WO2015152312A1 - 免疫クロマト分析方法 - Google Patents

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一芳 望月
伊藤　大輔
祐弥 加藤
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Tanaka Kikinzoku Kogyo KK
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    • G01N33/54393—Improving reaction conditions or stability, e.g. by coating or irradiation of surface, by reduction of non-specific binding, by promotion of specific binding

Definitions

  • the present invention relates to an immunochromatography analysis method, an immunochromatography analysis apparatus, and an immunochromatography analysis kit.
  • immunochromatographic immunoassays that do not require pretreatment of specimens have been used as simple in-vitro diagnostic kits or portable diagnostic devices that detect antigens in sample solutions using the specific reactivity of antibodies.
  • pathogen testing kits such as viruses and bacteria are familiar immunochromatographic devices widely used in general hospitals and clinics.
  • the simplest structure of an immunochromatography apparatus is a structure in which a sample addition part, a labeling substance holding part, a chromatographic medium carrying a detection part, and an absorption part are interconnected.
  • Patent Document 1 In order to prevent such a backflow of the developed component from the absorbent material, it has been attempted to configure the absorbent material using superabsorbent fibers (Patent Document 1). Further, an absorbent material containing a water-absorbing polymer has been proposed (Patent Document 2).
  • the absorbent material including the superabsorbent fiber described in Patent Document 1 has a slow absorption rate of the developing component, and the developing component is not sufficiently absorbed by the absorbent within the specified reaction time (10 to 15 minutes).
  • the absorbent material including the superabsorbent fiber described in Patent Document 1 has a slow absorption rate of the developing component, and the developing component is not sufficiently absorbed by the absorbent within the specified reaction time (10 to 15 minutes).
  • the positive signal appearing in the detection portion is blotted by an excessive liquid sample remaining on the chromatographic medium, or a background signal is increased because a colored labeling substance is not sufficiently collected.
  • the absorbent material containing the water-absorbing polymer described in Patent Document 2 has a problem that the water-absorbing polymer tends to spill during production, although the above-mentioned problems have been solved.
  • an object of the present invention is to provide an immunochromatographic analysis method capable of shortening the development time without reducing the detection sensitivity and reducing the liquid return of the development component.
  • the present invention is as follows. 1. A method for detecting a substance to be detected contained in a specimen using an immunochromatography analyzer including a sample addition part, a labeling substance holding part, a chromatographic medium part carrying a detection part, and an absorption part made of glass fiber, An immunochromatographic analysis method comprising the following steps (1) to (4). (1) A step of adding a sample-containing solution obtained by diluting a sample with a sample dilution solution to a sample addition unit (2) A step of recognizing a substance to be detected by a labeling substance held in a labeling substance holding part (3) Nonionic 1.
  • a step of developing a sample and a labeling substance as a mobile phase in a chromatographic medium part in the presence of a surfactant (4) A step of detecting a substance to be detected in the developed mobile phase by a detection part 2.
  • a nonionic surfactant is contained in at least one of the sample addition part and the specimen diluent. 3.
  • the content of the nonionic surfactant in the sample addition part is 0.05 to 5 mg per cm 2 . 4).
  • 3. The method according to item 2 above, wherein the content of the nonionic surfactant in the sample diluent is 0.05 to 10% by mass. 5. 5.
  • An immunochromatography analyzer comprising a sample addition part, a labeling substance holding part, a chromatographic medium part on which a detection part is supported, and an absorption part in sequence, the sample addition part holding a nonionic surfactant in a dry state,
  • the absorption part is an immunochromatographic analyzer made of glass fiber.
  • An immunochromatography analysis kit comprising an immunochromatography apparatus including a sample addition part, a labeling substance holding part, a chromatographic medium part carrying a detection part, and an absorption part in sequence, and a specimen dilution liquid for diluting a target substance contained in the specimen
  • An immunochromatography analysis kit, wherein the absorption part is made of glass fiber, and the sample diluent contains a nonionic surfactant.
  • the immunochromatographic analysis method of the present invention uses an immunochromatographic analyzer that develops a sample and a labeling substance as a mobile phase in a chromatographic medium part in the presence of a nonionic surfactant without reducing detection sensitivity.
  • the deployment time can be shortened.
  • the development time cannot be absorbed by the absorption part due to the short development time, and the liquid return of the development component occurs.
  • the liquid return of the developing component can be reduced and false positives can be avoided.
  • FIG. 1 shows the structure of an immunochromatographic analyzer.
  • the immunochromatography analysis method of the present invention uses a sample addition part, a labeling substance holding part, a chromatographic medium part carrying a detection part, and an immunochromatography analyzer including an absorption part made of glass fiber, and uses a nonionic surfactant. This is a method for detecting a substance to be detected contained in a specimen in the presence of an agent.
  • the immunochromatographic analyzer that can be used in the present invention and the method of using the same will be described below.
  • the immunochromatographic analyzer comprises a sample addition part (also called a sample pad) (1), a labeling substance holding part (also called a conjugate pad) (2), a chromatographic medium part (3), and a detection part.
  • the absorption part (5) is included one by one, and it also has a backing sheet (6). “Sequential” indicates the order of each part where the sample is developed in the immunochromatography analyzer of the present invention.
  • the structures, specifications and embodiments of each part are as follows.
  • the sample addition part (1) is a part where the sample is dropped in the immunochromatography analyzer. Any material that is usually used for immunochromatography may be used. Usually, a glass fiber or cellulose film that absorbs and holds a sample is used for the sample adding portion.
  • the sample addition part It is preferable to contain a nonionic surfactant in the sample addition part. This prevents the specimen from adsorbing to the additive member in the sample portion and reducing the detection sensitivity. In addition, the development time is shortened by lowering the surface tension of the sample.
  • the content of the nonionic surfactant in the sample addition part is preferably 0.05 to 5 mg, more preferably 0.2 mg to 5 mg, and further preferably 0.2 mg to 2.5 mg.
  • the content of the nonionic surfactant in the sample addition part is 0.05 mg or more, the surface tension of the sample can be significantly lowered, and when the content is 5 mg or less, the sample by the nonionic surfactant is used. It is because the denaturation action to can be suppressed.
  • Nonionic surfactants include, for example, polyoxyethylene alkyl ether, polyoxyethylene / polyoxypropylene alkyl ether, polyoxyethylene sorbitan fatty acid ester (trade name “Tween” series), polyoxyethylene pt-octyl Phenyl ether (trade name “Triton” series), polyoxyethylene pt-nonylphenyl ether (trade name “Triton N” series), alkyl polyglucoside, fatty acid diethanolamide, alkyl monoglyceryl ether, NP-40 (manufactured by Sigma-Aldrich) IGAPEL CA-520 (manufactured by Sigma Aldrich) and the like.
  • the HLB value of the nonionic surfactant is preferably 10 or more, more preferably 11.0 or more, and further preferably 12.4 or more.
  • the upper limit is not particularly limited, but is preferably 18 or less.
  • the HLB value of the nonionic surfactant is 10 or more, the denaturation effect on the sample due to hydrophobic interaction can be suppressed.
  • the HLB value of the nonionic surfactant is 18 or less, the denaturation effect on the sample due to hydrophobic interaction can be suppressed.
  • the CMC value of the nonionic surfactant is preferably 5 ⁇ mol to 60 mmol, more preferably 10 ⁇ mol to 60 mmol, still more preferably 12 ⁇ mol to 60 mmol.
  • the effect of addition can be exhibited when the CMC value of the nonionic surfactant is 5 ⁇ mol or more. Moreover, since it is 60 mmol or less, the usage-amount can be decreased and it is economical.
  • the nonionic surfactant to be contained in the sample addition part is an aqueous solution having a concentration of 0.05 to 10% by mass, and the member used for the sample addition part is immersed in this solution, and then vacuum-dried or naturally dried. Thus, a sample addition part containing a nonionic surfactant is used.
  • the labeling substance holding part (2) contains a labeling substance (marker substance), which will be described later, bound in advance to an antibody that binds to the substance to be detected.
  • a labeling substance labeling substance
  • the labeling substance holding part is made of, for example, a glass fiber nonwoven fabric or a cellulose film.
  • the chromatographic medium part (3) is a developed part of the chromatograph.
  • the chromatographic medium portion is an inactive film made of a microporous material that exhibits capillary action. Examples of those that are not reactive with a detection reagent, an immobilization reagent, or a substance to be detected used in a chromatograph include a membrane made of nitrocellulose (hereinafter sometimes referred to as “nitrocellulose membrane”).
  • Nitrocellulose-based membranes only need to contain nitrocellulose as a main component, and membranes based on nitrocellulose, such as pure products or nitrocellulose-mixed products, should be used. However, there are no problems with other materials. . Examples of other materials include cellulose membranes, nylon membranes, and porous plastic cloth (polyethylene, polypropylene).
  • the nitrocellulose membrane may further contain a substance that promotes capillary action.
  • a substance that lowers the surface tension of the film surface and brings about hydrophilicity is preferable.
  • a substance having an amphipathic action such as saccharides, amino acid derivatives, fatty acid esters, various synthetic surfactants or alcohols, which has no effect on the movement of a substance to be detected on an immunochromatograph and is a marker substance
  • Substances that do not affect the color development are preferred.
  • Examples of the substance include an anionic surfactant, an amphoteric surfactant, a nonionic surfactant, and glycerin, and among these, an anionic surfactant is preferable.
  • anionic surfactants include sodium dodecylbenzene sulfonate (SDBS), sodium dodecyl sulfonate (SDS), C12-C18 alkyl sodium sulfonate (alkane sulfonate sodium), sodium dialkylsulfosuccinate and cole. Examples include sodium acid.
