WO2015137380A1 - 液滴製造デバイス、液滴の製造方法、リポソームの製造方法、固定具及び液滴製造キット - Google Patents

液滴製造デバイス、液滴の製造方法、リポソームの製造方法、固定具及び液滴製造キット Download PDF

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雅宗 森田
仁義 山下
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    • B01L2400/0409—Moving fluids with specific forces or mechanical means specific forces centrifugal forces

Definitions

  • the present invention is a droplet production device capable of producing droplets excellent in monodispersibility from a small amount of droplet raw material, a droplet production method using the same, a liposome production method, and a droplet production device used for fixing. And a droplet manufacturing kit.
  • microchannels produced on a substrate by photolithography technology are used for the production of minute droplets.
  • a liquid droplet material is caused to flow into the flow path, and the operation of a pump for liquid feeding is controlled to form the liquid droplet material into droplets.
  • a cross-shaped channel shape in which a channel other than the channel intersects the channel at a right angle at the end of the channel through which the liquid droplet material flows. It has.
  • the present invention has been made in view of the above circumstances, and can provide a droplet manufacturing device that can be manufactured from a small amount of droplet raw material, has excellent monodispersibility, and has high droplet productivity. Let it be an issue.
  • the present inventors have found that the above problems can be solved by a droplet production device having the following characteristics, and have completed the present invention. That is, the present invention provides a droplet production device, a droplet production method, a fixture, and a droplet production kit having the following characteristics.
  • a droplet manufacturing device comprising: an outer tube; and an inner tube disposed inside the outer tube and configured to send a droplet raw material, An inner tube discharge port opens at the tip of the inner tube formed downstream in the fluid feeding direction, and an outer tube discharge port opens at the tip of the outer tube formed downstream in the fluid feeding direction.
  • a droplet manufacturing device wherein a gap is formed between the outer tube and the inner tube.
  • a droplet manufacturing method using the droplet manufacturing device according to any one of (1) to (7) For a droplet production device in which a second fluid is introduced into a gap formed between the outer tube and the inner tube, and the first fluid is introduced into the inner tube, By simultaneously feeding the first fluid and the second fluid, the second fluid is an outer layer, and the first fluid is an inner layer, thereby forming a droplet. Production method. (9) The method for producing droplets according to (8), wherein the liquid feeding is performed using centrifugal force. (10) The method for producing a droplet according to (8) or (9), wherein the droplet is formed by Rayleigh plateau instability. (11) The method for producing droplets according to any one of (8) to (10), wherein the first fluid contains a biomolecule.
  • a fixture used for disposing the inner tube constituting the droplet manufacturing device according to any one of (1) to (7) inside the outer tube A fixture having an outer tube fixing member for fixing the outer tube and an inner tube fixing member for fixing the inner tube.
  • the outer tube fixing member and the inner tube fixing member are plate-shaped members having a hole in the center, The outer tube fixing member and the inner tube fixing member are connected by a connecting member, The inner tube is disposed inside the outer tube by fitting the outer tube and the inner tube into the hole of the outer tube fixing member and the hole of the inner tube fixing member, respectively (13 ).
  • the fixture according to (13) or (14), wherein the connecting member is a screw that rotatably connects the outer tube fixing member and the inner tube fixing member.
  • a droplet manufacturing kit comprising an outer tube and an inner tube, A droplet production kit that forms the droplet production device according to any one of (1) to (7) by disposing the inner tube inside the outer tube.
  • the droplet manufacturing device of the present invention it is possible to manufacture droplets with high productivity and excellent monodispersibility from a small amount of droplet raw materials.
  • (A)-(b) is a perspective view showing an example of an embodiment of a droplet manufacturing device according to the present invention.
  • (A)-(c) It is a figure which shows a mode that a droplet is manufactured using the droplet manufacturing device which concerns on this invention. It is a perspective view for demonstrating the preferable shape of the droplet manufacturing device which concerns on this invention. It is a figure which shows a mode that the artificial cell membrane vesicle (liposome) is manufactured using the droplet manufacturing device which concerns on this invention. It is a perspective view showing an example of an embodiment of a fixture concerning the present invention.
  • FIG. 1 It is a front view which shows a mode that an outer tube
  • (A) It is a schematic diagram which shows a mode that the fixing tool and droplet manufacturing device which concern on this invention were accommodated in the tube for droplet collection
  • (B) It is a photograph which shows a mode that the fixing tool and droplet manufacturing device which concern on this invention were accommodated in the tube for droplet collection
  • 2 is a photograph showing a state of water-in-oil droplets produced in Example 1.
  • FIG. (A) It is a photograph which shows the mode of the water-in-oil droplet manufactured in Example 1.
  • FIG. (B) It is a photograph which shows the mode of the water-in-oil droplet manufactured in Example 2.
  • FIG. (C) It is a photograph which shows the mode of the water-in-oil droplet manufactured in Example 3.
  • FIG. (D) is a graph showing the size distribution of water droplets produced in Examples 1 to 3.
  • 6 is a graph showing the relationship between the average value of water droplets produced in Examples 1 to 3 and the inner diameter of the inner tube tip. 6 is a graph showing the evaluation of monodispersity of water droplets produced in Examples 1 to 9.
  • FIG. 2 is a photograph showing the state of liposomes produced in Example 11.
  • the droplet production device of the present invention is a droplet production device having an outer tube and an inner tube that is disposed inside the outer tube and feeds a droplet raw material, and is downstream in the fluid feeding direction.
  • the inner tube discharge port is opened at the tip of the inner tube formed on the outer tube
  • the outer tube discharge port is opened at the tip of the outer tube formed on the downstream side in the fluid feeding direction, and the outer tube and the inner tube A gap is formed between the two. In the gap, a fluid that is not mixed with the droplet raw material or difficult to mix is sent.
  • the cross-sectional shape of the flow path of the outer tube and the inner tube is not particularly limited, and may be a circle, an ellipse, a polygon, or the like.
  • the shape of the inner tube is preferably a shape having no portion in contact with the inner wall of the outer tube so that the gap can be formed around the inner tube without interruption.
  • the preferable value of a flow path internal diameter is mentioned later, when the cross-sectional shape of a flow path is not a perfect circle, it can convert into a perfect circle with the substantially same cross-sectional area of a flow path, and can be set as a preferable value of an internal diameter.
  • the droplet manufacturing device of the present embodiment is a droplet manufacturing device having an outer tube and an inner tube arranged concentrically, and the inner tube is formed at the tip of the inner tube formed on the downstream side in the fluid feeding direction.
  • a discharge port is opened, and an outer tube discharge port is opened at the distal end portion of the outer tube that is also formed on the downstream side in the fluid feeding direction, and a gap is formed between the outer tube and the inner tube.
  • Fig.1 (a) is an example of embodiment of the droplet manufacturing device based on this invention.
  • the droplet manufacturing device 1 of the present embodiment has an outer tube 2 and an inner tube 3 arranged concentrically.
  • the cross-sectional shape of the flow path of the outer tube and the inner tube is a perfect circle.
  • the inner tube 3 is disposed inside the outer tube 2, and a gap 2 c is formed between the outer tube 2 and the inner tube 3. More specifically, a gap 2 c is formed between the inner wall of the outer tube 2 and the outer wall of the inner tube 3.
  • the inner pipe 3 is filled with a fluid F1.
  • the gap 2c is filled with a fluid F2. Note that the fluid F1 and the fluid F2 are not components of the droplet manufacturing device of the present embodiment.
  • the fluid F1 and the fluid F2 are fed in the axial direction of the outer tube 2 and the inner tube 3.
  • the liquid feeding directions of the fluid F1 and the fluid F2 in the outer tube 2 and the inner tube 3 are the same.
  • the fluid feeding direction in the droplet manufacturing device 1 of the present embodiment is the direction indicated by the arrow in FIG. 1
  • the inner tube discharge port 3b is opened in the inner tube tip 3a
  • the outer tube tip An outer tube discharge port 2b is opened in 2a.
  • the inner tube discharge port of the droplet manufacturing device of the first embodiment is provided inside the outer tube on the upstream side in the fluid feeding direction from the outer tube discharge port. It is what. Descriptions common to the droplet manufacturing device of the first embodiment are omitted. As shown in FIG.
  • the inner tube discharge port 3b is provided inside the outer tube 2 on the upstream side in the liquid feeding direction from the outer tube discharge port 2b.
  • the droplet manufacturing device 11 of the present embodiment has the composite tube portion 4 including the outer tube 2 and the inner tube 3 on the upstream side in the liquid feeding direction with respect to the inner tube tip portion 3a.
  • a single tube portion 5 made of the outer tube 2 is provided downstream of the distal end portion 3a in the liquid feeding direction.
  • FIG. 2 schematically shows how droplets are manufactured using the droplet manufacturing device 11.
