WO2014128333A1 - Formulaciones basadas en nanoemulsiones y su uso para el tratamiento de la obesidad - Google Patents

Formulaciones basadas en nanoemulsiones y su uso para el tratamiento de la obesidad Download PDF

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nanoemulsion according
treatment
prevention
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Fernando Rodriguez De Fonseca
Francisco Javier PAVÓN MORÓN
Antonia SERRANO CRIADO
Miguel Romero Cuevas
Miguel WULFF PÉREZ
María José GÁLVEZ RUIZ
Antonio MARTÍN RODRÍGUEZ
Juan DE VICENTE ÁLVAREZ-MANZANEDA
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Universidad de Granada
Instituto Mediterraneo para el Avance de la Biotecnologia y la Investigacion Sanitaria (Fundacion Imabis)
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Universidad de Granada
Instituto Mediterraneo para el Avance de la Biotecnologia y la Investigacion Sanitaria (Fundacion Imabis)
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    • A61P3/04—Anorexiants; Antiobesity agents
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    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/06—Antihyperlipidemics
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y5/00—Nanobiotechnology or nanomedicine, e.g. protein engineering or drug delivery

Definitions

  • Obesity is a disease whose incidence has grown dramatically in the last 20 years to reach the rank of global epidemic of the 21st century in virtually all countries according to the World Health Organization (WHO).
  • WHO World Health Organization
  • WHO World Health Organization
  • the impact on public health is enormous, since obesity is related to cardiovascular, metabolic diseases (diabetes, cholesterolemia, triglyceridemia, ..) dermatological, gastrointestinal , osteoarticular and / or some cancers such as colon cancer.
  • phentermine An amphetamine called phentermine (Adipex-P® from Teva Pharmaceuticals and lonamin® from Medeva Pharmaceuticals) that can increase blood pressure (can induce primary pulmonary hypertension and heart problems) and cause insomnia.
  • phentermine An amphetamine called phentermine (Adipex-P® from Teva Pharmaceuticals and lonamin® from Medeva Pharmaceuticals) that can increase blood pressure (can induce primary pulmonary hypertension and heart problems) and cause insomnia.
  • phentermine An amphetamine called phentermine (Adipex-P® from Teva Pharmaceuticals and lonamin® from Medeva Pharmaceuticals) that can increase blood pressure (can induce primary pulmonary hypertension and heart problems) and cause insomnia.
  • topiramate Qsymia® from Vivus Inc.
  • said ratio (w / w) copolymer / oil phase is between 0.02 and 0.16, more preferably said ratio (w / w) copolymer / oil phase is between 0.032 and 0.08 and even more preferably said Ratio (w / w) copolymer / oil phase is 0.04.
  • the aqueous phase is at a concentration between 5% and 45% by weight per total volume of the nanoemulsion (w / v).
  • the amphiphilic block copolymer is a poloxamer.
  • the amphiphilic block copolymer is selected from the list consisting of pluronic F68 and pluronic F127.
  • the oil comprised in the oil phase is selected from the list consisting of sunflower oil, peanut, cotton, olive, castor, soy, safflower, palm, ⁇ tocopherol (vitamin E) , isopropyl myristate, squalene or any combination thereof.
  • the oil phase comprises sunflower oil. Even more preferably, the oil phase consists of sunflower oil.
  • the compound of formula (I) is N-oleylethanolamine.
  • a second aspect of the invention relates to a process for obtaining the nanoemulsion of the invention, which comprises: i) dissolving the copolymers in water under gentle agitation; ii) adding the oil dropwise to the aqueous phase produced in step i), under mechanical stirring, producing a pre-emulsion; iii) reduce the size of the emulsion drops by repeatedly passing the pre-emulsion of stage ii) through a high pressure homogenizer, thus forming the nanoemulsion; iv) add under gentle agitation to the nanoemulsion of step iii) a compound of the formula (I).
  • a third aspect of the invention relates to the nanoemulsion of the invention for use in therapy.
  • a fourth aspect of the invention relates to the use of the nanoemulsion of the invention for the preparation of a medicament for use in the treatment or prevention of obesity.
  • this fourth aspect of the invention relates to the nanoemulsion of the invention for use in the treatment or prevention of obesity.
  • the nanoemulsion of the invention for use in the treatment or prevention of obesity is administered orally.
  • a fifth aspect of the invention relates to the use of the nanoemulsion of the invention for the preparation of a medicament for use in the treatment or prevention of dyslipidemia.
  • this fifth aspect of the invention relates to the nanoemulsion of the invention for use in the treatment or prevention of dyslipidemia.
  • the nanoemulsion of the invention for use in the treatment or prevention of dyslipidemia is administered orally.
  • said dyslipidemia is selected from the list consisting of hypercholesterolemia, hypertriglyceridemia, hyperlipoproteinemia type I, lia, llb, III, IV or V, hyperkylmicronemia or combined hyperlipidemia.
  • a sixth aspect of the invention relates to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising the nanoemulsion of the invention and optionally one or more pharmaceutically acceptable excipients.
  • FIG. 1 Properties of nanoemulsions.
  • A Average size and time stability of nanoemulsions of the invention, measured by Dynamic Light Scattering.
  • B Controlled biodegradation of nanoemulsions under simulated duodenal conditions in vitro.
  • the nanoemulsions detailed in examples 1 and 2 have been used.
  • the points ( ⁇ , ⁇ , ⁇ I) represent means ⁇ SEM (represented by T or - 1 -).
  • the data were analyzed by ANOVA (2 ways: time and treatment) and Bonferroni post-tests. * P ⁇ 0.05 and ** P ⁇ 0.01 with respect to the saline control group.
  • A Time: 30, 60, 120 and 240 minutes.
  • B Time: 24 hours.
  • Columns represent means ⁇ SEM.
  • the data were analyzed by ANOVA (2 ways: time and treatment) and Bonferroni post-tests. * P ⁇ 0.05 and *** P ⁇ 0.001 with respect to a nanoemulsion control group.
  • A Time: 30, 60, 120 and 240 minutes.
  • B Time: 24 hours.
  • Columns represent means ⁇ SEM.
  • the data were analyzed by ANOVA (2 ways: time and treatment) and Bonferroni post-tests. * P ⁇ 0.05, ** P ⁇ 0.01 and *** P ⁇ 0.001 with respect to a nanoemulsion control group.
  • A Time: 15, 30, 60, 120 and 240 minutes.
  • B Time: 24 hours.
  • Columns represent means ⁇ SEM. The data were analyzed by ANOVA (2 ways: time and treatment) and Bonferroni post-tests. * P ⁇ 0.05 and ** P ⁇ 0.01 with respect to the respective control group.
  • the present invention faces the problem of finding effective and safe long-term pharmacological therapies against obesity.
  • the present invention solves this problem through the design and development of oil-in-water nanoemulsions (o / w) useful for the vehiculization of N-acylethanolamines, characterized by comprising (a) an aqueous phase (b) an oil phase, which comprises a oil, consisting of drops of an average diameter of less than 500 nanometers; c) an amphiphilic block copolymer and d) an N-acylethanolamine.
  • NAEs N-acyletanolamines
  • NAEs N-arachidonic ethanolamine, N-palmitylethanolamine, N-oleylethanolamine, etc.
  • NAEs N-arachidonic ethanolamine, N-palmitylethanolamine, N-oleylethanolamine, etc.
  • activity cannabinoid receptors CB1 and CB2; vanilloid ionic channel TRPV1; and transcription factor PPAR alpha
  • OAS NAE N-oleiletanolamine
  • OAS has been described as a potent peripheral anorexigenic mediator (mainly in adipose tissue and gastrointestinal tract), from which various synthetic derivatives capable of inducing satiety, modulating fat have been described body and prevent excessive weight gain.
  • OAS N-oleiletanolamine
  • Organic solvents such as propylene glycol, dimethylsulfoxide (DMSO), ethanol, methanol (usually in physiological serum in percentage ranging from 30-95%). Its main drawback is the degree of toxicity not admitted for use as a medicine.
  • Surfactants such as Tween 20 and 80 [Polyoxyethylene (20/80) sorbitan monolaurate]. Although these compounds improve the problem of the general toxicity of organic solvents, hepatotoxity problems and the affectation of key parameters to evaluate anti-obesity molecules (irritation, immune system involvement, reduction in weight gain, minor) have been described. consume of food, hemolysis, circulating levels of adiposity altered, increased liver fat content ).
  • Organic polymers such as carboxymethyl cellulose have been used for oral administration.
  • the drugs show anti-obesity activity only at high doses, which could lead to toxicity and overdose problems.
  • emulsions for example Tocrisolve® 100 (Tocris Bioscience) from soybean oil, water and pluronic F68 have a non-toxic profile according to their safety data. But, although the intraperitoneal, intramuscular or subcutaneous systemic administration allows the use of this type of emulsions, oral administration is complicated due to the conditions opposite to the absorption in the gastrointestinal tract of the contained drugs (pH, complexing agents, bile, presence of food, motility, enzymes such as lipases ...), affecting the absorption and bioavailability of the drug.
  • Tocrisolve® 100 Tocris Bioscience
  • the authors of the present invention have discovered as surprisingly concrete nanoemulsions characterized by comprising (a) an aqueous phase (b) an oil phase, comprising an oil, consisting of drops of average diameter less than 500 nanometers and c) a copolymer in amphiphilic blocks, they are especially useful for the pharmacological vehicle of N-acylethanolamines and do not present any of the problems mentioned above.
  • the authors of the present invention have evaluated this type of nanoemulsions in vivo in male Wistar rats for 3 weeks against other vehicles commonly used for fat-soluble drugs, such as Tween 20 (10% in v / v saline).
  • the surfactant / oil ratio was sufficient to properly coat the drops and that they were less than 500 nm in size (i.e., a surfactant concentration greater than 0.5% by weight / volume), but not excessive in order of not destabilizing the nanoemulsion by depletion-flocculation (that is, less than 6% by weight / volume), thus producing optimal conditions of size, coating of the drops and stability.
  • the value of this change in intensity can range from a barely appreciable value (0% lipolysis) to a maximum value, equivalent to a complete lipolysis (100% lipolysis).
  • the nanoemulsion of the invention has its own size of nanoemulsions, which also remains stable over a wide range of time (Figure 2A), and which in turn is conveniently biodegraded when mixed with the duodenal juices ( Figure 2B), thus allowing the release of the compounds administered therein in the appropriate place.
  • the copolymer / oil phase ratio in the nanoemulsion of the invention plays a fundamental role in achieving time-stable nanoemulsions, low toxicological profile and good absorption at the level intestinal.
  • the present invention is the first to assert that those nanoemulsions characterized by comprising (a) an aqueous phase (b) an oil phase, comprising an oil, consisting of drops of average diameter less than 500 nanometers and c) a copolymer in amphiphilic blocks; where the ratio (w / w) copolymer / oil phase is between 0.02 and 0.16, more preferably said ratio (w / w) copolymer / oil phase is between 0.032 and 0.08 and even more preferably said ratio (w / w) copolymer / oil phase is about 0.04, they are especially useful for oral administration of N-acylethanolamines.
