WO2015080223A1 - アデノ随伴ウイルスの定量方法 - Google Patents

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玉季 赤鹿
克行 百々
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Takara Bio Inc
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    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers

Definitions

  • the present invention relates to an adeno-associated virus (AAV) genome quantification method, an AAV titer measurement method, a composition for quantifying an AAV genome, an AAV genome quantification kit, an AAV quantification method, and an AAV quantification method.
  • AAV adeno-associated virus
  • the present invention relates to a composition and a kit for quantifying AAV.
  • Adeno-associated virus is a linear single-stranded DNA virus belonging to the family Parvoviridae. AAV can infect a wide variety of cells, including humans, and also infects non-dividing cells that have completed differentiation such as blood cells, muscles, and nerve cells. Wild-type AAV is not pathogenic to humans. AAV particles are very stable physicochemically. Because of these characteristics, AAV is being developed as a vector for gene transfer.
  • the AAV particle is composed of a protein capsid having three capsid proteins (VP1, VP2, and VP3) and a single-stranded DNA genome surrounded by the protein capsid.
  • the wild-type AAV genome has a nucleic acid sequence that forms a T-shaped hairpin structure called ITR (Inverted Terminal Repeat) at both ends, and half of the linear single-stranded genome between them is It encodes Rep protein (rep gene) and the other half encodes capsid protein (cap gene).
  • ITR Inverted Terminal Repeat
  • a typical recombinant adeno-associated virus vector has a genome structure in which the rep gene and cap gene of the AAV genome are replaced with desired genes and the like.
  • rAAV vector production methods include a vector plasmid in which a target gene is inserted between ITRs at both ends of AAV, a helper plasmid for supplying viral proteins required for AAV replication and virus particle formation, and AAV Adenovirus helper plasmids having a part of the gene region responsible for the helper action of adenovirus required for growth of cells are collectively introduced into host cells such as 293 cells to produce rAAV vectors in the nucleus of the host cell The method of letting it be mentioned.
  • rAAV vectors are used for gene transfer into cells, it is necessary to prepare rAAV vectors with sufficiently high titers. For this reason, when an rAAV vector is prepared, measurement of its titer is essential.
  • the ITR of the rAAV vector has a secondary structure that is difficult to amplify PCR. For this reason, a foreign gene inserted into the vector is used as a target sequence for measuring the titer of the rAAV vector by real-time PCR. However, when a foreign gene is used as a target sequence, it is necessary to design a primer used for PCR for each constructed vector.
  • Non-patent Document 1 a report on a method for measuring the titer of an rAAV vector by real-time PCR using a TaqMan probe using only the ITR sequence as a target sequence.
  • real-time PCR using a TaqMan probe is costly compared to quantitative real-time PCR using an intercalating dye because it is necessary to synthesize a double-labeled nucleic acid probe.
  • An object of the present invention is to provide a simple and efficient adeno-associated virus (AAV) quantification method, AAV titer measurement method, AAV genome quantification method, composition for quantifying AAV, and quantification of AAV genome It is an object of the present invention to provide a composition, a kit for quantifying AAV, and a kit for quantifying AAV genome.
  • AAV adeno-associated virus
  • the present inventors have found that the AAV genome can be quantified by quantitative real-time PCR using an intercalating dye having only the ITR sequence as a target sequence, The present invention has been completed.
  • a method for quantifying adeno-associated virus genome (A) preparing a composition comprising a specimen, at least one primer pair for amplifying only the nucleic acid sequence contained in the inverted terminal repeat sequence of the adeno-associated virus, and an intercalating dye; (B) a step of performing a nucleic acid amplification reaction using the composition prepared in step (a), and (c) a step of detecting the amplification product obtained in step (b), Including methods.
  • the primer pair consists of a primer consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 2 in the sequence listing and a primer consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 7 or 8 in the sequence listing. [1] Or the method as described in [2].
  • [5] A method for measuring the titer of adeno-associated virus, comprising the step of quantifying an adeno-associated virus genome by the method according to any one of [1] to [4].
  • [6] A composition for quantifying an adeno-associated virus genome, at least one primer pair for amplifying only the nucleic acid sequence contained in the inverted terminal repeat of the adeno-associated virus, and an intercalating dye
  • a composition comprising [7] The composition according to [6], wherein the primer pair comprises a primer comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 in the sequence listing and a primer comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 7 in the sequence listing. object.
  • the primer pair consists of a primer consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 2 in the sequence listing and a primer consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 7 or 8 in the sequence listing.
  • Kit for quantification of adeno-associated virus genome, comprising DNA polymerase, at least one primer pair for amplifying only the nucleic acid sequence contained in the inverted terminal repeat of adeno-associated virus, and intercalating A kit containing a dye.
  • the primer pair comprises a primer containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 in the sequence listing and a primer comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 7 in the sequence listing.
  • the primer pair consists of a primer consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 2 in the sequence listing and a primer consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 7 or 8 in the sequence listing.
  • the kit according to [11] [13] The kit according to any one of [10] to [12], wherein the intercalating dye includes a cyanine dye.
  • cyanine dye used in the present invention [2- [N- (3-dimethylaminopropyl) -N-propylamino] -4- [] represented by the following formula (I) of CAS registration number 163795-75-3 2,3-dihydro-3-methyl- (benzo-1,3-thiazol-2-yl) -methylidene] -1-phenyl-quinolinium] or a salt thereof can be used.
  • N ′, N′-dimethyl-N- [4-[(E)-(3-methyl-1,3-benzothiol-2-ylidene) methyl] -1-phenylquinolin-1-ium-2-yl ] -N-propylpropane-1,3-diamine or a salt thereof can be used.
  • SYBR® Green I SYBR® Green I.
  • a simple and efficient adeno-associated virus (AAV) quantification method AAV titer measurement method, AAV genome quantification method, composition for quantifying AAV, and AAV genome quantification , A kit for quantifying AAV, and a kit for quantifying AAV genome.
  • AAV adeno-associated virus
  • L1_R1 indicates a reaction using primer L1 and primer R1 as a primer pair. It is a figure which shows the result of the amplification curve obtained by real-time PCR in Example 3, and a melting curve analysis.
  • L3_R1 indicates a reaction using primer L3 and primer R1 as a primer pair. It is a figure which shows the result of the amplification curve obtained by real-time PCR in Example 3, and a melting curve analysis.
  • L5_R1 indicates a reaction using primer L5 and primer R1 as a primer pair.
  • L1_R1 indicates a reaction using the primer L1 and the primer R1 as a primer pair.
  • the method for quantifying an adeno-associated virus genome of the present invention comprises: (a) a specimen, at least one primer pair for amplifying only a nucleic acid sequence contained in the inverted terminal repeat sequence of adeno-associated virus, and an intercalating dye.
  • a step of preparing a composition comprising: (b) a step of performing a nucleic acid amplification reaction using the composition prepared in step (a); and (c) a step of detecting the amplification product obtained in step (b). .
  • the method of the present invention can be applied to any known serotype of adeno-associated virus (AAV) genome, for example, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11 , AAV12, and AAV13, and can be used for quantification of at least one AAV genome selected from the group consisting of AAV13.
  • AAV in the method of the present invention is not particularly limited, and a recombinant adeno-associated virus vector (rAAV vector) is exemplified.
  • rAAV vector recombinant adeno-associated virus vector
  • the serotype of the rAAV vector is determined according to the origin of the cap gene used at the time of rAAV preparation, and does not depend on the origin of the serotype of the AAV genome encapsulated in the rAAV particles.
  • the rAAV vector is referred to as serotype 6 in this specification.
  • the AAV genome quantification method of the present invention can be used for AAV quantification. Therefore, the AAV quantification method using the AAV genome quantification method of the present invention is a preferred embodiment of the present invention.
  • the genomic DNA is released from within the AAV particles, and the genomic DNA is quantified by the method for quantifying the AAV genome of the present invention. Can be estimated.
  • the method for measuring the titer of the rAAV vector thus carried out by measuring the amount of AAV is a preferred embodiment of the present invention.
  • the AAV titer estimated by quantification of the AAV genome is sometimes referred to as a genome titer (genome titer).
  • the rAAV vector may be derived from serotype AAV in which genomic DNA and capsid are different.
  • the titer of an rAAV vector having genomic DNA containing ITR derived from AAV2 and a foreign gene inserted inside thereof, and having a capsid derived from AAV of a serotype other than AAV2 is determined. It can also be measured.
  • Examples of the specimen in the method of the present invention include specimens obtained through a step of releasing AAV genomic DNA from a sample that requires the confirmation of the presence or absence of AAV.
  • Examples of the sample include a composition obtained through a process of extracting AAV produced in the host cell from the host cell, and a culture supernatant of the cell producing AAV, among which rAAV vector-producing cells
  • Preferred examples include a composition containing an rAAV vector obtained through the step of extracting an rAAV vector from the above and a culture supernatant of rAAV vector-producing cells.
  • the present invention is not particularly limited as a method for extracting AAV from a host cell, for example, a method for extracting an rAAV vector from an rAAV vector-producing cell, for example, a freeze-thaw method, an ultrasonic disruption method, and a solution extraction method Is exemplified.
  • the solution extraction method include a method of contacting host cells with an acidic solution.
  • the method of bringing a host cell into contact with an acidic solution includes suspending the host cell recovered by centrifugation or filtration in an acidic solution, or adding a component capable of acidifying the culture solution to a culture solution containing the host cell. Is implemented.
  • Examples of the pH of the acidic solution include pH 3.0 to 6.9, preferably pH 3.0 to 6.0, and more preferably pH 3.0 to 5.0.
