WO2015115656A1 - 抗Ｔｉｓｓｕｅ Ｆａｃｔｏｒモノクローナル抗体 - Google Patents

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遼 津村
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西山　伸宏
三浦　裕
眞鍋　史乃
加藤　泰己
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University of Tokyo NUC
National Cancer Center Japan
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    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Definitions

  • the present invention relates to an anti-Tissue Factor monoclonal antibody and a pharmaceutical composition using the antibody.
  • Tissue Factor (hereinafter sometimes referred to as “TF”) is an initiation factor of extrinsic coagulation, and its production is promoted by vascular injury or the like. TF expression in normal responses is local and transient. However, in many solid cancers such as pancreatic cancer and gastric cancer, it is known that TF is constantly up-regulated on the surface of cancer cells, vascular endothelial cells, monocytes, macrophages and the like in tumor tissues. Yes.
  • One of the objects of the present invention is to provide a novel antibody against TF.
  • Another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition using the antibody as a target binding factor.
  • the inventors of the present application have discovered a novel anti-TF monoclonal antibody having the ability to internalize cells, and by using the antibody as a target binding factor, the drug has high selectivity for cells expressing TF on the surface. And the present invention has been completed.
  • the following monoclonal antibody that binds to Tissue Factor is provided.
  • a heavy chain variable region having complementarity determining regions 1, 2 and 3 comprising the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 3, 4 and 5, respectively, and complementation comprising amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 6, 7 and 8, respectively.
  • An anti-human Tissue Factor monoclonal antibody comprising a light chain variable region having sex determining regions 1, 2 and 3;
  • a heavy chain variable region having complementarity determining regions 1, 2 and 3 comprising the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 11, 12 and 13, respectively, and complementation comprising the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 14, 15 and 16, respectively.
  • a monoclonal antibody that binds to the same epitope as the Tissue Factor epitope to which the monoclonal antibody binds.
  • a fragment of an antibody comprising a part of the above monoclonal antibody and capable of binding to Tissue Factor.
  • a pharmaceutical composition comprising the monoclonal antibody or antibody fragment as a target binding agent and a drug.
  • a composition for drug delivery comprising the above monoclonal antibody or antibody fragment as a target binding agent.
  • the monoclonal antibody of the present invention can recognize a cell expressing TF and have an internalization ability for the cell. Therefore, the drug can be efficiently delivered to the cells by using the antibody as a target binding factor.
  • a monoclonal antibody that binds to TF is provided.
  • the monoclonal antibody of the present invention typically can bind to TF and has the ability to internalize cells expressing TF.
  • TF is a factor III of blood coagulation and is expressed on the cell surface as a transmembrane glycoprotein.
  • TF is preferably human TF (hTF).
  • the full length amino acid sequence of hTF is already known as GenBank ACCESSION_AAA61152 (SEQ ID NO: 1).
  • the present invention also provides a monoclonal antibody against mouse TF (mTF). Utilizing an anti-mTF monoclonal antibody as a drug target binding factor can be effective in tests and studies using mice.
  • the full length amino acid sequence of mTF is already known as GenBank ACCESSION_AAA63400 (SEQ ID NO: 2).
  • internalization means a phenomenon in which an antibody forms an immune complex with an antigen on the cell surface and then is taken into the cell. Whether or not the anti-TF monoclonal antibody has an internalization ability is determined by, for example, contacting an antibody bound with a labeling substance with a cell expressing TF on the surface and transferring the labeling substance into the cell. To determine whether cell death or cell growth inhibition is induced when an antibody bound with a cytotoxic substance is brought into contact with a cell expressing TF on the surface. Can do. More specifically, the presence or absence of the antibody's internalization ability can be confirmed by the internalization assay described in the Examples.
  • any appropriate cell can be used as the cell expressing TF on the surface, and examples thereof include cells in tumor tissue.
  • the expression of TF in normal tissue is usually local and transient expression, whereas the expression of TF is on the cell surface of cancer cells, vascular endothelial cells, monocytes, macrophages and the like in the tumor tissue. Constantly increased.
  • cancer cells include pancreatic cancer cells and gastric cancer cells.
  • a monoclonal antibody is an antibody produced by a single clone of antibody-producing cells. Monoclonal antibodies have a uniform primary structure and recognize the same epitope.
  • the monoclonal antibody of the present invention has a basic structure consisting of a tetramer in which two homologous heavy chains and two homologous light chains are linked by a disulfide bond.
  • the anti-TF monoclonal antibody of the present invention may be any isotype of IgG, IgA, IgM, IgD or IgE, and is preferably IgG.
  • the epitope recognized by the anti-TF monoclonal antibody of the present invention is preferably present in the extracellular region of TF.
  • the dissociation constant (KD) for TF of the anti-TF monoclonal antibody of the present invention reaches, for example, 5 ⁇ 10 ⁇ 9 M or less, further 1 ⁇ 10 ⁇ 9 M or less, particularly 2 ⁇ 10 ⁇ 10 M or less.
  • the dissociation constant can be measured using, for example, a surface plasmon resonance method.
  • the anti-TF monoclonal antibody of the present invention may or may not have an anticoagulant action.
  • the presence or absence of anticoagulant action or its degree can be determined by prothrombin time (PT).
  • PT prothrombin time
  • the coagulation extension time ratio (PBS relative ratio) in the state in which the antigen-antibody complex of the anti-TF monoclonal antibody of the present invention is formed is preferably 3 or less, more preferably 2 or less, and further preferably 1 to 1.5.
  • the coagulation extension time ratio in the state in which the antigen-antibody complex is formed can be determined by the method described in the Examples.
  • the anti-hTF monoclonal antibody of the present invention comprises a heavy chain variable region having complementarity determining regions (CDRs) 1, 2 and 3 comprising the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 3, 4 and 5, respectively. And a light chain variable region having CDRs 1, 2 and 3 comprising the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 6, 7 and 8, respectively.
  • CDRs complementarity determining regions
  • a specific example thereof is preferably an anti-hTF monoclonal antibody comprising a heavy chain variable region comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 9 and a light chain variable region comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 10. .
  • an anti-hTF monoclonal antibody of the invention comprises a heavy chain variable region having CDRs 1, 2 and 3 comprising the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 11, 12, and 13, respectively, and SEQ ID NO: 14, Light chain variable regions having CDRs 1, 2 and 3 comprising the amino acid sequences set forth in 15 and 16.
  • a specific example thereof is preferably an anti-hTF monoclonal antibody comprising a heavy chain variable region comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 17 and a light chain variable region comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 18. .
  • a variant of each monoclonal antibody exemplified in the first or second embodiment may also be included in the anti-hTF monoclonal antibody of the present invention.
  • examples of such variants include substitution, insertion, addition and / or substitution of one or several (for example, 1 to 10, preferably 1 to 5) amino acids in the heavy chain variable region and / or the light chain variable region.
  • a monoclonal antibody containing a deletion can be mentioned.
  • Such a variant can also suitably bind to hTF and have the ability to internalize cells expressing hTF.
  • the modified monoclonal antibody include a heavy chain comprising an amino acid sequence which is preferably 90% or more, more preferably 95% or more, and further preferably 98% or more identical to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 9.
  • a monoclonal antibody comprising a variable region and a light chain variable region comprising an amino acid sequence that is preferably 90% or more, more preferably 95% or more, and even more preferably 98% or more identical to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 10 Is mentioned.
  • a heavy chain comprising an amino acid sequence which is preferably 90% or more, more preferably 95% or more, and further preferably 98% or more identical to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 17.
  • a monoclonal antibody comprising a variable region and a light chain variable region comprising an amino acid sequence that is preferably 90% or more, more preferably 95% or more, and even more preferably 98% or more identical to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 18 Is mentioned. These variants are preferably capable of binding to hTF and have the ability to internalize cells expressing hTF.
  • the variant of the monoclonal antibody is one or several, for example, 1, 2 or 3, preferably 1, or at least one CDR of the heavy chain variable region and / or light chain variable region of the corresponding monoclonal antibody. Two, more preferably one amino acid substitution, insertion, addition and / or deletion may be included.
  • Each CDR of the variant preferably has 90-100% homology with each CDR of the corresponding monoclonal antibody, more preferably 95-100%, even more preferably 98-100%, most preferably 100%. Have homology.
  • the entire CDR1-3 of the heavy chain and light chain of the variant preferably has 90-100% homology with the entire CDR1-3 of heavy chain and light chain of the corresponding monoclonal antibody, more preferably 95 ⁇ 100%, more preferably 98-100%, most preferably 100% homology.
  • the anti-hTF monoclonal antibody of the present invention may be a monoclonal antibody that binds to the same epitope as that of hTF to which the monoclonal antibody exemplified in the first or second embodiment binds.
  • Antibodies that bind to the same epitope can be obtained by known methods such as competitive ELISA.
  • the test antibody contains 30% or more compared to the binding activity of the control antibody (that is, the monoclonal antibody exemplified in the first or second embodiment) in the absence of the test antibody.
  • the test antibody can be said to be an antibody that binds to substantially the same epitope as the control antibody.
  • the antibody that binds to the same epitope is preferably capable of binding to hTF and has the ability to internalize cells expressing hTF.
  • the antibody that binds to the same epitope may be a variant of the monoclonal antibody exemplified in the first or second embodiment.
  • the anti-hTF monoclonal antibody of the present invention described above can be a human chimeric antibody or a humanized antibody.
  • a human chimeric antibody is an antibody in which a variable region of an antibody derived from a non-human mammal and a constant region of an antibody derived from a human are linked. Therefore, the human chimeric antibody of the present invention comprises the heavy chain variable region and the light chain variable region of the monoclonal antibody exemplified in the first, second or third embodiment, respectively, as the human heavy chain constant region and human light chain constant region, respectively. It may be a chimeric antibody obtained by linking to a normal region.
  • examples of the human chimeric antibody of the present invention include a heavy chain variable region and a light chain CDR1 comprising the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 3, 4, and 5 as heavy chain CDRs 1, 2, and 3, respectively.
  • examples of 2 and 3 include chimeric antibodies in which a light chain variable region comprising the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 6, 7 and 8 are linked to a human heavy chain constant region and a human light chain constant region, respectively.
  • Specific examples of the chimeric antibody include a heavy chain variable region comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 9 and a light chain variable region comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 10, respectively, as a human heavy chain constant region and human.
  • human chimeric antibody of the present invention includes a heavy chain variable region comprising the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 11, 12, and 13 as light chain CDRs 1, 2 and 3, and light chain CDRs 1, 2 and 3, respectively.
  • 3 includes chimeric antibodies in which a light chain variable region comprising the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 14, 15, and 16 are linked to a human heavy chain constant region and a human light chain constant region, respectively.
  • Specific examples of the chimeric antibody include a heavy chain variable region comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 17 and a light chain variable region comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 18, respectively.
  • the heavy chain constant region of the human chimeric antibody only needs to belong to human immunoglobulin (hereinafter referred to as hIg), and preferably belongs to the hIgG class.
  • hIg human immunoglobulin
  • the light chain constant region of the human chimeric antibody only needs to belong to hIg, and may be either ⁇ class or ⁇ class.
  • a humanized antibody is an antibody obtained by grafting a CDR of an antibody derived from a non-human mammal into an appropriate position of a variable region of a human-derived antibody. Therefore, the humanized antibody of the present invention has the heavy chain and light chain CDR1 to 3 of the monoclonal antibody exemplified in the first, second or third embodiment as the heavy chain and light chain CDR1 to 3.
  • the other region may be a human antibody derived from a human antibody.
  • humanized antibodies of the present invention include heavy chain CDRs 1, 2 and 3, respectively, comprising the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 3, 4, and 5, respectively, and light chain CDRs 1, 2, and 3, respectively.
  • the humanized antibody consisting of the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 6, 7 and 8 and other regions derived from human antibodies, and CDRs 1, 2 and 3 of the heavy chain are described in SEQ ID NOs: 11, 12 and 13, respectively.
  • humanized antibodies in which the light chain CDRs 1, 2 and 3 have the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 14, 15 and 16, respectively, and other regions are derived from human antibodies.
  • the heavy chain of a humanized antibody only needs to belong to hIg, and preferably belongs to the hIgG class.
  • the light chain of the humanized antibody only needs to belong to hIg, and may be either ⁇ class or ⁇ class.
  • an anti-mTF monoclonal antibody of the invention comprises a heavy chain variable region having CDRs 1, 2, and 3 comprising the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 19, 20, and 21, respectively, and SEQ ID NOs: 22, 23, respectively. And a light chain variable region having CDRs 1, 2 and 3 comprising the amino acid sequence described in 24.
  • a specific example thereof is preferably an anti-mTF monoclonal antibody comprising a heavy chain variable region comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 25 and a light chain variable region comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 26. .
  • the modified monoclonal antibody exemplified above can also be included in the anti-mTF monoclonal antibody of the present invention.
  • examples of such variants include substitution, insertion, addition and / or substitution of one or several (for example, 1 to 10, preferably 1 to 5) amino acids in the heavy chain variable region and / or the light chain variable region.
  • a monoclonal antibody containing a deletion can be mentioned.
  • Such a variant can also suitably bind to mTF and have the ability to internalize cells expressing mTF.
  • modified monoclonal antibody examples include a heavy chain comprising an amino acid sequence which is preferably 90% or more, more preferably 95% or more, and still more preferably 98% or more identical to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 25.
  • a monoclonal antibody comprising a variable region and a light chain variable region comprising an amino acid sequence that is preferably 90% or more, more preferably 95% or more, and even more preferably 98% or more identical to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 26 Is mentioned.
  • Such a variant preferably binds to mTF and has the ability to internalize cells expressing mTF.
  • the variant of the monoclonal antibody is one or several, for example, 1, 2 or 3, preferably 1, or at least one CDR of the heavy chain variable region and / or light chain variable region of the corresponding monoclonal antibody. Two, more preferably one amino acid substitution, insertion, addition and / or deletion may be included.
  • Each CDR of the variant preferably has 90-100% homology with each CDR of the corresponding monoclonal antibody, more preferably 95-100%, even more preferably 98-100%, most preferably 100%. Have homology.
  • the entire CDR1-3 of the heavy chain and light chain of the variant preferably has 90-100% homology with the entire CDR1-3 of heavy chain and light chain of the corresponding monoclonal antibody, more preferably 95 ⁇ 100%, more preferably 98-100%, most preferably 100% homology.
  • the anti-mTF monoclonal antibody of the present invention may be a monoclonal antibody that binds to the same epitope as that of mTF to which the monoclonal antibody exemplified above binds.
  • Antibodies that bind to the same epitope are preferably capable of binding to mTF and have the ability to internalize cells expressing mTF.
  • the antibody that binds to the same epitope may be a variant of the monoclonal antibody exemplified above.
  • bonded with this same epitope is as above-mentioned.
  • B-1 Preparation of monoclonal antibody using hybridoma
  • the monoclonal antibody of the present invention is prepared, for example, by preparing a hybridoma by cell fusion between an antibody-producing cell obtained from an animal immunized with an antigen and a myeloma cell, and producing the target antibody from the resulting hybridoma. Can be obtained by selecting those to be made and causing the selected hybridomas to produce antibodies.
  • TF full-length TF
  • a partial peptide thereof or cells expressing TF on the surface can be used.
  • hTF can be obtained, for example, by purifying human placenta-derived hTF according to the method described in JP-A-9-302000. Further, for example, TF or a partial peptide thereof can be obtained by a genetic engineering method or a chemical synthesis method. The partial peptide can be used in combination with any appropriate carrier protein as required.
  • the mRNA sequence of hTF is known in GenBank NM_001993.4 (SEQ ID NO: 27). Also, the mRNA sequence of mTF is known in GenBank M57896.1 (SEQ ID NO: 28).
