WO2014141528A1

WO2014141528A1 - 心臓又は血管組織型スフェロイド

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Publication number: WO2014141528A1
Application number: PCT/JP2013/079478
Authority: WO
Inventors: 野口亮; 田村忠士; 中山功一; 森田茂樹; 野出孝一
Original assignee: Saga University NUC; Cyfuse Biomedical KK
Current assignee: Saga University NUC; Cyfuse Biomedical KK
Priority date: 2013-03-15
Filing date: 2013-10-24
Publication date: 2014-09-18
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Abstract

本発明は、心筋細胞又は平滑筋細胞と、血管内皮細胞及び線維芽細胞から選ばれる少なくとも１種の細胞との混合物から形成された心臓組織型スフェロイド又は血管組織型スフェロイド、並びに前記スフェロイドを配合又は積層することを特徴とする心臓組織型立体構造体又は血管組織型立体構造体の製造方法を提供する。

Description

心臓又は血管組織型スフェロイド

　本発明は、心臓及び血管組織型スフェロイド並びにその製造方法に関する。

　２０１２年のノーベル医学・生理学賞を受賞した、京都大学山中教授のｉＰＳ細胞（ｒｅｐｒｏｇｒａｍｉｎｇ）技術を筆頭に、近年の組織幹細胞等の発見、臨床応用への開発・研究は目覚ましいものがある。幹細胞由来細胞の臨床応用を目指した、分化効率や安全性、純化の研究などが世界中でなされる一方で、細胞から組織等を構築し移植する技術の開発も急務であると考えられる。

　これらの技術により得られた細胞の臨床への利用方法として、細胞を直接臓器へ注入したり、静脈又は動脈注射による手法によりなされてきたが、生着効率の悪さなどが問題視されている（非特許文献１）。一方１９９３年頃からＶａｃａｎｔｉらにより組織工学（Ｔｉｓｓｕｅ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：ＴＥ）という概念が提唱され、コラーゲンやポリ乳酸などの生体溶解性の足場を利用し組織を構築する技術が提唱されている（非特許文献２）。この手法は、足場として外来異物を用いるため、生体溶解性素材に対するアレルギー、感染症など問題の解決という課題が残されている。そこで、足場を用いずに細胞のみで組織を作製する技術が提案されている。

　細胞のみで機能的な組織を作製する技術として、近年、温度感応性シートという手法を用いて細胞のみで構築されるシートを形成し、心筋、角膜、食道などを対象とした再生医療に臨床応用されている（非特許文献３）。しかしながら、形態学的特徴や力学的作用を有するように、組織（例えば心筋、血管、軟骨、弁など）を細胞のみで構築する技術は見当たらず、再生医療は未だ開発途上であるといえる。

　他方、より生体に近い組織形成手段の一つとして、元来接着系細胞が自然に有する性質である凝集反応により形成される３次元的細胞形成現象が知られている。この現象は接着系細胞を培養する際にディッシュ等に接着阻害物質をコートしておくと、細胞同士が凝集し球状の細胞凝集体（スフェロイドという）を形成する現象である。従来報告されているスフェロイドの特徴として、培養皿やフラスコにより従来行われている２次元培養と比較し、以下の通り３次元的組織構築に有利な点がある。

　１．３次元的に培養できるため、細胞外マトリックスがより生体に近い環境で産生できる
　２．播種する細胞数を調節することでスフェロイドの大きさを調節できる。
　３．マイクロピペットなどでハンドリング出来る
　４．スフェロイド同士を融合させる事が出来る。
　スフェロイドは、がん研究や創薬研究、組織工学などで主に単一の細胞についての解析を行うツールとして使用されてきた（非特許文献４）。
　理想的な臨床応用が可能な臓器再生のためには、細胞のみで高機能を有する（生体と同じように機能する）組織を作製する必要がある。

Ｆｅｎｇ　Ｗａｎｇ，Ｊｉａｎｊｕｎ　Ｇｕａｎ，Ｃｅｌｌｕｌａｒ　ｃａｒｄｉｏｍｙｏｐｌａｓｔｙ　ａｎｄ　ｃａｒｄｉａｃ　ｔｉｓｓｕｅ　ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　ｆｏｒ　ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ　ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｄｖａｎｃｅｄ　Ｄｒｕｇ　Ｄｅｌｉｖｅｒｙ　Ｒｅｖｉｅｗｓ　６２（２０１０）７８４−７９７Ｊｏｓｅｐｈ　Ｐ，Ｒｏｂｅｒｔ　Ｌａｎｇｅｒ，Ｔｉｓｓｕｅ　ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：ｔｈｅ　ｄｅｓｉｇｎ　ａｎｄ　ｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｌｉｖｉｎｇ　ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ　ｄｅｖｉｃｅｓ　ｆｏｒ　ｓｕｒｇｉｃａｌ　ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｍｅｄｉｃｉｎｅ　３５４，３２−３４，１９９９Ｊｕｎ　Ｆｕｊｉｔａ，Ｙｕｊｉ　Ｉｔａｂａｓｈｉ，Ｔｏｍｏｈｉｓａ　Ｓｅｋｉ，Ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ　ｃｅｌｌ　ｓｈｅｅｔ　ｔｈｅｒａｐｙ　ａｎｄ　ｃａｒｄｉａｃ　ｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ａｍ　Ｊ　Ｐｈｙｓｉｏｌ　Ｈｅａｒｔ　Ｃｉｒｃ　Ｐｈｙｓｉｏｌ　３０３：Ｈ１１６９−Ｈ１１８２，２０１２．Ｖｌａｄｉｍｉｒ　Ｍｉｒｏｎｏｖ，Ｒｉｃｈａｒｄ　Ｐ．Ｖｉｓｃｏｎｔｉ，Ｖｌａｄｉｍｉｒ　Ｋａｓｙａｎｏｖ，Ｏｒｇａｎ　ｐｒｉｎｔｉｎｇ：Ｔｉｓｓｕｅ　ｓｐｈｅｒｏｉｄｓ　ａｓ　ｂｕｉｌｄｉｎｇ　ｂｌｏｃｋｓ，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ　３０（２００９）２１６４−２１７４