  • the acidic solution is not particularly limited to the present invention, but includes citric acid, acetic acid, malic acid, phosphoric acid, hydrochloric acid, sulfuric acid, nitric acid, lactic acid, propionic acid, butyric acid, oxalic acid, malonic acid, succinic acid. At least one selected from the group consisting of acids, fumaric acid, maleic acid, tartaric acid, benzoic acid, sulfosalicylic acid, formic acid, and salts thereof, and a good buffer having a buffer range of less than pH 7, such as MES and Bis-Tris. Examples of the solution to be contained. Of these, citric acid, acetic acid, phosphoric acid, and salts thereof are preferably exemplified in the present invention, and citric acid is more preferably exemplified.
  • the contact time between the host cell and the acidic solution is not particularly limited, and examples thereof include 1 minute to 48 hours, preferably 5 minutes to 24 hours.
  • Examples of the temperature condition for contacting the host cell with the acidic solution include 0 to 40 ° C., preferably 4 to 37 ° C.
  • the AAV extract extracted from the host cell may contain DNA derived from the host cell.
  • the DNA may be decomposed by treating the AAV extract with deoxyribonuclease.
  • a known method capable of destroying the capsid of AAV may be used. For example, a method of releasing genomic DNA by treating AAV with a solution containing a protein denaturant or a surfactant. And a method of destroying the capsid of AAV by heat treatment.
  • the solution containing the free AAV genome thus prepared can be used as a specimen in the AAV quantification method of the present invention.
  • At least one primer pair for amplifying only the nucleic acid sequence contained in the inverted terminal repeat of adeno-associated virus in the method of the present invention in a quantitative nucleic acid amplification reaction using an intercalating dye
  • a primer pair capable of quantifying the genomic DNA of the AAV vector there is no particular limitation as long as it is a primer pair capable of quantifying the genomic DNA of the AAV vector.
  • the present invention is not particularly limited, but at least one AAV selected from the group consisting of AAV1, AAV2, AAV3, AAV6 and AAV7 is used.
  • At least one primer pair for amplifying only the nucleic acid sequence contained in the ITR is preferred.
  • Examples of such a primer pair include a primer pair consisting of a primer consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 and a primer consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 7, and a base sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • a primer pair comprising a primer pair and a primer comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 and a primer comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 8 is preferably exemplified.
  • primers are designed based on the ATR sequences derived from AAV2 and AAV6, and are the AAV1, AAV2, AAV3, AAV6 and AAV7 AAV genomes, and the rAAV vector genomes having ITRs derived from these serotypes of AAV Can be used for quantitative determination.
  • the range of the amount of template in which high correlation is obtained, and the amplification efficiency of PCR from the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 in the sequence listing
  • a primer pair consisting of a primer consisting of a primer consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 7 in the sequence listing is more preferred.
  • the amount of each primer used in the nucleic acid amplification reaction in the method of the present invention is not particularly limited, but 0.5 to 15 pmol, preferably 1 to 10 pmol per 25 ⁇ L of the reaction solution for nucleic acid amplification reaction. More preferably, 2 to 8 pmol, for example, 5 pmol is exemplified.
  • an intercalating dye refers to a dye whose fluorescence is enhanced by intercalation into a double-stranded nucleic acid.
  • the intercalating dye in the present invention is not particularly limited to these, and any intercalating dye in the present invention can be used as long as the fluorescence is enhanced by intercalation to a nucleic acid.
  • the dye is not particularly limited, and examples thereof include ethidium bromide and cyanine dyes. Examples of the cyanine dye include SYBR (registered trademark) Green I, PicoGreen, YOYO, TOTO, SYTO9, LCGreen, EvaGreen, and analogs thereof.
  • SYBR registered trademark
  • Green I is particularly preferable.
  • SYBR registered trademark
  • Green I is an asymmetric cyanine dye, and its structure has been clarified by Zipper H et al. ("Nucleic Acids Research", 2004, Vol. 32, No. 12, e103).
  • [2- [N- (3-dimethylaminopropyl) -N-propylamino] -4- [2,3-dihydro-3-methyl- (benzo-1,3-thiazol) represented by the following formula (I): -2-yl) -methylidene] -1-phenyl-quinolinium] or a salt thereof.
  • SYBR registered trademark
  • the dye may be a cis-trans isomer of the compound represented by the formula (I), and represented by the following formula (II): N ′, N′-dimethyl-N- [4- [ (Z)-(3-methyl-1,3-benzothiazol-2-ylidene) methyl] -1-phenylquinolin-1-ium-2-yl] -N-propylpropane-1,3-diamine, or a salt thereof is also used. it can.
  • the molar concentration of SYBR (registered trademark) Green I in a 10,000-fold diluted solution (x1 concentration) of DMSO solution of SYBR (registered trademark) Green I sold by Life Technologies is About 2 ⁇ M.
  • concentration of the intercalating dye suitable for the quantitative nucleic acid amplification reaction can be appropriately determined by those skilled in the art with reference to known information.
  • concentration of x0.025 (about 50 nM) or more is preferable.
  • a concentration of ⁇ 0.05 (about 100 nM) to ⁇ 2 (about 4 ⁇ M), more preferably ⁇ 0.1 (about 200 nM) to ⁇ 1 (about 2 ⁇ M) is exemplified.
  • the nucleic acid amplification reaction that can be used in the method of the present invention is not particularly limited as long as it is a reaction that synthesizes complementary DNA using DNA as a template.
  • PCR polymerase chain reaction
  • ICAN ICAN
  • LAMP Nucleic acid amplification reactions well known in the art such as SDA
  • SDA Nucleic acid amplification reactions well known in the art such as SDA
  • PCR temperature cycle conditions When PCR is used in the method of the present invention, general conditions can be applied as PCR temperature cycle conditions. For example, by a reaction comprising three steps of dissociation (denaturation) of a double-stranded template DNA into a single strand, annealing of a primer to the single-stranded template DNA, and synthesis of a complementary strand from the primer (extension), or “shuttle PCR ”[“ Forefront of PCR Method ”,“ Protein Nucleic Acid Enzyme ”, Volume 41, No. 5, pp. 425-428 (1996)], primer annealing and extension of the above-mentioned three-step reaction PCR is performed by a two-step reaction in which steps are performed at the same temperature.
  • the temperature cycle of PCR does not specifically limit the present invention, it is preferably less than 40 cycles, for example, about 35 cycles in order to avoid production of non-specific amplification products.
  • a 35-cycle reaction in which a cycle of 95 ° C. for 2 minutes, 95 ° C. for 5 seconds, and 60 ° C. for 30 seconds is taken as one cycle.
  • the detection of the amplification product obtained by the nucleic acid amplification reaction in the method of the present invention can be carried out by measuring the fluorescence intensity of the intercalating dye.
  • the measurement of the fluorescence intensity of the intercalating dye may be performed in the course of the step of performing the nucleic acid amplification reaction, and in this case, the nucleic acid amplification process can be monitored.
  • a commercially available device for real-time PCR for example, Thermal Cycler Dice (registered trademark) Real Time System II (manufactured by Takara Bio Inc.) may be used.
  • a method known in the art may be used.
  • the present invention is not particularly limited, for example, a dilution series of standard DNA (positive control DNA) having a nucleic acid sequence serving as a template for nucleic acid amplification by a primer pair used in a nucleic acid amplification reaction is prepared, and this is used as a template.
  • a calibration curve is created by calculating the Ct value by the real-time PCR used, and the DNA in the sample can be quantified based on this.
  • the standard nucleic acid for example, plasmid DNA can be used.
  • a method for calculating the Ct value for example, a method in which an intersection of a threshold and an amplification curve is a Ct value (Crossing Point method), or a method in which the second derivative of an amplification curve is obtained and the point at which the maximum is obtained is a Ct value (2nd Derivative Maximum method) can be used.
  • the method of the present invention may further include a step of performing a melting curve analysis.
  • the temperature of the reaction solution is gradually raised after the nucleic acid amplification reaction, and the fluorescence signal of the intercalating dye is monitored at that time.
  • the nucleic acid amplification product forms a double strand and shows a strong fluorescence signal, but when it reaches a certain temperature, it dissociates into a single strand, and the fluorescence signal intensity of the intercalating dye rapidly decreases.
  • the temperature at this time is the melting temperature (Tm value).
  • Tm value of the amplification product can be examined by melting curve analysis to confirm whether it is a specific amplification product.
  • the composition for quantifying the adeno-associated virus genome of the present invention comprises at least one primer pair for amplifying only the nucleic acid sequence contained in the inverted terminal repeat sequence of the adeno-associated virus, and an intercalating dye. Can be used to implement the method of the present invention.
  • the composition of the present invention may further contain at least one selected from the group consisting of a DNA polymerase, a reaction buffer, a divalent metal ion, and deoxyribonucleotide triphosphate.
  • the DNA polymerase used in the present invention is not particularly limited as long as it has an activity of synthesizing complementary DNA using DNA as a template.
  • the DNA polymerase used in the present invention is preferably a heat-resistant DNA polymerase.
  • thermostable DNA polymerases derived from eubacteria such as DNA polymerases derived from Thermus genus bacteria (Thermus aquaticus-derived DNA polymerases etc.) and thermophilic Bacillus genus bacteria-derived DNA polymerases (Bacillus caldotenax-derived DNA polymerases etc.), Pyrococcus archaea-derived DNA polymerase (Pyrococcus sp.-derived DNA polymerase etc.) and Thermococcus archaea-derived DNA polymerase (Thermococcus kodakaraaensis-derived DNA polymerase etc.) are exemplified.
  • thermostable DNA polymerases derived from eubacteria such as DNA polymerases derived from Thermus genus bacteria (Thermus aquaticus-derived DNA polymerases etc.) and thermophilic Bacillus genus bacteria-derived DNA polymerases (Bacillus caldotenax
  • the DNA polymerase can be used in the present invention regardless of whether it is a naturally occurring enzyme or a recombinant enzyme, and a DNA polymerase in which a naturally occurring amino acid sequence is modified within the range having DNA polymerase activity is also used in the present invention. it can.
