WO2015041430A1 - 아디포넥틴으로부터 유래한 펩타이드를 포함하는 조성물 - Google Patents

아디포넥틴으로부터 유래한 펩타이드를 포함하는 조성물 Download PDF

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Definitions

  • the present invention relates to a pharmaceutical or cosmetic composition
  • a pharmaceutical or cosmetic composition comprising a peptide fragment (peptide fragment or small peptide) derived from adiponectin.
  • the peptide has an activity of promoting skin regeneration and moisturizing and inhibiting wrinkles of the skin; It also has allergic or inflammatory inhibitory activity and metastasis inhibitory activity of cancer cells.
  • Wounds are sometimes referred to as wounds, and their symptoms include pain, bleeding, scarring, and dysfunction. Wound healing occurs through processes such as inflammatory reactions, granulation tissue formation, re-epithelialization and angiogenesis. This process consists of the action of growth factors, cytokines, neurohormones, etc. secreted from fibroblasts, adipocytes, blood-derived cells and sensory neurons, and thus proliferation of epidermal cells and generation of extracellular matrix.
  • MMPs matrix metalloproteinases
  • the protective response of the living body to restore the structure and function of tissues damaged by infection, trauma, etc. are collectively called an inflammatory response. Mobilization of leukocytes to the site of inflammation is important for rapid resolution of infection and repairing tissue damage resulting from various traumas. However, faulty or persistent inflammatory reactions cause damage and disease of human tissue.
  • inflammatory diseases are caused by bacterial or viral infections such as meningitis, enteritis, dermatitis, uveitis, encephalitis, adult respiratory distress syndrome, or non-infectious factors such as trauma, autoimmune diseases, and organ transplant rejection. Inflammatory diseases are classified into acute and chronic inflammatory diseases in which symptoms or pathological features are distinguished.
  • Infiltration of leukocytes into the site of inflammation is essential for an inflammatory response to occur, which involves the involvement of several cell adhesion molecules. That is, the leukocytes moved to the blood vessels of the inflammation site by the induction of chemokine secreted from the inflammation site rotates on the surface of the vascular endothelial cells while reducing the movement speed, and the white blood cells stop the rotation and endothelial cell wall. It can be divided into an adhesion stage and a transmigration stage of infiltration of capillaries and bottom membranes. This last step, or transmigration stage, is called diapedesis.
  • cancer cells are supplied with nutrients and oxygen, and cancer cells are metastasized by angiogenesis.
  • Cancer cells not only grow indefinitely at specific sites, but also move away from existing growth sites and move to new sites to grow. This process is called metastasis.
  • the metastasis process involves the steps of cancer cells turning into highly mobile mesenchymal cells, leaving the existing tissues, invading and moving surrounding connective tissues and capillaries, and moving out of blood vessels and out of blood vessels, within connective tissues. Migration and growth at new sites.
  • Adiponectin is a type of adipokine, a protein hormone specifically secreted by adipocytes. It enhances insulin function and induces insulin resistance, leading to cardiovascular diseases such as hyperglycemia, hyperinsulinemia, obesity, and atherosclerosis. Plays an important role in controlling the back.
  • adiponectin has a function of inhibiting cancer cell metastasis and inflammatory response.
  • Adiponectin promotes the expression of filaggrin, hyaluronic acid and extracellular matrix in the skin as well as proliferation of keratinocytes to perform wound healing, fibrosis inhibition, skin wrinkle improvement, and moisturizing.
  • the inventors have found that peptide fragments or small peptides having a specific sequence derived from aniponectin promote the proliferation of fibroblasts and induce the production of extracellular matrix such as collagen, thereby providing excellent activity for wound healing and skin regeneration. It was found that It has also been found to have skin moisturizing activity by promoting the expression of filaggrins and inducing the formation of a skin barrier. Furthermore, it has been found that by suppressing extravasation of leukocytes and invasion of cancer cells, it is possible to suppress allergic reactions and inflammatory reactions (particularly skin inflammatory reactions), and also inhibit cancer cell metastasis.
  • an object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition and a cosmetic composition comprising a specific peptide fragment derived from adiponectin as an active ingredient.
  • a pharmaceutical composition for preventing or treating skin diseases comprising a peptide selected from the group consisting of peptides consisting of amino acid sequences of SEQ ID NOs: 1 to 6 as an active ingredient, and comprising a pharmaceutically acceptable carrier.
  • a composition is provided.
  • the skin disease may be dermatitis, skin wrinkles, wounds, or dry skin; Preferably it may be at least one selected dermatitis from the group consisting of allergic dermatitis, atopic dermatitis, contact dermatitis, acne dermatitis, dermatitis caused by ultraviolet light, eczema and psoriasis.
  • a cosmetic composition for inhibiting or improving skin disorders comprising a peptide selected from the group consisting of peptides consisting of amino acid sequences of SEQ ID NOs: 1 to 6 as an active ingredient.
  • the skin disorder may be dermatitis, skin wrinkles, or dry skin, preferably skin wrinkles or dry skin.
  • Peptides selected from the group consisting of peptides of the present invention ie, peptides consisting of amino acid sequences of SEQ ID NOs: 1 to 6, have excellent activity against wound healing and skin regeneration by promoting the proliferation of fibroblasts and inducing the production of extracellular matrix such as collagen. Has In addition, it has a skin moisturizing activity by promoting the expression of filaggrin to induce the formation of a skin barrier. Accordingly, the peptides may be usefully applied to a pharmaceutical composition for promoting wound healing or wound treatment, a cosmetic composition for inhibiting skin wrinkle formation, and a cosmetic composition for moisturizing skin.
