WO2015034056A1 - アフィニティー分離マトリックス用分離能強化リガンド - Google Patents

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    • C07K1/22—Affinity chromatography or related techniques based upon selective absorption processes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies

Definitions

  • the antibody drugs that have been developed are basically monoclonal antibodies, and are produced in large quantities using recombinant cultured cell technology.
  • “Monoclonal antibody” refers to an antibody obtained from a clone derived from a single antibody-producing cell.
  • Most antibody drugs currently on the market are immunoglobulin G (IgG) subclass in terms of molecular structure.
  • Protein A is one of the cell wall proteins produced by the Gram-positive bacterium Staphylococcus aureus.
  • Signal sequence S five immunoglobulin binding domains (E domain, D domain, A domain, B) Domain, C domain) and an XM region which is a cell wall binding domain (Non-patent Document 1).
  • an affinity chromatography column in which protein A is immobilized as a ligand on a water-insoluble carrier is generally used (Non-patent Documents 1 and 2). .
  • the present invention also relates to an immunoglobulin G-binding peptide having a plurality of domains in which two or more of the immunoglobulin G-binding peptides are linked.
  • the present invention also relates to a method for producing an improved affinity purification ligand, which comprises a step of improving the cation exchange capacity by increasing the number of acidic amino acids in the amino acid sequence of the affinity purification ligand.
  • the increase in the number of acidic amino acids is preferably due to substitution mutations and / or addition of acidic amino acids.
  • the affinity purification ligand is an immunoglobulin G-binding domain of protein A, protein G, or protein L.
  • the increase in the number of acidic amino acids is preferably an increase of 3 or more.
  • the increase in the number of acidic amino acids is preferably an increase of 4 or more.
  • the immunoglobulin G (IgG) binding domain of protein A is any one of the E, D, A, B, and C domains of protein A, and the amino acid sequence derived therefrom.
  • Each domain has a high sequence identity with each other and can be aligned. For example, it can be confirmed by Clustal (http://www.clustal.org/omega/), which is a program for amino acid sequence multiple alignment.
  • Clustal http://www.clustal.org/omega/
  • the residue corresponding to position 31 in the C domain corresponds to position 31 in the A and B domains, corresponds to position 29 in the E domain, and position 34 in the D domain.
  • the amino acid to be substituted, inserted, deleted and / or added is the amino acid sequence of the C domain shown in SEQ ID NO: 1 or the Z domain shown in SEQ ID NO: 2. 1st, 2nd, 3rd, 4th, 6th, 23rd, 29th, 33rd, 35th, 36th, 37th, 42nd, One or more amino acids selected from the group consisting of the 49th, 50th, 57th, and 58th amino acids are preferred.
  • the immunoglobulin G-binding peptide of (3) has 80% or more sequence identity to the amino acid sequence of the immunoglobulin G-binding peptide of (1).
  • the acidic amino acid introduced in the immunoglobulin G-binding peptide of (1) above is maintained without further modification.
  • amino acids other than the acidic amino acid introduced in the immunoglobulin G-binding peptide of (1) are: It may be modified.
  • These multimers may be a homopolymer such as a homodimer or homotrimer that is a linked body of a single immunoglobulin G-binding domain, or a heteropolymer that is a linked body of a plurality of types of immunoglobulin G-binding domains. It may be a heteropolymer such as a dimer or heterotrimer.
  • the present invention also relates to a DNA comprising a base sequence encoding the above immunoglobulin G-binding peptide.
  • the base sequence may be any one in which the amino acid sequence obtained by translating the base sequence constitutes an immunoglobulin G-binding peptide.
  • Such a base sequence can be obtained by using a commonly used known method, for example, a polymerase chain reaction (hereinafter abbreviated as PCR) method. It can also be synthesized by a known chemical synthesis method, and can also be obtained from a DNA library.
  • the base sequence is not limited to the wild-type base sequence as long as the codon may be replaced with a degenerate codon and it encodes the same amino acid when translated.
  • a genetically modified organism can be obtained using the DNA, and a cell-free protein synthesis system using the DNA as a template DNA for transcription can also be obtained.
  • a DNA encoding a multimeric protein can be prepared by linking a desired number of DNAs encoding the monomer protein (one domain) in series.
  • an appropriate restriction enzyme site is introduced into a DNA sequence, and double-stranded DNA fragmented with a restriction enzyme can be ligated with DNA ligase.
  • the transformed cell of the present invention can be obtained by introducing the recombinant vector of the present invention into a host cell.
  • methods for introducing recombinant DNA into a host include a method using calcium ions, an electroporation method, a spheroplast method, a lithium acetate method, an Agrobacterium infection method, a particle gun method, or a polyethylene glycol method.
  • examples of a method for expressing the function of the obtained gene in a host include a method for incorporating the gene obtained in the present invention into a genome (chromosome).
  • the protein of the present invention is produced by culturing the above-described transformed cells in a medium, and producing and accumulating the protein of the present invention in the cultured cells (including the cell periplasm region) or in the culture solution (outside the cells). And the desired protein can be collected from the culture.
  • the protein of the present invention is obtained by culturing the above-described transformed cell in a medium, and in the cultured cell (including the cell periplasm region) or in the culture solution (outside the cell).
  • LB medium tryptone 1%, yeast extract 0.5%, NaCl 1%
  • 2xYT medium tryptone 1.6%, yeast extract 1 0.0%, NaCl 0.5%) and the like.
  • TM medium peptone 1%, meat extract 0.5%, yeast extract 0.2%, glucose 1%, pH 7.0
  • 2SL medium peptone 4%, yeast extract 0.5%, glucose 2%, pH 7.2
  • the culture temperature is 15 to 42 ° C., preferably 20 to 37 ° C.
  • the protein of the present invention is cultured in the cultured cells (in the periplasm region) by aerobically culturing for several hours to several days under aeration and stirring conditions. Or accumulated in a culture solution (extracellular) and collected. In some cases, the culture may be performed anaerobically by blocking aeration.
  • the assembly produced by separating the cultured cells and the supernatant containing the secreted protein by a general separation method such as centrifugation or filtration after the completion of the culture. The replacement protein can be recovered.
  • the cells when accumulated in cultured cells (including in the periplasm region), for example, the cells are collected from the culture solution by a method such as centrifugation or filtration, and then the cells are sonicated.
  • the protein accumulated and produced in the cells can be recovered by crushing by a French press method and / or solubilizing by adding a surfactant or the like.
  • introducing a reactive functional group a method of immobilizing by performing a coupling reaction with a compound to be immobilized as a ligand, a condensation reagent such as carbodiimide in a system in which a compound to be immobilized as a carrier and a ligand exists, or
  • the immobilization method include addition of a reagent having a plurality of functional groups in the molecule such as glutaraldehyde, condensation, and crosslinking.
  • the present invention will be described in more detail based on examples, but the present invention is not limited to these examples.
  • the various proteins obtained in the examples are described in the form of “alphabet showing domain-introduced mutation (Wild in wild type)”.
  • the wild type C domain of protein A is expressed as “C-wild”
  • the C domain mutant introduced with mutation G29A is expressed as “C-G29A”.
  • the notation of the mutant in which two kinds of mutations are introduced at the same time is written together using a slash.
  • the C domain mutant into which the mutation G29A and the mutation S33E have been introduced are represented in the form of “C-G29A / S33E”.
  • Comparative Example (0) C-G29A / S33E.
  • the preparation method of the expression vector for producing 1d is illustrated.
  • the base sequence encoding the peptide (SEQ ID NO: 7) is C-G29A / S33E.
  • Back translation was performed from the amino acid sequence of 1d (SEQ ID NO: 3) and designed.
  • the DNA encoding 1d was prepared by ligating two types of double-stranded DNAs (f1 and f2) with restriction enzymes and then ligating them, and inserting them into the multicloning site of the expression vector.
  • coding DNA was prepared and inserted into the vector simultaneously by three-fragment ligation in which three types of double-stranded DNA consisting of two types of double-stranded DNA and an expression vector were mixed and ligated.
  • the expression vector was extracted from the transformant using a plasmid purification kit (Promega, “Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification System”) according to the standard protocol attached to the kit.
  • a plasmid purification kit Promega, “Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification System”
  • the DNA encoding the C domain mutant of (1) to (3) above is also designed by reverse translation from the amino acid sequence to design a base sequence encoding the peptide, and containing the encoding DNA in the same manner as described above A transformant was prepared.
  • the coding DNA sequence of the C domain variant of (1) to (3) and the sequence number of the single-stranded oligo DNA (f1-1, f1-2, f2-1, f2-2) used for its synthesis The combinations are listed in Table 5.
  • the DNA encoding the peptide of the present invention has a length of about 200 bases (a protein of about 60 residues can be encoded), it can also be totally synthesized by outsourcing (for example, Eurogentec).
  • Example 3 Affinity evaluation of the obtained various C domain mutants with human IgG
  • the peptide obtained in Example 2 using a biosensor Biacore 3000 (GE Healthcare Bioscience) utilizing surface plasmon resonance was analyzed for the affinity with immunoglobulin.
  • a human immunoglobulin G preparation (hereinafter referred to as human IgG) fractionated from human plasma was immobilized on a sensor chip, and each peptide was allowed to flow on the chip to detect the interaction between them.
  • Immobilization of human IgG on the sensor chip CM5 is carried out by an amine coupling method using N-hydroxysuccinimide (NHS) and N-ethyl-N ′-(3-dimethylaminopropyl) carbohydrate hydride (EDC). Ethanolamine was used for the sensor chip (all sensor chips and immobilization reagents were manufactured by GE Healthcare Bioscience).
  • the human IgG solution was prepared by dissolving gamma globulin (Nichiyaku) in a standard buffer (20 mM NaH 2 PO 4 -Na 2 HPO 4 , 150 mM NaCl, pH 7.4) at 1.0 mg / mL.

