WO2015015023A1 - Método de reconstrucción holográfico basado en microscopia sin lentes en línea con múltiples longitudes de onda, microscopio holográfico sin lentes en línea basado en múltiples longitudes de onda y programa de ordenador - Google Patents

Método de reconstrucción holográfico basado en microscopia sin lentes en línea con múltiples longitudes de onda, microscopio holográfico sin lentes en línea basado en múltiples longitudes de onda y programa de ordenador Download PDF

Info

Publication number
WO2015015023A1
WO2015015023A1 PCT/ES2014/000135 ES2014000135W WO2015015023A1 WO 2015015023 A1 WO2015015023 A1 WO 2015015023A1 ES 2014000135 W ES2014000135 W ES 2014000135W WO 2015015023 A1 WO2015015023 A1 WO 2015015023A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
wavelengths
digital
holographic
lighting
hologram
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/ES2014/000135
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Francisco Javier GARCIA MONREAL
Vicente Micó Serrano
Martín SANZ SABATER
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Universitat de Valencia
Original Assignee
Universitat de Valencia
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Universitat de Valencia filed Critical Universitat de Valencia
Publication of WO2015015023A1 publication Critical patent/WO2015015023A1/es
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G03—PHOTOGRAPHY; CINEMATOGRAPHY; ANALOGOUS TECHNIQUES USING WAVES OTHER THAN OPTICAL WAVES; ELECTROGRAPHY; HOLOGRAPHY
    • G03H—HOLOGRAPHIC PROCESSES OR APPARATUS
    • G03H1/00—Holographic processes or apparatus using light, infrared or ultraviolet waves for obtaining holograms or for obtaining an image from them; Details peculiar thereto
    • G03H1/04—Processes or apparatus for producing holograms
    • G03H1/0443—Digital holography, i.e. recording holograms with digital recording means
    • G—PHYSICS
    • G03—PHOTOGRAPHY; CINEMATOGRAPHY; ANALOGOUS TECHNIQUES USING WAVES OTHER THAN OPTICAL WAVES; ELECTROGRAPHY; HOLOGRAPHY
    • G03H—HOLOGRAPHIC PROCESSES OR APPARATUS
    • G03H1/00—Holographic processes or apparatus using light, infrared or ultraviolet waves for obtaining holograms or for obtaining an image from them; Details peculiar thereto
    • G03H1/26—Processes or apparatus specially adapted to produce multiple sub- holograms or to obtain images from them, e.g. multicolour technique
    • G—PHYSICS
    • G03—PHOTOGRAPHY; CINEMATOGRAPHY; ANALOGOUS TECHNIQUES USING WAVES OTHER THAN OPTICAL WAVES; ELECTROGRAPHY; HOLOGRAPHY
    • G03H—HOLOGRAPHIC PROCESSES OR APPARATUS
    • G03H1/00—Holographic processes or apparatus using light, infrared or ultraviolet waves for obtaining holograms or for obtaining an image from them; Details peculiar thereto
    • G03H1/04—Processes or apparatus for producing holograms
    • G03H1/08—Synthesising holograms, i.e. holograms synthesized from objects or objects from holograms
    • G03H1/0866—Digital holographic imaging, i.e. synthesizing holobjects from holograms
    • G—PHYSICS
    • G03—PHOTOGRAPHY; CINEMATOGRAPHY; ANALOGOUS TECHNIQUES USING WAVES OTHER THAN OPTICAL WAVES; ELECTROGRAPHY; HOLOGRAPHY
    • G03H—HOLOGRAPHIC PROCESSES OR APPARATUS
    • G03H1/00—Holographic processes or apparatus using light, infrared or ultraviolet waves for obtaining holograms or for obtaining an image from them; Details peculiar thereto
    • G03H1/04—Processes or apparatus for producing holograms
    • G03H1/0443—Digital holography, i.e. recording holograms with digital recording means
    • G03H2001/0447—In-line recording arrangement
    • G—PHYSICS
    • G03—PHOTOGRAPHY; CINEMATOGRAPHY; ANALOGOUS TECHNIQUES USING WAVES OTHER THAN OPTICAL WAVES; ELECTROGRAPHY; HOLOGRAPHY
    • G03H—HOLOGRAPHIC PROCESSES OR APPARATUS
    • G03H1/00—Holographic processes or apparatus using light, infrared or ultraviolet waves for obtaining holograms or for obtaining an image from them; Details peculiar thereto
    • G03H1/22—Processes or apparatus for obtaining an optical image from holograms
    • G03H1/2249—Holobject properties
    • G03H2001/2263—Multicoloured holobject
    • G03H2001/2271—RGB holobject
    • G—PHYSICS
    • G03—PHOTOGRAPHY; CINEMATOGRAPHY; ANALOGOUS TECHNIQUES USING WAVES OTHER THAN OPTICAL WAVES; ELECTROGRAPHY; HOLOGRAPHY
    • G03H—HOLOGRAPHIC PROCESSES OR APPARATUS
    • G03H1/00—Holographic processes or apparatus using light, infrared or ultraviolet waves for obtaining holograms or for obtaining an image from them; Details peculiar thereto
    • G03H1/26—Processes or apparatus specially adapted to produce multiple sub- holograms or to obtain images from them, e.g. multicolour technique
    • G03H1/2645—Multiplexing processes, e.g. aperture, shift, or wavefront multiplexing
    • G03H2001/266—Wavelength multiplexing
    • G—PHYSICS
    • G03—PHOTOGRAPHY; CINEMATOGRAPHY; ANALOGOUS TECHNIQUES USING WAVES OTHER THAN OPTICAL WAVES; ELECTROGRAPHY; HOLOGRAPHY
    • G03H—HOLOGRAPHIC PROCESSES OR APPARATUS
    • G03H2222/00—Light sources or light beam properties
    • G03H2222/10—Spectral composition
    • G03H2222/17—White light
    • G03H2222/18—RGB trichrome light

