WO2015105356A1 - 순수 영양막층으로부터 유래된 줄기세포 및 이를 포함하는 세포치료제 - Google Patents

순수 영양막층으로부터 유래된 줄기세포 및 이를 포함하는 세포치료제 Download PDF

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    • C12N2506/1392—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells from mesenchymal stem cells from mesenchymal stem cells from other natural sources

Definitions

  • the present invention relates to stem cells derived from the pure trophoblast layer (the trophoblast layer without chorionic villus, chorionic trophoblast layer without villi, CT-V), which is a detailed structure of the placenta, and a cell therapy comprising the same.
  • Stem cells are undifferentiated cells and have the ability to differentiate into two or more different types of cells with self-replicating ability. Stem cells can be classified into totipotent stem cells, pluripotent stem cells, and multipotent stem cells according to their differentiation capacity. It can be divided into stem cells and adult stem cells. Embryonic stem cells are derived from preimplantation fertilized eggs or developing fetal genital tissues, while adult stem cells are derived from organs present in the adult, such as bone marrow, brain, liver, and pancreas.
  • Embryonic stem cells have limitations for use as cell therapy because of their ethical limitations.
  • adult stem cells can be collected mainly from fat, umbilical cord blood, bone marrow, and placenta, so there is no ethical problem.
  • adipose stem cells in adipose tissue and placental stem cells present in the placenta at birth are safe and differentiated. Because of its superiority, it can be used to improve the symptoms of various cell damage diseases such as diabetes, dementia, degenerative arthritis, myocardial infarction, cerebral infarction and renal failure, which are difficult to treat with modern medicine.
  • the placenta-derived stem cells by using the placenta discarded after childbirth, there is an advantage that can be easily collected and easily secure a large amount of stem cells.
  • Stem cells derived from adipose or bone marrow are limited in proliferative capacity and differentiation capacity due to the age or health status of the donor to be separated and extracted, and variable.
  • placental stem cells can be obtained at the earliest stage of adult stem cells.
  • Stem cells are hardly affected by stem cell capacity according to variables such as donor age and have excellent proliferation and differentiation capacity.
  • the placental stem cells can separate stem cell groups that can be used for various diseases such as neurological diseases, liver diseases, musculoskeletal diseases.
  • Korean Patent Registration No. 818214 discloses a method for separating stem cells from amnion or decidual membrane using NAC (N-acrtyl-L-cysteine) containing medium
  • Korean Patent Registration No. 871984 discloses bFGF. (Basic Fibroblast Growth Factor) using a medium containing a method for culturing stem cells derived from amnion, meninges, basal decidual membrane and placental tissue is disclosed
  • Korean Patent Publication No. 10-2007-0052204 A method for separating stem cells from chorionic villi is disclosed.
  • the present inventors continued to search for stem cells having better stem cell ability among placenta-derived stem cells.
  • pure trophoblast layer without chorionic villi, chorionic trophoblast layer without villi, CT-V Stem cells derived from show homogeneous growth characteristics, excellent proliferation characteristics and differentiation characteristics compared to the stem cells derived from the placenta as a whole, and in particular, it is confirmed that the stem cells derived from the placenta can be usefully used as cell therapeutic agents because of their excellent ability to differentiate into chondrocytes By this, the present invention was completed.
  • stem cells derived from the pure trophoblast layer which is a detailed tissue of the placenta.
  • Still another object of the present invention is to provide a cell therapeutic agent and a composition for tissue regeneration comprising stem cells derived from the pure trophoblast layer, which is a detailed tissue of the placenta, or cells differentiated from the stem cells as an active ingredient.
  • the present invention provides a stem cell derived from the pure trophoblast layer which is a detailed tissue of the placenta.
  • the present invention also provides a cell therapeutic agent comprising stem cells derived from the pure trophoblast layer, which is a detailed tissue of the placenta, or cells differentiated from the stem cells as an active ingredient.
  • the present invention also provides a composition for tissue regeneration comprising stem cells derived from the pure trophoblast layer, which is a detailed tissue of the placenta, or cells differentiated from the stem cells as an active ingredient.
  • Stem cells derived from the pure trophoblast layer (chorionic trophoblast layer without villi, CT-V) according to the present invention are homogeneous growth characteristics and excellent proliferation characteristics compared to stem cells derived from the whole placenta. And it shows the differentiation characteristics, in particular, excellent in the differentiation ability to cartilage cells can be usefully used as a cell therapy and tissue regeneration composition for the treatment of cartilage damage or cartilage defects.
  • AE amniotic epithelium
  • AM amniotic membrane
  • CM chorionic membrane
  • DC decidua
  • Figure 2 is a view showing a photograph of the cell morphology before microscopic passage (P0) and after long-term passage (P28) of pure trophoblast layer (CT-V) derived stem cells according to the present invention (X100) to be.
  • Figure 3 is a diagram showing a micrograph (X100) of the cell morphology before passage (P0) and long-term passage (P29) of the placenta-derived stem cells.
  • FIG. 4 is a diagram showing colony forming units of whole placenta-derived stem cells and pure trophoblastic layer (CT-V) -derived stem cells.
  • FIG. 5 is a diagram showing the population multiplication time of stem cells derived from placenta and pure trophoblastic layer (CT-V) derived stem cells.
  • FIG. 6 is a diagram showing the flow cytometry results for confirming the surface factor expression characteristics of pure trophoblastic layer (CT-V) derived stem cells according to the present invention.
  • Figure 7 shows the results of each staining to observe the degree of differentiation of adipogenesis, chondrocytes (Chondrogenesis) or osteocytes (Osteogenesis) of the placenta-derived stem cells and pure trophoblast-derived (CT-V) -derived stem cells It is also.
  • FIG. 8 is a diagram showing the results of quantification after staining with Saparin-O to observe the degree of differentiation of whole placental stem cells and pure trophoblast-derived stem cells (CT-V) -derived stem cells into cartilage cells.
  • Figure 9 shows the results of quantification after immunohistochemical staining using Type II collagen to observe the differentiation of whole placental stem cells and pure trophoblast-derived stem cells (CT-V) -derived stem cells into chondrocytes. to be.
  • CT-V trophoblast-derived stem cells
  • FIG. 10 is a diagram showing the results of comparative analysis of the differentiation of the stem cells derived from placental stem and pure trophoblast layer (CT-V) derived stem cells into adipocytes, chondrocytes or bone cells.
  • CT-V trophoblast layer
  • the present invention provides stem cells derived from the pure trophoblast layer without villi (CT-V), which is a detailed tissue of the placenta.
  • the "stem cell” refers to a cell having the ability to differentiate into two or more different kinds of cells while having a self-replicating ability.
  • Stem cells can be classified into totipotent stem cells, pluripotent stem cells, and multipotent stem cells.
  • totipotent stem cells are pluripotent cells capable of developing as a single individual. Cells up to 8 cell stages after fertilization of eggs and sperm have these properties. When a cell is separated and transplanted into the uterus, it means a cell capable of developing as a complete individual.
  • pluripotent stem cells are cells that can arise from various cells and tissues derived from ectoderm, mesoderm, and endoderm, and are located inside the blastocyst appearing after 4-5 days of fertilization. It originates from the inner cell mass, which is called embryonic stem cells, and refers to cells that differentiate into various other tissue cells but do not form new life.
  • multipotent stem cells refers to cells that can only differentiate into specific cells that form tissues and organs containing stem cells. For the purposes of the present invention said “stem cells” are preferably multipotent stem cells.
  • placenta refers to an in vivo tissue made for the fetus during pregnancy, and has a disc shape having a weight of 500-600 g, a diameter of 15-20 cm, and a thickness of 2-3 cm.
  • One side of the placenta is in contact with the mother and the other is in contact with the fetus, between which the transfer of nutrients and oxygen occurs between the mother's blood and the fetus's blood vessels.
  • Placenta can be largely divided into three layers, amnion, chorion, and decidual membrane, and more specifically, can be divided into amnion epithelium, amnion, chorion, trophoblast, and decidual membrane.
