WO2015004402A2 - Nouvelle souche de aurantiochytrium - Google Patents

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    • C12R2001/89—Algae ; Processes using algae

Definitions

  • the invention relates to a mixotrophic culture method, especially in the presence of discontinuous and / or variable light illumination, of a protist of the Labyrinthulomycete class, in particular of the genus Aurantiochytrium.
  • the method makes it possible to obtain a high yield of biomass and an enrichment of the protists thus cultivated with lipids and carotenoids, and more particularly with docosahexaenoic acid (DHA) and canthaxanthin and / or astaxanthin.
  • DHA docosahexaenoic acid
  • the method thus makes it possible to cultivate strains of the genus Aurantiochytrium of a mixotrophic nature, and having a high yield of lipids and / or carotenoids, and more particularly of polyunsaturated fatty acids and of canthaxanthin and / or astaxanthin.
  • the invention also relates to novel protist strains belonging to the genus Aurantiochytrium, particularly suitable for the production of lipids and carotenoids. These new strains of the genus Aurantiochytrium are useful for producing docosahexaenoic acid (DHA) and canthaxanthin and / or astaxanthin in the mixotrophic mode.
  • DHA docosahexaenoic acid
  • PUFA-CJO3 highly unsaturated omega-3 series
  • EPA or C20: 5 ⁇ 3 and docosahexaenoic acid (DHA or C22: 6 ⁇ 3) and of the omega-6 series (PUFA- ⁇ ), in particular, arachidonic acid (ARA or AA or eicosatetraenoic acid C20: 4 ⁇ 6) have a recognized nutritional importance and have high potential in terms of therapeutic applications.
  • PUFA-CJO3 highly unsaturated omega-3 series
  • EPA or C20: 5 ⁇ 3 eicosapentaenoic acid
  • DHA or C22: 6 ⁇ 3 docosahexaenoic acid
  • PUFA- ⁇ arachidonic acid
  • ARA or AA or eicosatetraenoic acid C20: 4 ⁇ 6 have a recognized nutritional importance and have high potential in terms of therapeutic applications.
  • DHA is necessary for the normal and functional development of cells, and plays a crucial role in various biochemical processes and functions. His polyunsaturated nature him gives crucial importance to the properties of the cell membrane, in both plants and animals: fluidity, flexibility and selective permeability, allowing, for example, effective adaptation, and even survival, at low temperatures, particularly in Pisces.
  • DHA is a major structural constituent of the human brain and is its main fatty acid. DHA represents 15-20% of the cerebral cortex (the brain of an adult contains at least 20 g of DHA) and 30-60% of the retina. It is essential for the development of the central nervous system and retinal function, by incorporation into cell membranes, and plays a vital role in the satisfactory acquisition and maintenance of the mechanisms of vision and memory.
  • New sources of these fatty acids such as ⁇ , DHA and TARA must therefore be sought in order to meet, in the future, the growing market demand for this type of polyunsaturated fatty acids.
  • Protists are microorganisms with simple cellular organization, that is to say they are generally unicellular and sometimes multicellular but do not present specialized tissues. They can be autotrophic or heterotrophic.
  • Protists are currently the subject of many industrial projects because some species are able to accumulate or secrete significant amounts of lipids, including polyunsaturated fatty acids.
  • protists offer several advantages over fish oils: they are cultivable in vitro under controlled conditions, which allows the production of a biomass of relatively biochemical composition. constant and, on the other hand, unlike fish oils, their lipids contain little or no cholesterol.
  • the lipids produced by protists have a simpler fatty acid profile than that of fish oils, which limits the separation steps of the fatty acids of interest.
  • carotenoids are also molecules of interest. They are generally used as pigments, but they also have an important role for human health as antioxidants. Finally, they have the ability to stimulate the immune system.
  • Thraustochytrids in particular Aurantiochytrium, are known to produce DHA when grown in heterotrophy [W.K. Hong et al. (201 1); Production of lipids containing high levels of docosahexaenoic acid by a newly isolated microalga, Aurantiochytrium sp. KRS101. Appl. Biochem. Biotechnol .: 164 (8): 1468-80].
  • Aurantiochytrium is also known to produce carotenoids, such as astaxanthin, zeaxanthin, canthaxanthin, echinenone, beta-carotene and phoenicoxanthin [Yokoyama, R, Hyundai, D.
  • the cultures can be carried out in autotrophic, mixotrophic or heterotrophic conditions depending on the strain, the temperature, the light conditions and the size of the fermenters.
  • crops can also be grown in one-liter containers, in a laboratory, in photobioreactors, and in 100,000-liter containers or in open ponds (several hectares).
  • energy and other resources such as labor and the ease of continuing the cultivation should be taken into account by developing ideal growing conditions.
  • the highest yield possible for example above 80 g / l of dry matter, more than 30% of fatty acids by weight relative to the total weight of the dry matter and more 0.1% by weight of carotenoids on the total weight of dry matter.
  • photoreceptors such as phytochrome are a typical example of a light sensor that controls the development of the organism that possesses it.
  • Various photoreceptors have been described to date, namely, among others, accessory pigments, cryptochromes and phototropins.
  • the vat is filled with the sterilized culture medium and the inoculum.
  • the fermentation then takes place without additional major addition of medium (mainly pH and antifoam patches). Volume remains constant and biomass productivity is relatively low.
  • the fermenter is emptied and its contents are replaced.
  • This production process is based on the progressive feeding of nutrient substrate during the cultivation.
  • This mode is generally used to achieve high cell density in the fermenter. - the continuous mode (in English "continuous"):
  • a fermentor commonly known as a "chemostat” is used in which a fresh culture medium is continuously added, while the culture liquid is withdrawn continuously to keep the culture volume constant.
  • the growth rate of the cells can be controlled by changing the nutrient supply rate while respecting the physiological limits of each cell type or strain (depending on its maximum specific growth rate (max) under the specific conditions of 'a method).
  • the continuous mode allows the culture of microorganisms in a given state of physiological equilibrium corresponding to a balance between the growth of the biomass and the production of metabolite (s) of interest.
  • the cells grow at a constant rate and all culture parameters remain constant (pH, volume, dissolved oxygen concentration, nutrient and product concentrations, cell density, etc.).
  • the continuous mode has, in particular, the following advantages:
  • the cultivation method according to the invention is practiced in mixotrophic mode, that is to say with a light contribution, preferably , with a variable and / or discontinuous intensity and in the presence of a supply of organic substrate.
  • mixotroph is usually used with respect to strains having a chloroplast, capable of developing in the presence of light using two carbon sources (organic and inorganic).
  • a chloroplast capable of developing in the presence of light using two carbon sources (organic and inorganic).
  • the term “mixotroph” will be broadened within the meaning of the invention to this category of strain.
  • photoheterotrophic can also be used to indicate such a strain.
  • strain (FCC 1324) was deposited on June 21, 2013 according to the provisions of the Budapest Treaty, under accession number CCAP 4062/1 to the CCAP.
  • FCC strains 31 (accession number CCAP 4062/2); FCC 131 1 (accession number CCAP 4062/3); FCC 1319 (accession number CCAP 4062/4); FCC 1325 (accession number CCAP 4062/5) and FCC 1479 (accession number CCAP 4062/6) were filed on July 8, 2014 in accordance with the provisions of the Budapest Treaty, with the CCAP.
  • the cultivation in mixotrophic mode is done under discontinuous and / or variable illumination conditions over time, the illumination having intensity variations whose amplitude is between 5 ⁇ . m “2 , s “ 1 and 1000 ⁇ . m “2 , s “ 1 , these variations occurring between 2 and 3600 times per hour.
  • the amplitude of the intensity variations is between 70 and 300 ⁇ . m “2 , s “ 1 , and preferably between 100 and 200 ⁇ . m “2 , s “ 1 .
  • FIG. 1 Process diagram according to one embodiment of the invention, the "decoupled process”.
  • FIG. 1 Growth comparison between FCC strain 1324 (CCAP 4062/1) and Aurantiochytrium mangrovei strain FCC 1104 (accession number CCAP4087 / 1).
  • A Growth in the presence of NH 4 + as a nitrogen source.
  • B Growth in the presence of NO 3 - as a nitrogen source.
  • Figure 3. Images of photon microscopy cells grown in medium containing NH 4 + as a nitrogen source.
  • A image of strain FCC1324 (CCAP 4062-1).
  • FIG. 1 Images were taken with the same x1000 magnification.
  • the subject of the present invention is therefore a process for the cultivation of protists of the class Labyrinthulomycete, in particular of the Thraustochytrid family, in particular of the genus Aurantiochytrium, in the mixotrophic mode, in particular under discontinuous and / or variable illumination conditions during the time.
  • the invention also relates to a process for producing DHA and / or carotenoid (s), in particular canthaxanthin and / or astaxanthin, comprising the following step:
  • the illumination preferably has intensity variations whose amplitude is generally between 5 ⁇ . m “2 , s “ 1 and 1000 ⁇ . m “2 , s “ 1 , preferably between 30 and 400 ⁇ . m “2 , s “ 1 . According to one embodiment of the invention these variations can take place between 2 and 3600 times per hour, preferably between 2 and 200 times per hour. This luminous contribution may comprise phases of discontinuous and / or variable illumination, with variations in intensity that may have identical or different amplitudes.
  • the light input is in the form of flashes.
  • a flash has a duration of between 1/10 seconds and 10 minutes, preferably 5 seconds and 10 minutes, more preferably between 10 seconds and 2 minutes, more preferably between 20 seconds and 1 minute.
  • the number of flashes is between 5 and 3600, preferably between 10 and 150, preferably between 15 and 100, and more preferably between 20 and 50 times per hour.
  • the illumination of the cultures is provided by an internal illumination device to the fermenter, preferably located on the counter-blades inside the fermenter.
  • the illumination sources are electroluminescent diodes.
  • the cultivation method in mixotrophic mode is carried out in the presence of 100 mM to 1.5 M, preferably from 200 mM to 1.2 M, more preferably from 250 mM to 1 M and even more preferably 300 mM to 600 mM of an organic carbon substrate.
  • Substrate supply is ensured continuously during culture, to allow the cells to accumulate a high concentration of lipids and carotenoids. Additional substrate is added to the culture medium during the culture process to maintain a sufficient concentration.
  • the culture method comprises culturing the cells in continuous mode under mixotrophic or heterotrophic conditions in a fermentor ("growth" stage), and then feeding continuously into fermenters operating in semi-continuous mode by the cells produced and their culture under conditions of mixotrophy in said fermenters ("maturation" stage) (see FIG. 1).
  • the method according to the invention has the advantage of increasing the yield of biomass obtained from the culture. It also has the advantage of enriching the protists thus cultivated in polyunsaturated fatty acids, more particularly in docosahexaenoic acid (DHA), and in carotenoids.
  • the carotenoids that can be produced by Aurantiochytrium according to one embodiment of the invention are astaxanthin, zeaxanthin, canthaxanthin, echinenone, beta-carotene and phoenicoxanthin.
  • the dominant carotenoids are canthaxanthin and astaxanthin.
  • Mixotrophic culture of this protist is preferably carried out in the presence of 100 mM to 1.5 M, preferably 200 mM to 1.2 M, more preferably 250 mM to 1 M, and even more preferably 300 mM at 600 mM of an organic carbon substrate.
  • the contribution of the substrate is preferably ensured continuously during the culture, to allow the cells to accumulate a high concentration of lipids and carotenoids. Additional substrate is added to the culture medium during the culture process to maintain a sufficient concentration.
  • This organic carbon substrate preferably comprises, in pure form or in a mixture: glucose, cellulose derivatives, sucrose and / or glycerol.
  • the organic carbon substrate contained in the culture medium may consist of complex molecules or a mixture of substrates.
  • Products resulting from the biotransformation of starch, for example from corn, wheat or potato, in particular starch hydrolysates, which consist of small molecules, constitute, for example, substrates organic carbon adapted to the mixotrophic culture of the protists according to the invention.
  • said organic carbon substrate present in the culture medium comprises at least 300 mM glucose and / or glycerol.
  • This method is more particularly intended for the implementation of new strains of the class Labyrinthulomycete, in particular of the genus Aurantiochytrium (Reign: Chromista, Order: Thraustochytriales, Family: Thraustochytriaceae) [ITIS Catalog of Life, 2010] selected for their mixotrophic character , and having a high yield of polyunsaturated fatty acids, especially DHA, and carotenoids, especially canthaxanthin and / or astaxanthin, and especially for their ability to be cultivated with a light input greater than 10 ⁇ , in a medium rich in organic elements, for example, the modified Verduyn medium (marine salts 15 g / L, (NH 4 ) 2 SO 4 3 g / L, KH 2 PO 4 1 g / L, MgSO 4 -7H 2 O, 0.5 g / L L, Na 2 EDTA 24 mg / L, ZnSO 4 -7H 2 O 3 mg /
  • strain is meant not only natural strains of the genus Aurantiochytrium, but also mutants of said natural strains.
  • mutants an organism derived from the original strain whose genetic heritage has been modified either by a natural process or by physico-chemical methods known to those skilled in the art that can generate random mutations (UV etc. .,) or by genetic engineering methods.
  • mixturetrophic conditions is meant a culture with a contribution of light and a contribution of organic carbon substrate.
  • heterotrophic conditions is meant a contribution of organic carbon substrate and in the dark.
  • strains of the strains are the strains:
  • Such strains are capable of producing significant quantities of biomass as well as lipids and carotenoids, and more particularly DHA and canthaxanthin and / or astaxanthin when they are cultivated in mixotrophic mode, in particular with a contribution of variable or discontinuous light, according to a preferred embodiment of the invention.
  • strains FCC 1324 (CCAP 4062/1), FCC 31 (CCAP 4062/2), FCC 131 1 (CCAP 4062/3), FCC 1319 (CCAP 4062/4), FCC 1325 (CCAP 4062/5) and FCC 1479 (CCAP 4062/6) belong to the genus Aurantiochytrium.
  • the subject of the invention is these novel strains FCC 1324 (CCAP 4062/1), FCC 31 (CCAP 4062/2), FCC 131 1 (CCAP 4062/1), FCC 1319 (CCAP 4062/4), FCC 1325 (CCAP 4062/5) and FCC 1479 (CCAP 4062/6).
  • strains belonging to the species Aurantiochytrium mangrovei have differences between them.
  • the following strains have very similar characteristics: CCAP 4062/1, CCAP 4062/2, CCAP 4062/3, CCAP 4062/4, CCAP 4062/5, CCAP 4062/6.
  • the CCAP 4062/1 strains and a strain of the prior art Aurantiochytrium mangrove FCC 1 104 differ in their morphological characteristics and their growth profiles.
  • strain CCAP4087 / 1 is grown more on a medium containing NH4 + compared to the strain CCAP4062 / 1, while the reverse is observed using a medium containing NO3 - as nitrogen source.
  • the invention relates to any strain of the Labyrinthulomycete class, in particular of the genus Aurantiochytrium, capable of growing under mixotrophic culture conditions as described in the present application, and capable of producing fatty acids, such as DHA and / or carotenoids such as astaxanthin, zeaxanthin, canthaxanthin, echinenone, beta-carotene and phoenicoxanthin.
  • the invention also relates to any species of protista of the genus Aurantiochytrium, capable of growing in mixotrophic culture conditions as described in the present application, and capable of producing fatty acids, such as DHA, and carotenoids such as canthaxanthin. and / or astaxanthin.
  • the Aurantiochytrium strains isolated according to the invention make it possible to produce, under mixotrophic conditions, significant amounts of biomass as well as lipids and carotenoids, the lipids being rich in DHA.
  • the process of the invention makes it possible to obtain an anti-aurantiochytrium biomass having 50% to 60% lipids relative to the weight of the dry matter.
  • DHA may represent more than 15%, or more than 20%, or more than 30% of the total fatty acids contained in the protists, the carotenoids being rich in canthaxanthin and / or astaxanthin, and said canthaxanthin and / or astaxanthin may represent more than 0.01%, or more than 0.1%, or more than 0.2% by weight on the total weight of dry matter.
  • the strains can reach a productivity level of canthanxathine and / or astaxanthin (amount of product of interest produced, per liter of culture, per hour) of 0.05 mg / L / h, or more than 1 mg / L / h, or more than 1.5 mg / L / hr.
  • Aurantiochytrium strains for example, strains FCC 1324, FCC 31, FCC 131 1, FCC 1319, FCC 1325 and FCC 1479, isolated by the applicant
  • which are cultivated under mixotrophic conditions, in particular in the presence of Variable and / or discontinuous illumination, especially in the form of flashes, makes it possible to produce canthaxanthin and / or astaxanthin.
  • heterotrophic conditions no canthaxanthin is detectable.
  • quantities of biomass obtained in mixotroph according to some embodiments of the invention are equal to or even higher (e.g., approximately 10 to 18% higher) than the amounts obtained under heterotrophic conditions.
  • heterotrophic conditions is meant culture conditions with an identical culture medium, but in the absence of light.
  • the subject of the invention is thus a process for the cultivation of stem protists of the Labyrinthulomycete class, in particular Thraustochytrid families, in particular of the genus Aurantiochytrium, in particular of the species Aurantiochytrium sp, in mixotrophic mode, in particular in the presence of an illumination.
  • variable or discontinuous over time for example in the form of flashes, in particular to produce polyunsaturated fatty acids and carotenoids, such as DHA and canthaxanthin and / or astaxanthin.
  • the invention thus relates to a process for producing DHA and / or carotenoid (s), especially canthaxanthin and / or astaxanthin by one or more strains of the genus Aurantiochytrium.
  • the subject of the invention is therefore a method for selecting protist strains of the Labyrinthulomycete class, in particular of the Thraustochytrid and Labyrinthulide families, in particular of the genus Aurantiochytrium, in particular of the species Aurantiochytrium sp., Of a mixotrophic nature, and having a high yield of polyunsaturated fatty acids and carotenoids such as DHA and canthaxanthin and astaxanthin, in mixotrophic mode, particularly in the presence of a variable and / or discontinuous illumination over time.