Definitions

  • the present invention concerns, in general and in a first aspect, a holographic reconstruction method based on microscopy without in-line lenses with multiple wavelengths, and more particularly a method comprising simultaneously recording, for all said multiple lengths of wave, a polychromatic multiple hologram, and digitally reconstruct a holographic image composed from the multispectral information included in said polychromatic multiple hologram.
  • a second aspect of the invention concerns a holographic microscope without in-line lenses based on the emission and detection of multiple wavelengths by a polychromatic light source, comprising recording means and processing means that allow, respectively, the simultaneous recording of a polychromatic multiple hologram and the digital reconstruction of a composite holographic image based on the multispectral information included therein.
  • a third aspect of the invention concerns a computer program that implements the digital reconstruction of the method of the first aspect.
  • the experimental system is basically the same one used for registration (except for minor changes) with the exception that the object is removed. In this way, there is only a beam of light that affects the photographic plate and which, upon its output, generates a double image of the object. Both images are identical but inverted and conjugated with respect to each other, and are known by the name of real and virtual image or twin images of the holography.
  • twin images are mainly a problem associated with the noise of the reconstructed image. That is, when performing the hologram reconstruction, the real image will be superimposed with an out of focus image or diffraction pattern from the virtual image. And this implies some background noise on the real image, which is the image of the object we want to analyze.
  • virtual image suppression methods phase shifting method, iteration algorithms between twin images, etc.
  • minimizing their effect partial coherence, digital post-processing, etc.
  • Gabor's principle is stated as follows.
  • a spherical wave of wavelength ⁇ emanating from a point source or "pinhole" of illumination with a diameter of the order of the wavelength of the illumination used illuminates an object typically located at a short distance (few thousand lengths of wave) of the "pinhole” lighting.
  • the object thus illuminated produces a diffraction pattern with a large magnification on a long distance screen (tens of millimeters) compared to the distance between the pinhole and the object.
  • the increase M provided can be calculated as:
  • L is the distance between the lighting "pinhole” and the detection screen
  • Z is the distance between the lighting "pinhole” and the object.
  • a (r) is called the amplitude of the illumination wave that reaches the plane of the object at a given moment, r being the vector that indicates the spatial position, and assuming constant emission within the illumination cone provided by the pinhole "of illumination, said illumination wave can be subdivided just in the plane after the object and in approximation of Gabor as sum of two contributions: A (r) ⁇ Aref (r) + A d ⁇ f (r).
  • equation 2 The four terms present in equation 2 can be identified as:
  • Term 2 is the intensity from the diffraction produced by the object.
  • a lv ⁇ (F) A ( * lj j- (F) is the product between the complex amplitudes of the reference wave and the complex-conjugate component from the diffraction of the object.
  • Terms 1 and 2 correspond to light backgrounds on the recorded hologram while terms 3 and 4 are interferential terms and have to do with the real and virtual images, 5 respectively, when the hologram is reconstructed.
  • the cons of the Wiener system are the same as in the concept of Gabor, however there are 3 numerous advantages derived from the use of a digital sensor in the capture of holograms.
  • the first thing that can be done is to construct a holographic contrast image simply by subtracting the illumination background from the registered hologram when there is an object. This assumes an initial calibration image where, without the presence of an object, the reference background image A ref (r) is recorded and its intensity is subtracted from the intensity provided by the hologram recorded in the presence of an object. This involves subtracting term 1 directly from equation 2: V) A r ' ef (7) A Jlf (7) + A ref (7) A] if (7)
  • the image recorded by the digital sensor is not a focused image of the object but the interference of a diffraction pattern of the object (i.e., something out of focus) with a background reference beam.
  • Said unfocused pattern must be digitally focused and for this it is essential that it is in the holographic regime, that is, little diffractive objects.
  • There are different methods to perform the digital approach with different characteristics depending on whether you are in a system of high or low numerical aperture, long or short propagation distance, etc.
  • This step serves to homogenize the intensity throughout the hologram by compensating for possible variations in intensity between center and periphery caused by non-constant laser lighting. It simply implies a re-normalization of the intensity that is calculated as:
  • holography refers to reconstruction
  • a dif (r) the complex distribution of amplitudes A dif (r) is obtained from the hologram.
  • the display of A dif (r) in a 2D plane, that is, perpendicular to the optical axis, provides or is equivalent to a single focused image of the object (something similar to what a conventional microscope provides).
  • holography it is possible to generate a stack of 2D images for different propagation distances from a single Registered hologram, so that they can be combined to provide a 3D image of the object that improves its display.
  • This processing does not allow eliminating the virtual image (it only minimizes its effect), and does not allow obtaining multispectral information from the sample (because it only uses a lighting wavelength).
  • the document [1] describes a digital, multispectral and compact online holographic microscope. They record holograms at different wavelengths using a monochrome camera that requires
  • the image sensor (of the CCD or CMOS type, for example) can be both monochromatic and color, it is not described in [9] the registration or reconstruction of holograms of multiple wavelengths, nor the use of a polychromatic sample illumination, the illumination used in [9] being described as a partially coherent visible light illumination quasi-monochromatic.
  • the document [4] describes a multicolored digital holography system that employs three wavelengths and obtains the reconstruction of a three-dimensional object through the use of phase-shifting digital holography.
  • RGB lighting is simultaneously emitted from a He-Cd laser, and such illuminations are used for single-step recording of three object holograms (one for each illumination wavelength) with a color CCD camera .
  • the phase shift technique is introduced where, for each RGB channel, 3 consecutive holograms are recorded. This technique is implemented with an achromatic phase shifter based on polarizers and wave delay blades. After the registration of the three holograms, these are properly combined in a computer by using the Fresnel transformation based on a convolution integral.
  • Documents [5] and [6] describe a holographic device that can be connected to a digital imaging device to function as a holographic microscope without lenses. Essentially, it is a device very similar to the one included in references [2] and [3] with the difference of the emitting source. In this case, a lighting pinhole is not used as a divergent point source, but a fiber optic terminal coupled to a GRIN ("Gradient Index") type lens is used. The rest of the configuration is equivalent to the system of references [2] and [3].
  • GRIN Gradient Index
  • the document [7] describes a digital holographic microscope without color lenses. They comment that to avoid decoding the multi-wavelength of the recorded holograms, in some applications multiple shooting may not be convenient, so it is interesting to use digital color holography to to obtain in a single shot the necessary chromatic channels, but they do not propose to use it in the document [7].
  • the use of three independent RGB emitting lasers that are aligned and combined using three dichroic beam combiners is proposed. The beams are focused by an apochromatic microscope objective on a pinhole to produce the spot source of illumination. They use a monochrome CCD where, in a sequential way (not in parallel), the holograms are superimposed due to the 3 RGB wavelengths used.
  • Document [8] describes an online digital holographic microscope concept / configuration without lenses other than those included in references [1], [2], [3], [5], [6] and [7].
  • the sample instead of placing the sample near the point of illumination to look for an increase in the sample by geometric projection, the sample is located very close to the digital sensor and separated a few mm from the point of illumination.
  • the difficulty of placing the sample very close to the source of illumination (which has to have very specific characteristics) is eliminated, in addition to greatly increasing the field under analysis (0.5x0 .5 mm 2 to 5x5 mm 2 , approx.).
  • it introduces a series of limitations such as the absence of optical magnification (practically, it is a lx configuration) and resolution limited by the pixel size of the digital sensor used.
  • the resolution can be improved by a sub-pixel method based on the recording of sequential holograms when the point source of illumination moves to a wide set of positions (36 displacements as indicated in the last paragraph of page 12477 of [8] ).
  • reference [8] involves digital processing that can be separated into two parts.
  • a high resolution monochrome image is obtained by sub-pixel displacement and without virtual image, using a single illumination (the green one) using a color sensor.
  • color information is captured by illuminating with the three wavelengths in order to produce a rendering and a color representation of the analyzed sample.
  • This second part of the digital processing involves the sequential recording of three holograms, one per wavelength, and for a single distance between the sample and the color sensor. These three low-resolution RGB holograms together with the previously obtained high-resolution sub-pixel image are used to generate a color image of the sample, that is, to color the high-resolution image obtained for a single color, for the purpose of display or rendering of the color sample. That is, the color information is not being used to eliminate the virtual image, eliminating it through a complex system of recording 108 sequential holograms in time with complex and precise mechanical positioning systems of optical components (light source and glass between sample and digital sensor).
  • Fig. 1 shows a basic scheme of Gabor's holographic system
  • Fig. 2 is a general scheme of the main elements of the microscope proposed by the second aspect of the invention, for an exemplary embodiment
  • Fig. 3 schematically shows an experimental system operating for the validation of the microscope proposed by the second aspect of the invention considering lighting and detection in RGB;
  • Fig. 4 shows in its top view an RGB hologram provided by the color sensor used in the method and microscope of the present invention and, in its three lower views, to the focused images of each RGB channel separately;
  • Fig. 5 is a diagram with the images of the different steps included in the digital processing of the first stage of the method proposed by the first aspect of the invention, and indicated next to the illustrated images;
  • Fig. 6 shows two images illustrating the final result provided by the second stage of the digital processing of the method proposed by the first aspect of the invention (right) compared to the image resulting from the first stage (left);
  • Fig. 7 illustrates a comparison of results, in the form of reconstructed holographic images, between the Wiener system (upper row) and the method and microscope proposed by the present invention (lower row); Y
  • Fig. 8 illustrates the experimental results (by columns) obtained with the method and microscope proposed by the present invention and for two different areas of a biological sample (pig sperm) as an object.
  • the upper row shows the RGB hologram, the intermediate one the result obtained by the Wiener method applied to the blue channel and without producing the contrast image (equation 3), and the lower one the result provided by the present invention.
  • the present invention concerns, in a first aspect, a holographic reconstruction method based on microscopy without in-line lenses with multiple wavelengths, comprising, in a manner known per se:
  • the one proposed by the first aspect of the invention comprises, in a characteristic way, carrying out said step of holographic information recording by means of simultaneous registration for all said wavelengths, which they are at least three, of a polychromatic multiple hologram, and obtaining said composite holographic image from the multispectral information included in said polychromatic multiple hologram.
  • the method comprises performing said simultaneous recording stage in a single shot of the illumination and with a single polychromatic digital sensor with sensitivity to said three or more wavelengths, to register a polychromatic multiple hologram of single exposure, as well as obtaining said channels separately from the polychromatic sensor, so that no image scanning or simultaneous capture is necessary since the information of all lighting channels is captured with a single shot of the lighting, which significantly reduces the Sample capture time and therefore obtaining the final image.
  • this advantage is essential for the analysis of dynamic samples since with a single shot (parallel capture) no sample information is lost, which does occur when sequential or serial captures are taken.
  • said digital sensor has sensitivity to said wavelengths, which are at least three, because it comprises a mask or filter or mosaic of cells with adapted spectral transmittance, the method comprising the specific adaptation of both the spectral transmittance and of the number of cells of the mask or filter or mosaic to be placed on the pixels of the digital sensor to the spectrum and number of wavelengths chosen for said stage of simultaneous illumination, so that the cells transmit in maximum the diffraction pattern provided for each of the lighting wavelengths.
  • simultaneous lighting is RGB lighting
  • the Bayer filter has RGB cells with spectral transmittance of each cell adapted or tuned to the RGB lambdas.
  • the method comprises using a mask, filter or mosaic lacking cells whose spectral transmittance are adapted to transmit the diffraction pattern at maximum provided by at least one of the lighting wavelengths, but that allow the passage of at least a portion of said diffraction pattern.
  • a mask, filter or mosaic lacking cells whose spectral transmittance are adapted to transmit the diffraction pattern at maximum provided by at least one of the lighting wavelengths, but that allow the passage of at least a portion of said diffraction pattern.
  • simultaneous illumination is an illumination with IR-RB (using blu-ray as a light source), that is, infrared, green and blue light
  • a digital sensor such as a CCD, can be used in color with a Bayer filter whose RGB cells do not have spectral transmittance adapted or tuned to the IR-RB lambdas.
  • the method comprises performing said simultaneous illumination only with said three or more wavelengths without requiring additional illumination of the object.
  • the method proposed by the first aspect of the invention comprises, according to a preferred embodiment, to obtain said composite holographic image, perform a digital processing of said multispectral information relative to at least said three wavelengths, and included in respective channels , which includes performing at least one weighted mix in the Fourier domain of the spectra corresponding to each wavelength.
  • said digital processing comprises using said multispectral information to eliminate the contribution of the virtual image in the composite holographic image.
  • the registered hologram is a single multichromatic or multispectral hologram
  • said digital processing includes a first stage which comprises performing sequentially:
  • the digital processing of the method proposed by the first aspect of the invention It also includes a second stage of iteration of the phase which comprises performing sequentially and in a loop:
  • the method comprises arranging the object closest to a light source with which the illumination thereof is carried out, than to means of registration with which the multispectral hologram is registered.
  • the three or more wavelengths are in a spectrum visible by the human eye (for example RGB) or, at least one of them is in a spectrum not visible by the human eye, such such as infrared or ultraviolet.
  • a second aspect of the invention concerns a holographic microscope without in-line lenses based on multiple wavelengths, comprising, in a manner known per se:
  • - support means configured and arranged to support an object
  • - recording means configured and arranged, in relation to said object supported by the support means, to record holographic information of said illuminated object that includes diffraction patterns generated by said object for said wavelengths, which are at least three;
  • - processing means in connection with said recording means to receive from them at least said registered holographic information, and configured to obtain, by digital reconstruction, a holographic image composed from said registered holographic information.
  • said recording means are configured and arranged for simultaneous recording for all said wavelengths, which are at least three, of a polychromatic multiple hologram of said illuminated object; and that said processing means are configured to obtain, by digital reconstruction, said holographic image composed from information) included in said polychromatic multispectral multiplex hologram.
  • the recording means comprise a single digital sensor with sensitivity to three or more wavelengths and control means that control the sensor to perform said recording simultaneously for all wavelengths, in a single lighting shot.
  • the recording means comprise a digital sensor with a mask or filter or mosaic of cells with spectral transmittance adapted to the wavelengths used in the lighting source, such as:
  • RGBE type mask sensitive to red (R), green (G), and blue (B) wavelengths (2x2 mosaic of cells with 2 G filters, one R and one B, or any other combination of RGB filters ); or - an RGBE type mask with spectral sensitivity to RGBE wavelengths, where E is the so-called emerald color (2x2 mosaic of cells with 1 G filter, one R, one B and one E); or
  • CYM type mask with spectral sensitivity to cyan (C), yellow (Y) and magenta (M) wavelengths (2x2 mosaic of cells with 1 C filter, two Y, and one M, or any other combination of CYM filters); or
  • CYGM type mask with spectral sensitivity to cyan (C), yellow (Y), green (G) and magenta (M) wavelengths (2x2 mosaic of cells with 1 C filter, one Y, one G and one M); or
  • RGBW type mask with spectral sensitivity to wavelengths (R), green (G), blue (B) and white (W) (2x2 mosaic of cells with 1 R filter, one G, one B and one W ); or
  • a mask that combines a mosaic composed of cells with different transmittance for each wavelength used in the lighting source (2x2 or 3x3 or 4x4 mosaic); or
  • both the spectral transmittance and the number of cells of the mask or filter or mosaic, to be placed on the pixels of the polychromatic digital sensor are specifically adapted to the spectrum and number of said three or more wavelengths, so that the cells transmit at maximum the diffraction pattern provided by each of the lighting wavelengths.
  • the spectral transmittance of the mask or filter or mosaic cells allows the light to pass at three or more wavelengths, but the mask or filter or mosaic lacks cells whose spectral transmittances are adapted to transmit at maximum the diffraction pattern provided by at least one of said three or more wavelengths.
  • divergent lighting means comprise a point source of light composed of the three or more wavelengths.
  • said divergent lighting means comprise:
  • pinhole multispectral lighting source ie pinhole type
  • a laser emitter system of three or more wavelengths assembled on a single physical support such as some diode cans with an emission capacity of 405/660/780 nanometers, and any type of elements (lenses, prisms, mirrors ...) light redirectors for proper handling.
  • the processing means implements the digital processing of the method of the first aspect.
  • the microscope processing means implements digital processing according to alternative methods to the first aspect.
  • a third aspect of the invention concerns a computer program that includes code instructions that, when executed on a computer, implement the digital processing of the method of the first aspect.
  • FIG. 2 A scheme of the proposed invention is presented in Figure 2.
  • a point source Pi that emits in multiple (at least 3) wavelengths ( ⁇ + ⁇ 2 + ⁇ 3 + ...) illuminates an object O located at a distance Z from the point source of illumination Pi and supported by support means (not illustrated).
  • the object O will generate multiple (at least three) diffraction patterns corresponding to each of the wavelengths used.
  • Each of said diffraction patterns will arrive at the registration plane (located at a distance L from the point lighting source Pi) where a digital sensor Re with spectral sensitivity to the multiple (at least 3) wavelengths will register multiple (at least 3) online holograms.
  • the way to make the digital sensor Re sensitive to the multiple (at least 3) wavelengths is by interposing a mask or filter or mosaic of cells with different spectral transmittance on each of the pixels that make up the digital sensor (typically a CCD or a CMOS sensor).
  • Figure 2 includes two types of masks (square frame mosaics with gray levels to the right of the digital sensor Re) with cells of type 3x3 and 2x2 pixels for the case of 9 and 4 different lighting wavelengths, respectively.
  • all pixels with the same transmittance filter will define a digital sensor channel with sensitivity to a given illumination wavelength.
  • each of the multiple wavelengths excites unique and
  • the Re sensor is associated or includes control means that control it to record the multiple holograms online simultaneously for all wavelengths, in a single lighting shot.
  • the polychromatic sensor Re is constituted by a camera or color CCD sensor (RGB sensitivity), which is a digital sensor in which a Bayer mask (cell type 2x2 cell is placed pixel by pixel) with 1 R filter, two G filters and a B filter) that filters the color information of the incident diffraction pattern on the CCD.
  • RGB sensitivity RGB sensitivity
  • the lighting source does not necessarily have to be a "pinhole" of illumination: lasers coupled with optical fiber can be used alternately and that is the terminal of the fiber who provides the divergent illumination, or in systems based on dichroic filters of combination of different wavelengths together with optical systems (lenses, zonal plates, etc.) of light focusing.
  • CCD AVT 1394 Stingray F-145C, 1038 x 1038 pixels, 6.45 x 6.45 ⁇ pixel spacing
  • the digital processing included in the method of the first aspect of the invention comprises, for an example of preferred embodiment, the realization of two stages that include the following steps:
  • the three corresponding channels are separated with the three illuminations used.
  • the RGB hologram is separated into the three RGB components causing three images (holograms) separately.
  • Digital processing is carried out that involves the following steps: o initial equalization of the three holograms according to the shape of the lighting used for each channel (intensity correction according to Wiener). or elimination of unwanted cross contributions between channels.
  • This step is because, to a greater or lesser degree, all wavelengths contribute to all generated holograms. That is, the green wavelength contributes to the blue and red channels, the blue to the red and green channels, and the red to the blue and green channels. Therefore, either with the theoretical characteristics of the color CCD or by experimental calibration, cross-terms can be eliminated to clean the initial images.
  • each hologram needs a different propagation distance to perform its focus
  • the second stage includes the following steps: o propagation of the single image generated in the first stage to the digital sensor plane with the propagation distances previously calculated for each channel. or in this way, three new holograms of the unfocused object are generated where the phase originated in each hologram due to digital propagation is accumulated and the amplitude is replaced by the square root of the hologram intensity corresponding to said channel. or these three new holograms are digitally propagated again to the plane of the object (each with its corresponding propagation distance). or and the weighted mixing of the Fourier domain spectra is performed again to end up generating a new / different unique image that is again the input of a new iteration of the loop.
  • Figure 5 shows the intermediate images corresponding to the first stage of the processing, where the following actions have been indicated with references A1-A6:
  • Al Obtaining the three focused images corresponding to the three channels separately.
  • A2 Correction of the intensity according to the lighting of each channel.
  • A3 Elimination of cross terms between channels.
  • A4 Digital Fourier transform of each channel.
  • A5 Weighted mixture of Fourier plane spectra, assigning weighting values of 0, 0.33, 0.5 and 1 to different gray areas of the mask indicated as Mp, to obtain the single spectrum Eu resulting from the combination weighted of the spectra of the three channels.
  • A6 Generation of the single input image of the second stage.
  • Figure 6 shows, in its right view, the final image provided by the second stage compared to the image resulting from the first stage (left view).
  • Figure 7 shows the images obtained with the Wiener system (images obtained from the publication “J. Garcia-Sucerquia, W. Xu, SK Jericho, P. Klages, MH Jericho, and HJ Kreuzer, "Digital in-line holographic microscopy,” Appl. Opt. 45, 836-850, 2006 ") when the object used is a resolution test analogous to that used in the experimental validation of the present invention used in this section, and with an experimental configuration also very similar (diameter of the lighting "pinhole”: 0.5 ⁇ , wavelength: 408 nm, numerical aperture: 0.208).
  • Images A and D of Figure 7 show the holograms of the resolution test for both the Wiener system and the present invention, respectively. It can be seen how the method and microscope proposed by the present invention provide an RGB hologram as a consequence of the three wavelengths used in the illumination while the Wiener system provides a monochrome hologram.
  • Image A in Figure 7 shows the contrast hologram (equation 3) of the resolution test for the Wiener system.
  • Images B and C show the results obtained with the Wiener method with image C being an enlargement of the central part of image B.
  • Image D of Figure 7 shows the color hologram provided by the present invention and not composed of a only wavelength (as would be the case of the Wiener system and image A) but for a sum of three.
  • Image E of Figure 7 shows the result provided by the blue channel according to the present invention (illumination pinhole diameter: 1 ⁇ , wavelength: 405 nm, numerical aperture: 0.16) where it is observed how, except for not having applied equation 3, an image very similar to that provided by the Wiener system is obtained. And finally, the image F shows again the result obtained by the present invention after having applied the second stage. It can be seen how, overall and by comparison with the C and E images representative of the Wiener method, the noise has been reduced (less variation of the illumination background) and the contrast has been improved (difference in gray level between the background and the bars horizontal and vertical resolution test) of the resulting image as a result of the elimination of the virtual image after the application of the proposed method.
  • Figure 8 shows some of the images obtained with the proposed experimental system, that is, with the microscope of the present invention, for two different areas of the biological sample.
  • the upper row shows the RGB hologram, the intermediate one the result obtained by the Wiener method applied to the blue channel and without producing the contrast image (equation 3), and the lower one the result provided by the present invention.