  • the peptides can suppress allergic and inflammatory responses (especially skin inflammatory responses) by inhibiting extravasation of leukocytes and invasion of cancer cells, and can also inhibit metastasis of cancer cells. Accordingly, the peptides may be usefully applied to pharmaceutical compositions for preventing or treating allergic or inflammatory diseases, cosmetic compositions for suppressing or improving skin allergies or dermatitis, and pharmaceutical compositions for inhibiting cancer metastasis.
  • Figure 1 shows the results of evaluating the effect of the peptides according to the invention on the proliferation of fibroblasts.
  • Figure 2 shows the results of evaluating the effect of the peptides according to the invention on collagen synthesis in fibroblasts.
  • Figure 3 shows the results of evaluating the effect of the peptide of the present invention on profilaggrin synthesis.
  • 4A to 4D show the results of evaluating the effect of the peptide of the present invention on NF- ⁇ B activity.
  • Figure 5 shows the result of measuring the extravasation of the U937 cells when the peptide of the present invention in the human monocyte cell line U937.
  • Figure 6 shows the results of measuring the degree of invasion to metrigel when the human breast cancer cell line MCF-7 treated with the peptide of the present invention.
  • the term " skin disease" includes all diseases occurring on the skin, and particularly includes diseases caused by adiponectin-mediated abnormalities of skin function. Examples of such skin diseases include dermatitis, skin wrinkles, wounds, and dry skin.
  • the dermatitis includes allergic dermatitis, atopic dermatitis, contact dermatitis, acne dermatitis, dermatitis caused by ultraviolet light, eczema, psoriasis and the like.
  • the skin wrinkles include skin wrinkles associated with ultraviolet irritation and aging.
  • the wound includes skin damage caused by burns or ultraviolet irritation.
  • the dry skin includes xeroderma, Sjogren's syndrome and the like.
  • skin disorder includes all disorders occurring on the skin, and particularly includes disorders caused by adiponectin-mediated abnormalities in skin function. Examples of such skin disorders include dermatitis, skin wrinkles, and dry skin.
  • the dermatitis includes allergic dermatitis, atopic dermatitis, contact dermatitis, acne dermatitis, dermatitis caused by ultraviolet light, eczema, psoriasis and the like.
  • the skin wrinkles include skin wrinkles associated with ultraviolet irritation and aging.
  • the skin dryness includes dry skin, Sjogren's syndrome and the like.
  • peptide fragments of various lengths from adiponectin and searched for their activity.
  • certain peptide fragments of short length consisting of 3 to 5 amino acids are excellent for wound healing and skin regeneration by promoting the proliferation of fibroblasts and inducing the production of extracellular matrix such as collagen. It was found to have activity. It has also been found to have skin moisturizing activity by promoting the expression of filaggrins and inducing the formation of a skin barrier.
  • the peptides can suppress allergic and inflammatory responses (especially skin inflammatory responses) by inhibiting extravasation of leukocytes, and inhibit metastasis of cancer cells (especially skin cancer cells) by inhibiting cancer cell infiltration.
  • the peptide fragments are shown in Table 1 below.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating skin diseases, comprising a peptide selected from the group consisting of peptides consisting of amino acid sequences of SEQ ID NOs: 1 to 6 as an active ingredient, and comprising a pharmaceutically acceptable carrier. do.
  • the skin disease may be skin allergy, dermatitis, skin wrinkles, wounds, or dry skin, preferably allergic dermatitis, atopic dermatitis, contact dermatitis, acne dermatitis, ultraviolet rays Dermatitis, eczema and psoriasis may be one or more of the dermatitis selected from the group consisting of.
  • the present invention comprises a peptide selected from the group consisting of peptides consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 to 6 as an active ingredient, cancer suppression (cancer metastasis) comprising a pharmaceutically acceptable carrier, preferably It provides a pharmaceutical composition for inhibiting skin cancer metastasis.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may include a pharmaceutically acceptable carrier, and may include, for example, excipients such as lactose and corn starch, lubricants such as magnesium stearate, known and usable emulsifiers, suspensions, buffers, and isotonic agents. Topics, and the like.
  • the pharmaceutical compositions of the invention may be formulated in oral or parenteral dosage forms, preferably parenteral dosage forms.
  • a sterile solution of the active ingredient is usually prepared and may comprise a buffer which can suitably adjust the pH of the solution, and for intravenous administration isotonic in the formulation. May be included to impart this.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be in the form of an aqueous solution containing a pharmaceutically acceptable carrier such as saline having a pH of 7.4, and may be locally introduced into the patient's intramuscular blood flow in the form of a solution.
  • a pharmaceutically acceptable carrier such as saline having a pH of 7.4
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be administered at a dose of about 1 to 2000 mg / kg per day to a patient suffering from a skin disease such as skin allergy, dermatitis, skin wrinkles, wounds, dry skin, or a cancer disease. Appropriate dosages will generally vary depending on the age, weight and symptoms of the patient.
  • the present invention also includes a functional cosmetic composition comprising the peptide as an active ingredient. That is, the present invention provides a cosmetic composition for inhibiting or improving skin disorders comprising a peptide selected from the group consisting of peptides consisting of amino acid sequences of SEQ ID NOs: 1 to 6 as an active ingredient.
  • the skin disorder may be dermatitis, skin wrinkles, or dry skin, preferably skin wrinkles or dry skin.
  • the cosmetic composition of the present invention may be prepared in various forms according to a conventional cosmetic preparation method.
  • the cosmetic composition may be prepared in the form of a cosmetic product containing the peptide, lotion, cream, lotion, etc., which may be diluted with a conventional cleansing liquid, astringent liquid and moisturizing liquid.
  • the cosmetic composition may include conventional adjuvants such as stabilizers, solubilizers, vitamins, pigments, and flavorings commonly used in the field of cosmetic compositions.
  • the content of the peptide may be contained in an amount effective to achieve an allergy or skin inflammation improving effect, for example, in an amount of 0.001 to 10% by weight based on the total weight of the composition, preferably about 0.01 It may be contained in an amount of 1 to 1% by weight.