  • the process for producing DHA and / or carotenoid (s), in particular canthaxanthin and / or astaxanthin comprises the mixotrophic culture of one or more strains of the kind Aurantiochytrium.
  • step a) may also comprise the following steps i ° and ii)
  • step i) is carried out continuously in a fermenter and step ii) comprises feeding continuously and successively n fermentors operating in semi-continuous mode, n being an integer equal to or greater than 2, by the cells produced in step i) and their culture under conditions of mixotrophy.
  • Step i) is the growth phase of the cells making it possible to reach a large population.
  • a culture medium suitable for the culture of the urantiochytrium strains is used.
  • Step ii) is a phase of accumulation of DHA and / or carotenoid (s).
  • this phase uses a second feed solution for preferentially orienting the metabolism towards the accumulation of these molecules of interest.
  • this orientation can be done by increasing the ratio of carbon concentration to that of assimilable nitrogen (C / N ratio).
  • a first fermentor operating in continuous mode allows the growth (step i)) of the cells, and the outflow (or withdrawal) of this growth fermenter feeds the maturation tanks where the biomass is enriched in molecules. interest (step ii)).
  • the process can be described as a so-called “decoupled” process because the growth phases according to step i) and of the maturation according to step ii) are separated physically and temporally. .
  • step i) of culturing the cells in continuous mode of the biomass production process according to the invention can be carried out in a fermenter known to those skilled in the art, for example, the "chemostat”.
  • the start of the culture of step i) can be done in a conventional manner (see Figure 1). Pre-culture steps can be performed upstream, so as to obtain the desired cell concentration for start the production of biomass continuously, namely between 2 and 50 g / l, preferably between 5 and 40 g / l.
  • scaling from the cryotube is done in several pre-culture stages. For example, it can be done in three stages, two stages in Erlenmeyer flask (preculture 1 and preculture 2), and a fermenter stage (pre-fermenter). Erlenmeyer growth occurs in batch mode. In general, the growth in pre-fermenter is also in batch mode.
  • the culture can progressively change from a 20 ml Erlenmeyer culture to a 2 L Erlenmeyer culture, then to a fermentor culture (pre-fermentor) in a batch mode, and then, at a culture in a fermenter in continuous mode ("fermenter of head").
  • the batch fermenter has a volume of 40 L and the top fermentor has a volume of 4000 L.
  • the start of the culture in the fermenter head has a phase of establishment during which the continuous diet is not reached, that is to say that the growth of the cells is not stabilized, or is not not in phase with the feed rate in fresh medium.
  • This is an “equilibrium” phase that could also be called a “steady state” phase.
  • This "steady-state phase” has a duration that depends on the growth rate of the microorganisms cultivated or more precisely the specific or maximum growth rate. For example, this time can be between 5 and 200 hours, preferably between 10 and 100 hours.
  • a withdrawal rate of the top fermentor to the ripening fermenter (s) is set up at a flow rate equivalent to the feed rate of the fresh culture medium.
  • This racking feeds a first ripening fermenter until the desired volume is transferred, and the racking is redirected to another maturation tank.
  • This volume of inoculum may be between 10 and 90% of the capacity of the maturation fermenter, depending on the cells cultured; for example, about 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, or 80% of the maturation fermenter capacity.
  • a culture medium different from that used during step i) is used during the ripening phase.
  • this culture medium is provided in the ripening fermenter simultaneously, or previously, or subsequently to the inoculum which comes from the withdrawal of the top fermentor.
  • the volume of the fermenter culture of step i) is determined according to the final culture volume desired for ripening fermenter cultures.
  • the top fermentor has a volume of 5 to 100%, preferably 10% to 50% and more preferably approximately 20% of the volume of the maturation fermenter that it feeds.
  • a 4000 L volume fermenter can feed a 20,000 L maturation fermenter. If the n maturation fermentors have different volumes, then the largest fermenter volume will determine the volume. fermenter at the head.
  • the culture according to stage i) of protist strains of the genus Aurantiochytrium for the production of DHA can be carried out in a medium of salt culture (sea salt 10-20 g / L, preferably 15 g / L) with a glucose concentration of 5 to 200 g / l, preferably 30 to 100 g / l and more preferably 30 to 60 g / l.
  • the culture medium also contains macroelements, such as magnesium salts and potassium salts, at a concentration of 1 to 50 g / l, preferably 2 to 25 g / l.
  • the salts of magnesium and zinc may be present at 2-4mg / L
  • the cobalt and molybdenum salts may be present in a small amount, such as 0.01-0.04 mg / L, preferably between 0.02-0, 03 mg / L.
  • the copper and nickel salts may be present at 1-4 mg / l, preferably at 1-2 mg / l.
  • the iron salts are present at a higher level relative to other salts, for example at a level of 8-15 mg / L.
  • the culture medium named "batch medium” of Table 1 below can be used for starting the continuous culture, and the feed solution of Table 1 is used to feed fermentors continuously.
  • Table 1 Example of culture media useful for the culture of strains of Aurantiochytrium, according to step i) of the culture method.
  • the “middle foot” is the medium that can be used to start the culture continuously.
  • the feed solution can be used to feed the fermentor continuously.
  • the nutrient solution used in the ripening step, step ii) contains a carbon source (for example glucose or glycerol), a nitrogen source (for example (NH) 4 ) 2 SO 4 , a source of phosphate (for example KH 2 PO 4 ), preferably the ratio of C (carbon), N (nitrogen) and P (phosphate) (C / N / P) is 530: 1 1: 1 with always the possibility of having up to more or less nitrogen (N), and / or up to twice more or less phosphate (P), for example the following ratios can be used 530: 22: 1, 530: 5.5: 1, 530: 22: 0.5, 530: 1 1: 2, 530: 22: 2, 530: 5.5: 0 , 530: 1 1: 0.5, 530: 5.5: 2
  • concentration ranges given for the medium used for preculture, batch culture and feed medium of the continuous culture are specifically adapted to the species Aurantiochytrium mangrovei, in particular
  • the withdrawal of the top fermentor serves to feed continuously and successively the different maturation fermenters operating in semi-continuous mode.
  • the culture of the cells is thus maintained under the conditions of mixotrophy in said fermenters ("maturation" stage), with a view to the production of DHA and / or carotenoid (s), in particular canthaxanthin and / or astaxanthin.
  • the feed of the ripening fermenters according to step ii) starts when the top fermentor is in steady state at a stable cell density.
  • this cell density could be between 10 7 and 10 9 cells per ml.
  • Feeding the ripening fermenters according to step ii) is
  • a ripening fermenter is fed with the withdrawal of the overhead fermenter before passing to the next ripening fermenter, n + 1.
  • the volume of inoculum used to inoculate the maturation fermenter can represent between 10 and 70% of the final volume of the cell suspension in the maturation fermenter, preferably between 20 and 60%, more preferably between 30 and 50%.
  • the culture in the ripening fermenter is stopped, then the fermenter is emptied when the production of DHA and / or carotenoid (s) reaches the desired level, for example, when the DHA titre is between 5 and 30 g / L and / or the carotenoid titer between 0.1 and 10 mg / g of dry biomass.
  • the emptying is done conventionally towards tools allowing the treatment of the biomass with a view to the extraction of the molecule (s) of interest.
  • the ripening fermenter is cleaned, usually by specific equipment that is integrated into the fermentor tanks, and then sterilized.
  • N + 2 culture N + 2 culture and the ripening fermenter 1 is being cultured; at J + 2, maturation fermenter 3 is filled and ripening fermenters 1 and 2 are being cultured; at D + 3, the ripening fermenter 1 is cleaned, the ripening fermenter 4 is filled and the ripening fermenters 2 and 3 are being cultured.
  • the number of maturation fermenters fed by the overhead fermenter is greater than 2, and, in general, this number is limited only by the space available for storing said fermenters and their ancillary equipment.
  • the number of ripening fermenters is 2 to 10, preferably 2 to 6.
  • the semi-continuous mode of cultivation is generally carried out for 24 to 200 hours in each fermenter, preferably for 48 hours to 96 hours, more preferably 72 hours to 96 hours.
  • composition of the culture medium for step ii) makes it possible to maintain a residual growth, while promoting the accumulation of DHA and / or carotenoid (s), in particular canthaxanthin and / or astaxanthin.
  • residual growth is meant a multiplication of the cells at a growth rate of between 1 and 90% of the growth rate of step i) but which makes it possible to improve the productivity of biomass and of molecule (s) of 'interest.
  • the growth rate in continuous culture is 0.05 to 0.20 h -1 , preferably 0.10 h -1 .
  • the growth rate characterizes population growth over time.
  • the growth rate ( ⁇ ) is calculated according to the formula:
  • N1 quantity of biomass at time t1
  • N2 quantity of biomass at time t2.
  • the amount of biomass can be expressed in optical density, cell density or dry mass.
  • the times t1 and t2 are expressed in hours.
  • the value of ⁇ is expressed in h -1 (1 / hour).
  • the culture medium used for the fermentation according to step ii) of semi-continuous culture is chosen to preferentially orient the metabolism of the cultured cells towards the accumulation of DHA and / or carotenoid (s), in particular of canthaxanthin and / or astaxanthin.
  • This is achieved during a nitrogen limitation.
  • nitrogen limitation is meant an insufficient nitrogen concentration in the culture medium to ensure normal cell growth, and which results in a change in metabolism promoting the accumulation of carbon in the form of lipids.
  • This modification of the metabolism can also be obtained by increasing the C / N ratio (ratio of the concentration of carbon to that of assimilable nitrogen).
  • the culture medium contains a source of organic carbon, which allows growth in mixotrophy or heterotrophy.
  • the organic carbon is present at a concentration of 10 to 90 g / l (55mM to 500mM).
  • the culture medium (reconstituted from the volume of the cell suspension from the fermenter of the head and volume of concentrated feed solution) comprises from 100 to 200 g / L of glucose, about 5 to 10 g / L of ammonium and 1 to 2 g / L of phosphate.
  • step i) can be done independently under heterotrophic conditions. or mixotrophy.
  • step ii) is in mixotrophy.
  • step i) is in heterotrophy and step ii) in mixotrophy.
  • steps i) and ii) are in mixotrophy.
  • step ii) is at a lower temperature than step i).
  • the amount of lipids, in particular DHA, produced is increased relative to a culture where step ii) is carried out at the same temperature as step i).
  • the optimum growth temperature is higher than the optimal temperature of production of DHA.
  • step ii) is performed at 1 to 8 degrees less than the temperature at which step i) is performed.
  • step i) of the culture can be carried out at 25 ° C, while step b) can be carried out at 18 ° C, 19 ° C, 20 ° C, 21 ° C, 22 ° C or 23 ° C.
  • step i) of the culture can be conducted at 22 ° C, while step b) can be conducted at 18 ° C, 19 ° C, 20 ° C or 21 ° C.
  • step i) of the culture can be conducted at 27 ° C, while step b) can be conducted at 20 ° C, 21 ° C, 22 ° C, 23 ° C, 24 ° C, 25 ° C or 26 ° C.
  • a low temperature also favors the accumulation of pigments.
  • lighting conditions are adapted to maximize the yield of biomass, fatty acids, especially DHA and carotenoids. It appeared that a variable and / or discontinuous illumination of crops, particularly in the implementation of a mixotrophic culture, had a favorable impact on the development of protists and made it possible to increase their productivity. , in particular as regards their production of lipids and carotenoids. Without being bound by the theory, the inventor considers that a discontinuous and / or variable supply of light to protists has the effect of causing a "stress" favorable to the growth and synthesis of lipids as well as the synthesis of carotenoids.
  • the periods of darkness may occupy more than a quarter of the time, preferably half or more of the time, during which the algae are grown.
  • the illumination is discontinuous and more preferably in the form of flashes.
  • a flash within the meaning of the invention, is a short period of illumination, that is to say less than 30 minutes.
  • the duration may be less than 15 minutes, preferably less than 5 minutes or more preferably less than 1 minute.
  • the flash duration may be less than one second.
  • the flash duration can be 1/10 of a second, or 2/10 of a second, or 3/10 of a second, or 4/10 of a second or 5/10 of a second, or 6/10 of a second, or 7/10 of a second, or 8/10 of a second, or 9/10 of a second.
  • the illuminance, or flash is usually longer than 15 seconds. It is generally between 5 seconds and 10 minutes, preferably between 10 seconds and 2 minutes, more preferably between 20 seconds and 1 minute. These flash times are suitable for "low frequency" light inputs;
  • the number of flashes is between about 2 and 3600 per hour. It can be, for example, between 100 and 3600 flashes per hour. It can also be between 120 and 3000, or between 400 and 2500, or between 600 and 2000, or between 800 and 1500 flashes per hour. It may also be between 2 and 200, preferably between 10 and 150, more preferably between 15 and 100, and even more preferably between 20 and 50 per hour.
  • a flash has a duration between 1/150000 seconds and 1/1000 seconds. These flash times are suitable for "high frequency” illumination regimes; that is, with flash rates of 150kHz to 1kHz respectively. According to this embodiment or the illumination regime (the contribution of light) is "high frequency", the flashes can take place between 3.6 x 10 5 and 5.4 x 10 9 times per hour. In this case the variation of the light is said to have a frequency of between 1 kHz and 150 kHz, that is to say between 1000 and 150 000 flashes per second.
  • the light input according to this last embodiment of the invention is called “high frequency”.
  • the number of flashes per hour is chosen according to the intensity and duration of the flashes (see below).
  • the intensity of the light provided in the form of flashes is between 5 and 1000 ⁇ . m “2 , s “ 1 , preferably between 5 and 500 ⁇ . m “2 , s “ 1 , or 50 and 400 ⁇ . m “2 , s “ 1 , and more preferably between 150 and 300 ⁇ . m “2 , s “ 1 . 1 ⁇ . m “2 , s " 1 corresponds to 1 ⁇ m "2 , s " 1 (Einstein), a unit often used in the literature.
  • the illumination may be variable, which means that the illumination is not interrupted by dark phases, but that the light intensity varies over time. This variation in light intensity is regular and can be periodic or cyclic. According to the invention, it is also possible to carry out a light supply combining continuous and discontinuous illumination phases.
  • the light intensity provided to the algae in culture varies at least one times in one hour.
  • the amplitude of this light intensity variation generally between 5 and 1000, or between 50 and 800, or between 100 and 600 ⁇ . m “2 , s " 1 .
  • the intensity of the light can also vary between 5 and 400 ⁇ . m “2 , s " 1 .
  • the amplitude of the light intensity variation is between 70 and 300 ⁇ . m “2 , s " 1 and more preferably between 100 and 200 ⁇ . m “2 , s “ 1 .
  • Said luminous intensity can successively achieve, under variable lighting conditions, for example, the values 50 ⁇ . m “2 , s “ 1 and 100 ⁇ . m “2 s “ 1 , or 5 and 400 ⁇ . m “2 s “ 1 , or 50 and 800 ⁇ . m “2 , s “ 1 several times each hour.
  • Said luminous intensity can successively reach, preferably, the values 50 and 200 ⁇ . m “2 , s " 1 .
  • said luminous intensity can successively, several times in the hour, for example, the values 0 and 50 ⁇ . m “2 , s “ 1 , the values 0 and 100 ⁇ .
  • the intensity of the light brought to the culture varies according to the cell density.
  • the denser the culture the more intense the light.
  • the cell density is the number of cells per ml and is measured according to the techniques known to those skilled in the art.
  • the light intensity can be between 5 and 15 ⁇ . m “2 , s “ 1 , preferably between 5 and 10 ⁇ . m “2 , s “ 1 .
  • the light intensity can be increased to between 15 and 200 ⁇ . m “2 , s “ 1 , for example, preferably between 20 and 50 ⁇ . m “2 , s " 1 .
  • the culture, at the final stage reaches a density between 10 8 and 10 9 cells per ml
  • the light intensity can be increased to between 50 and 700 ⁇ . m “2 , s “ 1 , for example, preferably between 50 and 150 ⁇ . m “2 , s “ 1 .
  • the intensity of the light may be greater compared to the values mentioned above.
  • the light intensity can be between 5 and 200 ⁇ . m “2 , s " 1 , preferably between 5 and 100 ⁇ . m “2 , s " 1 .
  • the light intensity can be increased to between 30 and 500 ⁇ mol. m “2 , s " 1 , for example, preferably between 50 and 400 ⁇ .
  • the intensity light can be increased to between 100 and 1000 ⁇ . m “2 , s “ 1 for example, preferably between 200 and 500 ⁇ . m “2 , s “ 1 .
  • the quantity of light brought to the culture in the hour remains between certain values. It is between about 2000 and 600 000, preferably between 2000 and 300 000 ⁇ . m "2. It can be between about 4000 and 200,000 ⁇ . m" 2 per hour.
  • the culture is illuminated with 30 flashes per hour, each flash having a duration of 30 seconds and an intensity of 10 ⁇ . m “2 , s " 1 .
  • the latter gives a total light input per hour of 9000 ⁇ . m "2.
  • the culture is irradiated with 20 flashes per hour, each flash having a duration of 30 seconds and an intensity of 20 ⁇ . m" 2 s "1. This gives total light output per hour of 12 000 ⁇ . m "2 .
  • the culture is illuminated with 45 flashes per hour, each flash having a duration of 15 seconds and an intensity of 5 ⁇ . m “2 , s " 1 , which gives a total light input per hour of 3375 ⁇ . m “2 .
  • the culture is illuminated with 120 flashes per hour, each flash having a duration of 10 seconds and an intensity of 200 ⁇ . m “2 , s " 1 , which gives a total light input per hour of 240,000 ⁇ . m “2 .