Landscapes

  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Computing Systems (AREA)
  • Theoretical Computer Science (AREA)
  • Microscoopes, Condenser (AREA)
  • Image Processing (AREA)
  • Holo Graphy (AREA)

Abstract

Método de reconstrucción holográfico basado en microscopía sin lentes en línea con múltiples longitudes de onda, microscopio holográfico sin lentes en línea basado en múltiples longitudes de onda y programa de ordenador El método comprende: - iluminar, de manera simultánea, un objeto (O) con luz divergente que incluye tres o más longitudes de onda (λι +λ2 +λ3 +...);- registrar un holograma múltiple del objeto iluminado (O); y - obtener, por reconstrucción digital, una imagen holográfica compuesta mediante un procesado digital de la información multiespectral incluida en el holograma múltiple relativa a las tres o más longitudes de onda (λι +λ2 +λ3 +...), que incluye realizar una mezcla ponderada en el dominio de Fourier de los espectros correspondientes a cada longitud de onda. El microscopio está adaptado para implementar el método del primer aspecto. El programa de ordenador implementa la reconstrucción digital del método de la invención.

Description

MÉTODO DE RECONSTRUCCIÓN HOLOGRÁFICO BASADO EN MICROSCOPIA SIN LENTES EN LÍNEA CON MÚLTIPLES LONGITUDES DE ONDA, MICROSCOPIO HOLOGRÁFICO SIN LENTES EN LÍNEA BASADO EN
MÚLTIPLES LONGITUDES DE ONDA Y PROGRAMA DE ORDENADOR
> Campo de la invención
La presente invención concierne, en general y en un primer aspecto, a un método de reconstrucción holográfico basado en microscopía sin lentes en línea con múltiples longitudes de onda, y más en particular a un método que comprende registrar simultáneamente, para todas dichas múltiples longitudes de onda, un holograma múltiple policromático, y reconstruir digitalmente una imagen ) holográfica compuesta a partir de la información multiespectral incluida en dicho holograma múltiple policromático.
Un segundo aspecto de la invención concierne a un microscopio holográfico sin lentes en línea basado en la emisión y detección de múltiples longitudes de onda por parte de una fuente de luz policromática, que comprende unos medios de registro y unos medios de procesamiento que » permiten, respectivamente, el registro simultáneo de un holograma múltiple policromático y la reconstrucción digital de una imagen holográfica compuesta a partir de la información multiespectral incluida en el mismo.
Un tercer aspecto de la invención concierne a un programa de ordenador que implementa la reconstrucción digital del método del primer aspecto. i
Estado de la técnica
El grupo del profesor Kreuzer ([2][3]) propuso un sistema de holografía digital en línea, comercializado por la empresa Resolution Optics, basado en el principio de la holografía inventado por Gabor en 1948 ([10]), en el cual, esencialmente, un haz de luz monocromático coherente ilumina un objeto y el patrón de difracción generado por dicho objeto llega al plano de registro tras propagarse una determinada distancia. En la idea original propuesta por Gabor, la iluminación empleada estaba compuesta por haces de electrones y en el plano de registro se colocaba una placa fotográfica para registrar el patrón difractado.
Tras registrar el holograma, hay que proceder a su reconstrucción. Para ello, el sistema experimental es básicamente el mismo utilizado para el registro (salvo pequeños cambios) con la salvedad de que se elimina el objeto. De este modo, solo hay haz de iluminación que incide sobre la placa fotográfica y que, a su salida, genera una doble imagen del objeto. Ambas imágenes son idénticas pero invertidas y conjugadas una con respecto a la otra, y se conocen con el nombre de imagen real y virtual o imágenes gemelas de la holografía.
La existencia de dos imágenes gemelas supone, principalmente, un problema asociado al ruido de la imagen reconstruida. Es decir, al realizar la reconstrucción del holograma, la imagen real estará superpuesta con una imagen desenfocada o patrón de difracción procedente de la imagen virtual. Y esto implica cierto ruido de fondo sobre la imagen real, que es la imagen del objeto que queremos analizar. No obstante, existen algunos métodos de supresión de la imagen virtual (método de "phase- shifting", algoritmos de iteración entre imágenes gemelas, etc.) así como de minimización de su efecto (coherencia parcial, post-procesado digital, etc.). En cualquier caso, la existencia de las imágenes gemelas es un problema que existe en los sistemas holográficos en línea que, dependiendo del caso, podrá ser más o menos crítico.
Matemáticamente, el principio de Gabor se enuncia del siguiente modo. Una onda esférica de longitud de onda λ que emana de una fuente puntual o "pinhole" de iluminación con un diámetro del orden de la longitud de onda de la iluminación empleada, ilumina un objeto típicamente situado a una distancia corta (pocas miles de longitudes de onda) del "pinhole" de iluminación. De este modo, el objeto así iluminado produce un patrón de difracción con un aumento grande sobre una pantalla situada a distancia larga (decenas de milímetros) en comparación con la distancia entre el "pinhole" y el objeto. El aumento M proporcionado puede calcularse como:
Figure imgf000004_0001
siendo L la distancia que hay entre el "pinhole" de iluminación y la pantalla de detección, y Z la distancia existente entre el "pinhole" de iluminación y el objeto. Estas distancias pueden identificarse en la Figura 1, donde los diferentes elementos del microscopio se han referenciado como: Pi: "pinhole", R: pantalla de registro holográfico y O: muestra u objeto iluminado.
Si se llama A( r ) a la amplitud de la onda de iluminación que llega al plano del objeto en un instante dado, siendo r el vector que indica la posición espacial, y suponiendo emisión constante dentro del cono de iluminación proporcionado por el "pinhole" de iluminación, dicha onda de iluminación puede subdividirse justo en el plano posterior al objeto y en aproximación de Gabor como suma de dos contribuciones: A( r )≡ Aref( r ) + Ad¡f( r ). Es decir, como suma de una onda de referencia que no se ve alterada por el objeto y sigue su propagación como si no hubiese objeto (Aref( r ) = exp(ikr)/r, en teoría escalar de la difracción siendo k-2n/ el número de onda) más una componente difractada por el objeto Adif( r ) donde se asume que Adif( r ) es mucho menor que Aref( r ). Tanto Aref( r ) como Adlf( r ) pueden identificarse en la Figura 1. De este modo, la distribución de intensidades l( r ) que llega a la pantalla de detección en un instante dado puede calcularse como:
1(F) = (7) (2)
Figure imgf000005_0001
Los cuatro términos presentes en la ecuación 2 pueden identificarse como:
S · Término 1: |^/-(r~)| es 'a intensidad procedente del fondo de iluminación, es decir, de la onda no alterada por el objeto y supone un fondo de intensidad sobre la imagen registrada en la pantalla de detección.
Figure imgf000005_0002
• Término 2: es la intensidad procedente de la difracción producida por el objeto.
• Término 3: Ar*i;j (F)Ai/if (7) es el producto entre las amplitudes complejas de la onda de D referencia complejo-conjugada y la componente procedente de la difracción del objeto.
• Término 4: Alví(F)A(*ljj-(F) es el producto entre las amplitudes complejas de la onda de referencia y la componente complejo-conjugada procedente de la difracción del objeto.
Los términos 1 y 2 se corresponden con fondos de luz sobre el holograma registrado mientras que los términos 3 y 4 son términos interferenciales y tienen que ver con las imágenes real y virtual, 5 respectivamente, cuando se realiza la reconstrucción del holograma.
Para llegar a la ecuación 2 ha sido necesario asumir que la onda originada por el objeto es mucho menor que la onda de referencia: Adif( r ) « Aref( r ). Solo bajo esta aproximación, es posible llegar a la ecuación 2 donde se dice que la holografía domina el proceso y es posible realizar reconstrucción holográfica del objeto. Esta situación se da cuando el objeto solo apantalla o bloquea una pequeña D fracción de la luz sobre la pantalla de registro. Es lo que se suele conocer como aproximación de objeto poco difractivo y se produce cuando el objeto es esencialmente transparente o, incluso siendo opaco, presenta una baja proporción de zonas opacas en comparación con las transparentes. En caso contrario, no se puede asegurar que se está en régimen holográfico y no es posible realizar reconstrucción holográfica del objeto.
5 La adaptación comercial en el rango óptico de la idea de Gabor fue propuesta por Kreuzer y colaboradores en 2001 ([11]). En el sistema de Kreuzer, básicamente, reemplazan la placa fotográfica del sistema de Gabor por un sensor digital (cámara CCD o sensor CMOS) y la iluminación de haces de electrones por luz visible.
Los contras del sistema Kreuzer son los mismos que en el concepto de Gabor, sin embargo existen 3 numerosas ventajas derivadas del empleo de un sensor digital en la captura de los hologramas. Así por ejemplo, lo primero que se puede hacer es construir una imagen de contraste holográfica simplemente sustrayendo el fondo de iluminación del holograma registrado cuando si hay objeto. Esto supone una imagen de calibración inicial donde, sin presencia de objeto, se registra la imagen del fondo de referencia Aref( r ) y su intensidad se resta de la intensidad proporcionada por el holograma registrado en presencia de objeto. Esto supone restar el término 1 directamente de la ecuación 2: V)
Figure imgf000006_0001
Ar'ef (7)AJlf (7) + Aref (7)A]if (7)
De este modo, las imágenes holográficas reconstruidas digitalmente poseen una contribución menos y, por lo tanto, menor ruido.
Obviamente, la imagen registrada por el sensor digital no es una imagen enfocada del objeto sino la interferencia de un patrón de difracción del objeto (es decir, algo desenfocado) con un haz de referencia de fondo. Dicho patrón desenfocado debe enfocarse digitalmente y para ello es fundamental que se esté en el régimen holográfico, es decir, objetos poco difractivos. Existen diferentes métodos para realizar el enfoque digital con diferentes características dependiendo de si se está en un sistema de alta o baja apertura numérica, de larga o corta distancia de propagación, etc. En cualquier caso, se trata de algoritmos de dominio público salvo en la patente de Kreuzer ([2]) donde sí se especifica un método de cálculo mediante una implementación rápida de la transformada de Kirchhoff-Helmhotz que permite evaluar Adif( r ) de manera exacta sin aproximaciones para diferentes distancias de propagación con el fin de construir una imagen 3D del objeto.
Sin embargo y como paso previo al enfoque digital, se suele realizar una corrección de la intensidad de la iluminación láser. Este paso sirve para homogenizar la intensidad en todo el holograma compensando las posibles variaciones de intensidad entre centro y periferia ocasionadas por una iluminación láser no constante. Simplemente implica una re-normalización de la intensidad que se calcula como:
Figure imgf000006_0002
Cuando en holografía se habla de reconstrucción se quiere decir que se obtiene la distribución compleja de amplitudes Adif( r ) a partir del holograma. La visualización de Adif( r ) en un plano 2D, es decir, perpendicular al eje óptico, proporciona o es equivalente a una única imagen enfocada del objeto (algo similar a lo que proporciona un microscopio convencional). Pero gracias a la holografía, es posible generar una pila de imágenes 2D para diferentes distancias de propagación a partir de un único holograma registrado, de tal manera que se pueden combinar para proporcionar una imagen 3D del objeto que mejora su visualización.
Así pues, el algoritmo digital realizado por el sistema de Kreuzer puede resumirse en los siguientes pasos:
> 1. Registro del holograma digital (ecuación 2).
2. Registro del fondo de iluminación sin objeto para generar holograma de contraste (ecuación 3).
3. Corrección de la intensidad según la iluminación láser (ecuación 4).
4. Reconstrucción numérica (algoritmo de propagación digital) a partir de la intensidad proporcionada por la ecuación 4 para enfocar el objeto.
) Este procesado no permite eliminar la imagen virtual (solo minimiza su efecto), y no permite obtener información multiespectral de la muestra (porque solo utiliza una longitud de onda de iluminación).
A continuación se citan y describen otras referencias representativas del estado de la técnica.
El documento [1] describe un microscopio holográfico en línea digital, multiespectral y compacto. Registran hologramas a diferentes longitudes de onda usando una cámara monocromo que requiere
> múltiples capturas secuenciales (consecutivas en el tiempo) para el registro de la información correspondiente a los diferentes hologramas proporcionados por cada longitud de onda. Pensando en una configuración de tres longitudes de onda (RGB por ejemplo), este hecho merma las capacidades técnicas del microscopio ya que (al menos) triplica el tiempo de captura al necesitar tres capturas secuenciales de hologramas, no resultando útil para el análisis de eventos dinámicos rápidos. Pese a l que se utilizan iluminación policromática procedente de fuentes de coherencia espacial variable (láser sintonizable y LED tricolor RGB), la información relativa al color se emplea únicamente para visualización y renderizado de una imagen de la muestra en color, y para análisis multiespectral de la muestra. Teóricamente, el tener varias lambdas de iluminación permite obtener imágenes multiespectrales con información de la muestra a diferentes lambdas. Esto puede ser muy útil porque permite analizar la muestra bajo diferentes lambdas (absorción selectiva multiespectral de la muestra).