  • B-1-2 Preparation of antibody-producing cells
  • the antigen obtained as described above is mixed with any appropriate adjuvant and administered to non-human mammals such as mice, rats, horses, monkeys, rabbits, goats and sheep for immunization. .
  • the antibody titer against the antigen of the immunized animal is measured, and the final immunization is given to the animal having a high antibody titer.
  • antibody-producing cells such as spleen cells and lymph node cells are collected. Details of the immunization method and the method of collecting antibody-producing cells are well known to those skilled in the art, and thus detailed description thereof is omitted.
  • the antibody titer can be measured by, for example, enzyme immunoassay (EIA) such as ELISA, radioimmunoassay (RIA) or the like using blood collected from an animal.
  • EIA enzyme immunoassay
  • RIA radioimmunoassay
  • any appropriate cell line derived from an animal such as a mouse or a rat and generally available to those skilled in the art can be used.
  • myeloma that has drug resistance and cannot survive in a selective medium eg, hypoxanthine, aminopterin, thymidine-containing medium (HAT medium)
  • HAT medium thymidine-containing medium
  • Cells are used.
  • the cell fusion can be performed using any appropriate method such as PEG method or electrofusion method.
  • the cells after cell fusion treatment are suspended and diluted in a selective medium (for example, HAT medium), and cultured in each well of the culture plate.
  • a selective medium for example, HAT medium
  • Hybridoma Screening and Cloning Cells that have formed colonies as a result of the culture after cell fusion are selected as hybridomas.
  • the selected hybridoma is cultured in, for example, a microtiter plate, and the obtained culture supernatant is collected to measure the reactivity to the antigen.
  • the reactivity to an antigen can be measured by EIA, RIA or the like.
  • EIA EIA
  • RIA a monoclonal antibody-producing hybridoma is isolated by a limiting dilution method or the like.
  • Monoclonal antibody can be obtained by culturing the above hybridoma in any appropriate medium and purifying it from the obtained culture supernatant. Injecting the hybridoma into the abdominal cavity of a non-human mammal such as a mouse or rat. And it can prepare by the method etc. which culture
  • Antibody purification can be achieved, for example, by using an ammonium sulfate salting-out method, a gel filtration chromatography method, an ion exchange chromatography method, an affinity column chromatography method such as an anti-immunoglobulin column, a protein A column, etc., in combination as necessary. It can be carried out.
  • the monoclonal antibody of the present invention can be produced by genetic engineering technique using an antibody gene cloned from an antibody producing cell such as the above hybridoma.
  • B-2-1 Cloning of the gene encoding the variable region Extracting the total mRNA from the hybridoma producing the target antibody, using reverse transcriptase from the obtained total mRNA, cDNA encoding the antibody variable region using a sequence common to the antibody gene as a primer Is synthesized.
  • the cDNA can be synthesized and amplified using, for example, the 5′-RACE method, and any appropriate restriction enzyme sites can be introduced at both ends of the cDNA.
  • a desired DNA fragment is purified from the obtained PCR product, ligated with vector DNA, and introduced into Escherichia coli or the like to prepare a desired recombinant vector.
  • the base sequence of the target antibody gene is confirmed by a known method such as the deoxy method.
  • DNA encoding the variable region cloned as described above is ligated with the DNA encoding the desired antibody constant region and incorporated into an expression vector.
  • DNA encoding a variable region may be incorporated into an expression vector containing DNA encoding a desired constant region.
  • the expression vector thus obtained can be introduced into any appropriate host cell, whereby the antibody can be expressed.
  • the heavy chain or light chain may be separately incorporated into an expression vector, and these two expression vectors may be introduced simultaneously into the same host cell, or the DNA encoding the heavy chain or light chain may be introduced into a single expression vector. May be incorporated into a host cell.
  • the DNA encoding the variable region can also be obtained by performing total synthesis using an artificial gene synthesis service or the like based on the base sequence determined in Section B-2-1. Examples of host cells include animal cells, plant cells, insect cells, yeasts, bacteria, and the like.
  • Monoclonal antibodies can be obtained by culturing host cells into which the expression vector is incorporated in any appropriate medium and purifying the resulting culture supernatant. The method for purifying the antibody is as described above.
  • a human chimeric antibody is obtained by, for example, ligating a DNA encoding a variable region of a monoclonal antibody obtained in the same manner as described above with a DNA encoding a constant region of a human antibody, and incorporating this into an expression vector. It can obtain by introduce
  • Humanized antibodies can be obtained by grafting CDRs of non-human mammalian antibodies to human antibodies so as to link them to the framework regions of human antibodies using so-called CDR grafting techniques. Methods for transplanting CDRs of antibodies from non-human mammals (eg, mice) into human framework regions are known, and examples include overlap extension PCR.
  • CDR grafting it is advantageous in maintaining CDR functions to select a human framework region having high homology with the framework region of an antibody of a non-human mammal. Therefore, it is preferable to use a human framework region consisting of an amino acid sequence having high homology with the amino acid sequence of the framework region adjacent to the CDR to be transplanted.
  • the present invention also provides a fragment of an antibody comprising a portion of the monoclonal antibody described in Section A and capable of binding to Tissue Factor.
  • the antibody fragment of the present invention typically has the ability to internalize cells expressing Tissue Factor. Examples of the antibody fragment include Fab, F (ab ′) 2 , Fab ′, single chain antibody (scFv), disulfide stabilized antibody (dsFv), dimerized V region fragment (Diabody), and peptide containing CDR Etc.
  • Fab can be obtained by papain treatment of the above monoclonal antibody. It can also be obtained by inserting the DNA encoding the Fab of the above monoclonal antibody into any appropriate expression vector, introducing the vector into a host cell, and expressing it.
  • F (ab ′) 2 can be obtained by treating the monoclonal antibody with pepsin. It can also be obtained by inserting the DNA encoding F (ab ′) 2 of the monoclonal antibody into any appropriate expression vector, introducing the vector into a host cell, and expressing it.
  • Fab ′ is an antibody fragment obtained by cleaving the SS bond between the hinges of F (ab ′) 2 .
  • Fab ′ can be obtained by treating the F (ab ′) 2 with a reducing agent dithiothreitol. It can also be obtained by inserting DNA encoding Fab ′ into any appropriate expression vector, introducing the vector into a host cell, and expressing it.
  • ScFv is obtained by connecting only the variable regions of the heavy chain and the light chain with an appropriate peptide linker.
  • the scFv can be obtained by constructing an scFv expression vector based on the DNA encoding the heavy chain variable region and the light chain variable region of the monoclonal antibody, introducing the vector into a host cell, and expressing the vector.
  • DsFv is a polypeptide in which one amino acid residue in each of the heavy chain variable region and the light chain variable region is replaced with a cysteine residue via an SS bond.
  • the position of introduction of a cysteine residue in each region can be determined based on the three-dimensional structure predicted by molecular modeling.
  • the dsFv can be obtained by constructing a dsFv expression vector based on DNA encoding the heavy chain variable region and the light chain variable region of the monoclonal antibody, introducing the vector into a host cell, and expressing the vector.
  • Diabody is a dimer of scFv linked by a short peptide linker of 8 amino acid residues or less, and has a bivalent antigen binding activity.
  • the bivalent antigen binding activity may be the same or different.
  • Diabody constructs an expression vector for scFv linked with a peptide linker of 8 amino acid residues or less based on DNA encoding the heavy chain variable region and the light chain variable region of the above monoclonal antibody, and introduces the vector into a host cell. And can be obtained by expression.
  • the peptide containing CDR contains at least one CDR of heavy chain variable region or light chain variable region.
  • the peptide containing CDR may be one in which a plurality of CDRs are bound directly or via an appropriate peptide linker.
  • a peptide containing CDR is obtained by inserting a DNA encoding CDR in the heavy chain variable region and the light chain variable region of the monoclonal antibody into any appropriate expression vector, introducing the vector into a host cell, and expressing the vector. be able to. It can also be obtained by chemical synthesis methods such as Fmoc method and tBoc method.
  • the pharmaceutical composition of the present invention comprises the monoclonal antibody described in Section A as a target binding agent or the antibody fragment described in Section C and a drug.
  • a monoclonal antibody or a fragment of the antibody hereinafter sometimes referred to as “monoclonal antibody”
  • the monoclonal antibody or the like may be in a state of being bound to a drug.
  • a polymer compound may be further bound to a monoclonal antibody or the like.
  • any appropriate drug is selected according to the disease to be treated.
  • biopharmaceuticals such as nucleic acid drugs, antibody drugs, gene therapy drugs, and cytotoxic molecules such as cytotoxins and cytotoxic drugs.
  • nucleic acid drug examples include plasmid DNA, siRNA, micro RNA, shRNA, antisense nucleic acid, decoy nucleic acid, aptamer, and ribozyme site.
  • cytoxins examples include taxol, cytochalasin B, gramicidin D, ethidium bromide, emetine, mitomycin, etoposide, tenoposide, vincristine, vinblastine, colchicine, doxorubicin, daunorubicin, dihydroxyanthracindione, mitoxantrone, mitramomycin, Actinomycin D, 1-dehydrotestosterone, glucocorticoid, procaine, tetracaine, lidocaine, propranolol, puromycin, duocarmycin, calicheamicin, maytansine, auristatin or derivatives thereof.
  • cytotoxic drugs include methotrexate, 6-mercaptopurine, 6-thioguanine, cytarabine, 5-fluorouracil decarbazine and other antimetabolites, mechloretamine, thioepachloram butyl, melphalan, carmustine (BSNU), lomustine (CCNU), cyclososfamide, busulfan, dibromomannitol, streptozotocin, mitomycin C, anthracyclines such as cis-dichlorodiamineplatinum (II), anthracyclines such as daunorubicin and doxorubicin, dactinomycin, bleomycin, mitramycin, Antibiotics such as anthramycin (AMC) and mitotic agents such as vincristine and vinblastine can be mentioned.
  • methotrexate 6-mercaptopurine, 6-thioguanine, cytarabine, 5-fluorouracil decarbazin
  • the binding between a drug or a polymer compound and a monoclonal antibody or the like can be performed by a method known in the art. For example, it can be performed by reacting a functional group that each has or a functional group introduced as necessary. Examples of combinations of the functional groups include amino groups and carboxyl groups, carboxyl groups and hydroxyl groups, maleimide groups and thiol groups, thiol groups and thiol groups, hydrazide groups and ketone groups, hydrazide groups and aldehyde groups, and amino groups and aldehydes.
  • the drug when it is a protein or peptide, it may be a fusion protein with a monoclonal antibody or the like by a genetic engineering technique. Furthermore, when the drug has a charge, it may be bound via an ionic bond.
  • any appropriate polymer compound is selected as the polymer compound.
  • Specific examples include polyethylene glycol, albumin, dextran, polyvinyl pyrrolidone, polyvinyl alcohol and the like. By binding such a polymer compound, stability in blood can be improved.
  • the binding site of the polymer compound can be any appropriate site as long as it does not impair the antigen binding activity and internalization ability of the monoclonal antibody or the like.
  • the monoclonal antibody or the like may be in a state of being bound to a DDS carrier material.
  • DDS carrier material those capable of forming nanoparticles encapsulating a drug (for example, particles having an average particle diameter of preferably 10 nm to 400 nm, more preferably 20 nm to 300 nm, still more preferably 30 nm to 150 nm) are preferably used.
  • a DDS carrier material nanoparticles encapsulating a drug can be formed, so that the stability of the drug in the living body can be improved and sustained release can be achieved. Furthermore, reliable drug delivery into the target cell by a monoclonal antibody or the like becomes possible.
  • Monoclonal antibodies and the like are bound to any appropriate position of the DDS carrier material.
  • the monoclonal antibody or the like is bound so as to be exposed on the outer surface of the nanoparticles formed by the DDS carrier material.
  • the binding between the monoclonal antibody or the like and the DDS carrier material can be performed, for example, by reacting a functional group that each has or a functional group introduced as necessary. Preferred combinations of functional groups are as described above.
  • DDS carrier material examples include polymer micelle-forming materials such as block copolymers having hydrophilic segments and hydrophobic segments, liposome-forming materials such as phospholipids, natural polymers such as gelatin, collagen, hyaluronic acid, and alginic acid, Examples include nanohydrogel capsule-forming materials such as synthetic polymers such as polyethylene glycol and polyvinyl alcohol, and nanosphere-forming materials such as polyglycolic acid, polylactic acid, and copolymers thereof. Among these, it is preferable to use a block copolymer having a hydrophilic segment and a hydrophobic segment.
  • a polymer micelle capable of delivering a drug into a target cell with high certainty by binding a monoclonal antibody or the like to the hydrophilic segment of a block copolymer having a hydrophilic segment and a hydrophobic segment to form a target-binding block copolymer. Can be obtained.
  • the drug the same drug as in the first embodiment can be used.
  • the drug may be used as it is, or may be used in the form of a drug-binding block copolymer bound to the hydrophobic segment of a block copolymer having a hydrophilic segment and a hydrophobic segment. .
  • the composition for drug delivery of the present invention comprises the monoclonal antibody described in Section A or the antibody fragment described in Section C.
  • the monoclonal antibody or a fragment of the antibody can be used as a target binding factor to cells expressing TF, and can further exhibit the ability to internalize the cells. Therefore, by administering a drug using the drug delivery composition of the present invention, the drug can be efficiently delivered into cells that express TF on the surface.
  • the anti-TF monoclonal antibody of the present invention is typically used for the treatment of a disease involving Tissue Factor (for example, a disease accompanied by increased expression of Tissue Factor on the tissue or cell surface).
  • diseases involving Tissue Factor include cancer, inflammation, and thrombosis. Since TF is constantly increased in expression in various cancer tissues, it can be used for the treatment regardless of the type of cancer. In addition, for example, in pancreatic cancer, it has been reported that the prognosis of a patient who highly expresses TF is poor, and it can be effectively used in treatment for such a patient.
  • the administration route of the pharmaceutical composition of the present invention is preferably parenteral administration such as subcutaneous, intravenous, arterial, local, etc., and intravenous injection is particularly preferable.
  • the dosage can be appropriately determined according to the type of drug, usage, patient age, sex, patient health and the like.
  • Parts and % mean “parts by weight” and “% by weight”.
  • Recombinant hTF 50 ⁇ g was administered intraperitoneally to 3 6-week-old female female rats together with Freund's complete adjuvant (Difco) for initial immunization. 14 days later, 50 ⁇ g of recombinant hTF was administered together with Sigma Adjuvant System (Sigma) for booster immunization. Thereafter, the same booster was performed 5 times every 21 days. Further, 126 days later, 10 ⁇ g of recombinant hTF diluted with PBS was intraperitoneally administered, and 40 ⁇ g of recombinant hTF was administered to the tail vein for final immunization.
  • each well was washed 3 times with 300 ⁇ L of a washing solution, and HRP-labeled anti-mouse IgG antibody (Bethyl) diluted 5,000 times with a blocking buffer was added at 50 ⁇ L and reacted for 30 minutes. After the reaction, each well was washed with 300 ⁇ L of washing solution three times, and 3.7 mM o-phenylenediamine / 25 mM citric acid / 130 mM Na 2 HPO 4 /0.006% H 2 O 2 (pH 5.0) was added at 100 ⁇ L. And colored. 10-15 minutes later, 2N sulfuric acid was added at 30 ⁇ L / well to stop the reaction, and the absorbance (490 nM) was measured with an absorbance plate reader.
  • HRP-labeled anti-mouse IgG antibody Bethyl
  • immunoprecipitation ELISA was performed by mixing recombinant hTF and hybridoma culture supernatant and measuring the amount of unbound hTF in the mixed solution by hTF quantitative sandwich ELISA. Furthermore, flow cytometry was performed according to a standard method, and the reactivity of the hybridoma culture supernatant to hTF-expressing cells was measured.
