WO2014098211A1 - 組織再生促進剤 - Google Patents

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WO2014098211A1
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cell
tissue
activated stellate
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PCT/JP2013/084228
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新津洋司郎
米田明弘
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Nitto Denko Corp
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Nitto Denko Corp
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    • C12Y304/2408—Membrane-type matrix metalloproteinase-1 (3.4.24.80)

Definitions

  • the present invention comprises activated stellate cells, activated stellate cell degradation products, MMP14, collagen treated with MMP14, and a component selected from the group consisting of activated stellate secretions, promoting tissue regeneration, promoting cell differentiation and / or
  • the present invention relates to a composition for promoting cell growth, a composition for inhibiting cell growth containing an MMP14 inhibitor, a cell culture substrate containing collagen treated with MMP14, and the like.
  • tissue regeneration When a living tissue is damaged, it regenerates to make up for the damaged portion and tries to recover its function. For example, it is known that the liver regenerates in a short period of time even if more than half of it is excised, and almost restores its original size and function. Research on tissue regeneration has been conducted for a long time, mainly in the liver, and various findings have been reported, but the detailed mechanism of tissue regeneration is still unclear. Multiple types of cells are thought to be involved in complex tissue regeneration, but there is no definitive view even of which of these cells plays a major role .
  • Non-Patent Document 1 discloses that in a mouse partial hepatectomy model, a specific phenotype of hepatic sinusoidal endothelial cell is an endothelial cell-specific transcription factor mediated by VEGFR2 (vascular endothelial growth factor-A receptor-2).
  • VEGFR2 vascular endothelial growth factor-A receptor-2
  • the present invention aims to provide a novel tissue regeneration promoting agent and tissue regeneration promoting method.
  • a composition for promoting tissue regeneration comprising a component selected from the group consisting of activated stellate cells, activated stellate cell degradation products, MMP14, collagen treated with MMP14, and activated stellate cell secretions.
  • composition according to (1) wherein the tissue regeneration occurs in a damaged tissue or a transplanted tissue.
  • the composition according to (2) which is administered within 4 days from the day of receiving the disorder or transplantation.
  • the composition according to (2) which is administered within one day from the day of receiving the disorder or transplantation.
  • the composition according to any one of (2) to (4), wherein the disorder is selected from the group consisting of tissue destruction, inflammation, necrosis, fibrosis, surgical invasion, and organ failure.
  • the composition according to (9), wherein the state in which tissue regeneration is suppressed is selected from the group consisting of inflammation, necrosis, fibrosis, organ failure, decreased platelet count, genetic abnormality, and decreased noradrenaline.
  • a method for promoting tissue regeneration in a subject comprising the step of administering the composition according to any one of (1) to (10) to a subject in need thereof.
  • stem cells comprising a component selected from the group consisting of activated stellate cells, activated stellate degradation products, MMP14, collagen treated with MMP14, and activated stellate secretions Composition.
  • a tissue stem cell comprising a step of contacting a stem cell with a component selected from the group consisting of activated stellate cell, activated stellate cell degradation product, MMP14, collagen treated with MMP14, and activated stellate secretion To differentiate and / or proliferate.
  • a composition for promoting cell proliferation comprising a component selected from the group consisting of activated stellate cells, activated stellate cell degradation products, MMP14, collagen treated with MMP14, and activated stellate secretions.
  • Cell proliferation including the step of contacting cells with a component selected from the group consisting of activated stellate cells, activated stellate degradation products, MMP14, collagen treated with MMP14, and activated stellate secretions How to promote.
  • a composition for suppressing cell proliferation comprising a substance that inhibits MMP14.
  • the composition according to (16), wherein the cell on which the substance that inhibits MMP14 acts is CAF and / or tumor cell.
  • a cell culture substrate containing collagen treated with MMP14 is CAF and / or tumor cell.
  • tissue regeneration not only in-vivo tissue regeneration but also in-vitro tissue formation can be promoted, and thus a great contribution can be expected from biological and medical aspects. Furthermore, the promotion of tissue regeneration according to the present invention is particularly useful in situations where tissue regeneration is suppressed, for example, in situations involving diseases such as fibrosis.
  • FIG. 10 is a diagram showing an outline of treatment applied to each group in Example 3. It is the figure which showed the external appearance of the extract
  • One aspect of the present invention is to promote tissue regeneration comprising a component selected from the group consisting of activated stellate cells, activated stellate cell degradation products, MMP14, collagen treated with MMP14, and activated stellate secretions. Of the composition.
  • Activated stellate cells can be obtained by subculturing stellate cells isolated from living organisms. Astrocytes are known to exist in various tissues such as the liver, pancreas, kidney, intestinal tract, and lung (Zhao and Burt, J Mol Histol. 2007 Mar; 38 (1): 53-64). Either of these can be used. Isolation of stellate cells can be performed using any known method. A specific example of the method for isolating hepatic stellate cells is exemplified in Example 5 (1) described later. Activated stellate cells are characterized by the expression of ⁇ SMA, which can be selected as a marker.
  • the activated stellate cell may be subjected to a treatment for increasing the expression of a protein selected from the group consisting of HGF, EGF, and MMP14.
  • a treatment for increasing the expression of a protein selected from the group consisting of HGF, EGF, and MMP14 examples include, but are not limited to, introduction of a gene encoding the protein into activated stellate cells.
  • Genes encoding HGF, EGF and MMP14 are known, and gene introduction methods are also well known in the art.
  • the activated stellate cell degradation product can be obtained by decomposing activated stellate cells by various methods including physical and / or chemical methods.
  • any known method for degrading cells such as osmotic shock method, freeze-thaw method, use of surfactant, enzymatic digestion method, ultrasonic treatment, French press, mortar grinding, homogenizer disruption, For example, crushing with glass beads can be used.
  • the decomposition method does not denature the protein or has a light denaturation. By using this method, MMP14 expressed on the cell membrane can be obtained without impairing its function.
  • the activated stellate cell degradation product contains a cell membrane component.
  • MMP14 (also called MT1-MMP) is an MMP expressed on the cell membrane. MMP14 can act on collagen I. The present inventors have revealed that the action of MMP14 on collagen I is deeply involved in cell proliferation. MMP14 in the present invention includes not only those expressed on the cell membrane but also those released from the cell membrane. MMP14 may be naturally occurring or artificially produced. Thus, MMP14 includes recombinant MMP14. Free MMP14 is known (eg, Jo et al., Biochem J. 2000 Feb 1; 345 Pt 3: 511-9) and is commercially available (eg, R & D Systems, Cat No. 918-MP). -010, 918-MPN-010, etc.).
  • the amino acid of MMP14 and the base sequence encoding it are known (for example, the base sequence of human MMP14 is registered as GenBank accession number NM_004995, and the amino acid sequence is registered as GenBank accession number NP_004986).
  • MMP14 in the present invention includes functional mutants thereof.
  • a functional variant of MMP14 is not limited, and includes, for example, (i) one or more, typically one or several mutations in the amino acid sequence of the protein.
  • a variant having the same function as (ii) one or more nucleotide sequences of nucleic acids having the nucleotide sequence of the gene encoding the protein or the same polypeptide as the nucleic acid typically Is encoded by a nucleic acid having one or several mutations and has a function equivalent to that of the protein, (iii) a nucleic acid having a base sequence of a gene encoding the protein, and the same polypeptide as the nucleic acid To a complementary strand of a nucleic acid encoding a nucleic acid encoding (ii) or a variant thereof, or a fragment thereof under stringent conditions
  • a variant having an amino acid sequence having a homology of 95% or more and having a function equivalent to that of the protein, (v) 60% or more with the base sequence of the gene encoding the protein preferably examples include mutants encoded by nucleic acids having homology of 70% or more, more preferably 80% or more, more preferably 90% or more, particularly preferably 95% or more, and having functions equivalent to the protein. .
  • a person skilled in the art can convert the above functional mutant into any known method such as chemical synthesis, cleavage or insertion of a nucleic acid with a restriction enzyme, site-directed mutagenesis, radiation or ultraviolet irradiation based on the sequence information of MMP14. It can be suitably produced by such as. Whether or not a certain mutant has a function equivalent to that of MMP14 is determined by analyzing the mutant by any known method with respect to the known function of MMP14, for example, collagen resolution, etc. It can be evaluated by comparing with a negative control or MMP14 as a positive control.
  • this mutant is a functional mutant of MMP14.
  • the above function when the above function is superior to the negative control, for example, 10% or more, 25% or more, 50% or more, 75% or more, or even 100% or more, and / or If this function is 1/100 or more, 1/50 or more, 1/25 or more, 1/10 or more, 1/5 or more, or even 1/2 or more of CSABP, this mutant is a functional mutant of MMP14.
  • stringent conditions is a well-known parameter in the art, and standard protocol collections such as Sambrook et al.,. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3d ed., Cold Spring. Harbor Press (2001), Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1992), and the like.
  • the stringent conditions in the present invention are, for example, 3.5 ⁇ SSC (0.15 M sodium chloride / 0.15 M sodium citrate, pH 7) at 65 ° C., Ficoll 0.02%, polyvinylpyrrolidone 0.02% Hybridization with a hybridization buffer consisting of 0.02% bovine serum albumin, 425 mM NaH2PO (pH 7), 0.05% SDS, and 2 mM EDTA. After hybridization, the membrane to which the DNA has been transferred is washed with 2 ⁇ SSC at room temperature and then with 0.1 to 0.5 ⁇ SSC / 0.1 ⁇ SDS at a temperature up to 68 ° C.
  • stringent hybridization may be performed using a commercially available hybridization buffer such as ExpressHyb® Hybridization Solution (Clontech) under the hybridization and washing conditions described by the manufacturer.
  • the MMP14 and / or functional variant thereof in the present invention includes not only the protein itself or a functional variant thereof, but also a nucleic acid encoding the protein or the functional variant thereof.
  • the collagen treated with MMP14 can be obtained by treating collagen with MMP14.
  • collagen for example, collagen I can be used.
  • MMP14 used for the treatment may be the above-described MMP14 (including a functional mutant of MMP14), a cell expressing MMP14 itself, or a degradation product of the cell containing MMP14.
  • the treatment time by the MMP 14 may be, for example, 1 to 120 hours, 3 to 60 hours, 6 to 48 hours, 12 to 36 hours, etc. at a temperature at which the MMP 14 can act.
  • the collagen treated with MMP14 is preferably in a state in which the RGD sequence can interact with cells.
  • Activated stellate secretion can be obtained from the culture supernatant of activated stellate cells.
  • the culture supernatant may be used as it is or after being concentrated by dialysis or lyophilization. Since activated stellate secretions contain various proteins, it is preferable to handle them so that the proteins are not denatured.
  • the tissue that promotes regeneration by the composition of the present invention is not particularly limited, and includes various tissues throughout the body.
  • a tissue include, but are not limited to, a tissue in which stellate cells are present, a tissue in which fibrosis occurs, and a tissue in which stem cells are present.
  • Specific examples include, but are not limited to, liver, pancreas, kidney, intestine, lung, spleen, heart, bone marrow, vocal cord, skin, peritoneum, eye, and vascular.
  • the composition of the present invention is useful for tissue regeneration that occurs in damaged tissues or transplanted tissues.
  • Damaged tissue includes tissue that has undergone tissue destruction, inflammation, necrosis, fibrosis, surgical invasion, organ failure, and the like.
  • the administration time of the composition of the present invention is not particularly limited, but it is preferably administered within 4 days from the day of receiving the disorder or transplant, or within 1 day of receiving the disorder or transplant.
  • Tissue regeneration by the composition of the present invention may involve stem cell differentiation and / or proliferation.
  • tissue regeneration by the composition of the present invention may be accompanied by proliferation of tissue parenchymal cells.
  • Stem cell differentiation can be evaluated, for example, by detecting a cell marker specific to the differentiated cell, detecting a function of the differentiated cell, or the like.
  • Cell proliferation can be determined by various known methods such as counting the number of living cells over time, measuring the size, volume or weight of tissues, measuring the amount of DNA synthesis, WST-1 method, BrdU (bromodeoxyuridine) method. , 3 H thymidine incorporation method, and the like.
  • composition of the present invention can be used for a subject having a state in which tissue regeneration is suppressed.
  • the state in which tissue regeneration is suppressed includes, but is not limited to, for example, inflammation, necrosis, fibrosis, organ failure, decreased platelet count, genetic abnormality, decreased noradrenaline, and the like.
  • the compounding amount of the active ingredient in the composition of the present invention may be an amount that promotes tissue regeneration when the composition is administered. In addition, an amount that does not cause adverse effects exceeding the benefits of administration is preferred. Such an amount is known or can be appropriately determined by an in vitro test using cultured cells, or a test in a model animal such as a mouse, rat, dog or pig. Such a test method is well known to those skilled in the art. Are known.
  • the promotion of tissue regeneration can be evaluated by restoring the function, weight, size, etc. of the tissue by biochemical examination, X-ray, ultrasound, MRI, CT, endoscopic image diagnosis, or the like.
  • the compounding amount of the active ingredient may vary depending on the dosage form of the composition.
  • the amount of the active ingredient blended in one unit of the composition may be a plurality of the amount of the active ingredient necessary for one administration. it can. Those skilled in the art can appropriately adjust the blending amount.
  • the present invention also promotes tissue regeneration, including blending a component selected from the group consisting of activated stellate cells, activated stellate cell degradation products, MMP14, collagen treated with MMP14, and activated stellate secretions
  • the present invention relates to a method for producing a composition for use, the use of the component for producing a composition for promoting tissue regeneration, and the component used for promoting tissue regeneration.
  • Each component can be blended according to any known technique.
  • the present invention also relates to a method for promoting tissue regeneration in a subject, comprising the step of administering the above composition to a subject in need thereof.
  • the subject in the method may have a disorder in the tissue or have undergone a tissue transplant. Disorders include, but are not limited to, for example, tissue destruction, inflammation, necrosis, fibrosis, surgical invasion, organ failure, and the like. Administration of the composition may be, for example, within 4 days from the date of receiving the disorder or transplant, or within one day of receiving the disorder or transplant.
  • the present invention also provides for the differentiation and / or proliferation of stem cells comprising a component selected from the group consisting of activated stellate cells, activated stellate cell lysates, MMP14, collagen treated with MMP14 and activated stellate cell secretions.
  • a composition for the preparation a method for producing a composition for stem cell differentiation and / or proliferation, comprising combining the components, and a composition for producing the composition for stem cell differentiation and / or proliferation.
  • the component used for stem cell differentiation and / or proliferation, and a method for differentiating and / or proliferating the stem cell comprising the step of contacting the component with the stem cell.
  • Stem cells are not particularly limited and include, for example, tissue stem cells (somatic stem cells, adult stem cells), embryonic stem cells, iPS cells, and the like. Stem cells may be totipotent, pluripotent, pluripotent or unipotent. Examples of tissue stem cells include, but are not limited to, neural stem cells, hematopoietic stem cells, mesenchymal stem cells, hepatic stem cells, pancreatic stem cells, skin stem cells, muscle stem cells, and reproductive stem cells. Stem cells may be autologous or may be from other individuals of the same species or from different species. Differentiated and / or expanded stem cells can be transplanted into a subject in need thereof.
  • the above method may be performed in in vitro, in vivo or ex vivo.
  • Each component can be blended according to any known technique.
  • collagen particularly collagen I
  • the present invention also includes a composition for promoting cell proliferation, comprising a component selected from the group consisting of activated stellate cells, activated stellate cell degradation products, MMP14, collagen treated with MMP14, and activated stellate secretions.
  • a method for producing a composition for promoting cell growth comprising combining the components, use of the component for producing a composition for promoting cell growth, and use for promoting cell growth
  • the present invention relates to a method for promoting cell proliferation, comprising the step of bringing the component into contact with the cell.
  • the cell that promotes proliferation is not limited, and examples thereof include cells such as liver, pancreas, kidney, intestine, lung, spleen, heart, bone marrow, vocal cord, skin, peritoneum, eye, and blood vessel.
  • the cells may be autologous, other individuals of the same species, or of different species. Differentiated and / or expanded cells can be transplanted into a subject in need thereof.
  • the above method may be performed in in vitro, in vivo or ex vivo.
  • Each component can be blended according to any known technique.
  • collagen particularly collagen I
  • the present invention also includes a composition for inhibiting cell proliferation, comprising a substance that inhibits MMP14, a method for producing a composition for inhibiting cell proliferation, comprising combining the substance,
  • the present invention relates to the use of a composition for inhibiting cell proliferation, the substance used for inhibiting cell proliferation, and a method for inhibiting cell proliferation comprising a step of bringing the substance into contact with cells.
  • the present invention also includes a composition for treating a cell proliferative disease comprising a substance that suppresses MMP14, a method for producing a composition for treating a cell proliferative disorder, comprising combining the substance, Use of the substance in the manufacture of a composition for treating a cell proliferative disorder, the substance used for the treatment of a cell proliferative disorder, and a therapeutically effective amount of the substance administered to a subject in need thereof And a method for treating a cell proliferative disorder.
  • substances that inhibit MMP14 include, but are not limited to, drugs that inhibit production and / or activity of MMP14, drugs that promote degradation and / or inactivation of MMP14, and the like.
  • examples of the drug that inhibits the production of MMP14 include, but are not limited to, RNAi molecules, ribozymes, antisense nucleic acids, DNA / RNA chimera polynucleotides for DNA encoding MMP14, and vectors that express these.
  • MMP14 inhibition can be determined by the fact that the expression and activity of MMP14 are inhibited in the cells compared to the case where no MMP14 inhibitor was allowed to act.