La aplicación del microscopio descrito en el documento [1] se restringe a exclusivamente los canales RGB, y el procesado de las imágenes empleado se limita únicamente al enfoque digital de los hologramas capturados en serie (secuenciales en el tiempo), es decir, no se elimina la imagen virtual, ya que los autores estiman que la imagen virtual o gemela no compromete la puesta a punto del dispositivo y, por tanto, no la eliminan con el procesado. El documento [9] propone un sistema para el análisis automatizado de semen, basado en microscopía holográfica sin lentes, mediante el cual se obtienen una serie de imágenes digitales de la muestra, a partir de las cuales se realiza una reconstrucción digital. A pesar de que se indica que el sensor de imagen (de tipo CCD o CMOS, por ejemplo) puede ser tanto monocromático como color, no se describe en [9] el registro ni la reconstrucción de hologramas de múltiples longitudes de onda, ni la utilización de una iluminación de la muestra poli-cromática, describiéndose la iluminación utilizada en [9] como una iluminación de luz visible parcialmente coherente cuasi-monocromática.
El documento [4] describe un sistema de holografía digital multicolor que emplea tres longitudes de onda y obtiene la reconstrucción de un objeto tridimensional mediante el uso de holografía digital de desplazamiento de fase ("phase-shifting digital holography"). Esencialmente, se emite simultáneamente iluminación RGB a partir de un láser de He-Cd, y dichas iluminaciones se utilizan para el registro en un solo paso de tres hologramas del objeto (uno para cada longitud de onda de iluminación) con una cámara CCD de color. Para eliminar la contribución de la imagen virtual, se introduce la técnica de desplazamiento de fase donde, para cada canal RGB, se registran 3 hologramas consecutivos. Esta técnica resulta implementada con un desplazador de fase acromática ("achromatic phase shifter") basado en polarizadores y láminas de retardo de onda. Tras el registro de los tres hologramas, éstos se combinan apropiadamente en un ordenador mediante el uso de la transformación de Fresnel basada en una integral de convolución.
La configuración del sistema de [4] no es en línea (los haces de referencia para el registro holográfico se insertan externamente), y el sistema necesita de un desplazador de fase acromática para el desplazamiento de fase que encarecen el dispositivo e inhabilita el sistema para el análisis de muestras dinámicas rápidas (ya que tres imágenes consecutivas deben ser capturadas por el CCD en color). Adicionalmente, el método algorítmico involucrado utiliza reconstrucción por transformada de Fourier debido a la presencia de los haces de referencia externos.
Los documentos [5] y [6] describen un dispositivo holográfico que se puede conectar a un dispositivo de imagen digital para que funcione como microscopio holográfico sin lentes. Esencialmente, se trata de un dispositivo muy similar al incluido en las referencias [2] y [3] con la diferencia de la fuente emisora. En este caso, no se utiliza un "pinhole" de iluminación como fuente puntual divergente sino que se utiliza un terminal de fibra óptica acoplado a una lente de tipo GRIN ("Gradient Index"). El resto de configuración es equivalente al sistema de las referencias [2] y [3].
El documento [7] describe un microscopio holográfico digital sin lentes a color. Comentan que para evitar decodificar la multi-longitud de onda de los hologramas registrados, en algunas aplicaciones el disparo múltiple puede no ser conveniente por lo que interesa usar holografía digital a color para conseguir en un único disparo los canales cromáticos necesarios, pero no proponen hacer uso de ello en el documento [7]. Se propone el uso de tres láseres con emisión en RGB independientes que son alineados y combinados mediante tres combinadores de haz dicroicos. Los haces son focalizados mediante un objetivo de microscopio apocromático sobre un "pinhole" para producir la fuente puntual de iluminación. Usan un CCD monocromo donde, de manera secuencial (no en paralelo), se superponen los hologramas debido a las 3 longitudes de onda RGB empleadas. En esencia, se trata de un sistema análogo al incluido en las referencias [2] y [3] solo que en lugar de emplear una única longitud de onda de iluminación, aquí se emplean 3 haces RGB. El método de reconstrucción de cada holograma es análogo al incluido en las referencias [2] y [3].
Al no permitir el registro en paralelo de los 3 hologramas no se pueden registrar hologramas correspondientes a eventos más rápidos que en la configuración secuencial, tales como las muestras dinámicas.
El procesado digital para el enfoque propuesto en [7] no elimina la imagen virtual, ya que no lo consideran necesario.
Por último, el objetivo y la aplicabilidad del sistema de la referencia [7] obedecen a representación en color de la imagen holográfica y no a recuperación de fase sin imagen virtual.
El documento [8] describe un concepto/configuración de microscopio holográfico digital en línea sin lentes diferente al incluido en las referencias [1], [2], [3], [5], [6] y [7]. En esta nueva configuración, en lugar de colocar la muestra cercana a la fuente puntual de iluminación para buscar aumento de la muestra por proyección geométrica, se sitúa la muestra muy cerca del sensor digital y separada algunos mm de la fuente puntual de iluminación. Esto supone una nueva configuración experimental en línea con ventajas e inconvenientes con respecto a la configuración previa ([1], [2], [3], [5], [6] y [7]). En cuanto a las ventajas, se puede decir que se elimina la dificultad que supone colocar la muestra muy cerca de la fuente de iluminación (la cual tiene que tener unas características muy específicas) además de incrementar enormemente el campo objeto de análisis (de 0.5x0.5 mm2 a 5x5 mm2, aprox.). Sin embargo, introduce una serie de limitaciones tales como ausencia de aumento óptico (prácticamente, es una configuración lx) y resolución limitada por el tamaño de pixel del sensor digital empleado. La resolución puede mejorarse mediante un método sub-píxel basado en el registro de hologramas secuenciales cuando la fuente puntual de iluminación se va desplazando a un conjunto amplio de posiciones (36 desplazamientos como se indica en el último párrafo de la página 12477 de [8]). Además de complicar y encarecer el sistema experimental, la necesidad de desplazar la fuente de iluminación para mejorar la resolución óptica del dispositivo haciéndola similar a otros ([1], [2], [3], [5], [6] y [7]), supone la pérdida de la capacidad de analizar muestras dinámicas ya que la muestra debe ser estática durante el registro de los 36 hologramas.
En pocas palabras, la referencia [8] supone un procesado digital que se puede separar en dos partes. En la primera, se obtiene una imagen monocroma de alta resolución mediante desplazamiento sub- píxel y sin imagen virtual, utilizando una única iluminación (la verde) empleando un sensor en color.
En la segunda parte, se captura información de color iluminando con las tres longitudes de onda para poder producir un renderizado y una representación en color de la muestra analizada. Esta segunda parte del procesado digital conlleva el registro secuencial de tres hologramas, uno por longitud de onda, y para una única distancia entre la muestra y el sensor en color. Estos tres hologramas RGB de baja resolución junto con la imagen sub-píxel de alta resolución previamente obtenida, se usan para generar una imagen en color de la muestra, es decir para colorear la imagen de alta resolución obtenida para un solo color, con fines de visualización o renderizado de la muestra en color. Es decir, no se está utilizando la información de color para eliminar la imagen virtual, eliminándose ésta mediante un complejo sistema de registro de 108 hologramas secuenciales en el tiempo con complejos y precisos sistemas mecánicos de posicionamiento de componentes ópticos (fuente de luz y vidrios entre muestra y sensor digital).
No se indica en [8] que los tres hologramas RGB puedan registrarse simultáneamente, ni aplicar la captura de información de color en la que se ilumina con las tres longitudes de onda en el registro de hologramas de alta resolución, es decir que no se propone utilizar la metodología de la segunda etapa (baja resolución) en la primera etapa (alta resolución), ni, por supuesto, prescindir de la realización de la primera etapa.
Tampoco se enseña ni se sugiere, en [8], dar un mayor o menor peso a alguno de los tres hologramas RGB capturados en la segunda etapa, a la hora de colorear la imagen de alta resolución obtenida en la primera etapa.
Breve descripción de las figuras
Las anteriores y otras ventajas y características se comprenderán más plenamente a partir de la siguiente descripción detallada de unos ejemplos de realización con referencia a los dibujos adjuntos, que deben tomarse a título ilustrativo y no limitativo, en los que:
Fig. 1 muestra un esquema básico de sistema holográfico de Gabor;
Fig. 2 es un esquema general de los principales elementos del microscopio propuesto por el segundo aspecto de la invención, para un ejemplo de realización; Fig. 3 muestra esquemáticamente a un sistema experimental operando para la validación del microscopio propuesto por el segundo aspecto de la invención considerando iluminación y detección en RGB;
Fig. 4 muestra en su vista superior a un holograma RGB proporcionado por el sensor en color utilizado en el método y microscopio de la presente invención y, en sus tres vistas inferiores, a las imágenes enfocadas de cada canal RGB por separado;
Fig. 5 es un esquema con las imágenes de los diferentes pasos incluidos en el procesado digital de la primera etapa del método propuesto por el primer aspecto de la invención, e indicados junto a las imágenes ilustradas;
Fig. 6 muestra dos imágenes que ilustran el resultado final proporcionado por la segunda etapa del procesado digital del método propuesto por el primer aspecto de la invención (derecha) en comparación con la imagen resultante de la primera etapa (izquierda);
Fig. 7 ilustra una comparativa de resultados, en la forma de imágenes holográficas reconstruidas, entre el sistema Kreuzer (fila superior) y el método y microscopio propuestos por la presente invención (fila inferior); y
Fig. 8 ilustra los resultados experimentales (por columnas) obtenidos con el método y microscopio propuestos por la presente invención y para dos zonas diferentes de una muestra biológica (esperma de cerdo) como objeto. La fila superior muestra el holograma RGB, la intermedia el resultado obtenido por el método Kreuzer aplicado al canal azul y sin producir la imagen de contraste (ecuación 3), y la inferior el resultado proporcionado por la presente invención.
Descripción detallada de la invención
Aparece necesario ofrecer una alternativa al estado de la técnica que cubra las lagunas halladas en el mismo, permitiendo obtener unas imágenes holográficas de mayor resolución y menor ruido, incluyendo las relativas a muestras dinámicas rápidas.
Con tal fin, la presente invención concierne, en un primer aspecto, a un método de reconstrucción holográfico basado en microscopía sin lentes en línea con múltiples longitudes de onda, que comprende, de manera en sí conocida:
- iluminar, de manera simultánea, un objeto con luz divergente que incluye al menos tres longitudes de onda; - registrar información holográfica de dicho objeto iluminado que incluye patrones de difracción generados por dicho objeto para dichas longitudes de onda, que son al menos tres; y
- obtener, por reconstrucción digital, una imagen holográfica compuesta a partir de al menos dicha información holográfica registrada.
A diferencia de los métodos conocidos en el estado de la técnica, el propuesto por el primer aspecto de la invención comprende, de manera característica, llevar a cabo dicha etapa de registro de información holográfica mediante el registro simultáneo para todas dichas longitudes de onda, que son al menos tres, de un holograma múltiple policromático, y obtener dicha imagen holográfica compuesta a partir de la información multiespectral incluida en dicho holograma múltiple policromático.
Con preferencia, el método comprende realizar dicha etapa de registro simultáneo en un solo disparo de la iluminación y con un único sensor digital policromático con sensibilidad a dichas tres o más longitudes de onda, para registrar un holograma múltiple policromático de única exposición, así como obtener dichos canales por separado a partir del sensor policromático, de manera que no se necesita realizar ningún escaneo de la imagen ni capturas simultáneas puesto que con un solo disparo de la iluminación se capturan las información de todos los canales de iluminación, lo que reduce significativamente el tiempo de captura de la muestra y por tanto la obtención de la imagen final. Además esta ventaja resulta fundamental para el análisis de muestras dinámicas puesto que con un solo disparo (captura en paralelo) no se pierde información de la muestra lo que si ocurre cuando se realizan capturas secuenciales o en serie.
Para un ejemplo de realización, dicho sensor digital tiene sensibilidad a dichas longitudes de onda, que son al menos tres, porque comprende una máscara o filtro o mosaico de celdillas con transmitancia espectral adaptada, comprendiendo el método la adaptación específica tanto de la transmitancia espectral como del número de celdillas de la máscara o filtro o mosaico a colocar sobre los píxeles del sensor digital al espectro y número de longitudes de onda elegidas para dicha etapa de iluminación simultánea, con el fin de que las celdillas transmitan en máximo el patrón de difracción proporcionado por cada una de las longitudes de onda de la iluminación. Por ejemplo, si la iluminación simultánea es una iluminación con RGB, el filtro Bayer tiene celdillas RGB con transmitancia espectral de cada celdilla adaptadas o sintonizadas a las lambdas RGB.