  • the fluid F2 is introduced into the gap 2c formed between the outer tube 2 and the inner tube 3 in the composite tube portion 4, and the fluid F1 is introduced into the inner tube 3 (FIG. 2 (a)).
  • the fluid F1 is a droplet raw material.
  • the fluid F2 is introduced into the outer pipe.
  • the fluid F1 and the fluid F2 are fed in the direction indicated by the arrow in FIG.
  • the fluid F1 and the fluid F2 are fed while maintaining the positional relationship between the concentric outer tube 2 and the inner tube 3, and a laminar flow in which the fluid F2 is the outer layer and the fluid F1 is the inner layer is formed in the single tube portion 5.
  • the flow of the fluid F1 which is the inner layer, becomes discontinuous, and droplets of the fluid F1 are formed from the front end (downstream side) of the flow of the fluid F1. It is considered that the flow of the fluid F1 is discontinuous because the flow between the fluid F1 and the fluid F2 in the single pipe portion 5 becomes unstable due to Rayleigh plateau instability.
  • the droplet manufacturing device 1 has an outer tube 2 and an inner tube 3, and a gap is formed between the outer tube 2 and the inner tube 3, so that a small amount of liquid droplet material (fluid F ⁇ b> 1)
  • a liquid (fluid F2) that is disposed inside the inner tube 3 and that does not or does not easily mix with the liquid droplet material in the gap 2c and only sends the liquid
  • droplets of the fluid F1 from a small amount of liquid droplet material can be obtained. It can be manufactured very easily.
  • the produced droplets are of high quality with excellent monodispersity.
  • the droplet manufacturing device 11 since the single tube portion 5 surrounded by the outer tube 2 is formed, a laminar flow in which the fluid F2 is the outer layer and the fluid F1 is the inner layer is efficiently formed. It is possible to more efficiently produce a droplet having excellent properties.
  • the amount of the fluid F1 necessary for manufacturing the droplet of the fluid F1 is only the amount introduced into the inner tube 3, and according to the droplet manufacturing device 1 of the present embodiment, droplets are manufactured from a small amount of droplet raw material. It is possible. In addition, a large number of droplets can be produced in a short time without requiring complicated liquid feeding control.
  • the inner diameter a of the inner tube tip 3a of the inner tube 3 constituting the droplet manufacturing device 11 is preferably 0.1 ⁇ m to 500 ⁇ m, more preferably 1 ⁇ m to 100 ⁇ m, and 5 ⁇ m to 30 ⁇ m. Further preferred.
  • the manufactured droplet follows the laws of microfluidics, so that it is possible to more easily manufacture a droplet having excellent monodispersity. It becomes. Further, the diameter of the produced droplet and the inner diameter a are likely to show a positive correlation, and the size of the produced droplet can be controlled more easily.
  • the ratio between the inner diameter a of the inner tube tip 3a and the inner diameter b of the outer tube tip 2a is not particularly limited as long as a laminar flow in which the fluid F2 is the outer layer and the fluid F1 is the inner layer can be formed.
  • the ratio of the inner diameter a to the inner diameter b is preferably 2 to 30 times the inner diameter a, and preferably 3 to 20 times. More preferably, it is 4 to 18 times, more preferably 4.5 to 15 times, and particularly preferably 5 to 10 times.
  • a laminar flow in which the fluid F2 is an outer layer and the fluid F1 is an inner layer is formed in the single tube portion 5.
  • the shape of the laminar flow is also determined by the ratio between the inner diameter c and the inner diameter a.
  • the ratio between the inner diameter c and the inner diameter a is not particularly limited as long as a laminar flow can be formed.
  • the inner diameter c of the outer tube at the inner tube tip 3a is the inner tube.
  • the inner diameter a of the tip 3a is preferably about 2 to 100 times, more preferably about 3 to 50 times, and further preferably about 5 to 10 times.
  • the ratio of the inner diameter c to the inner diameter a is in the above range, a droplet excellent in monodispersity can be obtained more easily.
  • the inner diameter c and the inner diameter b indicate the same portion, and therefore the ratio of the inner diameter a to the inner diameter c is This is the same as the ratio between the inner diameter a and the inner diameter b described above.
  • the inner diameter b of the outer tube tip 2a is preferably 1 ⁇ m to 1000 ⁇ m, more preferably 10 ⁇ m to 400 ⁇ m, still more preferably 40 ⁇ m to 100 ⁇ m, and particularly preferably 40 ⁇ m to 60 ⁇ m.
  • the inner diameter b is 1000 ⁇ m or less, the diameter of the produced droplet and the inner diameter a tend to show a positive correlation.
  • the inner diameter b is 60 ⁇ m or less, the fluid discharged from the outer tube distal end portion 2a is unlikely to swell in a bowl shape, so that the diameter of the manufactured droplet and the inner diameter a are more likely to have a positive correlation. For this reason, it is easier to control the size of the droplet.
  • Droplets are sequentially formed from the front end (downstream side) of the flow of the fluid F1. Since the droplet manufacturing device 11 has the single tube portion 5, the fluid is efficiently fed by the outer tube 2 constituting the single tube portion 5. Thus, it is preferable that the droplet is formed in the single tube portion 5.
  • the distance required for forming the droplet is about 10 times the inner diameter of the droplet. Accordingly, the distance d between the inner tube tip 3a and the outer tube tip 2a is preferably about 2 to 1000 times the inner diameter a of the inner tube tip, more preferably about 5 to 500 times, More preferably, it is about 7 to 300 times.
  • the droplet production device of the present invention is preferably a centrifugal droplet production device capable of producing droplets by feeding a droplet raw material by centrifugal force.
  • a centrifugal droplet production device has a structure suitable for producing droplets by centrifugal force using a centrifugal separator or the like.
  • a centrifugal force capable of producing droplets may be applied. It is strong enough not to break.
  • the length of the droplet production device 11 is preferably in the range of 0.1 to 30 cm, preferably 0.5 to 15 cm. The range is more preferable, and the range of 1 to 5 cm is more preferable.
  • the constituent materials of the outer tube 2 and the inner tube 3 are not particularly limited, and for example, materials such as resin, metal, glass and the like can be used. Especially, it is preferable that glass is used as a constituent material of the outer tube 2 and the inner tube 3.
  • the glass tube can be easily produced by heating and stretching a commercially available glass tube. If the glass tube is cut at a portion having a desired diameter, the outer tube 2 having the desired diameter can be easily obtained. And the inner pipe
  • the droplet manufacturing method of the present invention is a droplet manufacturing method using the droplet manufacturing device of the present invention, and the second fluid is introduced into a gap formed between the outer tube and the inner tube.
  • the first fluid and the second fluid are simultaneously fed to cause the second fluid to flow into the outer layer.
  • the fluid in which the first fluid is an inner layer is formed.
  • a droplet manufacturing method using the droplet manufacturing device 11 of the second embodiment shown in the above ⁇ Droplet manufacturing device >>.
  • the first fluid corresponds to the fluid F1
  • the second fluid corresponds to the fluid F2.
  • the method for producing droplets using the droplet production device 11 is the same as that described above with reference to FIG.
  • a fluid in which the second fluid is an outer layer and the first fluid is an inner layer is formed between the inner tube tip and the outer tube tip.
  • the liquid transfer operation required for manufacturing a droplet having excellent monodispersibility is sufficient in at least one direction and only once, and a complicated transfer operation is required. Liquid control is not required and high droplet productivity can be realized.
  • the means for feeding the liquid is not particularly limited, and can be performed by a conventional method such as using a pump, but is preferably performed using centrifugal force. Liquid feeding using centrifugal force can be performed using a centrifuge or the like. A desktop small centrifuge is preferred as the centrifuge.
  • the method for producing droplets of the present invention is also excellent in that liquid can be easily fed using a desktop small centrifuge. When a conventional method for producing liquid droplets using a microchannel is used to send a liquid by a syringe pump, the liquid of the liquid droplet material needs to be filled in the syringe or the connection between the syringe and the channel. It was.
  • an extra droplet raw material that becomes a dead volume is required in the syringe or in the connection portion between the syringe and the flow path.
  • mL of drop source liquid was required.
  • the droplet material necessary for producing the droplet of the fluid F1 is not necessary. Since the amount is only introduced into the inner tube 3, for example, 10,000 droplets having a diameter of 10 ⁇ m can be produced from a 0.1 ⁇ L droplet raw material.
  • liquid feeding by a centrifuge does not require complicated liquid feeding control, liquid feeding operation can be performed very easily as compared with liquid feeding using a pump.
  • the combination of the first fluid and the second fluid is a combination of two liquid phase separation systems or a mixture of two liquids.
  • a preferable combination of the fluid F1 and the fluid F2 includes a combination of oil and water.
  • the fluid F1 may be a combination of water and the fluid F2 may be a combination of oil (water droplets in oil), or the opposite fluid F1 may be a combination of oil and the fluid F2 may be a combination of water (oil-in-water droplets).