  • the expression of MMP14 is not limited to any known method, for example, immunoprecipitation using an anti-MMP14 antibody, EIA, ELISA, IRA, IRMA, Western blotting, immunohistochemistry, immunocytochemistry, Various hybridization methods, Northern blotting methods using nucleic acids that specifically hybridize to a nucleic acid that specifically encodes a nucleic acid encoding MMP14 or a unique fragment thereof or a transcription product (eg, mRNA) or a splicing product of the nucleic acid. , Southern blotting, various PCR methods and the like.
  • an RNAi molecule refers to any molecule that causes RNA interference, including but not limited to siRNA (small interfering RNA), miRNA (micro RNA), shRNA (short hairpin RNA), ddRNA (DNA- directed RNA), piRNA (Piwi-interacting RNA), double-stranded RNA such as rasiRNA (repeat associated siRNA), and variants thereof.
  • siRNA small interfering RNA
  • miRNA miRNA
  • micro RNA miRNA
  • shRNA short hairpin RNA
  • ddRNA DNA- directed RNA
  • piRNA piRNA
  • double-stranded RNA such as rasiRNA (repeat associated siRNA)
  • Antisense nucleic acid as used herein includes RNA, DNA, PNA, or a composite thereof.
  • a DNA / RNA chimeric polynucleotide is not limited, for example, a double-stranded polynucleotide comprising DNA and RNA that inhibits expression of a target gene described in JP-A-2003-219893. Including.
  • Examples of the cells that suppress the growth include, but are not limited to, cells that are adversely affected by the growth, cells that are involved in the disease. Specific examples include tumor cells, cancer cells, activated stellate cells, and the like. A substance that suppresses MMP14 may be administered to these cells, or may be administered to MMP14-expressing cells that assist the growth of these cells, such as CAF (cancer-associated fibroblasts).
  • Examples of cell proliferative diseases include, but are not limited to, benign or malignant tumors, hyperplasias, keloids, Cushing syndrome, primary aldosteronism, erythema, polycythemia vera, leukoplakia, hyperplastic scars, flatness Examples include lichen and melanosis.
  • the active ingredient in the various compositions, methods, etc. of the invention described herein is a nucleic acid, such as an RNAi molecule, ribozyme, antisense nucleic acid, DNA / RNA chimeric polynucleotide, etc.
  • a nucleic acid such as an RNAi molecule, ribozyme, antisense nucleic acid, DNA / RNA chimeric polynucleotide, etc.
  • the vector any known vector such as a plasmid vector, a phage vector, a phagemid vector, a cosmid vector, or a virus vector can be used.
  • the vector preferably includes at least a promoter that enhances the expression of the nucleic acid carried, and in this case, the nucleic acid is preferably operably linked to such a promoter.
  • Nucleic acid operably linked to a promoter means that the nucleic acid and the promoter are arranged so that the protein encoded by the nucleic acid is appropriately produced by the action of the promoter.
  • the vector may or may not be replicable in the host cell, and transcription of the gene may be performed outside or inside the nucleus of the host cell. In the latter case, the nucleic acid may be integrated into the genome of the host cell.
  • the active ingredient can also be supported on various non-viral lipids or protein carriers.
  • examples of such carriers include, but are not limited to, cholesterol, liposomes, antibody protomers, cyclodextrin nanoparticles, fusion peptides, aptamers, biodegradable polylactic acid copolymers, polymers, and the like, and increase the efficiency of incorporation into cells.
  • cationic liposomes and polymers for example, polyethyleneimine
  • polymers useful as such carriers include those described in US ⁇ ⁇ ⁇ 2008/0207553, US 2008/0312174, and the like.
  • compositions of the present invention described in the present specification can be used for medical applications such as tissue regeneration in the living body and treatment of diseases. Therefore, the various compositions of the present invention can be made into pharmaceutical compositions.
  • the active ingredient may be combined with other optional ingredients as long as the effect of the active ingredient is not hindered.
  • optional components include other chemotherapeutic agents, pharmacologically acceptable carriers, excipients, diluents and the like.
  • the composition may be coated with an appropriate material such as an enteric coating or a time-disintegrating material. It may be incorporated.
  • compositions (including various pharmaceutical compositions) of the present invention described herein can be produced by a variety of routes including both oral and parenteral, including, but not limited to, oral, intravenous, intramuscular. , Subcutaneous, topical, intratumoral, rectal, intraarterial, intraportal, intraventricular, transmucosal, transdermal, intranasal, intraperitoneal, intrapulmonary, and intrauterine routes. It may be formulated into a dosage form suitable for the above. Any known dosage form and formulation method can be adopted as appropriate (see, for example, Standard Pharmaceutical Sciences, Yoshiaki Watanabe, Nankodo, 2003, etc.).
  • dosage forms suitable for oral administration include, but are not limited to, powders, granules, tablets, capsules, solutions, suspensions, emulsions, gels, syrups, etc.
  • Suitable dosage forms include injections such as solution injections, suspension injections, emulsion injections, and injections prepared at the time of use.
  • Formulations for parenteral administration can be in the form of grafts, aqueous or non-aqueous isotonic sterile solutions or suspensions.
  • compositions (including various pharmaceutical compositions) of the present invention described in the present specification may be targeted to specific tissues or cells. Targeting can be accomplished by any known technique. When intended for delivery to cancer, it is not limited, for example, passive by making the formulation 50 to 200 ⁇ m in diameter suitable for the expression of EPR (enhanced permeability and retention) effect, particularly 75 to 150 ⁇ m. Targeting, CD19, HER2, transferrin receptor, folate receptor, VIP receptor, EGFR (Torchilin, AAPS J.
  • RAAG10 (Special Table 2005-532050), PIPA (Special Table 2006-506071), ligands such as KID3 (special table 2007-529197), peptides having RGD motif or NGR motif, F3, LyP-1 (Ruoslahti et al., J Cell Biol. 2010; 188 (6): 759-68) can be used as a targeting agent.
  • ligands such as KID3 (special table 2007-529197), peptides having RGD motif or NGR motif, F3, LyP-1 (Ruoslahti et al., J Cell Biol. 2010; 188 (6): 759-68) can be used as a targeting agent.
  • a carrier containing retinoids as targeting agents can also be used.
  • such carriers are described in WO 2009/036368, WO ⁇ ⁇ 2010/014117, WO ⁇ ⁇ 2012/170952, and the like.
  • compositions (including various pharmaceutical compositions) of the present invention described in the present specification may be supplied in any form, but from the viewpoint of storage stability, a form that can be prepared at the time of use, for example, medical It may be provided in a form that can be prepared by a doctor and / or pharmacist, nurse, or other paramedical at or near the site. Such a form is particularly useful when the composition of the present invention contains components that are difficult to stably store, such as lipids, proteins, and nucleic acids.
  • the composition of the present invention is provided as one or more containers comprising at least one of the essential components thereof, and is used before use, for example, within 24 hours, preferably 3 hours before. Within, and more preferably just before use. In the preparation, reagents, solvents, dispensing devices and the like that are usually available at the place of preparation can be appropriately used.
  • the present invention provides a preparation kit for a composition
  • a preparation kit for a composition comprising one or more containers, alone or in combination, containing the active ingredients that can be included in the various compositions of the present invention, as well as the form of such a kit. And the necessary constituents of the various compositions provided in.
  • the kit of the present invention may contain instructions describing how to prepare and administer the various compositions of the present invention, such as instructions, electronic recording media such as CDs and DVDs, and the like.
  • the kit of this invention may contain all the components for completing the various compositions of this invention, it does not necessarily need to contain all the components. Therefore, the kit of the present invention may not contain reagents and solvents that are usually available at medical sites, experimental facilities, etc., such as sterile water, physiological saline, and glucose solution.
  • the effective amount in the various methods of the present invention described in the present specification may be an amount that promotes tissue regeneration or eliminates delay in tissue regeneration, for example, with respect to tissue regeneration. With respect to the treatment of, it may be an amount that reduces the symptoms of the disease or delays or stops the progression of the disease, preferably an amount that suppresses or cures the disease. In addition, an amount that does not cause adverse effects exceeding the benefits of administration is preferred. Such an amount can be appropriately determined by an in vitro test using cultured cells or the like and a test in a model animal such as a mouse, rat, dog or pig, and such a test method is well known to those skilled in the art. . Moreover, the dose of the drug used in the treatment method of the present invention is known to those skilled in the art, or can be appropriately determined by the above-described test or the like.
  • the specific dose of the active ingredient administered in the treatment method of the present invention described herein depends on various conditions relating to the subject requiring treatment, such as the presence or absence of a state that inhibits regeneration, the severity of symptoms, the subject General health status, age, weight, subject sex, diet, timing and frequency of administration, medications used in combination, responsiveness to treatment, dosage form, compliance with treatment, and the like.
  • Administration routes include various routes including both oral and parenteral, such as oral, intravenous, intramuscular, subcutaneous, topical, intratumoral, rectal, intraarterial, intraportal, intraventricular, transmucosal, Routes such as transdermal, intranasal, intraperitoneal, intrapulmonary and intrauterine are included.
  • the frequency of administration varies depending on the properties of the agent and composition used and the conditions of the subject including the above, but for example, many times a day (ie, 2, 3, 4 or 5 times a day), 1 day a day Times, every few days (ie every 2, 3, 4, 5, 6, 7 days, etc.), every week, every few weeks (ie every 2, 3, 4 weeks, etc.).
  • the term “subject” means any living individual, preferably an animal, more preferably a mammal, more preferably a human individual.
  • a subject may be healthy or suffer from some disease, but when treatment of a specific disease is intended, typically the subject is suffering from such disease.
  • treatment as used herein also encompasses all types of medically acceptable prophylactic and / or therapeutic interventions intended to cure, temporarily ameliorate, or prevent disease. Shall.
  • the term “treatment” encompasses medically acceptable interventions for various purposes, including delaying or stopping the progression of a disease, regression or disappearance of a lesion, prevention of onset or prevention of recurrence, and the like.
  • the present invention also relates to a cell culture substrate comprising collagen treated with MMP14.
  • the collagen treated with MMP14 is as described above for various compositions.
  • the cell culture substrate of the present invention serves as a scaffold for cell growth, and may take various forms such as membranes and gels.
  • the cell culture substrate is preferably sterile, but may be provided in a non-sterile state and sterilized at the time of use.
  • the cell culture substrate of the present invention may be used for coating a cell culture container.
  • the coating concentration is not limited.
  • the collagen concentration may be 0.01 to 1000 ⁇ g / cm 2 , 0.1 to 100 ⁇ g / cm 2 , 1 to 50 ⁇ g / cm 2 , or 5 to 25 ⁇ g / cm 2. Good.
  • the present invention also relates to a cell culture substrate preparation kit containing collagen treated with MMP14 or MMP14 and collagen.
  • the kit includes instructions for using collagen treated with MMP14 as a cell culture substrate, instructions for treating collagen with MMP14, such as instructions, electronic recording media such as CDs and DVDs, etc. Etc. may be included.
  • the invention also relates to a cell culture vessel coated with collagen treated with MMP14.
  • Any known cell culture vessel can be used.
  • the cell culture container of the present invention may be produced by coating a cell culture container with collagen treated with MMP14, or may be produced by treating collagen previously coated on a cell culture container with MMP14.
  • MMP14 used for the treatment may be attached to the cell membrane or may be released from the cell membrane.
  • the treatment of collagen may include culturing cells that express MMP14, such as activated stellate cells, in a cell culture vessel coated with collagen.
  • the cells expressing MMP14 used for the collagen treatment may be removed after the treatment, or may be left in the cell culture vessel as it is, and cells to be proliferated may be added thereto.
  • This cell culture container is excellent in cell growth ability and can be used to promote cell culture.
  • a cell culture vessel further containing stellate cells can be used for stem cell differentiation induction.
  • the collagen coating concentration is not limited, and may be, for example, 0.01 to 1000 ⁇ g / cm 2 , 0.1 to 100 ⁇ g / cm 2 , 1 to 50 ⁇ g / cm 2 , and 5 to 25 ⁇ g / cm 2 .
  • the present invention also relates to a kit for producing a cell culture container coated with collagen treated with MMP14 or collagen treated with MMP14, which contains MMP14 and collagen.
  • the kit includes information including information for coating the cell culture container with collagen treated with MMP14, information for treating collagen coated on the cell culture container with MMP14, such as instructions, CD, An electronic recording medium such as a DVD may be included.
  • the kit of the present invention may include a cell culture container, but a commercially available cell culture container may be separately prepared and used.
  • the present invention further includes a step of coating a cell culture vessel with collagen treated with MMP14, or a step of treating collagen coated on the cell culture vessel with MMP14, and a cell culture vessel coated with collagen treated with MMP14 It relates to the manufacturing method.
  • MMP14 used for the treatment may be attached to the cell membrane or may be released from the cell membrane.
  • the step of treating the collagen coated on the cell culture container with MMP14 involves culturing cells expressing MMP14, such as activated stellate cells, in the cell culture container coated with collagen, Contacting the coated collagen with a degradation product of cells expressing MMP14.
  • Example 1 Preparation of VA-lip siRNA
  • siRNA Targeting the base sequence of gp46 GenBank Accession No. M69246, SEQ ID NO: 1
  • a rat homologue of human HSP47 a common molecular chaperone of collagen (types I to IV)
  • sense strand and antisense strand of siRNA were used.
  • siRNArandom (sometimes referred to as siRNA scramble).
  • C CGAUUCCGCUAGACCGGCUUCAUUGCAG (sense strand siRNA, SEQ ID NO: 4)
  • D GCAAUGAAGCCGGUCUAGCGAAUCGAU (antisense strand siRNA, SEQ ID NO: 5)
  • a sense strand with 6'-carboxyfluorescein (6-FAM) or fluorescein isothiocyanate (FITC) bound to the 5 'end was used. These sequences were confirmed to have no homology with other known rat mRNAs in BLAST searches.
  • VA-lip siRNA As cationic lipids, O, O′-ditetradecanoyl-N- ( ⁇ -trimethylammonioacetyl) diethanolamine chloride (DC-6-14), cholesterol and dioleylphosphatidylethanol Cationic liposomes (Lipotrust) containing amine (DOPE) in a molar ratio of 4: 3: 3 were purchased from Hokkaido System Science (Sapporo, Japan). Liposomes were prepared at a concentration of 1 mM (DC-6-14) by adding double-distilled water (DDW) under stirring conditions to the lyophilized lipid mixture prior to use.
  • DC-6-14 O, O′-ditetradecanoyl-N- ( ⁇ -trimethylammonioacetyl) diethanolamine chloride (DC-6-14), cholesterol and dioleylphosphatidylethanol Cationic liposomes (Lipotrust) containing amine (DOPE) in a molar ratio of 4: 3: 3 were purchased from Hokkaido
  • VA-bound liposomes 200 nmol of vitamin A (retinol, Sigma, USA) dissolved in DMSO and liposome suspension (100 nmol as DC-6-14) were stirred at 25 ° C. in a 1.5 ml tube. Mixed.
  • siRNAgp46 siRNAgp46 solution
  • the molar ratio of siRNA to DC-6-14 was 1: 11.5, and the molar ratio of vitamin A, DC-6-14 and siRNA was 11.5: 11.5: 1.
  • PBS phosphate buffered saline
  • Example 2 Effects of VA-lip siRNAgp46 administration on liver regeneration in partially hepatectomized rats (1) Preparation and treatment of partially hepatectomized rats The partially hepatectomized rats were male SD rats (150-200 g) (Slc Japan, Shizuoka, Japan) was prepared by excising the left lobe and middle lobe of about 70% of the whole liver.
  • VA-lip siRNAgp46 group I
  • VA-lip siRNA scramble mouse control, group II
  • glucose siRNA-free control, group III
  • Each siRNA was used at 0.75 mg / kg relative to the rat body weight.
  • the liver of the partially hepatectomized rat was collected 24 hours after the completion of the third and fifth administrations (that is, on the fifth and tenth days after partial hepatectomy).
  • the collected liver was observed for appearance and weighed and then embedded using an OCT compound to prepare a frozen section.
  • the obtained sections were fixed with 4% paraformaldehyde (PFA), then blocked with PBS containing 5% goat serum, washed with PBS, and then Cy3-labeled anti- ⁇ smooth muscle actin ( ⁇ -SMA) antibody (Sigma).
  • PFA paraformaldehyde
  • ⁇ -SMA Cy3-labeled anti- ⁇ smooth muscle actin
  • the reaction was carried out overnight at 4 ° C. using anti-Ki-67 antibody (Dako) or anti-CD133 antibody.
  • FIG. 2 shows the appearance of the liver of each group collected on the 5th and 10th days after partial hepatectomy in comparison with the liver before and after partial hepatectomy.
  • FIG. 3 shows changes in liver weight of each group collected. As can be seen from both figures, the liver already recovered in size and weight before excision on day 5 in groups II and III, but in group I administered VA-lip siRNAgp46, even after 10 days after excision. Liver size and weight did not recover.
  • Ki67 positive cells in group I were more prominent than other groups (group II and group III) that had also undergone partial hepatectomy. ( Figures 6 and 7).
  • the number of Ki67 positive cells in group II and group III is significantly larger than that of normal liver tissue that has not undergone partial hepatectomy, and Ki67 is a marker for cell proliferation. It shows that vigorous cell growth occurs.
  • CD133 positive cells in group I were more prominent than other groups (group II and group III) that had also undergone partial hepatectomy. It has become clear that the number is low (Fig. 8). Since CD133 is a stem cell marker, this result indicates that proliferation of stem cells was remarkably suppressed by VA-lip siRNAgp46. In consideration of the above-mentioned staining results, the proliferation of cells including stem cells in liver tissue was suppressed by apoptosis of ⁇ -SMA positive cells. In other words, ⁇ -SMA positive cells were partially excised from liver. It shows that it is indispensable for cell proliferation in liver tissue for subsequent tissue regeneration, especially for stem cell proliferation.