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Abstract

本発明は、アフィニティー精製の主要目的である抗体自体の高純度化と共に、抗体単量体の選択性を向上させ、抗体多量体の除去に関し後段の精製工程への負荷を低減できるアフィニティーリガンドを創出する。本発明は、新規アフィニティーリガンドとして、タンパク質のアミノ酸配列中の酸性アミノ酸数が増加するように変異を導入した改変タンパク質、該タンパク質の設計方法、該タンパク質の製造方法、および、該タンパク質をリガンドとして固定化したアフィニティー分離マトリックスを提供する。

Description

アフィニティー分離マトリックス用分離能強化リガンド
本発明は、抗体に特異的に結合するタンパク質、該タンパク質をリガンドとして固定化したアフィニティー分離マトリックス、および、該マトリックスを用いた抗体誘導体の分離精製に関する方法に関する。
タンパク質の重要な機能の一つとして、特定の分子に特異的に結合する機能が挙げられる。この機能は、生体内における免疫反応やシグナル伝達に重要な役割を果たす。一方、この機能を有用物質の分離精製に利用する技術開発も盛んになされている。実際に産業的に利用されている一例として、抗体医薬を動物細胞培養物から一度に高い純度で精製（キャプチャリング）するために利用される、プロテインＡアフィニティー分離マトリックスが挙げられる。
抗体医薬として開発されているのは、基本的にモノクローナル抗体であり、組換え培養細胞技術等を用いて大量に生産されている。「モノクローナル抗体」とは、単一の抗体産生細胞に由来するクローンから得られた抗体を指す。現在上市されている抗体医薬のほとんどは、分子構造的には免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）サブクラスである。プロテインＡは、グラム陽性細菌スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ）によって生産される細胞壁タンパク質の１種であり、シグナル配列Ｓ、５つの免疫グロブリン結合性ドメイン（Ｅドメイン、Ｄドメイン、Ａドメイン、Ｂドメイン、Ｃドメイン）、および、細胞壁結合ドメインであるＸＭ領域から構成されている（非特許文献１）。抗体医薬製造工程における初期精製工程（キャプチャー工程）には、プロテインＡがリガンドとして水不溶性担体に固定化された、アフィニティークロマトグラフィー用カラムが一般的に利用されている（非特許文献１～２）。
プロテインＡアフィニティー分離マトリックスの性能を改良するために、様々な技術開発がなされてきた。リガンドの側面からの技術開発も進んでいる。最初は天然型のプロテインＡがリガンドとして利用されてきたが、タンパク質工学的に改変を加えた組み換えプロテインＡをリガンドとして、カラムの性能を改良する技術も多く存在する。特に、プロテインＡの改変により、酸性溶液を用いてプロテインＡアフィニティー分離マトリックスに吸着させた抗体を溶出する工程で、溶出ｐＨを中性側にシフトさせる技術が開発されてきた（特許文献１～５）。抗体は酸性条件では損傷を受け、多量体（凝集体）が生成されることがあるが、溶出ｐＨを中性側にシフトさせれば、このような多量体の生成を抑制することができる。
抗体多量体は副作用や薬効低減を誘発するので、抗体医薬の製造において抗体多量体を除去することは重要である。抗体多量体は、先述のプロテインＡアフィニティー精製の工程だけでなく、細胞培養から製剤までの様々な工程で生じる。プロテインＡアフィニティー分離マトリックスは、抗体に対して高い結合特異性を示す一方で、単量体と多量体の分離能は高くはなく、抗体多量体はより後段の精製プロセスで除去するのが一般的である（非特許文献３）。先述のプロテインＡ改変技術（特許文献１～５）も、抗体の単量体と多量体の分離能の改変は意図されていない。
米国特許出願公開第２００６／０１９４９５０号明細書 国際公開第２０１０／１１０２８８号 国際公開第２０１１／１１８６９９号 特開２０１０－０８１８６６号公報 特表２０１２－５１５１６０号公報
Ｈｏｂｅｒ　Ｓ．他著、「Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂ」２００７年、８４８巻、４０－４７頁 Ｌｏｗ　Ｄ．他著、「Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂ」、２００７年、８４８巻、４８－６３頁 Ｖａｚｑｕｅｚ－Ｒｅｙ　Ｍ．他著、「Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．」２０１１年、１０８巻、１４９４－１５０８頁
抗体医薬品の生産において、培養、精製、および、製剤化過程を通して、形成または残留する、抗体多量体（凝集体）の低減が重要課題となっている。抗体多量体の形成抑制や除去のため、培養、精製、製剤化段階で、複雑な管理が行われ、添加剤が使用される。しかし、それより上流の工程で生成する抗体多量体が、収率や生産性に影響を及ぼすことから、上流工程において、簡便で効率的に抗体多量体を除去する技術が求められている。
本発明が解決しようとする課題は、アフィニティー精製の主要目的である抗体自体の高純度化と共に、抗体単量体に対する選択性を向上させ、抗体多量体を除去してその後の精製工程への負荷を低減できる新規アフィニティー精製用リガンドを創出することである。
本発明者らは、上記の課題を解決すべく、プロテインＡのＩｇＧ結合性ドメインをモデルタンパク質として、該タンパク質のアミノ酸配列中の酸性アミノ酸数を増加させた変異体を設計することにより、本発明を完成させるに至った。具体的には、プロテインＡのアミノ酸配列中において、アフィニティー精製の対象となる物質（この場合はＩｇＧ）に対する特異的な相互作用には影響を与えず、かつ、酸性アミノ酸を導入した場合に側鎖のカルボキシル基（陽イオン性交換基）がアフィニティー精製の対象となる物質への相互作用に影響を与えやすい部位を特定した。そして、それらのアミノ酸（単残基または多残基）を酸性アミノ酸に置換変異した変異体を設計した。
すなわち、本発明は、下記（１）～（３）のいずれかの免疫グロブリンＧ結合性ペプチド：
（１）配列番号１のアミノ酸配列、または配列番号２のアミノ酸配列において、第７位、第１８位、第３９位、第４０位、第４６位、第５４位、および、第５５位のアミノ酸からなる群から選択される１以上のアミノ酸が、酸性アミノ酸に置換されているアミノ酸配列を有する免疫グロブリンＧ結合性ペプチド；
（２）上記（１）のアミノ酸配列において、さらに第７位、第１８位、第３９位、第４０位、第４６位、第５４位、および、第５５位のアミノ酸以外の、１または数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失および／または付加されているアミノ酸配列を有する免疫グロブリンＧ結合性ペプチド；
（３）上記（１）のアミノ酸配列に対して８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する免疫グロブリンＧ結合性ペプチド（但し、上記（１）において置換により導入された酸性アミノ酸は維持されるものとする）
に関する。
前記酸性アミノ酸が、側鎖にカルボキシル基を有する酸性アミノ酸であることが好ましい。
前記側鎖にカルボキシル基を有する酸性アミノ酸が、アスパラギン酸またはグルタミン酸であることが好ましい。
前記酸性アミノ酸に置換されるアミノ酸が、第７位、第１８位、第４０位、第４６位、および、第５５位のアミノ酸からなる群から選択される１以上のアミノ酸であることが好ましい。
前記置換、挿入、欠失および／または付加されるアミノ酸が、第１位、第２位、第３位、第４位、第６位、第２３位、第２９位、第３３位、第３５位、第３６位、第３７位、第４２位、第４９位、第５０位、第５７位、および、第５８位のアミノ酸からなる群から選択される１以上のアミノ酸であることが好ましい。
前記置換、挿入、欠失および／または付加されるアミノ酸が、第２９位、第３３位、第３６位、および、第３７位のアミノ酸からなる群から選択される１以上のアミノ酸であることが好ましい。
２以上のアミノ酸が酸性アミノ酸に置換されていることが好ましい。
３以上のアミノ酸が酸性アミノ酸に置換されていることが好ましい。
４以上のアミノ酸が酸性アミノ酸に置換されていることが好ましい。
また、本発明は、前記免疫グロブリンＧ結合性ペプチドを２個以上連結した複数ドメインを有する、免疫グロブリンＧ結合性ペプチドに関する。
また、本発明は、前記免疫グロブリンＧ結合性ペプチドをコードする塩基配列を含むＤＮＡに関する。
また、本発明は、前記ＤＮＡを含むベクターに関する。
また、本発明は、前記ベクターを宿主細胞に導入して得られる形質転換体に関する。
また、本発明は、前記免疫グロブリンＧ結合性ペプチドを水不溶性担体に固定化して得られるアフィニティー分離マトリックスに関する。
また、本発明は、免疫グロブリンＧまたは免疫グロブリンＧ誘導体を前記アフィニティー分離マトリックスと接触させる工程、および、アフィニティー分離マトリックスに結合した免疫グロブリンＧまたは免疫グロブリンＧ誘導体を、アフィニティー分離マトリックスから分離する工程を含む、免疫グロブリンＧまたは免疫グロブリンＧ誘導体の製造方法に関する。
また、本発明は、アフィニティー精製用リガンドのアミノ酸配列中の酸性アミノ酸数を増加させることにより、陽イオン交換能を向上させる工程を含む、改良型アフィニティー精製用リガンドの製造方法に関する。
酸性アミノ酸数の増加が、酸性アミノ酸への置換変異、および／または酸性アミノ酸の付加によるものであることが好ましい。
前記アフィニティー精製の対象が、免疫グロブリンＧまたは免疫グロブリンＧ誘導体であることが好ましい。
前記アフィニティー精製用リガンドが、プロテインＡ、プロテインＧ、または、プロテインＬの免疫グロブリンＧ結合性ドメインであることが好ましい。
前記酸性アミノ酸数の増加が、２以上の増加であることが好ましい。
前記酸性アミノ酸数の増加が、３以上の増加であることが好ましい。
前記酸性アミノ酸数の増加が、４以上の増加であることが好ましい。
本発明のペプチドをリガンドとして担体に固定化して得られるアフィニティー分離マトリックスは、酸性条件下において、精製対象の物質と該リガンドとの特異的な結合が弱くなる（無くなる）が、同時に（または連続的に）陽イオン性交換基であるカルボキシル基との相互作用が（協奏的に）働くことが期待できる。