  • SDS sodium dodecyl sulfonate
  • C12-C18 alkyl sodium sulfonate sodium alkane sulfonate
  • the content of the anionic surfactant in the chromatographic medium part is preferably 0.02 to 4% by mass, more preferably 0.02 to 1% by mass, and further preferably 0.1 to 1% by mass. .
  • the content of the anionic surfactant in the chromatographic medium portion is 0.02% by mass or more, sufficient sensitivity and an effect of shortening the detection time can be obtained, and a decrease in storage stability can be avoided.
  • the content of the anionic surfactant in the chromatographic medium part is 4% by mass or less, it is possible to prevent a nonspecific reaction from occurring in the negative sample.
  • the anionic surfactant to be contained in the chromatographic medium part is an aqueous solution having a concentration of 0.1 to 10% by mass.
  • the nitrocellulose membrane is immersed in this solution and then vacuum-dried or air-dried, and then anionic.
  • a chromatographic medium containing a surfactant is used.
  • the additive may be added to the formed membrane directly by adding an additive directly to the formed membrane, and the membrane is not limited to these methods.
  • the nitrocellulose membrane thus prepared is porous and exhibits capillary action.
  • the index of the capillary phenomenon can be confirmed by measuring the water absorption rate (water absorption time: capillary flow time).
  • the water absorption rate affects detection sensitivity and inspection time.
  • the form and size of the nitrocellulose membrane as a chromatographic medium used in the immunochromatographic analysis method of the present invention are not particularly limited, and may be appropriate in terms of actual operation and observation of reaction results.
  • the support made of plastic or the like on the back surface of the chromatographic medium on which the reaction sites are formed on the surface.
  • the properties of the support are not particularly limited, but when the measurement result is observed by visual judgment, the support preferably has a color that is not similar to the color caused by the labeling substance. Usually, it is preferably colorless or white.
  • the detection part (4) is formed on the chromatographic medium part (3), that is, a reaction site in which a substance that specifically binds to the substance to be detected, such as an antibody, is immobilized as an immobilization reagent at an arbitrary position. Is formed.
  • the immobilization reagent can be immobilized on the chromatographic medium by directly immobilizing the immobilization reagent on the chromatographic medium by physical or chemical means, and by physically or chemically immobilizing the immobilization reagent on fine particles such as latex particles.
  • fine particles such as latex particles.
  • a direct immobilization method physical adsorption may be used, or covalent bonding may be used. In the case of a nitrocellulose membrane, physical adsorption can be performed. In the covalent bond, cyanogen bromide, glutaraldehyde, carbodiimide or the like is generally used to activate the chromatographic medium, but any method can be used.
  • an indirect immobilization method there is a method in which an immobilization reagent is bound to insoluble fine particles and then immobilization to a chromatographic medium.
  • the particle size of the insoluble fine particles can be selected such that it is captured by the chromatographic medium but cannot move, and is preferably fine particles having an average particle size of about 5 ⁇ m or less.
  • organic polymers such as organic polymer latex particles obtained by emulsion polymerization methods such as polystyrene, styrene-butadiene copolymer, styrene-methacrylic acid copolymer, polyglycidyl methacrylate or acrolein-ethylene glycol dimethacrylate copolymer.
  • Examples include fine particles of substances, fine particles such as gelatin, bentonite, agarose or cross-linked dextran, inorganic oxides such as silica, silica-alumina or alumina, or inorganic particles obtained by introducing a functional group to an inorganic oxide by silane coupling treatment, etc. .
  • direct immobilization is preferable from the viewpoint of ease of sensitivity adjustment.
  • Various methods can be used to immobilize the immobilization reagent on the chromatographic medium.
  • various techniques such as a microsyringe, a pen with a control pump, or ink jet printing can be used.
  • the form of the reaction site is not particularly limited, but it may be fixed as a circular spot, a line extending perpendicularly to the developing direction of the chromatographic medium, a numeral, a character, or a symbol such as +,-.
  • the chromatographic medium can be subjected to a blocking treatment by a known method as necessary in order to prevent the accuracy of the analysis from being reduced due to nonspecific adsorption.
  • a protein such as bovine serum albumin, skim milk, casein or gelatin is preferably used for the blocking treatment.
  • a protein such as bovine serum albumin, skim milk, casein or gelatin is preferably used for the blocking treatment.
  • one or a combination of two or more surfactants such as Tween 20, Triton X-100, or SDS may be washed.
  • the absorption part (5) is installed at the end of the chromatographic medium to absorb the developing solution.
  • the absorption part is made of glass fiber.
  • the absorbing portion is made of glass fiber, liquid return of the developing component can be greatly reduced.
  • the development time is shortened by performing immunochromatography analysis in the presence of a nonionic surfactant, if the absorption efficiency of the development component is poor at the absorption section, the development component cannot be absorbed by the absorption section, and the liquid of the development component A return will occur.
  • the absorption speed is slow and the diffusion rate of the developing component and nonionic surfactant in the absorbent portion is also slow. Since the effect of suppressing the adsorption by the activator becomes obvious, a backflow of the developed component occurs.
  • the absorbing portion made of glass fiber has a high water absorption speed, and the developing component diffuses quickly in the absorbing portion, and the developing component and nonionic surfactant become dilute and the backflow is suppressed. That is, by using glass fiber for the absorption part, the liquid return of the developing component can be greatly reduced, and the developing time can be shortened and false positives can be reduced.
  • the density of the nonionic surfactant per volume is high, it exerts an action of suppressing adsorption to the member, but the absorption part has a larger volume than the addition part, so the nonionic surfactant Since the density per volume of the absorbing portion is reduced and the adsorption suppression is alleviated, the backflow of the developed component from the absorbing member hardly occurs.
  • the absorbent section preferably has a drainage time of 20 seconds to 110 seconds, more preferably 20 to 105 seconds, and even more preferably 20 to 100 seconds.
  • the drainage time of the absorption part is 20 seconds or more, the time required for the reaction can be secured at the minimum, and the detection sensitivity does not decrease.
  • the determination time can be shortened because the drainage time of the absorption part is 110 seconds or less.
  • the drainage time of the water absorption part can be measured according to JIS P 3801: 1995.
  • the density of the absorption part to be used is preferably 150 to 500 mg / m 3 , more preferably 200 to 500 mg / m 3 , and still more preferably 200 to 350 mg / m 3 .
  • glass fiber having a density of 200 to 350 mg / m 3 the return of the developing component can be greatly reduced.
  • the backing sheet (6) is a base material. By applying an adhesive on one side or sticking an adhesive tape, one side has adhesiveness, and the sample addition part (1), labeling substance holding part (2), chromatographic medium part ( 3) A part or all of the detection unit (4) and the absorption unit (5) are provided in close contact with each other.
  • the backing sheet (6) is not particularly limited as long as the backing sheet (6) becomes impermeable and impermeable to the sample solution by the adhesive.
  • the immunochromatographic analysis method of the present invention includes the following steps (1) to (4), and a substance to be detected contained in a specimen is detected using the above immunochromatographic analyzer.
  • a step of adding a sample-containing solution obtained by diluting a sample with a sample dilution solution to a sample addition unit (2)
  • a step of recognizing a substance to be detected by a labeling substance held in a labeling substance holding part (3)
  • Nonionic Step of developing specimen and labeling substance as mobile phase in chromatographic medium in the presence of surfactant (4) Step of detecting detected substance in developed mobile phase by detecting section Each step will be described below.
  • step (1) Step of adding a specimen-containing solution obtained by diluting a specimen with a specimen diluent to the sample addition section
  • the specimen is smoothly passed through the immunochromatographic medium without degrading measurement accuracy. Adjust or dilute with a sample diluent to a concentration that allows the sample to move to (1).
  • a predetermined amount usually 0.1 to 2 ml
  • the specimen-containing liquid starts to move in the sample addition part (1).
  • the specimen diluent preferably contains a nonionic surfactant. This shortens the development time without lowering the detection sensitivity. Nonionic surfactants similar to those described above can be used.
  • the content of the nonionic surfactant in the sample diluent is preferably 0.05 to 10% by mass, more preferably 0.05 to 5% by mass, and still more preferably 0.05 to 3.%. 5% by mass.
  • the sample When the content of the nonionic surfactant in the sample diluent is 0.05% by mass or more, the sample is prevented from adsorbing to the member of the sample dropping part, and the detection sensitivity is not lowered.
  • the deployment time can be shortened by lowering the surface tension. This is because when the content of the nonionic surfactant in the sample diluent is 10% by mass or less, the denaturing action of the sample by the nonionic surfactant can be suppressed.
  • Samples containing the substance to be detected include, for example, biological samples, that is, whole blood, serum, plasma, urine, saliva, sputum, nasal cavity or throat wipe, cerebrospinal fluid, amniotic fluid, nipple discharge, tears, sweat, skin As well as extracts from milk, eggs, wheat, beans, beef, pork, chicken, and foods containing them, and the like.
  • step (2) The step of recognizing the substance to be detected by the labeling substance held in the labeling substance holding part
  • step (2) the sample-containing liquid added to the sample addition part in step (1) is used as the labeling substance holding part ( In this step, the substance to be detected is recognized by the labeling substance held in the labeling substance holding part.
  • the labeling substance labels a substance that specifically binds to the substance to be detected, such as an antibody.
  • an enzyme or the like is used for labeling the detection reagent in the immunochromatography method.
  • an insoluble carrier since it is suitable for visually determining the presence of the substance to be detected, it is preferable to use an insoluble carrier as the labeling substance.