  • Example 3 Effects of VA-lip siRNAgp46 administration time on liver regeneration in partially hepatectomized rats
  • Group A no treatment (no treatment control group)
  • Group B 5% glucose (solvent control group)
  • Group C VA-lip siRNA scramble (mock control group)
  • Group D VA-lip siRNAgp46 (test group)
  • VA-lip siRNAgp46 and VA-lip siRNA scramble were the same as those prepared in Example 1.
  • Groups B to D were administered each dose in a volume of 300 ⁇ l / dose for a total of 6 times every other day (ie, on days 0, 2, 4, 6, 8, and 10 after partial hepatectomy), , Total 4 times (ie 4, 6, 8 and 10 days after partial hepatectomy).
  • Each siRNA was used at 0.75 mg / kg relative to the rat body weight.
  • the liver of the partially hepatectomized rat was collected 24 hours after the sixth administration (fourth for the E group) was completed (that is, 11 days after the partial hepatectomy).
  • the collected liver was observed for appearance and weighed and then embedded using an OCT compound to prepare a frozen section.
  • the obtained sections were fixed with 4% paraformaldehyde, then blocked with PBS containing 5% goat serum, washed with PBS, and then washed with Cy3-labeled ⁇ -smooth muscle actin ( ⁇ -SMA) antibody (Sigma).
  • the reaction was allowed to proceed overnight at 0 ° C. After washing with PBS, sealed with ProLong (R) Gold with DAPI ( Invitrogen), it was observed by the fluorescence microscope.
  • FIGS. 10 and 11 show the appearance and weight of each group collected in (2) in comparison with the liver immediately after partial hepatectomy (day 0), respectively.
  • the liver recovered size and weight before excision in groups AC and E, but in group D, which received VA-lip siRNAgp46 from day 0, 11 days after excision.
  • liver size and weight did not recover.
  • VA-lip siRNAgp46 was administered at an early stage of tissue regeneration. It became clear that it should be.
  • Example 4 Temporal Change in Number of ⁇ -SMA Positive Cells in Liver Tissue after Partial Hepatectomy
  • Livers were collected from partially hepatectomized rats at 0, 1, 2, 3, 4, 5 or 6 days after partial hepatectomy.
  • the collected liver tissue was embedded using an OCT compound to prepare a frozen section.
  • the obtained sections were fixed with 4% paraformaldehyde, then blocked with PBS containing 5% goat serum, washed with PBS, and then washed with Cy3-labeled ⁇ -smooth muscle actin ( ⁇ -SMA) antibody (Sigma).
  • the reaction was allowed to proceed overnight at 0 ° C. After washing with PBS, sealed with ProLong (R) Gold with DAPI ( Invitrogen), it was observed by the fluorescence microscope.
  • Example 5 Involvement of stellate cells in stem cell differentiation (1) Preparation of cells As stellate cells, hepatic stellate cells collected from SD rat liver were used. That is, first, SD rats were perfused with an EGTA solution and a collagenase solution, and then the liver was collected, and the collected liver was cut into small pieces and filtered with a cell strainer (pore diameter: 100 ⁇ m). HBSS + 0.25% BSA (Bovine Serum Albumin) solution was added to the resulting cell suspension, and the mixture was centrifuged at 4 ° C. and 500 rpm for 2 minutes. The supernatant was collected and centrifuged at 4 ° C. and 1300 rpm for 5 minutes.
  • BSA Bovine Serum Albumin
  • HBSS + 0.25% BSA solution was added, and 28.7% Nycodenz solution (Axis Shield, Oslo, Norway) was added and mixed so that the concentration of Nycodenz was 13.2%.
  • Nycodenz solution Analog to Crystal
  • DMEM Dulbecco's Modified Eagle's medium
  • FBS fetal bovine serum
  • the cells on the first day of culture were quiescent hepatic stellate cells (qHSC), and the cells that had been subcultured on the fifth day of culture and further cultured for two days were called activated hepatic stellate cells (aHSC) (FIG. 14). .
  • qHSC quiescent hepatic stellate cells
  • aHSC activated hepatic stellate cells
  • hepatic stem cells collected from the liver of a 4-week-old GFP gene-introduced rat were used.
  • an EGTA solution and a collagenase solution were perfused into a GFP gene-introduced rat, and then the liver was collected, and the collected liver was cut into pieces and then filtered with a cell strainer (pore size: 100 ⁇ m).
  • Hank's balanced salt solution (HBSS) + 0.25% bovine serum albumin (BSA) solution was added to the obtained cell suspension and centrifuged at 4 ° C. and 500 rpm for 2 minutes. The supernatant was collected and centrifuged at 4 ° C. and 1300 rpm for 5 minutes.
  • HBSS Hank's balanced salt solution
  • BSA bovine serum albumin
  • MACS® Magnetic Activating Cell Sorting buffer (Miltenyi Biotec, Auburn, CA, USA) was added to the precipitate and mixed. After counting the number of cells, MACS (R) was performed using FITC-conjugated mouse anti-CD45 antibody (BD Pharmingen), rabbit polyclonal anti-CD133 antibody (Abcam) and mouse monoclonal anti-EpCAM antibody (Santa Cruz), and CD133 positive, EpCAM positive CD45 negative cells were collected and used as rat hepatic stem cells in this experiment.
  • hepatic stem cells were cultured in the same manner in the absence of aHSC.
  • immunostaining was performed with an antibody against albumin which is a hepatocyte marker (rabbit polyclonal, MP Biomedicals), and a GFP / albumin positive colony was photographed at a magnification of 100 using an inverted microscope (Nikon).
  • the number of GFP / albumin positive colonies was counted based on the obtained images, and the area was calculated using NIS-Elements software (Nikon) (FIGS. 15 to 18).
  • the cell culture insert containing aHSC was inserted into a well of a 24-well plate and co-cultured in an incubator at 37 ° C. and 5% CO 2 for 10 days (as a medium, DME / F12 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium / Nutrient F-12 Ham) + 10% FBS + ITS (using 10 mg / l insulin, 5.5 mg / l transferrin, 0.67 ⁇ g / l selenium) +0.1 ⁇ M dexamethasone + 10 mM nicotinamide + 50 ⁇ g / ml ⁇ -mercaptoethanol + 2 mM L-glutamine + 5 mM Hepes) .
  • a control only hepatic stem cells were cultured in the same manner in the absence of aHSC.
  • Example 6 Change in DNA synthesis over time in liver tissue after partial hepatectomy
  • rats with partial hepatectomy were prepared.
  • rats were injected intraperitoneally with BrdU at a concentration of 100 ⁇ g / g body weight.
  • Liver tissue was collected 3 hours after BrdU administration.
  • the collected liver tissue was fixed with 10% formalin and embedded in paraffin.
  • the paraffin-embedded liver tissue was cut into 5 ⁇ m-thick sections, activated with 10 mM citrate buffer at 120 ° C. for 20 minutes, and then blocked with 5% goat serum.
  • mouse monoclonal anti-BrdU antibody (MBL) was reacted at 37 ° C. for 60 minutes. After the section was washed with PBS, Alexa488-labeled goat anti-mouse IgG (Invitrogen) was reacted at 37 ° C. for 60 minutes. After washing with PBS, it was encapsulated using an encapsulant containing DAPI, and BrdU incorporation in the liver tissue was observed. The results are shown in FIG.
  • BrdU was injected intraperitoneally at a concentration of 100 ⁇ g / g body weight into the rats subjected to partial hepatectomy. .
  • the cell suspension was adjusted with Hanks solution (Invitrogen) containing 0.25% BSA so that the cell concentration was 1 ⁇ 10 7 cells / 100 ⁇ l, and APC-labeled mouse monoclonal anti-BrdU antibody (BioLegends) was added. , Reacted at 37 ° C.
  • BrdU was injected intraperitoneally at a concentration of 100 ⁇ g / g body weight into rats subjected to partial hepatectomy. did.
  • FIGS. 23 and 24 show that the proliferation of hepatocytes gradually decreases after peaking one day after partial hepatectomy.
  • the proliferation of whole cells present in the liver including hepatocytes has two peaks after 1 day and 3 days after partial hepatectomy, and the first peak after 1 day is the proliferation of hepatocytes.
  • the second peak after 3 days is considered to be due to proliferation of cells other than hepatocytes, such as stem cells.
  • Example 7 Involvement of stellate cells in hepatocyte proliferation (1) Co-culture of hepatocytes and stellate cells To evaluate the effect of stellate cells on hepatocyte proliferation, co-culture of hepatocytes and stellate cells was performed. It was. The aHSC obtained in Example 5 was seeded in a 60 mm dish at a concentration of 1 ⁇ 10 5 cells, and cultured at 37 ° C., 5% CO 2 for 24 hours using 10% FBS-added DMEM. At 24 hours of culture, the medium was removed, and Opti-MEM I reducing medium (Invitrogen) was added, and precultured until ready for siRNA transfection.
  • Opti-MEM I reducing medium Invitrogen
  • siRNA was mixed with RNAiMAX (Invitrogen) to a final concentration of 10 nM and allowed to stand at room temperature for 15 minutes to obtain a siRNA complex.
  • the siRNA used is as follows. GFP siRNA (Ambion, Silencer GFP siRNA, Cat. No. AM4626) Scramble siRNA: as described in Example 1 gp46 siRNA: as described in Example 1
  • siRNA complex was added to the pre-cultured aHSC and cultured at 37 ° C., 5% CO 2 for 5 hours. At 5 hours of culture, the medium was replaced with DMEM supplemented with 10% FBS, and cultured at 37 ° C., 5% CO 2 for 48 hours. At 48 hours of culture, the medium was removed and Opti-MEM I reducing medium was added and pre-cultured until ready for siRNA transfection.
  • SiRNA (GFP siRNA, Scramble siRNA, gp46 siRNA) was mixed with RNAiMAX to a final concentration of 10 nM and allowed to stand at room temperature for 15 minutes.
  • siRNA complex was added to the pre-cultured aHSC and cultured at 37 ° C., 5% CO 2 for 5 hours. After 5 hours of culture, the medium was removed, washed with PBS, and HSCs were collected using a trypsin-EDTA solution.
  • the collected HSCs were collected from the liver of a GFP gene-introduced rat in advance and seeded at a concentration of 5 ⁇ 10 4 on a 35 mm dish coated with collagen I at a concentration of 5 ⁇ 10 4 / dish.
  • the cells were cultured at 37 ° C. and 5% CO 2 for 48 hours.
  • the medium was replaced with DME / F12 medium containing 10 mM BrdU and 10% FBS, and the cells were further cultured at 37 ° C. and 5% CO 2 for 24 hours.
  • the medium was removed, washed with PBS, 4% PFA was added, and the mixture was fixed at room temperature for 30 minutes. After fixation, the plate was washed with PBS, and permeabilized by adding PBS containing 0.2N HCl and 0.1% Triton X-100.
  • Example 8 Effect of variously treated collagen on proliferation of hepatocytes
  • Rat tail-derived collagen I (Sigma) at a concentration of 10 ⁇ g / cm 2 A 60 mm dish was coated.
  • denatured collagen I rat tail-derived collagen I was treated at 60 ° C. for 30 minutes and coated on a 60 mm dish at a concentration of 10 ⁇ g / cm 2 .
  • MMP14-treated collagen I comprises rat tail-derived collagen I containing active MMP14 (R & D System) (0.1 ⁇ g / ml trypsin 3 (Recombinant Human Active Trypsin 3, R & D systems, Cat. No. 3714-SE), 50 mM.
  • Tris 0.15 M NaCl, 10 mM CaCl 2 , 5 ⁇ M ZnCl 2 , 0.05% (v / v) Brij 35, pH 7.5) was used for reaction at room temperature for 20 hours.
  • MMP14-treated collagen I was coated on a 60 mm dish at a concentration of 10 ⁇ g / cm 2 .
  • Hepatocytes were collected from rat liver, seeded at a concentration of 2 ⁇ 10 5 cells / dish, and cultured at 37 ° C. and 5% CO 2 for 48 hours. At 48 hours of culture, the medium was replaced with DME / F12 medium containing 10 ⁇ M BrdU and 10% FBS, and the cells were further cultured at 37 ° C.
  • the aHSC obtained in Example 5 was seeded in a 60 mm dish at a concentration of 1 ⁇ 10 5 cells, and cultured at 37 ° C., 5% CO 2 for 24 hours using 10% FBS-added DMEM. At 24 hours of culture, the medium was removed, and Opti-MEM I reducing medium (Invitrogen) was added, and precultured until ready for siRNA transfection.
  • siRNA was mixed with RNAiMAX (Invitrogen) to a final concentration of 10 nM and allowed to stand at room temperature for 15 minutes to obtain a siRNA complex.
  • the siRNA used is as follows. GFP siRNA (Ambion, Silencer GFP siRNA, Cat. No.
  • MMP14 siRNA Sense strand: 5′-GUCAUUCAUGGGUAGCGATT-3 ′ (SEQ ID NO: 6) Antisense strand: 5′-UCGCUACCCAUGAAUGAGCCT-3 ′ (SEQ ID NO: 7) HGF siRNA: Sense strand: 5′-AUAUCUUUCCGGCAAGAAUUUGUGC-3 ′ (SEQ ID NO: 8) Antisense strand: 5′-GCACAAAUUCUGCCCGGAAAGAUAU-3 ′ (SEQ ID NO: 9)
  • the siRNA complex was added to the pre-cultured aHSC and cultured at 37 ° C., 5% CO 2 for 5 hours. At 5 hours of culture, the medium was replaced with DMEM supplemented with 10% FBS, and cultured at 37 ° C., 5% CO 2 for 48 hours. At 48 hours of culture, the medium was removed and Opti-MEM I reducing medium was added and pre-cultured until ready for siRNA transfection.
  • SiRNA GFP siRNA, MMP14 siRNA, HGF siRNA
  • RNAiMAX RNAiMAX
  • the siRNA complex was added to the pre-cultured aHSC and cultured at 37 ° C., 5% CO 2 for 5 hours. After 5 hours of culture, the medium was removed, washed with PBS, and HSCs were collected using a trypsin-EDTA solution.
  • the collected HSCs were collected from the liver of a GFP gene-introduced rat in advance and seeded at a concentration of 5 ⁇ 10 4 on a 35 mm dish coated with collagen I at a concentration of 5 ⁇ 10 4 / dish.
  • the cells were cultured at 37 ° C. and 5% CO 2 for 48 hours.
  • the medium was replaced with DME / F12 medium containing 10 mM BrdU and 10% FBS, and the cells were further cultured at 37 ° C. and 5% CO 2 for 24 hours.
  • the medium was removed, washed with PBS, 4% PFA was added, and the mixture was fixed at room temperature for 30 minutes. After fixation, the plate was washed with PBS, and permeabilized by adding PBS containing 0.2N HCl and 0.1% Triton X-100.
  • MMP14 expressed by aHSC is involved in promoting the proliferation of hepatocytes by aHSC, and the contribution exceeds that of HGF, which is known as a key factor for promoting proliferation of hepatocytes. Recognize.
  • Example 10 Effect of RGD sequence on MMP14-treated collagen on hepatocyte proliferation
  • Rat hepatocytes collected from GFP gene-introduced rat liver were seeded in DME / F12 medium at a concentration of 2 ⁇ 10 5 cells / ml.
  • Peptide control peptide (H-Gly-Arg-Gly-Glu-Glu-Ser-OH, Peptides International, Cat. No. PFA-3907-PI): 500 ⁇ g / ml
  • GRGDS peptide Peptide Institute, Cat. No. 4189-v
  • 100 ⁇ g / ml, 200 ⁇ g / ml, and 500 ⁇ g / ml were added and reacted at 37 ° C.
  • rat hepatocytes were seeded at a concentration of 5 ⁇ 10 4 cells / dish in a 35 mm dish coated with collagen I treated with MMP14, and in DME / F12 medium containing 10 mM BrdU and 10% fetal bovine serum. The cells were cultured at 37 ° C. and 5% CO 2 for 72 hours. After completion of the culture, the medium was removed, washed with PBS, 4% PFA was added, and the mixture was fixed at room temperature for 30 minutes. After fixation, the plate was washed with PBS, and permeabilized by adding PBS containing 0.2N HCl and 0.1% Triton X-100.