  • the decidual membrane is a membrane formed by deforming epithelial cells of the uterus in order for the fertilized egg to implant in the uterus.
  • FIG. 1 A cross-sectional view of the placenta is briefly shown in FIG. 1.
  • the "pure trophoblast layer” refers to a tissue other than the chorionic villus of the trophoblast layer located between the chorion and the decidua.
  • Stem cells derived from the pure trophoblast layer according to the present invention are cells obtained by performing an enzymatic reaction by adding an enzyme solution to the pure trophoblast layer tissue separated from the placenta, without using growth factors, and adding fetal bovine serum and antibiotics. It can be obtained by culturing in the medium followed by recovery.
  • stem cells derived from the pure trophoblast layer according to the present invention can be obtained through the following steps.
  • the step (a) is to separate the pure nutrient membrane layer from the placenta, and the separation method is not particularly limited thereto, but is performed by mechanical separation method using cloth W, scalpel, etc., chemical separation method using enzymatic treatment, and the like. Can be.
  • the separation method is not particularly limited thereto, but is performed by mechanical separation method using cloth W, scalpel, etc., chemical separation method using enzymatic treatment, and the like. Can be.
  • the step (b) is trypsin, collagenase, dispase, DNase, RNase, protease, lipase, hyaluronidase (hyaluronidase) in pure trophoblastic tissue. And one or more enzymes selected from the group consisting of elastase to obtain cells derived from the pure trophoblast layer.
  • the collagenase includes collagenase A, I, II, III or IV.
  • the method of terminating the reaction of the enzyme is not particularly limited, but it is preferable to use a method of adding a medium containing fetal calf serum.
  • Step (c) is a step of selecting stem cells from the pure trophoblast-derived cells
  • the selection method is not particularly limited to this, the culture of the pure trophoblast-derived cells obtained through the step (b) in a culture vessel And, it is preferably carried out by the method of selecting the cells to be attached and cultured attached to the lower portion of the culture vessel.
  • the medium used in the culture may be any medium used for the culture of stem cells, but is not particularly limited, it is preferable to use a medium containing serum and antibiotics that do not include growth factors.
  • the cells obtained in step (b) are filtered through a mesh to remove undigested tissue, and washed with a medium to which fetal bovine serum and antibiotics are added.
  • the washed cells are cultured in a medium containing no fetal growth factor and added fetal bovine serum and antibiotics, and the mesenchymal stem cells attached to the bottom of the culture vessel are selected.
  • the selected mesenchymal stem cells have morphological characteristics similar to fibroblastic cells in appearance of protrusions and elongated forms.
  • Stem cells derived from the pure trophoblast layer which is a detailed tissue of the placenta according to the present invention, exhibits the following characteristics.
  • Stem cells derived from the pure trophoblast layer according to the present invention can be differentiated into different kinds of cells according to the following method, for example, adipocytes, chondrocytes, bone cells, nerve cells, ligament cells or dry cells ( tenocytes) can be differentiated into various kinds of cells, and the like.
  • differentiation generally refers to a phenomenon in which a relatively simple limit is separated into two or more qualitatively different sub-systems, specifically, a phenomenon in which structures or functions are specialized while cells divide and grow, In other words, it means a phenomenon in which the cells or tissues of a living organism change shape or function to perform a given task.
  • undifferentiated means a state in which the above-mentioned differentiation has not yet occurred, yet contains a characteristic as a stem cell.
  • the method of differentiating stem cells may be performed according to a conventionally known method, and is not particularly limited.
  • the stem cells are cultured in a medium containing dexamethasone (indamethasone), indomethacin (indomethacin), insulin and IBMX (3-isobutyl-1-methylxanthine) to differentiate into adipocytes;
  • the stem cells were cultured in a medium containing dexamethasone, BMP-6 (bone morphogenetic protein 6), transforming growth factor beta (TGF- ⁇ ), ascorbic acid, and L-proline (L-proline).
  • the stem cells are cultured in a medium containing dexamethasone, ascorbic acid, ⁇ -glycrophosphate and ⁇ -glycrophosphate and ascorbic acid-2-phosphate to differentiate into bone cells. This is preferred.
  • the method for measuring the degree of differentiation of stem cells derived from the pure trophoblast layer differentiated by the above method is not particularly limited thereto, but flow cytometry, immunocytochemical, PCR or gene-expression profiles known in the art may be used. Methods for measuring changes in cell surface labeling or morphology, methods for examining morphological changes of cells using an optical microscope or confocal microscopy, methods for measuring changes in gene expression profiles, and the like.
  • RT-PCR Oil-red O staining, Safranin O staining, Type II collagen immunohistochemical staining, ALP (alkaline phosphate) staining or Alizarin red S staining can be used.
  • Stem cells derived from the pure trophoblast layer (chorionic trophoblast layer without villi, CT-V) according to the present invention are homogeneous growth characteristics and excellent proliferation characteristics compared to stem cells derived from the whole placenta. And differentiation characteristics, in particular, the ability to differentiate into chondrocytes is excellent.
  • the present invention provides a cell therapy agent comprising stem cells derived from a pure trophoblast layer without villi (CT-V), which is a detailed structure of the placenta, or cells differentiated from the stem cells as an active ingredient.
  • C-V trophoblast layer without villi
  • the differentiated cells include chondrocytes, adipocytes, bone cells, nerve cells, ligament cells, psoriasis cells and the like, and may be selected for treatment purposes.
  • cellular therapeutic agent refers to a medicinal product (US FDA regulation) used for the purpose of treatment, diagnosis, and prevention of cells and tissues prepared through isolation, culture, and special manipulation from humans. Or through a series of actions such as proliferating and screening living autologous, allogeneic, or heterologous cells in vitro or otherwise altering the biological properties of a cell to restore tissue function. Means the drug used for the purpose.
  • the cell therapy agent of the present invention can be used for the treatment of cartilage damage, cartilage defect, bone defect, tendon-ligament defect, or adipose tissue defect.
  • cartilage defect is a meaning encompassing the case that the cartilage included in the body is damaged, defective (defect) or lack, for example, cartilage trauma, cartilage rupture, cartilage softening, cartilage necrosis, osteochondritis, cartilage Defects or osteoarthritis, and the like.
  • Stem cells derived from the pure trophoblast layer of the present invention are various types in which tissues or organs of the body are adjusted, strengthened, treated or replaced by engraftment, transplantation or infusion of a desired cell population, for example, a stem or differentiated cell population. Can be used in the treatment protocol. Stem cells derived from the pure trophoblast layer of the present invention can replace or enhance existing tissue, resulting in new or changed tissue, or bind to biological tissue or structures.
  • the stem cells derived from the pure trophoblast layer of the present invention can be used for the purpose of treating lesions of articular cartilage by administering in the joints, or treating or preventing them by administering to the tendons or ligaments.
  • stem cells derived from the pure trophic membrane layer of the present invention can be used to reconstruct or reconstruct tissues of joints (eg, knee joints, etc.).
  • Preferred dosages of the cell therapy of the present invention vary depending on the condition and weight of the individual, the extent of the disease, the form of the drug, the route of administration and the duration, and may be appropriately selected by those skilled in the art. Administration may be administered once a day, may be administered several times, the dosage does not limit the scope of the invention in any aspect.
  • the present invention also provides a composition for tissue regeneration comprising stem cells derived from the pure trophoblast layer or cells differentiated from the stem cells as an active ingredient.
  • the tissue is not particularly limited, but includes tissues such as cartilage, fat, bone, nerves, ligaments and tendons, and is preferably cartilage.
  • the cartilage includes hyaline cartilage, fibrocartilage, or elastic cartilage.
  • articular cartilage articular cartilage, ear cartilage, non-cartilage, elbow cartilage, meniscus. (meniscus), knee cartilage, costal cartilage, ankle cartilage, tracheal cartilage, laryngeal cartilage or spinal cartilage, but is not limited thereto.
  • Placenta was collected from mothers who agreed to donate at normal delivery after cesarean section at Samsung Medical Center. Placental tissue was transferred to sterile containers. After peeling the amniotic membrane from the transferred placental tissue, the trophoblast layer located between the chorional membrane (CM) and the decidual membrane (DC) is separated, and the chorionic trophoblast layer without villi, CT-V, except for the chorionic villi of the trophoblast layer. ) was carefully separated using sterile sachets W and scalpel. A cross section of the placenta is shown in FIG. 1.
