WO2015111700A1 - 希少脂肪酸を含む代謝改善剤 - Google Patents

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重信 岸野
照雄 河田
高橋　信之
後藤　剛
靖記 米島
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Kyoto University NUC
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Nitto Pharmaceutical Industries Ltd
Kyoto University NUC
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Definitions

  • the present invention relates to a metabolism improving agent containing a rare fatty acid. More specifically, the present invention relates to a metabolism improving agent utilizing physiological functions of rare fatty acids such as oxo fatty acid and hydroxylated fatty acid, for example, lipid, sugar and energy metabolism improving action.
  • the present invention also relates to foods, pharmaceuticals, feeds and the like containing the agent.
  • Metabolic syndrome refers to a state in which two or more of hyperglycemia, hypertension, and dyslipidemia are caused by visceral fat obesity and arteriosclerosis is easily caused. It is estimated that 40 to 74-year-old Japanese, one in two for men and one in five for women, are metabolic syndrome and their reserves. Therefore, the importance of optimizing calorie intake through diet therapy has been proposed for the purpose of preventing and eliminating the progress of lipid accumulation in the metabolic syndrome.
  • Non-patent Document 1 Conjugated fatty acids such as conjugated linoleic acid (Non-patent Document 1), ⁇ 3 polyunsaturated fatty acids such as eicosapentaenoic acid and docosahexaenoic acid, which have been reported to have lipid metabolism improving action, diabetes improving action, etc. in the diet ( There is a great interest in ingesting functional lipids including Patent Document 1), medium chain fatty acids (Patent Document 2) and the like.
  • oxo fatty acids such as 9-oxo-octadecadienoic acid and 13-oxo-octadecadienoic acid contained in tomato have been reported to have activities to improve lifestyle-related diseases such as lipid metabolism improvement. For this reason (Patent Document 3, Non-Patent Documents 2 and 3), attention has been focused on the physiological functions of rare fatty acids such as oxo fatty acids and hydroxylated fatty acids.
  • An object of the present invention is to provide a novel metabolism-improving agent that improves the metabolism of lipids and / or sugars including rare fatty acids.
  • a hydroxylated fatty acid such as 13-hydroxy-cis-9-octadecenoic acid or an oxo fatty acid such as 13-oxo-cis-9-octadecene. It has been found that acid has a peroxisome proliferator-activated receptor (hereinafter also referred to as “PPAR”) activating action, which is a physiological function not conventionally known.
  • PPAR peroxisome proliferator-activated receptor
  • the present invention is as follows: [1] Metabolism improving agent containing the following fatty acids: (1) a C18 fatty acid having a hydroxyl group or a carbonyl group at the 13-position, (2) a C20 fatty acid having a hydroxyl group or a carbonyl group at the 15-position, (3) a C20 fatty acid having a hydroxyl group or a carbonyl group at the 12-position, or (4) a C16 fatty acid having a hydroxyl group or a carbonyl group at the 10-position; [2] The agent according to [1], comprising the following fatty acids: (1) C18 saturated fatty acid having a hydroxyl group or a carbonyl group at position 13, or an unsaturated fatty acid having at least one cis-type double bond at positions 6, 9, and 15.
  • hydroxylated fatty acids or oxo fatty acids such as 13-hydroxy-cis-9-octadecenoic acid or 13-oxo-cis-9-octadecenoic acid are conventionally known. It was found to have PPAR activation which is a physiological function that did not exist. Based on this function, the present invention provides a metabolism improving agent containing rare fatty acids such as the above-mentioned hydroxylated fatty acids. Since the agent can be used in various fields such as pharmaceuticals, foods, and feeds, the present invention is extremely useful industrially.
  • the structural formulas of hydroxylated fatty acid and oxo fatty acid for which PPAR ⁇ / ⁇ agonist activity was measured are shown.
  • the result of the PPAR (alpha) agonist activity of a hydroxylated fatty acid and an oxo fatty acid is shown.
  • EtOH represents a negative control (ethanol added)
  • GW7647 represents a positive control (PPAR ⁇ agonist added).
  • the vertical axis shows relative luciferase activity.
  • the result of the PPAR ⁇ agonist activity of hydroxylated fatty acid and oxo fatty acid is shown.
  • EtOH represents a negative control (ethanol added)
  • Tro represents a positive control (PPAR ⁇ agonist added).
  • the vertical axis shows relative luciferase activity.
  • lipid metabolism improvement means that lipid and / or sugar and / or energy metabolism is improved.
  • lipid metabolism improvement refers to promoting the degradation of lipids present in body tissues, blood, or lymphoid tissues, suppressing lipid synthesis, and accumulation of lipids in body tissues such as adipose tissues. This refers to preventing and / or suppressing the action, or reducing lipid accumulated in body tissues and the like.
  • Lipid refers to triglycerides and / or cholesterol and includes fatty acids.
  • the improvement in glucose metabolism refers to suppressing an increase in sugar and / or glycated hemoglobin (HbA1c) present in blood, reducing a fasting blood glucose level, or promoting glucose metabolism after a meal. Furthermore, the improvement of glucose metabolism includes the improvement of abnormal glucose tolerance (a pathological condition that is not included in both normal and diabetic types and can be regarded as a diabetic reserve army). “Sugar” refers to a monosaccharide, disaccharide or polysaccharide. Improvement of energy metabolism means that a state in which the balance between the intake energy amount and the released energy amount is abnormal or cannot be adjusted normally is brought to a normal state or brought close to it.
  • ⁇ PPAR activity can be measured as an index of the metabolic improvement. It is known that there are at least three types of subtypes PPAR ⁇ , PPAR ⁇ (identical to ⁇ ), and PPAR ⁇ in PPAR. PPAR ⁇ is expressed mainly in the liver, heart, kidney, skeletal muscle, brown adipocytes, and is involved in the regulation of many genes involved in fatty acid ⁇ -oxidation. PPAR ⁇ is expressed relatively in the whole body (brain, adipose tissue, skin, etc.). PPAR ⁇ has at least three types of isoforms, which are mainly expressed in white adipocytes and macrophages and are involved in adipocyte differentiation.
  • PPARs if at least one or more PPARs are checked for the presence or absence of ligand (agonist, antagonist) activity, and exhibiting agonist activity, there is a high possibility of having a metabolic improvement effect, or having a metabolic improvement effect to decide.
  • the PPAR reporter assay described in FEBS Letters 514 (2002) p.315-322 can be performed, but the method is not limited thereto.
  • the rare fatty acid of the present invention is administered to an obese / diabetic model animal, and body weight, organ weight, blood glucose level, triglyceride level, oxygen consumption, rectal temperature, etc. are measured, and the change Can be confirmed.
  • the obesity / diabetes model animal is not limited as long as it is an animal exhibiting the property. Examples of the model animal include commercially available KKAy mice, NOD mice, NSY mice, TSOD mice, ZDF / Crl-Leprfa rats, SDT / Jcl rats, and the like. Body weight, organ weight, blood glucose level, neutral fat level, oxygen consumption, rectal temperature and the like can be measured by known methods.
  • the lipid synthesis promoting action induced by the LXR agonist is suppressed by the addition of the rare fatty acid of the present invention.
  • the method can be performed with reference to, for example, Journal of Lipid Research 47, (2006) 2712-2717, but is not limited to this method.
  • an LXR agonist is added, and a lipid synthesis-related factor, for example, (1) SREBP-1c, mature and immature SREBP-1, SCD-1, FAS, ACC1, and / or
  • the expression level of ACC2 mRNA and / or protein can be measured, (2) the amount of intracellular triacylglycerol can be measured, or (3) a luciferase assay can be performed.
  • LXR agonists include, but are not limited to, T0901317, 22 (R) -hydroxycholesterol, 24 (S) -hydroxycholesterol and the like.
  • the C18 fatty acid having a hydroxyl group or a carbonyl group at the 13-position refers to an 18-hydroxylated fatty acid having a hydroxyl group at the 13-position (hereinafter sometimes abbreviated as "13-hydroxy fatty acid”).
  • an oxo fatty acid having 18 carbon atoms having a carbonyl group at the 13-position hereinafter sometimes abbreviated as “13-oxo fatty acid”.
  • a C18 fatty acid having a hydroxyl group or a carbonyl group at the 10th and 13th positions (hereinafter sometimes abbreviated as “10,13-dihydroxy fatty acid” or “10,13-dioxo fatty acid”), or
  • An 18-carbon fatty acid having a hydroxyl group at position 13 and a carbonyl group at position 10 (hereinafter sometimes abbreviated as “10-oxo-13-hydroxy fatty acid”) is also referred to as “13-hydroxy fatty acid” or “13-oxo It is included as an embodiment of “fatty acid”.
  • the C18 fatty acid having a hydroxyl group or a carbonyl group at the 13-position may be a saturated fatty acid or an unsaturated fatty acid.
  • an unsaturated fatty acid an unsaturated fatty acid having at least one cis-type double bond at the 6th, 9th and 15th positions is preferable.
  • the C 20 fatty acid having a hydroxyl group or a carbonyl group at the 15-position is sometimes abbreviated as “15-hydroxy fatty acid” having 20 hydroxyl groups having a hydroxyl group at the 15-position.
  • an oxo fatty acid having 20 carbon atoms having a carbonyl group at the 15-position (hereinafter sometimes abbreviated as “15-oxo fatty acid”).
  • the C 20 fatty acid having a hydroxyl group or a carbonyl group at the 15-position may be a saturated fatty acid or an unsaturated fatty acid.
  • an unsaturated fatty acid an unsaturated fatty acid having at least one cis-type double bond at the 5-position, 8-position, 11-position, and 17-position is preferable.
  • the 20-carbon fatty acid having a hydroxyl group or a carbonyl group at the 12-position is sometimes abbreviated as a 20-carbon hydroxylated fatty acid having a hydroxyl group at the 12-position (hereinafter referred to as “12-hydroxy fatty acid”).
  • an oxo fatty acid having 20 carbon atoms having a carbonyl group at the 12-position hereinafter sometimes abbreviated as “12-oxo fatty acid”.
  • the C 20 fatty acid having a hydroxyl group or a carbonyl group at the 12-position may be a saturated fatty acid or an unsaturated fatty acid.
  • an unsaturated fatty acid having at least one cis-type double bond at the 5-position, 8-position, 14-position and 17-position is preferred.
  • a fatty acid having 16 or 16 carbon atoms having a hydroxyl group or a carbonyl group may be abbreviated as a 16-hydroxy fatty acid having 16 hydroxyl groups (hereinafter referred to as “10-hydroxy fatty acid”).
  • a 16-carbon oxo fatty acid having a carbonyl group at the 10-position hereinafter sometimes abbreviated as “10-oxo fatty acid”.
  • the C 16 fatty acid having a hydroxyl group or a carbonyl group at the 10-position may be a saturated fatty acid or an unsaturated fatty acid. More specifically, the saturated fatty acid having 18 carbon atoms having a hydroxyl group or a carbonyl group at the 13-position or an unsaturated fatty acid having at least one cis-type double bond at the 6-position, 9-position, and 15-position is not particularly limited.
  • the unsaturated fatty acid having at least one cis-type double bond at the 5-position, 8-position, 11-position, and 17-position having 20 hydroxyl groups or carbonyl groups at the 15-position is not particularly limited. Hydroxy-cis-11-eicosenoic acid, 15-hydroxy-cis-11, cis-17-eicosadienoic acid, 15-hydroxy-cis-8, cis-11-eicosadienoic acid, 15-hydroxy-cis-5, cis-8 Cis-11-eicosatrienoic acid, 15-hydroxy-cis-8, cis-11, cis-17-eicosatrienoic acid, 15-hydroxy-cis-5, cis-11-eicosadienoic acid, 15-hydroxy- Cis-5, cis-11, cis-17-eicosatrienoic acid, 15-oxo-cis-11-eicosenoic acid, 15-oxo-cis-11, cis-17-eicosa
  • saturated fatty acid having 20 carbon atoms having a hydroxyl group or a carbonyl group at the 12th position or an unsaturated fatty acid having at least one cis type double bond at the 5th, 8th, 14th and 17th positions is not particularly limited.
  • the saturated fatty acid having 16 or 16 carbon atoms having a hydroxyl group or a carbonyl group is not particularly limited, and examples thereof include 10-hydroxy-hexadecanoic acid and 10-oxo-hexadecanoic acid.
  • Rare fatty acids such as oxo fatty acids or hydroxylated fatty acids used in the present invention are produced from unsaturated fatty acids having 16, 18, and 20 carbon atoms into hydroxylated fatty acids by a novel fatty acid hydrase (FA-HY),
  • An oxo fatty acid can be produced by oxidating a hydroxyl group of a hydroxylated fatty acid by an enzymatic reaction or a chemical reaction. Specifically, it can be prepared by the following method.
  • the novel fatty acid hydrating enzyme ⁇ FA-HY '' (A) an enzyme protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, (B) In the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 includes an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted and / or substituted and / or inserted and / or added.
  • amino acid sequence in which the amino acid is replaced with another amino acid or (v) a protein comprising an amino acid sequence combining them And the like.
  • amino acids of similar properties for example, glycine and alanine, valine and leucine and isoleucine, serine and threonine, aspartic acid and glutamic acid, asparagine and glutamine, lysine and arginine, cysteine and methionine, phenylalanine and tyrosine, etc.
  • amino acids of similar properties for example, glycine and alanine, valine and leucine and isoleucine, serine and threonine, aspartic acid and glutamic acid, asparagine and glutamine, lysine and arginine, cysteine and methionine, phenylalanine and tyrosine, etc.
  • substitutions for example, there can be a greater number of substitutions.
  • stringent conditions means that nucleotide sequences having high identity, for example, nucleotide sequences having 70, 80, 90, 95, or 99% identity or more hybridize to each other and are identical to each other.
  • washing conditions for normal Southern hybridization 60 ° C., 1 ⁇ SSC, 0.1% SDS, preferably 0.1 ⁇ SSC, 0.1% SDS, more preferably 68 Examples include conditions of washing once, more preferably 2 to 3 times at a salt concentration and temperature corresponding to 0 ° C., 0.1 ⁇ SSC, and 0.1% SDS.
  • the enzymatic activity of the enzyme protein comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 includes (1) an unsaturated fatty acid having 18 carbon atoms having a cis-type double bond at position 12 (
  • enzyme activity reaction
  • C18 hydroxylated fatty acid 13-hydroxy fatty acid
  • hydroxyl group at the 13th position using “cis-12 unsaturated fatty acid” as a substrate.
  • cis-12 unsaturated fatty acid “cis-9 unsaturated fatty acid”, “cis-14 unsaturated fatty acid”, “cis-11 unsaturated fatty acid” are respectively cis-type double bonds at the 12th position.
  • C18 unsaturated fatty acid having a cis-type double bond at the 9th position C20 unsaturated fatty acid having a cis-type double bond at the 14th position, and cis at the 11th position.
  • fatty acid includes not only free acids but also esters and salts with basic compounds.
  • DHA and “myristoleic acid” include not only free acids but also esters and salts with basic compounds.
  • the FA-HY can be isolated from, for example, Lactobacillus acidophilus cells or culture solution by a known protein separation and purification technique.
  • FA-HY may be used as a bacterial body of Lactobacillus acidophilus containing FA-HY itself or a disrupted body thereof.
  • Lactobacillus acidophilus cells containing FA-HY are not particularly limited as long as they contain FA-HY.
  • NPMD National Institute for Product Evaluation Technology
  • 2014 NITE BP-01788 deposited on the 17th of May.
  • a gene encoding FA-HY can be isolated, subcloned into an appropriate vector, introduced into an appropriate host such as Escherichia coli and cultured, and then produced as a recombinant protein.
  • FA-HY may be purified or roughly purified. Alternatively, it may be expressed in bacterial cells such as Escherichia coli, and the bacterial cells themselves may be used, or a culture solution may be used.
  • the enzyme may be free or immobilized by various carriers.
  • the vector containing the nucleic acid encoding FA-HY can be appropriately selected and used for a host cell into which the vector is introduced according to the purpose (for example, protein expression).
  • an expression vector it contains the nucleic acid of the present invention operably linked to a suitable promoter, and preferably contains a transcription termination signal, that is, a terminator region downstream of the nucleic acid of the present invention.
  • a selection marker gene drug resistance gene, gene complementing an auxotrophic mutation, etc.
  • the vector may be one that is integrated into the genome of the target host cell.
  • the vector of the present invention can be introduced into a target host cell by a transformation method known per se, such as a competent cell method, a protoplast method, a calcium phosphate coprecipitation method or the like.