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Abstract

　本発明は、新規な組織再生促進剤および組織再生促進方法の提供を目的とする。　本発明は、活性化星細胞、活性化星細胞分解物、ＭＭＰ１４、ＭＭＰ１４で処理したコラーゲンおよび活性化星細胞分泌物からなる群から選択される成分を含む、組織再生促進、細胞分化促進および／または細胞増殖促進のための組成物、ＭＭＰ１４抑制物質を含む細胞増殖抑制のための組成物、ＭＭＰ１４で処理したコラーゲンを含む細胞培養基材等に関する。

Description

組織再生促進剤
　本発明は活性化星細胞、活性化星細胞分解物、ＭＭＰ１４、ＭＭＰ１４で処理したコラーゲンおよび活性化星細胞分泌物からなる群から選択される成分を含む、組織再生促進、細胞分化促進および／または細胞増殖促進のための組成物、ＭＭＰ１４抑制物質を含む細胞増殖抑制のための組成物、ＭＭＰ１４で処理したコラーゲンを含む細胞培養基材等に関する。
　生体の組織は、損傷を受けると、損傷部分を補うように再生し、その機能を回復しようとする。例えば肝臓は、その半分以上を切除しても、短期間で再生して、ほぼ元の大きさおよび機能を回復することが知られている。組織再生に関する研究は、肝臓を中心に古くから行われており、種々の知見が報告されているが、組織再生の詳細なメカニズムについては依然不明なところが多い。組織の再生には複数の種類の細胞が複雑に関わり合っていると考えられているが、これらの細胞のいずれが主要な役割を担っているのかについてさえ、決定的な見解は得られていない。
　組織再生メカニズムの解明は、組織染色や細胞染色などによる損傷組織の経時変化や、種々の生理活性物質の組織再生に及ぼす影響などを解析することによって進められている。例えば、非特許文献１には、マウス肝部分切除モデルにおいて、特定のフェノタイプの肝類洞内皮細胞が、VEGFR2（vascular endothelial growth factor-A receptor-2）を介した内皮細胞特異的転写因子であるId1の上方調節により肝細胞の増殖を引き起し、次いで内皮細胞自身が増殖することで、肝臓の再生が行われるという仮説が示されている。
　しかしながら、精力的な研究にも拘らず、組織再生に係る機構は未だそのごく一部が明らかにされているにすぎず、さらなる研究努力が求められている。
Ding et al., Nature. 2010 Nov 11;468(7321):310-5
　本発明は、新規な組織再生促進剤および組織再生促進方法の提供を目的とする。
　本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を進める中で、活性化星細胞が組織の再生に重要な役割を果していること、活性化星細胞の分泌物が組織再生の核となる幹細胞の増殖および分化を誘導すること、活性化星細胞が発現するＭＭＰ１４の作用を受けたコラーゲンが組織実質細胞の増殖を誘導すること、および、この増殖の誘導にコラーゲンに存在するＲＧＤ配列が関与することをそれぞれ見出し、本発明を完成させた。
　すなわち、本発明は以下に関する。
（１）活性化星細胞、活性化星細胞分解物、ＭＭＰ１４、ＭＭＰ１４で処理したコラーゲンおよび活性化星細胞分泌物からなる群から選択される成分を含む、組織再生を促進するための組成物。
（２）組織再生が、障害組織または移植組織において生じる、（１）に記載の組成物。
（３）障害または移植を受けた日から４日以内に投与される、（２）に記載の組成物。
（４）障害または移植を受けた日から１日以内に投与される、（２）に記載の組成物。
（５）障害が、組織破壊、炎症、壊死、線維化、手術的侵襲、臓器不全からなる群から選択される、（２）～（４）のいずれかに記載の組成物。
（６）組織再生が組織幹細胞の分化および／または増殖を伴う、（１）～（５）のいずれかに記載の組成物。
（７）組織再生が組織実質細胞の増殖を伴う、（１）～（６）のいずれかに記載の組成物。
（８）活性化星細胞が、ＨＧＦ、ＥＧＦ、ＭＭＰ１４からなる群から選択されるタンパク質の発現を増大させる処置を施されたものである、（１）～（７）のいずれかに記載の組成物。
（９）組織再生が抑制された状態を有する対象に対して用いる、（１）～（８）のいずれかに記載の組成物。
（１０）組織再生が抑制された状態が、炎症、壊死、線維化、臓器不全、血小板数の減少、遺伝子異常、ノルアドレナリンの減少からなる群から選択される、（９）に記載の組成物。
（１１）対象において組織再生を促進する方法であって、（１）～（１０）のいずれかに記載の組成物を、これを必要とする対象に投与する工程を含む、前記方法。
（１２）活性化星細胞、活性化星細胞分解物、ＭＭＰ１４、ＭＭＰ１４で処理したコラーゲンおよび活性化星細胞分泌物からなる群から選択される成分を含む、幹細胞の分化および／または増殖のための組成物。
（１３）活性化星細胞、活性化星細胞分解物、ＭＭＰ１４、ＭＭＰ１４で処理したコラーゲンおよび活性化星細胞分泌物からなる群から選択される成分と、幹細胞とを接触させる工程を含む、組織幹細胞を分化および／または増殖させる方法。
（１４）活性化星細胞、活性化星細胞分解物、ＭＭＰ１４、ＭＭＰ１４で処理したコラーゲンおよび活性化星細胞分泌物からなる群から選択される成分を含む、細胞増殖を促進するための組成物。
（１５）活性化星細胞、活性化星細胞分解物、ＭＭＰ１４、ＭＭＰ１４で処理したコラーゲンおよび活性化星細胞分泌物からなる群から選択される成分と、細胞とを接触させる工程を含む、細胞増殖を促進させる方法。
（１６）ＭＭＰ１４を阻害する物質を含む、細胞増殖を抑制するための組成物。
（１７）ＭＭＰ１４を阻害する物質が作用する細胞が、ＣＡＦおよび／または腫瘍細胞である、（１６）に記載の組成物。
（１８）ＭＭＰ１４で処理したコラーゲンを含む、細胞培養基材。
（１９）ＭＭＰ１４で処理したコラーゲンで被覆された細胞培養容器。
　本発明により、生体内での組織再生のみならず、生体外での組織形成をも促進させることができるため、生物学的、医学的に多大な貢献が期待できる。
　また、本発明による組織再生の促進は、組織再生が抑制されている状況、例えば、線維症などの疾患を伴う状況などにおいて特に有用である。
肝部分切除ラットに対する処置の流れを示した図である。 肝部分切除後５日目および１０日目に採取した各群の肝臓の外観を、肝部分切除前および切除直後の肝臓との比較で示した図である。 採取した各群の肝重量の推移を示したグラフである。 肝部分切除後５日目に採取した肝組織をＦＩＴＣ－ＴＵＮＥＬ、α－ＳＭＡおよびＤＡＰＩで共染色した蛍光顕微鏡像を示した図である。 肝部分切除後５日目に採取した肝組織をＦＩＴＣ－ＴＵＮＥＬ、α－ＳＭＡおよびＤＡＰＩで共染色した蛍光顕微鏡像における、α－ＳＭＡ陽性ＴＵＮＥＬ陽性細胞の数を示した図である。
肝部分切除後５日目に採取した肝組織をＫｉ６７およびＤＡＰＩで共染色した蛍光顕微鏡像を示した図である。 肝部分切除後５日目に採取した肝組織をＫｉ６７およびＤＡＰＩで共染色した蛍光顕微鏡像におけるＫｉ６７陽性細胞数を示した図である。 肝部分切除後５日目に採取した肝組織をＣＤ１３３およびＤＡＰＩで共染色した蛍光顕微鏡像を示した図である。 例３の各群に施した処置の概要を示した図である。 採取した各群の肝臓の外観を、肝部分切除直後（０日目）の肝臓との比較で示した図である。
採取した各群の肝臓の重量を、肝部分切除直後（０日目）の肝臓との比較で示したグラフである。 肝部分切除後の肝組織におけるα－ＳＭＡ陽性細胞の経時変化を示した図である。 肝部分切除後の肝組織におけるα－ＳＭＡ陽性細胞数の経時変化を示したグラフである。 静止型肝星細胞（上図）および活性型肝星細胞（下図）の顕微鏡像を示した図である。 幹細胞と星細胞との接触共培養における、ＧＦＰ／アルブミン両陽性コロニーの顕微鏡像を示した図である。
幹細胞と星細胞との接触共培養において、ＥＧＦおよびＨＧＦを添加したときの、ＧＦＰ／アルブミン両陽性コロニーの顕微鏡像を示した図である。 幹細胞と星細胞との接触共培養におけるＧＦＰ／アルブミン両陽性コロニー数を示したグラフである。 幹細胞と星細胞との接触共培養におけるＧＦＰ／アルブミン両陽性コロニーの面積を示したグラフである。 幹細胞と星細胞との非接触共培養におけるＧＦＰ／アルブミン両陽性コロニーの面積を示したグラフである。 幹細胞と星細胞との非接触共培養におけるＧＦＰ／アルブミン両陽性細胞数の増殖を吸光度で示したグラフである。
肝部分切除後の肝組織におけるＤＮＡ合成の経時変化を示した顕微鏡像である。 肝部分切除後の肝組織におけるＢｒｄＵ陽性細胞の割合の経時変化を示したグラフである。 肝部分切除後の肝組織におけるＤＮＡ合成の経時変化を示した顕微鏡像である。 肝部分切除後の肝組織におけるＢｒｄＵ陽性細胞の割合の経時変化を示したグラフである。 肝細胞と星細胞とを共培養したときのＢｒｄＵ陽性肝細胞を示した顕微鏡像である。
肝細胞と星細胞とを共培養したときのＢｒｄＵ陽性肝細胞の割合を示したグラフである。 種々の処理を施したコラーゲン上で肝細胞を培養したときのＢｒｄＵ陽性細胞を示した顕微鏡像である。 種々の処理を施したコラーゲン上で肝細胞を培養したときのＢｒｄＵ陽性細胞の割合を示したグラフである。 肝細胞と、ＭＭＰ１４および／またはＨＧＦをノックダウンした星細胞とを共培養したときのＢｒｄＵ陽性肝細胞を示した顕微鏡像である。
肝細胞と、ＭＭＰ１４および／またはＨＧＦをノックダウンした星細胞とを共培養したときのＢｒｄＵ陽性肝細胞の割合を示したグラフである。 ＭＭＰ１４処理コラーゲン上で肝細胞をＲＧＤペプチドの存在下で培養したときのＢｒｄＵ陽性細胞を示した顕微鏡像である。 ＭＭＰ１４処理コラーゲン上で肝細胞をＲＧＤペプチドの存在下で培養したときのＢｒｄＵ陽性細胞の割合を示したグラフである。
　本発明の一側面は、活性化星細胞、活性化星細胞分解物、ＭＭＰ１４、ＭＭＰ１４で処理したコラーゲンおよび活性化星細胞分泌物からなる群から選択される成分を含む、組織再生を促進するための組成物に関する。
　活性化星細胞は、生体から単離した星細胞を継代培養して得ることができる。星細胞は、肝臓、膵臓、腎臓、腸管、肺などの種々の組織に存在することが知られており（Zhao and Burt, J Mol Histol. 2007 Mar;38(1):53-64）、これらのいずれをも利用することができる。星細胞の単離は既知の任意の方法を用いて行うことができる。肝星細胞の単離方法の具体例は後述の例５（１）に例示されている。活性化星細胞はαＳＭＡの発現を特徴としており、これをマーカーとして選別することができる。
　活性化星細胞は、ＨＧＦ、ＥＧＦ、ＭＭＰ１４からなる群から選択されるタンパク質の発現を増大させる処置を施されたものであってもよい。かかる処置としては、限定されずに、例えば、前記タンパク質をコードする遺伝子の活性化星細胞への導入が挙げられる。ＨＧＦ、ＥＧＦおよびＭＭＰ１４をコードする遺伝子は既知であり、また、遺伝子の導入法も当該技術分野においてよく知られている。
　活性化星細胞分解物は、活性化星細胞を、物理的および／または化学的手法を含む種々の手法で分解して得ることができる。分解には、細胞を分解する既知の任意の手法、例えば、浸透圧ショック法、凍結融解法、界面活性剤の使用、酵素消化法、超音波処理、フレンチプレス、乳鉢による粉砕、ホモジナイザーによる破砕、ガラスビーズによる破砕などを用いることができる。分解手法は、タンパク質を変性させないか、変性が軽度のものが好ましい。かかる手法を用いることで、細胞膜上に発現しているＭＭＰ１４を、その機能を損なうことなく得ることができる。また、活性化星細胞分解物は、細胞膜成分を含んでいることが好ましい。
　ＭＭＰ１４（ＭＴ１－ＭＭＰとも呼ばれる）は、細胞膜上に発現するＭＭＰである。ＭＭＰ１４はコラーゲンＩに作用することができる。本発明者により、ＭＭＰ１４のコラーゲンＩに対する作用が、細胞の増殖に深く関与することが明らかとなった。
　本発明におけるＭＭＰ１４は、細胞膜上に発現しているもののみならず、細胞膜から遊離したものも含む。ＭＭＰ１４は天然に存在するものであっても、人工的に作製したものであってもよい。したがって、ＭＭＰ１４は組換えＭＭＰ１４を含む。遊離型のＭＭＰ１４は既知であり（例えば、Jo et al., Biochem J. 2000 Feb 1;345 Pt 3:511-9など）、市販もされている（例えば、R&D Systems, Cat No.918-MP-010、918-MPN-010など）。ＭＭＰ１４のアミノ酸およびこれをコードする塩基配列は既知である（例えば、ヒトＭＭＰ１４の塩基配列はGenBankアクセッション番号NM_004995、アミノ酸配列はGenBankアクセッション番号NP_004986として登録されている）。
　本発明におけるＭＭＰ１４は、その機能的変異体も含む。ＭＭＰ１４の機能的変異体は、限定されることなく、例えば、（ｉ）当該タンパク質のアミノ酸配列に１個または２個以上、典型的には１個または数個の変異を有するが、なお当該タンパク質と同等の機能を有する変異体、（ｉｉ）当該タンパク質をコードする遺伝子の塩基配列を有する核酸もしくは同核酸と同一のポリペプチドをコードする核酸の塩基配列に１個または２個以上、典型的には１個または数個の変異を有する核酸によりコードされ、かつ当該タンパク質と同等の機能を有する変異体、（ｉｉｉ）当該タンパク質をコードする遺伝子の塩基配列を有する核酸、同核酸と同一のポリペプチドをコードする核酸もしくは（ｉｉ）の変異体をコードする核酸の相補鎖、またはその断片にストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸によりコードされ、かつ、当該タンパク質と同等の機能を有する変異体、（ｉｖ）当該タンパク質のアミノ酸配列と６０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、当該タンパク質と同等の機能を有する変異体、（ｖ）当該タンパク質をコードする遺伝子の塩基配列と６０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上の相同性を有する核酸によりコードされ、かつ、当該タンパク質と同等の機能を有する変異体等が挙げられる。
　当業者はＭＭＰ１４の配列情報をもとに、上記機能的変異体を、既知の任意の手法、例えば、化学合成、制限酵素による核酸の切断または挿入、部位特異的変異導入、放射線もしくは紫外線の照射などにより適宜作製することができる。
　ある変異体がＭＭＰ１４と同等の機能を有するか否かは、当該変異体を、ＭＭＰ１４の既知の機能、限定されずに、例えば、コラーゲン分解能などについて、既知の任意の方法により解析し、適切な陰性対照や、陽性対照としてのＭＭＰ１４と比較することによって評価することができる。例えば、ある変異体において、上記機能が陰性対照より優れている場合、例えば、１０％以上、２５％以上、５０％以上、７５％以上、さらには１００％以上優れている場合、および／または、同機能がＣＳＡＢＰの１／１００以上、１／５０以上、１／２５以上、１／１０以上、１／５以上、さらには１／２以上である場合、この変異体をＭＭＰ１４の機能的変異体に含める。
　本明細書で用いる「ストリンジェントな条件」という用語は、当該技術分野において周知のパラメータであり、標準的なプロトコル集、例えばSambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3d ed., Cold Spring Harbor Press (2001)や、Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1992)等に記載されている。
　本発明におけるストリンジェントな条件は、例えば、６５℃での、３．５×ＳＳＣ（０．１５Ｍ塩化ナトリウム／０．１５Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７）、フィコール０．０２％、ポリビニルピロリドン０．０２％、ウシ血清アルブミン０．０２％、ＮａＨ２ＰＯ４２５ｍＭ（ｐＨ７）、ＳＤＳ０．０５％、ＥＤＴＡ２ｍＭからなるハイブリダイゼーションバッファーによるハイブリダイゼーションを指す。ハイブリダイゼーション後、ＤＮＡが移された膜は、２×ＳＳＣにて室温において、次いで０．１～０．５×ＳＳＣ／０．１×ＳＤＳにて６８℃までの温度において洗浄する。あるいは、ストリンジェントなハイブリダイゼーションは、ExpressHyb(R)Hybridization Solution（Clontech社）等の市販のハイブリダイゼーションバッファーを用いて、製造者によって記載されたハイブリダイゼーションおよび洗浄条件で行ってもよい。