　本発明は、心臓組織、血管などを細胞のみで構築するための方法を提供することを目的とする。

　本発明者は、上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、心筋細胞、内皮細胞及び線維芽細胞の混合物を用いることにより、また、平滑筋細胞、内皮細胞及び線維芽細胞の混合物を用いることにより、それぞれ生体内での機能に近似した心臓組織及び血管組織型スフェロイドを作製することに成功し、本発明を完成するに至った。

　すなわち、本発明は以下の通りである。
（１）心筋細胞と、血管内皮細胞及び線維芽細胞から選ばれる少なくとも１種の細胞との混合物から形成された心臓組織型スフェロイド。
（２）心筋細胞と血管内皮細胞と線維芽細胞との混合物から形成された、（１）に記載の心臓組織型スフェロイド。
（３）心筋細胞と血管内皮細胞と線維芽細胞との混合比が、心筋細胞１００に対して血管内皮細胞が１０~６０であり、線維芽細胞が１０~６０である（２）に記載の心臓組織型スフェロイド。
（４）心筋細胞から形成されたスフェロイドと、血管内皮細胞及び線維芽細胞から選ばれる少なくとも１種の細胞から形成されたスフェロイドとを融合してなる、心臓組織型スフェロイド。
（５）心筋細胞から形成されたスフェロイドと、血管内皮細胞から形成されたスフェロイドと、線維芽細胞から形成されたスフェロイドとを融合してなる、（４）に記載の心臓組織型スフェロイド。
（６）心筋細胞由来のスフェロイドと、血管内皮細胞由来のスフェロイドと、線維芽細胞由来のスフェロイドとの存在比が、心筋細胞由来のスフェロイド１００に対して血管内皮細胞由来のスフェロイドが１０~６０であり、線維芽細胞由来のスフェロイドが１０~６０である（５）に記載の心臓組織型スフェロイド。
（７）前記（１）~（６）のいずれか１項に記載の心臓組織型スフェロイドを配合又は積層することを特徴とする心臓組織型立体構造体の製造方法。
（８）スフェロイドの積層は、基板と、該基板に略垂直に配置させた糸状体又は針状体とを備える支持体を用いて行なうものである（７）に記載の方法。
（９）前記（１）~（６）のいずれか１項に記載の心臓組織型スフェロイド、又は前記（７）若しくは（８）に記載の方法により製造された立体構造体からなる人工心臓組織。
（１０）平滑筋細胞と、血管内皮細胞及び線維芽細胞から選ばれる少なくとも１種の細胞との混合物から形成された血管組織型スフェロイド。
（１１）平滑筋細胞と血管内皮細胞と線維芽細胞との混合物から形成された、（１０）に記載の血管組織型スフェロイド。
（１２）平滑筋細胞と血管内皮細胞と線維芽細胞との混合比が、平滑筋細胞１００に対して血管内皮細胞が１０~６０であり、線維芽細胞が１０~３００である（１１）に記載の血管組織型スフェロイド。
（１３）平滑筋細胞から形成されたスフェロイドと、血管内皮細胞及び線維芽細胞から選ばれる少なくとも１種の細胞から形成されたスフェロイドとを融合してなる、血管組織型スフェロイド。
（１４）平滑筋細胞から形成されたスフェロイドと、血管内皮細胞から形成されたスフェロイドと、線維芽細胞から形成されたスフェロイドとを融合してなる、（１３）に記載の心臓組織型スフェロイド。
（１５）平滑筋細胞由来のスフェロイドと、血管内皮細胞由来のスフェロイドと、線維芽細胞由来のスフェロイドとの存在比が、平滑筋細胞由来のスフェロイド１００に対して血管内皮細胞由来のスフェロイドが１０~６０であり、線維芽細胞由来のスフェロイドが１０~３００である（１４）に記載の血管組織型スフェロイド。
（１６）前記（１０）~（１５）のいずれか１項に記載の血管組織型スフェロイドを配合又は積層することを特徴とする血管組織型立体構造体の製造方法。
（１７）スフェロイドの積層は、基板と、該基板に略垂直に配置させた糸状体又は針状体とを備える支持体を用いて行なうものである（１６）に記載の方法。
（１８）前記（１０）~（１５）のいずれか１項に記載の血管組織型スフェロイド、又は前記（１６）若しくは（１７）に記載の方法により製造された立体構造体からなる人工血管組織。

　本発明により、心臓及び血管組織型スフェロイド並びにその製造方法が提供される。また、前記スフェロイドを配合又は積層することにより心臓組織型又は血管組織型立体構造体を製造することができる。本発明の方法により製造された組織は、生体内における機能に類似しており、人工心臓組織又は人工血管組織として使用することができる。従って、本発明は、再生医療に利用できる点で極めて有用である。

心筋細胞単独スフェロイドの大きさ（単位μｍ）を示す図である。血管平滑筋、血管内皮及び繊維芽細胞から作製した各スフェロイドの直径（μｍ）と細胞数（ｃｅｌｌｓ／ｓｐｈｅｒｏｉｄ）との関係（形成１日目）を示す図である。心筋スフェロイドの拍動効率と培養液との関係を検討した結果を示す図である。心筋スフェロイドの拍動効率と培養液との関係を検討した結果を示す図である。各細胞の混合比率におけるスフェロイドの形成を示す図である。３次元的血管網を有するスフェロイドを示す図である。３次元的血管網を有するスフェロイドを示す図である。心臓組織型スフェロイドの拍動を解析した結果を示す図である。血管網を形成し拍動する血管スフェロイドを示す図である。３種類の細胞をそれぞれ単独で用いて形成させたスフェロイドを融合したときの図である。血管パッチ組織を作製した図である。血管パッチ組織の心臓への移植試験を示す図である。血管組織を作製した図である。