  • the oil include mineral oil, vegetable oil such as olive oil, silicone oil, decane and the like.
  • the water may be in the form of an aqueous solution, and examples thereof include solutions derived from biological samples such as buffers and cell extracts.
  • the droplet interface may be compartmentalized by amphiphilic molecules. Since the interface is partitioned by the amphiphilic molecules, the possibility that the droplets are fused is reduced.
  • amphiphilic molecules include surfactants and lipids.
  • the surfactant include Span 80, Tween 80, Tween 20, Triton X-100, sodium dodecyl sulfate (SDS) and the like.
  • lipids include dioleoylphosphatidylcholine (DOPC), dipalmitoyl phosphatidylcholine (DPPC), cholesterol, sphingomyelin, glycolipid ganglioside and the like.
  • Each droplet can be used as a small test tube. By containing a reactant in the droplet, a large number of chemical reactions can be caused independently in each droplet. Since the droplet produced by the method for producing a droplet of the present invention is excellent in monodispersity, the measurement result can be used as the measurement result of a homogeneous multi-sample. This is useful for obtaining an average value of reaction results. In addition, since different reaction conditions, samples, and the like can be included for each droplet, multiple specimens can be screened at once or various conditions can be tried at once. Examples of reactions that can be performed in the droplet include chemical synthesis, genetic analysis, PCR, protein crystallization, enzyme activity measurement and the like.
  • ⁇ Method for producing artificial cell membrane vesicle (liposome)> it is possible to produce a large amount of minute droplets having a diameter of about 0.1 ⁇ m to 500 ⁇ m, for example.
  • the droplet size of 0.1 ⁇ m to 500 ⁇ m in diameter includes a general cell size of about 5 ⁇ m to 30 ⁇ m in diameter, so that an artificial cell membrane vesicle (liposome) having a structure imitating a cell can be produced. .
  • liposomes are included in droplets.
  • FIG. 4 schematically shows an example of how artificial cell membrane vesicles (liposomes) using the droplet manufacturing device 11 are manufactured.
  • FIG. 4 schematically shows an example of how artificial cell membrane vesicles (liposomes) using the droplet manufacturing device 11 are manufactured.
  • Fluid F2 contains dioleoylphosphatidylcholine (DOPC) as an amphiphilic molecule.
  • DOPC dioleoylphosphatidylcholine
  • the outer tube tip 2a of the droplet manufacturing device 11 is disposed so as to be immersed in the same mineral oil as the fluid F2. Further, water or a buffer solution is arranged on the downstream side in the liquid feeding direction. DOPC is arranged as an amphiphilic molecule at the interface between water or buffer and mineral oil.
  • the droplet manufactured by the droplet manufacturing device 11 is discharged into the mineral oil from the outer tube tip 2a.
  • the droplets released at this time have a lipid monolayer.
  • the liquid droplet travels straight in the liquid feeding direction, comes into contact with the DOPC disposed at the interface between the mineral oil and water or the buffer solution, and reaches the water or the buffer solution while being wrapped in the DOPC.
  • the droplet has a lipid bilayer membrane.
  • artificial cell membrane vesicles liposomes
  • an artificial cell that is functionally similar to a cell can be obtained.
  • various metabolic reactions that normally occur inside and outside the cell can occur inside the droplet.
  • the outer layer and the inner layer of the lipid bilayer membrane can be made asymmetric.
  • the fixture of the present invention is a fixture used to arrange the inner tube constituting the droplet manufacturing device of the present invention inside the outer tube, and is an outer tube fixing for fixing the outer tube.
  • FIG. 5 is an example of an embodiment of the fixture 6 according to the present invention.
  • the outer tube fixing member 7 and the inner tube fixing member 8 are plate-like members having a hole in the center, and the outer tube fixing member 7 and the inner tube fixing member 8 are connected by a connecting member 9.
  • the connecting member 9 is a screw that rotatably connects the outer tube fixing member 7 and the inner tube fixing member 8.
  • the fixture 6 is provided with support bodies 10 and 10 'which are plate-like members having a hole in the central portion in order to support the outer tube and the inner tube and to maintain the concentric arrangement more effectively. .
  • FIG. 6 an example of the procedure which arrange
  • the inner tube fixing member 8 and the support 10 ′ are rotated, and the centers of the holes of the outer tube fixing member 7 and the support 10 and the centers of the holes of the inner tube fixing member 8 and the support 10 ′
  • the outer tube 2 is inserted into each hole of the outer tube fixing member 7 and the support 10 (FIG. 6B).
  • the outer tube 2 is fitted by passing through the hole 7 a provided in the outer tube fixing member 7. Fixed.
  • the inner tube fixing member 8 and the support 10 ′ are rotated, and the centers of the holes of the outer tube fixing member 7 and the support 10 and the centers of the holes of the inner tube fixing member 8 and the support 10 ′ And the inner tube 3 is inserted into each hole of the inner tube fixing member 8 and the support 10 '(FIG. 6C).
  • the inner tube 3 is fitted by passing the inner tube 3 through the hole 8a provided in the inner tube fixing member 8, The inner tube 3 is fixed.
  • the outer tube 2 and the inner tube 3 can be arranged concentrically.
  • the outer tube fixing member 7, the support 10, the inner tube fixing member 8 and the support 10 ′ are connected by a connecting member 9 that is a screw. Therefore, it is possible to adjust the distance between members by rotating each member. Even if the outer tube 2 and the inner tube 3 are not arranged concentrically because the distance between the outer tube fixing member 7 and the inner tube fixing member 8 is too large, the outer tube fixing member 7 and the inner tube fixing member 8 The distance can be reduced and adjusted so that the inner tube 3 is concentrically arranged in the outer tube 2.
  • the liquid droplets manufactured by the liquid droplet manufacturing device may be stored in a container disposed on the downstream side in the liquid feed direction of the liquid droplet raw material.
  • the fixture 6 may be used to attach the inner tube and the outer tube to the container, in addition to being used to place the inner tube inside the outer tube.
  • a part or all of the fixture 6 is inserted into the container, and the surfaces of the constituent members of the fixture 6 such as the outer tube fixing member 7, the inner tube fixing member 8, the support 10 and the support 10 ', and the container
  • the inner tube and the outer tube can be attached to the container by contacting the inner wall surface (see also FIG. 7 described later).
  • the droplet production kit of the present invention includes an outer tube and an inner tube, and the droplet production device of the present invention is formed by arranging the inner tube inside the outer tube.
  • the droplet manufacturing device the above-described droplet manufacturing device 1 and droplet manufacturing device 11 are typified.
  • the droplet manufacturing kit of the present invention may further include a fixing device of the present invention, reagents such as a droplet raw material, amphiphilic molecules and the like, a container for storing the manufactured droplets, and the like.
  • the fixing tool is represented by the fixing tool 6 described above.
  • the inner tube 3 constituting the droplet manufacturing device has a plurality of types of inner tubes having different inner diameters at the inner tube tip 3a for the purpose of manufacturing droplets of a plurality of types.
  • a tube 3 may be provided. According to the droplet manufacturing kit including the inner tube 3 in which the inner tube tip 3a has different inner diameters, it is possible to easily manufacture droplets of a plurality of sizes simply by replacing the inner tube 3.
  • Example 1 [Preparation of droplet production device with inner and outer tubes fixed using fixtures] (Inner tube / outer tube) Using a puller (manufacturer: Narishige, model number: PC-10), pull out a commercially available glass tube (manufacturer: Narishige, model number: G-1, manufacturer: World Precision Instruments, model number: 1B200-6). An outer tube 2 and an inner tube 3 having a shape were produced.
  • Polyacetal resin is processed to produce four plates with a diameter of 0.9 cm, a thickness of 0.2 cm, and a hole with a diameter of 0.2 cm in the center, each of which is an outer tube fixing member 7, a support 10, and an inner tube
  • the fixing member 8 and the support 10 ′ were used.
  • two screw holes for penetrating two screws (standard: M2 ⁇ 15) were provided at the same position at the end of each plate. The first screw was passed through the outer tube fixing member 7, the support 10, the inner tube fixing member 8, and the support 10 'in the order shown in FIGS.
  • the distance d between the inner tube tip 3a and the outer tube tip 2a was 2000 ⁇ m, and the inner diameter c of the outer tube at the inner tube tip 3a was 115 ⁇ m.
  • the second screw was passed through the outer tube fixing member 7, the support 10, the inner tube fixing member 8, and the support 10 'to fix them.
  • Example 2 In the production of the droplet production device of Example 1, a droplet production device was produced in the same manner as in Example 1 except that the inner diameter a of the inner tube tip 3a was changed to 5 ⁇ m, and a droplet was produced. [Confirmation of droplets] An image of water droplets produced in Example 2 is shown in FIG.