  • the separated pure trophoblast tissue was washed several times with PBS to remove blood and blood cells, and then the tissue was chopped as finely as possible. Then, DMEM medium added with 0.2% collagenase was added and the mixture was stirred at 37 ° C. using a stirrer. After reacting for -3 hours, cells derived from the pure trophoblast layer were obtained.
  • Cells derived from the pure trophoblast layer tissue obtained above were filtered through a 70 ⁇ m mesh to remove undigested tissues, and DMEM medium containing fetal calf serum and antibiotics was added and centrifuged at 25 ° C. and 1000 rpm for 4 minutes. . The supernatant was removed and DMEM medium containing fetal calf serum and antibiotics was added to the remaining precipitated cells, and cultured under 37 ° C and 5% CO 2 . The cells attached to the bottom of the culture vessel in the culture were selected to obtain stem cells derived from the pure trophoblast layer.
  • DMEM medium to which 0.2% collagenase was added to the washed placental tissue was added and reacted using a stirrer at 37 ° C to obtain placental cells.
  • the obtained placental cells were filtered through a 70 ⁇ m mesh to remove undigested tissues, and DMEM medium containing fetal calf serum and antibiotics was added, followed by centrifugation at 25 ° C. and 1000 rpm for 4 minutes. The supernatant was removed and DMEM medium containing fetal calf serum and antibiotics was added to the remaining precipitated cells, and cultured under 37 ° C and 5% CO 2 .
  • the cells attached to the bottom of the culture vessel in the culture were selected to obtain stem cells derived from whole placenta (Pla).
  • DMEM medium containing fetal calf serum and antibiotics was added every 2 to 3 days without growth factors. While culturing. When the stem cells grow more than 80%, by treating (TryPLE) to separate the stem cells from the culture vessel, dilution of the separated stem cells in a ratio of 1/4, and then passage in another culture vessel method Cultivation was performed. As the passage was repeatedly performed, passage numbers that were no longer passaged were measured, and the cell morphology before passage (P0) and after passage for a long time was observed under a microscope.
  • the pure trophoblastic layer (CT-V) -derived stem cells according to the present invention exhibits the morphological characteristics of the fibroblast shape, has an excellent proliferative capacity up to 28 passages, it is possible to culture for a long time Confirmed.
  • whole placenta (Pla) -derived stem cells exhibit the morphological characteristics of the fibroblast shape from the beginning of passage culture, a plurality of different types of cells, not one form is mixed It could be confirmed. That is, compared with the pure trophoblast layer (CT-V) -derived stem cells according to the present invention (FIG. 2), stem cells derived from the pure trophoblast layer (CT-V) before and after passage culture specifically retain only a single cell. However, stem cells derived from the whole placenta were mixed with different types of cells.
  • the colony forming ability of stem cells derived from the pure trophoblast layer which is a detailed tissue of the placenta obtained in Example 1, was confirmed. More specifically, the stem cell derived from the pure trophoblast layer obtained in Example 1 was subjected to the first passage culture by the method of Example 2, 5 X 10 in a 100 mm dish at the time when the passage is terminated After seeding three times , the cells were cultured in DMEM medium containing fetal calf serum and antibiotics without growth factors for 10 days. The cultured stem cells were subjected to Gimessa staining to count how many colonies were formed in the stem cells, and their average values were calculated. In addition, colony forming ability was measured by the same method using the whole placental stem cells obtained in Comparative Example 1, and the resultant value was converted to 100%. The results are shown in FIG.
  • the pure trophoblastic layer (CT-V) derived stem cells according to the present invention was confirmed that the colony-forming ability than the stem cells derived from the placenta.
  • the population doubling time of stem cells derived from the pure trophoblast layer which is a detailed tissue of the placenta obtained in Example 1, was measured. More specifically, the stem cells derived from the pure trophoblast layer obtained in Example 1 were subjected to the first passage culture by the method of Example 2, and the cells were obtained and repeated subcultures at intervals of 2-3 days. . When the cells were obtained, the increased number of cells was confirmed, and when passaged, 3 ⁇ 10 5 cells were cultured in 100 mm dishes. The point at which the number of cells no longer increased during the passage was determined as the point at which the increase was not finally made. Doubling time was measured by the number of cells passaged from P2 to P6, calculated as follows. In addition, using the whole placental stem cells obtained in Comparative Example 1, the population doubling time was calculated in the same manner. The results are shown in FIG.
  • the pure trophoblast-derived stem cells (CT-V) -derived stem cells according to the present invention was confirmed that the population proliferation (population doubling time) is shorter than the stem cells derived from the placenta as a whole.
  • stem cells derived from the pure trophoblast layer which is a detailed tissue of the placenta obtained in Example 1
  • the following experiment was performed.
  • stem cells derived from the pure trophoblast layer were washed with PBS, triple treated, and the stem cells were collected and centrifuged at 1000 rpm for 4 minutes. After removing the supernatant, the stem cells were washed by adding a mixture of 2% FBS and PBS to inhibit nonspecific binding, and then centrifuged at 1000 rpm for 5 minutes. After removing the supernatant, the stem cells were suspended in PBS, and each 1 ⁇ 10 5 cells were dispensed into a flow cytometer-specific round flask.
  • the antibody PE-conjugated mouse anti-human monoclonal antibody
  • the antibody was added thereto, incubated for 30 minutes on ice, and centrifuged for 5 minutes at 1000 rpm. The supernatant was again removed, washed with PBS, and centrifuged at 1000 rpm for 5 minutes. The process was repeated twice. Finally, after removing the supernatant, stem cells were singulated and immunological characteristics were analyzed using a flow cytometer (FACS). In addition, the immunological characteristics of the whole placental stem cells obtained in Comparative Example 1 were analyzed by the same method. The results are shown in Table 1 and FIG.
  • the pure trophoblast layer (CT-V) -derived stem cells shows a positive marker expression characteristics for CD44, CD73, CD90 and CD105, CD31, CD34, CD45 and It was confirmed that the marker expression characteristics of the negative for HLA-DR.
  • the stem cells were known to induce differentiation of known chondrocyte differentiation medium (0.1 ⁇ M dexamethasone, 50 ⁇ g / ml ascorb). Differentiation into chondrocytes by incubation for 3 weeks in acid, 40 ⁇ g / ml L-proline, DMEM medium containing 10 ng / ml TGF- ⁇ 3, 500 ng / ml BMP-6, 50 mg / ml ITS premix) Induced.
  • known chondrocyte differentiation medium 0.1 ⁇ M dexamethasone, 50 ⁇ g / ml ascorb.
  • Differentiation into chondrocytes by incubation for 3 weeks in acid, 40 ⁇ g / ml L-proline, DMEM medium containing 10 ng / ml TGF- ⁇ 3, 500 ng / ml BMP-6, 50 mg / ml ITS premix
  • the pure trophoblast layer (CT-V) derived stem cells according to the present invention was confirmed that has a superior chondrocyte differentiation ability that can be differentiated into chondrocytes uniformly than the stem cells derived from the whole placenta. It was.
  • stem cells derived from the pure trophoblast layer are fat
  • the degree of differentiation into cells or osteoblasts was similar to that of stem cells derived from the placenta, but the differentiation into chondrocytes was particularly excellent (FIG. 10).
  • stem cells derived from the whole placenta are mixed with stem cells having different differentiation patterns derived from various tissues, and thus are somewhat insufficient in producing a desired cell therapeutic effect, but stem cells derived from the pure trophoblast layer according to the present invention.
  • stem cells derived from the pure trophoblast layer according to the present invention When using, only cells with homogeneous properties can be used, and the differentiation ability to cartilage cells is excellent, and when applied as a cell therapeutic agent of diseases requiring cartilage damage or cartilage regeneration, it was confirmed that the excellent effect.

