WO2014104807A1 - 원심력 미세유동 기반 혈소판 복합기능 및 약물반응 검사 장치 및 방법 - Google Patents

원심력 미세유동 기반 혈소판 복합기능 및 약물반응 검사 장치 및 방법 Download PDF

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Definitions

  • the present invention relates to an apparatus and method for testing platelet drug response, and more particularly, to a small amount of blood using microflow over a simple disposable rotating disc in connection with early diagnosis and prognosis for thrombotic ischemia and hemorrhagic disease.
  • the present invention relates to a centrifugal force microfluidic platelet complex function and a drug response test apparatus and method capable of automatically testing.
  • Thrombosis is the production of hemostasis or blood clots in the blood vessels. If these symptoms occur in the coronary arteries or cerebrovascular vessels of the heart, they cause a heart attack or cerebral infarction. It is a cause of death. The problem is that these thrombosis or hemorrhagic conditions are not diagnosed with genetic defects alone and are still unclear.
  • the platelet function test is an important test for discriminating hemorrhagic disease caused by congenital or acquired platelet dysfunction mainly in hemorrhagic disease without platelet count abnormality.
  • the platelet function test is a situation that is widely used for the test for the increase of hemorrhagic tendency or the resistance of the drug due to the antiplatelet drugs used for the treatment and prevention of cardiovascular diseases.
  • vascular endothelial cell When a wound occurs in a vascular endothelial cell, a substance such as collagen, which constitutes a vascular endothelial cell internal material, is exposed to blood flow, and platelets are attached to this material and activated. The mechanism of platelet adhesion depends on the environment of blood flow.
  • the platelet is difficult to adhere to the vascular lining when the blood flow rate is high and the shear force acting on the blood vessel wall, such as an artery, but it is activated under such conditions, and the von Willebrand factor (vWF) is easily attached to the vessel wall.
  • vWF von Willebrand factor
  • Platelet is attached to the vessel wall.
  • GPIb-IX-V a glycoprotein receptor complex present in platelet cell membranes, is known to cause interaction with von Willebrand factor (vWF).
  • the platelets thus attached draws the same kind of platelets, causing aggregation (aggregation) to hemostasis, and then strengthens the hemostatic action by fibrin again.
  • platelets does not always work only in the best way, but may function as a dysfunction in certain flow conditions or situations. For example, when a blood vessel wall is locally constricted due to atherosclerosis, platelets pass through this area and are exposed and activated at high shear rates, causing adhesion-coagulation at the posterior side of the stenosis, which can lead to clogged blood clots. .
  • the platelet and von Willebrand factor (vWF) are activated according to the magnitude of blood flow, that is, by shear stress caused by the flow, and the adhesion is greatly increased to have a hemostatic mechanism.
  • the shear force required for activation of platelets or von Willebrand factor (vWF) is 8 Pa or more, and the shear rate is known to be 5,000 1 / s or more.
  • the device As described above, various devices have been proposed and developed for early diagnosis and prognostic examination of hemostasis or thrombosis. However, if the device is classified based on a measurement sensor, it can be classified into a method of measuring the electrical, optical, and bleeding stop time.
  • Bleeding time (BT) test is a bleeding time measurement test developed about 100 years ago and is still used as a platelet function screening test.
  • the platelet function test that is currently used is difficult to standardize, there is a problem that the clinical usefulness and invasive methods must be used, and therefore, an objective measurement method for measuring platelet function has been required.
  • the Platelet Function Analyzer e.g. PFA-100
  • the von Willebrand factor (vWF) activated at high shear rate is used.
  • Platelet is aggregated by means of agglomerating platelets.
  • whole blood is flowed in a long capillary tube at high shear rate, and then platelets are formed in an orifice coated with collagen (ADP) or epinephrine (Epinephrine).
  • ADP collagen
  • Epinephrine epinephrine
  • vWF von Willebrand factor
  • blood samples must be exposed for a certain period of time at high shear rates.
  • PFA-100 employs a method of rapidly flowing blood through a fairly long capillary tube.
  • this method requires not only a large amount of blood, but also the von Willebrand factor located in the center of the tube where the shear rate is minimal but the von Willebrand factor (vWF) near the capillary wall at which the shear rate is maximum can be easily activated.
  • Factor (vWF) has a problem that can not be activated, which has the disadvantage that can cause problems in the repeatability of the test results.
  • Diamed's IMPACT adopts the Cone-Plate type rotary Kuet flow method to apply uniform shear force to the blood filled in it, and measures the platelet adhesion rate when high shear force is applied.
  • This like PFA-100, has a disadvantage that is very dependent on the concentration and function of von Willebrand factor (vWF) and fibrinogen.
  • vWF von Willebrand factor
  • Verify-NOW adopts the principle of measuring the degree of platelet aggregation as turbidity using an optical sensor, which mixes agonists in the blood and interacts with microbeads coated on the surface of the collagen. After the platelet is agglomerated to measure the turbidity according to the time, so despite the technical drawbacks of the existing various turbidity measurement method, the use frequency is increasing in recent years.
  • an object of the present invention is to solve the problems of the prior art as described above, to reduce the test cost and test by enabling multiple multiple early diagnosis and prognosis test for hemorrhagic and thrombotic disease in one test It is to provide a centrifugal force microfluidic platelet complex function and drug response test apparatus and method that can improve repeatability and precision.
  • Another object of the present invention is to provide a centrifugal force-based microfluidic platelet complex function and drug response test apparatus and method having a structure capable of automatically measuring the clogging time of blood flow.
  • the rotatable disk in order to achieve the object as described above, the rotatable disk; A sample chamber disposed at the center of the disk, the sample chamber receiving a blood sample therein; A stirring chamber connected to the sample chamber in a plurality of radial directions, respectively, for inducing shear flow in the blood sample; A microchannel connected to the stirring chamber, wherein the blood sample is moved and platelet adhesion and aggregation occur; And it provides a centrifugal force microfluidic platelet complex function and drug response testing device comprising a lung sample chamber that accommodates the blood sample passing through the microchannel.
  • the test apparatus may further include a measuring unit installed on the disk and measuring a moving distance of the blood sample.
  • the stirring chamber may be rotatably installed.
  • the stirrer may have a shape selected from a straight round rod, cross round rod, circular plate shape.
  • a drug for activating or deactivating platelet aggregation may be stored in a liquid or solid state inside the stirrer.
  • the drug in the present invention may be one or more agonists (agonist) selected from collagen, adenosine diphosphate (ADP), epinephrine (Epinephrine).
  • agonist selected from collagen, adenosine diphosphate (ADP), epinephrine (Epinephrine).
  • the drug may be at least one antagonist selected from aspirin, P2Y1 receptor antagonist, and P2Y12 receptor antagonist.
  • the P2Y1 receptor antagonist may be at least one selected from MRS 2179, MRS 2279, MRS 2500, A2P5P, A3P5P, and A3P5PS.
  • the P2Y12 receptor antagonist is clopidogrel, ticlopidine, prasugrel, AR-C67085MX, cangrelor, C1330-7, MRS 2395, 2-methylthioadenosine-5'- It may be at least one selected from monophosphate.
  • the minimum shear rate in the shear flow generated by the stirrer may be 5,000 (s ⁇ 1 ) or more, or the minimum shear force may be 8 Pa or more.
  • the center and both sides of the stirrer are open, the open portion may be provided with a sealing material.
  • the sealant may be a phase change material or a water-soluble membrane.
  • the phase change material may be paraffin wax, and the water-soluble membrane may be starch.
  • the microfluidic valve may be installed at the front end of the microchannel to control the flow of the blood sample.
  • the shape of the fine channel may be formed of any one or a combination of linear, curved, and zigzag shapes.
  • the microchannel may be formed with an intermediate chamber at a plurality of intermediate points.
  • the microchannel may be provided with a plurality of enlargements having a relatively large width in the middle.
  • the present invention also provides a rotatable disk; A plurality of stirring chambers arranged in a circumferential direction at a central portion of the disk, accommodating a blood sample therein, and inducing shear flow in the blood sample; A microchannel connected to the stirring chamber, wherein the blood sample is moved and platelet adhesion and aggregation occur; And it provides a centrifugal force microfluidic platelet complex function and drug response testing device comprising a lung sample chamber that accommodates the blood sample passing through the microchannel.