本発明のペプチドが、プロテインＡ変異体である場合について詳述する。抗体をアフィニティー分離マトリックスに添加する中性ｐＨの生理的条件下においては、プロテインＡが本来有する、抗体（のＦｃ領域）への強い特異的結合により、抗体がマトリックスに保持される。抗体との特異的相互作用面から離れた位置のカルボキシル基は、抗体との静電的な非特異相互作用をするポテンシャルを有するが、中性ｐＨの生理的条件下では、抗体とリガンドとの特異的作用にはほとんど影響しない。しかし、抗体を溶出する酸性条件下では、この特異的結合が減弱され、抗体がリガンドから解離するため、リガンド中のカルボキシル基による、抗体との静電的な非特異相互作用の影響が相対的に強くなる。このカルボキシル基は、別の視点から見ると、アフィニティー分離マトリックスにタンパク質を介して固定化された陽イオン性交換基と捉えることができる。
したがって、本発明のペプチドをリガンドとして担体に固定化して得られるアフィニティー分離マトリックスは、酸性溶液による抗体溶出時に、イオン強度依存的な溶出挙動がより顕著になることが期待される。本発明のアフィニティー分離マトリックスにより、陽イオン交換クロマトグラフィーで見られる抗体の単量体と多量体の分離（非特許文献３）を実現でき、アフィニティー精製工程において、単量体と多量体を高度に分離することが可能となる。
また、本発明のアフィニティー分離マトリックスは、従来の、カルボキシル基とタンパク質リガンドを個別にマトリックスに固定化する方法、および、カルボキシル基が固定化されたマトリックス（陽イオン交換樹脂）とアフィニティー分離マトリックスを個別に混合する方法に対して、以下に述べる点で優れている。
すなわち、本発明の免疫グロブリンＧ結合性ペプチドは、従来の方法と異なり、マトリックスの単位体積中におけるタンパク質リガンドの含有量が損なわれないため、目的物質の高い結合容量を維持することが可能である。さらに、アフィニティー分離用マトリックスの製造プロセスにおいて、従来の方法では２種のリガンドまたはマトリックスの比率を制御する必要があるのに対し、本発明の免疫グロブリンＧ結合性ペプチドを使用すると、単一のリガンドを単一のマトリックスに固定化すればよく、製造プロセスの管理が容易である。
実施例２に係る、発現ベクターの調製方法に関する図である。 実施例４に係る、各種変異体の陰イオン交換クロマトグラフィー・プロファイルを重ね合わせた図である。
本発明は、下記（１）～（３）のいずれかの免疫グロブリンＧ結合性ペプチドである：
（１）配列番号１のアミノ酸配列、または配列番号２のアミノ酸配列において、第７位、第１８位、第３９位、第４０位、第４６位、第５４位、および、第５５位のアミノ酸からなる群から選択される１以上のアミノ酸が、酸性アミノ酸に置換されているアミノ酸配列を有する免疫グロブリンＧ結合性ペプチド；
（２）上記（１）のアミノ酸配列において、さらに第７位、第１８位、第３９位、第４０位、第４６位、第５４位、および、第５５位のアミノ酸以外の、１または数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失および／または付加されているアミノ酸配列を有する免疫グロブリンＧ結合性ペプチド；
（３）上記（１）のアミノ酸配列に対して８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する免疫グロブリンＧ結合性ペプチド（但し、上記（１）において置換により導入された酸性アミノ酸は維持されるものとする）。
ここで、アミノ酸を置換する変異の表記について、置換位置の番号の前に、野生型、または、非変異型のアミノ酸を付し、置換位置の番号の後に、変異したアミノ酸を付して表記する。例えば、２９位のＧｌｙをＡｌａに置換する変異は、Ｇ２９Ａと記載する。
本明細書において、「タンパク質」という用語は、ポリペプチド構造を有するあらゆる分子を含むものであって、断片化された、または、ペプチド結合によって連結されたポリペプチド鎖も含む。したがって、本明細書において、「ペプチド」、「ポリペプチド」、および、「タンパク質」は同じ意味で使用される。また、「ドメイン」とは、タンパク質の高次構造上の単位であり、数十から数百のアミノ酸残基配列から構成され、なんらかの物理化学的または生物化学的な機能を発現するに十分なタンパク質の単位をいう。また、野生型のタンパク質配列に対し、１つ以上のアミノ酸が置換、付加、挿入、または、欠失が導入されたタンパク質を「変異体」と呼ぶ。
本発明は、ある物質に親和性を有するタンパク質をアフィニティーリガンドとして利用することを、実施形態の１つとして包含する。同様に、該リガンドを水不溶性担体に固定化してえられるアフィニティー分離マトリックスも、実施形態の１つとして包含する。ここで、「アフィニティーリガンド」とは、特異的な分子間の親和力に基づいて、ある分子の集合から目的の分子を選択的に捕集（結合）する物質（官能基）を指す用語である。特異的な分子間の親和力による結合として、例えば、抗原と抗体の結合が挙げられる。アフィニティーリガンドとして、例えば、免疫グロブリンに対して特異的に結合するタンパク質が挙げられる。
本発明におけるアフィニティーリガンドが標的とする分子は、アフィニティーリガンド中の標的分子結合ドメインが結合可能な、全ての分子であり、例えば、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）および免疫グロブリンＧ誘導体が挙げられる。ここで、「免疫グロブリンＧ誘導体」とは、免疫グロブリンＧに由来する改変型人工タンパク質の総称であり、例えば、ヒト免疫グロブリンＧの一部のドメインを他生物種の免疫グロブリンＧのドメインに置換して融合させたキメラ型免疫グロブリンＧ、ヒト免疫グロブリンＧのＣＤＲ（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ　Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｇ　Ｒｅｇｉｏｎｓ）部分を他生物種抗体のＣＤＲ部分に置き換えて融合させたヒト型化免疫グロブリンＧ、Ｆｃ領域の糖鎖に分子改変を加えた免疫グロブリンＧ、ヒト免疫グロブリンＧのＦｖ領域とＦｃ領域とを融合させた人工免疫グロブリンＧなどが挙げられる。
免疫グロブリンＧおよび免疫グロブリンＧ誘導体に結合できるドメインは、様々な免疫グロブリン結合性タンパク質に含まれる。このような免疫グロブリン結合性タンパク質として、例えば、Ｓｔａｐｈｙｌｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ由来のプロテインＡ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｐ．Ｇｒｏｕｐ　Ｃ／Ｇ由来のプロテインＧ、Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｍａｇｎｕｓ由来のプロテインＬ、ｇｒｏｕｐＡ　Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ由来のプロテインＨ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ由来のプロテインＤ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ＡＰ４由来のプロテインＡｒｐ、ヒト由来ＦｃγＲ等が挙げられるが、これらに限定されない。抗体医薬の初期精製（キャプチャー）工程で広く利用される、プロテインＡが好ましい。
プロテインＡの免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）結合性ドメインは、プロテインＡの、Ｅ、Ｄ、Ａ、Ｂ、および、Ｃドメインのいずれかのドメイン、およびそれらに由来したアミノ酸配列である。各々のドメインは、互いに配列同一性が高く、アラインメントすることができる。例えば、アミノ酸配列多重アラインメント用プログラムであるＣｌｕｓｔａｌ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｌｕｓｔａｌ．ｏｒｇ／ｏｍｅｇａ／）で確かめることが可能である。残基番号については、Ｃドメインの３１位に対応する残基は、Ａ、Ｂドメインでは、同じ３１位であり、Ｅドメインでは２９位、Ｄドメインでは３４位に相当する。
プロテインＡのＡ～Ｅドメインは各々の配列がわずかに異なるが、同様の機能を示す。変異導入前のアミノ酸配列も、免疫グロブリンＧ結合性ドメインの野生型アミノ酸配列ではなくても、野生型はアミノ酸配列との配列同一性が高ければ同様の機能を示す。変異前のアミノ酸配列が、部分的なアミノ酸の置換、挿入、欠失、および、化学修飾により改変されたアミノ酸配列であっても、その配列を有するタンパク質がＩｇＧ結合性を有している限り、本発明に含まれる。変異導入前のアミノ酸配列の、免疫グロブリンＧ結合性ドメインの野生型アミノ酸配列との配列同一性は、８０％以上であることが好ましく、８５％以上であることがより好ましく、９０％以上であることがさらに好ましく、９５％以上であることがさらにより好ましい。変異導入前のアミノ酸配列として、例えば、ＢドメインにＡ１ＶおよびＧ２９Ａの変異を導入して得られる、Ｚドメイン（特許文献１）が挙げられる。
変異を導入する前の、プロテインＡの免疫グロブリンＧ結合性ドメインのアミノ酸配列は、Ｃドメインを構成する配列番号１、その改変体である配列番号３、Ｚドメインを構成する配列番号２のアミノ酸配列が好ましく、Ｃドメインを構成する配列番号１、その改変体である配列番号３のアミノ酸配列がより好ましい。また、変異を導入する前のアミノ酸配列として、その他の公知の免疫グロブリンＧ結合性ドメインの変異体を使用することもできる。具体的には、特許文献１～２に記載されている、ＣまたはＺドメインの２９位にアミノ酸置換変異が導入された変異体、および、特許文献３に記載されている、ＣまたはＺドメインの３１位～３７位（好ましくは、３３位、３６位、または、３７位）にアミノ酸置換変異が導入された変異体が好ましい。
上記（１）の免疫グロブリンＧ結合性ペプチドにおいて酸性アミノ酸に置換するアミノ酸は、配列番号１のアミノ酸配列、または配列番号２のアミノ酸配列において、第７位、第１８位、第４０位、第４６位、および、第５５位のアミノ酸からなる群から選択される１以上のアミノ酸であることが好ましい。