  • Example 3 In the production of the droplet production device of Example 1, a droplet production device was produced in the same manner as in Example 1 except that the inner diameter a of the inner tube tip 3a was 20 ⁇ m, and a droplet was produced. [Confirmation of droplets] An image of water droplets produced in Example 3 is shown in FIG.
  • the droplets produced from the droplet production devices of Examples 1, 2, 4 to 9 have a monodispersity control rate of 80% or more. According to these droplet production devices, the monodispersity is extremely high. It has been shown that excellent droplets can be produced.
  • ⁇ Example 10 Synthesis of fluorescent protein> Protein synthesis was performed in droplets produced using a droplet production device. First, a buffer solution containing a protein expression system (green fluorescent protein (GFP) template DNA, amino acids, various factors necessary for protein synthesis) was introduced into the inner tube to produce droplets. The produced droplet was collected in a 1.5 mL tube. The 1.5 mL tube was then incubated at 37 ° C. As a result, template DNA information is transcribed, RNA is synthesized, and RNA information is translated to synthesize a protein. The state of the droplet before and after 37 ° C. incubation is shown in FIG. Since the expressed protein is GFP this time, green fluorescence was observed only in the droplet. It was shown that protein synthesis is possible in the droplets produced by the droplet production device according to the present invention.
  • a protein expression system green fluorescent protein (GFP) template DNA, amino acids, various factors necessary for protein synthesis
  • Example 11 Production of liposome>
  • L- ⁇ -phosphatidylcholine Egg PC (100 %)
  • mineral oil containing L- ⁇ -phosphatidylcholine Egg PC (100%)
  • Liposomes were produced in the same manner as in Example 1 except that water was introduced.
  • EggPC is uniformly arranged at the interface between mineral oil and water.
  • FIG. 11 An image of the liposome produced in Example 11 is shown in FIG. According to this example, it was shown that liposomes can be produced by the droplet production device shown in Example 1 above.
  • the present invention can be widely used in chemistry-related fields, physics-related fields, biological fields, and the like, and can also be used for chemical synthesis, gene analysis, and the like. Further, as shown in the examples, the present invention can be used for protein synthesis in droplets and for the production of artificial cell membrane vesicles (liposomes), and thus is particularly suitable in the fields related to biology and medicine. Is available.

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Abstract

外管（２）、及び該外管（２）の内部に配置され、液滴原料を送液する内管（３）を有する液滴製造デバイス（１）であって、流体の送液方向で下流側に形成された内管先端部（３ａ）に内管吐出口（３ｂ）が開口し、同じく流体の送液方向で下流側に形成された外管先端部（２ａ）に外管吐出口（２ｂ）が開口し、前記外管（２）と前記内管（３）との間には間隙（２ｃ）が形成されることを特徴とする液滴製造デバイス（１）。前記内管吐出口（３ｂ）は前記外管吐出口（２ｂ）よりも流体の送液方向で上流側の外管内部に設けられていることが好ましい。

Description

液滴製造デバイス、液滴の製造方法、リポソームの製造方法、固定具及び液滴製造キット
　本発明は、少量の液滴原料から、単分散性に優れる液滴を製造可能な液滴製造デバイス、それを用いた液滴の製造方法、リポソームの製造方法、液滴製造デバイスの固定に用いられる固定具、及び液滴製造キットに関する。本願は、２０１４年３月１１日に、日本に出願された特願２０１４－０４８０３７号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
　従来、微小な液滴の製造には、フォトリソグラフィー技術によって基板上に作製されたマイクロ流路が用いられている。この流路内に液滴原料の液を流し、送液用のポンプの動作を制御して、液滴原料を液滴化する方法が行われている。例えば、非特許文献１の図３に示される装置では、液滴原料が流れる流路の末端において、該流路とは別の流路が該流路に直角に交差する十字状の流路形状を備えている。液滴原料の液が流路の末端に到達すると、直交する流路から液滴原料の液とは混ざらない別の液がポンプ制御により間欠的に液滴原料の液流に向かって押し出され、これにより液滴原料の液流から液滴１つ分の液量が切り取られるようにして液滴が製造される。
　しかし、マイクロ流路を作製するには、フォトリソグラフィーを行うための専用装置、専用の作業環境等の設備を整える必要があり、液滴作製のためにそのような設備を新たに整えることは容易ではない。また、複数条件で液滴を作製したい場合にはマイクロ流路を複数作製する必要があるが、マイクロ流路の作製は高コストであるという問題がある。
　通常、流路への送液はシリンジポンプが用いられる。しかし、シリンジポンプを用いた場合では、シリンジ内やシリンジと流路との接続部に液滴原料の液が充填される必要があるため、製造した液滴分の液滴原料よりも多くの液滴原料を用意する必要がある。液滴原料としたいサンプルが希少である場合には、このような原料のロスを少なくすることが強く求められる。
　また、単分散性に優れる高品質な液滴を製造しようとするとシリンジポンプの動作を正確に行わなければならず、その調整が煩雑である。さらには、正確な送液が求められることにより液滴の生産スピードが低下してしまうという欠点もある。
Charles N. Baroud, Francois Gallaire and Remi Dangla「Dynamics of microfluidic droplets」　Lab on a Chip, 2010, 10, p2032-2045