  • the present invention comprises the steps of injecting a blood sample;
  • the blood sample is introduced into a stirring chamber, and the drug is discharged into the stirring chamber while the agitator in the stirring chamber is rotated;
  • the blood sample is moved through a microchannel and stopped by aggregation of platelets;
  • the disk is stopped, provides a centrifugal force microfluidic platelet complex function and drug response test method comprising the step of measuring the mobility of the blood sample.
  • the present invention comprises the steps of injecting a blood sample; Rotating the disk into which the blood sample is injected; The blood sample is released through the microchannels and is transported to stop by aggregation of platelets; And the disk is stopped, provides a centrifugal force microfluidic platelet complex function and drug response test method comprising the step of measuring the mobility of the blood sample.
  • multiple drug tests on a single blood sample can be performed on multiple channels in a single test in multiple channels, thereby enabling multiple tests for complex platelet function, reducing test time, and reducing test cost.
  • all the parts in contact with the blood can be made disposable and can be disposed of after use, so that the user's convenience and the risk of blood infection can be obtained.
  • FIG. 1 is a block diagram of the centrifugal force microfluidic platelet complex function and drug response test apparatus according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 2 is a block diagram showing the progress of a blood sample according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 3 is a block diagram showing the inside of the agitator according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 4 is a view showing another example of the microchannel and the flow pressure distribution according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 5 is a block diagram of a centrifugal force microfluidic platelet complex function and drug response test apparatus according to another embodiment of the present invention.
  • Figure 6 is a flow chart of the centrifugal force microfluidic platelet complex function and drug reaction test method according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 1 is a block diagram of the centrifugal force microfluidic platelet complex function and drug response test apparatus according to an embodiment of the present invention
  • Figure 2 is a block diagram showing the progress of a blood sample according to an embodiment of the present invention
  • Figure 3 is a block diagram showing the inside of the agitator according to an embodiment of the present invention.
  • the centrifugal force microfluidic platelet complex function and drug response test apparatus is a rotatable disk (10); A sample chamber 20 disposed in the center of the disc 10 and containing a blood sample therein; A stirring chamber 30 connected to the sample chamber 20 in a plurality of radial directions, respectively, for inducing shear flow in the blood sample; A microchannel 40 connected to the stirring chamber 30 and generating platelet adhesion and aggregation; And a lung sample chamber 24 in which a blood sample passing through the microchannel 40 is accommodated.
  • the microchannel 40 may have a polygonal, circular or elliptical shape such as a quadrangle.
  • the length of one corner may be 1 to 1,000 ⁇ m, preferably 10 to 200 ⁇ m, more preferably 20 to 50 ⁇ m. Even when the cross-sectional shape is circular, it may have a diameter in the above range.
  • the blood sample is moved in the radial direction by the centrifugal force.
  • the sample moving distance is different according to the degree of cohesion or adhesion of platelets, and the cohesion and adhesion of relative platelets are measured using the difference of the moving distance.
  • FIG. 1 is an embodiment of the present invention, in which a plurality of stirring chambers 30 are divided radially from one blood sample chamber 10, and each stirring chamber 30 includes a special drug for examination purposes. This allows you to perform a variety of drug response tests in one test.
  • the measurement of the moving distance of the blood sample may be obtained through the measuring unit 50 installed in the disk 10.
  • the measuring unit 50 may be configured with a device such as a small camera to acquire and analyze an image, or may measure a moving distance of a blood sample through a combination of sensors such as an LED and a photodiode sensor at a specific position.
  • the blood sample is introduced into the stirring chamber 30 through the connection channel 22.
  • the microfluidic valve 42 may be installed at the front end of the microchannel 40. The blood sample is then introduced into the lung sample chamber 24 through the microchannel 40.
  • an agitator 32 may be rotatably installed in the stirring chamber 30 to stir a blood sample.
  • the stirrer 32 can be rotated by a non-contact manner such as magnetic force, and can effectively generate the stirring and shear flow by controlling the rotation speed.
  • the shape of the stirrer 32 may have a variety of shapes, such as a cross-shaped circular rod or a circular plate shape, including a generally used round rod.
  • the stirring chamber 30 When the stirrer 32 is rotated by a non-contact force, the stirring chamber 30 generates not only stirring but also shear flow according to the rotation speed. This type of shear flow may be intermittent shear flow in the case of a straight circular rod, and continuous shear flow may occur in the case of a circular plate.
  • the stirrer 32 may be made of a thin metal so that it may be magnetized by the magnetic force of a separately installed stirring induction device (not shown) to be affected without a mechanical connection.
  • the diameter or thickness of the stirrer 32 is preferably about half the size of the depth of the stirring chamber 30, the length or diameter of the stirrer 32 has a size of 80 to 90% of the diameter of the stirring chamber 30 Is appropriate.
  • the drug 34 for activating or deactivating platelet aggregation may be stored in the stirrer 32 in a liquid or solid state. That is, the inside of the stirrer 32 may be hollow, and may store the drug in the form of a liquid or solid particulate powder in the stirrer 32.
  • the opening portion may be provided with a sealing material 36.
  • a phase change material such as paraffin wax, a water-soluble membrane such as starch, or the like is preferably used.
  • the paraffin wax is exposed to a certain temperature or more, the solid is changed into a liquid, and the sealing of the agitator 32 is released.
  • the drug 34 inside the agitator 32 is released into the stirring chamber 30 by centrifugal force.
  • the starch may be easily melted and released when exposed to blood, and the drug 34 may be released into the stirring chamber 30.
  • the sealing material 36 of the phase change material when used, the sealing may be released by irradiating a seal material 36 with a laser or electromagnetic wave to melt the phase change material.
  • the sealing material 36 when used as the water-soluble membrane, when the stirrer 32 is rotated to dissolve quickly in the blood, the sealing may be released and the drug 34 inside the stirrer 32 may be released.
  • the principle that the drug 34 is released may be the centrifugal force due to the rotation of the stirrer 32 may be the main driving force.
  • the minimum shear rate by rotation of the stirrer 32 is preferably 5,000 (s ⁇ 1 ) or more, or the minimum shear force is preferably 8 Pa or more.
  • the time that the blood sample is exposed to the shear flow field is preferably at least 30 seconds or more. This is to use the shear rate to achieve sufficient activation of platelets and von Willebrand factor (vWF).
  • Drugs 34 filled in the stirrer 32 include adenosine diphosphate (ADP) that activates platelet aggregation, an agonist such as epinephrine, and an antagonist that inactivates platelet aggregation or adhesion. Or two or more kinds thereof.
  • ADP adenosine diphosphate
  • the drug 34 may be filled in the form of a liquid phase and a liquid phase, a liquid phase and a solid phase inside the stirrer 32, respectively, and may be stored separately in different spaces. Moreover, when the drug 34 is only filled in solid phase, it may be stored mixed with each other as fine particles.
  • the platelet reaction by the drug 34 is generated while being homogeneously mixed by the rotation of the stirrer 32.
  • aggregation of platelets may be promoted to form large aggregates.
  • the rotating device (not shown) connected to the disk 10 including the stirring chamber 30 and the microchannel 40, etc. is allowed to rotate slowly. It has a fixed speed. At this time, the blood sample stored in the stirring chamber 30 is to go out in the radial direction by the centrifugal force, but clogged with a sealing material 36, such as a phase change material, the flow does not occur. However, when heat is transferred to the phase change material site by electromagnetic waves, lasers or other heating means, the flow path in the channel opens and the blood sample moves radially.
  • the microfluidic valve 42 is opened and the disk 10 is rotated, wherein the blood sample is a radius due to the centrifugal force by the rotation Force in the direction of movement along the microchannel 40.
  • the blood sample reacted with the drug 34 has a different speed of movement according to the degree of aggregation of platelets, and the drug reaction test of platelets is performed by using a characteristic of varying the degree of movement.
  • the intermediate chamber 44 may be formed at a plurality of intermediate points in the straight channel as shown in FIG. 1. The intermediate chamber 44 may reduce the flow rate of the blood sample to cause platelet aggregation, and serve to promote clogging of the aggregated platelet mass when reentering the microchannel 40.