  • Peptides of SEQ ID NO: 1 to 6 were synthesized by the FMOC solid-phase method using an automated synthesizer (PeptrEx-R48, Peptron, Daejeon, Korea). The synthesized peptide was purified and analyzed by reverse-phase HPLC using a C18 analytical RP column (Shiseido capcell pak) (Prominence LC-20AB, Shimadzu, Japan), and mass spectrometry (HP 1100 Series LC). / MSD, Hewlett-Packard, Roseville, USA).
  • Peptides of SEQ ID NO: 1 to 6 were dissolved in phosphate buffered saline (PBS) to prepare a concentration of 1 M.
  • PBS phosphate buffered saline
  • the obtained protein solution was diluted with PBS and used in the following test example.
  • Test Example 1 Proliferation promoting test of mouse fibroblast line NIH3T3
  • mice fibroblasts NIH3T3 (ATCC CRL-1658, USA) were dispensed in 100 ⁇ l of DMEM medium and incubated in 37 ° C., 5% CO 2 incubator for 24 hours. 100 ⁇ l of a peptide solution of 10 ⁇ M of SEQ ID NOS: 1, 2, 3 and 5 were added. Then incubate for 24, 48, 72 hours, treat for 2 hours with 10 ⁇ l of CCK-8 (Dojindo Laboratories, Japan) per well and absorbance at 475 nm with Spectramax plus 190 plate reader (Molecular Devices, USA). Measured. The result is shown in FIG.
  • profilaggrin is a major element constituting the skin barrier, whether human protein is promoted in the keratinocytes by treatment of the peptide of the present invention using human epidermal keratinocyte HaCaT (DKFZ, Heidelberg, Germany) Evaluated.
  • Human epidermal keratinocytes were treated with 0.1, 1.0 and 10 ⁇ M peptides of SEQ ID NOs: 3 and 5.
  • Western blotting analysis was performed on the cell extracts to measure the change in the amount of propyllagrin expression, and the results are shown in FIG. 3.
  • the expression level of propyllagrin was increased in a concentration-dependent manner by the peptides of SEQ ID NOs: 3 and 5. Therefore, it can be seen that the peptide according to the present invention has skin moisturizing activity by promoting expression of filaggrin.
  • In situ proximity ligation assay was used to analyze the effect of the peptide of the present invention on the activation of NF- ⁇ B transcriptional regulator protein.
  • the test was purchased from Duolink ® In Situ reagent from Olink Bioscience, Sweden and used for the test.
  • NIH3T3 2.5 ⁇ 10 4 cells were plated in 12 well glass plated 24-well plates and stabilized for 24 hours.
  • 0.1, 1, 10 ⁇ M of the peptides of SEQ ID NOs: 1, 2, 3 and 5 were added and treated for 1 hour after TNF- ⁇ (25 ⁇ g / ml).
  • TNF- ⁇ 25 ⁇ g / ml
  • a drop of blocking solution was dropped and treated at 37 ° C. for 30 minutes.
  • Anti-p50 mouse monoclonal antibody (NF ⁇ B p50 (4D1): sc-53744, Santa Cruz Biotechnology, INC., USA) and anti-p65 rabbit monoclonal antibody (NF- ⁇ B p65) were used to determine the degree of nuclear migration of NF- ⁇ B. (D14E12) the XP ® rabbit mAb, cell signaling Technology , USA) and treated at 37 °C the cell. After 30 minutes, the solution was added with PLA probe solution, treated at 37 ° C. for 1 hour, and further treated with ligation solution for 30 minutes.
  • FIGS. 4A to 4D results are shown in FIGS. 4A to 4D. same.
  • FIGS. 4A-4D when the peptides of SEQ ID NOs: 1, 2, 3 and 5 were treated, the migration of NF- ⁇ B into the nucleus was reduced by about 25-60% of the control group. This indicates that the peptides according to the present invention inhibit NF- ⁇ B activation, which plays a major role in the synthesis of inflammatory cytokines.
  • Human umbilical vein endothelial cells were cultured in the Wikan of the Boyden chamber. The culture supernatant was removed, and human monocytes (U937; Human monocyte) (U937), which had not been pretreated or pretreated for 1 hour with the peptide solution of SEQ ID NOs. 3 to 5 (30 ⁇ g / ml) prepared in Example 2, were added to each treatment. 10 5 each was added. In the lower compartment, incubation of monocytes was performed by adding a culture solution containing the supernatant obtained by centrifugation of NIH / 3T3, a mouse fibroblast, in a DMEM serum-free medium containing 0.005% vitamin C and 0.1% bovine albumin. Induced.
  • the number of cells infiltrated into the lower cell while incubating for 6 hours was measured. The test was repeated three times, and the results are shown in FIG. 5.
  • the control group was treated with phosphate buffered saline containing no peptide.
  • the number of mononuclear cells leaked out of the blood vessels significantly decreased (about 50-70% of the control group) compared to the control group.
  • the peptides of the present invention are expected to have an effective inflammatory inhibitory activity.
  • the control group was treated with only phosphate buffered saline containing no peptide.
  • the result is shown in FIG.
  • Figure 6 when treated with the peptide of SEQ ID NOS: 3 to 5 of the present invention, the degree of infiltration of the bottom membrane of human breast cancer cells is suppressed to about 80% compared to the control group without the peptide.
  • the peptides of the present invention may have an effective cancer cell metastasis inhibitory activity.

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Abstract

본 발명은 아디포넥틴에서 유래한 펩타이드 단편, 즉 서열번호 1 내지 6의 아미노산 서열로 구성된 펩타이드로 이루어진 군으로부터 선택된 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 약학 또는 화장료 조성물을 제공한다. 상기 펩타이드는 피부재생 및 보습을 촉진하고, 피부의 주름을 억제하는 활성을 가지며; 또한 알러지 또는 염증 억제 활성 및 암세포의 전이 억제 활성을 갖는다.

