C. for 2 minutes, cooled to room temperature, and then 50 ⁇ L of 10% in 500 ⁇ L of the enzyme reaction solution. Trichloroacetic acid was added to stop the reaction. By adding 100 ⁇ L cysteine solution and 3 mL of 70% sulfuric acid to 550 ⁇ L of this sample and incubating at 20 ° C. for 1 minute, further adding 100 ⁇ L of Carbazole solution and heating at 35 ° C. for 20 minutes, and measuring the absorbance at 540 nm. The sugar composition produced was measured.
  • Streptomyces sp. 710 strain and Streptomyces sp. 720 strain were identified from the 16S rRNA base sequence). These strains, Streptomyces sp. 710 and Streptomyces sp. 720, were incorporated into the National Institute of Technology and Evaluation Patent Microorganism Depositary (NITE, 2-5-8 Kazusa Kamashichi, Kisarazu City, Chiba Prefecture) respectively in 2012 ( 2012) It has been deposited internationally under the Budapest Treaty under the accession numbers NITE BP-01423 and NITE BP-01424 on October 10 (original deposit date) and is available from there.
  • NITE BP-01423 and NITE BP-01424 accession numbers
  • Streptomyces sp.710 strain was cultured in Tryptic Soy Broth medium (Becton Dickinson) (50 mL) supplemented with 0.5% glycine at 30 ° C. and 160 rpm for 2 days and centrifuged ( The cells were collected at 3,000 rpm, 10 minutes, 4 ° C.).
  • TS buffer (10.3% sucrose, 50 mM Tris buffer (pH 8.0), 25 mM EDTA ⁇ 2Na) (30 mL), and centrifuged again (3,000 rpm, 10 minutes, 4 ° C.). The cells were collected. Subsequently, TS buffer solution (10 mL) containing 0.5% lysozyme and 0.002% N-acetylmuramidase was added to the cells and allowed to stand at 37 ° C. for 60 minutes.
  • a chloroform: isoamyl alcohol solution (24: 1, 20 mL) was added and stirred with a pipette. After centrifugation (12,000 rpm, 10 minutes, 4 ° C.), 0.6 times as much isopropyl alcohol as the upper layer was added to the upper layer, and the resulting precipitate was recovered. The precipitate was washed with 70% ethanol and dried in vacuo. After vacuum drying, the precipitate was dissolved in TE buffer (10 mM Tris buffer (pH 8.0), 1 mM EDTA ⁇ 2Na) (10 mL) to which Rnase (0.5 mg) was added, and the Streptomyces sp. 710 strain (or 720) was used. Strain) was prepared (stored at 4 ° C.).
  • a buffer solution of 10 ⁇ ⁇ -agarase was added so that the final concentration was 1 ⁇ with respect to the weight of the gel block, and the mixture was allowed to stand at 68 ° C. until melting. After melting, the mixture was allowed to stand at 40 ° C. for 10 minutes, ⁇ -agarase (3 units per 0.5 g of gel) was added, and the mixture was allowed to stand at 40 ° C. for 60 minutes. Then, 5M sodium chloride aqueous solution is added to a final concentration of 0.5M, left on ice for 15 minutes, centrifuged (15,000 rpm, 15 minutes, 4 ° C.), and then the supernatant is mixed with 3 of the supernatant. Double the amount of ethanol was added.
  • distilled water (90 ⁇ L) and a phenol: chloroform: isoamyl alcohol solution (25: 24: 1, 100 ⁇ L) were added and stirred, followed by centrifugation (15,000 rpm, 10 minutes, 25 ° C.). Three times as much ethanol as the upper layer was added to the upper layer. After standing at ⁇ 80 ° C. for 10 minutes, the mixture was centrifuged (15,000 rpm, 15 minutes, 4 ° C.), 70% ethanol was added to the resulting precipitate, and the mixture was centrifuged (15,000 rpm, 15 minutes, 4 ° C.). .
  • the precipitate containing the partially degraded DNA fragment of the chromosome of Streptomyces sp. 710 (or 720) was vacuum dried and then dissolved in distilled water (5 ⁇ L).
  • E. coli colonies containing the cosmid plasmid obtained in Example 4 were cultured at 30 ° C. in LB medium (5 mL) containing kanamycin (50 ⁇ g / mL) one colony at 30 ° C. until the absorbance at 660 nm reached 0.6. did.
  • This culture solution (2 mL) was transferred to a sterilized Eppendorf tube and centrifuged (3,000 rpm, 5 minutes, 4 ° C.). After decanting the supernatant, LB medium (1 mL) was added and stirred vigorously to wash the cells.
  • thiostrepton 167 ⁇ g / mL
  • nalidixic acid Na 67 ⁇ g / mL
  • Nutrient broth manufactured by Becton Dickinson
  • agar medium agar 0.5%, 3 mL was overlaid, and further cultured for 3 days. Acquired).
  • Example 5 [Acquisition of recombinant actinomycetes capable of producing isomerase] The 1,000 colonies prepared in Example 5 were each inoculated into 50 mL of the medium shown above placed in a 500 mL baffle flask, and rotated and cultured at 28 ° C. and a rotation speed of 160 rpm. On the third day of culture, each culture solution was collected in a 50 mL centrifuge tube. HITACHI micro high-speed centrifuge (CF15RXII type) was centrifuged at 9000 rpm for 10 minutes, and the supernatant was discarded. The cells were washed once with distilled water, centrifuged again, and the supernatant was discarded.
  • Each bacterial cell was suspended in 30 ml of 40 mM Tris-maleic acid buffer (pH 7.0). Sonication was performed twice for 20 seconds with an Astrason ultrasonic cell disrupter (W385) DUTY CYCLE 50%, output control scale 5 of HEAT SYSTEM. The disrupted solution was centrifuged at 9,000 rpm for 10 minutes, and each supernatant was collected. Membrane filtration was performed using a Minisart 1.2 ⁇ m manufactured by Sartorius to obtain each crude enzyme solution (1,000 colonies). When the activity of these crude enzyme solutions was confirmed by the method described above, this activity was confirmed with one colony of the crude enzyme solution. As a result of analyzing the DNA sequence of the cosmid library of this colony, a structural gene sequence whose function could not be estimated was confirmed, so it was decided to try to express this structural gene.
  • PCR reaction was performed using Streptomyces sp. 710 genomic DNA as a template.
  • the PCR reaction was carried out using the product name “Pusion DNA Polymerase” (FINNZYMES) for 1 cycle (98 ° C. for 10 seconds, 58 ° C. for 10 seconds, 72 ° C. for 2 minutes in order) 35 cycles. It was.
  • the PCR fragment obtained by the PCR reaction was treated with restriction enzymes NdeI and HindIII.
  • the conjugated actinomycete plasmid pTONA4 was also treated with restriction enzymes NdeI and HindIII.
  • the obtained two fragments were ligated to each other and then introduced into Streptomyces lividans ( Streptomyces lividans 1326 strain (NBRC number: 15675)) to obtain XGP-710 strain.
  • the obtained PCR fragment was analyzed with a DNA sequencer, the nucleotide sequence was determined, and it was confirmed that it was exactly the same as SEQ ID NO: 3.
  • a forward primer SEQ ID NO: 7
  • a reverse primer SEQ ID NO: 8 were synthesized.
  • PCR reaction was performed using Streptomyces sp. 720 genomic DNA as a template using the two primers, and then the same operation as described above was performed to obtain XGP-720 strain.
  • the obtained PCR fragment was analyzed with a DNA sequencer, the nucleotide sequence was determined, and it was confirmed that it was exactly the same as SEQ ID NO: 4.
  • the primers of SEQ ID NOs: 5 to 8 are shown in Table 3.
  • a host cell comprising the above expression system was cultured to obtain a crude enzyme solution.
  • XGP-710 strain and XGP-720 strain were inoculated into two 50 mL TSB media placed in a 500 mL baffle flask, respectively, and rotationally cultured under conditions of 28 ° C. and 160 rpm.
  • each culture solution was collected in a 50 mL centrifuge tube.
  • HITACHI micro high-speed centrifuge (CF15RXII type) was centrifuged at 9000 rpm for 10 minutes, and the supernatant was discarded. The cells were washed once with distilled water, centrifuged again, and the supernatant was discarded.
