WO2015152688A1 - 퇴행성 신경 질환의 예방 또는 치료를 위한 그래핀 나노구조체 기반 약학적 조성물 - Google Patents

퇴행성 신경 질환의 예방 또는 치료를 위한 그래핀 나노구조체 기반 약학적 조성물 Download PDF

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Definitions

  • the present application relates to a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of degenerative neurological diseases, including graphene nanostructure as an active ingredient.
  • Misfolding of proteins not only leads to loss of normal protein function, but also causes toxicity by abnormal proteins accumulating in cells, thereby causing Alzheimer's disease, Parkinson's disease, Huntington's disease, Lou Gehrig's disease, cancer, cystic fibrosis It is known that a number of diseases occur, such as type 2 diabetes. That is, protein proteostasis does not work properly, causing protein misfolding and abnormal accumulation in cells.
  • the pathogenesis of degenerative neuropathy is not yet known 100%, but it is well known that neuronal protein aggregation is a major factor. Proteins made of fibril structures gradually transfer to surrounding neurons, which eventually kill all the neurons in a specific part of the brain, making them unable to perform their functions. In Parkinson's disease, neurons that produce neurotransmitters called dopamine gradually become necrotic and progress. The most common drug currently prescribed for Parkinson's patients is the drug Sinemet, and other Parkinson's medications do not function to fundamentally cure or delay the disease, but rather to levodopa (Levodopa, L) in the nerve cells. Dopa) only provides temporary relief of symptoms. Eventually, as the disease continues, the effect of the drug decreases, leading to death.
  • Congo Red a type of anti-amyloid compound that has been studied for protein misfolding, is effective in preventing fibril formation due to protein misfolding.
  • the toxicity is high and there is no effect of delaying the progression of the disease by inhibiting the transfer of misfolded proteins.
  • conventional drugs are specified in one form of uniform size, in terms of thermodynamic entropy, they show little advantage for the treatment of the disease.
  • the present application is to provide a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of degenerative neurological diseases comprising the graphene nanostructures as an active ingredient.
  • One aspect of the present application provides a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of degenerative neurological diseases comprising the graphene nanostructures as an active ingredient.
  • the pharmaceutical composition for the prevention or treatment of degenerative neurological diseases comprising the graphene nanostructures according to the embodiments of the present application as an active ingredient is the first attempt to use the graphene nanostructures for the prevention and treatment of degenerative neurological diseases.
  • Graphene nanostructures are not toxic to the body, do not accumulate in the body, and show excellent effects such as inhibiting fibril formation by protein misfolding by up to 80%, and inhibiting the transfer of misfolded proteins. It is also effective in delaying progress.
  • the graphene nanostructures are not specified in one form, and since each graphene nanostructure differs in molecular weight, molecular formula, and form, the formation of crystals in terms of thermodynamics As it interferes, fundamental treatment of the disease is possible.
  • the graphene nanostructures exhibit fluorescence in the UV-vis region and have the advantage of tracking how the graphene nanostructures act as drugs in the body when the intensity of these fluorescence is properly adjusted.
  • the nerve protein can be traced by connecting a substance targeting the nerve protein to functional groups bound to the ends of the graphene nanostructures.
  • 1 is a TEM and AFM image of graphene quantum dots according to an embodiment of the present application.
  • FIG. 2 is a graph illustrating a PL analysis result of graphene quantum dots according to an exemplary embodiment of the present application.
  • Figure 3 is a graph showing the results of the FT-IR analysis of the graphene quantum dot according to an embodiment of the present application.
  • FIG. 4 is a graph illustrating a zeta potential measurement result of graphene quantum dots according to an exemplary embodiment of the present application.
  • Figure 5 shows the effect of inhibiting fibrillation of the graphene nanostructures according to the embodiment of the present application.
  • 6a and 6b are (a) images and (b) graphs showing the results of analyzing the neuron survival rate by the graphene nanostructures according to the Examples of the present application.