  • blood mobility may be determined according to the degree of drug response of blood. That is, the blood sample that responds well to the agonist forms a large number of relatively large platelet aggregates, which act as a large flow resistance in the microchannel 40 to reduce the movement ratio of blood to the control group (Control). However, in the case of a blood sample that does not react well with the agonist, the degree of aggregation of platelets is low, which causes the blood to travel very long and may proceed by centrifugal force downstream. As such, the mobility ratio may be calculated by comparing the mobility of the blood sample mixed with the drug 34 with the moving distance of the sample group.
  • the arrangement of the microchannels 40 connected in the downstream direction of the stirring chamber 30 may be arranged radially in a straight, curved or zigzag form as in FIG. 1, or may be made of various combinations thereof.
  • the microchannel 40 may be configured as a straight channel
  • the microchannel 40 includes a relatively wider portion 46 in the middle to reduce the flow rate of the blood sample and reduce the aggregation and adhesion of platelets. Can be configured to increase. If the enlarged portion 46 is properly disposed in the middle, the blood sample may have a characteristic of moving while experiencing a pulsating pressure or a shear force, thereby simulating the flow in the living body.
  • the microchannel 40 connected to the enlargement 46 may depict a constriction that is present inside the blood vessel.
  • the surface of the enlarged portion 46 may be coated with an agonist that may increase adhesion of platelets, thereby improving discrimination of blood mobility. Blood samples that have passed through all of these microchannels 40 are collected into the lung sample chamber 24.
  • Examples of the drug include agonists that help platelets adhere, that is, collagen, ADP, and epinephrine.
  • antagonists that prevent or inhibit platelet aggregation may include aspirin, P2Y1 receptor antagonists, and P2Y12 receptor antagonists. Can be.
  • the P2Y1 receptor antagonist may be at least one of candidates such as MRS 2179, MRS 2279, MRS 2500, A2P5P, A3P5P, and A3P5PS.
  • the P2Y12 receptor antagonist may be at least one of candidates such as clopidogrel, ticlopidine, prasugrel, AR-C67085MX, cangrelor, C1330-7, MRS 2395, 2-methylthioadenosine-5'-monophosphate and the like.
  • the measurement of platelet aggregation function and resistance to drugs in the relevant drug users can be carried out by the test apparatus according to the present invention.
  • the drug resistance test that is, when taking aspirin, clopidogrel, ticlopidine, etc.
  • the aggregation function of platelets decreases, so the flow path inside the microchannel is not easily blocked, the clogging time increases and the travel distance increases.
  • the blockage time is short in response to the drug. If the ratio of the blockage time is significantly lower than that of the normal person, the drug resistance of aspirin and clopidogrel is determined.
  • centrifugal force microfluidic platelet complex function and drug response test apparatus according to another embodiment of the present invention will be described.
  • FIG. 5 is a block diagram of a centrifugal force microfluidic platelet complex function and drug response test apparatus according to another embodiment of the present invention.
  • the stirring chamber 30 may also have a function of the sample chamber to accommodate a blood sample, that is, the sample chamber 20 and the stirring chamber 30 of FIG. 1 may be merged.
  • the number of the stirring chambers 30 is not limited to the four illustrated, and for example, a plurality of stirring chambers 30 and the same number of microchannels 40 may be provided to enable a plurality of blood samples to be examined.
  • a plurality of stirring chambers 30 may be disposed along the circumferential direction at the center portion of the disk 10, and blood samples injected into each stirring chamber 30 may be moved in radial directions, respectively.
  • the configuration of the fine channel 40 may be configured in a combination of various shapes, such as straight, curved or zigzag form as shown in FIG.
  • Figure 6 is a flow chart of the centrifugal force microfluidic platelet complex function and drug reaction test method according to an embodiment of the present invention.
  • the examiner injects the blood sample collected intravenously into the sample chamber 20 (S10). Thereafter, the blood sample enters the stirring chamber 30 through the connecting channel 22 connected to the sample chamber 20, and the inside of the stirrer 32 is rotated by the magnetic force of the stirrer 32 in the stirring chamber 30. The drug 34 stored in the is released and mixed with the blood sample (S20).
  • the disk 10 provided with the sample chamber 20 is rotated (S30). Thereafter, when the microfluidic valve 42 is opened, the blood sample is moved downstream through the microchannel 40, and the speed and the moving distance of the microchannel 40 through the microchannel 40 vary depending on the degree of adhesion and adhesion of platelets. It is stopped or moved to the end (S40).
  • the disk 10 is stopped and the mobility of the sample is measured by the measuring unit 50 such as an imaging device or a light source and a light sensing sensor (S50).
  • the measuring unit 50 such as an imaging device or a light source and a light sensing sensor (S50).
  • platelets may be activated through high shear flow of blood by centrifugal force.
  • the microfluid valve 42 is opened after the blood flow is injected, the microfluid valve 42 is increased to a constant rotational speed after being closed, and the microfluidic valve 40 opens. Flow occurs.
  • the activated platelets react with a drug such as an agonist coated on the enlarged portion 46 or a specific portion of the microchannel to prevent adhesion and aggregation, thereby preventing the progress of flow.
  • the drug reaction test may be performed using the movement ratio of the sample flow or the time to reach the end of the microchannel 40.

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Abstract

본 발명은 원심력 미세유동 기반 혈소판 복합기능 및 약물반응 검사 장치 및 방법에 관한 것으로, 본 발명에 따른 검사 장치는 회전 가능한 디스크; 디스크의 중앙에 배치되고, 혈액 샘플이 내부에 수용되는 샘플 챔버; 샘플 챔버와 다수의 반경방향으로 각각 연결되고, 혈액 샘플 내에 전단유동을 유도하는 교반 챔버; 교반 챔버에 연결되고, 혈액 샘플이 이동되면서 혈소판의 부착과 응집이 발생하는 미세 채널; 및 미세 채널을 통과한 혈액 샘플이 수용되는 폐샘플 챔버를 포함할 수 있다. 이와 같은 본 발명에 의하면, 하나의 혈액 샘플에 대한 다수의 약물 검사를 다수의 채널에서 한 번의 검사로 복합적인 혈소판 기능에 대한 다중검사가 가능하고 검사 시간이 감소하며 검사 비용도 절감되는 효과가 있다.

Description

원심력 미세유동 기반 혈소판 복합기능 및 약물반응 검사 장치 및 방법
본 발명은 혈소판 약물반응 검사 장치 및 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 혈전성 허혈 및 출혈증에 대한 조기 진단과 예후와 관련하여 간단한 일회용 회전형 디스크 위에서 마이크로 유동을 이용하여 소량의 혈액으로 다수의 검사를 자동으로 검사할 수 있는 원심력 미세유동 기반 혈소판 복합기능 및 약물반응 검사 장치 및 방법에 관한 것이다.
혈전증(Thrombosis)은 혈관 내에서 지혈 또는 혈전 등이 생성되는 것인데, 이러한 증상이 심장의 관상동맥이나 뇌혈관에서 발생하면 심장마비 또는 뇌경색을 유발하며, 침묵의 살인자라는 별명을 지닌 혈전증은 현대인의 주요 사망원인으로 대두되고 있다. 문제는 이러한 혈전증 또는 출혈성 병증이 유전적 결함만으로 진단되지 않으며, 아직도 명확하게 밝혀지지 않은 상태이다.
더욱이, 이러한 혈전증 유병률이 유전 및 후천적 발생 요인 등에 의하여 매우 빠르게 증가하고 있다는 점이 더욱 심각한 문제이다. 따라서, 혈전증이나 출혈성 병증을 정량적으로 검사하고, 이를 통해 조기 진단 및 예후를 판단할 수 있는 장치와 방법이 오래 전부터 요구되어 왔다.
상처를 입은 혈관의 지혈 기전에 관여하는 여러 가지 인자들이 존재하는데, 각 요소들의 생화학적 및 생물리학 기전이 모두 중요하게 작용하고 있으며, 그 중에서도 혈소판의 지혈 기전은 결정적인 역할을 하는 것으로 잘 알려져 있다. 혈소판은 상처가 없는 혈관벽에서는 부착되지 않지만, 상처가 발생한 혈관벽에는 생화학적 및 생물리학적인 기전이 동시에 작용하여 어떠한 유동조건이든지 상관없이 지혈이 이루어질 수 있도록 작용한다.