  • the nanoemulsions of the invention are stable over time, have a low toxicological profile and good absorption at the intestinal level, which makes these nanoemulsions an excellent pharmacological vehicle for oral administration of N-acylethanolamines.
  • a first aspect of the present invention relates to an oil-in-water nanoemulsion (or / w) (hereinafter “nanoemulsion” of the invention) suitable for the administration of N-acylethanolamines, comprising:
  • An aqueous phase b.
  • An oil phase which comprises an oil, consisting of drops of an average diameter of less than 500 nanometers;
  • C An amphiphilic block copolymer;
  • Y d. A compound of formula (I):
  • w / w it refers to the percentage weight of surfactant / weight of the oil phase.
  • nanoemulsions are understood as structures composed of an oil or mixtures of oils suitable for use in food, dispersed in water as nano-sized drops, and in turn, stabilized by means of a copolymer which will prevent flocculation or coalescence of the drops.
  • This type of nanoemulsions is determined by its drop size and distribution. So that according to the average drop diameter, nanoemulsion means those emulsions that have an average drop diameter between 20-500 nm, with micro or macro-emulsions being those that have an average drop diameter between 0.5-100 pm . Preferably, according to the average drop diameter, nanoemulsion means those emulsions having an average drop diameter of less than 300 nm.
  • the nanoemulsions of the present invention have good long-term physical stability (no apparent flocculation or coalescence) and do not require a large amount of surfactant as is the case with microemulsions.
  • a surfactant concentration between 0.5% and 6% (w / v), more preferably between 0.8% and 2% (w / v), would be sufficient. to stabilize it, very lower than typical values associated with microemulsions (10-20%), with the toxicity problems that this would entail.
  • the specific percentages of the aqueous phase of the nanoemulsion will depend on the preparation method used, preferably the aqueous phase is at a concentration between 5% and 75% by weight per total volume of the nanoemulsion (w / v) .
  • the aqueous phase is at a concentration between 5% and 75% by weight per total volume of the nanoemulsion (w / v) .
  • amphiphilic block copolymers where amphiphilic is understood to mean those molecules, substances, active ingredients, structures or parts thereof that possess both hydrophobic properties as hydrophilic
  • block copolymers are substances formed by macromolecules consisting of blocks arranged in a linear sequence.
  • a block is a portion of a macromolecule, which comprises several constituent units, which has at least one characteristic that is not present in adjacent portions.
  • copolymers formed by two or three blocks which are usually symbolized, respectively, as AB and ABA or BAB, where A and B are the polymer blocks.
  • Other types of block-formed copolymers are grafted copolymers (in English, graft ⁇ and star copolymers.
  • amphiphilic agents consisting of macromolecules formed by lipophilic blocks linked to hydrophilic blocks.
  • This type of block copolymers which have surfactant properties, form different kinds of associations, such as micelles and liquid crystalline structures, which can act as excellent vehicles of active ingredients.
  • amphiphilic block copolymers most commonly used in pharmaceutical formulations are block compounds derived from ethylene (hydrophilic) and propylene oxides, which are known by the generic name of poloxamers and the trade names Pluronic (Basf) and Synperonic (ICI). These copolymers have relative molecular masses between 1000 and 15000 and a block content of poly (ethylene oxide) between 10 and 80 percent by mass.
  • hydrophilic poly (ethylene oxide) blocks Hydration of the hydrophilic poly (ethylene oxide) blocks is due to their easy accommodation in the water structure. This hydration is highly temperature dependent, whereby the solubility and aggregate formation of block polymers containing this polar group can be regulated by temperature variations.
  • These polymers which have a low cost and are biocompatible, can adopt different structures when dispersed in water, which depend on the proportion of each of the blocks and their relative molecular mass. This ratio also determines the solubility and hydrophilic-lipophilic balance of the polymer.
  • Pluronic copolymers are designated with letters and numbers.
  • the letter “L” is used for liquids, "P” for those presented as pastes and "F” (for flake, flake) for solids.
  • the first digit, or the first two in the numbers with three digits, multiplied by 300 is approximately equal to the average relative molecular mass of the lipophilic part.
  • the last digit, multiplied by 10, indicates the approximate mass percentage of the hydrophilic part.
  • Pluronic F68 is a solid copolymer in which the approximate relative molecular mass of the hydrophobic part is 1800 (6 x 300) and the mass proportion of the hydrophilic part is approximately 80% (8 x 10).
  • the amphiphilic block copolymer of the nanoemulsion of the invention is a poloxamer, more preferably the amphiphilic block copolymer is the F68 pluronic copolymer or the F127 pluronic copolymer.
  • the nanoemulsion of the invention is characterized by having an oil phase, comprising an oil, consisting of drops of an average diameter of less than 500 nanometers, preferably less than 300 nanometers.
  • mean diameter is understood as that measured by the Dynamic Light Scattering (DLS) technique, which is defined by the hydrodynamic diameter of a sphere that diffuses at the same speed as the particles that are being measured. This provides the average diameter of the drops, as well as an index of their polydispersity, and is the method recommended by the United States Pharmacopeia for the measurement of drops size of injectable lipid emulsions (method 729 USP).
  • DLS Dynamic Light Scattering
  • oils used to constitute the oil comprised in the oil phase of the nanoemulsion of the invention can be selected from one or more natural, semi-synthetic and synthetic oils for pharmaceutical use such as oils of animal, vegetable, hydrocarbon oils or oils of silicone.
  • suitable oils for carrying out the present invention include, but are not limited to, mineral oil, squalene oil, flavor oils, silicone oil, essential oils, water insoluble vitamins, isopropyl stearate, butyl stearate, octyl palmitate, cetyl palmitate, tridecyl behenate, diisopropyl adipate, dioctyl sebacate, menthyl anthranilate, cetyl octanoate, octyl salicylate, isopropyl myristate, neopentyl ketols of dicarpato, Cerafilos®, decyl oleate, C12- C15alquil lactates, cetyl lactate
  • the oil comprised in the oil phase of the nanoemulsions may consist of a single oil or a mixture of different oils, preferably selected from the above list.
  • the oil comprises sunflower oil.
  • the oil consists of sunflower oil, that is, the oil comprised in the oil phase is sunflower oil.
  • the nanoemulsions of the invention comprise an N-acylethanolamine as active ingredient.
  • active substance is refers to any substance that is used in the treatment, cure, prevention or diagnosis of a disease or that is used to improve the physical and mental well-being of humans and animals.
  • the nanoemulsions of the present invention are suitable for use in the treatment or prevention of obesity or dyslipidemia.
  • N-acylethanolamines used in the present invention are fatty acid amides that act as endogenous mediators of a lipid nature.
  • N-acylethanolamine is a compound that has the following chemical structure:
  • R is a linear alkyl (C1 1 -C21) or a linear alkenyl (C1 1 -C21) with 1-6 double bonds.
  • R groups can be selected from any one of the following groups:
  • N-acylethanolamine is N-oleylethanolamine.
  • N-acylethanolamine is N-oleylethanolamine.
  • a second aspect of the invention relates to a process for making the nanoemulsion of the invention.
  • the processes for obtaining the nanoemulsions of the invention are simple methods that avoid drastic conditions such as high temperatures.
  • the nanoemulsions of the invention it is possible to proceed to: i) dissolve the copolymers in water under gentle agitation; ii) adding the oil dropwise to the aqueous phase produced in step i), under mechanical stirring, producing a pre-emulsion; iii) reduce the size of the emulsion drops by repeatedly passing the pre-emulsion of step ii) through a high pressure homogenizer, thus forming the nanoemulsion; iv) add under gentle stirring to the nanoemulsion of step iii) a compound of the formula (I).
  • another aspect of the present invention relates to the nanoemulsion of the invention for use in therapy. More specifically, to a pharmaceutical composition, comprising the nanoemulsion of the invention, and optionally one or more excipients pharmaceutically acceptable.
  • the incorporation of N-acylethanolamines in the nanoemulsions of the invention causes compositions, whose characteristics in terms of their composition, properties and morphology, make them excellent candidates for the therapeutic area, more specifically for the treatment or prevention of Obesity or dyslipidemia.
  • the type of N-acylethanolamine to be incorporated into the nanoemulsions of the invention will be that with suitable pharmacotherapeutic properties according to the therapeutic application to which the formulation is intended.
  • the N-acylethanolamine is N-oleylethanolamine. Therefore, another aspect of the invention relates to a composition comprising the nanoemulsion of the invention for use in the treatment or prevention of obesity. Alternatively, the invention also relates to the use of a composition comprising the nanoemulsion of the invention for the preparation of a medicament for the treatment or prevention of obesity. Preferably, the nanoemulsion of the invention for use in the treatment or prevention of obesity is administered orally.
  • the invention relates to a composition comprising the nanoemulsion of the invention for use in the treatment or prevention of dyslipidemia.
  • the invention also relates to the use of a composition comprising the nanoemulsion of the invention for the preparation of a medicament for the treatment or prevention of dyslipidemia.
  • the nanoemulsion of the invention for use in the treatment or prevention of dyslipidemia is administered orally.
  • the invention relates to a method for the treatment or prevention of a metabolic disease in a subject that comprises administering to said subject a composition comprising the nanoemulsion of the invention.
  • obesity refers to the definition of obesity provided by the WHO based on body mass index (BMI), which consists of the relationship between a person's weight (in kg ) and the square of its height in meters.
  • a BMI of less than 18.5 kg / m2 is considered as insufficient weight or thinness
  • a BMI of 18.5-24.9 kg / m2 is considered normal weight
  • a BMI of 25.0-29.9 kg / m2 is considered as overweight in grade 1
  • a BMI of 30.0-39.9 kg / m2 is considered obesity or overweight in grade 2
  • a BMI greater than or equal to 40.0 kg / m2 is considered as morbid obesity.
  • the degree of obesity of an individual such as the waist diameter measured at the midpoint between the lower limit of the ribs and the upper limit of the pelvis (in cm), thickness of the folds of the skin and bioimpedance, based on the principle that lean mass transmits electricity better than fat mass.
  • Dyslipidemia refers to any pathological condition characterized by an alteration in lipid metabolism, with its consequent alteration of lipid concentrations (cholesterol, triglycerides and the like) and lipoproteins ( high density lipoproteins) in the blood.
  • Dyslipidemia that can be treated with the methods of the present invention include, without limitation, hypercholesterolemia, hypertriglyceridemia, hyperlipoproteinemia type I, l, l lb, I II, IV, V, hyperkylomicronemia, combined hyperlipidemia, etc.
  • subject includes living organisms, such as human beings, female or male, and of any race or age; animals, for example monkeys, cows, sheep, horses, pigs, goats, dogs, cats, mice, rats and transgenic species thereof.
  • the subject is a human being.