  • 7a and 7b are (a) image and (b) graph showing the results of 8-OHG staining analysis showing the active oxygen species generation inhibitory activity of the graphene nanostructures according to the embodiment of the present application.
  • 8A and 8B are (a) experimental schematic diagram and (b) image for confirming the inhibition of a-syn transfer of the graphene nanostructures according to the example of the present application.
  • Figure 9 shows the results of TEM analysis of fibrillation inhibition by the graphene nanostructures according to the embodiment of the present application.
  • FIG 10 shows the results of AFM analysis of fibrillation inhibition by graphene quantum dots according to an embodiment of the present application.
  • 11A and 11B show the results of high resolution TEM analysis of fibrillation inhibition by graphene nanostructures according to the Examples herein.
  • Figure 12 shows the results of analyzing the state of the PFFs after injection of the graphene nanostructures according to an embodiment of the present application by BN-PAGE.
  • FIG 13 is an image showing the light emission characteristics of the graphene nanostructures and the Congo red according to an embodiment of the present application.
  • FIG. 14 is a graph showing the photothermal characteristics of the graphene nanostructures according to an embodiment of the present application.
  • 16 shows fluorescence emission results of samples prepared according to an example of the present application.
  • the term "combination of these" included in the expression of the makushi form means one or more mixtures or combinations selected from the group consisting of constituents described in the expression of the makushi form, wherein the constituents It means to include one or more selected from the group consisting of.
  • graphene quantum dots means nano-sized fragments of graphene oxides or reduced graphene oxides.
  • graphene means that a plurality of carbon atoms are covalently linked to each other to form a polycyclic aromatic molecule, wherein the carbon atoms connected by the covalent bonds are 6-membered rings as basic repeating units. It is also possible to form, but further comprise a 5-membered ring and / or a 7-membered ring.
  • graphene oxide is also called graphene oxides and may be abbreviated as "GOs".
  • the graphene may include a structure in which a functional group containing oxygen such as a carboxyl group, a hydroxy group, or an epoxy group is bonded to the graphene, but may not be limited thereto.
  • reduced graphene oxide refers to graphene oxide with reduced oxygen ratio through a reduction process, also called reduced graphene oxides, and may be abbreviated as “rGOs”. However, this may not be limited.
  • the first aspect of the present application provides a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of degenerative neurological diseases comprising graphene nanostructure (graphene nanostructure) as an active ingredient.
  • the pharmaceutical composition may further include a pharmaceutically acceptable carrier or excipient, but may not be limited thereto.
  • the pharmaceutically acceptable carrier or excipient may be used without limitation as long as it is usable in the pharmaceutical composition, and may include, for example, selected from the group consisting of petrolatum, lanolin, polyethylene glycol, alcohol, and combinations thereof. However, this may not be limited.
  • the degenerative neurological disease is a disease related to misfolding of proteins, for example, Alzheimer's disease, Parkinson's disease, Huntington's disease, HIV dementia, stroke, systemic amyloidosis, primary systemic amyloidosis, secondary systemic amyloidosis , Type 2 diabetes, amyotrophic amyloidosis, hemodialysis-related amyloidosis, infectious spongiform encephalopathy, and multiple sclerosis, but may not be limited thereto.
  • Alzheimer's disease Parkinson's disease, Huntington's disease, HIV dementia, stroke, systemic amyloidosis, primary systemic amyloidosis, secondary systemic amyloidosis , Type 2 diabetes, amyotrophic amyloidosis, hemodialysis-related amyloidosis, infectious spongiform encephalopathy, and multiple sclerosis, but may not be limited thereto.
  • the graphene nanostructures may include graphite, graphene or graphene quantum dots, but may not be limited thereto.