Description

아디포넥틴으로부터 유래한 펩타이드를 포함하는 조성물
본 발명은 아디포넥틴(adiponectin)으로부터 유래한 펩타이드 단편(peptide fragment 또는 small peptide)을 포함하는 약학 또는 화장료 조성물에 관한 것이다. 상기 펩타이드는 피부재생 및 보습을 촉진하고, 피부의 주름을 억제하는 활성을 가지며; 또한 알러지 또는 염증 억제 활성 및 암세포의 전이 억제 활성을 갖는다.
상처는 창상이라고 칭해지기도 하며, 그 따른 증세로는 통증, 출혈, 흉터형성, 기능장애 등이 있다. 상처치유는 염증반응, 육아조직형성, 재상피화 및 혈관신생 등의 과정을 거쳐 일어난다. 이 과정은 섬유모세포, 지방세포, 혈액 유래 세포 및 감각 뉴우런으로부터 분비되는 성장인자, 사이토카인, 신경호르몬 등의 작용과 이에 따른 표피세포의 증식과 세포외기질의 생성으로 이루어진다.
피부의 결합조직이 재생되거나 파괴되지 않고 온전히 그 탄성과 강도를 유지하기 위해서는, 피부에 존재하는 콜라겐 I, III (Type I, III collagens), 엘라스틴(elastin), 파이브로넥틴(fibronectin)과 같은 세포외 기질(ECM: Extracellular matrix) 단백질의 생성 및 유지가 중요하다. 자연 노화 또는 자외선에 대한 만성적인 노출은 ECM 단백질의 손실과 피부조직의 탄성과 강도를 감소시키며, 이러한 현상들은 주름형성과 같은 특징적인 피부 노화와 강하게 연관되어 있다. 기저막 단백질 분해 효소(MMPs: matrix metalloproteinases)는 진피 ECM을 분해하는데 있어서 중요한 효소로 작용한다. 자외선 조사 등과 같은 스트레스 조건하에서 각질형성세포(keratinocytes) 및 진피 섬유아세포에서의 MMPs의 과발현은 ECM 단백질을 분해하는데 기여함으로써, 피부에 주름을 형성하게 한다.
감염, 외상 등에 의해 손상된 조직의 구조와 기능을 복원하기 위한 생체의 방어 반응을 통칭하여 염증 반응이라 한다. 염증 부위로의 백혈구 세포의 이동(mobilization)은 감염에 대한 신속한 해결(resolution) 및 다양한 외상으로부터 발생하는 조직 손상을 복구하는데 중요하다. 그러나, 잘못되거나 지속적인 염증 반응은 인체 조직의 손상과 질환을 야기한다. 예를 들어, 염증 질환은 뇌척수막염, 장염, 피부염, 포도막염, 뇌염, 성인성 호흡곤란 증후군 등과 같이 세균이나 바이러스에 의한 감염이나, 외상, 자가면역질환과 장기이식 거부 등과 같은 비감염 요인에 의하여 발생한다. 염증 질환은 증상이나 병리학적 특징이 구분되는 급성 및 만성 염증 질환으로 분류된다. 알러지나 세균과 바이러스의 감염과 같은 급성 염증의 국소적 증상은 혈류 및 혈관 크기의 변화, 혈관 투과성의 변화 및 백혈구의 침윤 등으로 나타난다. 이에 반하여 류마티스 관절염, 죽상 동맥경화증. 만성 신장염, 간경화증 등을 비롯한 만성 염증의 주요 병리학적 특징은 염증 유발 요인이 제거가 되지 않아 염증부위로 단핵구, 호중구, 림프구, 형질세포들이 지속적으로 침윤하는 것으로, 그 결과 염증 반응이 만성화된다.
염증 반응이 일어나기 위하여서는 백혈구의 염증 부위로의 침윤이 필수적이며, 이는 여러 세포 유착 분자들(cell adhesion molecules)이 관여하는 단계를 포함한다. 즉, 염증 부위에서 분비되는 케모카인(chemokine)의 유도에 의하여 염증부위의 혈관으로 이동한 백혈구들이 이동속도를 줄이면서 혈관 내피 세포 표면에서 회전하는 단계 (Rolling stage), 백혈구들이 회전을 멈추고 내피세포벽에 견고히 부착하는 단계 (Adhesion stage), 모세혈관과 바닥막을 침윤하는 단계 (Transmigration stage)로 구분할 수 있다. 상기 마지막 단계 즉 침윤하는 단계(Transmigration stage)는 혈구누출(diapedesis)로 지칭된다.
발암원(carcinogen)에 의해 변화된 암세포는 정상세포보다 빠르게 증식을 하며 종양(tumors) 덩어리를 형성하고, 주변의 조직에 침투하며 정상적인 신체 기능을 저해한다. 암세포는 혈관신생을 유도함으로써, 영양분과 산소를 공급받을 뿐 아니라, 혈관신생에 의해 암세포가 전이되게 된다. 암세포는 특정부위에서 무한 성장을 할 뿐만 아니라, 기존의 성장부위를 이탈하여 새로운 부위로 이동하여 성장을 하는데 이러한 과정을 전이(metastasis)라고 한다. 전이과정은 암세포가 이동성이 높은 중간엽성 세포로 변화하여 기존 조직에서 이탈하는 단계, 주위 결합조직과 모세혈관을 침윤하고 이동하는 단계, 혈관 내에서 이동한 후 혈관 밖으로 유출하는 단계, 결합조직 내에서의 이동 및 새로운 부위에서의 성장단계 등으로 구분할 수 있다.