  • hybridomas that showed strong affinity with hTF were selected, and hybridoma clones producing monoclonal antibodies that bind to hTF were established by performing the limiting dilution method twice for these clones.
  • each of the established hybridomas was cultured in a large amount in an RPMI 1640 medium containing 5% of bovine serum from which cow-derived IgG was removed, and a culture supernatant was obtained.
  • each hybridoma was cultured in large quantities in the abdominal cavity of ICR nude mice, and ascites was collected. The obtained culture supernatant or ascites was subjected to Protein G affinity column chromatography to purify the IgG monoclonal antibody.
  • Lysotracker RED-DND99 Invitrogen was added to the culture solution to a final concentration of 75 nM after 2 hours from the start of the culture, and then further cultured for 1 hour.
  • Lysotracker RED-DND99 Invitrogen was added to the culture solution to a final concentration of 75 nM after 2 hours from the start of the culture, and then further cultured for 1 hour.
  • PBS 4% paraformaldehyde
  • nuclear stained with DAPI (4 ′, 6-diamidino-2-phenylindole
  • Fluoromount G Southern Biotech
  • a DNA fragment encoding the heavy chain variable region and light chain variable region of the anti-hTF monoclonal antibody was obtained by PCR using the synthesized cDNA as a template. Specifically, from the following list of primers, the light chain variable region cloning was performed using the following primer 1-19 mixed primer and primer 20 as the sense primer and antisense primer for heavy chain variable region cloning, respectively. PCR was performed using the following mixed primer of primer 22 to 38 and primer 39 as a sense primer and an antisense primer, respectively.
  • Primer 1 NNCCATGGCCGAGGTRMAGCTTCAGGAGTC Primer 2 (SEQ ID NO: 31) NNCCATGGCCGAGGGTBCAGCTBCAGCAGTC Primer 3 (SEQ ID NO: 32) NNCCATGGCCGAGGGTGCAGCTGAAGSASTC Primer 4 (SEQ ID NO: 33) NNCCATGGCCGAGGTCCARCTGCAACARTC Primer 5 (SEQ ID NO: 34) NNCCATGGCCGAGGTYCAGCTBCAGCARTC Primer 6 (SEQ ID NO: 35) NNCCATGGCCGAGGTYCARCTGCAGCAGTC Primer 7 (SEQ ID NO: 36) NNCCATGGCCGAGGTCCCACGTGAAGCAGTC Primer 8 (SEQ ID NO: 37) NNCCATGGCCGAGGGTGAASSTGGGGAATC Primer 9 (SEQ ID NO: 38) NNCCATGGCCGAGGGTGAWGYTGGTGGAGTC Primer 10 (SEQ ID NO: 39) N
  • Each PCR product obtained above was cloned into a vector according to a conventional method, and the base sequence was determined.
  • the base sequences of the heavy chain variable region and the light chain variable region of the anti-hTF monoclonal antibody (No. 1849) determined as described above are as shown in SEQ ID NOs: 69 and 70, respectively.
  • the amino acid sequences of the heavy chain variable region and the light chain variable region are as described in SEQ ID NOs: 9 and 10, respectively. Further, by comparing these amino acid sequences with a database of amino acid sequences of known antibodies (IMGT website: http://www.imgt.org/), by examining the homology, the amino acid sequences of CDR It was decided as follows.
  • Anti-hTF monoclonal antibody No. 1859
  • Anti-hTF was obtained in the same manner as above except that total RNA was extracted from the hybridoma producing the anti-hTF monoclonal antibody (No. 1859) and that primer 21 was used as the antisense primer for cloning the heavy chain variable region.
  • the base sequences of the heavy chain variable region and the light chain variable region of the monoclonal antibody (No. 1859) were determined.
  • the determined base sequences of the heavy chain variable region and the light chain variable region of the anti-hTF monoclonal antibody are as shown in SEQ ID NOs: 71 and 72, respectively.
  • the amino acid sequences of the heavy chain variable region and the light chain variable region are as described in SEQ ID NOs: 17 and 18, respectively.
  • the amino acid sequences of CDRs in these variable regions were determined as follows.
  • Anti-hTF monoclonal antibodies (No. 1849, No. 1859) were immobilized on the surface of a Biacore CM5 chip.
  • a CM5 chip on which each antibody was immobilized was set in an SPR device, and an antigen-containing buffer containing purified hTF was passed through the flow path.
  • the dissociation constant between each antibody and hTF was determined by this measurement system.
  • the measurement conditions are as follows.
  • SPR device Biacore 2000 (Biacore)
  • Antigen-containing buffer 10 mM acetate buffer (pH 5.0) containing hTF at a final concentration of 25 ⁇ g / ml
  • Running buffer HBS-EP buffer (10 mM HEPES, pH 7.5, 0.15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0.005% surfactant P20 (Tween 20), pH 7.4).
  • the dissociation constant (KD) for hTF of each antibody was No. No. 1849 is 9.139 ⁇ 10 ⁇ 11 , no. 1859 was 1.894 ⁇ 10 ⁇ 10 .
  • the prothrombin time of the anti-hTF monoclonal antibodies was measured as follows. 3 ⁇ g of antibody was added to 350 ng of recombinant hTF antigen, and PBS was added until the total volume became 5 ⁇ l. The antigen-antibody reaction was allowed to proceed for 15 minutes while shaking at 37 ° C. and 600 rpm. 50 ⁇ l of human plasma anticoagulated with 3.8% sodium citrate and 100 ⁇ l of 25 mM CaCl 2 were added to the reaction solution, and the cells were cultured while shaking at 37 ° C. and 600 rpm, and the time until a fibrin clot was formed ( Prothrombin time) was measured. Table 3 and FIG. 2 show the coagulation extension time ratio (prothrombin time ratio) of each antibody when the prothrombin time in the control using PBS instead of the reaction solution is 1.
  • Example 2 pharmaceutical composition [Binding of monoclonal antibody to drug]
  • An anti-hTF monoclonal antibody (No. 1849) conjugated with monomethyl auristatin E (MMAE) (hereinafter referred to as “hTF-MMAE”) was obtained as follows.
  • a pH 6.4 buffer solution is prepared using 5 mM EDTA-containing PBS, 150 mM NaCl, and 5 mM EDTA-containing 100 mM phosphate buffer (pH 6.0), and the obtained buffer solution is used to produce an antibody concentration of 1.0 mg /
  • the antibody solution was prepared to be ml.
  • Dithiothreitol (DTT) was added to the antibody solution to a final concentration of 1 to 10 mM and reacted at 26 to 37 ° C. for 30 to 45 minutes. Subsequently, the reaction reagent was removed from the reaction solution with Amicon Ultra (MWCO: 30,000). Absorption measurement showed that the antibody recovery was 80-99%.
  • DTT Dithiothreitol
  • Amicon Ultra MWCO: 30,000
  • a buffer solution of pH 6.4 is prepared using 5 mM EDTA-containing PBS and 150 mM NaCl and 5 mM EDTA-containing 100 mM phosphate buffer (pH 6.0), and the reaction solution is prepared using the obtained buffer solution.
  • the protein concentration was diluted to 0.5 mg / ml.
  • the maleimide MMAE compound was mixed with the diluted solution at a molar ratio of 1: 4 (antibody: maleimide MMAE compound), and then reacted at room temperature for 1 hour and then at 4 ° C. overnight.
  • reaction reagent was removed from the reaction solution with Amicon Ultra (MWCO: 30,000), and the solvent was replaced with PBS.
  • Amicon Ultra MWCO: 30,000
  • the recovery rate was 60 to 90%.
  • FIG. 3 shows the percentage (%) of each cell viability when the cell viability of the negative control (no drug sample added) is 100%.
  • hTF-MMAE showed a remarkably superior cell killing effect compared to mTF-MMAE. From this, it can be seen that when the drug is bound to the anti-hTF monoclonal antibody (No. 1849), the migration into the cell expressing hTF on the surface is improved, and high drug efficacy can be exhibited.
  • hTF-MMAE showed a remarkably excellent antitumor effect. The results are consistent with the cell killing effect confirmed in vitro. Further, as shown in FIG. 5, no decrease in body weight was confirmed in the group administered with hTF-MMAE.
  • Recombinant mTF (50 ⁇ g) was administered intraperitoneally to three 6-week-old female female rats together with Freund's complete adjuvant (Difco) for initial immunization. 14 days later, 50 ⁇ g of recombinant mTF was administered together with Sigma Adjuvant System (Sigma) for booster immunization. Thereafter, the same boosting was performed 7 times every 21 days. Further, 207 days later, 10 ⁇ g of recombinant mTF diluted with PBS was intraperitoneally administered, and 40 ⁇ g of recombinant mTF was administered to the tail vein for final immunization.
  • each well was washed 3 times with 300 ⁇ L of a washing solution, and HRP-labeled anti-mouse IgG antibody (Bethyl) diluted 5,000 times with a blocking buffer was added at 50 ⁇ L and reacted for 30 minutes. After the reaction, each well was washed with 300 ⁇ L of washing solution three times, and 3.7 mM o-phenylenediamine / 25 mM citric acid / 130 mM Na 2 HPO 4 /0.006% H 2 O 2 (pH 5.0) was added at 100 ⁇ L. And colored. 10-15 minutes later, 2N sulfuric acid was added at 30 ⁇ L / well to stop the reaction, and the absorbance (490 nM) was measured with an absorbance plate reader.
  • HRP-labeled anti-mouse IgG antibody Bethyl
  • the immunoprecipitation ELISA method was performed by mixing recombinant mTF and hybridoma culture supernatant, and measuring the amount of unbound mTF in the mixed solution by mTF quantitative sandwich ELISA. Furthermore, flow cytometry was performed according to a standard method, and the reactivity of the hybridoma culture supernatant to hTF-expressing cells was measured.
  • hybridomas showing strong affinity with mTF were selected, and hybridoma clones producing monoclonal antibodies that bind to mTF were established by performing the limiting dilution method twice for these clones.
  • each of the established hybridomas was cultured in a large amount in an RPMI 1640 medium containing 5% of bovine serum from which cow-derived IgG was removed, and a culture supernatant was obtained.
  • each hybridoma was cultured in large quantities in the abdominal cavity of ICR nude mice, and ascites was collected. The obtained culture supernatant or ascites was subjected to Protein G affinity column chromatography to purify the IgG monoclonal antibody.
  • Lysotracker RED-DND99 Invitrogen was added to the culture solution to a final concentration of 75 nM after 2 hours from the start of the culture, and then further cultured for 1 hour.
  • Lysotracker RED-DND99 Invitrogen was added to the culture solution to a final concentration of 75 nM after 2 hours from the start of the culture, and then further cultured for 1 hour.
  • PBS 4% paraformaldehyde
  • nuclear stained with DAPI (4 ′, 6-diamidino-2-phenylindole
  • Fluoromount G Southern Biotech
  • Fig. 7 shows the level of enhancement of TF expression level in TF forced expression mouse B16 melanoma cells as a reference.
  • Fig. 7 shows the expression of GAPDH mRNA in mouse B16 melanoma cells and their TF forced expression cells. It is a graph which shows the ratio of the mRNA expression level of TF with respect to the quantity).
  • the determined nucleotide sequences of the heavy chain variable region and the light chain variable region of the anti-mTF monoclonal antibody are as shown in SEQ ID NOs: 74 and 75, respectively.
  • the amino acid sequences of the heavy chain variable region and the light chain variable region are as described in SEQ ID NOs: 25 and 26, respectively.
  • the amino acid sequences of CDRs in these variable regions were determined as follows.
  • Example 4 Production of Chimeric Antibody
  • the DNA fragment encoding the heavy chain variable region and the light chain variable region of the anti-hTF monoclonal antibody (No. 1849) cloned in Example 1 was amplified by PCR.
  • pFUSEss_CHIg-hG1e2 in vivoGen
  • the obtained expression vector was transfected into CHO-K1 cells using Lipofectamine LTX Reagent (Invitrogen). Subsequently, drug selection was performed using 10 ⁇ g / mL Blastcidin S (Kaken Pharmaceutical) and 300 ⁇ g / mL Zeocin (Invitrogen) to obtain both resistant cell lines.
  • the obtained cell line was maintained and cultured in a medium containing Ham's F12K (wako), 10% FBS, 1% penicillin, streptomycin (Invitrogen), 10 ⁇ g / mL Blastcidin S and 300 ⁇ g / mL Zeocin. Subsequently, a constant expression cell line of an anti-hTF human chimeric antibody (No. 1849 chimeric clone) was cloned by a limiting dilution method using a 96-well plate.
  • the monoclonal antibody or fragment thereof of the present invention can be suitably used in the field of DDS.