  • Each bacterial cell was suspended in 30 ml of 40 mM Tris-maleic acid buffer (pH 7.0). Sonication was performed twice for 20 seconds with an Astrason ultrasonic cell crusher (W385) DUTY CYCLE 50% and an output control scale 5 of HEAT SYSTEM. The disrupted solution was centrifuged at 9000 rpm for 10 minutes, and each supernatant was collected. Membrane filtration was carried out using Sarsius Minisart 1.2 ⁇ m to obtain crude enzyme solutions (XGP-710 crude enzyme solution and XGP-720 crude enzyme solution).
  • D-allose can be produced by chemical or biological methods, and can be produced chemically from D-ribose (Non-patent Document 5) or 1,2: 5,6-di-O. Obtained by reducing isopropylidene- ⁇ -D-ribohexofuranose-3-urose (Non-Patent Document 6), and enzymatically, L-ribose isomerase (L-RhI) from Pseudomonas stutzerii LL172 It can be produced from D-psicose by use (Non-patent Document 7). In the present invention, the characteristics of isomerase obtained from the genus Streptomyces were examined.
  • Table 8 shows the production rate of ketose and aldose when this enzyme (XGP-720 enzyme solution) is allowed to act on each aldose.
  • ketose formation was first observed.
  • b Production rate indicates aldose (residual substrate): ketose (product): aldose (product) when the equilibrium point is reached.
  • FIG. 6 shows the HPLC analysis results before the reaction (0 hour, D-psicose) and after the reaction (mixture of D-psicose, D-altrose, and D-allose after the reaction for 24 hours).
  • the enzyme of the present invention has the ability to isomerize D-psicose to produce D-allose, and the microorganism producing this enzyme is a strain belonging to the genus Streptomyces. Streptomyces microorganisms are related to the production of food and are considered to be highly safe microorganisms. The greatest feature of using the Streptomyces strain producing this enzyme in the food industry is the safety of the bacteria. As known enzymes for producing rare sugars such as D-allose, there are those of Pseudomonas, Agrobacterium, Rhizobium, Pseudomonas, etc., but these are opportunistic bacteria, plant cell infections, etc.

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Abstract

【課題】　安全性の高い微生物が産生する、Ｄ－プシコースからＤ－アロースへと異性化する活性を有する酵素タンパク質を提供すること。 【解決手段】　下記（ａ）から（ｃ）のいずれかに記載のＤ－プシコースをＤ－アロースへと異性化する活性を有するタンパク質。　（ａ）ストレプトマイセス属に属する微生物７１０株（受託番号：ＮＩＴＥ　ＢＰ－０１４２３）由来の配列番号１もしくは微生物７２０株（受託番号：ＮＩＴＥ　ＢＰ－０１４２４）由来の配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるＤ－プシコースからＤ－アロースへと異性化する活性を有するタンパク質。　（ｂ）配列番号１もしくは配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸残基が、置換、付加、挿入もしくは欠失したアミノ酸配列からなるＤ－プシコースからＤ－アロースへと異性化する活性を有するタンパク質。　（ｃ）配列番号１もしくは配列番号２に記載のアミノ酸　配列と６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるＤ－プシコースからＤ－アロースへと異性化する活性を有するタンパク質。　

Description

Ｄ－アロースの生産方法
　本発明は、ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）に属する微生物由来の配列番号１もしくは配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質の新規用途、すなわちＤ－プシコースをＤ－アロースへと異性化する酵素の用途に関する。
　本発明は、ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）に属する微生物の生産する上記酵素の有する糖異性化反応を触媒する触媒機能を明らかにしたものであり、該新規触媒機能を利用してＤ－アロースを生産する技術に関する。
　単糖類は還元基（カルボニル基）の状態によりアルドース（カルボニル基としてアルデヒド基を持つ糖）、ケトース（カルボニル基としてケトン基を持つ糖）、糖アルコール（別名：ポリオール、カルボニル基を持たない糖）に大別される。単糖類には「希少糖」といわれるものがある。希少糖とは、国際希少糖学会の定義によれば自然界に希にしか存在しない糖と定義されており、その種類によっては、有機化学的合成方法における収量も少ないものも多い。そのため、アロースを含めたアルドヘキソース（アルドース）希少糖の効率的な製造方法の開発とその特異な性質が探求されているのが現状である。
　希少糖が生理活性を有することは知られている。例えば、Ｄ－アロースの誘導体を有効成分とする抗腫瘍剤が開示され（特許文献１）、糖類の活性酸素に対する性質を利用したものでは、例えば、活性酸素を抑制する性質を有する多糖類を含有させた活性酸素産生抑制剤は知られている（特許文献２）。
　プシコースは、還元基としてケトン基を持つ六炭糖であり、近年、エピメラーゼの出現により比較的入手が容易となった糖である。Ｄ－プシコースは、甘味料、醗酵用炭素源、試薬、化粧品・医薬品の原料・中間体などとして有効に利用できることが示唆されている。プシコースの試薬・医薬品等の中間原料としての応用例としては、例えば、Ｄ－プシコースを原料としたヒダントイン誘導体の合成例が報告されている（非特許文献１）。
　Ｄ－アロースはＤ－プシコースから製造することができる。例えば、Ｄ－プシコースからＤ－アロースを生産することができる酵素であるイソメラーゼを利用したＤ－アロースの製造に関する特許文献には、例えば、異性化を触媒する酵素の作用で基質希少糖から目的希少糖へ変換し、得られる原液を擬似移動層により連続的に目的希少糖画分としてクロマト分離することを特徴とする精製希少糖の大量生産方法。（特許文献３）や、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｓｔｕｔｚｅｒｉ（ＩＰＯＤ　ＦＥＲＭ　ＢＰ－０８５９３）由来のＬ－ラムノースイソメラーゼ活性を有するタンパク質を作用させてＤ－アロースへと異性化するＤ－アロースの生産方法（特許文献４）が提案されている。
　また、Ｄ－プシコースおよび／またはＬ－プシコースを含有する溶液にＤ－キシロース・イソメラーゼを作用させて、Ｄ－プシコースからはＤ－アロースとＤ－アルトロースを、Ｌ－プシコースからはＬ－アルトロースを生成せしめ、これらＤ－アロース、Ｄ－アルトロースおよびＬ－アルトロースから選ばれる１種または２種以上のアルドヘキソースを採取するアルドヘキソースの製造方法が提案されている（特許文献５）。
特公昭５９－４０４００号 特開平０７－２８５８７１号公報 特開２００６－１５３５９１号公報 特開２００８－１０９９３３号公報 特開２００２－１７３９２号公報 国際公開ＷＯ２００７－０５８０８６号 米国特許５，６２０，９６０（１９９９） 特開２００９－１５３５１６号公報
Tetrahedron, 47, No.12/13, p2113 (1991) J. Bacteriol.,73:410-414 (1956). J. Biosci Bioeng., 96:89-91 (2003). Davis et al.,BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, 1986 Methods Carbohydr. Chem., 1:102-104 (1962). Carbohydr. Res., 24:192-197 (1972). J. Ferment Bioeng., 8: 539-541 (1998). J. Mol. Biol., 300:917-933 (2000).