Para otro ejemplo de realización, para el que el sensor también dispone de dicha máscara, filtro o mosaico de celdillas, el método comprende utilizar una máscara, filtro o mosaico que carezcan de celdillas cuyas transmitancias espectrales estén adaptadas para transmitir en máximo el patrón de difracción proporcionado por al menos una de las longitudes de onda de la iluminación, pero que permitan el paso de al menos una porción de dicho patrón de difracción. Por ejemplo, si la iluminación simultánea es una iluminación con IR-R-B (usando el blu-ray como fuente de luz), es decir luz infrarroja, verde y azul, se puede utilizar un sensor digital, tal como un CCD, en color con un filtro Bayer cuyas celdillas RGB no tienen transmitancia espectral adaptada o sintonizada a las lambdas IR-R-B.
Para un ejemplo de realización preferido, el método comprende realizar únicamente dicha iluminación simultánea con dichas tres o más longitudes de onda sin requerir de iluminaciones adicionales del objeto.
El método propuesto por el primer aspecto de la invención comprende, según un ejemplo de realización preferido, para obtener dicha imagen holográfica compuesta, realizar un procesado digital de dicha información multiespectral relativa a al menos dichas tres longitudes de onda, e incluida en unos respectivos canales, que incluye realizar al menos una mezcla ponderada en el dominio de Fourier de los espectros correspondientes a cada longitud de onda.
Según un ejemplo de realización, el citado procesado digital comprende utilizar dicha información multiespectral para eliminar la contribución de la imagen virtual en la imagen holográfica compuesta.
De acuerdo con un ejemplo de realización, el holograma registrado es un único holograma multicromático o multiespectral, y el mencionado procesado digital incluye una primera etapa que comprende realizar de manera secuencial:
- una separación de la información correspondiente a cada longitud de onda incluida en dicho holograma multicromático o multiespectral, obteniendo al menos tres correspondientes hologramas monocromáticos, uno por longitud de onda o canal;
- una ecualización inicial o corrección de intensidad de los tres hologramas monocromáticos según la iluminación empleada para cada canal;
- una eliminación de contribuciones cruzadas no deseadas entre canales;
- una propagación digital y enfoque de cada canal por separado hasta el plano del objeto; y
- la citada mezcla ponderada en el dominio de Fourier de los espectros de al menos tres hologramas monocromáticos, una vez enfocados, para la generación de dicha imagen holográfica compuesta a partir de al menos tres canales.
Con el fin de obtener una imagen holográfica final de mayor calidad, en términos de resolución y ruido, preferentemente el procesado digital del método propuesto por el primer aspecto de la invención incluye también una segunda etapa de iteración de la fase que comprende realizar de manera secuencial y en bucle:
- una propagación digital de la imagen holográfica compuesta al plano de registro con las distancias de propagación previamente calculadas para cada canal, generando así al menos tres nuevos hologramas del objeto desenfocado;
- un almacenamiento o acumulación, en estos al menos tres nuevos hologramas generados, de la fase generada en la propagación digital para cada uno de los al menos tres canales, y una sustitución de la amplitud obtenida en la propagación digital para los al menos tres canales por la registrada inicialmente para cada uno de los al menos tres canales;
- una propagación digital de los al menos dichos tres nuevos hologramas hasta el plano del objeto, cada uno con su correspondiente distancia de propagación; y
- una mezcla ponderada en el dominio de Fourier de los espectros de los al menos tres nuevos hologramas para generar una nueva imagen holográfica compuesta que, en función de su resolución y ruido:
- se selecciona como imagen final, si la resolución es suficientemente alta y el ruido suficientemente bajo; o
- vuelve a introducirse en dicho bucle hasta que tenga una resolución y ruido determinados, es decir una resolución alta resolución y un ruido bajo.
Según un ejemplo de realización, el método comprende disponer al objeto más próximo a una fuente de luz con la que se realiza la iluminación del mismo, que a unos medios de registro con los que se realiza el registro del holograma multiespectral.
En función del ejemplo de realización, la tres o más longitudes de onda se encuentran en un espectro visible por el ojo humano (por ejemplo RGB) o, como mínimo una de las mismas se encuentra en un espectro no visible por el ojo humano, tal como el infrarrojo o el ultravioleta.
La presente invención extiende la aplicabilidad de la microscopía sin lentes a un mayor rango de objetos ya que es útil no solo para objetos poco difractivos (o esencialmente transparentes y con baja densidad o porcentaje de objetos en la muestra) sino con un mayor porcentaje de bloqueo de la luz (muestras más opacas y con mayor densidad o porcentaje de objetos en la muestra). Un segundo aspecto de la invención concierne a un microscopio holográfico sin lentes en línea basado en múltiples longitudes de onda, que comprende, de manera en sí conocida:
- medios de soporte configurados y dispuestos para soportar un objeto;
- medios de iluminación divergente configurados y dispuestos, en relación a dicho objeto soportado
> por dichos medios de soporte, para iluminar, de manera simultánea, dicho objeto con luz que incluye al menos tres longitudes de onda;
- medios de registro configurados y dispuestos, en relación a dicho objeto soportado por los medios de soporte, para registrar información holográfica de dicho objeto iluminado que incluye patrones de difracción generados por dicho objeto para dichas longitudes de onda, que son al menos tres; y
) - medios de procesamiento, en conexión con dichos medios de registro para recibir de los mismos al menos dicha información holográfica registrada, y configurados para obtener, por reconstrucción digital, una imagen holográfica compuesta a partir de dicha información holográfica registrada.
A diferencia de los microscopios holográficos sin lentes en línea basados en múltiples longitudes de onda conocidos, en el propuesto por el segundo aspecto de la invención, de manera característica:
> - dichos medios de registro están configurados y dispuestos para el registro simultáneo para todas dichas longitudes de onda, que son al menos tres, de un holograma múltiple policromático de dicho objeto iluminado; y porque dichos medios de procesamiento están configurados para obtener, por reconstrucción digital, dicha imagen holográfica compuesta a partir de la información ) multiespectral incluida en dicho holograma múltiple policromático.
Según un ejemplo de realización del microscopio del segundo aspecto de la invención, los medios de registro comprenden un único sensor digital con sensibilidad a las tres o más longitudes de onda y unos medios de control que controlan al sensor para realizar dicho registro de manera simultánea para todas las longitudes de onda, en un solo disparo de iluminación. i Según un ejemplo de realización preferido, los medios de registro comprenden un sensor digital con una máscara o filtro o mosaico de celdillas con transmitancia espectral adaptada a las longitudes de onda empleadas en la fuente de iluminación, tal como:
- una máscara de tipo Bayer sensible a las longitudes de onda rojo (R), verde (G), y azul (B) (mosaico 2x2 de celdillas con 2 filtros G, uno R y uno B, o cualquier otra combinación de filtros RGB); o - una máscara de tipo RGBE con sensibilidad espectral a las longitudes de onda RGBE, siendo E el denominado color esmeralda (mosaico 2x2 de celdillas con 1 filtro G, uno R, uno B y uno E); o
- una máscara de tipo CYM con sensibilidad espectral a las longitudes de onda cían (C), amarillo (Y) y magenta (M) (mosaico 2x2 de celdillas con 1 filtro C, dos Y, y uno M, o cualquier otra combinación de filtros CYM); o
- una máscara de tipo CYGM con sensibilidad espectral a las longitudes de onda cían (C), amarillo (Y), verde (G) y magenta (M) (mosaico 2x2 de celdillas con 1 filtro C, uno Y, uno G y uno M); o
- una máscara de tipo RGBW con sensibilidad espectral a las longitudes de onda (R), verde (G), azul (B) y blanco (W) (mosaico 2x2 de celdillas con 1 filtro R, uno G, uno B y uno W); o
- en general, una máscara que combine un mosaico compuesto por celdillas con transmitancia diferente para cada longitud de onda empleada en la fuente de iluminación (mosaico 2x2 o 3x3 o 4x4); o
- una máscara basada no en el sistema de mosaico de celdillas en paralelo (casos anteriores) sino de filtros apilados verticalmente como en el sistema Foveon X3 de Sigma Corporation.
Según un ejemplo de realización del microscopio propuesto por el segundo aspecto de la invención, tanto la transmitancia espectral como el número de celdillas de la máscara o filtro o mosaico, a colocar sobre los píxeles del sensor digital policromático, están adaptados específicamente al espectro y número de dichas tres o más longitudes de onda, con el fin de que las celdillas transmitan en máximo el patrón de difracción proporcionado por cada una de las longitudes de onda de la iluminación.
Según otro ejemplo de realización alternativo, la transmitancia espectral de las celdillas de la máscara o filtro o mosaico, a colocar sobre los píxeles del sensor digital policromático, permite el paso de la luz a las tres o más longitudes de onda, pero la máscara o filtro o mosaico carece de celdillas cuyas transmitancias espectrales estén adaptadas para transmitir en máximo el patrón de difracción proporcionado por al menos una de dichas tres o más longitudes de onda.
En general, los medios de iluminación divergentes comprenden una fuente puntual de luz compuesta por las tres o más longitudes de onda.
Según diferentes ejemplos de realización, dichos medios de iluminación divergentes comprenden:
- una fuente de iluminación multiespectral estenopeica (es decir tipo "pinhole"); o - tres o más fuentes de luz láser o de coherencia parcial, una por longitud de onda, acopladas a la entrada de una guía de fibra óptica con una salida configurada para proporcionar iluminación divergente para todas las longitudes de onda; o
- un sistema de iluminación basado en filtros dicroicos de combinación de tres o más longitudes de onda diferentes junto con sistemas ópticos de focalización de luz, como es el caso del sistema de iluminación de los cabezales de los lectores de discos "blu-ray"; o
- un sistema emisor láser de tres o más longitudes de onda ensamblados en un único soporte físico, como es el caso de algunas latas de diodo con capacidad de emisión en 405/660/780 nanómetros, y cualquier tipo de elementos (lentes, prismas, espejos...) redireccionadores de la luz para su apropiado manejo.
Para un ejemplo de realización del microscopio propuesto por el segundo aspecto de la invención, los medios de procesamiento implementan el procesado digital del método del primer aspecto.
Para otros ejemplos de realización, los medios de procesamiento del microscopio implementan un procesado digital según métodos alternativos al del primer aspecto.
Un tercer aspecto de la invención concierne a un programa de ordenador que incluye instrucciones de código que cuando se ejecutan en un ordenador implementan el procesado digital del método del primer aspecto.
Ejemplos experimentales
Ejemplo 1: Optimización de los sensores
En la Figura 2 se presenta un esquema de la invención propuesta. Esencialmente, una fuente puntual Pi que emite en múltiples (al menos 3) longitudes de onda (λι +λ2 +λ3 +...) ilumina un objeto O situado a una distancia Z de la fuente puntual de iluminación Pi y soportado por unos medios de soporte (no ilustrados). Así iluminado, el objeto O generará múltiples (al menos tres) patrones de difracción correspondientes con cada una de las longitudes de onda utilizadas. Cada uno de dichos patrones de difracción llegará al plano de registro (situado a una distancia L de la fuente puntual de iluminación Pi) donde un sensor digital Re con sensibilidad espectral a las múltiples (al menos 3) longitudes de onda registrará múltiples (al menos 3) hologramas en línea. La manera de conseguir que el sensor digital Re sea sensible a las múltiples (al menos 3) longitudes de onda es interponiendo una máscara o filtro o mosaico de celdillas con diferente transmitancia espectral sobre cada uno de los píxeles que integran el sensor digital (típicamente un CCD o un sensor CMOS). A modo de ejemplo, la Figura 2 incluye dos tipos máscaras (mosaicos de tramas de cuadrados con niveles de gris a la derecha del sensor digital Re) con celdillas de tipo 3x3 y 2x2 píxeles para el caso de 9 y 4 longitudes de onda de iluminación diferentes, respectivamente. De este modo, todos los píxeles con el mismo filtro de transmitancia definirán un canal del sensor digital con sensibilidad a una determinada longitud de onda de iluminación. En el mejor de los casos, cada una de las múltiples longitudes de onda excita única y
5 exclusivamente uno de los canales del sensor digital policromático Re de manera que extrayendo los píxeles relativos a cada canal se obtiene información por separado del holograma proporcionada por cada longitud de onda de iluminación. Cada uno de estos hologramas en línea sería equivalente al holograma proporcionado por el sistema Kreuzer aunque con diferente longitud de onda. En un caso más desfavorable, diferentes longitudes de onda excitan a la vez diferentes canales del sensor
D policromático Re y sería necesaria una etapa adicional de calibración para poder separar independientemente los canales del sensor policromático Re.
El sensor Re está asociado o incluye unos medios de control que lo controlan para realizar el registro de los múltiples hologramas en línea de manera simultánea para todas las longitudes de onda, en un solo disparo de iluminación.
