WO2014157185A1 - 改変型カルボニル還元酵素およびその遺伝子 - Google Patents

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紀幸 伊藤
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    • C12Y101/00—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1)
    • C12Y101/01—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.1.1)
    • C12Y101/01184—Carbonyl reductase (NADPH) (1.1.1.184)

Definitions

  • the present invention relates to a modified carbonyl reductase, a gene thereof, a vector containing the gene, and a transformant transformed with the vector.
  • a method of asymmetric reduction of the carbonyl group of a carbonyl compound with a microorganism or an enzyme is known.
  • Asymmetric enzymes that reduce carbonyl compounds (hereinafter referred to as carbonyl reductases) are useful in the production of various optically active alcohols.
  • the enzyme is deactivated by a substrate, a product, an acid or alkali used for pH adjustment, a surfactant or an organic solvent added to improve the reaction liquid property, etc. And the enzyme reaction may be inhibited. Therefore, a carbonyl reductase capable of avoiding enzyme inactivation or reaction inhibition by an organic solvent or the like leads to shortening of the reaction time and improvement of the reaction yield, and is further useful for industrial production of optically active alcohols.
  • Patent Document 1 For example, attempts have been made to acquire resistance to organic solvents by random mutation introduction, and a reductase having resistance to 2-propanol and dimethyl sulfoxide has been reported (Patent Document 1, Non-Patent Document 1).
  • ezetimibe and montelukast are more soluble in dimethylformamide than 2-propanol or dimethylsulfoxide. If a dimethylformamide resistant enzyme can be used for the production of such a compound, the reaction solution property can be improved, and higher productivity can be expected than when other organic solvents are used.
  • an object of the present invention is to modify a wild-type enzyme whose reactivity decreases in the presence of dimethylformamide, and to improve the reactivity in the presence of an organic solvent and to improve the reactivity of the wild-type enzyme and / or It is to provide a transformant that produces the enzyme.
  • the present inventors From the mutant enzyme library prepared by randomly introducing mutations into the wild-type enzyme gene, the present inventors have modified carbonyl reductase with improved reactivity in the presence of an organic solvent compared to the wild-type enzyme. As a result, the present invention has been completed.
  • the present invention provides the following (a) to (c): (A) having 78% or more sequence identity with the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing; (B) reducing 2-pentanone to produce 2-pentanol, and (C) Compared with the carbonyl reductase consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 in the Sequence Listing, the reactivity with the carbonyl compound is high in the presence of an organic solvent and / or the thermal stability is high. It relates to a polypeptide exhibiting the properties of
  • the organic solvent is preferably dimethylformamide.
  • amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 in the Sequence Listing; 2nd, 22nd, 25th, 39th, 42nd, 45th, 51st, 56th, 71st, 87th, 90th, 102nd, 109th, 124th, 135th, 138th, 155th 159, 175, 177, 183, 190, 195, 212, 220, 226, 228, 236, 238, 250, 254, 257, 259, 265
  • an amino acid substitution is introduced into one or more amino acids selected from the 1st, 267th, 270th, 279th, 298th, 300th, 301st, and 331st amino acids.
  • the amino acid substitution is the following group in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 in the Sequence Listing; 2nd is isoleucine, 22nd is arginine, 25th is phenylalanine, 39th is arginine, 42nd is arginine, 45th is aspartic acid, 51st is alanine, 56th is lysine, 71st is asparagine or arginine, 87th Is isoleucine, 90 is glycine, 102 is isoleucine, 109 is glycine, 124 is leucine, 135 is alanine, 138 is asparagine, 155 is leucine or arginine, 159 is phenylalanine, 175 is aspartic acid 177th phenylalanine, 183th threonine, 190th serine, 195th leucine, 212th phenylalanine, threonine or tyrosine, 220
  • the amino acid substitution is the following group in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 in the Sequence Listing; 2nd isoleucine, 45th aspartic acid, 71st asparagine or arginine, 102th isoleucine, 124th leucine, 175th aspartic acid, 177th phenylalanine, 183th threonine, 195th leucine, 220th Valine, 226 is glycine, 236 is asparagine, 238 is isoleucine, 257 is serine, 259 is glutamic acid, 265 is lysine, 267 is proline, 270 is methionine, 300 is aspartic acid, And an amino acid substitution in which position 301 is replaced with cysteine, One or more amino acid substitutions selected from Compared with the carbonyl reductase consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing, it is preferable that the stability to organic solvents is improved.
  • Amino acid substitutions are the following groups: 22nd arginine, 39th arginine, 51st alanine, 87th isoleucine, 90th glycine, 259th glutamic acid, and 270th amino acid substitution with methionine,
  • the amino acid substitution is represented by the following (1) to (7) in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 in the Sequence Listing; (1) The 22nd is arginine, (2) 22nd is arginine, 87th is isoleucine, (3) 39th is arginine, (4) 39th is arginine, 51st is alanine, (5) 51st is alanine, (6) amino acid substitution in which position 87 is replaced with isoleucine, and (7) position 90 is replaced with glycine, One or more amino acid substitutions selected from are preferred.
  • the present invention also relates to a polynucleotide encoding the polypeptide.
  • the present invention also relates to a vector comprising the polynucleotide.
  • the polypeptide having reducible coenzyme regeneration ability is preferably glucose dehydrogenase.
  • the present invention also relates to a transformant obtained by transforming a host cell with the vector.
  • the host cell is preferably E. coli.
  • the present invention also relates to a method for producing an alcohol compound, characterized in that the polypeptide or the transformant and / or a processed product thereof is allowed to act on a carbonyl compound.
  • the carbonyl compound is an asymmetric ketone and the alcohol compound is an optically active alcohol.
  • the carbonyl compound is represented by the following formula (1): (Wherein R 1 and R 2 are a hydrogen atom, a halogen atom, an optionally substituted alkyl group, an optionally substituted aralkyl group, an optionally substituted aryl group, or an optionally substituted alkoxy; A group, an amino group, or a nitro group, or R 1 and R 2 may be bonded to each other to form a ring, provided that R 1 and R 2 have different structures).
  • the alcohol compound is represented by the following formula (2): (Wherein R 1 and R 2 are the same as described above, * represents an asymmetric carbon), and is preferably an optically active alcohol.
  • a modified carbonyl reductase whose reactivity in the presence of an organic solvent is improved as compared to the wild type and its gene, a vector containing the gene, a transformant transformed with the vector, a transformant of the transformant A method for producing a processed product can be provided.
  • the polypeptide of the present invention is characterized by exhibiting the following properties (a) to (c): (A) having 78% or more sequence identity with the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing, (b) reducing 2-pentanone to produce 2-pentanol, and (c) coordination Compared with the carbonyl reductase consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1 in the table, the reactivity with the carbonyl compound is high and / or the thermal stability is high in the presence of an organic solvent.
  • amino acids, peptides, and proteins are represented using abbreviations adopted by the IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Committee (CBN) shown below.
  • CBN Biochemical Nomenclature Committee
  • amino acid residue sequences of peptides and proteins are expressed from the N-terminus to the C-terminus from the left end to the right end.
  • CBN Biochemical Nomenclature Committee
  • substitution of tyrosine to aspartic acid at position 64 is expressed as “Y64D”.
  • Multiple mutations are expressed by separating them with a hyphen symbol “-”. For example, “S41A-Y64D” indicates substitution of serine at position 41 with alanine and tyrosine at position 64 with aspartic acid.
  • sequence identity of a polypeptide or polynucleotide is an optimal alignment of the two polypeptides or polynucleotides to be compared and the amino acid or nucleobase (eg, A, T, C, G, U, or I) Is divided by the total number of comparison bases and the result is multiplied by 100.
  • amino acid or nucleobase eg, A, T, C, G, U, or I
  • Sequence identity can be calculated, for example, using the following sequence analysis tools: GCG Wisconsin Package (University of Wisconsin), the ExPASy World Wide Web server for molecular biology (Swiss Bioinformatics Institute), BLAST ( US Biotechnology Information Center), GENETYX (Genetics).
  • the origin of the polypeptide is not limited, but is preferably a microorganism belonging to the genus Saccharomycesaceae , more preferably a genus Vanderwaltozyma , more preferably a species belonging to Vanderwaltozyma polyspora ( Vanderwaltozyma polyspora ) Carbonyl reductase derived from microorganisms, particularly preferably Vanderwaltozyma polyspora NBRC0996.
  • the microorganism can be obtained from the Biological Genetic Resource Department (NBRC: 292-0818, Kisarazu City, Chiba Prefecture).
  • the wild-type enzyme gene can be prepared by amplifying the polynucleotide represented by 2.
  • polypeptide of the present invention may be obtained by modifying the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • sequence identity between the amino acid sequence after modification and the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is 85% or more, preferably 90% or more, more preferably 92% or more, still more preferably 95% or more, 97% or more, 98% or more, 98.5% or more, 99% or more.
  • polypeptide of the present invention has the following groups in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing; the second is isoleucine, the 45th is aspartic acid, and the 71st is asparagine from the viewpoint of improving the stability to organic solvents.
  • (1) to (35) In the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing, the following (1) to (35); (1) 71st asparagine, 195th leucine, (2) 71st is arginine, 259th is glutamic acid, (3) 71st is arginine, 270th is methionine, (4) 71st is arginine, 300th is aspartic acid, (5) 102nd is isoleucine, 270th is methionine, (6) 177th is phenylalanine, 220th is valine, (7) Glycine at 226th, methionine at 270th, (8) 257th is serine, 259th is glutamic acid, (9) 257th is serine, 270th is methionine, (10) 259th is glutamic acid, 270th is methionine, (11) 259th is glutamic acid, 300th is aspartic acid, (12) 267th is proline,
  • polypeptide of the present invention is the following group of amino acid sequences shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing; from the viewpoint of improving resistance to reaction inhibition by an organic solvent; 22nd is arginine; 39th is arginine; It is preferable that one or more amino acid substitutions selected from amino acid substitutions in which the number is alanine, the number 87 is isoleucine, the number 90 is glycine, the number 259 is glutamic acid, and the number 270 is substituted with methionine are introduced.
  • the enzyme of the present invention has high reactivity with carbonyl compounds even in the presence of an organic solvent.
  • the presence of the organic solvent may be a state in which the enzyme-containing liquid and the organic solvent are mixed, but the enzyme-containing liquid and the organic solvent may be in a non-uniform state, which is physically stirred and mixed. But it ’s okay.
  • Enzyme highly reactive in the presence of an organic solvent means that after treatment for a certain period of time in the presence of the organic solvent, compared to the wild-type enzyme described in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing, or the presence of the organic solvent below, it shows that the reduction activity of the enzyme with respect to 2-pentanone is high.
  • the enzyme has high stability to the organic solvent or high resistance to reaction inhibition by the organic solvent.
  • the stability with respect to the organic solvent is improved means that the residual activity with respect to 2-pentanone or 2-hexanone after incubating the enzyme with the organic solvent is described in Example 4 or 5 below.
  • the residual activity is 1% or more higher than that of the wild-type enzyme, preferably 5% or more, more preferably 10% or more, and most preferably 20% or more.
  • the resistance to reaction inhibition by the organic solvent is improved
  • the relative activity with respect to 2-hexanone in the presence of the organic solvent was measured by the method described in Example 31 described later.
  • the relative activity is 1% or more higher than that of the wild-type enzyme, preferably 5% or more, more preferably 7% or more, still more preferably 10% or more, and most preferably 20% or more.
  • the stability of the enzyme with respect to the organic solvent can be evaluated by, for example, the following method.
  • a buffer solution containing an organic solvent at an arbitrary concentration (eg, 0.5% to 50%) (preferably 0.01 to 1M phosphate buffer solution having a pH of 5 to 8) is added to the cell-free extract containing the enzyme to add any Incubate at a temperature (eg, 4-40 ° C.). If the organic solvent and buffer are not homogeneous, incubate with shaking or stirring. Samples without addition of organic solvent and treatment liquid with addition of organic solvent were sampled 0.1 to 48 hours later, diluted with 0.1 M aqueous potassium phosphate (pH 7.0), and the diluted solution was used.
  • the activity of the enzyme is measured by the following [Method for evaluating reducing ability for carbonyl compounds].
  • the modified carbonyl reductase having improved stability to organic solvents has a residual activity in the wild type when evaluated as described above.
  • the enzyme is 1% or more higher than that, preferably 5% or more, more preferably 10% or more, and most preferably 20% or more.
  • the peptide of the present invention has the ability to reduce the carbonyl compound to be evaluated.
  • the reduction ability with respect to the evaluation carbonyl compound is so high that the rate of decrease in absorbance is high.
  • the reducing ability of the polypeptide can also be quantified, and the reducing activity 1U is defined as the amount of enzyme that catalyzes the consumption of 1 ⁇ mol NADPH per minute.
  • the modified carbonyl reductase of the present invention can be searched for by the following method. Using the error-prone PCR method (Leung et al., Technique 1, 11-15 (1989)) or a kit based on the same principle, the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2 (wild type enzyme gene) A DNA fragment into which substitution, insertion, deletion or addition of one or more base sequences is introduced can be obtained.
  • the wild-type enzyme gene can be used as a template, and the 240th T can be replaced with C by a conventional method to destroy the NdeI recognition site without changing the amino acid sequence of the wild-type enzyme (SEQ ID NO: 3 in the sequence listing).
  • Primer 1 5′-GGGAATTCCATATGAGTGTTTTAGTTTACAGG-3 ′ (SEQ ID NO: 4 in the Sequence Listing) and Primer 2: 5′-ATACGCGTCACTACTACTTTTCTTGAACCTTCA-3 ′ (SEQ ID NO: 5 in the Sequence Listing)
  • a random mutation is introduced into the entire length of the gene encoding the wild type enzyme, an Nde I recognition site is added to the start codon, and a Sal I recognition site is added immediately after the stop codon.
  • a kind of double-stranded DNA (mutant enzyme gene) can be obtained.
  • the amplified fragment was digested with Nde I and Sal I, the 185th T of plasmid pUCN18 (manufactured pUC18 (Takara Bio Inc. by PCR) was modified to A destroy Nde I site, further 471-472 th By inserting GC into TG and inserting the Nde I site downstream of the lac promoter of the plasmid into which the Nde I site was newly introduced) and Sal I recognition site, and using this plasmid, Escherichia coli ( Escherichia coli) ) Transform HB101 strain (hereinafter, E. coli HB101). The transformed E.
  • mutant enzyme gene obtained by the above method in place of the wild type gene, a mutant enzyme library into which mutations are further introduced can be prepared by the same operation.
  • the modified carbonyl reductase of the present invention can be selected from the above library. Although it does not specifically limit as a selection method, Preferably it is the following method. [Selection Method 1 by Enzyme Plate Evaluation with Improved Stability to Organic Solvents] Each recombinant bacterium of the mutant enzyme library and a recombinant bacterium producing a wild-type enzyme (for example, E. coli HB101 (pNKP) shown in Reference Example 3) are mixed with an appropriate medium (for example, 2 ⁇ containing 200 ⁇ g / ml ampicillin). YT medium (tryptone 1.6%, yeast extract 1.0%, sodium chloride 0.5%, pH 7.0) is inoculated, and cultured with shaking at 37 ° C.
  • an appropriate medium for example, 2 ⁇ containing 200 ⁇ g / ml ampicillin.
  • YT medium tryptone 1.6%, yeast extract 1.0%, sodium chloride 0.5%, pH 7.0
  • each treated cell-free extract is dispensed into a 96-well plate (manufactured by AGC Techno Glass), and NADPH (preferably 1.5 mM) and a carbonyl compound (preferably 10 mM)
  • NADPH preferably 1.5 mM
  • a carbonyl compound preferably 10 mM
  • a phosphate buffer solution pH 5 to 7 containing 2,3-butanedione
  • the NADPH fluorescence is observed over time with a UV sample photographing device FAS-III (manufactured by Toyobo Co., Ltd.).
  • NADPH fluorescence remains in the enzyme solution in which the reaction does not proceed, but the cell-free extract in which the reaction has progressed disappears as NADPH decreases.
  • Enzymes that disappeared in a short time compared with the wild-type enzyme as a control were selected as enzymes with improved stability against chloride.
  • a plasmid is extracted from the culture medium of the selected enzyme, and the base of the modified carbonyl reductase gene using BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems Japan) and Applied Biosystems 3130xl Genetic Analyzer (Applied Biosystems Japan) The sequence can be determined and the mutation site can be identified.
  • recombinant bacteria are placed in an appropriate liquid medium (for example, 2 ⁇ YT medium (200% of ampicillin / 200 ⁇ g / ml) (tripton 1.6%, yeast extract 1.0%, sodium chloride 0.5%, pH 7.0). Inoculate and incubate with shaking for 20 hours at 37 ° C. For each of the obtained cultures, the cells are collected by centrifugation and suspended in a buffer (preferably 50 mM 3- (N-morpholino) propanesulfonic acid (MOPS) buffer). This is crushed using a UH-50 type ultrasonic homogenizer (manufactured by SMT), and the cell residue is removed by centrifugation to obtain a cell-free extract.
  • a buffer preferably 50 mM 3- (N-morpholino) propanesulfonic acid (MOPS) buffer
  • a buffer preferably 50 mM 3- (N-morpholino) propanesulphonic acid (MOPS) buffer
  • dimethylformamide so that the final concentration of dimethylformamide is preferably 0.1 to 60%
  • the mixture is heated (preferably at 40 to 80 ° C. for 0.1 minute to 24 hours) and then cooled on ice.
  • a buffer preferably containing NADP + (preferably 1 mM), nitroblue tetrazolium (preferably 200 ⁇ M), 1-methyl-5-methylphenazinium methylsulfate (preferably 10 ⁇ M), 2-propanol (eg 0.1 to 50%) Is mixed with 50 mM of 3- (N-morpholino) propanesulfonic acid (MOPS) buffer, transferred to a 96-well plate (manufactured by AGC Techno Glass), and observed.
  • the dyed product can be selected as a modified carbonyl reductase with improved stability to organic solvents.
  • a plasmid is extracted from the selected recombinant bacterial culture, and the mutant RKP gene base using BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems Japan) and Applied Biosystems 3130xl Genetic Analyzer (Applied Biosystems Japan) The sequence can be determined and the mutation site can be identified.
  • NADPH fluorescence is observed with a Benchmark Plus microplate spectrophotometer (manufactured by BIO-RAD).
  • the NADPH fluorescence remains in the enzyme solution in which the reaction does not proceed, but the cell-free extract in which the reaction has progressed disappears as NADPH decreases.
  • NADPH is consumed as a result of reduction of the carbonyl compound, and the one that disappears in a short time is selected as a recombinant carbonyl reductase having improved resistance to reaction inhibition against organic solvents.
  • Plasmids are extracted from the selected recombinant bacterial culture, and using the BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems Japan) and Applied Biosystems 3130xl genetic analyzer (Applied Biosystems Japan) mutant RKP gene base The sequence can be determined and the mutation site can be identified.
  • Modifications that combine the properties of multiple mutations by combining multiple mutations that can increase reactivity with carbonyl compounds and / or increase thermal stability in the presence of organic solvents by site-directed mutagenesis Type carbonyl reductase can be produced.
  • the polynucleotide of the present invention is not particularly limited as long as it encodes the polypeptide of the present invention.
  • the polynucleotide comprising the base sequence encoding the wild-type enzyme shown in SEQ ID NO: 2 of the sequence listing, or this And polypeptides obtained by modifying the above.
  • a method for modifying a wild-type enzyme gene a known method described in, for example, Current Protocols in Molecular Biology (Frederic M. Ausubel, Green Publishing Associates and Wiley-Interscience (1989)) can be used. That is, one or a plurality of bases of the wild-type enzyme gene (for example, 40, preferably 20, more preferably 10, more preferably 5, 4, 3, or 2 bases) By substituting, adding, inserting or deleting, a polynucleotide in which the amino acid sequence of the wild-type enzyme is modified can be produced.
  • a mutagenesis method using PCR such as the error-prone PCR method (Leung et al., Technique 1, 11-15 (1989)), or a commercially available kit Diversity PCR Random Mutagenesis Kit (Clontech), TransformerMutageMeter.
  • Kit Clontech
  • EXOIII / Mung Bean Selection Kit Stratagene
  • QuickChange Site Directed Mutagenesis Kit (Stratagene)
  • site-directed mutagenesis methods include, for example, Olft Landt et al. (Gene, 96, 125-128 (1990)), Smith et al. (Genetic Engineering, 3, 1 , Setlow, J. Plenum Press), Vlasuk et al. (Experimental Manipulation of Gene Expression, Inouye, M. Academic Press), Hos. N. Examples include the method of Hunt et al. (Gene, 77, 51 (1989)) and the use of a commercial kit of QuikChange II Kit (manufactured by Stratagene).
  • the target polynucleotide of the present invention when introducing a mutation at two positions, can be obtained by repeating the method according to the above method twice. Even when a plurality of other positions are substituted with other amino acids, the target polynucleotide of the present invention can be obtained by this method.
  • the polynucleotide encoding the polypeptide of the present invention includes, for example, a carbonyl reductase having the activity of reducing 2-pentanone to produce 2-pentanol and comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the Sequence Listing.
  • a polynucleotide that encodes a polypeptide that is highly reactive to a carbonyl compound in the presence of an organic solvent and that includes a complementary nucleotide sequence to the polynucleotide consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2 in the Sequence Listing; Polynucleotides that hybridize under stringent conditions are preferred.
  • a polynucleotide that hybridizes under stringent conditions with a polynucleotide having a base sequence complementary to the polynucleotide shown in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing is shown in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing.
  • Hybridization can be performed according to the method described in Molecular Cloning 2nd Edition (Joseph Sambrook, Cold Spring Harbor Press (1989)).
  • the “polynucleotide hybridizing under stringent conditions” refers to, for example, 65 in the presence of 0.7 to 1.0 M sodium chloride using a filter on which colony or plaque-derived polynucleotide is immobilized. After hybridization at 0 ° C., the filter is washed under conditions of 65 ° C. using a 3-fold concentration SSC solution (the composition of the 1-fold concentration SSC solution is 150 mM sodium chloride and 15 mM sodium citrate). Can be obtained.
  • an SSC solution having a 1-fold concentration at 65 ° C. More preferably, it is washed with an SSC solution having a 0.7-fold concentration at 65 ° C., and further preferably, 0.5-fold, 0.45-fold,. It is a polynucleotide that can be obtained by washing with a 25-fold, 0.2-fold, or 0.15-fold concentrated SSC solution.
  • hybridization conditions have been described as described above, the conditions are not particularly limited.
  • a plurality of factors such as temperature and salt concentration can be considered as factors affecting the stringency of hybridization, and those skilled in the art can realize optimum stringency by appropriately selecting these factors.
  • the sequence identity with the polynucleotide shown in SEQ ID NO: 2 is preferably 78% or more, more preferably 84% or more, still more preferably 87% or more, Preferred examples include 89%, 90%, 94%, 95%, 97% or more of the polynucleotide, and the encoded polypeptide is included in the polynucleotide as long as it has the properties of the polypeptide of the present invention.
  • a polypeptide expression vector can be prepared by inserting a polynucleotide encoding the polypeptide of the present invention into an expression vector.
  • the expression vector used above is not particularly limited as long as it can express the polypeptide encoded by the polynucleotide in a suitable host organism.
  • examples of such vectors include plasmid vectors, phage vectors, cosmid vectors, and shuttle vectors that can exchange genes with other host strains can also be used.
  • such a vector in the case of Escherichia coli, such a vector usually contains regulatory elements such as lacUV5 promoter, trp promoter, trc promoter, tac promoter, lpp promoter, tufB promoter, recA promoter, pL promoter, etc., and operates with the DNA of the present invention. It can be suitably used as an expression vector comprising expression units that are ligated together. Examples thereof include pUCN18 (see Reference Example 2), pSTV28 (manufactured by Takara Bio Inc.), pUCNT (International Publication No. 94/03613) and the like.
  • regulatory element refers to a base sequence having a functional promoter and any associated transcription element (eg, enhancer, CCAAT box, TATA box, SPI site, etc.).
  • operably linked means that a gene is operably linked to various regulatory elements such as promoters and enhancers that regulate the expression of the gene. It is well known to those skilled in the art that the type and kind of the control factor can vary depending on the host.
  • the vector may further contain a polynucleotide encoding a polypeptide having the ability to regenerate reduced coenzyme.
  • polypeptide having reducible coenzyme regeneration ability include glucose dehydrogenase.
  • a transformant can be obtained by transforming a host cell with a vector.
  • a transformant obtained by introducing a polynucleotide encoding the polypeptide of the present invention into a chromosome can also be mentioned as a transformant.
  • Host cells for transformation with vectors are cells that can be transformed with a polypeptide expression vector containing a polynucleotide encoding each polypeptide and can express the polypeptide encoded by the introduced polynucleotide. There is no particular restriction.
  • the available microbial as the host cell e.g., Escherichia (Escherichia) genus Bacillus (Bacillus) genus Pseudomonas (Pseudomonas) genus Serratia (Serratia) genus Brevibacterium (Brevibacterium) genus Corynebacterium Rii um (Corynebacterium ) genus Streptococcus (Streptococcus) genus, and Lactobacillus (Lactobacillus) bacteria have been developed host-vector systems such as the genus Rhodococcus (Rhodococcus) genus and Streptomyces (Streptomyces) genus Streptomyces which have been developed in the host-vector systems such as bacteria, Saccharomyces (Saccharomyces) genus, Kuraiberoma Isis (Kluyveromyces) sp., Schizosacc
  • the vector of the present invention can be introduced into a host microorganism by a known method.
  • the plasmid of the present invention in which a polynucleotide encoding a modified carbonyl reductase is introduced into the above-described expression vector pUCN18 as a polypeptide expression vector (pNKPm01--shown in Examples 2-3, 6-15, 17-27, 30).
  • E. A transformant for example, E. coli HB101 (pNKPm50) shown in Example 27
  • the vector is introduced into a host cell by operating according to the protocol using an E. coli HB101 competent cell (manufactured by Takara Bio Inc.) or the like. ) Is obtained.
  • a transformant in which both the polypeptide of the present invention and the polypeptide having the ability to regenerate reduced coenzyme described below are expressed in the same cell can also be bred.
  • the polynucleotide encoding the polypeptide of the present invention and the polynucleotide encoding the polypeptide having the ability to regenerate reduced coenzyme are incorporated into the same vector and introduced into a host cell. It can also be obtained by incorporating two types of DNA into two different vectors of different incompatibility groups and introducing them into the same host cell.
  • the transformant thus obtained includes, for example, a recombinant vector in which a nucleotide encoding a modified carbonyl reductase is introduced into the expression vector pUCN18 (for example, pNKPm01 shown in Example 2) and a reduced complement.
  • An alcohol compound can be produced by allowing the polypeptide or transformant of the present invention and / or a processed product thereof to act on a carbonyl compound.
  • the carbonyl compound used as a substrate is not particularly limited.
  • asymmetric ketones are preferable because their reduction products become useful optically active alcohols.
  • Examples of the compound having a carbonyl group include the following formula (1): (Wherein R 1 and R 2 are a hydrogen atom, a halogen atom, an optionally substituted alkyl group, an optionally substituted aralkyl group, an optionally substituted aryl group, or an optionally substituted alkoxy; A group, an amino group, or a nitro group, or R 1 and R 2 may be bonded to each other to form a ring, provided that R 1 and R 2 have different structures). Examples of the product include the following formula (2): (Wherein R 1 and R 2 are the same as described above, * represents an asymmetric carbon).
  • R 1 and R 2 are each an alkyl group having 1 to 14 carbon atoms, an aryl group having 6 to 14 carbon atoms, a heteroaryl group having 4 to 14 carbon atoms, an alkoxy group having 1 to 5 carbon atoms, or an alkyl group having 2 to 5 carbon atoms.
  • a hydrogen atom, a halogen atom, a hydroxyl group, an amino group, or a nitro group is preferable.