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Abstract

본 발명은 태반의 세부조직인 순수 영양막층(융모막 융모를 제외한 영양막층, chorionic trophoblast layer without villi, CT-V)으로부터 유래된 줄기세포 및 이를 포함하는 세포치료제에 관한 것이다. 본 발명에 따른 순수 영양막층으로부터 유래된 줄기세포는 종래의 태반 전체로부터 유래된 줄기세포에 비하여 균질한 성장 특성, 우수한 증식 특성 및 분화 특성을 나타내며, 특히, 연골 세포로의 분화능이 우수하여 연골 손상 또는 연골 결손 등의 치료를 위한 세포치료제 및 조직 재생용 조성물로 유용하게 이용할 수 있다.

Description

순수 영양막층으로부터 유래된 줄기세포 및 이를 포함하는 세포치료제
본 발명은 태반의 세부조직인 순수 영양막층(융모막 융모를 제외한 영양막층, chorionic trophoblast layer without villi, CT-V)으로부터 유래된 줄기세포 및 이를 포함하는 세포치료제에 관한 것이다.
최근의 생명공학은 인간 복지를 최종 목표로 식량, 환경, 건강 문제에 새로운 해결책의 가능성을 제시하고 있으며, 그 중 줄기세포를 이용한 기술은 난치병 치료의 새로운 장으로 떠오르고 있다. 이전까지는 인간의 난치병 치료를 위해 장기이식, 유전자 치료 등이 제시되었으나, 면역 거부와 공급 장기 부족, 벡터 개발이나 질환 유전자에 대한 지식 부족으로 효율적인 실용화가 미진하였다. 이에 줄기세포에 대한 관심이 고조되어, 증식과 분화를 통해 모든 기관을 형성할 능력을 가진 만능 줄기세포가 대부분의 질병 치료는 물론 장기 훼손을 근원적으로 해결할 수 있는 것으로 인식되었다. 또한, 많은 과학자들이 인체의 거의 모든 장기 재생은 물론 난치병이었던 파킨슨병, 각종 암, 당뇨병과 척수손상 등의 치료에 이르기까지 줄기세포의 적용 가능성을 다양하게 제시해 왔다.
줄기세포(stem cell)란 미분화된 세포로서 자기 복제 능력을 가지면서 두 개 이상의 서로 다른 종류의 세포로 분화하는 능력을 갖는 세포를 말한다. 줄기세포는 분화능에 따라 만능 줄기세포(totipotent stem cell), 전분화능 줄기세포(pluripotent stem cells), 다분화능(다능성) 줄기세포(multipotent stem cells)로 분류할 수 있으며, 세포학적 유래에 따라 배아 줄기세포와 성체 줄기세포로 구분될 수 있다. 배아 줄기세포는 착상 전 수정란이나 발생중인 태아 생식기 조직 등에서 유래하는 반면, 성체 줄기세포는 성체 내에서 존재하는 각 기관, 예를 들면 골수, 뇌, 간, 췌장 등에서 유래한다.
배아 줄기세포는 윤리적으로 제한이 있기 때문에 세포치료제로 사용하기 위한 한계가 있었다. 이에 반해, 성체 줄기세포는 주로 지방, 제대혈, 골수 및 태반 등에서 채취가 가능하여 윤리적인 문제가 없으며, 특히, 지방 조직에 있는 지방 줄기세포와 출산 시 태반에 존재하는 태반 줄기세포는 안전하면서도 분화능력이 뛰어나기 때문에 현대의학으로 치료가 힘든 난치성 질환인 당뇨, 치매, 퇴행성 관절염, 심근경색, 뇌경색, 신부전 등의 다양한 세포손상 질환의 증상을 개선하는데 활용될 수 있다.
이중, 태반 유래 줄기세포의 경우 출산 후 폐기되는 태반을 이용함으로써, 채취가 용이하고 다량의 줄기 세포를 손쉽게 확보 가능한 장점이 있다. 지방이나 골수 유래 줄기세포는 분리, 추출되는 공여자의 나이나 건강상태 등에 영향을 받아 증식력이나 분화능 등에 제한이 있고 변동성이 많지만, 태반 유래 줄기세포의 경우 성체 줄기세포 중 가장 이른 시기에 수득할 수 있는 줄기세포로서 공여자의 나이 등의 변수에 따라 줄기세포능에 영향을 거의 받지 않으며 뛰어난 증식력 및 분화능을 가진다. 또한, 태반 유래 줄기세포는 신경계 질환, 간 질환, 근골격계 질환 등 다양한 질환에 활용 가능한 줄기세포군을 분리할 수 있다.
상술한 장점 때문에, 태반 유래 줄기세포에 관한 연구가 활발히 진행되고 있다. 예를 들어, 대한민국 특허등록 제818214호에는 NAC(N-acrtyl-L-cysteine) 함유 배지를 이용하여 양막 또는 탈락막으로부터 줄기세포를 분리하는 방법이 개시되어 있고, 대한민국 특허등록 제871984호에는 bFGF(Basic Fibroblast Growth Factor) 함유 배지를 이용하여 양막, 장막, 기저 탈락막 및 태반 조직으로부터 유래된 줄기세포를 배양하는 방법이 개시되어 있으며, 대한민국 공개특허 제10-2007-0052204호에는 태반 영양막의 태반 융모(chorionic villi)로부터 줄기세포를 분리하는 방법이 개시되어 있다. 그러나 현재까지 태반의 세부조직인 순수 영양막층으로부터 유래된 줄기세포에 대한 연구는 수행된 바가 없다.
이에, 본 발명자들은 태반 유래 줄기세포 중에서도 줄기세포능이 더욱 우수한 줄기세포를 찾기 위한 연구를 계속한 결과, 태반의 세부조직인 순수 영양막층(융모막 융모를 제외한 영양막층, chorionic trophoblast layer without villi, CT-V)으로부터 유래된 줄기세포가 종래의 태반 전체 유래 줄기세포에 비해 균질한 성장 특성, 우수한 증식 특성 및 분화 특성을 나타내며, 특히 연골 세포로의 분화능이 우수하여 세포치료제로서 유용하게 이용될 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 태반의 세부조직인 순수 영양막층으로부터 유래된 줄기세포를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 태반의 세부조직인 순수 영양막층으로부터 유래된 줄기세포 또는 상기 줄기세포로부터 분화된 세포를 유효성분으로 포함하는 세포치료제 및 조직 재생용 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 태반의 세부조직인 순수 영양막층으로부터 유래된 줄기세포를 제공한다.
또한, 본 발명은 태반의 세부조직인 순수 영양막층으로부터 유래된 줄기세포 또는 상기 줄기세포로부터 분화된 세포를 유효성분으로 포함하는 세포치료제를 제공한다.
또한, 본 발명은 태반의 세부조직인 순수 영양막층으로부터 유래된 줄기세포 또는 상기 줄기세포로부터 분화된 세포를 유효성분으로 포함하는 조직 재생용 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 순수 영양막층(융모막 융모를 제외한 영양막층, chorionic trophoblast layer without villi, CT-V)으로부터 유래된 줄기세포는 종래의 태반 전체로부터 유래된 줄기세포에 비하여 균질한 성장 특성, 우수한 증식 특성 및 분화 특성을 나타내며, 특히, 연골 세포로의 분화능이 우수하여 연골 손상 또는 연골 결손 등의 치료를 위한 세포치료제 및 조직 재생용 조성물로 유용하게 이용할 수 있다.
도 1은 태반의 단면을 나타내는 현미경 사진으로서, 위로부터 태반의 양막 상피(amniotic epithelium; AE), 양막(amniotic membrane; AM), 융모막(chorionic membrane; CM), 순수 영양막층(chorionic trophoblast layer without villi; CT-V), 융모막 융모(chorionic villi; CV) 및 탈락막(decidua; DC)이 순서적으로 적층된 형태를 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명에 따른 순수 영양막층(CT-V) 유래 줄기세포의 계대 배양하기 이전(P0)과 장기간 계대 배양한 이후(P28)의 세포 형태를 현미경으로 관찰한 사진(X100)을 나타낸 도이다.