　同程度のストリンジェンシーを生じる結果となる使用可能な他の条件、試薬等が存在するが、当業者はかかる条件に通じていると思われるため、これらについては、本明細書中に特段記載はしていない。しかしながら、タンパク質の変異体をコードしている核酸の明確な同定ができるよう、条件を操作することが可能である。
　本発明におけるＭＭＰ１４および／またはその機能的変異体は、当該タンパク質自体やその機能的変異体のほか、当該タンパク質やその機能的変異体をコードする核酸をも含む。
　ＭＭＰ１４で処理したコラーゲンは、コラーゲンをＭＭＰ１４で処理して得ることができる。コラーゲンとしては、例えば、コラーゲンＩを用いることができる。処理に用いるＭＭＰ１４は、上述のＭＭＰ１４（ＭＭＰ１４の機能的変異体を含む）のほか、ＭＭＰ１４を発現する細胞自体、または、ＭＭＰ１４を含む前記細胞の分解物であってもよい。ＭＭＰ１４による処理時間としては、例えば、ＭＭＰ１４が作用し得る温度で、１～１２０時間、３～６０時間、６～４８時間、１２～３６時間などであってもよい。ＭＭＰ１４で処理したコラーゲンは、ＲＧＤ配列が、細胞と相互作用できる状態になっていることが好ましい。
　活性化星細胞分泌物は、活性化星細胞の培養上清などから得ることができる。培養上清はそのまま用いても、透析や凍結乾燥などにより濃縮して用いてもよい。活性化星細胞分泌物には種々のタンパク質が含まれているため、タンパク質が変性しないように扱うことが好ましい。
　本発明の組成物により再生を促進する組織は特に限定されず、全身の種々の組織を含む。かかる組織としては、限定されずに、例えば、星細胞が存在する組織、線維化が生じる組織、幹細胞が存在する組織などが挙げられる。具体的には、限定されずに、例えば、肝臓、膵臓、腎臓、腸管、肺、脾臓、心臓、骨髄、声帯、皮膚、腹膜、眼、脈管などが挙げられる。
　本発明の組成物は、障害組織または移植組織において生じる組織再生に有用である。障害組織は、組織破壊、炎症、壊死、線維化、手術的侵襲、臓器不全等を受けた組織を含む。本発明の組成物の投与時期は特に限定されないが、障害または移植を受けた日から４日以内、または、障害または移植を受けた日から１日以内に投与することが好ましい。
　本発明の組成物による組織再生は、幹細胞の分化および／または増殖を伴うものであってもよい。また、本発明の組成物による組織再生は、組織実質細胞の増殖を伴うものであってもよい。幹細胞の分化は、例えば、分化細胞に特異的な細胞マーカーの検出、分化細胞が示す機能の検出などにより評価することができる。細胞の増殖は、種々の既知の手法、例えば、経時的な生細胞数の計数、組織のサイズ、体積または重量の測定、ＤＮＡ合成量の測定、ＷＳＴ－１法、ＢｒｄＵ（ブロモデオキシウリジン）法、３Ｈチミジン取込み法などにより評価することができる。
　本発明の組成物は、組織再生が抑制された状態を有する対象に対して用いることができる。組織再生が抑制された状態としては、限定されずに、例えば、炎症、壊死、線維化、臓器不全、血小板数の減少、遺伝子異常、ノルアドレナリンの減少などを含む。
　本発明の組成物における有効成分の配合量は、組成物が投与された場合に、組織再生が促進される量であってもよい。また、投与による利益を超える悪影響が生じない量が好ましい。かかる量は公知であるか、培養細胞などを用いたin vitro試験や、マウス、ラット、イヌまたはブタなどのモデル動物における試験により適宜決定することができ、このような試験法は当業者によく知られている。組織再生の促進は、組織の機能、重量、大きさなどの回復を、生化学検査、レントゲン、超音波、ＭＲＩ、ＣＴ、内視鏡などを用いた画像診断などにより評価することができる。有効成分の配合量は、組成物の投薬態様によって変化し得る。例えば、１回の投与に複数の単位の組成物を用いる場合、組成物１単位に配合する有効成分の量は、１回の投与に必要な有効成分の量の複数分の１とすることができる。かかる配合量の調整は当業者が適宜行うことができる。
　本発明はまた、活性化星細胞、活性化星細胞分解物、ＭＭＰ１４、ＭＭＰ１４で処理したコラーゲンおよび活性化星細胞分泌物からなる群から選択される成分を配合することを含む、組織再生を促進するための組成物を製造する方法、前記成分の、組織再生を促進するための組成物の製造への使用、ならびに、組織再生の促進に用いる前記成分に関する。
　上記製造方法または使用における各成分やその配合量については、既に上述したとおりである。各成分の配合は、既知の任意の手法に従って行うことができる。
　本発明はまた、上記の組成物を、これを必要とする対象に投与する工程を含む、対象において組織再生を促進する方法に関する。本方法における対象は、組織に障害を受けているか、組織移植を受けていてもよい。障害は、限定されずに、例えば、組織破壊、炎症、壊死、線維化、手術的侵襲、臓器不全等を含む。組成物の投与は、例えば、障害もしくは移植を受けた日から４日以内、障害もしくは移植を受けた日から１日以内であってもよい。
　本発明はまた、活性化星細胞、活性化星細胞分解物、ＭＭＰ１４、ＭＭＰ１４で処理したコラーゲンおよび活性化星細胞分泌物からなる群から選択される成分を含む、幹細胞の分化および／または増殖のための組成物、前記成分を配合することを含む、幹細胞の分化および／または増殖のための組成物を製造する方法、前記成分の、幹細胞の分化および／または増殖のための組成物の製造への使用、幹細胞の分化および／または増殖に用いる前記成分、ならびに、前記成分と、幹細胞とを接触させる工程を含む、幹細胞を分化および／または増殖させる方法に関する。
　幹細胞は、特に限定されず、例えば、組織幹細胞（体性幹細胞、成体幹細胞）、胚性幹細胞、ｉＰＳ細胞等を含む。幹細胞は、全能性、万能性、多能性または単能性であってもよい。組織幹細胞としては、限定されずに、例えば、神経幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、肝幹細胞、膵幹細胞、皮膚幹細胞、筋幹細胞、生殖幹細胞等が挙げられる。幹細胞は自己由来のものであっても、同種の他の個体または異種の個体のものであってもよい。分化および／または増殖させた幹細胞は、それを必要とする対象に移植することができる。
　上記方法はin vitro、in vivoまたはex vivoで行われてもよい。上記組成物、方法または使用における各成分やその配合量については、既に上述したとおりである。各成分の配合は、既知の任意の手法に従って行うことができる。上記組成物、方法または使用における有効成分としてＭＭＰ１４を用いる場合、増殖促進の対象となる細胞の周囲にコラーゲン（特にコラーゲンＩ）が存在することが好ましい。
　本発明はまた、活性化星細胞、活性化星細胞分解物、ＭＭＰ１４、ＭＭＰ１４で処理したコラーゲンおよび活性化星細胞分泌物からなる群から選択される成分を含む、細胞増殖を促進するための組成物、前記成分を配合することを含む、細胞増殖を促進するための組成物を製造する方法、前記成分の、細胞増殖を促進するための組成物の製造への使用、細胞増殖の促進に用いる前記成分、ならびに、前記成分と、細胞とを接触させる工程を含む、細胞増殖を促進させる方法に関する。
　増殖を促進する細胞は、限定されずに、例えば、肝臓、膵臓、腎臓、腸管、肺、脾臓、心臓、骨髄、声帯、皮膚、腹膜、眼、脈管などの細胞が挙げられる。細胞は自己由来のものであっても、同種の他の個体または異種の個体のものであってもよい。分化および／または増殖させた細胞は、それを必要とする対象に移植することができる。
　上記方法はin vitro、in vivoまたはex vivoで行われてもよい。上記組成物、方法または使用における各成分やその配合量については、既に上述したとおりである。各成分の配合は、既知の任意の手法に従って行うことができる。上記組成物、方法または使用における有効成分としてＭＭＰ１４を用いる場合、増殖促進の対象となる細胞の周囲にコラーゲン（特にコラーゲンＩ）が存在することが好ましい。
　本発明はまた、ＭＭＰ１４を抑制する物質を含む、細胞増殖を抑制するための組成物、前記物質を配合することを含む、細胞増殖を抑制するための組成物を製造する方法、前記物質の、細胞増殖を抑制するための組成物の製造への使用、細胞増殖の抑制に用いる前記物質、ならびに、前記物質と、細胞とを接触させる工程を含む細胞増殖を抑制する方法に関する。
　本発明はまた、ＭＭＰ１４を抑制する物質を含む、細胞増殖性疾患を処置するための組成物、前記物質を配合することを含む、細胞増殖性疾患を処置するための組成物を製造する方法、前記物質の、細胞増殖性疾患を処置するための組成物の製造への使用、細胞増殖性疾患の処置に用いる前記物質、ならびに、前記物質の治療有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む、細胞増殖性疾患を処置するための方法に関する。
　ＭＭＰ１４を阻害する物質としては、限定されずに、例えば、ＭＭＰ１４の産生および／または活性を阻害する薬物や、ＭＭＰ１４の分解および／または不活性化を促進する薬物などが含まれる。ＭＭＰ１４の産生を阻害する薬物としては、限定されずに、例えばＭＭＰ１４をコードするＤＮＡに対するＲＮＡｉ分子、リボザイム、アンチセンス核酸、ＤＮＡ／ＲＮＡキメラポリヌクレオチドおよびこれらを発現するベクター等が挙げられる。
　ＭＭＰ１４の阻害は、ＭＭＰ１４阻害物質を作用させなかった場合に比べ、細胞においてＭＭＰ１４の発現や活性が阻害されていることにより決定することができる。ＭＭＰ１４の発現は、既知の任意の手法、限定されずに、例えば、抗ＭＭＰ１４抗体を利用した免疫沈降法、ＥＩＡ、ＥＬＩＳＡ、ＩＲＡ、ＩＲＭＡ、ウェスタンブロッティング法、免疫組織化学法、免疫細胞化学法、フローサイトメトリー法、ＭＭＰ１４をコードする核酸もしくはそのユニークな断片または該核酸の転写産物（例えば、ｍＲＮＡ）もしくはスプライシング産物に特異的にハイブリダイズする核酸を利用した、種々のハイブリダイゼーション法、ノーザンブロット法、サザンブロット法、種々のＰＣＲ法などにより評価することができる。
　本明細書で用いる場合、ＲＮＡｉ分子は、ＲＮＡ干渉をもたらす任意の分子を指し、限定されずに、ｓｉＲＮＡ（small interfering RNA）、ｍｉＲＮＡ（micro RNA)、ｓｈＲＮＡ（short hairpin RNA）、ｄｄＲＮＡ（DNA-directed RNA）、ｐｉＲＮＡ（Piwi-interacting RNA）、ｒａｓｉＲＮＡ（repeat associated siRNA）などの二重鎖ＲＮＡおよびこれらの改変体などを含む。これらのＲＮＡｉ分子は市販されているか、既知の配列情報などに基づいて設計、作製することが可能である。
　また、本明細書で用いる場合アンチセンス核酸は、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ＰＮＡ、またはこれらの複合物を含む。
　本明細書で用いる場合、ＤＮＡ／ＲＮＡキメラポリヌクレオチドは、限定されずに、例えば、特開2003-219893に記載の、標的遺伝子の発現を阻害するＤＮＡとＲＮＡとからなる２本鎖ポリヌクレオチドを含む。
　増殖を抑制する細胞としては、限定されずに、例えば、その増殖が悪影響を及ぼす細胞、その増殖が疾患に関与する細胞などが挙げられる。具体的には、例えば、腫瘍細胞、がん細胞、活性化星細胞等が挙げられる。ＭＭＰ１４を抑制する物質は、これらの細胞に投与してもよいが、これらの細胞の増殖を補助するＭＭＰ１４発現細胞、例えば、ＣＡＦ（がん随伴線維芽細胞）等に投与してもよい。
　細胞増殖性疾患としては、限定されずに、例えば、良性または悪性腫瘍、過形成症、ケロイド、クッシング症候群、原発性アルドステロン症、紅板症、真性多血症、白板症、過形成瘢痕、扁平苔癬および黒子症などが挙げられる。
　本明細書に記載される本発明の各種の組成物、方法等における有効成分が核酸、例えば、ＲＮＡｉ分子、リボザイム、アンチセンス核酸、ＤＮＡ／ＲＮＡキメラポリヌクレオチドなどである場合、これらは、裸の核酸としてそのまま利用することもできるが、種々のベクターに担持させることもできる。ベクターとしては、プラスミドベクター、ファージベクター、ファージミドベクター、コスミドベクター、ウイルスベクター等の公知の任意のものを利用することができる。ベクターは、担持する核酸の発現を増強するプロモーターを少なくとも含んでいることが好ましく、この場合、該核酸は、かかるプロモーターと作動可能に連結されていることが好ましい。核酸がプロモーターに作動可能に連結されているとは、プロモーターの作用により、該核酸のコードするタンパク質が適切に産生されるように、該核酸とプロモーターとが配置されていることを意味する。ベクターは、宿主細胞内で複製可能であってもなくてもよく、また、遺伝子の転写は宿主細胞の核外で行われても、核内で行われてもよい。後者の場合、核酸は宿主細胞のゲノムに組み込まれてもよい。
　また、有効成分は、種々の非ウイルス性脂質またはタンパク質担体に担持させることもできる。かかる担体としては、限定されずに、例えば、コレステロール、リポソーム、抗体プロトマー、シクロデキストリンナノ粒子、融合ペプチド、アプタマー、生分解性ポリ乳酸コポリマー、ポリマーなどが挙げられ、細胞内への取込み効率を高めることができる（例えば、Pirollo and Chang, Cancer Res. 2008;68(5):1247-50などを参照）。特に、カチオン性リポソームやポリマー（例えば、ポリエチレンイミンなど）が有用である。かかる担体として有用なポリマーのさらなる例としては、例えば、US 2008/0207553、US 2008/0312174等に記載のものなどが挙げられる。
　本明細書に記載される本発明の各種組成物は、生体内の組織の再生、疾患の処置などの医療用途に用いることができる。したがって、本発明の各種組成物は医薬組成物とすることができる。医薬組成物においては、有効成分の効果を妨げない限り、有効成分を他の任意成分と組み合わせてもよい。そのような任意成分としては、例えば、他の化学治療剤、薬理学的に許容される担体、賦形剤、希釈剤等が挙げられる。また、投与経路や薬物放出様式などに応じて、上記組成物を、適切な材料、例えば、腸溶性のコーティングや、時限崩壊性の材料で被覆してもよく、また、適切な薬物放出システムに組み込んでもよい。
　本明細書に記載される本発明の各種組成物（各種医薬組成物を含む）は、経口および非経口の両方を包含する種々の経路、例えば、限定することなく、経口、静脈内、筋肉内、皮下、局所、腫瘍内、直腸、動脈内、門脈内、心室内、経粘膜、経皮、鼻内、腹腔内、肺内および子宮内等の経路で投与してもよく、各投与経路に適した剤形に製剤してもよい。かかる剤形および製剤方法は任意の公知のものを適宜採用することができる（例えば、標準薬剤学、渡辺喜照ら編、南江堂、２００３年などを参照）。
　例えば、経口投与に適した剤形としては、限定することなく、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、液剤、懸濁剤、乳剤、ゲル剤、シロップ剤などが挙げられ、また非経口投与に適した剤形としては、溶液性注射剤、懸濁性注射剤、乳濁性注射剤、用時調製型注射剤などの注射剤が挙げられる。非経口投与用製剤は、移植片、水性または非水性の等張性無菌溶液または懸濁液の形態であることができる。