  • a labeled detection reagent can be prepared by sensitizing the detection reagent to an insoluble carrier.
  • Insoluble carriers as labeling substances include colloidal metal particles such as gold, silver or platinum, colloidal metal oxide particles such as iron oxide, colloidal nonmetal particles such as sulfur, and latex particles composed of synthetic polymers. Or others can be used. In particular, colloidal gold is preferable because it is easy to detect.
  • the insoluble carrier is a labeling substance suitable for visually determining the presence of the substance to be detected, and is preferably colored to facilitate visual determination.
  • the colloidal metal particles and the colloidal metal oxide particles themselves exhibit a specific natural color corresponding to the particle diameter, and the color can be used as a label.
  • colloidal metal particles and colloidal metal oxide particles that can be used as labeling substances include colloidal gold particles, colloidal silver particles, colloidal platinum particles, colloidal iron oxide particles, and colloidal aluminum hydroxide particles. Etc.
  • the colloidal gold particles and the colloidal silver particles are preferable in that the colloidal gold particles are red and the colloidal silver particles are yellow in an appropriate particle size.
  • colloidal metal particles for example, when colloidal gold particles are used, commercially available ones may be used.
  • colloidal gold particles can be prepared by a conventional method, for example, a method of reducing chloroauric acid with sodium citrate.
  • the detection reagent As a method for sensitizing the detection reagent to the colloidal metal particles, known methods such as physical adsorption and chemical bonding can be used.
  • the antibody in the detection reagent in which antibody is sensitized to colloidal gold particles, the antibody is unbound by adding bovine serum albumin solution after adding the antibody to a colloidally dispersed solution and physically adsorbing the antibody. Prepare by blocking the particle surface.
  • the detection reagent labeled with an insoluble carrier can be dispersed and applied to the developing solution constituting the mobile phase, or the development of the mobile phase in the chromatographic medium constituting the stationary phase.
  • the present invention can also be applied by being present on the movement path, that is, in a region between the end where the mobile phase of the chromatographic medium is applied and the reaction site.
  • the site to be supported is added with a saccharide such as saccharose, maltose or lactose, or a sugar alcohol such as mannitol, or the like.
  • the substance can also be pre-coated.
  • the detection reagent When the detection reagent is present on the chromatographic medium by application / drying or the like, it can be directly applied / dried to the chromatographic medium on which the immobilized reagent is immobilized, or another porous substance such as After the detection reagent holding member is formed by applying to cellulose filter paper, glass fiber filter paper or nylon nonwoven fabric and drying, the detection reagent holding member may be connected to the chromatographic medium on which the immobilization reagent is immobilized by a capillary.
  • the substance to be detected to be detected by the method of the present invention is not particularly limited as long as a substance that specifically binds to the substance is present, and examples thereof include proteins, peptides, nucleic acids, sugars (especially sugar moieties of glycoproteins, Glycosides of glycolipids) and complex carbohydrates.
  • “specifically binds” means to bind based on the affinity of a biomolecule.
  • binding based on affinity include binding between an antigen and an antibody, binding between a sugar and a lectin, binding between a hormone and a receptor, binding between an enzyme and an inhibitor, complementary nucleic acids and nucleic acids and nucleic acids. Examples include binding to a binding protein.
  • examples of the substance that specifically binds to the substance to be detected include polyclonal antibodies and monoclonal antibodies.
  • examples of the substance that specifically binds to the substance to be detected include lectin protein.
  • the substance to be detected include carcinoembryonic antigen (CEA), HER2 protein, prostate specific antigen (PSA), CA19-9, ⁇ -fetoprotein (AFP), immunosuppressive acidic protein (IPA), CA15- 3, CA125, estrogen receptor, progesterone receptor, fecal occult blood, troponin I, troponin T, CK-MB, CRP, human chorionic gonadotropin (hCG), luteinizing hormone (LH), follicle stimulating hormone (FSH), syphilis antibody, Examples include, but are not limited to, influenza virus, human hemoglobin, chlamydia antigen, group A ⁇ -streptococcal antigen, HBs antibody, HBs antigen, rotavirus, adenovirus, albumin or glycated albumin.
  • Step (3) A step of developing a sample and a labeling substance as a mobile phase in a chromatographic medium in the presence of a nonionic surfactant Step (3) is a process in which a substance to be detected is recognized as a labeling substance in step (2). In this step, the specimen and the labeling substance are passed as a mobile phase over the chromatographic medium part (3) in the presence of a nonionic surfactant.
  • the nonionic surfactant is allowed to exist in the process of developing the sample and the labeling substance as a mobile phase on the chromatographic medium part. As described above, it is preferably contained in the sample addition part or contained in the sample diluent.
  • the sample diluent contains a nonionic surfactant.
  • the components can be homogenized in advance in the sample, and the effect of suppressing the adsorption to the member can be expected rather than the inclusion in the member.
  • the determination time can be further shortened.
  • the nonionic surfactant may be contained in both the sample addition part and the specimen diluent.
  • a developing solution may be used if necessary.
  • the developing solution is a liquid that constitutes a mobile phase in the immunochromatography method, and moves on a chromatographic medium that is a stationary phase together with a sample containing a substance to be detected and a labeled detection reagent. Any developing solution may be used.
  • step (4) A step of detecting a substance to be detected in the developed mobile phase by the detection unit
  • the detection unit (4) is held in the detection unit (4), that is, specifically reacted and bonded so as to be sandwiched between the supported and immobilized antibody and the labeling reagent. It is a process of coloring.
  • the labeling reagent dissolved in the moisture of the sample does not cause a specific binding reaction even if it passes through the detection part (4) on the chromatographic medium part (3). (4) is not colored.
  • the presence or absence of influenza virus infection can be accurately determined by examining the presence or absence of a detection target substance contained in the sample, for example, the influenza virus in the sample-containing liquid.
  • Example 1 to 4 (1) Preparation of detection part on chromatographic medium A sheet made of nitrocellulose (manufactured by Millipore, trade name: HF120, 300 mm ⁇ 25 mm) was used as a membrane. As a pretreatment, the membrane was immersed in an aqueous solution of 0.25% by mass of the anionic surfactant described in Table 1, and then dried at 30 ° C. for 24 hours.
  • nitrocellulose manufactured by Millipore, trade name: HF120, 300 mm ⁇ 25 mm
  • a solution obtained by diluting a goat-derived antiserum having a wide affinity with a gold nanoparticle labeling substance or animal meat protein as a detection substance with a phosphate buffer (pH 7.4) is used as a control site (control line). Applied. Then, it was dried at 50 ° C. for 30 minutes, and dried overnight at room temperature to prepare a chromatographic medium.
  • a phosphate buffer solution pH 7.4 containing 1% by weight of bovine serum albumin (BSA) was added, and the mixture was further allowed to stand at room temperature for 10 minutes. Then, after sufficiently stirring, centrifugation was performed at 8000 ⁇ g for 15 minutes to remove the supernatant, and 0.1 ml of a phosphate buffer solution (pH 7.4) containing 1% by mass of BSA was added.
  • the labeling substance solution was prepared by the above procedure.
  • the drainage time was measured according to JIS P 3801: 1995.
  • Specimen Diluting Solution A 50 mM BICINE buffer solution (pH 8.5) containing 2% by mass casein, 25 mM KCl, 0.095% sodium azide was prepared and used as a sample diluting solution.
  • the presence or absence of influenza A virus in the sample was measured by the following method. That is, one tube of the suction trap was inserted into the suction pump, and the other tube was inserted into the back of the nasal cavity of a person who was not infected with influenza, and the nasal discharge was collected using the suction pump as a negative pressure. The collected nasal discharge was diluted 20 times with the above-mentioned sample diluent, and this was used as a negative sample sample. Moreover, what added the commercially available inactivated influenza A virus so that protein concentration might be set to 50 ng / mL to the negative sample sample was made into the positive sample sample.
  • the background color is derived from the developed labeling substance (gold nanoparticles). When the red gold nanoparticles are completely absorbed by the absorption pad, the background color is lost and the original white color of the chromatographic medium is observed. Will come to be. In Table 1, when the background was a color equivalent to the original white color of the chromatographic medium, ⁇ (good), a little reddish, ⁇ (slightly bad), and a reddish one X (defect).
  • the backflow of the developed component was determined by visually observing the color tone of the chromatographic medium.
  • the evaluation of the backflow of the developing component was evaluated as having a background coloring after 60 minutes worse than after 10 minutes (increase in redness), and not having any other.
  • the presence or absence of false positives was determined by observing whether or not a red line derived from the labeling substance (gold nanoparticles) was generated at the detection part of the chromatographic medium at 60 minutes from the start of the test.
  • the sample used was a sample that was determined to be negative by the PCR method, and even in the test using the immunochromatographic test kit, no positive red line was observed in the detection part at 15 minutes after the start of the test. It was. However, when there is a backflow of the development component, a red line may appear in the detection unit at the point of 60 minutes from the start of the test. In this case, it was determined that there was a false positive.
  • Table 1 The results are shown in Table 1.
  • Example 5 Production of detection unit on chromatographic medium The detection unit was produced in the same manner as in Examples 1 to 4.
  • Sample dilution solution Prepare a 50 mM BICINE buffer solution (pH 8.5) containing 2% by mass casein, 25 mM KCl, 0.095% sodium azide, and mix by mixing 2% by mass Tween 80 to the indicated content. A diluted solution was prepared. (6) Measurement Measurement was performed and evaluated in the same manner as in Examples 1 to 4. The results are shown in Table 1.
  • Example 6 to 8 Production of detection unit on chromatographic medium The detection unit was produced in the same manner as in Examples 1 to 5.