酸性アミノ酸は、カルボキシル基を側鎖に有するアミノ酸であることが好ましく、アスパラギン酸またはグルタミン酸であることがより好ましい。
上記（２）の免疫グロブリンＧ結合性ペプチドにおいて、置換、挿入、欠失および／または付加されるアミノ酸の個数は、免疫グロブリンＧ結合性ペプチドとしての特性を維持する観点から、２０個以下であることが好ましく、１０個以下であることがより好ましく、５個以下であることがさらに好ましく、４個以下であることがさらにより好ましく、３個以下、２個以下、１個以下であることが特に好ましい。
一方、上記（２）の免疫グロブリンＧ結合性ペプチドにおいて、置換、挿入、および／または付加されるアミノ酸が酸性アミノ酸である場合には、免疫グロブリンＧ結合性ペプチドの表面の酸性度を向上させる観点からは、置換、挿入、および／または付加されるアミノ酸の個数は、１個以上であることが好ましく、２個以上であることがより好ましく、３個以上であることがさらに好ましく、４個以上であることがさらにより好ましく、５個以上であることが特に好ましい。
上記（２）の免疫グロブリンＧ結合性ペプチドにおいて、置換、挿入、欠失および／または付加されるアミノ酸は、配列番号１に示したＣドメイン、または、配列番号２に示したＺドメインのアミノ酸配列において、第１位、第２位、第３位、第４位、第６位、第２３位、第２９位、第３３位、第３５位、第３６位、第３７位、第４２位、第４９位、第５０位、第５７位、および、第５８位のアミノ酸からなる群から選択される１以上のアミノ酸であることが好ましい。置換、挿入、欠失および／または付加されるアミノ酸は、配列番号１に示したＣドメイン、または、配列番号２に示したＺドメインのアミノ酸配列において、第２９位、第３３位、第３６位、および、第３７位のアミノ酸からなる群から選択される１以上のアミノ酸であることがより好ましい。
上記（３）の免疫グロブリンＧ結合性ペプチドにおいて、上記（１）のアミノ酸配列に対する配列同一性は、８０％以上であることが好ましく、８５％以上であることがより好ましく、９０％以上であることがさらに好ましく、９５％以上であることがさらにより好ましい。
上記（３）の免疫グロブリンＧ結合性ペプチドは、上記（１）の免疫グロブリンＧ結合性ペプチドのアミノ酸配列に対して８０％以上の配列同一性を有する。ただし上記（１）の免疫グロブリンＧ結合性ペプチドにおいて導入された酸性アミノ酸は、さらに改変することなく、維持される。上記（１）の免疫グロブリンＧ結合性ペプチドのアミノ酸配列に対して８０％以上の配列同一性を有する限り、上記（１）の免疫グロブリンＧ結合性ペプチドにおいて導入された酸性アミノ酸以外のアミノ酸は、改変されていてもよい。
アミノ酸置換変異の数は、１個でも効果が期待されるが、２個以上が好ましく、３個以上がより好ましく、４個以上がさらに好ましい。上限は特に限定されないが、９個以下が好ましく、７個以下がより好ましい。
一般に、プロテインＡは、免疫グロブリン結合性ドメイン、つまり、免疫グロブリン結合性タンパク質が、５個つながった形で構成されるタンパク質である。本発明の免疫グロブリンＧ結合性ペプチドも、多量体タンパク質（複ドメイン型タンパク質）であることが好ましい。多量体タンパク質に含まれる単ドメインの数は、２個以上であることが好ましく、３個以上であることがより好ましく、４個以上であることがさらに好ましく、５個以上であることがさらにより好ましい。連結される単ドメインの数の上限は特に限定されないが、１０個以下であることが好ましく、８個以下であることがより好ましく、６個以下であることがさらに好ましい。これらの多量体は、単一の免疫グロブリンＧ結合性ドメインの連結体であるホモダイマー、ホモトリマー等のホモポリマーであってもよいし、複数種類の免疫グロブリンＧ結合性ドメインの連結体であるヘテロダイマー、ヘテロトリマー等のヘテロポリマーであってもよい。
本発明によって得られる単量体タンパク質の連結のされ方としては、リンカーとなるアミノ酸残基を介さず連結する方法、または、１または複数のアミノ酸残基で連結する方法が挙げられるが、これらの方法に限定されるものではない。連結するアミノ酸残基数に特に制限はない。好ましくは、単量体タンパク質の３次元立体構造を不安定化しないものがよい。
また、実施形態の１つとして、本発明により得られる免疫グロブリン結合性タンパク質、または、該タンパク質が２個以上連結された多量体タンパク質が、１つの構成成分として、機能の異なる他のタンパク質と融合されていることを特徴とする融合タンパク質が挙げられる。融合タンパク質の例としては、アルブミン、ＧＳＴ（グルタチオンＳ－トランスフェラーゼ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）が融合したタンパク質を例として挙げることができるが、これに限定されるものではない。また、ＤＮＡアプタマーなどの核酸、抗生物質などの薬物、ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）などの高分子が融合されている場合も、本発明で得られたタンパク質の有用性を利用するものであれば、本発明に包含される。
本発明は、上記免疫グロブリンＧ結合性ペプチドをコードする塩基配列を含むＤＮＡにも関する。該塩基配列は、その塩基配列を翻訳したアミノ酸配列が、免疫グロブリンＧ結合性ペプチドを構成するものであればよい。そのような塩基配列は、通常用いられる公知の方法、例えば、ポリメラーゼ・チェーン・リアクション（以下、ＰＣＲと略す）法を利用して取得できる。また、公知の化学合成法で合成することも可能であり、さらに、ＤＮＡライブラリーから得ることもできる。当該塩基配列は、コドンが縮重コドンで置換されていてもよく、翻訳されたときに同一のアミノ酸をコードしている限り、野生型の塩基配列には限られない。上記ＤＮＡを利用して遺伝子改変生物を得ることができ、また、上記ＤＮＡを転写の鋳型ＤＮＡとする無細胞タンパク質合成系を得ることもできる。
本発明のタンパク質をコードするＤＮＡを改変するための部位特異的な変異の導入は、以下のように、組換えＤＮＡ技術、ＰＣＲ法等を用いて行うことができる。
すなわち、組換えＤＮＡ技術による変異の導入は、例えば、本発明のタンパク質をコードする遺伝子中において、変異導入を希望する目的の部位の両側に適当な制限酵素認識配列が存在する場合に、それら制限酵素認識配列部分を前記制限酵素で切断し、変異導入を希望する部位を含む領域を除去した後、化学合成等によって目的の部位のみに変異導入したＤＮＡ断片を挿入するカセット変異法によって行うことができる。
また、ＰＣＲによる部位特異的変異の導入は、例えば、タンパク質をコードする二本鎖プラスミドを鋳型として、＋および－鎖に相補的な変異を含む２種の合成オリゴプライマーを用いてＰＣＲを行うダブルプライマー法により、行うことができる。
また、本発明の単量体タンパク質（１つのドメイン）をコードするＤＮＡを、意図する数だけ直列に連結することにより、多量体タンパク質をコードするＤＮＡを作製することもできる。例えば、多量体タンパク質をコードするＤＮＡの連結方法は、ＤＮＡ配列に適当な制限酵素部位を導入し、制限酵素で断片化した２本鎖ＤＮＡをＤＮＡリガーゼで連結することができる。制限酵素部位は１種類でもよいが、複数の異なる種類の制限酵素部位を導入することもできる。また、多量体タンパク質をコードするＤＮＡにおいて、各々の単量体タンパク質をコードする塩基配列が同一の場合には、宿主にて相同組み換えを誘発する可能性があるので、連結されている単量体タンパク質をコードするＤＮＡの塩基配列間の配列同一性が９０％以下であることが好ましく、８５％以下であることがより好ましく、８０％以下であることがさらに好ましく、７５％以下であることがさらにより好ましい。
本発明のベクターは、前述したタンパク質、または、その部分アミノ酸配列をコードする塩基配列、およびその塩基配列に作動可能に連結された宿主で機能しうるプロモーターを含む。通常は、前述したタンパク質をコードする遺伝子を、適当なベクターに連結もしくは挿入することにより得ることができる。遺伝子を挿入するためのベクターは、宿主中で自律複製可能なものであれば特に限定されず、プラスミドＤＮＡやファージＤＮＡをベクターとして用いることができる。例えば、大腸菌を宿主として用いる場合には、ｐＱＥ系ベクター（キアゲン社）、ｐＥＴ系ベクター（メルク社）、および、ｐＧＥＸ系ベクター（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）のベクターなどが挙げられる。ブレビバチルス属細菌の遺伝子の発現に有用なプラスミドベクターとしては、例えば、枯草菌ベクターとして公知であるｐＵＢ１１０、または、ｐＨＹ５００（特開平２－３１６８２号公報）、ｐＮＹ７００（特開平４－２７８０９１号公報）、ｐＮＵ２１１Ｒ２Ｌ５（特開平７－１７０９８４号公報）、ｐＨＴ２１０（特開平６－１３３７８２号公報）、または、大腸菌とブレビバチルス属細菌とのシャトルベクターであるｐＮＣＭＯ２（特開２００２－２３８５６９号公報）などが挙げられる。
本発明の形質転換細胞は、宿主となる細胞へ本発明の組換えベクターを導入することにより得ることができる。宿主への組換え体ＤＮＡの導入方法としては、例えばカルシウムイオンを用いる方法、エレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法、アグロバクテリウム感染法、パーティクルガン法、または、ポリエチレングリコール法などが挙げられるが、これに限定されるものではない。また、得られた遺伝子の機能を宿主で発現する方法としては、本発明で得られた遺伝子をゲノム（染色体）に組み込む方法なども挙げられる。宿主となる細胞については、特に限定されるものではないが、安価に大量生産する上では、大腸菌、枯草菌、ブレビバチルス属、スタフィロコッカス属、ストレプトコッカス属、ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）等のバクテリア（真正細菌）を好適に使用しうる。
本発明のタンパク質は、前記した形質転換細胞を培地で培養し、培養菌体中（菌体ぺリプラズム領域中も含む）、または、培養液中（菌体外）に本発明のタンパク質を生成蓄積させ、該培養物から所望のタンパク質を採取することにより製造することができる。また、本発明のタンパク質は、前記した形質転換細胞を培地で培養し、培養菌体中（菌体ぺリプラズム領域中も含む）、または、培養液中（菌体外）に、本発明のタンパク質を含む融合タンパク質を生成蓄積させ、該培養物から該融合タンパク質を採取し、該融合タンパク質を適切なプロテアーゼによって切断し、所望のタンパク質を採取することにより製造することができる。