　本明細書に記載される本発明の各種組成物（各種医薬組成物を含む）は、特定の組織や細胞に標的化されていてもよい。標的化は、既知の任意の手法により達成することができる。がんへの送達を企図する場合は、限定されずに、例えば、製剤をＥＰＲ（enhanced permeability and retention）効果の発現に好適な直径５０～２００μｍ、特に７５～１５０μｍなどのサイズにすることによるパッシブターゲティングや、ＣＤ１９、ＨＥＲ２、トランスフェリン受容体、葉酸受容体、ＶＩＰ受容体、ＥＧＦＲ（Torchilin, AAPS J. 2007;9(2):E128-47）、ＲＡＡＧ１０（特表２００５－５３２０５０）、ＰＩＰＡ（特表２００６－５０６０７１）、ＫＩＤ３（特表２００７－５２９１９７）などのリガンドや、ＲＧＤモチーフやＮＧＲモチーフを有するペプチド、Ｆ３、ＬｙＰ－１（Ruoslahti et al., J Cell Biol. 2010;188(6):759-68）などを標的化剤として利用するアクティブターゲティングなどの手法を用いることができる。また、レチノイドまたはその誘導体ががん細胞やＣＡＦへの標的化剤として有用であることも知られているため（WO 2008/120815）、レチノイドを標的化剤として含む担体を利用することもできる。かかる担体は、上記文献のほか、WO 2009/036368、WO 2010/014117、WO 2012/170952などに記載されている。
　本明細書に記載される本発明の各種組成物（各種医薬組成物を含む）はいずれの形態で供給されてもよいが、保存安定性の観点から、用時調製可能な形態、例えば、医療の現場あるいはその近傍において、医師および／または薬剤師、看護士、もしくはその他のパラメディカルなどによって調製され得る形態で提供してもよい。かかる形態は、本発明の組成物が、脂質やタンパク質、核酸などの安定した保存が難しい成分を含むときに特に有用である。この場合、本発明の組成物は、これらに必須の構成要素の少なくとも１つを含む１個または２個以上の容器として提供され、使用の前、例えば、２４時間前以内、好ましくは３時間前以内、そしてより好ましくは使用の直前に調製される。調製に際しては、調製する場所において通常入手可能な試薬、溶媒、調剤器具などを適宜使用することができる。
　したがって、本発明は、本発明の各種組成物に含まれ得る有効成分を、単独でもしくは組み合わせて含む１個または２個以上の容器を含む組成物の調製キット、ならびに、そのようなキットの形で提供される各種組成物の必要構成要素にも関する。本発明のキットは、上記のほか、本発明の各種組成物の調製方法や投与方法などが記載された指示、例えば説明書や、ＣＤ、ＤＶＤ等の電子記録媒体等を含んでいてもよい。また、本発明のキットは、本発明の各種組成物を完成するための構成要素の全てを含んでいてもよいが、必ずしも全ての構成要素を含んでいなくてもよい。したがって、本発明のキットは、医療現場や、実験施設などで通常入手可能な試薬や溶媒、例えば、無菌水や、生理食塩水、ブドウ糖溶液などを含んでいなくてもよい。
　本明細書に記載される本発明の各種方法における有効量とは、例えば、組織の再生に関しては、組織の再生を促進し、または、組織再生の遅延を解消する量であってもよく、疾患の処置に関しては、疾患の症状を低減し、または疾患の進行を遅延もしくは停止する量であってもよく、好ましくは、疾患を抑制し、または治癒する量である。また、投与による利益を超える悪影響が生じない量が好ましい。かかる量は、培養細胞などを用いたin vitro試験や、マウス、ラット、イヌまたはブタなどのモデル動物における試験により適宜決定することができ、このような試験法は当業者によく知られている。また、本発明の処置方法に用いる薬物の用量は当業者に公知であるか、または、上記の試験等により適宜決定することができる。
　本明細書に記載される本発明の処置方法において投与する有効成分の具体的な用量は、処置を要する対象に関する種々の条件、例えば、再生を阻害する状態の有無、症状の重篤度、対象の一般健康状態、年齢、体重、対象の性別、食事、投与の時期および頻度、併用している医薬、治療への反応性、剤形、および治療に対するコンプライアンスなどを考慮して決定され得る。
　投与経路としては、経口および非経口の両方を包含する種々の経路、例えば、経口、静脈内、筋肉内、皮下、局所、腫瘍内、直腸、動脈内、門脈内、心室内、経粘膜、経皮、鼻内、腹腔内、肺内および子宮内等の経路が含まれる。
　投与頻度は、用いる剤や組成物の性状や、上記のものを含む対象の条件によって異なるが、例えば、１日多数回（すなわち１日２、３、４回または５回以上）、１日１回、数日毎（すなわち２、３、４、５、６、７日毎など）、１週間毎、数週間毎（すなわち２、３、４週間毎など）であってもよい。
　本明細書で用いる場合、用語「対象」は、任意の生物個体を意味し、好ましくは動物、さらに好ましくは哺乳動物、さらに好ましくはヒトの個体である。本発明において、対象は健常であっても、何らかの疾患に罹患していてもよいものとするが、特定の疾患の処置が企図される場合には、典型的にはかかる疾患に罹患しているか、罹患するリスクを有する対象を意味する。
　また、用語「処置」は、本明細書で用いる場合、疾患の治癒、一時的寛解または予防などを目的とする医学的に許容される全ての種類の予防的および／または治療的介入を包含するものとする。例えば、「処置」の用語は、疾患の進行の遅延または停止、病変の退縮または消失、発症の予防または再発の防止などを含む、種々の目的の医学的に許容される介入を包含する。
　本発明はまた、ＭＭＰ１４で処理したコラーゲンを含む、細胞培養基材に関する。ＭＭＰ１４で処理したコラーゲンについては、各種組成物などに関して上述したとおりである。
　本発明の細胞培養基材は、細胞生育の足場となるものであり、膜状、ゲル状など種々の形態をとってもよい。細胞培養基材は無菌であることが好ましいが、非無菌状態で提供され、使用時に滅菌してもよい。本発明の細胞培養基材は、細胞培養容器を被覆するために用いてもよい。被覆濃度は、限定されずに、例えば、コラーゲンの濃度として０．０１～１０００μｇ／ｃｍ２、０．１～１００μｇ／ｃｍ２、１～５０μｇ／ｃｍ２、５～２５μｇ／ｃｍ２であってもよい。
　また、本発明は、ＭＭＰ１４で処理したコラーゲン、または、ＭＭＰ１４およびコラーゲンを含む細胞培養基材作製キットにも関する。該キットは、ＭＭＰ１４で処理したコラーゲンを細胞培養基材として使用するための情報や、コラーゲンをＭＭＰ１４で処理するための情報などを含む指示、例えば、説明書や、ＣＤ、ＤＶＤ等の電子記録媒体等を含んでいてもよい。
　本発明はまた、ＭＭＰ１４で処理したコラーゲンで被覆された細胞培養容器に関する。細胞培養容器は既知の任意のものを用いることができる。本発明の細胞培養容器は、ＭＭＰ１４で処理したコラーゲンを細胞培養容器に被覆して製造しても、細胞培養容器に予め被覆したコラーゲンをＭＭＰ１４で処理して製造してもよい。処理に用いるＭＭＰ１４は、細胞膜に付着していても、細胞膜から遊離していてもよい。したがって、コラーゲンの処理は、コラーゲンが被覆された細胞培養容器中で活性化星細胞などの、ＭＭＰ１４を発現する細胞を培養することを含み得る。コラーゲンの処理に使用したＭＭＰ１４を発現する細胞は、処理後に除去しても、そのまま細胞培養容器に残し、これに増殖させる細胞を加えてもよい。この細胞培養容器は、細胞増殖能に優れており、細胞培養を促進するために用いることができる。また、星細胞は、幹細胞の分化を誘導することができるため、星細胞をさらに含む細胞培養容器は、幹細胞の分化誘導にも用いることができる。コラーゲンの被覆濃度は、限定されずに、例えば、０．０１～１０００μｇ／ｃｍ２、０．１～１００μｇ／ｃｍ２、１～５０μｇ／ｃｍ２、５～２５μｇ／ｃｍ２であってもよい。
　また、本発明は、ＭＭＰ１４で処理したコラーゲン、または、ＭＭＰ１４およびコラーゲンを含む、ＭＭＰ１４で処理したコラーゲンで被覆された細胞培養容器の作製キットにも関する。該キットは、ＭＭＰ１４で処理したコラーゲンで細胞培養容器を被覆するための情報や、細胞培養容器に被覆されたコラーゲンをＭＭＰ１４で処理するための情報などを含む指示、例えば、説明書や、ＣＤ、ＤＶＤ等の電子記録媒体等を含んでいてもよい。本発明のキットは細胞培養容器を含んでもよいが、市販の細胞培養容器を別途用意して使用することもできる。
　本発明はさらに、ＭＭＰ１４で処理したコラーゲンで細胞培養容器を被覆する工程、または、細胞培養容器に被覆されたコラーゲンをＭＭＰ１４で処理する工程を含む、ＭＭＰ１４で処理したコラーゲンが被覆された細胞培養容器の製造方法に関する。処理に用いるＭＭＰ１４は、細胞膜に付着していても、細胞膜から遊離していてもよい。したがって、細胞培養容器に被覆されたコラーゲンをＭＭＰ１４で処理する工程は、コラーゲンが被覆された細胞培養容器中で活性化星細胞などの、ＭＭＰ１４を発現する細胞を培養することや、細胞培養容器に被覆されたコラーゲンと、ＭＭＰ１４を発現する細胞の分解物とを接触させることを含む。
　本発明を以下の例でさらに詳細に説明するが、これらは例示に過ぎず、本発明を決して限定するものではない。
例１　ＶＡ－ｌｉｐ　ｓｉＲＮＡの調製
（１）ｓｉＲＮＡの調製
　コラーゲン（Ｉ～ＩＶ型）の共通分子シャペロンであるヒトＨＳＰ４７のラットホモログ、ｇｐ４６（GenBank Accession No. M69246、配列番号１）の塩基配列を標的とするｓｉＲＮＡ（北海道システム・サイエンス, Sapporo, Japan）のセンス鎖およびアンチセンス鎖は以下のものを用いた。
Ａ：ＧＵＵＣＣＡＣＣＡＵＡＡＧＡＵＧＧＵＡＧＡＣＡＡＣＡＧ（ｇｐ４６の塩基配列上の第７５７塩基から始まるセンス鎖ｓｉＲＮＡ、配列番号２）
Ｂ：ＧＵＵＧＵＣＵＡＣＣＡＵＣＵＵＡＵＧＧＵＧＧＡＡＣＡＵ（アンチセンス鎖ｓｉＲＮＡ、配列番号３）
　ｓｉＲＮＡｒａｎｄｏｍ（ｓｉＲＮＡｓｃｒａｍｂｌｅと称することもある）として以下のものを用いた。
Ｃ：ＣＧＡＵＵＣＧＣＵＡＧＡＣＣＧＧＣＵＵＣＡＵＵＧＣＡＧ（センス鎖ｓｉＲＮＡ、配列番号４）
Ｄ：ＧＣＡＡＵＧＡＡＧＣＣＧＧＵＣＵＡＧＣＧＡＡＵＣＧＡＵ（アンチセンス鎖ｓｉＲＮＡ、配列番号５）
　いくつかの実験において、６’－カルボキシフルオレセイン（６－ＦＡＭ）またはフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）が５’末端に結合したセンス鎖を用いた。これらの配列はＢＬＡＳＴ検索において、既知の他のラットｍＲＮＡと相同性を有さないことを確認した。
（２）ＶＡ－ｌｉｐ　ｓｉＲＮＡの調製
　カチオン性脂質として、Ｏ，Ｏ’－ジテトラデカノイル－Ｎ－（α－トリメチルアンモニオアセチル）ジエタノールアミンクロライド（ＤＣ－６－１４）、コレステロールおよびジオレイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）を４：３：３のモル比で含むカチオン性リポソーム（Lipotrust）を北海道システム・サイエンス(Sapporo, Japan)から購入した。リポソームは、使用前に、凍結乾燥した脂質混合物に攪拌条件下で再蒸留水（ＤＤＷ）を添加することによって、１ｍＭ（ＤＣ－６－１４）の濃度で調製した。ＶＡ結合リポソームを調製するため、ＤＭＳＯに溶解した２００ｎｍｏｌのビタミンＡ（レチノール、Sigma, USA）をリポソーム懸濁液（ＤＣ－６－１４として１００ｎｍｏｌ）と、１．５ｍｌチューブ中で攪拌しながら２５℃で混合した。ｓｉＲＮＡｇｐ４６を担持するＶＡ結合リポソーム（ＶＡ－ｌｉｐ－ｓｉＲＮＡｇｐ４６）を調製するため、ｓｉＲＮＡｇｐ４６溶液（ＤＤＷ中に５８０ｐｍｏｌ／μｌ）を、レチノール結合リポソーム溶液に攪拌しながら室温下で添加した。ｓｉＲＮＡとＤＣ－６－１４とのモル比は１：１１．５、また、ビタミンＡ、ＤＣ－６－１４およびｓｉＲＮＡのモル比は１１．５：１１．５：１であった。in vitroでの使用に望ましい用量を得るため、ＶＡ－ｌｉｐ　ｓｉＲＮＡをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で再構成した。
例２　肝部分切除ラットへのＶＡ－ｌｉｐ　ｓｉＲＮＡｇｐ４６投与による肝再生への影響
（１）肝部分切除ラットの作製および処置
　肝部分切除ラットは、雄ＳＤラット（１５０～２００ｇ）（Slc Japan, Shizuoka, Japan）の肝臓全体の約７０％にあたる肝左葉および中葉を切除することにより作製した。この肝部分切除ラットに、例１で作製したＶＡ－ｌｉｐ　ｓｉＲＮＡｇｐ４６（群Ｉ）、ＶＡ－ｌｉｐ　ｓｉＲＮＡｓｃｒａｍｂｌｅ（ｍｏｃｋコントロール、群ＩＩ）、または５％グルコース（ｓｉＲＮＡ非含有コントロール、群ＩＩＩ）を、３００μｌ／回の容量で、１日おきに合計５回（すなわち肝部分切除後１、３、５、７および９日目に）尾静脈投与した（図１、ｎ＝６）。なお、各ｓｉＲＮＡは、ラット体重に対して０．７５ｍｇ／ｋｇで使用した。
（２）採取組織の評価
　３回目および５回目の投与が終了した２４時間後（すなわち肝部分切除後５日目および１０日目）に、肝部分切除ラットの肝臓を採取した。採取した肝臓は、外観を観察し、重量を測定した後、ＯＣＴコンパウンドを用いて封埋し、凍結切片を作製した。得られた切片を４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で固定し、次いで５％ヤギ血清含有ＰＢＳでブロッキングを施し、ＰＢＳで洗浄した後、Ｃｙ３標識抗α平滑筋アクチン（α－ＳＭＡ）抗体（Sigma）、抗Ｋｉ－６７抗体（Dako）または抗ＣＤ１３３抗体を用いて、４℃で一晩反応させた。ＰＢＳで洗浄した後、Ａｌｅｘａ４８８標識ヤギ抗マウス抗体（Invitrogen）を用いて室温で６０分間反応させた。ＰＢＳで洗浄した後、ProLong(R) Gold with DAPI（Invitrogen）で封入し、蛍光顕微鏡で観察を行った。また、採取した肝凍結切片のTunel染色は、In situ Apoptosis Detection Kit (Takara Bio, Japan)を用い、製造者の指示に従って行った。α－ＳＭＡとＴｕｎｅｌとの共染色には、ＦＩＴＣ－ＴＵＮＥＬ抗体およびＣｙ３標識抗α－ＳＭＡ抗体を用いた。陽性細胞数は、５視野（倍率２００倍）の平均値を算出した。
（３）結果
　図２に肝部分切除後５日目および１０日目に採取した各群の肝臓の外観を、肝部分切除前および切除直後の肝臓との比較で示す。また、図３に、採取した各群の肝重量の推移を示す。両図から分るとおり、肝臓は、群ＩＩおよびＩＩＩでは５日目にすでに切除前の大きさおよび重量を回復したが、ＶＡ－ｌｉｐ　ｓｉＲＮＡｇｐ４６を投与した群Ｉでは、切除後１０日経っても肝臓の大きさおよび重量は回復しなかった。
　次に、切除後５日目に採取した肝組織をＦＩＴＣ－ＴＵＮＥＬ、α－ＳＭＡおよびＤＡＰＩで共染色したところ、群Ｉにおいて、α－ＳＭＡ陽性細胞におけるＴＵＮＥＬ陽性細胞の数が、他の群に比べて顕著に多くなっていることが明らかになった（図４および５）。これは、活性化肝星細胞などのα－ＳＭＡ陽性細胞が、ＶＡ－ｌｉｐ　ｓｉＲＮＡｇｐ４６によるｇｐ４６の抑制により大量にアポトーシスを起したことを示している。
　さらに、切除後５日目に採取した肝組織をＫｉ６７およびＤＡＰＩで共染色したところ、群ＩにおけるＫｉ６７陽性細胞が、同じく肝部分切除を行った他の群（群ＩＩおよび群ＩＩＩ）に比べ顕著に少なくなっていることが明らかになった（図６および７）。なお、群ＩＩおよび群ＩＩＩにおけるＫｉ６７陽性細胞の数は、肝部分切除を行っていない正常肝組織のものよりも顕著に多く、Ｋｉ６７が細胞増殖のマーカーであることから、肝部分切除後に肝組織において旺盛な細胞増殖が生じていることを物語っている。
　また、切除後５日目に採取した肝組織をＣＤ１３３およびＤＡＰＩで共染色したところ、群ＩにおけるＣＤ１３３陽性細胞が、同じく肝部分切除を行った他の群（群ＩＩおよび群ＩＩＩ）に比べ顕著に少なくなっていることが明らかになった（図８）。ＣＤ１３３は幹細胞マーカーであることから、この結果は、ＶＡ－ｌｉｐ　ｓｉＲＮＡｇｐ４６により、幹細胞の増殖が顕著に抑制されたことを示すものである。
　上記の各染色結果は、合わせ考慮すると、α－ＳＭＡ陽性細胞のアポトーシスにより、肝組織における幹細胞を含む細胞の増殖が抑制されたこと、逆に言えば、α－ＳＭＡ陽性細胞が、肝部分切除後の組織再生に向けた肝組織における細胞増殖、特に幹細胞の増殖に不可欠であることを示すものである。
例３　肝部分切除ラットへのＶＡ－ｌｉｐ　ｓｉＲＮＡｇｐ４６投与時期による肝再生への影響
（１）肝部分切除ラットの作製および処置
　例２と同様にして肝部分切除ラットを作製した。この肝部分切除ラットに、以下の処置を施した（図９）。