  • the culture is illuminated with a frequency of 50 kHz, that is to say 1.8 x 10 8 flashes per hour, each flash having a duration of 1/100 000 seconds and a intensity of 200 ⁇ .
  • m “2 , s " 1 which gives a total light input per hour of 36,000 ⁇ . m "2
  • the amount of light provided to the culture per hour may vary depending on the cell density.
  • the total light input in the hour is generally between about 1500 and 8000, preferably 1500 and 6000 ⁇ . m “2 , more preferably between 2000 and 5000 ⁇ . m " 2 .
  • the total contribution of light in the hour can be increased to between 6000 and 67 000 ⁇ . m "2 , preferably between 6000 and 50 000, and more preferably between 12 000 and 45 000 ⁇ . m " 2 , for example.
  • the total light contribution in the hour can be increased to between 45,000 and 300,000, for example, preferably between 45,000 and 200,000 ⁇ . m "2 , and for example, more preferably between 50,000 and 150,000 ⁇ . m " 2 .
  • the culture is illuminated with 30 flashes per hour, each flash having a duration of 30 seconds and an intensity between 5 and 10 ⁇ . m “2 , s " 1 , which gives a total light input per hour of 2250 ⁇ . m “2 to 4500 ⁇ . m “ 2 .
  • the intermediate stage at a cell density between 10 6 and 10 7 cells per ml, the culture is illuminated with 30 flashes per hour, each flash having a duration of 30 seconds and an intensity between 15 and 50 ⁇ .
  • m "2 , s " 1 which gives a total light input per hour of 13,500 to 45,000 ⁇ . m "2.
  • the culture is irradiated with 30 flashes per hour, each flash having a duration of 30 seconds and an intensity between 50 and 150 ⁇ , m “2 , s " 1 , which gives a total light output per hour of 45,000 to 135,000 ⁇ . m "2 .
  • the duration of the flashes is for example less than one minute, or less than one second
  • the culture is illuminated with 30 flashes per hour, each flash having a duration of 10 seconds and an intensity between 50 and 100 ⁇ . m “2 , s " 1 , which gives a total light input per hour of 15,000 ⁇ . m “2 to 30,000 ⁇ . m “ 2 .
  • the culture is illuminated with 50 flashes per hour, each flash having a duration of 10 seconds and an intensity between 200 and 300 ⁇ .
  • m “2 , s " 1 which gives a total light output per hour of 100,000 to 150,000 ⁇ .
  • the culture is illuminated with 120 flashes per hour, each flash having a duration of 10 seconds and an intensity between 350 and 450 ⁇ .
  • m "2 , s " 1 which gives a total light output per hour of 420,000 to 540,000 ⁇ . m "2 .
  • the contribution of light in the cultures can be obtained by light sources distributed around the external wall of the fermenters.
  • a clock triggers these lamps for defined lighting times.
  • the illumination of the cultures is provided by an illumination device internal to the fermenter.
  • the illumination devices can be arranged on the rotating assembly provided with blades or on tubular parts immersed in the mass to be treated, or at the bottom or the ceiling of the tank.
  • the illumination device is located on the counter-blades inside the fermenter. Such a device is described in French Patent Application No. 1353641.
  • the fermenter is thus provided with a plurality of illumination sources carried by counter-blades, the latter having the function of preventing the formation of a vortex within the biomass under the action of the rotating assembly of brewing.
  • These sources of illumination are preferably encapsulated, partially or completely in at least a portion of these against blades, in a material compatible with the biomass and in a thickness for diffusing said light to the inside of the tank.
  • a particularly suitable material is polysulfone, which combines good compatibility with food standards (including the US Food and Drug Administration, or FDA for short), a good heat transfer coefficient (allowing heat dissipation to the mass of microorganisms and a semitransparency allowing a good transmission of light, if the material has a thickness chosen between 1 mm and 5 cm, in addition, this material retains its properties after a possible heat treatment of sterilization or cleaning with detergents or acid. If the combination of desired characteristics is changed, other materials may be selected, for example polyurethane, polypropylene, acrylic material or polycarbonate.
  • the illumination sources are light emitting diodes (LED for short); they are well-controlled light sources, both in their implementation and in their applications. Such sources can have very different emission spectra, since there are white LEDs (simulating the sunlight), but also LEDs with reduced spectral range (for example centered on a red, blue or green light). Such sources of illumination generate less heat than bulbs or bulbs; they also have small enough dimensions to be implanted on the faces of the counter-blades without inducing extra thickness affecting the main function of these plates.
  • LED light emitting diodes
  • the spectrum of the illumination sources is advantageously in the visible range, but can also, depending on the needs, be outside this visible range, for example in the UV (for example for applications involving sterilization), or in infra-red (for example, in applications to generate heat within the mass to be treated).
  • the sources of illumination may have control regimes (we also speak of control regimes or pilotage) very varied
  • the culture method according to the invention makes it possible to produce lipids and carotenoids.
  • the method according to certain embodiments of the invention further comprises the following steps: a) Mixotrophic culture of one or more strains of the Labyrinthulomycete class, in particular of the genus Aurantiochytrium under mixotrophic conditions, in particular in the presence of discontinuous and / or variable illumination over time, the illumination exhibiting intensity variations whose amplitude is between 5 ⁇ . m “2 , s " 1 and 1000, preferably between 5 and 400 ⁇ . m “2 , s “ 1 , these variations occurring between 2 and 3600, preferably 5-400 times per hour,
  • recovery step is meant more particularly the isolation of the strain or strains whose cell number has grown the most during said generations.
  • the hydrophobic material in fact comprises lipids and carotenoids.
  • the culture method according to the invention can also be applied to any species of the genus Aurantiochytrium, capable of growing under the mixotrophic conditions according to the invention, and capable of producing DHA and carotenoids.
  • the invention therefore also aims to optimize the production of biomass, as well as the production of lipids and carotenoids, especially DHA, and / or canthaxanthin and / or astaxanthin via the culture of protists of the genus Aurantiochytrium Mixotrophic, preferably cultured or selected according to the methods referred to above, then the recovery of the protists thus cultivated to extract the hydrophobic content, especially lipids including DHA and carotenoids including canthaxanthin and astaxanthin.
  • the amounts of biomass obtained are greater than 100 g / l, preferably greater than 1 g / l or more preferably higher. at 140g / L. Lipids are present in this biomass at a rate greater than 40% or even 50%. In general DHA represents more than 15%, see 20%, see 30% or even more than 35% of fatty acids. Canthaxanthin and / or astaxanthin may represent between 0.01% and 0.2% by weight on the total weight of dry matter.
  • the invention also relates to protists of the Labyrinthulomycete class, in particular of the family Labyrinthulaceae and Thraustochytriaceae, in particular of the genus Aurantiochytrium, obtainable according to the method of the invention as previously described.
  • protists are enriched in polyunsaturated fatty acids and carotenoids.
  • the total lipids of such protists generally represent more than 40%, or more than 50%, or more than 60% by weight of the dry matter. In general, they can have a DHA titre of 10 g / L to 20 g / L.
  • the canthaxanthin and / or astaxanthin contained by such protists can represent more than 0.1%, or more than 0.15%, or more than 0.2% by weight on the total weight of dry matter.
  • the protists according to one embodiment of the invention can thus have a productivity (quantity of product of interest produced, per liter of culture, by hour) of canthaxanthin and / or astaxanthin of 0.05 mg / L / h, or more than 1 mg / L / h, or more than 1, 5 mg / L / h. They may also have a DHA productivity of at least 0.1 g / L / h, preferably 0.2 g / L / h DHA, and more preferably at least 0.3 g / L / h DHA .
  • Aurantiochytrium cultures are carried out in fermentors (bioreactors) of 1 to 2 L useful with dedicated automata and supervision by computer station.
  • the system is regulated in pH via addition of base (2N sodium hydroxide solution) and / or acid (1N sulfuric acid solution).
  • the culture temperature is set at 26 ° C.
  • Stirring is carried out by means of 3 stirring wheels placed on the shaft according to the Rushton configuration (three-blade propellers with downward pumping).
  • the dissolved oxygen pressure is regulated in the medium throughout the culture, by the stirring speed (250-600 rpm), the air flow (0.25-1 vvm), or even the flow rate of oxygen (0.1 -0.5 vvm).
  • the control parameters make it possible to maintain a constant pO 2 at 15%.
  • the bioreactor is equipped with an external lighting system surrounding the transparent tank.
  • the intensity as well as the light cycles are controlled by a dedicated automaton supervised by a computer station.
  • the reactors are inoculated with a pre-culture carried out on a shaking table (140 rpm) in a thermostatically controlled enclosure (26 ° C.) and illuminated between 100 and 200 ⁇ .
  • the pre-cultures and cultures in bioreactors are carried out in the modified Verduyn medium (marine salts 15 g / L, (NH 4 ) 2 SO 4 3 g / L, KH 2 PO 4 1 g / L, MgSO 4 -7H 2 O, 0.5 g / L, Na 2 EDTA 24 mg / L, ZnSO 4 -7H 2 O 3 mg / L, MnCl 2 -2H 2 O 3 mg / L, Na 2 MoO 4 -2H 2 O 0.04 mg / L L, FeSO4-7H 2 O l Omg / L, pantothenate 3.2 mg / L, thiamine hydrochloride 9.5 mg / L, vitamin B12 0.15 mg / L).
  • the carbonaceous substrate used for conventional
  • Crop monitoring The total biomass concentration is monitored by measuring the dry mass (filtration on a GF / F filter, Whatman, then drying in an oven at 105 ° C for a minimum of 24 hours before weighing).
  • carotenoids including canthaxanthin and astaxanthin
  • 10 8 cells were extracted.
  • the methods of extraction and analysis of carotenoids, including canthaxanthin and astaxanthin, are known to those skilled in the art.
  • the crop is illuminated with 30 flashes per hour, each flash having a duration of 30 seconds and an intensity of 200 ⁇ . m “2 , s " 1 .
  • the light supply in the bioreactor cultures was obtained by LED lamps distributed around the external wall of the fermenter.
  • a clock triggers these LEDs for lighting times or pulses (for the cultivation in flash mixotrophy with discontinuous light).
  • Aurantiochytrium cultures are carried out in fermentors (bioreactors) of 1 to 2 L useful with dedicated automata and supervision by computer station.
  • the system is regulated in pH via addition of base (2N sodium hydroxide solution) and / or acid (1N sulfuric acid solution).
  • the culture temperature is set at 26 ° C.
  • Stirring is carried out by means of 3 stirring wheels placed on the shaft according to the Rushton configuration (three-blade propellers with downward pumping).
  • the dissolved oxygen pressure is regulated in the medium throughout the culture, by the stirring speed (250-600 rpm), the air flow (0.25-1 vvm), or even the flow rate of oxygen (0.1 -0.5 vvm).
  • the control parameters make it possible to maintain a constant pO 2 at 15%.
  • the bioreactor is equipped with an internal lighting system fixed on the counter-blades.
  • the intensity, as well as the light cycles, are controlled by a dedicated automaton supervised by a computer station.
  • the crop is illuminated with 60 flashes per hour, each flash having a duration of 20 seconds and an intensity of 100 ⁇ . m "2 , s " 1 .
  • the reactors are inoculated with a pre-culture carried out on a shaking table (140 rpm) in a thermostatically controlled enclosure (26 ° C.) and illuminated between 100 and 200 ⁇ .
  • Pre-cultures and cultures in bioreactors are carried out in the modified Verduyn medium (marine salts 15 g / L, (NH 4 ) 2 SO 4 3 g / L, KH 2 PO 4 1 g / L, MgSO 4 -7H 2 0, 0 , 5 g / L, Na 2 EDTA 24 mg / L, ZnSO 4 -7H 2 O 3 mg / L, MnCl 2 -2H 2 O 3 mg / L, Na 2 MoO 4 -2H 2 O 0.04 mg / L , FeSO4-7H 2 O l Omg / L, pantothenate 3.2 mg / L, thiamine hydrochloride 9,5mg / L, vitamin B12 0.15 mg / L).
  • the carbon substrate used is glucose
  • Feeding continuously with fresh medium is carried out with a dilution ratio of about 0.08 to 0.15 h -1 and with a concentrated medium between 10 and 15 times the initial concentration of each element. will know how to implement the continuous culture and calculate the feed rate, as well as determine when the steady state is reached. Once the steady state is reached, the withdrawal of this continuous fermentor can be used to feed the ripening fermenter of step b).
  • the cultures are carried out in fermenters (bioreactors) of 10 to 20 L useful with dedicated automata and supervision by computer station.
  • the regulation systems and the parameterization of these are, in every respect, similar to those of step i).
  • the reactors are inoculated with about 50% of the total volume of culture with the withdrawal of step i); and at the same time, the tank is also fed at the same flow rate with a concentrated medium 2 times, and which makes it possible to obtain the following final composition: marine salts 15 g / L; glucose between 60 and 120 g / L; (NH 4 ) 2 SO 4 at 0.8 gL; KH 2 PO 4 1 g / L; MgSO 4 -7H 2 O, 0.5 g / L, Na 2 EDTA 24 mg / L, ZnSO 4 -7H 2 O 3 mg / L, MnCl 2 -2H 2 O 3 mg / L, Na 2 MoO 4 -2H 2 O 0.04 mg / L, FeSO4-7H 2 O l Omg / L, pantothenate 3.2 mg / L, thiamine hydrochloride 9.5 mg / L, vitamin B12 0.15 mg / L.
  • the crop is illuminated with 60 flashes per hour, each flash having a duration of 20 seconds and an intensity of 500 ⁇ . m “2 , s " 1 .
  • the total biomass concentration is monitored by measuring the dry mass (filtration on GF / F filter, Whatman, then drying in an oven, 105 ° C, for 24 hours minimum before weighing).
  • Example 3 Continuous production of a high-density low-fat cell biomass (5 to 10%) and the accumulation of fatty acids by maturation of this biomass
  • Aurantiochytrium cultures are carried out in reactors from 1 to
  • the system is regulated in pH via addition of base (2N sodium hydroxide solution) and / or acid (1N sulfuric acid solution).
  • the culture temperature is set at 26 ° C.
  • the agitation is achieved thanks to
  • the dissolved oxygen pressure is regulated in the medium throughout the culture, by the speed of rotation of the stirring shaft (250-600 rpm), the air ventilation (0.25- 1 vvm) or oxygen (0.1 -0.5 vvm).
  • the control parameters, integrated in the supervisory PLC, make it possible to maintain a constant pO2 at 15%.
  • the fermenter is equipped with an internal lighting system fixed on the counter-blades.
  • the intensity and frequency of the illumination cycles are controlled by a dedicated automaton supervised by a computer station.
  • the culture is illuminated with 60 flashes per hour, each flash having a duration of 20 seconds and an intensity of 100 ⁇ . m-2. s-1.
  • the preculture is performed on a shaking table (140 rpm) in a thermostatically controlled enclosure (26 ° C) and illuminated between 100 and 200 ⁇ .
  • the reactor is inoculated at 1% from the preculture and is conducted in batch mode.
  • the withdrawal of the culture medium on the one hand and the supply of the feed solution on the other hand are started.
  • the steady state is reached after at least 5 residence times. Once the steady state has stabilized, the operating parameters (ventilation rate, dissipated power, feed rate, pH, volume of must), the residual substrate concentration in the must, and the concentration and macromolecular composition of the biomass produced are constant.
  • the composition of the chosen feed solution and the selected dilution rate make it possible to produce a volume of wort equivalent to 2.4 times the volume of the fermenter each day.
  • the diet is considered stable after 50 hours of culture. Once the diet has stabilized, the residual glucose concentration in the must stabilizes at 0 g / L, the cell density stabilizes around 3x10 9 cells / mL, which corresponds to approximately 65 g / L of biomass, the Fat in biomass stabilizes around 5% (Fatty matter / Dry matter). Fermentation in continuous mode was maintained for a total duration of 890 hours, including 815 hours in steady state.
  • the dilution rate by the feed solution is set at half the maximum growth rate of the strain on the medium used and in the culture conditions used.
  • the medium withdrawal rate is adapted to take into account the flow rate of the feed solution but also the volume of correction fluid pH.
  • the composition of the culture medium for the batch start of the culture is detailed in Table 1.
  • the feed solution of the continuous culture contains 15g / L of commercial sea salt (ex INSTANT OCEAN salts), 1 10 g / L of glucose, and contains concentrations of trace elements, macro-elements and vitamins equivalent to about 3 times those contained in the medium used for pre-culture and batch culture.
  • Other compositions for the feed solution are possible, as detailed in Table 1.
  • the total biomass concentration is monitored by measuring the dry mass (filtration on GF / F filter, Whatman, then drying in an oven, 105 ° C, for 24 hours minimum before weighing).
  • the must produced in continuous culture thus has a high cell density of a biomass containing very few lipids (5 to 10%).
  • This biomass is transferred to a maturation tank under conditions of culture where it accumulates very quickly fatty acids. (65 G / L in 24 hours). This makes it possible to produce a high concentration of biomass rich in fatty acid.
  • the volume taken from the continuous culture is taken at one time. In the case of industrial fermentation, this transfer is done gradually by the withdrawal of the culture medium.
  • the nutrient solution with a C / N / P ratio of 530: 1 1: 1 is gradually added to the sample volume.
  • the nutrient solution is added to the maturation tank each time the carbon source (here glucose) is exhausted.
  • Astaxanthin 0.05 mg / g DM (+/- 0.01) 0.07 mg / g DM (+/- 0.01)

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Abstract

L'invention se rapporte à de nouvelles souches de protistes appartenant au genre Aurantiochytrium permettant une production à haut rendement de lipides et de caroténoïdes, notamment d'acide docosahexaénoïque (DHA) et de canthaxanthine et/ou en astaxanthine, en mode mixotrophe, en particulier, utilisant un apport de lumière variable et/ou discontinu notamment sous forme de flashs.