本発明の形質転換細胞を培地で培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行われる。得られた形質転換体の培養に用いる培地は、該タンパク質を高効率、高収量で生産できるものであれば特に制限はない。具体的には、グルコース、蔗糖、グリセロール、ポリペプトン、肉エキス、酵母エキス、カザミノ酸などの炭素源や窒素源を使用することが出来る。その他、カリウム塩、ナトリウム塩、リン酸塩、マグネシウム塩、マンガン塩、亜鉛塩、鉄塩等の無機塩類が必要に応じて添加される。栄養要求性の宿主細胞を用いる場合は、生育に要求される栄養物質を添加すればよい。また、必要であればペニシリン、エリスロマイシン、クロラムフェニコール、ネオマイシンなどの抗生物質が添加されてもよい。
さらに、菌体内外に存在する宿主由来のプロテアーゼによる当該目的タンパク質の分解を抑えるために、公知の各種プロテアーゼ阻害剤、すなわち、Ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈａｎｅ　ｓｕｌｆｏｎｙｌ　ｆｌｕｏｒｉｄｅ　（ＰＭＳＦ）、Ｂｅｎｚａｍｉｄｉｎｅ、４－（２－ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ）－ｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎｙｌ　ｆｌｕｏｒｉｄｅ　（ＡＥＢＳＦ）、Ａｎｔｉｐａｉｎ、Ｃｈｙｍｏｓｔａｔｉｎ、Ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ、Ｐｅｐｓｔａｔｉｎ　Ａ、Ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｏｎ、Ａｐｒｏｔｉｎｉｎ、Ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａ　ａｃｅｔｉｃ　ａｃｉｄ　（ＥＤＴＡ）、および／または、その他市販されているプロテアーゼ阻害剤を適当な濃度で添加してもよい。
さらに、本発明のタンパク質を正しくフォールディングさせるために、例えば、ＧｒｏＥＬ／ＥＳ、Ｈｓｐ７０／ＤｎａＫ、Ｈｓｐ９０、Ｈｓｐ１０４／ＣｌｐＢなどの分子シャペロンを利用してもよい（例えば、共発現、または、融合タンパク質化などの手法で、本発明のタンパク質と共存させる）。なお、本発明のタンパク質の正しいフォールディングを目的とする場合には、正しいフォールディングを助長する添加剤を培地中に加える、および、低温にて培養するなどの手法もあるが、これらに限定されるものではない。
大腸菌を宿主として得られた形質転換細胞を培養する培地としては、ＬＢ培地（トリプトン　１％、酵母エキス　０．５％、ＮａＣｌ　１％）、または、２ｘＹＴ培地（トリプトン　１．６％、酵母エキス　１．０％、ＮａＣｌ　０．５％）等が挙げられる。ブレビバチルス属細菌を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、ＴＭ培地（ペプトン　１％、肉エキス　０．５％、酵母エキス　０．２％、グルコース　１％、ｐＨ　７．０）、または、２ＳＬ培地（ペプトン　４％、酵母エキス　０．５％　、グルコース　２％、ｐＨ７．２）等が挙げられる。
また、培養温度は、１５～４２℃、好ましくは２０～３７℃で、通気攪拌条件で好気的に数時間～数日培養することにより本発明のタンパク質を、培養細胞内（ぺリプラズム領域内を含む）、または、培養溶液（細胞外）に蓄積させて回収する。場合によっては、通気を遮断し嫌気的に培養してもよい。組換えタンパク質が分泌生産される場合には、培養終了後に、遠心分離、ろ過などの一般的な分離方法で、培養細胞と分泌生産されたタンパク質を含む上清を分離することにより生産された組換えタンパク質を回収することができる。また、培養細胞内（ぺリプラズム領域内を含む）に蓄積される場合にも、例えば、培養液から遠心分離、ろ過などの方法により菌体を採取し、次いで、この菌体を超音波破砕法、フレンチプレス法などにより破砕し、および／または、界面活性剤等を添加して可溶化することにより、細胞内に蓄積生産されたタンパク質を回収することができる。
本発明のタンパク質の精製はアフィニティークロマトグラフィー、陽イオンまたは陰イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー等を単独でまたは適宜組み合わせることによって行うことができる。得られた精製物質が目的のタンパク質であることの確認は、通常の方法、例えばＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動、Ｎ末端アミノ酸配列分析、ウエスタンブロッティング等により行うことができる。
免疫グロブリンに対する親和性は、例えば、表面プラズモン共鳴原理を用いたＢｉａｃｏｒｅシステム（ＧＥヘルスケア・バイオサイエンス社）などのバイオセンサーによって試験することができるが、これに限定されるものではない。測定条件としては、プロテインＡが免疫グロブリンに結合した時の結合シグナルが検出できれば良く、温度２０～４０℃（一定温度）にて、ｐＨ６～８の中性条件にて測定することで簡単に評価することができる。
結合パラメータとしては、例えば、親和定数（ＫＡ）や解離定数（ＫＤ）を用いることができる（永田他　著、「生体物質相互作用のリアルタイム解析実験法」、シュプリンガー・フェアラーク東京、１９９８年、４１頁）。本発明のタンパク質のＦｃに対する親和定数は、Ｂｉａｃｏｒｅシステムを利用して、センサーチップにヒトＩｇＧを固定化して、温度２５℃、ｐＨ７．４の条件下にて、各ドメイン変異体を流路添加する実験系で求めることができる。本発明のペプチドは、ヒトＩｇＧへの親和定数（ＫＡ）が１×１０５（Ｍ－１）以上であることが好ましく、１×１０６（Ｍ－１）以上であることがより好ましく、１×１０７（Ｍ－１）であることがさらに好ましい。
本発明は、上述のタンパク質を、免疫グロブリン誘導体に親和性を有することを特徴とするアフィニティーリガンドとして利用することも、実施形態の１つとして包含する。同様に、該リガンドを水不溶性担体に固定化したことを特徴とする、アフィニティー分離マトリックスも、実施形態の１つとして包含する。
本発明に用いる水不溶性担体としては、ガラスビーズ、シリカゲルなどの無機担体、架橋ポリビニルアルコール、架橋ポリアクリレート、架橋ポリアクリルアミド、架橋ポリスチレンなどの合成高分子や、結晶性セルロース、架橋セルロース、架橋アガロース、架橋デキストランなどの多糖類からなる有機担体、さらにはこれらの組み合わせによって得られる有機－有機、有機－無機などの複合担体などが挙げられる。市販品としては、多孔質セルロースゲルであるＧＣＬ２０００、アリルデキストランとメチレンビスアクリルアミドを共有結合で架橋したＳｅｐｈａｃｒｙｌ　Ｓ－１０００、アクリレート系の担体であるＴｏｙｏｐｅａｒｌ、アガロース系の架橋担体であるＳｅｐｈａｒｏｓｅ　ＣＬ４Ｂ、および、セルロース系の架橋担体であるＣｅｌｌｕｆｉｎｅなどを例示することができる。ただし、本発明における水不溶性担体は、例示したこれらの担体のみに限定されるものではない。
また、本発明に用いる水不溶性担体は、本アフィニティー分離マトリックスの使用目的および方法からみて、表面積が大きいことが望ましく、適当な大きさの細孔を多数有する多孔質であることが好ましい。担体の形態としては、ビーズ状、モノリス状、繊維状、膜状（中空糸を含む）などいずれも可能であり、任意の形態を選ぶことができる。
リガンドの固定化方法については、例えば、リガンドに存在するアミノ基、カルボキシル基、または、チオール基を利用した、従来のカップリング法で担体に結合してよい。カップリング法としては、担体を臭化シアン、エピクロロヒドリン、ジグリシジルエーテル、トシルクロライド、トレシルクロライド、ヒドラジン、および、過ヨウ素酸ナトリウムなどと反応させて担体を活性化し（あるいは担体表面に反応性官能基を導入し）、リガンドとして固定化する化合物とカップリング反応を行い固定化する方法、また、担体とリガンドとして固定化する化合物が存在する系にカルボジイミドのような縮合試薬、または、グルタルアルデヒドのように分子中に複数の官能基を持つ試薬を加えて縮合、架橋することによる固定化方法が挙げられる。
また、リガンドと担体の間に複数の原子からなるスペーサー分子を導入してもよいし、担体にリガンドを直接固定化してもよい。したがって、固定化のために、本発明のタンパク質に対して、化学修飾してもよいし、固定化に有用なアミノ酸残基を加えてもよい。固定化に有用なアミノ酸としては、側鎖に固定化の化学反応に有用な官能基を有しているアミノ酸が挙げられ、例えば、側鎖にアミノ基を含むＬｙｓや、側鎖にチオール基を含むＣｙｓが挙げられる。本発明の本質は、本発明においてタンパク質に付与した効果が、該タンパク質をリガンドとして固定化したマトリックスにおいても同様に付与されることにあり、固定化のためにいかように修飾・改変しても、本発明の範囲に含まれる。
本発明の免疫グロブリンＧまたは免疫グロブリンＧ誘導体の製造方法は、免疫グロブリンＧまたは免疫グロブリンＧ誘導体を、前記アフィニティー分離マトリックスと接触させる工程、および、アフィニティー分離マトリックスに結合した免疫グロブリンＧまたは免疫グロブリンＧ誘導体を、アフィニティー分離マトリックスから分離する工程を含む。アフィニティー分離マトリックスを用いた標的分子の精製法は、その吸着時には、一般的なアフィニティーカラム・クロマトグラフィ精製法に準じる手順により達成することができる。例えば、免疫グロブリンＧを標的分子とする場合、すでに市販品として存在するプロテインＡカラムを用いたアフィニティーカラム・クロマトグラフィ精製法に準じる手順により達成することができる（非特許文献１）。すなわち、免疫グロブリンのＦｃ領域を有するタンパク質を含有する緩衝液を中性となるように調製した後、該溶液を本発明のミックスモードアフィニティー分離マトリックスを充填したアフィニティーカラムに通過させ、免疫グロブリンのＦｃ領域を有するタンパク質を吸着させる。次いで、抗体アフィニティーリガンドが機能する条件範囲の緩衝液を適量通過させ、カラム内部を洗浄する。この時点では所望の免疫グロブリンのＦｃ領域を有するタンパク質はカラム内の本発明のアフィニティー分離マトリックスに吸着されている。この時、中性付近のｐＨでイオン強度や組成物の最適化により、不純物を効果的に除去できる場合がある。負荷、洗浄時において、陽イオン交換基が機能しない条件が好ましく、特に、吸着後の洗浄工程で高イオン強度の洗浄液の利用が好ましい。次いで、酸性ｐＨ、イオン強度の組み合わせにより、陽イオン交換分離モードを機能させ、抗体アフィニティーリガンドからの溶出と協奏的な作用で、選択性の高い分離が可能となる。酸性ｐＨでの溶出前に中性条件下でイオン強度を下げておくことが好ましい。