5 Para un ejemplo de realización, el sensor policromático Re está constituido por una cámara o sensor CCD en color (sensibilidad RGB), el cual se trata de un sensor digital en el que se antepone pixel a pixel una máscara Bayer (celdilla de tipo 2x2 con 1 filtro R, dos filtros G y un filtro B) que filtra la información de color del patrón de difracción incidente sobre el CCD. De este modo, seleccionando las 3 longitudes de onda de la iluminación para que coincidan con los mínimos de transmisión espectral de cada canal
D complementario, es posible registrar en una única captura de iluminación los tres patrones de difracción proporcionados por el objeto O sin interferencia cruzada del resto de longitudes de onda.
No obstante, para otros ejemplos de realización:
• Ni las longitudes de onda tienen que ser específicamente en RGB.
• Ni tienen que ser tres longitudes de onda: se pueden utilizar 4 o más.
5 · Ni el CCD tiene que ser con máscara Bayer en RGB: se puede pensar en un filtro específico con sensibilidad en diferentes bandas espectrales).
• Ni es necesario sintonizar las longitudes de onda de iluminación con la sensibilidad espectral de los filtros de la máscara Bayer (pueden existir términos cruzados que se pueden eliminar mediante calibración previa).
0 · Ni la fuente de iluminación tiene que ser necesariamente un "pinhole" de iluminación: se pueden utilizar alternativamente láseres acoplados con fibra óptica y que sea el propio terminal de la fibra quien proporcione la iluminación divergente, o en sistemas basados en filtros dicroicos de combinación de diferentes longitudes de onda junto con sistemas ópticos (lentes, placas zonales, etc.) de focalización de luz.
Es decir, se trata de un sistema bastante flexible en su definición de hardware que no supone una única implementación experimental.
En cualquier caso, al final lo que se obtiene son múltiples (al menos 3) hologramas digitales correspondientes con las múltiples (al menos 3) longitudes de onda empleadas, donde cada uno de dichos hologramas por separado equivale completamente a un sistema Kreuzer. Sin embargo, el método y microscopio propuestos por la presente invención proporciona 3 sistemas Kreuzer simultáneamente, reunidos en un sistema completamente diferente a nivel hardware (emisión y detección policromática adaptada) y software (procesado diferente mediante mezcla ponderada de espectros y algoritmo de iteración de fase) del de Kreuzer, y que además soluciona el problema de las imágenes virtuales en holografía, ya que gracias al procesado digital empleado se elimina casi completamente la contribución de la imagen virtual.
A continuación, con referencia a la Fig. 3, se incluye la caracterización experimental del microscopio propuesto por el segundo aspecto de la invención, realizada en laboratorio por los presentes inventores, suponiendo una cámara CCD en RGB (indicada como Re), en comunicación con un sistema de procesamiento PC para el procesado de los datos proporcionados por la cámara (implementado en el programa Matlab de The MathWorks Inc.), y tres longitudes de onda de iluminación: λκ = 633 nm, λG = 532 nm, y λΒ = 405 nm, a una distancia L de la cámara CCD, iluminando un objeto O dispuesto a una distancia Z de la fuente de iluminación Ri. El esquema del sistema experimental así como algunos datos geométricos y características del sistema se incluyen en la Fig. 3 o bien se indican a continuación:
• Diámetro de "pinhole": 1 μιτι
• CCD: AVT 1394 Stingray F-145C, 1038 x 1038 píxels, 6,45 x 6,45 μιτι separación entre píxeles
• NAbes, (mejor apertura numérica) _ 0,16→ Res = 2,5 μιτι
• Distancias aproximadas: L= 21 mm, Z = 1 mm
• Magnificación: M = L/Z = 20
• FOV (campo de visión) = 350x350 μιτι2 El objeto O empleado en esta validación experimental ha sido un test de resolución ("USAF positive high-resolution test target") que proporciona detalles de objetos variables en tamaño para testear la resolución del sistema experimental. El holograma RGB proporcionado por el CCD en color así como la imagen proporcionada por cada uno de los tres canales se muestra en la Figura 4. Se puede ver que el holograma RGB proporcionado por el CCD en color (indicado en la Figura como "RGB HOLOGRAM") no proporciona una imagen enfocada del objeto y que extrayendo los pixeles rojos, verdes y azules por separado se pueden reconstruir tres imágenes diferentes monocromas (con diferente resolución) del objeto O (indicadas en la Figura respectivamente como R, G y B) tras aplicar el algoritmo de enfoque digital. En la obtención de las imágenes RGB ilustradas en la Fig. 4 no se han realizado los pasos correspondientes al procesado de la imagen de contraste ni a la corrección de la intensidad según la iluminación láser que se corresponden con las ecuaciones 3 y 4 del sistema Kreuzer (se ha pasado directamente de la ecuación 1 al objeto enfocado).
Tal y como se ha descrito en un apartado anterior, el procesado digital incluido en el método del primer aspecto de la invención (implementados por el microscopio y el programa de ordenador de, respectivamente, el segundo y el tercer aspectos) comprende, para un ejemplo de realización preferido, la realización de dos etapas que incluyen los siguientes pasos:
Primera etapa:
• En la primera etapa, se separan los tres canales correspondientes con las tres iluminaciones empleadas. En el caso descrito en el presente apartado, el holograma RGB se separa en las tres componentes RGB originando tres imágenes (hologramas) por separado.
• Se realiza un procesado digital que conlleva los siguientes pasos: o ecualización inicial de los tres hologramas según la forma de la iluminación empleada para cada canal (corrección de la intensidad según Kreuzer). o eliminación de contribuciones cruzadas no deseadas entre canales. Este paso es debido a que, en mayor o menor grado, todas las longitudes de onda contribuyen a todos los hologramas generados. Es decir, la longitud de onda verde contribuye a los canales azul y rojo, la azul a los canales rojo y verde, y la roja a los canales azul y verde. Por tanto, bien con las características teóricas del CCD en color o bien mediante calibración experimental, se pueden eliminar los términos cruzados para limpiar las imágenes iniciales. o propagación digital y enfoque de cada canal por separado hasta el plano del objeto (cada holograma necesita una distancia de propagación diferente para realizar su enfoque) o y mezcla ponderada de los espectros de los tres hologramas enfocados en el dominio de Fourier para la generación de una imagen única a partir de los tres canales.
Hasta aquí la primera etapa.
Segunda etapa:
En la segunda etapa se realiza un procesado en bucle de repetición tantas veces como sea necesario hasta que la imagen final posea una alta resolución y bajo ruido. La segunda etapa (algoritmo de iteración de fase) incluye los siguientes pasos: o propagación de la imagen única generada en la primera etapa al plano del sensor digital con las distancias de propagación previamente calculadas para cada canal. o de este modo, se generan tres nuevos hologramas del objeto desenfocado donde se acumula la fase originada en cada holograma debida a la propagación digital y se sustituye la amplitud por la raíz cuadrada de la intensidad del holograma correspondiente a dicho canal. o estos tres nuevos hologramas se vuelven a propagar digitalmente de nuevo hasta el plano del objeto (cada uno con su correspondiente distancia de propagación). o y se realiza de nuevo la mezcla ponderada de los espectros en dominio de Fourier para acabar generando una nueva/diferente imagen única que vuelve a ser la entrada de una nueva iteración del bucle.
Los diferentes pasos del procesado digital propuesto pueden seguirse a través de las Figuras 5 y 6.
La Figura 5 muestra las imágenes intermedias correspondientes a la primera etapa del procesado, donde se han indicado con las referencias A1-A6 las siguientes acciones:
Al: Obtención de las tres imágenes enfocadas correspondientes a los tres canales por separado. A2: Corrección de la intensidad según la iluminación de cada canal. A3: Eliminación de los términos cruzados entre canales. A4: Transformada de Fourier digital de cada canal. A5: Mezcla ponderada de espectros en plano de Fourier, asignando valores de ponderación de 0, 0,33, 0,5 y 1 a diferentes zonas de gris de la máscara indicada como Mp, para la obtención del espectro único Eu fruto de la combinación ponderada de los espectros de los tres canales.
A6: Generación de la imagen única entrada de la segunda etapa.
La Figura 6 muestra, en su vista derecha, la imagen final proporcionada por la segunda etapa en comparación con la imagen resultante de la primera etapa (vista izquierda).
Finalmente, y única y exclusivamente a modo comparativo, la Figura 7 muestra las imágenes obtenidas con el sistema Kreuzer (imágenes obtenidas de la publicación "J. Garcia-Sucerquia, W. Xu, S. K. Jericho, P. Klages, M. H. Jericho, and H. J. Kreuzer, "Digital in-line holographic microscopy," Appl. Opt. 45, 836- 850, 2006") cuando el objeto utilizado es un test de resolución análogo al empleado en la validación experimental de la presente invención utilizada en el presente apartado, y con una configuración experimental también muy parecida (diámetro del "pinhole" de iluminación: 0,5 μιη, longitud de onda: 408 nm, apertura numérica: 0,208).
Las imágenes A y D de la Figura 7 muestran los hologramas del test de resolución tanto para el sistema Kreuzer como para el de la presente invención, respectivamente. Puede observarse cómo el método y microscopio propuestos por la presente invención proporcionan un holograma RGB consecuencia de las tres longitudes de onda empleadas en la iluminación mientras que el sistema Kreuzer proporciona un holograma monocromo. La imagen A de la Figura 7 muestra el holograma de contraste (ecuación 3) del test de resolución para el sistema Kreuzer. Las imágenes B y C muestran los resultados obtenidos con el método Kreuzer siendo la imagen C una ampliación de la parte central de la imagen B. La imagen D de la Figura 7 muestra el holograma en color proporcionado por la presente invención y compuesto no por una única longitud de onda (como sería el caso del sistema Kreuzer y la imagen A) sino por suma de tres. La imagen E de la Figura 7 muestra el resultado proporcionado por el canal azul según la presente invención (diámetro del "pinhole" de iluminación: 1 μιη, longitud de onda: 405 nm, apertura numérica: 0,16) donde se observa cómo, salvo por no haber aplicado la ecuación 3, se obtiene una imagen muy similar a la proporcionada por el sistema Kreuzer. Y finalmente, la imagen F presenta de nuevo el resultado obtenido mediante la presente invención tras haber aplicado la segunda etapa. Puede observarse como, globalmente y por comparación con las imágenes C y E representativas del método Kreuzer, se ha reducido el ruido (menor variación del fondo de iluminación) y se ha mejorado el contraste (diferencia en nivel de gris entre el fondo y las barras horizontales y verticales del test de resolución) de la imagen resultante como consecuencia de la eliminación de la imagen virtual tras la aplicación del método propuesto. Adicionalmente, la invención propuesta se ha validado experimentalmente para una muestra biológica compuesta por esperma de cerdo. La figura 8 presenta algunas de las imágenes obtenidas con el sistema experimental propuesto, es decir con el microscopio de la presente invención, para dos zonas diferentes de la muestra biológica. La fila superior muestra el holograma RGB, la intermedia el resultado obtenido por el método Kreuzer aplicado al canal azul y sin producir la imagen de contraste (ecuación 3), y la inferior el resultado proporcionado por la presente invención. Nuevamente, podemos observar la mejora global en la calidad de la imagen finalmente obtenida en cuanto a ruido, contraste y homogeneidad en todo el campo objeto proporcionada por el método y sistema propuesto en comparación con el método y sistema Kreuzer.
Un experto en la materia podría introducir cambios y modificaciones en los ejemplos de realización descritos sin salirse del alcance de la invención según está definido en las reivindicaciones adjuntas.
Bibliografía
[1]: Lensless multispectral digital in-line holographic microscope, James P. Ryle, Susan McDonnell, John T. Sheridan, Journal of Biomedical Optics 16(12), 126004 (December 2011).
[2]: H. Juergen Kreuzer, Holographic microscope and method for holographic reconstruction, US 6,411,406.
[3]: Jorge Garcia-Sucerquia, Wenbo Xu, Stephan K. Jericho, Peter Klages, Manfred H. Jericho, and H. Jürgen Kreuzer, "Digital in-line holographic microscopy," Applied Optics 45, 836-850 (2006).
[4]: Jun-ichi Kato and Ichirou Yamaguchi, Tatsuki Matsumura, Multicolor digital holography with an achromatic phase shifter, August 15, 2002 / Vol. 27, No. 16 / OPTICS LETTERS.
[5]: Stanislas Leibler; Seppe Kuehn; Zak Frentz; Doeke Hekstra, HOLOGRAPHIC MICROSCOPE, US 8,049,814 B2.
[6]: Zak Frentz, Seppe Kuehn, Doeke Hekstra, and Stanislas Leibler, "Microbial population dynamics by digital in-line holographic microscopy," Review of Scientific Instruments 81, 084301 (2010).
[7]: Garcia-Sucerquia J., Color lensless digital holographic microscopy with micrometer resolution, Opt Lett. 2012 May 15;37(10):1724-6.
[8]: Alón Greenbaum, Alborz Feizi, Najva Akbari, and Aydogan Ozcan, "Wide-field computational color imaging using pixel super-resolved on-chip microscopy," Optics Express 21, 12469- 12483 (2013). [9]: Aydogan Ozcan, Anthony F. Erlinger, Ting-Wei Su, COMPACT AUTOMATED SEMEN ANALYSIS PLATFORM USING LENS-FREE ON-CHIP MICROSCOPY, US 2012/0148141 Al.
[10]: D. Gabor, "Microscopy by Reconstructed Wave-Fronts," Proc. R. Soc. Lond. A 197, 454-487, 1949.
[11] W. Xu, M. H. Jericho, I. A. Meinertzhagen, and H. J. Kreuzer, "Digital in-line holography for biological applications," Proc. Nati. Acad. Sci. USA 25, 11,301-311,2001.