Ａ群：無処置（無処置コントロール群）
Ｂ群：５％グルコース（溶媒コントロール群）
Ｃ群：ＶＡ－ｌｉｐ　ｓｉＲＮＡｓｃｒａｍｂｌｅ（ｍｏｃｋコントロール群）
Ｄ群：ＶＡ－ｌｉｐ　ｓｉＲＮＡｇｐ４６（試験群）
Ｅ群：ＶＡ－ｌｉｐ　ｓｉＲＮＡｇｐ４６（遅延投与群）
（各群ともｎ＝４）
　ＶＡ－ｌｉｐ　ｓｉＲＮＡｇｐ４６およびＶＡ－ｌｉｐ　ｓｉＲＮＡｓｃｒａｍｂｌｅは例１で作製したものを使用した。Ｂ～Ｄ群は、それぞれの投与物を３００μｌ／回の容量で、１日おきに合計６回（すなわち肝部分切除後０、２、４、６、８および１０日目に）、Ｅ群は、合計４回（すなわち肝部分切除後４、６、８および１０日目に）尾静脈投与した。なお、各ｓｉＲＮＡは、ラット体重に対して０．７５ｍｇ／ｋｇで使用した。
（２）採取組織の評価
　６回目（Ｅ群については４回目）の投与が終了した２４時間後（すなわち肝部分切除後１１日目）に、肝部分切除ラットの肝臓を採取した。採取した肝臓は、外観を観察し、重量を測定した後、ＯＣＴコンパウンドを用いて封埋し、凍結切片を作製した。得られた切片を４％パラホルムアルデヒドで固定し、次いで５％ヤギ血清含有ＰＢＳでブロッキングを施し、ＰＢＳで洗浄した後、Ｃｙ３標識α平滑筋アクチン（α－ＳＭＡ）抗体（Sigma）を用いて４℃で一晩反応させた。ＰＢＳで洗浄した後、ProLong(R) Gold with DAPI（Invitrogen）で封入し、蛍光顕微鏡で観察を行った。
（３）結果
　図１０および１１に（２）で採取した各群の肝臓の外観および重量を、肝部分切除直後（０日目）の肝臓との比較でそれぞれ示す。両図から分るとおり、肝臓は、Ａ～ＣおよびＥ群で切除前の大きさおよび重量を回復したが、ＶＡ－ｌｉｐ　ｓｉＲＮＡｇｐ４６を第０日目から投与したＤ群では、切除後１１日経っても肝臓の大きさおよび重量は回復しなかった。また、同じ用量のＶＡ－ｌｉｐ　ｓｉＲＮＡｇｐ４６を第４日目から投与したＥ群で肝臓の大きさおよび重量の回復が認められたことから、ＶＡ－ｌｉｐ　ｓｉＲＮＡｇｐ４６は、組織再生の早期の段階で投与すべきことが明らかとなった。
例４　肝部分切除後の肝組織におけるα－ＳＭＡ陽性細胞数の経時変化
（１）肝部分切除ラットの作製および採取組織の評価
　例２と同様にして肝部分切除ラットを作製した。肝部分切除ラットから、肝部分切除後０、１、２、３、４、５または６日目に肝臓を採取した。採取した肝組織をＯＣＴコンパウンドを用いて封埋し、凍結切片を作製した。得られた切片を４％パラホルムアルデヒドで固定し、次いで５％ヤギ血清含有ＰＢＳでブロッキングを施し、ＰＢＳで洗浄した後、Ｃｙ３標識α平滑筋アクチン（α－ＳＭＡ）抗体（Sigma）を用いて４℃で一晩反応させた。ＰＢＳで洗浄した後、ProLong(R) Gold with DAPI（Invitrogen）で封入し、蛍光顕微鏡で観察を行った。
（２）結果
　図１２および１３に示す結果から、α－ＳＭＡ陽性細胞の数が肝部分切除後３日目に急激に増加し、その後なだらかに減少することが分る。この結果は、例２～３の結果および星細胞は活性化するとα－ＳＭＡを発現するようになることを考慮すると、組織再生の早期の段階で組織に存在する星細胞が活性化し、組織再生に向けた細胞増殖を引き起すことを示唆しするものである。
例５　幹細胞の分化に対する星細胞の関与
（１）細胞の調製
　星細胞としては、ＳＤラット肝臓から採取した肝星細胞を用いた。すなわち、まず、ＳＤラットにＥＧＴＡ溶液およびコラゲナーゼ溶液を灌流した後、肝臓を採取し、採取した肝臓を細切後、セルストレーナー（孔径１００μｍ）で濾過した。得られた細胞懸濁液にＨＢＳＳ＋０．２５％ＢＳＡ（Bovine Serum Albumin）溶液を加えて、４℃、５００ｒｐｍで２分間遠心した。上清を採取して、４℃、１３００ｒｐｍで５分間遠心を行った。上清を除去した後、ＨＢＳＳ＋０．２５％ＢＳＡ溶液を加え、Nycodenzの濃度が１３．２％になるように２８．７％　Nycodenz溶液（Axis Shield, Oslo, Norway）を加えて混合した。ＨＢＳＳ＋０．２５％ＢＳＡ溶液を重層した後、４℃、１４００×ｇで２０分間遠心した。遠心終了後、中間層を採取して、ＤＭＥＭ（Dulbecco's Modified Eagle's medium）＋１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）培地を用いて、培養を行った。培養１日目の細胞を静止型肝星細胞（ｑＨＳＣ）とし、また、培養５日目に継代を行い、さらに２日間培養したものを活性型肝星細胞（ａＨＳＣ）とした（図１４）。
　幹細胞としては、４週齢のＧＦＰ遺伝子導入ラット（Slc Japan）の肝臓より採取した肝幹細胞を用いた。まず、ＧＦＰ遺伝子導入ラットにＥＧＴＡ溶液およびコラゲナーゼ溶液を灌流した後、肝臓を採取し、採取した肝臓を細切後、セルストレーナー（孔径１００μｍ）で濾過した。得られた細胞懸濁液にハンクス平衡塩液（ＨＢＳＳ）＋０．２５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）溶液を加えて、４℃、５００ｒｐｍで２分間遠心した。上清を採取して、４℃、１３００ｒｐｍで５分間遠心を行った。上清を除去した後、沈殿に対してＭＡＣＳ(R)（Magnetic Activating Cell Sorting）バッファー（Miltenyi Biotec, Auburn, CA, USA）を加えて混合した。細胞数をカウント後、ＦＩＴＣ結合マウス抗ＣＤ４５抗体（BD Pharmingen）、ウサギポリクローナル抗ＣＤ１３３抗体（Abcam）およびマウスモノクローナル抗ＥｐＣＡＭ抗体（Santa Cruz）を用いてＭＡＣＳ(R)を行い、ＣＤ１３３陽性、ＥｐＣＡＭ陽性、ＣＤ４５陰性細胞を採取し、ラット肝幹細胞として本実験に用いた。
（２）幹細胞と星細胞との接触共培養
　Ｉ型コラーゲンでコートされたカバーガラス（IWAKI, Tokyo, Japan）を入れた６穴プレートに、上記（１）で得たａＨＳＣを５×１０４個／ウェルの密度で播種し、インキュベーター内で３７℃、５％ＣＯ２にて４８時間培養した。ａＨＳＣ播種の２日後に、上記（１）で得た肝幹細胞を３×１０４個／ウェルの密度でウェル内のａＨＳＣ上に播種し、インキュベーター内で３７℃、５％ＣＯ２にて９日間共培養した（培地として、ＤＭＥ／Ｆ１２（Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient F-12 Ham）＋１０％ＦＢＳ＋ＩＴＳ（１０ｍｇ／ｌインスリン、５．５ｍｇ／ｌトランスフェリン、０．６７μｇ／ｌセレン）＋０．１μＭデキサメサゾン＋１０ｍＭニコチンアミド＋５０μｇ／ｍｌβ－メルカプトエタノール＋２ｍＭ　Ｌ－グルタミン＋５ｍＭ　Ｈｅｐｅｓを使用）。条件によっては、２０ｎｇ／ｍｌのＥＧＦおよび／または５０ｎｇ／ｍｌのＨＧＦを共培養開始時に添加した。また、コントロールとして、肝幹細胞のみをａＨＳＣが存在しない状態で同様に培養した。
　共培養９日目に、肝細胞マーカーであるアルブミンに対する抗体（ウサギポリクローナル、MP Biomedicals）で免疫染色を行い、倒立顕微鏡（Nikon）を用いて１００倍の倍率でＧＦＰ／アルブミン両陽性コロニーを撮影し、得られた画像をもとにＧＦＰ／アルブミン両陽性コロニーの数をカウントするとともに、面積をNIS-Elements software（Nikon）を用いて算出した（図１５～１８）。
（３）幹細胞と星細胞との非接触共培養
　セルカルチャーインサート（孔径０．４μｍ、BD Falcon, Franklin Lakes, NJ, USA）上に上記（１）で得たａＨＳＣを５×１０４個／ウェルの密度で播種し、インキュベーター内で３７℃、５％ＣＯ２にて、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳを用いて４８時間培養した。ａＨＳＣ播種の２日後に、上記（１）で得た肝幹細胞をＩ型コラーゲンでコートされたカバーガラス（IWAKI, Tokyo, Japan）を入れた２４穴プレート（BD Falcon）に１×１０４個／ウェルの密度で播種した。次いで、ａＨＳＣを含む上記セルカルチャーインサートを２４穴プレートのウェルに挿入し、インキュベーター内で３７℃、５％ＣＯ２にて１０日間共培養した（培地として、ＤＭＥ／Ｆ１２（Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient F-12 Ham）＋１０％ＦＢＳ＋ＩＴＳ（１０ｍｇ／ｌインスリン、５．５ｍｇ／ｌトランスフェリン、０．６７μｇ／ｌセレン）＋０．１μＭデキサメサゾン＋１０ｍＭニコチンアミド＋５０μｇ／ｍｌβ－メルカプトエタノール＋２ｍＭ　Ｌ－グルタミン＋５ｍＭ　Ｈｅｐｅｓを使用）。また、コントロールとして、肝幹細胞のみをａＨＳＣが存在しない状態で同様に培養した。
　共培養１０日目に、抗アルブミン抗体（ウサギポリクローナル、MP Biomedicals）で免疫染色を行い、倒立顕微鏡（Nikon）を用いて１００倍の倍率でアルブミン陽性コロニーを撮影し、得られた画像をもとにアルブミン陽性コロニーの面積をNIS-Elements software（Nikon）を用いて算出した（図１９）。
　別な実験では、共培養１０日目に、Premix WST-1 Cell Proliferation Assay System (Takara, Tokyo, Japan)を使用して、マイクロプレートリーダー(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA)を用いて細胞増殖の測定を行った（図２０）。
（４）結果
　図１５～１８に示す接触共培養実験の結果から、肝幹細胞を活性型肝星細胞と共培養することで、肝幹細胞の肝細胞への分化および増殖が生じることが明らかとなった。また、肝幹細胞の肝細胞への分化・増殖は、ＥＧＦおよびＨＧＦの添加により顕著に促進されることが明らかとなった。
　図１９および２０に示す非接触共培養実験の結果からは、活性型肝星細胞が、肝幹細胞と接触しない状態であっても肝幹細胞の肝細胞への分化・増殖を誘導し得ることが明らかとなった。
　これらの結果は、活性型肝星細胞から分泌される液性因子が肝幹細胞の肝細胞への分化・増殖を誘導することを示すものである。
例６　肝部分切除後の肝組織におけるＤＮＡ合成の経時変化
（１）ＢｒｄＵ陽性細胞の経時変化
　例２と同様にして肝部分切除ラットを作製した。肝部分切除後の肝臓内のＤＮＡ合成の経時変化を調べるために、ラットに対して、ＢｒｄＵを１００μｇ／ｇ体重の濃度で腹腔内注射した。ＢｒｄＵ投与後３時間目に肝臓組織を採取した。採取した肝臓組織は、１０％ホルマリンで固定し、パラフィン包埋した。パラフィン包埋した肝臓組織は５μｍ厚の切片にし、１０ｍＭクエン酸バッファーを用いて、１２０℃で２０分間賦活化を行った後、５％ヤギ血清を用いてブロッキングした。ブロッキング後、マウスモノクローナル抗ＢｒｄＵ抗体（MBL）を３７℃で６０分間反応させた。切片をＰＢＳで洗浄後、Ａｌｅｘａ４８８標識ヤギ抗マウスＩｇＧ（Invitrogen）を３７℃で６０分間反応させた。ＰＢＳで洗浄後、ＤＡＰＩを含む封入剤を用いて封入し、肝臓組織内でのＢｒｄＵの取り込みを観察した。結果を図２１に示す。
　ラット肝部分切除後の肝組織内でＤＮＡ合成が行われている細胞の割合を測定するために、肝部分切除を施したラットに対して、ＢｒｄＵを１００μｇ／ｇ体重の濃度で腹腔内注射した。ＢｒｄＵ投与後３時間目に、門脈より０．０３％コラゲナーゼ溶液で灌流した後、肝臓組織を採取して細切し、細胞懸濁液を得た。この細胞懸濁液を、０．２５％ＢＳＡを含むハンクス溶液（Invitrogen）で、細胞濃度が１×１０７個／１００μｌとなるように調整し、ＡＰＣ標識マウスモノクローナル抗ＢｒｄＵ抗体（BioLegends）を加え、３７℃で６０分間反応させた。反応終了後、フローサイトメトリーを用いて、ＢｒｄＵ陽性細胞数を計測した。結果を図２２に示す。図中、ラット肝部分切除後の肝臓内でのＢｒｄＵ陽性細胞の割合は、ＢｒｄＵ陽性細胞数をフローサイトメトリーで解析した全細胞数で割ったもので示した。
　図２１および２２に示す結果から、肝部分切除後、肝組織内でのＤＮＡ合成が二峰性に増加することがわかる。すなわち、切除の１日後に最初のピークがあり、２日後にはやや沈静化するが、３日後に再び増加し、４日後以降は徐々に低下していく。
（２）ＢｒｄＵ陽性肝細胞の経時変化
　例２と同様にして肝部分切除ラットを作製した。肝部分切除後の肝臓内の肝細胞におけるＤＮＡ合成の経時変化を調べるために、ラットに対して、ＢｒｄＵを１００μｇ／ｇ体重の濃度で腹腔内注射した。ＢｒｄＵ投与後３時間目に肝臓組織を採取した。採取した肝臓組織は、１０％ホルマリンで固定し、パラフィン包埋した。パラフィン包埋した肝臓組織は５μｍ厚の切片にし、１０ｍＭクエン酸バッファーを用いて、１２０℃で２０分間賦活化を行った後、５％ヤギ血清を用いてブロッキングした。ブロッキング後、ＡＰＣ標識マウスモノクローナル抗ＢｒｄＵ抗体（BioLegends）およびヤギ抗ＨＮＦ４α抗体（Santa Cruz）を３７℃で６０分間反応させた。切片をＰＢＳで洗浄後、Ａｌｅｘａ４８８標識ヒツジ抗ヤギＩｇＧ（Invitrogen）を３７℃で６０分間反応させた。ＰＢＳで洗浄後、ＤＡＰＩを含む封入剤を用いて封入し、肝臓組織内での肝細胞によるＢｒｄＵの取り込みを観察した。結果を図２３に示す。
　ラット肝部分切除後の肝組織内でＤＮＡ合成が行われている肝細胞の割合を測定するために、肝部分切除を施したラットに対して、ＢｒｄＵを１００μｇ／ｇ体重の濃度で腹腔内注射した。ＢｒｄＵ投与後３時間目に、門脈より０．０３％コラゲナーゼ溶液で灌流した後、肝臓組織を採取して細切し、細胞懸濁液を得た。この細胞懸濁液を、０．２５％ＢＳＡを含むハンクス溶液（Invitrogen）で、細胞濃度が１×１０７個／１００μｌとなるように調整し、ＡＰＣ標識マウスモノクローナル抗ＢｒｄＵ抗体（BioLegends）およびヤギ抗ＨＮＦ４α抗体（Santa Cruz）を加え、３７℃で６０分間反応させた。ＰＢＳで洗浄後、Ａｌｅｘａ４８８標識ヒツジ抗ヤギＩｇＧ（Invitrogen）を３７℃で６０分間反応させた。反応終了後、フローサイトメトリーを用いて、ＢｒｄＵ陽性ＨＮＦ４α陽性細胞数を計測した。結果を図２４に示す。図中、ラット肝部分切除後の肝臓内でのＢｒｄＵ陽性肝細胞の割合は、ＢｒｄＵ陽性肝細胞数をフローサイトメトリーで解析した全肝細胞数で割ったもので示した。
　図２３および２４に示す結果から、肝細胞の増殖は肝部分切除の１日後にピークをつけた後、徐々に減少することがわかる。肝細胞を含む肝臓に存在する全細胞の増殖は、図２１および２２に示すとおり、肝部分切除の１日後と３日後に２つのピークを有するところ、１日後の最初のピークは肝細胞の増殖が主体であり、３日後の２番目のピークは、肝細胞以外の細胞、例えば、幹細胞などの増殖によるものと考えられる。
例７　肝細胞の増殖に対する星細胞の関与
（１）肝細胞と星細胞との共培養
　星細胞が肝細胞の増殖に与える影響を評価するために、肝細胞と星細胞との共培養を行った。例５で得たａＨＳＣを６０ｍｍディッシュに１×１０５個の濃度で播種し、１０％ＦＢＳ加ＤＭＥＭを用いて、３７℃、５％ＣＯ２で２４時間培養した。培養２４時間目に培地を除去し、Opti-MEM I reducing medium（Invitrogen）を加えて、ｓｉＲＮＡのトランスフェクションの準備ができるまで前培養した。ｓｉＲＮＡを最終濃度が１０ｎＭとなるようにRNAiMAX(Invitrogen)と混合し、室温で１５分間静置してｓｉＲＮＡ複合体を得た。使用したｓｉＲＮＡは以下のとおりである。
ＧＦＰ　ｓｉＲＮＡ（Ambion、Silencer GFP siRNA、Cat. No.AM4626）
Ｓｃｒａｍｂｌｅ　ｓｉＲＮＡ：例１に記載のもの
ｇｐ４６　ｓｉＲＮＡ：例１に記載のもの