　本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、少量の液滴原料から製造することが可能であり、単分散性に優れ、且つ液滴の生産性の高い液滴製造デバイスの提供を課題とする。
　本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、下記の特徴を有する液滴製造デバイスにより前記課題が解決されることを見出し、本発明を完成させた。
　すなわち、本発明は、下記の特徴を有する液滴製造デバイス、液滴の製造方法、固定具及び液滴製造キットを提供する。
（１）外管と、該外管の内部に配置され、液滴原料を送液する内管と、を備える液滴製造デバイスであって、
　流体の送液方向で下流側に形成された内管先端部に内管吐出口が開口し、同じく流体の送液方向で下流側に形成された外管先端部に外管吐出口が開口し、
　前記外管と前記内管との間には間隙が形成されることを特徴とする液滴製造デバイス。
（２）前記内管吐出口は前記外管吐出口よりも流体の送液方向で上流側の外管内部に設けられた前記（１）に記載の液滴製造デバイス。
（３）前記外管先端部の内径ｂが、前記内管先端部の内径ａの２～３０倍である前記（１）又は（２）に記載の液滴製造デバイス。
（４）前記内管先端部の内径ａが０．１μｍ～５００μｍである前記（１）～（３）のいずれか一つに記載の液滴製造デバイス。
（５）前記内管先端部における前記外管の内径ｃが、前記内管先端部の内径ａの２～１００倍である前記（１）～（４）のいずれか一つに記載の液滴製造デバイス。
（６）前記外管先端部の内径ｂが１μｍ～１０００μｍである前記（１）～（５）のいずれか一つに記載の液滴製造デバイス。
（７）前記内管先端部と前記前記外管先端部との距離ｄが、前記内管先端部の内径ａの２～１０００倍である前記（２）～（６）のいずれか一つに記載の液滴製造デバイス。
（８）前記（１）～（７）のいずれか一つに記載の液滴製造デバイスを用いる液滴の製造方法であって、
　前記外管と前記内管との間に形成された間隙に第２の流体が導入され、前記内管内部に第１の流体が導入された状態にある液滴製造デバイスに対して、
　前記第１の流体及び前記第２の流体を同時に送液させることにより、前記第２の流体が外層であり前記第１の流体が内層である流体を形成させて液滴を形成させる液滴の製造方法。
（９）前記送液が遠心力を用いて行われる前記（８）に記載の液滴の製造方法。
（１０）前記液滴がレイリー・プラトー不安定性により形成される前記（８）又は（９）に記載の液滴の製造方法。
（１１）前記第１の流体が生体分子を含有する前記（８）～（１０）のいずれか一つに記載の液滴の製造方法。
（１２）前記（８）～（１１）のいずれか一つに記載の液滴の製造方法を用いるリポソームの製造方法であって、
　液の界面に配置された両親媒性分子と接触させ、両親媒性分子を含有する膜を前記液滴表面に多重に形成させるリポソームの製造方法。
（１３）前記（１）～（７）のいずれか一つに記載の液滴製造デバイスを構成する前記内管を、前記外管内部に配置するために用いられる固定具であって、
　前記外管を固定するための外管固定部材と、前記内管を固定するための内管固定部材とを有する固定具。
（１４）前記外管固定部材及び前記内管固定部材は中央部に孔を有する板状の部材であり、
前記外管固定部材及び前記内管固定部材は連結部材により連結され、
前記外管固定部材が有する前記孔及び内管固定部材が有する前記孔の夫々に、前記外管及び前記内管が嵌め込まれることで、前記内管が前記外管内部に配置される前記（１３）に記載の固定具。
（１５）前記連結部材は、前記外管固定部材と前記内管固定部材とを回転自在に連結するネジである前記（１３）又は（１４）に記載の固定具。
（１６）外管と、内管と、を備える液滴製造キットであって、
　該内管を該外管内部に配置することにより、前記（１）～（７）のいずれか一つに記載の液滴製造デバイスを形成する液滴製造キット。
（１７）前記（１３）～（１５）のいずれか一つに記載の固定具をさらに備える前記（１６）に記載の液滴製造キット。
　本発明の液滴製造デバイスによれば、少量の液滴原料から、高い生産性で、単分散性に優れた液滴を製造することができる。
（ａ）～（ｂ）本発明に係る液滴製造デバイスの実施形態の一例を示す斜視図である。 （ａ）～（ｃ）本発明に係る液滴製造デバイスを用いて液滴が製造される様子を示す図である。 本発明に係る液滴製造デバイスの好ましい形状を説明するための斜視図である。 本発明に係る液滴製造デバイスを用いて人工細胞膜小胞（リポソーム）が製造される様子を示す図である。 本発明に係る固定具の実施形態の一例を示す斜視図である。 （ａ）～（ｃ）本発明に係る固定具の一例において、外管及び内管を同心円状に配置する様子を示す正面図である。 （ａ）本発明に係る固定具及び液滴製造デバイスが液滴回収用のチューブへと収納された様子を示す模式図である。（ｂ）本発明に係る固定具及び液滴製造デバイスが液滴回収用のチューブへと収納された様子を示す写真である。 実施例１において製造された油中水滴の様子を示す写真である。 （ａ）実施例１において製造された油中水滴の様子を示す写真である。（ｂ）実施例２において製造された油中水滴の様子を示す写真である。（ｃ）実施例３において製造された油中水滴の様子を示す写真である。（ｄ）実施例１～３において製造された水滴のサイズ分布を示すグラフである。 実施例１～３において製造された水滴の平均値と内管先端部の内径との関係を示すグラフである。 実施例１～９において製造された水滴の単分散性の評価を示すグラフである。 実施例１０において液滴内にて製造された、緑色蛍光タンパク質の様子を示す写真である。 実施例１１において製造されたリポソームの様子を示す写真である。
≪液滴製造デバイス≫
　本発明の液滴製造デバイスは、外管と、該外管の内部に配置され液滴原料を送液する内管と、を有する液滴製造デバイスであって、流体の送液方向で下流側に形成された内管先端部に内管吐出口が開口し、同じく流体の送液方向で下流側に形成された外管先端部に外管吐出口が開口し、前記外管と前記内管との間には間隙が形成される。間隙では液滴原料とは混じり合わない又は混じり合い難い流体が送液される。
　外管及び内管の流路の断面形状は特に制限されず、円形、楕円形、多角形等とすることができる。内管の形状は、内管の周囲に間隙を途切れなく形成させることのできるよう、外管内壁と接する部分のない形状とすることが好ましい。
　なお、好ましい流路内径の値について後述するが、流路の断面形状が真円でない場合、流路の断面積がほぼ同一の真円として換算し、好ましい内径の値とすることができる。
＜第一実施形態＞
　本実施形態の液滴製造デバイスは、同心円状に配置された外管及び内管を有する液滴製造デバイスであって、流体の送液方向で下流側に形成された内管先端部に内管吐出口が開口し、同じく流体の送液方向で下流側に形成された外管先端部に外管吐出口が開口し、前記外管と前記内管との間には間隙が形成されるものである。
　以下、本発明に係る液滴製造デバイスの実施形態の一例を、図面を参照して説明する。
　図１（ａ）は、本発明に係る液滴製造デバイスの実施形態の一例である。本実施形態の液滴製造デバイス１は、同心円状に配置された外管２及び内管３を有している。外管及び内管の流路の断面形状は真円である。図１に示すように、内管３は外管２の内部に配置され、外管２と内管３との間には間隙２ｃが形成されている。より詳しくは、外管２の内壁と内管３の外壁との間には間隙２ｃが形成されている。
　内管３の内部には流体Ｆ１が充填されている。間隙２ｃには流体Ｆ２が充填されている。なお、流体Ｆ１及び流体Ｆ２は本実施形態の液滴製造デバイスの構成要素ではない。
　前記流体Ｆ１及び流体Ｆ２は、外管２及び内管３の軸方向に送液される。外管２及び内管３における流体Ｆ１及び流体Ｆ２の送液方向は互いに同一である。本実施形態の液滴製造デバイス１における流体の送液方向を、図１中の矢印で示される方向としたとき、内管先端部３ａには内管吐出口３ｂが開口し、外管先端部２ａには外管吐出口２ｂが開口している。
＜第二実施形態＞
　本実施形態の液滴製造デバイス１１は、前記第一実施形態の液滴製造デバイスの内管吐出口が前記外管吐出口よりも流体の送液方向で上流側の外管内部に設けられているものである。第一実施形態の液滴製造デバイスと共通する点について、説明を省略する。
　図１（ｂ）に示すように、内管吐出口３ｂは、外管吐出口２ｂよりも当該送液方向の上流側の外管２内部に設けられている。このように、本実施形態の液滴製造デバイス１１は、内管先端部３ａよりも送液方向上流側では、外管２と内管３からなる複合管部４を有しており、内管先端部３ａよりも送液方向下流側では、外管２からなる単管部５を有している。
　図２に、液滴製造デバイス１１を用いて液滴が製造される様子を模式的に示す。液滴製造デバイス１１では、複合管部４において外管２と内管３との間に形成された間隙２ｃに流体Ｆ２が、内管３内部に流体Ｆ１がそれぞれ導入された状態にある（図２（ａ））。流体Ｆ１が液滴原料である。また、単管部においては外管内部に流体Ｆ２が導入された状態にある。ここで、図２（ｂ）中の矢印で示される方向に流体Ｆ１及び流体Ｆ２を送液する。すると同心円状の外管２及び内管３の位置関係を維持したまま流体Ｆ１及び流体Ｆ２が送液され、流体Ｆ２が外層であり流体Ｆ１が内層である層流が単管部５において形成される（図２（ｂ））。さらに流体Ｆ１及び流体Ｆ２の送液が進むと、内層である流体Ｆ１の流れが不連続になり、流体Ｆ１の流れの先端（下流側）から流体Ｆ１の液滴が形成される。
