WO2014175305A1 - ペプチド提示タンパク質及びそれを用いたペプチドライブラリー - Google Patents

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    • G01N2333/96425—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals
    • G01N2333/96427—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals in general
    • G01N2333/9643—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals in general with EC number
    • G01N2333/96466—Cysteine endopeptidases (3.4.22)

Definitions

  • the present invention relates to a peptide-presenting protein and a peptide library using the same. According to the present invention, a peptide having high specificity for a target molecule can be screened.
  • phage display As a display method for a specific peptide library, a phage display method (phage display), an E. coli display method, a yeast display method, or the like is used.
  • phage display the screened peptide is expressed as a polypeptide fusion to a bacteriophage coat protein.
  • the phage particles on which the peptide is displayed are brought into contact with a microtiter plate on which the target substance is immobilized, and affinity selection is performed to concentrate the phage having a peptide having an affinity for the target substance (non-binding).
  • Patent Document 1 In the phage display method, since the peptide displayed on the enriched phage and the gene encoding it correspond one-to-one, the target peptide can be easily identified. Further, since the gene can be easily amplified (proliferated), it is widely used as a screening method for peptides.
  • an object of the present invention is to provide a method for screening a peptide having high specificity with a target molecule.
  • Non-patent Document 2 Non-patent Document 2; hereinafter referred to as sfGFP may be referred to as No.
  • a peptide-presenting protein in which a peptide is presented in the presentation region of Nos. 131 to 139 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 54, wherein the presentation represents the amino acid sequence of 4 to 15 peptides, An amino acid sequence that is inserted into the amino acid sequence of Nos. 131 to 139 or substituted for the amino acid sequence of 1 to 9 of the amino acid sequence of Nos.
  • peptide-presenting protein having a chain length of 15 or less
  • amino acid sequence of Nos. 1 to 130 or the amino acid sequence of Nos. 140 to 238 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 54 one or more amino acids are deleted, substituted, inserted, and / or added.
  • amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 54 wherein the presentation comprises the amino acid sequence of 4 to 15 peptides
  • a peptide-presenting protein having a sequence chain length of 15 or less [10]
  • one or more amino acids are deleted, substituted, inserted, and / or added.
  • 131 to 139 or Nos. 131 to A nucleotide encoding a peptide that is substituted with the amino acid sequence of 1 to 9 of the amino acid sequence of the presentation region of 139 and whose chain length of the amino acid sequence corresponding to the amino acid sequence of 131 to 139 is 15 or less
  • a method of constructing a library comprising integration, obtaining an expression vector, and (2) introducing the expression vector into a host, [17]
  • a method for screening a peptide that binds to a target molecule comprising: (1) contacting the target molecule with the peptide library according to [8]; and (2) recovering a host bound to the target molecule.
  • the peptide-presenting protein of the present invention and a peptide library using the same, it is possible to screen for peptides having high specificity for the target molecule.
  • sfGFP which is a parent protein for presenting peptides
  • the number of molecules can be easily estimated from the fluorescence intensity. Therefore, it is useful for evaluating the amount of peptide binding during screening.
  • the present invention can be applied to widely used display technologies (eg, phage display method, E. coli display method, yeast display method, in vitro virus method, or ribosome display method). Therefore, it can be applied to existing high-throughput screening techniques.
  • based on the sequence information and structure information of the peptide obtained by the present invention it is possible to develop a molecular target drug and a drug delivery system.
  • the peptide-presenting protein of the present invention is a peptide-presenting protein in which a peptide is presented in the presentation region of Nos. 131 to 139 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 54, and the number of presentations is 4 to 15 (preferably 4-14, more preferably 4-13, and still more preferably 4-12) amino acid sequences of the 131st to 139th amino acid sequences or the 131st to 139th amino acid sequences.
  • 131 to 139 is 15 or less (preferably 14 or less, more preferably 13 or less, More preferably, it is 12 or less. Further, the lower limit of the chain length of the amino acid sequence corresponding to the amino acid sequence of Nos. 131 to 139 is preferably 5 or more.
  • one or a plurality of amino acids in the amino acid sequence Nos. 1 to 130 or the amino acid sequence Nos. 140 to 238 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 54 are deleted, substituted, inserted, And / or a peptide-presenting protein consisting of an added amino acid sequence and having fluorogenic activity.
  • the protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 54 is sfGFP described in Non-Patent Document 2, but in the peptide-presenting protein of the present invention, a GFP protein is used as a parent protein into which the peptide is incorporated. Can do. That is, GFP or GFP-derived GFP mutant protein can be used without limitation. Specific parent proteins can include GFP, YFP, CFP, BFP, or RFP. More preferably, the peptide-presenting protein of the present invention is a peptide-presenting protein in which a peptide is presented in the region of Nos.
  • the amino acid sequence of the peptide (preferably 4 to 13, more preferably 4 to 12) is inserted into the amino acid sequence of Nos. 131 to 138, or 1 to 8 amino acids of the amino acid sequence of Nos. 131 to 138
  • the chain length of the amino acid sequence that replaces the sequence and corresponds to the amino acid sequence of Nos. 131 to 138 is 14 or less (preferably 13 or less, more preferably 12 or less). Further, the lower limit of the chain length of the amino acid sequence corresponding to the amino acid sequence of Nos. 131 to 138 is preferably 4 or more.
  • the peptide-presenting protein of the present invention preferably has one or more amino acids deleted in the amino acid sequence Nos. 1 to 130 or 139 to 238 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 54 It may be a peptide-presenting protein consisting of a substituted, inserted, and / or added amino acid sequence and having fluorogenic activity. More preferably, the peptide-presenting protein of the present invention is a peptide-presenting protein in which a peptide is presented in the region of Nos.
  • the amino acid sequence of the peptide (preferably 4 to 12) is inserted into the amino acid sequence of the 131st to 137th amino acids or substituted with the 1 to 7 amino acid sequence of the amino acid sequence of the 131st to 137th amino acids.
  • the chain length of the amino acid sequence corresponding to the amino acid sequence of Nos. 131 to 137 is 13 or less (preferably 12 or less). Further, the lower limit of the chain length of the amino acid sequence corresponding to the amino acid sequence of Nos. 131 to 137 is preferably 4 or more.
  • the peptide-presenting protein of the present invention preferably has one or more amino acids deleted in the amino acid sequence Nos. 1 to 130 or 139 to 238 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 54 It may be a peptide-presenting protein consisting of a substituted, inserted, and / or added amino acid sequence and having fluorogenic activity.
  • the one where the length of the peptide shown is short is preferable at the point that aggregation of protein may be suppressed.
  • the 131st to 138th region or the 131st to 137th region is preferable because the aggregation of proteins may be suppressed.
  • the peptide-presenting protein of the present invention is a peptide-presenting protein capable of presenting a peptide in the presenting region of the 131st to 139th amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 54, and the number of the presenting proteins is 4-15 ( Preferably 4 to 14, more preferably 4 to 13, more preferably 4 to 12) amino acid sequence is inserted into the 131st to 139th amino acid sequences, or 131st to 139th amino acids.
  • the protein for presenting a peptide of the present invention is preferably 15 or less (preferably 14 or less, more preferably 13) Hereinafter, more preferably 12 or less. Further, the lower limit of the chain length of the amino acid sequence corresponding to the amino acid sequence of Nos. 131 to 139 is preferably 5 or more. Furthermore, in the protein for presenting a peptide of the present invention, one or more amino acids are deleted or substituted in the amino acid sequence Nos. 1 to 130 or the amino acid sequence Nos. 140 to 238 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 54
  • the peptide-presenting protein may comprise the amino acid sequence inserted, inserted and / or added, and has a fluorogenic activity.
  • the protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 54 is sfGFP described in Non-Patent Document 2, but in the peptide presenting protein of the present invention, a GFP protein is used as a parent protein into which the peptide is incorporated. be able to. That is, GFP or GFP-derived GFP mutant protein can be used without limitation. Specific parent proteins can include GFP, YFP, CFP, BFP, or RFP.
  • the peptide-presenting protein of the present invention is more preferably a peptide-presenting protein in which a peptide is presented in the region of Nos. 131 to 138 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 54.
  • amino acid sequences are inserted into the 131st to 138th amino acid sequences, or 1 to 8 amino acid sequences of 131st to 138th amino acids.
  • the chain length of the amino acid sequence corresponding to the amino acid sequence of Nos. 131 to 138 is 14 or less (preferably 13 or less, more preferably 12 or less).
  • the lower limit of the chain length of the amino acid sequence corresponding to the amino acid sequence of Nos. 131 to 138 is preferably 4 or more.
  • the peptide-presenting protein of the present invention preferably lacks one or more amino acids in the amino acid sequence Nos. 1 to 130 or 139 to 238 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 54.
  • the peptide-presenting protein of the present invention is more preferably a peptide-presenting protein in which a peptide is presented in the region of Nos. 131 to 137 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 54, wherein the presentation is 4 to 13
  • the amino acid sequence of each peptide (preferably 4 to 12) is inserted into the amino acid sequence of the 131st to 138th amino acids, or is replaced with the 1-7 amino acid sequence of the amino acid sequence of the 131st to 137th amino acids.
  • the peptide-presenting protein of the present invention preferably lacks one or more amino acids in the amino acid sequence Nos. 1 to 130 or 139 to 238 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 54. It may be a peptide-presenting protein consisting of a deleted, substituted, inserted and / or added amino acid sequence and having fluorogenic activity.
  • the “peptide-presenting protein” means, for example, a protein in which a peptide is presented in the region of Nos. 131 to 139 of sfGFP.
  • it means an sfGFP protein in which an arbitrary peptide used for peptide screening has already been incorporated in the region from No. 131 to No. 139.
  • it means a protein expressed from a vector contained in the peptide library of the present invention.
  • the “peptide-presenting protein” means a protein designed so that a peptide can be presented in the region of Nos. 131 to 139 of sfGFP, for example.
  • the polynucleotide encoding the peptide-presenting protein preferably has a restriction enzyme site for introducing a nucleotide encoding any peptide.
  • the areas 131 to 139 are preferably areas 131 to 138, and more preferably areas 131 to 137.
  • the length of the peptide to be inserted is preferably 4 to 15, more preferably 4 to 14, further preferably 4 to 13, and most preferably 4 to 12. This is because a peptide having a shorter length tends to solubilize the peptide-presenting protein.
  • Presentation region amino acid sequence from No. 131 to No. 139
  • the amino acid sequence of Nos. 131 to 139 in the amino acid sequence of sfGFP is “KEDGNLGH” (SEQ ID NO: 55).
  • this 9 amino acid sequence region is replaced with a peptide consisting of 4 to 15 (preferably 4 to 14) amino acid sequences, the structural freedom of the peptide is limited and a stable structure is presented on sfGFP. Is done. Therefore, by using it as a peptide library, it is possible to screen peptides having high specificity for the target molecule.
  • the presentation region is the amino acid sequence of Nos.
  • the amino acid sequence to be inserted or substituted is 4 to 15, preferably 4 to 14, and a part of the amino acid sequence of Nos. 131 to 139 is used. May be included. Accordingly, 4 to 6 amino acid sequences may be inserted without deleting the amino acid sequence of Nos. 131 to 139. Further, any number of amino acid sequences from 1 to 9 of the amino acid sequence of No. 131 to No. 139 is deleted, and the foreign amino acid sequence is changed to a total of 5 to 15, preferably 5 to 14. May be incorporated.
  • the presentation region is preferably the amino acid sequence from number 131 to number 138.