도 3는 태반 전체 유래 줄기세포의 계대 배양하기 이전(P0)과 장기간 계대 배양한 이후(P29)의 세포 형태를 현미경으로 관찰한 사진(X100)을 나타낸 도이다.
도 4는 태반 전체 유래 줄기세포 및 순수 영양막층(CT-V) 유래 줄기세포의 집락 형성 단위를 나타낸 도이다.
도 5는 태반 전체 유래 줄기세포 및 순수 영양막층(CT-V) 유래 줄기세포의 집단 배가 시간을 나타낸 도이다.
도 6은 본 발명에 따른 순수 영양막층(CT-V) 유래 줄기세포의 표면인자 발현 특성을 확인하기 위한 유세포 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 7은 태반 전체 유래 줄기세포 및 순수 영양막층(CT-V) 유래 줄기세포의 지방세포(Adipogenesis), 연골세포(Chondrogenesis) 또는 골세포(Osteogenesis)로의 분화 정도를 관찰하기 위한 각 염색 결과를 나타낸 도이다.
도 8은 태반 전체 유래 줄기세포 및 순수 영양막층(CT-V) 유래 줄기세포의 연골 세포로의 분화정도를 관찰하기 위하여 Saparin-O로 염색한 후, 정량화한 결과를 나타낸 도이다.
도 9는 태반 전체 유래 줄기세포 및 순수 영양막층(CT-V) 유래 줄기세포의 연골 세포로의 분화정도를 관찰하기 위하여 Type II collagen을 이용한 면역조직화학염색을 수행한 후 정량화한 결과를 나타낸 도이다.
도 10은 태반 전체 유래 줄기세포 및 순수 영양막층(CT-V) 유래 줄기세포의 지방세포, 연골세포 또는 골세포로의 분화 정도를 비교 분석한 결과를 나타낸 도이다.
이하, 본 발명에 대해 상세히 설명한다.
본 발명은 태반의 세부조직인 순수 영양막층(chorionic trophoblast layer without villi, CT-V)으로부터 유래된 줄기세포를 제공한다.
본 발명에서 "줄기세포"란, 자기 복제 능력을 가지면서 두 개 이상의 서로 다른 종류의 세포로 분화하는 능력을 갖는 세포를 의미한다. 줄기세포는 분화능에 따라, 만능 줄기세포(totipotent stem cell), 전분화능 줄기세포(pluripotent stem cells), 다분화능(다능성) 줄기세포(multpotent stem cells)로 분류할 수 있다.
본 발명에서 "만능 줄기세포(totipotent stem cells)"란, 하나의 완전한 개체로 발생해 나갈 수 있는 만능의 성질을 가진 세포로 난자와 정자의 수정 이후 8세포기까지의 세포가 이러한 성질을 가지며 이 세포를 분리하여 자궁에 이식하면 하나의 완전한 개체로 발생해 나갈 수 있는 세포를 의미한다. 본 발명에서 "전분화능 줄기세포(pluripotent stem cells)"란, 외배엽, 중배엽, 내배엽층 유래의 다양한 세포와 조직으로 발생할 수 있는 세포로서, 수정 4-5일 후 나타나는 배반포(blastocyst)의 안쪽에 위치한 내세포괴(inner cell mass)에서 유래하며, 이를 배아 줄기 세포라 하고 다양한 다른 조직 세포로 분화되지만 새로운 생명체를 형성하지는 못하는 세포를 의미한다. 본 발명에서 "다분화능 줄기세포"는 줄기세포가 포함되어 있는 조직 및 기관을 형성하는 특이적인 세포로만 분화할 수 있는 세포를 의미한다. 본 발명의 목적상 상기 "줄기세포"는 바람직하게는 다분화능 줄기세포이다.
본 발명에서 "태반(placenta)"이란, 임신 중에 태아를 위해 만들어지는 생체 내 조직을 의미하는데, 무게 500-600 g, 지름 15-20 cm, 두께 2-3 cm 정도의 원반형태이다. 태반의 한쪽은 모체와 닿아 있고 다른 한쪽은 태아와 맞닿아 있으며, 그 사이에서 모체의 혈액과 태아의 혈관 사이에 영양분 및 산소의 전달이 이루어지게 된다. 태반은 크게 양막, 융모막, 탈락막의 3층으로 구분할 수 있고, 보다 상세하게는 양막 상피, 양막, 융모막, 영양막층, 탈락막으로 구분할 수 있다. 탈락막은 수정란이 자궁에 착상되기 위해 자궁의 상피세포가 변형되어 형성된 막이다. 태반의 단면도를 도 1에 간략히 나타내었다.
본 발명에서 “순수 영양막층”이란 융모막과 탈락막 사이에 위치한 영양막층 중 융모막 융모를 제외한 조직을 의미한다.
본 발명에 따른 순수 영양막층으로부터 유래된 줄기세포는 태반으로부터 분리한 순수 영양막층 조직에 효소 용액을 가하여 효소반응을 수행하여 얻어진 세포를, 성장 인자를 사용하지 않고, 소 태아 혈청 및 항생제가 첨가된 배지에서 배양한 다음 회수함으로써 수득될 수 있다.
보다 구체적으로, 본 발명에 따른 순수 영양막층으로부터 유래된 줄기세포는 하기와 같은 단계를 통해 수득될 수 있다.
(a) 태반으로부터 세부조직인 순수 영양막층(chorionic trophoblast layer without villi; CT-V)을 분리하는 단계;
(b) 상기 분리된 순수 영양막층 조직에 트립신(Trypsin), 콜라게나아제(collagenase), 디스파아제(dispase), DNase, RNase, 프로테아제(protease), 리파아제(lipase), 히알루로니다아제(hyaluronidase) 및 엘라스타제 (elastase)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 효소를 처리하여, 순수 영양막층 유래의 세포를 수득하는 단계; 및
(c) 상기 수득한 순수 영양막층 유래의 세포로부터 줄기세포를 선별하는 단계.
이하, 본 발명의 순수 영양막층으로부터 줄기세포의 제조 방법을 각 단계별로 구체적으로 설명한다.
상기 (a) 단계는 태반으로부터 세부조직인 순수 영양막층을 분리하는 단계로, 분리 방법은 특별히 이에 제한되지 않으나, 포 W, 메스 등을 이용한 기계적 분리방법, 효소적 처리를 이용한 화학적 분리방법 등에 의하여 수행될 수 있다. 또한, (a) 단계 이후에 상기 분리된 조직을 세척하여 태반으로부터 유래된 혈액을 제거함이 바람직하며, 이때 세척액으로 PBS를 이용할 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.
상기 (b) 단계는 순수 영양막층 조직에 트립신(Trypsin), 콜라게나아제(collagenase), 디스파아제(dispase), DNase, RNase, 프로테아제(protease), 리파아제(lipase), 히알루로니다아제(hyaluronidase) 및 엘라스타제 (elastase)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 효소를 처리하여, 순수 영양막층 유래의 세포를 수득하는 단계이다. 상기 콜라게나아제는 콜라게나아제 A, I, II, III 또는 IV등을 포함한다. 상기 효소의 반응을 종료시키는 방법은 특별히 이에 제한되지 않으나, 우태아 혈청을 포함하는 배지를 추가하는 방법을 사용함이 바람직하다.
상기 (c) 단계는 순수 영양막층 유래의 세포로부터 줄기세포를 선별하는 단계로, 선별 방법은 특별히 이에 제한되지 않으나, 상기 (b) 단계를 통해 수득한 순수 영양막층 유래의 세포를 배양용기에서 배양하고, 상기 배양 용기의 하부에 부착되어 부착 배양되는 세포를 선별하는 방법에 의하여 수행됨이 바람직하다. 이때 배양 시 사용되는 배지는 줄기세포의 배양에 사용되는 모든 배지를 사용할 수 있으며, 특별히 이에 제한되지는 않으나, 성장인자를 포함하지 않은 혈청 및 항생제를 포함하는 배지를 사용함이 바람직하다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 (b) 단계에서 수득한 세포를 메쉬에 여과하여 분해되지 않은 조직을 제거하고, 소 태아 혈청 및 항생제가 첨가된 배지를 이용하여 세척한다. 상기 세척된 세포를 성장인자를 포함하지 않고, 소 태아 혈청 및 항생제가 첨가된 배지에서 배양하고, 배양 용기의 바닥에 부착되는 중간엽 줄기세포를 선별한다. 상기 선별된 중간엽 줄기세포는 외형적으로는 돌기 및 길쭉한 형태를 나타내어 섬유아세포(fibroblastic cells)와 유사한 형태학적 특성을 나타낸다.