한편, 아디포넥틴은 지방세포에서 특이적으로 분비되는 단백질 호르몬인 아디포카인(adipokine)의 일종으로서, 인슐린의 기능을 증진시키고 인슐린 저항성을 유도함으로써 고혈당, 고인슐린증, 비만, 동맥경화와 같은 심혈관질환 등을 조절하는 데에 중요한 역할을 한다. 또한, 아디포넥틴은 암세포의 전이와 염증반응을 억제하는 기능이 있다. 아디포넥틴은 각질세포의 증식뿐만 아니라 피부에서 필라그린(filaggrin), 하이루론산(hyaluronic acid)과 세포외기질의 발현을 촉진함으로써 상처치료, 섬유화 억제, 피부주름개선, 보습 등의 기능을 수행한다.
본 발명자들은 아니포넥틴으로부터 유래된 특정 서열을 갖는 펩타이드 단편들(peptide fragments 또는 small peptides)이 섬유모세포의 증식을 촉진하고 콜라겐과 같은 세포외기질의 생성을 유도함으로써 상처 치유 및 피부 재생에 대한 우수한 활성을 갖는다는 것을 발견하였다. 또한, 필라그린의 발현을 촉진하여 피부장벽(skin barrier)의 형성을 유도함으로써 피부 보습 활성을 갖는다는 것을 발견하였다. 나아가, 백혈구의 혈관외 유출 및 암세포의 침윤을 억제함으로써 알러지 반응 및 염증 반응(특히, 피부 염증 반응)을 억제할 수 있으며, 또한 암세포의 전이를 억제할 수 있음을 발견하였다.
따라서, 본 발명은 아디포넥틴으로부터 유래된 특정 펩타이드 단편을 유효성분으로 포함하는 약학 조성물 및 화장료 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 일 태양에 따라, 서열번호 1 내지 6의 아미노산 서열로 구성된 펩타이드로 이루어진 군으로부터 선택된 펩타이드를 유효성분으로 포함하고, 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, 피부 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물이 제공된다.
본 발명의 약학 조성물에 있어서, 상기 피부 질환은 피부염, 피부 주름, 상처, 또는 피부 건조증일 수 있으며; 바람직하게는 알러지성 피부염, 아토피성 피부염, 접촉성 피부염, 여드름성 피부염, 자외선에 의한 피부염, 습진 및 건선으로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택된 피부염일 수 있다.
본 발명의 다른 태양에 따라, 서열번호 1 내지 6의 아미노산 서열로 구성된 펩타이드로 이루어진 군으로부터 선택된 펩타이드를 유효성분으로 포함하는, 피부 장애의 억제 또는 개선용 화장료 조성물이 제공된다.
본 발명의 화장료 조성물에 있어서, 피부 장애는 피부염, 피부 주름, 또는 피부 건조증일 수 있으며, 바람직하게는 피부 주름 또는 피부 건조증일 수 있다.
본 발명의 펩타이드, 즉 서열번호 1 내지 6의 아미노산 서열로 구성된 펩타이드로 이루어진 군으로부터 선택된 펩타이드는 섬유모세포의 증식을 촉진하고 콜라겐과 같은 세포외기질의 생성을 유도함으로써 상처 치유 및 피부 재생에 대한 우수한 활성을 갖는다. 또한, 필라그린의 발현을 촉진하여 피부장벽(skin barrier)의 형성을 유도함으로써 피부 보습 활성을 갖는다. 따라서, 상기 펩타이드들은 상처 치료 또는 상처 치료 촉진용 약학 조성물, 피부 주름형성 억제용 화장료 조성물, 및 피부 보습용 화장료 조성물에 유용하게 적용될 수 있다.
또한, 상기 펩타이드들은 백혈구의 혈관외 유출 및 암세포의 침윤을 억제함으로써 알러지 반응 및 염증 반응(특히, 피부 염증 반응)을 억제할 수 있으며, 또한 암세포의 전이를 억제할 수 있다. 따라서, 상기 펩타이드들은 알러지 또는 염증 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물, 피부 알러지 또는 피부염의 억제 또는 개선용 화장료 조성물, 및 암 전이(cancer metastasis) 억제용 약학 조성물에도 유용하게 적용될 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 펩타이드가 섬유모세포의 증식에 미치는 영향을 평가한 결과를 나타낸다.
도 2는 본 발명에 따른 펩타이드가 섬유모세포에서 콜라겐 합성에 미치는 영향을 평가한 결과를 나타낸다.
도 3은 본 발명의 펩타이드가 프로필라그린(profilaggrin) 합성에 미치는 영향을 평가한 결과를 나타낸다.
도 4a 내지 도 4d는 본 발명의 펩타이드가 NF-κB 활성에 미치는 영향을 평가한 결과를 나타낸다.
도 5는 사람 단핵구 세포주 U937에 본 발명의 펩타이드를 처리하였을 때, U937 세포의 혈관외유출도를 측정한 결과를 나타낸다.
도 6은 사람 유방암 세포주 MCF-7에 본 발명의 펩타이드를 처리하였을 때, 메트리젤에의 침윤도를 측정한 결과를 나타낸다.
본 명세서에서, "피부 질환(skin disease)"라 함은 피부에 발생하는 질환을 모두 포함하며, 특히 아디포넥틴에 매개되는 피부 기능의 이상(abnormality)에 의한 질환을 포함한다. 상기 피부 질환의 예는 피부염(dermatitis), 피부 주름(skin wrinkle), 상처(wound), 및 피부 건조증(dry skin)을 포함한다. 상기 피부염은 알러지성 피부염(allergic dermatitis), 아토피성 피부염(atopic dermatitis), 접촉성 피부염, 여드름성 피부염, 자외선에 의한 피부염, 습진, 및 건선 등을 포함한다. 상기 피부 주름은 자외선 자극 및 노화에 수반되는 피부주름을 포함한다. 상기 상처는 화상이나 자외선 자극에 의한 피부 손상을 포함한다. 상기 피부 건조증은 건피증(xeroderma), 쇼그렌증후군(Sjogren's syndrome) 등을 포함한다.