  • alcohol compounds produced using the polypeptide of the present invention include 2-pentanol, 2-hexanol, 2,3-butanediol, 3-hydroxy-2-butanone, 1-phenylethyl alcohol, [3- [ (5R)-(4-Fluoro-phenyl) -5-hydroxypentanoyl]-(4S) -phenyl-1,3-oxazolidine-2-one, 1-phenyl-1-propanol, 1-phenyl-1-butanol 1-phenyl-1-pentanol, 1-phenyl-1-hexanol, 1-phenyl-2-butanol, 4-phenyl-2-butanol, 2,5-hexanediol, 5-hydroxy-2-hexanone, 2 , 3-hexanediol, 2-hydroxyhexane-3-one, 3-hydroxy-2-hexanone, 3,4-hexane Ol, 4-hydroxy-3-hexanone, and 1-phenoxy-2
  • An appropriate solvent for example, 100 mM phosphate buffer (pH 6.5), etc.
  • a substrate that is a carbonyl compound for example, 2-pentanone or acetophenone
  • NADPH or oxidized nicotinamide / adenine dinucleotide phosphate hereinafter, referred to as “NPTA”.
  • a coenzyme such as NADP + ), a culture of the transformant and / or a processed product thereof, and the like are added, and the mixture is reacted with stirring under pH adjustment.
  • the treated product is, for example, a crude extract, cultured cells, freeze-dried organisms, acetone-dried organisms, disrupted cells, or immobilized products thereof, and the enzyme catalytic activity of the polypeptide remains. Means what you are doing.
  • the reaction temperature is preferably 5 to 80 ° C., more preferably 10 to 60 ° C., and further preferably 20 to 40 ° C.
  • the pH of the reaction solution is preferably 3 to 10, more preferably 4 to 9, and still more preferably 5 to 8.
  • the reaction can be carried out batchwise or continuously.
  • the reaction substrate is 0.01 to 100% (w / v), preferably 0.1 to 70% (w / v), more preferably 0.5 to 50% (w / v). It can be added at a charge concentration. Further, a substrate may be newly added during the reaction.
  • the treated product of the transformant means, for example, a cell-free extract, cultured cells, freeze-dried cells, acetone-dried cells, or a ground product thereof, or a mixture thereof. Furthermore, they can be used by immobilizing them with a known means in the form of polypeptides or cells. .
  • NADPH or NADH is required as a coenzyme.
  • the reduction reaction can be carried out even if NADPH or NADH is added to the reaction system in a necessary amount.
  • a coenzyme regeneration system comprising an enzyme having the ability to convert the oxidized coenzyme (NADP + or NAD + ) into reduced NADPH or NADH (hereinafter referred to as reduced coenzyme regeneration ability) and its substrate, By performing the reaction in combination with the polypeptide of the present invention, the amount of expensive coenzyme used can be greatly reduced.
  • Examples of the enzyme having the ability to regenerate reduced coenzyme include hydrogenase, formate dehydrogenase, carbonyl reductase, glucose-6-phosphate dehydrogenase, and glucose dehydrogenase. Preferably, glucose dehydrogenase is used.
  • Such a reaction can also be carried out by adding a coenzyme regeneration system into the asymmetric reduction reaction system, but it encodes a polynucleotide encoding the enzyme of the present invention and a polypeptide having reduced coenzyme regeneration ability.
  • the transformant transformed with both of the polynucleotides to be used is used as a catalyst, the reaction can be carried out efficiently without separately preparing an enzyme capable of regenerating reduced coenzyme and adding it to the reaction system. Can do.
  • Such a transformant can be obtained by the method for producing a transformant described above.
  • the method for recovering alcohol from the reaction solution after the reaction is not particularly limited, but after separating the cells or the like directly from the reaction solution or if necessary, ethyl acetate, toluene, t-butyl methyl ether, hexane, methylene chloride, etc.
  • the product can be extracted with a solvent, and dehydrated, and then purified by distillation, recrystallization, silica gel column chromatography, or the like. By this method, a high-purity alcohol compound can be easily obtained.
  • double-stranded DNA (RKP gene) in which an Nde I recognition site is added to the start codon portion of the gene consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing and a Sal I recognition site is added immediately after the termination codon. )was gotten.
  • PCR reaction was further performed, and the 240th T was changed to C by a conventional method.
  • the double-stranded DNA (Nde I site consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 3 of Sequence Listing NdeI recognition site in the gene is destroyed RKP gene) was obtained.
  • PCR was performed using PrimeSTAR HS DNA polymerase (manufactured by Takara Bio Inc.) as a DNA polymerase, and the reaction conditions were in accordance with the instruction manual.
  • Example 2 The RKP gene was disrupted NdeI site obtained in constructing Example 1 recombinant vector pNKP was digested with Nde I and Sal I, 185 of plasmid pUCN18 (manufactured pUC18 (Takara Bio Inc. by PCR) The Nde I recognition site downstream of the lac promoter of the plasmid in which the Nde I site was newly introduced by changing the T to A to destroy the Nde I site and further changing the 471 to 472st GC to TG And a Sal I recognition site to construct a recombinant vector pNKP.
  • the acetophenone reduction activity of each recombinant organism is shown below.
  • E. coli HB101 pUCN18
  • the acetophenone reduction activity was 0.1 U / mg or less. Meanwhile, E was expressed RKP.
  • the acetophenone reduction activity of E. coli HB101 (pNKP) was 5 U / mg.
  • the recombinant organism obtained in Reference Example 3 had a reducing activity against acetophenone, and RKP expression was observed.
  • Reaction inhibition of wild type enzyme RKP with organic solvent A cell-free extract of wild type enzyme was obtained in the same manner as in Reference Example 4. To this cell-free extract, dimethylformamide having a final concentration of 30% was added, adjusted to pH 6.5 with sulfuric acid or sodium hydroxide, and incubated at 30 ° C. for 2 hours. In addition, a cell-free extract to which nothing was added was also incubated as a control. After 2 hours, each cell-free extract was diluted. The 2-hexanone reducing activity of these cell-free extracts was measured.
  • the reaction was performed by adding 30% dimethylformamide, 10 mM 2-hexanone, 0.25 mM coenzyme NADPH, and a cell-free extract to a 100 mM phosphate buffer (pH 6.5).
  • the consumption rate of NADPH was determined from the decrease rate of NADPH fluorescence, and the 2-hexanone reduction activity was calculated.
  • the relative activity at the time of solvent addition was calculated from the following formula, and this value was used as an index of stability for various compounds.
  • the activity (relative activity) of the wild-type enzyme under the solvent addition condition was 24% under the solvent non-addition condition.
  • Relative activity (%) [Enzyme activity (with solvent)] ⁇ [Enzyme activity (without solvent)] ⁇ 100
  • Example 1 Preparation of Mutant Enzyme Library 1 Using the plasmid pNKP containing the RKP gene prepared in Reference Example 2 as a template, primer 1: 5′-GGGAATTCCATATGAGTGTTTTAGTATAGGG-3 ′ (SEQ ID NO: 4 in the sequence listing) and primer 2: 5′-ATACGCGTCGCACTTACTTGTTCTTGAACCTCCA-3 ′ (sequence listing) Using the error-prone PCR method (Leung et al. Technique 1, 11-15 (1989)), a DNA amplified fragment in which a random mutation was introduced into the entire RKP gene was obtained.
  • Example 2 Selection 1 of modified carbonyl reductase A modified carbonyl reductase having improved stability against organic solvents was selected from the mutant enzyme library 1.
  • E. coli HB101 (pNKP) (control) was cultured in the same manner as in Reference Example 4, respectively.
  • a phosphate buffer solution (pH 6.5) containing dimethylformamide having a final concentration of 10 to 30% was added to 200 ⁇ l of each cell-free extract and incubated at 30 ° C. for 2 hours (dimethylformamide treatment).
  • 50 ⁇ l of each cell-free extract treated with dimethylformamide was dispensed into a 96-well plate (manufactured by AGC Techno Glass), containing 50 ⁇ l of phosphate buffer (pH 6.5) containing 6 mM NADPH and 133 mM 2,3-butanedione.
  • 100 ⁇ l of phosphate buffer (pH 6.5) was added and reacted at 30 ° C.
  • a plasmid is extracted from the culture solution of the selected enzyme, and the base sequence of the mutant RKP gene using the Big Dye Terminator Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems Japan) and Applied Biosystems 3130xl Genetic Analyzer (Applied Biosystems Japan) And the mutation site was identified.
  • Table 2 shows the modified carbonyl reductase having improved stability with respect to the organic solvent.
  • Example 3 Selection 2 of modified carbonyl reductase A modified carbonyl reductase having improved stability against organic solvents was selected from the mutant enzyme library 1.
  • E. coli HB101 (pNKP) (control) was inoculated on LB plate medium containing 100 ⁇ g / mL ampicillin. The obtained colony was transferred to a nylon membrane (Biodyne A, 0.45 ⁇ m) that had been heated at 40 ° C., and the nylon membrane was then added with 50 mM 3- (N-morpholino) propanesulfonic acid (containing 30% dimethylformamide).
  • MOPS metal-organic chemical vapor deposition
  • the nylon membrane was then placed in 50 mM MOPS buffer containing 1 mM NADP + , 200 ⁇ M nitroblue tetrazolium, 10 ⁇ M 1-methyl-5-methylphenylsulfurate and 10% (v / v) 2-propanol at room temperature for 30 minutes. Soaked. Thereafter, the nylon membrane was washed with distilled water, and the stained colony was selected as a recombinant carbonyl reductase candidate having improved stability to dimethylformamide.
  • the candidate strain was inoculated into 5 ml of 2 ⁇ YT medium (tripton 1.6%, yeast extract 1.0%, sodium chloride 0.5%, pH 7.0) containing 200 ⁇ g / ml ampicillin and cultured for 20 hours. About each obtained culture solution, the microbial cell was collected by centrifugation and suspended in 100 mM phosphate buffer (pH 6.5) of 1/6 amount of the culture solution. This was crushed using a UH-50 ultrasonic homogenizer (manufactured by SMT), and then the cell residue was removed by centrifugation to obtain a cell-free extract.
  • 2 ⁇ YT medium tripton 1.6%, yeast extract 1.0%, sodium chloride 0.5%, pH 7.0
  • Dimethylformamide having a final concentration of 20, 23, 26, and 30% and 50 mM MOPS buffer (pH 7.0) were added to 20 ⁇ l of the cell-free extract so that the total liquid volume became 40 ⁇ l, and the mixture was heated at 40 ° C. for 30 minutes. After cooling on ice for 1 minute, 200 ⁇ M of 50 mM MOPS buffer containing 1 mM NADP + , 200 ⁇ M nitroblue tetrazolium, 10 ⁇ M 1-methyl-5-methylphenylsulfurylate and 10% (v / v) 2-propanol was added. . The reaction solution was transferred to a 96-well plate (manufactured by AGC Techno Glass) and observed for 1 hour.
  • the stained product was selected as a recombinant carbonyl reductase having improved stability to dimethylformamide.
  • a plasmid is extracted from the selected recombinant bacterial culture, and the base of the mutant RKP gene using BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems Japan) and Applied Biosystems 3130xl Genetic Analyzer (Applied Biosystems Japan) The sequence was determined and the mutation site was identified.
  • Table 3 shows the modified carbonyl reductase having improved stability with respect to the organic solvent.
  • Enzymes with improved stability against 29 organic solvents shown in Table 3 were obtained. Six of these were the same mutant enzymes as the enzyme obtained in Example 2.
  • Relative activity (%) [enzyme activity at 3 hours (solvent added)] ⁇ [enzyme activity at 3 hours (no solvent added)] ⁇ 100
  • Table 4 shows the relative activities of the wild-type enzyme and the modified carbonyl reductase evaluated in the presence of 40% dimethylformamide.
  • the modified carbonyl reductase shown in Table 4 was more stable against organic solvents than the wild type enzyme.
  • Example 5 Evaluation 2 of modified carbonyl reductase Recombinant bacteria of the modified carbonyl reductase obtained in Example 3 and E. coli prepared in Reference Example 3.
  • E. coli HB101 (pNKP) (control) was cultured in the same manner as in Reference Example 4, respectively. About each obtained culture solution, the microbial cell was collected by centrifugation, and it suspended in the 100 mM phosphate buffer (pH 6.5) of the volume equal to 1/5 with a culture solution. This was crushed using a UH-50 ultrasonic homogenizer (manufactured by SMT), and then the cell residue was removed by centrifugation to obtain a cell-free extract.
  • the modified carbonyl reductase shown in Table 5 was more stable against organic solvents than the wild type enzyme.
  • Example 6 Production of Multiple Mutation Modified Carbonyl Reductase 1 Using the plasmid pNKPm02 obtained in Example 2 as a template, primer 1: 5′-GGGAATTCCATATGAGTGTTTTAGTTTACAGG-3 ′ (SEQ ID NO: 4 in the sequence listing), primer 3: 5′-GTTAATTTTCATTAGCGCGATTTTTAATTACATG-3 ′ (SEQ ID NO: 6 in the sequence listing) PCR was performed to obtain double-stranded DNA encoding an N-terminal polypeptide having an amino acid substitution of T257S in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 (N-terminal DNA).
  • N-terminal side DNA and C-terminal side DNA are mixed, PCR is performed using primer 1 and primer 2 as a template, and a polypeptide having amino acid substitutions of H71R and K259E in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is obtained.
  • a double-stranded DNA encoding was obtained. It was introduced into pUCN18 in the same manner as in Reference Example 2 to prepare pNKPm30. Using this pNKPm30, E. E. coli HB101 competent cells (manufactured by Takara Bio Inc.) to produce modified carbonyl reductase H71R-K259E E. coli HB101 (pNKPm30) was obtained.
  • Example 7 Production of Multiple Mutation Modified Carbonyl Reductase 2 Using the plasmid pNKPm02 obtained in Example 2 as a template, primer 1: 5′-GGGAATTCCATATGAGTGTTTTAGTTTACAGG-3 ′ (SEQ ID NO: 4 in the sequence listing), primer 5: 5′-GATCACACCTTTCACCCGCTTAACTCATCATTATG-3 ′ (SEQ ID NO: 8 in the sequence listing) PCR was performed to obtain double-stranded DNA encoding an N-terminal polypeptide having an amino acid substitution of T257S in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 (N-terminal DNA).
  • N-terminal DNA and C-terminal DNA are mixed, PCR is performed using primer 1 and primer 2 as a template, and a polypeptide having amino acid substitutions of T257S and K259E in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is obtained.
  • a double-stranded DNA encoding was obtained. It was introduced into pUCN18 in the same manner as in Reference Example 2 to prepare pNKPm31. Using this pNKPm31, E. E. coli HB101 competent cell (manufactured by Takara Bio Inc.) to produce modified carbonyl reductase T257S-K259E E. coli HB101 (pNKPm31) was obtained.
  • Example 8 Production of Multiple Mutation Modified Carbonyl Reductase 3 Using the plasmid pNKPm02 obtained in Example 2 as a template, primer 1: 5′-GGGAATTCCATATGAGTGTTTTAGTTTACAGG-3 ′ (SEQ ID NO: 4 in the sequence listing), primer 7: 5′-CTCGTTATGACACAGATCTCCTTGAGGTACTC-3 ′ (SEQ ID NO: 10 in the sequence listing) PCR was performed to obtain double-stranded DNA encoding an N-terminal polypeptide having an amino acid substitution of K259E or G300D in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 (N-terminal DNA).
  • N-terminal side DNA and C-terminal side DNA are mixed, PCR is performed using primer 1 and primer 2 as a template, and a polypeptide having amino acid substitutions of K259E and G300D in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is obtained.
  • a double-stranded DNA encoding was obtained. It was introduced into pUCN18 in the same manner as in Reference Example 2 to prepare pNKPm32. Using this pNKPm32, E. E. coli HB101 competent cells (manufactured by Takara Bio Inc.) to produce modified carbonyl reductase K259E-G300D E. coli HB101 (pNKPm32) was obtained.
  • Example 9 Production of multiple mutation-modified carbonyl reductase 4 Using the plasmid pNKPm04 obtained in Example 2 as a template, primer 1: 5′-GGGAATTCCATATGAGTGTTTTAGTTTACAGG-3 ′ (SEQ ID NO: 4 in the sequence listing), primer 9: 5′-GTTAATTTTCATTAGCGCGATTTTTAATTACATG-3 ′ (SEQ ID NO: 12 in the sequence listing) PCR was carried out to obtain double-stranded DNA encoding an N-terminal polypeptide having an amino acid substitution of H71R or K270M in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 (N-terminal DNA).
  • Example 10 Production of Multiple Mutation Modified Carbonyl Reductase 5 Using the plasmid pNKPm04 obtained in Example 2 as a template, Primer 1: 5′-GGGAATTCCATATGAGTGTTTTAGTTTACAGG-3 ′ (SEQ ID NO: 4 in the Sequence Listing), Primer 11: 5′-GGATACCTTTAGTACCAATAACAGCTGGGATATAAG-3 ′ (SEQ ID NO: 14 in the Sequence Listing) PCR was performed to obtain double-stranded DNA encoding an N-terminal polypeptide having an N102I amino acid substitution in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 (N-terminal DNA).
  • N-terminal DNA and C-terminal DNA are mixed, PCR is performed using primer 1 and primer 2 as a template, and a polypeptide having amino acid substitutions of N102I and K270M in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is obtained.
  • a double-stranded DNA encoding was obtained. It was introduced into pUCN18 in the same manner as in Reference Example 2 to prepare pNKPm34.
  • E. E. coli HB101 competent cells manufactured by Takara Bio Inc.
  • pNKPm34 E. E. coli HB101 competent cells (manufactured by Takara Bio Inc.) to produce modified carbonyl reductase N102I-K270M E. coli HB101 (pNKPm34) was obtained.
  • Example 11 Production of Multiple Mutation Modified Carbonyl Reductase 6
  • primer 1 5′-GGGAATTCCATATGAGTGTTTTAGTTTACAGG-3 ′ (SEQ ID NO: 4 in the sequence listing)
  • primer 13 5′-TTTTCAATTTTACTACTGCCTGTTGGAGCAACATAGAG-3 ′ (SEQ ID NO: 16 in the sequence listing)
  • PCR was performed to obtain double-stranded DNA encoding an N-terminal polypeptide having an amino acid substitution of E226G in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 (N-terminal DNA).
  • primer 14 5′-GCTAGTTTGCTCCCAACAGCGCGTGAAATTGATAAA-3 ′
  • primer 2 5′-ATACGCGTCGAACTTACACTGTTTCTTGAACCTTCA-3 ′
  • double-stranded DNA encoding a C-terminal polypeptide having an NE226G amino acid substitution in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 was obtained (C-terminal DNA).
  • N-terminal DNA and C-terminal DNA are mixed, PCR is performed using primer 1 and primer 2 as a template, and a polypeptide having amino acid substitutions of E226G and K270M in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is obtained.
  • a double-stranded DNA encoding was obtained. It was introduced into pUCN18 in the same manner as in Reference Example 2 to prepare pNKPm35. Using this pNKPm35, E. E. coli HB101 competent cell (manufactured by Takara Bio Inc.) to produce modified carbonyl reductase E226G-K270M E. coli HB101 (pNKPm35) was obtained.
  • Example 12 Production of Multiple Mutation Modified Carbonyl Reductase 7 Using the plasmid pNKPm04 obtained in Example 2 as a template, primer 1: 5′-GGGAATTCCATATGAGTGTTTTAGTTTACAGG-3 ′ (SEQ ID NO: 4 in the sequence listing), primer 15: 5′-GATCACACTTTTACCGCTTAACTCATCATTATG-3 ′ (SEQ ID NO: 18 in the sequence listing) PCR was performed to obtain double-stranded DNA encoding an N-terminal polypeptide having an amino acid substitution of T257S in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 (N-terminal DNA).
  • N-terminal DNA and C-terminal DNA are mixed, PCR is performed using primer 1 and primer 2 as a template, and a polypeptide having amino acid substitutions of T257S and K270M in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is obtained.
  • a double-stranded DNA encoding was obtained. It was introduced into pUCN18 in the same manner as in Reference Example 2 to prepare pNKPm36. Using this pNKPm36, E. E. coli HB101 competent cell (manufactured by Takara Bio Inc.) to produce a modified carbonyl reductase T257S-K270M E. coli HB101 (pNKPm36) was obtained.
  • Example 13 Production of Multiple Mutation Modified Carbonyl Reductase 8 Using the plasmid pNKPm04 obtained in Example 2 as a template, primer 1: 5′-GGGAATTCCATATGAGTGTTTTAGTTTACAGG-3 ′ (SEQ ID NO: 4 in the sequence listing), primer 17: 5′-GACAAGATCAACCTTTCACCAGTTTACACTCAT-3 ′ (SEQ ID NO: 20 in the sequence listing) PCR was performed to obtain double-stranded DNA encoding an N-terminal polypeptide having an amino acid substitution of K259E in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 (N-terminal DNA).
  • N-terminal DNA and C-terminal DNA are mixed, PCR is performed using primer 1 and primer 2 as a template, and a polypeptide having amino acid substitutions of K259E and K270M in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is obtained.
  • a double-stranded DNA encoding was obtained. It was introduced into pUCN18 in the same manner as in Reference Example 2 to prepare pNKPm37. Using this pNKPm37, E. E. coli HB101 competent cells (manufactured by Takara Bio Inc.) to produce modified carbonyl reductase K259E-K270M E. coli HB101 (pNKPm37) was obtained.
  • Example 14 Production of Multiple Mutation Modified Carbonyl Reductase 9 Using the plasmid pNKPm04 obtained in Example 2 as a template, primer 1: 5′-GGGAATTCCATATGAGTGTTTTAGTTTACAGG-3 ′ (SEQ ID NO: 4 in the sequence listing), primer 19: 5′-TTTGCATAGTAGGAACGGAGCATTTGACAAG-3 ′ (SEQ ID NO: 22 in the sequence listing) PCR was performed to obtain double-stranded DNA encoding an N-terminal polypeptide having an amino acid substitution of S267P in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 (N-terminal DNA).
  • PCR was performed using primer 20: 5′-CTTGTCCAAATGCTCCCGTTCACTATGCAA-3 ′ (SEQ ID NO: 23 in the sequence listing) and primer 2: 5′-ATACGCGTCCGACTTACACTTTGTTCTTGAACCTTCA-3 ′ (SEQ ID NO: 5 in the sequence listing). Then, double-stranded DNA encoding a C-terminal polypeptide having S267P and K270M amino acid substitutions in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 was obtained (C-terminal DNA).
  • N-terminal DNA and C-terminal DNA are mixed, PCR is performed using primer 1 and primer 2 as a template, and a polypeptide having amino acid substitutions of S267P and K270M in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is obtained.
  • a double-stranded DNA encoding was obtained. It was introduced into pUCN18 in the same manner as in Reference Example 2 to prepare pNKPm38. Using this pNKPm38, E. E. coli HB101 competent cell (manufactured by Takara Bio Inc.) to produce a modified carbonyl reductase S267P-K270M E. coli HB101 (pNKPm38) was obtained.
  • Example 15 Production of Multiple Mutation Modified Carbonyl Reductase 10 Using the plasmid pNKPm04 obtained in Example 2 as a template, primer 1: 5′-GGGAATTCCATATGAGTGTTTTAGTTTACAGG-3 ′ (SEQ ID NO: 4 in the sequence listing), primer 21: 5′-CTCGTTATGACACAGATCTCCTTGAGGTACTC-3 ′ (SEQ ID NO: 24 in the sequence listing) PCR was performed to obtain double-stranded DNA encoding an N-terminal polypeptide having an amino acid substitution of K270M or G300D in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 (N-terminal DNA).
  • PCR was performed using primer 22: 5′-GAGTTACCTCAAGGAGATCGTGTCCATAAACGAG-3 ′ (SEQ ID NO: 25 in the sequence listing) and primer 2: 5′-ATACGCGTCGAACTTACTTATTGTTCTTGAACCTTCA-3 ′ (SEQ ID NO: 5 in the sequence listing). Then, double-stranded DNA encoding a C-terminal polypeptide having an amino acid substitution of G300D in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 was obtained (C-terminal DNA).
  • N-terminal DNA and C-terminal DNA are mixed, PCR is performed using primer 1 and primer 2 as a template, and a polypeptide having amino acid substitutions of K270M and G300D in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is obtained.
  • a double-stranded DNA encoding was obtained. It was introduced into pUCN18 in the same manner as in Reference Example 2 to prepare pNKPm39. Using this pNKPm39, E. E. coli HB101 competent cells (manufactured by Takara Bio Inc.) to produce modified carbonyl reductase K270M-G300D E. coli HB101 (pNKPm39) was obtained.
  • Example 16 Evaluation of Multiple Mutation Modified Carbonyl Reductase 1
  • Recombinant bacteria of the multiple mutation-modified carbonyl reductase obtained in Examples 6 to 15 and E. coli prepared in Reference Example 3 were used.
  • E. coli HB101 (pNKP) (control) was cultured in the same manner as in Reference Example 4, respectively.
  • the stability of multiple mutation-modified carbonyl reductase against dimethylformamide was evaluated.
  • Table 6 shows the relative activities of the wild-type enzyme and the modified carbonyl reductase evaluated in the presence of 40% dimethylformamide.
  • the modified carbonyl reductase shown in Table 6 was more stable against organic solvents than the wild type enzyme.
  • Example 17 Production of Multiple Mutation Modified Carbonyl Reductase 11 Using the plasmid pNKPm37 obtained in Example 7 as a template, primer 1: 5′-GGGAATTCCATATGAGTGTTTTAGTTTACAGG-3 ′ (SEQ ID NO: 4 in the sequence listing), primer 23: 5′-CCAGTAGCCACCTGTAACTAAAACAATCAT-3 ′ (SEQ ID NO: 26 in the sequence listing) PCR was performed to obtain double-stranded DNA encoding an N-terminal polypeptide having an S2I amino acid substitution in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 (N-terminal DNA).
  • PCR was performed using plasmid pNKPm37 as a template, primer 24: 5′-ATGATTGTTTTAGTTTACGGGTCTACTGG-3 ′ (SEQ ID NO: 27 in the sequence listing), primer 2: 5′-ATACGCGTCACTACTACTTTGTTCTTGAACCTTCA-3 ′ (SEQ ID NO: 5 in the sequence listing). Then, double-stranded DNA encoding a C-terminal polypeptide having an amino acid substitution of S2I, K259E, and K270M in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 was obtained (C-terminal DNA).
  • N-terminal side DNA and C-terminal side DNA are mixed, PCR is performed using primer 1 and primer 2 as a template, and the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 has S2I, K259E, and K270M amino acid substitutions.
  • Double-stranded DNA encoding the peptide was obtained.
  • This was introduced into pUCN18 in the same manner as in Reference Example 2 to prepare pNKPm40.
  • E. E. coli HB101 competent cells manufactured by Takara Bio Inc.
  • coli HB101 (pNKPm40) was obtained.
  • Example 18 Production of Multiple Mutation Modified Carbonyl Reductase 12 Using the plasmid pNKPm37 obtained in Example 7 as a template, Primer 1: 5′-GGGAATTCCATATGAGTGTTTTAGTTTACAGG-3 ′ (SEQ ID NO: 4 in the Sequence Listing), Primer 25: 5′-GGCAGGCAATTGAAGAAAGTCAACAAATTTTTCTCAC-3 ′ (SEQ ID NO: 28 in the Sequence Listing) PCR was performed to obtain double-stranded DNA encoding an N-terminal polypeptide having an amino acid substitution of I124L in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 (N-terminal DNA).
  • primer 26 5′-GTGAAGAAATTTTGTCTGAACTTCTTCAATTGCTGCC-3 ′ (SEQ ID NO: 29 in the sequence listing)
  • primer 2 5′-ATACGCGTCGCACTTACACTGTTTCTTTGAACCTTCA-3 ′ (SEQ ID NO: 5 in the sequence listing)
  • double-stranded DNA encoding a C-terminal polypeptide having an amino acid substitution of I124L, K259E, K270M in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 was obtained (C-terminal DNA).
  • N-terminal DNA and C-terminal DNA are mixed, PCR is performed using primer 1 and primer 2 as a template, and polyamino acids having amino acid substitutions of I124L, K259E, and K270M among the amino acid sequences shown in SEQ ID NO: 1.