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Abstract

　本発明は、Ｔｉｓｓｕｅ　Ｆａｃｔｏｒに対する新規抗体を提供する。また、本発明は、該抗体を標的結合因子として利用した医薬組成物を提供する。本発明による抗体は、Ｔｉｓｓｕｅ　Ｆａｃｔｏｒを発現する細胞へのインターナリゼーション能を発揮し得る。

Description

抗Ｔｉｓｓｕｅ　Ｆａｃｔｏｒモノクローナル抗体
　本発明は、抗Ｔｉｓｓｕｅ　Ｆａｃｔｏｒモノクローナル抗体および該抗体を利用した医薬組成物に関する。
　本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願２０１４－１８５８６号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
　一般に、経口や静脈内注射によって薬物を全身投与すると、投薬対象物としての病巣部位だけでなく、正常組織にも薬物が供給される。この結果、薬物投与による副作用が認められ、治療方法の変更や中断が必要になる場合がある。これに対し、副作用の低減を目的として、投薬対象物に固有の受容体、リガンド、酵素等の分子マーカーに特異的に結合する能力を有した、分子標的薬と呼ばれる薬物が開発されている（例えば、特許文献１）。
　一方、Ｔｉｓｓｕｅ　Ｆａｃｔｏｒ（以下、「ＴＦ」と称する場合がある）は外因系凝固の開始因子であり、血管損傷等により産生が促進される。通常反応におけるＴＦ発現は、局所的、かつ、一過性である。しかしながら、膵臓癌、胃癌等の多くの固形癌においては、腫瘍組織内の癌細胞、血管内皮細胞および単球、マクロファージ等の細胞表面でＴＦが恒常的に発現亢進していることが知られている。
米国特許公開公報２０１２／００３９９８９
　本発明の目的の一つは、ＴＦに対する新規抗体の提供にある。また、本発明の目的の別の一つは、該抗体を標的結合因子として利用した医薬組成物の提供にある。
　本願発明者らは、細胞へのインターナリゼーション能を有する新規の抗ＴＦモノクローナル抗体を発見し、さらに、該抗体を標的結合因子として用いることにより表面にＴＦを発現する細胞へ薬物を高い選択性で送達し得ることに想到し、本発明を完成させるに至った。
　すなわち、本発明によれば、Ｔｉｓｓｕｅ　Ｆａｃｔｏｒに結合する、以下のモノクローナル抗体が提供される。
　それぞれ配列番号３、４および５に記載されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域１、２および３を有する重鎖可変領域と、それぞれ配列番号６、７および８に記載されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域１、２および３を有する軽鎖可変領域と、を含む、抗ヒトＴｉｓｓｕｅ　Ｆａｃｔｏｒモノクローナル抗体；
　それぞれ配列番号１１、１２および１３に記載されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域１、２および３を有する重鎖可変領域と、それぞれ配列番号１４、１５および１６に記載されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域１、２および３を有する軽鎖可変領域と、を含む、抗ヒトＴｉｓｓｕｅ　Ｆａｃｔｏｒモノクローナル抗体；または
　それぞれ配列番号１９、２０および２１に記載されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域１、２および３を有する重鎖可変領域と、それぞれ配列番号２２、２３および２４に記載されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域１、２および３を有する軽鎖可変領域と、を含む、抗マウスＴｉｓｓｕｅ　Ｆａｃｔｏｒモノクローナル抗体。
　本発明の別の局面によれば、上記モノクローナル抗体が結合するＴｉｓｓｕｅ　Ｆａｃｔｏｒのエピトープと同じエピトープに結合するモノクローナル抗体が提供される。
　本発明のさらに別の局面によれば、上記モノクローナル抗体の一部を含み、Ｔｉｓｓｕｅ　Ｆａｃｔｏｒと結合できる、抗体の断片が提供される。
　本発明のさらに別の局面によれば、標的結合因子としての上記モノクローナル抗体または抗体の断片と、薬物とを含む医薬組成物が提供される。
　本発明のさらに別の局面によれば、標的結合因子としての上記モノクローナル抗体または抗体の断片を含む、薬物送達用組成物が提供される。
　本発明のモノクローナル抗体は、ＴＦを発現する細胞を認識し、かつ、該細胞へのインターナリゼーション能を有し得る。よって、該抗体を標的結合因子として利用することにより、効率よく該細胞に薬物を送達することができる。
インターナリゼーションアッセイの結果を示す顕微鏡写真である。 抗凝固作用評価の結果を示すグラフである。 殺細胞効果確認試験の結果を示すグラフである。 抗腫瘍効果確認試験における腫瘍体積の変動を示すグラフである。 抗腫瘍効果確認試験における体重の変動を示すグラフである。 インターナリゼーションアッセイの結果を示す顕微鏡写真である。 マウスＢ１６メラノーマ細胞およびそのＴＦ強制発現細胞におけるＧＡＰＤＨのｍＲＮＡ発現量に対するＴＦのｍＲＮＡ発現量の割合を示すグラフである。 ＦＡＣＳ解析で得られたヒストグラムである。
［Ａ．モノクローナル抗体］
　本発明によれば、ＴＦに結合するモノクローナル抗体が提供される。本発明のモノクローナル抗体は、代表的には、ＴＦに結合でき、かつ、ＴＦを発現する細胞へのインターナリゼーション能を有する。ＴＦは、血液凝固の第ＩＩＩ因子であり、膜貫通型の糖タンパクとして細胞表面に発現している。本発明において、ＴＦは、好ましくはヒトＴＦ（ｈＴＦ）である。ｈＴＦの全長アミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋＡＣＣＥＳＳＩＯＮ＿ＡＡＡ６１１５２（配列番号１）として既に知られている。本発明においてはまた、マウスＴＦ（ｍＴＦ）に対するモノクローナル抗体も提供される。抗ｍＴＦモノクローナル抗体を薬物の標的結合因子として利用することは、マウスを用いた試験や研究において有効であり得る。ｍＴＦの全長アミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋＡＣＣＥＳＳＩＯＮ＿ＡＡＡ６３４００（配列番号２）として既に知られている。
　本明細書において、インターナリゼーションとは、抗体が細胞表面の抗原と免疫複合体を形成後、細胞内に取り込まれる現象を意味する。抗ＴＦモノクローナル抗体がインターナリゼーション能を有するか否かは、例えば、標識物質を結合した抗体を表面にＴＦを発現する細胞と接触させ、該標識物質が細胞内に移行するか否かを確認する方法、細胞毒性を有する物質を結合した抗体を表面にＴＦを発現する細胞と接触させた際に、細胞死または細胞の増殖阻害が誘導されるか否かを確認する方法等によって判断することができる。より具体的には、実施例に記載のインターナリゼーショアッセイによって抗体のインターナリゼーション能の有無を確認することができる。
　上記表面にＴＦを発現する細胞としては、任意の適切な細胞が用いられ得、例えば、腫瘍組織内の細胞が挙げられる。正常組織におけるＴＦの発現は、通常、局所的かつ一過性の発現であるのに対し、腫瘍組織内の癌細胞、血管内皮細胞、単球、マクロファージ等の細胞表面においては、ＴＦの発現が恒常的に亢進している。癌細胞の具体例としては、膵臓癌細胞、胃癌細胞等が挙げられる。
　本明細書において、モノクローナル抗体とは、単一クローンの抗体産生細胞が産生する抗体である。モノクローナル抗体は、均一な一次構造を有し、同一のエピトープを認識する。本発明のモノクローナル抗体は、相同な重鎖２本と相同な軽鎖２本とがジスルフィド結合によって結合されたテトラマーからなる基本構造を有する。本発明の抗ＴＦモノクローナル抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤまたはＩｇＥのいずれのアイソタイプであってもよく、好ましくはＩｇＧである。
　本発明の抗ＴＦモノクローナル抗体が認識するエピトープは、好ましくはＴＦの細胞外領域に存在する。
　本発明の抗ＴＦモノクローナル抗体のＴＦに対する解離定数（ＫＤ）は、例えば、５×１０－９Ｍ以下、さらには１×１０－９Ｍ以下、特には２×１０－１０Ｍ以下にまで達する。解離定数は、例えば、表面プラズモン共鳴法を用いて測定することができる。
　本発明の抗ＴＦモノクローナル抗体は、抗凝固作用を有していてもよく、有していなくてもよい。抗凝固作用の有無またはその程度はプロトロンビン時間（ＰＴ）によって判断することができる。抗凝固作用を有さないまたは抗凝固作用が低い抗ＴＦモノクローナル抗体によれば、血餅等で捕捉され難いことから、薬物の標的結合因子として利用した場合に標的部位への薬物の送達性が向上され得、その結果として、薬効が好適に発揮され得る。本発明の抗ＴＦモノクローナル抗体の抗原抗体複合体を形成した状態における凝固延長時間比（ＰＢＳ相対比）は、好ましくは３以下、より好ましくは２以下、さらに好ましくは１～１．５である。抗原抗体複合体を形成した状態における凝固延長時間比は、実施例に記載の方法で決定され得る。
［Ａ－１．抗ｈＴＦモノクローナル抗体］
　第１の実施形態において、本発明の抗ｈＴＦモノクローナル抗体は、それぞれ配列番号３、４および５に記載されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域（ＣＤＲ）１、２および３を有する重鎖可変領域と、それぞれ配列番号６、７および８に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、２および３を有する軽鎖可変領域と、を含む。その具体例としては、配列番号９に記載されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号１０に記載されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、を含む抗ｈＴＦモノクローナル抗体が好ましく例示できる。
　第２の実施形態において、本発明の抗ｈＴＦモノクローナル抗体は、それぞれ配列番号１１、１２および１３に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、２および３を有する重鎖可変領域と、それぞれ配列番号１４、１５および１６に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、２および３を有する軽鎖可変領域と、を含む。その具体例としては、配列番号１７に記載されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号１８に記載されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、を含む抗ｈＴＦモノクローナル抗体が好ましく例示できる。
　上記第１または第２の実施形態で例示した各モノクローナル抗体の改変体もまた、本発明の抗ｈＴＦモノクローナル抗体に含まれ得る。当該改変体としては、例えば、重鎖可変領域および／または軽鎖可変領域が１個または数個（例えば１～１０個、好ましくは１～５個）のアミノ酸の置換、挿入、付加および／または欠失を含むモノクローナル抗体が挙げられる。このような改変体もまた、好適にｈＴＦに結合でき、かつ、ｈＴＦを発現する細胞へのインターナリゼーション能を有し得る。
　上記モノクローナル抗体の改変体の具体例としては、配列番号９に記載されるアミノ酸配列と好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号１０に記載されるアミノ酸配列と好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、を含むモノクローナル抗体が挙げられる。また、別の改変体の具体例としては、配列番号１７に記載されるアミノ酸配列と好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号１８に記載されるアミノ酸配列と好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、を含むモノクローナル抗体が挙げられる。これらの改変体は、好ましくは、ｈＴＦに結合でき、かつ、ｈＴＦを発現する細胞へのインターナリゼーション能を有する。
　上記モノクローナル抗体の改変体は、対応するモノクローナル抗体の重鎖可変領域および／または軽鎖可変領域の少なくとも１つのＣＤＲにおいて、１個または数個、例えば１、２または３個、好ましくは１個または２個、より好ましくは１個のアミノ酸の置換、挿入、付加および／または欠失を含んでいてもよい。改変体の各ＣＤＲは、対応するモノクローナル抗体の各ＣＤＲと好ましくは９０～１００％の相同性を有し、より好ましくは９５～１００％、さらに好ましくは９８～１００％、最も好ましくは１００％の相同性を有する。また、改変体の重鎖および軽鎖のＣＤＲ１～３全体は、対応するモノクローナル抗体の重鎖および軽鎖のＣＤＲ１～３全体と好ましくは９０～１００％の相同性を有し、より好ましくは９５～１００％、さらに好ましくは９８～１００％、最も好ましくは１００％の相同性を有する。
　第３の実施形態において、本発明の抗ｈＴＦモノクローナル抗体は、上記第１または第２の実施形態で例示したモノクローナル抗体が結合するｈＴＦのエピトープと同じエピトープに結合するモノクローナル抗体であり得る。該同じエピトープに結合する抗体は、競合ＥＬＩＳＡ法等の公知の方法により得ることができる。競合ＥＬＩＳＡ法においては、例えば、被験抗体の非存在下における対照抗体（すなわち、第１または第２の実施形態で例示したモノクローナル抗体）の結合活性と比較して、被験抗体が、３０％以上、好ましくは４０％以上、より好ましくは５０％以上、対照抗体の結合性を低下させる場合、該被験抗体は対照抗体と実質的に同じエピトープに結合する抗体ということができる。該同じエピトープに結合する抗体は、好ましくはｈＴＦに結合でき、かつ、ｈＴＦを発現する細胞へのインターナリゼーション能を有する。なお、当該実施形態において、該同じエピトープに結合する抗体は、上記第１または第２の実施形態で例示したモノクローナル抗体の改変体であってもよい。
　上記で説明した本発明の抗ｈＴＦモノクローナル抗体は、ヒト型キメラ抗体またはヒト化抗体であり得る。
　ヒト型キメラ抗体とは、非ヒト哺乳動物由来の抗体の可変領域とヒト由来の抗体の定常領域とを連結した抗体である。よって、本発明のヒト型キメラ抗体は、上記第１、第２または第３の実施形態で例示したモノクローナル抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域をそれぞれ、ヒト重鎖定常領域およびヒト軽鎖定常領域に連結することによって得られるキメラ抗体であり得る。
　具体的には、本発明のヒト型キメラ抗体の例としては、重鎖ＣＤＲ１、２および３としてそれぞれ、配列番号３、４および５に記載されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および軽鎖ＣＤＲ１、２および３としてそれぞれ、配列番号６、７および８に記載されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域をそれぞれ、ヒト重鎖定常領域およびヒト軽鎖定常領域に連結したキメラ抗体が挙げられる。当該キメラ抗体の具体例としては、配列番号９に記載されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号１０に記載されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域をそれぞれ、ヒト重鎖定常領域およびヒト軽鎖定常領域に連結したキメラ抗体が挙げられる。