  • the number of amino acid sequences to be inserted or substituted is 4 to 14, preferably 4 to 13, and may include a part of the amino acid sequence of Nos. 131 to 138. Therefore, 4 to 6 amino acid sequences may be inserted without deleting the amino acid sequence of Nos. 131 to 138. Further, any number of amino acid sequences from 1 to 8 in the amino acid sequence from No. 131 to No. 138 is deleted, and the foreign amino acid sequence is changed to 4 to 14, preferably 4 to 13 in total. May be incorporated. Furthermore, in order to construct a peptide library efficiently, the amino acid sequences at both ends of the inserted or substituted peptide are preferably translated amino acid sequences of base sequences including restriction enzyme sites.
  • restriction enzyme site used for peptide incorporation is not limited, for example, BamHI, EcoRI, ScaI, SalI, SphI, PstI, NcoI, NheI, SspI, NotI, SacI, PvuII, MfeI, HindIII, SbfI, EagI, EcoRV, AvrII, BstXI, PciI, HpaI, AgeI, BsmBI, BspQI, SapI, KpnI or BsaI can be used.
  • amino acid sequence at both ends of 4 to 14 peptides to be inserted or substituted may be an amino acid sequence translated from a nucleotide containing a base sequence recognized by these restriction enzymes.
  • a peptide translated from such a restriction enzyme site may be referred to as a linker peptide.
  • the GFP-based protein can be used as the parent protein of the “peptide-presenting protein” and the “peptide-presenting protein” of the present invention.
  • the amino acid sequence encoding the GFP-based protein 1 or It may be a protein having an amino acid sequence in which a plurality of amino acids are deleted, substituted, inserted and / or added, and having fluorogenic activity.
  • amino acid in which one or more amino acids are deleted, substituted, inserted, and / or added in an amino acid sequence means a GFP-based protein or a site-specific mutation.
  • modification has been made by a known method such as a mutagenesis method or by substitution of several amino acids to the extent that can occur naturally.
  • the number of amino acid modifications is preferably 1 to 15, more preferably 1 to 10, still more preferably 1 to 5, even more preferably 1 to 3, and most preferably 1.
  • An example of a modified amino acid sequence of a polypeptide of the present invention can preferably be an amino acid sequence in which the amino acid has one or several (preferably 1, 2, 3 or 4) conservative substitutions. .
  • “conservative substitution” means that one or several amino acid residues are replaced with another chemically similar amino acid residue. For example, when a certain hydrophobic residue is substituted by another hydrophobic residue, a certain polar residue is substituted by another polar residue having the same charge, and the like. Functionally similar amino acids that can be made by such substitutions are known in the art for each amino acid. Examples of nonpolar (hydrophobic) amino acids include alanine, valine, isoleucine, leucine, proline, tryptophan, phenylalanine, methionine, and the like.
  • Examples of polar (neutral) amino acids include glycine, serine, threonine, tyrosine, glutamine, asparagine, cysteine, and the like.
  • Examples of positively charged (basic) amino acids include arginine, histidine, and lysine.
  • Examples of negatively charged (acidic) amino acids include aspartic acid and glutamic acid. Even when they are not chemically similar, amino acid residues having similar amino acid structures may be substituted. Examples include substitution of aspartic acid (D) with alanine (A), substitution of asparagine (E) with alanine (A), substitution of tyrosine (Y) with phenylalanine (F), and the like.
  • the fusion protein of the present invention is a protein in which the peptide-presenting protein of the present invention or a peptide-presenting protein and a surface-presenting protein are fused.
  • the surface display protein means a protein displayed on the surface of the host described later.
  • the host when the host is a phage, it means a surface protein of the phage.
  • the host when the host is a bacterium, it means a bacterial surface protein.
  • yeast when the host is yeast, it means a yeast surface protein, and when the host is an animal cell, it means an animal cell surface protein.
  • the peptide-presenting protein can be presented on the surface of the host by fusing the peptide-presenting protein or the protein for presenting the peptide with the surface protein of the host. Therefore, when affinity selection (screening) of a target peptide is performed using the peptide library of the present invention, the target peptide can be easily concentrated.
  • the surface protein of the phage includes, but is not limited to, g13p of g13p, g8p of M13 phage, or G10 of T7 phage.
  • Bacterial surface proteins such as E. coli surface protein include, but are not limited to, OmpA.
  • Examples of the surface protein of yeast include, but are not limited to, Flo1, ⁇ -agglutinin, or AGA2.
  • Examples of animal cell surface proteins include, but are not limited to, human Toll-like receptor 4, EGFR, LDL receptor, angiotensin II receptor, or PDGFR.
  • the polynucleotide of the present invention includes a polynucleotide encoding the peptide-presenting protein of the present invention (hereinafter sometimes referred to as a peptide-presenting polynucleotide), and a polynucleotide encoding a peptide-presenting protein (hereinafter referred to as a peptide-presenting polynucleotide). Or a polynucleotide encoding a fusion protein (hereinafter sometimes referred to as a fusion polynucleotide).
  • the fusion polynucleotide may comprise a nucleotide encoding a linker polypeptide that may be present between the peptide-presenting protein or peptide-presenting protein and the surface-presenting protein.
  • the base sequence of SEQ ID NO: 53 is the base sequence of the nucleotide encoding sfGFP.
  • the polynucleotide of the present invention is not limited, but can be easily amplified by incorporating it into a vector. Moreover, it can be easily expressed as a peptide-presenting protein or a fusion protein.
  • a vector into which the polynucleotide is incorporated any vector such as a plasmid, phage, or virus can be used as long as it can replicate in a host cell.
  • Escherichia coli plasmids such as pBR322, pBR325, pUC118, pUC119, pKC30, and pCFM536, Bacillus subtilis plasmids such as pUB110, yeast plasmids such as pG-1, YEp13, and YCp50, and phage DNAs such as ⁇ gt110 and ⁇ ZAPII.
  • vectors for mammalian cells include viral DNA such as baculovirus, vaccinia virus, adenovirus, SV40 and its derivatives.
  • the vector contains a replication origin, a selectable marker, and a promoter, and may contain an enhancer, a transcription termination sequence (terminator), a ribosome binding site, a polyadenylation signal, and the like as necessary.
  • a transcription termination sequence terminal
  • a ribosome binding site a polyadenylation signal, and the like.
  • the “host” is not limited as long as the vector is incorporated and the peptide-presenting protein or fusion protein can be expressed, and examples thereof include phage, bacteria, yeast, insect cells, or animal cells. Can do.
  • the phage vector host may include M13 phage, fd phage, or T7 phage.
  • examples of bacterial vector hosts include Escherichia coli, Streptomyces, and Bacillus subtilis.
  • examples of the yeast vector host include baker's yeast and methanol-assimilating yeast.
  • examples of insect cell vector hosts include Drosophila S2 and Spodoptera Sf9.
  • examples of the host for animal cell vectors include CHO, COS, BHK, 3T3, and C127.
  • the library of the present invention is a peptide display library, and the displayed peptide has an arbitrary amino acid sequence.
  • the peptide display library of the present invention can be used to screen for peptides that bind to a target molecule. Therefore, the presented peptide preferably includes a plurality (multiple types) of peptides having a random amino acid sequence.
  • the library of the present invention is a library containing the above-mentioned host, and examples thereof include phage display or cell display libraries of bacteria, yeast, insect cells, or animal cells.
  • the length of the displayed peptide subjected to screening using the library of the present invention is not particularly limited, but is, for example, 4 to 15, preferably 4 to 14, more preferably 4 to 13. is there.
  • the library construction method of the present invention comprises (1) 4 to 15 (preferably 4 to 14) vectors containing a polypeptide encoding the peptide-presenting protein of the present invention. Wherein the amino acid sequence is inserted into the amino acid sequence of the 131st to 139th presentation regions or substituted with 1 to 9 amino acid sequences of the amino acid sequence of the 131st to 139th presentation regions, And a step of obtaining a vector by incorporating a nucleotide encoding a peptide having a chain length of 15 or less (preferably 14 or less) of the amino acid sequence corresponding to the amino acid sequence of the display region of Nos. 131 to 139, and (2 ) Introducing the vector into a host; including.
  • the library is specifically a peptide display library and is a library capable of displaying any peptide.
  • the library construction method of the present invention preferably comprises (1) a vector containing a polypeptide encoding the peptide-presenting protein of the present invention and 4 to 14 (preferably 4 to 13) peptides, The amino acid sequence is inserted into the amino acid sequence of the presentation region of Nos. 131 to 138 or substituted with the 1-8 amino acid sequence of the amino acid sequence of the presentation region of Nos. 131 to 138, and the Nos.
  • 131 to 138 Incorporating a nucleotide encoding a peptide having an amino acid sequence corresponding to the amino acid sequence of the display region of 14 or less (preferably 13 or less) into a vector, and (2) using the vector as a host. Introducing.
  • the vector used for the library construction method is a vector containing a polypeptide encoding a peptide-presenting protein, and a polynucleotide encoding any polypeptide can be easily incorporated, for example, by a restriction enzyme site.
  • the length of the polypeptide encoded by the nucleotide to be incorporated is not particularly limited, but is, for example, 4 to 15, preferably 4 to 14, and more preferably 4 to 13.
  • a known method can be used for the construction of the vector and the introduction of the vector into the host.
  • the host is a phage
  • a library gene of a peptide displayed on a vector arm having a restriction enzyme cloning site is incorporated by ligation.
  • the resulting ligation solution is mixed with a packaging solution containing phage protein to form phage particles.
  • a phage library can be constructed by infecting this phage particle with E. coli (eg, BLT5403).
  • the gene to be incorporated into the library can be adjusted by a known method.
  • an NNK codon that encodes a random amino acid (N is any base of A, G, C, or T, K is any base of G or T) and a codon that encodes any amino acid are site-specifically Replace.
  • a method of chemically synthesizing an oligo DNA containing the region and incorporating it using a restriction enzyme or replicating the full length of the vector using PCR is used.
  • the screening method of the present invention comprises (1) a step of contacting a target molecule and the peptide library, (2) a step of recovering a host bound to the target molecule, Preferably, (3) further includes a step of amplifying the recovered host.
  • the contact between the target molecule and the peptide library in the contact step (1) can be performed by immobilizing the target molecule on an insoluble carrier (for example, a well or a dish).
  • the screening method of the present invention can be performed according to a known method except that the library of the present invention is used.
  • screening of a phage library using a phage as a host can be performed as follows.
  • the reaction is carried out by contacting the immobilized target molecule with a phage library on a plate or the like.
  • the phage that did not bind to the target molecule is removed by washing.
  • the phage bound to the target molecule is collected, infected with E. coli, lysed and propagated.
  • the phage displaying the binding molecule specific for the target molecule is concentrated.
  • the phage is cloned and the displayed peptide is identified by sequencing.
  • the resulting peptide is a peptide that can bind to the target molecule.
  • a peptide having a stable peptide structure and high specificity to the target molecule can be screened.
  • This fragment was cleaved with Bam HI and Eco RI, and ligated to the cloning vector pGEM-3Zf (+) (Promega) previously cleaved with Bam HI and Eco RI.
  • a vector pGEM-EGFP into which the EGFP gene was inserted was obtained.
  • PCR is performed with PfuUltra High fidelity DNA Polymerase (Agilent Technology) using the vector pGEM-EGFP as a template and primers (SEQ ID NOs: 3-16) (Table 2), and 9 amino acids are substituted site-specifically.
  • a vector pGEM-sfGFP into which the sfGFP gene was inserted was obtained.
  • This vector was digested with Bam HI and Eco RI to obtain a Bam HI-Eco RI fragment. This fragment was ligated to the BamHI site and EcoRI site of the GST fusion protein expression vector pGEX-6P-3 (GE Healthcare) to obtain a vector pGEX-sfGFP in which the sfGFP gene was inserted.