  • the composition of the present invention may contain two or more types of DNA polymerase.
  • the two or more types of DNA polymerases include a combination of a DNA polymerase having 3 ' ⁇ 5' exonuclease activity and a DNA polymerase having substantially no 3 ' ⁇ 5' exonuclease activity.
  • a technique for performing PCR using a reaction solution containing two types of DNA polymerases is known as LA-PCR (Long and Accurate PCR).
  • LA-PCR Long and Accurate PCR
  • a combination of a DNA polymerase having 3 ′ ⁇ 5 ′ exonuclease activity and a DNA polymerase having substantially no 3 ′ ⁇ 5 ′ exonuclease activity is suitable for the present invention. It is.
  • the concentration of the DNA polymerase in the composition of the present invention is not particularly limited as long as it is a concentration at which a DNA synthesis reaction can be performed, and examples thereof include a concentration at which PCR can be performed.
  • the amount of DNA polymerase in the reaction solution may be about 0.125 to 5 U.
  • the activity of the thermostable DNA polymerase described in the present specification is based on the indication of a commercially available enzyme. For example, activated salmon sperm DNA is used as a template / primer, and an activity measurement reaction solution (25 mM TAPS Buffer) is used.
  • the reaction buffer refers to a compound or a mixture having an action of reducing fluctuations in the hydrogen ion concentration (pH) of the reaction solution.
  • a mixed solution of a weak acid and its salt or a weak base and its salt has a strong buffering action, and is therefore widely used as a reaction buffer for the purpose of pH control.
  • the pH of the composition of the present invention is set in a normal range in which PCR is performed, for example, in the range of pH 8.0 to pH 9.5.
  • divalent metal ions contained in the composition of the present invention include magnesium ions, manganese ions, and cobalt ions.
  • Divalent metal ions and their concentrations suitable for each DNA polymerase are well known in the art.
  • Divalent metal ions can be supplied in the form of salts such as chloride, sulfate, or acetate.
  • the present invention is not particularly limited, examples of the concentration of the divalent metal ion in the composition of the present invention include 0.5 to 20 mM.
  • Deoxyribonucleotide is a compound in which a phosphate group is bonded to deoxyribose bonded to an organic base via a phosphodiester bond.
  • deoxyribonucleotides each having adenine, guanine, cytosine and thymine bases, are found in natural DNA.
  • the bases adenine, guanine, cytosine, and thymine are often abbreviated as A, G, C, and T, respectively.
  • Deoxyribonucleotides include free monophosphate, diphosphate, and triphosphate types (ie, the phosphate group has one, two, or three phosphate moieties, respectively).
  • deoxyribonucleoside triphosphates having hypoxanthine or uracil in the base moiety can also be used for nucleic acid amplification reactions.
  • at least one of deoxyribonucleoside triphosphates eg, dATP, dCTP, dITP, dGTP, dTTP, and dUTP
  • deoxyribonucleoside triphosphates eg, dATP, dCTP, dITP, dGTP, dTTP, and dUTP
  • Preferred examples of deoxyribonucleoside triphosphate that can be included in the composition of the present invention include a mixture of dATP, dCTP, dGTP, and dTTP (or dUTP).
  • the kit for quantifying adeno-associated virus of the present invention comprises DNA polymerase, at least one primer pair for amplifying only the nucleic acid sequence contained in the inverted terminal repeat sequence of adeno-associated virus, and an intercalating dye.
  • DNA polymerase, at least one primer pair for amplifying only the nucleic acid sequence contained in the inverted terminal repeat of adeno-associated virus, and the intercalating dye are mixed in part or all of them. Even if it is included in the kit, each may be included in the kit in the state of a single component.
  • the kit of the present invention further comprises a reaction buffer, a divalent metal ion, deoxyribonucleotide triphosphate, a reagent for extracting AAV from the host cell, a reagent for decomposing or removing DNA outside the virus particles of AAV, It may contain at least one selected from the group consisting of a reagent for releasing the AAV genome from AAV, a reagent for diluting the DNA solution, and a positive control DNA for preparing a calibration curve.
  • the reagent for extracting AAV from the host cell is not particularly limited, but it is pH 3.0 to 6.9, preferably pH 3.0 to 6.0, more preferably pH 3.0.
  • An acidic solution of ⁇ 5.0 is exemplified.
  • the acidic solution is not particularly limited to the present invention, but includes citric acid, acetic acid, malic acid, phosphoric acid, hydrochloric acid, sulfuric acid, nitric acid, lactic acid, propionic acid, butyric acid, oxalic acid, malonic acid, succinic acid.
  • MES and Bis-Tris a good buffer having a buffer range of less than pH 7, such as MES and Bis-Tris.
  • citric acid, acetic acid, phosphoric acid, and salts thereof are preferably exemplified in the present invention, and citric acid is more preferably exemplified.
  • kits of the present invention may further contain a reaction buffer for DNase.
  • Examples of the reagent for releasing AAV genomic DNA from the AAV include, for example, a solution containing a protein denaturant and a surfactant.
  • nucleic acid containing a nucleic acid sequence that can be amplified by a primer pair included in the kit of the present invention is exemplified.
  • An example of such a nucleic acid is plasmid DNA.
  • Example 1 Primer Design Based on the genomic nucleotide sequence information (RefSeq Acc. No. NC_001401) of type 2 AAV (hereinafter AAV2), a 5 ′ primer and a 3 ′ primer were designed for the ATR of IAV2.
  • the 5′-side primers were 6 of L1 (SEQ ID NO: 1), L2 (SEQ ID NO: 2), L3 (SEQ ID NO: 3), L4 (SEQ ID NO: 4), L5 (SEQ ID NO: 5), and L6 (SEQ ID NO: 6).
  • 3 ′ side primers are R1 (SEQ ID NO: 7), R2 (SEQ ID NO: 8), R3 (SEQ ID NO: 9), R4 (SEQ ID NO: 10), R5 (SEQ ID NO: 11), R6 (SEQ ID NO: 12), And R7 (SEQ ID NO: 13).
  • Example 2 Preparation of rAAV2 vector-derived crude purified genome (1) Seeding of cells for producing rAAV2 vector DMEM (manufactured by Sigma) having 10% FBS (manufactured by Gibco) in a 10 cm dish for cell culture (manufactured by Corning) 293 cells suspended in were seeded. Thereafter, the cells were cultured overnight in a 37 ° C. CO 2 incubator to confirm that the cells were approximately 70% confluent.
  • Example 2- (1) Transfection of plasmid for rAAV2 vector production
  • the cells prepared in Example 2- (1) were transformed into plasmids encoding AAV2 Rep protein and Cap protein, adenovirus E2A, VA, A plasmid containing the V4 sequence and a plasmid containing the expression cassette of the fluorescent protein ZsGreen1 were transfected between two ITRs of AAV2. Seven hours after transfection, the medium was completely removed, and 15 mL of DMEM containing 10% FBS was added per dish, and cultured in a CO 2 incubator at 37 ° C. for 2 days.
  • Example 3 Screening for selecting primer pairs Combined with 6 types of 5'-side primers and 7 types of 3'-side primers designed in Example 1 to make primer pairs (total 42 types), effective for quantification of AAV genome Screening of the correct primer pairs.
  • SYBR registered trademark
  • Premix Ex Taq II Tli RNase H Plus
  • SYBR registered trademark
  • Premix Ex Taq II Tli RNase H Plus 2 ⁇ conc.
  • a crudely purified genomic solution derived from the rAAV2 vector prepared in Example 2 was used as a positive control.
  • a reaction composition similar to the above except that sterile water was used instead of the template was prepared and used as a negative control reaction solution.
  • Two reactions were performed for each primer pair for both negative control and positive control. Reaction and detection were performed using Thermal Cycler Dice (registered trademark) Real Time System II, 95 ° C., 2 minutes (initial denaturation), and then 95 cycles of 95 ° C., 5 seconds to 60 ° C., 30 seconds. Real-time PCR. In addition, after completion of PCR, a melting curve analysis was performed.
  • Example 4 Confirmation of Quantitative Properties Quantitative properties were confirmed using four types of primer sets L1 / R1, L1 / R2, L2 / R1, and L2 / R2, which were more promising than in Example 3.
  • SYBR registered trademark
  • Premix Ex Taq II Tli RNase H Plus
  • 0.5 ⁇ L of each of the four 10 ⁇ M primer mixes, and 5.0 ⁇ L of the template were mixed. 25 ⁇ L.
  • the reaction solution used was a crude genomic solution derived from the rAAV2 vector prepared in Example 2 as a template.
  • a control using sterile distilled water instead of the template was prepared as a control. Reaction and detection were carried out by 35 cycles of real-time PCR with 95 ° C.
  • L1 / R1 a calibration curve with a correlation coefficient (R 2 ) of 1.000 was obtained in the template amount range of 1 ⁇ 10 3 copies to 1 ⁇ 10 7 copies.
  • the reaction efficiency when using L1 / R1 as a primer set in this template amount range was 99.7%, which was the closest to 100% of the reactions using four types of primer sets. It was.
  • the four primer sets L1 / R1, L1 / R2, L2 / R1, and L2 / R2 are excellent as primer sets for quantifying AAV2 genomic DNA, and the combination of L1 / R1 is the most preferred. I found it excellent.
  • the present invention is particularly useful in the fields of medicine, genetic engineering, and biology.