　これまで各種の微生物からＤ－アロースを製造する技術は開発されてきたが、その微生物の安全性に問題があるため食用のＤ－アロースの生産への実用化が困難であった。そこで、従来、安全性に問題のない微生物由来の酵素を用いて希少糖を生産することが求められていた。
　希少糖の製造に関しては、例えば、シュードモナス・チコリ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｃｉｃｈｏｒｉｉ）由来のＤ－ケトへキソース３－エピメラーゼを利用することによりＤ－フラクトースからＤ－プシコースが製造できることが知られている。しかしながら、シュードモナス・チコリは植物病原性微生物であるから食品用途に利用する上で適しているとは言えない。リゾビウム属に属する微生物によるＤ－プシコースの製造も提案されている（特許文献６）が、リゾビウム属に属する微生物は、植物病原性微生物の場合もあり、食品用途に使用する菌としては望ましくない。また、これら技術は、いずれもＤ－プシコースを生産する技術であって、Ｄ－アロースを生産するものではない。
　こうした従来技術の安全性に関する問題点を解決するために、本発明は、食品を製造する際に使用が認められている既存添加物名簿収載品目リストに収載されている菌種であって毒性がほとんどないと推定できる菌種から、高い収率でＤ－プシコースからＤ－アロースへの異性化を触媒するイソメラーゼを取得すること、その酵素を用いたＤ－アロースの製造方法を提供することを目的とするものである。
　また、本発明は、既存添加物として食品の製造に問題なく使用できる可能性が高い放線菌から得られる新規な酵素によりＤ－アロースを製造する方法を提供するものである。
　本発明者らはこうした従来技術の問題点である安全性に関する懸念のないＤ－アロースを産生する微生物、つまりは、微生物が生産する当該酵素を求めて研究を積み重ねることにより本発明に到達したのである。すなわち、本発明は、土壌より放線菌を単離してライブラリーを作成し、その中から、Ｄ－プシコースからＤ－アロースに転換する作用を有する酵素を見出したことに基づくものである。放線菌は既存添加物酵素の起源微生物として食品製造に問題なく使用できる可能性が高いことから、放線菌から得られるイソメラーゼは非常に有用なＤ－アロースの大量生産手段となりうる。
　すなわち、本発明は、以下の（１）ないし（３）に記載の活性を有するタンパク質を要旨とする。
（１）下記（ａ）から（ｃ）のいずれかに記載の、アルドースＣ１のＣＨＯ基とＣ２のＯＨ基を認識して反応し、Ｃ１のＣＨＯ基をＯＨ基に、Ｃ２のＯＨ基をＣＯ基に変換する、あるいは、ケトースのＣ１のＯＨ基とＣ２のＣＯ基を認識して反応し、Ｃ１のＯＨ基をＣＨＯ基に、Ｃ２のＣＯ基をＯＨ基に変換する活性を有するタンパク質。
　（ａ）配列番号１もしくは配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
　（ｂ）配列番号１もしくは配列番号２で示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸残基が、置換、付加、挿入もしくは欠失したアミノ酸配列からなるタンパク質。
　（ｃ）配列番号１もしくは配列番号２で示されるアミノ酸配列と６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質。
（２）ケトースのＤ－プシコースをアルドースのＤ－アロースへと異性化する、上記（１）に記載のタンパク質。
（３）以下の（ｄ）～（ｆ）の物理化学的性質によって特定されるものである上記（１）または（２）に記載のタンパク質。
（d）作用ｐＨおよび至適ｐＨ
　作用ｐＨは６．０～１１．０であり、至適ｐＨは９．０である。
（ｅ）作用温度および至適温度
　作用温度は１０～８０℃であり、至適温度は６０℃である。
（ｆ）Ｌ－ラムノース、 Ｄ－キシロース、Ｄ－リボース、 Ｄ－アロース、Ｄ－グルコース、およびＬ－アラビノースに対して反応性を有する。
　また、本発明は、以下の（４）に記載のＤＮＡ、（５）に記載の組換えベクター、（６）に記載の宿主細胞、ならびに、（７）に記載の組換えタンパク質の製造方法を要旨とする。
（４）配列番号３もしくは配列番号４に示される塩基配列もしくはその相補的配列またはこれらの配列の一部もしくは全部を含む配列からなる請求項１または２に記載のタンパク質をコードするＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ.７１０（受託番号：ＮＩＴＥ　ＢＰ－０１４２３）またはＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ.７２０（受託番号：ＮＩＴＥ　ＢＰ－０１４２４）由来のＤＮＡ。
（５）上記（４）に記載のＤＮＡを含む組換えベクター。
（６）上記（１）、（２）または（３）に記載のタンパク質を発現することができる発現系を含んでいる宿主細胞。
（７）上記（６）に記載の発現系を含んでいる宿主細胞を培地に培養し、得られる培養物から上記（１）、（２）、または（３）に記載の組換えタンパク質を採取することを特徴とする組換えタンパク質の製造方法。
　また、本発明は、以下の（８）ないし（１２）のＤ－アロースの生産方法を要旨とする。
（８）Ｄ－プシコースに、上記（１）、（２）または（３）記載のタンパク質を作用させてＤ－アロースへと異性化することを特徴とするＤ－アロースの生産方法。
（９）Ｄ－プシコースが、Ｄ－フラクトースをエピ化して生産したものである上記（８）に記載のＤ－アロースの生産方法。
（１０）Ｄ－プシコースが、Ｄ－グルコースを異性化してＤ－フラクトースへ導き、そのＤ－フラクトースをエピ化して生産したものである上記（８）に記載のＤ－アロースの生産方法。
（１１）Ｄ－プシコースが、未利用資源からＤ－グルコースを得て、そのＤ－グルコースを異性化してＤ－フラクトースへ導き、そのＤ－フラクトースをエピ化して生産したものである上記（８）に記載のＤ－アロースの生産方法。
（１２）目的とするＤ－アロースがＤ－プシコースとＤ－アロースの混合物である上記（８）ないし（１１）のいずれかに記載のＤ－アロースの生産方法。
　本発明により、すなわち、ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）に属する微生物由来の酵素タンパク質を使用することにより、アルドースＣ１のＣＨＯ基とＣ２のＯＨ基を認識して反応し、Ｃ１のＣＨＯ基をＯＨ基に、Ｃ２のＯＨ基をＣＯ基に変換する、あるいは、ケトースのＣ１のＯＨ基とＣ２のＣＯ基を認識して反応し、Ｃ１のＯＨ基をＣＨＯ基に、Ｃ２のＣＯ基をＯＨ基に変換すること、好ましくはＤ－プシコースからＤ－アロースを生産すること、が可能となった。ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）に属する微生物由来の配列番号１もしくは配列番号２に記載のアミノ酸配列からなる、アルドースＣ１のＣＨＯ基とＣ２のＯＨ基を認識して反応し、Ｃ１のＣＨＯ基をＯＨ基に、Ｃ２のＯＨ基をＣＯ基に変換する、あるいは、ケトースのＣ１のＯＨ基とＣ２のＣＯ基を認識して反応し、Ｃ１のＯＨ基をＣＨＯ基に、Ｃ２のＣＯ基をＯＨ基に変換する、好ましくはＤ－プシコースをＤ－アロースへと異性化する酵素を提供することができ、また、それを使用することによりＤ－アロースを生産することが可能となった。
　本発明により、菌体培養物の安全性が非常に高い菌を使用できることは大きな技術の進歩であり、Ｄ－プシコースを異性化してＤ－アロースを産生する酵素とその製造方法の確立は、製糖産業のみならず、これに関連する食品、化粧品、医薬品産業における工業的意義が極めて大きい。また、本発明は、最も安価に大量に入手できるＤ－グルコースや、フラクトースを原料としてＤ－プシコース経由でＤ－アロースの製造を可能とした。
実施例１の組換え型イソメラーゼの構成（制限酵素地図）を示す図である。 本酵素活性へ及ぼす金属イオンの影響を示す図である。 至適酵素活性に及ぼす温度の影響 (a)と１時間保温後の安定性(b) を示す図である。 至適酵素活性に及ぼすｐＨの影響 (a)と ２４時間保温後の酵素安定性（ｂ）を示す図である。 本発明の酵素の基質特異性を示す図である。 反応前(Ｄ－プシコース)と反応後(Ｄ－プシコース、Ｄ－アルトロース、Ｄ－アロース混合液)のＨＰＬＣ分析を示す図である。
　Ｄ－アロースは非常に有用な希少糖のひとつであり、ガン細胞の増殖抑制に重要な役割を果たす。ＡｒｎｏｌｄとＳｉｌａｄｙは、Ｄ－アロースが、他の有害な臨床的影響を及ぼさずに、実質的に分節核好中球の産生を阻害し、血小板数を下げるということを報告しており（特許文献７）、活性酸素の産生を阻害する報告もある(非特許文献３)。Ｄ－アロースについては、ここ数年、特に抗癌作用について多くの研究がなされている。そこで、本発明者らは、この有用なＤ－アロースを大量にかつ安全に製造できる手法として、食品製造に用いることのできる安全な菌種から、Ｄ－プシコースをＤ－アロースへと変換する酵素を得ることを目的とし、鋭意研究を試みた。
　Ｄ－プシコースからＤ－アロースへの異性化反応を触媒する酵素のひとつとしては、Ｌ－ラムノースイソメラーゼ（Ｌ－ＲｈＩ, Ｅ.Ｃ: ５.３.１.１４）があり、これは本来、Ｌ－ラムノースを相応するケトースであるＬ－ラムニュロースへ可逆的に異性化する反応を触媒する酵素で、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ（非特許文献２)において知られているが、食品製造に安全に利用できる菌とは言えない。