  • Double-stranded DNA encoding the peptide was obtained. It was introduced into pUCN18 in the same manner as in Reference Example 2 to prepare pNKPm41.
  • E. E. coli HB101 competent cells manufactured by Takara Bio Inc.
  • to produce modified carbonyl reductase I124L-K259E-K270M E. coli HB101 (pNKPm41) was obtained.
  • N-terminal side DNA and C-terminal side DNA are mixed, PCR is performed using primer 1 and primer 2 as a template, and polymorphisms having amino acid substitutions of L177F, K259E, K270M among the amino acid sequences shown in SEQ ID NO: Double-stranded DNA encoding the peptide was obtained. It was introduced into pUCN18 in the same manner as in Reference Example 2 to prepare pNKPm42. Using this pNKPm42, E. E. coli HB101 competent cells (manufactured by Takara Bio Inc.) to produce modified carbonyl reductase L177F-K259E-K270M E. coli HB101 (pNKPm42) was obtained.
  • Example 20 Production of Multiple Mutation Modified Carbonyl Reductase 14 Using the plasmid pNKPm37 obtained in Example 7 as a template, primer 1: 5′-GGGAATTCCATATGAGTGTTTTAGTTTACAGG-3 ′ (SEQ ID NO: 4 in the sequence listing), primer 29: 5′-GGACCAAAGACCCAGAACTGGGTTGATCG-3 ′ (SEQ ID NO: 32 in the sequence listing) PCR was performed to obtain double-stranded DNA encoding an N-terminal polypeptide having an amino acid substitution of F195L in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 (N-terminal DNA).
  • PCR was performed using primer 30: 5′-CGATCAACCCAGTTCTGGTCTTTGGTCC-3 ′ (SEQ ID NO: 33 in the sequence listing) and primer 2: 5′-ATACGCGTCACTACTACTTTGTTCTTGAACCTTCA-3 ′ (SEQ ID NO: 5 in the sequence listing). Then, double-stranded DNA encoding a C-terminal polypeptide having an amino acid substitution of F195L, K259E, and K270M in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 was obtained (C-terminal DNA). N-terminal DNA and C-terminal DNA are mixed, PCR is performed using primer 1 and primer 2 as a template.
  • Double-stranded DNA encoding the peptide was obtained. It was introduced into pUCN18 in the same manner as in Reference Example 2 to prepare pNKPm43. Using this pNKPm43, E. E. coli HB101 competent cells (manufactured by Takara Bio Inc.) to produce modified carbonyl reductase F195L-K259E-K270M E. coli HB101 (pNKPm43) was obtained.
  • Example 21 Production of Multiple Mutation Modified Carbonyl Reductase 15 Using the plasmid pNKPm37 obtained in Example 7 as a template, primer 1: 5′-GGGAATTCCATATGAGTGTTTTAGTTTACAGG-3 ′ (SEQ ID NO: 4 in the sequence listing), primer 31: 5′-CGTTGGAGCAAAACATCATTCCTTGATGATTTC-3 ′ (SEQ ID NO: 34 in the sequence listing) PCR was performed to obtain double-stranded DNA encoding an N-terminal polypeptide having an amino acid substitution of A220V in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 (N-terminal DNA).
  • Double-stranded DNA encoding the peptide was obtained. It was introduced into pUCN18 in the same manner as in Reference Example 2 to prepare pNKPm44. Using this pNKPm44, E. E. coli HB101 competent cells (manufactured by Takara Bio Inc.) to produce a modified carbonyl reductase A220V-K259E-K270M. E. coli HB101 (pNKPm44) was obtained.
  • Example 22 Production of Multiple Mutation Modified Carbonyl Reductase 16 Using the plasmid pNKPm37 obtained in Example 7 as a template, primer 1: 5′-GGGAATTCCATATGAGTGTTTTAGTTTACAGG-3 ′ (SEQ ID NO: 4 in the sequence listing), primer 33: 5′-CGTACCATCAACATAGTTACAAAAACAGATTTATC-3 ′ (SEQ ID NO: 36 in the sequence listing) PCR was performed to obtain double-stranded DNA encoding an N-terminal polypeptide having an amino acid substitution of S236N in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 (N-terminal DNA).
  • Example 23 Production of Multiple Mutation Modified Carbonyl Reductase 17 Using the plasmid pNKPm37 obtained in Example 7 as a template, primer 1: 5′-GGGAATTCCATATGAGTGTTTTAGTTTACAGG-3 ′ (SEQ ID NO: 4 in the sequence listing), primer 35: 5′-GCTACCATCACGTACCATCAATATACACTACAAAAAAC-3 ′ (SEQ ID NO: 38 in the sequence listing) PCR was carried out to obtain double-stranded DNA encoding an N-terminal polypeptide having an amino acid substitution of V238I in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 (N-terminal DNA).
  • primer 36 5′-GTTTTTGGTAGTTATATTGATGTACGTGATGTAGGC-3 ′ (SEQ ID NO: 39 in the sequence listing)
  • primer 2 5′-ATACGCGTCCGACTTACTATTGTTCTTGAACCTTCA-3 ′ (SEQ ID NO: 5 using the sequence listing)
  • C-terminal DNA double-stranded DNA encoding a C-terminal polypeptide having amino acid substitutions of V238I, K259E, and K270M in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 was obtained (C-terminal DNA).
  • N-terminal side DNA and C-terminal side DNA are mixed, PCR is performed using primer 1 and primer 2 as a template.
  • Example 24 Production of Multiple Mutation Modified Carbonyl Reductase 18 Using the plasmid pNKPm37 obtained in Example 7 as a template, primer 1: 5′-GGGAATTCCATATGAGTGTTTTAGTTTACAGG-3 ′ (SEQ ID NO: 4 in the sequence listing), primer 37: 5′-GATCACACTTTTACCGCTTAACTCATCATTATG-3 ′ (SEQ ID NO: 40 in the sequence listing) PCR was performed to obtain double-stranded DNA encoding an N-terminal polypeptide having an amino acid substitution of T257S in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 (N-terminal DNA).
  • primer 38 5′-CATAATGATGAGTTAAGCGGTAAAAGGTTGATC-3 ′
  • primer 2 5′-ATACGCGTCACTACTACTTTGTTCTTGAACCTTCA-3 ′
  • C-terminal DNA double-stranded DNA encoding a C-terminal polypeptide having an amino acid substitution of T257S, K259E, or K270M in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 was obtained (C-terminal DNA).
  • N-terminal DNA and C-terminal DNA are mixed, PCR is performed using primer 1 and primer 2 as a template.
  • Double-stranded DNA encoding the peptide was obtained. It was introduced into pUCN18 in the same manner as in Reference Example 2 to prepare pNKPm47. Using this pNKPm47, E. E. coli HB101 competent cell (manufactured by Takara Bio Inc.) to produce modified carbonyl reductase T257S-K259E-K270M E. coli HB101 (pNKPm47) was obtained.
  • Example 25 Production of Multiple Mutation Modified Carbonyl Reductase 19 Using the plasmid pNKPm37 obtained in Example 7 as a template, primer 1: 5′-GGGAATTCCATATGAGTGTTTTAGTTTACAGG-3 ′ (SEQ ID NO: 4 in the sequence listing), primer 39: 5′-GCATAGGTGAATGAAGCTTTTTGACAAGATCAACCTTTCACC-3 ′ (SEQ ID NO: 42 in the sequence listing) PCR was performed to obtain double-stranded DNA encoding an N-terminal polypeptide having amino acid substitutions of K259E and N265K in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 (N-terminal DNA).
  • N-terminal side DNA and C-terminal side DNA are mixed, PCR is performed using primer 1 and primer 2 as a template, and polymorphs having amino acid substitutions of K259E, N265K, and K270M among the amino acid sequences shown in SEQ ID NO: 1 Double-stranded DNA encoding the peptide was obtained. It was introduced into pUCN18 in the same manner as in Reference Example 2 to prepare pNKPm48. Using this pNKPm48, E. E. coli HB101 competent cells (manufactured by Takara Bio Inc.) to produce modified carbonyl reductase K259E-N265K-K270M E. coli HB101 (pNKPm48) was obtained.
  • Example 27 Production of Multiple Mutation Modified Carbonyl Reductase 21 Using the plasmid pNKPm37 obtained in Example 7 as a template, primer 1: 5′-GGGAATTCCATATGAGTGTTTTAGTTTACAGG-3 ′ (SEQ ID NO: 4 in the sequence listing), primer 43: 5′-CTTCTCGTTATGGACGCCACTCCCTTGAGGTACTACTCG-3 ′ (SEQ ID NO: 46 in the sequence listing) PCR was performed to obtain double-stranded DNA encoding an N-terminal polypeptide having an amino acid substitution of K259E, K270M, or R301C in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 (N-terminal DNA).
  • primer 44 5′-CGAGTTACCCTCAAGGAGGTTGCCGTCCATAACGAGAAG-3 ′ (SEQ ID NO: 47 in the sequence listing)
  • primer 2 5′-ATACGCGTCCGACTTACACTGTTTCTTTGAACCTTCA-3 ′ (SEQ ID NO: 5 in the sequence listing)
  • double-stranded DNA encoding a C-terminal polypeptide having an amino acid substitution of K259E, K270M, R301C in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 was obtained (C-terminal DNA).
  • N-terminal side DNA and C-terminal side DNA are mixed, PCR is performed using primer 1 and primer 2 as a template, and the amino acid sequence of K259E, K270M, R301C among the amino acid sequences shown in SEQ ID NO: 1 Double-stranded DNA encoding the peptide was obtained. It was introduced into pUCN18 in the same manner as in Reference Example 2 to prepare pNKPm50. Using this pNKPm50, E. E. coli HB101 competent cells (manufactured by Takara Bio Inc.) to produce modified carbonyl reductase K259E-K270M-R301C coli HB101 (pNKPm50) was obtained.
  • Example 28 Evaluation of Multiple Mutation Modified Carbonyl Reductase 2
  • E. coli HB101 pNKP
  • Table 7 shows the relative activities of the wild-type enzyme and the modified carbonyl reductase evaluated in the presence of 50% dimethylformamide.
  • the modified carbonyl reductase shown in Table 7 was more stable against organic solvents than the wild type enzyme.
  • Example 29 Preparation of Mutant Enzyme Library 2 Using the plasmid pNKPm37 containing the mutant RKP gene of K259E-K270M mutant enzyme obtained in Example 15 as a template, a mutant enzyme library was prepared in the same manner as in Example 1, and this was designated as mutant enzyme library 2.
  • modified carbonyl reductase 3 A modified carbonyl reductase having improved resistance to reaction inhibition by dimethylformamide, one of organic solvents, was selected from the mutant enzyme library 2. Recombinant bacteria of the mutant enzyme library 2 prepared in Example 29 and E. coli prepared in Reference Example 3. E. coli HB101 (pNKP) (control) was inoculated on LB plate medium containing 100 ⁇ g / mL ampicillin.
  • the nylon membrane was transferred to 30-60 in 50 mM 3- (N-morpholino) propansulfuric acid (MOPS) buffer containing 40% dimethylformamide. Dipped for a minute. The nylon membrane was then placed in 50 mM MOPS buffer containing 1 mM NADP + , 200 ⁇ M nitroblue tetrazolium, 10 ⁇ M 1-methyl-5-methylphenylsulfuric acid and 5% (v / v) 2-propanol at room temperature for 30 minutes. Soaked.
  • MOPS N-morpholino propansulfuric acid
  • the nylon membrane was washed with distilled water, and the stained colony was selected as a recombinant carbonyl reductase candidate having improved resistance to reaction inhibition by an organic solvent.
  • These candidate strains were inoculated into 5 ml of 2 ⁇ YT medium (tripton 1.6%, yeast extract 1.0%, sodium chloride 0.5%, pH 7.0) containing 200 ⁇ g / ml ampicillin and cultured for 20 hours. . The obtained culture broth was crushed and centrifuged, and the precipitate was removed to obtain a cell-free extract.
  • Dispense 200 ⁇ l of cell-free extract into a 96-well plate (manufactured by AGC Techno Glass), add 50 ⁇ l of 0.1 M phosphate buffer (pH 6.5) containing 0.625 mM NADPH and 10 mM 2,3-butanedione, and mix did.
  • the NADPH fluorescence was observed with a Benchmark Plus microplate spectrophotometer (manufactured by BIO-RAD) over time. Those having lost NADPH due to the reduction of 2,3-butanedione and having no fluorescence were selected as recombinant carbonyl reductase recombinant bacteria having further improved resistance to reaction inhibition by organic solvents.
  • a plasmid is extracted from the selected recombinant bacterial culture, and the base of the mutant RKP gene using BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems Japan) and Applied Biosystems 3130xl Genetic Analyzer (Applied Biosystems Japan) The sequence was determined and the mutation site was identified.
  • Table 8 shows the modified carbonyl enzymes with improved resistance to reaction inhibition by the organic solvent.
  • Example 31 Evaluation 3 of modified carbonyl reductase Recombinant bacteria of the modified carbonyl reductase obtained in Example 30 and the E. coli prepared in Reference Example 3.
  • E. coli HB101 (pNKP) (control) was cultured in the same manner as in Reference Example 4, respectively.
  • the microbial cell was collected by centrifugation and suspended in 100 mM phosphate buffer (pH 6.5) of 1/5 amount of the culture solution. This was crushed using a UH-50 ultrasonic homogenizer (manufactured by SMT), and then the cell residue was removed by centrifugation to obtain a cell-free extract.
  • Enzymes with improved resistance to reaction inhibition by the three types of organic solvents shown in Table 9 were obtained.
  • the modified carbonyl reductase shown in the table has improved resistance to reaction inhibition by dimethylformamide, which is one of organic solvents, compared to the wild-type enzyme.
  • Example 32 Production of 3-[(5R)-(4-fluoro-phenyl) -5-hydroxypentanoyl]-(4S) -phenyl-1,3-oxazolidine-2-one Obtained in Reference Example 4
  • 12.5 U of glucose dehydrogenase (trade name: GLUCDH “Amano” II, manufactured by Amano Enzyme), 80 mg of glucose, NADP + 0.6 mg, dimethylformamide or 300 ⁇ l of 0.1 M phosphate buffer (pH 7), (S) -1- (4

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Abstract

本発明の課題は、有機溶剤存在下で反応性が低下する野生型酵素を改変し、有機溶剤存在下での反応性が野生型酵素よりも向上した改変型カルボニル還元酵素および／または該酵素を生産する形質転換体を提供することである。本発明者らは、野生型酵素遺伝子にランダムに変異を導入して作製した変異型酵素ライブラリーの中から、有機溶剤存在下での反応性が野生型酵素よりも向上した改変型カルボニル還元酵素を見出し、本発明を完成するに至った。　

Description

改変型カルボニル還元酵素およびその遺伝子
本発明は、改変型カルボニル還元酵素、その遺伝子、その遺伝子を含むベクター、およびそのベクターで形質転換された形質転換体に関する。
医薬品や農薬の合成原料および中間体として有用な光学活性アルコールの製造方法の一つとして、カルボニル化合物のカルボニル基を微生物や酵素により不斉還元する方法が知られている。カルボニル化合物を還元する不斉酵素（以下、カルボニル還元酵素）は各種光学活性アルコールの製造において有用である。
カルボニル還元酵素を用いた不斉還元反応では、基質や生成物、ｐＨ調整に使用する酸やアルカリ、反応液性を改善するために添加される界面活性剤や有機溶剤などにより、酵素が失活されることや、酵素反応が阻害されることがある。したがって、有機溶剤等による酵素の失活や反応阻害を回避できるカルボニル還元酵素は、反応時間の短縮や反応収率の向上につながり、光学活性アルコールを工業的に生産する上でさらに有用となる。