이러한 혈소판의 기능(function)을 세분화하여 검사하려는 다양한 방법과 장치들이 병행하여 개발되어 왔다. 혈소판 기능 검사는 주로 혈소판의 수적 이상이 없는 출혈성 질환에서 선천성 혹은 후천성 혈소판 기능 이상에 의한 출혈성 질환을 감별하는 데 중요한 검사이다. 또한, 이러한 혈소판 기능 검사는 심혈관 질환의 치료 및 예방에 사용되는 항혈소판 약제로 인하여 출혈성 경향의 증가나 약제의 내성에 대한 검사를 위해서도 많이 이용되고 있는 실정이다.
혈관 내피세포에 상처가 발생하였을 경우, 혈관 내피세포 내부 물질을 구성하는 콜라젠과 같은 물질이 혈액 유동에 노출되고, 혈소판은 이러한 물질에 부착되면서 활성화된다. 혈소판의 부착 기전은 혈액유동의 환경에 따라 다른 특성을 띠게 된다.
이를 상세하게 설명하면, 동맥과 같이 혈류속도가 빠르고 혈관벽에 작용하는 전단력이 높은 경우 혈소판이 혈관 내막에 부착되기 어렵지만, 이러한 조건에서 활성화되어 혈관벽에 쉽게 부착하는 폰 빌레브란트 인자(vWF: von Willebrand factor)에 의하여 혈소판이 혈관벽에 부착된다. 물론 혈소판 세포막에 존재하는 당단백질 수용체(glycoproteic receptor) 복합체인 GPIb-IX-V 등이 폰 빌레브란트 인자(vWF)와 상호작용을 유발하여 부착되는 것으로 알려져 있다.
이와 같이 부착된 혈소판은 동류의 혈소판을 끌어들여 응집(aggregation)을 유발시켜 지혈을 하게 되며, 이후 다시 피브린에 의하여 지혈작용을 강화시킨다.
그러나, 이와 같이 혈소판의 기능이 항상 좋은 쪽으로만 작용하는 것이 아니라, 특정의 유동 조건이나 상황에서는 역기능으로 작용할 수 있다. 예를 들면, 동맥경화로 인하여 혈관벽이 국부적으로 협착되었을 경우, 혈소판이 이러한 부분을 통과하면서 높은 전단률에 노출되어 활성화됨으로써, 협착부 후방부에 부착-응집이 발생하여 혈관이 막히는 혈전증을 유발하기도 한다.
앞서 기술한 바와 같이 혈류 유동의 크기에 따라, 즉 유동에 의한 전단력(shear stress)에 의하여 혈소판 및 폰 빌레브란트 인자(vWF)는 활성화되며, 부착성이 크게 증가되어 지혈 기전을 갖게 된다. 이와 같이 혈소판이나 폰 빌레브란트 인자(vWF)의 활성화에 필요한 전단력은 8 Pa 이상이며, 전단률(shear rate)로는 5,000 1/s 이상인 것으로 알려져 있다.
이와 같이 지혈 또는 혈전 병증의 조기 진단 및 예후 검사를 위하여 다양한 장치들이 제안되고 개발되었지만, 이를 계측 센서를 기준으로 구분하면, 전기적, 광학적, 그리고 출혈정지 시간을 측정하는 방식 등으로 구분할 수 있다.
출혈시간(Bleeding time, BT) 검사법은 약 100년 전에 개발된 출혈시간 측정검사로서, 현재까지도 혈소판 기능 선별검사로 간혹 사용되고 있다. 그러나, 현재 사용되고 있는 혈소판 기능 검사의 경우 표준화가 어렵고 임상적 유용성이 적으며 침습적 방법을 사용해야 하는 문제가 있고, 이에 따라 혈소판 기능을 측정할 수 있는 객관화된 측정법이 요구되어 왔다.
이상의 문제점을 해결하기 위해 고안되어 혈소판의 기능을 측정하는 기술로 사용되고 있는 혈소판 기능 분석기(Platelet Function Analyzer)(예: PFA-100)의 경우에는, 고전단률에서 활성화된 폰 빌레브란트 인자(vWF)에 의하여 혈소판이 응집되는 특성을 이용한 것으로, 이러한 특성을 측정하기 위하여 긴 모세관에 고전단률로 전혈을 유동시킨 후, 콜라젠(Collagen)과 함께 ADP 혹은 에피네프린(Epinephrine)이 코팅된 오리피스(orifice)에 혈소판이 응집되어 오리피스 구멍이 막히는 막힘시간을 압력 또는 유량 등으로 측정하는 방법이 시행되고 있다.
이러한 혈소판 기능 검사를 위해서는, 폰 빌레브란트 인자(vWF)의 기능에 절대적으로 의존하여야 하고, 헤마토크릿(Hct)에 의존적인 검사가 이루어지며, 항아스피린(Aspirin) 또는 항클로피도그렐(Clopidogrel) 검사가 불가한 단점이 있다. 또한, 혈소판의 기능 검사를 위해 두 단계에 걸쳐 검사가 필요하여 검사 비용이 높아지는 단점을 가지고 있다.
특히, 폰 빌레브란트 인자(vWF)를 활성화하기 위하여 혈액 샘플이 높은 전단률로 일정 시간 이상에 노출되어야 하는데, 이를 위해 PFA-100에서는 상당히 긴 모세관에 빠른 속도로 혈액을 유동시키는 방법을 채택하였다. 그러나, 이러한 방법은 다량의 혈액이 요구될 뿐 아니라, 전단률이 최대가 되는 모세관 벽 근처의 폰 빌레브란트 인자(vWF)는 쉽게 활성화될 수 있지만 전단률이 최소가 되는 관 중심부에 위치한 폰 빌레브란트 인자(vWF)는 활성화되지 못하는 문제점을 갖고 있으며, 이로 인해 검사결과의 반복성에 문제를 초래할 수 있는 단점을 지니고 있다.
Diamed사의 IMPACT는 Cone-Plate 방식의 회전형 쿠엣 유동방식을 채택하여 그 안에 채워진 혈액에 균일한 전단력을 가하는 방식으로 구성되어 높은 전단력을 가하였을 경우 혈소판의 부착 정도를 측정하는 방식이다. 이는 PFA-100과 마찬가지로 폰 빌레브란트 인자(vWF) 및 피브리노겐(Fibrinogen)의 농도 및 기능에 매우 의존적인 단점을 갖고 있다.
Verify-NOW(Accumetrics)는 혈소판 응집 정도를 광학 센서를 이용하여 탁도로 측정하는 원리를 채택하였는데, 이는 혈액에 아고니스트(agonist)를 혼합하고 콜라젠이 표면에 코팅된 마이크로 비드와 작용시켜 혈액 내부에 혈소판이 응집되도록 한 후 이를 시간에 따라 탁도로 측정하는 방식이어서, 기존의 여러 가지 탁도 측정 방식의 기술적 단점을 그대로 보유하였음에도 불구하고 최근 사용 빈도가 늘어나고 있는 상황이다.
따라서, 본 발명의 목적은 상기한 바와 같은 종래 기술의 문제점을 해결하기 위한 것으로, 한 번의 검사로 출혈성 및 혈전성 병증에 대한 복합적인 다중 조기 진단 및 예후 검사가 가능하도록 하여 검사 비용을 절감하고 검사 반복성과 정밀도를 향상시킬 수 있는 원심력 미세유동 기반 혈소판 복합기능 및 약물반응 검사 장치 및 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 자동으로 혈액유동의 막힘 시간(Closure time)을 측정할 수 있는 구조를 가진 원심력 미세유동 기반 혈소판 복합기능 및 약물반응 검사 장치 및 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 상기한 바와 같은 목적을 달성하기 위해, 회전 가능한 디스크; 상기 디스크의 중앙에 배치되고, 혈액 샘플이 내부에 수용되는 샘플 챔버; 상기 샘플 챔버와 다수의 반경방향으로 각각 연결되고, 상기 혈액 샘플 내에 전단유동을 유도하는 교반 챔버; 상기 교반 챔버에 연결되고, 상기 혈액 샘플이 이동되면서 혈소판의 부착과 응집이 발생하는 미세 채널; 및 상기 미세 채널을 통과한 혈액 샘플이 수용되는 폐샘플 챔버를 포함하는 원심력 미세유동 기반 혈소판 복합기능 및 약물반응 검사 장치를 제공한다.