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Abstract

　アデノ随伴ウイルスゲノムの定量方法であって、（ａ）検体、アデノ随伴ウイルスの逆方向末端反復配列に含まれる核酸配列のみを増幅するための少なくとも１対のプライマー対、及びインターカレーティング色素を含む組成物を調製する工程、（ｂ）工程（ａ）により調製した組成物を用いて核酸増幅反応を行う工程、並びに（ｃ）工程（ｂ）により得られた増幅産物を検出する工程、を含む方法。本発明は、医学、遺伝子工学、生物学分野において特に有用である。

Description

アデノ随伴ウイルスの定量方法
　本発明は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ゲノムの定量方法、ＡＡＶの力価測定方法、ＡＡＶゲノムを定量するための組成物、ＡＡＶゲノムの定量用キット、ＡＡＶの定量方法、ＡＡＶを定量するための組成物、及びＡＡＶの定量用のキットに関する。
　アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、パルボウイルス科に属する線状一本鎖ＤＮＡウイルスである。ＡＡＶは、ヒトを含む広範な種の細胞に感染可能であり、血球、筋、神経細胞等の分化を終えた非分裂細胞にも感染する。野生型のＡＡＶは、ヒトに対する病原性がない。また、ＡＡＶ粒子は物理化学的に極めて安定である。これらの特徴から、ＡＡＶは、遺伝子導入用のベクターとして開発が進められている。
　ＡＡＶ粒子は、３つのカプシドタンパク質（ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３）を有するタンパク質カプシドと、それに囲まれた一本鎖ＤＮＡゲノムとからなる。野生型のＡＡＶのゲノムは、両端にＩＴＲ（Ｉｎｖｅｒｔｅｄ　Ｔｅｒｍｉｎａｌ　Ｒｅｐｅａｔ：逆方向末端反復配列）と呼ばれるＴ字型のヘアピン構造を形成する核酸配列を持ち、その間の直鎖状一本鎖ゲノムの半分はＲｅｐタンパク質をコード（ｒｅｐ遺伝子）し、残りの半分はカプシドタンパク質をコード（ｃａｐ遺伝子）している。ヒトに感染し得る野生型のＡＡＶとしては、現在までに少なくとも１３種類の血清型（ＡＡＶ１～１３）が知られている。
　典型的な組換えアデノ随伴ウイルスベクター（ｒＡＡＶベクター）は、ＡＡＶゲノムのｒｅｐ遺伝子とｃａｐ遺伝子とが所望の遺伝子等と置換されたゲノム構造を有する。ｒＡＡＶベクターの作製方法の一例としては、ＡＡＶの両端のＩＴＲ間に目的遺伝子を挿入したベクタープラスミド、ＡＡＶの複製やウイルス粒子の形成に必要とされるウイルスタンパク質を供給するためのヘルパープラスミド、及びＡＡＶの増殖に必要とされるアデノウイルスのヘルパー作用を担う遺伝子領域の一部を有するアデノウイルスヘルパープラスミドを一括して２９３細胞等の宿主細胞に導入し、宿主細胞内の核内にｒＡＡＶベクターを産生させる方法が挙げられる。細胞への遺伝子導入にｒＡＡＶベクターを用いる際には、十分に高い力価のｒＡＡＶベクターを調製する必要がある。このため、ｒＡＡＶベクターを調製した際には、その力価の測定が必須である。
　ｒＡＡＶの力価の測定方法としては、サザンブロッティング法、ドットブロッティング法、及びリアルタイムＰＣＲ法等が利用されている。このうち、操作の簡便性や迅速性等の観点からは、リアルタイムＰＣＲ法の利用が好適と言える。ｒＡＡＶベクターのＩＴＲは、ＰＣＲ増幅が困難な二次構造を有する。このため、ｒＡＡＶベクターの力価のリアルタイムＰＣＲによる測定の標的配列としては、ベクターに挿入された外来遺伝子が利用されている。しかしながら、標的配列として外来遺伝子を利用する場合、構築されたベクター毎にＰＣＲに利用するプライマーを設計する必要がある。最近、ＩＴＲ配列のみを標的配列とした、ＴａｑＭａｎプローブを用いたリアルタイムＰＣＲによるｒＡＡＶベクターの力価の測定方法について報告があった（非特許文献１）。しかしながら、ＴａｑＭａｎプローブを用いるリアルタイムＰＣＲは、二重標識した核酸プローブを合成する必要があるため、インターカレーティング色素を用いる定量リアルタイムＰＣＲと比較してコストがかかる。
Ｈｕｍａｎ　Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒａｐｙ　Ｍｅｔｈｏｄｓ、２０１２年２月、Ｐａｒｔ　Ｂ　２３、ｐ．１８－２８
　本発明の目的は、簡便で、かつ、効率の良いアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の定量方法、ＡＡＶの力価測定方法、ＡＡＶゲノムの定量方法、ＡＡＶを定量するための組成物、ＡＡＶゲノムを定量するための組成物、ＡＡＶの定量用のキット、及びＡＡＶゲノムの定量用キットを提供することにある。
　本発明者らは、上記の課題を解決すべく鋭意努力した結果、ＩＴＲ配列のみを標的配列としたインターカレーティング色素を用いた定量リアルタイムＰＣＲにより、ＡＡＶゲノムの定量が可能であることを見出し、本発明を完成させた。
　すなわち、本発明は、下記の[１]～[１３]に関する。
[１]　アデノ随伴ウイルスゲノムの定量方法であって、
（ａ）検体、アデノ随伴ウイルスの逆方向末端反復配列に含まれる核酸配列のみを増幅するための少なくとも１対のプライマー対、及びインターカレーティング色素を含む組成物を調製する工程、
（ｂ）工程（ａ）により調製した組成物を用いて核酸増幅反応を行う工程、並びに
（ｃ）工程（ｂ）により得られた増幅産物を検出する工程、
を含む方法。
[２]　プライマー対が、配列表の配列番号１で表される塩基配列を含むプライマーと、配列表の配列番号７で表される塩基配列を含むプライマーとからなる、[１]に記載の方法。
[３]　プライマー対が、配列表の配列番号１又は２で表される塩基配列からなるプライマーと、配列表の配列番号７又は８で表される塩基配列からなるプライマーとからなる、[１]又は[２]に記載の方法。
[４]　インターカレーティング色素が、シアニン系色素を含む、[１]～[３]いずれかに記載の方法。
[５]　[１]～[４]いずれかに記載の方法によりアデノ随伴ウイルスゲノムを定量する工程を包含する、アデノ随伴ウイルスの力価測定方法。
[６]　アデノ随伴ウイルスゲノムを定量するための組成物であって、アデノ随伴ウイルスの逆方向末端反復配列に含まれる核酸配列のみを増幅するための少なくとも１対のプライマー対、及びインターカレーティング色素を含む組成物。
[７]　プライマー対が、配列表の配列番号１で表される塩基配列を含むプライマーと、配列表の配列番号７で表される塩基配列を含むプライマーとからなる、[６]に記載の組成物。
[８]　プライマー対が、配列表の配列番号１又は２で表される塩基配列からなるプライマーと、配列表の配列番号７又は８で表される塩基配列からなるプライマーとからなる、[６]又は[７]に記載の組成物。
[９]　インターカレーティング色素が、シアニン系色素を含む、[６]～[８]いずれかに記載の組成物。
[１０]　アデノ随伴ウイルスゲノムの定量用のキットであって、ＤＮＡポリメラーゼ、アデノ随伴ウイルスの逆方向末端反復配列に含まれる核酸配列のみを増幅するための少なくとも１対のプライマー対、及びインターカレーティング色素を含むキット。
[１１]　プライマー対が、配列表の配列番号１で表される塩基配列を含むプライマーと、配列表の配列番号７で表される塩基配列を含むプライマーとからなる、[１０]に記載のキット。
[１２]　プライマー対が、配列表の配列番号１又は２で表される塩基配列からなるプライマーと、配列表の配列番号７又は８で表される塩基配列からなるプライマーとからなる、[１０]又は[１１]に記載のキット。
[１３]　インターカレーティング色素が、シアニン系色素を含む、[１０]～[１２]いずれかに記載のキット。
　ここで、本発明で用いるシアニン系色素としては、ＣＡＳ登録番号　１６３７９５－７５－３の下記式（Ｉ）に示される［２－［Ｎ－（３－ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）－Ｎ－ｐｒｏｐｙｌａｍｉｎｏ］－４－［２，３－ｄｉｈｙｄｒｏ－３－ｍｅｔｈｙｌ－（ｂｅｎｚｏ－１，３－ｔｈｉａｚｏｌ－２－ｙｌ）－ｍｅｔｈｙｌｉｄｅｎｅ］－１－ｐｈｅｎｙｌ－ｑｕｉｎｏｌｉｎｉｕｍ］あるいはその塩が使用できる。言い換えると、Ｎ’，Ｎ’－ｄｉｍｅｔｈｙｌ－Ｎ－［４－［（Ｅ）－（３－ｍｅｔｈｙｌ－１，３－ｂｅｎｚｏｔｈｉａｚｏｌ－２－ｙｌｉｄｅｎｅ）ｍｅｔｈｙｌ］－１－ｐｈｅｎｙｌｑｕｉｎｏｌｉｎ－１－ｉｕｍ－２－ｙｌ］－Ｎ－ｐｒｏｐｙｌｐｒｏｐａｎｅ－１，３－ｄｉａｍｉｎｅ、あるいはその塩が使用できる。これらは、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ　Ｉと称されている。さらにｃｉｓ－ｔｒａｎｓ異性体であってもよく、下記式（ＩＩ）に示されるＮ’，Ｎ’－ｄｉｍｅｔｈｙｌ－Ｎ－［４－［（Ｚ）－（３－ｍｅｔｈｙｌ－１，３－ｂｅｎｚｏｔｈｉａｚｏｌ－２－ｙｌｉｄｅｎｅ）ｍｅｔｈｙｌ］－１－ｐｈｅｎｙｌｑｕｉｎｏｌｉｎ－１－ｉｕｍ－２－ｙｌ］－Ｎ－ｐｒｏｐｙｌｐｒｏｐａｎｅ－１，３－ｄｉａｍｉｎｅ、あるいはその塩が使用できる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