例えば、ランダム変異導入による有機溶剤耐性の獲得が試みられており、２－プロパノールやジメチルスルホキシドに対する耐性を有する還元酵素が報告されている（特許文献１、非特許文献１）。
一方、工業的に有用性の高い有機溶剤である、ジメチルホルムアミドに対して耐性を有する酵素は少なく、実用レベルにジメチルホルムアミド耐性を獲得した還元酵素は報告されていないのが現状である。
特開２００９－２２５７７３号公報
ＣｈｅｍＳｕｓＣｈｅｍ，１，４３１－４３６（２００８）
例えばエゼチミブやモンテルカスト等、医薬品中間体の多くは、２－プロパノールやジメチルスルホキシドよりもジメチルホルムアミドへの溶解度が高い。このような化合物の生産にジメチルホルムアミド耐性酵素を用いることができれば、反応液性を改善でき、他の有機溶剤を使用した場合よりも高い生産性を期待できる。
そこで、本発明の課題は、ジメチルホルムアミド存在下で反応性が低下する野生型酵素を改変して、有機溶剤存在下での反応性が野生型酵素よりも向上した改変型カルボニル還元酵素および／または該酵素を生産する形質転換体を提供することである。
本発明者らは、野生型酵素遺伝子にランダムに変異を導入して作製した変異型酵素ライブラリーの中から、有機溶剤存在下での反応性が野生型酵素よりも向上した改変型カルボニル還元酵素を見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、以下の（ａ）～（ｃ）；
（ａ）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列と７８％以上の配列同一性を有し、
（ｂ）２－ペンタノンを還元して２－ペンタノールを生成し、かつ、
（ｃ）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるカルボニル還元酵素と比較して、有機溶剤存在下でカルボニル化合物に対する反応性が高い、および／または熱安定性が高い、
の性質を示すポリペプチドに関する。
前記有機溶剤がジメチルホルムアミドであることが好ましい。
配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列において次の群；
２番目、２２番目、２５番目、３９番目、４２番目、４５番目、５１番目、５６番目、７１番目、８７番目、９０番目、１０２番目、１０９番目、１２４番目、１３５番目、１３８番目、１５５番目、１５９番目、１７５番目、１７７番目、１８３番目、１９０番目、１９５番目、２１２番目、２２０番目、２２６番目、２２８番目、２３６番目、２３８番目、２５０番目、２５４番目、２５７番目、２５９番目、２６５番目、２６７番目、２７０番目、２７９番目、２９８番目、３００番目、３０１番目、および３３１番目から選択される１つ以上のアミノ酸に、アミノ酸置換が導入されていることが好ましい。
アミノ酸置換が、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列において次の群；
２番目がイソロイシン、２２番目がアルギニン、２５番目がフェニルアラニン、３９番目がアルギニン、４２番目がアルギニン、４５番目がアスパラギン酸、５１番目がアラニン、５６番目がリジン、７１番目がアスパラギンもしくはアルギニン、８７番目がイソロイシン、９０番目がグリシン、１０２番目がイソロイシン、１０９番目がグリシン、１２４番目がロイシン、１３５番目がアラニン、１３８番目がアスパラギン、１５５番目がロイシンもしくはアルギニン、１５９番目がフェニルアラニン、１７５番目がアスパラギン酸、１７７番目がフェニルアラニン、１８３番目がスレオニン、１９０番目がセリン、１９５番目がロイシン、２１２番目がフェニルアラニン、スレオニンもしくはチロシン、２２０番目がバリン、２２６番目がグリシン、２２８番目がバリン、２３６番目がアスパラギン、２３８番目がイソロイシン、２５０番目がプロリン、２５４番目がアスパラギン、２５７番目がセリン、２５９番目がグルタミン酸、２６５番目がリジン、２６７番目がプロリン、２７０番目がメチオニン、２７９番目がアルギニン、２９８番目がプロリン、３００番目がアスパラギン酸、３０１番目がシステイン、および、３３１番目がフェニルアラニンに置換されるアミノ酸置換、
から選択される１つ以上のアミノ酸置換であることが好ましい。
アミノ酸置換が、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列において次の群；
２番目がイソロイシン、４５番目がアスパラギン酸、７１番目がアスパラギンもしくはアルギニン、１０２番目がイソロイシン、１２４番目がロイシン、１７５番目がアスパラギン酸、１７７番目がフェニルアラニン、１８３番目がスレオニン、１９５番目がロイシン、２２０番目がバリン、２２６番目がグリシン、２３６番目がアスパラギン、２３８番目がイソロイシン、２５７番目がセリン、２５９番目がグルタミン酸、２６５番目がリジン、２６７番目がプロリン、２７０番目がメチオニン、３００番目がアスパラギン酸、および、３０１番目がシステインに置換されるアミノ酸置換、
から選択される１つ以上のアミノ酸置換であり、
配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるカルボニル還元酵素と比較して、有機溶剤に対する安定性が向上していることが好ましい。
アミノ酸置換が、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列において下記の（１）～（３５）；
（１）７１番目がアスパラギン、１９５番目がロイシン、
（２）７１番目がアルギニン、２５９番目がグルタミン酸、
（３）７１番目がアルギニン、２７０番目がメチオニン、
（４）７１番目がアルギニン、３００番目がアスパラギン酸、
（５）１０２番目がイソロイシン、２７０番目がメチオニン、
（６）１７７番目がフェニルアラニン、２２０番目がバリン、
（７）２２６番目がグリシン、２７０番目がメチオニン、
（８）２５７番目がセリン、２５９番目がグルタミン酸、
（９）２５７番目がセリン、２７０番目がメチオニン、
（１０）２５９番目がグルタミン酸、２７０番目がメチオニン、
（１１）２５９番目がグルタミン酸、３００番目がアスパラギン酸、
（１２）２６７番目がプロリン、２７０番目がメチオニン、
（１３）２７０番目がメチオニン、３００番目がアスパラギン酸、
（１４）２番目がイソロイシン、２５９番目がグルタミン酸、２７０番目がメチオニン、
（１５）４５番目がアスパラギン酸、１７５番目がアスパラギン酸、１８３番目がスレオニン、
（１６）１０２番目がイソロイシン、２２６番目がグリシン、２６７番目がプロリン、
（１７）１２４番目がロイシン、２５９番目がグルタミン酸、２７０番目がメチオニン、
（１８）１７７番目がフェニルアラニン、２５９番目がグルタミン酸、２７０番目がメチオニン、
（１９）２２０番目がバリン、２５９番目がグルタミン酸、２７０番目がメチオニン、
（２０）２３６番目がアスパラギン、２５９番目がグルタミン酸、２７０番目がメチオニン、
（２１）２３８番目がイソロイシン、２５９番目がグルタミン酸、２７０番目がメチオニン、
（２２）２５７番目がセリン、２５９番目がグルタミン酸、２７０番目がメチオニン、
（２３）２５７番目がセリン、２５９番目がグルタミン酸、３００番目がアスパラギン酸、
（２４）２５９番目がグルタミン酸、２６５番目がリジン、２７０番目がメチオニン、
（２５）２５９番目がグルタミン酸、２７０番目がメチオニン、３００番目がアスパラギン酸、
（２６）２５９番目がグルタミン酸、２７０番目がメチオニン、３０１番目がシステイン、
（２７）２番目がイソロイシン、２３８番目がイソロイシン、
（２８）７１番目がアスパラギン、１９５番目がロイシン、
（２９）１０９番目がグリシン、３３１番目がフェニルアラニン、
（３０）１２４番目がロイシン、２３６番目がアスパラギン、
（３１）１５９番目がフェニルアラニン、２５９番目がグルタミン酸、
（３２）４２番目がアルギニン、１５５番目がアルギニン、２７９番目がアルギニン、
（３３）４５番目がアスパラギン酸、１７５番目がアスパラギン酸、１８３番目がスレオニン、
（３４）１５５番目がロイシン、２５０番目がプロリン、２９８番目がプロリン、および
（３５）５６番目がリジン、１３８番目がアスパラギン、１９０番目がセリン、２５４番目がアスパラギンに置換されるアミノ酸置換、
から選択されるアミノ酸置換が導入されていることが好ましい。
アミノ酸置換が、次の群；
２２番目がアルギニン、３９番目がアルギニン、５１番目がアラニン、８７番目がイソロイシン、９０番目がグリシン、２５９番目がグルタミン酸、および、２７０番目がメチオニンに置換されるアミノ酸置換、
から選択される１つ以上のアミノ酸置換であり、
配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるカルボニル還元酵素と比較して、有機溶剤による反応阻害に対する抵抗性が向上していることが好ましい。
アミノ酸置換が、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列において下記の（１）～（７）；
（１）２２番目がアルギニン、
（２）２２番目がアルギニン、８７番目がイソロイシン、
（３）３９番目がアルギニン、
（４）３９番目がアルギニン、５１番目がアラニン、
（５）５１番目がアラニン、
（６）８７番目がイソロイシン、および
（７）９０番目がグリシンに置換されるアミノ酸置換、
から選択される1つ以上のアミノ酸置換であることが好ましい。
また、本発明は、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関する。
また、本発明は、前記ポリヌクレオチドを含むベクターに関する。
還元型補酵素再生能を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに含むことが好ましい。
還元型補酵素再生能を有するポリペプチドがグルコース脱水素酵素であることが好ましい。
また、本発明は、前記ベクターにより宿主細胞を形質転換して得られる形質転換体に関する。
前記宿主細胞が大腸菌であることが好ましい。
また、本発明は、前記ポリペプチド、または、前記形質転換体および／またはその処理物を、カルボニル化合物に作用させることを特徴とする、アルコール化合物の製造方法に関する。
前記カルボニル化合物が非対称ケトンであり、前記アルコール化合物が光学活性アルコールであることが好ましい。
前記カルボニル化合物が、下記式（１）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
 （式中、Ｒ１およびＲ２は水素原子、ハロゲン原子、置換されていても良いアルキル基、置換されていても良いアラルキル基、置換されていても良いアリール基、置換されていても良いアルコキシ基、アミノ基、またはニトロ基であるか、もしくは、Ｒ１とＲ２が互いに結合し環を形成しても良い。但し、Ｒ１とＲ２は構造が異なる）で表される非対称ケトンであり、
前記アルコール化合物が下記式（２）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
 （式中、Ｒ１、Ｒ２は前記と同じ、＊は不斉炭素を表す）で表される光学活性アルコールであること好ましい。
本発明により、有機溶剤存在下での反応性が野生型よりも向上した改変型カルボニル還元酵素およびその遺伝子、その遺伝子を含むベクター、そのベクターで形質転換された形質転換体、その形質転換体の処理物の製造方法を提供することができる。
本発明のポリペプチドは、以下の（ａ）～（ｃ）の性質を示すことを特徴とする；
（ａ）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列と７８％以上の配列同一性を有し、（ｂ）２－ペンタノンを還元して２－ペンタノールを生成し、かつ、（ｃ）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるカルボニル還元酵素と比較して、有機溶剤存在下でカルボニル化合物に対する反応性が高い、および／または熱安定性が高い。
［変異の記載方法］
なお、本明細書において、アミノ酸、ペプチド、タンパク質は下記に示すＩＵＰＡＣ－ＩＵＢ生化学命名委員会（ＣＢＮ）で採用された略号を用いて表される。また、特に明示しない限り、ペプチドおよびタンパク質のアミノ酸残基の配列は、左端から右端にかけてＮ末端からＣ末端となるように表される。また、参照を容易にするため、一般的に用いられている下記の命名法を適用する。１つは、“もとのアミノ酸；位置；置換したアミノ酸”と記述する方法であり、例えば、位置６４におけるチロシンのアスパラギン酸への置換は「Ｙ６４Ｄ」と表される。多重変異については、ハイフン記号“－”により分けることで表記する。例えば、「Ｓ４１Ａ－Ｙ６４Ｄ」とは、位置４１のセリンをアラニンへ、かつ、位置６４のチロシンをアスパラギン酸へ置換することを示す。
［アミノ酸の略号］
Ａ＝Ａｌａ＝アラニン、Ｃ＝Ｃｙｓ＝システイン、　
Ｄ＝Ａｓｐ＝アスパラギン酸、Ｅ＝Ｇｌｕ＝グルタミン酸、　
Ｆ＝Ｐｈｅ＝フェニルアラニン、Ｇ＝Ｇｌｙ＝グリシン、　
Ｈ＝Ｈｉｓ＝ヒスチジン、Ｉ＝Ｉｌｅ＝イソロイシン、　
Ｋ＝Ｌｙｓ＝リシン、Ｌ＝Ｌｅｕ＝ロイシン、　
Ｍ＝Ｍｅｔ＝メチオニン、Ｎ＝Ａｓｎ＝アスパラギン、　
Ｐ＝Ｐｒｏ＝プロリン、Ｑ＝Ｇｌｎ＝グルタミン、　
Ｒ＝Ａｒｇ＝アルギニン、Ｓ＝Ｓｅｒ＝セリン、　
Ｔ＝Ｔｈｒ＝スレオニン、Ｖ＝Ｖａｌ＝バリン、　
Ｗ＝Ｔｒｐ＝トリプトファン、Ｙ＝Ｔｙｒ＝チロシン　　
［配列同一性］
ポリペプチドやポリヌクレオチドの「配列同一性」とは、対比される２つのポリペプチドまたはポリヌクレオチドを最適に整列させ、アミノ酸または核酸塩基（例えば、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｕ、またはＩ）が両方の配列で一致した位置の数を比較塩基総数で除し、そして、この結果に１００を乗じた数値で表される。
配列同一性は、例えば、以下の配列分析用ツールを用いて算出し得る；ＧＣＧ　Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ　Ｐａｃｋａｇｅ（ウィスコンシン大学）、ｔｈｅ　ＥｘＰＡＳｙ　Ｗｏｒｌｄ　Ｗｉｄｅ　Ｗｅｂ分子生物学用サーバー（スイスバイオインフォマティックス研究所）、ＢＬＡＳＴ（米国生物工学情報センター）、ＧＥＮＥＴＹＸ（ゼネティックス社）。
本発明において、変異を導入する前の野生型酵素は、配列表の配列番号１で表される３３５個のアミノ酸残基からなり、２－ペンタノンを還元して２－ペンタノールを生成す能力を有するポリペプチドである。
ポリペプチドの起源は限定されるものではないが、好ましくはサッカロミセス科（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｔａｃｅａｅ）、より好ましくはヴァンデルワルトザイマ（Ｖａｎｄｅｒｗａｌｔｏｚｙｍａ）属に属する微生物、さらに好ましくはヴァンデルワルトザイマ・ポリスポラ（Ｖａｎｄｅｒｗａｌｔｏｚｙｍａ　ｐｏｌｙｓｐｏｒａ）種に属する微生物、特に好ましくはヴァンデルワルトザイマ・ポリスポラ（Ｖａｎｄｅｒｗａｌｔｏｚｙｍａ　ｐｏｌｙｓｐｏｒａ）ＮＢＲＣ０９９６株由来のカルボニル還元酵素である。当該微生物は、独立行政法人製品評価技術基盤機構バイオテクノロジー本部　生物遺伝資源部門（ＮＢＲＣ：〒２９２－０８１８　千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８）より入手することができる。
本発明の野生型酵素は、配列表の配列番号２に示されるポリヌクレオチドによりコードされる。例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　２ｎｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｊｏｓｅｐｈ　Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ（１９８９））等に記載される通常の遺伝子工学的手法に準じてサッカロミセス科、好ましくはヴァンデルワルトザイマ属、より好ましくはヴァンデルワルトザイマ・ポリスポラ（Ｖａｎｄｅｒｗａｌｔｏｚｙｍａ　ｐｏｌｙｓｐｏｒａ）種に属する微生物、さらに好ましくはヴァンデルワルトザイマ・ポリスポラ（Ｖａｎｄｅｒｗａｌｔｏｚｙｍａ　ｐｏｌｙｓｐｏｒａ）ＮＢＲＣ０９９６株から取得することができる。
即ち、ヴァンデルワルトザイマ・ポリスポラ（Ｖａｎｄｅｒｗａｌｔｏｚｙｍａ　ｐｏｌｙｓｐｏｒａ）ＮＢＲＣ０９９６株のゲノムＤＮＡから［参考例１］に記載の方法でＰＣＲを行うことにより、配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド、または配列番号２で示されるポリヌクレオチドを増幅して野生型酵素遺伝子を調製することができる。
本発明のポリペプチドは、配列番号１に示すアミノ酸配列に改変を加えて得られるものであっても良い。
配列番号１に示すアミノ酸配列に加える改変としては、置換、付加、挿入もしくは欠失が挙げられ、１種類の改変（例えば置換）のみを含むものであっても良いし、２種以上の改変（例えば、置換と挿入）を含んでいても良い。上記の「複数個のアミノ酸」とは、例えば、４０個、好ましくは２０個、より好ましくは１０個、さらに好ましくは８個、５個、４個、３個、または２個のアミノ酸を意味する。
また、改変を加えた後のアミノ酸配列と、配列番号１に示すアミノ酸配列との配列の同一性は８５％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９２％以上、さらに好ましくは９５％以上、９７％以上、９８％以上、９８．５％以上、９９％以上である。
配列表の配列番号１に示したアミノ酸配列において、アミノ酸が置換、挿入、欠失、付加される場所は特に制限されないが、好ましくは配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列のうち、２、２２、２５、３９、４２、４５、５１、５６、７１、８７、９０、１０２、１０９、１２４、１３５、１３８、１５５、１５９、１７５、１７７、１８３、１９０、１９５、２１２、２２０、２２６、２２８、２３６、２３８、２５０、２５４、２５７、２５９、２６５、２６７、２７０、２７９、２９８、３００、３０１、および３３１番目から選択される１つもしくは複数のアミノ酸置換が導入されているポリペプチドであることが好ましい。
さらに好ましくは、配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列において次の群；２番目がイソロイシン、２２番目がアルギニン、２５番目がフェニルアラニン、３９番目がアルギニン、４２番目がアルギニン、４５番目がアスパラギン酸、５１番目がアラニン、５６番目がリジン、７１番目がアスパラギンもしくはアルギニン、８７番目がイソロイシン、９０番目がグリシン、１０２番目がイソロイシン、１０９番目がグリシン、１２４番目がロイシン、１３５番目がアラニン、１３８番目がアスパラギン、１５５番目がロイシンもしくはアルギニン、１５９番目がフェニルアラニン、１７５番目がアスパラギン酸、１７７番目がフェニルアラニン、１８３番目がスレオニン、１９０番目がセリン、１９５番目がロイシン、２１２番目がフェニルアラニン、スレオニンもしくはチロシン、２２０番目がバリン、２２６番目がグリシン、２２８番目がバリン、２３６番目がアスパラギン、２３８番目がイソロイシン、２５０番目がプロリン、２５４番目がアスパラギン、２５７番目がセリン、２５９番目がグルタミン酸、２６５番目がリジン、２６７番目がプロリン、２７０番目がメチオニン、２７９番目がアルギニン、２９８番目がプロリン、３００番目がアスパラギン酸、３０１番目がシステイン、および３３１番目がフェニルアラニンに置換、から選択される１つ以上のアミノ酸に、アミノ酸置換が導入されているポリペプチドである。
また、本発明のポリペプチドは、有機溶剤に対する安定性の向上の観点から、配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列において次の群；２番目がイソロイシン、４５番目がアスパラギン酸、７１番目がアスパラギンもしくはアルギニン、１０２番目がイソロイシン、１２４番目がロイシン、１７５番目がアスパラギン酸、１７７番目がフェニルアラニン、１８３番目がスレオニン、１９５番目がロイシン、２２０番目がバリン、２２６番目がグリシン、２３６番目がアスパラギン、２３８番目がイソロイシン、２５７番目がセリン、２５９番目がグルタミン酸、２６５番目がリジン、２６７番目がプロリン、２７０番目がメチオニン、３００番目がアスパラギン酸、および３０１番目がシステインに置換、から選択される１つ以上のアミノ酸置換が導入されていることが好ましい。
さらに、下記の（１）～（３５）；　配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列において下記の（１）～（３５）；
（１）７１番目がアスパラギン、１９５番目がロイシン、
（２）７１番目がアルギニン、２５９番目がグルタミン酸、
（３）７１番目がアルギニン、２７０番目がメチオニン、
（４）７１番目がアルギニン、３００番目がアスパラギン酸、
（５）１０２番目がイソロイシン、２７０番目がメチオニン、
（６）１７７番目がフェニルアラニン、２２０番目がバリン、
（７）２２６番目がグリシン、２７０番目がメチオニン、
（８）２５７番目がセリン、２５９番目がグルタミン酸、
（９）２５７番目がセリン、２７０番目がメチオニン、
（１０）２５９番目がグルタミン酸、２７０番目がメチオニン、
（１１）２５９番目がグルタミン酸、３００番目がアスパラギン酸、
（１２）２６７番目がプロリン、２７０番目がメチオニン、
（１３）２７０番目がメチオニン、３００番目がアスパラギン酸、
（１４）２番目がイソロイシン、２５９番目がグルタミン酸、２７０番目がメチオニン、
（１５）４５番目がアスパラギン酸、１７５番目がアスパラギン酸、１８３番目がスレオニン、
（１６）１０２番目がイソロイシン、２２６番目がグリシン、２６７番目がプロリン、
（１７）１２４番目がロイシン、２５９番目がグルタミン酸、２７０番目がメチオニン、
（１８）１７７番目がフェニルアラニン、２５９番目がグルタミン酸、２７０番目がメチオニン、
（１９）２２０番目がバリン、２５９番目がグルタミン酸、２７０番目がメチオニン、
（２０）２３６番目がアスパラギン、２５９番目がグルタミン酸、２７０番目がメチオニン、
（２１）２３８番目がイソロイシン、２５９番目がグルタミン酸、２７０番目がメチオニン、
（２２）２５７番目がセリン、２５９番目がグルタミン酸、２７０番目がメチオニン、
（２３）２５７番目がセリン、２５９番目がグルタミン酸、３００番目がアスパラギン酸、
（２４）２５９番目がグルタミン酸、２６５番目がリジン、２７０番目がメチオニン、
（２５）２５９番目がグルタミン酸、２７０番目がメチオニン、３００番目がアスパラギン酸、
（２６）２５９番目がグルタミン酸、２７０番目がメチオニン、３０１番目がシステイン、
（２７）２番目がイソロイシン、２３８番目がイソロイシン、
（２８）７１番目がアスパラギン、１９５番目がロイシン、
（２９）１０９番目がグリシン、３３１番目がフェニルアラニン、
（３０）１２４番目がロイシン、２３６番目がアスパラギン、
（３１）１５９番目がフェニルアラニン、２５９番目がグルタミン酸、
（３２）４２番目がアルギニン、１５５番目がアルギニン、２７９番目がアルギニン、
（３３）４５番目がアスパラギン酸、１７５番目がアスパラギン酸、１８３番目がスレオニン、
（３４）１５５番目がロイシン、２５０番目がプロリン、２９８番目がプロリン、および
（３５）５６番目がリジン、１３８番目がアスパラギン、１９０番目がセリン、２５４番目がアスパラギンに置換されるアミノ酸置換
から選択されるアミノ酸置換が導入されているポリペプチドであることがより好ましい。
また、本発明のポリペプチドは、有機溶剤による反応阻害に対する抵抗性の向上の観点から、配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列のうち次の群；２２番目がアルギニン、３９番目がアルギニン、５１番目がアラニン、８７番目がイソロイシン、９０番目がグリシン、２５９番目がグルタミン酸、および２７０番目がメチオニンに置換されるアミノ酸置換、から選択される１つ以上のアミノ酸置換が導入されていることが好ましい。
さらに、配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列に下記の（１）～（７）；
（１）２２番目がアルギニン、
（２）２２番目がアルギニン、８７番目がイソロイシン、
（３）３９番目がアルギニン、
（４）３９番目がアルギニン、５１番目がアラニン、
（５）５１番目がアラニン、
（６）８７番目がイソロイシン、および
（７）９０番目がグリシンに置換されるアミノ酸置換
のいずれかで示されるアミノ酸置換が導入されていることがより好ましい。
有機溶剤としては、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、２－プロパノール、酢酸エチル、トルエン、メタノール、エタノール、ｎ－ブタノール、ヘキサン、アセトニトリル、酢酸プロピル、酢酸ブチル、アセトン、ジメトキシプロパン、ｔ－メチルブチルエーテル、ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル、ジオキサン、テトラヒドロフラン、ジメチルアセトアミド、ジグリム、エチレングリコール、ジメトキシエタン、四塩化炭素、塩化メチレン、エチルセロソルブ、酢酸セロソルブ、１，３－ジメチル－２－イミダゾリジノン、または、ヘキサメチルリン酸トリアミドなどであることが好ましく、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、２－プロパノール、酢酸エチル、トルエン、酢酸ブチル、または、１，３－ジメチル－２－イミダゾリジノンであることがより好ましく、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシドまたは２－プロパノールであることがさらに好ましい。
本発明の酵素は、有機溶剤存在下でもカルボニル化合物に対する反応性が高い。有機溶剤存在下とは、酵素を含む液体と有機溶剤が混合している状態でも良いが、酵素を含む液体と有機溶剤が不均一な状態でも良く、これを物理的に攪拌し、混合した状態でも良い。
「有機溶剤存在下で反応性の高い酵素」とは、配列表の配列番号１に記載の野生型酵素と比較して、前記有機溶剤存在下で一定時間処理した後、もしくは、前記有機溶剤存在下で２－ペンタノンに対する酵素の還元活性が高いことを示す。好ましくは有機溶剤に対する酵素の安定性が高い、もしくは有機溶剤による反応阻害に対する抵抗性が高い酵素である。
「有機溶剤に対する安定性が向上している」とは、具体的には、酵素を有機溶剤とインキュベートした後で、２－ペンタノンまたは２－ヘキサノンに対する残存活性を後述の実施例４または５に記載する方法で測定した場合に、野生型酵素と比較して残存活性が１％以上高いことであり、好ましくは５％以上、さらに好ましくは１０％以上、もっとも好ましくは２０％以上高いことをいう。
また、「有機溶剤による反応阻害に対する抵抗性が向上している」とは、具体的には、有機溶剤存在条件下での２－ヘキサノンに対する相対活性を後述の実施例３１に記載する方法で測定した場合に、野生型酵素と比較して相対活性が１％以上高いことであり、好ましくは５％以上、より好ましくは７％以上、さらに好ましくは１０％以上、最も好ましくは２０％以上高いことをいう。
有機溶剤に対する酵素の安定性は、例えば、以下の方法で評価できる。
［有機溶剤に対する酵素の安定性の評価方法］
酵素を含む無細胞抽出液に任意の濃度（例えば０．５％～５０％）の有機溶剤を含む緩衝液（好ましくはｐＨ５～８の０．０１～１Ｍリン酸緩衝液）を加えて任意の温度（例えば４～４０℃）でインキュベートする。有機溶剤と緩衝液が不均一な場合は振とう、または攪拌しながらインキュベートする。有機溶剤を非添加のサンプルと有機溶剤を添加した処理液を０．１～４８時間後にサンプリングし、それを０．１Ｍのリン酸カリウム水溶液（ｐＨ７．０）で希釈し、その希釈液を用いて下記の　［カルボニル化合物に対する還元能力の評価方法］で酵素の活性を測定する。相対活性は下記式で算出することができる。
相対活性（％）＝［溶剤添加条件での酵素活性］÷［溶剤非添加条件での酵素活性］×１００
配列表の配列番号１に記載のカルボニル還元酵素と比較して、有機溶剤に対する安定性が向上している改変型カルボニル還元酵素とは、上記の評価を行なった場合の残存活性が、野生型に比べて１％以上高い酵素であり、好ましくは５％以上、さらに好ましくは１０％以上、最も好ましくは２０％以上高い酵素である。
［カルボニル化合物に対する還元能力の評価方法］
１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５）にＮＡＤＰＨもしくは還元型ニコチンアミド・アデニンジヌクレオチド（以下、ＮＡＤＨ）０．２５ｍＭ、還元活性を評価したいカルボニル化合物（例えば２－ペンタノン、２－ヘキサノン、２，３－ブタンジオン）１～５０ｍＭおよび本発明のポリペプチドを含む反応液を３０℃で反応させ、ＮＡＤＰＨもしくはＮＡＤＨ量の減少に伴う波長３４０ｎｍの吸光度の減少を測定することにより、還元反応の進行を容易に評価することができる。吸光度が減少した場合、本発明のペプチドは評価対象のカルボニル化合物を還元する能力を有する、と判断することができる。なお、吸光度の減少速度が速いほど、評価対象のカルボニル化合物に対する還元能力が高いといえる。また、ポリペプチドの還元能力は数値化することも可能であり、還元活性１Ｕは１分間に１μｍｏｌのＮＡＤＰＨの消費を触媒する酵素量とした。
また、有機溶剤による反応阻害に対する抵抗性は、例えば、以下の方法のように決定することができる。
［有機溶剤による反応阻害に対する抵抗性の評価方法１］
１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５）にＮＡＤＰＨもしくは還元型ニコチンアミド・アデニンジヌクレオチド（以下、ＮＡＤＨ）３ｍＭ、還元活性を評価したいカルボニル化合物（例えば２－ペンタノン、２－ヘキサノン、２，３－ブタンジオン）１％、有機溶剤０．０１～６０％（ｖ／ｖ）または有機溶剤非添加、および本発明のポリペプチドを含む反応液を３０℃で０．０１～５時間反応させ、ガスクロマトグラフィーなどにより分析し、カルボニル化合物からアルコールへの変換率を求める。
相対活性は下記式で算出することができる。
相対活性（％）＝［有機溶剤存在下での変換率］÷［有機溶剤非存在下での変換率］×１００