  • pGEX-sfGFP has a size of 5.6 kbp, and has the base sequences of GST and sfGFP structural genes in this order downstream of the tac promoter. Therefore, pGEX-sfGFP expresses GST and sfGFP in this order as one fusion protein in E. coli cells.
  • a peptide-presenting protein was prepared by introducing a caspase 3 recognition peptide into the amino acid sequence of Nos. 131 to 139 of sfGFP.
  • pGEX-sfGFP constructed in Reference Example 1 as a template and using primers (SEQ ID NOs: 17, 18, 23-28, 31-46, 58-59, 64-71) (Table 2)
  • PfuUltra High fidelity DNA PCR was performed with Polymerase, and vectors pGEX-m1 (Example 1) and pGEX-m4 to pGEX-m6 (Example 2) for expressing sfGFP incorporating a Caspase-3 recognition peptide sequence (DEVD) in a site-specific manner To 4) and pGEX-m10 to pGEX-m22 (Examples 5 to 17) were obtained.
  • Table 1 shows the length and position of the substituted peptides.
  • the peptide presentation protein shows the length and position of the substituted
  • Comparative Examples 1 to 5 a peptide-presenting protein in which a caspase 3 recognition peptide was introduced into an amino acid sequence other than the region of the amino acid sequence of Nos. 131 to 139 of sfGFP was prepared.
  • Example 1 As primers, SEQ ID NO: 19 and 20 (Comparative Example 1), SEQ ID NO: 21 and 22 (Comparative Example 2), SEQ ID NO: 29 and 30 (Comparative Example 3), SEQ ID NO: 60 and 61 (Comparative Example 4), SEQ ID NO: 62 And 63 (Comparative Example 5), the procedure of Example 1 was repeated except that the vectors pGEX-m2 (Comparative Example 1), pGEX-m3 (Comparative Example 2), and pGEX-m7 (Comparative Example 3) were used. ), PGEX-m8 (Comparative Example 4), and pGEX-m9 (Comparative Example 5). Table 1 shows the length and position of the substituted peptides.
  • Isopropyl- ⁇ -thiogalactopyranoside was added to the culture solution to a concentration of 0.1 mM, and cultured overnight at 20 ° C. to obtain E. coli expressing the GST fusion protein.
  • Escherichia coli expressing the protein was collected by centrifugation and resuspended in 20 mL of phosphate buffer (PBS).
  • PBS phosphate buffer
  • the obtained bacterial cells were crushed by freeze-thawing and ultrasonication three times, and then Triton x-100 with a final concentration of 1% was added, and the mixture was allowed to stand on ice for 30 minutes.
  • the bacterial cell liquid was centrifuged at 5000 rpm for 10 minutes at 4 ° C., and the supernatant containing the protein was recovered.
  • the collected solution was added to GST agarose beads washed with PBS, and GST fusion protein was adsorbed while slowly rotating at 4 ° C. overnight.
  • the beads were washed with PBS, and further washed with Precision Clearvage Buffer (0.05 M Tris-HCl (pH 7.0), 0.15 M NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT).
  • Precision Clearvage Buffer 0.05 M Tris-HCl (pH 7.0), 0.15 M NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT.
  • 1 mL of Prescission Cleavage Buffer and 5 ⁇ L of Prescission Protease (GE Healthcare) were added and reacted at room temperature for 4 hours. The reaction was allowed to proceed overnight at 4 ° C. Next, the supernatant was collected by centrifugation at 3000 rpm for 15 minutes at 4 ° C.
  • peptide-presenting proteins sfGFP-m1 to m9 and sfGFP-m11 to m21
  • sfGFP-m10 and sfGFP-m22 were expressed in inclusion bodies.
  • m1 (Example 1), m4 (Example 2), m5 (Example 3), m6 (Example 4), m11 (Example 5), m12 (Example 6), m13 (Example 7).
  • M14 (Example 8), m15 (Example 9), m16 (Example 10), m17 (Example 11), m18 (Example 12), m19 (Example 13), m20 (Example 14), In m21 (Example 15), it was hardly cut
  • disconnected (Table 1 and FIG. 2).
  • ⁇ Fluorescence intensity of peptide-presenting protein The influence of the peptide incorporation on the fluorescence intensity of the peptide-presenting protein was examined.
  • thermodynamically stable structure was calculated from the initial structure using the ff99SB force field of Amber 11 program package (Amber).
  • the molecular dynamics simulation uses the Amber 11 Sander module to calculate 10 nanoseconds in the GB / SA solvent model and evaluate fluctuations using the 4.5 nanosecond to 10 nanosecond structure that reached equilibrium. did.
  • the results are shown in FIG.
  • the vertical axis represents the fluctuation magnitude of each residue in the simulation of 4.5 nanoseconds to 10 nanoseconds
  • the horizontal axis represents the residue number.
  • the fluctuations in the K131-H139 region of sfGFP, m1 (Example 1), m6 (Example 4), and m19 (Example 13) were within 0.1 nanometers for most residues.
  • m7 Comparative Example 3
  • the maximum size was increased to about 0.3 nanometers, indicating that the K131-H139 region fluctuated greatly. Therefore, it was shown that the modified substance that is not easily decomposed into caspase 3 has almost no fluctuation, and the structural freedom of the incorporated peptide is limited.
  • Examples 16 to 20 In this example, five types of peptides reported to bind to the breast cancer marker protein HER2 were incorporated into the region of the amino acid sequence of amino acids 131 to 139 of sfGFP to obtain an expression vector and a purified protein.
  • SEQ ID NO: 47 and 48 (Example 16), SEQ ID NO: 49 and 50 (Example 17), SEQ ID NO: 51 and 52 (Example 18), SEQ ID NO: 72 and 73 (Example 19), SEQ ID NO: 74 And 75 (Example 20), except that the primers of Example 1 were used, and the vectors pGEX-mH1 (Example 16), pGEX-mH2 (Example 17), and pGEX-mH3 (Example 18) were repeated. ), PGEX-mH4 (Example 19), and pGEX-mH5 (Example 20).
  • FIG. 5A shows the length and position of the substituted peptide.
  • mH1 is “KEDGCCKCYSLGH” (SEQ ID NO: 55)
  • mH2 is “KEDGCDGFYACGH” (SEQ ID NO: 56)
  • mH3 is “KEDGFHAHPGH” (SEQ ID NO: 57)
  • mH4 is “KEDGWYAWMLGH” (SEQ ID NO: 76)
  • mH5 is “KEDGHY”. (SEQ ID NO: 77).
  • the vectors pGEX-mH1, pGEX-mH2, pGEX-mH3, pGEX-mH4, and pGEX-mH5 were used, the above-described “expression and purification of peptide-presenting protein” was repeated to display the peptide. Proteins were obtained (hereinafter, peptide-presenting proteins obtained from pGEX-mH1 to mH5 may be referred to as mH1 to mH5, respectively).
  • HER2 protein which is overexpressed frequently in breast cancer cells, is useful as a therapeutic target / imaging target for breast cancer, and a peptide that functions in vivo in mice has been reported.
  • the peptide of mH1 has been screened from a phage library, has an SS bond between adjacent cysteines, and is partially limited in structure (Karasseva et al., J. Protein Protein Chem., 2002, 21, 287). -296).
  • the peptide of mH2 is a peptide designed with reference to the binding surface of a HER2 binding antibody, and has binding activity in a state in which the structure is limited by cyclization (Park et al., Nat. Biotechnol., 2000, 18, 194). -198).
  • the mH3 peptide was selected by in silico screening under conditions that allow it to take a free structure (Nakajima et al., Breast Cancer, 2008, 15, 65-72).
  • the mH4 and mH5 peptides were screened simultaneously with the mH1 peptide and the structure is not limited.
  • mH1 and mH2 have already been reported to function in vivo in mice (Deutscher SL, Chem. Rev., 2010, 110, 3196-3211).
  • ⁇ Binding of peptide-presenting protein incorporating HER2 peptide to cancer cells >> 2.5 ⁇ 10 4 HER2-positive N87 gastric cancer cells and HER2-negative SUIT-2 pancreatic cancer cells were cultured for 16 hours in 8-well slide chamber culture plates. The cells were fixed by reacting with 4% paraformaldehyde phosphate buffer for 15 minutes, washed with PBS solution, and blocked with 3% bovine serum albumin / TBST for 15 minutes. Next, 2 ⁇ M peptide-presenting protein (mH1, mH2, mH3, mH4, or mH5) was added and incubated at 4 ° C. for 16 hours, and the binding property was evaluated by observation with a fluorescence microscope.
  • Example 2 Examination of structural fluctuations in the K131-L137 region >> M12 (Example 6), m15 (Example 9), m16 (Example 10), m19 (Example 13), m21 (Example 15), and m22 which are the peptide-presenting proteins of the present invention in the K131-L137 region
  • the molecular dynamics simulation of (Example 17) was performed.
  • As a positive control sfGFP was used.
  • the amino acid sequence is shown in FIG. 6 (A), and the analysis result is shown in FIG. 6 (B).
  • the vertical axis represents the fluctuation magnitude of each residue in the simulation of 4.5 nanoseconds to 10 nanoseconds, and the horizontal axis represents the amino acid sequence. It was shown that the modified substance that is not easily decomposed into caspase 3 has almost no fluctuation, and the structural freedom of the incorporated peptide is limited.
  • the peptide-presenting protein of the present invention and a peptide library using the same can be used for screening for peptides that can specifically bind to a target molecule.
  • Peptides screened by the peptide library of the present invention can be used effectively as an active ingredient of a medicine.