  • the immunochromatographic analyzer was produced in the same manner as in Examples 1 to 5.
  • Specimen Diluent 50 mM BICINE buffer (pH 8.5) containing 2% by weight casein, 25 mM KCl, 0.095% sodium azide is prepared, and the nonionic surfactants listed in Table 1 are described.
  • a sample dilution solution was prepared by mixing to obtain a content rate.
  • IGAPEL CA-520 is polyoxyethylene (5) isooctyl phenyl ether, manufactured by Sigma-Aldrich.
  • Measurement Measurement was performed and evaluated in the same manner as in Examples 1 to 5. The results are shown in Table 1.
  • a non-woven fabric is used as a base material composed of a backing sheet as an absorption part for absorbing the developed chromatographic medium, the labeling substance holding member, the sample addition part used for the part to which the sample is added, the developed sample and the labeling substance. Pasted together. And it cut
  • the drainage time was measured according to JIS P 3801: 1995.
  • Specimen Diluent 50 mM BICINE buffer (pH 8.5) containing 2% by weight casein, 25 mM KCl, 0.095% sodium azide is prepared, and the nonionic surfactants listed in Table 1 are described.
  • a sample dilution solution was prepared by mixing to obtain a content rate.
  • the immunochromatography analyzer was produced in the same manner as in the example.
  • Comparative Example 1 a cotton linter was used for the absorption part, and in Comparative Example 2, cellulose fiber was used for the absorption part. As a result, liquid return of the sample was confirmed, and a false positive reaction was observed. It was.
  • the sample development speed can be increased and the sample development speed can be increased. Even if it did, it turned out that the liquid return of a developing component can be reduced and a false positive can be avoided by using a glass fiber for an absorption part.
  • Sample addition part (sample pad) 2. Labeling substance holding part (conjugate pad) 3. 3. Chromatographic media part 4. Detection unit Absorber 6. Backing sheet

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Abstract

　検出感度を低下させることなく展開時間を短くし、かつ展開成分の液戻りを低減することのできる免疫クロマト分析方法を提供することを課題とし、グラスファイバーからなる吸収部を含む免疫クロマト分析装置を用いて検体に含まれる被検出物質を検出する方法であって、非イオン性界面活性剤存在下で検体および標識物質を移動相としてクロマトグラフ媒体部に展開させ、被検出物質を検出部で検出する方法を提供する。

Description

免疫クロマト分析方法
　免疫クロマト分析方法、免疫クロマト分析装置および免疫クロマト分析キットに関する。
　近年、検体の前処理を行う必要の無い、免疫クロマトグラフィーによるイムノアッセイは、抗体の持つ特異的反応性を利用して、試料液中の抗原を検出する簡便な体外診断キットもしくは携帯用診断装置として重要性が高まっている。特に、ウィルスや細菌等の病原体検査キットは、一般の病院やクリニックでも汎用されている身近な免疫クロマトグラフィー装置である。
　免疫クロマトグラフィー装置の最も簡単な構造としては、試料添加部、標識物質保持部、検出部が担持されたクロマトグラフ媒体、および吸収部が相互に繋がった構造である。
　この中で吸収部には、従来、セルロース繊維、もしくはパルプ繊維などからなる綿、不織物またはろ紙等が用いられている。しかし、これらの素材のみで構成される吸収材は、いったん吸収した展開成分を保持する力に欠け、その結果、吸収材からの展開成分の逆流が発生するという問題があった。
　従来、このような吸収材からの展開成分の逆流を防止するために、高吸水性繊維を用いて吸収材を構成することが試みられている（特許文献１）。また、吸水性ポリマーを含有した吸収材が提案されている（特許文献２）。
日本国特開２００９－６３４８２号公報 日本国特開２０１２－１８９３４６号公報
　しかし、特許文献１に記載の高吸水性繊維を含む吸収材は、展開成分の吸収速度が遅く、規定された反応時間（１０～１５分間）内に展開成分が十分に吸収材に吸収されず、クロマトグラフ媒体上に残存した過剰な液体試料により検出部に現れる陽性シグナルが滲んだり、有色の標識物質が十分に回収されないためにバックグラウンドシグナルが上昇するという問題があった。
　また、特許文献２に記載の吸水性ポリマーを含有した吸収材は、上記問題点は解決しているものの、製造時に吸水性ポリマーが零れ落ちやすいという問題があった。
　また、展開成分の展開時間を短くするため展開速度を上昇させると、吸収部で展開成分の吸収効率が悪いことにより、吸収部で展開成分を吸収しきれず、展開成分の液戻りが発生し、偽陽性が生じてしまうという問題があった。
　したがって、本発明の目的は、検出感度を低下させることなく展開時間を短くし、かつ展開成分の液戻りを低減することのできる免疫クロマト分析方法を提供することにある。
　本発明は、以下の通りである。
１．試料添加部、標識物質保持部、検出部が担持されたクロマトグラフ媒体部およびグラスファイバーからなる吸収部を含む免疫クロマト分析装置を用いて検体に含まれる被検出物質を検出する方法であって、以下の工程（１）～（４）を含む免疫クロマト分析方法。
（１）検体希釈液により検体を希釈した検体含有液を試料添加部に添加する工程
（２）標識物質保持部に保持されている標識物質により被検出物質を認識させる工程
（３）非イオン性界面活性剤存在下で検体および標識物質を移動相としてクロマトグラフ媒体部に展開させる工程
（４）展開された移動相中の被検出物質を検出部で検出する工程
２．前記試料添加部および前記検体希釈液の少なくとも一方に非イオン性界面活性剤を含有する前項１に記載の方法。
３．前記試料添加部における非イオン性界面活性剤の含有量が１ｃｍ２あたり０．０５～５ｍｇである前項２に記載の方法。
４．前記検体希釈液における非イオン性界面活性剤の含有量が０．０５～１０質量％である前項２に記載の方法。
５．前記非イオン性界面活性剤のＨＬＢ値が１０以上である前項１～４のいずれか１項に記載の方法。
６．前記クロマトグラフ媒体部が陰イオン性界面活性剤を含む前項１～５のいずれか１項に記載の方法。
７．前記クロマトグラフ媒体部における陰イオン性界面活性剤の含有量が、０．０２～４質量％である前項６に記載の方法。
８．前記クロマトグラフ媒体部がニトロセルロースからなる前項１～７のいずれか１項に記載の方法。
９．前記吸収部の濾水時間が２０秒～１１０秒であり、かつ密度が１５０～５００ｍｇ／ｍ３である前項１～８のいずれか１項に記載の方法。
１０．試料添加部、標識物質保持部、検出部が担持されたクロマトグラフ媒体部および吸収部を順次含む免疫クロマト分析装置であって、該試料添加部は非イオン性界面活性剤を乾燥保持し、該吸収部はグラスファイバーからなる免疫クロマト分析装置。
１１．試料添加部、標識物質保持部、検出部が担持されたクロマトグラフ媒体部および吸収部を順次含む免疫クロマト装置と、検体に含まれる被検出物質を希釈する検体希釈液とを含む免疫クロマト分析キットであって、該吸収部がグラスファイバーからなり、該検体希釈液が非イオン性界面活性剤を含む免疫クロマト分析キット。