  • the “host cell” may be any cell as long as it can express a vector containing the nucleic acid encoding the FA-HY, and examples thereof include bacteria, yeast, fungi, and higher eukaryotic cells. Examples of bacteria include gram positive bacteria such as Bacillus or Streptomyces or gram negative bacteria such as E. coli. Recombinant cells into which a vector containing a nucleic acid encoding FA-HY has been introduced can be cultured by a method known per se suitable for host cells.
  • the above-mentioned “purification” of FA-HY is a method known per se, for example, after microbial cells collected by centrifugation or the like are ground with ultrasonic waves or glass beads, and then solidified such as cell debris by centrifugation or the like.
  • a salting-out method with ammonium sulfate, sodium sulfate, etc. ion-exchange chromatography, gel filtration chromatography, chromatographic methods such as affinity chromatography, gel electrophoresis, etc. be able to.
  • the FA-HY uses cis-12 unsaturated fatty acid, cis-9 unsaturated fatty acid, cis-14 unsaturated fatty acid, cis-11 unsaturated fatty acid, DHA, myristoleic acid as a substrate, 13-hydroxy fatty acid, 10-hydroxy fatty acid, 15-hydroxy fatty acid, 12-hydroxy fatty acid, 14-hydroxy-cis-4, cis-7, cis-10, cis-16, cis-19-docosapentaenoic acid, 10 -Enzyme activity that can be converted into hydroxy-tetradecanoic acid, respectively.
  • a method for producing 13-hydroxy fatty acid from cis-12 unsaturated fatty acid by the hydration reaction using FA-HY (Production method 1), [2] From cis-9 unsaturated fatty acid, Method of producing 10-hydroxy fatty acid by hydration reaction using FA-HY (Production method 2), [3] From cis-14 unsaturated fatty acid, hydration reaction using FA-HY, Method for producing 15-hydroxy fatty acid (Production method 3), [4] Method for producing 12-hydroxy fatty acid from cis-11 unsaturated fatty acid by hydration reaction using FA-HY (Production method 4), [A] 14-hydroxy-cis-4, cis-7, cis-10, cis-16, cis-19-docosapentaenoic acid is produced from DHA by the hydration reaction using FA-HY.
  • Production Method A and [I] A method (Production Method I) for producing 10-hydroxy-tetradecanoic acid from myristoleic acid by hydration using the FA-HY of the present invention is proposed.
  • Examples of the “cis-12 unsaturated fatty acid” in Production Method 1 include, for example, cis-9, cis-12-octadecadienoic acid (linoleic acid), cis-6, cis-9, cis-12-octadecatriene.
  • the substrate may be obtained by a method other than WO2013 / 168310.
  • the “13-hydroxy fatty acid” produced by the production method 1, for example, 13-hydroxy-cis-9-octadecenoic acid derived from cis-9, cis-12-octadecadienoic acid (linoleic acid), 13-hydroxy-cis-6, cis-9-octadecadienoic acid, cis-9, cis-12 derived from cis-6, cis-9, cis-12-octadecatrienoic acid ( ⁇ -linolenic acid) 13-hydroxy-cis-9, cis-15-octadecadienoic acid, cis-6, cis-9, cis-12, cis-, derived from cis-15-octadecatrienoic acid ( ⁇ -linolenic acid) Derived from 13-hydroxy-cis-6, cis-9, cis-15
  • Examples of the “cis-9 unsaturated fatty acid” in Production Method 2 include cis-9-hexadecenoic acid (palmitoleic acid).
  • Examples of the “10-hydroxy fatty acid” produced by the above production method 2 include 10-hydroxy-hexadecanoic acid derived from cis-9-hexadecenoic acid (palmitoleic acid).
  • Examples of the “cis-14 unsaturated fatty acid” in the production method 3 include, for example, cis-11, cis-14-eicosadienoic acid, cis-11, cis-14, cis-17-eicosatrienoic acid, cis-8, Cis-11, cis-14-eicosatrienoic acid (dihomo- ⁇ -linolenic acid), cis-5, cis-8, cis-11, cis-14-eicosatetraenoic acid (arachidonic acid), cis-8 Cis-11, cis-14, cis-17-eicosatetraenoic acid, cis-5, cis-11, cis-14-eicosatrienoic acid, cis-5, cis-11, cis- 14, cis-17-eicosatetraenoic acid (juniperonic acid) and the like.
  • Examples of the “15-hydroxy fatty acid” produced by the above-mentioned production method 3 include, for example, 15-hydroxy-cis-11-eicosenoic acid, cis-11, cis-derived from cis-11, cis-14-eicosadienoic acid.
  • Examples of the “cis-11 unsaturated fatty acid” in the production method 4 include, for example, cis-11, cis-14-eicosadienoic acid, cis-11, cis-14, cis-17-eicosatrienoic acid, cis-8, Cis-11, cis-14-eicosatrienoic acid (dihomo- ⁇ -linolenic acid), cis-5, cis-8, cis-11-eicosatrienoic acid (mead acid), cis-8, cis-11, Examples thereof include cis-14, cis-17-eicosatetraenoic acid, cis-5, cis-8, cis-11, cis-14-eicosatetraenoic acid (arachidonic acid).
  • Examples of the “12-hydroxy fatty acid” produced by the production method 4 include, for example, 12-hydroxy-cis-14-eicosenoic acid, cis-11, cis-derived from cis-11, cis-14-eicosadienoic acid.
  • an unsaturated fatty acid as a substrate and the above-mentioned FA-HY are mixed at an appropriate concentration in an appropriate buffer (eg, phosphate buffer, Tris buffer, borate buffer, etc.). Can be performed by incubating.
  • the substrate concentration is, for example, 1 to 1000 g / L, preferably 10 to 500 g / L, more preferably 20 to 250 g / L.
  • the amount of FA-HY added is, for example, 0.001 to 10 mg / m L, preferably 0.1 to 5 mg / m L, more preferably 0.2 to 2 mg / m L.
  • a “cofactor” may be used for the hydration reaction (reactions 1 to 4, reaction A or reaction I).
  • FAD or the like can be used.
  • the addition concentration may be a concentration at which the hydration reaction proceeds efficiently. The amount is preferably 0.001 to 20 mM, more preferably 0.01 to 10 mM.
  • an “activator” may be used for the hydration reaction, and examples thereof include 1 or 2 compounds selected from the group consisting of NADH and NADPH.
  • the addition concentration may be a concentration at which the hydration reaction proceeds efficiently. Preferably it is 0.1 to 20 mM, more preferably 1 to 10 mM.
  • the hydration reaction is desirably carried out within the above-mentioned preferred temperature range and preferred pH range of FA-HY.
  • the reaction temperature is 5 to 50 ° C., preferably 20 to 45 ° C.
  • the pH of the reaction solution is, for example, pH 4 to 10, preferably pH 5 to 9.
  • the reaction time is not particularly limited, but is, for example, 10 minutes to 72 hours, preferably 30 minutes to 36 hours.
  • the FA-HY is a recombinant cell (for example, E. coli, Bacillus subtilis, yeast, insect cell, animal cell, etc.) into which an expression vector containing a nucleic acid encoding it is introduced.
  • the reaction system Provided to the reaction system.
  • the hydration reaction can also be performed by culturing the cells by adding a substrate and, if necessary, a cofactor or an activator to a liquid medium suitable for culturing the cells.
  • the oxo fatty acid having 18 carbon atoms having a carbonyl group at the 13-position from the 13-hydroxy fatty acid obtained by the above production methods 1 to 4, production method A and production method I.
  • 13-oxo fatty acid 16-carbon oxo fatty acid having a carbonyl group at the 10-position from 10-hydroxy fatty acid (hereinafter abbreviated as “10-oxo fatty acid”) (Reaction 6), 20-carbon oxo fatty acid having a carbonyl group at the 15-position from 15-hydroxy fatty acid (hereinafter sometimes abbreviated as “15-oxo fatty acid”) (Reaction 7), 12- 20-carbon oxo fatty acid having a carbonyl group at position 12 from hydroxy fatty acid (hereinafter sometimes abbreviated as “12-oxo fatty acid”) (Reaction 8), 14-hydroxy-cis-4, cis-7, cis -10, cis-16, cis-19-docosapentaenoic acid to 14-oxo-cis-4, cis-7, -10, cis -16, cis -19-docosapentaenoic acid to 14-oxo-
  • 13-hydroxy fatty acid is derived from [5] cis-12 unsaturated fatty acid by the hydration reaction using FA-HY, and from the 13-hydroxy fatty acid by dehydrogenation reaction or chemical oxidation, Method for producing 13-oxo fatty acid (Production method 5), [6] 10-hydroxy fatty acid is derived from cis-9 unsaturated fatty acid by hydration reaction using FA-HY, and the 10-hydroxy fatty acid is produced.
  • the above-mentioned production methods 5 to 8 include “cis-12 unsaturated fatty acid”, “cis-9 unsaturated fatty acid”, “cis-14 unsaturated fatty acid”, and “cis-11 unsaturated fatty acid”. This is the same as the substrate described in 4.
  • Examples of the “13-oxo fatty acid” produced by the production method 5 include, for example, 13-oxo-cis-9-octadecenoic acid derived from cis-9, cis-12-octadecadienoic acid (linoleic acid), 13-oxo-cis-6, cis-9-octadecadienoic acid, cis-9, cis-12 derived from cis-6, cis-9, cis-12-octadecatrienoic acid ( ⁇ -linolenic acid) 13-oxo-cis-9, cis-15-octadecadienoic acid, cis-6, cis-9, cis-12, cis-, derived from cis-15-octadecatrienoic acid ( ⁇ -linolenic acid) 13-oxo-cis-6, cis-9, cis-15-octadecatrienoic acid, 10-hydroxy
  • Examples of the “10-oxo fatty acid” produced by the production method 6 include 10-oxo-hexadecanoic acid derived from cis-9-hexadecenoic acid (palmitoleic acid).
  • Examples of the “15-oxo fatty acid” produced by the production method 7 include, for example, 15-oxo-cis-11-eicosenoic acid, cis-11, cis-derived from cis-11, cis-14-eicosadienoic acid.
  • Examples of the “12-oxo fatty acid” produced by the above production method 8 include, for example, 12-oxo-cis-14-eicosenoic acid, cis-11, cis-derived from cis-11, cis-14-eicosadienoic acid.
  • the dehydrogenases used in the above production methods 5-8, production method B or production method II include 13-hydroxy fatty acid, 10-hydroxy fatty acid, 15-hydroxy fatty acid, 12-hydroxy fatty acid, 14-hydroxy-cis-4, cis. -7, cis-10, cis-16, cis-19-docosapentaenoic acid, 10-hydroxy-tetradecanoic acid as substrate, 13-oxo fatty acid, 10-oxo fatty acid, 15-oxo fatty acid, 12-oxo
  • the enzyme can be converted into fatty acid, 14-oxo-cis-4, cis-7, cis-10, cis-16, cis-19-docosapentaenoic acid and 10-oxo-tetradecanoic acid, respectively.
  • CLA-DH hydroxylated fatty acid dehydrogenase derived from lactic acid bacteria
  • CLA-DH hydroxylated fatty acid dehydrogenase
  • More preferred is CLA-DH derived from Lactobacillus plantarum.
  • CLA-DH can be obtained by the method described in JP2007-259712A or the method described in WO2013 / 168310.
  • the dehydrogenase may be purified or roughly purified. Alternatively, it may be expressed in bacterial cells such as Escherichia coli, and the bacterial cells themselves may be used, or a culture solution may be used.
  • the enzyme may be free or immobilized by various carriers.
  • the dehydrogenation reaction is carried out in a suitable buffer solution (for example, phosphate buffer solution, Tris buffer solution, borate buffer solution, etc.), and the substrate 13-hydroxy fatty acid, 10-hydroxy fatty acid, 15-hydroxy fatty acid, 12- Hydroxy fatty acid, 14-hydroxy-cis-4, cis-7, cis-10, cis-16, cis-19-docosapentaenoic acid, 10-hydroxy-tetradecanoic acid and dehydrogenase are mixed at an appropriate concentration. Can be performed by incubating.
  • the substrate concentration is, for example, 0.01 to 100 g / L, preferably 0.05 to 50 g / L, more preferably 0.1 to 5 g / L.
  • the amount of dehydrogenase added is, for example, 0.001 to 10 mg / mL, preferably 0.005 to 1 mg / mL, more preferably 0.05 to 0.2 mg / mL.
  • a “cofactor” may be used for the dehydrogenation reaction, and for example, NAD + or NADP + can be used.
  • the addition concentration may be a concentration at which the oxidation reaction proceeds efficiently.
  • the amount is preferably 0.001 to 20 mM, more preferably 0.01 to 10 mM.
  • the dehydrogenation reaction is performed within a range of a suitable temperature and a suitable pH of the dehydrogenase.
  • the reaction temperature is 5 to 50 ° C., preferably 20 to 45 ° C.
  • the pH of the reaction solution is, for example, pH 4 to 10, preferably pH 5 to 9.
  • the reaction time is not particularly limited, but is, for example, 10 minutes to 72 hours, preferably 30 minutes to 36 hours.
  • the dehydrogenase is in the form of a recombinant cell (for example, E. coli, Bacillus subtilis, yeast, insect cell, animal cell, etc.) into which an expression vector containing a nucleic acid encoding it is introduced.
  • a recombinant cell for example, E. coli, Bacillus subtilis, yeast, insect cell, animal cell, etc.
  • the oxidation reaction can also be performed by culturing the cells by adding a substrate and, if necessary, a cofactor or an activator to a liquid medium suitable for culturing the cells.
  • Examples of chemical oxidation include methods known per se, such as chromic acid oxidation, preferably Jones oxidation.
  • chromic acid salts and complexes of compounds such as chromic anhydride CrO 3 , chromic acid H 2 CrO 4 , and dichromic acid H 2 Cr 2 O 7 can be used.
  • a chromic acid solution is prepared by adding 90 ml of acetone to a mixture of 2.67 g of chromic anhydride with 2.3 ml of sulfuric acid and 7.7 ml of water.
  • the extract (mixture containing the substrate and the product (oxo fatty acid)) obtained by the oxidation reaction with chromic anhydride is subjected to medium pressure chromatography, and the solution coming out of the column is divided into fractions and collected. Each collected fraction is analyzed by LC / MS and gas chromatography, and fractions containing only oxo fatty acids are collected and concentrated on a rotary evaporator. After methyl esterification using a part of the final product obtained, the purity of the oxo fatty acid can be evaluated by gas chromatography, and an oxo fatty acid having a purity of 98% or more can be obtained.
  • the metabolism improving agent containing rare fatty acids of the present invention can also be applied to the improvement of lifestyle-related diseases.
  • “Lifestyle related diseases” refers to a group of diseases in which lifestyle habits such as eating habits, exercise habits, rest, smoking, and drinking are related to the onset and progression of it.
  • the metabolism improving agent of the present invention includes diabetes (type 1 diabetes, type 2 diabetes, maternal diabetes, etc.), diabetic complications (arteriosclerotic disease, diabetic retinopathy, diabetic nephropathy, diabetic neuropathy, etc.). It can also be used to prevent or ameliorate dyslipidemia, hyperlipidemia, hypercholesterolemia, hypertriglyceridemia, insulin resistance, fatty liver.
  • the metabolism of the present invention is applied to humans or non-human animals (eg, dogs, cats, mice, rats, hamsters, guinea pigs, rabbits, pigs, cows, chickens, parakeets, nine-birds, goats, horses, sheep, monkeys, etc.). Administering an improving agent to prevent or treat at least one selected from the group consisting of obesity, diabetes, dyslipidemia, hyperlipidemia, hypercholesterolemia, hypertriglyceridemia, insulin resistance, fatty liver Can be used for.
  • the rare fatty acid of the present invention can also be used as an accelerator for PPAR activity.
  • PPAR ⁇ there are at least three subtypes PPAR ⁇ , PPAR ⁇ (identical to ⁇ ), and PPAR ⁇ in PPAR P.
  • the rare fatty acid of the present invention had agonist activity against PPAR ⁇ and PPAR ⁇ . Therefore, the presence or absence of ligand (agonist, antagonist) activity is confirmed for at least one of these PPARs (preferably PPAR ⁇ or PPAR ⁇ ), and when agonist activity is exhibited, PPAR activity for improving metabolism is demonstrated.
  • the metabolism improving agent (or PPAR activity promoter) containing the rare fatty acid of the present invention can be used, for example, as a pharmaceutical, food, feed, cosmetics or the like, or blended in them.
  • the pharmaceutical dosage forms include powders, granules, pills, soft capsules, hard capsules, tablets, chewable tablets, quick-disintegrating tablets, syrups, solutions, suspensions, suppositories, ointments, creams, gels, and stickies. Agents, inhalants, injections and the like.
  • hydroxylated fatty acids and the like are hardly soluble in water, they can be dissolved in non-hydrophilic organic solvents such as vegetable oils and animal oils, or emulsifiers, dispersants or Along with a surfactant and the like, a homogenizer (high pressure homogenizer) is used to disperse and emulsify in an aqueous solution.