  • the amount of active agents (NAE) that will be effective in the treatment of obesity or dyslipidemia can be determined by standard clinical techniques based on the present description.
  • in vitro assays can optionally be used to help identify the optimum dosage ranges.
  • the precise dose to be used in the formulation will also depend on the route of administration, and the severity of the condition, and should be decided according to the judgment of the doctor and the circumstances of each subject.
  • a therapeutically effective dose can be estimated initially from in vitro assays.
  • a dose can be formulated in animal models to achieve a circulating concentration range that includes the IC50 (a measure of drug efficacy that indicates how much of a substance is necessary to inhibit a given biological process) that has been determined in culture. mobile. Such information can be used to more accurately determine useful doses in humans.
  • the initial dosages can also be estimated from in vivo data, eg, animal models, using techniques that are well known in the state of the art. Someone with normal experience in the art can easily optimize human administration based on data in animals.
  • Sunflower oil was purchased from Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, MO, USA) and purified by activated magnesium silicate to remove free fatty acids.
  • the poloxamer Plurónico F68 is a polymeric surfactant with a molecular weight of 8400 Da acquired from Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, MO, USA).
  • F68 Pluronic poloxamer were added to 22.2 g of purified MilliQ water (0.054 mS) and dissolved therein with the aid of a magnetic stirrer. Subsequently Add 7.5 g of sunflower oil drop by drop while mechanically stirring using a Heidolph Diax 900 high speed stirrer, stirring being maintained for 4 minutes at 13000 rpm, thus forming the pre-emulsion.
  • This pre-emulsion was immediately homogenized by the Emulsiflex-C3 high pressure homogenizer (Avestin, CA, USA) at 103 MPa. This last process was repeated 8 times.
  • Pluronic surfactant F127 (poloxamer P407) is a triblock copolymer with a molecular weight of 12600 g / mol, purchased from Sigma-Aldrich. The method of preparing nanoemulsions with this surfactant is similar to that explained in Example 1 for Pluronic F68, with the only modification of the amount of Pluronic used (in grams). In order to ensure a correct coating of the drops of the nanoemulsion, the amount of Pluronic F127 will be equivalent in moles to that of Pluronic F68, so that the greater the molecular weight the amount added in grams will be greater. Thus, in this case the added amount of Pluronic F127 was 0.45 g. EXAMPLE 3. Preparation of formulation with OAS
  • nanoemulsion G-F68 or Tween 20 were prepared in 5% physiological serum.
  • the compound was obtained from Tocris Bioscience (Bristol, United Kingdom). It was administered in a solution composed of nanoemulsion G-F68 (5%) and physiological serum (95%) whose preparation was carried out on the same experimental day.
  • the doses used were: a) 1, 5 and 10 mg / kg of OAS for acute intraperitoneal intake tests.
  • Administration volume 1 mL / kg
  • EXAMPLE 5 Prolonged study of intake and determination of liver fat and biochemical plasma content of new nanoemulsions: toxicity and metabolic effects
  • G-F68 and G-F127 nanoemulsions have been evaluated in vivo in male Wistar rats for 3 weeks against another vehicle commonly used for fat-soluble drugs: Tween 20 (10% in v / v saline).
  • Tween 20 10% in v / v saline.
  • animals treated with the present nanoemulsions showed a significantly improved toxicological profile compared to those treated with Tween 20 and similar to those treated only with serum.
  • Tween 20 induced a lower weight gain in these animals compared to those receiving saline. This lower gain was significant from the second week (* P ⁇ 0.05), increasing the third (** P ⁇ 0.01). However, the administration of both nanoemulsions did not have an effect on weight gain compared to the saline treated group ( Figure 3).
  • the animals were sacrificed after treatment with the different solutions by decapitation, prior anesthesia (pentobarbital 200 mg / kg, ip).
  • the collected stem blood was centrifuged (2000xg, 15 min, 25 ° C) and the plasma was extracted in cryotubes to preserve immediately at -20 ° C.
  • Biochemical analysis of plasma showed a significant increase in cholesterol (** P ⁇ 0.01), triglycerides (* P ⁇ 0.05), and transaminases [GPT (** P ⁇ 0.01) and GOT (** P ⁇ 0.01)] in those animals treated with Tween 20 with respect to treated with saline.
  • EXAMPLE 6 Acute effects on intake after systemic and oral administration of OAS
  • the biological activity related to satiety induction and intake control of N-acylethanolamine OEA was assessed using nanoemulsion G-F68 as a transport system (vehicle).
  • the experiments were carried out in animals used to the experimental protocol. For this purpose, 48 hours before each test, the base material (sand or sawdust) was removed, and small containers with food were placed inside the cages for 4 hours. After this initial phase, the animals were deprived of food for 24 hours, always with free access to water. Once the treatment groups were established, 15 minutes after the acute administration, the containers were placed with a known amount of food (normally 30-40 g) and a bottle of fresh water. These food containers were weighed at different times during the first 4 hours and 24 hours after their acute treatment. 1. Effects of nanoemulsion G-F68 on intake behavior
  • the OAS was administered using G-F68 (5% in saline) intraperitoneally in a volume of 1 mL / kg, controlling the food ingested at different times for 24 hours after administration. of the drug.
  • G-F68 5% in saline
  • Acute administration of different doses of OAS induced an inhibitory effect on food consumption in a dose-dependent manner with respect to the group of control rats (treated with vehicle G-F68).

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Abstract

La presente invención es de interés para el sector farmacéutico. Se refiere a nuevas formulaciones terapéuticas basadas en nanoemulsiones de aceites vegetales como sistema transportador de fármacos derivados de N-aciletanolaminas (NAEs) para su administración como herramienta farmacológica y como fármacos para la inducción de saciedad y control de la ingesta, modulación de los efectos metabólicos proanorexígenos y prevención de ganancia de peso.

Description

Formulaciones basadas en nanoemulsiones y su uso para el tratamiento de la obesidad
La presente invención es de interés para el sector farmacéutico. Se refiere a nuevas formulaciones terapéuticas basadas en nanoemulsiones de aceites vegetales como sistema transportador de fármacos derivados de N-aciletanolaminas (NAEs) para su administración como herramienta farmacológica y como fármacos para la inducción de saciedad y control de la ingesta, modulación de los efectos metabólicos proanorexígenos y prevención de ganancia de peso.
ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR
La obesidad es una enfermedad cuya incidencia ha crecido espectacularmente en los últimos 20 años hasta alcanzar el rango de epidemia global del siglo XXI en prácticamente todos los países según la Organización Mundial de la Salud (OMS). Dicho organismo estableció en 201 1 el sobrepeso y la obesidad como el quinto factor principal de riesgo de defunción en el mundo, con una tasa de 2,8 millones de personas adultas muertas (OMS, 10 datos sobre la obesidad 2010) y una previsión de 2.300 millones de adultos con sobrepeso y unos 700 millones con obesidad para el año 2015. La repercusión en la salud pública es enorme, ya que la obesidad está relacionada con enfermedades cardiovasculares, metabólicas (diabetes, colesterolemia, trigliceridemia, ..) dermatológicas, gastrointestinales, osteoarticulares y/o algunos cánceres como el cáncer de colon. Según datos de la OMS, el 44% de la carga de diabetes tipo 2 es atribuible a la obesidad o sobrepeso (OMS. Nota descriptiva N°31 1 , 201 1 ). Una de las estrategias utilizadas para intentar solucionar este problema es el uso de herramientas farmacológicas con distintos mecanismos de acción y dirigidas a distintas dianas biológicas. Sin embargo, esta línea de tratamiento no acaba de consolidarse debido a los problemas de efectos adversos, que han provocado la retirada del mercado de muchos de los fármacos comercializados por las principales agencias de seguridad del medicamento (USFDA de Estados Unidos y EMA de Europa), destacando los casos de: a) Rimonabant (SR141716A, Acomplia® y Zimulti® de Sanofi-Aventis) es el primer antagonista/agonista inverso de los receptores cannabinoides tipo 1 CB1 (relacionado con las NAEs) aprobado en 2006 para el tratamiento de pacientes obesos o pacientes con sobrepeso con factores de riesgo asociados, tales como diabetes tipo 2 o dislipidemia. Sin embargo, a partir de estudios clínicos se observaron efectos adversos psiquiátricos que incluían trastornos depresivos y ansiedad, así como mayor riesgo de suicidio. Por ello se retiró del mercado en 2007
(EE.UU.) y 2008 (Europa),
b) Un inhibidor central de recaptación de serotonina y norepinefrina llamado sibutramina (Meridia® o Reductil® de Abbott Laboratorios) no exento de efectos cardiovasculares. De hecho se mostró que causa infartos de miocardio e ictus en pacientes con sobrepeso con enfermedad cardíaca preexistente. Por ello se retiró en 2010.
Así, el arsenal farmacológico actual contra la obesidad sigue siendo reducido:
a) Un inhibidor de lipasa llamado orlistat (Xenical® de Roche) con efectos secundarios gastrointestinales: flatulencias, diarrea, dolor abdominal, dispepsias e incluso deficiencia en vitaminas liposolubles a largo plazo.
b) Una anfetamina llamada phentermine (Adipex-P® de Teva Pharmaceuticals y lonamin® de Medeva Pharmaceuticals) que puede aumentar la presión arterial (puede inducir hipertensión pulmonar primaria y problemas cardíacos) y provocar insomnio. Recientemente ha sido aprobado por la USFDA un nuevo medicamento antiobesidad surgido de la combinación de phentermine y un antiepiléptico: topiramate (Qsymia® de Vivus Inc.).
Por tanto, la necesidad de encontrar terapias farmacológicas eficaces y seguras a largo plazo frente a la obesidad sigue siendo uno de los principales objetivos de la industria farmacéutica y la investigación a nivel mundial.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere al diseño y desarrollo de nanoemulsiones aceite en agua (o/w) útiles para la vehiculización de N-aciletanolaminas, caracterizadas por comprender (a) una fase acuosa (b) una fase oleosa, que comprende un aceite, constituida por gotas de diámetro medio inferior a 500 nanómetros; c) un copolímero en bloques anfifílico y d) una N-aciletanolamina.
Por lo tanto, un primer aspecto de la invención se refiere a una nanoemulsion (de aquí en adelante "nanoemulsion de la invención") del tipo aceite en agua (o/w) adecuada para la administración de N-aciletanolaminas, que comprende: a. Una fase acuosa; b. Una fase oleosa que comprende un aceite constituida por gotas de diámetro inferior a 500 nanómetros; c. Un copolímero en bloques anfifílico; y d. Un compuesto de formula (I):
Figure imgf000005_0001
FormHa (I) donde el grupo R es un alquilo lineal (C1 1 -C21 ) o un alquenilo lineal (C1 1 -C21 ) con 1 -6 dobles enlaces y donde el ratio peso/peso (p/p) copolímero/fase oleosa se encuentra entre 0,02 y 0,24. Preferiblemente, dicho ratio (p/p) copolímero/fase oleosa se encuentra entre 0,02 y 0, 16, más preferiblemente dicho ratio (p/p) copolímero/fase oleosa se encuentra entre 0,032 y 0,08 y aún más preferiblemente dicho ratio (p/p) copolímero/fase oleosa es 0,04.