본 발명에 따른 태반의 세부조직인 순수 영양막층으로부터 유래된 줄기세포는 다음과 같은 특징을 나타낸다.
(a) 섬유아세포(fibroblastic cell) 모양의 형태학적 특징;
(b) 25 내지 30 이상의 계대수에 이르도록 장기간 동안 증식할 수 있는 능력;
(c) 지방세포, 연골세포 또는 골세포로 분화할 수 있는 능력;
(d) 집락형성능;
(e) CD44, CD73, CD90 및 CD105에 대하여 양성의 면역학적 특성; 및,
(f) CD31, CD34, CD45 및 HLA-DR에 대하여 음성의 면역학적 특성;
본 발명에 따른 순수 영양막층으로부터 유래된 줄기세포는 하기 방법에 따라 서로 다른 종류의 세포로 분화할 수 있으며, 예를 들어, 지방세포, 연골세포, 골세포, 신경세포, 인대세포 또는 건세포(tenocyte) 등 다양한 종류의 세포로 분화할 수 있고, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 "분화(differentiation)"란, 일반적으로 비교적 단순 한계가 둘 이상의 질적으로 다른 부분계로 분리되는 현상을 의미하는데, 구체적으로 세포가 분열 증식하여 성장하는 동안에 서로 구조나 기능이 특수화하는 현상, 즉 생물의 세포, 조직 등이 각각에게 주어진 일을 수행하기 위하여 형태나 기능이 변해가는 현상을 의미한다. 상대적으로, "미분화"란 상술한 분화가 일어나지 않은, 아직 줄기세포로써의 특징을 함유하고 있는 상태를 의미한다.
줄기세포를 분화시키는 방법은 종래 공지된 방법에 따라 수행될 수 있으며, 특별히 제한되지 않는다. 예를 들어, 상기 줄기세포를 덱사메타손(dexamethasone), 인도메타신(indomethacin), 인슐린 및 IBMX(3-isobutyl-1-methylxanthine)를 포함하는 배지에서 배양하여 지방세포로 분화시키는 방법; 상기 줄기세포를 덱사메타손, BMP-6(bone morphogenetic protein 6), TGF-β(Transforming growth factor beta), 아스코르브 산(ascorbic acid) 및 L-프롤린(L-proline)을 포함하는 배지에서 배양하여 연골세포로 분화시키는 방법; 상기 줄기세포를 덱사메타손, 아스코르브 산, β-글리크로포스페이트(β-glycrophosphate) 및 아스코르브 산-2-포스페이트(ascorbic acid-2-phosphate)를 포함하는 배지에 배양하여 골세포로 분화시키는 방법 등을 사용함이 바람직하다.
상기 방법으로 분화된 순수 영양막층으로부터 유래된 줄기세포의 분화 정도를 측정하는 방법은 특별히 이에 제한되지 않으나, 당해 분야에 공지된 기법인 유세포 분석방법, 면역세포화학적 방법, PCR 또는 유전자-발현 프로파일을 사용하여 세포 표면 표지 또는 형태의 변화를 측정하는 방법, 광학 현미경 또는 공초점 현미경을 사용하여 세포의 형태변화를 조사하는 방법, 유전자 발현 프로파일의 변화를 측정하는 방법 등을 사용할 수 있고, 바람직하게는 RT-PCR, Oil-red O 염색법, Safranin O 염색법, Type II collagen 면역조직화학 염색법, ALP (alkaline phosphate) 염색법 또는 Alizarin red S 염색법 등을 이용할 수 있다.
본 발명에 따른 순수 영양막층(융모막 융모를 제외한 영양막층, chorionic trophoblast layer without villi, CT-V)으로부터 유래된 줄기세포는 종래의 태반 전체로부터 유래된 줄기세포에 비하여 균질한 성장 특성, 우수한 증식 특성 및 분화 특성을 나타내며, 특히, 연골 세포로의 분화능이 우수하다.
따라서 본 발명은 태반의 세부조직인 순수 영양막층(chorionic trophoblast layer without villi, CT-V)으로부터 유래된 줄기세포 또는 상기 줄기세포로부터 분화된 세포를 유효성분으로 포함하는 세포치료제를 제공한다.
상기 분화된 세포는 연골세포, 지방세포, 골세포, 신경세포, 인대세포, 건세포 등을 포함하며, 치료 목적에 맞게 선택될 수 있다.
본 발명의 용어 "세포치료제(cellular therapeutic agent)"란, 인간으로부터 분리, 배양 및 특수한 조작을 통해 제조된 세포 및 조직으로 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품(미국 FDA 규정)으로서, 세포 혹은 조직의 기능을 복원시키기 위하여 살아있는 자가, 동종, 또는 이종세포를 체외에서 증식 선별하거나 다른 방법으로 세포의 생물학적 특성을 변화시키는 등의 일련의 행위를 통하여 이러한 세포가 질병의 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품을 의미한다.
바람직하게는 본 발명의 세포치료제는 연골 손상, 연골 결함, 골 결손, 건-인대 결손, 또는 지방조직 결손 등에 대한 치료용으로 이용될 수 있다.
본 발명에서 “연골 결함”이란 신체 내 포함되는 연골에 손상, 결함(defect) 또는 부족이 있는 경우를 포괄하는 의미로서, 예를 들어 연골외상, 연골파열, 연골연화, 연골괴사, 골연골염, 연골결손 또는 골관절염 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 순수 영양막층으로부터 유래된 줄기세포는 신체의 조직 또는 기관이 목적하는 세포 군집, 예를 들어 줄기세포 또는 분화세포 군집의 생착, 이식 또는 주입에 의해 조정, 강화, 치료 또는 대체되는 다양한 종류의 치료 프로토콜에 사용될 수 있다. 본 발명의 순수 영양막층으로부터 유래된 줄기세포는 존재하는 조직을 대체 또는 강화시켜, 새롭거나 변화된 조직이 되게 하거나 생물학적 조직 또는 구조와 결합시킬 수 있다.
또한, 본 발명의 순수 영양막층으로부터 유래된 줄기세포는 관절 내에 투여함으로써 관절 연골의 병변을 치료하거나, 건 또는 인대 부위에 투여함으로써 치료 혹은 예방 하는 등의 목적으로 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 순수 영양막층으로부터 유래된 줄기세포를 관절이나 건, 또는 인대 부위에 투여함으로써 상기 조직의 손상부위에 대한 회복이나 조정을 도모하거나, 본 발명의 순수 영양막층으로부터 유래된 줄기세포로부터 유래된 연골조직 구성물 등 줄기세포 유래 물질을 이용하여 관절(예를 들어, 무릎관절 등)의 조직을 재구성하거나 재생 등의 방법으로 치료하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 세포치료제의 바람직한 투여량은 개체의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있으며, 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 순수 영양막층으로부터 유래된 줄기세포 또는 상기 줄기세포로부터 분화된 세포를 유효성분으로 포함하는 조직 재생용 조성물을 제공한다.
상기 조직은 특별히 제한되지 않으나, 연골, 지방, 골, 신경, 인대, 건 등의 조직을 포함하며, 바람직하게는 연골이다.
상기 연골은 유리연골(hyaline cartilage), 섬유연골(fibrocartilage) 또는 탄성연골(elastic cartilage)등을 포함하며, 예를 들어, 관절연골(articular Cartilage), 귀 연골, 비연골, 팔꿈치 연골, 반월상연골(meniscus), 무릎연골, 늑연골, 발목연골, 기관연골, 후두연골 또는 척추 연골일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
이하, 하기 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 이들 실시예는 본 발명을 상세히 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.