  • a homogenizer high pressure homogenizer
  • Additives that can be used for formulation include animal and vegetable oils such as soybean oil, safflower oil, olive oil, germ oil, sunflower oil, beef tallow, sardine oil, polyethylene glycol, propylene glycol, glycerin, sorbitol, etc.
  • Surfactant such as polyhydric alcohol, sorbitan fatty acid ester, sucrose fatty acid ester, glycerin fatty acid ester, polyglycerin fatty acid ester, purified water, lactose, starch, crystalline cellulose, D-mannitol, lecithin, gum arabic, sorbitol solution, sugar Examples include excipients such as liquids, sweeteners, colorants, pH adjusters, and fragrances.
  • the liquid preparation may be dissolved or suspended in water or other suitable medium at the time of taking. Tablets and granules may be coated by a known method.
  • Intravenous administration When administered in the form of an injection, it can be administered intravenously, intraperitoneally, intramuscularly, subcutaneously, transdermally, intraarticularly, within the bursa, intravesicular, intraperiosteally, sublingually, orally.
  • intravenous administration or intraperitoneal administration is preferred.
  • Intravenous administration may be either drip administration or bolus administration.
  • the food is not particularly limited as long as it can be taken orally, such as a solution, a suspension, a powder, and a solid molded product.
  • Specific examples include supplements (powder, granules, soft capsules, hard capsules, tablets, chewable tablets, quick-disintegrating tablets, syrups, liquids, etc.), beverages (carbonated beverages, lactic acid beverages, sports beverages, fruit juice beverages, vegetable beverages, soy milk beverages) , Coffee beverages, tea beverages, powdered beverages, concentrated beverages, nutritional beverages, alcoholic beverages, etc.), confectionery (gummy, jelly, gum, chocolate, cookies, candy, caramel, Japanese confectionery, snacks, etc.), instant foods (immediate noodles, Retort food, Canned food, Microwave food, Instant soup / Miso soup, Freeze-dried food, etc.) Oil, Fat food (Mayonnaise, Dressing, Butter, Cream, Margarine, etc.), Flour products (Bread, Past
  • the above foods include various nutrients, various vitamins (vitamin A, vitamin B1, vitamin B2, vitamin B6, vitamin C, vitamin D, vitamin E, vitamin K, etc.) and various minerals (magnesium, zinc, Iron, sodium, potassium, selenium, etc.), dietary fiber, dispersants, emulsifiers and other stabilizers, sweeteners, taste ingredients (citric acid, malic acid, etc.), flavors, royal jelly, propolis, agarics, etc. it can.
  • the metabolism improving agent of the present invention When used as a feed or feed additive, examples of the feed include pet food, livestock or aquaculture feed additives.
  • the metabolism improving agent of the present invention when used as cosmetics or cosmetic additives, the cosmetics include creams, gels, emulsions, serums, lotions, microemulsion essences, packs, foundations, lipsticks, eye shadows, shampoos, conditioners, A bath agent etc. are mentioned, and you may mix a fragrance
  • the hydroxylated fatty acid and oxo fatty acid blended in the pharmaceutical, food, feed, cosmetic and the like of the present invention may be used alone or in combination of two or more.
  • the dose of the pharmaceutical of the present invention or the intake of the food of the present invention can be appropriately determined depending on the age and weight of the patient or the user, symptoms, administration time, dosage form, administration method, combination of drugs, and the like.
  • the total amount of the active ingredient, such as hydroxylated fatty acid is 0.02 to 100 mg / kg body weight per day for an adult, preferably 0.2 to 50 mg / kg body weight.
  • the total amount of active ingredients such as hydroxylated fatty acids should be in the range of 1 to 6000 mg, preferably 10 to 3000 mg per adult per day. Can be blended.
  • the intake of the feed of the present invention and the usage of the cosmetic of the present invention can also be appropriately determined according to the intake of the food and the dose of the pharmaceutical product, respectively.
  • FIG. 1 shows structural formulas (1) to (10) and fatty acids derived therefrom.
  • GW7647 PPAR ⁇ agonist
  • Troglitazone PPAR ⁇ agonist
  • Example 1 Measurement of PPAR ⁇ and ⁇ Ligand Activity
  • the activation ability of PPAR ⁇ and ⁇ was measured. This measurement was performed according to Nobuyuki Takahashi et al., FEBS Letters 514 (2002) p315-322, ⁇ Dual action of isoprenols from herbal medicines on both PPARgamma and PPARalpha in 3T3-L1 adipocytes and HepG2 hepatocytes. '' This was done by referring to the column.
  • PPAR ⁇ , ⁇ ligand activity was measured by a reporter assay in which the binding of a PPAR ligand binding region and a GAL4 DNA binding region to a fusion protein and target gene activation were evaluated by luciferase expression.
  • a plasmid containing DNA encoding a fusion protein of PPAR ⁇ , ⁇ ligand binding region and GAL4 DNA binding region and a reporter plasmid in which luciferase is connected to the GAL4 binding DNA sequence are introduced into CV-1 cells. The following ligands were added to the cells and incubated, and then luciferase activity was detected. Samples were adjusted in concentration (10 ⁇ M and 30 ⁇ M) using ethanol.
  • Ethanol was used as a negative control, and PPAR ⁇ and ⁇ ligand agents GW7647 (10 nM) and troglitazone (5 ⁇ M) were used as positive controls.
  • the results are shown in FIGS. 2 and 3, PPAR ⁇ and ⁇ agonist activities were observed in all the fatty acids (1) to (10).
  • 13-OXO GLA showed strong PPAR ⁇ agonist activity
  • (5) 13-OXO ALA showed strong PPAR ⁇ agonist activity.
  • the present invention has been clarified to have an effect of improving lipid and / or sugar and / or energy metabolism, which is not conventionally known as a physiological function such as hydroxylated fatty acid.
  • the lipid and / or sugar and / or energy metabolism-improving agent containing the hydroxylated fatty acid and / or oxo fatty acid can be applied to various fields such as pharmaceuticals, foods, feeds, etc., and the present invention is extremely useful industrially. .
  • This application is based on Japanese Patent Application No. 2014-011871 (filing date: January 24, 2014) filed in Japan, the contents of which are incorporated in full herein.

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Abstract

　本発明は、水酸化脂肪酸、オキソ脂肪酸等の希少脂肪酸を含む代謝改善剤、さらに、当該代謝改善剤を含む食品、医薬品等を提供する。

Description

希少脂肪酸を含む代謝改善剤
　本発明は、希少脂肪酸を含む代謝改善剤に関する。より詳細には、オキソ脂肪酸、水酸化脂肪酸等の希少脂肪酸の生理機能、例えば、脂質、糖、エネルギーの代謝改善作用を利用した代謝改善剤に関する。本発明は当該剤を含む食品、医薬品、飼料等にも関する。
　近年、過食・運動不足等による肥満、特に内臓脂肪の蓄積を伴う生活習慣病が社会的問題となっている。メタボリックシンドロームとは、内臓脂肪型肥満により、高血糖、高血圧、脂質異常症のうち２つ以上を合併し、動脈硬化が引き起こされやすくなった状態のことをいう。40～74才の日本人、男性では２人に１人、女性では５人に１人が、メタボリックシンドローム及びその予備軍と推計されている。そのため、メタボリックシンドロームにおける脂質蓄積の進行防止・解消を目的に、食事療法により摂取カロリーの適正化を図ることの重要性が提唱されている。
　食事において、脂質代謝改善作用や糖尿病改善作用等を有することが報告さている、共役リノール酸等の共役脂肪酸（非特許文献１）、エイコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸等のω3系多価不飽和脂肪酸（特許文献１）、中鎖脂肪酸（特許文献２）等を含む機能性脂質を摂取することに高い関心が寄せられている。
　加えて、トマトに含有される９－オキソ－オクタデカジエン酸や１３－オキソ－オクタデカジエン酸等、一部のオキソ脂肪酸に、脂質代謝改善等の生活習慣病を改善する活性が報告されたことから（特許文献３、非特許文献２、３）、オキソ脂肪酸や水酸化脂肪酸等の希少脂肪酸の生理機能に対する注目も集まっている。
　オキソ脂肪酸や水酸化脂肪酸等の希少脂肪酸の生産に関しては、発明者らが見いだした乳酸菌Lactobacillus plantarum由来の水和脱水酵素を用いる炭素数18のC10位水酸化脂肪酸ならびにC10位オキソ脂肪酸の生産法が報告されている（特許文献４）。また、これらのC10位水酸化脂肪酸ならびにC10位オキソ脂肪酸に関する代謝改善作用（特許文献５）、腸管保護作用（特許文献６）も報告されているが、炭素数18以外の水酸化脂肪酸・オキソ脂肪酸あるいはC10位以外に水酸基、カルボニル基を有する水酸化脂肪酸・オキソ脂肪酸に関する適当な生産法に関する報告はなかった。また、これらの希少脂肪酸誘導体の生理機能も不明であった。
特表2006-521368号公報 再表2009/096570号公報 特開2011-184411号公報 WO2013/168310 WO2014/069227 WO2014/129384