En una realización preferida del primer aspecto de la invención, la fase acuosa se encuentra a una concentración entre un 5% y un 45% en peso por volumen total de la nanoemulsion (p/v).
En otra realización preferida del primer aspecto de la invención, el copolímero en bloques anfifílico es un poloxámero. En una realización aún más preferida el copolímero en bloques anfifílico se selecciona de la lista que consiste en plurónico F68 y plurónico F127. En otra realización preferida del primer aspecto de la invención, el aceite comprendido en la fase oleosa se selecciona de la lista que consiste en aceite de girasol, cacahuete, algodón, oliva, ricino, soja, cártamo, palma, α tocoferol (vitamina E), miristato de isopropilo, escualeno o cualquier combinación de los mismos. Preferiblemente la fase oleosa comprende aceite de girasol. Aún más preferiblemente, la fase oleaosa consiste en aceite de girasol.
En aún otra realización preferida del primer aspecto de la invención, el compuesto de formula (I) es N-oleiletanolamina.
Un segundo aspecto de la invención, se refiere a un procedimiento para la obtención de la nanoemulsión de la invención, que comprende: i) disolver el/los copolímeros en agua bajo agitación suave; ii) añadir el aceite gota a gota a la fase acuosa producida en la etapa i), bajo agitación mecánica, produciendo una pre-emulsión; iii) reducir el tamaño de las gotas de la emulsión haciendo pasar en repetidas ocasiones la pre-emulsión de la etapa ii) por un homogeneizador de alta presión, formándose así la nanoemulsión; iv) añadir bajo agitación suave a la nanoemulsión de la etapa iii) un compuesto de la fórmula (I).
Un tercer aspecto de la invención se refiere a la nanoemulsión de la invención para su uso en terapia.
Un cuarto aspecto de la invención se refiere al uso de la nanoemulsión de la invención para la elaboración de un medicamento para su uso en el tratamiento o prevención de la obesidad. Alternativamente, este cuarto aspecto de la invención se refiere a la nanoemulsión de la invención para su uso en el tratamiento o prevención de la obesidad. Preferiblemente, la nanoemulsión de la invención para su uso en el tratamiento o prevención de la obesidad se administra oralmente. Un quinto aspecto de la invención se refiere al uso de la nanoemulsion de la invención para la elaboración de un medicamento para su uso en el tratamiento o prevención de la dislipemia. Alternativamente, este quinto aspecto de la invención se refiere a la nanoemulsion de la invención para su uso en el tratamiento o prevención de la dislipemia. Preferiblemente, la nanoemulsion de la invención para su uso en el tratamiento o prevención de la dislipemia se administra oralmente.
En una realización preferida del quinto aspecto de la invención, dicha dislipemia se selecciona de la lista que consiste en hipercolesterolemia, hipertrigliceridemia, hiperlipoproteinemia de tipo I, lia, llb, III, IV ó V, hiperquilimicronemia o hiperlipidemia combinada.
Un sexto aspecto de la invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende la nanoemulsion de la invención y opcionalmente uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Figura 1. Estructura química de Plurónico F68 y F127 (A), y OEA (B).
Figura 2. Propiedades de las nanoemulsiones. (A) Tamaño medio y estabilidad en el tiempo de nanoemulsiones de la invención, medidos mediante Dynamic Light Scattering. (B) Biodegradación controlada de las nanoemulsiones bajo condiciones duodenales simuladas in vitro. Para la realización de este ejemplo se han utilizado las nanoemulsiones detalladas en los ejemplos 1 y 2.
Figura 3. Evolución de peso relativo en ratas Wistar macho (N=8 por grupo) tras la administración diaria (i.p.) de salino, Tween 20 (10% en salino), nanoemulsion G-F68 (10% en salino) ó G-F127 (10% en salino) durante 3 semanas. Los puntos (■,□, · y o) representan medias ± SEM (representadas por T o -1-). Los datos fueron analizados por ANOVA (2 vías: tiempo y tratamiento) y post-tests Bonferroni. *P<0,05 y **P<0,01 respecto al grupo control salino. Figura 4. Consumo de comida de ratas Wistar macho (N=8 por grupo) en ayunas tras la administración aguda intraperitoneal (A, B) o intragástrica (C, D) de salino o nanoemulsion evaluado a diferentes tiempos: 30, 60, 120 y 240 minutos y 24 horas. Columnas representan medias ± SEM. Los puntos (■,□) representan medias ± SEM (representadas por -|- o Los datos fueron analizados por ANOVA (2 vías: tiempo y tratamiento) y posttests Bonferroni.
Figura 5. Consumo de comida de ratas Wistar macho (N=8 por grupo) en ayunas tras la administración aguda de OEA vía i.p. en nanoemulsion. (A) Tiempo: 30, 60, 120 y 240 minutos. (B) Tiempo: 24 horas. Columnas representan medias ± SEM. Los datos fueron analizados por ANOVA (2 vías: tiempo y tratamiento) y post-tests Bonferroni. *P<0,05 y ***P<0,001 respecto algrupo control nanoemulsion.
Figura 6. Consumo de comida de ratas Wistar macho (N=8 por grupo) en ayunas tras la administración aguda de OEA vía oral en nanoemulsion. (A) Tiempo: 30, 60, 120 y 240 minutos. (B) Tiempo: 24 horas. Columnas representan medias ± SEM. Los datos fueron analizados por ANOVA (2 vías: tiempo y tratamiento) y post-tests Bonferroni. *P<0,05, **P<0,01 y ***P<0,001 respecto algrupo control nanoemulsion.
Figura 7. Consumo de comida de ratas Wistar macho (N=8 por grupo) en ayunas tras la administración aguda de OEA (50 mg/kg) vía oral en Tween 20 o en nanoemulsion. (A) Tiempo: 15, 30, 60, 120 y 240 minutos. (B) Tiempo: 24 horas. Columnas representan medias ± SEM. Los datos fueron analizados por ANOVA (2 vías: tiempo y tratamiento) y post-tests Bonferroni. *P<0,05 y **P<0,01 respecto al grupo control respectivo.
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
La presente invención se enfrenta al problema de encontrar terapias farmacológicas eficaces y seguras a largo plazo frente a la obesidad. La presente invención resuelve este problema a través del diseño y desarrollo de nanoemulsiones aceite en agua (o/w) útiles para la vehiculización de N-aciletanolaminas, caracterizadas por comprender (a) una fase acuosa (b) una fase oleosa, que comprende un aceite, constituida por gotas de diámetro medio inferior a 500 nanómetros; c) un copolímero en bloques anfifílico y d) una N- aciletanolamina. Resulta conocido que una de las dianas farmacológicas validada para el tratamiento de la obesidad es el sistema de señalización de las N-aciletanolaminas (NAEs), que está relacionado con el balance energético, el control del apetito y la adiposidad. El mismo comprende las NAEs (N-araquidoniletanolamina, N-palmitiletanolamina, N- oleiletanolamina, etc.) además de aquellas proteínas y moléculas involucradas en su síntesis, actividad (receptores cannabinoides CB1 y CB2; canal iónico vanilloide TRPV1 ; y el factor de transcripción PPAR alfa) y degradación. En especial, la NAE N- oleiletanolamina (OEA) ha sido descrita como un potente mediador anorexígeno a nivel periférico (principalmente en tejido adiposo y tracto gastrointestinal), a partir del cual se han descrito distintos derivados sintéticos capaces de inducir saciedad, modular la grasa corporal y prevenir la excesiva ganancia de peso. Pero, aunque sus características de ácidos grasos hacen de ellas moléculas con bajos perfiles toxicológicos, su naturaleza liposoluble es un problema para su adecuada administración, lo que supone un verdadero obstáculo para su uso como medicamentos.
Hasta el momento, para la administración de este tipo de compuestos liposolubles cannabinoides, vanilloides o NAEs en ensayos in vivo, se han utilizado diversos tipos de sustancias como vehículo. Sin embargo, aunque puedan dar resultados relativamente efectivos en ensayos experimentales bajo paradigmas crónicos/subcrónicos de administración en modelos animales de investigación, todavía presentan problemas a la hora de su desarrollo como medicamentos, tales como los que se mencionan a continuación:
Disolventes orgánicos como propilenglicol, dimetilsulfóxido (DMSO), etanol, metanol (normalmente en suero fisiológico en porcentaje que oscila 30-95%). Su principal inconveniente es el grado toxicidad no admitido para su uso como medicamento. Surfactantes como Tween 20 y 80 [Polioxietilen (20/80) sorbitan monolaurato]. Si bien estos compuestos mejoran el problema de la toxicidad general de los disolventes orgánicos, se han descrito problemas de hepatotoxidad y la afectación de parámetros clave para evaluar moléculas anti-obesidad (irritación, afectación del sistema inmunológico, reducción en la ganancia de peso, menor consumo de comida, hemolisis, niveles circulantes de adiposidad alterados, aumento del contenido graso en hígado... ).
c) Polímeros orgánicos como la carboximetilcelulosa se ha utilizado para su administración por vía oral. Sin embargo, los fármacos muestran actividad antiobesidad solo a altas dosis, lo que podría acarrear problemas de toxicidad y sobredosificación.
d) Emulsiones comerciales, por ejemplo Tocrisolve® 100 (Tocris Bioscience) a partir de aceite de soja, agua y plurónico F68 presentan un perfil no tóxico de acuerdo con sus datos de seguridad. Pero, si bien la administración sistémica intraperitoneal, intramuscular o subcutánea permite el uso de este tipo de emulsiones, la administración oral es complicada debido a las condiciones opuestas a la absorción en el tracto gastrointestinal de los fármacos contenidos (pH, agentes complejantes, bilis, presencia de alimentos, motilidad, enzimas como las lipasas... ), afectando la absorción y biodisponibilidad del fármaco.