　本発明のヒト型キメラ抗体の別の例としては、重鎖ＣＤＲ１、２および３としてそれぞれ、配列番号１１、１２および１３に記載されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および軽鎖ＣＤＲ１、２および３としてそれぞれ、配列番号１４、１５および１６に記載されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域をそれぞれ、ヒト重鎖定常領域およびヒト軽鎖定常領域に連結したキメラ抗体が挙げられる。当該キメラ抗体の具体例としては、配列番号１７に記載されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号１８に記載されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域をそれぞれ、ヒト重鎖定常領域およびヒト軽鎖定常領域に連結したキメラ抗体が挙げられる。
　ヒト型キメラ抗体の重鎖定常領域は、ヒトイムノグロブリン（以下、ｈＩｇと表記する）に属するものであればよく、好ましくはｈＩｇＧクラスに属する。同様に、ヒト型キメラ抗体の軽鎖定常領域は、ｈＩｇに属するものであればよく、κクラスまたはλクラスのいずれであってもよい。
　ヒト化抗体とは、非ヒト哺乳動物由来の抗体のＣＤＲをヒト由来の抗体の可変領域の適切な位置に移植した抗体である。よって、本発明のヒト化抗体は、重鎖および軽鎖のＣＤＲ１～３として上記第１、第２または第３の実施形態で例示したモノクローナル抗体の重鎖および軽鎖のＣＤＲ１～３を有し、その他の領域がヒト抗体に由来するヒト抗体であり得る。
　本発明のヒト化抗体の具体例としては、重鎖のＣＤＲ１、２および３がそれぞれ、配列番号３、４および５に記載されるアミノ酸配列からなり、軽鎖のＣＤＲ１、２および３がそれぞれ、配列番号６、７および８に記載されるアミノ酸配列からなり、その他の領域がヒト抗体に由来するヒト化抗体、重鎖のＣＤＲ１、２および３がそれぞれ、配列番号１１、１２および１３に記載されるアミノ酸配列からなり、軽鎖のＣＤＲ１、２および３がそれぞれ、配列番号１４、１５および１６に記載されるアミノ酸配列からなり、その他の領域がヒト抗体に由来するヒト化抗体が挙げられる。
　ヒト化抗体の重鎖は、ｈＩｇに属するものであればよく、好ましくはｈＩｇＧクラスに属する。同様に、ヒト化抗体の軽鎖は、ｈＩｇに属するものであればよく、κクラスまたはλクラスのいずれであってもよい。
［Ａ－２．抗ｍＴＦモノクローナル抗体］
　１つの実施形態において、本発明の抗ｍＴＦモノクローナル抗体は、それぞれ配列番号１９、２０および２１に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、２および３を有する重鎖可変領域と、それぞれ配列番号２２、２３および２４に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、２および３を有する軽鎖可変領域とを含む。その具体例としては、配列番号２５に記載されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号２６に記載されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、を含む抗ｍＴＦモノクローナル抗体が好ましく例示できる。
　上記で例示したモノクローナル抗体の改変体もまた、本発明の抗ｍＴＦモノクローナル抗体に含まれ得る。当該改変体としては、例えば、重鎖可変領域および／または軽鎖可変領域が１個または数個（例えば１～１０個、好ましくは１～５個）のアミノ酸の置換、挿入、付加および／または欠失を含むモノクローナル抗体が挙げられる。このような改変体もまた、好適にｍＴＦに結合でき、かつ、ｍＴＦを発現する細胞へのインターナリゼーション能を有し得る。
　上記モノクローナル抗体の改変体の具体例としては、配列番号２５に記載されるアミノ酸配列と好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号２６に記載されるアミノ酸配列と好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、を含むモノクローナル抗体が挙げられる。このような改変体は、好ましくは、ｍＴＦに結合でき、かつ、ｍＴＦを発現する細胞へのインターナリゼーション能を有する。
　上記モノクローナル抗体の改変体は、対応するモノクローナル抗体の重鎖可変領域および／または軽鎖可変領域の少なくとも１つのＣＤＲにおいて、１個または数個、例えば１、２または３個、好ましくは１個または２個、より好ましくは１個のアミノ酸の置換、挿入、付加および／または欠失を含んでいてもよい。改変体の各ＣＤＲは、対応するモノクローナル抗体の各ＣＤＲと好ましくは９０～１００％の相同性を有し、より好ましくは９５～１００％、さらに好ましくは９８～１００％、最も好ましくは１００％の相同性を有する。また、改変体の重鎖および軽鎖のＣＤＲ１～３全体は、対応するモノクローナル抗体の重鎖および軽鎖のＣＤＲ１～３全体と好ましくは９０～１００％の相同性を有し、より好ましくは９５～１００％、さらに好ましくは９８～１００％、最も好ましくは１００％の相同性を有する。
　別の実施形態において、本発明の抗ｍＴＦモノクローナル抗体は、上記で例示したモノクローナル抗体が結合するｍＴＦのエピトープと同じエピトープに結合するモノクローナル抗体であり得る。該同じエピトープに結合する抗体は、好ましくはｍＴＦに結合でき、かつ、ｍＴＦを発現する細胞へのインターナリゼーション能を有する。当該実施形態において、該同じエピトープに結合する抗体は、上記で例示したモノクローナル抗体の改変体であってもよい。なお、該同じエピトープに結合する抗体の取得方法は上述のとおりである。
[Ｂ．モノクローナル抗体の製造方法]
Ｂ－１．ハイブリドーマを用いたモノクローナル抗体の作製
　本発明のモノクローナル抗体は、例えば、抗原で免疫した動物から得られる抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞融合によりハイブリドーマを調製し、得られるハイブリドーマから目的の抗体を産生するものを選択し、選択されたハイブリドーマに抗体を産生させることによって得られ得る。
Ｂ－１－１．抗原の調製
　動物の免疫に用いる抗原としては、例えば、ＴＦ（全長ＴＦ）またはその部分ペプチドあるいはＴＦを表面に発現する細胞が用いられ得る。ｈＴＦは、例えば、特開平９－３０２０００号に記載の方法等に準じてヒト胎盤由来のｈＴＦを精製して得ることができる。また、例えば、遺伝子工学的方法または化学合成法によってＴＦまたはその部分ペプチドを得ることができる。部分ペプチドは、必要に応じて任意の適切なキャリアタンパク質と結合させて用いられ得る。なお、ｈＴＦのｍＲＮＡ配列は、ＧｅｎＢａｎｋ　ＮＭ＿００１９９３．４（配列番号２７）において公知である。また、ｍＴＦのｍＲＮＡ配列は、ＧｅｎＢａｎｋ　Ｍ５７８９６．１（配列番号２８）において公知である。
Ｂ－１－２．抗体産生細胞の調製
　上記のようにして得られた抗原を任意の適切なアジュバントと混合して、マウス、ラット、ウマ、サル、ウサギ、ヤギ、ヒツジ等の非ヒト哺乳動物に投与して免疫する。免疫した動物の抗原に対する抗体価を測定し、抗体価の高い動物に対して最終免疫を施す。最終免疫日から数日後に脾臓細胞、リンパ節細胞等の抗体産生細胞を採取する。免疫方法および抗体産生細胞の採取方法の詳細は、当業者に周知であるのでその詳細な説明は省略する。抗体価は、例えば、動物から採取した血液を用いて、ＥＬＩＳＡ法等の酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、放射性免疫測定法（ＲＩＡ）等によって測定することができる。
Ｂ－１－３．細胞融合
　抗体産生細胞と融合させるミエローマ細胞としては、マウス、ラット等の動物に由来し、当業者が一般に入手可能な任意の適切な細胞株を用いることができる。好ましくは、薬剤抵抗性を有し、未融合の状態では選択培地（例えば、ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン含有培地（ＨＡＴ培地））で生存できず、融合した状態でのみ生存できる性質を有するミエローマ細胞が用いられる。細胞融合は、ＰＥＧ法、電気融合法等の任意の適切な方法を用いて行われ得る。次いで、細胞融合処理後の細胞を選択培地（例えば、ＨＡＴ培地）に懸濁および希釈し、培養プレートの各ウェルにて培養を行う。
Ｂ－１－４．ハイブリドーマのスクリーニングおよびクローニング
　上記細胞融合後の培養の結果、コロニーを形成した細胞をハイブリドーマとして選択する。次いで、選択したハイブリドーマを、例えばマイクロタイタープレート中で培養し、得られた培養上清を採取して抗原に対する反応性を測定する。抗原に対する反応性は、ＥＩＡ、ＲＩＡ等によって測定することができる。該測定の結果、抗原に対して反応性を示すものを選択し、限界希釈法等によってモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを単離する。
Ｂ－１－５．ハイブリドーマからのモノクローナル抗体の調製
　モノクローナル抗体は、上記ハイブリドーマを任意の適切な培地で培養し、得られた培養上清から精製する方法、マウス、ラット等の非ヒト哺乳動物の腹腔内にハイブリドーマを注入して腹水中で培養し、得られた腹水から精製する方法等によって調製され得る。抗体の精製は、例えば、硫安塩析法、ゲルろ過クロマトグラフィー法、イオン交換クロマトグラフィー法、抗イムノグロブリンカラム、プロテインＡカラム等のアフィニティカラムクロマトグラフィー法等を必要に応じて組み合わせて用いることによって行うことができる。
Ｂ－２．遺伝子工学的手法によるモノクローナル抗体の作製
　本発明のモノクローナル抗体は、例えば、上記ハイブリドーマ等の抗体産生細胞からクローニングされた抗体遺伝子を利用して、遺伝子工学的手法によって作製され得る。
Ｂ－２－１．可変領域をコードする遺伝子のクローニング
　目的の抗体を産生するハイブリドーマから全ｍＲＮＡを抽出し、得られた全ｍＲＮＡから逆転写酵素を用い、抗体遺伝子に共通な配列をプライマーとして抗体可変領域をコードするｃＤＮＡを合成する。当該ｃＤＮＡの合成および増幅は、例えば、５’－ＲＡＣＥ法を用いて行うことができ、その際、ｃＤＮＡの両末端に任意の適切な制限酵素サイトを導入することができる。得られたＰＣＲ産物から目的とするＤＮＡ断片を精製し、ベクターＤＮＡと連結して大腸菌等に導入することによって所望の組換えベクターを調製する。次いで、目的とする抗体遺伝子の塩基配列をデオキシ法等の公知の方法によって確認する。
Ｂ－２－２．宿主細胞への抗体遺伝子の導入
　上記のようにしてクローニングした可変領域をコードするＤＮＡを所望の抗体定常領域をコードするＤＮＡと連結し、これを発現ベクターへ組み込む。あるいは、可変領域をコードするＤＮＡを所望の定常領域をコードするＤＮＡを含む発現ベクターへ組み込んでもよい。このようにして得られた発現ベクターを任意の適切な宿主細胞に導入し、これにより、抗体を発現させることができる。このとき、重鎖または軽鎖を別々に発現ベクターに組み込み、これら２つの発現ベクターを同じ宿主細胞に同時に導入してもよいし、あるいは重鎖または軽鎖をコードするＤＮＡを単一の発現ベクターに組み込んで宿主細胞に導入してもよい。なお、可変領域をコードするＤＮＡは、Ｂ－２－１項で決定した塩基配列に基づいて人工遺伝子合成サービス等を利用して全合成を行うことによっても得られ得る。宿主細胞としては、例えば、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、酵母、細菌等が挙げられる。
Ｂ－２－３．宿主細胞からのモノクローナル抗体の調製
　モノクローナル抗体は、上記発現ベクターを組み込まれた宿主細胞を任意の適切な培地で培養し、得られた培養上清から精製することによって得られ得る。抗体の精製方法は、上述のとおりである。
Ｂ－３．キメラ抗体の作製
　ヒト型キメラ抗体は、例えば、上記と同様にして得たモノクローナル抗体の可変領域をコードするＤＮＡをヒト抗体の定常領域をコードするＤＮＡと連結し、これを発現ベクターに組み込んで宿主に導入し、発現させることにより得られ得る（例えば、ＷＯ９５／１４０４１）。
Ｂ－４．ヒト化抗体の作製
　ヒト化抗体は、いわゆるＣＤＲグラフティング技術を用いて、非ヒト哺乳動物の抗体のＣＤＲをヒト抗体のフレームワーク領域に連結するようにヒト抗体に移植することによって得られ得る。非ヒト哺乳動物（例えば、マウス）の抗体のＣＤＲをヒトのフレームワーク領域に移植する方法は公知であり、例えば、オーバーラップエクステンションＰＣＲ法が挙げられる。
　一般に、ＣＤＲグラフティングにおいては、非ヒト哺乳動物の抗体のフレームワーク領域と相同性の高いヒトフレームワーク領域を選択することが、ＣＤＲの機能の維持において有利である。よって、移植するＣＤＲに隣接するフレームワーク領域のアミノ酸配列と相同性の高いアミノ酸配列からなるヒトフレームワーク領域を利用することが好ましい。
［Ｃ．抗体断片］
　本発明はまた、Ａ項に記載のモノクローナル抗体の一部を含み、Ｔｉｓｓｕｅ　Ｆａｃｔｏｒと結合できる、抗体の断片を提供する。本発明の抗体の断片は、代表的には、Ｔｉｓｓｕｅ　Ｆａｃｔｏｒを発現する細胞へのインターナリゼーション能を有する。当該抗体断片としては、例えば、Ｆａｂ、Ｆ(ａｂ’)２、Ｆａｂ’、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ)、ジスルフィド安定化抗体（ｄｓＦｖ)、２量化体Ｖ領域断片(Ｄｉａｂｏｄｙ)、ＣＤＲを含むペプチド等が挙げられる。
　Ｆａｂは、上記モノクローナル抗体をパパイン処理して得ることができる。また、上記モノクローナル抗体のＦａｂをコードするＤＮＡを任意の適切な発現ベクターに挿入し、該ベクターを宿主細胞へ導入し、発現させることによって得ることもできる。
　Ｆ(ａｂ’)２は、上記モノクローナル抗体をペプシン処理して得ることができる。また、上記モノクローナル抗体のＦ(ａｂ’)２をコードするＤＮＡを任意の適切な発現ベクターに挿入し、該ベクターを宿主細胞へ導入し、発現させることによって得ることもできる。
　Ｆａｂ’は、Ｆ(ａｂ’)２のヒンジ間のＳ‐Ｓ結合を切断して得られる抗体断片である。Ｆａｂ’は、上記Ｆ(ａｂ’)２を還元剤ジチオスレイトール処理して得ることができる。また、Ｆａｂ’をコードするＤＮＡを任意の適切な発現ベクターに挿入し、該ベクターを宿主細胞へ導入し、発現させることによって得ることもできる。
　ｓｃＦｖは、重鎖と軽鎖の可変領域のみを適切なペプチドリンカーで連結したものである。ｓｃＦｖは、上記モノクローナル抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域をコードするＤＮＡに基づいてｓｃＦｖ発現ベクターを構築し、該ベクターを宿主細胞へ導入し、発現させることによって得ることができる。
　ｄｓＦｖは、重鎖可変領域および軽鎖可変領域中のそれぞれ１アミノ酸残基をシステイン残基に置換したポリペプチドをＳ‐Ｓ結合を介して結合したものである。各領域におけるシステイン残基の導入位置は分子モデリングにより予測される立体構造に基づき決定することができる。ｄｓＦｖは、上記モノクローナル抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域をコードするＤＮＡに基づいてｄｓＦｖ発現ベクターを構築し、該ベクターを宿主細胞へ導入し、発現させることによって得ることができる。
　Ｄｉａｂｏｄｙは、８アミノ酸残基以下の短いペプチドリンカーで連結されたｓｃＦｖの２量体であり、２価の抗原結合活性を有する。２価の抗原結合活性は、同一であってもよく、互いに異なっていてもよい。Ｄｉａｂｏｄｙは、上記モノクローナル抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域をコードするＤＮＡに基づいて８アミノ酸残基以下のペプチドリンカーで連結されたｓｃＦｖの発現ベクターを構築し、該ベクターを宿主細胞へ導入し、発現させることによって得ることができる。