Nagao K, (2005), J. Biosci. Bioeng., vol.100, no.2, p.152-157 Kim Y-I,(2011), Mol. Nutr. Food Res., vol.55, p.585-593 Kim Y-I,(2012), PLoS ONE, vol.7, no.2, e31317
　本発明の目的は、希少脂肪酸を含む、脂質及び／又は糖等の代謝を改善する新規な代謝改善剤を提供することである。
　本発明者らは、上記課題に鑑み鋭意研究を行なった結果、水酸化脂肪酸、例えば、13-ヒドロキシ-シス-9-オクタデセン酸、または、オキソ脂肪酸、例えば、13-オキソ-シス-9-オクタデセン酸が従来知られていない生理機能である、ペルオキシソーム増殖剤応答性受容体（以下、「PPAR」ともいう）活性化作用を有することを見出した。
　以上の知見に基づき、本発明が完成された。
　即ち、本発明は下記のとおりである： 
［１］以下の脂肪酸を含む、代謝改善剤：
（１）13位に水酸基またはカルボニル基を有する炭素数18の脂肪酸、
（２）15位に水酸基またはカルボニル基を有する炭素数20の脂肪酸、
（３）12位に水酸基またはカルボニル基を有する炭素数20の脂肪酸、または
（４）10位に水酸基またはカルボニル基を有する炭素数16の脂肪酸；
［２］以下の脂肪酸を含む、［１］に記載の剤：
（１）13位に水酸基もしくはカルボニル基を有する炭素数18の飽和脂肪酸または6位、9位、15位に少なくとも１つのシス型二重結合を有する不飽和脂肪酸、
（２）15位に水酸基またはカルボニル基を有する炭素数20の5位、8位、11位、17位に少なくとも１つのシス型二重結合を有する不飽和脂肪酸、
（３）12位に水酸基もしくはカルボニル基を有する炭素数20の飽和脂肪酸または5位、8位、14位、17位に少なくとも１つのシス型二重結合を有する不飽和脂肪酸、または
（４）10位に水酸基またはカルボニル基を有する炭素数16の飽和脂肪酸；
［３］以下の脂肪酸を含む、［２］に記載の剤：
（１）13位に水酸基もしくはカルボニル基を有する炭素数18の飽和脂肪酸または6位、9位、15位に少なくとも１つのシス型二重結合を有する不飽和脂肪酸、または
（２）15位に水酸基もしくはカルボニル基を有する炭素数20の5位、8位、11位、17位に少なくとも１つのシス型二重結合を有する不飽和脂肪酸；
［４］以下の脂肪酸を含む、［２］に記載の剤：
（１）13位に水酸基もしくはカルボニル基を有する炭素数18の飽和脂肪酸または6位、9位、15位に少なくとも１つのシス型二重結合を有する不飽和脂肪酸が、13-ヒドロキシ-シス-9-オクタデセン酸、13-ヒドロキシ-シス-6,シス-9-オクタデカジエン酸、13-ヒドロキシ-シス-9,シス-15-オクタデカジエン酸、13-ヒドロキシ-シス-6,シス-9,シス-15-オクタデカトリエン酸、10,13-ジヒドロキシ-オクタデカン酸、10,13-ジヒドロキシ-シス-6-オクタデセン酸、10,13-ジヒドロキシ-シス-15-オクタデセン酸、10,13-ジヒドロキシ-シス-6,シス-15-オクタデカジエン酸、10-オキソ-13-ヒドロキシ-オクタデカン酸、10-オキソ-13-ヒドロキシ-シス-6-オクタデセン酸、10-オキソ-13-ヒドロキシ-シス-15-オクタデセン酸、10-オキソ-13-ヒドロキシ-シス-6,シス-15-オクタデカジエン酸、13-ヒドロキシ-シス-5,シス-9-オクタデカジエン酸、13-ヒドロキシ-トランス-5,シス-9-オクタデカジエン酸、13-オキソ-シス-9-オクタデセン酸、13-オキソ-シス-6,シス-9-オクタデカジエン酸、13-オキソ-シス-9,シス-15-オクタデカジエン酸、13-オキソ-シス-6,シス-9,シス-15-オクタデカトリエン酸、10,13-ジオキソ-オクタデカン酸、10,13-ジオキソ-シス-6-オクタデセン酸、10,13-ジオキソ-シス-15-オクタデセン酸、10,13-ジオキソ-シス-6,シス-15-オクタデカジエン酸、13-オキソ-シス-5,シス-9-オクタデカジエン酸または13-オキソ-トランス-5,シス-9-オクタデカジエン酸、
（２）15位に水酸基またはカルボニル基を有する炭素数20の5位、8位、11位、17位に少なくとも１つのシス型二重結合を有する不飽和脂肪酸が、15-ヒドロキシ-シス-11-エイコセン酸、15-ヒドロキシ-シス-11,シス-17-エイコサジエン酸、15-ヒドロキシ-シス-8,シス-11-エイコサジエン酸、15-ヒドロキシ-シス-5,シス-8,シス-11-エイコサトリエン酸、15-ヒドロキシ-シス-8,シス-11,シス-17-エイコサトリエン酸、15-ヒドロキシ-シス-5,シス-11-エイコサジエン酸、15-ヒドロキシ-シス-5,シス-11,シス-17-エイコサトリエン酸、15-オキソ-シス-11-エイコセン酸、15-オキソ-シス-11,シス-17-エイコサジエン酸、15-オキソ-シス-8,シス-11-エイコサジエン酸、15-オキソ-シス-5,シス-8,シス-11-エイコサトリエン酸、15-オキソ-シス-8,シス-11,シス-17-エイコサトリエン酸、15-オキソ-シス-5,シス-11-エイコサジエン酸または15-オキソ-シス-5,シス-11,シス-17-エイコサトリエン酸、
（３）12位に水酸基もしくはカルボニル基を有する炭素数20の飽和脂肪酸または5位、8位、14位、17位に少なくとも１つのシス型二重結合を有する不飽和脂肪酸が、12-ヒドロキシ-シス-14-エイコセン酸、12-ヒドロキシ-シス-14,シス-17-エイコサジエン酸、12-ヒドロキシ-シス-8,シス-14-エイコサジエン酸、12-ヒドロキシ-シス-5,シス-8-エイコサジエン酸、12-ヒドロキシ-シス-8,シス-14,シス-17-エイコサトリエン酸、12-ヒドロキシ-シス-5,シス-8,シス-14-エイコサトリエン酸、12-オキソ-シス-14-エイコセン酸、12-オキソ-シス-14,シス-17-エイコサジエン酸、12-オキソ-シス-8,シス-14-エイコサジエン酸、12-オキソ-シス-5,シス-8-エイコサジエン酸、12-オキソ-シス-8,シス-14,シス-17-エイコサトリエン酸、または12-オキソ-シス-5,シス-8,シス-14-エイコサトリエン酸、
（４）10位に水酸基またはカルボニル基を有する炭素数16の飽和脂肪酸が、10-ヒドロキシ-ヘキサデカン酸または10-オキソ-ヘキサデカン酸；
［５］以下の脂肪酸を含む、［３］に記載の剤：
（１）13位に水酸基もしくはカルボニル基を有する炭素数18の飽和脂肪酸または6位、9位、15位に少なくとも１つのシス型二重結合を有する不飽和脂肪酸が、13-ヒドロキシ-シス-9-オクタデセン酸、13-ヒドロキシ-シス-6,シス-9-オクタデカジエン酸、13-ヒドロキシ-シス-9,シス-15-オクタデカジエン酸、10,13-ジヒドロキシ-オクタデカン酸、10,13-ジヒドロキシ-シス-6-オクタデセン酸、10,13-ジヒドロキシ-シス-15-オクタデセン酸、13-オキソ-シス-9-オクタデセン酸、13-オキソ-シス-6,シス-9-オクタデカジエン酸、または13-オキソ-シス-9,シス-15-オクタデカジエン酸、
（２）15位に水酸基またはカルボニル基を有する炭素数20の5位、8位、11位、17位に少なくとも１つのシス型二重結合を有する不飽和脂肪酸が、15-ヒドロキシ-シス-5,シス-8,シス-11-エイコサトリエン酸；
［６］肥満、糖尿病、脂質代謝異常、高脂血症、及び脂肪肝からなる群から選択される少なくとも１種の予防又は改善に使用される［１］－［５］のいずれか１つに記載の剤；
［７］食品もしくは食品添加物である、［１］－［５］のいずれか１つに記載の剤；
［８］医薬品である、［１］－［５］のいずれか１つに記載の剤；
［９］飼料もしくは飼料添加物である、［１］－［５］のいずれか１つに記載の剤；
［１０］以下の脂肪酸を含む、PPAR活性促進剤：
（１）13位に水酸基またはカルボニル基を有する炭素数18の脂肪酸、
（２）15位に水酸基またはカルボニル基を有する炭素数20の脂肪酸、
（３）12位に水酸基またはカルボニル基を有する炭素数20の脂肪酸、または
（４）10位に水酸基またはカルボニル基を有する炭素数16の脂肪酸；
［１１］以下の脂肪酸を含む、［１０］に記載の剤：
（１）13位に水酸基もしくはカルボニル基を有する炭素数18の飽和脂肪酸または6位、9位、15位に少なくとも１つのシス型二重結合を有する不飽和脂肪酸、
（２）15位に水酸基またはカルボニル基を有する炭素数20の5位、8位、11位、17位に少なくとも１つのシス型二重結合を有する不飽和脂肪酸、または、
（３）12位に水酸基もしくはカルボニル基を有する炭素数20の飽和脂肪酸または5位、8位、14位、17位に少なくとも１つのシス型二重結合を有する不飽和脂肪酸、または
（４）10位に水酸基またはカルボニル基を有する炭素数16の飽和脂肪酸；
［１２］以下の脂肪酸を含む、［１１］に記載の剤：
（１）13位に水酸基もしくはカルボニル基を有する炭素数18の飽和脂肪酸または6位、9位、15位に少なくとも１つのシス型二重結合を有する不飽和脂肪酸、または
（２）15位に水酸基もしくはカルボニル基を有する炭素数20の5位、8位、11位、17位に少なくとも１つのシス型二重結合を有する不飽和脂肪酸；
［１３］以下の脂肪酸を含む、［１１］に記載の剤：
（１）13位に水酸基もしくはカルボニル基を有する炭素数18の飽和脂肪酸または6位、9位、15位に少なくとも１つのシス型二重結合を有する不飽和脂肪酸が、13-ヒドロキシ-シス-9-オクタデセン酸、13-ヒドロキシ-シス-6,シス-9-オクタデカジエン酸、13-ヒドロキシ-シス-9,シス-15-オクタデカジエン酸、13-ヒドロキシ-シス-6,シス-9,シス-15-オクタデカトリエン酸、10,13-ジヒドロキシ-オクタデカン酸、10,13-ジヒドロキシ-シス-6-オクタデセン酸、10,13-ジヒドロキシ-シス-15-オクタデセン酸、10,13-ジヒドロキシ-シス-6,シス-15-オクタデカジエン酸、10-オキソ-13-ヒドロキシ-オクタデカン酸、10-オキソ-13-ヒドロキシ-シス-6-オクタデセン酸、10-オキソ-13-ヒドロキシ-シス-15-オクタデセン酸、10-オキソ-13-ヒドロキシ-シス-6,シス-15-オクタデカジエン酸、13-ヒドロキシ-シス-5,シス-9-オクタデカジエン酸、13-ヒドロキシ-トランス-5,シス-9-オクタデカジエン酸、13-オキソ-シス-9-オクタデセン酸、13-オキソ-シス-6,シス-9-オクタデカジエン酸、13-オキソ-シス-9,シス-15-オクタデカジエン酸、13-オキソ-シス-6,シス-9,シス-15-オクタデカトリエン酸、10,13-ジオキソ-オクタデカン酸、10,13-ジオキソ-シス-6-オクタデセン酸、10,13-ジオキソ-シス-15-オクタデセン酸、10,13-ジオキソ-シス-6,シス-15-オクタデカジエン酸、13-オキソ-シス-5,シス-9-オクタデカジエン酸または13-オキソ-トランス-5,シス-9-オクタデカジエン酸、
（２）15位に水酸基またはカルボニル基を有する炭素数20の5位、8位、11位、17位に少なくとも１つのシス型二重結合を有する不飽和脂肪酸が、15-ヒドロキシ-シス-11-エイコセン酸、15-ヒドロキシ-シス-11,シス-17-エイコサジエン酸、15-ヒドロキシ-シス-8,シス-11-エイコサジエン酸、15-ヒドロキシ-シス-5,シス-8,シス-11-エイコサトリエン酸、15-ヒドロキシ-シス-8,シス-11,シス-17-エイコサトリエン酸、15-ヒドロキシ-シス-5,シス-11-エイコサジエン酸、15-ヒドロキシ-シス-5,シス-11,シス-17-エイコサトリエン酸、15-オキソ-シス-11-エイコセン酸、15-オキソ-シス-11,シス-17-エイコサジエン酸、15-オキソ-シス-8,シス-11-エイコサジエン酸、15-オキソ-シス-5,シス-8,シス-11-エイコサトリエン酸、15-オキソ-シス-8,シス-11,シス-17-エイコサトリエン酸、15-オキソ-シス-5,シス-11-エイコサジエン酸または15-オキソ-シス-5,シス-11,シス-17-エイコサトリエン酸、
（３）12位に水酸基もしくはカルボニル基を有する炭素数20の飽和脂肪酸または5位、8位、14位、17位に少なくとも１つのシス型二重結合を有する不飽和脂肪酸が、12-ヒドロキシ-シス-14-エイコセン酸、12-ヒドロキシ-シス-14,シス-17-エイコサジエン酸、12-ヒドロキシ-シス-8,シス-14-エイコサジエン酸、12-ヒドロキシ-シス-5,シス-8-エイコサジエン酸、12-ヒドロキシ-シス-8,シス-14,シス-17-エイコサトリエン酸、12-ヒドロキシ-シス-5,シス-8,シス-14-エイコサトリエン酸、12-オキソ-シス-14-エイコセン酸、12-オキソ-シス-14,シス-17-エイコサジエン酸、12-オキソ-シス-8,シス-14-エイコサジエン酸、12-オキソ-シス-5,シス-8-エイコサジエン酸、12-オキソ-シス-8,シス-14,シス-17-エイコサトリエン酸、または12-オキソ-シス-5,シス-8,シス-14-エイコサトリエン酸、
（４）10位に水酸基またはカルボニル基を有する炭素数16の飽和脂肪酸が、10-ヒドロキシ-ヘキサデカン酸または10-オキソ-ヘキサデカン酸；
［１４］以下の脂肪酸を含む、［１２］に記載の剤：
（１）13位に水酸基もしくはカルボニル基を有する炭素数18の飽和脂肪酸または6位、9位、15位に少なくとも１つのシス型二重結合を有する不飽和脂肪酸が、13-ヒドロキシ-シス-9-オクタデセン酸、13-ヒドロキシ-シス-6,シス-9-オクタデカジエン酸、13-ヒドロキシ-シス-9,シス-15-オクタデカジエン酸、10,13-ジヒドロキシ-オクタデカン酸、10,13-ジヒドロキシ-シス-6-オクタデセン酸、10,13-ジヒドロキシ-シス-15-オクタデセン酸、13-オキソ-シス-9-オクタデセン酸、13-オキソ-シス-6,シス-9-オクタデカジエン酸、または13-オキソ-シス-9,シス-15-オクタデカジエン酸、
（２）15位に水酸基またはカルボニル基を有する炭素数20の5位、8位、11位、17位に少なくとも１つのシス型二重結合を有する不飽和脂肪酸が、15-ヒドロキシ-シス-5,シス-8,シス-11-エイコサトリエン酸；
［１５］PPARがPPARαまたはPPARγである、［１０］―「１４」のいずれか１つに記載の剤；
［１６］［１］－［５］のいずれか１つに記載の脂肪酸の有効量を患者に投与することを含む、代謝に関わる疾患の予防または治療方法；
［１７］代謝に関わる疾患が肥満、糖尿病、脂質代謝異常、高脂血症、及び脂肪肝からなる群から選択される少なくとも１種である、［１６］に記載の方法；
［１８］代謝に関わる疾患の予防または治療に使用するための、［１］－［５］のいずれか１つに記載の脂肪酸；
［１９］代謝に関わる疾患が肥満、糖尿病、脂質代謝異常、高脂血症、及び脂肪肝からなる群から選択される少なくとも１種である、［１８］に記載の脂肪酸；
［２０］代謝に関わる疾患の予防または治療剤を製造するための、［１］－［５］のいずれか１つに記載の脂肪酸の使用；
［２１］代謝に関わる疾患が肥満、糖尿病、脂質代謝異常、高脂血症、及び脂肪肝からなる群から選択される少なくとも１種である、［２０］に記載の使用。
　本発明において、13-ヒドロキシ-シス-9-オクタデセン酸又は13-オキソ-シス-9-オクタデセン酸のような水酸化脂肪酸又はオキソ脂肪酸（以下、水酸化脂肪酸等ともいう）が、従来知られていなかった生理機能であるPPAR活性化作用を有することを見出した。
　本発明は、当該機能に基づき、前記の水酸化脂肪酸等の希少脂肪酸を含む代謝改善剤を提供する。当該剤は、医薬品、食品、飼料等、様々な分野において使用し得ることからも、本発明は、産業上極めて有用である。
PPARα/γアゴニスト活性を測定した水酸化脂肪酸、オキソ脂肪酸の構造式を示す。 水酸化脂肪酸及びオキソ脂肪酸のPPARαアゴニスト活性の結果を示す。EtOHは陰性対照（エタノール添加）、GW7647は陽性対照（PPARαアゴニスト添加）を示す。縦軸は、相対的なルシフェラーゼ活性を示す。 水酸化脂肪酸及びオキソ脂肪酸のPPARγアゴニスト活性の結果を示す。EtOHは陰性対照（エタノール添加）、Troは陽性対照（PPARγアゴニスト添加）を示す。縦軸は、相対的なルシフェラーゼ活性を示す。
　以下、本発明の詳細を説明する。
　本発明において、「代謝改善」とは、脂質及び／又は糖及び／又はエネルギーの代謝が改善されることをいう。具体的には、例えば、脂質代謝改善とは、体組織、血中、又はリンパ組織中に存在する脂質の分解を促進する、脂質の合成を抑制する、脂肪組織等の体組織に脂質が蓄積することを予防及び／又は抑制する、若しくは、体組織等に蓄積した脂質を減少させることをいう。「脂質」とは、トリグリセリド、及び／又は、コレステロールをいい、脂肪酸を含む。
　糖代謝改善とは、血中に存在する糖、及び／又は、糖化ヘモグロビン（HbA1c）の上昇を抑制する、空腹時血糖値を低下させる、若しくは、食事後の糖代謝を促進することをいう。さらに、糖代謝改善には、耐糖能異常（正常型と糖尿病型のいずれにも含まれない、糖尿病予備軍ともいえる病態）が改善されることも含まれる。「糖」とは、単糖、二糖または多糖をいう。
　エネルギー代謝改善とは、摂取エネルギー量及び放出エネルギー量のバランスが、異常又は正常に調節できない状態を、正常な状態にする、又は近付けることをいう。