Sin embargo, los autores de la presente invención han descubierto como sorprendentemente nanoemulsiones concretas caracterizadas por comprender (a) una fase acuosa (b) una fase oleosa, que comprende un aceite, constituida por gotas de diámetro medio inferior a 500 nanómetros y c) un copolímero en bloques anfifílico, resultan especialmente útiles para la vehiculación farmacológica de N-aciletanolaminas y no presentan ninguno de los problemas mencionados anteriormente. De este modo, los autores de la presente invención han evaluado este tipo de nanoemulsiones in vivo en ratas Wistar macho durante 3 semanas frente a otros vehículos habitualmente empleados para fármacos liposolubles, tales como Tween 20 (10% en salino v/v). Utilizando suero fisiológico como grupo control de referencia, los animales tratados con las nanoemulsiones de la presente invención mostraron un perfil toxicológico significativamente mejorado respecto a aquellos tratados con Tween 20 y similar a los tratados únicamente con suero (ver ejemplo 4). Es importante resaltar que las nanoemulsiones de la invención se han sintetizado a partir de la identificación de los mecanismos de estabilidad/inestabilidad de las nanoemulsiones de aceites en agua. La información estructural obtenida por reología se ha relacionado con el comportamiento macroscópico de las nanoemulsiones, relacionando de esta forma estructura con funcionalidad. Paralelamente a estos trabajos se ha llevado a cabo un estudio comparativo de reacciones de hidrólisis de aceites mediante lipasas, a través de la simulación de procesos de degradación en el intestino, haciendo uso de un tensiómetro de gota pendiente. En este sentido, para el desarrollo y selección de estas nanoemulsiones se ha investigado el efecto de la presencia de sales biliares, componentes fundamentales en los procesos de lipólisis. Se ha analizado cómo afectan las condiciones gástricas, duodenales e intravenosas a las nanoemulsiones, y especialmente la acción de las respectivas lipasas (lipólisis), ya que esta acción está directamente relacionada con la velocidad y lugar de liberación del fármaco dentro del organismo así como su posterior absorción. De esta forma se realizó la experimentación mostrada en la figura 2 utilizando una serie de nanoemulsiones de acuerdo con las especificaciones dadas en los ejemplos 1 y 2 de la memoria, es decir se utilizo una nanoemulsión donde el ratio surfactante/aceite (p/p)se encuentra entre 0,032 y 0,08. De esta forma la proporción surfactante/aceite era suficiente para recubrir correctamente las gotas y que éstas tuvieran un tamaño inferior a 500 nm (es decir, una concentración de surfactante superior a 0,5% en peso/volumen), pero no excesiva a fin de no desestabilizar la nanoemulsión por depleción-floculación (es decir, inferior al 6% en peso/volumen), produciendo por tanto condiciones óptimas de tamaño, recubrimiento de las gotas y estabilidad. Estos ensayos de lipólisis duodenal simulada fueron realizados mezclando las nanoemulsiones descritas anteriormente con un buffer de digestión duodenal que contiene los principales componentes implicados en la digestión (sales biliares, lipasa pancreática, cloruros de sodio y calcio, etc.) con concentraciones similares a las del organismo, y midiendo la disminución de la intensidad de luz retrodispersada, directamente relacionada con el tamaño de las gotas de nanoemulsión. Así, al producirse la lipólisis, los triglicéridos que componen las gotas de nanoemulsión son convertidos en productos que abandonan dichas gotas y se solubilizan en el agua (monoglicéridos y ácidos grasos), por lo que las gotas disminuyen su tamaño. Este descenso generalizado del tamaño se corresponde con un descenso generalizado de la intensidad de luz retrodispersada por la nanoemulsión. El valor de este cambio en la intensidad puede ir desde un valor apenas apreciable (0% lipólisis) a un valor máximo, equivalente a una lipólisis completa (100% lipólisis). Como se puede apreciar en la figura 2, la nanoemulsion de la invención posee un tamaño propio de las nanoemulsiones, que además permanece estable en un rango amplio de tiempo (Figura 2A), y que a su vez es convenientemente biodegradada cuando es mezclada con los jugos duodenales (Figura 2B), pudiendo producirse así la liberación de los compuestos administrados en ellas en el lugar apropiado. De esta forma y a lo largo de sucesivas experimentaciones se ha determinado que el ratio copolímero/fase oleosa en la nanoemulsion de la invención juega un papel fundamental a la hora de lograr nanoemulsiones estables en el tiempo, de bajo perfil toxicológico y una buena absorción a nivel intestinal. De este modo, la presente invención es la primera en aseverar que aquellas nanoemulsiones caracterizadas por comprender (a) una fase acuosa (b) una fase oleosa, que comprende un aceite, constituida por gotas de diámetro medio inferior a 500 nanómetros y c) un copolímero en bloques anfifílico; donde el ratio (p/p) copolímero/fase oleosa se encuentra entre 0,02 y 0, 16, más preferiblemente dicho ratio (p/p) copolímero/fase oleosa se encuentra entre 0,032 y 0,08 y aún más preferiblemente dicho ratio (p/p) copolímero/fase oleosa es aproximadamente 0,04, resultan especialmente útiles para la administración oral de N- aciletanolaminas.
Así se ha demostrado que las nanoemulsiones de la invención son estables en el tiempo presentan un bajo perfil toxicológico y una buena absorción a nivel intestinal, lo que hace de estas nanoemulsiones un excelente vehículo farmacológico para la administración oral de N-aciletanolaminas.
Por lo tanto, un primer aspecto de la presente invención se refiere a una nanoemulsion aceite en agua (o/w) (de aquí en adelante "nanoemulsion" de la invención) adecuado para la administración de N-aciletanolaminas, que comprende:
a. Una fase acuosa; b. Una fase oleosa, que comprende un aceite, constituida por gotas de diámetro medio inferior a 500 nanómetros; c. Un copolímero en bloques anfifílico; y d. Un compuesto de formula (I):
Formula (I):
Figure imgf000013_0001
donde el grupo R es un alquilo lineal (C1 1 -C21 ) o un alquenilo lineal (C1 1 -C21 ) con 1 -6 dobles enlaces y donde el ratio (p/p) copolímero/fase oleosa se encuentra entre 0,02 y 0, 16, más preferiblemente dicho ratio (p/p) copolímero/fase oleosa se encuentra entre 0,032 y 0,08 y aún más preferiblemente dicho ratio (p/p) copolímero/fase oleosa es aproximadamente 0,04.
En el contexto de la presente invención (p/p) hace referencia al porcentaje peso de surfactante/peso de la fase oleosa.
En el contexto de la presente invención, por nanoemulsiones se entiende a las estructuras compuestas de un aceite o mezclas de aceites aptos para su uso en alimentación, dispersado en agua como gotas de tamaño nanométrico, y a su vez, estabilizadas éstas por medio de un copolímero que impedirá la floculación o coalescencia de las gotas. Este tipo de nanoemulsiones está determinado por su tamaño de gota y distribución. De modo que atendiendo al diámetro medio de gota, por nanoemulsión se entiende aquellas emulsiones que presenten un diámetro medio de gota entre 20-500 nm, siendo micro o macro-emulsiones aquellas que presenten un diámetro medio de gota entre 0,5-100 pm. Preferiblemente, atendiendo al diámetro medio de gota, por nanoemulsión se entiende aquellas emulsiones que presenten un diámetro medio de gota inferior a 300 nm.
Se hace notar, que las nanoemulsiones de la presente invención, presentan una buena estabilidad física a largo plazo (sin floculación aparente o coalescencia) y no requieren una gran cantidad de surfactante como sucede con las microemulsiones. Así por ejemplo para una nanoemulsión aceite/agua (25%), una concentración de surfactante entre 0,5% y 6% (p/v), más preferiblemente entre 0,8% y 2% (p/v), sería suficiente para estabilizarla, muy inferior a valores típicos asociados con microemulsiones (10-20%), con los problemas de toxicidad que ello conllevaría.
Por otro lado los porcentajes concretos de la fase acuosa de la nanoemulsion dependerán del método de preparación empleado, preferiblemente la fase acuosa se encuentra a una concentración entre un 5% y un 75% en peso por volumen total de la nanoemulsion (p/v). Ahora bien, en cualquier caso para que la nanoemulsion de la invención sea estable en el tiempo, de bajo perfil toxicológico y con una buena absorción a nivel intestinal, es necesario mantener el ratio (p/p) copolímero/fase oleosa entre 0,02 y 0, 16, más preferiblemente dicho ratio (p/p) copolímero/fase oleosa se encuentra entre 0,032 y 0,08 y aún más preferiblemente dicho ratio (p/p) copolímero/fase oleosa es 0,04.
Por otro lado, se hace notar que el surfactante empleado para la realización de la nanoemulsion de la presente invención son copolímeros en bloques anfifílicos, donde por anfifílico se entiende aquellas moléculas, sustancias, principios activos, estructuras o parte de ellas que poseen tanto propiedades hidrofóbicas como hidrofílicas.
De acuerdo con la IUPAC 1 , los copolímeros en bloques son sustancias formadas por macromoléculas constituidas por bloques dispuestos en una secuencia lineal. Para este organismo, un bloque es una porción de una macromolécula, que comprende varias unidades constitutivas, que tiene al menos una característica que no está presente en las porciones adyacentes. Existen copolímeros formados por dos o por tres bloques, a los que se suelen simbolizar, respectivamente, como AB y ABA o BAB, donde A y B son los bloques poliméricos. También son posibles copolímeros en bloques constituidos por la repetición de unidades formadas por dos bloques, (AB)n y por la incorporación a un polímero de dos bloques de una tercera cadena (ABC). Otros tipos de copolímeros formados por bloques son los copolímeros injertados (en inglés, graft οοροΐγηηθή y los copolímeros estrella. Entre los copolímeros en bloques con aplicaciones farmacéuticas se han de destacar los anfifílicos, que consisten de macromoléculas formados por bloques lipofílicos unidos a bloques hidrofílicos. Este tipo de copolímeros en bloques, que poseen propiedades tensoactivas, forman distintas clases de asociaciones, tales como micelas y estructuras líquido cristalinas, que pueden actuar como excelentes vehículos de principios activos. Entre los copolímeros en bloques anfifílicos más utilizados en formulaciones farmacéuticas se encuentran los compuestos por bloques derivados de los óxidos de etileno (hidrofílicos) y de propileno, a los que se conoce con el nombre genérico de poloxameros y los nombres comerciales Pluronic (Basf) y Synperonic (ICI). Estos copolímeros poseen masas moleculares relativas comprendidas entre 1000 y 15000 y un contenido de bloques de poli(óxido de etileno) entre el 10 y el 80 por ciento en masa.
La hidratación de los bloques hidrofílicos de poli(óxido de etileno) se debe a su fácil acomodamiento en la estructura del agua. Esta hidratación es altamente dependiente de la temperatura, por lo cual la solubilidad y la formación de agregados de los polímeros en bloques que contienen este grupo polar pueden ser reguladas por variaciones de la temperatura. Estos polímeros, que poseen un bajo costo y son biocompatibles, pueden adoptar distintas estructuras cuando se dispersan en agua, las que dependen de la proporción de cada uno de los bloques y de su masa molecular relativa. Esta proporción también determina la solubilidad y el balance hidrofílico-lipofílico del polímero.