　以下、本発明を詳細に説明する。
　本発明は、心筋細胞と、血管内皮細胞及び線維芽細胞から選ばれる少なくとも１種の細胞との混合物から形成された心臓組織型スフェロイドに関する。また、本発明は、平滑筋細胞と、血管内皮細胞及び線維芽細胞から選ばれる少なくとも１種の細胞との混合物から形成された血管組織型スフェロイドに関する。

　さらに、本発明は、心筋細胞と、血管内皮細胞及び線維芽細胞から選ばれる少なくとも１種の細胞との混合物からスフェロイドを形成させ、このスフェロイドを配合又は積層することを特徴とする心臓組織型立体構造体の製造方法である。また、本発明は、平滑筋細胞と、血管内皮細胞及び線維芽細胞から選ばれる少なくとも１種の細胞との混合物からスフェロイドを形成させ、このスフェロイドを配合又は積層することを特徴とする血管組織型立体構造体の製造方法である。

　本発明の方法により製造された心臓組織型スフェロイド又は立体構造体、あるいは血管組織型スフェロイド又は立体構造体は、それぞれ人工心臓組織、人工血管組織として利用することができる。
　本発明者は、前記スフェロイド形成に着目し、より生体に近い機能を持たせるため目的とする臓器特有の細胞を組み合わせることにより、より立体的かつ高機能な組織を形成する技術を開発した。

　本発明において、主体となる細胞は心筋細胞又は平滑筋細胞である。この主体となる細胞を、本明細書では「主体細胞」という。主体細胞として心筋細胞を用いて形成されたスフェロイド又は立体構造体を、本発明ではそれぞれ「心臓組織型スフェロイド」、「心臓組織型立体構造体」という。また、主体細胞として平滑筋細胞を用いて形成されたスフェロイド又は立体構造体を、本発明ではそれぞれ「血管組織型スフェロイド」、「血管組織型立体構造体」という。

　本発明においては、上記主体細胞（心筋細胞又は平滑筋細胞）と、血管内皮細胞若しくは線維芽細胞又はその両細胞とを混合して心臓組織型又は血管組織型スフェロイドを作製する。このスフェロイドを任意の方法で配合又は積層することにより、スフェロイド同士が立体的に融合して、心臓組織型立体構造体又は血管組織型立体構造体を得ることができる。

１．心臓組織型又は血管組織型スフェロイドの形成（１）
　本発明は、上記主体細胞と、血管内皮細胞及び／又は線維芽細胞とを混合して細胞の混合物を作製し、この混合物を用いてスフェロイドを形成させるというものである。従って、１個のスフェロイドの中には、その構成細胞として、主体細胞、並びに血管内皮細胞及び／又は線維芽細胞が含まれる。

　スフェロイドを作製する細胞の混合比は以下の通りである。
　心臓組織型スフェロイドを心筋細胞と血管内皮細胞との２種類の細胞を用いて作製する場合は、心筋細胞１００に対し、血管内皮細胞は１０~６０であり、好ましくは１０~３０である。
　心臓組織型スフェロイドを心筋細胞と線維芽細胞との２種類の細胞を用いて作製する場合は、心筋細胞１００に対し、線維芽細胞は１０~６０であり、好ましくは１０~３０である。
　心臓組織型スフェロイドを心筋細胞、血管内皮細胞及び線維芽細胞の３種類の細胞を用いて作製する場合は、心筋細胞１００に対し、血管内皮細胞は１０~６０、好ましくは１０~２０であり、かつ、線維芽細胞は１０~６０、好ましくは１０~２０である。

　本発明において使用される「線維芽細胞」は、コラーゲン、エラスチン、ヒアルロン酸などの真皮の成分を作り出す細胞であり、皮膚由来の線維芽細胞が使用される。
　また、本発明においては、血管内皮細胞及び上記線維芽細胞のほかに、他の血管内皮細胞、線維芽細胞又は間葉系幹細胞等を混合することもできる。これらの細胞としては、例えば間葉系幹細胞、脂肪細胞、血管平滑筋細胞、幹細胞由来血管内皮細胞、幹細胞由来線維芽細胞、幹細胞由来血管内皮細胞、幹細胞由来間葉系幹細胞などが挙げられる。この場合の混合比率は、心筋細胞１００に対して５~５０、好ましくは１０~５０とするか、あるいは、全体として、心筋細胞が全体の割合の４０％以上となるように混合すればよい。間葉系幹細胞を混合することにより、さらにスフェロイドの高機能化が期待できる。

　血管組織型スフェロイドを平滑筋細胞と血管内皮細胞との２種類の細胞を用いて作製する場合は、平滑筋細胞１００に対し、血管内皮細胞は１０~６０であり、好ましくは１０~３０である。
　血管組織型スフェロイドを平滑筋細胞と線維芽細胞との２種類の細胞を用いて作製する場合は、平滑筋細胞１００に対し、線維芽細胞は１０~３００であり、好ましくは１００~３００である。
　血管組織型スフェロイドを平滑筋細胞、血管内皮細胞及び線維芽細胞の３種類の細胞を用いて作製する場合は、平滑筋細胞１００に対し、血管内皮細胞は１０~６０、好ましくは１０~３０であり、かつ、線維芽細胞は１０~３００、好ましくは１００~３００である。

　また、本発明においては、前記と同様、血管内皮細胞及び線維芽細胞のほかに、間葉系幹細胞、幹細胞由来血管内皮細胞、幹細胞由来血管平滑筋細胞、幹細胞由来血管前駆細胞、幹細胞由来線維芽細胞などを混合することも可能である。その場合の混合比率は、血管平滑筋細胞１００に対して１０~３００、好ましくは１００~３００とするか、あるいは、全体として、血管平滑筋細胞が血管構造体全体の割合の１０~９０％となるように混合すればよい。間葉系幹細胞を混合することにより、さらにスフェロイドの高機能化が期待できる。