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Abstract

　本発明の目的は、標的分子との特異性の高いペプチドのスクリーニング方法を提供することである。　前記課題は、配列番号５４で表されるアミノ酸配列における１３１番～１３９番の提示領域にペプチドが提示されたペプチド提示タンパク質であって、前記提示が、４～１５個のペプチドのアミノ酸配列を、前記１３１番～１３９番のアミノ酸配列に挿入、若しくは１３１番～１３９番のアミノ酸配列の１～９個のアミノ酸配列と置換するものであって、且つ１３１番～１３９番のアミノ酸配列に相当するアミノ酸配列の鎖長が１５個以下である、ペプチド提示タンパク質によって解決することができる。

Description

ペプチド提示タンパク質及びそれを用いたペプチドライブラリー
　本発明は、ペプチド提示タンパク質及びそれを用いたペプチドライブラリーに関する。本発明によれば、標的分子に対して特異性の高いペプチドをスクリーニングすることができる。
　標的分子に高い特異性をもって結合する機能性ペプチドは創薬にとって有用であり、それらを獲得するために、各種のペプチド提示技術によるペプチドライブラリーの作製とハイスループットなスクリーニング技術が多数開発されている。具体的なペプチドライブラリーのための提示法としては、ファージ提示法（ファージディスプレイ）、大腸菌提示法、又は酵母提示法などが用いられている。例えば、ファージディスプレイでは、スクリーニングされるペプチドは、バクテリオファージ被膜タンパク質へのポリペプチド融合体として発現される。ペプチドがディスプレイされたファージ粒子を、標的物質が固定化されたマイクロタイタープレートと接触させ、アフィニティセレクションを行うことにより、標的物質と親和性を有するペプチドを持ったファージを濃縮することができる（非特許文献１）。
　ファージディスプレイ法では、濃縮されたファージに提示されたペプチドと、それをコードする遺伝子が１対１で対応するため、目的のペプチドが容易に特定可能である。また、遺伝子を容易に増幅（増殖）できるため、ペプチドのスクリーニング方法として、広範に用いられている。
「サイエンス（Science）」（米国）１９９０年、第２４９巻、ｐ．３８６－３９０ 「ネイチャー・バイオテクノロジー（Nature Biotechnology）」（英国）２００６年、第２４巻、ｐ．７９－８８
　しかしながら、従来のディスプレイ法で得られたペプチドは、標的分子と結合できるが、他の分子とも結合することが多かった。すなわち、標的分子との特異性が低いペプチドもスクリーニングされるため、医薬として実用化できないことが多かった。
　従って、本発明の目的は、標的分子との特異性の高いペプチドのスクリーニング方法を提供することである。
　本発明者らは、スクリーニングされたペプチドの特異性が低いことについて、鋭意検討した結果、従来のディスプレイ法によって提示されたペプチドは、その構造が自由に変化できる条件でスクリーニングされているのではないかと考えた。そのため、候補ペプチドとして得られたペプチドの多くが標的物質以外の分子にも結合してしまうと考えた。
　本発明者は、提示されるペプチドの構造の自由度を抑制する方法について、鋭意研究した結果、驚くべきことに、ｓｕｐｅｒｆｏｌｄｅｒＧＦＰ（非特許文献２；以下、ｓｆＧＦＰと称することがある）の１３１番～１３９番の領域にペプチドを組込むことにより、ペプチドの構造の自由度が抑制され、標的分子と特異的に結合することのできるペプチドをスクリーニングできることを見出した。
　本発明は、こうした知見に基づくものである。
　従って、本発明は、
［１］配列番号５４で表されるアミノ酸配列における１３１番～１３９番の提示領域にペプチドが提示されたペプチド提示タンパク質であって、前記提示が、４～１５個のペプチドのアミノ酸配列を、前記１３１番～１３９番のアミノ酸配列に挿入、若しくは１３１番～１３９番のアミノ酸配列の１～９個のアミノ酸配列と置換するものであって、且つ１３１番～１３９番のアミノ酸配列に相当するアミノ酸配列の鎖長が１５個以下である、ペプチド提示タンパク質、
［２］前記配列番号５４で表されるアミノ酸配列における１番～１３０番のアミノ酸配列又は１４０番～２３８番のアミノ酸配列において、１又は複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つ蛍光発生活性を有する［１］に記載のペプチド提示タンパク質、
［３］前記挿入又は置換される４～１５個のペプチドの末端のアミノ酸配列が、制限酵素サイトを含む塩基配列から翻訳されたアミノ酸配列である、［１］又は［２］に記載のタンパク質、
［４］前記［１］～［３］のいずれかに記載のペプチド提示タンパク質及び表面提示タンパク質の融合タンパク質、
［５］前記［１］～［３］のいずれかに記載のペプチド提示タンパク質、又は［４］に記載の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、
［６］［５］に記載のポリヌクレオチドを含むベクター、
［７］［６］に記載のベクターを含む宿主、
［８］前記提示されるペプチドがランダムなアミノ酸配列からなる複数のペプチドである、［７］の宿主を含むライブラリー、
［９］配列番号５４で表されるアミノ酸配列における１３１番～１３９番の提示領域にペプチドが提示可能なペプチド提示用タンパク質であって、前記提示が、４～１５個のペプチドのアミノ酸配列を、前記１３１番～１３９番のアミノ酸配列に挿入、若しくは１３１番～１３９番のアミノ酸配列の１～９個のアミノ酸配列と置換するものであって、且つ１３１番～１３９番のアミノ酸配列に相当するアミノ酸配列の鎖長が１５個以下である、ペプチド提示用タンパク質、
［１０］前記配列番号５４で表されるアミノ酸配列における１番～１３０番のアミノ酸配列又は１４０番～２３８番のアミノ酸配列において、１又は複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つ蛍光発生活性を有する［９］に記載のペプチド提示用タンパク質、
［１１］前記挿入又は置換される４～１５個のペプチドの末端のアミノ酸配列が、制限酵素サイトを含む塩基配列の翻訳されたアミノ酸配列である、［９］又は［１０］に記載のペプチド提示用タンパク質、
［１２］前記［９］～［１０］のいずれかに記載のペプチド提示用タンパク質及び表面提示タンパク質の融合タンパク質、
［１３］前記［９］～［１１］のいずれかに記載のペプチド提示用タンパク質及び［１２］に記載の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、
［１４］［１３］に記載のポリヌクレオチドを含むベクター、
［１５］［１４］に記載のベクターを含む宿主、
［１６］（１）前記［１４］に記載のベクターに、４～１５個のペプチドであって、そのアミノ酸配列を、前記１３１番～１３９番の提示領域のアミノ酸配列に挿入、若しくは１３１番～１３９番の提示領域のアミノ酸配列の１～９個のアミノ酸配列と置換し、且つ１３１番～１３９番のアミノ酸配列に相当するアミノ酸配列の鎖長が１５個以下であるペプチド、をコードするヌクレオチドを組込み、発現ベクターを得る工程、及び（２）前記発現ベクターを宿主に導入する工程、を含むライブラリーの構築方法、
［１７］（１）標的分子及び［８］に記載のペプチドライブラリーを接触させる工程、（２）標的分子に結合した宿主を回収する工程、を含む標的分子に結合するペプチドのスクリーニング方法、
［１８］（３）前記回収した宿主を増幅する工程、を更に含む［１７］に記載のペプチドのスクリーニング方法、及び
［１９］前記接触工程（１）、宿主回収工程（２）及び増幅工程（３）を繰り返す、［１８］に記載のペプチドのスクリーニング方法、
に関する。
　本発明のペプチド提示タンパク質及びそれを用いたペプチドライブラリーによれば、標的分子に特異性の高いペプチドをスクリーニングすることができる。また、ペプチドを提示させる親タンパク質であるｓｆＧＦＰは、蛍光タンパク質であるため、蛍光強度によって簡便に分子数を見積もることができる。従って、スクリーニングの際のペプチドの結合量を評価するのに有用である。本発明は、汎用されている提示技術（例えば、ファージ提示法、大腸菌提示法、酵母提示法、インビトロウイルス法、又はリボゾームディスプレイ法）に適用できる。従って、既存のハイスループットなスクリーニング技術に応用可能である。更に、本発明により得られるペプチドの配列情報、構造情報を基に分子標的治療薬の開発、ドラッグデリバリーシステムの開発が可能である。
ｓｆＧＦＰの全長のアミノ酸配列、及び１３１番から１３９番のアミノ酸配列（白抜き）を示した図である。 実施例１～１５及び比較例１～５で導入されたカスパーゼ３認識ペプチドのカスパーセ３による切断を示した写真である。 実施例１～１５及び比較例１～５のペプチド提示タンパク質の、蛍光強度を示したグラフである。 ペプチド提示タンパク質に組み込んだペプチド（ｍ１（実施例１）、ｍ６（実施例４）、ｍ１９（実施例１３）、ｍ７（比較例３））の分子動力学シミュレーションを示した図である。 乳がん細胞で高頻度に過剰発現が起こるＨＥＲ２タンパク質に結合するペプチドの配列（Ａ）及びそのペプチドを組込んだペプチド提示タンパク質のＨＥＲ２への結合（Ｂ）を示した図である。 １３１番～１３７番における本発明のペプチド提示タンパク質であるｍ１２（実施例６）、ｍ１５（実施例９）、ｍ１６（実施例１０）、ｍ１９（実施例１３）、ｍ２１（実施例１５）、及びｍ２２（実施例１７）のアミノ酸配列（Ａ）及び分子動力学シミュレーション（Ｂ）を示した図である。
［１］ペプチド提示タンパク質、ポリヌクレオチド、ベクター、及び宿主
《ペプチド提示タンパク質》
　本発明のペプチド提示タンパク質は、配列番号５４で表されるアミノ酸配列における１３１番～１３９番の提示領域にペプチドが提示されたペプチド提示タンパク質であって、前記提示が、４～１５個（好ましくは４～１４個、より好ましくは４～１３個、更に好ましくは４～１２個）のペプチドのアミノ酸配列を、前記１３１番～１３９番のアミノ酸配列に挿入、若しくは１３１番～１３９番のアミノ酸配列の１～９個のアミノ酸配列と置換するものであって、且つ１３１番～１３９番のアミノ酸配列に相当するアミノ酸配列の鎖長が１５個以下（好ましくは１４個以下、より好ましくは１３個以下、更に好ましくは１２個以下）である。また、１３１番～１３９番のアミノ酸配列に相当するアミノ酸配列の鎖長の下限は、好ましくは５個以上である。本発明のペプチド提示タンパク質は、配列番号５４で表されるアミノ酸配列における１番～１３０番のアミノ酸配列又は１４０番～２３８番のアミノ酸配列において、１又は複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つ蛍光発生活性を有するペプチド提示タンパク質であってもよい。配列番号５４で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質は、非特許文献２に記載のｓｆＧＦＰであるが、本発明のペプチド提示タンパク質において、ペプチドが組込まれる親タンパク質としては、ＧＦＰ系のタンパク質を用いることができる。すなわち、ＧＦＰ又はＧＦＰ由来のＧＦＰ変異体タンパク質を、限定されることなく用いることができる。具体的な親タンパク質としては、ＧＦＰ、ＹＦＰ、ＣＦＰ、ＢＦＰ、又はＲＦＰを挙げることができる。