本発明において、リガンドに対する酸性アミノ酸への置換変異の数（比率）によって、抗体分離機能の調節が可能である。例えば、抗体アフィニティーリガンドの特異的結合による結合容量が陽イオン交換基の非特異的な結合による結合容量よりも大きい場合は、酸性溶出時に低イオン強度でも抗体が担体から溶出されるが、抗体アフィニティーリガンドの特異的結合による結合容量が陽イオン交換基の非特定的結合による結合容量と同程度または低い場合には、抗体アフィニティーリガンドから溶出された抗体について、陽イオン交換基主体の結合への受け渡しが行なわれるため、低イオン強度では抗体の溶出は起こらない。何れの場合も、イオン強度の変更により、溶出量、および、溶出液中の抗体単量体の比率を制御可能である。ｐＨも抗体アフィニティーリガンドからの溶出と陽イオン交換基への結合とイオン強度（塩濃度）依存的溶出を決定する因子である。すなわち、本発明により調製されたアフィニティー分離マトリックスは、ｐＨおよびイオン強度等の溶出条件等により、分離を最適化できる。本発明により調製されるアフィニティー分離マトリックスからの抗体溶出は、塩濃度グラジエントでもステップワイズ溶出でも適用可能であるが、溶出液量の低減を目的にした場合はイオン強度によるステップワイズ溶出が好ましい。更に、操作の単純化のためには、ワンステップ溶出による抗体の回収と単量体含量の向上を達成できる条件設定が好ましい。
また、本発明は、アフィニティー精製用リガンドのアミノ酸配列中の酸性アミノ酸数を増加させることにより、陽イオン交換能を向上させる工程を含む、改良型アフィニティー精製用リガンドの製造方法にも関する。酸性アミノ酸としては、側鎖にカルボキシル基を有するアミノ酸が挙げられ、アスパラギン酸、またはグルタミン酸が好ましい。前記リガンドの酸性アミノ酸に含まれるカルボキシル基は、改良型アフィニティー精製用リガンドを担体に固定化して得られるアフィニティー分離マトリックスにおいて、タンパク質を介して固定化された陽イオン性交換基と捉えることができる。なお、改良型アフィニティー精製用リガンドは、酸性アミノ酸数を増加する前のアフィニティー精製用リガンドよりも、正電荷を帯びた精製対象との親和性、および負電荷を帯びた不純物の吸着抑制効果が向上したアフィニティー精製用リガンドを意味する。
酸性アミノ酸数の増加は、酸性アミノ酸への置換変異、および／または酸性アミノ酸の付加によるものであることが好ましい。前記酸性アミノ酸数の増加は、２以上の増加であることが好ましく、３以上の増加であることがより好ましく、４以上の増加であることがさらに好ましい。
前記アフィニティー精製の対象は、免疫グロブリンＧまたは免疫グロブリンＧ誘導体であることが好ましい。前記アフィニティー精製用リガンドは、プロテインＡ、プロテインＧ、または、プロテインＬの免疫グロブリンＧ結合性ドメインであることが好ましい。
以下に実施例に基づいて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。実施例で取得した各種タンパク質について、「ドメインを示すアルファベット－導入した変異（野生型ではＷｉｌｄ）」の形で表記する。例えば、プロテインＡの野生型Ｃドメインは「Ｃ－ｗｉｌｄ」、変異Ｇ２９Ａを導入したＣドメイン変異体は「Ｃ－Ｇ２９Ａ」という形で表記する。２種類の変異を同時に導入した変異体の表記については、スラッシュを用いて併記する。例えば、変異Ｇ２９Ａ、および、変異Ｓ３３Ｅを導入したＣドメイン変異体については、「Ｃ－Ｇ２９Ａ／Ｓ３３Ｅ」という形で表記する。また、単ドメインを複数連結したタンパク質については、ピリオドをつけて、連結した数に「ｄ」をつけて併記する。例えば、変異Ｇ２９Ａ、および、変異Ｓ３３Ｅを導入したＣドメイン変異体を５連結したタンパク質は、「Ｃ－Ｇ２９Ａ／Ｓ３３Ｅ．５ｄ」と表記する。
（実施例１）酸性アミノ酸を導入したプロテインＡのＣドメイン変異体の設計
酸性アミノ酸を導入する部位の評価には、Ｚドメイン（Ｚ－Ｗｉｌｄ．１ｄ、配列番号２）の立体構造を利用した。タンパク質立体構造データベースＰＤＢ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒｃｓｂ．ｏｒｇ／ｐｄｂ／ｈｏｍｅ／ｈｏｍｅ．ｄｏ）にある公知のＺドメインの立体構造（ＰＤＢコード：２ＳＰＺ）を用いて、各アミノ酸残基の溶媒露出面積（ＡＳＡ）をＤＳＳＰを用いて算出した。アミノ酸側鎖の大きさの違いによる影響を補正するため、ｒＡＳＡ値（ＡＳＡ（Ｘｘｘ）／ＡＳＡ（Ｇｌｙ－Ｘｘｘ－Ｇｌｙ）、Ｘｘｘは計算対象の任意のアミノ酸）も算出した。この各残基のＡＳＡ値／ｒＡＳＡ値を表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
このｒＡＳＡ値が、Ｇｌｙ－２９の値（この時は０．４４）より小さな、溶媒への露出が少ないアミノ酸残基を、酸性アミノ酸に置換変異する候補から除いた。また、ＩｇＧとの特異的な相互作用に関与するアミノ酸残基、ドメインの末端に位置する残基、主鎖構造の維持に重要なＰｒｏ残基、および、野生型において酸性アミノ酸である残基などを除き、酸性アミノ酸に置換変異するアミノ酸残基候補を選定した。結果として、Ｌｙｓ－７、Ｈｉｓ－１８、Ｓｅｒ－３９、Ｖａｌ－４０、Ａｌａ－４６、Ａｌａ－５４、Ｇｌｎ－５５を選択した。
次に選択した７か所のアミノ酸残基に対する変異導入効果を検証することとした。この効果を検証するモデルリガンドとして、本実施例ではＣドメインを選択した。Ｃドメインは、例えば他のドメインがＡｓｎである４３位が酸性アミノ酸のＧｌｕになっているように、他のドメインに比較して酸性アミノ酸が多いのが、選択の理由である。このＣドメインのアミノ酸配列に、リガンドの化学安定性を向上する変異Ｇ２９Ａと、ＶＨ３型のＦａｂ領域への結合を欠失させる変異Ｓ３３Ｅを導入したＣドメイン変異体であるＣ－Ｇ２９Ａ／Ｓ３３Ｅ．１ｄ（配列番号３）を変異導入前のアミノ酸配列とした。
Ｃ－Ｇ２９Ａ／Ｓ３３Ｅ．１ｄのモデリング立体構造は、Ｚドメインの立体構造を鋳型として、タンパク質立体構造ホモロジーモデリングソフトであるＨｏｍｏｌｏｇｙ　Ｍｏｄｅｌｉｎｇ　ｆｏｒ　ＨｙｐｅｒＣｈｅｍ（分子機能研究所）を利用して作成した。作成の際には、ソフトに付属する標準機能を用いて、側鎖ロータマーの最適化、分子力場ポテンシャルを利用したエネルギー極小化計算を行った。このモデリング立体構造のｒＡＳＡ値も表１に示す。
ＺドメインとはｒＡＳＡ値が大きく異なる残基もあるが、本実施例では、純粋に実験によって決定されたＺドメインの立体構造を用いた変異箇所の選択を適用する。
続いて、選択した７か所のアミノ酸残基が、それぞれ、アスパラギン酸、または、グルタミン酸に置換された変異体のモデリング立体構造を作成し、ＩｇＧのＦｃ領域と特異的に相互作用する残基（Ｐｈｅ－５、Ｇｌｎ－９、Ｇｌｎ－１０、Ａｓｎ－１１、Ｐｈｅ－１３、Ｔｙｒ－１４、Ｌｅｕ－１７、Ａｓｎ－２８、Ｉｌｅ－３１、Ｇｌｎ－３２、Ｌｙｓ－３５）のＡＳＡ（ＡＳＡ－Ｆｃ）を算出した。
そして、Ｃ－Ｇ２９Ａ／Ｓ３３Ｅ．１ｄのモデリング立体構造のＡＳＡ－Ｆｃに対する、各変異体モデリング立体構造のＡＳＡ－Ｆｃの相関係数（Ｃｏｒｒ．－Ｆｃ）を算出し、表２に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
各残基のアスパラギン酸、または、グルタミン酸に置換された場合のＣｏｒｒ．－Ｆｃの平均値が、０．９５未満であるＳｅｒ－３９とＡｌａ－５４は、変異の導入によって、ＩｇＧへの特異的な結合に変化を及ぼすリスクが他に比べると高いと推測される。
次に、Ｓｅｒ－３９とＡｌａ－５４を除く、Ｌｙｓ－７、Ｈｉｓ－１８、Ｖａｌ－４０、Ａｌａ－４６、および、Ｇｌｎ－５５の５か所のアミノ酸残基に関し、それぞれ、野生型、アスパラギン酸、グルタミン酸の３通りのいずれかのアミノ酸となる多残基変異体全て（３の５乗＝２４３通り）のモデリング立体構造を作成し、Ｃｏｒｒ．－Ｆｃを算出した。
また、先述のＩｇＧのＦｃ領域と特異的に相互作用する残基の全原子について、Ｃ－Ｇ２９Ａ／Ｓ３３Ｅ．１ｄのモデリング立体構造に対する平均二乗偏差（ＲＭＳＤ、残基を限定したこのケースではＲＭＳＤ－Ｆｃと表記する）を算出した。各多残基変異体のＣｏｒｒ．－Ｆｃ値とＲＭＳＤ－Ｆｃ値を表３および表４に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
Ｃｏｒｒ．－Ｆｃ値が高い変異体は、ＩｇＧへの特異的な結合に変化を及ぼすリスクが低いと推測されるため、本発明で用いるリガンドとして好ましい。また、同様の視点から、ＲＭＳＤ－Ｆｃ値が小さい変異体も、本発明で用いるリガンドとして好ましい。
モデリング立体構造を基に、分子の表面電荷を評価するためのソフトであるＡｄａｐｔｉｖｅ　Ｐｏｉｓｓｏｎ－Ｂｏｌｔｚｍａｎｎ　Ｓｏｌｖｅｒ（ＡＰＢＳ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｏｉｓｓｏｎｂｏｌｔｚｍａｎｎ．ｏｒｇ／ａｐｂｓ）を用いた、各変異体の表面電荷の評価も行った。適切な位置への酸性アミノ酸残基の導入によって、ＩｇＧとの相互作用面の電荷変化が少なく、それ以外の面で負電荷領域が増えていることを確認した。
（実施例２）酸性アミノ酸を導入したプロテインＡのＣドメイン変異体の取得
プロテインＡのＣドメインに、実施例１で設計した酸性アミノ酸への置換変異を導入して得られるペプチドを、大腸菌発現系を利用して取得した。
Ｃ－Ｇ２９Ａ／Ｓ３３Ｅ．１ｄに、実施例１で設計した酸性アミノ酸への置換変異を導入した下記の変異体（１）～（３）を作成した。比較例として（０）Ｃ－Ｇ２９Ａ／Ｓ３３Ｅ．１ｄを使用した。比較例の変異（Ｇ２９Ａ／Ｓ３３Ｅ）と、本発明の酸性アミノ酸への置換変異を区別するため、本発明の変異は全てＧ２９Ａ／Ｓ３３Ｅの後ろに記載した。