　よって、本発明者らは、この産業的に有望なＤ－アロースの生産をより容易にする手法を確立する目的で、土壌より放線菌を単離してライブラリーを作成し、そのライブラリーよりＤ－プシコースからＤ－アロースへ変換するイソメラーゼを生産する菌を探索した。
　本発明におけるＤ－プシコースからＤ－アロースを生産することができる酵素としては、上記のストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）に属する微生物由来の配列番号１もしくは微生物由来の配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するＤ－プシコースからＤ－アロースに変換する活性を有するタンパク質を用いる。
　通常、得られた培養菌体から目的とする酵素を抽出し、そのままで反応に用いることができるが、好ましくは固定化した形態で用いる。固定化の対象とする上記の活性を有する酵素そのものは、使用目的に応じて、必ずしも高純度に精製されたものでなくてもよく、粗酵素であっても用いることができる。粗酵素の具体的例としては、上記の活性を有する酵素産生能を有する微生物自体を、また、その培養物や部分精製した培養物を用いることができる。
　上記固定化酵素は、例えば本発明の目的とする酵素を担体結合法、架橋法、または包括法等の定法によって固定化して用いることができる。これは、酵素に限定せず、菌体そのものや粗酵素を樹脂等の担体に対して固定化等することで得られる。固定化によって、これまで１週間ほどの安定性であったものが数ヶ月の安定性を持つ固定化酵素を得ることができる。
　例えば、本発明の目的とする酵素および／または微生物を、担体結合法のうちのひとつである共有結合法によって固定化した固定化酵素および／または固定化微生物に、５０％エタノールを含むＤ－プシコース溶液を通液することで、反応時は４２℃、結晶化時は４℃というように、温度をコントロールすることによりＤ－アロースの結晶を連続的に製造することができる。また、その結晶化後のろ液をエタノール除去、濃縮することなしに上記の固定化酵素および／または固定化微生物に再度通液することで、再度連続的にＤ－アロースを製造することができる。
　これは、Ｄ－プシコースとＤ－アロースの混合溶液に、エタノールを添加することでＤ－アロースのみを分離することができる画期的な方法であり、しかも、酵素反応に用いる緩衝液を除く必要もなく、分離過程を大幅に省力化し、効率化できるという非常に大きなメリットがある。５０％Ｄ－プシコースを原料にして酵素反応でＤ－アロースを生産した場合、生産物は、３５％Ｄ－プシコースと１５％Ｄ－アロースの混合溶液として得られるので、酵素反応産物から迅速にＤ－プシコースとＤ－アロースを分離して高純度のＤ－アロースを得ることが可能となる。
　本発明において、例えば、Ｄ－プシコースからＤ－アロースを生産する場合の酵素反応は、通常、下記の条件で行われる。即ち、基質としてＤ－プシコースを含有する溶液として、通常、水溶液を用い、その基質濃度は、１～６０ｗ／ｖ％、望ましくは、１０～５０ｗ／ｖ％、さらに望ましくは２０～４０ｗ／ｖ％の範囲から適宜選ばれる。酵素反応温度は、酵素が失活しない温度、例えば、１０～８５℃、望ましくは４０～８０℃、より望ましくは至適温度６０℃から選ばれる。同様に、酵素反応ｐＨは６．０～１１．０、より望ましくは至適ｐＨ９．０から選ばれる。酵素活性は基質グラム当り１単位以上、望ましくは、５０～５，０００単位の範囲から選ばれる。反応時間は、使用する基質量、酵素量、温度、ｐＨ条件等により変動するが、固定化酵素ではなくバッチ式を採用する場合を例に挙げるとすれば、経済性を考慮して、約２～１００時間、望ましくは約５～５０時間の範囲で行うことが望ましい。
　本発明は、Ｄ－プシコースに、下記（ａ）から（ｃ）のいずれかに記載の活性を有するタンパク質を作用させてＤ－アロースへと異性化することを特徴とするＤ－アロースの生産方法に関するものであり、安全性の高い放線菌から産生されるＤ－プシコースからＤ－アロースを生産する酵素によりＤ－プシコースからＤ－アロースを製造する。
　（ａ）配列番号１もしく配列番号２に記載のアミノ酸配列からなる上記活性を有するタンパク質。
　（ｂ）配列番号１もしくは配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸残基が、置換、付加、挿入もしくは欠失したアミノ酸配列からなる上記活性を有するタンパク質。
　（ｃ）配列番号１もしくは配列番号２に記載のアミノ酸配列と６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなる上記活性を有するタンパク質。
　上記タンパク質のＬ－ラムノースイソメラーゼ活性は、以下の（d）～（ｆ）の物理化学的性質によって特定されるものである。
　本発明の酵素活性は、以下の（d）～（ｆ）の物理化学的性質によって特定されるものである。
　（ｄ）作用ｐＨおよび至適ｐＨ
　作用ｐＨは６．０～１１．０であり、至適ｐＨは９．０である。
　（ｅ）作用温度および至適温度
　作用温度は１０～８０℃であり、至適温度は６０℃である。
　（ｆ）Ｌ－ラムノース、Ｄ－キシロース、Ｄ－リボース、 Ｄ－アロース、Ｄ－グルコース、およびＬ－アラビノースに対して反応性を有する。
［Ｄ－ プシコース］
　本発明で使用するＤ－プシコースは様々な方法で製造することができるが、例えば、Ｄ－フラクトースをエピ化して生産する、Ｄ－グルコースを異性化してＤ－フラクトースへ導き、そのＤ－フラクトースをエピ化して生産する、Ｄ－プシコースが、未利用資源からＤ－グルコースを得て、そのＤ－グルコースを異性化してＤ－フラクトースへ導き、そのＤ－フラクトースをエピ化して生産する、などを挙げることができる。
　本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明は実施例によってなんら限定されるものではない。
　［Ｄ－プシコースからＤ－アロースへの変換能を有する酵素の生産菌株の取得］
　　環境から採取した土壌０．１ｇを滅菌蒸留水１ｍＬに懸濁した。この懸濁液を滅菌蒸留水で５０倍希釈し、その０．１ｍＬを放線菌分離培地に接種し、３０℃で３日間培養した。現れたコロニーをピックアップ（約２００株）した。放線菌分離培地は表１の組成の放線菌培地を用いた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　次に、得られた約２００菌株を、試験管に入れた下記に示す生産培地５ｍＬにそれぞれ植菌し、２８℃、振とう速度２２０ｒｐｍの条件下で振とう培養した。培養７日目にそれぞれの培養液を１５ｍＬずつ遠心管に回収し、ＨＩＴＡＣＨＩ微量高速遠心機（ＣＦ１５ＲＸII型）９０００ｒｐｍ、１０分遠心後、上清を廃棄した。菌体を蒸留水で1回洗浄し、再び遠心を行い、上清を廃棄した。それぞれの菌体を４０ｍＭトリス－マレイン酸緩衝液（ｐＨ７．０）２ｍＬに懸濁し、ＨＥＡＴ　ＳＹＳＴＥＭ社アストラソン超音波細胞破砕機（Ｗ３８５）、ＤＵＴＹ　ＣＹＣＬＥ５０％、出力コントロール目盛り５で２０秒間２回超音波処理を行った。破砕溶液を９０００ｒｐｍ、１０分遠心し、それぞれの上清を回収して粗酵素液とした。この粗酵素液のタンパク濃度を０．１０ｍｇ/５０μＬとなるよう調整したものを「酵素試料」とし、以下、酵素活性測定に用いることとした。
　［生産培地組成］
　糖培地（１．０％Ｄ－プシコース、０．１％Ｄ－タガトース、０．１％グリセロール）とミネラル培地（０．２６％硫酸アンモニウム、０．２４％リン酸二水素カリウム、０．５６％リン酸水素二カリウム、０．０１％硫酸マグネシウム７水和物、０．０５％酵母エキス：ｐＨ７．０）のそれぞれを１２１℃、２０分間滅菌処理して等量ずつを無菌的に混合調製する。
　[酵素活性の確認方法]
　上記方法で得た酵素試料を用いて、各酵素試料のイソメラーゼ活性は、ＨＰＬＣ法または／およびシステインカルバゾール法（Ｃｙｓｔｅｉｎｅ　Ｃａｒｂａｚｏｌｅ法）により確認した。
　ＨＰＬＣ法：　表２に示される組成で酵素反応させた後、１００℃・２分間の処理により酵素反応を停止させ、室温まで冷却してからイオン交換樹脂およびフィルターによる精製処理を施し、ＨＰＬＣに供する試料とした。このＨＰＬＣ用試料を、三菱化学株式会社製ＣＫ０８ＥＣカラム（８０℃）に供し、流速０．４ｍＬ／ｍｉｎの純水で溶出させて、東ソー株式会社製　検出器ＲＩ－８０２０にて生成する糖組成を測定した。