　このようにして得られた細胞混合物を、撥水処理又は細胞非接着処理を施したプレート、例えばテフロン（登録商標）加工されたプレート上で細胞を培養すると、細胞は足場を求めて、お互いに接着し合い、細胞凝集塊であるスフェロイドが形成される。スフェロイドが形成されるまでの培養時間は、６~４８時間、好ましくは１２~４８時間である。

　その他のスフェロイド形成方法としてＩＷＡＫＩ社製容器（ＥＺｓｐｈｅｒｅ）（ｈｔｔｐ：／／ａｔｇ．ｕｓｈｏｐ．ｊｐ／ｒｉｋａ／ｈｂｉｎ／ｅｚ２０１２．ｈｔｍｌ）を使用することもでき、あるいは他社製の低接着性の１０ｃｍ又は６ｃｍディッシュを使用することもできる。
　スフェロイドを形成させるための培養液は、動物細胞培養用に通常使用される標準培養液、例えばダルベッコ　ＭＥＭ培地（ＤＭＥＭ／Ｈｉｇｈ　ｇｌｕｃｏｓｅ）、ダルベッコ　ＭＥＭ／ハムＦ１２培地、ＲＰＭＩ−１６４０培地などを使用し、これに血清を添加することができる。血管内皮細胞と混合してスフェロイドを形成するときは、ＥＣＭ（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　ｃｅｌｌ　ｍｅｄｉｕｍ：Ｓｃｉｅｎｃｅｌｌ）を使用するか、培地に血管内皮細胞増殖因子を添加することが好ましい。

２．心臓組織型又は血管組織型スフェロイドの形成（２）
　本発明においては、上記のように１つのスフェロイド中に複数種類の細胞が混合されたものを使用することもできるが、１つのスフェロイドには単一種類の細胞のみが存在するようにして、これを複数種類の細胞の分だけ別のスフェロイドを形成することもできる。
　例えば、心臓組織型スフェロイドを作製する場合は、心筋細胞由来のスフェロイドのほかに、血管内皮細胞由来のスフェロイド及び／又は線維芽細胞由来のスフェロイドを作製して、これらのスフェロイドを融合させればよい。また、血管組織型スフェロイドを作製する場合は、平滑筋細胞由来のスフェロイドのほかに、血管内皮細胞由来のスフェロイド及び／又は線維芽細胞由来のスフェロイドを作製して、これを融合させればよい。
　スフェロイドの形成方法（容器や培養条件など）は前記と同様である。

３．心臓組織型又は血管組織型立体構造体の構築
　本発明においては、前記のように形成させたスフェロイドを配合又は積層することにより、心臓組織型又は血管組織型立体構造体を作製することができる。
　スフェロイドを立体的に配合又は積層する方法は、特に限定されるものではない。例えば、チューブなどにスフェロイドを入れて培養すると、スフェロイド同士が融合してさらに大きなスフェロイドの塊となる。

　また、例えばＷＯ２００８／１２３６１４号公報に記載の方法を採用して立体構造体を作製することもできる。ＷＯ２００８／１２３６１４号公報には、基板と、細胞塊（スフェロイド）を貫通させるための糸状体又は針状体（以下、単に「針状体」という）とを備える支持体が記載されており、この支持体を用いると、スフェロイドを任意の空間に配置することができる。上記支持体において、針状体は、基板に略垂直に備えられており、スフェロイドを串刺し状にして積層することができる。各針状体（基板上の各座標の針状体）に突き刺すスフェロイドの個数を制御することで、スフェロイドを任意の３次元空間に配置させる。スフェロイド同士が融合／結合して構造体が形成された後に、支持体を抜去することによって、スフェロイドのみからなり、しかも、全体として任意形状の立体的細胞構築物を得ることができる。スフェロイドは、近接した状態で放置すると融合することが知られているが、上記支持体を用いることによって、スフェロイドの融合により形成される構築物の形状を制御し、任意の３次元空間にスフェロイドを所望のとおりに配置することができる。

　任意の３次元空間にスフェロイドを配置させた後は、所定時間培養することにより、目的の組織を得ることができる。
　単一種類の細胞により形成させたスフェロイドを複数種類配合又は積層する場合において、それぞれの単一種類の細胞由来のスフェロイドの存在比は、複数種類の細胞の混合によりスフェロイドを形成させるときの細胞の混合比率に準じることができる。あるいは、主となる単独スフェロイド（心筋細胞もしくは血管平滑筋細胞）の比率を１００とすると従となる単独スフェロイドの比率は合計で１０−１００という比率にしてもよい。

　このようにして構築された心臓組織型立体構造体は、各細胞が同期して拍動するようになる。この拍動する構造体は、生体における心臓がもつｇａｐ結合を心筋細胞間に発現しており、生体における心電図と類似した細胞外電位を発現することから、また、得られた立体構造体においてはカルシウムイオンチャンネルによる活性が順次細胞間で伝達されることから、実際の心臓の機能を再現したと言える。

　他方、構築された血管組織は、生体に類似した弾性特性を有する管状構造が形成されている。この形態は、種々の機械的なストレス（伸展や圧迫）に耐えうることから、実際の血管の機能を再現したと言える。
　従って、本発明の心臓組織型スフェロイド又は立体構造体は、人工心臓組織として利用することができ、本発明の血管組織型スフェロイド又は立体構造体は、人工血管組織として利用することができる。
　以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。