本明細書中で、配列表の配列番号１に記載のカルボニル還元酵素と比較して、有機溶剤による反応阻害に対する抵抗性が向上している改変型カルボニル還元酵素とは、上記の評価を行った場合の残存活性が、野生型に比べて１％以上高いことであり、好ましくは５％以上、より好ましくは７％以上、さらに好ましくは１０％以上、最も好ましくは２０％以上高いことである。また、本発明の酵素は、配列表の配列番号１に記載のカルボニル還元酵素と比較して、熱安定性が高い。
本発明の改変型カルボニル還元酵素は、下記の方法により探索することができる。
エラープローンＰＣＲ法（Ｌｅｕｎｇ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ　１，　１１－１５（１９８９））、あるいは同様の原理に基づいたキットを用いて、配列表の配列番号２に示す塩基配列（野生型酵素遺伝子）に１つ以上の塩基配列の置換、挿入、欠失、付加が導入されたＤＮＡ断片を得ることができる。例えば、野生型酵素遺伝子をテンプレートにし、定法により、２４０番目のＴをＣに置換し、野生型酵素のアミノ酸配列を変えずにＮｄｅＩ認識部位を破壊できる（配列表の配列番号３）。これをテンプレートにプライマー１：５’－ＧＧＧＡＡＴＴＣＣＡＴＡＴＧＡＧＴＧＴＴＴＴＡＧＴＴＡＣＡＧＧ－３’（配列表の配列番号４）、およびプライマー２：５’－ＡＴＡＣＧＣＧＴＣＧＡＣＴＴＡＣＴＡＴＴＧＴＴＣＴＴＧＡＡＣＣＴＴＣＡ－３’（配列表の配列番号５）とＤｉｖｅｒｓｉｆｙ　ＰＣＲ　Ｒａｎｄｏｍ　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を用いて、野生型酵素をコードする遺伝子の全長にランダムに変異が導入され、かつ開始コドンにＮｄｅＩ認識部位が付加され、終始コドンの直後にＳａｌＩ認識部位が付加された複数種類の二本鎖ＤＮＡ（変異型酵素遺伝子）を得ることができる。この増幅断片をＮｄｅＩおよびＳａｌＩで消化し、プラスミドｐＵＣＮ１８（ＰＣＲ法によりｐＵＣ１８（タカラバイオ社製）の１８５番目のＴをＡに改変してＮｄｅＩサイトを破壊し、更に４７１－４７２番目のＧＣをＴＧに改変することにより新たにＮｄｅＩサイトを導入したプラスミド）のｌａｃプロモーターの下流のＮｄｅＩ認識部位とＳａｌＩ認識部位の間に挿入し、このプラスミドを用いてエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）ＨＢ１０１株（以下、Ｅ．ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１）を形質転換する。形質転換した大腸菌を１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢプレート培地に塗布し、シングルコロニーの大腸菌を得る。また、野生型遺伝子の代わりに前記方法で得られた変異型酵素遺伝子を用いて、同様の操作でさらに変異を導入した変異酵素ライブラリーを作製することもできる。
上記ライブラリーから、本発明の改変型カルボニル還元酵素を選抜することができる。選抜方法としては特に限定されないが、好ましくは下記の方法である。
［有機溶剤に対する安定性が向上した酵素のプレート評価による選抜法１］
変異酵素ライブラリーの各組換え菌および野生型酵素を生産する組換え菌（例えば、参考例３に示すＥ．ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１（ｐＮＫＰ））を適当な培地（例えば２００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む２×ＹＴ培地（トリプトン１．６％、イーストエキス１．０％、塩化ナトリウム　０．５％、ｐＨ７．０））に接種し、３７℃で２４時間振盪培養する。得られた各培養液を菌体破砕処理し、遠心分離後、沈殿を除去し、無細胞抽出液を得る。各酵素を含む無細胞抽出液に適当な濃度の有機溶剤（好ましくは終濃度１０～３０％のジメチルホルムアミド）を含む緩衝液（好ましくはｐＨ５～８の０．０１～１Ｍリン酸緩衝液）を加えて適当な温度（例えば４～４０℃）でインキュベートする。０．１～４８時間程度インキュベートした後、処理した各無細胞抽出液を９６穴プレート（ＡＧＣテクノグラス社製）に分注し、ＮＡＤＰＨ（好ましくは１．５ｍＭ）とカルボニル化合物（好ましくは１０ｍＭの２，３－ブタンジオン）を含むリン酸緩衝液（ｐＨ５～７）を加えて、１０～４０℃で反応する。経時的にＵＶサンプル撮影装置ＦＡＳ－ＩＩＩ（東洋紡績社製）でＮＡＤＰＨの蛍光を観察する。この時、反応が進行しない酵素液はＮＡＤＰＨの蛍光が残存するが、反応が進行した無細胞抽出液はＮＡＤＰＨの減少に伴い、蛍光がなくなる。対照である野生型酵素に比べ、短時間で蛍光がなくなった酵素を塩化物に対する安定性が向上した酵素として選抜した。選抜した酵素の培養液からプラスミドを抽出し、ＢｉｇＤｙｅ　Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　Ｋｉｔ（アプライドバイオシステムズジャパン社製）およびＡｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　３１３０ｘｌジェネティックアナライザ（アプライドバイオシステムズジャパン社製）を用いて改変型カルボニル還元酵素遺伝子の塩基配列を決定し、変異部位を特定することができる。
［有機溶剤に対する安定性が向上した酵素のプレート評価による選抜法２］
変異酵素ライブラリーの各組換え菌および野生型酵素を生産する菌（例えば、参考例３に示すＥ．ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１（ｐＮＫＰ））を適当な培地）を適当な寒天培地（例えば、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢプレート培地）に植菌し、３０℃で２４時間培養する。得られたコロニーをナイロン膜（ＢｉｏｄｙｎｅＡ、０．４５μｍ）に転写した後、そのナイロン膜を有機溶剤（好ましくは４０％のジメチルホルムアミド）を含むバッファー（好ましくは５０ｍＭの３－（Ｎ－ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ）ｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ　ａｃｉｄ（ＭＯＰＳ）バッファー中に０．１分～２４時間浸漬する。このバッファーは４０～８０℃に加温されていることが好ましい。その後、このナイロン膜をＮＡＤＰ＋（好ましくは１ｍＭ）、ｎｉｔｒｏｂｌｕｅ　ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ（好ましくは２００μＭ）、１－ｍｅｔｈｏｘｙ－５－ｍｅｔｈｙｌｐｈｅｎａｚｉｎｉｕｍ　ｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆａｔｅ（好ましくは１０μＭ）、２－プロパノール（例えば０．１～５０％）を含むバッファー（好ましくは５０ｍＭの３－（Ｎ－ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ）ｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ　ａｃｉｄ（ＭＯＰＳ）バッファー）中に適当な温度（例えば４～４０℃）で０．１分～２４時間浸漬する。その後、ナイロン膜を蒸留水で洗浄し、４染色されたコロニーを有機溶剤に対する安定性が向上した改変型カルボニル還元酵素の組換え菌として選抜することができる。
これらの組換え菌を適当な液体培地（例えば、２００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む２×ＹＴ培地（トリプトン１．６％、イーストエキス１．０％、塩化ナトリウム　０．５％、ｐＨ７．０）に接種し、３７℃で２０時間振盪培養する。得られた各培養液について、遠心分離により菌体を集め、バッファー（好ましくは５０ｍＭの３－（Ｎ－ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ）ｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ　ａｃｉｄ（ＭＯＰＳ）バッファー）に懸濁する。これをＵＨ－５０型超音波ホモゲナイザー（ＳＭＴ社製）を用いて破砕した後、遠心分離により菌体残渣を除去し、無細胞抽出液を得る。
バッファー（好ましくは５０ｍＭの３－（Ｎ－ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ）ｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ　ａｃｉｄ（ＭＯＰＳ）バッファー）とジメチルホルムアミドの混合液を、ジメチルホルムアミドの終濃度が好ましくは０．１～６０％になるように各無細胞抽出液に加え、加温（好ましくは４０～８０℃で０．１分～２４時間）したのち、氷冷する。これに、ＮＡＤＰ＋（好ましくは１ｍＭ）、ｎｉｔｒｏｂｌｕｅ　ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ（好ましくは２００μＭ）、１－ｍｅｔｈｏｘｙ－５－ｍｅｔｈｙｌｐｈｅｎａｚｉｎｉｕｍ　ｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆａｔｅ（好ましくは１０μＭ）、２－プロパノール（例えば０．１～５０％）を含むバッファー（好ましくは５０ｍＭの３－（Ｎ－ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ）ｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ　ａｃｉｄ（ＭＯＰＳ）バッファー）を混合し、９６穴プレート（ＡＧＣテクノグラス社製）に移して観察する。染色されたものを有機溶剤に対する安定性がより向上した改変型カルボニル還元酵素として選抜することができる。
選抜した組換え菌の培養液からプラスミドを抽出し、ＢｉｇＤｙｅ　Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　Ｋｉｔ（アプライドバイオシステムズジャパン社製）およびＡｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　３１３０ｘｌジェネティックアナライザ（アプライドバイオシステムズジャパン社製）を用いて変異型ＲＫＰ遺伝子の塩基配列を決定し、変異部位を特定することができる。
［有機溶剤による反応阻害に対する抵抗性が向上した酵素のプレート評価による選抜法］
変異酵素ライブラリーの各組換え菌および野生型酵素を生産する菌（例えば、参考例３に示すＥ．ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１（ｐＮＫＰ））を適当な寒天培地（例えば、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢプレート培地）に植菌し、３０℃で２４時間培養する。得られたコロニーをナイロン膜（ＢｉｏｄｙｎｅＡ、０．４５μｍ）に転写した後、ＮＡＤＰ＋（好ましくは１ｍＭ）、ｎｉｔｒｏｂｌｕｅ　ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ（好ましくは２００μＭ）、１－ｍｅｔｈｏｘｙ－５－ｍｅｔｈｙｌｐｈｅｎａｚｉｎｉｕｍ　ｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆａｔｅ（好ましくは１０μＭ）、２－プロパノール（例えば０．１～５０％）と有機溶剤（好ましくは０．１～８０％のジメチルホルムアミド）含むバッファー（好ましくは５０ｍＭの３－（Ｎ－ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ）ｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ　ａｃｉｄ（ＭＯＰＳ）バッファー）中に適当な温度（例えば４～４０℃）で０．１分～１０時間浸漬する。その後、ナイロン膜を蒸留水で洗浄し、染色されたコロニーを有機溶剤による反応阻害に対する抵抗性が向上した改変型カルボニル還元酵素の組換え菌の候補として選抜することができる。
これらの組換え菌を適当な液体培地（例えば、２００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む２×ＹＴ培地（トリプトン１．６％、イーストエキス１．０％、塩化ナトリウム０．５％、ｐＨ７．０））に接種し、３７℃で２０時間振盪培養する。得られた各培養液を菌体破砕処理し、遠心分離後、沈殿を除去し、無細胞抽出液を得る。無細胞抽出液にＮＡＤＰＨ（好ましくは０．６２５Ｍ）、カルボニル化合物（好ましくは１０ｍＭの２，３－ブタンジオン）、有機溶剤（好ましくは０．１～８０％のジメチルホルムアミド）を溶解したバッファー（好ましくは０．１Ｍのリン酸バッファー（ｐＨ６．５））を混合する。これを９６穴プレート（アサヒテクノグラス社製）に分注し、継時的にＢｅｎｃｈｍａｒｋ　Ｐｌｕｓ　ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ　ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（ＢＩＯ－ＲＡＤ社製）でＮＡＤＰＨの蛍光を観察する。反応が進行しない酵素液はＮＡＤＰＨの蛍光が残存するが、反応が進行した無細胞抽出液はＮＡＤＰＨの減少に伴い、蛍光が無くなる。カルボニル化合物の還元によってＮＡＤＰＨが消費され、短時間で蛍光がなくなったものを有機溶剤に対する反応阻害に対する抵抗性がさらに向上した改変型カルボニル還元酵素の組換え菌として選抜する。
選抜した組換え菌の培養液からプラスミドを抽出し、ＢｉｇＤｙｅ　Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　Ｋｉｔ（アプライドバイオシステムズジャパン社製）およびＡｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　３１３０ｘｌジェネティックアナライザ（アプライドバイオシステムズジャパン社製）を用いて変異型ＲＫＰ遺伝子の塩基配列を決定し、変異部位を特定することができる。
有機溶剤存在下でカルボニル化合物に対する反応性を高めることのできる、および／または熱安定性を高めることのできる複数の変異を、部位特異的変異導入によって組み合わせることによって、複数の変異の性質を併せ持つ改変型カルボニル還元酵素を作製できる。
本発明のポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチドをコードするものであれば特に限定されないが、例えば、配列表の配列番号２に示した野生型酵素をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチド、またはこれに改変を加えて得られるポリペプチドが挙げられる。
野生型酵素遺伝子の改変方法としては、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ　Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｇｒｅｅｎｅ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ　ａｎｄ　Ｗｉｌｅｙ－Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（１９８９））等に記載の公知の方法を用いることができる。すなわち、野生型酵素遺伝子の塩基の１個、または複数個（例えば、４０個、好ましくは２０個、より好ましくは１０個、さらに好ましくは５個、４個、３個、または２個の塩基）を置換、付加、挿入もしくは欠失することにより、野生型酵素のアミノ酸配列を改変したポリヌクレオチドを作製することができる。例えば、エラープローンＰＣＲ法（Ｌｅｕｎｇ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ　１，　１１－１５（１９８９））などのＰＣＲを用いた変異導入法や、あるいは市販のキットＤｉｖｅｒｓｉｆｙ　ＰＣＲ　Ｒａｎｄｏｍ　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）、Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｒ　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）、ＥＸＯＩＩＩ／Ｍｕｎｇ　Ｂｅａｎ　Ｄｅｌｅｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ　Ｓｉｔｅ　Ｄｉｒｅｃｔｅｄ　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）などの利用が挙げられる。
ポリヌクレオチドを部位特異的変異導入法により作製する場合、部位特異的変異導入法としては、例えば、Ｏｌｆｅｒｔ　Ｌａｎｄｔら（Ｇｅｎｅ，　９６，　１２５－１２８　（１９９０））、Ｓｍｉｔｈら（Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，　３，１，　Ｓｅｔｌｏｗ，Ｊ．　Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｒｅｓｓ）、Ｖｌａｓｕｋら（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｇｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，　Ｉｎｏｕｙｅ，Ｍ．　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ）、Ｈｏｓ．Ｎ．Ｈｕｎｔら（Ｇｅｎｅ，７７，５１　（１９８９））の方法やＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ　ＩＩ　Ｋｉｔ（ストラタジーン社製）の市販キットの利用等があげられる。なお、２箇所に変異を導入する場合には上記方法に準じた方法を２回繰り返すことにより、目的とする本発明ポリヌクレオチドを得ることができる。尚、複数の他のポジションが他のアミノ酸で置換されている場合も当該方法により、目的とする本発明ポリヌクレオチドを得ることができる。　
本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとしては、例えば、２－ペンタノンを還元して２－ペンタノールを生成する活性を有し、配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列からなるカルボニル還元酵素と比較して、有機溶剤存在下でカルボニル化合物に対する反応性が高いポリペプチドをコードし、かつ、配列表の配列番号２に示した塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドが好ましい。
ここで、「配列表の配列番号２に示したポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド」とは、配列表の配列番号２に示した塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドをプローブとして、ストリンジェントな条件下にコロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法、あるいはサザンハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるポリヌクレオチドを意味する。
ハイブリダイゼーションは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　２ｎｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｊｏｓｅｐｈ　Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ（１９８９））等に記載されている方法に準じて行うことができる。ここで、「ストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド」とは、例えば、コロニーあるいはプラーク由来のポリヌクレオチドを固定化したフィルターを用いて、０．７～１．０Ｍの塩化ナトリウム存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、３倍濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウムよりなる）を用い、６５℃の条件下でフィルターを洗浄することにより取得できるＤＮＡをあげることができる。より好ましくは６５℃で１倍濃度のＳＳＣ溶液で洗浄、さらに好ましくは６５℃で０．７倍濃度のＳＳＣ溶液で洗浄、更に好ましくは６５℃で０．５倍、０．４５倍、０．２５倍、０．２倍、０．１５倍濃度のＳＳＣ溶液で洗浄することにより取得できるポリヌクレオチドである。
以上のようにハイブリダイゼーション条件を記載したが、これらの条件に特に制限されない。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度や塩濃度など複数の要素が考えられ、当業者であればこれら要素を適宜選択することで最適なストリンジェンシーを実現することが可能である。
上記の条件にてハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドとしては、配列番号２に示されるポリヌクレオチドとの配列同一性が、好ましくは７８％以上、より好ましくは８４％以上、さらに好ましくは８７％以上、さらに好ましくは８９％、９０％、９４％、９５％、９７％以上のポリヌクレオチドを挙げることができ、コードされるポリペプチドが、本発明のポリペプチドの性質を有する限り、上記ポリヌクレオチドに包含される。
本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを発現ベクターに挿入することにより、ポリペプチド発現ベクターを作製できる。
上記で用いる発現ベクターとしては、適当な宿主生物内で当該ポリヌクレオチドがコードするポリペプチドを発現できるものであれば、特に限定されない。このようなベクターとしては、例えば、プラスミドベクター、ファージベクター、コスミドベクターなどが挙げられ、さらに、他の宿主株との間での遺伝子交換が可能なシャトルベクターも使用できる。
このようなベクターは、例えば大腸菌の場合では、通常、ｌａｃＵＶ５プロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｌｐｐプロモーター、ｔｕｆＢプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、ｐＬプロモーター等の制御因子を含み、本発明のＤＮＡと作動可能に連結された発現単位を含む発現ベクターとして好適に使用できる。例えば、ｐＵＣＮ１８（参考例２参照）、ｐＳＴＶ２８（タカラバイオ社製）、ｐＵＣＮＴ（国際公開第９４／０３６１３号）などが挙げられる。
本明細書で用いる用語「制御因子」は、機能的プロモーターおよび、任意の関連する転写要素（例えばエンハンサー、ＣＣＡＡＴボックス、ＴＡＴＡボックス、ＳＰＩ部位など）を有する塩基配列をいう。
本明細書で用いる用語「作動可能に連結」は、遺伝子の発現を調節するプロモーター、エンハンサー等の種々の調節エレメントと遺伝子が、宿主細胞中で作動し得る状態で連結されることをいう。制御因子のタイプおよび種類が、宿主に応じて変わり得ることは、当業者に周知の事項である。
各種生物において利用可能なベクター、プロモーターなどに関して微生物学基礎講座（８、安藤忠彦、共立出版、（１９８７））などに詳細に記述されている。
ベクターは、還元型補酵素再生能を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに含んでいても良い。還元型補酵素再生能を有するポリペプチドとしては、例えば、グルコース脱水素酵素が挙げられる。
ベクターにより宿主細胞を形質転換することにより、形質転換体を得ることができる。或いは、形質転換体として、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを染色体中に導入して得られる形質転換体も挙げられる。
ベクターにより形質転換するための宿主細胞としては、各ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むポリペプチド発現ベクターにより形質転換され、導入したポリヌクレオチドがコードするポリペプチドを発現することができる細胞であれば、特に制限されない。宿主細胞として利用可能な微生物としては、例えば、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、コリネバクテリイウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、およびラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属など宿主ベクター系の開発されている細菌、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属およびストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属など宿主ベクター系の開発されている放線菌、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、クライベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属、シゾサッカロマイセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、チゴサッカロマイセス（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）属、ロドスポリジウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、およびキャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属などの宿主ベクター系の開発されている酵母、ノイロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、セファロスポリウム（Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ）属、およびトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属などの宿主ベクター系の開発されているカビ、などが挙げられる。また、微生物以外でも、植物、動物において様々な宿主・ベクター系が開発されており、特に蚕を用いた昆虫（Ｎａｔｕｒｅ，３１５，５９２－５９４（１９８５））や菜種、トウモロコシ、ジャガイモなどの植物中に大量に異種タンパク質を発現させる系が開発されており、好適に利用できる。これらのうち、導入および発現効率から細菌が好ましく、大腸菌が特に好ましい。
本発明のベクターは、公知の方法により宿主微生物に導入できる。例えば、ポリペプチド発現ベクターとして前記の発現ベクターｐＵＣＮ１８に改変型カルボニル還元酵素をコードするポリヌクレオチドを導入した本発明のプラスミド（実施例２～３、６～１５、１７～２７、３０に示すｐＮＫＰｍ０１～５３）を、宿主微生物として大腸菌を用いる場合は、市販のＥ．ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１コンピテントセル（タカラバイオ社製）などを用いて、そのプロトコールに従って操作することにより、当該ベクターを宿主細胞に導入した形質転換体（例えば、実施例２７に示すＥ．ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１（ｐＮＫＰｍ５０））が得られる。
また、本発明のポリペプチドおよび後述する還元型補酵素再生能を有するポリペプチドの両ポリペプチドを、同一菌体内で発現させた形質転換体も育種することができる。すなわち、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドおよび還元型補酵素再生能を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、同一のベクターに組み込み、これを宿主細胞に導入することにより得られる他、これら２種類のＤＮＡを不和合性グループの異なる２種のベクターにそれぞれ組み込み、それらを同一の宿主細胞に導入することによっても得られ得る。
このようにして得られる形質転換体としては、例えば、改変型カルボニル還元酵素をコードするヌクレオチドを前記の発現ベクターｐＵＣＮ１８に導入した組換えベクター（例えば、実施例２に示したｐＮＫＰｍ０１）と還元型補酵素再生能を有するポリペプチドであるグルコース脱水素酵素をコードするポリヌクレオチドを含むベクター、Ｅ．ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１コンピテントセル（タカラバイオ社製）に導入した形質転換体などが挙げられる。
本発明のポリペプチドもしくは形質転換体および／またはその処理物を、カルボニル化合物に作用させることにより、アルコール化合物を製造することができる。
基質となるカルボニル化合物は特に制限されない。カルボニル化合物の中でも、非対称ケトンは、その還元産物が有用な光学活性アルコールとなるため、好ましい。
前記カルボニル基を有する化合物としては、例えば、下記式（１）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
 （式中、Ｒ１およびＲ２は水素原子、ハロゲン原子、置換されていても良いアルキル基、置換されていても良いアラルキル基、置換されていても良いアリール基、置換されていても良いアルコキシ基、アミノ基、またはニトロ基であるか、もしくは、Ｒ１とＲ２が互いに結合し環を形成しても良い。但し、Ｒ１とＲ２は構造が異なる）で表される非対称ケトンが挙げられ、その生成物としては、例えば、下記式（２）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
 （式中、Ｒ１、Ｒ２は前記と同じ、＊は不斉炭素を表す）で表される光学活性アルコールが挙げられる。