　本発明のペプチド提示タンパク質は、より好ましくは配列番号５４で表されるアミノ酸配列における１３１番～１３８番の領域にペプチドが提示されたペプチド提示タンパク質であって、前記提示が、４～１４個（好ましくは４～１３個、より好ましくは４～１２個）のペプチドのアミノ酸配列を、前記１３１番～１３８番のアミノ酸配列に挿入、若しくは１３１番～１３８番のアミノ酸配列の１～８個のアミノ酸配列と置換するものであって、且つ１３１番～１３８番のアミノ酸配列に相当するアミノ酸配列の鎖長が１４個以下（好ましくは１３個以下、より好ましくは１２個以下）である。また、１３１番～１３８番のアミノ酸配列に相当するアミノ酸配列の鎖長の下限は、好ましくは４個以上である。この場合、本発明のペプチド提示タンパク質は、好ましくは配列番号５４で表されるアミノ酸配列における１番～１３０番のアミノ酸配列又は１３９番～２３８番のアミノ酸配列において、１又は複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つ蛍光発生活性を有するペプチド提示タンパク質であってもよい。
　本発明のペプチド提示タンパク質は、より好ましくは配列番号５４で表されるアミノ酸配列における１３１番～１３７番の領域にペプチドが提示されたペプチド提示タンパク質であって、前記提示が、４～１３個（好ましくは４～１２個）のペプチドのアミノ酸配列を、前記１３１番～１３７番のアミノ酸配列に挿入、若しくは１３１番～１３７番のアミノ酸配列の１～７個のアミノ酸配列と置換するものであって、且つ１３１番～１３７番のアミノ酸配列に相当するアミノ酸配列の鎖長が１３個以下（好ましくは１２個以下）である。また、１３１番～１３７番のアミノ酸配列に相当するアミノ酸配列の鎖長の下限は、好ましくは４個以上である。この場合、本発明のペプチド提示タンパク質は、好ましくは配列番号５４で表されるアミノ酸配列における１番～１３０番のアミノ酸配列又は１３９番～２３８番のアミノ酸配列において、１又は複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つ蛍光発生活性を有するペプチド提示タンパク質であってもよい。
　なお、提示されるペプチドの長さが短い方が、タンパク質の凝集が抑制されることがある点で好ましい。また、提示される領域が１３１～１３９番の領域に比べて、１３１番～１３８番の領域、又は１３１番～１３７番の領域の場合、タンパク質の凝集が抑制されることがある点で好ましい。
《ペプチド提示用タンパク質》
　本発明のペプチド提示用タンパク質は、配列番号５４で表されるアミノ酸配列における１３１番～１３９番の提示領域にペプチドが提示可能なペプチド提示用タンパク質であって、前記提示が、４～１５個（好ましくは４～１４個、より好ましくは４～１３個、更に好ましくは４～１２個）のペプチドのアミノ酸配列を、前記１３１番～１３９番のアミノ酸配列に挿入、若しくは１３１番～１３９番のアミノ酸配列の１～９個のアミノ酸配列と置換するものであって、且つ１３１番～１３９番のアミノ酸配列に相当するアミノ酸配列の鎖長が１５個以下（好ましくは１４個以下、より好ましくは１３個以下、更に好ましくは１２個以下）である。また、１３１番～１３９番のアミノ酸配列に相当するアミノ酸配列の鎖長の下限は、好ましくは５個以上である。
　更に、本発明のペプチド提示用タンパク質は、配列番号５４で表されるアミノ酸配列における１番～１３０番のアミノ酸配列又は１４０番～２３８番のアミノ酸配列において、１又は複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つ蛍光発生活性を有する前記のペプチド提示用タンパク質であってもよい。配列番号５４で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質は、非特許文献２に記載のｓｆＧＦＰであるが、本発明のペプチド提示用タンパク質において、ペプチドが組込まれる親タンパク質としては、ＧＦＰ系のタンパク質を用いることができる。すなわち、ＧＦＰ又はＧＦＰ由来のＧＦＰ変異体タンパク質を、限定されることなく用いることができる。具体的な親タンパク質としては、ＧＦＰ、ＹＦＰ、ＣＦＰ、ＢＦＰ、又はＲＦＰを挙げることができる。
　本発明のペプチド提示用タンパク質は、より好ましくは配列番号５４で表されるアミノ酸配列における１３１番～１３８番の領域にペプチドが提示されたペプチド提示用タンパク質であって、前記提示が、４～１４個（好ましくは４～１３個、より好ましくは４～１２個）のペプチドのアミノ酸配列を、前記１３１番～１３８番のアミノ酸配列に挿入、若しくは１３１番～１３８番のアミノ酸配列の１～８個のアミノ酸配列と置換するものであって、且つ１３１番～１３８番のアミノ酸配列に相当するアミノ酸配列の鎖長が１４個以下（好ましくは１３個以下、より好ましくは１２個以下）である。また、１３１番～１３８番のアミノ酸配列に相当するアミノ酸配列の鎖長の下限は、好ましくは４個以上である。この場合、本発明のペプチド提示用タンパク質は、好ましくは配列番号５４で表されるアミノ酸配列における１番～１３０番のアミノ酸配列又は１３９番～２３８番のアミノ酸配列において、１又は複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つ蛍光発生活性を有するペプチド提示タンパク質であってもよい。
　本発明のペプチド提示用タンパク質は、より好ましくは配列番号５４で表されるアミノ酸配列における１３１番～１３７番の領域にペプチドが提示されたペプチド提示用タンパク質であって、前記提示が、４～１３個（好ましくは４～１２個）のペプチドのアミノ酸配列を、前記１３１番～１３８番のアミノ酸配列に挿入、若しくは１３１番～１３７番のアミノ酸配列の１～７個のアミノ酸配列と置換するものであって、且つ１３１番～１３７番のアミノ酸配列に相当するアミノ酸配列の鎖長が１３個以下（好ましくは１２個以下）である。また、１３１番～１３７番のアミノ酸配列に相当するアミノ酸配列の鎖長の下限は、好ましくは４個以上である。この場合、本発明のペプチド提示用タンパク質は、好ましくは配列番号５４で表されるアミノ酸配列における１番～１３０番のアミノ酸配列又は１３９番～２３８番のアミノ酸配列において、１又は複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つ蛍光発生活性を有するペプチド提示タンパク質であってもよい。
　本明細書において、「ペプチド提示タンパク質」とは、例えばｓｆＧＦＰの１３１番～１３９番の領域に、ペプチドが提示されたタンパク質を意味する。例えば、１３１番～１３９番の領域に、ペプチドスクリーニングに用いる任意のペプチドが既に組込まれたｓｆＧＦＰのタンパク質を意味する。具体的な１つの態様としては、本発明のペプチドライブラリーに含まれるベクターから発現されるタンパク質を意味する。
　一方、本明細書において「ペプチド提示用タンパク質」とは、例えばｓｆＧＦＰの１３１番～１３９番の領域に、ペプチドが提示可能なように設計されたタンパク質を意味する。例えば、１３１番～１３９番の領域に、ペプチドスクリーニングに用いる任意のペプチドが組込み可能であるが、まだスクリーニングされるペプチドが組込まれていないｓｆＧＦＰのタンパク質を意味する。具体的な１つの態様としては、ｓｆＧＦＰの１３１番～１３９番の領域にペプチドが組込み可能に設計されたベクターから、翻訳されるタンパク質を意味する。従って、ペプチド提示用タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、任意のペプチドをコードするヌクレオチドを導入するための制限酵素サイトを有することが好ましい。
　前記１３１番～１３９番の領域は、好ましくは１３１番～１３８番の領域であり、更に好ましくは１３１番～１３７番の領域である。領域の長さが短い方が、ペプチド提示タンパク質が可溶化しやすい傾向があるからである。更に、挿入されるペプチドの長さは、好ましくは４～１５個であり、より好ましくは４～１４個であり、更に好ましくは４～１３個であり、最も好ましくは４～１２個である。挿入されるペプチドの長さが短い方が、ペプチド提示タンパク質が可溶化しやすい傾向があるからである。
（提示領域：１３１番～１３９番のアミノ酸配列）
　ｓｆＧＦＰのアミノ酸配列における１３１番～１３９番のアミノ酸配列は「ＫＥＤＧＮＬＧＨ」（配列番号５５）である。この９個のアミノ酸配列の領域を、４～１５個（好ましくは４～１４個）のアミノ酸配列からなるペプチドに置換した場合、ペプチドの構造自由度が制限され、安定した構造でｓｆＧＦＰ上に提示される。そのため、ペプチドライブラリーとして用いることにより、標的分子に対して特異性の高いペプチドをスクリーニングすることができる。
　提示領域が１３１番～１３９番のアミノ酸配列の場合、挿入又は置換されるアミノ酸配列は４～１５個であり、好ましくは４～１４個であり、１３１番～１３９番のアミノ酸配列の１部を含んでいてもよい。従って、１３１番～１３９番のアミノ酸配列を欠失することなく、４～６個のアミノ酸配列が挿入されてもよい。また、１３１番～１３９番のアミノ酸配列の１～９個のいずれかの数のアミノ酸配列を欠失させ、合計で５～１５個、好ましくは５～１４個となるように外来のアミノ酸配列を組込んでもよい。
　提示領域は、好ましくは１３１番～１３８番のアミノ酸配列である。この場合、挿入又は置換されるアミノ酸配列は４～１４個であり、好ましくは４～１３個であり、１３１番～１３８番のアミノ酸配列の１部を含んでいてもよい。従って、１３１番～１３８番のアミノ酸配列を欠失することなく、４～６個のアミノ酸配列が挿入されてもよい。また、１３１番～１３８番のアミノ酸配列の１～８個のいずれかの数のアミノ酸配列を欠失させ、合計で４～１４個、好ましくは４～１３個となるように外来のアミノ酸配列を組込んでもよい。
　更に、効率的にペプチドライブラリーを構築するためには、挿入又は置換されるペプチドの両末端のアミノ酸配列が、制限酵素サイトを含む塩基配列の翻訳されたアミノ酸配列であることが好ましい。ペプチドの組み込みに用いられる制限酵素サイトは、限定されるものではないが、例えばＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩ、ＳｃａＩ、ＳａｌＩ、ＳｐｈＩ、ＰｓｔＩ、ＮｃｏＩ、ＮｈｅＩ、ＳｓｐＩ、ＮｏｔＩ、ＳａｃＩ、ＰｖｕＩＩ、ＭｆｅＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＳｂｆＩ、ＥａｇＩ、ＥｃｏＲＶ、ＡｖｒＩＩ、ＢｓｔＸＩ、ＰｃｉＩ、ＨｐａＩ、ＡｇｅＩ、ＢｓｍＢＩ、ＢｓｐＱＩ、ＳａｐＩ、ＫｐｎＩ又はＢｓａＩを用いることができる。例えば、挿入又は置換される４～１４個のペプチドの両末端のアミノ酸配列はこれらの制限酵素が認識する塩基配列を含むヌクレオチドから翻訳されるアミノ酸配列であってもよい。
　なお、このような制限酵素サイトから翻訳されるペプチドをリンカーペプチドと称することがある。
（アミノ酸の欠失、置換、挿入、及び／又は付加）