　本発明の免疫クロマト分析方法は、非イオン性界面活性剤存在下で、検体および標識物質を移動相としてクロマトグラフ媒体部に展開させる免疫クロマト分析装置を用いることで、検出感度を低下させることなく、且つ展開時間を短くすることができる。
　従来の免疫クロマト分析方法においては、展開時間が短くなることによって、吸収部で展開成分を吸収しきれず、展開成分の液戻りが発生してしまうが、本発明の免疫クロマト分析方法は、吸収部にグラスファイバーを用いることで、展開成分の液戻りを低減し、偽陽性を回避することができる。
図１は、免疫クロマト分析装置の構造を示す。
　以下に、本発明を実施するための形態を説明する。
　本発明の免疫クロマト分析方法は、試料添加部、標識物質保持部、検出部が担持されたクロマトグラフ媒体部およびグラスファイバーからなる吸収部を含む免疫クロマト分析装置を用いて、非イオン性界面活性剤の存在下で検体に含まれる被検出物質を検出する方法である。
　本発明で用いることのできる免疫クロマト分析装置およびその使用方法について、以下に説明をする。
　免疫クロマト分析装置は図１に示すように、試料添加部（サンプルパッドともいう）（１）、標識物質保持部（コンジュゲートパッドともいう）（２）、クロマトグラフ媒体部（３）、検出部（４）、吸収部（５）を順次含んでおり、さらにバッキングシート（６）を有している。順次とは、本発明の免疫クロマト分析装置において試料が展開する各部位の順番を示す。それらの各部位の構造、仕様および態様は以下のとおりである。
　試料添加部（１）は、免疫クロマト分析装置において、サンプルを滴下する部位である。通常免疫クロマトグラフに使用される素材であればどのようなものでもよい。通常、試料添加部は試料を吸収保持するグラスファイバーまたはセルロースの膜が使用される。
　試料添加部には、非イオン性界面活性剤を含有させておくことが好ましい。このことにより、検体が試料部の添加部材に吸着し検出感度が低下することを防ぐ。加えて、試料の表面張力を下げることにより、展開時間が短くなる。
　試料添加部における非イオン性界面活性剤の含有量は、０．０５～５ｍｇであることが好ましく、より好ましくは０．２ｍｇ～５ｍｇであり、さらに好ましくは０．２ｍｇ～２．５ｍｇである。
　試料添加部における非イオン性界面活性剤の含有量が０．０５ｍｇ以上であることによって、試料の表面張力を有意に下げることができ、５ｍｇ以下であることによって、非イオン性界面活性剤による試料への変性作用を抑制できるからである。
　非イオン性界面活性剤としては、例えば、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレン／ポリオキシプロピレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル（商品名「Ｔｗｅｅｎ」シリーズ）、ポリオキシエチレンｐ－ｔ－オクチルフェニルエーテル（商品名「Ｔｒｉｔｏｎ」シリーズ）、ポリオキシエチレンｐ－ｔ－ノニルフェニルエーテル（商品名「ＴｒｉｔｏｎＮ」シリーズ）、アルキルポリグルコシド、脂肪酸ジエタノールアミド、アルキルモノグリセリルエーテル、ＮＰ－４０（シグマアルドリッチ製）、ＩＧＡＰＥＬ　ＣＡ－５２０（シグマアルドリッチ製）等を挙げることができる。
　非イオン性界面活性剤のＨＬＢ値は、１０以上であることが好ましく、より好ましくは１１．０以上であり、さらに好ましくは１２．４以上である。上限値については特に限定されないが、好ましくは１８以下である。
　非イオン性界面活性剤のＨＬＢ値が、１０以上であることによって、疎水性相互作用による試料への変性効果を抑制できる。非イオン性界面活性剤のＨＬＢ値が、１８以下であることによって、疎水性相互作用による試料への変性効果を抑制できる。
　非イオン性界面活性剤のＣＭＣ値は５μｍｏｌ～６０ｍｍｏｌであることが好ましく、より好ましくは１０μｍｏｌ～６０ｍｍｏｌであり、さらに好ましくは１２μｍｏｌ～６０ｍｍｏｌである。
　非イオン性界面活性剤のＣＭＣ値が、５μｍｏｌ以上であることにより添加の効果を発揮することができる。また、６０ｍｍｏｌ以下であることにより使用量を少なくすることができ、経済的である。
　試料添加部に含有させる場合の非イオン性界面活性剤は、０．０５～１０質量％の濃度の水溶液とし、この溶液に試料添加部に使用する部材を浸漬し、その後真空乾燥又は自然乾燥させて、非イオン性界面活性剤を含有した試料添加部とする。
　標識物質保持部（２）は、あらかじめ被検出物質と結合する抗体に結合した、後述する標識物質（マーカー物質）が含有されている。標識物質保持部内を被検出物質が移動する際に抗体と結合し、標識化される。標識物質保持部は、例えば、グラスファイバー不織布またはセルロース膜等からなっている。
　クロマトグラフ媒体部（３）は、クロマトグラフの展開部位である。クロマトグラフ媒体部は、毛管現象を示す微細多孔性物質からなる不活性の膜である。クロマトグラフで使用される検出試薬、固定化試薬または被検出物質などと反応性を有しないものとして、例えば、ニトロセルロース製のメンブレン（以下「ニトロセルロースメンブレン」という場合がある）等が挙げられる。
　ニトロセルロース製のメンブレンとしては、ニトロセルロースが主体で含まれていればよく、純品またはニトロセルロース混合品などニトロセルロースを主材とするメンブレンを使用すると良いが、その他の材料でも何ら問題はない。その他の材料としては、例えば、セルロース類メンブレン、ナイロンメンブレン及び多孔質プラスチック布類（ポリエチレン、ポリプロピレン）などが挙げられる。
　前記ニトロセルロースメンブレンは、さらに毛細管現象を促進させる物質を含有させることもできる。該物質としては、膜面の表面張力を低下させ、親水性をもたらす物質が好ましい。例えば、糖類、アミノ酸の誘導体、脂肪酸エステル、各種合成界面活性剤またはアルコール等の両親媒性の作用を有する物質であって、免疫クロマトグラフ上での被検出物質の移動に影響がなく、マーカー物質（例えば金コロイドなど）の発色に影響を及ぼさない物質が好ましい。
　前記物質としては、例えば、陰イオン性界面活性剤、両イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、グリセリンが挙げられ、中でも陰イオン性界面活性剤が好ましい。陰イオン性界面活性剤としては、例えば、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム（ＳＤＢＳ）、ドデシルスルホン酸ナトリウム（ＳＤＳ）、Ｃ１２～Ｃ１８のアルキルのスルホン酸ナトリウム（アルカンスルホン酸ナトリウム）、ジアルキルスルホコハク酸ナトリウムおよびコール酸ナトリウム等が挙げられる。
　特に好ましくは、ドデシルスルホン酸ナトリウム（ＳＤＳ）またはＣ１２～Ｃ１８のアルキルのスルホン酸ナトリウム（アルカンスルホン酸ナトリウム）である。
　クロマトグラフ媒体部における陰イオン性界面活性剤の含有量は０．０２～４質量％が好ましく、より好ましくは０．０２～１質量％であり、さらに好ましくは０．１～１質量％である。
　クロマトグラフ媒体部における陰イオン性界面活性剤の含有量が０．０２質量％以上であることで、十分な感度と検出時間の短縮効果が得られ、保存安定性の低下を回避できる。クロマトグラフ媒体部における陰イオン性界面活性剤の含有量が４質量％以下であることで、陰性検体での非特異反応が生じることを防ぐことができる。
　クロマトグラフ媒体部中に含有させる陰イオン性界面活性剤は０．１～１０質量％の濃度の水溶液とし、この溶液にニトロセルロースメンブレンを浸漬し、その後真空乾燥又は自然乾燥させて、陰イオン性界面活性剤を含有したクロマト媒体とする。前記方法の他、製膜されたメンブレンに対して添加剤を直接添加し乾燥させるなど、製膜されたメンブレンに対し外添により含有させられればよく、これらの方法に限られない。
　このようにして調製したニトロセルロースメンブレンは、多孔性であって、毛細管現象を示す。この毛細管現象の指標は、吸水速度（吸水時間：ｃａｐｉｌｌａｒｙ　ｆｌｏｗ　ｔｉｍｅ）を測ることで確認できる。吸水速度は、検出感度と検査時間に影響する。
　本発明の免疫クロマト分析方法で用いるクロマトグラフ媒体としてのニトロセルロースメンブレンの形態及び大きさは特に制限されるものではなく、実際の操作の点及び反応結果の観察の点において適切であればよい。
　さらに操作をより簡便にするためには、反応部位が表面に形成されているクロマトグラフ媒体の裏面に、プラスチックなどよりなる支持体を設けることが好ましい。この支持体の性状は特に制限されるものではないが、目視判定によって測定結果の観察を行う場合には、支持体は、標識物質によりもたらされる色彩と類似しない色彩を有するものであることが好ましく、通常、無色又は白色であることが好ましい。
　検出部（４）は、前記クロマトグラフ媒体部（３）上に形成され、すなわち、被検出物質と特異的に結合する物質、例えば抗体が固定化試薬として任意の位置に固定化された反応部位が形成される。
　固定化試薬をクロマトグラフ媒体に固定化する方法としては、固定化試薬をクロマトグラフ媒体に物理的又は化学的手段により直接固定化する方法と、固定化試薬をラテックス粒子などの微粒子に物理的又は化学的に結合し、この微粒子をクロマトグラフ媒体に捕捉して固定化する間接固定化方法がある。
　直接的に固定化する方法としては、物理吸着を利用してもよいし、共有結合によってもよい。ニトロセルロースメンブレンの場合、物理吸着を行うことができる。共有結合ではクロマトグラフ媒体の活性化には一般的に臭化シアン、グルタルアルデヒドまたはカルボジイミド等が用いられるが、いずれの方法も用いることができる。
　間接的に固定化する方法としては、不溶性微粒子に固定化試薬を結合した後に、クロマトグラフ媒体に固定化する方法がある。不溶性微粒子の粒径はクロマトグラフ媒体に捕捉されるが移動することのできないサイズのものを選択することができ、好ましくは平均粒径５μｍ程度以下の微粒子である。