前記Ｒ１、Ｒ２は炭素数１～１４のアルキル基、炭素数６～１４のアリール基、炭素数４～１４のヘテロアリール基、炭素数１～５のアルコキシ基、炭素数２～５のアルコキシカルボキシル基、炭素数１～５の直鎖もしくは分岐鎖アルキル基、炭素数２～５のアルケニル基、炭素数５～１０のシクロアルキル基、炭素数４～９のヘテロシクロアルキル基、カルボキシル基、水素原子、ハロゲン原子、ヒドロキシル基、アミノ基、またはニトロ基が好ましい。
なお、上記で言う置換されていても良いとは、置換基を有していても良いという意味であり、置換基として、ハロゲン原子、ヒドロキシル基、カルボキシル基、アミノ基、シアノ基、ニトロ基、アルキル基、アリール基、アラルキル基、またはアルコキシ基などが挙げられる。また、ハロゲン原子として、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子などが挙げられる。
具体的なカルボニル化合物として、２－ペンタノン、２－ヘキサノン、２，３－ブタンジオン、アセトフェノン、（Ｓ）－１－（４－フルオロ－フェニル）－５－（２－オキソ－４－フェニル－オキサゾリジン－３－イル）－ペンタン－１，５－ジオン、プロピオフェノン、ｎ－ブチロフェノン、バレロフェノン、ヘキサノフェノン、１－フェニル－２－ブタノン、ベンジルアセトン、２，５－ヘキサンジオン、２，３－ヘキサンジオン、３，４－ヘキサンジオン、フェノキシ―２－プロパノンが挙げられる。
本発明のポリペプチドを使用して生産されるアルコール化合物として、２－ペンタノール、２－ヘキサノール、２，３－ブタンジオール、３－ヒドロキシ－２－ブタノン、１－フェニルエチルアルコール、［３－［（５Ｒ）－（４－フルオロ－フェニル）－５－ヒドロキシペンタノイル］－（４Ｓ）－フェニル－１，３－オキサゾリジン－２－オン、１－フェニル－１－プロパノール、１－フェニル－１－ブタノール、１－フェニル－１－ペンタノール、１－フェニル－１－ヘキサノール、１－フェニル－２－ブタノール、４－フェニル－２－ブタノール、２，５－ヘキサンジオール、５－ヒドロキシ－２－ヘキサノン、２，３－ヘキサンジオール、２－ヒドロキシヘキサン－３－オン、３－ヒドロキシ－２－ヘキサノン、３，４－ヘキサンジオール、４－ヒドロキシ－３－ヘキサノン、１－フェノキシ－２－プロパノールが挙げられる。
本発明のポリペプチドもしくは本発明のポリペプチドを発現させた形質転換体および／またはその処理物を用いて、前記カルボニル基を有する化合物を還元してアルコールを製造する場合、以下のように実施され得る。但し、以下の方法に限定されるわけではない。
適当な溶媒（例えば１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）など）、カルボニル化合物である基質（例えば、２－ペンタノンもしくはアセトフェノン）を加え、ＮＡＤＰＨや酸化型ニコチンアミド・アデニンジヌクレオチドリン酸（以下、ＮＡＤＰ＋）等の補酵素、および該形質転換体の培養物および／またはその処理物などを添加し、ｐＨ調整下、攪拌して反応させる。
ここで、処理物とは、例えば、粗抽出液、培養菌体、凍結乾燥生物体、アセトン乾燥生物体、菌体破砕物、またはそれらの固定化物等で、該ポリペプチドの酵素触媒活性が残存している物を意味する。
反応温度は５～８０℃であることが好ましく、１０～６０℃であることがより好ましく、２０～４０℃であることがさらに好ましい。反応液のｐＨは３～１０であることが好ましく、ｐＨ４～９であることがより好ましく、ｐＨ５～８であることがさらに好ましい。反応はバッチ式あるいは連続方式で行われ得る。バッチ方式の場合は、反応基質は０．０１～１００％（ｗ／ｖ）、好ましくは０．１～７０％（ｗ／ｖ）、より好ましくは０．５～５０％（ｗ／ｖ）の仕込み濃度で添加されうる。また、反応の途中で新たに基質を追加添加しても良い。
また、反応には水系溶媒を用いても良いし、水系の溶媒と有機系の溶媒とを混合して用いても良い。有機系溶媒としては、例えばジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、２－プロパノール、酢酸エチル、トルエン、メタノール、エタノール、ｎ－ブタノール、ヘキサン、アセトニトリル、酢酸プロピル、酢酸ブチル、アセトン、ジメトキシプロパン、ｔ－メチルブチルエーテル、ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル、ジオキサン、テトラヒドロフラン、ジメチルアセトアミド、ジグリム、エチレングリコール、ジメトキシエタン、四塩化炭素、塩化メチレン、エチルセロソルブ、酢酸セロソルブ、１，３－ジメチル－２－イミダゾリジノン、ヘキサメチルリン酸トリアミド等が挙げられる。反応系に含まれる有機系溶媒の濃度は、特に限定されないが、好ましくは１～９５％、より好ましくは５～９０％、さらに好ましくは１０～８０％である。
ここで形質転換体の処理物等とは、例えば、無細胞抽出液、培養菌体、凍結乾燥菌体、アセトン乾燥菌体、あるいはそれらの磨砕物、これらの混合物などを意味する。更にそれらは、ポリペプチド自体あるいは菌体のまま公知の手段で固定化されて用いられ得る。　　　　
また、反応を行う際に、本発明のポリペプチド、および還元型補酵素再生能を有するポリペプチドの両者を生産する形質転換体を用いれば、補酵素の使用量を大幅に減らすことが可能となる。還元型補酵素再生能を有するポリペプチドについて、次に詳述する。
本発明のポリペプチドの生産能を有する形質転換体を用いて、カルボニル化合物を還元してアルコール化合物を合成する場合、補酵素としてＮＡＤＰＨもしくはＮＡＤＨが必要となる。上記のように、反応系にＮＡＤＰＨもしくはＮＡＤＨを必要な量だけ添加しても還元反応を実施しうる。しかし、酸化された該補酵素（ＮＡＤＰ＋やＮＡＤ＋）を還元型ＮＡＤＰＨやＮＡＤＨに変換する能力（以後還元型補酵素再生能力と呼ぶ）を有する酵素とその基質からなる補酵素再生系を、本発明のポリペプチドと組み合わせて反応を行うことにより、高価な補酵素の使用量を大幅に削減することができる。還元型補酵素再生能力を有する酵素としては、ヒドロゲナーゼ、ギ酸脱水素酵素、カルボニル還元酵素、グルコース－６－リン酸脱水素酵素およびグルコース脱水素酵素等を用いることができる。好適には、グルコース脱水素酵素が用いられる。
このような反応は、補酵素再生系を不斉還元反応系内に添加することによっても行われ得るが、本発明の酵素をコードするポリヌクレオチドおよび還元型補酵素再生能を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの両者により形質転換された形質転換体を触媒とした場合は、還元型補酵素再生能を有する酵素を別に調製し反応系内に添加しなくても、効率的に反応を行うことができる。このような形質転換体は、先述の形質転換体の作製方法により得られる。
反応後の反応液からのアルコールの回収方法は特に限定されないが、反応液から直接、または必要に応じて菌体等を分離後、酢酸エチル、トルエン、ｔ－ブチルメチルエーテル、ヘキサン、塩化メチレン等の溶剤で抽出し、脱水後、蒸留、再結晶あるいはシリカゲルカラムクロマトグラフィー等により精製することができる。この方法により高純度のアルコール化合物を容易に得ることができる。
以下、実施例で本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらにより限定されるものではない。なお、以下の実施例において用いた組み換えＤＮＡ技術に関する詳細な操作方法などは、次の成書に記載されている：
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　２ｎｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｊｏｓｅｐｈ　Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ（１９８９））、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ　Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｇｒｅｅｎｅ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ　ａｎｄ　Ｗｉｌｅｙ－Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（１９８９））。
（参考例１）ヴァンデルワルトザイマ・ポリスポラ（Ｖａｎｄｅｒｗａｌｔｏｚｙｍａ　ｐｏｌｙｓｐｏｒａ）ＮＢＲＣ０９９６株由来カルボニル化合物還元活性を有するポリペプチド（野生型酵素）をコードするＤＮＡの取得
ヴァンデルワルトザイマ・ポリスポラ（Ｖａｎｄｅｒｗａｌｔｏｚｙｍａ　ｐｏｌｙｓｐｏｒａ）ＮＢＲＣ０９９６株よりカルボニル化合物に対する還元活性を有するポリペプチド（以下、本ポリペプチドをＲＫＰと呼ぶ）をコードするＤＮＡをＰＣＲにより取得した。
［ヴァンデルワルトザイマ・ポリスポラ　ＮＢＲＣ０９９６株の染色体ＤＮＡの調製］
５００ｍｌ容坂口フラスコに、バクトトリプトン１６ｇ、酵母エキス１０ｇ、塩化ナトリウム５ｇ、アデカノールＬＧ－１０９（日油社製）０．１ｇ（いずれも１Ｌ当たり）の組成からなる液体培地（ｐＨ７）５０ｍｌを調製し、１２０℃で２０分間蒸気殺菌をおこなった。この培地に、予め同培地にて前培養しておいたヴァンデルワルトザイマ・ポリスポラ（Ｖａｎｄｅｒｗａｌｔｏｚｙｍａ　ｐｏｌｙｓｐｏｒａ）ＮＢＲＣ０９９６株の培養液を５ｍｌ接種し、３０℃で１８時間振盪しながら培養を行った。この培養液から、Ｍｕｒｒａｙ等の方法（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．８，４３２１（１９８０））に記載の方法に従って染色体ＤＮＡを抽出した。
［ＰＣＲ反応］
プライマー１：５’－ＧＧＧＡＡＴＴＣＣＡＴＡＴＧＡＧＴＧＴＴＴＴＡＧＴＴＡＣＡＧＧ－３’（配列表の配列番号４）、プライマー２：５’－ＡＴＡＣＧＣＧＴＣＧＡＣＴＴＡＣＴＡＴＴＧＴＴＣＴＴＧＡＡＣＣＴＴＣＡ－３’（配列表の配列番号５）を用いて、ヴァンデルワルトザイマ・ポリスポラ（Ｖａｎｄｅｒｗａｌｔｏｚｙｍａ　ｐｏｌｙｓｐｏｒａ）ＮＢＲＣ０９９６株の染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。
その結果、配列表の配列番号２に示す塩基配列からなる遺伝子の開始コドン部分にＮｄｅＩ認識部位が付加され、かつ終始コドンの直後にＳａｌＩ認識部位が付加された二本鎖ＤＮＡ（ＲＫＰ遺伝子）が得られた。これを鋳型にさらにＰＣＲ反応を行い、定法により２４０番目のＴをＣに改変した。これによりこの遺伝子がコードするＲＫＰ酵素のアミノ酸配列は変わらずに、遺伝子中のＮｄｅＩ認識部位が破壊された配列表の配列番号３に示す塩基配列からなる二本鎖ＤＮＡ（ＮｄｅＩ部位を破壊したＲＫＰ遺伝子）が得られた。ＰＣＲは、ＤＮＡポリメラ－ゼとして、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ　ＨＳ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製）を用いて行い、反応条件はその取り扱い説明書に従った。
（参考例２）組換えベクターｐＮＫＰの構築
参考例１で得られたＮｄｅＩ部位を破壊したＲＫＰ遺伝子をＮｄｅＩおよびＳａｌＩで消化し、プラスミドｐＵＣＮ１８（ＰＣＲ法によりｐＵＣ１８（タカラバイオ社製）の１８５番目のＴをＡに改変してＮｄｅＩサイトを破壊し、更に４７１－４７２番目のＧＣをＴＧに改変することにより新たにＮｄｅＩサイトを導入したプラスミド）のｌａｃプロモーターの下流のＮｄｅＩ認識部位とＳａｌＩ認識部位の間に挿入し、組換えベクターｐＮＫＰを構築した。
（参考例３）ポリペプチドを発現する組換え生物の作製
参考例２で構築した組換えベクターｐＮＫＰを用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１コンピテントセル（タカラバイオ社製）を形質転換し、組換え生物Ｅ．ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１（ｐＮＫＰ）を得た。また、ｐＵＣＮ１８を用いてＥ．ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１コンピテントセル（タカラバイオ社製）を形質転換し、組換え生物Ｅ．ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１（ｐＵＣＮ１８）を得た。
（参考例４）組換え生物におけるＤＮＡの発現
参考例３で得た２種類の組換え生物（Ｅ．ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１（ｐＵＣＮ１８）、Ｅ．ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１（ｐＮＫＰ））を、２００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む２×ＹＴ培地（トリプトン１．６％、イーストエキス１．０％、塩化ナトリウム　０．５％、ｐＨ７．０）５ｍｌに接種し、３７℃で２４時間振盪培養した。上記の培養で得られたそれぞれ培養液について、遠心分離により菌体を集め、５ｍｌの１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）に懸濁した。これを、ＵＨ－５０型超音波ホモゲナイザー（ＳＭＴ社製）を用いて破砕した後、遠心分離により菌体残渣を除去し、無細胞抽出液を得た。これら無細胞抽出液のアセトフェノン還元活性を測定した。アセトフェノンに対する還元活性は、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）に、アセトフェノン１０ｍＭ、補酵素ＮＡＤＰＨ　０．２５ｍＭ、および無細胞抽出液を添加して３０℃で１分間反応を行い、波長３４０ｎｍにおける吸光度の減少速度より算出した。この反応条件において、１分間に１μｍｏｌのＮＡＤＰＨをＮＡＤＰに酸化する酵素活性を１Ｕと定義した。それぞれの組換え生物のアセトフェノン還元活性を以下に示す。Ｅ．ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１（ｐＵＣＮ１８）については、アセトフェノン還元活性は０．１Ｕ／ｍｇ以下であった。一方、ＲＫＰを発現させたＥ．ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１（ｐＮＫＰ）のアセトフェノン還元活性は５Ｕ／ｍｇであった。以上のように、参考例３で得られた組換え生物はアセトフェノンに対する還元活性を有し、ＲＫＰの発現が認められた。
（参考例５）野生型酵素ＲＫＰの有機溶剤に対する安定性
参考例４と同様の方法で野生型酵素の無細胞抽出液を得た。この無細胞抽出液に終濃度３０、４０、５０％のジメチルホルムアミドを添加し、硫酸もしくは水酸化ナトリウムでｐＨ６．５に調整後、３０℃で３時間インキュベートした。また、対照として何も添加しない無細胞抽出液も同様にインキュベートした。３時間後、各無細胞抽出液を希釈した。これら無細胞抽出液の２－ペンタノン還元活性を参考例４と同様の方法で測定した。下記式より溶剤添加時の相対活性を算出し、この値を各種化合物に対する安定性の指標とした。結果を表１に示す。
相対活性（％）＝［３時間目の酵素活性（溶剤添加）］÷［３時間目の酵素活性（溶剤非添加）］×１００
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
野生型酵素はジメチルスルホキシドに比べて、ジメチルホルムアミドに対する安定性が低かった。
（参考例６）野生型酵素ＲＫＰの有機溶剤に対する安定性
参考例４と同様の方法で野生型酵素の無細胞抽出液を得た。この無細胞抽出液に終濃度３０％のジメチルホルムアミドを添加し、硫酸もしくは水酸化ナトリウムでｐＨ６．５に調整後、３０℃で２時間インキュベートした。また、対照として何も添加しない無細胞抽出液も同様にインキュベートした。２時間後、各無細胞抽出液を希釈した。これら無細胞抽出液の２－ヘキサノン還元活性を測定した。１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）に、２－ヘキサノン１０ｍＭ、補酵素ＮＡＤＰＨ　０．２５ｍＭ、および無細胞抽出液を添加して３０℃で１分間反応を行い、波長３４０ｎｍにおける吸光度の減少速度を測定した。この減少速度より２－ヘキサノン還元活性を算出した。下記式より溶剤添加時の相対活性を算出し、この値を各種化合物に対する安定性の指標とした。溶剤添加条件下の野生型酵素の活性（相対活性）は溶剤非添加条件下の８％であった。
相対活性（％）＝［２時間目の酵素活性（溶剤添加）］÷［２時間目の酵素活性（溶剤非添加）］×１００
（参考例７）野生型酵素ＲＫＰの有機溶剤による反応阻害
参考例４と同様の方法で野生型酵素の無細胞抽出液を得た。この無細胞抽出液に終濃度３０％のジメチルホルムアミドを添加し、硫酸もしくは水酸化ナトリウムでｐＨ６．５に調整後、３０℃で２時間インキュベートした。また、対照として何も添加しない無細胞抽出液も同様にインキュベートした。２時間後、各無細胞抽出液を希釈した。これら無細胞抽出液の２－ヘキサノン還元活性を測定した。１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）に、３０％ジメチルホルムアミド、２－ヘキサノン１０ｍＭ、補酵素ＮＡＤＰＨ　０．２５ｍＭ、および無細胞抽出液を添加して反応を行った。ＮＡＤＰＨの蛍光の減少速度からＮＡＤＰＨの消費速度を求め、２－ヘキサノン還元活性を算出した。下記式より溶剤添加時の相対活性を算出し、この値を各種化合物に対する安定性の指標とした。溶剤添加条件下の野生型酵素の活性（相対活性）は溶剤非添加条件下の２４％であった。
相対活性（％）＝［酵素活性（溶剤添加）］÷［酵素活性（溶剤非添加）］×１００
（実施例１）変異酵素ライブラリーの作製１
参考例２で作製したＲＫＰ遺伝子を含むプラスミドｐＮＫＰをテンプレートに、プライマー１：５’－ＧＧＧＡＡＴＴＣＣＡＴＡＴＧＡＧＴＧＴＴＴＴＡＧＴＴＡＣＡＧＧ－３’（配列表の配列番号４）およびプライマー２：５’－ＡＴＡＣＧＣＧＴＣＧＡＣＴＴＡＣＴＡＴＴＧＴＴＣＴＴＧＡＡＣＣＴＴＣＡ－３’（配列表の配列番号５）を用いてエラープローンＰＣＲ法（Ｌｅｕｎｇ　ｅｔ　ａｌ．Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ　１，１１－１５（１９８９））を用いて、ＲＫＰ遺伝子全長にランダムな変異を導入したＤＮＡ増幅断片を得た。この増幅断片を制限酵素ＮｄｅＩおよびＳａｌＩで消化したのち、同酵素で処理した高発現ベクターｐＵＣＮ１８に組み込み、複数の変異酵素発現プラスミドを作製した。このプラスミドを用いてＥ．ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１を形質転換し、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢプレート培地に塗布した。生育したコロニーは変異導入されたＲＫＰ遺伝子を有する組換え大腸菌であり、この組換え菌群を変異酵素ライブラリー１とした。
（実施例２）改変型カルボニル還元酵素の選抜１
変異酵素ライブラリー１より有機溶剤に対する安定性が向上した改変型カルボニル還元酵素を選抜した。実施例１で作製した変異酵素ライブラリー１の各組換え菌および参考例３で作製したＥ．ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１（ｐＮＫＰ）（対照）をそれぞれ参考例４と同様の方法で培養した。得られた各培養液６０μｌに１０ｍＭ　ＥＤＴＡ・２Ｎａおよび１％　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００を含むリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）２４０μｌを加え、３７℃で１時間インキュベートした。各処理液を遠心し、上清を無細胞抽出液とした。各無細胞抽出液２００μｌに終濃度１０～３０％のジメチルホルムアミドを含むリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）を加え、３０℃で２時間インキュベートした（ジメチルホルムアミド処理）。ジメチルホルムアミド処理した各無細胞抽出液を９６穴プレート（ＡＧＣテクノグラス社製）に５０μｌ分注し、６ｍＭのＮＡＤＰＨを含むリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）５０μｌと１３３ｍＭ　２，３－ブタンジオンを含むリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）１００μｌを加え３０℃で反応した。経時的にＵＶサンプル撮影装置ＦＡＳ－ＩＩＩ（東洋紡績社製）でＮＡＤＰＨの蛍光を観察した。反応が進行しない酵素液はＮＡＤＰＨの蛍光が残存するが、反応が進行した無細胞抽出液はＮＡＤＰＨの減少に伴い、蛍光がなくなった。対照であるＥ．ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１（ｐＮＫＰ）の無細胞抽出液（野生型酵素）に比べ、早く蛍光がなくなった酵素をジメチルホルムアミド存在下で反応性の高い酵素、すなわち有機溶剤に対する安定性が向上した改変型カルボニル還元酵素として選抜した。選抜した酵素の培養液からプラスミドを抽出し、Ｂｉｇ　Ｄｙｅ　Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　Ｋｉｔ（アプライドバイオシステムズジャパン社製）およびＡｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　３１３０ｘｌジェネティックアナライザ（アプライドバイオシステムズジャパン社製）を用いて変異型ＲＫＰ遺伝子の塩基配列を決定し、変異部位を特定した。得られた有機溶剤に対する安定性の向上した改変型カルボニル還元酵素を表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
表２に示す６種類の有機溶剤に対する安定性が向上した酵素を取得した。
（実施例３）改変型カルボニル還元酵素の選抜２
変異酵素ライブラリー１より有機溶剤に対する安定性が向上した改変型カルボニル還元酵素を選抜した。実施例１で作製した変異酵素ライブラリー１の各組換え菌および参考例３で作製したＥ．ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１（ｐＮＫＰ）（対照）を１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢプレート培地上に植菌した。得られたコロニーを４０℃で加熱しておいたナイロン膜（ＢｉｏｄｙｎｅＡ、０．４５μｍ）に転写した後、そのナイロン膜を３０％のジメチルホルムアミドを含む５０ｍＭの３－（Ｎ－ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ）ｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ　ａｃｉｄ（ＭＯＰＳ）バッファー中に４０℃で３０分浸漬した。その後、このナイロン膜を１ｍＭのＮＡＤＰ＋、２００μＭのｎｉｔｒｏｂｌｕｅ　ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ、１０μＭの１－ｍｅｔｈｏｘｙ－５－ｍｅｔｈｙｌｐｈｅｎａｚｉｎｉｕｍ　ｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆａｔｅおよび１０％（ｖ／ｖ）の２－プロパノールを含む５０ｍＭのＭＯＰＳバッファー中に室温で３０分浸漬した。その後、ナイロン膜を蒸留水で洗浄し、染色されたコロニーをジメチルホルムアミドに対する安定性が向上した改変型カルボニル還元酵素の組換え菌候補として選抜した。候補株を２００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む２×ＹＴ培地（トリプトン１．６％、イーストエキス１．０％、塩化ナトリウム　０．５％、ｐＨ７．０）５ｍｌに接種し、２０時間培養した。得られた各培養液について、遠心分離により菌体を集め、培養液の１／６量の１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）に懸濁した。これを、ＵＨ－５０型超音波ホモゲナイザー（ＳＭＴ社製）を用いて破砕した後、遠心分離により菌体残渣を除去し、無細胞抽出液を得た。この無細胞抽出液２０μｌに終濃度２０、２３、２６、３０％のジメチルホルムアミドと５０ｍＭ　ＭＯＰＳバッファー（ｐＨ７．０）を総液量が４０μｌになるように添加し、４０℃で３０分間加熱した。氷上で１分間冷却した後、１ｍＭのＮＡＤＰ＋、２００μＭのｎｉｔｒｏｂｌｕｅ　ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ、１０μＭの１－ｍｅｔｈｏｘｙ－５－ｍｅｔｈｙｌｐｈｅｎａｚｉｎｉｕｍ　ｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆａｔｅおよび１０％（ｖ／ｖ）の２－プロパノールを含む５０ｍＭのＭＯＰＳバッファーを２００μ加えた。反応液を９６穴プレート（ＡＧＣテクノグラス社製）に移し、１時間観察した。染色されたものをジメチルホルムアミドに対する安定性がさらに向上した改変型カルボニル還元酵素の組換え菌として選抜した。選抜した組換え菌の培養液からプラスミドを抽出し、ＢｉｇＤｙｅ　Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　Ｋｉｔ（アプライドバイオシステムズジャパン社製）およびＡｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　３１３０ｘｌジェネティックアナライザ（アプライドバイオシステムズジャパン社製）を用いて変異型ＲＫＰ遺伝子の塩基配列を決定し、変異部位を特定した。得られた有機溶剤に対する安定性の向上した改変型カルボニル還元酵素を表３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
表３に示す２９種類の有機溶剤に対する安定性が向上した酵素を取得した。これらのうち６種類は実施例２で取得した酵素と同一の変異酵素だった。
（実施例４）改変型カルボニル還元酵素の評価１
実施例２で取得した改変型カルボニル還元酵素の各組換え菌および参考例３で作製したＥ．ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１（ｐＮＫＰ）（対照）をそれぞれ参考例４と同様の方法で培養した。得られた各培養液について、遠心分離により菌体を集め、培養液と等量から１／５量の１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）に懸濁した。これを、ＵＨ－５０型超音波ホモゲナイザー（ＳＭＴ社製）を用いて破砕した後、遠心分離により菌体残渣を除去し、無細胞抽出液を得た。無細胞抽出液６０μｌに終濃度３０、４０％または５０％のジメチルホルムアミドを含むリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）６０μｌを加え、３０℃でインキュベートした（ジメチルホルムアミド処理）。３時間目のジメチルホルムアミド処理液をサンプリングし、希釈して参考例４に示した方法で２－ペンタノンに対する還元活性を測定した。下記式より残存活性は算出し、この値をジメチルホルムアミドに対する安定性の指標とした。
相対活性（％）＝［３時間目の酵素活性（溶剤添加）］÷［３時間目の酵素活性（溶剤非添加）］×１００
ジメチルホルムアミド４０％存在下で評価した野生型酵素および改変型カルボニル還元酵素の相対活性を表４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
表４に示した改変型カルボニル還元酵素は野生型酵素よりも有機溶剤に対する安定性が向上していた。
（実施例５）改変型カルボニル還元酵素の評価２
実施例３で取得した改変型カルボニル還元酵素の各組換え菌および参考例３で作製したＥ．ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１（ｐＮＫＰ）（対照）をそれぞれ参考例４と同様の方法で培養した。得られた各培養液について、遠心分離により菌体を集め、培養液と等量から１／５量の１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）に懸濁した。これを、ＵＨ－５０型超音波ホモゲナイザー（ＳＭＴ社製）を用いて破砕した後、遠心分離により菌体残渣を除去し、無細胞抽出液を得た。２５μｌの無細胞抽出液に等量の８０％ジメチルホルムアミド溶液を加え、３０℃で３０分静置した。これに１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）２００μｌを加え、混合した。この溶液１５μｌに終濃度０．６２５ｍＭのＮＡＤＰＨと１２．５ｍＭの２，３－ブタンジオンを溶解した１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）を２５０μｌ加え、混合した。５秒振とうし、ＮＡＤＰＨの吸光（３４０ｎｍ）をＢｅｎｃｈｍａｒｋ　Ｐｌｕｓ　ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ　ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（ＢＩＯ－ＲＡＤ社製）で１５秒間測定し、その減少速度から２，３－ブタンジオンに対する還元活性を求めた。下記式よりジメチルホルムアミド非添加時に対する添加時の酵素活性を算出し、この値をジメチルホルムアミドに対する安定性の指標とした。
相対活性（％）＝［酵素活性（ジメチルホルムアミド添加）］÷［酵素活性（ジメチルホルムアミド非添加）］×１００
野生型酵素および改変型カルボニル還元酵素の相対活性を表５に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
表５に示した改変型カルボニル還元酵素は野生型酵素よりも有機溶剤に対する安定性が向上していた。
（実施例６）多重変異改変型カルボニル還元酵素の作製１