Claims

REIVINDICACIONES
1. Método de reconstrucción holográfico basado en microscopía sin lentes en línea con múltiples longitudes de onda, que comprende:
- iluminar, de manera simultánea, un objeto (O) con luz divergente que incluye al menos tres longitudes de onda (λχ +λ2 +λ3 +...);
- registrar información holográfica de dicho objeto iluminado (O) que incluye patrones de difracción generados por dicho objeto (O) para dichas longitudes de onda (λι +λ2 +λ3 +...), que son al menos tres; y
- obtener, por reconstrucción digital, una imagen holográfica compuesta a partir de al menos dicha información holográfica registrada; estando el método caracterizado porque comprende llevar a cabo dicha etapa de registro de información holográfica mediante el registro simultáneo para todas dichas longitudes de onda (λα +λ2 +λ3 +...), que son al menos tres, de un holograma múltiple policromático, y obtener dicha imagen holográfica compuesta a partir de la información multiespectral incluida en dicho holograma múltiple policromático.
2. Método según la reivindicación 1 caracterizado porque comprende realizar dicha etapa de registro simultáneo en un solo disparo de la iluminación y con un único sensor digital (Re) con sensibilidad a dichas longitudes de onda (λα +λ2 +λ3 +...), que son al menos tres.
3. Método según la reivindicación 2, caracterizado porque dicho sensor digital (Re) tiene sensibilidad a dichas longitudes de onda (λι +λ2 +λ3 +...), que son al menos tres, porque comprende una máscara o filtro o mosaico de celdillas con transmitancia espectral adaptada, comprendiendo el método la adaptación específica tanto de la transmitancia espectral como del número de celdillas de la máscara o filtro o mosaico a colocar sobre los pixeles del sensor digital al espectro y número de longitudes de onda (λχ +λ2 +λ3 +...) elegidas para dicha etapa de iluminación simultánea, con el fin de que las celdillas transmitan en máximo el patrón de difracción proporcionado por cada una de las longitudes de onda (λχ +λ2 +λ3 +...) de la iluminación.
4. Método según la reivindicación 2, caracterizado porque dicho sensor digital (Re) tiene sensibilidad a dichas longitudes de onda (λχ +λ2 +λ3 +...), que son al menos tres, porque comprende una máscara o filtro o mosaico de celdillas con transmitancia espectral que permite el paso de la luz a dichas longitudes de onda (λι +λ2 +λ3 +...), pero que carece de celdillas cuyas transmitancias espectrales estén adaptadas para transmitir en máximo el patrón de difracción proporcionado por al menos una de las longitudes de onda de la iluminación (λι +λ2 +λ3 +...), que son al menos tres.
5. Método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque comprende realizar únicamente dicha iluminación simultánea con dichas longitudes de onda (λι +λ2 +λ3 +...), que son al menos tres, sin requerir de iluminaciones adicionales del objeto (O).
6. Método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque comprende, para obtener dicha imagen holográfica compuesta, realizar un procesado digital de dicha información multiespectral relativa a al menos dichas tres longitudes de onda (λ! +λ2 +λ3 +...), e incluida en unos respectivos canales, que incluye realizar al menos una mezcla ponderada en el dominio de Fourier de los espectros correspondientes a cada longitud de onda.
7. Método según la reivindicación 6, caracterizado porque dicho procesado digital comprende utilizar dicha información multiespectral para eliminar la contribución de la imagen virtual en dicha imagen holográfica compuesta.
8. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 6 ó 7, caracterizado porque dicho holograma registrado es un único holograma multicromático o multiespectral, y porque dicho procesado digital incluye una primera etapa que comprende realizar de manera secuencial:
- una separación de la información correspondiente a cada longitud de onda incluida en dicho holograma multicromático o multiespectral, obteniendo al menos tres correspondientes hologramas monocromáticos, uno por longitud de onda o canal;
- una ecualización inicial o corrección de intensidad de los tres hologramas monocromáticos según la iluminación empleada para cada canal;
- una eliminación de contribuciones cruzadas no deseadas entre canales;
- una propagación digital y enfoque de cada canal por separado hasta el plano del objeto; y
- dicha mezcla ponderada en el dominio de Fourier de los espectros de al menos tres hologramas monocromáticos, una vez enfocados, para la generación de dicha imagen holográfica compuesta a partir de al menos tres canales.
9. Método según la reivindicación 8, caracterizado porque dicho procesado digital incluye una segunda etapa que comprende realizar de manera secuencial y en bucle un algoritmo de iteración de fase:
- una propagación digital de dicha imagen holográfica compuesta al plano de registro con las distancias de propagación previamente calculadas para cada canal, generando así al menos tres nuevos hologramas del objeto desenfocado;
- un almacenamiento, en estos al menos tres nuevos hologramas generados, de la fase generada en la propagación digital para cada uno de los al menos tres canales, y una sustitución de la amplitud obtenida en la propagación digital para los al menos tres canales por la registrada inicialmente para cada uno de los al menos tres canales;
- una propagación digital de al menos dichos tres nuevos hologramas hasta el plano del objeto, cada uno con su correspondiente distancia de propagación; y
- una mezcla ponderada en el dominio de Fourier de los espectros de los tres nuevos hologramas para generar una nueva imagen holográfica compuesta que, en función de su resolución y ruido:
- se selecciona como imagen final; o
- vuelve a introducirse en dicho bucle hasta que tenga una resolución y ruido determinados.
10. Método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque comprende disponer a dicho objeto (O) más próximo a una fuente de luz (Pi) con la que se realiza dicha iluminación del mismo, que a unos medios de registro (Re) con los que se realiza dicho registro del holograma multiespectral.
11. Método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque dichas longitudes de onda (λι +λ2 +λ3 +...), que son al menos tres, se encuentran en un espectro visible por el ojo humano.
12. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizado porque al menos una de dichas longitudes de onda (λι +λ2 +λ3 +...), que son al menos tres, se encuentra en un espectro no visible por el ojo humano.
13. Microscopio holográfico sin lentes en línea basado en múltiples longitudes de onda, que comprende: - medios de soporte configurados y dispuestos para soportar un objeto (O);
- medios de iluminación divergente (Pi) configurados y dispuestos, en relación a dicho objeto (O) soportado por dichos medios de soporte, para iluminar, de manera simultánea, dicho objeto (O) con luz que incluye al menos tres longitudes de onda (λ: +λ2 +λ3 +...);
- medios de registro (Re) configurados y dispuestos, en relación a dicho objeto (O) soportado por los medios de soporte, para registrar información holográfica de dicho objeto iluminado (O) que incluye patrones de difracción generados por dicho objeto (O) para dichas longitudes de onda (λ: +λ2 +λ3 +...), que son al menos tres; y
- medios de procesamiento (PC), en conexión con dichos medios de registro (Re) para recibir de los mismos al menos dicha información holográfica registrada, y configurados para obtener, por reconstrucción digital, una imagen holográfica compuesta a partir de dicha información holográfica registrada; estando el microscopio caracterizado porque: dichos medios de registro (Re) están configurados y dispuestos para el registro simultáneo para todas dichas longitudes de onda (λ: +λ2 +λ3 +...), que son al menos tres, de un holograma múltiple policromático de dicho objeto iluminado (O); y porque dichos medios de procesamiento (PC) están configurados para obtener, por reconstrucción digital, dicha imagen holográfica compuesta a partir de la información multiespectral incluida en dicho holograma múltiple policromático.
14. Microscopio según la reivindicación 13, caracterizado porque dichos medios de registro (Re) comprenden un único sensor digital policromático con sensibilidad a dichas longitudes de onda (λ: +λ2 +λ3 +...), que son al menos tres, y unos medios de control que controlan al sensor digital policromático para realizar dicho registro simultáneo para todas las longitudes de onda, en un solo disparo de iluminación.
15. Microscopio según la reivindicación 13 ó 14, caracterizado porque dichos medios de procesamiento (PC) implementan el procesado digital del método según una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 9.
16. Microscopio según la reivindicación 14, caracterizado porque dichos medios de registro (Re) comprenden una máscara o filtro o mosaico de celdillas con transmitancia espectral adaptada a dichas longitudes de onda (λα +λ2 +λ3 +...), que son al menos tres, dispuesta o dispuesto frente a dicho sensor digital policromático.
17. Microscopio según la reivindicación 16, caracterizado porque tanto la transmitancia espectral como el número de celdillas de dicha máscara o filtro o mosaico, a colocar sobre los píxeles del sensor digital policromático, están adaptados específicamente al espectro y número de dichas longitudes de onda (λι +λ2 +λ3 +...), que son al menos tres, con el fin de que las celdillas transmitan en máximo el patrón de difracción proporcionado por cada una de las longitudes de onda (λ: +λ2 +λ3 +...) de la iluminación.
18. Microscopio según la reivindicación 16, caracterizado porque la transmitancia espectral de las celdillas de dicha máscara o filtro o mosaico, a colocar sobre los píxeles del sensor digital policromático, permite el paso de la luz a dichas longitudes de onda (λι +λ2 +λ3 +...), que son al menos tres, pero la máscara o filtro o mosaico carece de celdillas cuyas transmitancias espectrales estén adaptadas para transmitir en máximo el patrón de difracción proporcionado por al menos una de dichas longitudes de onda (λι +λ2 +λ3 +...), que son al menos tres.
19. Microscopio según una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 18, caracterizado porque dichos medios de iluminación divergente (Pi) comprenden una fuente puntual de luz compuesta por dichas longitudes de onda (λχ +λ2 +λ3 +...), que son al menos tres.
20. Microscopio según la reivindicación 19, caracterizado porque dichos medios de iluminación divergente (Pi) comprenden:
- una fuente de iluminación multiespectral estenopeica; o
- al menos tres fuentes de luz láser, una por longitud de onda, acopladas a la entrada de una guía de fibra óptica con una salida configurada para proporcionar iluminación divergente para todas las longitudes de onda, que son al menos tres; o
- un sistema de iluminación basado en filtros dicroicos de combinación de al menos tres diferentes longitudes de onda junto con sistemas ópticos de focalización de luz; o
- un sistema emisor láser de tres o más longitudes de onda ensamblados en un único soporte físico, como es el caso de algunas latas de diodo con capacidad de emisión en 405/660/780 nanómetros, y cualquier tipo de elementos redireccionadores de la luz para su apropiado manejo.
21. Programa de ordenador que incluye instrucciones de código que cuando se ejecutan en un ordenador implementan el procesado digital del método según una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 9.
PCT/ES2014/000135 2013-08-02 2014-07-25 Método de reconstrucción holográfico basado en microscopia sin lentes en línea con múltiples longitudes de onda, microscopio holográfico sin lentes en línea basado en múltiples longitudes de onda y programa de ordenador Ceased WO2015015023A1 (es)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
ESP201300750 2013-08-02
ES201300750A ES2537784B1 (es) 2013-08-02 2013-08-02 Método de reconstrucción holográfico basado en microscopía sin lentes en línea con múltiples longitudes de onda, microscopio holográfico sin lentes en línea basado en múltiples longitudes de onda y programa de ordenador