　流体Ｆ１の流れが不連続となるのは、単管部５における流体Ｆ１及び流体Ｆ２間の流れがレイリー・プラトー不安定性により不安定となることによると考えられる。
　液滴製造デバイス１では、外管２及び内管３を有し、外管２と内管３との間には間隙が形成されているので、少量の液滴原料の液（流体Ｆ１）を内管３内部に配置し、液滴原料と混じり合わない又は混じり合い難い液（流体Ｆ２）を間隙２ｃに配置し、送液を行うだけで、少量の液滴原料から流体Ｆ１の液滴を極めて容易に製造することができる。そして、製造された液滴は単分散性に優れた高品質なものである。
　液滴製造デバイス１１では、外管２に囲まれた単管部５が形成されていることにより、流体Ｆ２が外層であり流体Ｆ１が内層である層流が効率よく形成されるため、単分散性に優れる液滴をより効率的に製造することができる。流体Ｆ１の液滴の製造に必要な流体Ｆ１の量は内管３に導入される量のみであり、本実施形態の液滴製造デバイス１によれば少量の液滴原料から液滴を製造することが可能である。また、複雑な送液制御を必要とせずに短時間で多数の液滴を製造することができる。
＜液滴製造デバイスの好ましい形状＞
　次に、単分散性に優れる液滴をより容易に製造可能とするとの観点から、本発明に係る液滴製造デバイスの好ましい形状について、図３を参照して説明する。
　液滴製造デバイス１１を構成する内管３の内管先端部３ａの内径ａは、０．１μｍ～５００μｍであることが好ましく、１μｍ～１００μｍであることがより好ましく、５μｍ～３０μｍであることがさらに好ましい。内管先端部３ａの内径ａが上記範囲にある液滴製造デバイス１１では、製造される液滴はマイクロ流体力学の法則に従うため、単分散性に優れる液滴をより容易に製造することが可能となる。また、製造される液滴の直径と内径ａとが正の相関を示し易く、製造される液滴のサイズ制御をより容易に行うことができる。
　内管先端部３ａの内径ａと外管先端部２ａの内径ｂとの比は、流体Ｆ２が外層であり流体Ｆ１が内層である層流が形成され得るものであれば特に限定されないが、単分散性に優れる液滴をより容易に製造可能とするとの観点から、内径ａと内径ｂとの比は、内径ｂが内径ａの２～３０倍であることが好ましく、３～２０倍であることがより好ましく、４～１８倍であることがさらに好ましく、４．５～１５倍であることがさらに好ましく、５～１０倍であることが特に好ましい。
　単分散性に優れる液滴の製造には、単管部５において、流体Ｆ２が外層であり流体Ｆ１が内層である層流が形成されることが好ましい。当該層流の形状は内径ｃと内径ａとの比によっても決定される。内径ｃと内径ａとの比は、層流が形成され得るものであれば特に限定されないが、好ましい内径ｃと内径ａとの比として、内管先端部３ａにおける外管の内径ｃが内管先端部３ａの内径ａの２～１００倍程度であることが好ましく、３～５０倍程度であることがより好ましく、５～１０倍程度であることがさらに好ましい。内径ｃと内径ａとの比が上記範囲にあると、単分散性に優れる液滴がより得られ易い。
　なお、上述の液滴製造デバイス１のように内管先端部３ａが外管先端部２ａと一致する場合は、内径ｃと内径ｂは同一部分を指すので、内径aと内径ｃの比は、上述した内径ａと内径ｂとの比と同様である。
　外管先端部２ａの内径ｂは、１μｍ～１０００μｍであることが好ましく、１０μｍ～４００μｍであることがより好ましく、４０μｍ～１００μｍであることがさらに好ましく、４０μｍ～６０μｍであることが特に好ましい。内径ｂが１０００μ以下であると、製造される液滴の直径と内径ａとが正の相関を示し易い。特に内径ｂが６０μｍ以下であると、外管先端部２ａから吐出された流体が雫状に膨らみ難くなるため、製造される液滴の直径と内径ａとが正の相関をより示し易い。このため液滴のサイズ制御がより容易である。
　液滴は、流体Ｆ１の流れの先端（下流側）から、順次形成される。液滴製造デバイス１１は単管部５を有するので、単管部５を構成する外管２により流体が効率良く送液される。このように、液滴は単管部５において形成されることが好ましい。通常、液滴の形成に必要な距離は液滴の内径の１０倍程度である。したがって、内管先端部３ａと外管先端部２ａとの距離ｄが、内管先端部の内径ａの２～１０００倍程度であることが好ましく、５～５００倍程度であることがより好ましく、７～３００倍程度であることがさらに好ましい。
　本発明の液滴製造デバイスは、液滴原料を遠心力により送液することで、液滴を製造可能な遠心用液滴製造デバイスであることが好ましい。遠心用液滴製造デバイスとは、遠心分離機等を用いて、遠心力によって液滴を製造するのに好適な構造を有するものであり、例えば、液滴を製造可能な遠心力をかけても破損しない程度の強度を有する。
　また、遠心分離機を用いた遠心力による送液を容易とするという観点から、液滴製造デバイス１１の長さは、０．１～３０ｃｍの範囲であることが好ましく、０．５～１５ｃｍの範囲であることがより好ましく、１～５ｃｍの範囲であることがさらに好ましい。
　外管２及び内管３の構成材料は特に制限されず、例えば、樹脂、金属、ガラス等の材料を使用することができる。なかでも、外管２及び内管３の構成材料としてガラスが用いられることが好ましい。ガラス管は、市販のガラス管を熱して引き延ばすことで微細な内径の管の作製が容易であり、所望の径を有する部分でガラス管を切断すれば、容易に所望の径を有する外管２及び内管３を得ることができる。
≪液滴の製造方法≫
　本発明の液滴の製造方法は、本発明の液滴製造デバイスを用いる液滴の製造方法であって、前記外管と前記内管との間に形成された間隙に第２の流体が導入され、前記内管内部に第１の流体が導入された状態にある液滴製造デバイスにおいて、前記第１の流体及び前記第２の流体を同時に送液させることにより、前記第２の流体が外層であり前記第１の流体が内層である流体を形成させるものである。
　一例としては、上述の≪液滴製造デバイス≫で示した第二実施形態の液滴製造デバイス１１を用いる液滴の製造方法である。第１の流体が流体Ｆ１に相当し、第２の流体が流体Ｆ２に相当する。液滴製造デバイス１１を用いた液滴の製造方法については、上述の≪液滴製造デバイス≫の説明において先に図２を参照して説明したものと重複するため、説明を省略する。なお、液滴製造デバイス１１を用いた場合、前記第２の流体が外層であり前記第１の流体が内層である流体を、前記内管先端部と前記前記外管先端部との間に形成させるので、送液が効率的となり、単分散性に優れる液滴をより効率的に製造することができる。
　本発明の液滴製造デバイスを用いた液滴の製造方法によれば、単分散性に優れる液滴の製造に必要な送液作業は、少なくとも一方向且つ一回のみで十分あり、複雑な送液制御を必要とせず、高い液滴の生産性を実現できる。
　当該送液を行う手段は特に制限されず、ポンプを用いる等の定法により行うことができるが、遠心力を用いて行われることが好ましい。遠心力を用いた送液は、遠心分離機等を用いて行うことができる。遠心分離機としては卓上小型遠心機が好ましい。本発明の液滴の製造方法は卓上小型遠心機を用いて簡便に送液ができる点からも優れている。従来のマイクロ流路を用いた液滴の製造方法でシリンジポンプによる送液を行った場合には、シリンジ内やシリンジと流路との接続部に液滴原料の液が充填される必要があった。そのため、シリンジ内やシリンジと流路との接続部にデッドボリュームとなってしまう余分な液滴原料が必要となってしまい、例えば、直径１０μｍの液滴を１万個製造するには、通常数ｍＬの液滴原料の液が必要であった。対して、本発明の液滴製造デバイスを用いて遠心力により送液を行った場合では、余分な液滴原料を用意する必要はなく、流体Ｆ１の液滴の製造に必要な液滴原料の量は内管３に導入されるのみであるため、例えば、０．１μＬの液滴原料から直径１０μｍの液滴を１万個製造することも可能である。また、遠心分離機による送液では複雑な送液の制御を必要としないため、ポンプを用いた送液と比較して、極めて容易に送液操作を行うことができる。
　第１の流体と第２の流体との組合せ（上述の≪液滴製造デバイス≫の動作の説明においては流体Ｆ１と流体Ｆ２の組合せ）は、二液相分離系である組合せ又は二液が混じりあい難い組合せであれば特に制限されない。例えば、流体Ｆ１と流体Ｆ２との好ましい組合せとしては、油と水の組合せが挙げられる。流体Ｆ１が水で流体Ｆ２が油の組合せ（油中水滴）でも、その逆の流体Ｆ１が油で流体Ｆ２が水の組合せ（水中油滴）であってもよい。油としては、ミネラルオイル、オリーブオイル等の植物油、シリコンオイル、デカン等が挙げられる。上記水としては水溶液の状態であってもよく、緩衝液、細胞抽出液などの生物試料由来の溶液等が挙げられる。
　液滴の界面は両親媒性分子によって区画化されていてもよい。界面が両親媒性分子によって区画化されることで、液滴同士が融合してしまう恐れが低減される。両親媒性分子としては界面活性剤、脂質等を挙げることができる。界面活性剤としては、Span80, Tween80, Tween20, TritonX-100, ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)等を例示できる。脂質としては、ジオレオイルフォスファチヂルコリン(DOPC), ジパルミトイルフォスファチヂルコリン(DPPC), コレステロール, スフィンゴミエリン, 糖脂質ガングリオシド等を例示できる。