　システインカルバゾール法：　表２に示される組成で反応させた後、反応液を１００℃・２分間の処理により酵素反応を停止させ、室温まで冷却してから、５００μＬの酵素反応溶液に５０μＬの１０％トリクロロ酢酸を加えて反応を停止させた。この試料５５０μＬに、１００μＬシステイン溶液と３ｍＬの７０％硫酸を加えて２０℃で１分間保温後、さらに１００μＬのＣａｒｂａｚｏｌｅ溶液を加えて３５℃で２０分間加温し、５４０ｎｍにおける吸光度を測定することにより、生成する糖組成を測定した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　上記一連の手順により、目的とする酵素活性の高い２株（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ.７１０株およびＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｓｐ.７２０株。属は、１６ＳｒＲＮＡ塩基配列から同定した。）を得た。これらの菌株Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ.７１０株およびＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｓｐ.７２０は、独立行政法人製品評価技術基盤機構　特許微生物寄託センター（ＮＩＴＥ、千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８）に、それぞれ平成２４年（２０１２年）１０月１０日付け（原寄託日）で受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－０１４２３、ＮＩＴＥ　ＢＰ－０１４２４の下でブタペスト条約に基づき国際寄託されており、そこから入手可能である。なお本寄託の７１０株は平成２５年（２０１３年）１０月７日に、７２０株は平成２５年（２０１３年）１０月３０日に、国内寄託（原寄託）からブダペスト条約に基づく国際寄託に移管請求し、受領された。そして、それらの２株について２５年（２０１３年）１０月３０日に国際寄託の受託証が発行された。
　Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｓｐ.７１０株およびＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｓｐ.７２０株からショットガンクローニングを行った。
　［Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｓｐ.７１０株（または７２０株）の染色体の調製］
　Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｓｐ.７１０株（または７２０株）を０．５％のグリシンを加えたトリプティック・ソイ・ブロス培地（ベクトン・ディッキンソン社製）（５０ｍＬ）で３０℃、１６０ｒｐｍで２日間培養し、遠心分離（３，０００ｒｐｍ、１０分、４℃）で菌体を回収した。ＴＳ緩衝液（１０．３％スクロース、５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．０）、２５ｍＭ　ＥＤＴＡ・２Ｎａ）（３０ｍＬ）で菌体を洗浄し、再び遠心分離（３，０００ｒｐｍ、１０分、４℃）で菌体を回収した。ついで、０．５％リゾチームと０．００２％Ｎ－アセチルムラミダーゼ入りＴＳ緩衝液（１０ｍＬ）を菌体に加え、３７℃、６０分静置した。プロトプラスト状になった菌体溶液に、１０％ＳＤＳ水溶液（２．４ｍＬ）と２ｍｇ／ｍＬプロテイナーゼＫ入りＴＳ緩衝液（０．４ｍＬ）を加え、ゆっくり撹拌した後、３７℃、６０分静置して、さらに５０℃、３０分静置した。ここに、５Ｍ塩化ナトリウム水溶液（２ｍＬ）と６５℃に加温した１０％セチルトリメチルアンモニウムブロマイドの０．７Ｍ塩化ナトリウム水溶液（１．６ｍＬ）を加え、ゆっくり撹拌した後、６５℃、２０分静置した。そして、クロロホルム：イソアミルアルコール溶液（２４：１、２０ｍＬ）を加え、ピペットで撹拌した。遠心分離（１２，０００ｒｐｍ、１０分、４℃）した後、上層に上層の０．６倍量のイソプロピルアルコールを加え、生じた沈殿を回収した。沈殿を７０％エタノールで洗浄し、真空乾燥した。真空乾燥後、沈殿は、Ｒｎａｓｅ（０．５ｍｇ）を加えたＴＥ緩衝液（１０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．０）、１ｍＭ　ＥＤＴＡ・２Ｎａ）（１０ｍＬ）に溶解させ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｓｐ. ７１０株（または７２０株）の染色体溶液を調製した（４℃で保存）。
　［染色体の部分分解］
　Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｓｐ.７１０株（または７２０株）の染色体溶液（４０．４μＬ）に１０×Ｈ緩衝液（タカラバイオ社製）（４．６μＬ）と０．２５ユニットの制限酵素Ｓａｕ３AＩを加え、４０分、３７℃で静置した。０．５Ｍ　ＥＤＴＡ水溶液（５０μＬ）を加え、０．５％低融点アガロースゲルで電気泳動して、２３ｋｂ以上のＤＮＡ断片を含むアガロースゲル分画を切り出した。切り出したゲルブロックは、蒸留水（５０ｍＬ）に入れ、ゆっくりと１５分振とうし、もう一度同じ操作を繰り返した。ゲルブロックの重量に対し、最終濃度が１×になるように１０×β-アガラーゼの緩衝液を加え、６８℃で、融解するまで静置した。融解させた後、１０分、４０℃で静置して、β-アガラーゼ（ゲル０．５ｇあたり３ユニット）を加え、６０分、４０℃で静置した。そして、５Ｍ塩化ナトリウム水溶液を終濃度０．５Ｍになるように加え、氷上で１５分静置して、遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、１５分、４℃）した後、上清に上清の３倍量のエタノールを加えた。－８０℃で１０分静置した後、遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、１５分、４℃）し、生じた沈殿に７０％エタノールを加え、遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、１５分、４℃）した。沈殿を真空乾燥した後、蒸留水（８μＬ）に溶解した。ここに１０×アルカリフォスファターゼ緩衝液（１μＬ）とアルカリフォスファターゼ（１μＬ）を加え、６０分、３７℃で静置した。ついで蒸留水（９０μＬ）とフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール溶液（２５：２４：１、１００μＬ）を加え、撹拌した後、遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、１０分、２５℃）した。上層に上層の３倍量のエタノールを加えた。－８０℃で１０分静置した後、遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、１５分、４℃）し、生じた沈殿に７０％エタノールを加え、遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、１５分、４℃）した。このＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｓｐ.７１０株（または７２０株）の染色体の部分分解ＤＮＡ断片を含む沈殿を真空乾燥した後、蒸留水（５μＬ）に溶解した。
　［Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｓｐ.７１０株（または７２０株）染色体のコスミドライブラリーの作製］
　放線菌－大腸菌シャトルコスミドベクターｐＴＯＹＡＭＡｃｏｓ（尾仲宏康（Ｈｉｒｏｙａｓｕ　Ｏｎａｋａ）ら、「ザ・ジャーナル・オブ・アンチバイオティクス（Ｊ.Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ）」、２００３年、５６巻、９５０－９５６頁に記載）の１０μｇを制限酵素ＢａｍＨＩで分解し、アガロースゲルで電気泳動し、８．３ｋｂのＤＮＡ断片を含むアガロースゲル分画を切り出した。切り出したゲルブロックから、ジンクリーンキット（Ｑバイオジーン社製）でＤＮＡ断片を精製し、蒸留水（２．５μＬ）に溶解した。ここに実施例で得たＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｓｐ. ＸＰ－７１０株およびＸＰ－７２０株の染色体の部分消化ＤＮＡ断片水溶液（５μＬ）を加え、ライゲーションキット（タカラバイオ社製）（７．５μＬ）を加え、１７時間、１６℃で静置した。ついで、このライゲーション溶液中のプラスミドをギガパックIIIパッケージングエクストラクトキット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）で、接合性大腸菌に導入した。カルベニシリン入り（５０μｇ／Ｌ）のＬＢ寒天培地で３０℃、２日間、プラスミドの入った大腸菌を培養し、生育した形質転換体（大腸菌）から１，０００コロニーを釣菌して別のカルベニシリン入り（５０μｇ／Ｌ）のＬＢ寒天培地で３０℃、１日間、培養した。
　［大腸菌コスミドライブラリーから放線菌へのプラスミドの導入］