　本発明により、簡便で、かつ、効率の良いアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の定量方法、ＡＡＶの力価測定方法、ＡＡＶゲノムの定量方法、ＡＡＶを定量するための組成物、ＡＡＶゲノムを定量するための組成物、ＡＡＶの定量用のキット、及びＡＡＶゲノムの定量用キットが提供される。
実施例３におけるリアルタイムＰＣＲにより得られた増幅曲線と融解曲線分析の結果を示す図である。図中Ｌ１＿Ｒ１は、プライマーペアとしてプライマーＬ１及びプライマーＲ１を用いた反応であることを示す。 実施例３におけるリアルタイムＰＣＲにより得られた増幅曲線と融解曲線分析の結果を示す図である。図中Ｌ３＿Ｒ１は、プライマーペアとしてプライマーＬ３及びプライマーＲ１を用いた反応であることを示す。 実施例３におけるリアルタイムＰＣＲにより得られた増幅曲線と融解曲線分析の結果を示す図である。図中Ｌ５＿Ｒ１は、プライマーペアとしてプライマーＬ５及びプライマーＲ１を用いた反応であることを示す。 実施例４におけるリアルタイムＰＣＲの結果を示す図である。図中Ｌ１＿Ｒ１は、プライマーペアとしてプライマーＬ１及びプライマーＲ１を用いた反応であることを示し、各プライマーセットについて、上から順に、各コピー数のプラスミドＤＮＡを鋳型として用いた場合の増幅曲線、各コピー数のプラスミドＤＮＡを鋳型として用いた場合の融解曲線分析結果、鋳型としてｒＡＡＶ２ベクター由来の粗精製ゲノム溶液を用いた場合とネガティブコントロールの反応の増幅曲線、鋳型としてｒＡＡＶ２ベクター由来の粗精製ゲノム溶液を用いた場合とネガティブコントロールの反応の融解曲線分析結果、及び各コピー数のプラスミドＤＮＡを鋳型として用いたリアルタイムＰＣＲの結果より作成した検量線を示す。
　本発明のアデノ随伴ウイルスゲノムの定量方法は、（ａ）検体、アデノ随伴ウイルスの逆方向末端反復配列に含まれる核酸配列のみを増幅するための少なくとも１対のプライマー対、及びインターカレーティング色素を含む組成物を調製する工程、（ｂ）工程（ａ）により調製した組成物を用いて核酸増幅反応を行う工程、並びに（ｃ）工程（ｂ）により得られた増幅産物を検出する工程を含む。
　本発明の方法は、公知のいずれの血清型のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ゲノムにも適用可能であり、例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、及びＡＡＶ１３からなる群より選択された少なくとも１種のＡＡＶのゲノムの定量に利用することができる。本発明の方法におけるＡＡＶとしては、本発明を特に限定するものではないが、組換えアデノ随伴ウイルスベクター（ｒＡＡＶベクター）が例示される。なお、本明細書においてｒＡＡＶベクターの血清型について述べる場合、カプシドの由来となる血清型を基準とする。すなわち、ｒＡＡＶ調製時に使用されるｃａｐ遺伝子の由来に応じてそのｒＡＡＶベクターの血清型を決定するものとし、ｒＡＡＶ粒子中に封入されているＡＡＶゲノムの血清型の由来には依存しないものとする。例えば、カプシドがＡＡＶ６由来で、ｒＡＡＶ粒子中に封入されているＡＡＶゲノム中のＩＴＲがＡＡＶ２由来の場合は、本明細書中では当該ｒＡＡＶベクターは血清型６とする。
　本発明のＡＡＶゲノムの定量方法は、ＡＡＶの定量に使用することができる。従って、本発明のＡＡＶゲノムの定量方法を利用したＡＡＶの定量方法は、本発明の好適な一態様である。ＡＡＶを含む組成物中のＡＡＶ粒子外のＤＮＡを分解又は除去した後に、ＡＡＶ粒子内よりゲノムＤＮＡを遊離させ、このゲノムＤＮＡを本発明のＡＡＶゲノムの定量方法で定量することにより、元のＡＡＶの量を推定することができる。同様に、こうしてＡＡＶの量を測定することにより実施されるｒＡＡＶベクターの力価の測定方法は、本発明の好適な一態様である。なお、ＡＡＶゲノムの定量により推定されたＡＡＶの力価は、ゲノム力価（ゲノムタイター）と言われることもある。ｒＡＡＶベクターは、ゲノムＤＮＡとカプシドとが異なる血清型のＡＡＶに由来するものであってもよい。例えば、本発明の方法により、ＡＡＶ２に由来するＩＴＲとその内側に挿入された外来遺伝子とを含むゲノムＤＮＡを有し、ＡＡＶ２以外の血清型のＡＡＶに由来するカプシドを有するｒＡＡＶベクターの力価を測定することもできる。
　本発明の方法における検体としては、ＡＡＶが存在するか、ＡＡＶの存在の有無の確認を要するサンプルからＡＡＶのゲノムＤＮＡを遊離させる工程を経て得られた検体が例示される。上記のサンプルとしては、例えば、宿主細胞内で産生したＡＡＶを宿主細胞から抽出する工程を経て得られた組成物や、ＡＡＶを産生する細胞の培養上清が例示され、なかでもｒＡＡＶベクター産生細胞からｒＡＡＶベクターを抽出する工程を経て得られたｒＡＡＶベクターを含む組成物や、ｒＡＡＶベクター産生細胞の培養上清が好適に例示される。
　ＡＡＶの宿主細胞からの抽出方法、例えばｒＡＡＶベクターのｒＡＡＶベクター産生細胞からの抽出方法としては、本発明を特に限定するものではないが、例えば、凍結融解法、超音波破砕法、及び溶液抽出法が例示される。溶液抽出法としては、宿主細胞を酸性の溶液と接触させる方法が例示される。宿主細胞を酸性の溶液と接触させる方法は、遠心分離やろ過によって回収された宿主細胞の酸性の溶液への懸濁、又は宿主細胞を含む培養液への当該培養液を酸性とし得る成分の添加により実施される。酸性の溶液のｐＨとしては、例えばｐＨ３．０～６．９、好ましくはｐＨ３．０～６．０、より好ましくはｐＨ３．０～５．０が例示される。また、酸性の溶液としては、本発明を特に限定するものではないが、クエン酸、酢酸、リンゴ酸、リン酸、塩酸、硫酸、硝酸、乳酸、プロピオン酸、酪酸、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、フマル酸、マレイン酸、酒石酸、安息香酸、スルホサリチル酸、ギ酸、及びそれらの塩、並びにＭＥＳ、Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ等の緩衝域がｐＨ７未満のグッドバッファーからなる群より選択された少なくとも１種を含有する溶液が例示される。本発明には、このうち、クエン酸、酢酸、リン酸、及びそれらの塩が好適に例示され、このうちクエン酸がより好適に例示される。
　宿主細胞と酸性の溶液との接触の時間は、本発明を特に限定するものではないが、例えば１分～４８時間、好適には５分～２４時間が例示される。宿主細胞と酸性の溶液との接触の際の温度条件としては、例えば０～４０℃、好適には４～３７℃が例示される。宿主細胞から抽出されたＡＡＶ抽出液は、宿主細胞由来のＤＮＡを含有することがある。例えば、デオキシリボヌクレアーゼによる処理をＡＡＶ抽出液に施して、このＤＮＡを分解してもよい。
　ＡＡＶからゲノムＤＮＡを遊離させるには、ＡＡＶのカプシドを破壊できる公知の方法を利用すればよく、例えば、ＡＡＶをタンパク質変性剤や界面活性剤を含む溶液で処理することによりゲノムＤＮＡを遊離させる方法、及び熱処理によりＡＡＶのカプシドを破壊する方法が例示される。こうして調製される遊離のＡＡＶゲノムを含有する溶液は、本発明のＡＡＶの定量方法における検体として用いることができる。
　本発明の方法におけるアデノ随伴ウイルスの逆方向末端反復配列に含まれる核酸配列のみを増幅するための少なくとも１対のプライマー対は、インターカレーティング色素を利用した定量的な核酸増幅反応に用いることによりＡＡＶベクターのゲノムＤＮＡの定量が可能なプライマー対であれば特に限定はない。本発明の方法をｒＡＡＶベクターのゲノムＤＮＡの定量に利用する場合、本発明を特に限定するものではないが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ６及びＡＡＶ７からなる群より選択された少なくとも１種のＡＡＶのＩＴＲに含まれる核酸配列のみを増幅するための少なくとも１対のプライマー対が好ましい。
　このようなプライマー対としては、例えば、配列番号１で表される塩基配列からなるプライマーと配列番号７で表される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマー対、配列番号１で表される塩基配列からなるプライマーと配列番号８で表される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマー対、配列番号２で表される塩基配列からなるプライマーと配列番号７で表される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマー対、及び配列番号２で表される塩基配列からなるプライマーと配列番号８で表される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマー対が好適に例示される。これらのプライマーはＡＡＶ２及びＡＡＶ６由来のＩＴＲ配列を元に設計したプライマーであり、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ６及びＡＡＶ７のＡＡＶゲノムや、これらの血清型のＡＡＶに由来するＩＴＲを有するｒＡＡＶベクターのゲノムの定量に使用することができる。リアルタイムＰＣＲにより算出されるＣｔ値と鋳型量との相関性、高い相関性が得られる鋳型量の範囲、及びＰＣＲの増幅効率の観点からは、配列表の配列番号１で表される塩基配列からなるプライマーと配列表の配列番号７で表される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマー対がより好適に例示される。本発明の方法において核酸増幅反応に使用される各プライマーの量は、本発明を特に限定するものではないが、核酸増幅反応の反応液２５μＬあたり０．５～１５ｐｍｏｌが、好適には１～１０ｐｍｏｌが、より好適には２～８ｐｍｏｌ、例えば５ｐｍｏｌが例示される。