　これらの粒子としては抗原抗体反応に使用されるものが種々知られており、本発明でもこれら公知の粒子を使用することができる。例えば、ポリスチレン、スチレン－ブタジエン共重合体、スチレン－メタクリル酸共重合体、ポリグリシジルメタクリレートもしくはアクロレイン－エチレングリコールジメタクリレート共重合体などの乳化重合法によって得られる有機高分子ラテックス粒子などの有機高分子物質の微粒子、ゼラチン、ベントナイト、アガロースもしくは架橋デキストランなどの微粒子、シリカ、シリカ－アルミナもしくはアルミナなどの無機酸化物または無機酸化物にシランカップリング処理などで官能基を導入した無機粒子等が挙げられる。
　本発明においては、感度調整の容易さ等から直接固定化の方が好ましい。また、クロマトグラフ媒体への固定化試薬の固定化には、いろいろな方法が使用できる。例えば、マイクロシリンジ、調節ポンプ付きペンまたはインキ噴射印刷等、種々の技術が使用可能である。反応部位の形態としては特に限定されないが、円形のスポット、クロマトグラフ媒体の展開方向に垂直にのびるライン、数字、文字または＋、－などの記号等として固定化することもできる。
　固定化試薬を固定化した後、非特異的な吸着により分析の精度が低下することを防止するため、必要に応じて、クロマトグラフ媒体に、公知の方法でブロッキング処理を行うことができる。
　一般にブロッキング処理はウシ血清アルブミン、スキムミルク、カゼインまたはゼラチン等の蛋白質が好適に用いられる。かかるブロッキング処理後に、必要に応じて、例えば、Ｔｗｅｅｎ２０、ＴｒｉｔｏｎＸ－１００またはＳＤＳ等の界面活性剤を１つ又は２つ以上組み合わせて洗浄してもよい。
　吸収部（５）は、クロマトグラフ媒体の末端に、展開液を吸収させるために設置される。本発明の免疫クロマト分析装置において、吸収部はグラスファイバーからなる。吸収部がグラスファイバーからなることによって、展開成分の液戻りを大幅に低減することができる。
　非イオン性界面活性剤存在下において免疫クロマト分析を行うことにより、展開時間が短くなるが、吸収部で展開成分の吸収効率が悪いと、吸収部で展開成分を吸収しきれず、展開成分の液戻りが発生してしまう。
　ここで、吸収部にセルロース繊維などの汎用される部材を吸収剤として用いると、吸収スピードが遅く吸収部での展開成分や非イオン性界面活性剤などの拡散速度も遅いため、非イオン性界面活性剤による吸着抑制効果が顕在化するため展開成分の逆流が生じてしまう。
　しかし、グラスファイバーからなる吸収部は吸水スピードが速く、展開成分が吸収部で速やかに拡散し展開成分や非イオン性界面活性剤などは希薄となり逆流が抑制される。すなわち、吸収部にグラスファイバーを用いることによって、展開成分の液戻りを大幅に低減することができ、展開時間の短縮および偽陽性の低減が可能となる。
　上述した試料添加部では、体積あたりの非イオン性界面活性剤の密度が高いため部材への吸着を抑制する作用を発揮するが、吸収部では添加部より体積が大きいため非イオン性界面活性剤の吸収部体積あたりの密度が低くなり吸着抑制が緩和されるため吸収部材からの展開成分の逆流は起こりにくくなる。
　吸収部は、濾水時間が２０秒～１１０秒であることが好ましく、より好ましくは２０～１０５秒であり、さらに好ましくは２０～１００秒である。
　吸収部の濾水時間が２０秒以上であることにより、反応に必要な時間を最低限確保することができ、検出感度が低下することがない。吸収部の濾水時間が１１０秒以下であることにより、判定時間を短くすることができる。吸水部の濾水時間は、ＪＩＳ　Ｐ　３８０１：１９９５に従うことにより測定することができる。
　また、使用する吸収部の密度は、１５０～５００ｍｇ／ｍ３であることが好ましく、より好ましくは２００～５００ｍｇ／ｍ３であり、さらに好ましくは２００～３５０ｍｇ／ｍ３である。密度が２００～３５０ｍｇ／ｍ３であるグラスファイバーを用いることによって、展開成分の液戻りを大幅に軽減できる。
　バッキングシート（６）は、基材である。片面に粘着剤を塗布したり、粘着テープを貼り付けることにより、片面が粘着性を有し、該粘着面上に試料添加部（１）、標識物質保持部（２）、クロマトグラフ媒体部（３）、検出部（４）、および吸収部（５）の一部または全部が密着して設けられている。バッキングシート（６）は、粘着剤によって試料液に対して不透過性、非透湿性となるようなものであれば、基材としては、特に限定されない。
　本発明の免疫クロマト分析方法は以下の工程（１）～（４）を含み、上記の免疫クロマト分析装置を用いて検体に含まれる被検出物質を検出する。
（１）検体希釈液により検体を希釈した検体含有液を試料添加部に添加する工程
（２）標識物質保持部に保持されている標識物質により被検出物質を認識させる工程
（３）非イオン性界面活性剤存在下で検体および標識物質を移動相としてクロマトグラフ媒体部に展開させる工程
（４）展開された移動相中の被検出物質を検出部で検出する工程
　各工程について以下に説明する。
（１）検体希釈液により検体を希釈した検体含有液を試料添加部に添加する工程
　工程（１）では、第１に、検体を、測定精度を低下させることなく、免疫クロマトグラフ媒体中をスムーズに移動する程度の濃度に検体希釈液で調整または希釈して検体含有液とする。第２に、該検体含有液を試料添加部（１）上に、所定量（通常、０．１～２ｍｌ）滴下する。検体含有液が滴下されると、検体含有液は試料添加部（１）中で移動を開始する。
　検体希釈液は、非イオン性界面活性剤を含有することが好ましい。このことにより、検出感度が低下することなく、且つ展開時間が短くなる。非イオン性界面活性剤は上記と同様のものを使用できる。検体希釈液における非イオン性界面活性剤の含有量は、０．０５～１０質量％であることが好ましく、より好ましくは０．０５～５質量％であり、さらに好ましくは０．０５～３．５質量％である。
　検体希釈液における非イオン性界面活性剤の含有量が０．０５質量％以上であることによって、検体が試料滴下部の部材に吸着し、検出感度が低下することを防ぎ、且つ検体希釈液の表面張力を下げることで展開時間を短くすることができる。
　検体希釈液における非イオン性界面活性剤の含有量が１０質量％以下であることによって、非イオン性界面活性剤による試料の変性作用を抑制できるためである。
　被検出物質を含む検体としては、例えば、生体試料、即ち、全血、血清、血漿、尿、唾液、喀痰、鼻腔又は咽頭拭い液、髄液、羊水、乳頭分泌液、涙、汗、皮膚からの浸出液、組織や細胞及び便からの抽出液等の他、牛乳、卵、小麦、豆、牛肉、豚肉、鶏肉などやそれらを含む食品等の抽出液等が挙げられる。
（２）標識物質保持部に保持されている標識物質により被検出物質を認識させる工程
　工程（２）は、工程（１）において試料添加部に添加された検体含有液を、標識物質保持部（２）へと移動させ、標識物質保持部に保持されている標識物質により検体中の被検出物質を認識させる工程である。
　標識物質は、被検出物質と特異的に結合する物質、例えば抗体を標識化する。免疫クロマトグラフ法における検出試薬の標識には、一般に酵素等も使用されるが、被検出物質の存在を目視で判定するのに適していることから、標識物質としては不溶性担体を用いることが好ましい。検出試薬を不溶性担体に感作することにより標識化した検出試薬を調製することができる。
　標識物質としての不溶性担体には、金、銀もしくは白金のようなコロイド状金属粒子、酸化鉄のようなコロイド状金属酸化物粒子、硫黄などのコロイド状非金属粒子及び合成高分子よりなるラテックス粒子、またはその他を用いることができる。特に金コロイドが、検出が簡便で好ましい。
　不溶性担体は、被検出物質の存在を視覚的に判定するのに適した標識物質であり、目視による判定を容易にするためには有色であることが好ましい。コロイド状金属粒子及びコロイド状金属酸化物粒子は、それ自体が粒径に応じた特定の自然色を呈するものであり、その色彩を標識として利用することができる。
　標識物質として用いることのできるコロイド状金属粒子及びコロイド状金属酸化物粒子には、例えば、コロイド状金粒子、コロイド状銀粒子、コロイド状白金粒子、コロイド状酸化鉄粒子、コロイド状水酸化アルミニウム粒子などが挙げられる。
　特に、コロイド状金粒子とコロイド状銀粒子が適当な粒径において、コロイド状金粒子は赤色、コロイド状銀粒子は黄色を示す点で好ましい。
　コロイド状金属粒子として、例えばコロイド状金粒子を用いる場合には、市販のものを用いてもよい。あるいは、常法、例えば塩化金酸をクエン酸ナトリウムで還元する方法によりコロイド状金粒子を調製することができる。
　検出試薬をコロイド状金属粒子に感作する方法としては、物理吸着や化学結合などの公知の方法が使用できる。例えば、コロイド状金粒子に抗体を感作した検出試薬は、金粒子がコロイド状に分散した溶液に抗体を加えて物理吸着させた後、牛血清アルブミン溶液を添加して抗体が未結合である粒子表面をブロッキングすることにより調製する。
　実際の免疫クロマト分析の実施において、不溶性担体により標識化した検出試薬は、移動相を構成する展開液に分散して適用することもできるし、固定相を構成するクロマトグラフ媒体における移動相の展開移動経路上、すなわちクロマトグラフ媒体の移動相が適用される端部と反応部位との間の領域に存在させて適用することもできる。
　クロマトグラフ媒体上に存在させる場合、検出試薬が展開液に速やかに溶解して毛管作用によって自由に移動できるように、検出試薬を支持させるのが好ましい。支持させる部位には、検出試薬が感作された不溶性担体の再溶解性を良好にするため、サッカロース、マルトースもしくはラクトース等の糖類、またはマンニトール等の糖アルコールを添加して塗布したり、これらの物質を予めコーティングしたりしておくこともできる。
　検出試薬を塗布・乾燥等によりクロマトグラフ媒体上に存在させる際には、固定化試薬が固定化されたクロマトグラフ媒体に直接、塗布・乾燥等することもできるし、別の多孔性物質、例えばセルロース濾紙、グラスファイバー濾紙またはナイロン不織布に塗布・乾燥等して検出試薬保持部材を形成した後、固定化試薬が固定化されたクロマトグラフ媒体と毛管で繋がるように配置してもよい。