Los copolímeros Pluronic se designan con letras y números. La letra "L" se utiliza para los líquidos, "P" para los que se presentan como pastas y "F" (del inglés flake, escama) para los sólidos. El primer dígito, o los dos primeros en los números con tres dígitos, multiplicado por 300 es aproximadamente igual a la masa molecular relativa promedio de la parte lipofílica. El último dígito, multiplicado por 10, indica el porcentaje en masa aproximado de la parte hidrofílica. Así, por ejemplo, el Pluronic F68 es un copolímero sólido en el cual la masa molecular relativa aproximada de la parte hidrofóbica es 1800 (6 x 300) y la proporción en masa de la parte hidrofílica es aproximadamente 80% (8 x 10). Así, en otro aspecto preferido del primer aspecto de la invención, el copolímero en bloques anfifílico de la nanoemulsión de la invención es un poloxámero, más preferiblemente el copolímero en bloques anfifílico es el copolímero plurónico F68 ó el copolímero plurónico F127. Por otro lado, tal y como ya se ha comentado anteriormente, la nanoemulsión de la invención se caracteriza por tener una fase oleosa, que comprende un aceite, constituida por gotas de un diámetro medio inferior a 500 nanómetros, preferiblemente inferior a 300 nanómetros. En este sentido es importante resaltar que en el contexto de la presente invención, se entiende por diámetro medio aquel medido mediante la técnica Dynamic Light Scattering (DLS), que está definido por el diámetro hidrodinámico de una esfera que difunde a la misma velocidad que las partículas que se están midiendo. Esto proporciona el diámetro medio de las gotas, así como un índice de su polidispersidad, y es el método recomendado por la United States Pharmacopeia para la medida de tamaño de gotas de emulsiones lipídicas inyectables (método 729 USP).
Adicionalmente, los aceites utilizados para constituir el aceite comprendido en la fase oleosa de la nanoemulsión de la invención se pueden seleccionar entre uno o más aceites naturales, semisintéticos y sintéticos de uso farmacéutico tales como aceites de origen animal, vegetal, aceites hidrocarbonados o aceites de silicona. Aceites adecuados para llevar a cabo la presente invención incluyen, pero no se limitan a, aceite mineral, aceite de escualeno, aceites de sabor, aceite de silicona, aceites esenciales, vitaminas insolubles en agua, isopropil estearato, butil estearato, octil palmitato, cetil palmitato, tridecil behenato, diisopropil adipato, dioctil sebacato, mentil antranilato, cetil octanoato, octil salicilato, isopropil miristato, cetoles de dicarpato de neopentilglicol, Cerafilos®, decil oleato, C12- C15alquil lactatos, cetil lactato, lauril lactato, isostearil neopentanoato, miristil lactato, isocetil estearoil estearato, octildodecil estearoil estearato, aceites de hidrocarburos, isoparafina, parafinas fluidas, isododecano, vaselina, aceite de argán, aceite de colza, aceite de chile, aceite de coco, aceite de maíz, aceite de algodón, aceite de lino, aceite de semilla de uva, aceite de mostaza, aceite de oliva, aceite de palma, aceite de palma fraccionado, aceite de cacahuete, aceite de ricino, aceite de semilla de pino, aceite de semilla de amapola, aceite de semilla de calabaza, aceite de salvado de arroz, cártamo, aceite de té, aceite de trufa, aceite vegetal, aceite de albaricoque, aceite de jojoba, aceite de macadamia, aceite de germen de trigo, aceite de almendra, aceite de soja, aceite de sésamo, aceite de avellana, aceite de girasol, aceite de cáñamo, aceite de bois, aceite de nuez de Kukui, aceite de aguacate, aceite de nuez, aceite de pescado, aceite de baya, aceite de pimienta de Jamaica, aceite de enebro, aceite de semilla, aceite de semilla de almendra, aceite de semilla de anís, aceite de semilla de apio, aceite de semilla de comino, aceite de semilla de nuez moscada, aceite de hoja de albahaca, aceite de hoja de laurel, aceite de hoja de canela, aceite de hoja de salvia común, aceite de hoja de eucalipto, aceite de hoja de limón, aceite de hoja de melaleuca, aceite de orégano, aceite de hoja de pachuli, aceite de hoja de menta, aceite de aguja de pino, aceite de hoja de romero, aceite de menta verde, aceite de hoja del árbol de té, aceite de hoja de tomillo, aceite de hoja de té de Canadá, aceite de flor, aceite de camomila, aceite de salvia romana, aceite de clavo, aceite de flor de geranio, aceite de flor de hisopo, aceite de flor de jazmín, aceite de flor de lavanda, aceite de flor de mauka, aceite de flor de mejorana, aceite de flor de naranja, aceite de flor de rosa, aceite de flor de ylang-ylang, aceite de corteza, aceite de corteza de casia, aceite de corteza de canela, aceite de corteza de sasafrás, aceite de madera, aceite de madera de alcanfor, aceite de madera de cedro, aceite de palo de rosa, aceite de sándalo, aceite de madera de jengibre, aceite de resina, aceite de ricino, aceite de mirra, aceite de piel, aceite de piel de Bérgamo, aceite de piel de pomelo, aceite de piel de limón, aceite de piel de lima, aceite de piel de naranja, aceite de piel de mandarina, aceite de raíz, aceite de valeriana, ácido oleico, ácido linoleico, oleil alcohol, alcohol de isostearilo, oleato de etilo, Miglyol®, Labrafil®, Labrafac®, Rylo®, Peceol® y Maisine®, derivados sintéticos o semisintéticos de los mimos y combinaciones de los mismos. Es decir, en el contexto de la presente invención, el aceite comprendido en la fase oleosa de las nanoemulsiones puede consistir en un único aceite o en una mezcla de diferentes aceites, preferiblemente seleccionados de la lista anterior. Preferentemente el aceite comprende aceite de girasol. Aún más preferentemente, el aceite consiste en aceite de girasol, es decir, el aceite comprendido en la fase oleaosa es aceite de girasol. Por otro lado, tal como se ha definido anteriormente, las nanoemulsiones de la invención comprenden una N-aciletanolamina como principio activo. El término "principio activo" se refiere a cualquier sustancia que se utiliza en el tratamiento, cura, prevención o diagnóstico de una enfermedad o que se utiliza para mejorar el bienestar físico y mental de seres humanos y animales. Así las nanoemulsiones de la presente invención resultan adecuadas para su uso en el tratamiento o prevención de la obesidad o dislipemia.
Las N-aciletanolaminas (NAEs) utilizadas en la presente invención, son amidas de ácidos grasos que actúan como mediadores endógenos de naturaleza lipídica. Así, en el contexto de la presente invención, una N-aciletanolamina es un compuesto que presenta la siguiente estructura química:
Formula (I):
Figure imgf000018_0001
donde el grupo R es un alquilo lineal (C1 1 -C21 ) o un alquenilo lineal (C1 1 -C21 ) con 1 -6 dobles enlaces. En un aspecto preferido de la presente invención los grupos R pueden ser seleccionados de uno cualquiera de los siguientes grupos:
Figure imgf000018_0002
7. CH3(CH2)3CH=CH(CH2)7,
8. CH3(CH2)5CH=CH(CH2)7,
9. CH3(CH2)8CH=CH(CH2)4,
10. CH3(CH2)7CH=CH(CH2)7,
1 1. CH3(CH2)5CH=CH(CH2)9,
12. CH3(CH2)4CH=CHCH2CH=CH(CH2)7,
13. CH3CH2CH=CHCH2CH=CHCH2CH=CH(CH2)7,
14. CH3(CH2)4CH=CHCH2CH=CHCH2CH=CHCH2CH=CH(CH2)3, 15. CH3CH2CH=CHCH2CH=CHCH2CH=CHCH2CH=CHCH2CH=CH(CH2)3,
16. CH3(CH2)7CH=CH(CH2)ii,
17.
CH3CH2CH=CHCH2CH=CHCH2CH=CHCH2CH=CHCH2CH=CHCH2CH=CH(CH2)2
Un tipo concreto de N-aciletanolamina es la N-oleiletanolamina., de ahí que en otro aspecto preferido del primer aspecto de la invención, la N-aciletanolamina es N- oleiletanolamina. El término N-oleiletanolamina (OEA), tal y como se usa en la presente invención, se refiere a una NAE cuya estructura se describe en la figura 1 B, que se genera de forma natural regulando la ingesta y la ganancia de peso corporal en todos los vertebrados. Es un ligando endógeno del Receptor Activado por Proliferadores de Peroxisomas tipo alfa PPARa que regula su actividad para estimular la lipólisis.
Por otro lado, un segundo aspecto de la invención se refiere a un procedimiento para elaborar la nanoemulsion de la invención. En este sentido, se hace notar que los procedimientos de obtención de las nanoemulsiones de la invención son métodos sencillos que evitan condiciones drásticas como altas temperaturas. Además, tampoco es necesario llevar a cabo ningún tipo de reacción química para la obtención de los mismos, ya que la obtención del sistema implica interacciones no covalentes. Por tanto, se preserva así la integridad de las moléculas incorporadas al sistema, susceptibles de ser degradadas. En este sentido, para lograr la formación de las nanoemulsiones de la invención se puede proceder a: i) disolver el/los copolímeros en agua bajo agitación suave; ii) añadir el aceite gota a gota a la fase acuosa producida en la etapa i), bajo agitación mecánica, produciendo una pre-emulsión; iii)reducir el tamaño de las gotas de la emulsión haciendo pasar en repetidas ocasiones la pre-emulsión de la etapa ii) por un homogeneizador de alta presión, formándose así la nanoemulsion; iv) añadir bajo agitación suave a la nanoemulsion de la etapa iii) un compuesto de la fórmula (I).
Adicionalmente, otro aspecto de la presente invención se refiere a la nanoemulsion de la invención para su uso en terapia. Más concretamente, a una composición farmacéutica, que comprende la nanoemulsion de la invención, y opcionalmente uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables. En particular, la incorporación de N-aciletanolaminas en las nanoemulsiones de la invención origina composiciones, cuyas características en cuanto a su composición, propiedades y morfología, les convierte en excelentes candidatos para el área de la terapéutica, más concretamente para el tratamiento o prevención de la obesidad o de la dislipemia. El tipo de N-aciletanolamina a incorporar en las nanoemulsiones de la invención será aquél con propiedades farmacoterapéuticas adecuadas de acuerdo con la aplicación terapéutica a la cual sea destinada la formulación. Así en una realización particular, la N-aciletanoamina es N-oleiletanolamina. Por lo tanto, otro aspecto de la invención se refiere a una composiciónque comprende la nanoemulsión de la invención para su uso en el tratamiento o prevención de la obesidad. Alternativamente, la invención también se refiere al uso de una una composición que comprende la nanoemulsión de la invención para la preparación de un medicamento para el tratamiento o prevención de la obesidad. Preferiblemente, la nanoemulsión de la invención para su uso en el tratamiento o prevención de la obesidad se administra oralmente.
En aún otro aspecto, la invención se refiere a una composición que comprende la nanoemulsión de la invención para su uso en el tratamiento o prevención de la dislipemia. Alternativamente, la invención se refiere también al uso de una una composición que comprende la nanoemulsión de la invención para la preparación de un medicamento para el tratamiento o prevención de la dislipemia. Preferiblemente, la nanoemulsión de la invención para su uso en el tratamiento o prevención de la dislipemia se administra oralmente.