  • the graphene quantum dots are, for example, about 1 nm to about 20 nm, about 5 nm to about 20 nm, about 10 nm to about 20 nm, about 15 nm to about 20 nm, about 1 nm to about 15 nm, It may be in the range of about 1 nm to about 10 nm, or about 1 nm to about 5 nm, but may not be limited thereto.
  • the graphene nanostructures are about 1 nm to about 100 nm, for example, about 10 nm to about 100 nm, about 30 nm to about 100 nm, about 50 nm to about 100 nm, About 70 nm to about 100 nm, about 90 nm to about 100 nm, about 1 nm to about 90 nm, about 1 nm to about 70 nm, about 1 nm to about 50 nm, about 1 nm to about 30 nm, or about It may include, but is not limited to, graphene nanostructures of various sizes ranging from 1 nm to about 10 nm.
  • the graphene nanostructures may inhibit fibril formation by misfolding of proteins, and also may inhibit transmission of misfolded proteins, but is not limited thereto. Can be.
  • the graphene nanostructures do not accumulate in the body and do not show toxicity to the body.
  • the graphene nanostructures may be to inhibit the generation of reactive oxygen species in neurons through a mechanism to prevent mitochondrial dysfunction by the fibril state protein, but may not be limited thereto.
  • a substance that targets a nerve protein to a functional group at the end of the graphene nanostructures for example, thioflavin (anti-amyloid substance Congo red or amyloid detecting dye (detecting dye) ( thioflavin) T or S may be combined, but may not be limited thereto.
  • the graphene nanostructures may be to exhibit a photothermal effect by far-infrared laser irradiation, but may not be limited thereto.
  • the pharmaceutical composition of the present invention there is an advantage that can be traced to the nerve protein by connecting a substance targeting the nerve protein to the functional groups bound to the end of the graphene nanostructures. In this way, by inducing the graphene nanostructures near the nerve protein and irradiating the infrared laser with low damage to the cells, the fibrillation and aggregation can be suppressed through the photothermal effect of the graphene nanostructures.
  • GQDs were prepared with reference to a paper published in 2012 in Nano Letters [ Nano lett , 12, 844-849 (2012)]. Carbon fiber was added to a solution mixed with sulfuric acid and nitric acid at a ratio of 3: 1, and then heated at 80 ° C. for 24 hours (thermo-oxidation process). After the reaction was completed, purified through a dialysis process, vacuum filtration, etc. to obtain the final powder form of GQDs with Rotovap. The GQDs thus made were obtained in the form of particles having structurally very different sizes (about 5 nm to about 20 nm) (FIG. 1).
  • PFFs pre-formed fibrils
  • fibril is formed about a week after PFFs are injected into neurons, which eventually leads to necrosis of neurons. Fibrillation results in phosphorylation of alpha synuclein, which can be identified as a stained image as shown in FIG. 5.
  • dense pa-syn phosphorylated alpha-synuclein
  • FIG. 6A the left side is a tunnel assay in which damaged cells are indicated by red staining, the middle part is DAPI staining in which DNA in the cell nucleus is indicated by blue staining, and the right side is their quantification.
  • the graphene nanostructures used to inhibit mitochondrial dysfunction by fibril-like proteins in experiments to inhibit the generation of reactive oxygen species in neurons were 8-OHG (DNA oxidation of The major product was stained with 8-oxo-2'-deoxyguanosine) and analyzed (FIG. 7A). As shown in FIG. 7a, it was confirmed that the amount of 8-OHG produced by the influence of reactive oxygen species dropped significantly by adding the graphene nanostructures. Experiments on mitochondrial dysfunction were confirmed through basal respiratory rate, maximum respiratory rate and mitochondrial Complex I activity analysis of cells (FIG. 7B). As shown in the graph of FIG.
  • FIG. 8A is a schematic diagram of a simple experiment, and FIG. 8B shows the results of this experiment.
  • C1 chamber 1
  • C2 chamber 2
  • GQDs were injected into the neurons in the second chamber. Confirmed.