Description

NOUVELLE SOUCHE DE AURANTIOCHYTRIUM
L'invention se rapporte à un procédé de culture en mode mixotrophe, notamment en présence d'un éclairement discontinu et/ou variable de lumière, d'un protiste de la classe Labyrinthulomycete, en particulier du genre Aurantiochytrium. Le procédé permet d'obtenir un haut rendement en biomasse et un enrichissement des protistes ainsi cultivés en lipides et en caroténoïdes, et plus particulièrement en acide docosahexaénoïque (DHA) et en canthaxanthine et/ou en astaxanthine. Le procédé permet ainsi de cultiver des souches du genre Aurantiochytrium à caractère mixotrophe, et ayant un haut rendement en lipides et/ou caroténoïdes, et plus particulièrement en acides gras polyinsaturés et en canthaxanthine et/ou en astaxanthine. L'invention se rapporte aussi à de nouvelles souches de protiste appartenant au genre Aurantiochytrium, particulièrement adaptée à la production de lipides et de caroténoïdes. Ces nouvelles souches du genre Aurantiochytrium sont utiles pour produire de l'acide docosahexaénoïque (DHA) et de la canthaxanthine et/ou de l'astaxanthine en mode mixotrophe.
Préambule
Parmi les acides gras polyinsaturés, certains hautement insaturés (AGHI) de la série des oméga-3 (PUFA-CJO3), en particulier l'acide éicosapentaénoïque (EPA ou C20:5 ω3) et l'acide docosahexaénoïque (DHA ou C22:6 ω3), et de la série des oméga-6 (PUFA-ωθ), en particulier, l'acide arachidonique (ARA ou AA ou encore acide eicosatétraénoïque C20:4 ω6) ont une importance nutritionnelle reconnue et présentent de fortes potentialités en terme d'applications thérapeutiques.
Considéré comme nutriment essentiel, le DHA est nécessaire au développement normal et fonctionnel des cellules, et joue un rôle crucial dans divers processus et fonctions biochimiques. Sa nature polyinsaturée lui confère une importance cruciale vis-à-vis des propriétés de la membrane cellulaire, chez les végétaux comme chez les animaux : fluidité, flexibilité et perméabilité sélective permettant par exemple une adaptation effective, et même la survie, aux basses températures, en particulier chez les poissons.
Le DHA est un constituant structurel majeur du cerveau humain et il en est le principal acide gras. Le DHA représente 15-20 % du cortex cérébral (le cerveau d'un adulte contient au moins 20 g de DHA) et 30-60 % de la rétine. Il est indispensable au développement du système nerveux central et à la fonction rétinienne, par incorporation dans les membranes cellulaires, et joue un rôle capital dans l'acquisition et le maintien satisfaisant des mécanismes de la vision et de la mémoire.
Les huiles de poissons, issues de l'industrie de la pêche, sont actuellement la principale source commerciale de ce type d'acides gras. Toutefois, alors que ces huiles trouvent de nouvelles applications (complément alimentaire en aquaculture, intégration dans les margarines), les ressources halieutiques marines se raréfient du fait d'une activité de pêche intensive.
De nouvelles sources de ces acides gras tels que ΙΈΡΑ, le DHA et TARA doivent donc être recherchées afin de répondre, dans le futur, à la demande croissante du marché pour ce type d'acides gras polyinsaturés.
Les protistes sont des microorganismes à organisation cellulaire simple, c'est-à-dire qu'ils sont généralement unicellulaires et parfois multicellulaires mais ne présentent pas de tissus spécialisés. Ils peuvent être autotrophes ou hétérotrophes.
Les protistes font l'objet actuellement de nombreux projets industriels car certaines espèces sont capables d'accumuler ou de sécréter des quantités importantes de lipides, notamment d'acides gras polyinsaturés.
Outre leur capacité à synthétiser les acides gras de novo, les protistes offrent plusieurs avantages par rapport aux huiles de poisson : elles sont cultivables in vitro dans des conditions contrôlées, ce qui permet la production d'une biomasse de composition biochimique relativement constante et, d'autre part, contrairement aux huiles de poissons, leurs lipides ne contiennent pas ou peu de cholestérol.
Enfin, les lipides produits par les protistes ont un profil d'acides gras plus simple que celui des huiles de poissons, ce qui limite les étapes de séparation des acides gras d'intérêt.
Par ailleurs, les caroténoïdes sont également des molécules d'intérêt. Ils sont généralement utilisés en tant que pigments, mais ils ont aussi un rôle important pour la santé de l'homme en tant qu'agents antioxydants. Enfin, ils présentent la capacité de stimuler le système immunitaire.
Les Thraustochytrides, en particulier Aurantiochytrium, sont connus pour produire du DHA lorsqu'ils sont cultivés en hétérotrophie [W.K. Hong et al. (201 1 ); Production of lipids containing high levels of docosahexaenoic acid by a newly isolated microalga, Aurantiochytrium sp. KRS101 . Appl. Biochem. Biotechnol.: 164(8) :1468-80]. Aurantiochytrium est aussi connue pour produire des caroténoïdes, tels que l'astaxanthine, la zéaxanthine, la canthaxanthine, l'échinénone, le bêta-carotène et la phoenicoxanthine [Yokoyama, R, Honda, D. (2007) Taxonomic rearrangement of the genus Schizochytrium sensu lato based on morphology, chemotaxonomic characteristics, and 18S rRNA gene phylogeny (Thraustochytriaceae, Labyrinthulomycetes): emendation for Schizochytrium and érection of Aurantiochytrium and Oblongichytrium gen. nov.; Mycoscience, Vol. 48, pp 199-21 1 ].
Pour mettre en œuvre la production des acides gras et des caroténoïdes par des protistes à l'échelle industrielle, plusieurs facteurs doivent être pris en compte. Par exemple, les cultures peuvent être réalisées en condition autotrophe, mixotrophe ou hétérotrophe selon la souche, la température, les conditions de lumière et la taille des fermenteurs. Par exemple, les cultures peuvent également être réalisées dans des conteneurs d'un litre, dans un laboratoire, dans des photobioréacteurs, et dans des conteneurs de 100 000 litres ou bien dans des bassins ouverts (plusieurs hectares). Toutefois, les dépenses énergétiques et autres ressources telles que la main d'œuvre et la facilité de poursuivre la culture doivent être prises en compte en développant des conditions de culture idéales.
En tout état de cause, il serait souhaitable de pouvoir obtenir des rendements en DHA et en caroténoïdes plus importants que ce qui est décrit dans l'art antérieur pour une exploitation industrielle plus efficace et plus rentable.
Ainsi, il est préférable d'avoir un rendement le plus élevé possible (par exemple au-delà de 80 g/1 de matière sèche, plus de 30% d'acides gras en poids par rapport au poids total de la matière sèche et plus de 0,1 % en poids de caroténoïdes sur le poids total de matière sèche).
L'effet de la lumière sur la croissance n'est pas réservé uniquement aux organismes photosynthétiques (plantes, cyanobactéries, microalgues et macroalgues). Certains organismes non chlorophylliens possèdent des photorécepteurs qui leur permettent de capter l'énergie lumineuse, essentielle pour leur développement. Les photorécepteurs comme le phytochrome représentent un exemple typique d'un capteur de lumière qui contrôle le développement de l'organisme qui le possède. Différents photorécepteurs ont été décrits à ce jour, à savoir, entre autres, les pigments accessoires, les cryptochromes et phototropines.
De plus, concernant les modes de cultures il existe trois types de procédés de fermentation couramment utilisés dans le domaine de la production de biomasse.
- le mode discontinu (en anglais « batch ») :
La cuve est remplie par le milieu de culture stérilisé, puis l'inoculum. La fermentation se déroule ensuite sans addition majeure supplémentaire de milieu (principalement les correctifs pH et antimousse). Le volume reste constant et la productivité de biomasse est relativement faible. En fin de fermentation, le fermenteur est vidé et son contenu est remplacé.
- le mode semi-continu (en anglais « fed-batch ») :
Ce procédé de production repose sur l'alimentation progressive de substrat nutritif lors de la culture. Ce mode est généralement utilisé pour atteindre une densité cellulaire élevée dans le fermenteur. - le mode continu (en anglais « continuous ») :
Dans ce procédé, on utilise un fermenteur couramment appelé « chemostat » dans lequel un milieu de culture frais est ajouté en permanence, tandis que le liquide de culture est soutiré en permanence pour garder le volume de culture constant.
Le taux de croissance des cellules peut être contrôlé en modifiant le débit d'alimentation en matière nutritive tout en respectant les limites physiologiques de chaque type de cellule ou souche (en fonction de son taux de croissance spécifique maximal ( max) dans les conditions spécifiques d'un procédé).
Le mode continu permet la culture des microorganismes dans un état d'équilibre physiologique donné correspondant à un équilibre entre la croissance de la biomasse et la production de métabolite(s) d'intérêt.
Dans l'état d'équilibre, les cellules croissent à une vitesse constante et tous les paramètres de culture demeurent constants (pH, volume, concentration en oxygène dissous, concentrations en éléments nutritifs et en produits, densité cellulaire, etc.).
Le mode continu présente, en particulier, les avantages suivants :
- le coût de production global de biomasse est diminué (moins d'opérations de nettoyage, stérilisation, culture, immobilisation d'équipements au niveau de la fermentation);
- la productivité (quantité de biomasse produite par heure) est augmentée;
- la récupération de la biomasse de manière continue permet de faciliter les opérations en aval tout en optimisant le dimensionnement des
équipements.
Cependant, les procédés continus présentent également des inconvénients, notamment lorsque la production de la molécule d'intérêt est dissociée ou partiellement dissociée de la phase de croissance cellulaire. Ainsi, lorsqu'une substance d'intérêt est produite en dehors de cette phase de croissance optimale (par exemple en fin de culture, pendant la phase stationnaire de la culture), il est plus difficile d'obtenir des performances compatibles avec les intérêts économiques.
D'autres contraintes liées au mode continu sont :
- la gestion des effluents en plus grande quantité (concentration en biomasse plus faible),
- la perte de matières premières non consommées (substrats résiduels) pouvant également avoir un impact sur les processus en aval (extraction, séchage...).
Il est, donc souhaitable de réaliser des cultures des souches Aurantiochytrium pour la production de DHA et/ou de canthaxanthine et/ou d'astaxanthine selon le mode de culture qui va permettre d'atteindre un taux de biomasse et des molécules d'intérêts de manière rentable à l'échelle industrielle,
Pour améliorer le rendement en DHA et en caroténoïdes, en particulier de la canthaxanthine et/ou en astaxanthine, le procédé de culture selon l'invention est pratiqué en mode mixotrophe, c'est-à-dire avec un apport de lumière, de préférence, avec une intensité variable et/ou discontinue et en présence d'un apport de substrat organique.
Il est entendu que le terme mixotrophe est usuellement employé à l'égard de souches présentant un chloroplaste, capable de se développer en présence de lumière en utilisant deux sources de carbone (organique et inorganique). Dans le cas des souches du genre Aurantiochytrium, un tel chloroplaste n'a pas été identifié. Toutefois, la souche étant à la fois hétérotrophe et réactive à la lumière, le terme mixotrophe sera élargi au sens de l'invention à cette catégorie de souche. On peut également utiliser le terme « photo-hétérotrophe » pour indiquer une telle souche.
Ainsi, c'est au terme de nombreuses expérimentations de criblage de souches que le demandeur est parvenu à isoler des souches de protiste du genre Aurantiochytrium, cultivables en mode mixotrophe et permettant, dans les conditions de la présente invention, une production à haut rendement d'acides gras polyinsaturés et de caroténoïdes, notamment de DHA et des caroténoïdes, notamment de la canthaxanthine et de l'astaxanthine. Des souches représentatives des nouvelles souches d 'Aurantiochytrium ainsi isolées et sélectionnées, ont été déposées auprès de la CCAP (Culture Collection of Algae and Protozoa, Scottish Association for Marine Science, Dunstaffnage Marine Laboratory, Oban, Argyll PA371 QA, Ecosse, Royaume- Uni).
Ainsi la souche (FCC 1324) a été déposée le 21 juin 2013 selon les dispositions du Traité de Budapest, sous le numéro d'accession CCAP 4062/1 auprès de la CCAP.
Les souches FCC 31 (numéro d'accession CCAP 4062/2) ; FCC 131 1 (numéro d'accession CCAP 4062/3) ; FCC 1319 (numéro d'accession CCAP 4062/4) ; FCC 1325 (numéro d'accession CCAP 4062/5) et FCC 1479 (numéro d'accession CCAP 4062/6), ont été déposées le 8 juillet 2014 selon les dispositions du Traité de Budapest, auprès de la CCAP.
Selon un mode de réalisation, la culture en mode mixotrophe se fait dans des conditions d'éclairement discontinu et/ou variable au cours du temps, l'éclairement présentant des variations d'intensité dont l'amplitude est comprise entre 5 μιτιοΙ. m"2, s"1 et 1000 μιτιοΙ. m"2, s"1 , ces variations ayant lieu entre 2 et 3600 fois par heure. L'amplitude des variations d'intensité est comprise entre 70 et 300 μιτιοΙ. m"2, s"1 , et de préférence, entre 100 et 200 μηηοΙ. m"2, s"1.
Légendes des figures :
Figure 1. Schéma de procédé selon un mode de réalisation de l'invention, le « procédé découplé ».
Figure 2. Comparaison de croissance entre la souche FCC 1324 (CCAP 4062/1) et la souche FCC 1104 d'Aurantiochytrium mangrovei (numéro de dépôt CCAP4087/1). (A) Croissance en présence de NH4 + comme source d'azote. (B) Croissance en présence de NO3" comme source d'azote. Figure 3. Images de microscopie photonique cellules ayant poussé en milieu contenant du NH4 + comme source d'azote. (A) image de la souche FCC1324 (CCAP 4062-1 ). (B) Image de la souche FCC1 104 Aurantiochytrium mangrovei (CCAP4087/1 ). Les deux images ont été prises avec le même grossissement x1000.
Description détaillée
La présente invention a donc pour objet un procédé de culture des protistes de la classe Labyrinthulomycete, notamment de la famille Thraustochytride, en particulier du genre Aurantiochytrium, en mode mixotrophe, en particulier dans des conditions d'éclairement discontinu et/ou variable au cours du temps.
L'invention concerne également un procédé de production de DHA et/ou de caroténoïde(s), en particulier de canthaxanthine et/ou de l'astaxanthine, comprenant l'étape suivante :
a) la culture en mode mixotrophe d'une ou plusieurs souches du genre Aurantiochytrium.
L'éclairement présente préférentiellement des variations d'intensité dont l'amplitude est généralement comprise entre 5 μιτιοΙ. m"2, s"1 et 1000 μιτιοΙ. m"2, s"1 , de préférence entre 30 et 400 μιτιοΙ. m"2, s"1. Selon un mode de réalisation de l'invention ces variations peuvent avoir lieu entre 2 et 3600 fois par heure, de préférence entre 2 et 200 fois par heure. Cet apport lumineux peut comporter des phases d'éclairement discontinu et/ou variable, avec des variations d'intensité pouvant avoir des amplitudes identiques ou différentes.
Selon un mode de réalisation l'apport de lumière s'effectue sous forme de flashs. Selon un mode de réalisation un flash a une durée comprise entre 1/10 seconde et 10 minutes, de préférence 5 secondes et 10 minutes, de préférence encore entre 10 secondes et 2 minutes, plus préférentiellement entre 20 secondes et 1 minute. Selon un mode de réalisation, le nombre de flashs est entre 5 et 3600, de préférence entre 10 et 150, préférentiellement entre 15 et 100, et plus préférentiel lement entre 20 et 50 fois par heure.
Selon un mode de réalisation, l'éclairement des cultures est assuré par un dispositif d'illumination interne au fermenteur, de préférence, situé sur les contre-pales à l'intérieur du fermenteur. Selon un mode de réalisation préféré des sources d'éclairement sont des diodes électro-luminescentes.
Selon un mode de réalisation de l'invention, le procédé de culture en mode mixotrophe s'effectue en présence de 100 mM à 1 ,5 M, de préférence de 200 mM à 1 ,2 M, plus préférentiellement de 250 mM à 1 M, et encore plus préférentiellement de 300 mM à 600 mM d'un substrat carboné organique. L'apport du substrat est assuré continuellement pendant la culture, afin de permettre aux cellules d'accumuler une concentration importante de lipides et de caroténoïdes. Du substrat additionnel est ajouté au milieu de culture pendant le procédé de culture pour maintenir une concentration suffisante.
Selon un autre mode de réalisation de l'invention, le procédé de culture comprend la culture des cellules en mode continu en conditions de mixotrophie ou en hétérotrophie dans un fermenteur (étape de « croissance »), puis l'alimentation en continu dans des fermenteurs fonctionnant en mode semi-continu par les cellules produites et leur culture en conditions de mixotrophie dans lesdits fermenteurs (étape de « maturation ») (voir Figure 1 ).
Le procédé selon l'invention a pour avantage d'augmenter le rendement en biomasse obtenu de la culture. Il a aussi pour avantage d'enrichir les protistes ainsi cultivés en acides gras polyinsaturés, plus particulièrement en acide docosahexaénoïque (DHA), et en caroténoïdes. Les caroténoïdes qui peuvent être produits par Aurantiochytrium selon un mode de réalisation de l'invention sont l'astaxanthine, la zéaxanthine, la canthaxanthine, l'échinénone, le bêta-carotène et la phoenicoxanthine. Selon un mode de réalisation de l'invention, les caroténoïdes dominants sont la canthaxanthine et l'astaxanthine. La culture en mode mixotrophe de ce protiste s'effectue préférentiel lement en présence de 100 mM à 1 ,5 M, de préférence de 200 mM à 1 ,2 M, plus préférentiellement de 250 mM à 1 M, et encore plus préférentiellement de 300 mM à 600 mM d'un substrat carboné organique. L'apport du substrat est préférentiellement assuré continuellement pendant la culture, afin de permettre aux cellules d'accumuler une concentration importante de lipides et de caroténoïdes. Du substrat additionnel est ajouté au milieu de culture pendant le procédé de culture pour maintenir une concentration suffisante. Ce substrat carboné organique comprend préférentiellement, sous forme pure ou en mélange : du glucose, des dérivés de cellulose, du saccharose et/ou du glycérol.