　前記代謝改善の指標として、PPAR活性を測定することができる。PPAR には、少なくとも３種類のサブタイプPPARα、PPARδ（βと同一）、PPARγが存在することが知られている。PPARαは主に肝臓、心臓、腎臓、骨格筋、褐色脂肪細胞等で発現し、脂肪酸のβ酸化に関与する多くの遺伝子の調整に関与している。PPARδは、比較的全身（脳、脂肪組織、皮膚等）に発現している。PPARγには、少なくとも３種類のアイソフォームが存在し、主に白色脂肪細胞やマクロファージで発現し、脂肪細胞分化等に関与している。これらPPARのうち、少なくとも１種以上のPPARに対し、リガンド（アゴニスト、アンタゴニスト）活性の有無を確認し、アゴニスト活性を示す場合、代謝改善効果を有する可能性が高い、又は代謝改善効果を有すると判断する。一例として、FEBS Letters 514 (2002) p.315-322に記載のPPARレポーターアッセイを行うことができるが、当該方法に限定されない。
　または、代謝改善の指標として、肥満・糖尿病モデル動物に、本発明の希少脂肪酸を投与し、体重、臓器重量、血糖値、中性脂肪値、酸素消費量、直腸温度等を測定し、その変化の有無を確認することができる。肥満・糖尿病モデル動物としては、当該性質を示す動物であれば限定されない。例えば、前記モデル動物として、市販のKKAyマウス、NODマウス、NSYマウス、TSODマウス、ZDF/Crl-Leprfaラット、SDT/Jclラット等が挙げられる。体重、臓器重量、血糖値、中性脂肪値、酸素消費量、直腸温度等は、公知の方法で測定することができる。これらを指標に、体重又は臓器重量、若しくは血糖値、中性脂肪値の減少が認められる場合、あるいは、酸素消費量又は直腸温度の増加が認められる場合、代謝改善効果を有する可能性が高い、又は代謝改善効果を有すると判断する。
　あるいは、代謝改善の指標として、LXRアゴニストにより誘導される脂質合成促進作用が、本発明の希少脂肪酸の添加により、抑制されるか否かを確認することができる。その手法は、例えば、Journal of Lipid Research 47,(2006) 2712-2717を参考に行うことができるが、当該方法に限定されない。前記文献に記載の手法としては、LXRアゴニストを添加し、脂質合成関連因子、例えば、(1)SREBP-1c、成熟型及び未成熟型のSREBP-1、SCD-1、FAS、ACC1及び/又はACC2のmRNA及び/又はタンパク質の発現量を測定する、(2)細胞内トリアシルグリセロール量を測定する、若しくは、(3)ルシフェラーゼアッセイを行うことができる。LXRアゴニストとしては、T0901317、22（R）-ヒドロキシコレステロール、24（S）-ヒドロキシコレステロール等が挙げられるが、これらに限定されない。脂質合成関連因子のmRNA及び/又はタンパク質の発現量が低下する場合、脂質合成が抑制されたとし、代謝改善効果を有する可能性が高い、又は代謝改善効果を有すると判断する。
　本発明において、13位に水酸基またはカルボニル基を有する炭素数18の脂肪酸とは、13位に水酸基を有する炭素数18の水酸化脂肪酸（以下、「13-hydroxy脂肪酸」と略記する場合がある）、又は13位にカルボニル基を有する炭素数18のオキソ脂肪酸（以下、「13-oxo脂肪酸」と略記する場合がある）をいう。ここで、10位及び13位に水酸基またはカルボニル基を有する炭素数18の脂肪酸（以下、「10,13-dihydroxy脂肪酸」または「10,13-dioxo脂肪酸」と略記する場合がある）、あるいは、13位に水酸基および10位にカルボニル基を有する炭素数18の脂肪酸（以下、「10-oxo-13-hydroxy脂肪酸」と略記する場合がある）も、「13-hydroxy脂肪酸」または「13-oxo脂肪酸」の一態様として包含される。また、13位に水酸基またはカルボニル基を有する炭素数18の脂肪酸は、飽和脂肪酸であっても不飽和脂肪酸であってもよい。不飽和脂肪酸である場合は、6位、9位、15位に少なくとも１つのシス型二重結合を有する不飽和脂肪酸が好ましい。
　また、本発明において、15位に水酸基またはカルボニル基を有する炭素数20の脂肪酸とは、15位に水酸基を有する炭素数20の水酸化脂肪酸（以下、「15-hydroxy脂肪酸」と略記する場合がある）、又は15位にカルボニル基を有する炭素数20のオキソ脂肪酸（以下、「15-oxo脂肪酸」と略記する場合がある）をいう。また、15位に水酸基またはカルボニル基を有する炭素数20の脂肪酸は、飽和脂肪酸であっても不飽和脂肪酸であってもよい。不飽和脂肪酸である場合は、5位、8位、11位、17位に少なくとも１つのシス型二重結合を有する不飽和脂肪酸が好ましい。
　また、本発明において、12位に水酸基またはカルボニル基を有する炭素数20の脂肪酸とは、12位に水酸基を有する炭素数20の水酸化脂肪酸（以下、「12-hydroxy脂肪酸」と略記する場合がある）、又は12位にカルボニル基を有する炭素数20のオキソ脂肪酸（以下、「12-oxo脂肪酸」と略記する場合がある）をいう。また、12位に水酸基またはカルボニル基を有する炭素数20の脂肪酸は、飽和脂肪酸であっても不飽和脂肪酸であってもよい。不飽和脂肪酸である場合は、5位、8位、14位、17位に少なくとも１つのシス型二重結合を有する不飽和脂肪酸が好ましい。
　また、本発明において、10位に水酸基またはカルボニル基を有する炭素数16の脂肪酸とは、10位に水酸基を有する炭素数16の水酸化脂肪酸（以下、「10-hydroxy脂肪酸」と略記する場合がある）、又は10位にカルボニル基を有する炭素数16のオキソ脂肪酸（以下、「10-oxo脂肪酸」と略記する場合がある）をいう。また、10位に水酸基またはカルボニル基を有する炭素数16の脂肪酸は、飽和脂肪酸であっても不飽和脂肪酸であってもよい。
　より具体的には、13位に水酸基もしくはカルボニル基を有する炭素数18の飽和脂肪酸または6位、9位、15位に少なくとも１つのシス型二重結合を有する不飽和脂肪酸としては、とくに限定されないが、13-ヒドロキシ-シス-9-オクタデセン酸、13-ヒドロキシ-シス-6,シス-9-オクタデカジエン酸、13-ヒドロキシ-シス-9,シス-15-オクタデカジエン酸、13-ヒドロキシ-シス-6,シス-9,シス-15-オクタデカトリエン酸、10,13-ジヒドロキシ-オクタデカン酸、10,13-ジヒドロキシ-シス-6-オクタデセン酸、10,13-ジヒドロキシ-シス-15-オクタデセン酸、10,13-ジヒドロキシ-シス-6,シス-15-オクタデカジエン酸、10-オキソ-13-ヒドロキシ-オクタデカン酸、10-オキソ-13-ヒドロキシ-シス-6-オクタデセン酸、10-オキソ-13-ヒドロキシ-シス-15-オクタデセン酸、10-オキソ-13-ヒドロキシ-シス-6,シス-15-オクタデカジエン酸、13-ヒドロキシ-シス-5,シス-9-オクタデカジエン酸、13-ヒドロキシ-トランス-5,シス-9-オクタデカジエン酸、13-オキソ-シス-9-オクタデセン酸、13-オキソ-シス-6,シス-9-オクタデカジエン酸、13-オキソ-シス-9,シス-15-オクタデカジエン酸、13-オキソ-シス-6,シス-9,シス-15-オクタデカトリエン酸、10,13-ジオキソ-オクタデカン酸、10,13-ジオキソ-シス-6-オクタデセン酸、10,13-ジオキソ-シス-15-オクタデセン酸、10,13-ジオキソ-シス-6,シス-15-オクタデカジエン酸、13-オキソ-シス-5,シス-9-オクタデカジエン酸または13-オキソ-トランス-5,シス-9-オクタデカジエン酸等が挙げられ、より好ましくは、13-ヒドロキシ-シス-9-オクタデセン酸、13-ヒドロキシ-シス-6,シス-9-オクタデカジエン酸、13-ヒドロキシ-シス-9,シス-15-オクタデカジエン酸、10,13-ジヒドロキシ-オクタデカン酸、10,13-ジヒドロキシ-シス-6-オクタデセン酸、10,13-ジヒドロキシ-シス-15-オクタデセン酸、13-オキソ-シス-9-オクタデセン酸、13-オキソ-シス-6,シス-9-オクタデカジエン酸、または13-オキソ-シス-9,シス-15-オクタデカジエン酸が挙げられる。
　また、15位に水酸基またはカルボニル基を有する炭素数20の5位、8位、11位、17位に少なくとも１つのシス型二重結合を有する不飽和脂肪酸としては、とくに限定されないが、15-ヒドロキシ-シス-11-エイコセン酸、15-ヒドロキシ-シス-11,シス-17-エイコサジエン酸、15-ヒドロキシ-シス-8,シス-11-エイコサジエン酸、15-ヒドロキシ-シス-5,シス-8,シス-11-エイコサトリエン酸、15-ヒドロキシ-シス-8,シス-11,シス-17-エイコサトリエン酸、15-ヒドロキシ-シス-5,シス-11-エイコサジエン酸、15-ヒドロキシ-シス-5,シス-11,シス-17-エイコサトリエン酸、15-オキソ-シス-11-エイコセン酸、15-オキソ-シス-11,シス-17-エイコサジエン酸、15-オキソ-シス-8,シス-11-エイコサジエン酸、15-オキソ-シス-5,シス-8,シス-11-エイコサトリエン酸、15-オキソ-シス-8,シス-11,シス-17-エイコサトリエン酸、15-オキソ-シス-5,シス-11-エイコサジエン酸または15-オキソ-シス-5,シス-11,シス-17-エイコサトリエン酸等が挙げられ、より好ましくは、15-ヒドロキシ-シス-5,シス-8,シス-11-エイコサトリエン酸が挙げられる。
　また、12位に水酸基もしくはカルボニル基を有する炭素数20の飽和脂肪酸または5位、8位、14位、17位に少なくとも１つのシス型二重結合を有する不飽和脂肪酸としては、とくに限定されないが、12-ヒドロキシ-シス-14-エイコセン酸、12-ヒドロキシ-シス-14,シス-17-エイコサジエン酸、12-ヒドロキシ-シス-8,シス-14-エイコサジエン酸、12-ヒドロキシ-シス-5,シス-8-エイコサジエン酸、12-ヒドロキシ-シス-8,シス-14,シス-17-エイコサトリエン酸、12-ヒドロキシ-シス-5,シス-8,シス-14-エイコサトリエン酸、12-オキソ-シス-14-エイコセン酸、12-オキソ-シス-14,シス-17-エイコサジエン酸、12-オキソ-シス-8,シス-14-エイコサジエン酸、12-オキソ-シス-5,シス-8-エイコサジエン酸、12-オキソ-シス-8,シス-14,シス-17-エイコサトリエン酸、または12-オキソ-シス-5,シス-8,シス-14-エイコサトリエン酸等が挙げられる。
　また、10位に水酸基またはカルボニル基を有する炭素数16の飽和脂肪酸としては、とくに限定されないが、10-ヒドロキシ-ヘキサデカン酸または10-オキソ-ヘキサデカン酸等が挙げられる。
　本発明で使用するオキソ脂肪酸又は水酸化脂肪酸等の希少脂肪酸は、新規脂肪酸水和酵素（FA-HY）によって、炭素数１６、１８、２０の不飽和脂肪酸から水酸化脂肪酸に製造し、さらに該水酸化脂肪酸の水酸基を酵素反応又は化学反応によりオキソ化することによってオキソ脂肪酸を製造することができる。具体的には、下記の手法により調製することができる。
　前記の新規脂肪酸水和酵素「FA-HY」は、
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる酵素タンパク質、
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１又は複数個のアミノ酸が欠失及び／又は置換及び／又は挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列を含み、かつ配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる酵素タンパク質が有する酵素活性を有するタンパク質、あるいは
（ｃ）配列番号１に示される塩基配列の相補鎖配列からなる核酸と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列によってコードされ、かつ配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる酵素タンパク質が有する酵素活性を有するタンパク質である。
　上記（ｂ）に関し、より具体的には、（i）配列番号２に示されるアミノ酸配列中の1～20個、好ましくは1～10個、より好ましくは1～数（5、4、3もしくは2）個のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、（ii）配列番号２に示されるアミノ酸配列に1～20個、好ましくは1～10個、より好ましくは1～数（5、4、3もしくは2）個のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、（iii）配列番号２に示されるアミノ酸配列に1～20個、好ましくは1～10個、より好ましくは1～数（5、4、3もしくは2）個のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、（iv）配列番号２に示されるアミノ酸配列中の1～20個、好ましくは1～10個、より好ましくは1～数（5、4、3もしくは2）個のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、又は（v）それらを組み合わせたアミノ酸配列を含むタンパク質が挙げられる。性質の似たアミノ酸（例えば、グリシンとアラニン、バリンとロイシンとイソロイシン、セリンとトレオニン、アスパラギン酸とグルタミン酸、アスパラギンとグルタミン、リシンとアルギニン、システインとメチオニン、フェニルアラニンとチロシン等）同士の置換等であれば、さらに多くの個数の置換等がありうる。
　上記のようにアミノ酸が欠失、置換又は挿入されている場合、その欠失、置換、挿入の位置は、上記酵素活性が保持される限り、特に限定されない。
　上記（ｃ）において「ストリンジェントな条件」とは、同一性が高いヌクレオチド配列同士、例えば70、80、90、95又は99％以上の同一性を有するヌクレオチド配列同士がハイブリダイズし、それより同一性が低いヌクレオチド配列同士がハイブリダイズしない条件、具体的には通常のサザンハイブリダイゼーションの洗浄条件である60℃、1xSSC、0.1％SDS、好ましくは、0.1xSSC、0.1％SDS、さらに好ましくは、68℃、0.1xSSC、0.1％SDSに相当する塩濃度及び温度で、1回、より好ましくは2～3回洗浄する条件等が挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
　上記（ｂ）または（ｃ）に関し、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる酵素タンパク質が有する酵素活性としては、（１）12位にシス型二重結合を有する炭素数18の不飽和脂肪酸（以下、「cis-12不飽和脂肪酸」と略記する場合がある）を基質として利用し、13位に水酸基を有する炭素数18の水酸化脂肪酸（13-hydroxy脂肪酸）に変換し得る酵素活性（反応１）、（２）9位にシス型二重結合を有する炭素数16の不飽和脂肪酸（以下、「cis-9不飽和脂肪酸」と略記する場合がある）を基質として利用し、10位に水酸基を有する炭素数16の水酸化脂肪酸（10-hydroxy脂肪酸）に変換し得る酵素活性（反応２）、（３）14位にシス型二重結合を有する炭素数20の不飽和脂肪酸（以下、「cis-14不飽和脂肪酸」と略記する場合がある）を基質として利用し、15位に水酸基を有する炭素数20の水酸化脂肪酸（15-hydroxy脂肪酸）に変換し得る酵素活性（反応３）、（４）11位にシス型二重結合を有する炭素数20の不飽和脂肪酸（以下、「cis-11不飽和脂肪酸」と略記する場合がある）を基質として利用し、12位に水酸基を有する炭素数20の水酸化脂肪酸（12-hydroxy脂肪酸）に変換し得る酵素活性（反応４）、シス-4,シス-7,シス-10,シス-13,シス-16,シス-19-ドコサヘキサエン酸（DHA）を14-ヒドロキシ-シス-4,シス-7,シス-10,シス-16,シス-19-ドコサペンタエン酸に変換しうる酵素活性（反応Ａ）、およびシス-9-テトラデセン酸（ミリストレイン酸）を10-ヒドロキシ-テトラデカン酸に変換しうる酵素活性（反応I）の少なくとも１つ、好ましくは全てを有していれば特に制限はない。
　上記の「cis-12不飽和脂肪酸」、「cis-9不飽和脂肪酸」、「cis-14不飽和脂肪酸」、「cis-11不飽和脂肪酸」としては、それぞれ、12位にシス型二重結合を有する炭素数18の不飽和脂肪酸、9位にシス型二重結合を有する炭素数16の不飽和脂肪酸、14位にシス型二重結合を有する炭素数20の不飽和脂肪酸、11位にシス型二重結合を有する炭素数20の不飽和脂肪酸であれば特に制限されず、例えば一価不飽和脂肪酸、二価不飽和脂肪酸、三価不飽和脂肪酸、四価不飽和脂肪酸、五価不飽和脂肪酸などが挙げられる。尚、本明細書において「脂肪酸」という場合、遊離の酸のみならず、エステル体、塩基性化合物との塩等をも包含する。「DHA」および「ミリストレイン酸」についても、遊離の酸のみならず、エステル体、塩基性化合物との塩等をも包含する。