　前記のように、本発明の「ペプチド提示タンパク質」、及び「ペプチド提示用タンパク質」の親タンパク質は、ＧＦＰ系のタンパク質を用いることができるが、ＧＦＰ系のタンパク質をコードするアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つ蛍光発生活性を有するタンパク質であってもよい。
　本発明において、「アミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸」とは、ＧＦＰ系のタンパク質であることを意味するか、又は部位特異的突然変異誘発法等の周知の方法により、又は天然に生じ得る程度の数個の数のアミノ酸の置換等により改変がなされたことを意味する。アミノ酸の改変の個数は、好ましくは１～１５個、より好ましくは１～１０個、更に好ましくは１～５個、更により好ましくは１～３個、最も好ましくは１個である。
　本発明のポリペプチドの改変アミノ酸配列の例は、好ましくは、そのアミノ酸が、１又は数個（好ましくは、１、２、３又は４個）の保存的置換を有するアミノ酸配列であることができる。
　本明細書において「保存的置換」とは、１若しくは数個のアミノ酸残基を、別の化学的に類似したアミノ酸残基で置き換えることを意味する。例えば、ある疎水性残基を別の疎水性残基によって置換する場合、ある極性残基を同じ電荷を有する別の極性残基によって置換する場合などが挙げられる。このような置換を行うことでできる機能的に類似のアミノ酸は、アミノ酸毎に当該技術分野において公知である。非極性（疎水性）アミノ酸としては、例えば、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、プロリン、トリプトファン、フェニルアラニン、メチオニンなどが挙げられる。極性（中性）アミノ酸としては、例えば、グリシン、セリン、スレオニン、チロシン、グルタミン、アスパラギン、システインなどが挙げられる。陽電荷をもつ（塩基性）アミノ酸としては、アルギニン、ヒスチジン、リジンなどが挙げられる。また、負電荷をもつ（酸性）アミノ酸としては、アスパラギン酸、グルタミン酸などが挙げられる。また、化学的に類似していない場合でも、アミノ酸の構造が類似したアミノ酸残基で置き換えてもよい。例えばアスパラギン酸（Ｄ）からアラニン（Ａ）への置換、アスパラギン（Ｅ）からアラニン（Ａ）への置換、チロシン（Ｙ）からフェニルアラニン（Ｆ）への置換などを挙げることができる。
（融合タンパク質）
　本発明の融合タンパク質は、本発明のペプチド提示タンパク質、又はペプチド提示用タンパク質と、表面提示タンパク質とが融合したタンパク質である。
　本明細書において、表面提示タンパク質とは、後述の宿主の表面に提示されるタンパク質を意味する。例えば、宿主がファージの場合は、ファージの表面タンパク質を意味する。また、宿主が細菌の場合は、細菌表面タンパク質を意味する。更に、宿主が酵母の場合は、酵母の表面タンパク質を意味し、宿主が動物細胞の場合は、動物細胞の表面タンパク質を意味する。
　ペプチド提示タンパク質、又はペプチド提示用タンパク質と、宿主の表面たんぱく質とが融合することにより、ペプチド提示タンパク質は、宿主の表面に提示されることができる。従って、本発明のペプチドライブラリーを用いて、目的ペプチドのアフィニティーセレクション（スクリーニング）を行う場合、容易に目的ペプチドの濃縮を行うことができる。
　ファージの表面タンパク質としては、限定されるものではないが、Ｍ１３ファージのｇ３ｐ、ｇ８ｐ、又はＴ７ファージのＧ１０を挙げることができる。
　細菌の表面タンパク質、例えば大腸菌の表面タンパク質としては、限定されるものではないが、ＯｍｐＡを挙げることができる。
　酵母の表面タンパク質としては、限定されるものではないが、Ｆｌｏ１、αアグルチニン、又はＡＧＡ２を挙げることができる。
　動物細胞の表面タンパク質としては、限定されるものではないが、human Toll-like receptor 4、ＥＧＦＲ、LDL receptor、angiotensin II receptor、又はＰＤＧＦＲを挙げることができる。
（ポリヌクレオチド）
　本発明のポリヌクレオチドは、本発明のペプチド提示タンパク質をコードするポリヌクレオチド（以下、ペプチド提示ポリヌクレオチドと称することがある）、ペプチド提示用タンパク質をコードするポリヌクレオチド（以下、ペプチド提示用ポリヌクレオチドと称することがある）、又は融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド（以下、融合ポリヌクレオチドと称することがある）である。融合ポリヌクレオチドは、ペプチド提示タンパク質又はペプチド提示用タンパク質と、表面提示タンパク質との間に存在することのあるリンカーポリペプチドをコードするヌクレオチドを含んでもよい。なお、配列番号５３の塩基配列は、ｓｆＧＦＰをコードするヌクレオチドの塩基配列である。
（ベクター）
　本発明のポリヌクレオチドは、限定されるものではないが、ベクターに組み込むことによって、容易に増幅させることができる。また、ペプチド提示タンパク質、又は融合タンパク質として、容易に発現させることができる。
　前記ポリヌクレオチドを組込むベクターとしては、宿主細胞において複製可能である限り、プラスミド、ファージ、又はウイルス等のいかなるベクターも用いることができる。例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、ｐＫＣ３０、ｐＣＦＭ５３６等の大腸菌プラスミド、ｐＵＢ１１０等の枯草菌プラスミド、ｐＧ－１、ＹＥｐ１３、ＹＣｐ５０等の酵母プラスミド、λｇｔ１１０、λＺＡＰＩＩ等のファージのＤＮＡ等が挙げられ、哺乳類細胞用のベクターとしては、バキュロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス等のウイルスＤＮＡ、ＳＶ４０とその誘導体等が挙げられる。ベクターは、複製開始点、選択マーカー、プロモーターを含み、必要に応じてエンハンサー、転写終結配列（ターミネーター）、リボソーム結合部位、ポリアデニル化シグナル等を含んでいてもよい。
　例えば、本発明のライブラリーとして用いる場合、Ｍ１３ファージベクター、又はＴ７ファージベクターを用いることが好ましい。ファージディスプレイのベクターとして用いることができるからである。
（宿主）
　本明細書において「宿主」とは、前記ベクターが組込まれ、ペプチド提示タンパク質又は融合タンパク質を発現できる限りにおいて、限定されるものでなく、ファージ、細菌、酵母、昆虫細胞、又は動物細胞を挙げることができる。例えば、ファージベクターの宿主としては、Ｍ１３ファージ、ｆｄファージ、又はＴ７ファージを挙げることができる。
　また、細菌のベクターの宿主としては、大腸菌、ストレプトミセス、又は枯草菌を挙げることができる。更に、酵母ベクターの宿主としては、パン酵母、又はメタノール資化性酵母を挙げることができる。昆虫細胞ベクターの宿主としては、ドロソフィラＳ２、スポドプテラＳｆ９を挙げることができる。更に、動物細胞ベクターの宿主としては、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＢＨＫ、３Ｔ３、Ｃ１２７を挙げることができる。
［２］ライブラリー
　本発明のライブラリーは、ペプチド提示ライブラリーであり、提示されるペプチドは任意のアミノ酸配列を有するものである。本発明のペプチド提示ライブラリーは、標的分子に結合するペプチドをスクリーニングするために用いることができる。従って提示されるペプチドは、ランダムなアミノ酸配列からなる複数（多種類）のペプチドが含まれているものが好ましい。また、本発明のライブラリーは、前記の宿主を含むライブラリーであり、ファージディスプレイ、又は細菌、酵母、昆虫細胞、若しくは動物細胞の細胞ディスプレイのライブラリーを挙げることができる。
　本発明のライブラリーを用いたスクリーニングに供される提示ペプチドの長さは特に限定されるものではないが、例えば４～１５であり、好ましくは４～１４であり、より好ましくは４～１３である。
［３］ライブラリーの構築方法
　本発明のライブラリーの構築方法は、（１）本発明のペプチド提示用タンパク質をコードするポリペプチドを含むベクターに、４～１５個（好ましくは４～１４個）のペプチドであって、そのアミノ酸配列を、前記１３１番～１３９番の提示領域のアミノ酸配列に挿入、若しくは１３１番～１３９番の提示領域のアミノ酸配列の１～９個のアミノ酸配列と置換し、且つ１３１番～１３９番の提示領域のアミノ酸配列に相当するアミノ酸配列の鎖長が１５個以下（好ましくは１４個以下）であるペプチド、をコードするヌクレオチドを組込み、ベクターを得る工程、及び（２）前記ベクターを宿主に導入する工程、
を含む。ライブラリーは、具体的にはペプチド提示ライブラリーであり、任意のペプチドを提示することのできるライブラリーである。
　本発明のライブラリーの構築方法は、好ましくは（１）本発明のペプチド提示用タンパク質をコードするポリペプチドを含むベクターに、４～１４個（好ましくは４～１３個）のペプチドであって、そのアミノ酸配列を、前記１３１番～１３８番の提示領域のアミノ酸配列に挿入、若しくは１３１番～１３８番の提示領域のアミノ酸配列の１～８個のアミノ酸配列と置換し、且つ１３１番～１３８番の提示領域のアミノ酸配列に相当するアミノ酸配列の鎖長が１４個以下（好ましくは１３個以下）であるペプチド、をコードするヌクレオチドを組込み、ベクターを得る工程、及び（２）前記ベクターを宿主に導入する工程、を含む。
　ライブラリーの構築方法に用いるベクターは、ペプチド提示用タンパク質をコードするポリペプチドを含むベクターであり、任意のポリペプチドコードするポリヌクレオチドを、例えば制限酵素サイトにより、容易に組込むことができる。
　組込まれるヌクレオチドがコードするポリペプチドの長さは、特に限定されるものではないが、例えば４～１５であり、好ましくは４～１４であり、より好ましくは４～１３である。
　ベクターの構築及びベクターの宿主への導入は、公知の方法を用いることができる。例えば、宿主がファージである場合、制限酵素のクローニングサイトを持つベクターアームに提示するペプチドのライブラリー遺伝子をライゲーションによって組込む。得られたライゲーション溶液を、ファージタンパク質を含むパッケージング溶液と混合し、ファージ粒子を形成させる。このファージ粒子を大腸菌（例えば、ＢＬＴ５４０３）に感染させることによってファージライブラリーを構築することができる。
（ライブラリー遺伝子）
　ライブラリーに組込む遺伝子は、公知の方法で調整することができる。
　例えば、ランダムなアミノ酸をコードするＮＮＫコドン（ＮはＡ、Ｇ、Ｃ、Ｔのいずれかの塩基、ＫはＧもしくはＴのいずれかの塩基）を任意のアミノ酸をコードするコドンと部位特異的に置換する。置換には当該領域を含むオリゴＤＮＡを化学合成し、制限酵素を利用して組込む、あるいはＰＣＲを用いてベクター全長を複製する方法が用いられる。
［４］スクリーニング方法
　本発明のスクリーニング方法は、（１）標的分子及び前記のペプチドライブラリーを接触させる工程、（２）標的分子に結合した宿主を回収する工程、
を含み、好ましくは（３）前記回収した宿主を増幅する工程を更に含む。本発明のスクリーニング方法は、前記接触工程（１）、宿主回収工程（２）及び増幅工程（３）を繰り返し、標的分子に結合するペプチドを濃縮することが好ましい。前記接触工程（１）における標的分子及びペプチドライブラリーの接触は、標的分子を不溶性担体（例えば、ウエル又はディッシュ）に固相化して行うことができる。