본 명세서에서, "피부 장애(skin disorder)"라 함은 피부에 발생하는 장애를 모두 포함하며, 특히 아디포넥틴에 매개되는 피부 기능의 이상에 의한 장애를 포함한다. 상기 피부 장애의 예는 피부염, 피부 주름, 및 피부 건조증을 포함한다. 상기 피부염은 알러지성 피부염, 아토피성 피부염, 접촉성 피부염, 여드름성 피부염, 자외선에 의한 피부염, 습진, 및 건선 등을 포함한다. 상기 피부 주름은 자외선 자극 및 노화에 수반되는 피부주름을 포함한다. 상기 피부 건조증은 건피증, 쇼그렌증후군 등을 포함한다.
본 발명자들은 아디포넥틴으로부터 다양한 길이의 단편을 제조하여, 그 활성을 검색하였다. 놀랍게도, 아디포넥틴으로부터 유래한 펩타이드로서, 3개 내지 5개의 아미노산으로 구성된 짧은 길이를 갖는 특정 펩타이드 단편들이 섬유모세포의 증식을 촉진하고 콜라겐과 같은 세포외기질의 생성을 유도함으로써 상처 치유 및 피부 재생에 대한 우수한 활성을 갖는다는 것을 발견하였다. 또한, 필라그린의 발현을 촉진하여 피부장벽(skin barrier)의 형성을 유도함으로써 피부 보습 활성을 갖는다는 것을 발견하였다. 또한, 상기 펩타이드들은 백혈구의 혈관외 유출을 억제함으로써 알러지 반응 및 염증 반응(특히, 피부 염증 반응)을 억제할 수 있으며, 암세포의 침윤을 억제함으로써 암세포(특히 피부암 세포)의 전이를 억제할 수 있음을 발견하였다. 상기 펩타이드 단편들은 다음 표 1과 같다.
표 1
펩타이드 명칭 서열번호 아미노산 서열
adipo-pep A4 서열번호 1 Tyr-His-Ile-Thr
adipo-pep A3 서열번호 2 His-Ile-Thr
adipo-pep B5 서열번호 3 Leu-Phe-Thr-Tyr-Asp
adipo-pep B4 서열번호 4 Leu-Phe-Thr-Tyr
adipo-pep B3 서열번호 5 Phe-Thr-Tyr
adipo-pep C3 서열번호 6 His-Leu-Thr
따라서, 본 발명은 서열번호 1 내지 6의 아미노산 서열로 구성된 펩타이드로 이루어진 군으로부터 선택된 펩타이드를 유효성분으로 포함하고, 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, 피부 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다. 본 발명의 약학 조성물에 있어서, 상기 피부 질환은 피부 알러지, 피부염, 피부 주름, 상처, 또는 피부 건조증일 수 있으며, 바람직하게는 알러지성 피부염, 아토피성 피부염, 접촉성 피부염, 여드름성 피부염, 자외선에 의한 피부염, 습진 및 건선으로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택된 피부염일 수 있다.
또한, 본 발명은 서열번호 1 내지 6의 아미노산 서열로 구성된 펩타이드로 이루어진 군으로부터 선택된 펩타이드를 유효성분으로 포함하고, 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 암 전이(cancer metastasis) 억제용, 바람직하게는 피부암 전이 억제용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 포함할 수 있으며, 예를 들어, 락토즈, 옥수수전분 등의 부형제, 마그네슘 스테아레이트 등의 윤활제, 공지되어 사용가능한 유화제, 현탁제, 완충제, 등장화제 등을 포함할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 경구 또는 비경구 투여 형태, 바람직하게는 비경구 투여형태로 제제화될 수 있다. 근육내, 복강내, 피하 및 정맥내 투여 형태의 경우, 통상 활성 성분의 멸균 용액을 제조하고, 용액의 pH를 적합하게 조절할 수 있는 완충제를 포함할 수 있으며, 정맥내 투여의 경우 제제에 등장성이 부여되도록 등장화제를 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 약학 조성물은 pH가 7.4인 염수와 같은 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 수용액제의 형태가 될 수 있으며, 용액제의 형태로 국소적으로 환자의 근육내 혈류에 도입할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 피부 알러지, 피부염, 피부 주름, 상처, 피부 건조증 등의 피부 질환 또는 암 질환을 앓고 있는 환자에게 1일 약 1 내지 2000 mg/kg의 용량으로 투여될 수 있다. 적절한 투여량은 환자의 연령, 체중 및 증상에 따라 일반적으로 변경될 수 있다.