　前記のFA-HYは、例えば、ラクトバチルス・アシドフィルスの菌体や培養液から、自体公知のタンパク質分離精製技術により単離することができる。または、FA-HYは、FA-HYを含むラクトバチルス・アシドフィルスの菌体自体またはその菌体破砕物として用いてもよい。FA-HYを含むラクトバチルス・アシドフィルスの菌体としては、前記のFA-HYを含む限り特に制限はないが、例えば、独立行政法人　製品評価技術基盤機構　特許微生物寄託センター（NPMD）に２０１４年１月１７日に寄託したNITE BP-01788などが挙げられる。あるいは、FA-HYをコードする遺伝子を単離し、適当なベクターにサブクローニングし、大腸菌などの適当な宿主に導入して培養し、組換えタンパク質として製造することもできる。FA-HYは精製されたものであっても、粗精製されたものであってもよい。あるいは、大腸菌等の菌体に発現させ、その菌体自体を用いても、培養液を用いてもよい。さらには、該酵素は遊離型のものでもよく、各種担体によって固定化されたものでもよい。
　前記のFA-HYをコードする核酸を含むベクターは、目的（例えば、タンパク質の発現）に応じて、ベクターを導入する宿主細胞に適したものを適宜選択し、使用することができる。発現ベクターである場合、適切なプロモーターに機能可能に連結された本発明の核酸を含み、好ましくは本発明の核酸の下流に転写終結シグナル、すなわちターミネーター領域を含む。さらに、形質転換体を選択するための選択マーカー遺伝子（薬剤耐性遺伝子、栄養要求性変異を相補する遺伝子等）も含むこともできる。また、発現したタンパク質の分離・精製に有用なタグ配列をコードする配列等を含んでもよい。また、ベクターは、対象宿主細胞のゲノムに組み込まれるものであってもよい。そして、本発明のベクターは、コンピテント細胞法、プロトプラスト法、リン酸カルシウム共沈法等、自体公知の形質転換法で、対象宿主細胞内に導入することができる。
　本明細書において「宿主細胞」は、前記のFA-HYをコードする核酸を含むベクターを発現できれば任意の細胞でよく、細菌、酵母、真菌及び高等真核細胞等が挙げられる。細菌の例としては、バチルス又はストレプトマイセス等のグラム陽性菌又は大腸菌等のグラム陰性菌が挙げられる。FA-HYをコードする核酸を含むベクターが導入された組換え細胞は、宿主細胞に適した自体公知の方法により培養することができる。
　前記のFA-HYの「精製」は、自体公知の方法、例えば、遠心分離等で集菌した菌体を、超音波又はガラスビーズ等で摩砕した後、遠心分離等により細胞片等の固形物を除き、粗酵素液を調製し、さらに、硫安、硫酸ナトリウム等による塩析法、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、アフィニテイクロマトグラフィー等のクロマトグラフ法、ゲル電気泳動法等を用いることができる。
　前記のFA-HYは、上記の通り、cis-12不飽和脂肪酸、cis-9不飽和脂肪酸、cis-14不飽和脂肪酸、cis-11不飽和脂肪酸、DHA、ミリストレイン酸を基質として利用し、13-hydroxy脂肪酸、10-hydroxy脂肪酸、15-hydroxy脂肪酸、12-hydroxy脂肪酸、14-ヒドロキシ-シス-4,シス-7,シス-10,シス-16,シス-19-ドコサペンタエン酸、10-ヒドロキシ-テトラデカン酸にそれぞれ変換し得る酵素活性を有する。従って、［１］cis-12不飽和脂肪酸から、前記のFA-HYを用いた水和反応により、13-hydroxy脂肪酸を製造する方法（製法１）、［２］cis-9不飽和脂肪酸から、前記のFA-HYを用いた水和反応により、10-hydroxy脂肪酸を製造する方法（製法２）、［３］cis-14不飽和脂肪酸から、前記のFA-HYを用いた水和反応により、15-hydroxy脂肪酸を製造する方法（製法３）、［４］cis-11不飽和脂肪酸から、前記のFA-HYを用いた水和反応により、12-hydroxy脂肪酸を製造する方法（製法４）、［Ａ］DHAから、前記のFA-HYを用いた水和反応により、14-ヒドロキシ-シス-4,シス-7,シス-10,シス-16,シス-19-ドコサペンタエン酸を製造する方法（製法Ａ）、［I］ミリストレイン酸から、本発明のFA-HYを用いた水和反応により、10-ヒドロキシ-テトラデカン酸を製造する方法（製法I）がそれぞれ提供される。
　前記の製法１の「cis-12不飽和脂肪酸」としては、例えば、シス-9,シス-12-オクタデカジエン酸（リノール酸）、シス-6,シス-9,シス-12-オクタデカトリエン酸（γ-リノレン酸）、シス-9,シス-12,シス-15-オクタデカトリエン酸（α-リノレン酸）、シス-6,シス-9,シス-12,シス-15-オクタデカテトラエン酸（ステアリドン酸）の他、WO2013/168310で製造可能となった10-ヒドロキシ-シス-12-オクタデセン酸、10-ヒドロキシ-シス-6,シス-12-オクタデカジエン酸、10-ヒドロキシ-シス-12,シス-15-オクタデカジエン酸、10-ヒドロキシ-シス-6,シス-12,シス-15-オクタデカトリエン酸、10-オキソ-シス-12-オクタデセン酸、10-オキソ-シス-6,シス-12-オクタデカジエン酸、10-オキソ-シス-12,シス-15-オクタデカジエン酸、10-オキソ-シス-6,シス-12,シス-15-オクタデカトリエン酸、シス-5,シス-9,シス-12-オクタデカトリエン酸（ピノレン酸）、トランス-5,シス-9,シス-12-オクタデカトリエン酸（コルンビン酸）等が挙げられる。もちろん、当該基質はWO2013/168310以外の方法により得られたものであってもよい。
　前記の製法１によって製造される「13-hydroxy脂肪酸」としては、例えば、シス-9,シス-12-オクタデカジエン酸（リノール酸）から誘導される13-ヒドロキシ-シス-9-オクタデセン酸、シス-6,シス-9,シス-12-オクタデカトリエン酸（γ-リノレン酸）から誘導される13-ヒドロキシ-シス-6,シス-9-オクタデカジエン酸、シス-9,シス-12,シス-15-オクタデカトリエン酸（α-リノレン酸）から誘導される13-ヒドロキシ-シス-9,シス-15-オクタデカジエン酸、シス-6,シス-9,シス-12,シス-15-オクタデカテトラエン酸（ステアリドン酸）から誘導される13-ヒドロキシ-シス-6,シス-9,シス-15-オクタデカトリエン酸、10-ヒドロキシ-シス-12-オクタデセン酸から誘導される10,13-ジヒドロキシ-オクタデカン酸、10-ヒドロキシ-シス-6,シス-12-オクタデカジエン酸から誘導される10,13-ジヒドロキシ-シス-6-オクタデセン酸、10-ヒドロキシ-シス-12,シス-15-オクタデカジエン酸から誘導される10,13-ジヒドロキシ-シス-15-オクタデセン酸、10-ヒドロキシ-シス-6,シス-12,シス-15-オクタデカトリエン酸から誘導される10,13-ジヒドロキシ-シス-6,シス-15-オクタデカジエン酸、10-オキソ-シス-12-オクタデセン酸から誘導される10-オキソ-13-ヒドロキシ-オクタデカン酸、10-オキソ-シス-6,シス-12-オクタデカジエン酸から誘導される10-オキソ-13-ヒドロキシ-シス-6-オクタデセン酸、10-オキソ-シス-12,シス-15-オクタデカジエン酸から誘導される10-オキソ-13-ヒドロキシ-シス-15-オクタデセン酸、10-オキソ-シス-6,シス-12,シス-15-オクタデカトリエン酸から誘導される10-オキソ-13-ヒドロキシ-シス-6,シス-15-オクタデカジエン酸、シス-5,シス-9,シス-12-オクタデカトリエン酸（ピノレン酸）から誘導される13-ヒドロキシ-シス-5,シス-9-オクタデカジエン酸、トランス-5,シス-9,シス-12-オクタデカトリエン酸（コルンビン酸）から誘導される13-ヒドロキシ-トランス-5,シス-9-オクタデカジエン酸等が挙げられる。
　前記の製法２の「cis-9不飽和脂肪酸」としては、例えば、シス-9-ヘキサデセン酸（パルミトレイン酸）等が挙げられる。
　前記の製法２によって製造される「10-hydroxy脂肪酸」としては、例えば、シス-9-ヘキサデセン酸（パルミトレイン酸）から誘導される10-ヒドロキシ-ヘキサデカン酸等が挙げられる。
　前記の製法３の「cis-14不飽和脂肪酸」としては、例えば、シス-11,シス-14-エイコサジエン酸、シス-11,シス-14,シス-17-エイコサトリエン酸、シス-8,シス-11,シス-14-エイコサトリエン酸（ジホモ-γ-リノレン酸）、シス-5,シス-8,シス-11,シス-14-エイコサテトラエン酸（アラキドン酸）、シス-8,シス-11,シス-14,シス-17-エイコサテトラエン酸、シス-5,シス-11,シス-14-エイコサトリエン酸（シアドン酸）、シス-5,シス-11,シス-14,シス-17-エイコサテトラエン酸（ジュニペロン酸）等が挙げられる。
　前記の製法３によって製造される「15-hydroxy脂肪酸」としては、例えば、シス-11,シス-14-エイコサジエン酸から誘導される15-ヒドロキシ-シス-11-エイコセン酸、シス-11,シス-14,シス-17-エイコサトリエン酸から誘導される15-ヒドロキシ-シス-11,シス-17-エイコサジエン酸、シス-8,シス-11,シス-14-エイコサトリエン酸（ジホモ-γ-リノレン酸）から誘導される15-ヒドロキシ-シス-8,シス-11-エイコサジエン酸、シス-5,シス-8,シス-11,シス-14-エイコサテトラエン酸（アラキドン酸）から誘導される15-ヒドロキシ-シス-5,シス-8,シス-11-エイコサトリエン酸、シス-8,シス-11,シス-14,シス-17-エイコサテトラエン酸から誘導される15-ヒドロキシ-シス-8,シス-11,シス-17-エイコサトリエン酸、シス-5,シス-11,シス-14-エイコサトリエン酸（シアドン酸）から誘導される15-ヒドロキシ-シス-5,シス-11-エイコサジエン酸、シス-5,シス-11,シス-14,シス-17-エイコサテトラエン酸（ジュニペロン酸）から誘導される15-ヒドロキシ-シス-5,シス-11,シス-17-エイコサトリエン酸等が挙げられる。
　前記の製法４の「cis-11不飽和脂肪酸」としては、例えば、シス-11,シス-14-エイコサジエン酸、シス-11,シス-14,シス-17-エイコサトリエン酸、シス-8,シス-11,シス-14-エイコサトリエン酸（ジホモ-γ-リノレン酸）、シス-5,シス-8,シス-11-エイコサトリエン酸（ミード酸）、シス-8,シス-11,シス-14,シス-17-エイコサテトラエン酸、シス-5,シス-8,シス-11,シス-14-エイコサテトラエン酸（アラキドン酸）等が挙げられる。
　前記の製法４によって製造される「12-hydroxy脂肪酸」としては、例えば、シス-11,シス-14-エイコサジエン酸から誘導される12-ヒドロキシ-シス-14-エイコセン酸、シス-11,シス-14,シス-17-エイコサトリエン酸から誘導される12-ヒドロキシ-シス-14,シス-17-エイコサジエン酸、シス-8,シス-11,シス-14-エイコサトリエン酸（ジホモ-γ-リノレン酸）から誘導される12-ヒドロキシ-シス-8,シス-14-エイコサジエン酸、シス-5,シス-8,シス-11-エイコサトリエン酸（ミード酸）から誘導される12-ヒドロキシ-シス-5,シス-8-エイコサジエン酸、シス-8,シス-11,シス-14,シス-17-エイコサテトラエン酸から誘導される12-ヒドロキシ-シス-8,シス-14,シス-17-エイコサトリエン酸、シス-5,シス-8,シス-11,シス-14-エイコサテトラエン酸（アラキドン酸）から誘導される12-ヒドロキシ-シス-5,シス-8,シス-14-エイコサトリエン酸等が挙げられる。
　水和反応は、適当な緩衝液（例えば、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、ホウ酸緩衝液等）中で、基質である不飽和脂肪酸と前記のFA-HYとを適当な濃度で混合し、インキュベートすることにより行われ得る。基質濃度は、例えば1～1000g/L、好ましくは10～500g/L、より好ましくは20～250g/Lである。前記のFA-HYの添加量は、例えば、0.001～10mg/m L、好ましくは0.1～5mg/m L、より好ましくは0.2～2mg/m Lである。
　水和反応（反応１～４、反応Ａまたは反応Ｉ）には「補因子」を用いてよく、例えば、FAD等を用いることができる。その添加濃度は水和反応が効率良く進む濃度であればよい。好ましくは0.001～20mM、より好ましくは0.01～10mMである。
　さらに、水和反応に「活性化剤」を用いてよく、例えば、NADH、NADPHからなる群から選ばれる１又は２の化合物が挙げられる。その添加濃度は水和反応が効率良く進む濃度であればよい。好ましくは0.1～20mM、より好ましくは1～10mMである。
　水和反応は、前記のFA-HYの好適温度、好適ｐＨの範囲内で行うことが望ましい。例えば、反応温度は５～５０℃、好ましくは２０～４５℃である。また、反応液のｐＨとしては、例えば、ｐＨ４～１０、好ましくはｐＨ５～９である。反応時間も特に制限はないが、例えば１０分～７２時間、好ましくは３０分～３６時間である。
　本発明の好ましい一実施態様においては、前記のFA-HYは、それをコードする核酸を含む発現ベクターが導入された組換え細胞（例えば、大腸菌、枯草菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞等）の形態で反応系に提供される。この場合、当該細胞の培養に適した液体培地に、基質及び必要に応じて補因子や活性化剤を添加して、当該細胞を培養することにより、水和反応を行うこともできる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
　更に、脱水素反応もしくはクロム酸を用いた化学的酸化により、前記の製法１～４、製法Ａ、製法Iで得られた13-hydroxy脂肪酸から13位にカルボニル基を有する炭素数18のオキソ脂肪酸（以下、「13-oxo脂肪酸」と略記する場合がある）（反応５）、10-hydroxy脂肪酸から10位にカルボニル基を有する炭素数16のオキソ脂肪酸（以下「10-oxo脂肪酸」と略記する場合がある）（反応６）、15-hydroxy脂肪酸から15位にカルボニル基を有する炭素数20のオキソ脂肪酸（以下、「15-oxo脂肪酸」と略記する場合がある）（反応７）、12-hydroxy脂肪酸から12位にカルボニル基を有する炭素数20のオキソ脂肪酸（以下、「12-oxo脂肪酸」と略記する場合がある）（反応８）、14-ヒドロキシ-シス-4,シス-7,シス-10,シス-16,シス-19-ドコサペンタエン酸から14-オキソ-シス-4,シス-7,シス-10,シス-16,シス-19-ドコサペンタエン酸（反応Ｂ）、10-ヒドロキシ-テトラデカン酸から10-オキソ-テトラデカン酸（反応II）がそれぞれ生成される。
　従って、［５］cis-12不飽和脂肪酸から、前記のFA-HYを用いた水和反応により、13-hydroxy脂肪酸を誘導し、該13-hydroxy脂肪酸から、脱水素反応又は化学的酸化により、13-oxo脂肪酸を製造する方法（製法５）、［６］cis-9不飽和脂肪酸から、前記のFA-HYを用いた水和反応により、10-hydroxy脂肪酸を誘導し、該10-hydroxy脂肪酸から、脱水素反応又は化学的酸化により、10-oxo脂肪酸を製造する方法（製法６）、［７］cis-14不飽和脂肪酸から、前記のFA-HYを用いた水和反応により、15-hydroxy脂肪酸を誘導し、該15-hydroxy脂肪酸から、脱水素反応又は化学的酸化により、15-oxo脂肪酸を製造する方法（製法７）、［８］cis-11不飽和脂肪酸から、前記のFA-HYを用いた水和反応により、12-hydroxy脂肪酸を誘導し、該12-hydroxy脂肪酸から、脱水素反応又は化学的酸化により、12-oxo脂肪酸を製造する方法（製法８）、［Ｂ］DHAから、本発明のFA-HYを用いた水和反応により、14-ヒドロキシ-シス-4,シス-7,シス-10,シス-16,シス-19-ドコサペンタエン酸を誘導し、該14-ヒドロキシ-シス-4,シス-7,シス-10,シス-16,シス-19-ドコサペンタエン酸から、脱水素反応又は化学的酸化により、14-オキソ-シス-4,シス-7,シス-10,シス-16,シス-19-ドコサペンタエン酸を製造する方法（製法Ｂ）、［II］ミリストレイン酸から、本発明のFA-HYを用いた水和反応により、10-ヒドロキシ-テトラデカン酸を誘導し、該10-ヒドロキシ-テトラデカン酸から、脱水素反応又は化学的酸化により、10-オキソ-テトラデカン酸を製造する方法（製法II）がそれぞれ提供される。
　前記の製法５～８の「cis-12不飽和脂肪酸」、「cis-9不飽和脂肪酸」、「cis-14不飽和脂肪酸」、「cis-11不飽和脂肪酸」としては、上記の製法１～４に記載の基質と同様である。