　本明細書においてインターカレーティング色素とは、二本鎖核酸へのインターカレーションにより蛍光が増強される色素のことを言う。本発明におけるインターカレーティング色素は、特にこれらに限定されるものではなく、核酸へのインターカレーションにより蛍光が増強される色素であれば、本発明におけるインターカレーティング色素に包含される。当該色素としては、特に限定はされないが例えば、臭化エチジウムやシアニン系色素が挙げられる。前記シアニン系色素としては、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ　Ｉ、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ、ＹＯＹＯ、ＴＯＴＯ、ＳＹＴＯ９、ＬＣＧｒｅｅｎ、ＥｖａＧｒｅｅｎ、及びこれらの類似体等が例示される。本発明の方法におけるインターカレーティング色素としては、なかでもＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ　Ｉが好適である。
　ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ　Ｉは、非対称シアニン系色素であり、その構造はＺｉｐｐｅｒ　Ｈら（“Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ”、２００４年、第３２巻、第１２号、ｅ１０３）により明らかにされている。当該文献では、下記式（Ｉ）に示される［２－［Ｎ－（３－ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）－Ｎ－ｐｒｏｐｙｌａｍｉｎｏ］－４－［２，３－ｄｉｈｙｄｒｏ－３－ｍｅｔｈｙｌ－（ｂｅｎｚｏ－１，３－ｔｈｉａｚｏｌ－２－ｙｌ）－ｍｅｔｈｙｌｉｄｅｎｅ］－１－ｐｈｅｎｙｌ－ｑｕｉｎｏｌｉｎｉｕｍ］、あるいはその塩と解析されている。言い換えると、Ｎ’，Ｎ’－ｄｉｍｅｔｈｙｌ－Ｎ－［４－［（Ｅ）－（３－ｍｅｔｈｙｌ－１，３－ｂｅｎｚｏｔｈｉａｚｏｌ－２－ｙｌｉｄｅｎｅ）ｍｅｔｈｙｌ］－１－ｐｈｅｎｙｌｑｕｉｎｏｌｉｎ－１－ｉｕｍ－２－ｙｌ］－Ｎ－ｐｒｏｐｙｌｐｒｏｐａｎｅ－１，３－ｄｉａｍｉｎｅ、あるいはその塩である。これらは、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ　Ｉと称されている。さらに当該色素は、前記式（Ｉ）で表される化合物のｃｉｓ－ｔｒａｎｓ異性体であってもよく、下記式（ＩＩ）に示される、Ｎ’，Ｎ’－ｄｉｍｅｔｈｙｌ－Ｎ－［４－［（Ｚ）－（３－ｍｅｔｈｙｌ－１，３－ｂｅｎｚｏｔｈｉａｚｏｌ－２－ｙｌｉｄｅｎｅ）ｍｅｔｈｙｌ］－１－ｐｈｅｎｙｌｑｕｉｎｏｌｉｎ－１－ｉｕｍ－２－ｙｌ］－Ｎ－ｐｒｏｐｙｌｐｒｏｐａｎｅ－１，３－ｄｉａｍｉｎｅ、あるいはその塩も使用できる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
　Ｚｉｐｐｅｒ　Ｈらによれば、ライフテクノロジーズ社より販売されているＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ　ＩのＤＭＳＯ溶液の１０，０００倍希釈液（×１濃度）のＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ　Ｉのモル濃度は、約２μＭである。定量的な核酸増幅反応に好適なインターカレーティング色素の濃度は、当業者であれば公知の情報を参考に適宜決定可能であるが、例えば×０．０２５濃度（約５０ｎＭ）以上、好適には×０．０５濃度（約１００ｎＭ）～×２濃度（約４μＭ）、より好適には×０．１濃度（約２００ｎＭ）～×１濃度（約２μＭ）が例示される。
　本発明の方法に利用可能な核酸増幅反応としては、ＤＮＡを鋳型としてこれに相補的なＤＮＡを合成する反応であれば特に限定はないが、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ＩＣＡＮ、ＬＡＭＰ、ＳＤＡ等の当分野で周知の核酸増幅反応が例示され、なかでもＰＣＲが好適に例示される。
　本発明の方法にＰＣＲを利用する場合、ＰＣＲの温度サイクル条件としては一般的な条件が適用できる。例えば、二本鎖鋳型ＤＮＡの一本鎖への解離（変性）、一本鎖鋳型ＤＮＡへのプライマーのアニーリング、プライマーからの相補鎖合成（伸長）の３つのステップからなる反応により、又は「シャトルＰＣＲ」［『ＰＣＲ法最前線』、「蛋白質核酸  酵素」別冊、第４１巻、第５号、４２５頁～４２８頁（１９９６）］と呼ばれる、前述の３ステップ反応のうちプライマーのアニーリング及び伸長のステップを同一温度で行なう２ステップ反応によりＰＣＲが実施される。ＰＣＲの温度サイクルは、本発明を特に限定するものではないが、非特異的な増幅産物の産生を避けるため、４０サイクル未満、例えば３５サイクル程度が好ましい。特に限定はされないが例えば、９５℃　２分間処理後、９５℃　５秒、６０℃　３０秒を１サイクルとする３５サイクル反応が挙げられる。
　本発明の方法における核酸増幅反応により得られた増幅産物の検出は、インターカレーティング色素の蛍光強度を測定することにより実施できる。インターカレーティング色素の蛍光強度の測定は、核酸増幅反応を行う工程の過程において実施しても良く、この場合、核酸増幅過程のモニタリングが可能である。核酸増幅過程のモニタリングには、例えば市販のリアルタイムＰＣＲ用装置、例えばＴｈｅｒｍａｌ　Ｃｙｃｌｅｒ　Ｄｉｃｅ（登録商標）　Ｒｅａｌ　Ｔｉｍｅ　Ｓｙｓｔｅｍ　ＩＩ（タカラバイオ社製）を用いればよい。
　核酸増幅過程のモニタリング結果を利用したＤＮＡの定量は、当該技術分野で公知の方法を利用すればよい。本発明を特に限定するものではないが、例えば、核酸増幅反応に使用するプライマー対による核酸増幅の鋳型となる核酸配列を有するスタンダードＤＮＡ（ポジティブコントロールＤＮＡ）の希釈系列を作成し、これを鋳型として用いたリアルタイムＰＣＲによりＣｔ値を算出して検量線を作成し、これに基づいて検体中のＤＮＡを定量することができる。上記のスタンダード核酸としては、例えばプラスミドＤＮＡを用いることができる。Ｃｔ値の算出方法としては、例えば閾値と増幅曲線の交点をＣｔ値とする方法（Ｃｒｏｓｓｉｎｇ　Ｐｏｉｎｔ法）や、増幅曲線の２次導関数を求めてそれが最大となる点をＣｔ値とする方法（２ｎｄ　Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ　Ｍａｘｉｍｕｍ法）が利用できる。
　本発明の方法は、更に融解曲線分析を実施する工程を含んでもよい。融解曲線分析では、核酸増幅反応後に反応液の温度を徐々に上げ、その際にインターカレーティング色素の蛍光シグナルをモニタリングする。低温では核酸増幅産物が二本鎖を形成して強い蛍光シグナルを示すが、ある一定の温度に達すると一本鎖に解離し、インターカレーティング色素の蛍光シグナル強度は急激に低下する。このときの温度が融解温度（Ｔｍ値）である。融解曲線分析により増幅産物のＴｍ値を調べ、特異的な増幅産物であるか否かを確認することができる。
　本発明のアデノ随伴ウイルスゲノムを定量するための組成物は、アデノ随伴ウイルスの逆方向末端反復配列に含まれる核酸配列のみを増幅するための少なくとも１対のプライマー対、及びインターカレーティング色素を含み、本発明の方法の実施に利用できる。本発明の組成物は、更にＤＮＡポリメラーゼ、反応緩衝剤、２価の金属イオン、及びデオキシリボヌクレオチド三リン酸からなる群より選択された少なくとも１種を含んでもよい。
　本発明に使用されるＤＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡを鋳型としてこれに相補的なＤＮＡを合成する活性を有するものであれば特に限定はない。本発明を特に限定するものではないが、本発明に使用されるＤＮＡポリメラーゼとしては、耐熱性のＤＮＡポリメラーゼが好ましい。このようなＤＮＡポリメラーゼとしては、Ｔｈｅｒｍｕｓ属細菌由来ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｈｅｒｍｕｓ　ａｑｕａｔｉｃｕｓ由来ＤＮＡポリメラーゼ等）や好熱性Ｂａｃｉｌｌｕｓ属細菌由来ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｃａｌｄｏｔｅｎａｘ由来ＤＮＡポリメラーゼ等）等の真正細菌由来の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、及びＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ属古細菌由来ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｐ．由来ＤＮＡポリメラーゼ等）やＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ属古細菌由来ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ　ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ由来ＤＮＡポリメラーゼ等）等の古細菌由来の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼが例示される。また、ＤＮＡポリメラーゼは、天然由来酵素、組換体酵素のいずれであっても本発明に使用でき、ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する範囲で天然由来のアミノ酸配列に改変が施されたＤＮＡポリメラーゼも本発明に使用できる。