  • FIG. 11A illustrates data obtained by sampling only PFFs on a TEM grid. As can be seen in the image, a very thick and long fibrillated bundle was formed. On the other hand, in the sample in which the GQDs were put together, an image in which the GQDs and the alpha synuclein oligomers were tangled as shown in the AFM image was obtained (FIG. 11B).
  • TEM transmission electron microscopy
  • FIGS. 9 to 11 showed a significant difference between when GQDs were injected into and not injected into PFFs, these images were obtained in a dried state, and thus the correct state of PFFs after injection of GQDs was obtained. There was a limit to the show.
  • BN-PAGE blue native polyacrylamide gel electrophoresis
  • Fig. 12 BN-PAGE (blue native polyacrylamide gel electrophoresis) was confirmed as a result of the analysis (Fig. 12).
  • No. 1 is a case in which only GQDs are added as a negative control
  • No. 2 and 4 are cases in which only PFFs are added
  • No. 3 and No. 5 are samples in which GQDs are put together in PFFs.

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Abstract

본원은 그래핀 나노구조체(graphene nanostructure)를 유효성분으로서 포함하는 퇴행성 신경 질환의 예방 또는 치료를 위한 약학적 조성물에 관한 것이다.

Description

퇴행성 신경 질환의 예방 또는 치료를 위한 그래핀 나노구조체 기반 약학적 조성물
본원은 그래핀 나노구조체(graphene nanostructure)를 유효성분으로서 포함하는 퇴행성 신경 질환의 예방 또는 치료를 위한 약학적 조성물에 관한 것이다.
단백질의 미스폴딩(misfolding)은 정상 단백질의 기능의 소실을 야기할 뿐만 아니라, 비정상적 단백질이 세포 내에서 축적됨으로써 독성을 일으키며, 이에 의해 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅턴병, 루게릭병, 암, 낭포성 섬유증, 제 2형 당뇨병과 같은 여러 질병이 초래되는 것으로 알려져 있다. 즉, 단백질항상성(proteostasis)이 제대로 작용하지 않음으로 인해 단백질의 미스폴딩과 세포내의 비정상적 축적을 야기하게 되는 것이다.
퇴행성 신경 질환의 발병은 그 원인이 아직까지도 100 퍼센트 밝혀지지는 않았지만 신경 단백질의 응집이 주요 요인라는 사실은 이미 잘 알려져 있다. 피브릴 구조로 만들어진 단백질들은 주변 뉴런들로 점점 전이(transmission)되어 결국 뇌의 특정 부분의 뉴런들을 모두 괴사시킴에 따라 그 부분이 담당하는 기능을 수행하지 못하게 한다. 파킨슨병의 경우 도파민이라는 신경전달물질을 생성하는 뉴런들이 점차 괴사해 나가며 병이 진행이 된다. 현재 파킨슨병 환자들에게 처방되고 있는 가장 흔한 약물은 Sinemet이라는 약품이며, 이를 비롯한 다른 파킨슨병 치료제들은 질병을 근본적으로 치료하거나 지연시키는 기능을 하기보다는, 신경 세포 내에서 도파민으로 변하는 레보도파(Levodopa, L-DOPA)를 투입함에 의해 증상의 일시적인 완화만을 이루게 된다. 결국 병이 계속 진행됨에 따라 약물의 효과가 감소하여 사망에 이르게 된다.
단백질의 미스폴딩에 관련한 연구로 진행되었던 항-아밀로이드 화합물(anti-amyloid compound)의 종류 중 하나인 콩고 레드(Congo Red)등은 단백질 미스폴딩에 의한 피브릴 형성을 막는 효과가 있기는 하지만, 신체 독성이 크고, 미스폴딩된 단백질의 전이를 억제하여 질환의 진행을 지연시키는 효과까지는 없다는 단점이 있다. 또한, 종래의 약물은 사이즈가 균일한 한 가지 형태로 특정되기 때문에 열역학적 측면(entropy) 에서 보면 병의 치료에 대한 별다른 이점을 나타내지 못한다.