　前記の製法５によって製造される「13-oxo脂肪酸」としては、例えば、シス-9,シス-12-オクタデカジエン酸（リノール酸）から誘導される13-オキソ-シス-9-オクタデセン酸、シス-6,シス-9,シス-12-オクタデカトリエン酸（γ-リノレン酸）から誘導される13-オキソ-シス-6,シス-9-オクタデカジエン酸、シス-9,シス-12,シス-15-オクタデカトリエン酸（α-リノレン酸）から誘導される13-オキソ-シス-9,シス-15-オクタデカジエン酸、シス-6,シス-9,シス-12,シス-15-オクタデカテトラエン酸（ステアリドン酸）から誘導される13-オキソ-シス-6,シス-9,シス-15-オクタデカトリエン酸、10-ヒドロキシ-シス-12-オクタデセン酸あるいは10-オキソ-シス-12-オクタデセン酸から誘導される10,13-ジオキソ-オクタデカン酸、10-ヒドロキシ-シス-6,シス-12-オクタデカジエン酸あるいは10-オキソ-シス-6,シス-12-オクタデカジエン酸から誘導される10,13-ジオキソ-シス-6-オクタデセン酸、10-ヒドロキシ-シス-12,シス-15-オクタデカジエン酸あるいは10-オキソ-シス-12,シス-15-オクタデカジエン酸から誘導される10,13-ジオキソ-シス-15-オクタデセン酸、10-ヒドロキシ-シス-6,シス-12,シス-15-オクタデカトリエン酸あるいは10-オキソ-シス-6,シス-12,シス-15-オクタデカトリエン酸から誘導される10,13-ジオキソ-シス-6,シス-15-オクタデカジエン酸、シス-5,シス-9,シス-12-オクタデカトリエン酸（ピノレン酸）から誘導される13-オキソ-シス-5,シス-9-オクタデカジエン酸、トランス-5,シス-9,シス-12-オクタデカトリエン酸（コルンビン酸）から誘導される13-オキソ-トランス-5,シス-9-オクタデカジエン酸等が挙げられる。
　前記の製法６によって製造される「10-oxo脂肪酸」としては、例えば、シス-9-ヘキサデセン酸（パルミトレイン酸）から誘導される10-オキソ-ヘキサデカン酸等が挙げられる。
　前記の製法７によって製造される「15-oxo脂肪酸」としては、例えば、シス-11,シス-14-エイコサジエン酸から誘導される15-オキソ-シス-11-エイコセン酸、シス-11,シス-14,シス-17-エイコサトリエン酸から誘導される15-オキソ-シス-11,シス-17-エイコサジエン酸、シス-8,シス-11,シス-14-エイコサトリエン酸（ジホモ-γ-リノレン酸）から誘導される15-オキソ-シス-8,シス-11-エイコサジエン酸、シス-5,シス-8,シス-11,シス-14-エイコサテトラエン酸（アラキドン酸）から誘導される15-オキソ-シス-5,シス-8,シス-11-エイコサトリエン酸、シス-8,シス-11,シス-14,シス-17-エイコサテトラエン酸から誘導される15-オキソ-シス-8,シス-11,シス-17-エイコサトリエン酸、シス-5,シス-11,シス-14-エイコサトリエン酸（シアドン酸）から誘導される15-オキソ-シス-5,シス-11-エイコサジエン酸、シス-5,シス-11,シス-14,シス-17-エイコサテトラエン酸（ジュニペロン酸）から誘導される15-オキソ-シス-5,シス-11,シス-17-エイコサトリエン酸等が挙げられる。
　前記の製法８によって製造される「12-oxo脂肪酸」としては、例えば、シス-11,シス-14-エイコサジエン酸から誘導される12-オキソ-シス-14-エイコセン酸、シス-11,シス-14,シス-17-エイコサトリエン酸から誘導される12-オキソ-シス-14,シス-17-エイコサジエン酸、シス-8,シス-11,シス-14-エイコサトリエン酸（ジホモ-γ-リノレン酸）から誘導される12-オキソ-シス-8,シス-14-エイコサジエン酸、シス-5,シス-8,シス-11-エイコサトリエン酸（ミード酸）から誘導される12-オキソ-シス-5,シス-8-エイコサジエン酸、シス-8,シス-11,シス-14,シス-17-エイコサテトラエン酸から誘導される12-オキソ-シス-8,シス-14,シス-17-エイコサトリエン酸、シス-5,シス-8,シス-11,シス-14-エイコサテトラエン酸（アラキドン酸）から誘導される12-オキソ-シス-5,シス-8,シス-14-エイコサトリエン酸等が挙げられる。
　前記の製法５～８、製法Ｂまたは製法IIで用いられる脱水素酵素としては、13-hydroxy脂肪酸、10-hydroxy脂肪酸、15-hydroxy脂肪酸、12-hydroxy脂肪酸、14-ヒドロキシ-シス-4,シス-7,シス-10,シス-16,シス-19-ドコサペンタエン酸、10-ヒドロキシ-テトラデカン酸を基質として利用し、13-oxo脂肪酸、10-oxo脂肪酸、15-oxo脂肪酸、12-oxo脂肪酸、14-オキソ-シス-4,シス-7,シス-10,シス-16,シス-19-ドコサペンタエン酸、10-オキソ-テトラデカン酸にそれぞれ変換し得る酵素であれば特に制限はないが、例えば、乳酸菌由来の水酸化脂肪酸デヒドロゲナーゼ（CLA-DH）が好ましい。より好ましくは、ラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）由来のCLA-DHであり、特に好ましくは、Ｌ．プランタルムFERM BP-10549菌株由来のCLA-DHである。CLA-DHは、特開2007-259712号公報に記載される方法や、WO2013/168310に記載される方法により取得することができる。脱水素酵素は精製されたものであっても、粗精製されたものであってもよい。あるいは、大腸菌等の菌体に発現させ、その菌体自体を用いても、培養液を用いてもよい。さらには、該酵素は遊離型のものでもよく、各種担体によって固定化されたものでもよい。
　脱水素反応は、適当な緩衝液（例えば、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、ホウ酸緩衝液等）中で、基質である13-hydroxy脂肪酸、10-hydroxy脂肪酸、15-hydroxy脂肪酸、12-hydroxy脂肪酸、14-ヒドロキシ-シス-4,シス-7,シス-10,シス-16,シス-19-ドコサペンタエン酸、10-ヒドロキシ-テトラデカン酸と脱水素酵素とを適当な濃度で混合し、インキュベートすることにより行われ得る。基質濃度は、例えば0.01～100g/L、好ましくは0.05～50g/L、より好ましくは0.1～5g/Lである。脱水素酵素の添加量は、例えば、0.001～10mg/mL、好ましくは0.005～1mg/mL、より好ましくは0.05～0.2mg/mLである。
　脱水素反応には「補因子」を用いてよく、例えば、NAD＋やNADP＋等を用いることができる。その添加濃度は酸化反応が効率良く進む濃度であればよい。好ましくは0.001～20mM、より好ましくは0.01～10mMである。
　脱水素反応は、脱水素酵素の好適温度、好適ｐＨの範囲内で行うことが望ましい。例えば、反応温度は５～５０℃、好ましくは２０～４５℃である。また、反応液のｐＨとしては、例えば、ｐＨ４～１０、好ましくはｐＨ５～９である。反応時間も特に制限はないが、例えば１０分～７２時間、好ましくは３０分～３６時間である。
　本発明の一実施態様においては、脱水素酵素は、それをコードする核酸を含む発現ベクターが導入された組換え細胞（例えば、大腸菌、枯草菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞等）の形態で反応系に提供される。この場合、当該細胞の培養に適した液体培地に、基質及び必要に応じて補因子や活性化剤を添加して、当該細胞を培養することにより、酸化反応を行うこともできる。
　また脱水素反応を、クロム酸を用いた化学的酸化に置き換えることにより、化学的に酵素反応と同様のオキソ脂肪酸を得られることができる。
　化学的酸化としては、自体公知の方法、例えばクロム酸酸化、好ましくはジョーンズ酸化等が挙げられる。クロム酸としては、無水クロム酸CrO3、クロム酸H2CrO4、二クロム酸H2Cr2O7といった化合物の塩や錯体を使用することができる。具体的には、無水クロム酸2.67 gに硫酸 2.3 ml、水7.7 mlを加えた物を、アセトンを90 ml加えてクロム酸溶液を作成する。三角フラスコに、2 gの水酸化脂肪酸と、40 mlのアセトンを加え、氷上にてスターラーで撹拌しながら上記のクロム酸溶液を１滴ずつ加える。溶液が青色から抹茶色になったらクロム酸溶液の滴下をやめ、イソプロピルアルコールを用いて反応を停止する。析出した沈殿をろ紙を用いて濾過し、分液ロートに入れさらにジエチルエーテルを150 ml及びミリQ水300 mlを加えてよく振り、ジエチルエーテル層を数回ミリQ水で洗浄する。洗浄後のジエチルエーテル層に硫酸ナトリウム（無水）を適量加えて撹拌し残存水分を除去する。添加した無水硫酸ナトリウムをろ紙を用いてろ過し、得られたジエチルエーテル層をロータリーエバポレーターにて濃縮し、反応産物(オキソ脂肪酸)及び未反応の基質を抽出する。
　無水クロム酸による酸化反応により得られた抽出物(基質と生成物（オキソ脂肪酸）を含む混合物) を中圧クロマトグラフィーに供し、カラムから出てきた溶液をフラクションに分けて回収する。回収した各フラクションをLC/MS及びガスクロマトグラフィーにより分析し、オキソ脂肪酸のみが含まれたフラクションを集めてロータリーエバポレーターにて濃縮する。得られた最終生成物の一部を用いてメチルエステル化した後に、ガスクロマトグラフィーにてオキソ脂肪酸の純度を評価し、純度98%以上のオキソ脂肪酸を得ることができる。
　本発明の希少脂肪酸を含む代謝改善剤は、生活習慣病の改善に適用することもできる。「生活習慣病」とは、食習慣、運動習慣、休養、喫煙、飲酒等の生活習慣がその発症、進行に関与する疾患群をいい、成人肥満、小児肥満、栄養失調症、拒食症、胃がん、大腸がん、痛風、高血圧、動脈硬化症、腎臓結石、心筋梗塞、狭心症、胃潰瘍、腎臓病、骨粗しょう症、歯周囲炎、アルコール性肝炎、肝硬変、肝臓がん、肺がん、気管支炎、肺気腫、歯周病、脳卒中、脳梗塞、動脈瘤、過労死、不眠症等の病態が挙げられる。
　さらに、本発明の代謝改善剤は、糖尿病（１型糖尿病、２型糖尿病、妊婦糖尿病等）、糖尿病合併症（動脈硬化性疾患、糖尿病性網膜症、糖尿病性腎症、糖尿病性神経障害等）、脂質代謝異常、高脂血症、高コレステロール血症、高トリグリセリド血症、インスリン抵抗性、脂肪肝の予防又は改善に使用することもできる。
　あるいは、ヒト、又はヒト以外の動物（例えば、イヌ、ネコ、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、ブタ、ウシ、ニワトリ、インコ、九官鳥、ヤギ、ウマ、ヒツジ、サル等）に本発明の代謝改善剤を投与し、肥満、糖尿病、脂質代謝異常、高脂血症、高コレステロール血症、高トリグリセリド血症、インスリン抵抗性、脂肪肝からなる群から選択される少なくとも１種を予防又は治療するために、使用することができる。
　また、本発明の希少脂肪酸は、PPAR活性の促進剤としても使用することができる。PPAR には、少なくとも３種類のサブタイプPPARα、PPARδ（βと同一）、PPARγが存在している。後述する実施例の通り、本発明の希少脂肪酸は、PPARα、PPARγに対してアゴニスト活性を有した。従って、これらPPARのうち、少なくとも１種以上のPPAR(好ましくはPPARαまたはPPARγ)に対し、リガンド（アゴニスト、アンタゴニスト）活性の有無を確認し、アゴニスト活性を示す場合、代謝改善するためのPPAR活性の促進剤として使用することができる。
　本発明の希少脂肪酸を含む代謝改善剤（またはPPAR活性促進剤）は、例えば、医薬品、食品、飼料、化粧品等として、あるいはそれらに配合して使用することができる。
　当該医薬品の剤型としては、散剤、顆粒剤、丸剤、ソフトカプセル、ハードカプセル、錠剤、チュアブル錠、速崩錠、シロップ、液剤、懸濁剤、座剤、軟膏、クリーム剤、ゲル剤、粘付剤、吸入剤、注射剤等が挙げられる。これらの製剤は常法に従って調製されるが、水酸化脂肪酸等は水に難溶性であるため、植物性油、動物性油等の非親水性有機溶媒に溶解するか又は、乳化剤、分散剤もしくは界面活性剤等とともに、ホモジナイザー（高圧ホモジナイザー）を用いて水溶液中に分散、乳化させて用いる。
　製剤化のために用いることができる添加剤には、例えば大豆油、サフラー油、オリーブ油、胚芽油、ひまわり油、牛脂、いわし油等の動植物性油、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン、ソルビトール等の多価アルコール、ソルビタン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、ポリグリセリン脂肪酸エステル等の界面活性剤、精製水、乳糖、デンプン、結晶セルロース、Ｄ－マンニトール、レシチン、アラビアガム、ソルビトール液、糖液等の賦形剤、甘味料、着色料、ｐＨ調整剤、香料等を挙げることができる。なお、液体製剤は、服用時に水又は他の適当な媒体に溶解又は懸濁する形であってもよい。また、錠剤、顆粒剤は周知の方法でコーティングしても良い。
　注射剤の形で投与する場合には、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、経皮、関節内、滑液嚢内、胞膜内、骨膜内、舌下、口腔内等に投与することが好ましく、特に静脈内投与又は腹腔内投与が好ましい。静脈内投与は、点滴投与、ボーラス投与のいずれであってもよい。
　本発明の代謝改善剤を食品もしくは食品添加物として使用する場合、当該食品は、溶液、懸濁物、粉末、固体成形物等、経口摂取可能な形態であればよく、特に限定するものではない。具体例としては、サプリメント（散剤、顆粒剤、ソフトカプセル、ハードカプセル、錠剤、チュアブル錠、速崩錠、シロップ、液剤等）、飲料（炭酸飲料、乳酸飲料、スポーツ飲料、果汁飲料、野菜飲料、豆乳飲料、コーヒー飲料、茶飲料、粉末飲料、濃縮飲料、栄養飲料、アルコール飲料等）、菓子（グミ、ゼリー、ガム、チョコレート、クッキー、キャンデー、キャラメル、和菓子、スナック菓子等）、即席食品類（即席麺、レトルト食品、缶詰、電子レンジ食品、即席スープ・みそ汁類、フリーズドライ食品等）、油、油脂食品（マヨネーズ、ドレッシング、バター、クリーム、マーガリン等）、小麦粉製品（パン、パスタ、麺、ケーキミックス、パン粉等）、調味料（ソース、トマト加工調味料、風味調味料、調理ミックス、つゆ類等）、畜産加工品（畜肉ハム・ソーセージ等）が挙げられる。
　上記食品には、必要に応じて各種栄養素、各種ビタミン類（ビタミンA、ビタミンB1、ビタミンB2、ビタミンB6、ビタミンC、ビタミンD、ビタミンE、ビタミンK等）、各種ミネラル類（マグネシウム、亜鉛、鉄、ナトリウム、カリウム、セレン等）、食物繊維、分散剤、乳化剤等の安定剤、甘味料、呈味成分（クエン酸、リンゴ酸等）、フレーバー、ローヤルゼリー、プロポリス、アガリクス等を配合することができる。
　本発明の代謝改善剤を飼料もしくは飼料添加物として使用する場合、当該飼料としては、ペットフード、畜産又は水産養殖飼料添加物等が挙げられる。
　本発明の代謝改善剤を化粧品もしくは化粧品添加物として使用する場合、当該化粧品としては、クリーム、ゲル、乳液、美容液、ローション、マイクロエマルジョンエッセンス、パック、ファンデーション、口紅、アイシャドー、シャンプー、コンディショナー、入浴剤等が挙げられ、香料等を混合してもよい。
　本発明の医薬品、食品、飼料、化粧品等に配合される水酸化脂肪酸及びオキソ脂肪酸は、1種類のみであってもよいし、2種以上を組み合わせて用いてもよい。
　本発明の医薬品の投与量又は本発明の食品の摂取量は、患者又は摂取者の年齢及び体重、症状、投与時間、剤型、投与方法、薬剤の組み合わせ等に依存して適宜決定できる。例えば、本発明の医薬品を経口投与する場合、有効成分である水酸化脂肪酸等の総量として、成人1日当たり0.02～100mg／kg体重、好ましくは0.2～50mg／kg体重の範囲で、また、非経口的に投与する場合は0.002mg～50mg／kg体重、好ましくは0.02～50mg／kg体重の範囲で、一日1回もしくは数回（2～5回）に分けて投与することができる。また、食品として摂取する場合には、有効成分である水酸化脂肪酸等の総量が、成人1人1日当たり1～6000mgの範囲、好ましくは10～3000mgの範囲の摂取量となるように、食品に配合することができる。本発明の飼料の摂取量及び本発明の化粧品の使用量についても、それぞれ上記食品の摂取量及び上記医薬品の投与量に準じて適宜決定することができる。
　以下の実施例により本発明をより具体的に説明するが、実施例は本発明の単なる例示にすぎず、本発明の範囲を何ら限定するものではない。
　本発明で使用した(1) 13-ヒドロキシ-シス-9-オクタデセン酸（「13-OH LA」と示す）、(2) 13-オキソ-シス-9-オクタデセン酸（「13-OXO LA」と示す）、(3) 10,13-ジヒドロキシ-オクタデカン酸（「10,13-OH LA」と示す）、(4) 13-ヒドロキシ-シス-9,シス-15-オクタデカジエン酸（「13-OH ALA」と示す）、(5) 13-オキソ-シス-9,シス-15-オクタデカジエン酸（「13-OXO ALA」と示す）、(6) 10,13-ジヒドロキシ-シス-15-オクタデセン酸（「10,13-OH ALA」と示す）(7) 13-ヒドロキシ-シス-6,シス-9-オクタデカジエン酸（「13-OH GLA」と示す）、(8) 13-オキソ-シス-6,シス-9-オクタデカジエン酸（「13-OXO GLA」と示す）、(9) 10,13-ジヒドロキシ-シス-6-オクタデセン酸（「10,13-OH GLA」と示す）、(10) 15-ヒドロキシ-シス-5,シス-8,シス-11-エイコサトリエン酸（「15-OH AA」と示す）等の水酸化脂肪酸及びオキソ脂肪酸等は、上記方法に基づき調製した。(1)－(10)の構造式と由来の脂肪酸について図１に示す。GW7647（PPARαアゴニスト）、Troglitazone（PPARγアゴニスト）は、シグマ－アルドリッチから、その他の試薬は和光純薬又はナカライテスク等から購入した。
（実施例１）PPARα、γリガンド活性の測定