본 발명은 또한 상기한 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 기능성 화장료 조성물을 포함한다. 즉, 본 발명은 서열번호 1 내지 6의 아미노산 서열로 구성된 펩타이드로 이루어진 군으로부터 선택된 펩타이드를 유효성분으로 포함하는, 피부 장애의 억제 또는 개선용 화장료 조성물을 제공한다. 본 발명의 화장료 조성물에 있어서, 상기 피부 장애는 피부염, 피부 주름, 또는 피부 건조증일 수 있으며, 바람직하게는 피부 주름 또는 피부 건조증일 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물은 통상의 화장료 제조방법에 따라, 다양한 형태로 제조될 수 있다. 예를 들어, 상기 화장료 조성물은 상기 펩타이드를 함유하는 향장 제품, 화장수, 크림, 로오숀 등의 형태로 제조될 수 있으며, 이는 통상의 클렌징액, 수렴액 및 보습액으로 희석하여 사용될 수 있다. 또한, 상기 화장료 조성물은 화장료 조성물 분야에서 통상적으로 사용되는 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료, 및 향료와 같은 통상적인 보조제를 포함할 수 있다. 상기 화장료 조성물에 있어서, 상기 펩타이드의 함량은 알러지 또는 피부 염증 개선 효과를 달성하기에 유효한 양, 예를 들면 조성물 총 중량에 대하여 0.001 ∼ 10 중량%의 함량으로 함유될 수 있고, 바람직하게는 약 0.01 ∼ 1 중량%의 함량으로 함유될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예 및 시험예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나, 이들 실시예 및 시험예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명이 이들 실시예 및 시험예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 펩타이드의 합성
서열번호 1 내지 6의 펩타이드(상기 표 1 참조)는 자동화합성기(PeptrEx-R48, 펩트론사, 대전, 대한민국)을 이용하여 FMOC solid-phase method로 합성하였다. 합성된 펩타이드는 C18 analytical RP 컬럼 (Shiseido capcell pak)을 사용한 역상 고속액체크로마토그래피(reverse-phase HPLC) (Prominence LC-20AB, Shimadzu사, 일본)로 정제 및 분석하였으며, 질량분석기(HP 1100 Series LC/MSD, Hewlett-Packard사, Roseville, 미국)를 이용하여 동정하였다.
실시예 2. 펩타이드를 포함하는 조성물의 제조
서열번호 1 내지 6의 펩타이드를 인산완충식염수(PBS)에 용해시켜, 1 M의 농도가 되도록 제조하였다. 얻어진 단백질 용액을 PBS로 희석하여 하기 시험예에서 사용하였다.
시험예 1. 생쥐 섬유모세포주 NIH3T3의 증식 촉진 시험
96-웰 마이크로플레이트의 각 웰에 5 X 103 개의 생쥐 섬유모세포주 NIH3T3(ATCC CRL-1658, USA)를 100 ㎕의 DMEM 배지에 분주하고 37 ℃, 5% CO2 인큐베이터에서 24시간 배양한 후, 10 μM의 서열번호 1, 2, 3 및 5의 펩타이드 용액 100 ㎕를 첨가하였다. 이 후 24, 48, 72시간 동안 배양하고, 각 웰 당 10 ㎕의 CCK-8 (Dojindo Laboratories, Japan)으로 2 시간 처리하고, Spectramax plus 190 plate reader(Molecular Devices, USA)로 475 nm에서 흡광도를 측정하였다. 그 결과는 도 1과 같다. 도 1에서 확인할 수 있는 바와 같이, 서열번호 1, 2, 3 및 5의 펩타이드를 처리한 경우, NIH3T3 세포의 증식이 현저히 증가되었다. 이는 본 발명에 따른 펩타이드가 섬유모세포의 증식을 촉진함으로써, 상처치유 및 피부재생 활성을 갖는다는 것을 나타낸다.
시험예 2. 섬유모세포에서의 제1형 프로콜라겐(Procollagen type-1) 발현 활성화 평가
아교섬유 합성의 촉진은 피부노화를 억제할 수 있는 주요 수단이므로, 본 발명의 펩타이드의 처리에 의하여 섬유모세포에서 콜라겐 합성이 촉진되는지를 생쥐 섬유모세포 NIH3T3(ATCC CRL-1658, USA)를 이용하여 평가하였다. 섬유모세포를 서열번호 1, 2, 3 및 5의 펩타이드 0.1, 1 및 10 μM로 처리하였다. 48시간 후, 세포추출물을 대상으로 웨스턴 블롯팅 분석을 실시하여 제1형 프로콜라겐 발현량의 변화를 측정하였으며, 그 결과는 도 2와 같다. 도 2에서 확인할 수 있는 바와 같이, 제1형 프로콜라겐의 발현량은 서열번호 1, 2, 3 및 5의 펩타이드에 의하여 농도의존적으로 증가하였다. 따라서, 본 발명에 따른 펩타이드는 콜라겐 소실에 의한 피부의 노화, 특히 피부 주름을 억제할 수 있음을 확인할 수 있다.
시험예 3. 사람 각질세포주 HaCaT에서의 프로필라그린(Profilaggrin) 발현 조절 평가
프로필라그린(Profilaggrin)은 피부장벽을 구성하는 주요 요소이므로, 본 발명의 펩타이드의 처리에 의하여 각질세포에서 프로필라그린 합성이 촉진되는지를 사람표피 각질세포 HaCaT(DKFZ, Heidelberg, Germany)를 이용하여 평가하였다. 사람 표피 각질세포를 서열번호 3 및 5의 펩타이드 0.1, 1.0 및 10 μM로 처리하였다. 48시간 후, 세포추출물을 대상으로 웨스턴 블롯팅 분석을 실시하여 프로필라그린 발현량의 변화를 측정하였으며, 그 결과는 도 3과 같다. 도 3에서 확인할 수 있는 바와 같이, 프로필라그린의 발현량은 서열번호 3 및 5의 펩타이드에 의하여 농도의존적으로 증가하였다. 따라서, 본 발명에 따른 펩타이드는 필라그린의 발현 촉진에 의한 피부 보습 활성을 가짐을 알 수 있다.
시험예 4. NF-κB 활성 억제 시험
본 발명의 펩타이드가 NF-κB 전사조절 단백질의 활성화에 미치는 영향을 분석하기 위하여 in situ proximity ligation assay 방법을 사용하였다. 상기 시험은 스웨덴 오링크 바이오사이언스(Olink Bioscience, Sweden)로부터 Duolink® In Situ 시약을 구입하여 시험에 사용하였다.