　（１）細胞の調製
（１−１）初代心筋細胞（ラット胎児心室心筋細胞）（ＣＭ）の調製（ｐｒｅｐｌａｔｉｎｇ法）
　生後１−３日目ＳＤ（ｋｕｄ：ｓｄ）ラット新生児を断頭後に開胸、心臓を摘出した。
　４℃に冷却したＨＢＳＳ＋／＋（Ｈａｎｋ’ｓ　Ｂａｌａｎｃｅｄ　Ｓａｌｔ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ、Ｍｇ，Ｃａ含有：ｓｉｇｍａ　ａｌｄｒｉｃｈ）で３度洗浄し、その後、ＨＢＳＳ−／−（Ｍｇ，Ｃａ不含）にて３回洗浄した。
　心房や大血管を除去して心室のみにした後、心室をハサミで細かく切断し１ｍｍ以下の大きさの断片にした。この細かく切断した心室断片を０．１％トリプシン液（和光純薬）ｉｎ　ＨＢＳＳ−／−に入れて４℃で６時間静置した。
　続いて１０％ＦＢＳ（ｓｉｇｍａ）及びＰ／Ｓ液含有ＤＭＥＭ（Ｌｏｗ　Ｇｌｕｃｏｓｅ）（和光純薬）を加え、トリプシンの反応を停止させた。
　容器から液体を極力除去した後に、容器にＴｙｐｅ２コラゲナーゼ（ｓｉｇｍａ）含有ＨＢＳＳ−／−（Ｍｇ，Ｃａ不含）（最終濃度　０．８ｍｇ／ｍｌ）を加え、３７度の恒温槽で５分反応させた後に上澄みを破棄した。
　容器に再度コラゲナーゼを加え、３７度で１５−２０分反応させた。セルストレイナーを通して上澄みを回収し、５分１０００回転で遠沈させた。得られたペレットを１０％ＤＭＥＭで再懸濁して１０ｍｍのＴｙｐｅＩコラーゲンコートディッシュ（ＩＷＡＫＩ）に播種した。６０分後に上澄みのみをディッシュから回収した。
　その結果、８５．６％~９４．７％の生存率で、９０％前後に純化した心筋細胞を得た。

　（１−２）血管内皮細胞（ＥＣ）の調製
　血管内皮細胞として、Ｈｕｍａｎ　Ｃａｒｄｉａｃ　Ｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒ　Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　Ｃｅｌｌｓ（ＨＣＭＥＣ）を、コスモバイオ株式会社より購入した（販売元はＳｃｉｅｎｃｅｌｌ）。
（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｒｉｍａｒｙｃｅｌｌ．ｃｏｍ／ｐｄｆ／６０００．ｐｄｆ）
　この細胞を専用のＥＣＭ（Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　Ｃｅｌｌ　Ｍｅｄｉｕｍ）で培養した（継代数５−９代目（Ｐ５−９）の血管内皮細胞を使用）。
　目的の細胞数を得るまで１０ｃｍディッシュ（Ｔｙｐｅ　Ｉ　Ｃｏｌｌａｇｅｎ　Ｃｏａｔｅｄ　Ｄｉｓｈ：ＩＷＡＫＩ）で培養した。継代は０．０５％トリプシンを使用した。

　（１−３）血管平滑筋細胞（ＳＭＣ）の調製
　血管平滑筋細胞として、Ｈｕｍａｎ　Ａｏｒｔｉｃ　Ｓｍｏｏｔｈ　Ｍｕｓｃｌｅ　Ｃｅｌｌｓ（ＨＡＳＭＣ）をコスモバイオ株式会社より購入した（販売元はＳｃｉｅｎｃｅｌｌ）。
（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｒｉｍａｒｙｃｅｌｌ．ｃｏｍ／ｐｄｆ／６１１０．ｐｄｆ）
　この細胞を１０％ＦＢＳ（ｓｉｇｍａ）及びＰ／Ｓ液含有ＤＭＥＭ（Ｌｏｗ　Ｇｌｕｃｏｓｅ）（和光純薬）で培養した（Ｐ５−１０の細胞を使用。）。継代は０．０５％トリプシンを使用した。
　培養容器は１０ｃｍディッシュ、１５ｃｍディッシュ（ＮＵＮＣ、Ｃｏｒｎｉｎｇ社製等）、又は５層のＢＤ　Ｆａｌｃｏｎセルカルチャー　マルチフラスコで培養した。
（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｄｊ．ｃｏ．ｊｐ／ｆａｌｃｏｎ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｆａｌｃｏｎ−ｍｕｌｔｉ−ｆｌａｓｋ．ｈｔｍｌ）

　（１−４）繊維芽細胞（ＦＢ）の調製
　線維芽細胞として、正常ヒト皮膚線維芽細胞（成人）（ＮＨＤＦ−Ａｄ）をタカラバイオより購入した（販売元ＣＭＷ（ＬＯＮＺＡ））。
（ｈｔｔｐ：／／ｃａｔａｌｏｇ．ｔａｋａｒａ−ｂｉｏ．ｃｏ．ｊｐ／ｐｒｏｄｕｃｔ／ｂａｓｉｃ＿ｉｎｆｏ．ａｓｐ？ｕｎｉｔｉｄ＝Ｕ１００００２７０５）
　この細胞を１０％ＦＢＳ（ｓｉｇｍａ）及びＰ／Ｓ液含有ＤＭＥＭ（Ｌｏｗ　Ｇｌｕｃｏｓｅ）（和光純薬）で培養し、Ｐ５−１０の細胞を使用した（継代は０．０５％トリプシンを使用）。培養容器は１０ｃｍディッシュ、１５ｃｍディッシュ（ＮＵＮＣ、Ｃｏｒｎｉｎｇ社製等）、又は５層のＢＤ　Ｆａｌｃｏｎセルカルチャー　マルチフラスコを用いた。
（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｄｊ．ｃｏ．ｊｐ／ｆａｌｃｏｎ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｆａｌｃｏｎ−ｍｕｌｔｉ−ｆｌａｓｋ．ｈｔｍｌ）