　ＣＤＲを含むペプチドは、重鎖可変領域または軽鎖可変領域のＣＤＲの少なくとも１つを含む。ＣＤＲを含むペプチドは、複数のＣＤＲを直接または適当なペプチドリンカーを介して結合させたものであってもよい。ＣＤＲを含むペプチドは、上記モノクローナル抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域におけるＣＤＲをコードするＤＮＡを任意の適切な発現ベクターに挿入し、該ベクターを宿主細胞へ導入し、発現させることによって得ることができる。また、Ｆｍｏｃ法、ｔＢｏｃ法等の化学合成法によって得ることもできる。
［Ｄ．医薬組成物］
　本発明の医薬組成物は、標的結合因子としてのＡ項に記載のモノクローナル抗体またはＣ項に記載の抗体の断片と、薬物とを含む。上記モノクローナル抗体または該抗体の断片（以下、「モノクローナル抗体等」と称する場合がある）を標的結合因子として利用することにより、表面にＴＦを発現する細胞内に効率よく薬物を送達することができる。
　第１の実施形態において、上記モノクローナル抗体等は薬物と結合された状態であり得る。また、当該実施形態においては、必要に応じて、モノクローナル抗体等に高分子化合物がさらに結合されていてもよい。
　上記薬物としては、治療対象の疾患等に応じて任意の適切な薬物が選択される。例えば、核酸医薬、抗体医薬、遺伝子治療薬等のバイオ薬物およびサイトトキシン、細胞傷害性薬物等の細胞傷害分子が挙げられる。
　核酸医薬としては、例えば、プラスミドＤＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉｃｒｏ　ＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンス核酸、デコイ核酸、アプタマーおよびリボザイムサイトが挙げられる。
　サイトキシンとしては、例えば、タキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、エチジウムブロマイド、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジハイドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１－デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、ピューロマイシン、デュオカルマイシン、カリケアマイシン、マイタンシン、オーリスタチンまたはそれらの誘導体が挙げられる。
　細胞傷害性薬物としては、例えば、メトトレキセート、６－メルカプトプリン、６－チオグアニン、シタラビン、５－フルオロウラシルデカルバジン等の代謝拮抗物質、メクロレタミン、チオエパクロラムブチル、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロソスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ、シス－ジクロロジアミン白金（ＩＩ）等のアルカリ化剤、ダウノルビシン、ドキソルビシン等のアントラサイクリン、ダクチノマイシン、ブレオマイシン、ミトラマイシン、アンスラマイシン（ＡＭＣ）等の抗生物質およびビンクリスチン、ビンブラスチン等の有糸分裂剤が挙げられる。
　薬物または高分子化合物とモノクローナル抗体等との結合は、当該技術分野において公知の方法で行われ得る。例えば、各々が有する官能基または必要に応じて導入された官能基を反応させることによって行われ得る。当該官能基の組み合わせとしては、例えば、アミノ基とカルボキシル基、カルボキシル基とヒドロキシル基、マレイミド基とチオール基、チオール基とチオール基、ヒドラジド基とケトン基、ヒドラジド基とアルデヒド基、アミノ基とアルデヒド基、チオール基とカルボキシル基、アミノ基とスクアリン酸誘導体、ジエニルアルデヒド基とアミノ基、ハロエステルとチオール基、アジドとアルキン等が挙げられる。また、例えば、薬物がタンパク質またはペプチドである場合には、遺伝子工学的手法によりモノクローナル抗体等との融合タンパク質であってもよい。さらにまた、薬物が電荷を有する場合には、イオン結合を介して結合していてもよい。
　上記高分子化合物としては、任意の適切な高分子化合物が選択される。具体例としては、ポリエチレングリコール、アルブミン、デキストラン、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール等が挙げられる。このような高分子化合物が結合されることにより、血中安定性が向上し得る。
　高分子化合物の結合部位は、モノクローナル抗体等の抗原結合活性およびインターナリゼーション能を損なわない限りにおいて任意の適切な部位であり得る。
　第２の実施形態において、上記モノクローナル抗体等はＤＤＳキャリア素材と結合された状態であり得る。当該ＤＤＳキャリア素材としては、薬物を内包したナノ粒子（例えば、平均粒子径が好ましくは１０ｎｍ～４００ｎｍ、より好ましくは２０ｎｍ～３００ｎｍ、さらに好ましくは３０ｎｍ～１５０ｎｍの粒子）を形成し得るものが好ましく用いられ得る。このようなＤＤＳキャリア素材によれば、薬物を内包したナノ粒子が形成され得るので、生体内での該薬物の安定性が向上され得、また、徐放化が可能となる。さらに、モノクローナル抗体等による標的細胞内への確実な薬物送達が可能となる。
　モノクローナル抗体等は、ＤＤＳキャリア素材の任意の適切な位置に結合される。標的結合性を好適に発揮させる観点から、好ましくは、モノクローナル抗体等は、ＤＤＳキャリア素材が形成するナノ粒子の外表面に露出するように結合される。モノクローナル抗体等とＤＤＳキャリア素材との結合は、例えば、それぞれが有する官能基または必要に応じて導入した官能基を反応させることによって行われ得る。官能基の好ましい組み合わせについては上記のとおりである。
　上記ＤＤＳキャリア素材としては、例えば、親水性セグメントと疎水性セグメントとを有するブロックコポリマー等のポリマーミセル形成材料、リン脂質等のリポソーム形成材料、ゼラチン、コラーゲン、ヒアルロン酸、アルギン酸等の天然高分子、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール等の合成高分子等のナノハイドロゲルカプセル形成材料、ポリグリコール酸、ポリ乳酸およびこれらの共重合体等のナノスフェア形成材料が挙げられる。なかでも、親水性セグメントと疎水性セグメントとを有するブロックコポリマーを用いることが好ましい。親水性セグメントと疎水性セグメントとを有するブロックコポリマーの親水性セグメントにモノクローナル抗体等を結合して標的結合性ブロックコポリマーとすることにより、薬物を標的細胞内へ高い確実性で送達可能なポリマーミセルが得られ得る。
　上記薬物としては、第１の実施形態と同様の薬物が用いられ得る。第２の実施形態においては、薬物は、そのまま用いてもよく、親水性セグメントと疎水性セグメントとを有するブロックコポリマーの疎水性セグメントに結合されて、薬物結合ブロックコポリマーの形態で用いられてもよい。
［Ｅ．薬物送達用組成物］
　本発明の薬物送達用組成物は、Ａ項に記載のモノクローナル抗体またはＣ項に記載の抗体の断片を含む。上記モノクローナル抗体または該抗体の断片はＴＦを発現する細胞への標的結合因子として利用され得、さらには、該細胞へのインターナリゼーション能を発揮し得る。よって、本発明の薬物送達用組成物を用いて薬物を投与することにより、表面にＴＦを発現する細胞内に効率よく薬物を送達することができる。
［Ｆ．本発明の抗ＴＦモノクローナル抗体の用途］
　本発明の抗ＴＦモノクローナル抗体は、代表的には、Ｔｉｓｓｕｅ　Ｆａｃｔｏｒが関与する疾患（例えば、組織や細胞表面にてＴｉｓｓｕｅ　Ｆａｃｔｏｒの発現の亢進を伴う疾患）の治療に用いられる。Ｔｉｓｓｕｅ　Ｆａｃｔｏｒが関与する疾患としては、例えば、癌、炎症、血栓症等が挙げられる。ＴＦは、種々の癌組織において発現が恒常的に亢進していることから、癌の種類に関わらずその治療に用いることができる。また、例えば、膵臓癌においては、ＴＦを高発現する患者の予後が悪いことが報告されており、このような患者を対象とする治療においても有効に利用され得る。
　本発明の医薬組成物の投与ルートは、皮下、静脈、動脈、局所等の非経口投与が好ましく、静脈内注射が特に好ましい。投与量は、薬物の種類、用法、患者の年齢、性別、患者の健康状態等に応じて適切に決定され得る。
　以下、実施例により、本発明をさらに詳細に説明する。本発明はこれらの実施例により何ら限定されるものではない。なお、「部」および「％」は、「重量部」および「重量％」を意味する。
［実施例１　抗ｈＴＦモノクローナル抗体およびその断片］
［抗原の調製］
　ｈＴＦ全長アミノ酸配列の３３位～２５１位までのアミノ酸配列を含む組み換え蛋白質を大腸菌で発現させ、ニッケルカラムで精製して得られたレコンビナントｈＴＦ（配列番号２９）を抗原として用いた。
［ラットへの免疫］
　レコンビナントｈＴＦ５０μｇをフロイント完全アジュバント（Ｄｉｆｃｏ）と共に６週令のＷｉｓｔｅｒ雌ラット３匹に腹腔内投与し、初回免疫とした。その１４日後にレコンビナントｈＴＦ５０μｇをＳｉｇｍａ　Ａｄｊｕｖａｎｔ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ｓｉｇｍａ）と共に投与し、追加免疫とした。以降、２１日毎に同様の追加免疫を５回行った。さらに１２６日後にＰＢＳで希釈したレコンビナントｈＴＦ１０μｇを腹腔投与し、レコンビナントｈＴＦ４０μｇを尾静脈投与することで最終免疫とした。
［ハイブリドーマの調製］
　最終免疫の３日後に脾臓を摘出し、脾臓細胞を回収した。脾臓細胞とマウスミエローマ細胞（ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３）を５０％濃度のポリエチレングリコール４０００（Ｍｅｒｃｋ）を用いて融合させ、ＨＡＴ培地で選択した。
［抗体産生ハイブリドーマのスクリーニング］
　細胞融合８日後に抗体産生ハイブリドーマのスクリーニングを行った。スクリーニングに用いたイムノアッセイは以下のとおりである。ＥＬＩＳＡ法を行うにあたり、９６穴マイクロタイタープレート（ヌンク社製）の各ウェルにレコンビナントｈＴＦを１μｇ／ｍＬ含む５０ｍＭ炭酸緩衝液（ｐＨ８）を５０μＬ／ｗｅｌｌで添加し、４℃で一晩もしくは室温で２時間固定した。これらのウェルを３００μＬの洗浄液（０．０５％　Ｔｗｅｅｎ２０／２５ｍＭ　Ｔｒｉｓ／１４０ｍＭ　ＮａＣｌ／２．５ｍＭ　ＫＣｌ、ｐＨ７．４）で３回洗浄した後、ブロッキングバッファー（０．０５％　Ｔｗｅｅｎ２０／１％　ＢＳＡ／１００　ｍＭ　ＮａＨ２ＰＯ４／１４０ｍＭ　ＮａＣｌ、ｐＨ５）を２００μＬで加えて４℃で一晩もしくは室温で１時間静置してブロッキングを行った。このようにして得たｈＴＦ固相化プレートの各ウェルに５０μＬのハイブリドーマ培養上清を添加して室温で１時間反応させた。各ウェルを３００μＬの洗浄液で３回洗浄後、ブロッキングバッファーで５,０００倍に希釈したＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体（Ｂｅｔｈｙｌ）を５０μＬで加えて３０分反応させた。反応後、各ウェルを３００μＬの洗浄液で３回洗浄し、３．７ｍＭ　o-フェニレンジアミン／２５ｍＭ　クエン酸／１３０ｍＭ　Ｎａ２ＨＰＯ４／０．００６％　Ｈ２Ｏ２（ｐＨ５．０）を１００μＬで添加し、呈色させた。１０～１５分後に２規定硫酸を３０μＬ／ｗｅｌｌで添加して反応を停止し、吸光度（４９０ｎＭ）を吸光プレートリーダーで測定した。また免疫沈降ＥＬＩＳＡ法はレコンビナントｈＴＦとハイブリドーマ培養上清とを混合し、混合液中の未結合ｈＴＦの量をｈＴＦ定量サンドイッチＥＬＩＳＡで測定することで実施した。さらに、フローサイトメトリー法を定法に従って実施し、ｈＴＦ発現細胞に対するハイブリドーマ培養上清の反応性を測定した。
　上記測定の結果、ｈＴＦと強い親和性を示したハイブリドーマを選択し、これらのクローンについて限界希釈法を２回行うことでｈＴＦと結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマクローンを樹立した。
［抗体の調製］
　樹立した各ハイブリドーマを牛由来ＩｇＧを除去した牛血清を５％量含むＲＰＭＩ１６４０培地等で大量培養し、培養上清を得た。もしくは、各ハイブリドーマをＩＣＲヌードマウスの腹腔内で大量培養し、腹水を採取した。得られた培養上清もしくは腹水をＰｒｏｔｅｉｎ　Ｇアフィニティカラムクロマトグラフィーに供してＩｇＧモノクローナル抗体を精製した。
［インターナリゼーションアッセイ］
　上記のようにして得られた各モノクローナル抗体を以下のインターナリゼーションアッセイに供した。
　カルチャースライド４チャンバー（ＢＤ）にＴＦ高発現のヒト膵臓癌細胞ＢｘＰＣ３を５×１０４ｃｅｌｌｓ／チャンバーで播種し、ＲＰＭＩ　１６４０培地で３７℃、５％ＣＯ２環境下、１２時間培養した。ＰＢＳで３回洗浄した後にＡｌｅｘａ６４７蛍光ラベルｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で標識した３０μｇの抗体を１ｍｌのＲＰＭＩ　１６４０培地で希釈し各チャンバーに投与し、３時間培養した。当該３時間の培養においては、培養開始から２時間経過後に、終濃度７５ｎＭとなるようにＬｙｓｏｔｒａｃｋｅｒ　ＲＥＤ－ＤＮＤ９９（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を培養液に加え、その後さらに１時間培養した。次いで、ＰＢＳで３回洗浄後、４％パラホルムアルデヒドで固定し、ＤＡＰＩ（４’，６－ｄｉａｍｉｄｉｎｏ－２－ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅ）で核染色後、ＦｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔＧ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈ）で封入した。次いで、蛍光顕微鏡(Ｋｅｙｅｎｃｅ)を用いて各細胞を観察した。観察の結果を図１に示す。
　図１（ａ）および（ｂ）に示すように、２つのモノクローナル抗体（Ｎｏ．１８４９、Ｎｏ．１８５９）においては、細胞内に標識物質が移行していることから、これらのモノクローナル抗体がインターナリゼーション能を有することが確認された。一方、図１（ｃ）に示す抗体に関してはインターナリゼーション能が確認されなかった。なお、これらの抗体について、マウスモノクローナル抗体アイソタイピングＥＬＩＳＡキット（ＢＤバイオサイエンス社製）を用いて、抗体のサブクラスを決定した結果、Ｎｏ．１８４９はＩｇＧ２ｂ、Ｎｏ．１８５９はＩｇＧ２ａであった。
［可変領域をコードするＤＮＡ配列、アミノ酸配列およびＣＤＲ配列の決定］
１．抗ｈＴＦモノクローナル抗体（Ｎｏ．１８４９）
　抗ｈＴＦモノクローナル抗体（Ｎｏ．１８４９）を産生するハイブリドーマから常法に従って全ＲＮＡを抽出し、次いで、得られた全ＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。
　合成したｃＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲ法にて、抗ｈＴＦモノクローナル抗体（Ｎｏ．１８４９）の重鎖可変領域および軽鎖可変領域をコードするＤＮＡ断片を得た。具体的には、下記のプライマー一覧の中から、重鎖可変領域クローニング用のセンスプライマーおよびアンチセンスプライマーとして、それぞれ、以下のプライマー１～１９の混合プライマーおよびプライマー２０を用い、軽鎖可変領域クローニング用のセンスプライマーおよびアンチセンスプライマーとして、それぞれ、以下のプライマー２２～３８の混合プライマーおよびプライマー３９を用いてＰＣＲを行った。