Adicionalmente, en otro aspecto más, la invención se relaciona con un método para el tratamiento o prevención de una enfermedad metabólica en un sujeto que comprende la administración a dicho sujeto de una composición que comprende la nanoemulsión de la invención. El término "obesidad", según se usa en la presente invención, se refiere a la definición de obesidad proporcionada por la OMS basada en el índice de masa corporal (IMC), que consiste en la relación entre el peso de una persona (en kg) y el cuadrado de su altura en metros. Según este criterio, un IMC inferior a 18,5 kg/m2 se considera como peso insuficiente o delgadez, un IMC de 18,5-24,9 kg/m2 se considera normopeso, un IMC de 25,0-29,9 kg/m2 se considera como sobrepeso en grado 1 , un IMC de 30,0-39,9 kg/m2 se considera obesidad o sobrepeso en grado 2 y un IMC mayor o igual a 40,0 kg/m2 se considera como obesidad mórbida. Alternativamente, existen otros métodos para definir el grado de obesidad de un individuo tales como el diámetro de la cintura medida en el punto medio entre el límite inferior de las costillas y el límite superior de la pelvis (en cm), grosor de los pliegues de la piel y bioimpedancia, basada en el principio de que la masa magra transmite la electricidad mejor que la masa grasa.
El término "dislipemia", según se usa en la presente invención, se refiere a cualquier condición patológica caracterizada por una alteración en el metabolismo de los lípidos, con su consecuente alteración de las concentraciones de lípidos (colesterol, triglicéridos y similares) y lipoproteínas (lipoproteínas de alta densidad) en la sangre. Dislipemias que pueden ser tratadas con los métodos de la presente invención incluyen, sin limitación, hipercolesterolemia, hipertrigliceridemia, hiperlipoproteinemia de tipo I, l ia, l lb, I II, IV, V, hiperquilomicronemia, hiperlipidemia combinada, etc.
El término "sujeto", según se usa en la presente invención incluye organismos vivos, tales como seres humanos, de sexo femenino o masculino, y de cualquier raza o edad; animales, por ejemplo monos, vacas, ovejas, caballos, cerdos, cabras, perros, gatos, ratones, ratas y especies transgénicas de los mismos. En una realización preferida, el sujeto es un ser humano.
La cantidad de agentes activos (NAE) que será eficaz en el tratamiento de la obesidad o dislipemia puede determinarse por técnicas clínicas estándar basadas en la presente descripción. Además, pueden emplearse opcionalmente ensayos in vitro para ayudar a identificar los intervalos de dosificación óptimos. La dosis precisa a emplear en la formulación dependerá también de la vía de administración, y la gravedad de la afección, y debe decidirse conforme al juicio del médico y las circunstancias de cada sujeto.
Para la administración oral, una dosis terapéuticamente eficaz puede estimarse inicialmente a partir de ensayos in vitro. Por ejemplo, puede formularse una dosis en modelos animales para conseguir un intervalo de concentración circulante que incluya la IC50 (una medida de eficacia de la droga que indica cuánto de una sustancia es necesario para inhibir un proceso biológico dado) que se haya determinado en cultivo celular. Tal información puede usarse para determinar de manera más precisa las dosis útiles en humanos. Las dosificaciones iniciales pueden estimarse también a partir de datos in vivo, p.ej., modelos animales, usando técnicas que son bien conocidas en el estado de la técnica. Alguien con una experiencia normal en la técnica podrá optimizar fácilmente la administración a humanos basada en los datos en animales. A continuación, para una mayor comprensión de las características y ventajas de la presente invención, se hará referencia a una serie de ejemplos que de forma explicativa completan la descripción anterior, sin suponer en modo alguno que ésta se vea limitada a los mismos.
EJEMPLOS DE REALIZACIÓN DE LA INVENCIÓN
EJEMPLO 1. Preparación y obtención de nanoemulsión G-F68
El aceite de girasol fue adquirido de Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, MO, EE.UU.) y purificado mediante silicato de magnesio activado para eliminar ácidos grasos libres.
El poloxámero Plurónico F68 es un surfactante polimérico con un peso molecular de 8400 Da adquirido de Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, MO, EE.UU.).
0,3 g de poloxámero Plurónico F68 fueron añadidos a 22.2 g de agua purificada MilliQ (0,054 mS) y disueltos en ella con la ayuda de un agitador magnético. Posteriormente, se añaden 7.5 g de aceite de girasol gota a gota mientras se agita mecánicamente mediante un agitador de alta velocidad Heidolph Diax 900, manteniéndose la agitación durante 4 minutos a 13000 rpm, formándose así la pre-emulsión. Esta pre-emulsión fue inmediatamente homogeneizada mediante el homogeneizador de alta presión Emulsiflex- C3 (Avestin, CA, EE.UU.) a 103 MPa. Este último proceso se repitió 8 veces.
EJEMPLO 2. Preparación y obtención de nanoemulsion G-F127
El surfactante Plurónico F127 (poloxámero P407) es un copolímero tribloque con un peso molecular de 12600 g/mol, adquirido de Sigma-Aldrich. El método de preparación de nanoemulsiones con este surfactante es similar al explicado en el Ejemplo 1 para el Plurónico F68, con la única modificación de la cantidad de Plurónico empleado (en gramos). Con el fin de asegurar un correcto recubrimiento de las gotas de la nanoemulsion, la cantidad de Plurónico F127 será equivalente en moles a la de Plurónico F68, por lo que al ser mayor su peso molecular la cantidad añadida en gramos será superior. Así, en este caso la cantidad añadida de Plurónico F127 fue de 0.45 g. EJEMPLO 3. Preparación de formulación con OEA
A partir de la nanoemulsion G-F68, se añadirá la cantidad previamente determinada de OEA en función de la dosis a utilizar. En un vial conteniendo un volumen de nanoemulsion correspondiente a un 5% (v/v) del volumen total de la solución, se añade una cantidad pesada de OEA (estado sólido). Este vial se encontrará en agitación a temperatura 35- 45°C durante 30 minutos. Transcurrido este tiempo, la nanoemulsion conteniendo OEA se someterá a sonicación en un baño de agua convencional durante 5 minutos controlando la temperatura. A continuación se volverá a agitar el vial añadiendo gota a gota suero fisiológico (5% NaCI) hasta completar el restante 95% de volumen total de la solución de trabajo. Esta preparación se llevará a cabo en fresco el mismo día del trabajo experimental in vivo. EJEMPLO 4. Actividad biológica de nanoformulaciones de OEA con G-F68A continuación se ilustrará la invención mediante unos ensayos experimentales in vivo realizados por los autores de la presente invención, que ponen de manifiesto la efectividad de las formulaciones de la invención. Animales de experimentación
Ratas Wistar macho de 300-350 g fueron mantenidas individualmente en jaulas en unas condiciones de humedad y temperatura constantes, y con libre acceso a agua y comida estándar hasta llevarse a cabo los estudios de ingesta correspondientes. Los animales fueron manipulados por los experimentadores para su habituación. Compuestos y dosis
Para el estudio de ingesta prolongado, una serie de soluciones de potencial uso para fármacos liposolubles relacionados con la conducta de ingesta fueron preparadas: a) Suero fisiológico.
b) Tween 20 [10% en suero fisiológico v/v, obtenido de Tocris Bioscience (Bristol, Reino Unido)].
c) Nanoemulsión G-F68 (10% en suero fisiológico v/v).
d) Nanoemulsión G-F127 (10% en suero fisiológico v/v).
Todas las soluciones fueron administradas diariamente en un volumen de 1 mL/kg vía intraperitoneal (i.p.) durante 3 semanas. Para los estudios de ingesta agudos, la nanoemulsión G-F68 o el Tween 20 fueron preparados en suero fisiológico al 5%.
Respecto a los estudios agudos con OEA, el compuesto se obtuvo de Tocris Bioscience (Bristol, Reino Unido). Se administró en una solución compuesta de la nanoemulsión G- F68 (5%) y suero fisiológico (95%) cuya preparación se llevaba a cabo el mismo día experimental. Las dosis empleadas fueron: a) 1 , 5 y 10 mg/kg de OEA para los ensayos agudos de ingesta vía intraperitoneal. Volumen de administración 1 mL/kg
b) 1 , 10 y 50 mg/kg de OEA para los ensayos agudos de ingesta vía oral por intubación intragástrica (gavage, i.g.). Volumen de administración 3 mL/kg.
EJEMPLO 5. Estudio prolongado de ingesta y determinación del contenido graso hepático y bioquímica en plasma de nuevas nanoemulsiones: toxicidad y efectos metabólicos
Las nanoemulsiones G-F68 y G-F127 han sido evaluadas in vivo en ratas Wistar macho durante 3 semanas frente a otro vehículo habitualmente empleado para fármacos liposolubles: Tween 20 (10% en salino v/v). Utilizando suero fisiológico como grupo control de referencia, los animales tratados con las presentes nanoemulsiones mostraron un perfil toxicológico significativamente mejorado respecto a aquellos tratados con Tween 20 y similar a los tratados únicamente con suero. 1. Evolución peso
La administración de Tween 20 indujo una menor ganancia de peso en estos animales en comparación con aquellos que recibían salino. Esta menor ganancia resultó significativa a partir de la segunda semana (*P<0,05), incrementándose la tercera (**P<0,01 ). Sin embargo, la administración de ambas nanoemulsiones no produjo efectos sobre la ganancia de peso respecto al grupo tratado con salino (figura 3).
2. Bioquímica en plasma
Los animales fueron sacrificados tras el tratamiento con las diferentes soluciones por decapitación, previa anestesia (pentobarbital 200 mg/kg, i.p.). La sangre troncal recogida fue centrifugada (2000xg, 15 min, 25°C) y se extrajo el plasma en criotubos para preservar inmediatamente a -20°C. El análisis bioquímico del plasma mostró un incremento significativo de colesterol (**P<0,01 ), triglicéridos (*P<0,05), y transaminasas [GPT (**P<0,01 ) y GOT (**P<0,01 )] en aquellos animales tratados con Tween 20 respecto a los tratados con salino. Sin embargo, los animales tratados con las nuevas nanoemulsiones mostraron una significativa mejoría de estos parámetros frente al Tween 20: a) G-F68 mostró un incremento significativo del colesterol respecto al grupo salino (*P<0,05), pero indujo una caída muy acusada de triglicéridos (^ΡΟ,ΟΟΙ ) y transaminasas [GPT (#P<0,05) y GGt (#P<0,05)] respecto al Tween 20; b) G-F127 indujo una reducción de creatinina (#P<0,05), colesterol (##P<0,01 ) y GPT (#P<0,05). Ver Tabla 1 .
Tabla 1. Parámetros bioquímicos en plasma de ratas Wistar macho (N=8 por grupo) tras la administración diaria de salino, Tween 20 ó nanoemulsiones durante 3 semanas.