　（２）スフェロイド形成方法
　上記の細胞を必要量培養し、トリプシン処理して所定の培養液を用いて細胞懸濁液を作製した。この際、２種類又は３種類の細胞を一定の配分で混合して懸濁液を作製した。
　心筋細胞は前述の心筋純化法であるｐｒｅｐｌａｔｉｎｇ法（前記（１−１）項）で細胞を回収直後にプレートに播種してスフェロイドを形成させた。
　プレートは主に住友ベークライト社製９６ウェルプレート（ｐｒｉｍｅ　ｓｕｒｆａｃｅ）を使用し、このプレートに一定の細胞数で播種すると１２−４８時間でスフェロイドを形成した。
（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｕｍｉｂｅ．ｃｏ．ｊｐ／ｐｒｏｄｕｃｔ／ｓ−ｂｉｏ／ｃｅｌｌ−ｃｕｌｔｕｒｅ／ｐｒｉｍｅｓｕｒｆａｃｅ−９６ｕ／ｓｐｅｃ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）
　播種した細胞数と形成されたスフェロイドの大きさとの関係を図１、図２に示す。
　図１は、心筋細胞のみを凝集させてスフェロイドを形成したスフェロイドあたりの細胞数と直径を示した図である（縦軸の単位：μｍ）。
　図２は、血管平滑筋、血管内皮細胞及び繊維芽細胞を用いて作製されたスフェロイドの直径と、スフェロイドを構成する細胞数との関係を示す図である。例えば、ＳＭＣの「４００００　Ｓｐｈｅｒｏｉｄｓ」では、ＳＭＣを４００００個凝集させると、１２００（μｍ）の直径のスフェロイドができることを意味している。
　なお、心筋単独スフェロイドの形成方法として、スフェロイド形成時には１０％前後のＦＢＳ（牛胎児血清）を添加することが好ましい。
　スフェロイドを構築してから２４から４８時間経過すると、細胞が拍動するようになった。心筋スフェロイドの拍動効率と培養液との関係を検討した結果を図３及び図４に示す。

　（３）細胞の各種検査
（３−１）Ｃｅｌｌ蛍光トレーサー
　スフェロイド形成過程及び形成後の解析のため、細胞をＣｅｌｌ　Ｔｒａｃｋｅｒで染色した。
　心筋細胞はＣｅｌｌ　Ｔｒａｃｋｅｒ　Ｇｒｅｅｎ（タカラバイオ、（ｈｔｔｐ：／／ｃａｔａｌｏｇ．ｔａｋａｒａ−ｂｉｏ．ｃｏ．ｊｐ／ｐｒｏｄｕｃｔ／ｂａｓｉｃ＿ｉｎｆｏ．ａｓｐ？ｕｎｉｔｉｄ＝Ｕ１００００４６４２））を使用した。
　細胞をＤＭＥＭ（ＦＢＳなし）に使用説明書に記載の通りの濃度で溶解し、心筋純化法であるｐｒｅｐｌａｔｉｎｇ法で３７℃５％ＣＯ_２環境下に６０分培養する際に染色した。
　血管内皮細胞は、８０％コンフルエンスに達した状態で、ＰＢＳで洗浄後、ＤＭＥＭ（ＦＢＳなし）にＣｅｌｌ　Ｔｒａｃｋｅｒ　Ｒｅｄ（タカラバイオ）を溶解し、２時間３７℃５％ＣＯ_２環境下で培養し染色し使用した。
　繊維芽細胞はＣｅｌｌ　Ｔｒａｃｋｅｒ　Ｂｌｕｅ（Ｉｎｖｉｔｏｒｇｅｎ）を使用して同様に染色した。
（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ．ｊｐ／ｃａｔａｌｏｇｕｅ／ｍｏｌｅｃｕｌａｒ＿ｐｒｏｂｅｓ／ｃｅｌｌ＿ｂｉｏ＿ｎｅｗ／ｃｏｎｔｅｎｔ０８／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）

　（３−２）顕微鏡観察
　細胞又は立体構造体の蛍光及び位相差像は、ＢＺ９０００（ＫＥＹＥＮＣＥ）を使用して静止画、動画を撮影した。
　（３−３）動画解析
　ＶＷ−９０００（ＫＥＹＥＮＣＥ）を用いて、拍動する心筋スフェロイドおよび構造体の機能解析を行った。具体的にはスフェロイド内の４点（０時３時６時９時の点）の動きを解析し速度の平均を求めた。
　（３−４）組織学的評価
血管構造体を１０％ホルマリン固定し、ＨＥ染色、ＭＴ、ＥＶＧ染色を行った。心筋構造体はＨＥ染色を行なった。

　（４）結果
　（４−１）スフェロイドの形成
　心筋細胞、血管内皮細胞及び繊維芽細胞を図５に示す割合で混合し心臓組織型スフェロイドを形成した。形成後２時間、１２時間、２４時間、４８時間で形態を観察し球形のスフェロイドを形成する過程を観察した（図５）。スフェロイド形成時に、繊維芽細胞、血管内皮細胞を混合するとスフェロイド形成効率が向上した。
　心筋細胞単独で融合するよりも、ＦＢ及びＥＣを混合したときのスフェロイドを融合したほうが、形成効率が最もよく、３次元的かつ機能的な血管網を形成することができた（図５）。

　図５において各パネルに示すスフェロイドの細胞組成は以下の通りである。
　（ｉ）最も左のパネル：心筋細胞１００％単一細胞スフェロイド
　（ｉｉ）左から２番目のパネル：心筋細胞　８０％　線維芽細胞１０％、血管内皮細胞１０％の３種混合スフェロイド
　（ｉｉｉ）左から３番目のパネル：心筋細胞　８０％　線維芽細胞０％、血管内皮細胞２０％の２種混合スフェロイド
　（ｉｖ）最も右側のパネル：心筋細胞　８０％　線維芽細胞２０％、血管内皮細胞０％の２種混合スフェロイド