이에, 단백질의 미스폴딩을 치료하기 위한 많은 연구가 이루어지고 있으나(대한민국 공개 특허 제10-2009-0019790호), 신체에 독성이 없으면서 우수한 억제 능력을 나타내는 치료제에 대해서는 아직까지 큰 성과가 없었다.
본원은, 그래핀 나노구조체를 유효성분으로서 포함하는 퇴행성 신경 질환의 예방 또는 치료를 위한 약학적 조성물을 제공하고자 한다.
그러나, 본원이 해결하고자 하는 과제는 이상에서 기술한 과제로 제한되지 않으며, 기술되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본원의 일 측면은, 그래핀 나노구조체를 유효성분으로서 포함하는 퇴행성 신경 질환의 예방 또는 치료를 위한 약학적 조성물을 제공한다.
본원의 구현예에 따른 그래핀 나노구조체를 유효성분으로서 포함하는 퇴행성 신경 질환의 예방 또는 치료를 위한 약학적 조성물은, 그래핀 나노구조체를 퇴행성 신경 질환의 예방 및 치료에 사용하는 최초의 시도이다. 그래핀 나노구조체는 신체 독성이 없고, 신체에 축적이 되지도 않으며, 단백질 미스폴딩에 의한 피브릴 형성을 80%까지 억제하는 등의 탁월한 효능을 나타내고, 미스폴딩된 단백질의 전이를 억제하여 병의 진행을 지연시키는 데에도 효과적이다. 또한, 종래의 치료제와는 달리, 그래핀 나노구조체는 한 가지 형태로 특정되지 않으며, 각각의 그래핀 나노구조체마다 분자량, 분자식, 형태 등이 모두 상이하므로, 열역학적 측면에서 볼 때 결정의 형성 자체를 방해하므로, 질환의 근본적인 치료가 가능하다. 뿐만 아니라 그래핀 나노구조체는 UV-vis 영역에서 형광을 나타내며 적절하게 이러한 형광의 세기를 조절했을 때 체내에서 약물로서 작용할 그래핀 나노구조체가 어떻게 움직이는지 추적(tracking)할 수 있다는 장점이 있다. 또는, 그래핀 나노구조체의 말단에 결합된 작용기들에 신경 단백질을 타겟팅하는 물질을 연결시켜 신경 단백질을 추적할 수 있다는 장점이 있다. 이러한 방식으로 그래핀 나노구조체를 신경 단백질 근처로 유도한 후 세포에 데미지가 적은 원적외선 레이저를 조사하면 그래핀 나노구조체의 광열 효과를 통해 피브릴화 및 뭉침현상을 억제할 수 있다.
도 1은, 본원의 일 실시예에 따른 그래핀 양자점의 TEM 및 AFM 이미지이다.
도 2는, 본원의 일 실시예에 따른 그래핀 양자점의 PL 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 3은, 본원의 일 실시예에 따른 그래핀 양자점의 FT-IR 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4는, 본원의 일 실시예에 따른 그래핀 양자점의 제타 포텐셜 측정 결과를 나타낸 그래프이다.
도 5는, 본원의 실시예에 따른 그래핀 나노구조체의 피브릴화 억제 효과를 나타낸 것이다.
도 6a 및 6b는, 본원의 실시예에 따른 그래핀 나노구조체에 의한 뉴런 생존률을 분석한 결과를 나타낸 (a) 이미지 및 (b) 그래프이다.
도 7a 및 7b는, 본원의 실시예에 따른 그래핀 나노구조체의 활성산소종 생성 억제 활성을 나타내는 8-OHG 염색 분석 결과를 나타낸 (a) 이미지 및 (b) 그래프이다.