　各液滴一つ一つは、言わば微小な試験管として用いることができる。液滴内に反応物を含有させることで、各液滴内で独立に多数の化学反応を起こすことができる。本発明の液滴の製造方法によって製造される液滴は単分散性に優れるので、測定結果は均質な多サンプルの測定結果として利用することができる。これは反応結果の平均値を得る際などに有用である。また、液滴ごとに異なる反応条件やサンプル等が含有させることも可能であるため、多検体のスクリーニングを一度に行ったり、様々な条件を一度に試したりすることができる。液滴内で実施され得る反応の一例として、化学合成、遺伝子解析、ＰＣＲ、タンパク質結晶化、酵素活性測定などが挙げられる。
＜人工細胞膜小胞(リポソーム)の製造方法＞
　本発明の液滴の製造方法によれば、例えば、直径０．１μｍ～５００μｍ程度の微小液滴を多量に製造することが可能である。この直径０．１μｍ～５００μｍの液滴サイズは、一般的な細胞のサイズである直径５μｍ～３０μｍ程度を包含するので、細胞を模した構造の人工細胞膜小胞(リポソーム)を製造することができる。なお、本発明において、リポソームは液滴に包含されるものとする。
　以下、図４に、液滴製造デバイス１１を用いた人工細胞膜小胞(リポソーム)が製造される様子の一例を模式的に示す。図４は液滴製造デバイス１１により液滴が製造される過程を示している。内管３には流体Ｆ１として水又は緩衝液が導入されている。間隙２ｃには流体Ｆ２としてミネラルオイルが導入されている。流体Ｆ２には両親媒性分子としてジオレオイルフォスファチヂルコリン(DOPC)が含有されている。液滴製造デバイス１１の外管先端部２ａは流体Ｆ２と同じミネラルオイルに没するように配置されている。さらに送液方向の下流側では、今度は水又は緩衝液が配置されている。水又は緩衝液とミネラルオイルの界面には両親媒性分子としてDOPCが配置されている。
　まず、液滴製造デバイス１１により製造された液滴が外管先端部２ａからミネラルオイル内へと放出される。この時放出された液滴は脂質の一重膜を有している。このまま該液滴は送液方向を直進しミネラルオイルと水又は緩衝液の界面に配置されたDOPCに接触し、DOPCに包まれつつ水又は緩衝液内へと到達する。この時、液滴は脂質二重膜を有している。このようにして、細胞と同様に脂質二重膜を有する人工細胞膜小胞(リポソーム)を得ることができる。
　さらに、流体Ｆ１内に予めタンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ等の生体分子及び／又は生体物質を含有させることで、機能的にも細胞に類似した人工細胞とすることができる。これらの生体分子を用いて、細胞内及び細胞外で通常生じる種々の代謝の反応を、液滴内部にて生じさせることが可能である。
　また、流体Ｆ２内に混合している脂質と下流側のミネラルオイル内に混合している脂質を異なる種類のものにすることで、脂質二重膜の外層と内層を非対称にすることができる。
≪固定具≫
　本発明の固定具は、本発明の液滴製造デバイスを構成する前記内管を、前記外管内部に配置するために用いられる固定具であって、前記外管を固定するための外管固定部材と、前記内管を固定するための内管固定部材とを有する。
　図５は本発明に係る固定具６の実施形態の一例である。
　外管固定部材７及び内管固定部材８は中央部に孔を有する板状の部材であり、外管固定部材７及び内管固定部材８は連結部材９により連結されている。連結部材９は、外管固定部材７と内管固定部材８とを回転自在に連結するネジである。さらに固定具６には、外管及び内管を支えてより効果的に同心円状の配置を保つため、中央部に孔を有する板状の部材である支持体１０,１０’が備えられている。
　図６に、固定具６を用いて外管２と内管３とを同心円状に配置する手順の一例を示す。図６（ａ）に示す固定具６では、外管固定部材７、支持体１０、内管固定部材８及び支持体１０’の有する孔が同心円状列に配置されている。
　まず、内管固定部材８及び支持体１０’を回転させ、外管固定部材７及び支持体１０の有する各孔の中心と、内管固定部材８及び支持体１０’の有する各孔の中心とをずらし、外管固定部材７及び支持体１０の有する各孔に外管２を挿入する（図６（ｂ））。ここで外管２は流体の送液方向で上流側ほど外径が大きくされているので、外管固定部材７に設けられた孔７ａに通すことで外管２が嵌め込まれ、外管２が固定される。
　次いで、内管固定部材８及び支持体１０’を回転させ、外管固定部材７及び支持体１０の有する各孔の中心と、内管固定部材８及び支持体１０’の有する各孔の中心とを一致させ、内管固定部材８及び支持体１０’の有する各孔に内管３を挿入する（図６（ｃ））。ここで内管３も流体の送液方向で上流側ほど外径が大きくされているので、内管３を内管固定部材８に設けられた孔８ａに通すことで内管３が嵌め込まれ、内管３が固定される。このようにして、外管２及び内管３を同心円状に配置することができる。
　固定具６では、外管固定部材７、支持体１０、内管固定部材８及び支持体１０’がネジである連結部材９によって連結されている。そのため、各部材を回転させて部材同士の距離を調節することが可能である。仮に外管固定部材７と内管固定部材８との距離が大きすぎるために外管２と内管３とが同心円状に配置されない場合でも、外管固定部材７と内管固定部材８との距離を小さくして、外管２内に内管３が同心円状に配置されるよう調節することができる。
　ところで、液滴製造デバイスによって製造された液滴は、液滴原料の送液方向の下流側に配置された容器内に溜められてもよい。固定具６は、前記内管を、前記外管内部に配置するために用いられることに加えて、前記内管及び前記外管を前記容器に取り付けるために用いられてもよい。例えば、固定具６の一部又は全部を容器内に挿入し、外管固定部材７、内管固定部材８、支持体１０、支持体１０’等の固定具６の構成部材の表面と、容器内壁面とを当接させて、前記内管及び前記外管を前記容器内に取り付け可能である（後述の図７も参照）。
≪液滴製造キット≫
　本発明の液滴製造キットは外管と内管とを備え、内管を外管内部に配置することにより、本発明の液滴製造デバイスを形成する。液滴製造デバイスとしては、上述した液滴製造デバイス１及び液滴製造デバイス１１に代表される。
　また、本発明の液滴製造キットは、本発明の固定具、液滴原料、両親媒性分子等の試薬類、製造された液滴を溜めるための容器等をさらに備えてもよい。固定具としては、上述した固定具６に代表される。
　本発明の液滴製造キットでは、複数種類のサイズの液滴を製造可能とする目的で、液滴製造デバイスを構成する内管３が、内管先端部３ａの内径が夫々異なる複数種類の内管３を備えていてもよい。内管先端部３ａの内径が異なる内管３を備える液滴製造キットによれば、内管３を取り換えるだけで簡便に複数サイズの液滴を製造可能である。
　次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
＜実施例１＞
［固定具を使用して内管及び外管が固定された液滴製造デバイスの作製］
（内管・外管）
　プーラー（製造元：ナリシゲ、型番：ＰＣ－１０）を使用して、市販のガラス管（製造元：ナリシゲ、型番：G－１, 製造元：Ｗｏｒｌｄ　Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、型番：１Ｂ２００―６）を引きのばし、以下の形状を有する外管２及び内管３を作製した。
内管先端部３ａの内径ａ：１０μｍ
外管先端部２ａの内径ｂ：６０μｍ
（固定具）
　ポリアセタール樹脂を加工し、直径０．９ｃｍ、厚み０．２ｃｍで中心部に直径０．２ｃｍの孔が設けられた板を４枚作製し、それぞれを外管固定部材７、支持体１０、内管固定部材８及び支持体１０’とした。さらに２本のネジ（規格：Ｍ２×１５）を貫通させるための２か所ネジ穴を、各板の端部にそれぞれ同位置に設けた。外管固定部材７、支持体１０、内管固定部材８及び支持体１０’に図５及び図６に示される順で１本目のネジを通した。
（液の導入）
　外管２内部に、Ｓｐａｎ８０を２％（ｗ/ｗ）含有するヘキサデカンを９μＬ封入した。
　内管先端部３ａを、水に浸し、毛細管現象により内管３内部に０．１μＬの水を吸い上げた。なお、内管３内部には１０μＬ程度の水を封入可能である。
（内管及び外管の固定）
　図６に示す手順で、固定具６を用いて外管２と内管３とを同心円状に配置した。これにより外管２と内管３との間に形成された間隙２ｃにＳｐａｎ８０を含有したヘキサデカンが、内管３内部に水がそれぞれ導入された状態となった。内管先端部３ａと前記外管先端部２ａとの距離ｄは２０００μｍであり、内管先端部３ａにおける外管の内径ｃは１１５μｍであった。２本目のネジを外管固定部材７、支持体１０、内管固定部材８及び支持体１０’に通してこれらを固定した。
［液滴回収の準備］
　市販の１．５ｍＬチューブ（製造元：日京テクノス(株)、型番：ＭＰ－１５０ＨＣ）に１００μＬのヘキサデカンを注ぎ、外管２及び内管３を固定した固定具６をチューブへと収納した（図７（ａ），（ｂ））。このとき外管先端部はチューブ底に溜められたヘキサデカンの液中に浸っていた。
［液滴の製造］
　チューブを卓上小型遠心機（製造元：（株）ハイテック、型番：ＡＴＴ－１０１）にセットし、１２００Ｇ（使用した卓上小型遠心機の最大出力）の遠心力で３秒間遠心し、ヘキサデカン及び水を同時に送液し、レイリー・プラトー不安定性により水滴を製造した。製造された水滴はチューブ底に溜められたヘキサデカン中に放出された。
［液滴の確認］
　実施例１において製造された水滴の画像を図８及び図９（ａ）に示す。３秒間の送液操作で約５万個の液滴を製造することができた。