본 발명에 따른 검사 장치는 상기 디스크에 설치되고, 상기 혈액 샘플의 이동거리를 측정하기 위한 측정부를 더 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 교반 챔버에는 교반기가 회전 가능하게 설치될 수 있다.
본 발명에서 상기 교반기는 일자 원형봉, 십자 원형봉, 원형판 형상 중에서 선택되는 형상을 가질 수 있다.
본 발명에서 상기 교반기의 내부에는 혈소판 응집을 활성화시키거나 비활성화시키기 위한 약물이 액체 또는 고체의 상태로 저장될 수 있다.
본 발명에서 상기 약물은 콜라젠, 아데노신2인산(ADP), 에피네프린(Epinephrine) 중에서 선택되는 1종 이상의 아고니스트(agonist)일 수 있다.
본 발명에서 상기 약물은 아스피린, P2Y1 리셉터 안타고니스트, P2Y12 리셉터 안타고니스트 중에서 선택되는 1종 이상의 안타고니스트(antagonist)일 수 있다.
본 발명에서 상기 P2Y1 리셉터 안타고니스트는 MRS 2179, MRS 2279, MRS 2500, A2P5P, A3P5P, A3P5PS 중에서 선택되는 1종 이상일 수 있다.
본 발명에서 상기 P2Y12 리셉터 안타고니스트는 클로피도그렐(clopidogrel), 티클로피딘(ticlopidine), 프라수그렐(prasugrel), AR-C67085MX, 칸그렐로르(cangrelor), C1330-7, MRS 2395, 2-methylthioadenosine-5'-monophosphate 중에서 선택되는 1종 이상일 수 있다.
본 발명에서 상기 교반기에 의해 발생하는 전단유동에서 최소 전단율은 5,000 (s-1) 이상이거나, 최소 전단력이 8 Pa 이상일 수 있다.
본 발명에서 상기 교반기의 중앙과 양측은 개방되며, 상기 개방된 부분에는 밀봉재가 구비될 수 있다.
본 발명에서 상기 밀봉재는 상변화 물질 또는 수용성 맴브레인일 수 있다.
본 발명에서 상기 상변화 물질은 파라핀 왁스이고, 상기 수용성 맴브레인은 녹말일 수 있다.
본 발명에서 상기 미세 채널의 전단에는 상기 혈액 샘플의 유동을 제어하기 위한 미세유동 밸브가 설치될 수 있다.
본 발명에서 상기 미세 채널의 형상은 직선형, 곡선형, 지그재그형 중에서 선택되는 어느 하나 또는 이들의 조합으로 이루어질 수 있다.
본 밤령에서 상기 미세 채널에는 중간의 다수 지점에 중간 챔버가 형성될 수 있다.
본 발명에서 상기 미세 채널에는 중간에 상대적으로 폭이 큰 다수의 확대부가 구비될 수 있다.
또한, 본 발명은 회전 가능한 디스크; 상기 디스크의 중앙부에 원주 방향을 따라 복수 개로 배치되고, 혈액 샘플을 내부에 수용하며, 상기 혈액 샘플 내에 전단유동을 유도하는 교반 챔버; 상기 교반 챔버에 연결되고, 상기 혈액 샘플이 이동되면서 혈소판의 부착과 응집이 발생하는 미세 채널; 및 상기 미세 채널을 통과한 혈액 샘플이 수용되는 폐샘플 챔버를 포함하는 원심력 미세유동 기반 혈소판 복합기능 및 약물반응 검사 장치를 제공한다.
또한, 본 발명은 혈액 샘플을 주입하는 단계; 상기 혈액 샘플이 교반 챔버로 유입되고, 상기 교반 챔버 내의 교반기가 회전하면서 약물이 상기 교반 챔버로 방출되는 단계; 상기 교반 챔버가 설치된 디스크가 회전되는 단계; 상기 혈액 샘플이 미세 채널을 통해 이동되다가 혈소판의 응집에 의해 정지되는 단계; 및 상기 디스크가 정지되고, 상기 혈액 샘플의 이동도를 측정하는 단계를 포함하는 원심력 미세유동 기반 혈소판 복합기능 및 약물반응 검사 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 혈액 샘플을 주입하는 단계; 상기 혈액 샘플이 주입된 디스크가 회전되는 단계; 상기 혈액 샘플이 미세 채널을 통해 방출되어 이동되다가 혈소판의 응집에 의해 정지되는 단계; 및 상기 디스크가 정지되고, 상기 혈액 샘플의 이동도를 측정하는 단계를 포함하는 원심력 미세유동 기반 혈소판 복합기능 및 약물반응 검사 방법을 제공한다.
본 발명에 의하면, 다수의 채널을 통해 대량의 혈액 샘플을 한 번에 빠른 시간에 검사할 수 있는 효과가 있다.
또한, 하나의 혈액 샘플에 대한 다수의 약물 검사를 다수의 채널에서 한 번의 검사로 복합적인 혈소판 기능에 대한 다중검사가 가능하고 검사 시간이 감소하며 검사 비용도 절감되는 효과가 있다.
또한, 혈액을 이동시키기 위하여 진공 펌프 등과 같은 유체구동장치 없이 원심력으로 이를 대체하는 효과를 얻을 수 있다.
또한, 혈액에 접촉하는 부분이 모두 일회용으로 제작되어 사용 후 폐기할 수 있어 사용자의 편리성과 혈액 감염 등의 위험에서 벗어나는 효과를 얻을 수 있다.
또한, 계측 시간의 짧음과 여러 개의 샘플이 동시에 측정될 수 있는 시스템의 구현이 가능하여 대량 검사를 수행하기에 적합한 효과가 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 원심력 미세유동 기반 혈소판 복합기능 및 약물반응 검사 장치의 구성도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 혈액 샘플의 진행 과정을 보인 구성도이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 교반기 내부를 보인 구성도이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 미세 채널의 다른 예와 유동 압력 분포를 보인 도면이다.
도 5는 본 발명의 다른 실시예에 따른 원심력 미세유동 기반 혈소판 복합기능 및 약물반응 검사 장치의 구성도이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 원심력 미세유동 기반 혈소판 복합기능 및 약물반응 검사 방법의 순서도이다.
이하에서는 본 발명에 의한 원심력 미세유동 기반 혈소판 복합기능 및 약물반응 검사 장치의 일 실시예를 첨부된 도면을 참고하여 상세하게 설명한다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 원심력 미세유동 기반 혈소판 복합기능 및 약물반응 검사 장치의 구성도이고, 도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 혈액 샘플의 진행 과정을 보인 구성도이며, 도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 교반기 내부를 보인 구성도이다.
이에 도시된 바에 따르면, 본 발명에 의한 원심력 미세유동 기반 혈소판 복합기능 및 약물반응 검사 장치는 회전 가능한 디스크(10); 상기 디스크(10)의 중앙에 배치되고, 혈액 샘플이 내부에 수용되는 샘플 챔버(20); 상기 샘플 챔버(20)와 다수의 반경방향으로 각각 연결되고, 상기 혈액 샘플 내에 전단유동을 유도하는 교반 챔버(30); 상기 교반 챔버(30)에 연결되고, 혈소판의 부착과 응집이 발생하는 미세 채널(40); 및 상기 미세 채널(40)을 통과한 혈액 샘플이 수용되는 폐샘플 챔버(24)를 포함할 수 있다.
미세 채널(40)은 그 단면 형상이 사각형 등의 다각형, 원형 또는 타원형일 수 있다. 예를 들어, 단면 형상이 정사각형인 채널의 경우 한 모서리의 길이는 1 내지 1,000 ㎛, 바람직하게는 10 내지 200 ㎛, 더욱 바람직하게는 20 내지 50 ㎛일 수 있다. 단면 형상이 원형인 경우에도 상기 범위의 직경을 가질 수 있다.
본 발명에서는 일회용의 디스크(10)가 회전하게 되면, 원심력에 의하여 혈액 샘플이 반경 방향으로 이동하게 된다. 이때, 혈소판의 응집성 또는 부착 정도에 따라서 샘플 이동거리가 차이 나게 되고 이때 이동거리의 차를 이용하여 상대적 혈소판의 응집성 및 부착성을 측정하게 된다.