　図５において縦方向の４つのパネルは、総細胞数が１２００個／スフェロイドとなるように細胞を播種してスフェロイド形成し、それぞれ、２時間、１２時間、２４時間、４８時間後に観察したものである。心筋細胞単独群に比べ、細胞の混合物から得たスフェロイドのほうが、明らかに凝集効率が高いことが示された。

（４−２）スフェロイドの蛍光色素染色による形態観察
　心筋細胞を緑色、線維芽細胞を青色、血管内皮細胞を赤色の蛍光色素で染色し、心筋：線維芽：内皮の比を２０００：８００：２００となるように混合させてスフェロイドを形成させ、４８時間後に形態を観察した。
　その結果、血管壁を想定した高機能血管スフェロイドを作成することが出来た（図６）。また、心筋細胞を、血管内皮細胞及び繊維芽細胞と共培養することで、スフェロイド形成効率が上昇することが示された。
　図６において、血管内皮細胞は３次元的に血管網を形成するとともに、管腔状に内皮細胞が配列した（図６左下パネル）。すなわち、心筋細胞、血管内皮細胞及び繊維芽細胞を適切な配合割合で混合すると、３次元的な血管網を持ったスフェロイドを作製できることが示された。

　血管内皮細胞の混合率は１０−５０％程度が望ましく、それ以上割合を増やしても、死細胞が増え、最終的に形成されるスフェロイドが小さくなる傾向があった（図７）。
　図７は、心筋細胞、血管内皮細胞及び線維芽細胞を所定配合で混合して蛍光色素染色し、形態、大きさ及び内皮細胞の状態を観察した結果を示す図である。各細胞の配合割合を図７の各パネルの左側に示した。
　血管内皮細胞が１０％程度の配合でも、血管網を構築することができた（図７、上から３段目のパネル）。その際、線維芽細胞の割合が血管内皮より多いほうが、より立体的かつ複雑な血管網を形成した（図７、上から４段目のパネル）。
　線維芽細胞は、１０％程度の比率でも混合すればスフェロイドの凝集効率が上昇し、その割合を増やすとスフェロイドの形成効率は良くなった（図７、最上段のパネル）。但し、非心筋細胞を４０％以上の割合に増やすと拍動効率が低下する。

（４−３）　スフェロイドの拍動解析
　心筋細胞比率を０から１００％まで６段階に分けて配合したスフェロイド、及び非心筋細胞配合では線維芽細胞と血管内皮細胞とを１：１で配合したスフェロイドの拍動を動画で１０秒間記録し、スフェロイドの０，３，６，９時方向の表面の点を動態解析した。
　結果を図８に示す。図８の縦軸は動点の速度の絶対値を平均したものである。この数字が高いほど、すなわち速度の平均が高いほど、たくさん拍動していたことを示す。
　図８において、「Ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓ　１００％」は、スフェロイドの構成細胞が心筋細胞のみであることを意味し、「Ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓ　８０％」は、心筋細胞８０％、血管内皮細胞１０％、繊維芽細胞１０％であることを意味する。同様に、「Ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓ　６０％」は、心筋細胞６０％、血管内皮細胞２０％、繊維芽細胞２０％、「Ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓ　４０％」は、心筋細胞４０％、血管内皮細胞３０％、繊維芽細胞３０％、「Ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓ　２０％」は、心筋細胞２０％、血管内皮細胞４０％、繊維芽細胞４０％、「Ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓ　０％」は、心筋細胞０％、血管内皮細胞５０％、繊維芽細胞５０％であることを意味する。
　図８より、好ましい細胞配合は心筋細胞が６０−９０％、血管内皮細胞が１０−５０％、線維芽細胞が１０−５０％の範囲であるといえる（図８）。
　心筋比率は高いほうが拍動効率がよく、心筋細胞１００％が最も高い。しかし、心筋細胞のみでは移植後の生着効率、生存率が低下し、生理的な血管網構築能が低下する点で機能が持続しないことから、線維芽細胞と血管内皮細胞とを混合することが好ましいといえる。

　本実施例は、スフェロイドを融合させて立体構造体を作製した例である。
　各細胞のスフェロイドの形成は実施例１と同様に行なった。
　心筋細胞を緑、血管内皮細胞を赤、繊維芽細胞を青の蛍光色素で染色し、心臓組織型スフェロイドを形成した。さらに４つのスフェロイドを融合させ、３時間後、１２時間後、２４時間後に観察した。
　その結果、３種類の細胞の配合により、血管網が形成されるとともに、拍動する心臓組織型スフェロイドを作製することができた（図９）。図９に示す通り、３種類の細胞が融合していることが分かる。また、細胞はある程度再編成して、新たな血管ネットワークも形成された。
　このスフェロイド同士を融合すると、スフェロイドが同期して拍動した。

　本実施例では、１種類の細胞を用いて複数種類のスフェロイドを形成させ、それぞれのスフェロイドを配合したときの心臓組織の形成試験を行った。
　各細胞のスフェロイドの形成は実施例１と同様に行なった。
　心筋細胞単独で形成させたスフェロイド（緑）、血管内皮細胞単独で形成させたスフェロイド（赤）、及び線維芽細胞単独で形成させたスフェロイド（青）の３種類を融合させ、２４時間後に観察した。
　結果を図１０に示す。図１０に示す通り、３種類のスフェロイドを融合することができた。