　本発明のスクリーニング方法は、本発明のライブラリーを用いる以外は、公知の方法に従って行うことができる。例えば、宿主としてファージを用いたファージライブラリーのスクリーニングは、以下のようにことができる。プレートなどに、固相化した標的分子と、ファージライブラリーとを接触させることにより反応させる。洗浄によって標的分子と結合しなかったファージを除去する。標的分子に結合したファージを回収し、大腸菌に感染させ、溶菌、そして増殖させる。溶菌後の培養上清、又は精製したファージを、更に固相化した標的分子と反応させる（パンニングさせる）ことによって、標的分子に特異的な結合分子を提示したファージを濃縮する。最終的にファージをクローン化し、提示ペプチドをシークエンスにより同定する。
　得られたペプチドは、標的分子と結合することができるペプチドである。本発明のスクリーニング方法では、ペプチドが本発明のペプチド提示用タンパク質に提示されているため、ペプチドの構造が安定し、標的分子に特異性の高いペプチドをスクリーニングすることができる。
　以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
《参考例１：ｓｆＧＦＰ発現ベクターの構築》
　本参考例では、ｓｆＧＦＰを発現するベクターを構築した。
　Enhanced GFP（ＥＧＦＰ）の遺伝子を持つベクターｐＧＥＸ－６Ｐ－３－ＰＴＤ－３－ＯＤＤ－ＥＧＦＰ（Kizaka-Kondohら、Clin. Cancer. Res.、２００９年、１５巻、３４３３－３４４１頁）を鋳型として、プライマー（配列番号１及び２）（表２）を用いて、ＫＯＤ　ＦＸ（ＴＯＹＯＢＯ）にてＰＣＲを行い、両端に制限酵素Ｂａｍ　ＨＩ及びＥｃｏ　ＲＩ認識部位が付加された０．７ｋｂのＥＧＦＰ遺伝子断片を得た。この断片をＢａｍ　ＨＩ及びＥｃｏ　ＲＩで切断し、予めＢａｍ　ＨＩ及びＥｃｏ　ＲＩで切断しておいたクローニングベクターｐＧＥＭ－３Ｚｆ（＋）（プロメガ）に連結した。これにより、ＥＧＦＰ遺伝子が挿入されたベクターｐＧＥＭ－ＥＧＦＰを得た。
　ベクターｐＧＥＭ－ＥＧＦＰを鋳型としてプライマー（配列番号３－１６）（表２）を用いて、PfuUltra High fidelity DNA Polymerase（アジレント・テクノロジー）にてＰＣＲを行い、部位特異的に９ヶ所のアミノ酸を置換するための変異を導入してｓｆＧＦＰ遺伝子が挿入されたベクターｐＧＥＭ－ｓｆＧＦＰを得た。このベクターをＢａｍ　ＨＩ及びＥｃｏ　ＲＩで切断してＢａｍ　ＨＩ－Ｅｃｏ　ＲＩ断片を得た。この断片をＧＳＴ融合タンパク質発現用ベクターｐＧＥＸ－６Ｐ－３（ＧＥヘルスケア）のＢａｍ　ＨＩ部位とＥｃｏ　ＲＩ部位に連結し、ｓｆＧＦＰ遺伝子を挿入したベクターｐＧＥＸ－ｓｆＧＦＰを得た。ｐＧＥＸ－ｓｆＧＦＰは、５．６ｋｂｐの大きさであり、ｔａｃプロモーターの下流にＧＳＴ及びｓｆＧＦＰの構造遺伝子の塩基配列をこの順で有する。従って、ｐＧＥＸ－ｓｆＧＦＰは、ＧＳＴ及びｓｆＧＦＰを、この順に１つの融合タンパク質として大腸菌細胞内に発現する。
《実施例１～１７》
　本実施例では、ｓｆＧＦＰの１３１番～１３９番のアミノ酸配列に、カスパーゼ３の認識ペプチドを導入したペプチド提示タンパク質を作成した。
　参考例１で構築したベクターｐＧＥＸ－ｓｆＧＦＰを鋳型として、プライマー（配列番号１７、１８、２３－２８、３１－４６、５８－５９、６４－７１）（表２）を用いて、PfuUltra High fidelity DNA PolymeraseにてＰＣＲを行い、部位特異的にＣａｓｐａｓｅ－３認識ペプチド配列（ＤＥＶＤ）を組み込んだｓｆＧＦＰを発現するためのベクターｐＧＥＸ－ｍ１（実施例１）、ｐＧＥＸ－ｍ４～ｐＧＥＸ－ｍ６（実施例２～４）、ｐＧＥＸ－ｍ１０～ｐＧＥＸ－ｍ２２（実施例５～実施例１７）を得た。置換されたペプチドの長さ及び位置を表１に示す。なお、実施例１６（ｍ１０）及び実施例１７（ｍ２２）で得られたペプチド提示タンパク質は、不溶化しやすかった。
《比較例１～５》
　本比較例では、ｓｆＧＦＰの１３１番～１３９番のアミノ酸配列の領域以外のアミノ酸配列に、カスパーゼ３の認識ペプチドを導入したペプチド提示タンパク質を作成した。
　プライマーとして、配列番号１９及び２０（比較例１）、配列番号２１及び２２（比較例２）、配列番号２９及び３０（比較例３）、配列番号６０及び６１（比較例４）、配列番号６２及び６３（比較例５）のプライマーを用いた以外は、実施例１の操作を繰り返して、ベクターｐＧＥＸ－ｍ２（比較例１）、ｐＧＥＸ－ｍ３（比較例２）、ｐＧＥＸ－ｍ７（比較例３）、ｐＧＥＸ－ｍ８（比較例４）、ｐＧＥＸ－ｍ９（比較例５）を得た。置換されたペプチドの長さ及び位置を表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
《ペプチド提示タンパク質の発現及び精製》
　前記実施例１～１７及び比較例１～５で得られたベクターを用いて、ペプチド提示タンパク質の発現及び精製を行った。
　前記発現ベクターｐＧＥＸ－ｓｆＧＦＰ、ｐＧＥＸ－ｍ１～ｐＧＥＸ－ｍ２２を、ヒートショック法で大腸菌Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　Ｃｏｌｉ　ＢＬ２１－ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ（ＤＥ３）株（アジレント・テクノロジー）にそれぞれ導入した。発現ベクターが導入された大腸菌を、５０ｍＬのＬＢＡ培地（０．０１％アンピシリンを含む、１％Ｂａｃｔｏ　Ｔｒｙｐｔｏｎｅ、０．５％Ｂａｃｔｏ　Ｙｅａｓｔ　ｅｘｔｒａｃｔ、１％ＮａＣｌ培地）中で３７℃にてＯ．Ｄ．６００＝０．５になるまで培養した。イソプロピル－β－チオガラクトピラノシドを０．１ｍＭになるように培養液に添加し、２０℃にて一晩培養してＧＳＴ融合タンパク質を発現させた大腸菌を得た。
　タンパク質を発現させた大腸菌を遠心操作により集菌し、２０ｍＬのリン酸緩衝液（ＰＢＳ）に再懸濁した。得られた菌体は３回の凍結融解及び超音波により破砕し、その後に終濃度１％のＴｒｉｔｏｎ　ｘ－１００を加え、氷上で３０分静置した。次に、菌体液を５０００ｒｐｍ、１０分、４℃で遠心し、タンパク質の含まれる上清を回収した。次に、ＰＢＳで洗浄したＧＳＴアガロースビーズに回収した溶液を加え、４℃で一晩ゆっくり回転させながらＧＳＴ融合タンパク質を吸着させた。ビーズをＰＢＳで洗い、更にPrescission Cleavage Buffer（０．０５Ｍ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．０）、０．１５Ｍ　ＮａＣｌ、１ｍＭ　ＥＤＴＡ、１ｍＭ　ＤＴＴ）で洗った。次に、ＧＳＴと、ｓｆＧＦＰ又はｓｆＧＦＰ改変体（ｓｆＧＦＰ－ｍ１～ｓｆＧＦＰ－ｍ２２）を切り離すために１ｍＬのPrescission Cleavage Buffer及び５μＬのPrescission Protease（ＧＥヘルスケア）を加え、室温で４時間反応させた後４℃で一晩反応させた。次に、３０００ｒｐｍ、１５分、４℃で遠心して上清を回収し、１０ｋＤａ　ｃｕｔの限外ろ過によりＰＢＳに置換し、およそ５ｍｇのペプチド提示タンパク質（ｓｆＧＦＰ－ｍ１～ｍ９及びｓｆＧＦＰ－ｍ１１～ｍ２１）を得た（以下、ｐＧＥＸ－ｍ１～ｍ９及びｐＧＥＸ－ｍ１１～ｍ２１から得られたペプチド提示タンパク質を、それぞれｍ１～ｍ９及びｍ１１～ｍ２１と称することがある）。ｓｆＧＦＰ－ｍ１０及びｓｆＧＦＰ－ｍ２２は、封入体で発現した。
《提示ペプチドのカスパーゼ３による切断》
　ｐＧＥＸ－ｍ１～ｍ９及びｍ１１～ｍ２１から得られたペプチド提示タンパク質は、カスパーゼ３認識ペプチド配列（ＤＥＶＤ）が組込まれている。この提示ペプチドの構造自由度を検討のために、ペプチド提示タンパク質のカスパーゼ３による切断を行った。
　１０μＭのペプチド提示タンパク質ｍ１～ｍ９及びｍ１１～ｍ２１をカスパーゼ３反応バッファー（２０ｍＭ　Ｐｉｐｅｓ（ｐＨ７．２）、１００ｍＭ　ＮａＣｌ、０．１％ＣＨＡＰＳ、１０％スクロース、１０ｍＭ　ＤＴＴ）中で、４ｍＵ／ｍＬのヒトカスパーゼ３（Sigma-Aldrich）と３７℃で２４時間反応させた。コントロールとしてｓｆＧＦＰを用いた。反応液は１５％アクリルアミドゲルで電気泳動し、Hybond ECL membranes（ＧＥヘルスケア）に２０Ｖ電圧一定で１時間転写した。次に５％スキムミルクでブロッキングを行い、一次抗体（ラビットポリクローナル抗ＧＦＰ抗体）を４℃で一晩反応させ、二次抗体（ＨＲＰ結合抗ラビットＩｇＧ抗体）を室温で１時間反応させ、ECL prime（ＧＥヘルスケア）を添加して切断断片を検出した。この結果、ｍ２（比較例１）、ｍ３（比較例２）、ｍ７（比較例３）、ｍ８（比較例４）、ｍ９（比較例５）はカスパーゼ３に分解された。一方、ｍ１（実施例１）、ｍ４（実施例２）、ｍ５（実施例３）、ｍ６（実施例４）、ｍ１１（実施例５）、ｍ１２（実施例６）、ｍ１３（実施例７）、ｍ１４（実施例８）、ｍ１５（実施例９）、ｍ１６（実施例１０）、ｍ１７（実施例１１）、ｍ１８（実施例１２）、ｍ１９（実施例１３）、ｍ２０（実施例１４）、ｍ２１（実施例１５）ではほとんど切断されなかった（表１及び図２）。これはｓｆＧＦＰの１３１番～１３９番の領域に、アミノ酸長５－１４の認識ペプチドを組み込んだ場合、カスパーゼ３に結合されないことを示し、これ以外の領域ではカスパーゼ３が結合可能であることを示している。すなわち、ｓｆＧＦＰの１３１番～１３９番の領域に組込まれたペプチドは、構造的に固定されており、ペプチドの構造自由度が制限されていると考えられた。
《ペプチド提示タンパク質の蛍光強度》
　ペプチドを組込むことによるペプチド提示タンパク質の蛍光強度への影響を検討した。
　ペプチド提示タンパク質（ｍ１～ｍ９及びｍ１１～ｍ２１）を、バッファー（２０ｍＭ　Ｐｉｐｅｓ（ｐＨ７．２）、１００ｍＭ　ＮａＣｌ、０．１％ＣＨＡＰＳ、１０スクロース、１０ｍＭ　ＤＴＴ）で１０μＭに調整して蛍光を測定した（励起／蛍光波長＝４８０／５１０ｎｍ）。ペプチドの構造自由度が制限されているｍ１（実施例１）、ｍ４（実施例２）、ｍ５（実施例３）、ｍ６（実施例４）、ｍ１１（実施例５）、ｍ１２（実施例６）、ｍ１３（実施例７）、ｍ１４（実施例８）、ｍ１５（実施例９）、ｍ１６（実施例１０）、ｍ１７（実施例１１）、ｍ１８（実施例１２）、ｍ１９（実施例１３）、ｍ２０（実施例１４）、ｍ２１（実施例１５）では蛍光が見られたが、ｍ２（比較例１）、ｍ３（比較例２）、ｍ７（比較例３）、ｍ８（比較例４）、ｍ９（比較例５）では蛍光が消失していた（表１及び図３）。すなわち、ｓｆＧＦＰの１３１番～Ｈ１３９番の領域に、アミノ酸長５－１４の認識ペプチドを組み込んだ場合は、ＧＦＰの蛍光が維持されることが示された。
《解析例１：Ｋ１３１－Ｈ１３９領域の構造的ゆらぎの検討》
　作製したペプチド提示タンパク質に組み込んだペプチドの構造自由度が制限されていれば、分子動力学シミュレーションにおいてＫ１３１－Ｈ１３９領域は構造的なゆらぎが小さくなると考えられた。