（０）Ｃ－Ｇ２９Ａ／Ｓ３３Ｅ．１ｄ（配列番号３、比較例として）
（１）Ｃ－Ｇ２９Ａ／Ｓ３３Ｅ／Ｑ５５Ｅ．１ｄ（配列番号４）
（２）Ｃ－Ｇ２９Ａ／Ｓ３３Ｅ／Ｋ７Ｅ／Ａ４６Ｅ．１ｄ（配列番号５）
（３）Ｃ－Ｇ２９Ａ／Ｓ３３Ｅ／Ｋ７Ｅ／Ｈ１８Ｄ／Ｖ４０Ｄ／Ａ４６Ｄ／Ｑ５５Ｅ．１ｄ（配列番号６）
各変異体をコードするＤＮＡを、ペプチドの精製操作の画一化の為、ＧＳＴ（グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ）が融合された単ドメイン型のタンパク質として発現・精製できる市販の大腸菌発現用ベクターｐＧＥＸ６Ｐ－１（ＧＥヘルスケア・バイオサイエンス社）に挿入することにより、発現ベクターを調製した。発現ベクターを使用して、発現用大腸菌を形質転換した。以下に、その概要を記載する。
比較例の（０）Ｃ－Ｇ２９Ａ／Ｓ３３Ｅ．１ｄを作製するための発現ベクターの調製方法を例示する。当該ペプチドをコードする塩基配列（配列番号７）は、Ｃ－Ｇ２９Ａ／Ｓ３３Ｅ．１ｄ（配列番号３）のアミノ酸配列から逆翻訳を行い、設計した。
Ｃ－Ｇ２９Ａ／Ｓ３３Ｅ．１ｄをコードするＤＮＡは、２種の二本鎖ＤＮＡ（ｆ１とｆ２）を制限酵素で切断した後に連結することにより調製し、発現ベクターのマルチクローニングサイトに挿入した。実際には、２種の二本鎖ＤＮＡと発現ベクターからなる、３種の二本鎖ＤＮＡを混合して連結する３断片ライゲーションによって、コードＤＮＡ調製と、ベクターへの挿入を同時に実施した。２種の二本鎖ＤＮＡの調製方法は、互いに１０塩基程度の相補領域を含む２種の一本鎖オリゴＤＮＡ（ｆ１－１／ｆ１－２、または、ｆ２－１／ｆ２－２）を、オーバーラップＰＣＲによって伸長し、目的の二本鎖ＤＮＡを調製した。発現ベクターの作製方法の概要を図１に示す。
具体的には、以下の操作により発現ベクターを作製した。一本鎖オリゴＤＮＡｆ１－１（配列番号８）／ｆ１－２（配列番号９）を外注によって合成し（シグマジェノシス社）、ポリメラーゼとしてＢｌｅｎｄ　Ｔａｑ（ＴＯＹＯＢＯ社）を用い、オーバーラップＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応生成物をアガロース電気泳動にかけ、目的のバンドを切り出すことで抽出した二本鎖ＤＮＡを、制限酵素ＢａｍＨＩとＭｌｕＩ（いずれもタカラバイオ社）により切断した。同様に、一本鎖オリゴＤＮＡｆ２－１（配列番号１０）／ｆ２－２（配列番号１１）を外注によって合成し、オーバーラップＰＣＲ反応を経て、合成・抽出した二本鎖ＤＮＡを、制限酵素ＭｌｕＩとＥｃｏＲＩ（いずれもタカラバイオ社）により切断した。次に、プラスミドベクターｐＧＥＸ－６Ｐ－１のマルチクローニングサイト中のＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩサイトに上記２種の二本鎖ＤＮＡをサブクローニングした。サブクローニングにおけるライゲーション反応は、Ｌｉｇａｔｉｏｎ　Ｈｉｇｈ（ＴＯＹＯＢＯ社）を用いて、製品に添付のプロトコルに準じて行った。
上記ペプチドのコードＤＮＡを含むプラスミドベクターｐＧＥＸ－６Ｐ－１を用いて、大腸菌コンピテント細胞ＨＢ１０１（タカラバイオ社）の形質転換を、付属のプロトコルに従って行った。なお、上記プラスミドベクターｐＧＥＸ－６Ｐ－１を用いれば、ＧＳＴが融合したＣ－Ｇ２９Ａ／Ｓ３３Ｅ．１ｄを産生することができる。
プラスミド精製キット（プロメガ社製、「Ｗｉｚａｒｄ　Ｐｌｕｓ　ＳＶ　Ｍｉｎｉｐｒｅｐｓ　ＤＮＡ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ」）を用い、キット付属の標準プロトコルに従って、形質転換体から発現ベクターを抽出した。
発現ベクターのコードＤＮＡの塩基配列は、ＤＮＡシークエンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製、「３１３０ｘｌ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ａｎａｌｙｚｅｒ」）を用いて確認した。遺伝子解析キット（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製、「ＢｉｇＤｙｅ　Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　ｖ．１．１　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　Ｋｉｔ）と、プラスミドベクターｐＧＥＸ－６Ｐ－１のシークエンシング用ＤＮＡプライマー（ＧＥヘルスケア・バイオサイエンス社）を用いて、添付のプロトコルに従いシークエンシングＰＣＲ反応を行った。その反応産物を、プラスミド精製キットＢｉｇＤｙｅ　ＸＴｅｒｍｉｎａｔｏｒ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）に添付のプロトコルに従い精製し、塩基配列解析に用いた。
上記（１）～（３）のＣドメイン変異体をコードするＤＮＡも、アミノ酸配列から逆翻訳を行って当該ペプチドをコードする塩基配列を設計し、上記と同様の方法でコードＤＮＡを含む発現ベクターと形質転換体を調製した。（１）～（３）のＣドメイン変異体のコードＤＮＡ配列、および、その合成に利用した一本鎖オリゴＤＮＡ（ｆ１－１、ｆ１－２、ｆ２－１、ｆ２－２）の配列番号の組合せを表５に記載する。なお、本発明のペプチドをコードするＤＮＡは、２００塩基長程度（６０残基程度のタンパク質をコード可能）であれば、外注で全合成することも可能である（例えば、Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ社）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
形質転換体を、アンピシリン含有２×ＹＴ培地にて、３７℃で終夜培養した。培養液を、１００倍量程度のアンピシリンを含有する２×ＹＴ培地に接種し、３０℃で約３時間培養した後で、終濃度０．２ｍＭになるようＩＰＴＧ（イソプロピル１－チオ－β－Ｄ－ガラクシド）を添加し、さらに、３０℃にて２４時間培養した。
培養終了後、遠心分離により集菌し、ＰＢＳ緩衝液５ｍＬ（培地約０．７５Ｌあたり）に再懸濁した。超音波破砕により細胞を破砕し、遠心分離により上清画分（無細胞抽出液）と不溶性画分に分画した。ｐＧＥＸ－６Ｐ－１ベクターのマルチクローニングサイトに目的の遺伝子を導入すると、ＧＳＴがＮ末端に付与した融合ペプチドとして発現される。上清画分および不溶性画分を、それぞれＳＤＳ電気泳動により分析した。いずれの形質転換体の培養液から調製した上清画分（無細胞抽出液）においても、分子量約３３，０００の位置にＩＰＴＧにより発現誘導されたと考えられるペプチドのバンドを確認した。
ＧＳＴ融合ペプチドを含む各々の無細胞抽出液から、ＧＳＴに対して親和性のあるＧＳＴｒａｐ　ＨＰカラム（ＧＥヘルスケア・バイオサイエンス社）を用いたアフィニティークロマトグラフィーを使用して、ＧＳＴ融合ペプチドを粗精製した。具体的には、無細胞抽出液をＧＳＴｒａｐ　ＨＰカラムに添加し、標準緩衝液（２０ｍＭ　ＮａＨ２ＰＯ４－Ｎａ２ＨＰＯ４、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）でカラムを洗浄し、続いて溶出用緩衝液（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、２０ｍＭグルタチオン、ｐＨ８．０）で目的のＧＳＴ融合ペプチドを溶出した。
ｐＧＥＸ－６Ｐ－１ベクターのマルチクローニングサイトに遺伝子を導入すると、配列特異的プロテアーゼＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ　Ｐｒｏｔｅａｓｅ（ＧＥヘルスケア・バイオサイエンス社）でＧＳＴを切断することが可能なアミノ酸配列が、ＧＳＴと目的タンパク質の間に導入される。ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ　Ｐｒｏｔｅａｓｅを用いて、添付プロトコルに従いＧＳＴ切断反応を行った。
ＧＳＴを切断したサンプルから、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ　７５　１０／３００　ＧＬカラム（ＧＥヘルスケア・バイオサイエンス社）を用いたゲルろ過クロマトグラフィーにて、目的のペプチドの精製を行った。標準緩衝液で平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ　７５　１０／３００　ＧＬカラムに、各々の反応溶液を添加し、目的のタンパク質を、切断したＧＳＴやＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ　Ｐｒｏｔｅａｓｅから分離精製した。なお、以上のカラムを用いたクロマトグラフィーによるペプチド精製は、全てＡＫＴＡｐｒｉｍｅ　ｐｌｕｓシステム（ＧＥヘルスケア・バイオサイエンス社）を利用して実施した。また、ＧＳＴ切断後の各々のペプチドのアミノ酸配列は、Ｎ末端側に、ベクターｐＧＥＸ－６Ｐ－１由来のＧｌｙ－Ｐｒｏ－Ｌｅｕ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒを含む。
（実施例３）取得した各種Ｃドメイン変異体のヒトＩｇＧとの親和性評価
表面プラズモン共鳴を利用したバイオセンサーＢｉａｃｏｒｅ　３０００（ＧＥヘルスケア・バイオサイエンス社）を用いて、実施例２で取得したペプチドの免疫グロブリンとの親和性を解析した。ヒト血漿から分画したヒト免疫グロブリンＧ製剤（以後は、ヒトＩｇＧと記する）をセンサーチップに固定化し、各ペプチドをチップ上に流して、両者の相互作用を検出した。