Le substrat carboné organique contenu dans le milieu de culture peut consister en des molécules complexes ou en un mélange de substrats. Les produits issus de la biotransformation de l'amidon, par exemple à partir de maïs, de blé ou de pomme de terre, notamment les hydrolysats de l'amidon, qui sont constitués de molécules de petite taille, constituent, par exemple, des substrats carbonés organiques adaptés à la culture en mixotrophie des protistes selon l'invention.
Selon un mode de réalisation, ledit substrat carboné organique présent dans le milieu de culture comprend au moins 300 mM de glucose et/ou glycérol.
Ce procédé est plus particulièrement destiné à la mise en œuvre de nouvelles souches de la classe Labyrinthulomycete, en particulier du genre Aurantiochytrium (Règne : Chromista, Ordre : Thraustochytriales, Famille: Thraustochytriaceae) [ITIS Catalogue of Life, 2010] sélectionnées pour leur caractère mixotrophe, et ayant un haut rendement en acides gras polyinsaturés, notamment en DHA, et en caroténoïdes, notamment en canthaxanthine et/ou en astaxanthine, et notamment pour leur capacité à être cultivées avec un apport lumineux supérieur à 10 μΕ, dans un milieu riche en éléments organiques, par exemple, le milieu Verduyn modifié (sels marins 15 g/L, (NH4)2SO4 3g/L , KH2PO4 1 g/L, MgSO4-7H20 , 0,5 g/L, Na2EDTA 24 mg/L, ZnSO4-7H2O 3 mg/L, MnCI2-2H2O 3 mg/L, Na2MoO4-2H2O 0,04 mg/L, FeSO4-7H2O 10mg/L, pantothénate 3,2 mg/L, hydrochlorure de thiamine 9,5 mg/L, vitamine B12 0,15 mg/L, antimousse 0,1 mL/L) dans lequel est ajouté un substrat carboné organique. De préférence, le substrat carboné organique comprend du glucose, du glycérol, dans une concentration équivalente ou supérieure à 300 mM.
Par « souche », on entend non seulement les souches naturelles du genre Aurantiochytrium, mais également les mutants desdites souches naturelles.
Par « mutants » on entend un organisme dérivé de la souche originelle dont le patrimoine génétique a été modifié soit par un processus naturel, soit par des méthodes physico-chimiques connues par l'homme de l'art pouvant générer des mutations aléatoires (UV etc.,), soit par des méthodes de génie génétique.
Par « conditions de mixotrophie », on entend une culture avec un apport de lumière et un apport en substrat carboné organique.
Par « conditions en hétérotrophie », on entend un apport en substrat carboné organique et dans l'obscurité.
Des souches représentatives des souches (du genre Aurantiochytrium) selon l'invention sont les souches :
- FCC 1324 isolée par le demandeur et déposée à la CCAP sous le numéro CCAP 4062/1 ;
- FCC 31 isolée par le demandeur et déposée à la CCAP sous le numéro CCAP 4062/2 ;
- FCC 131 1 isolée par le demandeur et déposée à la CCAP sous le numéro CCAP CCAP 4062/3 ;
- FCC 1319 isolée par le demandeur et déposée à la CCAP sous le numéro CCAP 4062/4 ;
- FCC 1325 isolée par le demandeur et déposée à la CCAP sous le numéro CCAP 4062/5) ; et
- FCC 1479 isolée par le demandeur et déposée à la CCAP sous le numéro CCAP 4062/6. De telles souches sont capables de produire des quantités significatives de biomasse ainsi que des lipides et des caroténoïdes, et plus particulièrement du DHA et de la canthaxanthine et/ou de l'astaxanthine quand elles sont cultivées en mode mixotrophe, en particulier avec un apport en lumière variable ou discontinu, selon un mode de réalisation préféré de l'invention.
Selon les analyses taxonomiques en cours, les souches FCC 1324 (CCAP 4062/1 ), FCC 31 (CCAP 4062/2), FCC 131 1 (CCAP 4062/3), FCC 1319 (CCAP 4062/4), FCC 1325 (CCAP 4062/5) et FCC 1479 (CCAP 4062/6) appartiennent au genre Aurantiochytrium.
L'invention a pour objet ces nouvelles souches FCC 1324 (CCAP 4062/1 ), FCC 31 (CCAP 4062/2), FCC 131 1 (CCAP 4062/1 ), FCC 1319 (CCAP 4062/4), FCC 1325 (CCAP 4062/5) et FCC 1479 (CCAP 4062/6).
Certaines souches appartenant à l'espèce Aurantiochytrium mangrovei présentent des différences entre elles. Les souches suivantes ont des caractéristiques très semblables : CCAP 4062/1 , CCAP 4062/2, CCAP 4062/3, CCAP 4062/4, CCAP 4062/5, CCAP 4062/6. Par exemple, les souches CCAP 4062/1 et une souche de l'art antérieur ^'Aurantiochytrium mangrovei FCC 1 104 (numéro de dépôt CCAP4087/1 ) se distinguent au niveau de leurs caractéristiques morphologiques et leurs profils de croissance.
Les inventeurs ont pu voir la distinction par des tests de croissance et des analyses morphologiques. Dans les mêmes conditions de culture, la croissance de ces deux souches est différente, tant au niveau de la vitesse de croissance qu'au niveau de la densité optique atteinte lors de la phase de saturation (voir la Figure 2A et 2B). Effectivement, la souche CCAP4087/1 se développe plus sur un milieu contenant du NH4+ par rapport à la souche CCAP4062/1 , alors qu'on observe l'inverse en utilisant un milieu contenant du NO3" comme source d'azote.
De plus les souches CCAP4087/1 sont plus petites (voir la Figure 3A et 3B). L'invention porte sur toute souche de la classe Labyrinthulomycete, en particulier du genre Aurantiochytrium, capable de croître en conditions de culture mixotrophe telles que décrites dans la présente demande, et capable de produire des acides gras, tels que le DHA et/ou des caroténoïdes tels que l'astaxanthine, la zéaxanthine, la canthaxanthine, l'échinénone, le bêta- carotène et la phoenicoxanthine.
L'invention porte aussi sur toute espèce de protiste du genre Aurantiochytrium, capable de croître en conditions de culture mixotrophe telles que décrites dans la présente demande, et capable de produire des acides gras, tels que le DHA, et des caroténoïdes tels que la canthaxanthine et/ou de l'astaxanthine.
Les souches Aurantiochytrium isolées selon l'invention permettent de produire, en condition de mixotrophie, des quantités significatives de biomasse ainsi que de lipides et de caroténoïdes, les lipides étant riches en DHA. En effet, le procédé de l'invention permet d'obtenir une biomasse ϋ Aurantiochytrium ayant 50% à 60 % de lipides par rapport au poids de la matière sèche. Le DHA peut représenter plus de 15 %, ou plus de 20 %, ou plus de 30 % des acides gras totaux contenus dans les protistes, les caroténoïdes étant riches en canthaxanthine et/ou en astaxanthine, et ladite canthaxanthine et/ou astaxanthine peut représenter plus de 0,01 %, ou plus de 0,1 %, ou plus de 0,2 % en poids sur le poids total de matière sèche. Les souches peuvent atteindre un niveau de productivité en canthanxathine et/ou en astaxanthine (quantité de produit d'intérêt produit, par litre de culture, par heure) de 0,05 mg/L/h, ou plus de 1 mg/L/h, ou plus de 1 ,5 mg/L/h.
Dans la présente invention, les souches Aurantiochytrium (par exemple, les souches FCC 1324, FCC 31 , FCC 131 1 , FCC 1319, FCC 1325 et FCC 1479, isolées par le demandeur) qui sont cultivées en conditions mixotrophes, en particulier en présence d'un éclairement variable et/ou discontinu, notamment sous forme de flashs, permettent de produire de la canthaxanthine et/ou de l'astaxanthine.
Par contre, en conditions d'hétérotrophie aucune canthaxanthine n'est détectable. De plus, des quantités de biomasse obtenues en mode mixotrophe selon certains modes de réalisation de l'invention sont égales ou même supérieures (par exemple, approximativement supérieures de 10 à 18%) aux quantités obtenues en conditions d'hétérotrophie. Par conditions d'hétérotrophie, on entend des conditions de culture avec un milieu de culture identique, mais en l'absence de lumière.
L'invention a ainsi pour objet un procédé de culture de protistes souches de la classe Labyrinthulomycete, notamment des familles Thraustochytride, en particulier du genre Aurantiochytrium, notamment de l'espèce Aurantiochytrium sp, en mode mixotrophe, en particulier en présence d'un éclairement variable ou discontinu au cours du temps, par exemple sous forme de flashs, notamment en vue de produire des acides gras polyinsaturés et des caroténoïdes, tels que le DHA et la canthaxanthine et/ou l'astaxanthine.
L'invention a ainsi pour objet un procédé de production de DHA et/ou de caroténoïde(s), notamment de la canthaxanthine et/ou l'astaxanthine par une ou plusieurs souches du genre Aurantiochytrium.
L'invention a ainsi pour objet un procédé de sélection des protistes souches de la classe Labyrinthulomycete, notamment des familles Thraustochytride et Labyrinthulide, en particulier, du genre Aurantiochytrium, notamment de l'espèce Aurantiochytrium sp., à caractère mixotrophe, et ayant un haut rendement en acides gras polyinsaturés et en caroténoïdes tels que le DHA et la canthaxanthine et l'astaxanthine, en mode mixotrophe, en particulier en présence d'un éclairement variable et/ou discontinu au cours du temps.
Selon un mode de réalisation de l'invention, le procédé de production de DHA et/ou de caroténoïde(s), en particulier de canthaxanthine et/ou de l'astaxanthine, comprend la culture en mode mixotrophe d'une ou plusieurs souches du genre Aurantiochytrium.
Selon un mode de réalisation de l'invention l'étape a) peut également comprendre les étapes i° et ii) suivantes
Une étape i) de croissance en conditions de mixotrophie ou d'hétérotrophie et Une étape ii) d'accumulation de DHA et/ou de caroténoïdes en conditions de mixotrophie.
Selon un mode de réalisation de l'invention, particulièrement adapté à la production de DHA et/ou de caroténoïde(s) à l'échelle industrielle, l'étape i) est réalisée en mode continu dans un fermenteur et l'étape ii) comprend l'alimentation en continu et successivement de n fermenteurs fonctionnant en mode semi-continu, n étant un nombre entier égal ou supérieur à 2, par les cellules produites dans l'étape i) et leur culture en conditions de mixotrophie.
L'étape i) est la phase de croissance des cellules permettant d'atteindre une population importante. En général, un milieu de culture adapté pour la culture des souches ô'Aurantiochytrium est utilisé.
L'étape ii) est une phase d'accumulation de DHA et/ou de caroténoïde(s). De préférence, cette phase utilise une seconde solution d'alimentation permettant d'orienter préférentiellement le métabolisme vers l'accumulation de ces molécules d'intérêt. Par exemple, en cas de production de DHA, cette orientation peut se faire par l'augmentation du rapport de la concentration du carbone sur celle de l'azote assimilable (rapport C/N).
En pratique, un premier fermenteur fonctionnant en mode continu permet la croissance (l'étape i)) des cellules, et le flux sortant (ou soutirage) de ce fermenteur de croissance alimente des cuves de maturation où la biomasse s'enrichit en molécules d'intérêt (l'étape ii)).
Selon ce mode de réalisation de l'invention, le procédé peut être décrit en tant qu'un procédé dit « découplé » car les phases de croissance selon l'étape i) et de maturation selon l'étape ii) sont séparées physiquement et temporellement.
L'étape i) de culture des cellules en mode continu du procédé de production de biomasse selon l'invention, ou « étape de croissance », peut être mise en œuvre dans un fermenteur connu de l'homme de métier, comme par exemple, le « chemostat ».
Le démarrage de la culture de l'étape i) peut se faire de manière classique (voir Figure 1 ). Des étapes de pré-culture peuvent être effectuées en amont, de manière à obtenir la concentration cellulaire voulue pour débuter la production de biomasse en continu, à savoir entre 2 et 50 g/L, de préférence entre 5 et 40 g/L.
En général, la montée en échelle à partir du cryotube se fait en plusieurs étapes de pré-culture. Par exemple, elle peut se faire en trois étapes, deux étapes en Erlenmeyer (préculture 1 et préculture 2), et une étape en fermenteur (pré-fermenteur). La croissance en Erlenmeyer se déroule en mode discontinu (« batch »). En général, la croissance en pré-fermenteur se fait également en mode discontinu.
Par exemple, la culture peut passer progressivement d'une culture en Erlenmeyer de 20 mL à une culture en Erlenmeyer de 2 L, puis à une culture en fermenteur (pré-fermenteur) en mode discontinu (« batch »), puis, à une culture dans un fermenteur en mode continu (« fermenteur de tête »). Par exemple, le fermenteur en mode discontinu a un volume de 40 L et le fermenteur de tête a un volume de 4000 L.
Le démarrage de la culture dans le fermenteur de tête a une phase de mise en place durant laquelle le régime continu n'est pas atteint, c'est-à-dire que la croissance des cellules n'est pas stabilisée, ou n'est pas en phase avec le débit d'alimentation en milieu frais. Il s'agit d'une phase « d'atteinte de l'équilibre » que l'on pourrait aussi appeler « phase de mise en régime permanent ». Cette « phase de mise en régime permanent » a une durée qui dépend de la vitesse de croissance des microorganismes cultivés ou plus précisément du taux de croissance spécifique ou max. A titre exemple, cette durée peut être comprise entre 5 et 200 heures, de préférence entre 10 et 100 heures.
De manière générale, une fois le régime permanent atteint, un débit de soutirage du fermenteur de tête vers le ou les fermenteur(s) de maturation est mis en place à un débit équivalent au débit d'alimentation en milieu de culture frais. Ce soutirage alimente un premier fermenteur de maturation jusqu'à ce que le volume souhaité soit transféré, puis le soutirage est réorienté vers une autre cuve de maturation. L'homme de métier saura déterminer le volume d'inoculum nécessaire selon le type de cellules à cultiver, la molécule d'intérêt à produire et les capacités des cuves de maturation selon un mode de réalisation. Ce volume d'inoculum peut être compris entre 10 et 90 % de la capacité du fermenteur de maturation, en fonction des cellules cultivées ; par exemple environ 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, ou 80 % de la capacité du fermenteur de maturation.
Le soutirage vers les fermenteurs de maturation est fait de manière conventionnelle en utilisant des équipements connus.
De manière générale, un milieu de culture différent de celui utilisé pendant l'étape i) est employé pendant la phase de maturation. Selon des modes de réalisation différents, ce milieu de culture est apporté dans le fermenteur de maturation simultanément, ou préalablement, ou ultérieurement à l'inoculum qui provient du soutirage du fermenteur de tête.
Le volume de la culture en fermenteur de l'étape i) est déterminé en fonction du volume final de culture souhaité pour les cultures en fermenteurs de maturation. En général, le fermenteur de tête a un volume de 5 à 100 %, de préférence 10 % à 50 % et plus préférentiellement environ 20 % du volume du fermenteur de maturation qu'il alimente. Par exemple, un fermenteur de tête ayant un volume de 4000 L peut alimenter un fermenteur de maturation de 20 000 L. Si les n fermenteurs de maturation ont des volumes différents, c'est le volume de fermenteur le plus important qui va déterminer le volume du fermenteur en tête.
De manière générale, la culture selon l'étape i) des souches de protistes du genre Aurantiochytrium pour la production de DHA peut se faire en milieu de culture salin (sel marin 10-20 g/L, de préférence 15 g/L) avec une concentration de glucose de 5 à-200 g/L, de préférence 30 à 100 g/L et plus préférentiellement de 30 à 60 g/L. Selon un mode de réalisation, le milieu de culture contient également des macroéléments, tels que des sels de magnésium et des sels de potassium, à une concentration de 1 à 50 g/L, de préférence 2 à 25 g/L. Il contient aussi des oligoéléments utilisés de manière conventionnelle pour la culture des protistes, tels que des sels de manganèse, de zinc, de cobalt, de molybdène et de cuivre, de nickel et de fer. Des valeurs typiques pour la concentration de ces oligoéléments sont de 0,02 à 15 mg/L pour chaque oligoélément. Par exemple, les sels de magnésium et de zinc peuvent être présents à 2-4mg/L, les sels de cobalt et de molybdène peuvent être présents en faible quantité, telle que 0,01 -0,04 mg/L, de préférence entre 0,02-0,03 mg/L. Les sels de cuivre et de nickel peuvent être présents à 1 - 4 mg/L, de préférence à 1 -2 mg/L. En général, les sels de fer sont présents à un taux plus important par rapport à d'autres sels, par exemple à un niveau de 8-15 mg/L.
Selon un mode de réalisation de l'invention adapté pour atteindre des très hautes densités cellulaires (1 à 3x109 cellules/ml), le milieu de culture nommé « Milieu batch» du Tableau 1 ci-dessous peut être utilisé pour le démarrage de la culture en continu, et la solution d'alimentation du Tableau 1 est utilisée pour alimenter les fermenteurs en continu.