　ｓｉＲＮＡ複合体を前培養したａＨＳＣに添加し、３７℃、５％ＣＯ２で５時間培養した。培養５時間目に、培地を１０％ＦＢＳ加ＤＭＥＭに置換し、３７℃、５％ＣＯ２で４８時間培養した。培養４８時間目に、培地を除去して、Opti-MEM I reducing mediumを加え、ｓｉＲＮＡのトランスフェクションの準備ができるまで、前培養した。最終濃度が１０ｎＭとなるようにｓｉＲＮＡ（ＧＦＰ　ｓｉＲＮＡ、Ｓｃｒａｍｂｌｅ　ｓｉＲＮＡ、ｇｐ４６　ｓｉＲＮＡ）をＲＮＡｉＭＡＸと混合し、室温で１５分間静置した。ｓｉＲＮＡ複合体を前培養したａＨＳＣに添加し、３７℃、５％ＣＯ２で５時間培養した。培養５時間目に培地を除去し、ＰＢＳで洗浄した後、トリプシン－ＥＤＴＡ溶液を用いてＨＳＣを回収した。
　回収したＨＳＣは、事前にＧＦＰ遺伝子導入ラット肝臓から採取し、コラーゲンＩでコートした３５ｍｍディッシュに５×１０４個の濃度で播種した肝細胞に対して、５×１０４個／ディッシュの濃度で加え、３７℃、５％ＣＯ２で４８時間培養した。培養４８時間目に、培地を１０ｍＭ　ＢｒｄＵおよび１０％ＦＢＳを含むＤＭＥ／Ｆ１２培地に置換し、３７℃、５％ＣＯ２でさらに２４時間培養した。培養２４時間目に、培地を除去し、ＰＢＳで洗浄後、４％ＰＦＡを加え、室温で３０分間固定した。固定後、ＰＢＳで洗浄し、０．２Ｎ　ＨＣｌおよび０．１％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００を含むＰＢＳを加えて透過処理を行った。
（２）蛍光顕微鏡での観察
　上記（１）で透過処理を行った細胞をＰＢＳで洗浄後、５％ヤギ血清でブロッキングを行い、マウスモノクローナル抗ＢｒｄＵ抗体（MBL）およびウサギポリクローナル抗ＧＦＰ抗体（Invitrogen）を加えて一次抗体反応を３７℃で６０分間行った。一次抗体反応後、ＰＢＳで洗浄し、Ａｌｅｘａ４８８標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Invitrogen）およびＡｌｅｘａ５５５標識ヤギ抗マウスＩｇＧ（Invitrogen）を加えて二次抗体反応を３７℃で６０分間行った。二次抗体反応後、ＰＢＳで洗浄し、ＤＡＰＩを含む封入剤を用いて細胞を封入した。蛍光顕微鏡像を図２５に示す。
（３）ＦＡＣＳ解析
　ＢｒｄＵ陽性ＧＦＰ陽性肝細胞の割合を測定するために、上記（１）で透過処理を行った細胞をＰＢＳで洗浄した後、ＡＰＣ標識マウスモノクローナル抗ＢｒｄＵ抗体およびＦＩＴＣ標識ウサギポリクローナル抗ＧＦＰ抗体を加えて抗体反応を３７℃で６０分間行った。抗体反応終了後、ＰＢＳで細胞を洗浄して、ＦＡＣＳ解析によりＢｒｄＵ陽性ＧＦＰ陽性肝細胞の割合を測定した。結果を図２６に示す。ＢｒｄＵ陽性細胞の割合は、ＢｒｄＵ陽性細胞数をフローサイトメトリーで解析した全細胞数で割ったもので示した。
　図２５および２６に示した結果から、肝細胞をａＨＳＣと共培養すると、肝細胞を単独で培養したときよりも肝細胞の増殖が高まるが、ａＨＳＣにｇｐ４６　ｓｉＲＮＡを作用させるとこの効果が抑制されることがわかる。これらの結果は、ａＨＳＣが肝細胞の増殖に関与していることを示すものである。
例８　種々の処理を施したコラーゲンが肝細胞の増殖に与える影響
（１）種々の処理を施したコラーゲン上での肝細胞の培養
　ラット尾由来コラーゲンＩ（Ｓｉｇｍａ）を１０μｇ／ｃｍ２の濃度で６０ｍｍディッシュにコートした。変性コラーゲンＩは、ラット尾由来コラーゲンＩを６０℃で３０分間処理し、１０μｇ／ｃｍ２の濃度で６０ｍｍディッシュにコートした。ＭＭＰ１４処理コラーゲンＩは、ラット尾由来コラーゲンＩを活性型ＭＭＰ１４（R&D System）を含む反応液（０．１μｇ／ｍｌトリプシン３（Recombinant Human Active Trypsin3、R&D systems、Cat. No. 3714-SE）、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ、０．１５Ｍ　ＮａＣｌ、１０ｍＭ　ＣａＣｌ２、５μＭ　ＺｎＣｌ２、０．０５％（ｖ／ｖ）Ｂｒｉｊ３５、ｐＨ７．５）を用いて、室温で２０時間反応させた。反応終了後、ＭＭＰ１４処理コラーゲンＩを１０μｇ／ｃｍ２の濃度で６０ｍｍディッシュにコートした。肝細胞はラット肝臓から採取し、２×１０５個／ディッシュの濃度で播種し、３７℃、５％ＣＯ２で４８時間培養した。培養４８時間目に、培地を１０μＭ　ＢｒｄＵおよび１０％ＦＢＳを含むＤＭＥ／Ｆ１２培地に置換して、３７℃、５％ＣＯ２でさらに２４時間培養した。培養２４時間目に、培地を除去し、ＰＢＳで洗浄した後、４％ＰＦＡを加え、室温で３０分間固定した。固定後、ＰＢＳで洗浄し、０．２Ｎ　ＨＣｌおよび０．１％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００を含むＰＢＳを加えて透過処理を行った。
（２）蛍光顕微鏡での観察
　上記（１）で透過処理を行った細胞をＰＢＳで洗浄後、５％ヤギ血清でブロッキングを行い、マウスモノクローナル抗ＢｒｄＵ抗体（MBL）およびウサギポリクローナル抗ＧＦＰ抗体(Invitrogen)を加えて一次抗体反応を３７℃で６０分間行った。一次抗体反応後、ＰＢＳで洗浄し、Ａｌｅｘａ４８８標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Invitrogen）およびＡｌｅｘａ５５５標識ヤギ抗マウスＩｇＧ（Invitrogen）を加えて二次抗体反応を３７℃で６０分間行った。二次抗体反応後、ＰＢＳで洗浄し、ＤＡＰＩを含む封入剤を用いて細胞を封入した。蛍光顕微鏡像を図２７に示す。
（３）ＦＡＣＳ解析
　ＢｒｄＵ陽性肝細胞の割合を測定するために、上記（１）で透過処理を行った細胞をＰＢＳで洗浄した後、ＡＰＣ標識マウスモノクローナル抗ＢｒｄＵ抗体を加えて抗体反応を４℃で３０分間行った。抗体反応終了後、ＰＢＳで細胞を洗浄して、ＦＡＣＳ解析によりＢｒｄＵ陽性肝細胞の割合を測定した。結果を図２８に示す。ＢｒｄＵ陽性細胞の割合は、ＢｒｄＵ陽性細胞数をフローサイトメトリーで解析した全細胞数（３×１０４個）で割ったもので示した。
　図２７および２８に示した結果から、変性コラーゲンＩおよびＭＭＰ１４処理コラーゲンＩでコートしたディッシュにおいて、未処理のコラーゲンＩでコートしたディッシュに比べて、肝細胞の増殖が促進されることが分かる。ＨＳＣには、コラゲナーゼ活性を有するＭＭＰ１４が発現していることから、上記結果は、ＨＳＣによる肝細胞の増殖促進の一因として、ＨＳＣが発現するＭＭＰ１４によるコラーゲンへの作用が関与していることを示唆するものである。
例９　ａＨＳＣにおけるＭＭＰ１４の発現が肝細胞の増殖に与える影響
（１）肝細胞と星細胞との共培養
　星細胞が肝細胞の増殖に与える影響を評価するために、肝細胞と星細胞との共培養を行った。例５で得たａＨＳＣを６０ｍｍディッシュに１×１０５個の濃度で播種し、１０％ＦＢＳ加ＤＭＥＭを用いて、３７℃、５％ＣＯ２で２４時間培養した。培養２４時間目に培地を除去し、Opti-MEM I reducing medium（Invitrogen）を加えて、ｓｉＲＮＡのトランスフェクションの準備ができるまで前培養した。ｓｉＲＮＡを最終濃度が１０ｎＭとなるようにＲＮＡｉＭＡＸ(Invitrogen)と混合し、室温で１５分間静置してｓｉＲＮＡ複合体を得た。使用したｓｉＲＮＡは以下のとおりである。
ＧＦＰ　ｓｉＲＮＡ（Ambion、Silencer GFP siRNA、Cat. No.AM4626）
ＭＭＰ１４　ｓｉＲＮＡ：
センス鎖：５’－ＧＣＵＣＡＵＵＣＡＵＧＧＧＵＡＧＣＧＡＴＴ－３’（配列番号６）
アンチセンス鎖：５’－ＵＣＧＣＵＡＣＣＣＡＵＧＡＡＵＧＡＧＣＣＴ－３’（配列番号７）
ＨＧＦ　ｓｉＲＮＡ：
センス鎖：５’－ＡＵＡＵＣＵＵＵＣＣＧＧＣＡＡＧＡＡＵＵＵＧＵＧＣ－３’（配列番号８）
アンチセンス鎖：５’－ＧＣＡＣＡＡＡＵＵＣＵＵＧＣＣＧＧＡＡＡＧＡＵＡＵ－３’（配列番号９）
　ｓｉＲＮＡ複合体を前培養したａＨＳＣに添加し、３７℃、５％ＣＯ２で５時間培養した。培養５時間目に、培地を１０％ＦＢＳ加ＤＭＥＭに置換し、３７℃、５％ＣＯ２で４８時間培養した。培養４８時間目に、培地を除去して、Opti-MEM I reducing mediumを加え、ｓｉＲＮＡのトランスフェクションの準備ができるまで、前培養した。最終濃度が１０ｎＭとなるようにｓｉＲＮＡ（ＧＦＰ　ｓｉＲＮＡ、ＭＭＰ１４　ｓｉＲＮＡ、ＨＧＦ　ｓｉＲＮＡ）をＲＮＡｉＭＡＸと混合し、室温で１５分間静置した。ｓｉＲＮＡ複合体を前培養したａＨＳＣに添加し、３７℃、５％ＣＯ２で５時間培養した。培養５時間目に培地を除去し、ＰＢＳで洗浄した後、トリプシン－ＥＤＴＡ溶液を用いてＨＳＣを回収した。
　回収したＨＳＣは、事前にＧＦＰ遺伝子導入ラット肝臓から採取し、コラーゲンＩでコートした３５ｍｍディッシュに５×１０４個の濃度で播種した肝細胞に対して、５×１０４個／ディッシュの濃度で加え、３７℃、５％ＣＯ２で４８時間培養した。培養４８時間目に、培地を１０ｍＭ　ＢｒｄＵおよび１０％ＦＢＳを含むＤＭＥ／Ｆ１２培地に置換し、３７℃、５％ＣＯ２でさらに２４時間培養した。培養２４時間目に、培地を除去し、ＰＢＳで洗浄後、４％ＰＦＡを加え、室温で３０分間固定した。固定後、ＰＢＳで洗浄し、０．２Ｎ　ＨＣｌおよび０．１％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００を含むＰＢＳを加えて透過処理を行った。
（２）蛍光顕微鏡での観察
　上記（１）で透過処理を行った細胞をＰＢＳで洗浄後、５％ヤギ血清でブロッキングを行い、マウスモノクローナル抗ＢｒｄＵ抗体（MBL）およびウサギポリクローナル抗ＧＦＰ抗体（Invitrogen）を加えて一次抗体反応を３７℃で６０分間行った。一次抗体反応後、ＰＢＳで洗浄し、Ａｌｅｘａ４８８標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Invitrogen）およびＡｌｅｘａ５５５標識ヤギ抗マウスＩｇＧ（Invitrogen）を加えて二次抗体反応を３７℃で６０分間行った。二次抗体反応後、ＰＢＳで洗浄し、ＤＡＰＩを含む封入剤を用いて細胞を封入した。蛍光顕微鏡像を図２９に示す。
（３）ＦＡＣＳ解析
　ＢｒｄＵ陽性ＧＦＰ陽性肝細胞の割合を測定するために、上記（１）で透過処理を行った細胞をＰＢＳで洗浄した後、ＡＰＣ標識マウスモノクローナル抗ＢｒｄＵ抗体およびＦＩＴＣ標識ウサギポリクローナル抗ＧＦＰ抗体を加えて抗体反応を４℃で３０分間行った。抗体反応終了後、ＰＢＳで細胞を洗浄して、ＦＡＣＳ解析によりＢｒｄＵ陽性ＧＦＰ陽性肝細胞の割合を測定した。結果を図３０に示す。ＢｒｄＵ陽性細胞の割合は、ＢｒｄＵ陽性細胞数をフローサイトメトリーで解析した全細胞数で割ったもので示した。
　図２９および３０に示した結果から、ａＨＳＣによる肝細胞の増殖促進にａＨＳＣが発現するＭＭＰ１４が関与しており、その寄与度が、肝細胞の増殖促進のキーファクターとして知られるＨＧＦを上回ることがわかる。
例１０　ＭＭＰ１４処理コラーゲン上のＲＧＤ配列が肝細胞の増殖に与える影響
　ＧＦＰ遺伝子導入ラット肝臓から採取したラット肝細胞を２×１０５個／ｍｌの濃度でＤＭＥ／Ｆ１２培地に播種し、異なる濃度のペプチド（コントロールペプチド（Ｈ－Ｇｌｙ－Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ｇｌｕ－Ｇｌｕ－Ｓｅｒ－ＯＨ、Peptides International、Cat. No. PFA-3907-PI）：５００μｇ／ｍｌ、ＧＲＧＤＳペプチド（ペプチド研究所、Cat. No. 4189-v）：１００μｇ／ｍｌ、２００μｇ／ｍｌ、５００μｇ／ｍｌ）を加え、３７℃で３０分間反応させた。反応終了後のラット肝細胞を、ＭＭＰ１４で処理したコラーゲンＩをコートした３５ｍｍディッシュに５×１０４個／ディッシュの濃度で播種し、１０ｍＭ　ＢｒｄＵおよび１０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥ／Ｆ１２培地中、３７℃、５％ＣＯ２で７２時間培養した。培養終了後、培地を除去し、ＰＢＳで洗浄した後、４％ＰＦＡを加えて室温で３０分間固定した。固定後、ＰＢＳで洗浄し、０．２Ｎ　ＨＣｌおよび０．１％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００を含むＰＢＳを加えて透過処理を行った。
　ＰＢＳで洗浄後、５％ヤギ血清でブロッキングを行い、マウスモノクローナル抗ＢｒｄＵ抗体（MBL）およびウサギポリクローナル抗ＧＦＰ抗体（Invitrogen）を加えて一次抗体反応を３７℃で６０分間行った。一次抗体反応後、ＰＢＳで洗浄して、Ａｌｅｘａ４８８標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Invitrogen）およびＡｌｅｘａ５５５標識ヤギ抗マウスＩｇＧ（Invitrogen）を加えて二次抗体反応を３７℃で６０分間行った。二次抗体反応後、ＰＢＳで洗浄して、ＤＡＰＩを含む封入剤を用いて、細胞を封入した。蛍光顕微鏡像を図３１に示す。増殖細胞の割合は、ＢｒｄＵ陽性細胞数をカウントした全細胞数で割ったもので示した（図３２）。
　図３１および３２に示した結果から、ａＨＳＣによる肝細胞の増殖促進に、ＲＧＤ配列が関与していることが分かる。このことから、ａＨＳＣが発現するＭＭＰ１４の作用により露出したコラーゲンＩのＲＧＤ配列が、肝細胞の増殖促進に関与していることが示唆される。

Claims (19)

  1. 　活性化星細胞、活性化星細胞分解物、ＭＭＰ１４、ＭＭＰ１４で処理したコラーゲンおよび活性化星細胞分泌物からなる群から選択される成分を含む、組織再生を促進するための組成物。
  2. 　組織再生が、障害組織または移植組織において生じる、請求項１に記載の組成物。
  3. 　障害または移植を受けた日から４日以内に投与される、請求項２に記載の組成物。
  4. 　障害または移植を受けた日から１日以内に投与される、請求項２に記載の組成物。
  5. 　障害が、組織破壊、炎症、壊死、線維化、手術的侵襲、臓器不全からなる群から選択される、請求項２～４のいずれか一項に記載の組成物。
  6. 　組織再生が組織幹細胞の分化および／または増殖を伴う、請求項１～５のいずれか一項に記載の組成物。
  7. 　組織再生が組織実質細胞の増殖を伴う、請求項１～６のいずれか一項に記載の組成物。
  8. 　活性化星細胞が、ＨＧＦ、ＥＧＦ、ＭＭＰ１４からなる群から選択されるタンパク質の発現を増大させる処置を施されたものである、請求項１～７のいずれか一項に記載の組成物。
  9. 　組織再生が抑制された状態を有する対象に対して用いる、請求項１～８のいずれか一項に記載の組成物。
  10. 　組織再生が抑制された状態が、炎症、壊死、線維化、臓器不全、血小板数の減少、遺伝子異常、ノルアドレナリンの減少からなる群から選択される、請求項９に記載の組成物。
  11. 　対象において組織再生を促進する方法であって、請求項１～１０のいずれか一項に記載の組成物を、これを必要とする対象に投与する工程を含む、前記方法。
  12. 　活性化星細胞、活性化星細胞分解物、ＭＭＰ１４、ＭＭＰ１４で処理したコラーゲンおよび活性化星細胞分泌物からなる群から選択される成分を含む、幹細胞の分化および／または増殖のための組成物。
  13. 　活性化星細胞、活性化星細胞分解物、ＭＭＰ１４、ＭＭＰ１４で処理したコラーゲンおよび活性化星細胞分泌物からなる群から選択される成分と、幹細胞とを接触させる工程を含む、組織幹細胞を分化および／または増殖させる方法。
  14. 　活性化星細胞、活性化星細胞分解物、ＭＭＰ１４、ＭＭＰ１４で処理したコラーゲンおよび活性化星細胞分泌物からなる群から選択される成分を含む、細胞増殖を促進するための組成物。
  15. 　活性化星細胞、活性化星細胞分解物、ＭＭＰ１４、ＭＭＰ１４で処理したコラーゲンおよび活性化星細胞分泌物からなる群から選択される成分と、細胞とを接触させる工程を含む、細胞増殖を促進させる方法。
  16. 　ＭＭＰ１４を阻害する物質を含む、細胞増殖を抑制するための組成物。
  17. 　ＭＭＰ１４を阻害する物質が作用する細胞が、ＣＡＦおよび／または腫瘍細胞である、請求項１６に記載の組成物。
  18. 　ＭＭＰ１４で処理したコラーゲンを含む、細胞培養基材。
  19. 　ＭＭＰ１４で処理したコラーゲンで被覆された細胞培養容器。
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