　実施例４で取得したコスミドプラスミドが入った大腸菌１，０００コロニーを、それぞれ１コロニーずつカナマイシン入り（５０μｇ／ｍＬ）ＬＢ培地（５ｍＬ）で、吸光度６６０ｎｍが０．６になるまで、３０℃で培養した。この培養液（２ｍＬ）を滅菌済みのエッペンチューブに移し、遠心分離（３，０００ｒｐｍ、５分、４℃）した。上清をデカンテーションした後、ＬＢ培地（１ｍＬ）を加えて激しく撹拌し、菌体を洗浄した。遠心分離（３，０００ｒｐｍ、５分、４℃）し、上清をデカンテーションした後、さらにもう２回同じ操作を繰り返した。ＬＢ培地（０．５ｍＬ）を加えて菌体を懸濁した。別に容易した滅菌済みのエッペンチューブにストレプトマイセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｌｉｖｉｄａｎｓ　１３２６株（ＮＢＲＣ番号：１５６７５）の胞子懸濁液（１μＬ）とプラスミドの入った接合性大腸菌の懸濁液（０．１ｍＬ）をよく混合し、放線菌培地「ダイゴ」Ｎｏ．４（日本製薬社製）に広げた。３０℃で１８時間培養後、チオストレプトン（１６７μｇ／ｍＬ）とナリジキシン酸Ｎａ（６７μｇ／ｍＬ）入りニュートリエント・ブロス（ベクトン・ディッキンソン社製）寒天培地（寒天０．５％、３ｍＬ）を重層し、さらに３日間培養を続けた。生育してきたコロニーを取得した（１つの大腸菌に対して１コロニー取得した）。
　［イソメラーゼ生産能を持つ組換え放線菌の取得］
実施例５で作製した１，０００コロニーを５００ｍＬバッフルフラスコに入れた上記で示した培地５０ｍＬにそれぞれ植菌し、２８℃、回転数１６０ｒｐｍの条件下で回転培養した。培養３日目にそれぞれの培養液を５０ｍＬ遠心管に回収した。ＨＩＴＡＣＨＩ微量高速遠心機（ＣＦ１５ＲＸII型）９０００ｒｐｍ、１０分遠心後、上清を廃棄した。菌体を蒸留水で1回洗浄し、再び遠心を行い、上清を廃棄した。それぞれの菌体を４０ｍＭトリス－マレイン酸緩衝液（ｐＨ７．０）３０ｍｌに懸濁した。ＨＥＡＴ　ＳＹＳＴＥＭ社アストラソン超音波細胞破砕機（Ｗ３８５）ＤＵＴＹ ＣＹＣＬＥ ５０％、出力コントロール目盛り５で２０秒間２回超音波処理を行った。破砕溶液を９，０００ｒｐｍ、１０分遠心し、それぞれの上清を回収した。ザルトリウス社のＭｉｎｉｓａｒｔ１．２μｍで膜ろ過し、それぞれの粗酵素液（１，０００コロニー分）を得た。
　これら粗酵素液の活性の確認を、上記記載の方法で行ったところ、１コロニーの粗酵素液で本活性が確認された。
　本コロニーのコスミドライブラリーのＤＮＡ配列を解析した結果、機能が推定できない構造遺伝子配列が確認されたため、本構造遺伝子の発現を試みることにした。
　本例では、接合型放線菌プラスミドｐＴＯＮＡ４（特許文献８）を用いて、ＰＣＲ断片をプラスミドｐＴＯＮＡ４に導入し、ストレプトマイセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｌｉｖｉｄａｎｓ　１３２６株（ＮＢＲＣ番号：１５６７５））に発現させ、図１に示す組換え型イソメラーゼの構成（制限酵素地図）を得た。
　商品名「ＩｎｓｔａＧｅｎｅ（商標）Ｍａｔｒｉｘ」（ＢＩＯ－ＲＡＤ社製）を用いて、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｓｐ.７１０株および７２０株からそれぞれのゲノムＤＮＡを単離した。フォワードプライマー（配列番号５）およびリバースプライマー（配列番号６）を合成した。前記２つのプライマーを用いて、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｓｐ.７１０株ゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ反応を行った。なお、前記ＰＣＲ反応は、商品名「Ｐｈｕｓｉｏｎ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ」（ＦＩＮＮＺＹＭＥＳ社製）を用い、１サイクル（９８℃で１０秒間、５８℃で１０秒間、７２℃で２分間を順に行う）を３５サイクル行った。前記ＰＣＲ反応により得られたＰＣＲ断片を、制限酵素ＮｄｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで処理した。また、前記接合型放線菌プラスミドｐＴＯＮＡ４も制限酵素ＮｄｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで処理した。得られた２つの断片を互いにライゲーションした後、ストレプトマイセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｌｉｖｉｄａｎｓ　１３２６株（ＮＢＲＣ番号：１５６７５））に導入し、ＸＧＰ－７１０株を得た。得られたＰＣＲ断片は、ＤＮＡシークエンサーで分析し、塩基配列を決定し、配列番号３と全く同じであることを確認した。
　また、フォワードプライマー（配列番号７）およびリバースプライマー（配列番号８）を合成した。前記２つのプライマーを用いて、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｓｐ.７２０株ゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ反応を行い、以下、上記と同様の操作を行い、ＸＧＰ－７２０株を得た。得られたＰＣＲ断片は、ＤＮＡシークエンサーで分析し、塩基配列を決定し、配列番号４と全く同じであることを確認した。配列番号５～８のプライマーを表３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　次に、上記発現系を含んでなる宿主細胞を培養して粗酵素液を得た。
　５００ｍＬバッフルフラスコに入れたＴＳＢ培地５０ｍＬ２本にＸＧＰ－７１０株およびＸＧＰ－７２０株をそれぞれ植菌し、２８℃、回転数１６０ｒｐｍの条件下で回転培養した。培養３日目にそれぞれの培養液を５０ｍＬ遠心管に回収した。ＨＩＴＡＣＨＩ微量高速遠心機（ＣＦ１５ＲＸII型）９０００ｒｐｍ、１０分遠心後、上清を廃棄した。菌体を蒸留水で1回洗浄し、再び遠心を行い、上清を廃棄した。それぞれの菌体を４０ｍＭトリス－マレイン酸緩衝液（ｐＨ７．０）３０ｍｌに懸濁した。ＨＥＡＴ　ＳＹＳＴＥＭ社アストラソン超音波細胞破砕機（Ｗ３８５）ＤＵＴＹ ＣＹＣＬＥ ５０％、出力コントロール目盛り５で２０秒間２回超音波処理を行った。破砕溶液を９０００ｒｐｍ、１０分遠心し、それぞれの上清を回収した。ザルトリウス社のＭｉｎｉｓａｒｔ １．２μｍで膜ろ過し、それぞれの粗酵素液（ＸＧＰ－７１０粗酵素液およびＸＧＰ－７２０粗酵素液）を得た。
　Ｄ－アロースは、化学的または生物学的な方法により生産することができ、化学的には、Ｄ－リボースから生産したり(非特許文献５)、１，２：５，６－ジ－Ｏ－イソプロピリデン－α－Ｄ－リボヘキソフラノース－３－ウロースを還元することで得られ(非特許文献６)、酵素的には、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｓｔｕｔｚｅｒｉｉ　ＬＬ１７２からのＬ－リボースイソメラーゼ（Ｌ－ＲｈＩ）の利用により、Ｄ－プシコースから生産することができる(非特許文献７)。
　本発明においては、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属から得られたイソメラーゼの特性を調べることとした。
（１）本酵素の反応性
　まず、本酵素の各基質に対する反応性を調べることとした。
　基質として、アルドースであるＬ－ラムノース、Ｄ－リボース、Ｄ－アラビノース、Ｌ－アラビノース、Ｄ－キシロース、Ｄ－グルコース、Ｄ－アロースをそれぞれ用い、前述の酵素活性反応条件で反応させた後、得られたそれぞれの反応液をＣｙｓｔｅｉｎｅ　Ｃａｒｂａｚｏｌｅ法に従って酵素活性を測定した。その結果、Ｌ－ラムノースに対する基質活性が高く、次いで、Ｄ－キシロース、Ｄ－リボース、Ｄ－アロース、Ｄ－グルコース、およびＬ－アラビノースに対する基質反応活生が高かった（図５）。
（２）本酵素活性へ及ぼす金属の影響
　次に、イソメラーゼ活性に対する金属イオンの影響を調べる目的で、酵素を一部透析して酵素活性を測定した。透析は、粗酵素液をセルロース膜に入れ、２０ｍＭＥＤＴＡを含むグリシン－ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ９．０）に浸し、この緩衝液をゆっくりと１６時間かけて撹拌することにより行い、他の金属イオンの影響を取り除いた。こうして得られたアポ酵素の酵素活性を、各種二価イオン存在下（表４の反応条件下）で反応後、システインカルバゾール法により測定した。　
　その結果、ＭｎＣｌ２は本酵素活性を著しく上昇させ、本酵素は金属依存性を示した一方、ＭｇＳＯ４、ＭｇＣｌ２、ＣｏＣｌ２は、その活性をわずかに上昇させた。ＣａＣｌ２、ＢａＣｌ２、ＺｎＣｌ２、ＣｕＳＯ４はその活性を阻害することがわかった(図２)。
　Ｅ．ｃｏｌｉで発現するＬ－ＲｈＩは、その酵素活性を示すのにＭｎ２＋またはＺｎ２＋を要求することが報告されている(非特許文献８)。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
（３）本酵素活性へ及ぼす温度の影響（至適温度）
　次に、本酵素活性へ及ぼす温度の影響を調べた。
　酵素活性は、表５の条件において反応温度を随時１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０℃と変えて酵素反応をさせた後に、システインカルバゾール法により測定することにより確認した。
　その結果、本酵素活性の至適温度は６０℃であった(図３ａ)。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
（４）本酵素活性の熱耐性
　次に、本酵素活性の熱耐性を調べた。