　本発明の組成物には、２種類以上のＤＮＡポリメラーゼが含まれていても良い。２種類以上のＤＮＡポリメラーゼとしては、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼと３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を実質的に有さないＤＮＡポリメラーゼとの組み合わせが例示される。なお、このような２種類のＤＮＡポリメラーゼを含む反応液でＰＣＲを行う技術は、ＬＡ－ＰＣＲ（Ｌｏｎｇ　ａｎｄ　Ａｃｃｕｒａｔｅ　ＰＣＲ）として知られている。本発明を特に限定するものではないが、本発明には３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼと３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を実質的に有さないＤＮＡポリメラーゼとの組み合わせが好適である。
　本発明の組成物中のＤＮＡポリメラーゼの濃度は、ＤＮＡ合成反応が実施可能な濃度であれば特に限定はなく、例えばＰＣＲが実施可能な濃度が例示される。Ｔｈｅｒｍｕｓ　ａｑｕａｔｉｃｕｓ由来ＤＮＡポリメラーゼを用いて反応液量２５μＬでＰＣＲを行う場合、反応液中のＤＮＡポリメラーゼの量は０．１２５～５Ｕ程度にすればよい。なお、本明細書に記載の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの活性は、市販の酵素の表示に基づくものであり、例えば、活性化サケ精子ＤＮＡを鋳型／プライマーとして用い、活性測定用反応液（２５ｍＭ　ＴＡＰＳ　Ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ９．３、２５℃）、５０ｍＭ　ＫＣｌ、２ｍＭ　ＭｇＣｌ２、１ｍＭ　２－Ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ、各２００μＭ　ｄＡＴＰ・ｄＧＴＰ・ｄＴＴＰ、１００μＭ　［α－３２Ｐ］ｄＣＴＰ、０．２５ｍｇ／ｍＬ　活性化サケ精子ＤＮＡ）中にて、７４℃において３０分間に１０ｎｍｏｌの全ヌクレオチドを酸不溶性沈殿物に取り込む活性を１Ｕとする。
　本明細書において反応緩衝剤とは、反応溶液の水素イオン濃度（ｐＨ）の変動を和らげる作用を持つ化合物又は混合物のことをいう。一般に弱酸とその塩、あるいは弱塩基とその塩の混合溶液は強い緩衝作用を持つので、反応緩衝剤としてｐＨコントロールの目的で広く用いられている。本発明を特に限定するものではないが、本発明の組成物のｐＨは、ＰＣＲが実施される通常の範囲、例えばｐＨ８．０～ｐＨ９．５の範囲に設定されるのが適当である。
　本発明の組成物に含まれる２価の金属イオンとしては、マグネシウムイオン、マンガンイオン、及びコバルトイオンが例示される。各ＤＮＡポリメラーゼに適する２価の金属イオンとその濃度は、当該分野でよく知られている。２価の金属イオンは塩化物、硫酸塩、又は酢酸塩等の塩の形態で供給され得る。本発明を特に限定するものではないが、本発明の組成物中の２価の金属イオンの濃度としては、例えば０．５～２０ｍＭが例示される。
　デオキシリボヌクレオチドは、有機塩基に結合したデオキシリボースにホスホジエステル結合を介してリン酸基が結合した化合物である。それぞれアデニン、グアニン、シトシン及びチミン塩基を有する４種のデオキシリボヌクレオチドが天然型ＤＮＡに見られる。塩基のアデニン、グアニン、シトシン、及びチミンはそれぞれ、Ａ、Ｇ、Ｃ、及びＴと略されることが多い。デオキシリボヌクレオチドは、遊離の一リン酸型、二リン酸型及び三リン酸型（すなわち、リン酸基が、それぞれ、１つ、２つ又は３つのリン酸部分を有する）を含む。また、塩基部分にヒポキサンチンやウラシルを有するデオキシリボヌクレオシド三リン酸も核酸増幅反応に使用できることが知られている。本発明の組成物には、デオキシリボヌクレオシド三リン酸（例えば、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＩＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、及びｄＵＴＰ）及びそれらの誘導体の少なくとも１種が使用できる。本発明の組成物に含まれうるデオキシリボヌクレオシド三リン酸としては、好適にはｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰ（又はｄＵＴＰ）の混合物が例示される。
　本発明のアデノ随伴ウイルスの定量用のキットは、ＤＮＡポリメラーゼ、アデノ随伴ウイルスの逆方向末端反復配列に含まれる核酸配列のみを増幅するための少なくとも１対のプライマー対、及びインターカレーティング色素を含む。ＤＮＡポリメラーゼ、アデノ随伴ウイルスの逆方向末端反復配列に含まれる核酸配列のみを増幅するための少なくとも１対のプライマー対、及びインターカレーティング色素は、これらのうち一部又は全部が混合された状態でキットに包含されていても、それぞれが単独のコンポーネントの状態でキットに包含されていてもよい。
　本発明のキットは、更に反応緩衝剤、２価の金属イオン、デオキシリボヌクレオチド三リン酸、宿主細胞からＡＡＶを抽出するための試薬、ＡＡＶのウイルス粒子外のＤＮＡを分解又は除去するための試薬、ＡＡＶからＡＡＶゲノムを遊離させるための試薬、ＤＮＡ溶液の希釈のための試薬、及び検量線作成用のポジティブコントロールＤＮＡからなる群より選択された少なくとも１種を含んでも良い。
　上記の宿主細胞からＡＡＶを抽出するための試薬としては、本発明を特に限定するものではないが、ｐＨ３．０～６．９、好ましくはｐＨ３．０～６．０、より好ましくはｐＨ３．０～５．０の酸性の溶液が例示される。また、酸性の溶液としては、本発明を特に限定するものではないが、クエン酸、酢酸、リンゴ酸、リン酸、塩酸、硫酸、硝酸、乳酸、プロピオン酸、酪酸、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、フマル酸、マレイン酸、酒石酸、安息香酸、スルホサリチル酸、ギ酸、及びそれらの塩、並びにＭＥＳ、Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ等の緩衝域がｐＨ７未満のグッドバッファーからなる群より選択された少なくとも１種を含有する溶液が例示される。本発明には、このうち、クエン酸、酢酸、リン酸、及びそれらの塩が好適に例示され、このうちクエン酸がより好適に例示される。
　上記のＡＡＶのウイルス粒子外のＤＮＡを分解又は除去するための試薬としては、例えばＤＮａｓｅＩ等のデオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）が例示される。ＡＡＶのウイルス粒子外のＤＮＡを分解又は除去するための試薬としてＤＮａｓｅを利用する場合、本発明のキットは、更にＤＮａｓｅ用の反応緩衝液を含んでいてもよい。
　上記のＡＡＶからＡＡＶのゲノムＤＮＡを遊離させるための試薬としては、例えば、タンパク質変性剤や界面活性剤を含む溶液が例示される。
　上記の検量線作成用のポジティブコントロールＤＮＡとしては、本発明のキットに含まれるプライマー対により核酸増幅が可能な核酸配列を含む核酸が例示される。このような核酸としては、例えばプラスミドＤＮＡが例示される。
　以下に実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に何ら限定されるものではない。なお、以下の実施例におけるリアルタイムＰＣＲの反応装置としては、Ｔｈｅｒｍａｌ　Ｃｙｃｌｅｒ　Ｄｉｃｅ（登録商標）　Ｒｅａｌ　Ｔｉｍｅ　Ｓｙｓｔｅｍ　ＩＩ（タカラバイオ社製）を使用した。
実施例１　プライマー設計
　２型ＡＡＶ（以下、ＡＡＶ２）のゲノム塩基配列情報（ＲｅｆＳｅｑ　Ａｃｃ．　Ｎｏ．ＮＣ＿００１４０１）を元に、ＡＡＶ２のＩＴＲに対して５’側プライマー及び３’側プライマーを設計した。５’側プライマーは、Ｌ１（配列番号１）、Ｌ２（配列番号２）、Ｌ３（配列番号３）、Ｌ４（配列番号４）、Ｌ５（配列番号５）、及びＬ６（配列番号６）の６種類、３’側プライマーは、Ｒ１（配列番号７）、Ｒ２（配列番号８）、Ｒ３（配列番号９）、Ｒ４（配列番号１０）、Ｒ５（配列番号１１）、Ｒ６（配列番号１２）、及びＲ７（配列番号１３）の７種類である。
実施例２　ｒＡＡＶ２ベクター由来の粗精製ゲノムの調製
（１）ｒＡＡＶ２ベクター製造用細胞の播種
　細胞培養用１０ｃｍディッシュ（コーニング社製）に、１０％ＦＢＳ（ギブコ社製）を含むＤＭＥＭ（シグマ社製）に懸濁した２９３細胞を播種した。その後、３７℃のＣＯ２インキュベーターで終夜培養し、細胞がおよそ７０％コンフルエントになっていることを確認した。
（２）ｒＡＡＶ２ベクター製造用プラスミドのトランスフェクション