［プライマー一覧］
プライマー１（配列番号３０）
ＮＮＣＣＡＴＧＧＣＣＧＡＧＧＴＲＭＡＧＣＴＴＣＡＧＧＡＧＴＣ
プライマー２（配列番号３１）
ＮＮＣＣＡＴＧＧＣＣＧＡＧＧＴＢＣＡＧＣＴＢＣＡＧＣＡＧＴＣ
プライマー３（配列番号３２）
ＮＮＣＣＡＴＧＧＣＣＧＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＡＡＧＳＡＳＴＣ
プライマー４（配列番号３３）
ＮＮＣＣＡＴＧＧＣＣＧＡＧＧＴＣＣＡＲＣＴＧＣＡＡＣＡＲＴＣ
プライマー５（配列番号３４）
ＮＮＣＣＡＴＧＧＣＣＧＡＧＧＴＹＣＡＧＣＴＢＣＡＧＣＡＲＴＣ
プライマー６（配列番号３５）
ＮＮＣＣＡＴＧＧＣＣＧＡＧＧＴＹＣＡＲＣＴＧＣＡＧＣＡＧＴＣ
プライマー７（配列番号３６）
ＮＮＣＣＡＴＧＧＣＣＧＡＧＧＴＣＣＡＣＧＴＧＡＡＧＣＡＧＴＣ
プライマー８（配列番号３７）
ＮＮＣＣＡＴＧＧＣＣＧＡＧＧＴＧＡＡＳＳＴＧＧＴＧＧＡＡＴＣ
プライマー９（配列番号３８）
ＮＮＣＣＡＴＧＧＣＣＧＡＧＧＴＧＡＷＧＹＴＧＧＴＧＧＡＧＴＣ
プライマー１０（配列番号３９）
ＮＮＣＣＡＴＧＧＣＣＧＡＧＧＴＧＣＡＧＳＫＧＧＴＧＧＡＧＴＣ
プライマー１１（配列番号４０）
ＮＮＣＣＡＴＧＧＣＣＧＡＧＧＴＧＣＡＭＣＴＧＧＴＧＧＡＧＴＣ
プライマー１２（配列番号４１）
ＮＮＣＣＡＴＧＧＣＣＧＡＧＧＴＧＡＡＧＣＴＧＡＴＧＧＡＲＴＣ
プライマー１３（配列番号４２）
ＮＮＣＣＡＴＧＧＣＣＧＡＧＧＴＧＣＡＲＣＴＴＧＴＴＧＡＧＴＣ
プライマー１４（配列番号４３）
ＮＮＣＣＡＴＧＧＣＣＧＡＧＧＴＲＡＡＧＣＴＴＣＴＣＧＡＧＴＣ
プライマー１５（配列番号４４）
ＮＮＣＣＡＴＧＧＣＣＧＡＧＧＴＧＡＡＲＳＴＴＧＡＧＧＡＧＴＣ
プライマー１６（配列番号４５）
ＮＮＣＣＡＴＧＧＣＣＧＡＧＧＴＴＡＣＴＣＴＲＡＡＡＧＷＧＴＳＴＧ
プライマー１７（配列番号４６）
ＮＮＣＣＡＴＧＧＣＣＧＡＧＧＴＣＣＡＡＣＴＶＣＡＧＣＡＲＣＣ
プライマー１８（配列番号４７）
ＮＮＣＣＡＴＧＧＣＣＧＡＧＧＴＧＡＡＣＴＴＧＧＡＡＧＴＧＴＣ
プライマー１９（配列番号４８）
ＮＮＣＣＡＴＧＧＣＣＧＡＧＧＴＧＡＡＧＧＴＣＡＴＣＧＡＧＴＣ
プライマー２０（配列番号４９）
ＴＧＴＧＣＡＧＡＣＣＣＴＣＧＴＧＧＡＣＣＡＣＧＧＡＧＣＡ
プライマー２１（配列番号５０）
ＧＧＡＣＴＣＴＧＧＧＲＴＣＡＴＴＴＡＣＣＭＧＧＡＧＡＧＴ
プライマー２２（配列番号５１）
ＮＮＮＮＧＴＣＧＡＣＧＣＴＣＧＡＹＡＴＣＣＡＧＣＴＧＡＣＴＣＡＧＣＣ
プライマー２３（配列番号５２）
ＮＮＮＮＧＴＣＧＡＣＧＣＴＣＧＡＹＡＴＴＧＴＴＣＴＣＷＣＣＣＡＧＴＣ
プライマー２４（配列番号５３）
ＮＮＮＮＧＴＣＧＡＣＧＣＴＣＧＡＹＡＴＴＧＴＧＭＴＭＡＣＴＣＡＧＴＣ
プライマー２５（配列番号５４）
ＮＮＮＮＧＴＣＧＡＣＧＣＴＣＧＡＹＡＴＴＧＴＧＹＴＲＡＣＡＣＡＧＴＣ
プライマー２６（配列番号５５）
ＮＮＮＮＧＴＣＧＡＣＧＣＴＣＧＡＹＡＴＴＧＴＲＡＴＧＡＣＭＣＡＧＴＣ
プライマー２７（配列番号５６）
ＮＮＮＮＧＴＣＧＡＣＧＣＴＣＧＡＹＡＴＴＭＡＧＡＴＲＡＭＣＣＡＧＴＣ
プライマー２８（配列番号５７）
ＮＮＮＮＧＴＣＧＡＣＧＣＴＣＧＡＹＡＴＴＣＡＧＡＴＧＡＹＤＣＡＧＴＣ
プライマー２９（配列番号５８）
ＮＮＮＮＧＴＣＧＡＣＧＣＴＣＧＡＹＡＴＹＣＡＧＡＴＧＡＣＡＣＡＧＡＣ
プライマー３０（配列番号５９）
ＮＮＮＮＧＴＣＧＡＣＧＣＴＣＧＡＹＡＴＴＧＴＴＣＴＣＡＷＣＣＡＧＴＣ
プライマー３１（配列番号６０）
ＮＮＮＮＧＴＣＧＡＣＧＣＴＣＧＡＹＡＴＴＧＷＧＣＴＳＡＣＣＣＡＡＴＣ
プライマー３２（配列番号６１）
ＮＮＮＮＧＴＣＧＡＣＧＣＴＣＧＡＹＡＴＴＳＴＲＡＴＧＡＣＣＣＡＲＴＣ
プライマー３３（配列番号６２）
ＮＮＮＮＧＴＣＧＡＣＧＣＴＣＧＡＹＲＴＴＫＴＧＡＴＧＡＣＣＣＡＲＡＣ
プライマー３４（配列番号６３）
ＮＮＮＮＧＴＣＧＡＣＧＣＴＣＧＡＹＡＴＴＧＴＧＡＴＧＡＣＢＣＡＧＫＣ
プライマー３５（配列番号６４）
ＮＮＮＮＧＴＣＧＡＣＧＣＴＣＧＡＹＡＴＴＧＴＧＡＴＡＡＣＹＣＡＧＧＡ
プライマー３６（配列番号６５）
ＮＮＮＮＧＴＣＧＡＣＧＣＴＣＧＡＹＡＴＴＧＴＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＷＴ
プライマー３７（配列番号６６）
ＮＮＮＮＧＴＣＧＡＣＧＣＴＣＧＡＹＡＴＴＧＴＧＡＴＧＡＣＡＣＡＡＣＣ
プライマー３８（配列番号６７）
ＮＮＮＮＧＴＣＧＡＣＧＣＴＣＧＡＹＡＴＴＴＴＧＣＴＧＡＣＴＣＡＧＴＣ
プライマー３９（配列番号６８）
ＣＣＴＴＡＧＧＡＧＧＧＡＡＧＡＴＴＧＧＡＡＧＧＡＧＣＴ
　なお、上記塩基配列中、ＲはＧまたはＡ、ＹはＴまたはＣ、ＭはＡまたはＣ、ＫはＧまたはＴ、ＳはＧまたはＣ、ＷはＡまたはＴ、ＢはＧ、ＣまたはＴ、ＤはＡ、ＧまたはＴ、ＶはＡ、ＧまたはＣ、ＮはＡ、Ｔ、ＧまたはＣを意味する。
　上記で得られた各ＰＣＲ産物を常法に従ってベクターにクローニングし、塩基配列を決定した。
　上記のようにして決定した抗ｈＴＦモノクローナル抗体（Ｎｏ．１８４９）の重鎖可変領域および軽鎖可変領域の塩基配列はそれぞれ、配列番号６９および７０に記載のとおりである。また、該重鎖可変領域および軽鎖可変領域のアミノ酸配列はそれぞれ配列番号９および１０に記載されるとおりである。また、これらのアミノ酸配列を既知の抗体のアミノ酸配列のデータベース（ＩＭＧＴのウェブサイト：ｈｔｔｐ:／／ｗｗｗ.ｉｍｇｔ.ｏｒｇ／）と比較して相同性を調べることにより、ＣＤＲのアミノ酸配列を以下のとおり決定した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
２．抗ｈＴＦモノクローナル抗体（Ｎｏ．１８５９）
　抗ｈＴＦモノクローナル抗体（Ｎｏ．１８５９）を産生するハイブリドーマから全ＲＮＡを抽出したこと、および、重鎖可変領域クローニング用のアンチセンスプライマーとしてプライマー２１を用いたこと以外は、上記と同様にして抗ｈＴＦモノクローナル抗体（Ｎｏ．１８５９）の重鎖可変領域および軽鎖可変領域の塩基配列を決定した。
　決定された抗ｈＴＦモノクローナル抗体（Ｎｏ．１８５９）の重鎖可変領域および軽鎖可変領域の塩基配列はそれぞれ配列番号７１および７２に記載のとおりである。また、該重鎖可変領域および軽鎖可変領域のアミノ酸配列はそれぞれ配列番号１７および１８に記載されるとおりである。また、これらの可変領域におけるＣＤＲのアミノ酸配列を以下のとおり決定した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
［表面プラズモン共鳴法による結合活性評価］
　Ｂｉａｃｏｒｅ社のＣＭ５チップ表面に抗ｈＴＦモノクローナル抗体（Ｎｏ．１８４９、Ｎｏ．１８５９）を固相化した。各抗体を固相化したＣＭ５チップをＳＰＲ装置にセットし、その流路に精製ｈＴＦを含有した抗原含有ｂｕｆｆｅｒを流した。この測定系により各抗体とｈＴＦとの解離定数を求めた。なお、測定条件は以下のとおりである。
ＳＰＲ装置：Ｂｉａｃｏｒｅ　２０００（ビアコア社）
抗原含有ｂｕｆｆｅｒ：ｈＴＦを最終濃度２５μｇ／ｍｌで含む１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）
Ｒｕｎｎｉｎｇ　ｂｕｆｆｅｒ：ＨＢＳ－ＥＰ　ｂｕｆｆｅｒ　（１０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ，　ｐＨ７．５，　０．１５Ｍ　ＮａＣｌ，　３ｍＭ　ＥＤＴＡ，　０．００５％　ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ　Ｐ２０（Ｔｗｅｅｎ　２０），　ｐＨ７．４）。
　上記測定の結果、各抗体のｈＴＦに対する解離定数（ＫＤ）は、Ｎｏ．１８４９が９．１３９×１０－１１、Ｎｏ．１８５９が１．８９４×１０－１０であった。
［抗凝固作用評価］
　以下のようにして、抗ｈＴＦモノクローナル抗体（Ｎｏ．１８４９およびＮｏ．１８５９）のプロトロンビン時間を測定した。
　リコンビナントｈＴＦ抗原３５０ｎｇに抗体３μｇを添加し、全量が５μｌになるまでＰＢＳを加えた。３７℃、６００ｒｐｍで振とうさせながら１５分抗原抗体反応をさせた。反応液に３．８％クエン酸ナトリウムで抗凝固処理をしたヒト血漿　５０μｌ、２５ｍＭ　ＣａＣｌ２　１００μｌを添加すると同時に３７℃、６００ｒｐｍで振とうさせながら培養し、フィブリン塊が形成されるまでの時間（プロトロンビン時間）を計測した。反応液の代わりにＰＢＳを用いた対照におけるプロトロンビン時間を１としたときの各抗体の凝固延長時間比（プロトロンビン時間比）を表３および図２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　表３および図２に示されるとおり、Ｎｏ．１８５９の凝固延長時間比は１．２２２であり、抗凝固作用が極めて小さいことがわかる。
［実施例２　医薬組成物］
［モノクローナル抗体と薬物との結合］
　以下のようにしてモノメチルオーリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）が結合された抗ｈＴＦモノクローナル抗体（Ｎｏ．１８４９）（以下、「ｈＴＦ－ＭＭＡＥ」と称する）を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
 　Ｈ－Ｃｉｔ－ＯＨ（１．１８ｇ，６．７４ｍｍｏｌ）とＮａＨＣＯ３（５６６ｍｇ，６．７４ｍｍｏｌ）の水溶液（１８ｍＬ）にＦｍｏｃ－Ｖａｌ－ＯＳｕ（２．８０ｇ，６．４２ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（１８ｍＬ）溶液を加え、さらにＴＨＦ（９ｍＬ）を加えて、終夜撹拌した。反応を１５％クエン酸水溶液（４０ｍＬ）により停止させ、水層をＡｃＯＥｔ／ｉ－ＰｒＯＨ（９／１）混合溶液（１００ｍＬ，２０ｍＬ　×２）により抽出した。あわせた有機層を水（７０ｍＬ）で洗浄し、減圧濃縮した。残渣の固体をジエチルエーテルにより洗浄し、ジペプチド（３．１１ｇ，９７％）を白色固体として得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
 　Ｆｍｏｃ－Ｖａｌ－Ｃｉｔ－ＯＨ（３．００ｇ，６．０４ｍｍｏｌ）とｐ－アミノベンジルアルコール（１．４９ｇ，１２．１ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（７０ｍＬ）とメタノール（３０ｍＬ）の溶液に１－エトキシカルボニル－２－エトキシ－１，２－ジヒドロキノリン（ＥＥＤＱ）（２．９９ｇ，１２．１ｍｍｏｌ）を加えた。１日後、さらにＥＥＤＱ（１．５０ｇ，６．０４ｍｍｏｌ）を加え、終夜撹拌した。反応液を濃縮し、残渣をジエチルエーテルにより洗浄し、目的物（２．５１ｇ，６９％）を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
 　Ｆｍｏｃ－Ｖａｌ－Ｃｉｔ－ＰＡＢ－ＯＨ（２．００ｇ，３．３２ｍｍｏｌ）をジメチルホルムアミド（２０ｍＬ）に溶かし、ビス－ｐ－ニトロフェニルカーボネート（２．０２ｍｇ，６．６５ｍｍｏｌ）とジイソプロピルエチルアミン（０．８７ｍＬ，４．９８ｍｍｏｌ）を加えた。終夜撹拌した後、反応溶液を減圧濃縮し、残渣を酢酸エチルとジエチルエーテルにより洗浄し、ｐ－ニトロフェニルカーボネート体（１．７３ｇ，６８％）を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
 　ｐ－ニトロフェニルカーボネート体（１．２８ｇ，１．６７ｍｍｏｌ）とＨＯＢｔ（３７６ｍｇ，２．７８ｍｍｏｌ）のジメチルホルムアミド（３．４ｍＬ）とピリジン（０．８５ｍＬ）の溶液にＭＭＡＥ（１．００ｇ，１．３９ｍｍｏｌ）を加えた。２４時間後、反応液をＳｅｐｈａｄｅｘ　ＬＨ２０（溶媒ＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ＝１：１）により精製し、Ｆｍｏｃ－Ｖａｌ－Ｃｉｔ－ＰＡＢＣ－ＭＭＡＥ（１．４４　ｇ，７７％）を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
 　Ｆｍｏｃ－Ｖａｌ－Ｃｉｔ－ＰＡＢＣ－ＭＭＡＥ（１．４４ｇ，１．０７ｍｍｏｌ）のジメチルホルムアミド溶液（２０ｍＬ）にＥｔ２ＮＨ（５ｍＬ）を加えた。終夜撹拌後、反応液を減圧濃縮し、残渣を酢酸エチルとジエチルエーテルにて洗浄し、淡黄色固体（９６０ｍｇ，８０％）を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
 　Ｈ－Ｖａｌ－Ｃｉｔ－ＰＡＢＣ－ＭＭＡＥ（９６０ｍｇ，０．８５５ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液（２０ｍＬ）にＮ末端にマレイミド基を有するＭａｌ－ＰＥＧ１２－ＯＳｕ（８１４ｍｇ，０．９４ｍｍｏｌ）とジイソプロピルエチルアミン（０．４５ｍｍｏｌ，２．５７ｍｍｏｌ）を加えた。終夜撹拌し、反応液をＳｅｐｈａｄｅｘ　ＬＨ２０（ＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ＝１：１）と分子ふるいＨＰＬＣにより精製し、Ｍａｌ－ＰＥＧ１２－Ｖａｌ－Ｃｉｔ－ＰＡＢＣ－ＭＭＡＥ（以下、「マレイミドＭＭＡＥ化合物」と称する場合がある）を無色オイル（７６９ｍｇ，４８％）として得た。
　５ｍＭ　ＥＤＴＡ含有ＰＢＳと１５０ｍＭ　ＮａＣｌおよび５ｍＭ　ＥＤＴＡ含有１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）とを用いてｐＨ６．４の緩衝液を調製し、得られた緩衝液を用いて抗体濃度が１．０ｍｇ／ｍｌになるよう抗体溶液を調製した。該抗体溶液にジチオトレイトール（ＤＴＴ）を最終濃度１～１０ｍＭになるように加えて、２６～３７℃で３０～４５分反応させた。次いで、Ａｍｉｃｏｎ　Ｕｌｔｒａ（ＭＷＣＯ:３０，０００）で反応液から反応試薬を除去した。吸収測定したところ抗体の回収率は８０～９９％であった。また、５，５’－ジチオビス（２－ニトロ安息香酸）（ＤＮＴＢ）によるＳＨ基の定量結果から、１抗体あたり３～５個のＳＨ基が得られたことがわかった。
　次に、５ｍＭ　ＥＤＴＡ含有ＰＢＳと１５０ｍＭ　ＮａＣｌおよび５ｍＭ　ＥＤＴＡ含有１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）とを用いてｐＨ６．４の緩衝液を調製し、得られた緩衝液を用いて上記反応液をタンパク質濃度０．５ｍｇ／ｍｌとなるように希釈した。該希釈液に上記マレイミドＭＭＡＥ化合物を１：４のモル比（抗体：マレイミドＭＭＡＥ化合物）で混合した後、室温１時間、その後４℃で一晩反応させた。
　その後、Ａｍｉｃｏｎ　Ｕｌｔｒａ（ＭＷＣＯ:３０，０００）で反応液から反応試薬を除去した後、溶媒をＰＢＳに置換した。Ａｍｉｃｏｎ　Ｕｌｔｒａでタンパク質を回収したところ６０～９０％の回収率であった。
　上記のようにして、抗体１個あたり３～５個のＭＭＡＥが付加されたｈＴＦ－ＭＭＡＥを得た。
［殺細胞効果確認試験］
　９６ｗｅｌｌ　ｐｌａｔｅにヒト膵臓癌細胞（ＢｘＰＣ３）を３×１０３個ずつ加え、１０％ＦＣＳ、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）、およびストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）を含むＲＰＭＩ培地で培養した。各ウェルに種々の薬物濃度となるようにｈＴＦ－ＭＭＡＥを添加し、添加後７２時間における細胞生存率を算出した。
　なお、比較試験として、ｈＴＦ－ＭＭＡＥの代わりに、ヒト癌細胞に発現していないマウスＴＦに対するモノクローナル抗体（ｍＴＦ）に上記と同様にしてＭＭＡＥを結合したｍＴＦ－ＭＭＡＥを用いて同様の試験を行い、細胞生存率を算出した。ネガティブコントロール（薬物サンプルの添加なし）の細胞生存率を１００％とした場合における各細胞生存率の割合（％）を図３に示す。