　カスパーゼ３に分解されにくいｓｆＧＦＰ、ｍ１（実施例１）、ｍ６（実施例４）、ｍ１９（実施例１３）の分子動力学シミュレーションを実施した。コントロールとしてカスパーゼ３に分解されるｍ７（比較例３）を用いた。これらのタンパク質の初期構造はｓｆＧＦＰの結晶構造（ＰＤＢ　ＩＤ：２Ｂ３Ｐ）より作成した。計算を簡便にするために蛍光団を構成する２アミノ酸（６５Ｔ，６６Ｙ）はグリシン残基に置換した。Ａｍｂｅｒ　１１　ｐｒｏｇｒａｍ　ｐａｃｋａｇｅ（Ａｍｂｅｒ）のｆｆ９９ＳＢ力場を利用して初期構造から熱力学的な安定構造を計算した。分子動力学シミュレーションはＡｍｂｅｒ　１１のＳａｎｄｅｒモジュールを利用し、ＧＢ／ＳＡ溶媒モデルにおいて１０ナノ秒の計算を行い、平衡状態に達した４．５ナノ秒～１０ナノ秒の構造を用いてゆらぎを評価した。
　結果を図４に示す。縦軸は４．５ナノ秒～１０ナノ秒のシミュレーションにおける各残基のゆらぎの大きさを表し、横軸は残基番号を表す。ｓｆＧＦＰ、ｍ１（実施例１）、ｍ６（実施例４）、ｍ１９（実施例１３）のＫ１３１－Ｈ１３９領域のゆらぎは、ほとんどの残基で０．１ナノメートル以内に収まっていた。しかし、ｍ７（比較例３）では最大で０．３ナノメートル程度まで大きくなっており、Ｋ１３１－Ｈ１３９領域は大きくゆらぐことが示された。従って、カスパーゼ３に分解されにくい改変体では、ゆらぎはほとんどなく、組み込んだペプチドの構造自由度が制限されていることが示された。
《実施例１６～２０》
　本実施例では、乳癌マーカータンパク質ＨＥＲ２に結合することが報告されている５種のペプチドをｓｆＧＦＰの１３１番～１３９番のアミノ酸配列の領域に組み込み、発現ベクター及び精製タンパク質を得た。
　プライマーとして、配列番号４７及び４８（実施例１６）、配列番号４９及び５０（実施例１７）、配列番号５１及び５２（実施例１８）、配列番号７２及び７３（実施例１９）、配列番号７４及び７５（実施例２０）のプライマーを用いた以外は、実施例１の操作を繰り返して、ベクターｐＧＥＸ－ｍＨ１（実施例１６）、ｐＧＥＸ－ｍＨ２（実施例１７）、ｐＧＥＸ－ｍＨ３（実施例１８）、ｐＧＥＸ－ｍＨ４（実施例１９）、及びｐＧＥＸ－ｍＨ５（実施例２０）を得た。置換されたペプチドの長さ及び位置を図５（Ａ）に示す。ｍＨ１は「ＫＥＤＧＫＣＣＹＳＬＧＨ」（配列番号５５）、ｍＨ２は「ＫＥＤＧＣＤＧＦＹＡＣＧＨ」（配列番号５６）、ｍＨ３は「ＫＥＤＧＦＨＡＨＰＧＨ」（配列番号５７）、ｍＨ４は「ＫＥＤＧＷＹＡＷＭＬＧＨ」（配列番号７６）、そしてｍＨ５は「ＫＥＤＧＷＹＳＷＬＬＧＨ」（配列番号７７）である。
　更に、ベクターｐＧＥＸ－ｍＨ１、ｐＧＥＸ－ｍＨ２、ｐＧＥＸ－ｍＨ３、ｐＧＥＸ－ｍＨ４、及びｐＧＥＸ－ｍＨ５を用いたことを除いては、前記「ペプチド提示タンパク質の発現及び精製」の操作を繰り返して、ペプチド提示タンパク質を得た（以下、ｐＧＥＸ－ｍＨ１～ｍＨ５から得られたペプチド提示タンパク質を、それぞれｍＨ１～ｍＨ５と称することがある）。
　乳がん細胞で高頻度に過剰発現が起こるＨＥＲ２タンパク質は、乳がんの治療標的・イメージング標的として有用であり、マウス生体内でも機能するペプチドが報告されている。ｍＨ１のペプチドは、ファージライブラリーよりスクリーニングされ、隣り合うシステイン間でＳ－Ｓ結合を持ち、部分的に構造が制限されている（Karassevaら、J. Protein Chem.、２００２年、２１巻、２８７－２９６頁）。ｍＨ２のペプチドはＨＥＲ２結合抗体の結合表面を参考にデザインされたペプチドで、環状化されて構造が制限された状態で結合活性を持つ（Parkら、Nat. Biotechnol.、２０００年、１８巻、１９４－１９８頁）。ｍＨ３のペプチドは自由に構造を取れる条件のｉｎ　ｓｉｌｉｃｏスクリーニングにより選抜された（Nakajimaら、Breast Cancer、２００８年、１５巻、６５－７２頁）。ｍＨ４及びｍＨ５のペプチドはｍＨ１のペプチドと同時にスクリーニングされ、構造は制限されていない。ｍＨ１及びｍＨ２は既にマウス生体内で機能することが報告されていた（Deutscher SL、Chem. Rev.、２０１０年、１１０巻、３１９６－３２１１頁）。
《ＨＥＲ２ペプチドを組み込んだペプチド提示タンパク質の癌細胞への結合》
　２．５×１０４個のＨＥＲ２陽性Ｎ８７胃がん細胞及びＨＥＲ２陰性ＳＵＩＴ－２膵がん細胞を８ｗｅｌｌスライドチャンバー培養プレート中で１６時間培養した。細胞は４％パラホルムアルデヒドリン酸バッファーと１５分反応させて固定し、ＰＢＳ溶液で洗浄、３％ウシ血清アルブミン／ＴＢＳＴで１５分ブロッキングした。次に２μＭのペプチド提示タンパク質（ｍＨ１、ｍＨ２、ｍＨ３、ｍＨ４、又はｍＨ５）を添加して４℃で１６時間インキュベートし、蛍光顕微鏡観察により結合性を評価した。この結果、ｍＨ１及びｍＨ２ではＮ８７細胞への特異的な結合が見られたが、ｍＨ３、ｍＨ４、及びｍＨ５は結合しなかった（図４（Ｂ））。つまり、構造が制限されている条件でスクリーニングされたペプチドを組み込んだ場合には同様に高い結合性が見られ、構造が自由に変化する条件でスクリーニングされたペプチドを組み込んでも結合は見られなかった。前者は既にマウス生体内でも機能することが分かっている。従って、ｓｆＧＦＰのＫ１３１－Ｈ１３９領域にペプチドを組み込み評価に利用することで、生体内でも機能する特異性の高い標的結合ペプチドを簡便に高感度にスクリーニングできることが示された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
《解析例２：Ｋ１３１－Ｌ１３７領域の構造的ゆらぎの検討》
　Ｋ１３１－Ｌ１３７領域における本発明のペプチド提示タンパク質であるｍ１２（実施例６）、ｍ１５（実施例９）、ｍ１６（実施例１０）、ｍ１９（実施例１３）、ｍ２１（実施例１５）、及びｍ２２（実施例１７）の分子動力学シミュレーションを実施した。陽性コントトールとして、ｓｆＧＦＰを用いた。ｍ１２（実施例６）、ｍ１５（実施例９）、ｍ１６（実施例１０）、ｍ１９（実施例１３）、ｍ２１（実施例１５）、及びｍ２２（実施例１７）を用いた以外は、解析例１の操作を繰り返した。
　アミノ酸配列を図６（Ａ）に示し、解析結果を図６（Ｂ）に示す。縦軸は４．５ナノ秒～１０ナノ秒のシミュレーションにおける各残基のゆらぎの大きさを表し、横軸はアミノ酸配列を表す。カスパーゼ３に分解されにくい改変体は、ゆらぎはほとんどなく、組み込んだペプチドの構造自由度が制限されていることが示された。
　本発明のペプチド提示タンパク質及びそれを用いたペプチドライブラリーは標的分子に特異的に結合することのできるペプチドのスクリーニングに用いることができる。本発明のペプチドライブラリーによって、スクリーニングされたペプチドは、医薬の有効成分として、有効用いることができる。
　以上、本発明を特定の態様に沿って説明したが、当業者に自明の変形や改良は本発明の範囲に含まれる。

Claims (19)

  1. 　配列番号５４で表されるアミノ酸配列における１３１番～１３９番の提示領域にペプチドが提示されたペプチド提示タンパク質であって、
    前記提示が、４～１５個のペプチドのアミノ酸配列を、前記１３１番～１３９番のアミノ酸配列に挿入、若しくは１３１番～１３９番のアミノ酸配列の１～９個のアミノ酸配列と置換するものであって、且つ１３１番～１３９番のアミノ酸配列に相当するアミノ酸配列の鎖長が１５個以下である、ペプチド提示タンパク質。
  2. 　前記配列番号５４で表されるアミノ酸配列における１番～１３０番のアミノ酸配列又は１４０番～２３８番のアミノ酸配列において、１又は複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つ蛍光発生活性を有する請求項１に記載のペプチド提示タンパク質。
  3. 　前記挿入又は置換される４～１５個のペプチドの末端のアミノ酸配列が、制限酵素サイトを含む塩基配列から翻訳されたアミノ酸配列である、請求項１又は２に記載のタンパク質。
  4. 　請求項１～３のいずれか一項に記載のペプチド提示タンパク質及び表面提示タンパク質の融合タンパク質。
  5. 　請求項１～３のいずれか一項に記載のペプチド提示タンパク質、又は請求項４に記載の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
  6. 　請求項５に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
  7. 　請求項６に記載のベクターを含む宿主。
  8. 　前記提示されるペプチドがランダムなアミノ酸配列からなる複数のペプチドである、請求項７の宿主を含むライブラリー。
  9. 　配列番号５４で表されるアミノ酸配列における１３１番～１３９番の提示領域にペプチドが提示可能なペプチド提示用タンパク質であって、
    前記提示が、４～１５個のペプチドのアミノ酸配列を、前記１３１番～１３９番のアミノ酸配列に挿入、若しくは１３１番～１３９番のアミノ酸配列の１～９個のアミノ酸配列と置換するものであって、且つ１３１番～１３９番のアミノ酸配列に相当するアミノ酸配列の鎖長が１５個以下である、ペプチド提示用タンパク質。
  10. 　前記配列番号５４で表されるアミノ酸配列における１番～１３０番のアミノ酸配列又は１４０番～２３８番のアミノ酸配列において、１又は複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つ蛍光発生活性を有する請求項９に記載のペプチド提示用タンパク質。
  11. 　前記挿入又は置換される４～１５個のペプチドの末端のアミノ酸配列が、制限酵素サイトを含む塩基配列の翻訳されたアミノ酸配列である、請求項９又は１０に記載のペプチド提示用タンパク質。
  12. 　前記請求項９～１１のいずれか一項に記載のペプチド提示用タンパク質及び表面提示タンパク質の融合タンパク質。
  13. 　前記請求項９～１１のいずれか一項に記載のペプチド提示用タンパク質及び請求項１２に記載の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
  14. 　請求項１３に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
  15. 　請求項１４に記載のベクターを含む宿主。
  16. （１）前記請求項１４に記載のベクターに、
    ４～１５個のペプチドであって、そのアミノ酸配列を、前記１３１番～１３９番の提示領域のアミノ酸配列に挿入、若しくは１３１番～１３９番の提示領域のアミノ酸配列の１～９個のアミノ酸配列と置換し、且つ１３１番～１３９番のアミノ酸配列に相当するアミノ酸配列の鎖長が１５個以下であるペプチド、
    をコードするヌクレオチドを組込み、発現ベクターを得る工程、及び
    （２）前記発現ベクターを宿主に導入する工程、
    を含むライブラリーの構築方法。
  17. （１）標的分子及び請求項８に記載のペプチドライブラリーを接触させる工程、
    （２）標的分子に結合した宿主を回収する工程、
    を含む標的分子に結合するペプチドのスクリーニング方法。
  18. （３）前記回収した宿主を増幅する工程、
    を更に含む請求項１７に記載のペプチドのスクリーニング方法。
  19. 　前記接触工程（１）、宿主回収工程（２）及び増幅工程（３）を繰り返す、請求項１８に記載のペプチドのスクリーニング方法。
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