도 1은 본 발명의 일 실시예로서, 하나의 혈액 샘플 챔버(10)로부터 다수의교반 챔버(30)가 반경방향으로 각각 나누어지며, 각각의 교반 챔버(30)에서는 검사 목적의 특수한 약물이 포함되어 있어 한 번의 검사로 다양한 약물 반응 검사를 수행할 수 있다. 여기에서, 혈액 샘플의 이동 거리 측정은 디스크(10)에 설치된 측정부(50)를 통하여 얻어질 수 있다. 측정부(50)는 소형 카메라 등의 장치로 구성되어 영상을 획득하여 분석할 수도 있고, 특정 위치에 LED 및 포토다이오드 센서 등의 센서 조합을 통해 혈액 샘플의 이동거리를 측정할 수도 있다.
도 2를 참조하면, 먼저 샘플 챔버(20)에 혈액 샘플이 공급되면 연결 채널(22)을 통해 교반 챔버(30)로 혈액 샘플이 유입된다. 이때, 혈액 샘플이 더 이상 하류로 흘러가지 못하도록 제어하기 위해, 미세 채널(40)의 전단에는 미세유동 밸브(42)가 설치될 수 있다. 그리고, 혈액 샘플은 미세 채널(40)을 통해 폐샘플 챔버(24)로 유입된다.
도 3을 참조하면, 교반 챔버(30)의 내부에는 혈액 샘플의 교반을 위한 교반기(32)가 회전 가능하게 설치될 수 있다. 교반기(32)는 자력과 같은 비접촉 방식에 의해 회전될 수 있으며, 회전수를 제어함으로써 교반 및 전단 유동을 효과적으로 생성할 수 있다.
또한, 교반기(32)의 형상은 일반적으로 사용되는 일자 원형봉을 비롯하여, 십자 원형봉 또는 원형판 형상 등 다양한 형상을 가질 수 있다. 이러한 교반기(32)가 비접촉 방식의 힘을 받아 회전하게 되면, 교반 챔버(30) 내부에는 교반뿐만 아니라 회전수에 따른 전단 유동이 발생한다. 이러한 전단 유동의 형태는 일자 원형봉일 경우 간헐적인 전단 유동일 수 있으며, 원형판일 경우 연속적인 전단 유동이 발생할 수 있다. 예를 들어, 교반기(32)는 별도로 설치된 교반유도장치(도시되지 않음)의 자력에 의해 자화되어 기계적인 연결 없이 영향을 받을 수 있도록 얇은 금속재로 제작될 수 있다.
교반기(32)의 직경 또는 두께는 교반 챔버(30) 깊이의 절반 크기 내외를 갖는 것이 바람직하며, 교반기(32)의 길이 또는 지름은 교반 챔버(30) 직경의 80 내지 90% 수준의 크기를 갖는 것이 적절하다.
한편, 교반기(32)의 내부에는 혈소판 응집을 활성화시키거나 비활성화시키기 위한 약물(34)이 액체 또는 고체의 상태로 저장될 수 있다. 즉, 교반기(32)의 내부는 속이 비어 있는 중공 형태일 수 있으며, 교반기(32) 내부에 액체 또는 고체 미립 분말 형태의 약물을 저장할 수 있다.
일 실시예로서, 일자 원형봉인 교반기(32)의 경우, 교반기(32)의 중앙과 양측 부분이 개방되며, 상기 개방된 부분에는 밀봉재(36)가 구비될 수 있다. 밀봉재(36)로는 파라핀 왁스와 같은 상변화 물질, 녹말 등과 같은 수용성 멤브레인이 사용되는 것이 바람직하다. 파라핀 왁스는 일정 온도 이상에 노출되면 고체가 액체로 변화되면서 교반기(32)의 밀봉이 해제되며, 이때 교반기(32) 내부의 약물(34)은 원심력에 의하여 교반 챔버(30)의 내부로 방출될 수 있다. 또한, 녹말은 혈액에 노출되면 쉽게 녹아 밀봉이 해제되며, 약물(34)이 교반 챔버(30)의 내부로 방출될 수 있다.
또한, 상변화 물질의 밀봉재(36)가 사용된 경우, 레이저 또는 전자기파 등을 밀봉재(36)에 조사하여 상변화 물질이 녹아내리도록 가열하여 밀봉을 해제시킬 수 있다. 그리고, 수용성 멤브레인으로 밀봉재(36)가 사용된 경우, 혈액에 빨리 녹도록 교반기(32)를 회전시키면 밀봉이 해제되어 교반기(32) 내부의 약물(34)이 방출될 수 있다. 이와 같이, 약물(34)이 방출되는 원리는 교반기(32)의 회전에 따른 원심력이 주요 구동력이 될 수 있다.
혈소판이 역학적 힘에 의하여 활성화되는 여부를 검사하고자 할 경우에는, 교반기(32)의 회전에 의한 최소 전단율은 5,000 (s-1) 이상이 되거나, 최소 전단력이 8 Pa 이상인 것이 바람직하다. 또한, 상기 전단 유동장에 혈액 샘플이 노출되는 시간은 최소 30초 이상인 것이 바람직하다. 이는 상기 전단율을 이용하여 혈소판 및 폰 빌레브란트 인자(vWF)의 충분한 활성화를 이루기 위함이다.
교반기(32)에 충진되는 약물(34)로는 혈소판 응집을 활성화시키는 아데노신2인산(ADP), 에피네프린과 같은 아고니스트(agonist), 이와 반대로 혈소판의 응집이나 부착을 비활성화시키는 안타고니스트(antagonist) 등이 단독 또는 2종 이상 조합되어 사용될 수 있다.
또한, 약물(34)은 교반기(32)의 내부에 액상과 액상, 액상과 고상의 형태로 각각 충진될 수 있으며, 서로 다른 공간에 분리되어 저장될 수도 있다. 더욱이, 약물(34)이 고상으로만 충진될 때에는 미세입자로 서로 혼합되어 저장될 수도 있다.
이와 같이 약물(34)이 교반기(32)로부터 방출되어 혈액 샘플에 유입되면, 교반기(32)의 회전에 의해 균질하게 혼합되면서 약물(34)에 의한 혈소판 반응이 발생하게 된다. 특히, 아고니스트의 약물일 경우, 혈소판의 응집이 촉진되어 큰 덩어리의 응집체가 형성될 수 있다.
약물(34)과 혈액 샘플이 교반기(32)에 의하여 혼합이 완료되면, 교반 챔버(30)와 미세 채널(40) 등을 포함한 디스크(10)에 연결된 회전 장치(미도시)는 서서히 회전을 하게 되며, 일정 속도의 회전수를 갖게 된다. 이때, 교반 챔버(30)에 저장되어 있는 혈액 샘플은 원심력에 의하여 반경방향으로 나가려 하지만, 상변화 물질과 같은 밀봉재(36)로 막혀있어 유동이 발생하지 못한다. 그러나, 상변화 물질 부위에 전자기파, 레이저 또는 기타 가열 수단에 의하여 열이 전달되면, 채널 내 유로가 열리고 혈액 샘플이 반경방향으로 이동하게 된다.
다시 도 1 및 2를 참조하면, 약물(34)의 혼합 및 전단 교반과정이 끝나면, 미세유동 밸브(42)가 열리고 디스크(10)가 회전하게 되는데, 이때 혈액 샘플은 회전에 의한 원심력에 의하여 반경방향으로 힘을 받게 되어 미세 채널(40)을 따라 이동한다. 이때, 약물(34)과 반응한 혈액 샘플은 혈소판의 응집 정도에 따라 이동의 속도가 다르게 되며, 이동 정도 또한 다르게 되는 특성을 이용하여 혈소판의 약물반응 검사를 수행하게 된다.
혈소판 응집 등에 의하여 혈액 샘플의 진행이 미세 채널(40) 내에서 멈추게 되는데, 이때 혈액 샘플의 이동비(migration ratio)를 상대적으로 측정할 수 있다. 또한, 미세 채널(40)의 다른 예로서, 도 1에서와 같이 일자형 채널에 중간 챔버(44)가 중간의 다수 지점에 형성될 수 있다. 중간 챔버(44)는 혈액 샘플의 유속을 감소시켜 혈소판의 응집을 유발시킬 수 있으며, 응집된 혈소판 덩어리가 미세 채널(40)에 재진입할 때 막히는 것을 촉진하도록 하는 역할을 한다.