　本発明の方法により検出される被検出物質としては、それに特異的に結合する物質が存在するものであれば特に限定されず、例えば、蛋白質、ペプチド、核酸、糖（特に糖タンパク質の糖部分、糖脂質の糖部分等）、複合糖質等が挙げられる。
　本発明において「特異的に結合する」とは、生体分子が持つ親和力に基づいて結合することを意味する。このような親和力に基づく結合としては、例えば、抗原と抗体との結合、糖とレクチンとの結合、ホルモンと受容体との結合、酵素と阻害剤との結合、相補的核酸同士及び核酸と核酸結合蛋白質との結合などが挙げられる。
　従って、被検出物質が抗原性を有する場合、被検出物質に特異的に結合する物質としては、例えば、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体が挙げられる。また、被検出物質が糖の場合、被検出物質に特異的に結合する物質としては例えば、レクチンタンパク質が挙げられる。
　具体的な被検出物質としては、例えば、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＨＥＲ２タンパク、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、ＣＡ１９－９、α－フェトプロテイン（ＡＦＰ）、免疫抑制酸性タンパク（ＩＰＡ）、ＣＡ１５－３、ＣＡ１２５、エストロゲンレセプター、プロゲステロンレセプター、便潜血、トロポニンＩ、トロポニンＴ、ＣＫ－ＭＢ、ＣＲＰ、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、梅毒抗体、インフルエンザウィルス、ヒトヘモグロビン、クラミジア抗原、Ａ群β溶連菌抗原、ＨＢｓ抗体、ＨＢｓ抗原、ロタウィルス、アデノウィルス、アルブミンまたは糖化アルブミン等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
（３）非イオン性界面活性剤存在下で検体および標識物質を移動相としてクロマトグラフ媒体部に展開させる工程
　工程（３）は、工程（２）において被検出物質が標識物質に認識された後、検体および標識物質を、非イオン性界面活性剤存在下でクロマトグラフ媒体部（３）上を移動相として通過させる工程である。
　非イオン性界面活性剤は、検体および標識物質を移動相としてクロマトグラフ媒体部に展開させる過程において存在させておく。上記したように試料添加部に含有させておくか、または検体希釈液に含有させることが好ましい。
　非イオン性界面活性剤を含有させておくことによって検体が試料滴下部の部材へ吸着し、検出感度が低下することを防ぐことができ、試料溶液の表面張力を下げることで判定時間を短くすることができるからである。より好ましくは検体希釈液に非イオン性界面活性剤を含有させる。
　検体希釈液に非イオン性界面活性剤を含有させることによって、試料中に成分を予め均一化することができ、部材に含有させるよりもより部材への吸着を抑制する効果が期待できる。加えて、試料滴下部での非イオン性界面活性剤の溶出時間がないため、より判定時間が短くすることができるためである。非イオン性界面活性剤は、試料添加部と検体希釈液の両方に含有させておいてもよい。
　本発明の免疫クロマト分析方法においては、必要であれば展開液を用いてもよい。展開液は、免疫クロマトグラフ法において移動相を構成する液体であり、固定相であるクロマトグラフ媒体上を、被検出物質を含む試料及び標識化した検出試薬と共に移動する。このような展開液であれば、どのようなものであってもよい。
（４）展開された移動相中の被検出物質を検出部で検出する工程
　工程（４）は、クロマトグラフ媒体部（３）上を移動相として通過した検体中の被検出物質が、抗原・抗体の特異的結合反応により、検出部（４）に保持、即ち、担持固定されている抗体と標識試薬とによってサンドイッチ状に挟まれるように特異的に反応結合して、検出部（４）が着色する工程である。
　被検出物質が存在しない場合には、試料の水分に溶解した標識試薬は、クロマトグラフ媒体部（３）上の検出部（４）を通過しても特異的結合反応が起こらないので、検出部（４）が着色しない。
　最後に、検体含有液の水分は、吸収部（５）へと移動する。
　このように、検体に含まれる被検出物質、例えば、検体含有液中のインフルエンザウィルスの有無を検査することにより、インフルエンザウィルスの感染の有無を正確に判定することができる。
　以下、本発明を実施例および比較例によりさらに説明するが、本発明は下記実施例に制限されるものではない。
　［実施例１～４］
　（１）クロマトグラフ媒体上への検出部の作製
　メンブレンとしてニトロセルロースからなるシート（ミリポア社製、商品名：ＨＦ１２０、３００ｍｍ×２５ｍｍ）を用いた。前処理としてメンブレンを０．２５質量％の表１に記載の陰イオン性界面活性剤の水溶液に浸漬した後、３０℃２４時間で乾燥させた。
　次に、５質量％のイソプロピルアルコールを含むリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で１．０ｍｇ／ｍｌの濃度になるようにマウス由来抗インフルエンザＡモノクローナル抗体（第一抗体）を希釈した溶液１５０μＬを、陰イオン性界面活性剤を含有させ乾燥されたメンブレン上の検出部位（検出ライン）に１ｍｍの幅で塗布し、金ナノ粒子標識試薬の展開の有無や展開速度を確認するために検出部位の下流に、金ナノ粒子標識物質や被検出物質である動物肉タンパク質などと広く親和性を有するヤギ由来抗血清をリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で希釈した液をコントロール部位（コントロールライン）に塗布した。その後、５０℃で３０分間乾燥させ、室温で一晩乾燥させ、クロマトグラフ媒体を作製した。
　（２）標識物質溶液の作製
　金コロイド懸濁液（田中貴金属工業社製：ＬＣ４０ｎｍ）０．５ｍｌに、リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で０．０５ｍｇ／ｍｌの濃度になるように希釈したマウス由来抗インフルエンザＡモノクローナル抗体（第二抗体）を０．１ｍｌ加え、室温で１０分間静置した。
　次いで、１質量％の牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）を０．１ｍｌ加え、更に室温で１０分間静置した。その後、十分撹拌した後、８０００×ｇで１５分間遠心分離を行い、上清を除去した後、１質量％のＢＳＡを含むリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）を０．１ｍｌ加えた。以上の手順で標識物質溶液を作製した。
　（３）試料添加部の作製
　試料添加部としてグラスファイバーからなる不織布（ミリポア社製：３００ｍｍ×３０ｍｍ）を、２質量％の表１に示す非イオン性界面活性剤水溶液に浸漬した後、３０℃２４時間で乾燥し試料添加部を作製した。作製された試料添加部中に含まれる、非イオン性界面活性剤の種類、そのＨＬＢ値および含有量を表１に示す。表１中、Ｔｗｅｅｎ２０とはポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレートであり、Ｔｗｅｅｎ８０とはポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオーレートであり、ＴｒｉｔｏｎＸ－１００とはポリオキシエチレン（１０）オクチルフェニルエーテルであり、いずれも和光純薬工業株式会社製である。また、ＮＰ－４０とは、（オクチルフェノキシ）ポリエトキシエタノールであり、シグマアルドリッチ社製である。
　（４）免疫クロマト分析装置の作製
　上記作製した標識物質溶液３００μＬに３００μＬの１０質量％トレハロース水溶液と１．８ｍＬの蒸留水を加えたものを１５ｍｍ×３００ｍｍのグラスファイバーパッド（ミリポア社製）に均一になるように添加した後、真空乾燥機にて乾燥させ、標識物質保持部材を作製した。
　次に、バッキングシートから成る基材に、上記作製したクロマトグラフ媒体、標識物質保持部材、試料を添加する部分に用いる試料添加部、展開した試料や標識物質を吸収するための吸収部としてグラスファイバー製の不織布（密度０．２５ｇ／ｍ３）を貼り合わせた。そして、裁断機で幅が５ｍｍとなるように裁断し、免疫クロマト分析装置とした。吸収部に用いた不織物の種類および吸水部の濾水時間を表１に示す。
　濾水時間は、ＪＩＳ　Ｐ　３８０１：１９９５に従い測定した。
　（５）検体希釈液
　２質量％カゼイン、２５ｍＭ　ＫＣｌ、０．０９５％アジ化ナトリウムを含む５０ｍＭ　ＢＩＣＩＮＥ緩衝液（ｐＨ８．５）を調製し、検体希釈液とした。
　（６）測定
　上記作製した免疫クロマトグラフィー用試験片を用いて、以下の方法で試料中のインフルエンザＡウィルスの存在の有無を測定した。即ち、吸引トラップの片方の管を吸引ポンプに、もう片方の管をインフルエンザに感染していない人の鼻腔の奥部まで挿入し、吸引ポンプを陰圧にして鼻汁を採取した。採取した鼻汁を上記検体希釈液で２０倍に希釈し、これを陰性検体試料とした。また、陰性検体試料に、蛋白濃度が５０ｎｇ／ｍＬとなるように市販の不活化インフルエンザＡウィルスを加えたものを陽性検体試料とした。
　陰性検体試料、陽性検体試料とも１５０μＬを免疫クロマトグラフィー用試験片の試料添加部上に載せて展開させ、１０分後に目視判定をした。テストラインの赤い線を確認できるものを「＋」、赤い線は確認できるが、非常に色が薄いものを「±」、赤い線を確認できないものを「－」とした。
　また、検査開始から１０分の時点でのバックグラウンド着色の有無、検査開始から６０分の時点での展開成分の逆流及び偽陽性の有無（陰性検体のみ）を観察した。試験の結果を表１に示す。