　水酸化脂肪酸及びオキソ脂肪酸等の機能を評価するため、PPARα、γの活性化能を測定した。当該測定はNobuyuki Takahashiら、FEBS Letters 514 (2002) p315-322、「Dual action of isoprenols from herbal medicines on both PPARgamma and PPARalpha in 3T3-L1 adipocytes and HepG2 hepatocytes.」のMaterial and methods Reporter plasmids and luciferase assaysの欄を参照して行った。詳細には、PPARα，γリガンド活性は、PPARリガンド結合領域とGAL4 DNA結合領域との融合タンパクに対する結合および標的遺伝子活性化をルシフェラーゼの発現で評価するレポーター・アッセイにより測定した。具体的には、CV-1細胞に、PPARα，γリガンド結合領域とGAL4 DNA結合領域の融合タンパク質をコードするDNAを含むプラスミドと、GAL4結合DNA配列にルシフェラーゼをつないだレポータープラスミドを導入し、この細胞に、以下に記載のリガンドを添加して、インキュベートした後にルシフェラーゼ活性の検出を行った。
　サンプルはエタノールを用いて濃度調整（10μM及び30μM）を行った。陰性コントロールにはエタノール、陽性対照にはPPARα，γリガンド剤　GW7647(10nM)、troglitazone（5μM）をそれぞれ用いた。結果を図２、図３に示す。
　図２、３から、(1)－(10)の脂肪酸全てにおいてPPARα及びγアゴニスト活性が認められた。(8)13-OXO GLAは強いPPARαアゴニスト活性が、(5)13-OXO ALAは強いPPARγアゴニスト活性が認められた。
　本発明を好ましい態様を強調して説明してきたが、好ましい態様が変更され得ることは当業者にとって自明である。
　ここで述べられた特許及び特許出願明細書を含む全ての刊行物に記載された内容は、ここに引用されたことによって、その全てが明示されたと同程度に本明細書に組み込まれるものである。
　本発明は、水酸化脂肪酸等の生理機能として、従来知られていない、脂質及び／又は糖及び／又はエネルギー代謝改善効果を有することを明らかにした。当該水酸化脂肪酸及び／又はオキソ脂肪酸等を含む脂質及び／又は糖及び／又はエネルギー代謝改善剤は、医薬品、食品、飼料等様々な分野へ適用可能であり、本発明は産業上極めて有用である。
　本出願は、日本で出願された特願２０１４－０１１８７１（出願日：平成２６年１月２４日）を基礎としており、その内容はすべて本明細書に包含されるものとする。
[規則26に基づく補充 06.03.2015]　
Figure WO-DOC-FIGURE-RO134

Claims (21)

  1. 　以下の脂肪酸を含む、代謝改善剤：
    （１）13位に水酸基またはカルボニル基を有する炭素数18の脂肪酸、
    （２）15位に水酸基またはカルボニル基を有する炭素数20の脂肪酸、
    （３）12位に水酸基またはカルボニル基を有する炭素数20の脂肪酸、または
    （４）10位に水酸基またはカルボニル基を有する炭素数16の脂肪酸。
  2. 　以下の脂肪酸を含む、請求項１に記載の剤：
    （１）13位に水酸基もしくはカルボニル基を有する炭素数18の飽和脂肪酸または6位、9位、15位に少なくとも１つのシス型二重結合を有する不飽和脂肪酸、
    （２）15位に水酸基またはカルボニル基を有する炭素数20の5位、8位、11位、17位に少なくとも１つのシス型二重結合を有する不飽和脂肪酸、
    （３）12位に水酸基もしくはカルボニル基を有する炭素数20の飽和脂肪酸または5位、8位、14位、17位に少なくとも１つのシス型二重結合を有する不飽和脂肪酸、または
    （４）10位に水酸基またはカルボニル基を有する炭素数16の飽和脂肪酸。
  3. 　以下の脂肪酸を含む、請求項２に記載の剤：
    （１）13位に水酸基もしくはカルボニル基を有する炭素数18の飽和脂肪酸または6位、9位、15位に少なくとも１つのシス型二重結合を有する不飽和脂肪酸、または
    （２）15位に水酸基もしくはカルボニル基を有する炭素数20の5位、8位、11位、17位に少なくとも１つのシス型二重結合を有する不飽和脂肪酸。
  4. 　以下の脂肪酸を含む、請求項２に記載の剤：
    （１）13位に水酸基もしくはカルボニル基を有する炭素数18の飽和脂肪酸または6位、9位、15位に少なくとも１つのシス型二重結合を有する不飽和脂肪酸が、13-ヒドロキシ-シス-9-オクタデセン酸、13-ヒドロキシ-シス-6,シス-9-オクタデカジエン酸、13-ヒドロキシ-シス-9,シス-15-オクタデカジエン酸、13-ヒドロキシ-シス-6,シス-9,シス-15-オクタデカトリエン酸、10,13-ジヒドロキシ-オクタデカン酸、10,13-ジヒドロキシ-シス-6-オクタデセン酸、10,13-ジヒドロキシ-シス-15-オクタデセン酸、10,13-ジヒドロキシ-シス-6,シス-15-オクタデカジエン酸、10-オキソ-13-ヒドロキシ-オクタデカン酸、10-オキソ-13-ヒドロキシ-シス-6-オクタデセン酸、10-オキソ-13-ヒドロキシ-シス-15-オクタデセン酸、10-オキソ-13-ヒドロキシ-シス-6,シス-15-オクタデカジエン酸、13-ヒドロキシ-シス-5,シス-9-オクタデカジエン酸、13-ヒドロキシ-トランス-5,シス-9-オクタデカジエン酸、13-オキソ-シス-9-オクタデセン酸、13-オキソ-シス-6,シス-9-オクタデカジエン酸、13-オキソ-シス-9,シス-15-オクタデカジエン酸、13-オキソ-シス-6,シス-9,シス-15-オクタデカトリエン酸、10,13-ジオキソ-オクタデカン酸、10,13-ジオキソ-シス-6-オクタデセン酸、10,13-ジオキソ-シス-15-オクタデセン酸、10,13-ジオキソ-シス-6,シス-15-オクタデカジエン酸、13-オキソ-シス-5,シス-9-オクタデカジエン酸または13-オキソ-トランス-5,シス-9-オクタデカジエン酸、
    （２）15位に水酸基またはカルボニル基を有する炭素数20の5位、8位、11位、17位に少なくとも１つのシス型二重結合を有する不飽和脂肪酸が、15-ヒドロキシ-シス-11-エイコセン酸、15-ヒドロキシ-シス-11,シス-17-エイコサジエン酸、15-ヒドロキシ-シス-8,シス-11-エイコサジエン酸、15-ヒドロキシ-シス-5,シス-8,シス-11-エイコサトリエン酸、15-ヒドロキシ-シス-8,シス-11,シス-17-エイコサトリエン酸、15-ヒドロキシ-シス-5,シス-11-エイコサジエン酸、15-ヒドロキシ-シス-5,シス-11,シス-17-エイコサトリエン酸、15-オキソ-シス-11-エイコセン酸、15-オキソ-シス-11,シス-17-エイコサジエン酸、15-オキソ-シス-8,シス-11-エイコサジエン酸、15-オキソ-シス-5,シス-8,シス-11-エイコサトリエン酸、15-オキソ-シス-8,シス-11,シス-17-エイコサトリエン酸、15-オキソ-シス-5,シス-11-エイコサジエン酸または15-オキソ-シス-5,シス-11,シス-17-エイコサトリエン酸、
    （３）12位に水酸基もしくはカルボニル基を有する炭素数20の飽和脂肪酸または5位、8位、14位、17位に少なくとも１つのシス型二重結合を有する不飽和脂肪酸が、12-ヒドロキシ-シス-14-エイコセン酸、12-ヒドロキシ-シス-14,シス-17-エイコサジエン酸、12-ヒドロキシ-シス-8,シス-14-エイコサジエン酸、12-ヒドロキシ-シス-5,シス-8-エイコサジエン酸、12-ヒドロキシ-シス-8,シス-14,シス-17-エイコサトリエン酸、12-ヒドロキシ-シス-5,シス-8,シス-14-エイコサトリエン酸、12-オキソ-シス-14-エイコセン酸、12-オキソ-シス-14,シス-17-エイコサジエン酸、12-オキソ-シス-8,シス-14-エイコサジエン酸、12-オキソ-シス-5,シス-8-エイコサジエン酸、12-オキソ-シス-8,シス-14,シス-17-エイコサトリエン酸、または12-オキソ-シス-5,シス-8,シス-14-エイコサトリエン酸、
    （４）10位に水酸基またはカルボニル基を有する炭素数16の飽和脂肪酸が、10-ヒドロキシ-ヘキサデカン酸または10-オキソ-ヘキサデカン酸。
  5. 　以下の脂肪酸を含む、請求項３に記載の剤：
    （１）13位に水酸基もしくはカルボニル基を有する炭素数18の飽和脂肪酸または6位、9位、15位に少なくとも１つのシス型二重結合を有する不飽和脂肪酸が、13-ヒドロキシ-シス-9-オクタデセン酸、13-ヒドロキシ-シス-6,シス-9-オクタデカジエン酸、13-ヒドロキシ-シス-9,シス-15-オクタデカジエン酸、10,13-ジヒドロキシ-オクタデカン酸、10,13-ジヒドロキシ-シス-6-オクタデセン酸、10,13-ジヒドロキシ-シス-15-オクタデセン酸、13-オキソ-シス-9-オクタデセン酸、13-オキソ-シス-6,シス-9-オクタデカジエン酸、または13-オキソ-シス-9,シス-15-オクタデカジエン酸、
    （２）15位に水酸基またはカルボニル基を有する炭素数20の5位、8位、11位、17位に少なくとも１つのシス型二重結合を有する不飽和脂肪酸が、15-ヒドロキシ-シス-5,シス-8,シス-11-エイコサトリエン酸。
  6. 　肥満、糖尿病、脂質代謝異常、高脂血症、及び脂肪肝からなる群から選択される少なくとも１種の予防又は改善に使用される請求項１－５のいずれか１項に記載の剤。
  7. 　食品もしくは食品添加物である、請求項１－５のいずれか１項に記載の剤。
  8. 　医薬品である、請求項１－５のいずれか１項に記載の剤。
  9. 　飼料もしくは飼料添加物である、請求項１－５のいずれか１項に記載の剤。
  10. 　以下の脂肪酸を含む、PPAR活性促進剤：
    （１）13位に水酸基またはカルボニル基を有する炭素数18の脂肪酸、
    （２）15位に水酸基またはカルボニル基を有する炭素数20の脂肪酸、
    （３）12位に水酸基またはカルボニル基を有する炭素数20の脂肪酸、または
    （４）10位に水酸基またはカルボニル基を有する炭素数16の脂肪酸。
  11. 　以下の脂肪酸を含む、請求項１０に記載の剤：
    （１）13位に水酸基もしくはカルボニル基を有する炭素数18の飽和脂肪酸または6位、9位、15位に少なくとも１つのシス型二重結合を有する不飽和脂肪酸、
    （２）15位に水酸基またはカルボニル基を有する炭素数20の5位、8位、11位、17位に少なくとも１つのシス型二重結合を有する不飽和脂肪酸、
    （３）12位に水酸基もしくはカルボニル基を有する炭素数20の飽和脂肪酸または5位、8位、14位、17位に少なくとも１つのシス型二重結合を有する不飽和脂肪酸、または
    （４）10位に水酸基またはカルボニル基を有する炭素数16の飽和脂肪酸。
  12. 　以下の脂肪酸を含む、請求項１１に記載の剤：
    （１）13位に水酸基もしくはカルボニル基を有する炭素数18の飽和脂肪酸または6位、9位、15位に少なくとも１つのシス型二重結合を有する不飽和脂肪酸、または
    （２）15位に水酸基もしくはカルボニル基を有する炭素数20の5位、8位、11位、17位に少なくとも１つのシス型二重結合を有する不飽和脂肪酸。
  13. 　以下の脂肪酸を含む、請求項１１に記載の剤：
    （１）13位に水酸基もしくはカルボニル基を有する炭素数18の飽和脂肪酸または6位、9位、15位に少なくとも１つのシス型二重結合を有する不飽和脂肪酸が、13-ヒドロキシ-シス-9-オクタデセン酸、13-ヒドロキシ-シス-6,シス-9-オクタデカジエン酸、13-ヒドロキシ-シス-9,シス-15-オクタデカジエン酸、13-ヒドロキシ-シス-6,シス-9,シス-15-オクタデカトリエン酸、10,13-ジヒドロキシ-オクタデカン酸、10,13-ジヒドロキシ-シス-6-オクタデセン酸、10,13-ジヒドロキシ-シス-15-オクタデセン酸、10,13-ジヒドロキシ-シス-6,シス-15-オクタデカジエン酸、10-オキソ-13-ヒドロキシ-オクタデカン酸、10-オキソ-13-ヒドロキシ-シス-6-オクタデセン酸、10-オキソ-13-ヒドロキシ-シス-15-オクタデセン酸、10-オキソ-13-ヒドロキシ-シス-6,シス-15-オクタデカジエン酸、13-ヒドロキシ-シス-5,シス-9-オクタデカジエン酸、13-ヒドロキシ-トランス-5,シス-9-オクタデカジエン酸、13-オキソ-シス-9-オクタデセン酸、13-オキソ-シス-6,シス-9-オクタデカジエン酸、13-オキソ-シス-9,シス-15-オクタデカジエン酸、13-オキソ-シス-6,シス-9,シス-15-オクタデカトリエン酸、10,13-ジオキソ-オクタデカン酸、10,13-ジオキソ-シス-6-オクタデセン酸、10,13-ジオキソ-シス-15-オクタデセン酸、10,13-ジオキソ-シス-6,シス-15-オクタデカジエン酸、13-オキソ-シス-5,シス-9-オクタデカジエン酸または13-オキソ-トランス-5,シス-9-オクタデカジエン酸、
    （２）15位に水酸基またはカルボニル基を有する炭素数20の5位、8位、11位、17位に少なくとも１つのシス型二重結合を有する不飽和脂肪酸が、15-ヒドロキシ-シス-11-エイコセン酸、15-ヒドロキシ-シス-11,シス-17-エイコサジエン酸、15-ヒドロキシ-シス-8,シス-11-エイコサジエン酸、15-ヒドロキシ-シス-5,シス-8,シス-11-エイコサトリエン酸、15-ヒドロキシ-シス-8,シス-11,シス-17-エイコサトリエン酸、15-ヒドロキシ-シス-5,シス-11-エイコサジエン酸、15-ヒドロキシ-シス-5,シス-11,シス-17-エイコサトリエン酸、15-オキソ-シス-11-エイコセン酸、15-オキソ-シス-11,シス-17-エイコサジエン酸、15-オキソ-シス-8,シス-11-エイコサジエン酸、15-オキソ-シス-5,シス-8,シス-11-エイコサトリエン酸または15-オキソ-シス-8,シス-11,シス-17-エイコサトリエン酸、15-オキソ-シス-5,シス-11-エイコサジエン酸または15-オキソ-シス-5,シス-11,シス-17-エイコサトリエン酸、
    （３）12位に水酸基もしくはカルボニル基を有する炭素数20の飽和脂肪酸または5位、8位、14位、17位に少なくとも１つのシス型二重結合を有する不飽和脂肪酸が、12-ヒドロキシ-シス-14-エイコセン酸、12-ヒドロキシ-シス-14,シス-17-エイコサジエン酸、12-ヒドロキシ-シス-8,シス-14-エイコサジエン酸、12-ヒドロキシ-シス-5,シス-8-エイコサジエン酸、12-ヒドロキシ-シス-8,シス-14,シス-17-エイコサトリエン酸、12-ヒドロキシ-シス-5,シス-8,シス-14-エイコサトリエン酸、12-オキソ-シス-14-エイコセン酸、12-オキソ-シス-14,シス-17-エイコサジエン酸、12-オキソ-シス-8,シス-14-エイコサジエン酸、12-オキソ-シス-5,シス-8-エイコサジエン酸、12-オキソ-シス-8,シス-14,シス-17-エイコサトリエン酸、または12-オキソ-シス-5,シス-8,シス-14-エイコサトリエン酸、
    （４）10位に水酸基またはカルボニル基を有する炭素数16の飽和脂肪酸が、10-ヒドロキシ-ヘキサデカン酸または10-オキソ-ヘキサデカン酸。
  14. 　以下の脂肪酸を含む、請求項１２に記載の剤：
    （１）13位に水酸基もしくはカルボニル基を有する炭素数18の飽和脂肪酸または6位、9位、15位に少なくとも１つのシス型二重結合を有する不飽和脂肪酸が、13-ヒドロキシ-シス-9-オクタデセン酸、13-ヒドロキシ-シス-6,シス-9-オクタデカジエン酸、13-ヒドロキシ-シス-9,シス-15-オクタデカジエン酸、10,13-ジヒドロキシ-オクタデカン酸、10,13-ジヒドロキシ-シス-6-オクタデセン酸、10,13-ジヒドロキシ-シス-15-オクタデセン酸、13-オキソ-シス-9-オクタデセン酸、13-オキソ-シス-6,シス-9-オクタデカジエン酸、または13-オキソ-シス-9,シス-15-オクタデカジエン酸、
    （２）15位に水酸基もしくはカルボニル基を有する炭素数20の5位、8位、11位、17位に少なくとも１つのシス型二重結合を有する不飽和脂肪酸が、15-ヒドロキシ-シス-5,シス-8,シス-11-エイコサトリエン酸。
  15. 　PPARがPPARαまたはPPARγである、請求項１０―１４のいずれか１項に記載の剤。
  16. 　請求項１～５のいずれか１項に記載の脂肪酸の有効量を患者に投与することを含む、代謝に関わる疾患の予防または治療方法。
  17. 　代謝に関わる疾患が肥満、糖尿病、脂質代謝異常、高脂血症、及び脂肪肝からなる群から選択される少なくとも１種である、請求項１６に記載の方法。
  18. 　代謝に関わる疾患の予防または治療に使用するための、請求項１～５のいずれか１項に記載の脂肪酸。
  19. 　代謝に関わる疾患が肥満、糖尿病、脂質代謝異常、高脂血症、及び脂肪肝からなる群から選択される少なくとも１種である、請求項１８に記載の脂肪酸。
  20. 　代謝に関わる疾患の予防または治療剤を製造するための、請求項１～５のいずれか１項に記載の脂肪酸の使用。
  21. 　代謝に関わる疾患が肥満、糖尿病、脂質代謝異常、高脂血症、及び脂肪肝からなる群から選択される少なくとも１種である、請求項２０に記載の使用。
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