　各酵素液を、グリシン－ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ９．０）中で各温度条件（１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０℃）下で１時間保温し、その残存する酵素活性を、上記条件下で酵素反応させた後に、システインカルバゾール法により測定した。
　その結果、６０℃における１時間の保温後にも、約８０～９０％の酵素活性が残存していた(図３ｂ)。
（５）本酵素活性へ及ぼすｐＨの影響（至適ｐＨ）
　次に、本酵素活性へ及ぼすｐＨの影響を調べた。
　具体的には、各ｐＨ緩衝溶液（５０ｍＭクエン酸緩衝液 (ｐＨ３．０－６．０）、５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液(ｐＨ６．０－８．０）、５０ｍＭトリス－塩酸緩衝液(ｐＨ７．０－９．０）、５０ｍＭグリシン－水酸化ナトリウム緩衝液(ｐＨ９．０－１１．０）)中に、酵素液を４℃で２４間置いた後、表６の反応条件下で酵素反応をさせ、残存する酵素活性をＣｙｓｔｅｉｎｅ　Ｃａｒｂａｚｏｌｅ法により測定した。この際のＤ－アロースからＤ－プシコースへの異性化反応条件は下表に示す。
　その結果、本酵素の至適ｐＨはｐＨ９．０であることがわかり(図４ａ)、ｐＨ９．０のグリシン－水酸化ナトリウム緩衝液中における酵素活性がより安定であった(図４ｂ)。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
（６）本酵素が触媒する反応の平衡点における各希少糖の生成率
　次に、本酵素が、アルドースであるＬ－ラムノース、Ｄ－リボース、Ｄ－アラビノース、Ｌ－アラビノース、Ｄ－キシロース、Ｄ－グルコース、Ｄ－アロースのそれぞれを基質とし、表７の反応条件で反応させ（ただし、反応時間は６～４８時間）、平衡点に達したときに得られる反応液の糖組成をＨＰＬＣ法により調べた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　表８に、各アルドースに本酵素（ＸＧＰ－７２０酵素液）を作用させたときのケトースとアルドースの生成率を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
 a すべての場合において、はじめにケトースの生成がみられた。
b 生成率は、平衡点に達したときのアルドース（残存した基質）：ケトース（生成物）：アルドース（生成物）を示す。
（７）Ｄ－プシコースとＤ－アロース間のイソメラーゼ反応
　次に、Ｄ－プシコースからＤ－アロースへのイソメラーゼ反応について調べた。
表９の反応条件下で酵素反応させ、ＨＰＬＣ法により糖組成を測定した。反応前(０時間、Ｄ－プシコース)と反応後（２４時間反応後のＤ－プシコース、Ｄ－アルトロース、Ｄ－アロース混合液)のＨＰＬＣ分析結果を図６に示す。
　その結果、Ｄ－プシコースを基質として酵素反応を開始したときにも、先の各アルドースを基質としたときの変換率に示したように、本酵素は、Ｄ－プシコース：Ｄ－アロース：Ｄ－アルトロース＝６６：３３：１の比率で、Ｄ－プシコースからＤ－アロースを生成するということが確認できた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
［結論］
　両酵素ともＬ－ラムノースに対して高い親和性を示し、ＸＧＰ－７１０酵素に比較してＸＧＰ－７２０酵素のほうがやや高い活性を示した。これら酵素の至適温度および安定性は６０℃近辺にあり、微生物汚染を防ぐ効果が見込まれる。さらに、金属イオンとしてのＭｎＣｌ２存在下、ｐＨ９．０のグリシン－水酸化ナトリウム緩衝液中で最も高い活性を示した。これらの結果から、同定された本ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）に属する菌株の酵素はＤ－プシコースからＤ－アロースを生産するのに効果的な酵素であることを明らかに示唆している。
　本発明の酵素は、Ｄ－プシコースを異性化してＤ－アロースを産生する能力を有すると共に、この酵素を産生する微生物は、ストレプトマイセス属に属する株であることを特徴とする。ストレプトマイセス属の微生物は、従来食品の製造に関わるものであり、安全性の高いとされる微生物である。本酵素を生産するストレプトマイセス株を食品産業で用いる最も大きな特徴としては、菌の安全性にある。これまで知られているＤ－アロースなどの希少糖の生産酵素としては、シュードモナス属、アグロバクテリウム属、リゾビウム属、シュードモナス属などによるものがあるが、これらは日和見菌としてや、植物細胞感染などの報告もあり、安全性を確認するには多くの労力を要する微生物であった。本発明で菌体あるいは菌体培養物の安全性が非常に高い菌を使用できることは大きな技術の進歩である。したがって、本発明の、Ｄ－プシコースを異性化してＤ－アロースを産生する酵素とその製造方法の確立は、製糖産業のみならず、これに関連する食品、化粧品、医薬品産業における工業的意義が極めて大きいものと考えられる。
 

Claims (12)

  1. 　下記（ａ）から（ｃ）のいずれかに記載の、アルドースＣ１のＣＨＯ基とＣ２のＯＨ基を認識して反応し、Ｃ１のＣＨＯ基をＯＨ基に、Ｃ２のＯＨ基をＣＯ基に変換する、あるいは、ケトースのＣ１のＯＨ基とＣ２のＣＯ基を認識して反応し、Ｃ１のＯＨ基をＣＨＯ基に、Ｃ２のＣＯ基をＯＨ基に変換する活性を有するタンパク質。
    　（ａ）配列番号１もしくは配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
    　（ｂ）配列番号１もしくは配列番号２で示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸残基が、置換、付加、挿入もしくは欠失したアミノ酸配列からなるタンパク質。
    　（ｃ）配列番号１もしくは配列番号２で示されるアミノ酸配列と６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質。
  2. 　ケトースのＤ－プシコースをアルドースのＤ－アロースへと異性化する、請求項１に記載のタンパク質。
  3. 　以下の（ｄ）～（ｆ）の物理化学的性質によって特定されるものである請求項１または２に記載のタンパク質。
    （d）作用ｐＨおよび至適ｐＨ
    　作用ｐＨは６．０～１１．０であり、至適ｐＨは９．０である。
    （ｅ）作用温度および至適温度
    　作用温度は１０～８０℃であり、至適温度は６０℃である。
    （ｆ）Ｌ－ラムノース、 Ｄ－キシロース、Ｄ－リボース、 Ｄ－アロース、Ｄ－グルコース、およびＬ－アラビノースに対して反応性を有する。
  4. 　配列番号３もしくは配列番号４に示される塩基配列もしくはその相補的配列またはこれらの配列の一部もしくは全部を含む配列からなる請求項１または２に記載のタンパク質をコードするＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ.７１０（受託番号：ＮＩＴＥ　ＢＰ－０１４２３）またはＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ.７２０（受託番号：ＮＩＴＥ　ＢＰ－０１４２４）由来のＤＮＡ。
  5. 　請求項４に記載のＤＮＡを含む組換えベクター。
  6. 　請求項１、２または３に記載のタンパク質を発現することができる発現系を含んでいる宿主細胞。
  7. 　請求項６に記載の発現系を含んでいる宿主細胞を培地に培養し、得られる培養物から請求項１、２または３に記載の組換えタンパク質を採取することを特徴とする組換えタンパク質の製造方法。
  8. 　Ｄ－プシコースに、請求項１、２または３に記載のタンパク質を作用させてＤ－アロースへと異性化することを特徴とするＤ－アロースの生産方法。
  9. 　Ｄ－プシコースが、Ｄ－フラクトースをエピ化して生産したものである請求項８に記載のＤ－アロースの生産方法。
  10. 　Ｄ－プシコースが、Ｄ－グルコースを異性化してＤ－フラクトースへ導き、そのＤ－フラクトースをエピ化して生産したものである請求項８に記載のＤ－アロースの生産方法。
  11. 　Ｄ－プシコースが、未利用資源からＤ－グルコースを得て、そのＤ－グルコースを異性化してＤ－フラクトースへ導き、そのＤ－フラクトースをエピ化して生産したものである請求項８に記載のＤ－アロースの生産方法。
  12. 　目的とするＤ－アロースがＤ－プシコースとＤ－アロースの混合物である請求項８ないし１１のいずれかに記載のＤ－アロースの生産方法。


     
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115349018A (zh) * 2020-03-26 2022-11-15 国立大学法人香川大学 新型l－鼠李糖异构酶

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102087396B1 (ko) * 2015-11-16 2020-03-10 주식회사 삼양사 과당-함유 기질로부터 사이코스를 생산하는 방법
KR101785299B1 (ko) 2015-11-23 2017-11-15 대상 주식회사 최적화된 리보스 5-인산 이성화효소를 코딩하는 유전자 및 이를 포함하는 미생물 및 이를 이용한 알로스 제조 방법