実施例２で取得したプラスミドｐＮＫＰｍ０２を鋳型として、プライマー１：５’－ＧＧＧＡＡＴＴＣＣＡＴＡＴＧＡＧＴＧＴＴＴＴＡＧＴＴＡＣＡＧＧ－３’（配列表の配列番号４）、プライマー３：５’－ＧＴＴＡＡＴＴＴＣＡＴＴＡＧＣＧＣＧＡＴＴＴＴＴＡＡＴＴＡＣＡＴＧ－３’（配列表の配列番号６）を用いてＰＣＲを行い、配列番号１に示すアミノ酸配列のうちＴ２５７Ｓのアミノ酸置換を有するＮ末端側のポリペプチドをコードする二本鎖ＤＮＡを得た（Ｎ末端側ＤＮＡ）。同様にプラスミドｐＮＫＰｍ０２を鋳型として、プライマー４：５’－ＣＡＴＧＴＡＡＴＴＡＡＡＡＡＴＣＧＣＧＣＴＡＡＴＧＡＡＡＴＴＡＡＣ－３’（配列表の配列番号７）、プライマー２：５’－ＡＴＡＣＧＣＧＴＣＧＡＣＴＴＡＣＴＡＴＴＧＴＴＣＴＴＧＡＡＣＣＴＴＣＡ－３’（配列表の配列番号５）を用いてＰＣＲを行い、配列番号１に示すアミノ酸配列のうちＨ７１Ｒ、Ｋ２５９Ｅのアミノ酸置換を有するＣ末端側のポリペプチドをコードする二本鎖ＤＮＡを得た（Ｃ末端側ＤＮＡ）。Ｎ末端側ＤＮＡとＣ末端側ＤＮＡを混合し、これを鋳型として、プライマー１、プライマー２を用いてＰＣＲを行い、配列番号１に示すアミノ酸配列のうちＨ７１Ｒ、Ｋ２５９Ｅのアミノ酸置換を有するポリペプチドをコードする二本鎖ＤＮＡを得た。参考例２と同様の方法でｐＵＣＮ１８に導入し、ｐＮＫＰｍ３０を作製した。このｐＮＫＰｍ３０を用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１コンピテントセル（タカラバイオ社製）を形質転換し、改変型カルボニル還元酵素Ｈ７１Ｒ－Ｋ２５９Ｅを生産する組換え生物Ｅ．ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１（ｐＮＫＰｍ３０）を得た。
（実施例７）多重変異改変型カルボニル還元酵素の作製２
実施例２で取得したプラスミドｐＮＫＰｍ０２を鋳型として、プライマー１：５’－ＧＧＧＡＡＴＴＣＣＡＴＡＴＧＡＧＴＧＴＴＴＴＡＧＴＴＡＣＡＧＧ－３’（配列表の配列番号４）、プライマー５：５’－ＧＡＴＣＡＡＣＣＴＴＴＣＡＣＣＧＣＴＴＡＡＣＴＣＡＴＣＡＴＴＡＴＧ－３’（配列表の配列番号８）を用いてＰＣＲを行い、配列番号１に示すアミノ酸配列のうちＴ２５７Ｓのアミノ酸置換を有するＮ末端側のポリペプチドをコードする二本鎖ＤＮＡを得た（Ｎ末端側ＤＮＡ）。同様にプラスミドｐＮＫＰｍ０２を鋳型として、プライマー６：５’－ＣＡＴＡＡＴＧＡＴＧＡＧＴＴＡＡＧＣＧＧＴＧＡＡＡＧＧＴＴＧＡＴＣ－３’（配列表の配列番号９）、プライマー２：５’－ＡＴＡＣＧＣＧＴＣＧＡＣＴＴＡＣＴＡＴＴＧＴＴＣＴＴＧＡＡＣＣＴＴＣＡ－３’（配列表の配列番号５）を用いてＰＣＲを行い、配列番号１に示すアミノ酸配列のうちＴ２５７Ｓ、Ｋ２５９Ｅのアミノ酸置換を有するＣ末端側のポリペプチドをコードする二本鎖ＤＮＡを得た（Ｃ末端側ＤＮＡ）。Ｎ末端側ＤＮＡとＣ末端側ＤＮＡを混合し、これを鋳型として、プライマー１、プライマー２を用いてＰＣＲを行い、配列番号１に示すアミノ酸配列のうちＴ２５７Ｓ、Ｋ２５９Ｅのアミノ酸置換を有するポリペプチドをコードする二本鎖ＤＮＡを得た。参考例２と同様の方法でｐＵＣＮ１８に導入し、ｐＮＫＰｍ３１を作製した。このｐＮＫＰｍ３１を用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１コンピテントセル（タカラバイオ社製）を形質転換し、改変型カルボニル還元酵素Ｔ２５７Ｓ－Ｋ２５９Ｅを生産する組換え生物Ｅ．ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１（ｐＮＫＰｍ３１）を得た。
（実施例８）多重変異改変型カルボニル還元酵素の作製３
実施例２で取得したプラスミドｐＮＫＰｍ０２を鋳型として、プライマー１：５’－ＧＧＧＡＡＴＴＣＣＡＴＡＴＧＡＧＴＧＴＴＴＴＡＧＴＴＡＣＡＧＧ－３’（配列表の配列番号４）、プライマー７：５’－ＣＴＣＧＴＴＡＴＧＧＡＣＡＣＧＡＴＣＴＣＣＴＴＧＡＧＧＴＡＡＣＴＣ－３’（配列表の配列番号１０）を用いてＰＣＲを行い、配列番号１に示すアミノ酸配列のうちＫ２５９Ｅ、Ｇ３００Ｄのアミノ酸置換を有するＮ末端側のポリペプチドをコードする二本鎖ＤＮＡを得た（Ｎ末端側ＤＮＡ）。同様にプラスミドｐＮＫＰｍ０２を鋳型として、プライマー８：５’－ＧＡＧＴＴＡＣＣＴＣＡＡＧＧＡＧＡＴＣＧＴＧＴＣＣＡＴＡＡＣＧＡＧ－３’（配列表の配列番号１１）、プライマー２：５’－ＡＴＡＣＧＣＧＴＣＧＡＣＴＴＡＣＴＡＴＴＧＴＴＣＴＴＧＡＡＣＣＴＴＣＡ－３’（配列表の配列番号５）を用いてＰＣＲを行い、配列番号１に示すアミノ酸配列のうちＧ３００Ｄのアミノ酸置換を有するＣ末端側のポリペプチドをコードする二本鎖ＤＮＡを得た（Ｃ末端側ＤＮＡ）。Ｎ末端側ＤＮＡとＣ末端側ＤＮＡを混合し、これを鋳型として、プライマー１、プライマー２を用いてＰＣＲを行い、配列番号１に示すアミノ酸配列のうちＫ２５９Ｅ、Ｇ３００Ｄのアミノ酸置換を有するポリペプチドをコードする二本鎖ＤＮＡを得た。参考例２と同様の方法でｐＵＣＮ１８に導入し、ｐＮＫＰｍ３２を作製した。このｐＮＫＰｍ３２を用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１コンピテントセル（タカラバイオ社製）を形質転換し、改変型カルボニル還元酵素Ｋ２５９Ｅ－Ｇ３００Ｄを生産する組換え生物Ｅ．ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１（ｐＮＫＰｍ３２）を得た。
（実施例９）多重変異改変型カルボニル還元酵素の作製４
実施例２で取得したプラスミドｐＮＫＰｍ０４を鋳型として、プライマー１：５’－ＧＧＧＡＡＴＴＣＣＡＴＡＴＧＡＧＴＧＴＴＴＴＡＧＴＴＡＣＡＧＧ－３’（配列表の配列番号４）、プライマー９：５’－ＧＴＴＡＡＴＴＴＣＡＴＴＡＧＣＧＣＧＡＴＴＴＴＴＡＡＴＴＡＣＡＴＧ－３’（配列表の配列番号１２）を用いてＰＣＲを行い、配列番号１に示すアミノ酸配列のうちＨ７１Ｒ、Ｋ２７０Ｍのアミノ酸置換を有するＮ末端側のポリペプチドをコードする二本鎖ＤＮＡを得た（Ｎ末端側ＤＮＡ）。同様にプラスミドｐＮＫＰｍ０２を鋳型として、プライマー１０：５’－ＣＡＴＧＴＡＡＴＴＡＡＡＡＡＴＣＧＣＧＣＴＡＡＴＧＡＡＡＴＴＡＡＣ－３’（配列表の配列番号１３）、プライマー２：５’－ＡＴＡＣＧＣＧＴＣＧＡＣＴＴＡＣＴＡＴＴＧＴＴＣＴＴＧＡＡＣＣＴＴＣＡ－３’（配列表の配列番号５）を用いてＰＣＲを行い、配列番号１に示すアミノ酸配列のうちＨ７１Ｒ、Ｋ２７０Ｍのアミノ酸置換を有するＣ末端側のポリペプチドをコードする二本鎖ＤＮＡを得た（Ｃ末端側ＤＮＡ）。Ｎ末端側ＤＮＡとＣ末端側ＤＮＡを混合し、これを鋳型として、プライマー１、プライマー２を用いてＰＣＲを行い、配列番号１に示すアミノ酸配列のうちＨ７１Ｒ、Ｋ２７０Ｍのアミノ酸置換を有するポリペプチドをコードする二本鎖ＤＮＡを得た。参考例２と同様の方法でｐＵＣＮ１８に導入し、ｐＮＫＰｍ３３を作製した。このｐＮＫＰｍ３３を用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１コンピテントセル（タカラバイオ社製）を形質転換し、改変型カルボニル還元酵素Ｈ７１Ｒ－Ｋ２７０Ｍを生産する組換え生物Ｅ．ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１（ｐＮＫＰｍ３３）を得た。
（実施例１０）多重変異改変型カルボニル還元酵素の作製５
実施例２で取得したプラスミドｐＮＫＰｍ０４を鋳型として、プライマー１：５’－ＧＧＧＡＡＴＴＣＣＡＴＡＴＧＡＧＴＧＴＴＴＴＡＧＴＴＡＣＡＧＧ－３’（配列表の配列番号４）、プライマー１１：５’－ＧＧＡＴＡＣＣＴＴＴＡＧＴＡＣＣＡＡＴＡＡＣＡＧＣＴＧＧＧＡＴＴＡＡＧ－３’（配列表の配列番号１４）を用いてＰＣＲを行い、配列番号１に示すアミノ酸配列のうちＮ１０２Ｉのアミノ酸置換を有するＮ末端側のポリペプチドをコードする二本鎖ＤＮＡを得た（Ｎ末端側ＤＮＡ）。同様にプラスミドｐＮＫＰｍ０４を鋳型として、プライマー１２：５’－ＣＴＴＡＡＴＣＣＣＡＧＣＴＧＴＴＡＴＴＧＧＴＡＣＴＡＡＡＧＧＴＡＴＣＣ－３’（配列表の配列番号１５）、プライマー２：５’－ＡＴＡＣＧＣＧＴＣＧＡＣＴＴＡＣＴＡＴＴＧＴＴＣＴＴＧＡＡＣＣＴＴＣＡ－３’（配列表の配列番号５）を用いてＰＣＲを行い、配列番号１に示すアミノ酸配列のうちＮ１０２Ｉ、Ｋ２７０Ｍのアミノ酸置換を有するＣ末端側のポリペプチドをコードする二本鎖ＤＮＡを得た（Ｃ末端側ＤＮＡ）。Ｎ末端側ＤＮＡとＣ末端側ＤＮＡを混合し、これを鋳型として、プライマー１、プライマー２を用いてＰＣＲを行い、配列番号１に示すアミノ酸配列のうちＮ１０２Ｉ、Ｋ２７０Ｍのアミノ酸置換を有するポリペプチドをコードする二本鎖ＤＮＡを得た。参考例２と同様の方法でｐＵＣＮ１８に導入し、ｐＮＫＰｍ３４を作製した。このｐＮＫＰｍ３４を用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１コンピテントセル（タカラバイオ社製）を形質転換し、改変型カルボニル還元酵素Ｎ１０２Ｉ－Ｋ２７０Ｍを生産する組換え生物Ｅ．ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１（ｐＮＫＰｍ３４）を得た。
（実施例１１）多重変異改変型カルボニル還元酵素の作製６
実施例２で取得したプラスミドｐＮＫＰｍ０４を鋳型として、プライマー１：５’－ＧＧＧＡＡＴＴＣＣＡＴＡＴＧＡＧＴＧＴＴＴＴＡＧＴＴＡＣＡＧＧ－３’（配列表の配列番号４）、プライマー１３：５’－ＴＴＴＡＴＣＡＡＴＴＴＣＡＣＴＧＣＣＴＧＴＴＧＧＡＧＣＡＡＡＣＡＴＡＧＣ－３’（配列表の配列番号１６）を用いてＰＣＲを行い、配列番号１に示すアミノ酸配列のうちＥ２２６Ｇのアミノ酸置換を有するＮ末端側のポリペプチドをコードする二本鎖ＤＮＡを得た（Ｎ末端側ＤＮＡ）。同様にプラスミドｐＮＫＰｍ０４を鋳型として、プライマー１４：５’－ＧＣＴＡＴＧＴＴＴＧＣＴＣＣＡＡＣＡＧＧＣＡＧＴＧＡＡＡＴＴＧＡＴＡＡＡ－３’（配列表の配列番号１７）、プライマー２：５’－ＡＴＡＣＧＣＧＴＣＧＡＣＴＴＡＣＴＡＴＴＧＴＴＣＴＴＧＡＡＣＣＴＴＣＡ－３’（配列表の配列番号５）を用いてＰＣＲを行い、配列番号１に示すアミノ酸配列のうちＮＥ２２６Ｇのアミノ酸置換を有するＣ末端側のポリペプチドをコードする二本鎖ＤＮＡを得た（Ｃ末端側ＤＮＡ）。Ｎ末端側ＤＮＡとＣ末端側ＤＮＡを混合し、これを鋳型として、プライマー１、プライマー２を用いてＰＣＲを行い、配列番号１に示すアミノ酸配列のうちＥ２２６Ｇ、Ｋ２７０Ｍのアミノ酸置換を有するポリペプチドをコードする二本鎖ＤＮＡを得た。参考例２と同様の方法でｐＵＣＮ１８に導入し、ｐＮＫＰｍ３５を作製した。このｐＮＫＰｍ３５を用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１コンピテントセル（タカラバイオ社製）を形質転換し、改変型カルボニル還元酵素Ｅ２２６Ｇ－Ｋ２７０Ｍを生産する組換え生物Ｅ．ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１（ｐＮＫＰｍ３５）を得た。
（実施例１２）多重変異改変型カルボニル還元酵素の作製７
実施例２で取得したプラスミドｐＮＫＰｍ０４を鋳型として、プライマー１：５’－ＧＧＧＡＡＴＴＣＣＡＴＡＴＧＡＧＴＧＴＴＴＴＡＧＴＴＡＣＡＧＧ－３’（配列表の配列番号４）、プライマー１５：５’－ＧＡＴＣＡＡＣＣＴＴＴＴＡＣＣＧＣＴＴＡＡＣＴＣＡＴＣＡＴＴＡＴＧ－３’（配列表の配列番号１８）を用いてＰＣＲを行い、配列番号１に示すアミノ酸配列のうちＴ２５７Ｓのアミノ酸置換を有するＮ末端側のポリペプチドをコードする二本鎖ＤＮＡを得た（Ｎ末端側ＤＮＡ）。同様にプラスミドｐＮＫＰｍ０４を鋳型として、プライマー１６：５’－ＣＡＴＡＡＴＧＡＴＧＡＧＴＴＡＡＧＣＧＧＴＡＡＡＡＧＧＴＴＧＡＴＣ－３’（配列表の配列番号１９）、プライマー２：５’－ＡＴＡＣＧＣＧＴＣＧＡＣＴＴＡＣＴＡＴＴＧＴＴＣＴＴＧＡＡＣＣＴＴＣＡ－３’（配列表の配列番号５）を用いてＰＣＲを行い、配列番号１に示すアミノ酸配列のうちＴ２５７Ｓ、Ｋ２７０Ｍのアミノ酸置換を有するＣ末端側のポリペプチドをコードする二本鎖ＤＮＡを得た（Ｃ末端側ＤＮＡ）。Ｎ末端側ＤＮＡとＣ末端側ＤＮＡを混合し、これを鋳型として、プライマー１、プライマー２を用いてＰＣＲを行い、配列番号１に示すアミノ酸配列のうちＴ２５７Ｓ、Ｋ２７０Ｍのアミノ酸置換を有するポリペプチドをコードする二本鎖ＤＮＡを得た。参考例２と同様の方法でｐＵＣＮ１８に導入し、ｐＮＫＰｍ３６を作製した。このｐＮＫＰｍ３６を用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１コンピテントセル（タカラバイオ社製）を形質転換し、改変型カルボニル還元酵素Ｔ２５７Ｓ－Ｋ２７０Ｍを生産する組換え生物Ｅ．ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１（ｐＮＫＰｍ３６）を得た。
（実施例１３）多重変異改変型カルボニル還元酵素の作製８
実施例２で取得したプラスミドｐＮＫＰｍ０４を鋳型として、プライマー１：５’－ＧＧＧＡＡＴＴＣＣＡＴＡＴＧＡＧＴＧＴＴＴＴＡＧＴＴＡＣＡＧＧ－３’（配列表の配列番号４）、プライマー１７：５’－ＧＡＣＡＡＧＡＴＣＡＡＣＣＴＴＴＣＡＣＣＡＧＴＴＡＡＣＴＣＡＴＣ－３’（配列表の配列番号２０）を用いてＰＣＲを行い、配列番号１に示すアミノ酸配列のうちＫ２５９Ｅのアミノ酸置換を有するＮ末端側のポリペプチドをコードする二本鎖ＤＮＡを得た（Ｎ末端側ＤＮＡ）。同様にプラスミドｐＮＫＰｍ０４を鋳型として、プライマー１８：５’－ＧＡＴＧＡＧＴＴＡＡＣＴＧＧＴＧＡＡＡＧＧＴＴＧＡＴＣＴＴＧＴＣ－３’（配列表の配列番号２１）、プライマー２：５’－ＡＴＡＣＧＣＧＴＣＧＡＣＴＴＡＣＴＡＴＴＧＴＴＣＴＴＧＡＡＣＣＴＴＣＡ－３’（配列表の配列番号５）を用いてＰＣＲを行い、配列番号１に示すアミノ酸配列のうちＫ２５９Ｅ、Ｋ２７０Ｍのアミノ酸置換を有するＣ末端側のポリペプチドをコードする二本鎖ＤＮＡを得た（Ｃ末端側ＤＮＡ）。Ｎ末端側ＤＮＡとＣ末端側ＤＮＡを混合し、これを鋳型として、プライマー１、プライマー２を用いてＰＣＲを行い、配列番号１に示すアミノ酸配列のうちＫ２５９Ｅ、Ｋ２７０Ｍのアミノ酸置換を有するポリペプチドをコードする二本鎖ＤＮＡを得た。参考例２と同様の方法でｐＵＣＮ１８に導入し、ｐＮＫＰｍ３７を作製した。このｐＮＫＰｍ３７を用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１コンピテントセル（タカラバイオ社製）を形質転換し、改変型カルボニル還元酵素Ｋ２５９Ｅ－Ｋ２７０Ｍを生産する組換え生物Ｅ．ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１（ｐＮＫＰｍ３７）を得た。
（実施例１４）多重変異改変型カルボニル還元酵素の作製９
実施例２で取得したプラスミドｐＮＫＰｍ０４を鋳型として、プライマー１：５’－ＧＧＧＡＡＴＴＣＣＡＴＡＴＧＡＧＴＧＴＴＴＴＡＧＴＴＡＣＡＧＧ－３’（配列表の配列番号４）、プライマー１９：５’－ＴＴＴＧＣＡＴＡＧＴＧＡＡＣＧＧＡＧＣＡＴＴＴＧＡＣＡＡＧ－３’（配列表の配列番号２２）を用いてＰＣＲを行い、配列番号１に示すアミノ酸配列のうちＳ２６７Ｐのアミノ酸置換を有するＮ末端側のポリペプチドをコードする二本鎖ＤＮＡを得た（Ｎ末端側ＤＮＡ）。同様にプラスミドｐＮＫＰｍ０４を鋳型として、プライマー２０：５’－ＣＴＴＧＴＣＡＡＡＴＧＣＴＣＣＧＴＴＣＡＣＴＡＴＧＣＡＡＡ－３’（配列表の配列番号２３）、プライマー２：５’－ＡＴＡＣＧＣＧＴＣＧＡＣＴＴＡＣＴＡＴＴＧＴＴＣＴＴＧＡＡＣＣＴＴＣＡ－３’（配列表の配列番号５）を用いてＰＣＲを行い、配列番号１に示すアミノ酸配列のうちＳ２６７Ｐ、Ｋ２７０Ｍのアミノ酸置換を有するＣ末端側のポリペプチドをコードする二本鎖ＤＮＡを得た（Ｃ末端側ＤＮＡ）。Ｎ末端側ＤＮＡとＣ末端側ＤＮＡを混合し、これを鋳型として、プライマー１、プライマー２を用いてＰＣＲを行い、配列番号１に示すアミノ酸配列のうちＳ２６７Ｐ、Ｋ２７０Ｍのアミノ酸置換を有するポリペプチドをコードする二本鎖ＤＮＡを得た。参考例２と同様の方法でｐＵＣＮ１８に導入し、ｐＮＫＰｍ３８を作製した。このｐＮＫＰｍ３８を用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１コンピテントセル（タカラバイオ社製）を形質転換し、改変型カルボニル還元酵素Ｓ２６７Ｐ－Ｋ２７０Ｍを生産する組換え生物Ｅ．ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１（ｐＮＫＰｍ３８）を得た。
（実施例１５）多重変異改変型カルボニル還元酵素の作製１０
実施例２で取得したプラスミドｐＮＫＰｍ０４を鋳型として、プライマー１：５’－ＧＧＧＡＡＴＴＣＣＡＴＡＴＧＡＧＴＧＴＴＴＴＡＧＴＴＡＣＡＧＧ－３’（配列表の配列番号４）、プライマー２１：５’－ＣＴＣＧＴＴＡＴＧＧＡＣＡＣＧＡＴＣＴＣＣＴＴＧＡＧＧＴＡＡＣＴＣ－３’（配列表の配列番号２４）を用いてＰＣＲを行い、配列番号１に示すアミノ酸配列のうちＫ２７０Ｍ、Ｇ３００Ｄのアミノ酸置換を有するＮ末端側のポリペプチドをコードする二本鎖ＤＮＡを得た（Ｎ末端側ＤＮＡ）。同様にプラスミドｐＮＫＰｍ０４を鋳型として、プライマー２２：５’－ＧＡＧＴＴＡＣＣＴＣＡＡＧＧＡＧＡＴＣＧＴＧＴＣＣＡＴＡＡＣＧＡＧ－３’（配列表の配列番号２５）、プライマー２：５’－ＡＴＡＣＧＣＧＴＣＧＡＣＴＴＡＣＴＡＴＴＧＴＴＣＴＴＧＡＡＣＣＴＴＣＡ－３’（配列表の配列番号５）を用いてＰＣＲを行い、配列番号１に示すアミノ酸配列のうちＧ３００Ｄのアミノ酸置換を有するＣ末端側のポリペプチドをコードする二本鎖ＤＮＡを得た（Ｃ末端側ＤＮＡ）。Ｎ末端側ＤＮＡとＣ末端側ＤＮＡを混合し、これを鋳型として、プライマー１、プライマー２を用いてＰＣＲを行い、配列番号１に示すアミノ酸配列のうちＫ２７０Ｍ、Ｇ３００Ｄのアミノ酸置換を有するポリペプチドをコードする二本鎖ＤＮＡを得た。参考例２と同様の方法でｐＵＣＮ１８に導入し、ｐＮＫＰｍ３９を作製した。このｐＮＫＰｍ３９を用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１コンピテントセル（タカラバイオ社製）を形質転換し、改変型カルボニル還元酵素Ｋ２７０Ｍ－Ｇ３００Ｄを生産する組換え生物Ｅ．ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１（ｐＮＫＰｍ３９）を得た。
（実施例１６）多重変異改変型カルボニル還元酵素の評価１
実施例６～１５で取得した多重変異改変型カルボニル還元酵素の各組換え菌および参考例３で作製したＥ．ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１（ｐＮＫＰ）（対照）をそれぞれ参考例４と同様の方法で培養した。実施例４と同様に多重変異改変型カルボニル還元酵素のジメチルホルムアミドに対する安定性を評価した。ジメチルホルムアミド４０％存在下で評価した野生型酵素および改変型カルボニル還元酵素の相対活性を表６に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
表６に示した改変型カルボニル還元酵素は野生型酵素よりも有機溶剤に対する安定性が向上していた。
（実施例１７）多重変異改変型カルボニル還元酵素の作製１１
実施例７で取得したプラスミドｐＮＫＰｍ３７を鋳型として、プライマー１：５’－ＧＧＧＡＡＴＴＣＣＡＴＡＴＧＡＧＴＧＴＴＴＴＡＧＴＴＡＣＡＧＧ－３’（配列表の配列番号４）、プライマー２３：５’－ＣＣＡＧＴＡＧＣＡＣＣＴＧＴＡＡＣＴＡＡＡＡＣＡＡＴＣＡＴ－３’（配列表の配列番号２６）を用いてＰＣＲを行い、配列番号１に示すアミノ酸配列のうちＳ２Ｉのアミノ酸置換を有するＮ末端側のポリペプチドをコードする二本鎖ＤＮＡを得た（Ｎ末端側ＤＮＡ）。同様にプラスミドｐＮＫＰｍ３７を鋳型として、プライマー２４：５’－ＡＴＧＡＴＴＧＴＴＴＴＡＧＴＴＡＣＡＧＧＴＧＣＴＡＣＴＧＧ－３’（配列表の配列番号２７）、プライマー２：５’－ＡＴＡＣＧＣＧＴＣＧＡＣＴＴＡＣＴＡＴＴＧＴＴＣＴＴＧＡＡＣＣＴＴＣＡ－３’（配列表の配列番号５）を用いてＰＣＲを行い、配列番号１に示すアミノ酸配列のうちＳ２Ｉ、Ｋ２５９Ｅ、Ｋ２７０Ｍのアミノ酸置換を有するＣ末端側のポリペプチドをコードする二本鎖ＤＮＡを得た（Ｃ末端側ＤＮＡ）。Ｎ末端側ＤＮＡとＣ末端側ＤＮＡを混合し、これを鋳型として、プライマー１、プライマー２を用いてＰＣＲを行い、配列番号１に示すアミノ酸配列のうちＳ２Ｉ、Ｋ２５９Ｅ、Ｋ２７０Ｍのアミノ酸置換を有するポリペプチドをコードする二本鎖ＤＮＡを得た。参考例２と同様の方法でｐＵＣＮ１８に導入し、ｐＮＫＰｍ４０を作製した。このｐＮＫＰｍ４０を用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１コンピテントセル（タカラバイオ社製）を形質転換し、改変型カルボニル還元酵素Ｓ２Ｉ－Ｋ２５９Ｅ－Ｋ２７０Ｍを生産する組換え生物Ｅ．ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１（ｐＮＫＰｍ４０）を得た。
（実施例１８）多重変異改変型カルボニル還元酵素の作製１２
実施例７で取得したプラスミドｐＮＫＰｍ３７を鋳型として、プライマー１：５’－ＧＧＧＡＡＴＴＣＣＡＴＡＴＧＡＧＴＧＴＴＴＴＡＧＴＴＡＣＡＧＧ－３’（配列表の配列番号４）、プライマー２５：５’－ＧＧＣＡＧＣＡＡＴＴＧＡＡＧＡＡＧＴＣＡＧＡＡＣＡＡＡＴＴＴＣＴＴＣＡＣ－３’（配列表の配列番号２８）を用いてＰＣＲを行い、配列番号１に示すアミノ酸配列のうちＩ１２４Ｌのアミノ酸置換を有するＮ末端側のポリペプチドをコードする二本鎖ＤＮＡを得た（Ｎ末端側ＤＮＡ）。同様にプラスミドｐＮＫＰｍ３７を鋳型として、プライマー２６：５’－ＧＴＧＡＡＧＡＡＡＴＴＴＧＴＴＣＴＧＡＣＴＴＣＴＴＣＡＡＴＴＧＣＴＧＣＣ－３’（配列表の配列番号２９）、プライマー２：５’－ＡＴＡＣＧＣＧＴＣＧＡＣＴＴＡＣＴＡＴＴＧＴＴＣＴＴＧＡＡＣＣＴＴＣＡ－３’（配列表の配列番号５）を用いてＰＣＲを行い、配列番号１に示すアミノ酸配列のうちＩ１２４Ｌ、Ｋ２５９Ｅ、Ｋ２７０Ｍのアミノ酸置換を有するＣ末端側のポリペプチドをコードする二本鎖ＤＮＡを得た（Ｃ末端側ＤＮＡ）。Ｎ末端側ＤＮＡとＣ末端側ＤＮＡを混合し、これを鋳型として、プライマー１、プライマー２を用いてＰＣＲを行い、配列番号１に示すアミノ酸配列のうちＩ１２４Ｌ、Ｋ２５９Ｅ、Ｋ２７０Ｍのアミノ酸置換を有するポリペプチドをコードする二本鎖ＤＮＡを得た。参考例２と同様の方法でｐＵＣＮ１８に導入し、ｐＮＫＰｍ４１を作製した。このｐＮＫＰｍ４１を用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１コンピテントセル（タカラバイオ社製）を形質転換し、改変型カルボニル還元酵素Ｉ１２４Ｌ－Ｋ２５９Ｅ－Ｋ２７０Ｍを生産する組換え生物Ｅ．ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１（ｐＮＫＰｍ４１）を得た。
（実施例１９）多重変異改変型カルボニル還元酵素の作製１３
実施例７で取得したプラスミドｐＮＫＰｍ３７を鋳型として、プライマー１：５’－ＧＧＧＡＡＴＴＣＣＡＴＡＴＧＡＧＴＧＴＴＴＴＡＧＴＴＡＣＡＧＧ－３’（配列表の配列番号４）、プライマー２７：５’－ＣＣＴＴＴＡＴＴＣＴＣＴＴＣＡＡＡＧＡＡＧＴＴＣＣＡＡＧＣＡＧＣ－３’（配列表の配列番号３０）を用いてＰＣＲを行い、配列番号１に示すアミノ酸配列のうちＬ１７７Ｆのアミノ酸置換を有するＮ末端側のポリペプチドをコードする二本鎖ＤＮＡを得た（Ｎ末端側ＤＮＡ）。同様にプラスミドｐＮＫＰｍ３７を鋳型として、プライマー２８：５’－ＧＣＴＧＣＴＴＧＧＡＡＣＴＴＣＴＴＴＧＡＡＧＡＧＡＡＴＡＡＡＧＧ－３’（配列表の配列番号３１）、プライマー２：５’－ＡＴＡＣＧＣＧＴＣＧＡＣＴＴＡＣＴＡＴＴＧＴＴＣＴＴＧＡＡＣＣＴＴＣＡ－３’（配列表の配列番号５）を用いてＰＣＲを行い、配列番号１に示すアミノ酸配列のうちＬ１７７Ｆ、Ｋ２５９Ｅ、Ｋ２７０Ｍのアミノ酸置換を有するＣ末端側のポリペプチドをコードする二本鎖ＤＮＡを得た（Ｃ末端側ＤＮＡ）。Ｎ末端側ＤＮＡとＣ末端側ＤＮＡを混合し、これを鋳型として、プライマー１、プライマー２を用いてＰＣＲを行い、配列番号１に示すアミノ酸配列のうちＬ１７７Ｆ、Ｋ２５９Ｅ、Ｋ２７０Ｍのアミノ酸置換を有するポリペプチドをコードする二本鎖ＤＮＡを得た。参考例２と同様の方法でｐＵＣＮ１８に導入し、ｐＮＫＰｍ４２を作製した。このｐＮＫＰｍ４２を用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１コンピテントセル（タカラバイオ社製）を形質転換し、改変型カルボニル還元酵素Ｌ１７７Ｆ－Ｋ２５９Ｅ－Ｋ２７０Ｍを生産する組換え生物Ｅ．ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１（ｐＮＫＰｍ４２）を得た。
（実施例２０）多重変異改変型カルボニル還元酵素の作製１４
実施例７で取得したプラスミドｐＮＫＰｍ３７を鋳型として、プライマー１：５’－ＧＧＧＡＡＴＴＣＣＡＴＡＴＧＡＧＴＧＴＴＴＴＡＧＴＴＡＣＡＧＧ－３’（配列表の配列番号４）、プライマー２９：５’－ＧＧＡＣＣＡＡＡＧＡＣＣＡＧＡＡＣＴＧＧＧＴＴＧＡＴＣＧ－３’（配列表の配列番号３２）を用いてＰＣＲを行い、配列番号１に示すアミノ酸配列のうちＦ１９５Ｌのアミノ酸置換を有するＮ末端側のポリペプチドをコードする二本鎖ＤＮＡを得た（Ｎ末端側ＤＮＡ）。同様にプラスミドｐＮＫＰｍ３７を鋳型として、プライマー３０：５’－ＣＧＡＴＣＡＡＣＣＣＡＧＴＴＣＴＧＧＴＣＴＴＴＧＧＴＣＣ－３’（配列表の配列番号３３）、プライマー２：５’－ＡＴＡＣＧＣＧＴＣＧＡＣＴＴＡＣＴＡＴＴＧＴＴＣＴＴＧＡＡＣＣＴＴＣＡ－３’（配列表の配列番号５）を用いてＰＣＲを行い、配列番号１に示すアミノ酸配列のうちＦ１９５Ｌ、Ｋ２５９Ｅ、Ｋ２７０Ｍのアミノ酸置換を有するＣ末端側のポリペプチドをコードする二本鎖ＤＮＡを得た（Ｃ末端側ＤＮＡ）。Ｎ末端側ＤＮＡとＣ末端側ＤＮＡを混合し、これを鋳型として、プライマー１、プライマー２を用いてＰＣＲを行い、配列番号１に示すアミノ酸配列のうちＦ１９５Ｌ、Ｋ２５９Ｅ、Ｋ２７０Ｍのアミノ酸置換を有するポリペプチドをコードする二本鎖ＤＮＡを得た。参考例２と同様の方法でｐＵＣＮ１８に導入し、ｐＮＫＰｍ４３を作製した。このｐＮＫＰｍ４３を用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１コンピテントセル（タカラバイオ社製）を形質転換し、改変型カルボニル還元酵素Ｆ１９５Ｌ－Ｋ２５９Ｅ－Ｋ２７０Ｍを生産する組換え生物Ｅ．ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１（ｐＮＫＰｍ４３）を得た。
（実施例２１）多重変異改変型カルボニル還元酵素の作製１５
実施例７で取得したプラスミドｐＮＫＰｍ３７を鋳型として、プライマー１：５’－ＧＧＧＡＡＴＴＣＣＡＴＡＴＧＡＧＴＧＴＴＴＴＡＧＴＴＡＣＡＧＧ－３’（配列表の配列番号４）、プライマー３１：５’－ＣＴＧＴＴＧＧＡＧＣＡＡＡＣＡＴＣＡＣＴＴＣＣＴＴＧＡＴＧＡＴＴＴＣ－３’（配列表の配列番号３４）を用いてＰＣＲを行い、配列番号１に示すアミノ酸配列のうちＡ２２０Ｖのアミノ酸置換を有するＮ末端側のポリペプチドをコードする二本鎖ＤＮＡを得た（Ｎ末端側ＤＮＡ）。同様にプラスミドｐＮＫＰｍ３７を鋳型として、プライマー３２：５’－ＧＡＡＡＴＣＡＴＣＡＡＧＧＡＡＧＴＧＡＴＧＴＴＴＧＣＴＣＣＡＡＣＡＧ－３’（配列表の配列番号３５）、プライマー２：５’－ＡＴＡＣＧＣＧＴＣＧＡＣＴＴＡＣＴＡＴＴＧＴＴＣＴＴＧＡＡＣＣＴＴＣＡ－３’（配列表の配列番号５）を用いてＰＣＲを行い、配列番号１に示すアミノ酸配列のうちＡ２２０Ｖ、Ｋ２５９Ｅ、Ｋ２７０Ｍのアミノ酸置換を有するＣ末端側のポリペプチドをコードする二本鎖ＤＮＡを得た（Ｃ末端側ＤＮＡ）。Ｎ末端側ＤＮＡとＣ末端側ＤＮＡを混合し、これを鋳型として、プライマー１、プライマー２を用いてＰＣＲを行い、配列番号１に示すアミノ酸配列のうちＡ２２０Ｖ、Ｋ２５９Ｅ、Ｋ２７０Ｍのアミノ酸置換を有するポリペプチドをコードする二本鎖ＤＮＡを得た。参考例２と同様の方法でｐＵＣＮ１８に導入し、ｐＮＫＰｍ４４を作製した。このｐＮＫＰｍ４４を用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１コンピテントセル（タカラバイオ社製）を形質転換し、改変型カルボニル還元酵素Ａ２２０Ｖ－Ｋ２５９Ｅ－Ｋ２７０Ｍを生産する組換え生物Ｅ．ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１（ｐＮＫＰｍ４４）を得た。
（実施例２２）多重変異改変型カルボニル還元酵素の作製１６
実施例７で取得したプラスミドｐＮＫＰｍ３７を鋳型として、プライマー１：５’－ＧＧＧＡＡＴＴＣＣＡＴＡＴＧＡＧＴＧＴＴＴＴＡＧＴＴＡＣＡＧＧ－３’（配列表の配列番号４）、プライマー３３：５’－ＣＧＴＡＣＡＴＣＡＡＣＡＴＡＧＴＴＡＣＣＡＡＡＡＡＣＡＧＡＴＴＴＡＴＣ－３’（配列表の配列番号３６）を用いてＰＣＲを行い、配列番号１に示すアミノ酸配列のうちＳ２３６Ｎのアミノ酸置換を有するＮ末端側のポリペプチドをコードする二本鎖ＤＮＡを得た（Ｎ末端側ＤＮＡ）。同様にプラスミドｐＮＫＰｍ３７を鋳型として、プライマー３４：５’－ＧＡＴＡＡＡＴＣＴＧＴＴＴＴＴＧＧＴＡＡＣＴＡＴＧＴＴＧＡＴＧＴＡＣＧ－３’（配列表の配列番号３７）、プライマー２：５’－ＡＴＡＣＧＣＧＴＣＧＡＣＴＴＡＣＴＡＴＴＧＴＴＣＴＴＧＡＡＣＣＴＴＣＡ－３’（配列表の配列番号５）を用いてＰＣＲを行い、配列番号１に示すアミノ酸配列のうちＳ２３６Ｎ、Ｋ２５９Ｅ、Ｋ２７０Ｍのアミノ酸置換を有するＣ末端側のポリペプチドをコードする二本鎖ＤＮＡを得た（Ｃ末端側ＤＮＡ）。Ｎ末端側ＤＮＡとＣ末端側ＤＮＡを混合し、これを鋳型として、プライマー１、プライマー２を用いてＰＣＲを行い、配列番号１に示すアミノ酸配列のうちＳ２３６Ｎ、Ｋ２５９Ｅ、Ｋ２７０Ｍのアミノ酸置換を有するポリペプチドをコードする二本鎖ＤＮＡを得た。参考例２と同様の方法でｐＵＣＮ１８に導入し、ｐＮＫＰｍ４５を作製した。このｐＮＫＰｍ４５を用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１コンピテントセル（タカラバイオ社製）を形質転換し、改変型カルボニル還元酵素Ｓ２３６Ｎ－Ｋ２５９Ｅ－Ｋ２７０Ｍを生産する組換え生物Ｅ．ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１（ｐＮＫＰｍ４５）を得た。
（実施例２３）多重変異改変型カルボニル還元酵素の作製１７