실시예 1: 태반의 세부조직인 순수 영양막층으로부터 유래된 줄기세포의 수득
태반은 삼성서울병원 임상시험윤리위원회지침서에 따라 삼성서울병원에서 제왕절개한 정상 분만에서 기증에 동의한 산모로부터 수집하였다. 태반 조직은 멸균된 용기에 넣어서 옮겼다. 옮긴 태반 조직으로부터 양막을 벗겨 낸 후, 융모막(CM)과 탈락막(DC) 사이에 위치한 영양막층을 분리하고, 상기 영양막층 중 융모막 융모를 제외한 순수 영양막층(chorionic trophoblast layer without villi, CT-V)을 멸균된 포 W과 메스를 이용하여 조심스럽게 분리하였다. 태반의 단면도를 도 1에 나타내었다.
분리된 순수 영양막층 조직을 PBS를 이용하여 여러 번 세척하여 혈액 및 혈구 세포를 제거한 후에 조직을 최대한 잘게 잘라준 후, 0.2% 콜라게나아제를 첨가한 DMEM 배지를 가하고 37℃에서 교반기를 이용하여 2-3시간 반응시켜, 순수 영양막층으로부터 유래된 세포를 수득하였다.
상기 수득한 순수 영양막층 조직으로부터 유래된 세포를 70 ㎛ 메쉬에 여과하여 분해되지 않은 조직을 제거하고, 우태아 혈청 및 항생제가 첨가된 DMEM 배지를 가한 후 25℃, 1000 rpm에서 4분간 원심분리하였다. 상층액을 제거하고 남은 침전된 세포에 성장인자를 포함하지 않고, 우태아 혈청 및 항생제가 첨가된 DMEM 배지를 가하고, 37℃, 5% CO2 조건하에서 배양하였다. 상기 배양물에서 배양 용기의 바닥에 부착된 세포를 선별하여 순수 영양막층으로부터 유래된 줄기세포를 수득하였다.
비교예 1: 태반 전체로부터 유래된 줄기세포의 수득
전체 태반 조직을 세절하고, PBS로 세척하여 태반 조직으로부터 혈액 및 혈구세포를 제거하였다. 상기 세척된 태반 조직에 0.2% 콜라게나아제를 첨가한 DMEM 배지를 가하고 37℃에서 교반기를 이용하여 반응시켜 태반 세포를 수득하였다. 상기 수득한 태반 세포를 70 ㎛ 메쉬에 여과하여 분해되지 않은 조직을 제거하고, 우태아 혈청 및 항생제가 첨가된 DMEM 배지를 가한 후 25℃, 1000 rpm에서 4분간 원심 분리하였다. 상층액을 제거하고 남은 침전된 세포에 성장인자를 포함하지 않고, 우태아 혈청 및 항생제가 첨가된 DMEM 배지를 가하고, 37℃, 5% CO2 조건하에서 배양하였다. 상기 배양물에서 배양 용기의 바닥에 부착된 세포를 선별하여 태반 전체(Whole placenta, Pla) 유래 줄기세포를 수득하였다.
실시예 2: 태반의 세부조직인 순수 영양막층으로부터 유래된 줄기세포의 계대배양
상기 실시예 1에서 수득한 태반의 세부조직인 순수 영양막층으로부터 유래된 줄기세포를 PBS로 세척한 후, 성장인자를 포함하지 않고, 우태아 혈청 및 항생제가 첨가된 DMEM 배지를 2~3일마다 교체하면서 배양하였다. 상기 줄기세포가 80% 이상 성장한 시점에서 트리플(TryPLE)을 처리하여 줄기세포를 배양 용기에서 분리하고, 분리된 줄기세포를 1/4의 비율로 희석한 다음, 다른 배양 용기에서 배양하는 방법으로 계대 배양을 수행하였다. 상기와 같은 계대 배양을 반복적으로 수행하면서, 더 이상 계대 배양 되지 않는 계대수(passage number)를 측정하였으며, 계대 배양하기 이전(P0)과 장기간 동안 계대 배양한 이후의 세포 형태를 현미경으로 관찰하였다. 또한, 상기 비교예 1에서 수득한 태반 전체(Whole placenta, Pla) 유래 줄기세포를 이용하여, 동일한 방법으로 계대 배양을 수행한 후, 계대 배양하기 이전(P0)과 장기간 동안 계대 배양한 이후의 세포 형태를 현미경으로 관찰하였다. 이를 각각 도 2 및 도 3에 나타내었다.
도 2에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 순수 영양막층(CT-V) 유래 줄기세포는 섬유아세포 모양의 형태학적 특징을 나타내고, 계대수가 28에 이르기까지 우수한 증식능을 가지고 있어, 장기간 배양이 가능함을 확인하였다.
또한, 도 3에 나타낸 바와 같이, 태반 전체(Whole placenta, Pla) 유래 줄기세포는 계대 배양 초기부터 섬유아세포 모양의 형태적 특성을 나타내고, 하나의 형태가 아니라 다수의 서로 다른 형태의 세포가 혼합되어 있음을 확인할 수 있었다. 즉, 본 발명에 따른 순수 영양막층(CT-V) 유래 줄기세포 (도 2)와 비교하면, 계대 배양 전후로 순수 영양막층(CT-V) 으로부터 유래된 줄기세포는 단일의 세포만을 특이적으로 유지하였으나, 태반 전체로부터 유래된 줄기세포는 서로 다른 형태의 세포가 혼합되어 있었다.
실시예 3: 태반의 세부조직인 순수 영양막층으로부터 유래된 줄기세포의 집락형성능 분석
상기 실시예 1에서 수득한 태반의 세부조직인 순수 영양막층으로부터 유래된 줄기세포의 집락형성능을 확인하였다. 보다 구체적으로, 상기 실시예 1에서 수득한 순수 영양막층으로부터 유래된 줄기세포를 상기 실시예 2의 방법으로 첫 번째 계대 배양을 수행하고, 상기 계대 배양이 종료되는 시점에서 100 ㎜ 디쉬에 5 X 103개씩 접종(seeding)한 후, 10일 동안 성장인자를 포함하지 않고 우태아 혈청 및 항생제가 첨가된 DMEM 배지에서 배양하였다. 상기 배양된 줄기세포를 대상으로 김자 염색법(Giemsa stain)을 실시하여 줄기세포에서 몇 개의 집락이 형성되는지를 계수하고, 이들의 평균값을 산출하였다. 또한, 상기 비교예 1에서 수득한 태반 전체 유래 줄기세포를 이용하여, 동일한 방법으로 집락형성능을 측정하였으며, 이의 결과값을 100%로 하여 환산하였다. 그 결과를 도 4에 나타내었다.
도 4에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 순수 영양막층(CT-V) 유래 줄기세포는 태반 전체 유래 줄기세포보다 집락 형성능이 우수함을 확인하였다.
실시예 4: 태반의 세부조직인 순수 영양막층으로부터 유래된 줄기세포의 집단 배가시간 분석
상기 실시예 1에서 수득한 태반의 세부조직인 순수 영양막층으로부터 유래된 줄기세포의 집단 배가 시간을 측정하였다. 보다 구체적으로, 상기 실시예 1에서 수득한 순수 영양막층으로부터 유래된 줄기세포를 상기 실시예 2의 방법으로 첫 번째 계대 배양을 수행하고, 2-3일 간격으로 세포를 수득 및 계대배양을 반복하였다. 세포의 수득 시에는 증가된 세포의 수를 확인 하였으며, 계대 시에는 3X105개의 세포를 100 ㎜ 디쉬에 배양을 하였다. 계대 과정 중에 더 이상 세포의 수가 증가하지 않는 시점을 최종적으로 증가가 안되는 시점으로 정하였다. 배가 시간은 P2에서 P6까지 계대배양 된 세포 수로 측정하였으며, 하기와 같이 계산하였다. 또한, 상기 비교예 1에서 수득한 태반 전체 유래 줄기세포를 이용하여, 동일한 방법으로 집단 배가 시간을 계산하였다. 그 결과를 도 5에 나타내었다.