KR102069301B1 (ko) * 2015-12-21 2020-01-22 주식회사 삼양사 과당으로부터 알로오스를 생산하는 균주 및 이를 이용한 알로오스 생산방법
KR102581107B1 (ko) 2016-12-14 2023-09-21 보너모스, 인코포레이티드 D-알룰로스의 효소적 생산
KR102093509B1 (ko) * 2018-12-17 2020-03-25 대상 주식회사 알로스 제조용 조성물 및 알로스 제조방법
CN112521429B (zh) * 2020-12-30 2022-02-18 河南科技大学 一种微波辐射法从坚果壳中提取d-阿洛糖的方法
CN114031649B (zh) * 2021-07-16 2023-03-03 山东福洋生物科技股份有限公司 一种提高阿洛酮糖晶体粒度和流动性的方法

Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5940400B2 (ja) 1980-03-24 1984-09-29 わかもと製薬株式会社 新規ｄ−アロ−ス誘導体及びこれを有効成分とする抗腫瘍剤
JPH07285871A (ja) 1994-04-18 1995-10-31 Mikimoto Pharmaceut Co Ltd 活性酸素抑制剤
US5620960A (en) 1994-08-15 1997-04-15 Uop Use of D-allose as an immunosuppressive agent
JP2002017392A (ja) 2000-07-07 2002-01-22 Hayashibara Biochem Lab Inc Ｄ−キシロース・イソメラーゼを用いるアルドヘキソースの製造方法
WO2006022239A1 (ja) * 2004-08-24 2006-03-02 National University Corporation Kagawa University 耐熱性l-ラムノースイソメラーゼ遺伝子配列とその用途
JP2006153591A (ja) 2004-11-26 2006-06-15 Kagawa Univ 精製希少糖の大量生産方法
WO2007058086A1 (ja) 2005-11-15 2007-05-24 Kabushiki Kaisha Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo ケトース３－エピメラーゼとその製造方法並びに用途
JP2008109933A (ja) 2003-01-10 2008-05-15 Kishoto Seisan Gijutsu Kenkyusho:Kk 新しい触媒機能を有するｌ−ラムノースイソメラーゼの用途
JP2009153516A (ja) 2007-12-05 2009-07-16 Nagase & Co Ltd β−Ｌ−アラビノピラノシダーゼ

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2005102503A (ja) * 2003-01-10 2005-04-21 Kagawa Univ 新しい触媒機能を有するｌ−ラムノースイソメラーゼの遺伝子配列およびその用途
CN102839184A (zh) * 2012-09-27 2012-12-26 江南大学 一种重组核糖-5-磷酸异构酶及其应用

Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5940400B2 (ja) 1980-03-24 1984-09-29 わかもと製薬株式会社 新規ｄ−アロ−ス誘導体及びこれを有効成分とする抗腫瘍剤
JPH07285871A (ja) 1994-04-18 1995-10-31 Mikimoto Pharmaceut Co Ltd 活性酸素抑制剤
US5620960A (en) 1994-08-15 1997-04-15 Uop Use of D-allose as an immunosuppressive agent
JP2002017392A (ja) 2000-07-07 2002-01-22 Hayashibara Biochem Lab Inc Ｄ−キシロース・イソメラーゼを用いるアルドヘキソースの製造方法
JP2008109933A (ja) 2003-01-10 2008-05-15 Kishoto Seisan Gijutsu Kenkyusho:Kk 新しい触媒機能を有するｌ−ラムノースイソメラーゼの用途
WO2006022239A1 (ja) * 2004-08-24 2006-03-02 National University Corporation Kagawa University 耐熱性l-ラムノースイソメラーゼ遺伝子配列とその用途
JP2006153591A (ja) 2004-11-26 2006-06-15 Kagawa Univ 精製希少糖の大量生産方法
WO2007058086A1 (ja) 2005-11-15 2007-05-24 Kabushiki Kaisha Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo ケトース３－エピメラーゼとその製造方法並びに用途
JP2009153516A (ja) 2007-12-05 2009-07-16 Nagase & Co Ltd β−Ｌ−アラビノピラノシダーゼ

Non-Patent Citations (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CARBOHYDR. RES., vol. 24, 1972, pages 192 - 197
DATABASE UNIPROT/TREMBL [online] 1 June 2003 (2003-06-01), "Definition: Streptomyces avermitilis, rhamnose isomerase", XP055265486, Database accession no. Q825P2 *
DATABASE UNIPROT/TREMBL [online] 1 November 1999 (1999-11-01), "Definition: Streptomyces coelicolor, rhamnose isomerase", XP055265462, Database accession no. Q9XAB3 *
DATABASE UNIPROT/TREMBL [online] 21 May 2012 (2012-05-21), "Definition: Streptomyces coelicoflavus, rhamnose isomerase", XP055265471, Database accession no. H1QB75 *
DATABASE UNIPROT/TREMBL [online] 5 October 2010 (2010-10-05), "Definition: Streptomyces griseoflavus, rhamnose isomerase", XP055265482, Database accession no. D9Y207 *
DAVIS ET AL., BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, 1986
HIROYASU ONAKA ET AL., J. ANTIBIOTICS, vol. 56, 2003, pages 950 - 956
J. BACTERIOL., vol. 73, 1956, pages 410 - 414
J. BIOSCI BIOENG., vol. 96, 2003, pages 89 - 91
J. FERMENT BIOENG., vol. 8, 1998, pages 539 - 541
J. MOL. BIOL., vol. 300, 2000, pages 917 - 933
METHODS CARBOHYDR. CHEM., vol. 1, 1962, pages 102 - 104
TETRAHEDRON, vol. 47, no. 12/13, 1991, pages 2113
YU-RI LIM ET AL.: "Microbial metabolism and biotechnological production of D-allose", APPL. MICROBIOL. BIOTECHNOL., vol. 91, no. 2, 8 June 2011 (2011-06-08), pages 229 - 235, XP019920942 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115349018A (zh) * 2020-03-26 2022-11-15 国立大学法人香川大学 新型l－鼠李糖异构酶
CN115349018B (zh) * 2020-03-26 2025-11-07 国立大学法人香川大学 新型l－鼠李糖异构酶

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