実施例７で取得したプラスミドｐＮＫＰｍ３７を鋳型として、プライマー１：５’－ＧＧＧＡＡＴＴＣＣＡＴＡＴＧＡＧＴＧＴＴＴＴＡＧＴＴＡＣＡＧＧ－３’（配列表の配列番号４）、プライマー３５：５’－ＧＣＴＡＣＡＴＣＡＣＧＴＡＣＡＴＣＡＡＴＡＴＡＡＣＴＡＣＣＡＡＡＡＡＣ－３’（配列表の配列番号３８）を用いてＰＣＲを行い、配列番号１に示すアミノ酸配列のうちＶ２３８Ｉのアミノ酸置換を有するＮ末端側のポリペプチドをコードする二本鎖ＤＮＡを得た（Ｎ末端側ＤＮＡ）。同様にプラスミドｐＮＫＰｍ３７を鋳型として、プライマー３６：５’－ＧＴＴＴＴＴＧＧＴＡＧＴＴＡＴＡＴＴＧＡＴＧＴＡＣＧＴＧＡＴＧＴＡＧＣ－３’（配列表の配列番号３９）、プライマー２：５’－ＡＴＡＣＧＣＧＴＣＧＡＣＴＴＡＣＴＡＴＴＧＴＴＣＴＴＧＡＡＣＣＴＴＣＡ－３’（配列表の配列番号５）を用いてＰＣＲを行い、配列番号１に示すアミノ酸配列のうちＶ２３８Ｉ、Ｋ２５９Ｅ、Ｋ２７０Ｍのアミノ酸置換を有するＣ末端側のポリペプチドをコードする二本鎖ＤＮＡを得た（Ｃ末端側ＤＮＡ）。Ｎ末端側ＤＮＡとＣ末端側ＤＮＡを混合し、これを鋳型として、プライマー１、プライマー２を用いてＰＣＲを行い、配列番号１に示すアミノ酸配列のうちＶ２３８Ｉ、Ｋ２５９Ｅ、Ｋ２７０Ｍのアミノ酸置換を有するポリペプチドをコードする二本鎖ＤＮＡを得た。参考例２と同様の方法でｐＵＣＮ１８に導入し、ｐＮＫＰｍ４６を作製した。このｐＮＫＰｍ４６を用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１コンピテントセル（タカラバイオ社製）を形質転換し、改変型カルボニル還元酵素Ｖ２３８Ｉ－Ｋ２５９Ｅ－Ｋ２７０Ｍを生産する組換え生物Ｅ．ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１（ｐＮＫＰｍ４６）を得た。
（実施例２４）多重変異改変型カルボニル還元酵素の作製１８
実施例７で取得したプラスミドｐＮＫＰｍ３７を鋳型として、プライマー１：５’－ＧＧＧＡＡＴＴＣＣＡＴＡＴＧＡＧＴＧＴＴＴＴＡＧＴＴＡＣＡＧＧ－３’（配列表の配列番号４）、プライマー３７：５’－ＧＡＴＣＡＡＣＣＴＴＴＴＡＣＣＧＣＴＴＡＡＣＴＣＡＴＣＡＴＴＡＴＧ－３’（配列表の配列番号４０）を用いてＰＣＲを行い、配列番号１に示すアミノ酸配列のうちＴ２５７Ｓのアミノ酸置換を有するＮ末端側のポリペプチドをコードする二本鎖ＤＮＡを得た（Ｎ末端側ＤＮＡ）。同様にプラスミドｐＮＫＰｍ３７を鋳型として、プライマー３８：５’－ＣＡＴＡＡＴＧＡＴＧＡＧＴＴＡＡＧＣＧＧＴＡＡＡＡＧＧＴＴＧＡＴＣ－３’（配列表の配列番号４１）、プライマー２：５’－ＡＴＡＣＧＣＧＴＣＧＡＣＴＴＡＣＴＡＴＴＧＴＴＣＴＴＧＡＡＣＣＴＴＣＡ－３’（配列表の配列番号５）を用いてＰＣＲを行い、配列番号１に示すアミノ酸配列のうちＴ２５７Ｓ、Ｋ２５９Ｅ、Ｋ２７０Ｍのアミノ酸置換を有するＣ末端側のポリペプチドをコードする二本鎖ＤＮＡを得た（Ｃ末端側ＤＮＡ）。Ｎ末端側ＤＮＡとＣ末端側ＤＮＡを混合し、これを鋳型として、プライマー１、プライマー２を用いてＰＣＲを行い、配列番号１に示すアミノ酸配列のうちＴ２５７Ｓ、Ｋ２５９Ｅ、Ｋ２７０Ｍのアミノ酸置換を有するポリペプチドをコードする二本鎖ＤＮＡを得た。参考例２と同様の方法でｐＵＣＮ１８に導入し、ｐＮＫＰｍ４７を作製した。このｐＮＫＰｍ４７を用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１コンピテントセル（タカラバイオ社製）を形質転換し、改変型カルボニル還元酵素Ｔ２５７Ｓ－Ｋ２５９Ｅ－Ｋ２７０Ｍを生産する組換え生物Ｅ．ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１（ｐＮＫＰｍ４７）を得た。
（実施例２５）多重変異改変型カルボニル還元酵素の作製１９
実施例７で取得したプラスミドｐＮＫＰｍ３７を鋳型として、プライマー１：５’－ＧＧＧＡＡＴＴＣＣＡＴＡＴＧＡＧＴＧＴＴＴＴＡＧＴＴＡＣＡＧＧ－３’（配列表の配列番号４）、プライマー３９：５’－ＧＣＡＴＡＧＴＧＡＡＴＧＡＡＧＣＴＴＴＴＧＡＣＡＡＧＡＴＣＡＡＣＣＴＴＴＣＡＣＣ－３’（配列表の配列番号４２）を用いてＰＣＲを行い、配列番号１に示すアミノ酸配列のうちＫ２５９Ｅ、Ｎ２６５Ｋのアミノ酸置換を有するＮ末端側のポリペプチドをコードする二本鎖ＤＮＡを得た（Ｎ末端側ＤＮＡ）。同様にプラスミドｐＮＫＰｍ３７を鋳型として、プライマー４０：５’－ＧＧＴＧＡＡＡＧＧＴＴＧＡＴＣＴＴＧＴＣＡＡＡＡＧＣＴＴＣＡＴＴＣＡＣＴＡＴＧＣ－３’（配列表の配列番号４３）、プライマー２：５’－ＡＴＡＣＧＣＧＴＣＧＡＣＴＴＡＣＴＡＴＴＧＴＴＣＴＴＧＡＡＣＣＴＴＣＡ－３’（配列表の配列番号５）を用いてＰＣＲを行い、配列番号１に示すアミノ酸配列のうちＫ２５９Ｅ、Ｎ２６５Ｋ、Ｋ２７０Ｍのアミノ酸置換を有するＣ末端側のポリペプチドをコードする二本鎖ＤＮＡを得た（Ｃ末端側ＤＮＡ）。Ｎ末端側ＤＮＡとＣ末端側ＤＮＡを混合し、これを鋳型として、プライマー１、プライマー２を用いてＰＣＲを行い、配列番号１に示すアミノ酸配列のうちＫ２５９Ｅ、Ｎ２６５Ｋ、Ｋ２７０Ｍのアミノ酸置換を有するポリペプチドをコードする二本鎖ＤＮＡを得た。参考例２と同様の方法でｐＵＣＮ１８に導入し、ｐＮＫＰｍ４８を作製した。このｐＮＫＰｍ４８を用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１コンピテントセル（タカラバイオ社製）を形質転換し、改変型カルボニル還元酵素Ｋ２５９Ｅ－Ｎ２６５Ｋ－Ｋ２７０Ｍを生産する組換え生物Ｅ．ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１（ｐＮＫＰｍ４８）を得た。
（実施例２６）多重変異改変型カルボニル還元酵素の作製２０
実施例７で取得したプラスミドｐＮＫＰｍ３７を鋳型として、プライマー１：５’－ＧＧＧＡＡＴＴＣＣＡＴＡＴＧＡＧＴＧＴＴＴＴＡＧＴＴＡＣＡＧＧ－３’（配列表の配列番号４）、プライマー４１：５’－ＣＴＣＧＴＴＡＴＧＧＡＣＡＣＧＡＴＣＴＣＣＴＴＧＡＧＧＴＡＡＣＴＣ－３’（配列表の配列番号４４）を用いてＰＣＲを行い、配列番号１に示すアミノ酸配列のうちＫ２５９Ｅ、Ｋ２７０Ｍ、Ｇ３００Ｄのアミノ酸置換を有するＮ末端側のポリペプチドをコードする二本鎖ＤＮＡを得た（Ｎ末端側ＤＮＡ）。同様にプラスミドｐＮＫＰｍ３７を鋳型として、プライマー４２：５’－ＧＡＧＴＴＡＣＣＴＣＡＡＧＧＡＧＡＴＣＧＴＧＴＣＣＡＴＡＡＣＧＡＧ－３’（配列表の配列番号４５）、プライマー２：５’－ＡＴＡＣＧＣＧＴＣＧＡＣＴＴＡＣＴＡＴＴＧＴＴＣＴＴＧＡＡＣＣＴＴＣＡ－３’（配列表の配列番号５）を用いてＰＣＲを行い、配列番号１に示すアミノ酸配列のうちＫ２５９Ｅ、Ｋ２７０Ｍ、Ｇ３００Ｄのアミノ酸置換を有するＣ末端側のポリペプチドをコードする二本鎖ＤＮＡを得た（Ｃ末端側ＤＮＡ）。Ｎ末端側ＤＮＡとＣ末端側ＤＮＡを混合し、これを鋳型として、プライマー１、プライマー２を用いてＰＣＲを行い、配列番号１に示すアミノ酸配列のうちＫ２５９Ｅ、Ｋ２７０Ｍ、Ｇ３００Ｄのアミノ酸置換を有するポリペプチドをコードする二本鎖ＤＮＡを得た。参考例２と同様の方法でｐＵＣＮ１８に導入し、ｐＮＫＰｍ４９を作製した。このｐＮＫＰｍ４９を用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１コンピテントセル（タカラバイオ社製）を形質転換し、改変型カルボニル還元酵素Ｋ２５９Ｅ－Ｋ２７０Ｍ－Ｇ３００Ｄを生産する組換え生物Ｅ．ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１（ｐＮＫＰｍ４９）を得た。
（実施例２７）多重変異改変型カルボニル還元酵素の作製２１
実施例７で取得したプラスミドｐＮＫＰｍ３７を鋳型として、プライマー１：５’－ＧＧＧＡＡＴＴＣＣＡＴＡＴＧＡＧＴＧＴＴＴＴＡＧＴＴＡＣＡＧＧ－３’（配列表の配列番号４）、プライマー４３：５’－ＣＴＴＣＴＣＧＴＴＡＴＧＧＡＣＧＣＡＡＣＣＴＣＣＴＴＧＡＧＧＴＡＡＣＴＣＧ－３’（配列表の配列番号４６）を用いてＰＣＲを行い、配列番号１に示すアミノ酸配列のうちＫ２５９Ｅ、Ｋ２７０Ｍ、Ｒ３０１Ｃのアミノ酸置換を有するＮ末端側のポリペプチドをコードする二本鎖ＤＮＡを得た（Ｎ末端側ＤＮＡ）。同様にプラスミドｐＮＫＰｍ３７を鋳型として、プライマー４４：５’－ＣＧＡＧＴＴＡＣＣＴＣＡＡＧＧＡＧＧＴＴＧＣＧＴＣＣＡＴＡＡＣＧＡＧＡＡＧ　－３’（配列表の配列番号４７）、プライマー２：５’－ＡＴＡＣＧＣＧＴＣＧＡＣＴＴＡＣＴＡＴＴＧＴＴＣＴＴＧＡＡＣＣＴＴＣＡ－３’（配列表の配列番号５）を用いてＰＣＲを行い、配列番号１に示すアミノ酸配列のうちＫ２５９Ｅ、Ｋ２７０Ｍ、Ｒ３０１Ｃのアミノ酸置換を有するＣ末端側のポリペプチドをコードする二本鎖ＤＮＡを得た（Ｃ末端側ＤＮＡ）。Ｎ末端側ＤＮＡとＣ末端側ＤＮＡを混合し、これを鋳型として、プライマー１、プライマー２を用いてＰＣＲを行い、配列番号１に示すアミノ酸配列のうちＫ２５９Ｅ、Ｋ２７０Ｍ、Ｒ３０１Ｃのアミノ酸置換を有するポリペプチドをコードする二本鎖ＤＮＡを得た。参考例２と同様の方法でｐＵＣＮ１８に導入し、ｐＮＫＰｍ５０を作製した。このｐＮＫＰｍ５０を用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１コンピテントセル（タカラバイオ社製）を形質転換し、改変型カルボニル還元酵素Ｋ２５９Ｅ－Ｋ２７０Ｍ－Ｒ３０１Ｃを生産する組換え生物Ｅ．ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１（ｐＮＫＰｍ５０）を得た。
（実施例２８）多重変異改変型カルボニル還元酵素の評価２
実施例１７～２７で取得した多重変異改変型カルボニル還元酵素の各組換え菌および参考例３で作製したＥ．ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１（ｐＮＫＰ）（対照）をそれぞれ参考例４と同様の方法で培養した。実施例４と同様に多重変異改変がたカルボニル還元酵素のジメチルホルムアミドに対する安定性を評価した。ジメチルホルムアミド５０％存在下で評価した野生型酵素および改変型カルボニル還元酵素の相対活性を表７に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
表７に示した改変型カルボニル還元酵素は野生型酵素よりも有機溶剤に対する安定性が向上していた。
（実施例２９）変異酵素ライブラリーの作製２
実施例１５で取得したＫ２５９Ｅ－Ｋ２７０Ｍ変異酵素の変異型ＲＫＰ遺伝子を含むプラスミドｐＮＫＰｍ３７をテンプレートに実施例１と同様の方法で変異酵素ライブラリーを作成し、これを変異酵素ライブラリー２とした。
（実施例３０）改変型カルボニル還元酵素の選抜３
変異酵素ライブラリー２より有機溶剤の１つであるジメチルホルムアミドによる反応阻害に対する抵抗性が向上した改変型カルボニル還元酵素を選抜した。実施例２９で作製した変異酵素ライブラリー２の各組換え菌および参考例３で作製したＥ．ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１（ｐＮＫＰ）（対照）を１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢプレート培地上に植菌した。
得られたコロニーをナイロン膜（ＢｉｏｄｙｎｅＡ、０．４５μｍ）に転写した後、そのナイロン膜を４０％のジメチルホルムアミドを含む５０ｍＭの３－（Ｎ－ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ）ｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ　ａｃｉｄ（ＭＯＰＳ）バッファー中に３０～６０分浸漬した。その後、このナイロン膜を１ｍＭのＮＡＤＰ＋、２００μＭのｎｉｔｒｏｂｌｕｅ　ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ、１０μＭの１－ｍｅｔｈｏｘｙ－５－ｍｅｔｈｙｌｐｈｅｎａｚｉｎｉｕｍ　ｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆａｔｅおよび５％（ｖ／ｖ）の２－プロパノールを含む５０ｍＭのＭＯＰＳバッファー中に室温で３０分浸漬した。その後、ナイロン膜を蒸留水で洗浄し、染色されたコロニーを有機溶剤による反応阻害に対する抵抗性が向上した改変型カルボニル還元酵素の組換え菌の候補として選抜した。これらの候補株を２００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む２×ＹＴ培地（トリプトン１．６％、イーストエキス１．０％、塩化ナトリウム　０．５％、ｐＨ７．０）５ｍｌに接種し、２０時間培養した。得られた培養液を菌体破砕処理し、遠心分離後、沈殿を除去し、無細胞抽出液を得た。無細胞抽出液を９６穴プレート（ＡＧＣテクノグラス社製）に２００μｌ分注し、ＮＡＤＰＨ０．６２５ｍＭと１０ｍＭの２，３－ブタンジオンを含む０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）５０μｌを加え混合した。経時的にＢｅｎｃｈｍａｒｋ　Ｐｌｕｓ　ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ　ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（ＢＩＯ－ＲＡＤ社製）でＮＡＤＰＨの蛍光を観察した。２，３－ブタンジオンの還元によってＮＡＤＰＨが消費され、蛍光がなくなったものを、有機溶剤による反応阻害に対する抵抗性がさらに向上した改変型カルボニル還元酵素の組換え菌として選抜した。選抜した組換え菌の培養液からプラスミドを抽出し、ＢｉｇＤｙｅ　Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　Ｋｉｔ（アプライドバイオシステムズジャパン社製）およびＡｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　３１３０ｘｌジェネティックアナライザ（アプライドバイオシステムズジャパン社製）を用いて変異型ＲＫＰ遺伝子の塩基配列を決定し、変異部位を特定した。得られた有機溶剤による反応阻害に対する抵抗性が向上した改変型カルボニル酵素を表８に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000014
 表８に示す３種類の有機溶剤による反応阻害に対する抵抗性が向上した酵素を取得した。
（実施例３１）改変型カルボニル還元酵素の評価３
実施例３０で取得した改変型カルボニル還元酵素の各組換え菌および参考例３で作製したＥ．ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１（ｐＮＫＰ）（対照）をそれぞれ参考例４と同様の方法で培養した。得られた各培養液について、遠心分離により菌体を集め、培養液の１／５量の１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）に懸濁した。これを、ＵＨ－５０型超音波ホモゲナイザー（ＳＭＴ社製）を用いて破砕した後、遠心分離により菌体残渣を除去し、無細胞抽出液を得た。無細胞抽出液１００μｌに１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）４００μｌ、水または６０％ＤＭＦ溶液５００μｌ、２－ヘキサノン１％、ＮＡＤＰＨ５％、グルコース３．４％を混合し３０℃で２時間撹拌し、反応した。反応後、反応液を酢酸エチルで抽出した。抽出液を下記の［ガスクロマトグラフィーによる分析条件］に記載の条件で分析することにより、２－ヘキサノールの生成を確認した。２－ヘキサノールと２－ヘキサノンのピーク面積から変換率を算出した。
［ガスクロマトグラフィーによる分析条件］
カラム：ＩｎｅｒｔＣａｐＩ　キャピラリーカラム（３０ｍ、内径０．２５ｍｍ、ジーエル　サイエンス社製）
検出器：水素炎イオン化検出器
注入部温度：２５０℃
カラム温度：５０℃
検出器温度：２５０℃
キャリアーガス：ヘリウム、流量１５０ｋＰａ
この変換率から、各組換え菌のジメチルホルムアミド非存在条件に対する、ジメチルホルムアミド６０％存在下での相対活性を算出した。相対活性は下記式より算出し、この値をジメチルホルムアミドによる反応阻害の指標とした。結果を表９に示す。
相対活性（％）＝［ジメチルホルムアミド存在下での変換率］÷［ジメチルホルムアミド非存在下での変換率］×１００
得られた有機溶剤による反応阻害に対する抵抗性が向上した改変型カルボニル還元酵素を表９に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000015
 表９に示す３種類の有機溶剤による反応阻害に対する抵抗性が向上した酵素を取得した。表に示した改変型カルボニル還元酵素は野生型酵素よりも有機溶剤の１つであるジメチルホルムアミドによる反応阻害に対する抵抗性が向上していた。
（実施例３２）３－［（５Ｒ）－（４－フルオロ－フェニル）－５－ヒドロキシペンタノイル］－（４Ｓ）－フェニル－１，３－オキサゾリジン－２－オンの製造
参考例４で取得したヴァンデルワルトザイマ・ポリスポラ（Ｖａｎｄｅｒｗａｌｔｏｚｙｍａ　ｐｏｌｙｓｐｏｒａ）ＮＢＲＣ０９９６株由来のカルボニル還元酵素ＲＫＰ（野生型）を発現する組換え大腸菌の培養液、および実施例２４で取得した改変型カルボニル還元酵素Ｔ２５７Ｓ－Ｋ２５９Ｅ－Ｋ２７０Ｍを生産する組換え大腸菌を参考例４と同様の方法を用いて培養した培養液７００μｌに、グルコース脱水素酵素（商品名：ＧＬＵＣＤＨ“Ａｍａｎｏ”ＩＩ、天野エンザイム社製）１２．５Ｕ、グルコース８０ｍｇ、ＮＡＤＰ＋０．６ｍｇ、ジメチルホルムアミドまたは０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７）３００μｌ、（Ｓ）－１－（４－フルオロ－フェニル）－５－（２－オキソ－４－フェニル－オキサゾリジン－３－イル）－ペンタン－１，５－ジオン１０ｍｇを加えて、３０℃で２０時間撹拌した。反応液をジメチルスルホキシドで希釈し、下記の条件で高速液体クロマトグラフィー分析し、３－［（５Ｒ）－（４－フルオロ－フェニル）－５－ヒドロキシペンタノイル］－（４Ｓ）－フェニル－１，３－オキサゾリジン－２－オンへの変換率、その光学純度を測定した。その結果を表１０に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000016
［３－［（５Ｒ）－（４－フルオロ－フェニル）－５－ヒドロキシペンタノイル］－（４Ｓ）－フェニル－１，３－オキサゾリジン－２－オンへの変換率の算出方法と分析条件］
カラム：ＣＯＳＭＯＳＩＬ　５Ｃ８－ＭＳ（２５０ｍｍ、内径４．６μｍ、ナカライテスク社製）
カラム温度：４０℃
検出波長：２５４ｍｍ
移動相：水／アセトニトリル＝１／１
保持時間：［３－［（５）－（４－フルオロ－フェニル）－５－ヒドロキシペンタノイル］－（４）－フェニル－１，３－オキサゾリジン－２－オン　約８．５分、１－（４－フルオロ－フェニル）－５－（２－オキソ－４－フェニル－オキサゾリジン－３－イル）－ペンタン－１，５－ジオン　約１２．９分
変換率＝［３－［（５）－（４－フルオロ－フェニル）－５－ヒドロキシペンタノイル］－（４）－フェニル－１，３－オキサゾリジン－２－オンの生成量／（［３－［（５）－（４－フルオロ－フェニル）－５－ヒドロキシペンタノイル］－（４）－フェニル－１，３－オキサゾリジン－２－オンの生成量＋１－（４－フルオロ－フェニル）－５－（２－オキソ－４－フェニル－オキサゾリジン－３－イル）－ペンタン－１，５－ジオンの残存量）×１００
［３－［（５Ｒ）－（４－フルオロ－フェニル）－５－ヒドロキシペンタノイル］－（４Ｓ）－フェニル－１，３－オキサゾリジン－２－オンの光学純度の算出方法と分析条件］
カラム：ＣＨＩＲＡＬＣＥＬ　ＯＤ－Ｈ（２５０ｍｍ、内径４．６μｍ、ダイセル化学工業社製）
カラム温度：３０℃
検出波長：２５４ｍｍ
移動相：ヘキサン／エタノール＝８／２
保持時間：３－［（５Ｒ）－（４－フルオロ－フェニル）－５－ヒドロキシペンタノイル］－（４Ｓ）－フェニル－１，３－オキサゾリジン－２－オン　約１８．１分、３－［（５Ｓ）－（４－フルオロ－フェニル）－５－ヒドロキシペンタノイル］－（４Ｓ）－フェニル－１，３－オキサゾリジン－２－オン　約２１．７分
Ｒ体の光学純度（％ｅ．ｅ．）＝｛（Ｒ体のピーク面積）－（Ｓ体のピーク面積）｝÷｛（Ｒ体のピーク面積）＋（Ｓ体のピーク面積）｝×１００

Claims (17)

  1. 以下の（ａ）～（ｃ）；
    （ａ）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列と７８％以上の配列同一性を有し、
    （ｂ）２－ペンタノンを還元して２－ペンタノールを生成し、かつ、
    （ｃ）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるカルボニル還元酵素と比較して、有機溶剤存在下でカルボニル化合物に対する反応性が高い、および／または熱安定性が高い、
    の性質を示すポリペプチド。
  2. 前記有機溶剤がジメチルホルムアミドである、請求項１に記載のポリペプチド。
  3. 配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列において次の群；
    ２番目、２２番目、２５番目、３９番目、４２番目、４５番目、５１番目、５６番目、７１番目、８７番目、９０番目、１０２番目、１０９番目、１２４番目、１３５番目、１３８番目、１５５番目、１５９番目、１７５番目、１７７番目、１８３番目、１９０番目、１９５番目、２１２番目、２２０番目、２２６番目、２２８番目、２３６番目、２３８番目、２５０番目、２５４番目、２５７番目、２５９番目、２６５番目、２６７番目、２７０番目、２７９番目、２９８番目、３００番目、３０１番目、および３３１番目から選択される１つ以上のアミノ酸に、アミノ酸置換が導入されている、請求項１または２に記載のポリペプチド。
  4. アミノ酸置換が、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列において次の群；
    ２番目がイソロイシン、２２番目がアルギニン、２５番目がフェニルアラニン、３９番目がアルギニン、４２番目がアルギニン、４５番目がアスパラギン酸、５１番目がアラニン、５６番目がリジン、７１番目がアスパラギンもしくはアルギニン、８７番目がイソロイシン、９０番目がグリシン、１０２番目がイソロイシン、１０９番目がグリシン、１２４番目がロイシン、１３５番目がアラニン、１３８番目がアスパラギン、１５５番目がロイシンもしくはアルギニン、１５９番目がフェニルアラニン、１７５番目がアスパラギン酸、１７７番目がフェニルアラニン、１８３番目がスレオニン、１９０番目がセリン、１９５番目がロイシン、２１２番目がフェニルアラニン、スレオニンもしくはチロシン、２２０番目がバリン、２２６番目がグリシン、２２８番目がバリン、２３６番目がアスパラギン、２３８番目がイソロイシン、２５０番目がプロリン、２５４番目がアスパラギン、２５７番目がセリン、２５９番目がグルタミン酸、２６５番目がリジン、２６７番目がプロリン、２７０番目がメチオニン、２７９番目がアルギニン、２９８番目がプロリン、３００番目がアスパラギン酸、３０１番目がシステイン、および、３３１番目がフェニルアラニンに置換されるアミノ酸置換、
    から選択される１つ以上のアミノ酸置換である、請求項３に記載のポリペプチド。
  5. アミノ酸置換が、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列において次の群；
    ２番目がイソロイシン、４５番目がアスパラギン酸、７１番目がアスパラギンもしくはアルギニン、１０２番目がイソロイシン、１２４番目がロイシン、１７５番目がアスパラギン酸、１７７番目がフェニルアラニン、１８３番目がスレオニン、１９５番目がロイシン、２２０番目がバリン、２２６番目がグリシン、２３６番目がアスパラギン、２３８番目がイソロイシン、２５７番目がセリン、２５９番目がグルタミン酸、２６５番目がリジン、２６７番目がプロリン、２７０番目がメチオニン、３００番目がアスパラギン酸、および、３０１番目がシステインに置換されるアミノ酸置換、
    から選択される１つ以上のアミノ酸置換であり、
    配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるカルボニル還元酵素と比較して、有機溶剤に対する安定性が向上している、請求項４に記載のポリペプチド。
  6. アミノ酸置換が、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列において下記の（１）～（３５）；
    （１）７１番目がアスパラギン、１９５番目がロイシン、
    （２）７１番目がアルギニン、２５９番目がグルタミン酸、
    （３）７１番目がアルギニン、２７０番目がメチオニン、
    （４）７１番目がアルギニン、３００番目がアスパラギン酸、
    （５）１０２番目がイソロイシン、２７０番目がメチオニン、
    （６）１７７番目がフェニルアラニン、２２０番目がバリン、
    （７）２２６番目がグリシン、２７０番目がメチオニン、
    （８）２５７番目がセリン、２５９番目がグルタミン酸、
    （９）２５７番目がセリン、２７０番目がメチオニン、
    （１０）２５９番目がグルタミン酸、２７０番目がメチオニン、
    （１１）２５９番目がグルタミン酸、３００番目がアスパラギン酸、
    （１２）２６７番目がプロリン、２７０番目がメチオニン、
    （１３）２７０番目がメチオニン、３００番目がアスパラギン酸、
    （１４）２番目がイソロイシン、２５９番目がグルタミン酸、２７０番目がメチオニン、
    （１５）４５番目がアスパラギン酸、１７５番目がアスパラギン酸、１８３番目がスレオニン、
    （１６）１０２番目がイソロイシン、２２６番目がグリシン、２６７番目がプロリン、
    （１７）１２４番目がロイシン、２５９番目がグルタミン酸、２７０番目がメチオニン、
    （１８）１７７番目がフェニルアラニン、２５９番目がグルタミン酸、２７０番目がメチオニン、
    （１９）２２０番目がバリン、２５９番目がグルタミン酸、２７０番目がメチオニン、
    （２０）２３６番目がアスパラギン、２５９番目がグルタミン酸、２７０番目がメチオニン、
    （２１）２３８番目がイソロイシン、２５９番目がグルタミン酸、２７０番目がメチオニン、
    （２２）２５７番目がセリン、２５９番目がグルタミン酸、２７０番目がメチオニン、
    （２３）２５７番目がセリン、２５９番目がグルタミン酸、３００番目がアスパラギン酸、
    （２４）２５９番目がグルタミン酸、２６５番目がリジン、２７０番目がメチオニン、
    （２５）２５９番目がグルタミン酸、２７０番目がメチオニン、３００番目がアスパラギン酸、
    （２６）２５９番目がグルタミン酸、２７０番目がメチオニン、３０１番目がシステイン、
    （２７）２番目がイソロイシン、２３８番目がイソロイシン、
    （２８）７１番目がアスパラギン、１９５番目がロイシン、
    （２９）１０９番目がグリシン、３３１番目がフェニルアラニン、
    （３０）１２４番目がロイシン、２３６番目がアスパラギン、
    （３１）１５９番目がフェニルアラニン、２５９番目がグルタミン酸、
    （３２）４２番目がアルギニン、１５５番目がアルギニン、２７９番目がアルギニン、
    （３３）４５番目がアスパラギン酸、１７５番目がアスパラギン酸、１８３番目がスレオニン、
    （３４）１５５番目がロイシン、２５０番目がプロリン、２９８番目がプロリン、および
    （３５）５６番目がリジン、１３８番目がアスパラギン、１９０番目がセリン、２５４番目がアスパラギンに置換されるアミノ酸置換、
    から選択されるアミノ酸置換が導入されている、請求項５に記載のポリペプチド。
  7. アミノ酸置換が、次の群；
    ２２番目がアルギニン、３９番目がアルギニン、５１番目がアラニン、８７番目がイソロイシン、９０番目がグリシン、２５９番目がグルタミン酸、および、２７０番目がメチオニンに置換されるアミノ酸置換、
    から選択される１つ以上のアミノ酸置換であり、
    配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるカルボニル還元酵素と比較して、有機溶剤による反応阻害に対する抵抗性が向上している、請求項４に記載のポリペプチド。
  8. アミノ酸置換が、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列において下記の（１）～（７）；
    （１）２２番目がアルギニン、
    （２）２２番目がアルギニン、８７番目がイソロイシン、
    （３）３９番目がアルギニン、
    （４）３９番目がアルギニン、５１番目がアラニン、
    （５）５１番目がアラニン、
    （６）８７番目がイソロイシン、および
    （７）９０番目がグリシンに置換されるアミノ酸置換、
    から選択される1つ以上のアミノ酸置換である、請求項７に記載のポリペプチド。
  9. 請求項１～８のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
  10. 請求項９に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
  11. 還元型補酵素再生能を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに含む、請求項１０に記載のベクター。
  12. 還元型補酵素再生能を有するポリペプチドがグルコース脱水素酵素である、請求項１１に記載のベクター。
  13. 請求項１０～１２のいずれか１項に記載のベクターにより宿主細胞を形質転換して得られる形質転換体。
  14. 前記宿主細胞が大腸菌である請求項１３に記載の形質転換体。
  15. 請求項１～８のいずれか１項に記載のポリペプチド、または、請求項１３または請求項１４に記載の形質転換体および／またはその処理物を、カルボニル化合物に作用させることを特徴とする、アルコール化合物の製造方法。
  16. 前記カルボニル化合物が非対称ケトンであり、前記アルコール化合物が光学活性アルコールである、請求項１５に記載の製造方法。
  17. 前記カルボニル化合物が、下記式（１）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     （式中、Ｒ１およびＲ２は水素原子、ハロゲン原子、置換されていても良いアルキル基、置換されていても良いアラルキル基、置換されていても良いアリール基、置換されていても良いアルコキシ基、アミノ基、またはニトロ基であるか、もしくは、Ｒ１とＲ２が互いに結合し環を形成しても良い。但し、Ｒ１とＲ２は構造が異なる）で表される非対称ケトンであり、
    前記アルコール化合物が下記式（２）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     （式中、Ｒ１、Ｒ２は前記と同じ、＊は不斉炭素を表す）で表される光学活性アルコールである、請求項１５または１６に記載の製造方法。
    　
    　
    　
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