NIH3T3 2.5 × 104개의 세포를 12mm glass가 깔린 24 웰 플레이트에 도말하고 24시간 동안 안정화하였다. 서열번호 1, 2, 3 및 5의 펩타이드 0.1, 1, 10 μM를 첨가하고 1시간 후, TNF-α(25 μg/ml)로 2시간 동안 처리하였다. 4% 포름알데히드로 고정한 세포를 0.1% 트리톤-X로 처리한 후, 한 방울의 blocking solution을 떨어뜨리고 37℃에서 30 분간 처리하였다. NF-κB의 핵 내 이동 정도를 측정하기 위해 항-p50 생쥐단클론항체(NFκB p50 (4D1):sc-53744, Santa Cruz Biotechnology, INC., USA)와 항-p65 토끼단클론항체(NF-κB p65 (D14E12) XP® rabbit mAb, Cell signaling Technology, USA)를 37℃에서 세포에 처리하였다. 30분 후 PLA probe solution으로 첨가하고 37℃에서 1시간 동안 처리한 다음, ligation solution으로 30분간 추가 처리하였다. 마지막으로 amplication solution으로 100분간 처리하고 세척한 후, 공초점 현미경(confocal microscopy)을 이용하여 붉은점으로 나타난 NF-κB 중 세포 핵 안으로 이동한 수를 측정하였으며, 그 결과는 도 4a 내지 도 4d와 같다. 도 4a 내지 도 4d에서 확인할 수 있는 바와 같이, 서열번호 1, 2, 3 및 5의 펩타이드를 처리한 경우, NF-κB의 핵내로의 이동이 대조군의 약 25∼60 % 정도로 감소되었다. 이는 본 발명에 따른 펩타이드가 염증성 사이토카인의 합성에서 주요한 역할을 하는 NF-κB 활성화를 억제한다는 것을 나타낸다.
시험예 5. 단핵구의 시험관 내( in vitro ) 혈관외유출 억제 시험
인간 제대 정맥 내피세포를 보이덴 챔버(Boyden chamber)의 위칸에서 배양하였다. 배양 상층액을 제거하고, 실시예 2에서 제조한 서열번호 3 내지 5의 펩타이드 용액(30 ㎍/ml)으로 1시간 동안 전처리하거나 전처리하지 않은 사람 단핵구 (U937; Human monocyte)를 각 처리구에 2 x 105 개씩 가하였다. 이때 아래칸에는 생쥐 섬유모세포인 NIH/3T3를 0.005% 비타민 C와 0.1% 소혈청알부민이 첨가된 DMEM 무혈청배지에서 16시간 배양한 후 원심분리하여 얻은 상등액이 포함된 배양액을 넣어서 단핵구의 침윤을 유도하였다. 6 시간 동안 배양하면서 아래칸으로 침윤하여 이동한 세포수를 측정하였다. 상기 시험은 3회 반복하였으며, 결과는 도 5와 같다. 대조군은 펩타이드를 포함하지 않은 인산완충식염수를 처리한 군이다. 도 5에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명에 따른 펩타이드를 처리한 경우, 혈관 외로 유출된 단핵세포의 갯수가 대조군에 비해서 유의성있게(대조군의 약 50∼70% 수준) 감소되었다. 백혈구가 혈관을 따라 이동하다가 염증 부위로 이동하기 위해서는 혈관 밖으로 유출되는 과정이 수반됨을 감안할 때, 본 발명의 펩타이드는 효과적인 염증반응 억제 활성을 가질 것으로 기대된다.
시험예 6. 암세포의 침윤 억제능 시험
바닥막 성분의 복합체인 매트리겔 (Matrigel)을 트랜스웰에서 중합반응을 일으킨 후, 1.5 x 105개의 사람 유방암 세포주 MCF-7을 트랜스웰의 상단부에 넣고 서열번호 3 내지 5의 펩타이드를 1 μM의 농도로 처리하여 37℃, 5% CO2 배양기에서 배양하였다. 0.1% BSA를 가하고, 트랜스웰 하단부에는 침윤유도배지(NIH 3T3 세포를 0.005% 비타민 C, 1% BSA, DMEM 혈청제거 배양액에서 24시간 동안 배양하여 얻은 배양상층액)를 넣어준 후 24시간 주기로 트랜스웰의 하단부로 이동한 세포 수를 3회에 걸쳐 측정하였다. 각각의 시험은 3회씩 수행하여 그 결과를 통계처리 하였다. 대조군은 펩타이드가 포함되지 않은 인산완충식염수만을 처리한 군이다. 그 결과는 도 6과 같다. 도 6에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 서열번호 3 내지 5의 펩타이드를 처리한 경우, 펩타이드를 처리하지 않은 대조군에 비해서 인간 유방암 세포의 바닥막을 침윤하는 정도가 약 80% 수준으로 억제된다. 혈관 밖으로 빠져나온 암세포는 바닥막이나 주위 결합조직을 침윤하는 과정을 거쳐 새로운 부위로 전이하는 것을 감안할 때, 본 발명의 펩타이드는 효과적인 암세포 전이 억제 활성을 가짐을 알 수 있다.

Claims (6)

  1. 서열번호 1 내지 6의 아미노산 서열로 구성된 펩타이드로 이루어진 군으로부터 선택된 펩타이드를 유효성분으로 포함하고, 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, 피부 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 피부 질환이 피부염, 피부 주름, 상처, 또는 피부 건조증인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  3. 제2항에 있어서, 상기 피부 질환이 알러지성 피부염, 아토피성 피부염, 접촉성 피부염, 여드름성 피부염, 자외선에 의한 피부염, 습진 및 건선으로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택된 피부염인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  4. 서열번호 1 내지 6의 아미노산 서열로 구성된 펩타이드로 이루어진 군으로부터 선택된 펩타이드를 유효성분으로 포함하는, 피부 장애의 억제 또는 개선용 화장료 조성물.
  5. 제4항에 있어서, 상기 피부 장애가 피부염, 피부 주름, 또는 피부 건조증인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 상기 피부 장애가 피부 주름 또는 피부 건조증인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
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