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2015015023A1 true WO2015015023A1 (es) 2015-02-05

Family

ID=52431045

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/ES2014/000135 Ceased WO2015015023A1 (es) 2013-08-02 2014-07-25 Método de reconstrucción holográfico basado en microscopia sin lentes en línea con múltiples longitudes de onda, microscopio holográfico sin lentes en línea basado en múltiples longitudes de onda y programa de ordenador

Country Status (2)

Country Link
ES (1) ES2537784B1 (es)
WO (1) WO2015015023A1 (es)

Cited By (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2016189257A1 (fr) 2015-05-28 2016-12-01 Commissariat à l'énergie atomique et aux énergies alternatives Procédé d'observation d'un échantillon
FR3056749A1 (fr) * 2016-09-28 2018-03-30 Commissariat A L'energie Atomique Et Aux Energies Alternatives Procede de numeration de leucocytes dans un echantillon
EP3339963A1 (en) 2016-12-21 2018-06-27 IMEC vzw An apparatus and a method for in-line holographic imaging
CN109074025A (zh) * 2016-03-23 2018-12-21 原子能和替代能源委员会 用于表征样本中的颗粒的全息方法
CN110836867A (zh) * 2019-10-18 2020-02-25 南京大学 一种基于卷积神经网络的无透镜全息显微微粒表征方法
CN111273533A (zh) * 2019-09-27 2020-06-12 中国工程物理研究院激光聚变研究中心 一种同轴数字全息自动聚焦方法及系统
US11373278B2 (en) 2016-09-30 2022-06-28 University Of Utah Research Foundation Lensless imaging device
WO2024123803A1 (en) * 2022-12-05 2024-06-13 Macula Vision Systems, Inc. Holographic optical system and method for automatic imaging and interpretation of biological samples
CN118295225A (zh) * 2024-06-06 2024-07-05 南昌大学 一种双通道先验约束的多距离无透镜数字全息重建方法
US12528262B2 (en) 2020-06-29 2026-01-20 Transitions Optical, Ltd. System for marking a coated ophthalmic lens

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3695744A (en) * 1971-01-14 1972-10-03 Rca Corp Holographic multicolor technique
US20120148141A1 (en) * 2010-12-14 2012-06-14 Aydogan Ozcan Compact automated semen analysis platform using lens-free on-chip microscopy

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3695744A (en) * 1971-01-14 1972-10-03 Rca Corp Holographic multicolor technique
US20120148141A1 (en) * 2010-12-14 2012-06-14 Aydogan Ozcan Compact automated semen analysis platform using lens-free on-chip microscopy

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
GARCÍA-SUCERQUIA, J. ET AL.: "Microscopia holográfica digital sin lentes: una herramienta para estudiar el micromundo en cuatro dimensiones", DYNA, vol. 79, no. 175, October 2012 (2012-10-01), pages 29 - 37 *
RYLE, J. ET AL.: "Lensless multispectral digital in-line holographic microscope", J. BIOMED. OPT., vol. 16, no. 12, December 2011 (2011-12-01), pages 1 - 17, XP009189853 *
RYLE, J. ET AL.: "Multispectral lensless digital holographic microscope: imaging MCF-7 and MDA-MB-231 cancer cell cultures", PROC. OF SPIE, vol. 7442, no. 744206, 2009, pages 1 - 11 *

Cited By (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR3036800A1 (fr) * 2015-05-28 2016-12-02 Commissariat Energie Atomique Procede d’observation d’un echantillon
WO2016189257A1 (fr) 2015-05-28 2016-12-01 Commissariat à l'énergie atomique et aux énergies alternatives Procédé d'observation d'un échantillon
US20180210395A1 (en) * 2015-05-28 2018-07-26 Commissariat A L'energie Atomique Et Aux Energies Alternatives Method for observing a sample
US10564602B2 (en) 2015-05-28 2020-02-18 Commissariat A L'energie Atomique Et Aux Energies Alternatives Method for observing a sample
CN109074025A (zh) * 2016-03-23 2018-12-21 原子能和替代能源委员会 用于表征样本中的颗粒的全息方法
FR3056749A1 (fr) * 2016-09-28 2018-03-30 Commissariat A L'energie Atomique Et Aux Energies Alternatives Procede de numeration de leucocytes dans un echantillon
WO2018060589A1 (fr) 2016-09-28 2018-04-05 Commissariat à l'énergie atomique et aux énergies alternatives Procédé de numération de leucocytes dans un échantillon
US11373278B2 (en) 2016-09-30 2022-06-28 University Of Utah Research Foundation Lensless imaging device
EP3339963A1 (en) 2016-12-21 2018-06-27 IMEC vzw An apparatus and a method for in-line holographic imaging
US10684589B2 (en) 2016-12-21 2020-06-16 Imec Vzw Apparatus and method for in-line holographic imaging
CN111273533A (zh) * 2019-09-27 2020-06-12 中国工程物理研究院激光聚变研究中心 一种同轴数字全息自动聚焦方法及系统
CN111273533B (zh) * 2019-09-27 2021-08-06 中国工程物理研究院激光聚变研究中心 一种同轴数字全息自动聚焦方法及系统
CN110836867A (zh) * 2019-10-18 2020-02-25 南京大学 一种基于卷积神经网络的无透镜全息显微微粒表征方法
US12528262B2 (en) 2020-06-29 2026-01-20 Transitions Optical, Ltd. System for marking a coated ophthalmic lens
WO2024123803A1 (en) * 2022-12-05 2024-06-13 Macula Vision Systems, Inc. Holographic optical system and method for automatic imaging and interpretation of biological samples
CN118295225A (zh) * 2024-06-06 2024-07-05 南昌大学 一种双通道先验约束的多距离无透镜数字全息重建方法

Also Published As

Publication number Publication date
ES2537784A1 (es) 2015-06-12
ES2537784B1 (es) 2016-04-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2015015023A1 (es) Método de reconstrucción holográfico basado en microscopia sin lentes en línea con múltiples longitudes de onda, microscopio holográfico sin lentes en línea basado en múltiples longitudes de onda y programa de ordenador
KR102394823B1 (ko) 하이브리드 분광 이미저
Tahara et al. Roadmap of incoherent digital holography
CN110178069B (zh) 显微镜设备、方法和系统
Quirin et al. Simultaneous imaging of neural activity in three dimensions
US12411088B2 (en) Optimized photon collection for light-sheet microscopy
US20230106701A1 (en) Multiple camera microscope imaging with patterned illumination
US20150362713A1 (en) Rapid adaptive optical microscopy over large multicellular volumes
CN111426381A (zh) 一种基于超构透镜阵列的超紧凑型光谱光场相机系统
CN106164784B (zh) 数字全息设备
JP5796191B2 (ja) 撮像システム
US20140055661A1 (en) Imaging device and imaging system
US20150077842A1 (en) High-resolution scanning microscopy
JPWO2012002207A1 (ja) 偏光イメージング装置および偏光イメージング方法
US10900900B2 (en) Structured illumination microscope, observation method, and storage medium
Granero et al. Single-exposure super-resolved interferometric microscopy by RGB multiplexing in lensless configuration
Mukhtar et al. Compact Spectral Imaging: A review of miniaturized and integrated systems
WO2021177446A1 (en) Signal acquisition apparatus, signal acquisition system, and signal acquisition method
Zhang et al. Using symmetric illumination and color camera to achieve high throughput Fourier ptychographic microscopy
CN116973315A (zh) 基于光谱复用的傅里叶叠层显微的高光谱成像装置及方法
Zhang et al. Three-dimensional light field microscope based on a lenslet array
Shepard et al. Optical design and characterization of an advanced computational imaging system
Tamm et al. Super-Resolution Correlating Optical Endoscopy
CN114730067B (zh) 显微镜装置、分光器和显微镜系统
CN104516097B (zh) 光学成像系统

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 14831597

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 14831597

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1