Figure imgf000019_0001
Tableau 1 : Exemple de milieux de culture utiles pour la culture des souches de Aurantiochytrium, selon l'étape i) du procédé de culture. Le « milieu pied» correspond au milieu qui peut être utilisé pour le démarrage de la culture en continu. Ensuite « la solution d'alimentation » peut être utilisée pour alimenter le fermenteur en continu. Selon le même mode de réalisation, la solution nutritive utilisée dans l'étape de maturation, l'étape ii), contient une source de carbone (par exemple du glucose ou du glycérol), une source d'azote (par exemple du (NH4)2SO4, une source de phosphate (par exemple du KH2PO4). De manière préférée, le ratio entre le C (carbone), le N (l'azote) et le P (le phosphate) (C/N/P) est 530 :1 1 :1 avec toujours la possibilité d'avoir jusqu'à aux fois plus ou moins d'azote (N), et/ou jusqu'à deux fois plus ou moins de phosphate (P), par exemple les ratios suivants peuvent être utilisés 530:22:1 ,530:5,5:1 ; 530:22:0,5; 530:1 1 :2; 530:22:2; 530:5,5:0,5; 530:1 1 :0,5; 530:5,5:2. Les gammes de concentrations données pour le milieu utilisé pour la préculture, la culture discontinue et le milieu d'alimentation de la culture continue sont spécifiquement adaptés à l'espèce Aurantiochytrium mangrovei, notamment, la souche FCC 1324. Des concentrations en dehors des gammes conseillées peuvent être utilisées selon l'espèce et la souche. En se basant sur les gammes décrites ci-dessous l'homme de métier saura déterminer la composition adaptée à la souche utilisée en prenant garde à éviter les carences et les inhibitions.
De manière générale, lorsque la concentration en biomasse dans le fermenteur de tête a atteint un équilibre, entre environ 5 et 100 g/L, de préférence entre environ 10 et 70 g/L en concentration de biomasse, le soutirage du fermenteur de tête sert à alimenter de manière continue et successive les différents fermenteurs de maturation fonctionnant en mode semi-continu. La culture des cellules est ainsi maintenue en conditions de mixotrophie dans lesdits fermenteurs (étape de « maturation »), en vue de la production de DHA et/ou de caroténoïde(s), en particulier de canthaxanthine et/ou de l'astaxanthine. Ainsi, de manière générale, l'alimentation des fermenteurs de maturation selon l'étape ii) démarre quand le fermenteur de tête est en régime permanent à une densité cellulaire stable. De manière générale, pour Aurantiochytrium cette densité cellulaire pourrait être entre 107 et 109 cellules par ml_.
L'alimentation des fermenteurs de maturation selon l'étape ii) se fait
(en général) de manière successive, c'est-à-dire que l'on alimente un fermenteur n de maturation avec le soutirage du fermenteur de tête avant de passer au fermenteur de maturation suivant, n+1 .
Le volume d'inoculum utilisé pour inoculer le fermenteur de maturation peut représenter entre 10 et 70 % du volume final de la suspension cellulaire dans le fermenteur de maturation, préférentiellement entre 20 et 60 %, plus préférentiellement entre 30 et 50 %.
De manière générale, une fois que le volume d'inoculum souhaité a été atteint dans le fermenteur de maturation n, on alimente le deuxième (n+1 ) fermenteur de maturation (ou « maturateur »), puis on alimente le troisième
(n+2) fermenteur de maturation, etc.
Selon un mode de réalisation, la culture dans le fermenteur de maturation est arrêtée, puis le fermenteur est vidé quand la production de DHA et/ou de caroténoïde(s) atteint le niveau désiré, par exemple, lorsque le titre en DHA est entre 5 et 30 g/L et/ou le titre en caroténoïde entre 0,1 et 10 mg/g de biomasse sèche.
La vidange se fait de manière conventionnelle vers des outils permettant le traitement de la biomasse en vue de l'extraction de la ou des molécule(s) d'intérêt. Après avoir été vidé, le fermenteur de maturation est nettoyé, généralement par un équipement spécifique qui est intégré aux cuves des fermenteurs, puis est stérilisé.
Par exemple (voir le Tableau 2 et le schéma selon la Figure 1 ), avec un temps de culture dans les fermenteurs de maturation de 72h, le premier jour, J, le fermenteur de maturation 1 est rempli et les autres fermenteurs de maturation sont en attente; à J+ 1 , le fermenteur de maturation 2 est rempli
(culture N+2) et le fermenteur de maturation 1 est en cours de culture; à J+ 2, le fermenteur de maturation 3 est rempli et les fermenteurs de maturation 1 et 2 sont en cours de culture; à J+ 3, le fermenteur de maturation 1 est nettoyé, le fermenteur de maturation 4 est rempli et les fermenteurs de maturation 2 et 3 sont en cours de culture.
Figure imgf000022_0001
Tableau 2
Le nombre de fermenteurs de maturation alimentés par le fermenteur de tête est supérieur à 2, et, de manière générale, ce nombre est limité seulement par l'espace disponible pour stocker lesdits fermenteurs et leurs équipements annexes. En général, le nombre de fermenteurs de maturation est de 2 à 10, de préférence de 2 à 6.
Pour la culture à'Aurantiochytrium l'étape de culture en mode semi- continu est de manière générale effectuée pendant 24 à 200 h dans chaque fermenteur, de préférence pendant 48 h à 96 h, plus préférentiellement 72 h à 96 h.
La composition du milieu de culture pour l'étape ii) permet de maintenir une croissance résiduelle, tout en favorisant l'accumulation de DHA et/ou de caroténoïde(s), en particulier de canthaxanthine et/ou de l'astaxanthine. Par « croissance résiduelle », on entend une multiplication des cellules à un taux de croissance compris entre 1 et 90 % du taux de croissance de l'étape i) mais qui permet d'améliorer la productivité en biomasse et en molécule(s) d'intérêt.
Par exemple, pour la production de DHA par des Aurantiochytrium FCC1324, le taux de croissance en culture continue est de 0,05 à 0,20 h"1 , de préférence de 0,10 h"1. Le taux de croissance caractérise l'accroissement de la population au cours du temps. Le taux de croissance (μ) est calculé selon la formule :
μ= (In N2- ln N1 ) / (t2- t1 )
où N1 = quantité de biomasse au temps t1 , N2 : quantité de biomasse au temps t2. La quantité de biomasse peut être exprimée en densité optique, densité cellulaire ou masse sèche. Les temps t1 et t2 sont exprimés en heure. La valeur de μ est exprimée en h"1 (1 /heure).
Le milieu de culture utilisé pour la fermentation selon l'étape ii) de culture en semi-continu est choisi pour orienter préférentiellement le métabolisme des cellules cultivées vers l'accumulation de DHA et/ou de caroténoïde(s), en particulier de canthaxanthine et/ou de l'astaxanthine. Cela est réalisé lors d'une limitation en azote. Par limitation en azote, on entend une concentration en azote insuffisante dans le milieu de culture pour assurer une croissance normale des cellules, et qui se traduit par une modification du métabolisme favorisant l'accumulation du carbone sous forme de lipides. Cette modification du métabolisme peut également être obtenue en augmentant le rapport C/N (rapport de la concentration de carbone sur celle d'azote assimilable).
Toutefois, le milieu de culture contient une source de carbone organique, qui permet une croissance en mixotrophie ou hétérotrophie. Typiquement, pour une culture de protiste, le carbone organique est présent à une concentration de 10 à 90 g/l (de 55mM à 500mM).
En général, pour la culture selon l'étape ii) de maturation (pour la production de DHA (et éventuellement des caroténoïdes) par la souche Aurantiochytrium, le milieu de culture (reconstitué à partir du volume de la suspension cellulaire issue du fermenteur de tête et du volume de solution d'alimentation concentrée) comprend de 100 à 200 g/L de glucose, environ 5 à 10g/L d'ammonium et 1 à 2 g/L de phosphate.
La méthode de culture selon un mode de réalisation de l'invention se fait en conditions de mixotrophie et/ou en conditions d'hétérotrophie, c'est-à-dire que l'étape i) peut se faire indépendamment en conditions d'hétérotrophie ou de mixotrophie. De manière générale l'étape ii) se fait en mixotrophie. Selon un mode de réalisation, l'étape i) se fait en hétérotrophie et l'étape ii) en mixotrophie. Selon un autre mode de réalisation, les étapes i) et ii) se font en mixotrophie.
Selon un mode de réalisation, l'étape ii) se fait à une température plus basse que l'étape i). Les inventeurs ont constaté que, selon ce mode de réalisation, la quantité de lipides, notamment de DHA, produite est augmentée par rapport à une culture où l'étape ii) est réalisée à la même température que l'étape i). En effet, selon le procédé d'invention, la température optimale de croissance est supérieure à la température optimale de production de DHA. De manière générale, l'étape ii) est réalisée à 1 à 8 degrés de moins que la température à laquelle l'étape i) est réalisée. Par exemple, l'étape i) de la culture peut être menée à 25°C, tandis que l'étape b) peut être menée à 18°C, 19°C, 20°C, 21 °C, 22°C ou 23°C. Par exemple, l'étape i) de la culture peut être menée à 22°C, tandis que l'étape b) peut être menée à 18°C, 19°C, 20°C ou 21 °C. Par exemple, l'étape i) de la culture peut être menée à 27°C, tandis que l'étape b) peut être menée à 20°C, 21 °C, 22°C, 23°C, 24°C, 25°C ou 26°C. Une température basse favorise également l'accumulation de pigments.
Selon un autre aspect de l'invention, des conditions d'éclairage sont adapté à maximiser le rendement en biomasse, en acides gras, notamment en DHA et des caroténoïdes. Il est apparu qu'un éclairement variable et/ou discontinu des cultures, en particulier dans la mise en œuvre d'une culture en mode mixotrophie, avait un impact favorable sur le développement des protistes et permettait d'accroître la productivité de celles-ci, notamment en ce qui concerne leur production de lipides et de caroténoïdes. Sans être lié par la théorie, l'inventeur estime qu'un apport discontinu et/ou variable de lumière aux protistes a pour effet de provoquer un « stress » favorable à la croissance et à la synthèse des lipides ainsi qu'à la synthèse des caroténoïdes. Ce phénomène pourrait s'expliquer, en partie, par le fait que dans la nature, les protistes ont tendance à accumuler des réserves lipidiques et en caroténoïdes pour résister aux contraintes de leur environnement. Par éclairement discontinu, il faut entendre un éclairement ponctué par des périodes d'obscurité. Les périodes d'obscurité peuvent occuper plus d'un quart du temps, de préférence la moitié du temps ou plus, durant lequel les algues sont cultivées.
Selon un aspect préféré de l'invention, l'éclairement est discontinu et plus préférentiellement sous forme de flashs. Un flash, au sens de l'invention, est un éclairement lumineux de courte durée, c'est-à-dire de moins de 30 minutes. La durée peut être de moins de 15 minutes, de préférence de moins de 5 minutes ou plus préférentiellement encore de moins de 1 minute. Selon certains modes de réalisation de l'invention, la durée du flash peut être de moins d'une seconde. Par exemple, le durée du flash peut être 1/10 d'une seconde, ou 2/10 d'une seconde, ou 3/10 d'une seconde, ou 4/10 d'une seconde ou 5/10 d'une seconde, ou 6/10 d'une seconde, ou 7/10 d'une seconde, ou 8/10 d'une seconde, ou 9/10 d'une seconde. L'éclairement lumineux, ou le flash, est généralement d'une durée supérieure à 15 secondes. Elle est généralement comprise entre 5 secondes et 10 minutes, de préférence entre 10 secondes et 2 minutes, plus préférentiellement entre 20 secondes et 1 minute. Ces durées de flash sont appropriées pour des apports de lumière de « basse fréquence » ;
Selon ce dernier mode de réalisation, ou le régime d'illumination (l'apport de la lumière) est de « basse fréquence », le nombre de flashs est compris entre environ 2 et 3600 par heure. Il peut être, par exemple, compris entre 100 et 3600 flashs par heure. Il peut être également compris entre 120 et 3000, ou entre 400 et 2500, ou entre 600 et 2000, ou entre 800 et 1500 flashs par heure. Il peut être également compris entre 2 et 200, préférentiellement entre 10 et 150, plus préférentiellement entre 15 et 100, et plus préférentiellement encore entre 20 et 50 par heure.
Selon un mode de réalisation, un flash a une durée entre 1/150000 seconde et 1/1000 seconde. Ces durées de flash sont appropriées pour des régimes d'illumination de « haute fréquence » ; c'est-à-dire avec des fréquences de flash de 150kHz à 1 kHz respectivement. Selon ce mode de réalisation ou le régime d'illumination (l'apport de la lumière) est de « haute fréquence », les flashs peuvent avoir lieu entre 3,6 x105 et 5,4 x 109 fois par heure. Dans ce cas la variation de la lumière est dite d'avoir une fréquence d'entre 1 kHz et 150kHz, c'est-à-dire entre 1000 et 150 000 flashes par seconde. L'apport de lumière selon ce dernier mode de réalisation de l'invention est nommé « haute fréquence ».
Le nombre de flashs par heure est choisi en fonction de l'intensité et de la durée des flashs (voir ci-dessous). En général, l'intensité de la lumière apportée sous forme de flashs est entre 5 et 1000 μιτιοΙ. m"2, s"1, de préférence entre 5 et 500 μιτιοΙ. m"2, s"1 , ou 50 et 400 μιτιοΙ. m"2, s"1 , et plus préférentiellement entre 150 et 300 μιτιοΙ. m"2, s"1. 1 μιτιοΙ. m"2, s"1 correspond à 1 μΕ m"2, s"1 (Einstein), unité souvent utilisée dans la littérature.
Selon un autre mode de l'invention, l'éclairement peut être variable, ce qui signifie que l'éclairement n'est pas interrompu par des phases d'obscurité, mais que l'intensité lumineuse varie au cours du temps. Cette variation de l'intensité de lumière est régulière et peut être périodique ou cyclique. Selon l'invention, on peut aussi procéder à un apport lumineux alliant des phases d'éclairement continues et discontinues.
Selon l'invention, quelles que soient les conditions d'éclairement, l'intensité lumineuse apportée aux algues en culture, exprimée en micromoles de photons par seconde par mètre carré (μιτιοΙ. m"2, s"1), varie au moins une fois dans une même heure. L'amplitude de cette variation d'intensité de lumière généralement comprise entre 5 et 1000, ou entre 50 et 800, ou entre 100 et 600 μιτιοΙ. m"2, s"1. L'intensité de la lumière peut également varier entre 5 et 400 μιτιοΙ. m"2, s"1. De préférence, l'amplitude de la variation d'intensité de lumière est entre 70 et 300 μιτιοΙ. m"2, s"1 et plus préférentiellement entre 100 et 200 μιτιοΙ. m"2, s"1.
Ladite intensité lumineuse peut atteindre successivement, en conditions d'éclairement variable, par exemple, les valeurs 50 μιτιοΙ. m"2, s"1 et 100 μιτιοΙ. m"2 s"1, ou 5 et 400 μιτιοΙ. m"2 s"1, ou 50 et 800 μιτιοΙ. m"2, s"1 plusieurs fois chaque heure. Ladite intensité lumineuse peut atteindre successivement, de préférence, les valeurs 50 et 200 μιτιοΙ. m"2, s"1. Alternativement, en conditions d'éclairement discontinu, ladite intensité lumineuse peut atteindre successivement, plusieurs fois dans l'heure, par exemple, les valeurs 0 et 50 μιτιοΙ. m"2, s"1 , les valeurs 0 et 100 μιτιοΙ. m"2, s"1 ou préférentiel lement encore les valeurs 0 et 200 μιτιοΙ. m"2, s"1. Elle peut également atteindre successivement, plusieurs fois dans l'heure, par exemple, les valeurs 0 et 300 μιτιοΙ. m"2, s"1, les valeurs 0 et 600 μιτιοΙ. m"2, s"1, les valeurs 0 et 800 μιτιοΙ. m"2, s"1 ou encore les valeurs 0 et 1000 μιτιοΙ. m"2, s"1.
Selon un mode de l'invention et quelles que soient les conditions d'éclairement, l'intensité de la lumière apportée à la culture varie en fonction de la densité cellulaire. Plus la culture devient dense, plus la lumière peut être intense. La densité cellulaire est le nombre de cellules par ml et est mesurée selon les techniques connues de l'homme de l'art.
Au stade initial de la culture, quand la densité cellulaire est entre environ 106 et 5 x 106 cellules par ml, l'intensité lumineuse peut être entre 5 et 15 μιτιοΙ. m"2, s"1, de préférence, entre 5 et 10 μιτιοΙ. m"2, s"1. Quand la culture atteint une densité entre 107 et 108 cellules par ml, l'intensité lumineuse peut être augmentée jusqu'à entre 15 et 200 μιτιοΙ. m"2, s"1, par exemple, de préférence, entre 20 et 50 μιτιοΙ. m"2, s"1. Quand la culture, au stade final, atteint une densité entre 108 et 109 cellules par ml, l'intensité lumineuse peut être augmentée jusqu'à entre 50 et 700 μιτιοΙ. m"2, s"1, par exemple, de préférence, entre 50 et 150 μιτιοΙ. m"2, s"1.
Selon certains modes de réalisation, par exemple, quand la durée des flashs est par exemple de moins d'une minute, ou moins d'une seconde, l'intensité de la lumière peut être plus importante par rapport aux valeurs citées ci-dessus. Au stade initial de la culture, quand la densité cellulaire est entre environ 106 et 5 x 106 cellules par ml, l'intensité lumineuse peut être entre 5 et 200 μιτιοΙ. m"2, s"1 , de préférence, entre 5 et 100 μιτιοΙ. m"2, s"1. Quand la culture atteint une densité entre 107 et 108 cellules par ml, l'intensité lumineuse peut être augmentée jusqu'à entre 30 et 500 μ mol. m"2, s"1, par exemple, de préférence, entre 50 et 400 μιτιοΙ. m"2, s"1. Quand la culture, au stade final, atteint une densité entre 108 et 109 cellules par ml, l'intensité lumineuse peut être augmentée jusqu'à entre 100 et 1000 μιτιοΙ. m"2, s"1 par exemple, de préférence, entre 200 et 500 μιτιοΙ. m"2, s"1.