Figure imgf000026_0001
Los valores representan medias ± SEM (error estándar de la media). Los datos fueron analizados por ANOVA (1 vía) y post-tests Bonferroni. * P<0,05, **P<0,01 y ***P<0,001 vs. Grupo control salino; #P<0,05, **Ρ<0,01 y ###P<0,001 respecto al grupo Tween 20. Abreviaturas: HDL-C: Colesterol-lipoproteína de alta densidad; GPT: Glutamato-piruvato transaminasa; GOT: Glutamato-oxaloacetato transaminasa; GGt: Gamma glutamil transpetidasa. 3. Cuantificación de la grasa hepática
Para la cuantificación del contenido graso hepático, los lípidos totales se extrajeron de las muestras de hígados congeladas (procedentes de los animales sacrificados tras el tratamiento con las diferentes soluciones por decapitación, previa anestesia) utilizando una mezcla de cloroformo-metanol (2: 1 [v/v]). La cuantificación mostró un aumento significativo de la grasa total (*P<0,05) en aquellos animales tratados con Tween 20 respecto a los tratados con salino. Sin embargo los animales tratados con la nanoemulsion G-F68 mostraron una reducción del contenido lipídico hepático, alcanzando valores similares a los del grupo salino. Ver Tabla 2.
Tabla 2. Grasa total hepática de ratas Wistar macho (N=8 por grupo) tras la administración diaria de salino, Tween 20 ó nanoemulsion G-F68 durante 3 semanas.
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Los valores representan medias ± SEM (error estándar de la media). Los datos fueron analizados por ANOVA (1 vía) y post-tests Bonferroni. * P<0,05 vs. grupo control salino; #P<0,05 respecto al grupo Tween 20.
EJEMPLO 6. Efectos agudos sobre ingesta tras la administración sistémica y oral de OEA Se valoró la actividad biológica relativa a la inducción de saciedad y control de la ingesta de la N-aciletanolamina OEA usando la nanoemulsion G-F68 como sistema de transporte (vehículo). Los experimentos se llevaron a cabo en animales habituados al protocolo experimental. Para este fin, 48 horas antes de cada ensayo se retiraba el material de base (arena o serrín), y se situaban pequeños contenedores con comida dentro de las jaulas durante 4 horas. Pasada esta fase inicial, los animales fueron privados de comida durante 24 horas, siempre con acceso libre al agua. Una vez establecidos los grupos de tratamiento, a los 15 minutos de la administración aguda se colocaban los contenedores con una cantidad de comida conocida (normalmente 30-40 g) y una botella de agua fresca. Estos contenedores de comida se pesaron a diferentes tiempos durante las primeras 4 horas y a las 24 horas después de su tratamiento agudo. 1. Efectos de la nanoemulsión G-F68 sobre la conducta de ingesta
En primer lugar se demostró que una administración aguda de G-F68 tanto por vía intraperitoneal (1 mL/kg, i.p.) como por vía oral por gavage (3 mL/kg, i.g.), no afectaba la conducta de ingesta en ratas en ayunas, frente a aquellas que recibieron suero fisiológico (Figura 4). Transcurridas 24 horas de la inyección tampoco se observaron diferencias en la cantidad de comida ingerida por ambos grupos experimentales.
2. Efectos de la administración sistémica de OEA en la nanoemulsión G-F68
Una vez descartados efectos sobre ingesta de la nanoemulsión per se, la OEA fue administrada usando G-F68 (5% en salino) vía intraperitoneal en un volumen de 1 mL/kg, controlando la comida ingerida a diferentes tiempos durante 24 horas tras la administración del fármaco. De este modo, se pudo observar y reproducir la actividad anorexigénica descrita para este mediador lipídico de saciedad usando estas nanoemulsiones (Rodríguez de Fonseca y col. , 2001 ; Fu y col. , 2003).
Como ilustra la Figura 5, la administración sistémica de OEA indujo una reducción significativa del consumo de comida con dosis de 5 mg/kg (***P<0,001 a los 15 min; *P<0,05 a los 30 min) y 10 mg/kg (***P<0,001 a los 15 min; ***P<0,001 a los 30 min; ***P<0,001 a los 60 min) comparado con los tratados con la nanoemulsión únicamente. Transcurridas 24 horas de la administración aguda de las diferentes dosis de OEA, no se observó diferencias de ingesta acumulada respecto a los animales tratados con vehículo (G-F68).
3. Efectos de la administración oral de OEA en la nanoemulsión G-F68 Adicionalmente se llevó a cabo el tratamiento agudo de ratas en ayunas con OEA administrada vía oral (i.g.) en un volumen de 3 mL/kg. Estos animales fueron previamente habituados a la técnica de intubación intragástrica por sonda rígida utilizando suero fisiológico.
La administración aguda de diferentes dosis de OEA indujo un efecto inhibidor en el consumo de comida de modo dosis-dependiente respecto al grupo de ratas control (tratadas con vehículo G-F68).
La administración oral por gavage de OEA indujo una reducción significativa del consumo de comida con dosis de 1 mg/kg (**P<0,01 a los 240 min), 10 mg/kg (*P<0,05 a los 240 min) y 50 mg/kg (**P<0,01 a los 15 min; *P<0,05 a los 30 min; *P<0,05 a los 60 min; **P<0,01 a los 120 min; ***P<0,001 a los 240 min; **P<0,01 a las 24 h) comparado con los animales tratados con la nanoemulsión G-F68 únicamente (figura 6)
4. Comparación de los efectos de la administración oral de OEA administrada en el Tween 20 o en la nanoemulsión G-F68
Para este experimento, se llevó a cabo el tratamiento agudo vía oral (i.g.) de ratas en ayunas con OEA preparada en Tween 20 o en la nanoemulsión G-F68. La OEA se administró en un volumen de 3 mL/kg utilizando la dosis más efectiva de las ensayadas en el estudio previo (50 mg/kg).
Como la ilustra la Figura 7, la administración oral por gavage de OEA en Tween 20 indujo una reducción significativa del consumo de comida a los 30 y 60 min (*P<0,05). Sin embargo, la administración oral de OEA en la nanoemulsión G-F68 produjo una disminución significativa y prolongada del consumo de comida en todos los tiempos evaluados (**P<0,01 a los 15 min; *P<0,05 a los 30 y 60 min; **P<0,01 a los 120 min; *P<0,05 a los 240 min y a las 24 h). Cabe destacar que los presentes datos de administración oral de OEA con la nueva nanoemulsion G-F68 muestran un efecto inhibidor de ingesta con dosis efectivas inferiores a las descritas en la literatura, así como una mayor duración de este efecto. Estos datos demostrarían la capacidad de estas nanoformulaciones para liberar OEA de forma controlada gracias a la composición de la nanoemulsion.
Por tanto, la administración con estas nuevas nanoemulsiones de NAEs y fármacos liposolubles relacionados con estas moléculas, representa un sistema de transporte, liberación y actividad eficaz y seguro. Esto tiene aplicación directa en los campos de la biomedicina y de la farmacia, ya que se podrían administrar de manera apropiada estas aciletanolamidas para fines terapéuticos. Por ejemplo, se puede utilizar el efecto saciante de OEA ya demostrado para esta formulación con el fin de reducir la ingesta calórica, y por tanto, disminuir los graves efectos sobre la salud derivados de ésta: obesidad, diabetes, enfermedades cardiovasculares, etc.

Claims

REIVINDICACIONES
1 . Una nanoemulsion del tipo aceite en agua (o/w) adecuada para la administración de N- aciletanolaminas, que comprende: a. Una fase acuosa; b. Una fase oleosa que comprende un aceite constituida por gotas de diámetro inferior a 500 nanómetros; c. Un copolímero en bloques anfifílico; y d. Un compuesto de formula (I):
Formula (I):
Figure imgf000031_0001
donde el grupo R es un alquilo lineal (C1 1 -C21 ) o un alquenilo lineal (C1 1 -C21 ) con 1 -6 dobles enlacesy donde el ratio (p/p) copolímero/fase oleosa se encuentra entre 0,02 y 0, 16.
2. La nanoemulsion según la reivindicación 1 , donde el ratio (p/p) copolímero/fase oleosa se encuentra entre 0,032 y 0,08.
3. La nanoemulsion según la reivindicación 1 , donde el ratio (p/p) copolímero/fase oleosa es 0,04.
4. La nanoemulsion según la reivindicación 1 , donde la concentración del copolímero se encuentra a una concentración de un 1 % en peso del volumen total de la nanoemulsion (p/v).
5. La nanoemulsion según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el copolímero en bloques anfifílico es un poloxámero.
6. La nanoemulsion según la reivindicación 5, en donde el poloxámero se selecciona de la lista que consiste en plurónico F68 y plurónico F127.
7. La nanoemulsion según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el aceite de la fase oleosa se selecciona de la lista que consiste en aceite de girasol, cacahuete, algodón, oliva, ricino, soja, cártamo, palma, α tocoferol (vitamina E), miristato de isopropilo, escualeno o cualquier combinación de los mismos.
8. La nanoemulsion de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, donde la fase oleosa consiste en aceite de girasol.
9. La nanoemulsion según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el compuesto de formula (I) es N-oleiletanolamina.
10. Procedimiento para la obtención de la nanoemulsion tal y como se define en la reivindicación 1 , que comprende: i) disolver el/los copolímeros en agua bajo agitación suave; ii) añadir el aceite gota a gota a la fase acuosa producida en la etapa i), bajo agitación mecánica, produciendo una pre-emulsión; iii) reducir el tamaño de las gotas de la emulsión haciendo pasar en repetidas ocasiones la pre- emulsión de la etapa ii) por un homogeneizador de alta presión, formándose así la nanoemulsión; iv) añadir bajo agitación suave a la nanoemulsión de la etapa iii) un compuesto de la fórmula (I).
1 1 . La nanoemulsión según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 para su uso en terapia.
12. Uso de la nanoemulsión según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, para la elaboración de un medicamento para su uso en el tratamiento o prevención de la obesidad.
13. Uso de la nanoemulsión según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, para la elaboración de un medicamento para su uso en el tratamiento o prevención de la dislipemia.
Uso de la nanoemulsión según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, para la elaboración de un medicamento para su uso en el tratamiento o prevención de la dislipemia, donde dicha dislipemia se selecciona de la lista que consiste en hipercolesterolemia, hipertrigliceridemia, hiperlipoproteinemia de tipo I, lia, llb, III, IV ó V, hiperquilimicronemia o hiperlipidemia combinada.
Composición farmacéutica que comprende la nanoemulsión de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 y opcionalmente uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables.
16. Nanoemulsion según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, para su uso en el tratamiento o prevención de la obesidad por vía de administración oral.
17. Nanoemulsion según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, para su uso en el tratamiento o prevención de la dislipemia por vía de administración oral.
18. Nanoemulsion según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, para su uso en el tratamiento o prevención de la dislipemia, donde dicha dislipemia se selecciona de la lista que consiste en hipercolesterolemia, hipertrigliceridemia, hiperlipoproteinemia de tipo I, lia, llb, III, IV ó V, hiperquilimicronemia o hiperlipidemia combinada y dónde la nanoemulsion se administra oralmente.
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