교반 챔버(30)에 연결되고 다수의 중간 챔버(44)를 포함하는 미세 채널(40)에서, 혈액의 약물 반응의 정도에 따라 혈액 이동도가 결정될 수 있다. 즉, 아고니스트에 잘 반응하는 혈액 샘플은 상대적으로 큰 혈소판 응집체를 다수 형성하며, 이는 상기 미세 채널(40)에 큰 유동저항으로 작용하여 검체군(Control) 대비 혈액의 이동비가 작아질 수 있다. 그러나, 아고니스트와 잘 반응하지 않는 혈액 샘플일 경우, 혈소판의 응집 정도가 낮으며, 이로 인해 혈액의 이동거리는 매우 길어 하류까지 원심력에 의하여 진행될 수 있다. 이와 같이 약물(34)과 혼합된 혈액 샘플의 이동도를 검체군의 이동 거리와 비교하여 이동비를 계산할 수 있다.
또한, 교반 챔버(30)의 하류 방향으로 연결된 미세 채널(40)의 배열은 반경방향으로 도 1에서와 같이 직선형, 곡선형 또는 지그재그 형태로 배치할 수도 있고, 이들의 다양한 조합으로 이루어질 수도 있다.
한편, 도 4를 참조하면, 미세 채널(40)은 일자형 채널로 구성될 수도 있지만, 중간에 상대적으로 폭이 큰 확대부(46)를 구비하여 혈액 샘플의 유속을 감속시키면서 혈소판의 응집과 부착을 증가시킬 수 있도록 구성할 수 있다. 이러한 확대부(46)를 중간에 적절히 배치하면, 혈액 샘플은 마치 맥동형 압력이나 전단력을 경험하면서 이동하는 특성을 갖게 되어 생체 내부의 유동을 모사할 수 있다. 확대부(46)에 연결된 미세 채널(40)은 마치 혈관 내부에 존재하는 협착부를 묘사할 수도 있다.
또한, 확대부(46) 표면에는 혈소판의 부착을 증가시킬 수 있는 아고니스트를 코팅하여 혈액의 이동도의 변별력을 향상시킬 수 있다. 이러한 미세 채널(40)을 모두 통과한 혈액 샘플은 폐샘플 챔버(24)로 수집된다.
상기 약물로는, 혈소판이 부착하는 것에 도움이 되는 아고니스트, 즉 콜라젠, ADP, 에피네프린 등이 있으며, 반대로 혈소판의 응집을 방해하거나 억제하는 안타고니스트로는 아스피린, P2Y1 리셉터 안타고니스트, P2Y12 리셉터 안타고니스트 등이 사용될 수 있다.
P2Y1 리셉터 안타고니스트는 MRS 2179, MRS 2279, MRS 2500, A2P5P, A3P5P, A3P5PS 등의 후보물질 중 적어도 어느 하나일 수 있다. P2Y12 리셉터 안타고니스트는 클로피도그렐, 티클로피딘, 프라수그렐, AR-C67085MX, 칸그렐로르, C1330-7, MRS 2395, 2-methylthioadenosine-5'-monophosphate 등의 후보물질 중 적어도 어느 하나일 수 있다.
특히, 상기 관련 약물 복용자에서의 혈소판 응집기능과 약물들에 대한 저항성 측정이 본 발명에 의한 검사 장치에 의하여 실시될 수 있다.
혈소판의 기능 측정을 위해, 정상인 혹은 아스피린 및 클로피도그렐 복용자의 혈액을 citrated 튜브에 채취한 뒤, 약 50 내지 100 microliter의 전혈액을 취하여 각기 ADP, 프로스타글란딘 E(Prostaglandin E), 피브리노겐, 아라키돈산의 최적 농도에서 37℃의 온도로 10 내지 30분간 반응시킬 수 있다. 반응 후 혈액을 미세 채널에서 원심력을 가하여 이동시키게 되는데, 대상자의 혈소판의 기능이 정상이라면, 짧은 시간 내에 미세 채널의 유로가 막혀 유동이 정지하게 되거나, 이동거리가 짧게 된다. 반대로 혈소판의 기능에 이상이 있는 경우 정상에 비해 막힘 시간이 늘어나게 되거나 이동거리가 증가하게 된다.
약물 내성을 검사하는 경우, 즉 아스피린, 클로피도그렐, 티클로피딘 등을 복용한 경우, 혈소판의 응집기능이 저하하므로, 미세채널 내부의 유로가 쉽게 막히지 않아 막힘 시간이 증가하고 이동거리가 증가하게 된다. 정상인의 경우 약물에 잘 반응하여 이 막힘 시간이 짧게 나타나는데, 이러한 막힘 시간의 비율이 정상인보다 현저히 줄어들게 되면, 아스피린과 클로피도그렐의 약물 내성으로 판단하게 된다.
다음으로, 이하에서는 본 발명의 다른 실시예에 따른 원심력 미세유동 기반 혈소판 복합기능 및 약물반응 검사 장치에 대하여 설명한다.
도 5는 본 발명의 다른 실시예에 따른 원심력 미세유동 기반 혈소판 복합기능 및 약물반응 검사 장치의 구성도이다.
이에 도시된 바에 따르면, 본 실시예에서는 4개의 서로 다른 혈액 샘플이 하나의 디스크(10)에 주입되어, 한 번의 검사로 수행될 수 있는 장점을 지니고 있다. 본 실시예에서 교반 챔버(30)는 샘플 챔버의 기능도 겸비하여 혈액 샘플을 수용할 수 있으며, 즉 도 1의 샘플 챔버(20)와 교반 챔버(30)를 병합한 것일 수 있다. 교반 챔버(30)의 개수는 도시된 4개에 한정되지 않으며, 예를 들어 다수의 혈액 샘플 검사가 가능하도록 다수의 교반 챔버(30) 및 이와 동일한 개수의 미세 채널(40)이 구비될 수 있다. 여기에서, 교반 챔버(30)는 디스크(10)의 중앙부에 다수 개가 원주 방향을 따라 배치될 수 있고, 각각의 교반 챔버(30)에 주입된 혈액 샘플은 각각 반경방향으로 이동될 수 있다.
또한, 미세 채널(40)의 구성은 도 1에 도시된 바와 같이 직선형, 곡선형 또는 지그재그 형태 등 다양한 형상의 조합으로 구성될 수 있다.
이하에서는 상기한 바와 같은 구성을 가지는 원심력 미세유동 기반 혈소판 복합기능 및 약물반응 검사 방법을 상세하게 설명한다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 원심력 미세유동 기반 혈소판 복합기능 및 약물반응 검사 방법의 순서도이다.
이에 도시된 바에 따르면, 검사자는 정맥 채혈한 혈액 샘플을 샘플 챔버(20)에 주입한다(S10). 이후, 혈액 샘플은 샘플 챔버(20)에 연결된 연결 채널(22)을 통해 교반 챔버(30)로 유입되고, 교반 챔버(30) 내의 교반기(32)가 자력에 의하여 회전하게 되면서 교반기(32) 내부에 저장되어 있는 약물(34)이 방출되면서 혈액 샘플과 혼합된다(S20).
이때, 혈소판의 기계적 자극을 통한 활성화 시험의 경우에는, 특정 회전수로 빠르게 회전시켜 혈소판 및 폰 빌레브란트 인자(vWF)를 활성화시킬 수 있다. 이러한 기계적 활성화 시험이 아닌 경우에는, 약물과 혈액 샘플의 교반 목적으로 미리 설정된 속도 및 시간 동안 회전시킬 수 있다.
다음으로, 샘플 챔버(20)가 설치된 디스크(10)가 회전하게 된다(S30). 이후, 미세유동 밸브(42)가 열리면, 혈액 샘플은 미세 채널(40)을 통해 하류로 이동되는데, 혈소판의 응집 정도 및 부착성에 따라 미세 채널(40)을 흘러나가는 속도와 이동거리가 달라지며, 정지되거나 끝까지 이동된다(S40).
그러면, 디스크(10)는 정지하게 되고, 샘플의 이동도가 영상장치 또는 광원 및 광감지 센서 등의 측정부(50)를 통해 측정된다(S50).