　図３に示されるとおり、ｈＴＦ－ＭＭＡＥは、ｍＴＦ－ＭＭＡＥに比べて顕著に優れた殺細胞効果を示した。このことから、薬物が抗ｈＴＦモノクローナル抗体（Ｎｏ．１８４９）に結合されることによって、表面にｈＴＦを発現する細胞内への移行性が向上し、高い薬効を発揮し得ることがわかる。
［抗腫瘍効果確認試験］
　４週齢ヌードマウス（ＢＡＬＢｃ　ｎｕ／ｎｕ、メス）の背部皮下に１×１０７個／１００μＬのヒト膵臓癌細胞（ＢｘＰＣ３）を移植し、腫瘍体積（腫瘍径に基づいて算出）が約２００ｍｍ３となった時点から治療を開始した。治療開始当日をＤａｙ０とし、Ｄａｙ０、４および８に１回ずつ薬物を尾静脈投与した（計３回投与）。薬物としては、ｈＴＦ－ＭＭＡＥを用い、対照として生理食塩水を投与した（各群：Ｎ＝７）。薬物の投与量は、１回あたり１０ｍｇ／ｋｇ（抗体量：約２００μｇ／匹）であった。以後、Ｄａｙ３０まで腫瘍径および体重を週２回計測した。Ｄａｙ０における腫瘍体積および体重に対する腫瘍体積および体重の比をそれぞれ図４および５に示す。
　図４に示されるとおり、ｈＴＦ－ＭＭＡＥは顕著に優れた抗腫瘍効果を示した。該結果はｉｎ　ｖｉｔｒｏで確認された殺細胞効果に一致するものである。また、図５に示されるとおり、ｈＴＦ－ＭＭＡＥを投与した群において体重の減少は確認されなかった。
［実施例３　抗ｍＴＦモノクローナル抗体およびその断片］
［抗原の調製］
　ｍＴＦ全長アミノ酸配列の３０位～２５１位までのアミノ酸配列を含む組み換え蛋白質を大腸菌で発現させ、ニッケルカラムで精製して得られたレコンビナントｍＴＦ（配列番号７３）を抗原として用いた。
［ラットへの免疫］
　レコンビナントｍＴＦ５０μｇをフロイント完全アジュバント（Ｄｉｆｃｏ）と共に６週令のＷｉｓｔｅｒ雌ラット３匹に腹腔内投与し、初回免疫とした。その１４日後にレコンビナントｍＴＦ５０μｇをＳｉｇｍａ　Ａｄｊｕｖａｎｔ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ｓｉｇｍａ）と共に投与し、追加免疫とした。以降、２１日毎に同様の追加免疫を７回行った。さらに２０７日後にＰＢＳで希釈したレコンビナントｍＴＦ１０μｇを腹腔投与し、レコンビナントｍＴＦ４０μｇを尾静脈投与することで最終免疫とした。
［ハイブリドーマの調製］
　最終免疫の３日後に脾臓を摘出し、脾臓細胞を回収した。脾臓細胞とマウスミエローマ細胞（ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３）を５０％濃度のポリエチレングリコール４０００（Ｍｅｒｃｋ）を用いて融合させ、ＨＡＴ培地で選択した。
［抗体産生ハイブリドーマのスクリーニング］
　細胞融合８日後に抗体産生ハイブリドーマのスクリーニングを行った。スクリーニングに用いたイムノアッセイは以下のとおりである。ＥＬＩＳＡ法を行うにあたり、９６穴マイクロタイタープレート（ヌンク社製）の各ウェルにレコンビナントｍＴＦを１μｇ／ｍＬ含む５０ｍＭ炭酸緩衝液（ｐＨ８）を５０μＬ／ｗｅｌｌで添加し、４℃で一晩もしくは室温で２時間固定した。これらのウェルを３００μＬの洗浄液（０．０５％　Ｔｗｅｅｎ２０／２５ｍＭ　Ｔｒｉｓ／１４０ｍＭ　ＮａＣｌ／２．５ｍＭ　ＫＣｌ、ｐＨ７．４）で３回洗浄した後、ブロッキングバッファー（０．０５％　Ｔｗｅｅｎ２０／１％　ＢＳＡ／１００　ｍＭ　ＮａＨ２ＰＯ４／１４０ｍＭ　ＮａＣｌ、ｐＨ５）を２００μＬで加えて４℃で一晩もしくは室温で１時間静置してブロッキングを行った。このようにして得たｍＴＦ固相化プレートの各ウェルに５０μＬのハイブリドーマ培養上清を添加して室温で１時間反応させた。各ウェルを３００μＬの洗浄液で３回洗浄後、ブロッキングバッファーで５,０００倍に希釈したＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体（Ｂｅｔｈｙｌ）を５０μＬで加えて３０分反応させた。反応後、各ウェルを３００μＬの洗浄液で３回洗浄し、３．７ｍＭ　o-フェニレンジアミン／２５ｍＭ　クエン酸／１３０ｍＭ　Ｎａ２ＨＰＯ４／０．００６％　Ｈ２Ｏ２（ｐＨ５．０）を１００μＬで添加し、呈色させた。１０～１５分後に２規定硫酸を３０μＬ／ｗｅｌｌで添加して反応を停止し、吸光度（４９０ｎＭ）を吸光プレートリーダーで測定した。また免疫沈降ＥＬＩＳＡ法はレコンビナントｍＴＦとハイブリドーマ培養上清とを混合し、混合液中の未結合ｍＴＦの量をｍＴＦ定量サンドイッチＥＬＩＳＡで測定することで実施した。さらに、フローサイトメトリー法を定法に従って実施し、ｈＴＦ発現細胞に対するハイブリドーマ培養上清の反応性を測定した。
　上記測定の結果、ｍＴＦと強い親和性を示したハイブリドーマを選択し、これらのクローンについて限界希釈法を２回行うことでｍＴＦと結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマクローンを樹立した。
［抗体の調製］
　樹立した各ハイブリドーマを牛由来ＩｇＧを除去した牛血清を５％量含むＲＰＭＩ１６４０培地等で大量培養し、培養上清を得た。もしくは、各ハイブリドーマをＩＣＲヌードマウスの腹腔内で大量培養し、腹水を採取した。得られた培養上清もしくは腹水をＰｒｏｔｅｉｎ　Ｇアフィニティカラムクロマトグラフィーに供してＩｇＧモノクローナル抗体を精製した。
［インターナリゼーションアッセイ］
　上記のようにして得られた各モノクローナル抗体を以下のインターナリゼーションアッセイに供した。
　カルチャースライド４チャンバー（ＢＤ）にマウスＢ１６メラノーマ細胞とそのＴＦ強制発現細胞を５×１０４ｃｅｌｌｓ／チャンバーで播種し、ＲＰＭＩ　１６４０培地で３７℃、５％ＣＯ２環境下、１２時間培養した。ＰＢＳで３回洗浄した後にＡｌｅｘａ６４７蛍光ラベルｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で標識した３０μｇの抗体を１ｍｌのＲＰＭＩ　１６４０培地で希釈し各チャンバーに投与し、３時間培養した。当該３時間の培養においては、培養開始から２時間経過後に、終濃度７５ｎＭとなるようにＬｙｓｏｔｒａｃｋｅｒ　ＲＥＤ－ＤＮＤ９９（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を培養液に加え、その後さらに１時間培養した。次いで、ＰＢＳで３回洗浄後、４％パラホルムアルデヒドで固定し、ＤＡＰＩ（４’，６－ｄｉａｍｉｄｉｎｏ－２－ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅ）で核染色後、ＦｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔＧ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈ）で封入した。次いで、蛍光顕微鏡(Ｋｅｙｅｎｃｅ)を用いて各細胞を観察した。観察の結果を図６に示す。
　図６に示すように、モノクローナル抗体（Ｎｏ．１１５７）においては、細胞内に蛍光標識された抗体（赤色）が移行していることから、当該モノクローナル抗体がｍＴＦを発現する細胞へのインターナリゼーション能を有することが確認された。なお、図６において、蛍光標識された抗体（赤色）が内部に移行している細胞は、ＴＦ強制発現のマウスＢ１６メラノーマ細胞であり、内部に抗体が移行していない細胞は、通常のマウスＢ１６メラノーマ細胞と推測される（参考として、ＴＦ強制発現のマウスＢ１６メラノーマ細胞におけるＴＦ発現量の増強レベルを図７に示す。図７は、マウスＢ１６メラノーマ細胞およびそのＴＦ強制発現細胞におけるＧＡＰＤＨのｍＲＮＡ発現量に対するＴＦのｍＲＮＡ発現量の割合を示すグラフである）。
［可変領域をコードするＤＮＡ配列、アミノ酸配列およびＣＤＲ配列の決定］
　抗ｍＴＦモノクローナル抗体（Ｎｏ．１１５７）を産生するハイブリドーマから全ＲＮＡを抽出したこと以外は、抗ｈＴＦモノクローナル抗体（Ｎｏ．１８４９）の重鎖可変領域および軽鎖可変領域の塩基配列の決定方法と同様にして、抗ｍＴＦモノクローナル抗体（Ｎｏ．１１５７）の重鎖可変領域および軽鎖可変領域の塩基配列を決定した。
　決定された抗ｍＴＦモノクローナル抗体（Ｎｏ．１１５７）の重鎖可変領域および軽鎖可変領域の塩基配列はそれぞれ配列番号７４および７５に記載のとおりである。また、該重鎖可変領域および軽鎖可変領域のアミノ酸配列はそれぞれ配列番号２５および２６に記載されるとおりである。また、これらの可変領域におけるＣＤＲのアミノ酸配列を以下のとおり決定した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
［実施例４　キメラ抗体の作製］
　実施例１でクローニングした抗ｈＴＦモノクローナル抗体（Ｎｏ．１８４９）の重鎖可変領域および軽鎖可変領域をコードするＤＮＡ断片をＰＣＲで増幅した。重鎖の可変領域ＤＮＡ断片をヒトＩｇＧ１重鎖定常領域を発現するクローニングベクター（ｐＦＵＳＥｓｓ＿ＣＨＩｇ－ｈＧ１ｅ２（ｉｎｖｉｖｏＧｅｎ））に挿入し、軽鎖の可変領域ＤＮＡ断片をヒトｋａｐｐａ軽鎖定常領域を発現するクローニングベクター（ｐＦＵＳＥ２ｓｓ＿ＣＬＩｇ＿ｈｋ（ｉｎｖｉｖｏＧｅｎ））に挿入して、発現ベクターを得た。得られた発現ベクターをＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ　ＬＴＸ　Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＣＨＯ－Ｋ１細胞にトランスフェクションした。次いで、１０μｇ／ｍＬ　Ｂｌａｓｔｃｉｄｉｎ　Ｓ（科研製薬）および３００μｇ／ｍＬ　Ｚｅｏｃｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて薬剤選択を行い、両耐性細胞株を得た。
　得られた細胞株をＨａｍ’ｓ　Ｆ１２Ｋ（ｗａｋｏ）、１０％ＦＢＳ、１％ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ、ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１０μｇ／ｍＬ　Ｂｌａｓｔｃｉｄｉｎ　Ｓおよび３００μｇ／ｍＬ　Ｚｅｏｃｉｎを含む培地で維持培養した。次いで、９６ｗｅｌｌプレートを用いた限界希釈法により抗ｈＴＦヒト型キメラ抗体の定常発現細胞株（Ｎｏ．１８４９キメラクローン）をクローニングした。
　クローニングした細胞株（Ｎｏ．１８４９キメラクローン）の培養上清をＥＬＩＳＡに供したところ、ｈＴＦとの反応性が確認できた。また、クローニングした細胞株の培養上清をフローサイトメトリー解析（ＦＡＣＳ）に供したところ、ヒト結腸腺癌細胞（ＤＬＤ－１）に対する反応性が確認できた。具体的には、図８に示されるとおり、培養上清は、ｈＴＦ発現細胞であるＤＬＤ－１に対して特異的な反応性を示した（図８中、（１）、（２）および（３）はそれぞれ、ラット抗ｈＴＦモノクローナル抗体（Ｎｏ．１８４９）、Ｎｏ．１８４９キメラクローンの培養上清およびラットのアイソタイプ・コントロールを用いた解析結果を示す）。
［キメラ抗体をコードするＤＮＡ配列およびアミノ酸配列の決定］
　Ｎｏ．１８４９キメラクローンからベクターを抽出し、常法に従って該ベクターにコードされている抗ｈＴＦヒト型キメラ抗体（Ｎｏ．１８４９）の重鎖および軽鎖の塩基配列ならびにアミノ酸配列を決定した。決定されたキメラ抗体の重鎖および軽鎖の塩基配列はそれぞれ配列番号７６および７７に記載のとおりである。また、決定されたキメラ抗体の重鎖および軽鎖のアミノ酸配列はそれぞれ配列番号７８および７９に記載のとおりである。
　本発明のモノクローナル抗体またはその断片は、ＤＤＳの分野において好適に利用され得る。

Claims (9)

  1. 　Ｔｉｓｓｕｅ　Ｆａｃｔｏｒに結合するモノクローナル抗体であって、
    　それぞれ配列番号３、４および５に記載されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域１、２および３を有する重鎖可変領域と、それぞれ配列番号６、７および８に記載されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域１、２および３を有する軽鎖可変領域と、を含む、抗ヒトＴｉｓｓｕｅ　Ｆａｃｔｏｒモノクローナル抗体；
    　それぞれ配列番号１１、１２および１３に記載されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域１、２および３を有する重鎖可変領域と、それぞれ配列番号１４、１５および１６に記載されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域１、２および３を有する軽鎖可変領域と、を含む、抗ヒトＴｉｓｓｕｅ　Ｆａｃｔｏｒモノクローナル抗体；または
    　それぞれ配列番号１９、２０および２１に記載されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域１、２および３を有する重鎖可変領域と、それぞれ配列番号２２、２３および２４に記載されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域１、２および３を有する軽鎖可変領域と、を含む、抗マウスＴｉｓｓｕｅ　Ｆａｃｔｏｒモノクローナル抗体；
    　である、モノクローナル抗体。
  2. 　配列番号９に記載されるアミノ酸配列または該アミノ酸配列と９０％以上同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号１０に記載されるアミノ酸配列または該アミノ酸配列と９０％以上同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、を含む抗ヒトＴｉｓｓｕｅ　Ｆａｃｔｏｒモノクローナル抗体；
    　配列番号１７に記載されるアミノ酸配列または該アミノ酸配列と９０％以上同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号１８に記載されるアミノ酸配列または該アミノ酸配列と９０％以上同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、を含む抗ヒトＴｉｓｓｕｅ　Ｆａｃｔｏｒモノクローナル抗体；または
    　配列番号２５に記載されるアミノ酸配列または該アミノ酸配列と９０％以上同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号２６に記載されるアミノ酸配列または該アミノ酸配列と９０％以上同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、を含む抗マウスＴｉｓｓｕｅ　Ｆａｃｔｏｒモノクローナル抗体；
    　である、請求項１に記載のモノクローナル抗体。
  3. 　請求項１に記載のモノクローナル抗体が結合するＴｉｓｓｕｅ　Ｆａｃｔｏｒのエピトープと同じエピトープに結合する、モノクローナル抗体。
  4. 　Ｔｉｓｓｕｅ　Ｆａｃｔｏｒを発現する細胞へのインターナリゼーション能を有する、請求項１から３のいずれかに記載のモノクローナル抗体。
  5. 　ヒト型キメラ抗体またはヒト化抗体である、請求項１から４のいずれかに記載のモノクローナル抗体。
  6. 　請求項１から５のいずれかに記載のモノクローナル抗体の一部を含み、Ｔｉｓｓｕｅ　Ｆａｃｔｏｒと結合できる、抗体の断片。
  7. 　Ｔｉｓｓｕｅ　Ｆａｃｔｏｒを発現する細胞へのインターナリゼーション能を有する、請求項６に記載の抗体の断片。
  8. 　標的結合因子としての請求項１から５のいずれかに記載のモノクローナル抗体あるいは請求項６または７に記載の抗体の断片と、薬物とを含む医薬組成物。
  9. 　標的結合因子としての請求項１から５のいずれかに記載のモノクローナル抗体あるいは請求項６または７に記載の抗体の断片を含む、薬物送達用組成物。
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