Selon un mode de l'invention, la quantité de lumière apportée à la culture dans l'heure reste entre certaines valeurs. Elle est comprise entre environ 2000 et 600 000, de préférence entre 2000 et 300 000 μηηοΙ. m"2. Elle peut être comprise entre environ 4000 et 200 000 μιτιοΙ. m"2 par heure.
Selon un mode de l'invention, la culture est illuminée avec 30 flashs par heure, chaque flash ayant une durée de 30 secondes et une intensité de 10 μιτιοΙ. m"2, s"1. Ce dernier donne un apport total de lumière par heure de 9000 μιτιοΙ. m"2. Selon un autre mode de l'invention, la culture est illuminée avec 20 flashs par heure, chaque flash ayant une durée de 30 secondes et une intensité de 20 μιτιοΙ. m"2, s"1. Ce dernier donne un apport total de lumière par heure de 12 000 μιτιοΙ. m"2. Selon un autre mode de l'invention, la culture est illuminée avec 45 flashs par heure, chaque flash ayant une durée de 15 secondes et une intensité de 5 μιτιοΙ. m"2, s"1 , ce qui donne un apport total de lumière par heure de 3375 μιτιοΙ. m"2.
Selon un autre mode de l'invention, la culture est illuminée avec 120 flashs par heure, chaque flash ayant une durée de 10 secondes et une intensité de 200 μιτιοΙ. m"2, s"1, ce qui donne un apport total de lumière par heure de 240 000 μηηοΙ. m"2.
Selon un autre mode de réalisation de l'invention, la culture est illuminée avec une fréquence de 50kHz, c'est-à-dire 1 .8 x108 flashs par heure, chaque flash ayant une durée de 1/100 000 secondes et une intensité de 200 μιτιοΙ. m"2, s"1 , ce qui donne un apport total de lumière par heure de 36 000 μιτιοΙ. m"2
Comme décrit pour l'intensité lumineuse ci-dessus, et selon un mode de l'invention, la quantité de lumière apportée à la culture par heure peut varier en fonction de la densité cellulaire. Au stade initial de la culture, quand la densité cellulaire est de 105 et 5 x 105 cellules par ml, l'apport total de lumière dans l'heure est généralement compris entre environ 1500 et 8000, de préférence 1500 et 6000 μιτιοΙ. m"2, de préférence encore entre 2000 et 5000 μιτιοΙ. m"2. Quand la culture atteint une densité entre 106 et 107 cellules par ml, l'apport total de lumière dans l'heure peut être augmenté jusqu'à entre 6000 et 67 000 μηηοΙ. m"2, de préférence entre 6000 et 50 000, et de préférence encore entre 12 000 et 45 000 μιτιοΙ. m"2, par exemple. Au stade final de la culture, à une densité cellulaire entre 107 et 108 cellules par ml, l'apport total de lumière dans l'heure peut être augmenté jusqu'à entre 45 000 et 300 000, par exemple, de préférence, entre 45 000 et 200 000 μιτιοΙ. m"2, et par exemple, de préférence encore, entre 50 000 et 150 000 μηηοΙ. m"2.
Selon un mode de l'invention, au stade initial de la culture (à une densité cellulaire entre 105 et 5 x105 cellules par ml), la culture est illuminée avec 30 flashs par heure, chaque flash ayant une durée de 30 secondes et une intensité entre 5 et 10 μιτιοΙ. m"2, s"1 , ce qui donne un apport total de lumière par heure de 2250 μιτιοΙ. m"2 à 4500 μιτιοΙ. m"2. Puis, au stade intermédiaire (à une densité cellulaire entre 106 et 107 cellules par ml), la culture est illuminée avec 30 flashs par heure, chaque flash ayant une durée de 30 secondes et une intensité entre 15 et 50 μιτιοΙ. m"2, s"1 , ce qui donne un apport total de lumière par heure de 13 500 à 45 000 μιτιοΙ. m"2. Puis au stade final de la culture (à une densité cellulaire entre 107 et 108 cellules par ml), la culture est illuminée avec 30 flashs par heure, chaque flash ayant une durée de 30 secondes et une intensité entre 50 et 150 μιτιοΙ. m"2, s"1, ce qui donne un apport total de lumière par heure de 45 000 à 135 000 μιτιοΙ. m"2.
Selon un mode de l'invention, par exemple, quand la durée des flashs est par exemple de moins d'une minute, ou moins d'une seconde, au stade initial de la culture (à une densité cellulaire entre 105 et 5 x 105 cellules par ml), la culture est illuminée avec 30 flashs par heure, chaque flash ayant une durée de 10 secondes et une intensité entre 50 et 100 μιτιοΙ. m"2, s"1, ce qui donne un apport total de lumière par heure de 15 000 μιτιοΙ. m"2 à 30 000 μιτιοΙ. m"2. Puis au stade intermédiaire (à une densité cellulaire entre 106 et 107 cellules par ml), la culture est illuminée avec 50 flashs par heure, chaque flash ayant une durée de 10 secondes et une intensité entre 200 et 300 μιτιοΙ. m"2, s"1 , ce qui donne un apport total de lumière par heure de 100 000 à 150 000 μιτιοΙ. m"2. Puis, au stade final de la culture (à une densité cellulaire entre entre 107 et 108 cellules par ml), la culture est illuminée avec 120 flashs par heure, chaque flash ayant une durée de 10 secondes et une intensité entre 350 et 450 μιτιοΙ. m"2, s"1 , ce qui donne un apport total de lumière par heure de 420 000 à 540 000 μιτιοΙ. m"2.
L'apport de lumière dans les cultures peut être obtenu par des sources de lumière réparties autour de la paroi externe des fermenteurs. Une horloge déclenche ces lampes pour des temps d'éclairement définis. Selon un mode de réalisation préféré, l'éclairage des cultures est assuré par un dispositif d'illumination interne au fermenteur. Ainsi, l'efficacité de l'illumination est meilleure par rapport à une configuration où la lumière pénètre par des hublots à partir de sources disposées à l'extérieur. Les dispositifs d'illumination peuvent être disposés sur l'ensemble tournant muni de pales ou sur des pièces tubulaires plongeant dans la masse à traiter, ou encore au fond ou au plafond de la cuve. Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, le dispositif d'illumination est situé sur les contre-pales à l'intérieur du fermenteur. Un tel dispositif est décrit dans la demande de brevet français N°1353641 . Le fermenteur est ainsi muni d'une pluralité de sources d'illumination portées par des contre-pales, ces dernières ayant pour fonction d'empêcher la formation d'un vortex au sein de la biomasse sous l'action de l'ensemble tournant de brassage. Ces sources d'illumination sont de préférence encapsulées, partiellement ou complètement dans au moins une partie de ces contre pales, dans une matière compatible avec la biomasse et en une épaisseur permettant de diffuser ladite lumière vers l'intérieur de la cuve.
Une matière particulièrement bien adaptée est le polysulfone qui combine une bonne compatibilité avec les normes alimentaires (y compris les normes américaines de la Food and Drug Administration, ou FDA en abrégé), un bon coefficient de transfert thermique (permettant une évacuation de la chaleur vers la masse de micro-organismes et un caractère semi-transparent permettant une bonne transmission de la lumière, si le matériau a une épaisseur choisie entre 1 mm et 5 cm ; en outre, ce matériau conserve ses propriétés après un éventuel traitement thermique de stérilisation ou de nettoyage avec des détergents ou de l'acide. Si l'on modifie la combinaison de caractéristiques souhaitées, d'autres matériaux peuvent être choisis, par exemple le polyuréthane, le polypropylène, un matériau acrylique ou un polycarbonate.
De manière préférée, les sources d'illumination sont des diodes électroluminescentes (LED en abrégé); il s'agit de sources de lumière bien maîtrisées, aussi bien dans leur mise en œuvre que dans leurs applications. De telles sources peuvent avoir des spectres d'émission très divers, puisqu'il y a des LED blanches (simulant la lumière solaire), mais aussi des LED à gamme spectrale réduite (par exemple centrées sur une lumière rouge, bleue ou verte). De telles sources d'illumination génèrent moins de chaleur que des bulbes ou des ampoules ; elles ont en outre des dimensions suffisamment petites pour pouvoir être implantées sur les faces des contre-pales sans induire de surépaisseur nuisant à la fonction principale de ces plaques.
Le spectre des sources d'illumination est avantageusement dans le domaine du visible, mais peut aussi, en fonction des besoins, être à l'extérieur de ce domaine visible, par exemple dans les UV (par exemple pour des applications impliquant une stérilisation), ou dans les infra-rouges (par exemple, dans des applications visant à générer de la chaleur au sein de la masse à traiter).
Les sources d'illumination peuvent avoir des régimes de commande (on parle aussi de régimes de contrôle ou de pilotage) très variés
Ainsi qu'a pu le constater le déposant, le fait que les souches ainsi cultivées présentent de bonnes aptitudes à croître en mode mixotrophe, en présence d'une lumière discontinue et/ou variable, prédispose lesdites souches à une production plus élevée d'acides gras polyinsaturés et en caroténoïdes, notamment en DHA et en canthaxanthine et/ou en astaxanthine.
Le procédé de culture selon l'invention permet de produire des lipides et des caroténoïdes.
Dans ce cas, le procédé selon certains modes de réalisation de l'invention comporte en outre les étapes suivantes : a) la culture en mode mixotrophe d'une ou plusieurs souches de la classe Labyrinthulomycete, en particulier du genre Aurantiochytrium dans des conditions mixotrophes, en particulier en présence d'un éclairement discontinu et/ou variable au cours du temps, l'éclairement présentant des variations d'intensité dont l'amplitude est comprise entre 5 μιτιοΙ. m"2, s"1 et 1000, de préférence entre 5 et 400 μιτιοΙ. m"2, s"1, ces variations ayant lieu entre 2 et 3600, de préférence 5-400 fois par heure,
b) une étape de maintien de ladite culture sur plusieurs générations, en présence d'un substrat carboné organique dans le milieu de culture, et éventuellement
c) une étape de récupération des protistes ainsi cultivés.
Par étape de récupération, on entend plus particulièrement l'isolement de la ou des souches dont le nombre de cellules s'est accru le plus au cours desdites générations.
d) une étape de récupération de la matière hydrophobe des protistes, et éventuellement
e) l'extraction du DHA (acide docosahexaénoïque) et des caroténoïdes, notamment de la canthaxanthine et/ou d'astaxanthine de la matière hydrophobe récupérée.
La matière hydrophobe comporte en effet les lipides et les caroténoïdes.
Le procédé de culture selon l'invention peut s'appliquer également à toute espèce du genre Aurantiochytrium, capable de croître dans les conditions mixotrophes selon l'invention, et capable de produire du DHA et des caroténoïdes.
L'invention a donc également pour but l'optimisation de la production de biomasse, ainsi que la production de lipides et de caroténoïdes, notamment de DHA, et/ou de canthaxanthine et/ou d'astaxanthine via la culture de protistes du genre Aurantiochytrium à caractère mixotrophe, de préférence cultivés ou sélectionnés selon les procédés visés précédemment, puis la récupération des protistes ainsi cultivés pour en extraire le contenu hydrophobe, en particulier les lipides dont le DHA et les caroténoïdes dont la canthaxanthine et l'astaxanthine. Selon les modes de réalisation du procédé de production de DHA et/ou de la canthaxanthine et/ou en astaxanthine, décrits précédemment, les quantités de biomasse obtenus sont supérieures à 100g/L, de préférence supérieures à 1 10g/L ou plus préférentiellement supérieures à 140g/L. Les lipides sont présent dans cette biomasse à un taux supérieur à 40%, voire 50%. En générale le DHA représente plus de 15%, voir 20%, voir 30%, voire plus 35% des acides gras. La canthaxanthine et/ou l'astaxanthine peut représenter entre 0,01 %, et 0,2 % en poids sur le poids total de matière sèche.
Les méthodes d'extraction sélective des lipides dont le DHA sont connues de l'homme du métier et sont, par exemple, décrites par [Bligh, E.G. et Dyer, W.J. (1959); A rapid method of total lipid extraction and purification, Can. J. Biochem. Physiol., 37:91 1 -917].
Les méthodes d'extraction et d'analyse des caroténoïdes, dont la lutéine, sont connues de l'homme du métier et sont, par exemple, décrites par Wright et al. (1991 ) (S.W. Wright, S.W. Jeffrey, R.F.C. Mantoura, C.A. Llewellyn, T. Bjornland, D. Répéta, N. Welschmeyer : Improved HPLC method for the analysis of chlorophylls and carotenoids from marine phytoplankton. Marine ecology progress séries : Vol. 77 : 183-196, 1991 ).
L'invention porte également sur les protistes de la classe Labyrinthulomycete, notamment de la famille Labyrinthulaceae et Thraustochytriaceae, en particulier du genre Aurantiochytrium, susceptibles d'être obtenus selon le procédé de l'invention tel que précédemment décrit. Ces protistes sont enrichis en acides gras polyinsaturés et en caroténoïdes. Les lipides totaux de tels protistes représentent généralement plus de 40 %, ou plus de 50 %, ou plus de 60 % en poids de la matière sèche. De manière générale, ils peuvent avoir un titre de DHA de 10 g/L à 20 g/L. La canthaxanthine et/ou l'astaxanthine contenue par de tels protistes, selon un mode de l'invention, peut représenter plus de 0,1 %, ou plus de 0,15 %, ou plus de 0,2 % en poids sur le poids total de matière sèche. Les protistes selon un mode de réalisation de l'invention peuvent avoir ainsi une productivité (quantité de produit d'intérêt produit, par litre de culture, par heure) de canthaxanthine et/ou de l'astaxanthine de 0,05 mg/L/h, ou plus de 1 mg/L/h, ou plus de 1 ,5 mg/L/h. Ils peuvent avoir également avoir une productivité de DHA d'au moins 0,1 g/L/h, de préférence 0,2 g/L/h DHA, et plus préférentiellement d'au moins 0,3 g/L/h DHA.
Exemple 1
Les cultures à'Aurantiochytrium sont réalisées dans des fermenteurs (bioréacteurs) de 1 à 2 L utiles avec automates dédiés et supervision par station informatique. Le système est régulé en pH via l'ajout de base (solution d'hydroxyde de sodium à 2N) et/ou d'acide (solution d'acide sulfurique à 1 N). La température de culture est fixée à 26 °C. L'agitation est réalisée grâce à 3 mobiles d'agitation placés sur l'arbre selon la configuration de Rushton (hélices tripales à pompage descendant). La pression d'oxygène dissous est régulée dans le milieu tout au long de la culture, par la vitesse d'agitation (250-600 t/min), le débit d'air (0,25- 1 vvm), voire le débit d'oxygène (0,1 -0,5 vvm). Les paramètres de régulation, intégrés dans l'automate de supervision, permettent de maintenir une pO2 constante à 15 %. Le bioréacteur est équipé d'un système luminaire externe entourant la cuve transparente. L'intensité ainsi que les cycles de lumière sont contrôlés par un automate dédié et supervisé par station informatique.
Les réacteurs sont inoculés avec une pré-culture réalisée sur table d'agitation (140 t/min) en enceinte thermostatée (26 °C) et éclairée entre 100 et 200 μΕ. Les pré-cultures et cultures en bioréacteurs sont réalisées dans le milieu Verduyn modifié (sels marins 15 g/L, (NH4)2SO4 3g/L , KH2PO4 1 g/L, MgSO4-7H20, 0,5 g/L, Na2EDTA 24 mg/L, ZnSO4-7H2O 3 mg/L, MnCI2-2H2O 3 mg/L, Na2MoO4-2H2O 0,04 mg/L, FeSO4-7H2O l Omg/L, pantothénate 3,2 mg/L, hydrochlorure de thiamine 9,5 mg/L, vitamine B12 0,15 mg/L). Le substrat carboné utilisé pour la culture en mixotrophie classique, en hétérotrophie et en mixotrophie flash (lumière variable/discontinue) en bioréacteur est du glucose à des concentrations entre 300 mM et 1 M.
Suivi des cultures : La concentration en biomasse totale est suivie par mesure de la masse sèche (filtration sur filtre GF/F, Whatman, puis séchage en étuve, à 105 °C, pendant 24 h minimum avant pesée).
Concernant la quantification des lipides totaux, 108 cellules ont été extraites. Les méthodes d'extraction des lipides sont connues de l'homme du métier.
Pour la quantification des caroténoïdes, et notamment la canthaxanthine et de l'astaxanthine, 108 cellules ont été extraites. Les méthodes d'extraction et d'analyse des caroténoïdes, dont la canthaxanthine et de l'astaxanthine, sont connues de l'homme du métier.
Eclairement (pour la culture en mixotrophie) :
La culture est illuminée avec 30 flashs par heure, chaque flash ayant une durée de 30 secondes et une intensité de 200 μιτιοΙ. m"2, s"1.
L'apport de lumière dans les cultures en bioréacteur a été obtenu par des lampes LED réparties autour de la paroi externe du fermenteur. Une horloge déclenche ces LED pour des temps d'éclairement ou des puises (pour la culture en mixotrophie flash avec lumière discontinue).