　バックグラウンドの着色は展開される標識物質（金ナノ粒子）に由来し、赤色の金ナノ粒子が吸収パッドに完全に吸収されると、バックグラウンドの着色が抜け、クロマトグラフ媒体本来の白色が観察されるようになる。表１では、バックグラウンドが、クロマトグラフ媒体本来の白色と同等の色であったものを○（良好）、やや赤味がかっていたものを△（やや不良）、赤味を帯びていたものを×（不良）で示す。
　クロマトグラフ媒体は乾燥状態と湿潤状態では色調が異なって見えるため、展開成分の逆流は、クロマトグラフ媒体の色調を目視で観察することにより判定した。展開成分の逆流の評価は、６０分後のバックグラウンド着色が１０分後よりも悪化している（赤みが増している）ものを有りと評価し、それ以外を無しと評価した。
　偽陽性の有無は、検査開始から６０分の時点で、クロマトグラフ媒体の検出部に標識物質（金ナノ粒子）に由来する赤いラインが生じるか否かを観察することにより判定した。用いた試料はＰＣＲ法による検査で陰性と判定された試料であり、イムノクロマト法による検査キットを用いた試験でも、検査開始から１５分の時点では、検出部に陽性を示す赤いラインは観察されなかった。しかしながら、展開成分の逆流がある場合には、検査開始から６０分の時点で、検出部に赤いラインが生じることがあり、この場合に偽陽性有りと判定した。結果を表１に示す。
　［実施例５］
　（１）クロマトグラフ媒体上への検出部の作製
　検出部については、実施例１～４と同様に作製した。
　（２）標識物質溶液の作製
　標識物質溶液については、実施例１～４と同様に作製した。
　（３）試料添加部の作製
　試料添加部については、実施例１～４と同様に作製した。
　（４）免疫クロマト分析装置の作製
　免疫クロマト分析装置については、実施例１～４と同様に作製した。
　（５）検体希釈液
　２質量％カゼイン、２５ｍＭ　ＫＣｌ、０．０９５％アジ化ナトリウムを含む５０ｍＭ　ＢＩＣＩＮＥ緩衝液（ｐＨ８．５）を調製し、２質量％Ｔｗｅｅｎ８０を記載含有率となるよう混合し検体希釈液を作製した。
　（６）測定
　測定については、実施例１～４と同様に実施し、評価した。結果を表１に示す。
　［実施例６～８］
　（１）クロマトグラフ媒体上への検出部の作製
　検出部については、実施例１～５と同様に作製した。
　（２）標識物質溶液の作製
　標識物質溶液については、実施例１～５と同様に作製した。
　（３）試料添加部の作製
　試料添加部としてグラスファイバーからなる不織布（ミリポア社製：３００ｍｍ×３０ｍｍ）を使用した。
　（４）免疫クロマト分析装置の作製
　免疫クロマト分析装置については、実施例１～５と同様に作製した。
　（５）検体希釈液
　２質量％カゼイン、２５ｍＭ　ＫＣｌ、０．０９５％アジ化ナトリウムを含む５０ｍＭ　ＢＩＣＩＮＥ緩衝液（ｐＨ８．５）を調製し、表１に記載の非イオン性界面活性剤をそれぞれ記載含有率となるよう混合し検体希釈液を作製した。表１中、ＩＧＡＰＥＬ　ＣＡ－５２０とは、ポリオキシエチレン（５）イソオクチルフェニルエーテルであり、シグマアルドリッチ社製である。
　（６）測定
　測定については、実施例１～５と同様に実施し、評価した。結果を表１に示す。
　［比較例１、２］
　（１）クロマトグラフ媒体上への検出部の作製
　検出部については、実施例と同様に作製した。
　（２）標識物質溶液の作製
　標識物質溶液については、実施例と同様に作製した。
　（３）試料添加部の作製
　試料添加部としてグラスファイバーからなる不織布（ミリポア社製：３００ｍｍ×３０ｍｍ）を使用した。
　（４）免疫クロマト分析装置の作製
　上記作製した標識物質溶液３００μＬに３００μＬの１０質量％トレハロース水溶液と１．８ｍＬの蒸留水を加えたものを１５ｍｍ×３００ｍｍのグラスファイバーパッド（ミリポア社製）に均一になるように添加した後、真空乾燥機にて乾燥させ、標識物質保持部材を作製した。
　次に、バッキングシートから成る基材に、上記作製したクロマトグラフ媒体、標識物質保持部材、試料を添加する部分に用いる試料添加部、展開した試料や標識物質を吸収するための吸収部として不織布を貼り合わせた。そして、裁断機で幅が５ｍｍとなるように裁断し、免疫クロマト分析装置とした。吸収部に用いた不織物の種類および吸収部の濾水時間を表１に示す。
　濾水時間は、ＪＩＳ　Ｐ　３８０１：１９９５に従い測定した。
　（５）検体希釈液
　２質量％カゼイン、２５ｍＭ　ＫＣｌ、０．０９５％アジ化ナトリウムを含む５０ｍＭ　ＢＩＣＩＮＥ緩衝液（ｐＨ８．５）を調製し、表１に記載の非イオン性界面活性剤をそれぞれ記載含有率となるよう混合し検体希釈液を作製した。
　（６）測定
　測定については、実施例と同様に実施し、評価した。結果を表１に示す。
　［比較例３］
　（１）クロマトグラフ媒体上への検出部の作製
　検出部については、実施例と同様に作製した。
　（２）標識物質溶液の作製
　標識物質溶液については、実施例と同様に作製した。
　（３）試料添加部の作製
　試料添加部としてグラスファイバーからなる不織布（ミリポア社製：３００ｍｍ×３０ｍｍ）を使用した。
　（４）免疫クロマト分析装置の作製
　免疫クロマト分析装置については、実施例と同様に作製した。
　（５）検体希釈液
　２質量％カゼイン、２５ｍＭ　ＫＣｌ、０．０９５％アジ化ナトリウムを含む５０ｍＭ　ＢＩＣＩＮＥ緩衝液（ｐＨ８．５）を調製し、検体希釈液を作製した。
　（６）測定
　測定については、実施例と同様に実施し、評価した。結果を表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　表１に示すように、実施例１～８において、吸収部にグラスファイバーを用い、非イオン性界面活性剤存在下で検体および標識物質を移動相としてクロマトグラフ媒体部に展開させたところ、試料の液戻りが確認されず、その結果、偽陽性の反応は見られなかった。
　一方、比較例１では、吸収部にコットンリンターを用いており、比較例２では、吸収部にセルロース繊維を使用しており、その結果、試料の液戻りが確認され、偽陽性の反応が見られた。
　また、比較例３では、吸収部にグラスファイバーを用いているが、非イオン性界面活性剤の非存在下で検体および標識物質を移動相としてクロマトグラフ媒体部に展開させた結果、試料の液戻りが確認されなかったが、偽陽性の反応が見られた。
　これは、非イオン性界面活性剤が存在しないため展開速度が減少し、展開成分の剥離速度も減少するため、展開成分の逆流は発生しないが、クロマトグラフ媒体上に標識試薬が留まってしまうため、１０分後と６０分後のバックグラウンドの着色に変化が見られず、偽陽性の反応が見られたと考えられる。
　以上の結果から、非イオン性界面活性剤存在下で検体および標識物質を移動相としてクロマトグラフ媒体部に展開させると、試料の展開速度を上昇させることができ、また、試料の展開速度が上昇したとしても、吸収部にグラスファイバーを用いることによって、展開成分の液戻りを低減し、偽陽性を回避することができることが分かった。
　本発明を特定の態様を用いて詳細に説明したが、本発明の意図と範囲を離れることなく様々な変更および変形が可能であることは、当業者にとって明らかである。なお本出願は、２０１４年４月４日付で出願された日本特許出願（特願２０１４－０７７８６１）に基づいており、その全体が引用により援用される。
　　１．試料添加部（サンプルパッド）
　　２．標識物質保持部（コンジュゲートパッド）
　　３．クロマトグラフ媒体部
　　４．検出部
　　５．吸収部
　　６．バッキングシート

Claims (11)

  1. 　試料添加部、標識物質保持部、検出部が担持されたクロマトグラフ媒体部およびグラスファイバーからなる吸収部を含む免疫クロマト分析装置を用いて検体に含まれる被検出物質を検出する方法であって、以下の工程（１）～（４）を含む免疫クロマト分析方法。
    （１）検体希釈液により検体を希釈した検体含有液を試料添加部に添加する工程
    （２）標識物質保持部に保持されている標識物質により被検出物質を認識させる工程
    （３）非イオン性界面活性剤存在下で検体および標識物質を移動相としてクロマトグラフ媒体部に展開させる工程
    （４）展開された移動相中の被検出物質を検出部で検出する工程
  2. 　前記試料添加部および前記検体希釈液の少なくとも一方に非イオン性界面活性剤を含有する請求項１に記載の方法。
  3. 　前記試料添加部における非イオン性界面活性剤の含有量が１ｃｍ２あたり０．０５～５ｍｇである請求項２に記載の方法。
  4. 　前記検体希釈液における非イオン性界面活性剤の含有量が０．０５～１０質量％である請求項２に記載の方法。
  5. 　前記非イオン性界面活性剤のＨＬＢ値が１０以上である請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
  6. 　前記クロマトグラフ媒体部が陰イオン性界面活性剤を含む請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
  7. 　前記クロマトグラフ媒体部における陰イオン性界面活性剤の含有量が、０．０２～４質量％である請求項６に記載の方法。
  8. 　前記クロマトグラフ媒体部がニトロセルロースからなる請求項１～７のいずれか１項に記載の方法。
  9. 　前記吸収部の濾水時間が２０秒～１１０秒であり、かつ密度が１５０～５００ｍｇ／ｍ３である請求項１～８のいずれか１項に記載の方法。
  10. 　試料添加部、標識物質保持部、検出部が担持されたクロマトグラフ媒体部および吸収部を順次含む免疫クロマト分析装置であって、該試料添加部は非イオン性界面活性剤を乾燥保持し、該吸収部はグラスファイバーからなる免疫クロマト分析装置。
  11. 　試料添加部、標識物質保持部、検出部が担持されたクロマトグラフ媒体部および吸収部を順次含む免疫クロマト装置と、検体に含まれる被検出物質を希釈する検体希釈液とを含む免疫クロマト分析キットであって、該吸収部がグラスファイバーからなり、該検体希釈液が非イオン性界面活性剤を含む免疫クロマト分析キット。
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