상기 혈액 샘플에 전단력을 가하여 혈소판을 활성화하는 방법으로 교반기를 회전시켜 전단유동을 발생시키는 방법 이외에, 원심력에 의한 혈액의 고전단 유동을 통해 혈소판을 활성화시킬 수 있다. 좀 더 상세하게 설명하면, 혈액 샘플이 주입된 후 미세유동 밸브(42)가 폐쇄된 상태에서 일정 회전 속도까지 증가시킨 후 미세유동 밸브(42)가 열리게 되면, 미세 채널(40)을 통해 높은 전단 유동이 발생하게 된다. 이를 통해 활성화된 혈소판이 미세 채널의 확대부(46) 또는 특정 부위에 코팅된 아고니스트 등의 약물과 반응하여 부착 및 응집 등이 이루어져 유동의 진행정도를 방해하게 된다. 이때, 샘플 유동의 이동비 또는 미세 채널(40) 끝에 도달하는 시간 등을 이용하여 약물반응 검사를 수행할 수 있다.
본 발명의 권리범위는 위에서 설명된 실시예에 한정되지 않고 청구범위에 기재된 바에 의해 정의되며, 본 발명의 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 청구범위에 기재된 권리범위 내에서 다양한 변형과 개작을 할 수 있다는 것은 자명하다.
[부호의 설명]
10: 디스크
20: 샘플 챔버
22: 연결 채널
30: 교반 챔버
32: 교반기
34: 약물
36: 밀봉재
40: 미세 채널
42: 미세유동 밸브
44: 중간 챔버
46: 확장부
50: 측정부

Claims (20)

  1. 회전 가능한 디스크;
    상기 디스크의 중앙에 배치되고, 혈액 샘플이 내부에 수용되는 샘플 챔버;
    상기 샘플 챔버와 다수의 반경방향으로 각각 연결되고, 상기 혈액 샘플 내에 전단유동을 유도하는 교반 챔버;
    상기 교반 챔버에 연결되고, 상기 혈액 샘플이 이동되면서 혈소판의 부착과 응집이 발생하는 미세 채널; 및
    상기 미세 채널을 통과한 혈액 샘플이 수용되는 폐샘플 챔버를 포함하는 원심력 미세유동 기반 혈소판 복합기능 및 약물반응 검사 장치.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 디스크에 설치되고, 상기 혈액 샘플의 이동거리를 측정하기 위한 측정부를 더 포함하는 원심력 미세유동 기반 혈소판 복합기능 및 약물반응 검사 장치.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 교반 챔버에는 교반기가 회전 가능하게 설치되는 것을 특징으로 하는 원심력 미세유동 기반 혈소판 복합기능 및 약물반응 검사 장치.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 교반기는 일자 원형봉, 십자 원형봉, 원형판 형상 중에서 선택되는 형상을 가지는 것을 특징으로 하는 원심력 미세유동 기반 혈소판 복합기능 및 약물반응 검사 장치.
  5. 제3항에 있어서,
    상기 교반기의 내부에는 혈소판 응집을 활성화시키거나 비활성화시키기 위한 약물이 액체 또는 고체의 상태로 저장되는 것을 특징으로 하는 원심력 미세유동 기반 혈소판 복합기능 및 약물반응 검사 장치.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 약물은 콜라젠, 아데노신2인산(ADP), 에피네프린(Epinephrine) 중에서 선택되는 1종 이상의 아고니스트(agonist)인 것을 특징으로 하는 원심력 미세유동 기반 혈소판 복합기능 및 약물반응 검사 장치.
  7. 제5항에 있어서,
    상기 약물은 아스피린, P2Y1 리셉터 안타고니스트, P2Y12 리셉터 안타고니스트 중에서 선택되는 1종 이상의 안타고니스트(antagonist)인 것을 특징으로 하는 원심력 미세유동 기반 혈소판 복합기능 및 약물반응 검사 장치.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 P2Y1 리셉터 안타고니스트는 MRS 2179, MRS 2279, MRS 2500, A2P5P, A3P5P, A3P5PS 중에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 원심력 미세유동 기반 혈소판 복합기능 및 약물반응 검사 장치.
  9. 제7항에 있어서,
    상기 P2Y12 리셉터 안타고니스트는 클로피도그렐(clopidogrel), 티클로피딘(ticlopidine), 프라수그렐(prasugrel), AR-C67085MX, 칸그렐로르(cangrelor), C1330-7, MRS 2395, 2-methylthioadenosine-5'-monophosphate 중에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 원심력 미세유동 기반 혈소판 복합기능 및 약물반응 검사 장치.
  10. 제3항에 있어서,
    상기 교반기에 의해 발생하는 전단유동에서 최소 전단율은 5,000 (s-1) 이상이거나, 최소 전단력이 8 Pa 이상인 것을 특징으로 하는 원심력 미세유동 기반 혈소판 복합기능 및 약물반응 검사 장치.
  11. 제3항에 있어서,
    상기 교반기의 중앙과 양측은 개방되며, 상기 개방된 부분에는 밀봉재가 구비되는 것을 특징으로 하는 원심력 미세유동 기반 혈소판 복합기능 및 약물반응 검사 장치.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 밀봉재는 상변화 물질 또는 수용성 맴브레인인 것을 특징으로 하는 원심력 미세유동 기반 혈소판 복합기능 및 약물반응 검사 장치.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 상변화 물질은 파라핀 왁스이고, 상기 수용성 맴브레인은 녹말인 것을 특징으로 하는 원심력 미세유동 기반 혈소판 복합기능 및 약물반응 검사 장치.
  14. 제1항에 있어서,
    상기 미세 채널의 전단에는 상기 혈액 샘플의 유동을 제어하기 위한 미세유동 밸브가 설치되는 것을 특징으로 하는 원심력 미세유동 기반 혈소판 복합기능 및 약물반응 검사 장치.
  15. 제1항에 있어서,
    상기 미세 채널의 형상은 직선형, 곡선형, 지그재그형 중에서 선택되는 어느 하나 또는 이들의 조합으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 원심력 미세유동 기반 혈소판 복합기능 및 약물반응 검사 장치.
  16. 제1항에 있어서,
    상기 미세 채널에는 중간의 다수 지점에 중간 챔버가 형성되는 것을 특징으로 하는 원심력 미세유동 기반 혈소판 복합기능 및 약물반응 검사 장치.
  17. 제1항에 있어서,
    상기 미세 채널에는 중간에 상대적으로 폭이 큰 다수의 확대부가 구비되는 것을 특징으로 하는 원심력 미세유동 기반 혈소판 복합기능 및 약물반응 검사 장치.
  18. 회전 가능한 디스크;
    상기 디스크의 중앙부에 원주 방향을 따라 복수 개로 배치되고, 혈액 샘플을 내부에 수용하며, 상기 혈액 샘플 내에 전단유동을 유도하는 교반 챔버;
    상기 교반 챔버에 연결되고, 상기 혈액 샘플이 이동되면서 혈소판의 부착과 응집이 발생하는 미세 채널; 및
    상기 미세 채널을 통과한 혈액 샘플이 수용되는 폐샘플 챔버를 포함하는 원심력 미세유동 기반 혈소판 복합기능 및 약물반응 검사 장치.
  19. 혈액 샘플을 주입하는 단계;
    상기 혈액 샘플이 교반 챔버로 유입되고, 상기 교반 챔버 내의 교반기가 회전하면서 약물이 상기 교반 챔버로 방출되는 단계;
    상기 교반 챔버가 설치된 디스크가 회전되는 단계;
    상기 혈액 샘플이 미세 채널을 통해 이동되다가 혈소판의 응집에 의해 정지되는 단계; 및
    상기 디스크가 정지되고, 상기 혈액 샘플의 이동도를 측정하는 단계를 포함하는 원심력 미세유동 기반 혈소판 복합기능 및 약물반응 검사 방법.
  20. 혈액 샘플을 주입하는 단계;
    상기 혈액 샘플이 주입된 디스크가 회전되는 단계;
    상기 혈액 샘플이 미세 채널을 통해 방출되어 이동되다가 혈소판의 응집에 의해 정지되는 단계; 및
    상기 디스크가 정지되고, 상기 혈액 샘플의 이동도를 측정하는 단계를 포함하는 원심력 미세유동 기반 혈소판 복합기능 및 약물반응 검사 방법.
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