배가 시간 = 배양된 시간/배가
배가 = log( N초기 세포수/N 증가된 세포수 )/log2
도 5에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 순수 영양막층(CT-V) 유래 줄기세포는 태반 전체 유래 줄기세포보다 집단 배가 시간(population doubling time)이 짧아 세포 증식이 빠름을 확인하였다.
실시예 5: 태반의 세부조직인 순수 영양막층으로부터 유래된 줄기세포의 표면 마커 분석
상기 실시예 1에서 수득한 태반의 세부조직인 순수 영양막층으로부터 유래된 줄기세포의 면역학적 특성을 확인하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다. 먼저, 순수 영양막층으로부터 유래된 줄기세포를 PBS로 세척하고, 트리플 처리한 뒤 줄기세포를 수거하여 1000 rpm에서 4분 동안 원심 분리하였다. 상층액을 제거한 후 비특이적 결합을 억제하기 위해 2% FBS 및 PBS의 혼합액을 넣어서 줄기세포를 세척한 후, 1000 rpm에서 5분 동안 원심 분리하였다. 상층액을 제거한 후 줄기세포를 PBS에 부유시켜 1 ×105 cell씩 플로우사이토미터 전용 둥근 플라스크에 분주하였다. 여기에 항체(PE-conjugated mouse anti-human monoclonal antibody)를 넣고, 얼음에서 30분 동안 인큐베이션 한 후, 1000rpm에서 5분 동안 원심 분리하였다. 다시 상층액을 제거한 뒤 PBS로 세척하고 1000rpm에서 5분 동안 원심 분리하였다. 상기 과정을 2회 반복하였다. 마지막으로 상층액을 제거한 후 줄기세포를 싱글화하고, 플로우사이토미터(FACS)를 이용해 면역학적 특성을 분석하였다. 또한, 동일한 방법으로 상기 비교예 1에서 수득한 태반 전체 유래 줄기세포의 면역학적 특성을 분석하였다. 그 결과를 표 1 및 도 6에 나타내었다.
표 1
Figure PCTKR2015000204-appb-T000001
표 1 및 도 6에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 순수 영양막층(CT-V) 유래 줄기세포는 CD44, CD73, CD90 및 CD105에 대하여 양성의 표지인자 발현 특성을 나타내고, CD31, CD34, CD45 및 HLA-DR에 대하여 음성의 표지인자 발현 특성을 나타냄을 확인하였다.
실시예 6: 태반의 세부조직인 순수 영양막층으로부터 유래된 줄기세포의 연골세포로의 분화능 확인
상기 실시예 1에서 수득한 태반의 세부조직인 순수 영양막층으로부터 유래된 줄기세포의 연골세포로의 분화능을 확인하기 위하여, 줄기세포를 공지된 연골세포 분화 유도 배지(0.1μM 덱사메타손, 50 ㎍/㎖ 아스코르브산, 40 ㎍/㎖ L-프롤린, 10 ng/㎖ TGF-β3, 500 ng/㎖ BMP-6, 50 mg/ml ITS premix가 포함된 DMEM 배지)에서 3주 동안 배양하여 연골세포로의 분화를 유도하였다. 상기 줄기세포의 연골세포로의 분화 정도를 측정하기 위하여, 종래 공지된 방법에 따라 Safranin-O 염색 및 Type II collagen을 이용한 면역화학염색법을 수행하였다. 또한, 동일한 방법으로 상기 비교예 1에서 수득한 태반 전체 유래 줄기세포의 연골세포로의 분화능을 측정하였다. 그 결과를 도 7 내지 도 9에 나타내었다.
도 7 내지 도 9에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 순수 영양막층(CT-V) 유래 줄기세포는 태반 전체 유래 줄기세포보다 균일하게 연골세포로 분화될 수 있는 우수한 연골세포 분화능을 가지고 있음을 확인하였다.
특히, 종래 공지된 방법에 따라 순수 영양막층으로부터 유래된 줄기세포와 태반 전체 유래 줄기세포의 골세포, 연골세포, 또는 지방세포로의 분화능을 비교 분석한 결과, 순수 영양막층으로부터 유래된 줄기세포는 지방세포나 골세포로의 분화 정도는 태반 전체 유래 줄기세포와 유사하나 연골세포로의 분화능이 특히 우수하였다(도 10).
이를 통하여 태반 전체 유래 줄기세포는 다양한 조직으로부터 유래된 서로 다른 분화 패턴을 가지는 줄기세포가 혼재하여 있어, 목적하는 세포 치료 효과를 내는데 다소 부족함이 있으나, 본 발명에 따른 순수 영양막층으로부터 유래된 줄기세포를 이용할 경우, 균질한 특성을 가진 세포만을 이용할 수 있으며, 연골 세포로의 분화능이 우수하며 연골 손상이나 연골 재생이 필요한 질환의 세포치료제로 적용할 경우 우수한 효과를 나타냄을 확인하였다.

Claims (13)

  1. 태반의 세부조직인 순수 영양막층(chorionic trophoblast layer without villi, CT-V)으로부터 유래된 줄기세포.
  2. 제1항에 있어서, 상기 줄기세포는 CD44, CD73, CD90 및 CD105에 대하여 양성의 표면인자 발현 특성을 갖는 것을 특징으로 하는, 줄기세포.
  3. 제1항에 있어서, 상기 줄기세포는 CD31, CD34, CD45 및 HLA-DR에 대하여 음성의 표면인자 발현 특성을 갖는 것을 특징으로 하는, 줄기세포.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 순수 영양막층으로부터 유래된 줄기세포는 융모막과 탈락막 사이에 위치한 영양막층 중 융모막 융모를 제외한 조직으로부터 유래된 것을 특징으로 하는, 줄기세포.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 줄기세포는
    (a) 태반으로부터 세부조직인 순수 영양막층(chorionic trophoblast layer without villi; CT-V)을 분리하는 단계;
    (b) 상기 분리된 순수 영양막층 조직에 트립신(Trypsin), 콜라게나아제(collagenase), 디스파아제(dispase), DNase, RNase, 프로테아제(protease), 리파아제(lipase), 히알루로니다아제(hyaluronidase) 및 엘라스타제 (elastase)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 효소를 처리하여, 순수 영양막층 유래의 세포를 수득하는 단계; 및
    (c) 상기 수득한 순수 영양막층 유래의 세포로부터 줄기세포를 선별하는 단계를 통해 제조된 것을 특징으로 하는, 줄기세포.
  6. 태반의 세부조직인 순수 영양막층(chorionic trophoblast layer without villi, CT-V)으로부터 유래된 줄기세포 또는 상기 줄기세포로부터 분화된 세포를 유효성분으로 포함하는 세포치료제.
  7. 제6항에 있어서, 상기 줄기세포로부터 분화된 세포는 연골세포, 지방세포, 골세포, 신경세포, 인대세포 및 건세포로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 세포치료제.
  8. 제6항 또는 제7항에 있어서, 상기 세포치료제는 연골 손상, 연골 결함, 골 결손, 건-인대 결손, 또는 지방조직 결손의 치료용인 것을 특징으로 하는, 세포치료제.
  9. 제8항에 있어서, 상기 연골 결함은 연골외상, 연골파열, 연골연화, 연골괴사, 골연골염, 연골결손 및 골관절염으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 세포치료제.
  10. 태반의 세부조직인 순수 영양막층(chorionic trophoblast layer without villi, CT-V)으로부터 유래된 줄기세포 또는 상기 줄기세포로부터 분화된 세포를 유효성분으로 포함하는 조직 재생용 조성물.
  11. 제10항에 있어서, 상기 조직은 연골, 지방, 골, 신경, 인대 및 건으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 조성물.
  12. 제11항에 있어서, 상기 연골은 유리연골(hyaline cartilage), 섬유연골(fibrocartilage) 또는 탄성연골(elastic cartilage)인 것을 특징으로 하는, 조성물.
  13. 제11항에 있어서, 상기 연골은 관절연골(articular Cartilage), 귀 연골, 비연골, 팔꿈치 연골, 반월상연골(meniscus), 무릎연골, 늑연골, 발목연골, 기관연골, 후두연골 및 척추 연골로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 조성물.
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