　本実施例は、ＷＯ２００８／１２３６１４号公報に記載の方法を採用して心臓血管組織を作製した例である。
（１）血管パッチの作製
　コンピューター処理により図１１の左図に示すパッチ形状をデザインした。
　１スフェロイド当たり約１０００個の細胞からなるスフェロイドを作製し、約１４０００個のスフェロイドを、図１１の左図に示すパッチ形状となるように配列融合させた。
　図１１において、中央パネルは、血管平滑筋細胞：繊維芽細胞：血管内皮細胞を３：２：１で混合形成させたスフェロイドを用いてパッチ形成したものである（融合２日目）。
　右パネルは、繊維芽細胞のみでスフェロイドを形成し、同様のパッチを形成したものである（融合２日目）。
　３種類の細胞（平滑筋細胞、血管内皮細胞、繊維芽細胞）を混合したスフェロイドを用いて作製したパッチと、繊維芽細胞単独で形成したスフェロイドを用いて作製したパッチ（立体構造体）とでは、明らかに前者のほうが肉眼的にも表面なめらかで血管壁としての素材に適していることが示された。

（２）心筋パッチの移植試験
　上記の通り作製した血管パッチを、虚血を起こさせたＦ３４４ヌードラットの心臓に移植した（図１２）。

（３）血管組織の作製
　上記と同様にして、図１３の左図に示す管形状をデザインしてスフェロイドを積層し、血管組織構造体を作製した。
　その結果、図１３に示す通り、弾力性のある欠陥構造体を製造することができた。
生体幹細胞又は間葉系幹細胞、脂肪由来細胞、脂肪由来幹細胞、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、あるいは分化細胞の初期化により獲られる誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）から得られる複数種の細胞を利用できる。

　本発明は以下の点で有用である。
（ｉ）複数種類の細胞を混合させることにより、より高機能な３次元細胞構造体（心臓、血管）を作製できる。
（ｉｉ）複数種類の細胞で構成されるスフェロイドを融合させることにより、心臓や血管の機能及び特徴を持たせることができる。
（ｉｉｉ）スフェロイドを形成させた後に、別の機能を有する細胞懸濁液やスフェロイドを融合させ、より高機能化できる。
（ｉｖ）スフェロイド又はスフェロイドから構築された組織は、心臓、皮下、血管、筋肉、大網内などに移植し生着させ、治療効果を得ることができる。
（ｉｖ）本発明の方法により作製された立体構造体は、創薬試験や各種生物学的研究に応用できる。
（ｖ）本発明の方法は、今後臨床応用が期待されるｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞又は組織幹細胞由来の分化した細胞を用いることができる。

Claims

　心筋細胞と、血管内皮細胞及び線維芽細胞から選ばれる少なくとも１種の細胞との混合物から形成された心臓組織型スフェロイド。
　心筋細胞と血管内皮細胞と線維芽細胞との混合物から形成された、請求項１に記載の心臓組織型スフェロイド。
　心筋細胞と血管内皮細胞と線維芽細胞との混合比が、心筋細胞１００に対して血管内皮細胞が１０~６０であり、線維芽細胞が１０~６０である請求項２に記載の心臓組織型スフェロイド。
　心筋細胞から形成されたスフェロイドと、血管内皮細胞及び線維芽細胞から選ばれる少なくとも１種の細胞から形成されたスフェロイドとを融合してなる、心臓組織型スフェロイド。
　心筋細胞から形成されたスフェロイドと、血管内皮細胞から形成されたスフェロイドと、線維芽細胞から形成されたスフェロイドとを融合してなる、請求項４に記載の心臓組織型スフェロイド。
　心筋細胞由来のスフェロイドと、血管内皮細胞由来のスフェロイドと、線維芽細胞由来のスフェロイドとの存在比が、心筋細胞由来のスフェロイド１００に対して血管内皮細胞由来のスフェロイドが１０~６０であり、線維芽細胞由来のスフェロイドが１０~６０である請求項５に記載の心臓組織型スフェロイド。
　請求項１~６のいずれか１項に記載の心臓組織型スフェロイドを配合又は積層することを特徴とする心臓組織型立体構造体の製造方法。
　スフェロイドの積層は、基板と、該基板に略垂直に配置させた糸状体又は針状体とを備える支持体を用いて行なうものである請求項７に記載の方法。
　請求項１~６のいずれか１項に記載の心臓組織型スフェロイド、又は請求項７若しくは８に記載の方法により製造された立体構造体からなる人工心臓組織。
　平滑筋細胞と、血管内皮細胞及び線維芽細胞から選ばれる少なくとも１種の細胞との混合物から形成された血管組織型スフェロイド。
　平滑筋細胞と血管内皮細胞と線維芽細胞との混合物から形成された、請求項１０に記載の血管組織型スフェロイド。
　平滑筋細胞と血管内皮細胞と線維芽細胞との混合比が、平滑筋細胞１００に対して血管内皮細胞が１０~６０であり、線維芽細胞が１０~３００である請求項１１に記載の血管組織型スフェロイド。
　平滑筋細胞から形成されたスフェロイドと、血管内皮細胞及び線維芽細胞から選ばれる少なくとも１種の細胞から形成されたスフェロイドとを融合してなる、血管組織型スフェロイド。
　平滑筋細胞から形成されたスフェロイドと、血管内皮細胞から形成されたスフェロイドと、線維芽細胞から形成されたスフェロイドとを融合してなる、請求項１３に記載の心臓組織型スフェロイド。
　平滑筋細胞由来のスフェロイドと、血管内皮細胞由来のスフェロイドと、線維芽細胞由来のスフェロイドとの存在比が、平滑筋細胞由来のスフェロイド１００に対して血管内皮細胞由来のスフェロイドが１０~６０であり、線維芽細胞由来のスフェロイドが１０~３００である請求項１４に記載の血管組織型スフェロイド。
　請求項１０~１５のいずれか１項に記載の血管組織型スフェロイドを配合又は積層することを特徴とする血管組織型立体構造体の製造方法。
　スフェロイドの積層は、基板と、該基板に略垂直に配置させた糸状体又は針状体とを備える支持体を用いて行なうものである請求項１６に記載の方法。
　請求項１０~１５のいずれか１項に記載の血管組織型スフェロイド、又は請求項１６若しくは１７に記載の方法により製造された立体構造体からなる人工血管組織。