ヒトＩｇＧのセンサーチップＣＭ５への固定化は、Ｎ－ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ（ＮＨＳ）、および、Ｎ－ｅｔｈｙｌ－Ｎ’－（３－ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ　ｈｙｄｒｏｃｈｒｏｒｉｄｅ（ＥＤＣ）を用いたアミンカップリング法にて行い、ブロッキングにはＥｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅを用いた（センサーチップや固定化用試薬は、全てＧＥヘルスケア・バイオサイエンス社）。ヒトＩｇＧ溶液は、ガンマグロブリン（ニチヤク社）を標準緩衝液（２０ｍＭ　ＮａＨ２ＰＯ４－Ｎａ２ＨＰＯ４、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）に１．０ｍｇ／ｍＬになるよう溶解して調製した。ヒトＩｇＧ溶液を、固定化用緩衝液（１０ｍＭ　ＣＨ３ＣＯＯＨ－ＣＨ３ＣＯＯＮａ、ｐＨ４．５）で１０倍に希釈し、Ｂｉａｃｏｒｅ　３０００付属のプロトコルに従い、センサーチップへ固定した（レゾナンス・ユニットにして３０００ＲＵ程度）。また、チップ上の別のフローセルに対して、ＥＤＣ／ＮＨＳにより活性化した後にＥｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅを固定化する処理を行うことで、ネガティブ・コントロールとなるリファレンスセルも用意した。
各ペプチドは、ランニング緩衝液（２０ｍＭ　ＮａＨ２ＰＯ４－Ｎａ２ＨＰＯ４、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、０．００５％　Ｐ－２０、ｐＨ７．４）を用いて、１０～１０００ｎＭの範囲で適宜調製し（各々について、異なる濃度の溶液を３種類調製）、それぞれ流速４０μＬ／ｍｉｎで６０秒間センサーチップに添加した。測定温度２５℃にて、添加時（結合相、６０秒間）、および、添加終了後（解離相、６０秒間）の結合反応曲線を順次観測した。観測終了後に、２５ｍＭ　ＮａＯＨ（３０秒間）を添加してセンサーチップを再生した。この操作は、センサーチップ上に残ったペプチドの除去が目的であり、固定化したヒトＩｇＧの結合活性がほぼ完全に戻ることを確認した。得られた結合反応曲線（リファレンスセルの結合反応曲線を差し引いた結合反応曲線）に対して、システム付属ソフトＢＩＡ　ｅｖａｌｕａｔｉｏｎを用いた１：１の結合モデルによるフィッティング解析を行い、ペプチドの、ヒトＩｇＧに対する親和定数（ＫＡ＝ｋｏｎ／ｋｏｆｆ）を算出した。その結果を表６に示す。
各種単ドメイン型Ｃドメイン変異体はヒトＩｇＧに対して結合活性を示した。変異体（１）Ｃ－Ｇ２９Ａ／Ｓ３３Ｅ／Ｑ５５Ｅ．１ｄ、および、変異体（２）Ｃ－Ｇ２９Ａ／Ｓ３３Ｅ／Ｋ７Ｅ／Ａ４６Ｅ．１ｄの結合パラメータは、（０）Ｃ－Ｇ２９Ａ／Ｓ３３Ｅ．１ｄ（比較例）と同程度であった。変異体（３）Ｃ－Ｇ２９Ａ／Ｓ３３Ｅ／Ｋ７Ｅ／Ｈ１８Ｄ／Ｖ４０Ｄ／Ａ４６Ｄ／Ｑ５５Ｅ．１ｄの結合パラメータは、解離速度定数ｋｏｆｆはＣ－Ｇ２９Ａ／Ｓ３３Ｅ．１ｄと同程度であったが、結合速度定数ｋｏｎは優位に小さく、親和定数ＫＡは１／１０程度であった。しかし、適度な結合力の低下は、保持した抗体を分離（溶出）する際に有利に働く可能性もあり、必要最低限な結合力は保持できている。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
（実施例４）取得した各種Ｃドメイン変異体の分子表面特性の評価
実施例２で取得した各種単ドメイン型Ｃドメイン変異体の陰イオン交換クロマトグラフィー実験を行い、変異体の陰イオン性の違いを解析した。
各種単ドメイン型Ｃドメイン変異体のタンパク質溶液を、遠心式フィルターユニットであるアミコン（メルクミリポア社）を用いて、濃縮しながら、陰イオン交換用緩衝液Ａ（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．０）に１００倍程度希釈した。このサンプルを、ＡＫＴＡｐｒｉｍｅ　ｐｌｕｓシステムを利用して、陰イオン交換用緩衝液Ａにて平衡化した陰イオン交換カラムＭｏｎｏ　Ｑカラム（ＧＥヘルスケア・バイオサイエンス社）に添加し、陰イオン交換用緩衝液Ａで洗浄後、陰イオン交換緩衝液Ａと陰イオン交換緩衝液Ｂ（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１．０Ｍ　ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）を利用した塩濃度勾配（Ｂ：５％→４５％、２０ＣＶ）にて、途中に溶出される目的タンパク質をＵＶでモニタリングした。各々のクロマトグラフィー・プロファイルを重ね合わせて図２に示した。
図２に示した通り、本発明のペプチドは、全て、Ｃ－Ｇ２９Ａ／Ｓ３３Ｅ．１ｄ（比較例）よりも長いピークの保持時間を示した（ピークが後ろに位置した）。これは、本発明のペプチドをカラムから解離するのに、Ｃ－Ｇ２９Ａ／Ｓ３３Ｅ．１ｄよりも高い塩濃度が必要であることを意味する。酸性アミノ酸の変異導入によって、分子表面の酸性基（カルボキシル基）由来の陰イオン性が増強されており、実施例１における設計の有効性が実証された。ペプチドの陰イオン性の強化により、当該ペプチドをリガンドとして固定化した場合の陽イオン交換機能が増強されたことになり、リガンドとしての抗体分離能が変異導入前に比べて向上すると考えられる。実施例１～４の結果は、本発明によって、プロテインＡの抗体結合能を損なうことなく、プロテインＡの表面電荷（陽イオン交換作用）を効果的に改変できることを示している。

Claims (22)

  1. 下記（１）～（３）のいずれかの免疫グロブリンＧ結合性ペプチド：
    （１）配列番号１のアミノ酸配列、または配列番号２のアミノ酸配列において、第７位、第１８位、第３９位、第４０位、第４６位、第５４位、および、第５５位のアミノ酸からなる群から選択される１以上のアミノ酸が、酸性アミノ酸に置換されているアミノ酸配列を有する免疫グロブリンＧ結合性ペプチド；
    （２）上記（１）のアミノ酸配列において、さらに第７位、第１８位、第３９位、第４０位、第４６位、第５４位、および、第５５位のアミノ酸以外の、１または数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失および／または付加されているアミノ酸配列を有する免疫グロブリンＧ結合性ペプチド；
    （３）上記（１）のアミノ酸配列に対して８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する免疫グロブリンＧ結合性ペプチド（但し、上記（１）において置換により導入された酸性アミノ酸は維持されるものとする）。
  2. 前記酸性アミノ酸が、側鎖にカルボキシル基を有する酸性アミノ酸である、請求項１に記載の免疫グロブリンＧ結合性ペプチド。
  3. 前記側鎖にカルボキシル基を有する酸性アミノ酸が、アスパラギン酸またはグルタミン酸である、請求項２に記載の免疫グロブリンＧ結合性ペプチド。
  4. 前記酸性アミノ酸に置換されるアミノ酸が、第７位、第１８位、第４０位、第４６位、および、第５５位のアミノ酸からなる群から選択される１以上のアミノ酸である、請求項１～３のいずれかに記載の免疫グロブリンＧ結合性ペプチド。
  5. 前記置換、挿入、欠失および／または付加されるアミノ酸が、第１位、第２位、第３位、第４位、第６位、第２３位、第２９位、第３３位、第３５位、第３６位、第３７位、第４２位、第４９位、第５０位、第５７位、および、第５８位のアミノ酸からなる群から選択される１以上のアミノ酸である、請求項１～４のいずれかに記載の免疫グロブリンＧ結合性ペプチド。
  6. 前記置換、挿入、欠失および／または付加されるアミノ酸が、第２９位、第３３位、第３６位、および、第３７位のアミノ酸からなる群から選択される１以上のアミノ酸である、請求項５に記載の免疫グロブリンＧ結合性ペプチド。
  7. ２以上のアミノ酸が酸性アミノ酸に置換されている、請求項１～６のいずれかに記載の免疫グロブリンＧ結合性ペプチド。
  8. ３以上のアミノ酸が酸性アミノ酸に置換されている、請求項１～７のいずれかに記載の免疫グロブリンＧ結合性ペプチド。
  9. ４以上のアミノ酸が酸性アミノ酸に置換されている、請求項１～８のいずれかに記載の免疫グロブリンＧ結合性ペプチド。
  10. 請求項１～９のいずれかに記載の免疫グロブリンＧ結合性ペプチドを２個以上連結した複数ドメインを有する、免疫グロブリンＧ結合性ペプチド。
  11. 請求項１～１０のいずれかに記載の免疫グロブリンＧ結合性ペプチドをコードする塩基配列を含むＤＮＡ。
  12. 請求項１１に記載のＤＮＡを含むベクター。
  13. 請求項１２に記載のベクターを宿主細胞に導入して得られる形質転換体。
  14. 請求項１～１０のいずれかに記載の免疫グロブリンＧ結合性ペプチドを水不溶性担体に固定化して得られるアフィニティー分離マトリックス。
  15. 免疫グロブリンＧまたは免疫グロブリンＧ誘導体を請求項１４に記載のアフィニティー分離マトリックスと接触させる工程、および、アフィニティー分離マトリックスに結合した免疫グロブリンＧまたは免疫グロブリンＧ誘導体を、アフィニティー分離マトリックスから分離する工程を含む、免疫グロブリンＧまたは免疫グロブリンＧ誘導体の製造方法。
  16. アフィニティー精製用リガンドのアミノ酸配列中の酸性アミノ酸数を増加させることにより、陽イオン交換能を向上させる工程を含む、改良型アフィニティー精製用リガンドの製造方法。
  17. 酸性アミノ酸数の増加が、酸性アミノ酸への置換変異、および／または酸性アミノ酸の付加によるものである、請求項１６に記載の改良型アフィニティー精製用リガンドの製造方法。
  18. 前記アフィニティー精製の対象が、免疫グロブリンＧまたは免疫グロブリンＧ誘導体である、請求項１６または１７に記載の改良型アフィニティー精製用リガンドの製造方法。
  19. 前記アフィニティー精製用リガンドが、プロテインＡ、プロテインＧ、または、プロテインＬの免疫グロブリンＧ結合性ドメインである、請求項１６～１８のいずれかに記載の改良型アフィニティー精製用リガンドの製造方法。
  20. 前記酸性アミノ酸数の増加が、２以上の増加である、請求項１６～１９のいずれかに記載の改良型アフィニティー精製用リガンドの製造方法。
  21. 前記酸性アミノ酸数の増加が、３以上の増加である、請求項１６～２０のいずれかに記載の改良型アフィニティー精製用リガンドの製造方法。
  22. 前記酸性アミノ酸数の増加が、４以上の増加である、請求項１６～２１のいずれかに記載の改良型アフィニティー精製用リガンドの製造方法。
    　
    　
    　
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