Tableau 3 Résultats de l'Exemple 1 (n=3)
Figure imgf000035_0001
Exemple 2
La production d'une huile riche en DHA et en canthaxanthine par la souche FCC 1324 du genre Aurantiochytrium est décrite ci-dessous. Etape i) :
Les cultures à'Aurantiochytrium sont réalisées dans des fermenteurs (bioréacteurs) de 1 à 2 L utiles avec automates dédiés et supervision par station informatique. Le système est régulé en pH via l'ajout de base (solution d'hydroxyde de sodium à 2N) et/ou d'acide (solution d'acide sulfurique à 1 N). La température de culture est fixée à 26 °C. L'agitation est réalisée grâce à 3 mobiles d'agitation placés sur l'arbre selon la configuration de Rushton (hélices tripales à pompage descendant). La pression d'oxygène dissous est régulée dans le milieu tout au long de la culture, par la vitesse d'agitation (250-600 t/min), le débit d'air (0,25-1 vvm), voire le débit d'oxygène (0,1 -0,5 vvm). Les paramètres de régulation, intégrés dans l'automate de supervision, permettent de maintenir une pO2 constante à 15 %. Le bioréacteur est équipé d'un système luminaire interne fixé sur les contre-pales. L'intensité, ainsi que les cycles de lumière, sont contrôlés par un automate dédié et supervisé par station informatique. La culture est illuminée avec 60 flashs par heure, chaque flash ayant une durée de 20 secondes et une intensité de 100 μιτιοΙ. m"2, s"1.
Les réacteurs sont inoculés avec une pré-culture réalisée sur table d'agitation (140 t/min) en enceinte thermostatée (26 °C) et éclairée entre 100 et 200 μΕ. Pré-cultures et cultures en bioréacteurs sont réalisées dans le milieu Verduyn modifié (sels marins 15 g/L, (NH4)2SO4 3g/L, KH2PO4 1 g/L, MgSO4-7H20, 0,5 g/L, Na2EDTA 24 mg/L, ZnSO4-7H2O 3 mg/L, MnCI2-2H2O 3 mg/L, Na2MoO4-2H2O 0,04 mg/L, FeSO4-7H2O l Omg/L, pantothénate 3,2 mg/L, hydrochlorure de thiamine 9,5mg/L, vitamine B12 0,15 mg/L). Le substrat carboné utilisé est du glucose à des concentrations entre 60 et 200 g/L.
L'alimentation en continu avec du milieu frais est réalisée avec un taux de dilution d'environ 0,08 à 0,15 h"1 et avec un milieu concentré entre 10 et 15 fois la concentration initiale de chaque élément. L'homme du métier saura déterminer comment mettre en œuvre la culture continue et calculer le débit d'alimentation, ainsi que déterminer quand le régime permanent est atteint. Une fois le régime permanent atteint, le soutirage de ce fermenteur continu peut servir à alimenter le fermenteur de maturation de l'étape b).
Etape ii) :
Les cultures sont réalisées dans des fermenteurs (bioréacteurs) de 10 à 20 L utiles avec automates dédiés et supervision par station informatique. Les systèmes de régulation ainsi que le paramétrage de ces derniers sont, en tout point, similaires à ceux de l'étape i).
Les réacteurs sont inoculés avec environ 50 % du volume total de culture avec le soutirage de l'étape i) ; et en même temps, la cuve est également alimentée au même débit avec un milieu concentré 2 fois, et qui permet d'obtenir la composition finale suivante : sels marins 15 g/L ; glucose entre 60 et 120 g/L; (NH4)2SO4 à 0,8 gL; KH2PO4 1 g/L ; MgSO4-7H20, 0,5 g/L, Na2EDTA 24 mg/L, ZnSO4-7H2O 3 mg/L, MnCI2-2H2O 3 mg/L, Na2MoO4-2H2O 0,04 mg/L, FeSO4-7H2O l Omg/L, pantothénate 3,2 mg/L, hydrochlorure de thiamine 9,5 mg/L, vitamine B12 0,15 mg/L.
La culture est illuminée avec 60 flashs par heure, chaque flash ayant une durée de 20 secondes et une intensité de 500 μιτιοΙ. m"2, s"1.
Suivi des cultures :
La concentration en biomasse totale est suivie par mesure de la masse sèche (filtration sur filtre GF/F, Whatman, puis séchage en étuve, 105 °C, pendant 24h minimum avant pesée).
Concernant la quantification des lipides totaux, environ 108 cellules ont été extraites. Les méthodes d'extraction des lipides sont connues de l'homme du métier.
Pour la quantification des caroténoïdes, et notamment la canthaxanthine, 108 cellules ont été extraites. Les méthodes d'extraction et d'analyse des caroténoïdes, dont la canthaxanthine, sont connues de l'homme du métier.
Tableau 4 : Résultats de l'Exemple 2 (n=3) Masse Sèche Lipides totaux Canthaxanthine
% DHA
(9 L) (% de la MS) (mg/g de MS)
155 +/- 3,3 55 +/- 2,8 18,0 +/- 3.0 2,1 +/- 0.3
Exemple 3 La production en continu d'une biomasse à haute densité cellulaire pauvre en matière grasse (5 à 10%) puis l'accumulation d'acides gras par maturation de cette biomasse
Etape i): Culture continue pour la production de biomasse
Les cultures d'Aurantiochytrium sont réalisées dans des réacteurs de 1 à
2 L de volume utile avec automates dédiés et supervision par station informatique. Le système est régulé en pH via l'ajout de base (solution d'hydroxyde de sodium à 2N) et/ou d'acide (solution d'acide sulfurique à 1 N). La température de culture est fixée à 26 °C. L'agitation est réalisée grâce à
3 mobiles d'agitation : 1 turbine Rushton à 6 pâles droites positionnée à l'extrémité inférieure de l'arbre d'agitation au-dessus du sparger et 2 hélices tripâles placées sur l'arbre d'agitation (distance inter-mobile = 1 .5 X le diamètre d'une hélice).
La pression d'oxygène dissous est régulée dans le milieu tout au long de la culture, par la vitesse de rotation de l'arbre d'agitation (250-600 t/min), la ventilation par l'air (0,25-1 vvm) ou d'oxygène (0,1 -0,5 vvm). Les paramètres de régulation, intégrés dans l'automate de supervision, permettent de maintenir une pO2 constante à 15 %.
Le fermenteur est équipé d'un système luminaire interne fixé sur les contre-pâles.
L'intensité et la fréquence des cycles d'illumination sont contrôlées par un automate dédié et supervisé par station informatique. La culture est illuminée avec 60 flashs par heure, chaque flash ayant une durée de 20 secondes et une intensité de 100 μιτιοΙ. m-2. s-1 .
La pré-culture est réalisée sur table d'agitation (140 t/min) en enceinte thermostatée (26 °C) et éclairée entre 100 et 200 μΕ. Le réacteur est inoculé à 1 % à partir de la pré-culture et conduit en mode discontinu.
Une fois le substrat contenu dans le milieu initial consommé et la densité cellulaire souhaitée atteinte, le soutirage du milieu de culture d'une part et l'apport de la solution d'alimentation d'autre part sont mis en route. Le régime permanent est atteint après au moins 5 temps de séjour. Une fois le régime permanent stabilisé, les paramètres opératoires (débit de ventilation, puissance dissipée, débit d'alimentation, pH, volume de moût), la concentration résiduelle en substrat dans le moût, ainsi que la concentration et la composition macromoléculaire de la biomasse produite sont constants.
Pour la souche FCC 1324, la composition de la solution d'alimentation choisie et le taux de dilution sélectionné permettent de produire un volume de moût équivalent à 2,4 fois le volume du fermenteur chaque jour.
Le régime est considéré stable au bout de 50 heures de culture. Une fois le régime stabilisé, la concentration résiduelle en glucose dans le moût se stabilise vers 0 g/L, la densité cellulaire se stabilise autour de 3x109 cellules/mL, ce qui correspond à environ 65 g/L de biomasse, la teneur en matière grasse dans la biomasse se stabilise autour de 5% (gMatière Grasse/gMatière Sèche). La fermentation en mode continu a été maintenue pour une durée totale de 890 heures, dont 815 heures en régime stabilisé.
Pour cet exemple le taux de dilution par la solution d'alimentation est fixé à la moitié du taux de croissance maximum de la souche sur le milieu utilisé et dans les conditions de culture utilisées.
Le débit de soutirage du milieu est adapté afin de prendre en compte le débit de la solution d'alimentation mais aussi le volume de liquide correcteur de pH.
La composition du milieu de culture pour le démarrage en batch de la culture est détaillée dans le Tableau 1 . La solution d'alimentation de la culture continue contient 15g/L de sel de mer commercial (ex Sels INSTANT OCEAN), 1 10 g/L de glucose, et contient des concentrations en oligo-éléments, macro-éléments et vitamines équivalentes à environ 3 fois celles contenues dans le milieu utilisé pour la pré-culture et la culture discontinue. Des autres compositions pour la solution d'alimentation sont possible, comme détaillée dans le Tableau 1 .
La concentration en biomasse totale est suivie par mesure de la masse sèche (filtration sur filtre GF/F, Whatman, puis séchage en étuve, 105 °C, pendant 24h minimum avant pesée).
Concernant la quantification des lipides totaux, environ 10x8 cellules ont été extraites. Les méthodes d'extraction des lipides sont connues de l'homme du métier.
Pour la quantification des caroténoïdes, et notamment la canthaxanthine, 10x8 cellules ont été extraites. Les méthodes d'extraction et d'analyse des caroténoïdes, dont la canthaxanthine, sont connues de l'homme du métier.
Tableau 5. Caractéristiques du régime permanent obtenu en culture continue.
Figure imgf000040_0001
Etape ii) de maturation
Le moût produit en culture continue présente donc une haute densité cellulaire d'une biomasse contenant très peu de lipides (5 à 10%). Cette biomasse est transférée dans une cuve de maturation dans des conditions de culture où elle accumule très rapidement des acides gras. (65 G/L en 24 heures). Ceci permet de produire une forte concentration de biomasse riche en acide gras.
Dans cet exemple, plusieurs essais de maturation sont effectués à partir du moût issu du fermenteur conduit en mode chemostat. Les cultures sont réalisées dans des fermenteurs (bioréacteurs) de 3 à 5 L utiles avec automates dédiés et supervision par station informatique. Les systèmes de régulation ainsi que le paramétrage de ces derniers sont, en tout point, similaires à ceux de l'étape 1 .
Dans le cas des essais de maturation décrits dans cet exemple, le volume prélevé dans la culture continue est prélevé en une fois. Dans le cas d'une fermentation industrielle, ce transfert se fait progressivement par le soutirage du milieu de culture.
Dans la cuve de maturation, la solution nutritive avec un ratio C/N/P de 530 :1 1 :1 est progressivement ajoutée au volume prélevé.
La solution nutritive est ajoutée dans la cuve de maturation à chaque fois que la source de carbone (ici le glucose) est épuisée.
Le suivi de la culture discontinue alimentée, réalisée en cuve de maturation, est réalisé selon des protocoles en tout point identiques à ceux de l'étape i). Les résultats sont donnés dans le Tableau 5.
Tableau 6 :
Matière sèche, acides gras et DHA produits en 24 heures et en 48 heures lors de la maturation à 25°C et pH 6,5 (5 répétitions)
24 Heures de culture 48 Heures de culture
Matière Sèche 160 g/L (+/- 2g/l) 185 g/l (+/-5g/l)
Acides Gras 67 g/L (+/-2g/l) 85 g/l (+/-5g/l)
DHA 16,5 g/L(+/-0,5g/l) 21 g/L (+/-2g/l)
Astaxanthine 0,05 mg/g MS (+/-0.01 ) 0,07 mg/g MS (+/-0.01 )

Claims

REVENDICATIONS
1 . Procédé de production de DHA et/ou de caroténoïde(s), en particulier de canthaxanthine et/ou de l'astaxanthine, comprenant l'étape suivante :
a) la culture en mode mixotrophe d'une ou plusieurs souches du genre Aurantiochytrium caractérisé en ce que l'étape a) de la culture comprend
-Une étape i) de croissance en conditions de mixotrophie ou d'hétérotrophie et
-Une étape ii) d'accumulation de DHA et/ou de caroténoïdes en conditions de mixotrophie.
2. Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que l'étape i) est réalisé en mode continu dans un fermenteur et l'étape ii) comprend l'alimentation en continu et successivement de n fermenteurs fonctionnant en mode semi-continu, n étant un nombre entier égal ou supérieur à 2, par les cellules produites dans l'étape i) et leur culture en conditions de mixotrophie
3. Procédé selon la revendication 1 ou 2 , caractérisé en ce que la culture en mode mixotrophe se fait dans des conditions d'éclairement discontinu et/ou variable au cours du temps, l'éclairement présentant des variations d'intensité dont l'amplitude est comprise entre 5 μιτιοΙ. m"2, s"1 et 1000 μιτιοΙ. m"2, s"1 , ces variations ayant lieu entre 2 et 3600 fois par heure.
4. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que l'amplitude des variations d'intensité est comprise entre 70 et 300 μιτιοΙ. m"2. s"1, et de préférence, entre 100 et 200 μιτιοΙ. m"2, s"1.
5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que l'apport de lumière s'effectue sous forme de flashs.
6. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce qu'un flash a une durée comprise entre 1/10 seconde et 10 minutes, de préférence 5 secondes et 10 minutes, de préférence encore entre 10 secondes et 2 minutes, plus préférentiellement entre 20 secondes et 1 minute.
7. Procédé selon la revendication 5 caractérisée en ce qu'un flash a une durée entre 1/150000 seconde et 1/1000 seconde.
8. Procédé selon la revendication 5 ou la revendication 6, caractérisé en ce que le nombre de flashs est entre 5 et 3600, de préférence entre 10 et 150, préférentiellement entre 15 et 100, et plus préférentiellement entre 20 et 50 fois par heure.
9. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que le nombre de flashs est entre 3,6 x105 et 5,4 x 109 par heure.
10. Procédé selon l'une des revendications 1 à 9 caractérisé en ce que la culture s'effectue en présence d'un substrat carboné organique à une concentration de 100 mM à 1 ,5 M, de préférence de 200 mM à 1 ,2 M, plus préférentiellement de 250 mM à 1 M, et encore plus préférentiellement de 300 mM à 600 mM d'un substrat carboné organique, le substrat carboné organique étant choisi parmi le saccharose, le glycérol, le glucose et les dérivés de cellulose et un mélange de ces molécules.
1 1 . Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisé en ce qu'il comprend en outre les étapes suivantes :
b) une étape de maintien de ladite culture sur plusieurs générations en présence d'un substrat carboné organique dans le milieu de culture, et éventuellement c) une étape de récupération des cellules ainsi cultivés, et éventuellement
d) une étape de récupération de la matière hydrophobe, et éventuellement
e) l'extraction du DHA (acide docosahexaénoïque) et de caroténoïde(s) de la matière hydrophobe récupérée.
12. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 1 1 , caractérisé en ce que la souche du genre Aurantiochytrium correspond à la souche FCC 1324, déposée auprès de la CCAP (Culture Collection of Algae and Protozoa), sous le numéro d'accession CCAP 4062/1 .
13. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 1 1 , caractérisé en ce que la souche du genre Aurantiochytrium correspond à une souche choisie parmi les souches suivantes :
- FCC 31 isolée par le demandeur et déposée à la CCAP (Culture Collection of Algae and Protozoa), sous le numéro CCAP 4062/2 ;
- FCC 131 1 isolée par le demandeur et déposée à la CCAP (Culture Collection of Algae and Protozoa), sous le numéro CCAP CCAP 4062/3 ;
- FCC 1319 isolée par le demandeur et déposée à la CCAP (Culture Collection of Algae and Protozoa), sous le numéro CCAP 4062/4 ;
- FCC 1325 isolée par le demandeur et déposée à la CCAP (Culture Collection of Algae and Protozoa), sous le numéro CCAP 4062/5) ; et
- FCC 1479 isolée par le demandeur et déposée à la CCAP (Culture Collection of Algae and Protozoa), sous le numéro CCAP 4062/6.
14. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 1 1 , caractérisé en ce que la souche est un mélange de plusieurs souches du genre Aurantiochytrium choisies parmi les souches suivantes:
- FCC 1324, déposée auprès de la CCAP (Culture Collection of Algae and Protozoa), sous le numéro d'accession CCAP 4062/1 - FCC 31 isolée par le demandeur et déposée à la CCAP (Culture Collection of Algae and Protozoa), sous le numéro CCAP 4062/2 ;
- FCC 131 1 isolée par le demandeur et déposée à la CCAP (Culture Collection of Algae and Protozoa), sous le numéro CCAP CCAP 4062/3 ;
- FCC 1319 isolée par le demandeur et déposée à la CCAP (Culture Collection of Algae and Protozoa), sous le numéro CCAP 4062/4 ;
- FCC 1325 isolée par le demandeur et déposée à la CCAP (Culture Collection of Algae and Protozoa), sous le numéro CCAP 4062/5) ; et
- FCC 1479 isolée par le demandeur et déposée à la CCAP (Culture Collection of Algae and Protozoa), sous le numéro CCAP 4062/6.
15. Procédé selon une quelconque des revendications 1 et 14 caractérisé en ce que l'éclairement des cultures est assuré par un dispositif d'illumination interne au fermenteur, de préférence, situé sur les contre-pales à l'intérieur du fermenteur.
16. Procédé selon une quelconque des revendications 1 et 15 caractérisé en ce que des sources d'éclairement sont des diodes électroluminescentes.
17. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 16, caractérisé en ce que l'étape ii) est réalisée entre 15 et 25°C.
18. Souche FCC 1324, déposée auprès de la CCAP (Culture
Collection of Algae and Protozoa), sous le numéro d'accession CCAP 4062/1 .
19. Souches choisies parmi les souches suivantes :
- FCC 31 déposée à la CCAP (Culture Collection of Algae and Protozoa), sous le numéro CCAP 4062/2 ; - FCC 131 1 déposée à la CCAP (Culture Collection of Algae and Protozoa), sous le numéro CCAP 4062/3 ;
- FCC 1319 déposée à la CCAP (Culture Collection of Algae and Protozoa), sous le numéro CCAP 4062/4 ;
- FCC 1325 isolée par le demandeur et déposée à la CCAP (Culture Collection of Algae and Protozoa), sous le numéro CCAP 4062/5) ; et
- FCC 1479 déposée à la CCAP (Culture Collection of Algae and Protozoa), sous le numéro CCAP 4062/6.
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