　前記実施例２－（１）で調製した細胞に、リン酸カルシウム法を用いて、ＡＡＶ２のＲｅｐタンパク質及びＣａｐタンパク質をコードするプラスミド、アデノウイルスのＥ２Ａ、ＶＡ、Ｖ４配列を含むプラスミド、並びにＡＡＶ２の２つのＩＴＲの間に蛍光タンパク質ＺｓＧｒｅｅｎ１の発現カセットを含むプラスミドをトランスフェクションした。トランスフェクション７時間後、培地を完全に除去した後、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭをディッシュ１枚当たり１５ｍＬ添加し、３７℃のＣＯ２インキュベーターで２日間培養した。
（３）ｒＡＡＶ２ベクター産生細胞の回収
　（２）の培養終了後、２０ｍＭ　ＥＤＴＡを含むＰＢＳ溶液３ｍＬを各ディッシュへ添加し、室温で数分間反応させることで細胞を剥離させた。その後、溶液ごと細胞を回収し、１，７５０×ｇ、４℃で１０分間遠心分離した後、上清を除去した。細胞ペレットにクエン酸を含有する酸性バッファーを添加し、遠心分離後、その上清をｒＡＡＶ２ベクター抽出液とした。得られたｒＡＡＶ２ベクター抽出液中のＡＡＶ２のウイルス粒子外の核酸をＤＮａｓｅＩにて消化した後、タンパク質変性剤を用いてＡＡＶ２粒子よりゲノムＤＮＡを遊離させた。こうして得られた溶液を、ｒＡＡＶ２ベクター由来の粗精製ゲノム溶液とした。
実施例３　プライマーペア選定のためのスクリーニング
　実施例１において設計した６種類の５’側プライマーと７種類の３’側プライマーとを組み合わせてプライマーペア（全４２通り）とし、ＡＡＶゲノムの定量に有効なプライマーペアのスクリーニングを行った。スクリーニングには、ＳＹＢＲ（登録商標）　Ｐｒｅｍｉｘ　Ｅｘ　Ｔａｑ　ＩＩ（Ｔｌｉ　ＲＮａｓｅＨ　Ｐｌｕｓ）（タカラバイオ社製）を使用し、以下の反応組成で行った。ＳＹＢＲ（登録商標）　Ｐｒｅｍｉｘ　Ｅｘ　Ｔａｑ　ＩＩ（Ｔｌｉ　ＲＮａｓｅＨ　Ｐｌｕｓ）（２×ｃｏｎｃ．）　１２．５μＬ、各１０μＭ　プライマーミックス　０．５μＬ、鋳型　５．０μＬを混合し、滅菌水にて全量を２５μＬにした。鋳型にはポジティブコントロールとして実施例２で調製したｒＡＡＶ２ベクター由来の粗精製ゲノム溶液を用いた。また、鋳型の代わりに滅菌水を使用する以外は上記と同様の反応組成のものを調製し、これをネガティブコントロールの反応液とした。反応は、ネガティブコントロールとポジティブコントロール共に、プライマーペア毎に２反応ずつ行った。反応及び検出は、Ｔｈｅｒｍａｌ　Ｃｙｃｌｅｒ　Ｄｉｃｅ（登録商標）　Ｒｅａｌ　Ｔｉｍｅ　Ｓｙｓｔｅｍ　ＩＩを使用し、９５℃、２分（初期変性）の後、９５℃、５秒～６０℃、３０秒を１サイクルとする３５サイクルのリアルタイムＰＣＲにより行った。また、ＰＣＲ終了後には、融解曲線分析を行った。
　リアルタイムＰＣＲにより得られた増幅曲線と融解曲線分析の結果を各プライマーペアについてまとめたものを、図１、２、３に示す。また、この結果に基づいて、ポジティブコントロールにおける反応性について各プライマーペアに関して行った判定を表１に、ネガティブコントロールにおける非特異的増幅の有無について各プライマーペアに関して行った判定を表２に示した。表１中、「○」は良好な増幅シグナルが認められる組み合わせを、「×」はそうでない組み合わせを示し、表２中、「○」は非特異的増幅シグナルが認められない組合せを、「×」は非特異的増幅シグナルが認められる組み合わせをそれぞれ示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　この結果より、プライマーの組み合わせとしては、全４２種類の組合せのうち、僅かにＬ１／Ｒ１、Ｌ１／Ｒ２、Ｌ２／Ｒ１、Ｌ２／Ｒ２の組み合わせのみが有望であった。
実施例４　定量性の確認
　実施例３より有望であったプライマーセットＬ１／Ｒ１、Ｌ１／Ｒ２、Ｌ２／Ｒ１、Ｌ２／Ｒ２の４通りを用いて定量性の確認を行った。定量性の確認には、ＳＹＢＲ（登録商標）　Ｐｒｅｍｉｘ　Ｅｘ　Ｔａｑ　ＩＩ（Ｔｌｉ　ＲＮａｓｅＨ　Ｐｌｕｓ）を使用し、以下の反応組成で行った。ＳＹＢＲ（登録商標）　Ｐｒｅｍｉｘ　Ｅｘ　Ｔａｑ　ＩＩ（Ｔｌｉ　ＲＮａｓｅＨ　Ｐｌｕｓ）（２×ｃｏｎｃ．）　１２．５μＬ、前記４通りの各１０μＭ　プライマーミックス　０．５μＬ、鋳型　５．０μＬを混合し、滅菌水にて全量を２５μＬにした。反応液は、鋳型として実施例２で調製したｒＡＡＶ２ベクター由来の粗精製ゲノム溶液を使用したもの、ＡＡＶ２のＩＴＲ中の増幅領域を搭載したプラスミドＤＮＡの１０倍段階希釈物（１×１０２コピー／５μＬ、１×１０３コピー／５μＬ、１×１０４コピー／５μＬ、１×１０５コピー／５μＬ、１×１０６コピー／５μＬ、又は１×１０7コピー／５μＬ）を使用したもの、及びネガティブコントロールとして鋳型の代わりに滅菌蒸留水を用いたものを調製した。反応及び検出は、９５℃、２分（初期変性）の後、９５℃、５秒～６０℃、３０秒を１サイクルとする３５サイクルのリアルタイムＰＣＲにより行った。また、リアルタイムＰＣＲの終了後には融解曲線分析を行った。さらに、各コピー数のプラスミドＤＮＡを鋳型として用いたリアルタイムＰＣＲの結果より検量線を作成し、得られた検量線よりｒＡＡＶ２ベクター由来の粗精製ゲノムの定量解析を行った。
　結果を図４に示した。図４では、各プライマーセットについて、上から順に、各コピー数のプラスミドＤＮＡを鋳型として用いた場合の増幅曲線、各コピー数のプラスミドＤＮＡを鋳型として用いた場合の融解曲線分析結果、鋳型としてｒＡＡＶ２ベクター由来の粗精製ゲノム溶液を用いた場合とネガティブコントロールの反応の増幅曲線、鋳型としてｒＡＡＶ２ベクター由来の粗精製ゲノム溶液を用いた場合とネガティブコントロールの反応の融解曲線分析結果、及び検量線を示す。図４から明らかな通り、いずれのプライマーセットも良好な定量性を示し、ｒＡＡＶ２のゲノムＤＮＡを定量することができた。また、非特異的増幅も認められなかった。Ｌ１／Ｒ１の組み合わせでは、１×１０３コピー～１×１０７コピーの鋳型量の範囲で相関係数（Ｒ２）が１．０００の検量線が得られた。また、この鋳型量の範囲でのＬ１／Ｒ１をプライマーセットとして用いた場合の反応効率は９９．７％であり、４種類のプライマーセットを用いた反応のうち最も１００％に近い反応効率であった。本実施例により、プライマーセットＬ１／Ｒ１、Ｌ１／Ｒ２、Ｌ２／Ｒ１、Ｌ２／Ｒ２の４通りがＡＡＶ２のゲノムＤＮＡの定量用のプライマーセットとして優れており、なかでもＬ１／Ｒ１の組み合わせが最も優れていることが分かった。
　本発明は、医学、遺伝子工学、生物学分野において特に有用である。
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Claims (13)

  1. 　アデノ随伴ウイルスゲノムの定量方法であって、
    （ａ）検体、アデノ随伴ウイルスの逆方向末端反復配列に含まれる核酸配列のみを増幅するための少なくとも１対のプライマー対、及びインターカレーティング色素を含む組成物を調製する工程、
    （ｂ）工程（ａ）により調製した組成物を用いて核酸増幅反応を行う工程、並びに
    （ｃ）工程（ｂ）により得られた増幅産物を検出する工程、
    を含む方法。
  2. 　プライマー対が、配列表の配列番号１で表される塩基配列を含むプライマーと、配列表の配列番号７で表される塩基配列を含むプライマーとからなる、請求項１に記載の方法。
  3. 　プライマー対が、配列表の配列番号１又は２で表される塩基配列からなるプライマーと、配列表の配列番号７又は８で表される塩基配列からなるプライマーとからなる、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 　インターカレーティング色素が、シアニン系色素を含む、請求項１～３いずれかに記載の方法。
  5. 　請求項１～４いずれかに記載の方法によりアデノ随伴ウイルスゲノムを定量する工程を包含する、アデノ随伴ウイルスの力価測定方法。
  6. 　アデノ随伴ウイルスゲノムを定量するための組成物であって、アデノ随伴ウイルスの逆方向末端反復配列に含まれる核酸配列のみを増幅するための少なくとも１対のプライマー対、及びインターカレーティング色素を含む組成物。
  7. 　プライマー対が、配列表の配列番号１で表される塩基配列を含むプライマーと、配列表の配列番号７で表される塩基配列を含むプライマーとからなる、請求項６に記載の組成物。
  8. 　プライマー対が、配列表の配列番号１又は２で表される塩基配列からなるプライマーと、配列表の配列番号７又は８で表される塩基配列からなるプライマーとからなる、請求項６又は７に記載の組成物。
  9. 　インターカレーティング色素が、シアニン系色素を含む、請求項６～８いずれかに記載の組成物。
  10. 　アデノ随伴ウイルスゲノムの定量用のキットであって、ＤＮＡポリメラーゼ、アデノ随伴ウイルスの逆方向末端反復配列に含まれる核酸配列のみを増幅するための少なくとも１対のプライマー対、及びインターカレーティング色素を含むキット。
  11. 　プライマー対が、配列表の配列番号１で表される塩基配列を含むプライマーと、配列表の配列番号７で表される塩基配列を含むプライマーとからなる、請求項１０に記載のキット。
  12. 　プライマー対が、配列表の配列番号１又は２で表される塩基配列からなるプライマーと、配列表の配列番号７又は８で表される塩基配列からなるプライマーとからなる、請求項１０又は１１に記載のキット。
  13. 　インターカレーティング色素が、シアニン系色素を含む、請求項１０～１２いずれかに記載のキット。
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