＜実施例２＞
　実施例１の液滴製造デバイスの作製において、内管先端部３ａの内径ａを５μｍにした以外は実施例１と同様にして液滴製造デバイスの作製を行い、液滴を製造した。
［液滴の確認］
　実施例２において製造された水滴の画像を図９（ｂ）に示す。
＜実施例３＞
　実施例１の液滴製造デバイスの作製において、内管先端部３ａの内径ａを２０μｍにした以外は実施例１と同様にして液滴製造デバイスの作製を行い、液滴を製造した。
［液滴の確認］
　実施例３において製造された水滴の画像を図９（ｃ）に示す。
＜実施例１～３で製造された水滴の比較＞
　実施例１～３で製造された水滴のサイズを計測した結果を図９（ｄ）のグラフに示す。図９（ｄ）のグラフから単分散性に優れる液滴を、短時間で大量に製造できたことがわかる。
　内管先端部の内径(ａ)と油中水滴の直径サイズ(ｘ)については、以下の値であった。
ａ ＝ ５ μｍで、ｘ ＝ ８．０±３．０ μｍ
ａ ＝ １０ μｍで、ｘ ＝ １３．０±３．３ μｍ
ａ ＝ ２０ μｍで、ｘ ＝ １８．５±４．２ μｍ
　この値をグラフにしたものを図１０に示す。内管先端部の内径と油中水滴の直径は、ほぼ比例関係にあることがわかる。このことから、内管の先端部の内径(a)を変更するだけで、水滴の直径を制御可能であることが示された。
＜内管先端部の内径ａと外管先端部の内径ｂとの比についての検討＞
　実施例１～３と同様にして、内径ａがそれぞれ５μｍ、１０μｍ、２０μｍである内管を製造し、内径ｂがそれぞれ４０μｍ、６０μｍ、８０μｍ、１００μｍである外管を製造した。これらの外管と内管を組みわせ、以下の形状を有する液滴製造デバイスを製造した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　次いで、実施例１で示したものと同様の方法で液滴を製造し、液滴の直径の単分散性を評価した。単分散性の評価は、単分散性制御率 ＝ 単分散の結果が得られた回数/全試行数として算出した。標準偏差が３～４μｍであれば、単分散の結果が得られたこととした。全試行数は各実施例ともに最低３回行った。
　結果を図１１に示す。実施例１～９の液滴製造デバイスにより製造された液滴は、単分散性制御率６０％以上であり、これらの液滴製造デバイスによれば、単分散性に優れた液滴を製造可能であることが示された。特に、実施例１、２、４～９の液滴製造デバイスより製造された液滴は、単分散性制御率８０％以上であり、これらの液滴製造デバイスによれば、単分散性に極めて優れた液滴を製造可能であることが示された。
＜実施例１０：蛍光タンパク質の合成＞
　液滴製造デバイスを用いて製造した液滴内で、タンパク質合成を行った。まず、内管内部にタンパク質発現システム（緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の鋳型ＤＮＡ、アミノ酸、タンパク質合成に必要な各種因子）を含む緩衝液を導入し、液滴を製造した。製造された液滴は１．５ｍＬチューブに溜められた。
　次いで、当該１．５ｍＬチューブを３７℃でインキュベーションした。これにより鋳型DNAの情報が転写され、RNAが合成され、さらにはRNAの情報が翻訳されて、タンパク質が合成される。３７℃インキュベーション前と、３７℃インキュベーション後の液滴の様子を図１２に示す。今回、発現させたタンパク質はＧＦＰなので、液滴内でのみ、緑色の蛍光が観察された。本発明に係る液滴製造デバイスにより製造された液滴内で、タンパク質の合成が可能であることが示された。
＜実施例１１：リポソームの製造＞
　上記実施例１に示す液滴製造デバイス、及びそれを用いた液滴の製造において、間隙２Cに導入したSpan80を含有したヘキサデカンに代えて、終濃度５ｍMでＬ－α－ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ（Ｅｇｇ　ＰＣ（１００％））を含有したミネラルオイルを導入したこと、並びに、１．５ｍLチューブに注いだヘキサデカンに代えて、終濃度５ｍMでＬ－α－ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ（Ｅｇｇ　ＰＣ（１００％））を含有したミネラルオイル及び水を導入したこと以外は、実施例１と同様にして、リポソームの製造を行った。上記１．５ｍLチューブ内では、ミネラルオイルと水との界面にＥｇｇＰＣが一様に配置される。
　実施例１１において製造されたリポソームの画像を図１３に示す。本実施例によれば、上記実施例１に示す液滴製造デバイスにより、リポソームが製造可能であることが示された。
　内管先端部の内径(ａ)とリポソームの直径サイズ(ｘ)については、以下の値であった。
ａ ＝ １０ μｍで、ｘ ＝ １０．０±４．０μｍ
　以上で説明した各実施形態における各構成及びそれらの組み合わせ等は一例であり、本発明の趣旨を逸脱しない範囲で、構成の付加、省略、置換、およびその他の変更が可能である。また、本発明は各実施形態によって限定されることはなく、請求項（クレーム）の範囲によってのみ限定される。
　本発明は、化学関連分野、物理学関連分野、生物関連分野などに幅広く利用可能であり、化学合成、遺伝子解析等にも利用可能である。また、実施例において示されるとおり、本発明は、液滴内でのタンパク質合成や、人工細胞膜小胞(リポソーム)の製造にも利用可能であるので、特に生物学関連分野、医学関連分野において好適に利用可能である。
１，１１…液滴製造デバイス、２…外管、２ａ…外管先端部、２ｂ…外管吐出口、２ｃ…間隙、３…内管、３ａ…内管先端部、３ｂ…内管吐出口、４…複合管部、５…単管部、
６…固定具、７…外管固定部材、８…内管固定部材、９…連結部材、１０，１０’…支持体、Ｆ１，Ｆ２…流体

Claims (17)

  1. 　外管と、該外管の内部に配置され、液滴原料を送液する内管と、を備える液滴製造デバイスであって、
    　流体の送液方向で下流側に形成された内管先端部に内管吐出口が開口し、同じく流体の送液方向で下流側に形成された外管先端部に外管吐出口が開口し、
    　前記外管と前記内管との間には間隙が形成されることを特徴とする液滴製造デバイス。
  2. 　前記内管吐出口は前記外管吐出口よりも流体の送液方向で上流側の外管内部に設けられた請求項１に記載の液滴製造デバイス。
  3. 　前記外管先端部の内径ｂが、前記内管先端部の内径ａの２～３０倍である請求項１又は２に記載の液滴製造デバイス。
  4. 　前記内管先端部の内径ａが０．１μｍ～５００μｍである請求項１～３のいずれか一項に記載の液滴製造デバイス。
  5. 　前記内管先端部における前記外管の内径ｃが、前記内管先端部の内径ａの２～１００倍である請求項１～４のいずれか一項に記載の液滴製造デバイス。
  6. 　前記外管先端部の内径ｂが１μｍ～１０００μｍである請求項１～５のいずれか一項に記載の液滴製造デバイス。
  7. 　前記内管先端部と前記前記外管先端部との距離ｄが、前記内管先端部の内径ａの２～１０００倍である請求項２～６のいずれか一項に記載の液滴製造デバイス。
  8. 　請求項１～７のいずれか一項に記載の液滴製造デバイスを用いる液滴の製造方法であって、
    　前記外管と前記内管との間に形成された間隙に第２の流体が導入され、前記内管内部に第１の流体が導入された状態にある液滴製造デバイスに対して、
    　前記第１の流体及び前記第２の流体を同時に送液させることにより、前記第２の流体が外層であり前記第１の流体が内層である流体を形成させて液滴を形成させる液滴の製造方法。
  9. 　前記送液が遠心力を用いて行われる請求項８に記載の液滴の製造方法。
  10. 　前記液滴がレイリー・プラトー不安定性により形成される請求項８又は９に記載の液滴の製造方法。
  11. 　前記第１の流体が生体分子を含有する請求項８～１０のいずれか一項に記載の液滴の製造方法。
  12. 　請求項８～１１のいずれか一項に記載の液滴の製造方法を用いるリポソームの製造方法であって、
    　液の界面に配置された両親媒性分子と接触させ、両親媒性分子を含有する膜を前記液滴表面に多重に形成させるリポソームの製造方法。
  13. 　請求項１～７のいずれか一項に記載の液滴製造デバイスを構成する前記内管を、前記外管内部に配置するために用いられる固定具であって、
    　前記外管を固定するための外管固定部材と、前記内管を固定するための内管固定部材とを有する固定具。
  14. 　前記外管固定部材及び前記内管固定部材は中央部に孔を有する板状の部材であり、
    前記外管固定部材及び前記内管固定部材は連結部材により連結され、
    前記外管固定部材が有する前記孔及び前記内管固定部材が有する前記孔の夫々に、前記外管及び前記内管が嵌め込まれることで、前記内管が前記外管内部に配置される請求項１３に記載の固定具。
  15. 　前記連結部材は、前記外管固定部材と前記内管固定部材とを回転自在に連結するネジである請求項１４に記載の固定具。
  16. 　外管と、内管と、を備える液滴製造キットであって、
    　該内管を該外管内部に配置することにより、請求項１～７のいずれか一項に記載の液滴製造デバイスを形成する液滴製造キット。
  17. 　請求項１３～１５のいずれか一項に記載の固定具をさらに備える請求項１６に記載の液滴製造キット。
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