도 8a 및 8b는, 본원의 실시예에 따른 그래핀 나노구조체의 a-syn 전이 억제를 확인하기 위한 (a) 실험 모식도 및 (b) 그 결과를 나타낸 이미지이다.
도 9는, 본원의 실시예에 따른 그래핀 나노구조체에 의한 피브릴화 억제의 TEM 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 10은, 본원의 일 실시예에 따른 그래핀 양자점에 의한 피브릴화 억제의 AFM 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 11a 및 11b는, 본원의 실시예에 따른 그래핀 나노구조체에 의한 피브릴화 억제의 고해상 TEM 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 12는, 본원의 실시예에 따른 그래핀 나노구조체의 주입 후의 PFFs 상태를 BN-PAGE로 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 13은, 본원의 일 실시예에 따른 그래핀 나노구조체와 콩고 레드의 발광 특성을 나타내는 이미지이다.
도 14는, 본원의 일 실시예에 따른 그래핀 나노구조체의 광열 특성을 나타내는 그래프이다.
도 15는, 본원의 일 실시예에 따라 제조된 샘플들의 FT-IR 스펙트럼을 나타낸다.
도 16은, 본원의 일 실시예에 따라 제조된 샘플들의 형광 발광 측정 결과를 나타낸다.
이하, 첨부한 도면을 참조하여 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본원의 구현예 및 실시예를 상세히 설명한다.
그러나 본원은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 구현예 및 실시예에 한정되지 않는다. 그리고 도면에서 본 발명을 명확하게 설명하기 위해서 설명과 관계없는 부분은 생략하였으며, 명세서 전체를 통하여 유사한 부분에 대해서는 유사한 도면 부호를 붙였다.
본원 명세서 전체에서, 어떤 부재가 다른 부재 "상에" 위치하고 있다고 할 때, 이는 어떤 부재가 다른 부재에 접해 있는 경우뿐 아니라 두 부재 사이에 또 다른 부재가 존재하는 경우도 포함한다.
본원 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함" 한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다. 본원 명세서 전체에서 사용되는 정도의 용어 "약", "실질적으로" 등은 언급된 의미에 고유한 제조 및 물질 허용오차가 제시될 때 그 수치에서 또는 그 수치에 근접한 의미로 사용되고, 본원의 이해를 돕기 위해 정확하거나 절대적인 수치가 언급된 개시 내용을 비양심적인 침해자가 부당하게 이용하는 것을 방지하기 위해 사용된다. 본원 명세서 전체에서 사용되는 정도의 용어 "~(하는) 단계" 또는 "~의 단계"는 "~ 를 위한 단계"를 의미하지 않는다.
본원 명세서 전체에서, 마쿠시 형식의 표현에 포함된 "이들의 조합"의 용어는 마쿠시 형식의 표현에 기재된 구성 요소들로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 혼합 또는 조합을 의미하는 것으로서, 상기 구성 요소들로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 포함하는 것을 의미한다.
본원 명세서 전체에서, "그래핀 양자점(graphene quantum dots, GQDs)"은 산화 그래핀(graphene oxides)이나 환원 산화 그래핀(reduced graphene oxides)의 나노-크기 단편을 의미한다.
본원 명세서 전체에서, "그래핀"이라는 용어는 복수개의 탄소 원자들이 서로 공유 결합으로 연결되어 폴리시클릭 방향족 분자를 형성한 것을 의미하는 것으로서, 상기 공유 결합으로 연결된 탄소 원자들은 기본 반복 단위로서 6 원환을 형성하나, 5 원환 및/또는 7 원환을 더 포함하는 것도 가능하다.　
본원 명세서 전체에서, "산화 그래핀"이라는 용어는 그래핀 옥사이드 (graphene oxides)라고도 불리우고, "GOs"로 약칭될 수 있다.　 그래핀 상에 카르복실기, 히드록시기, 또는 에폭시기 등의 산소를 함유하는 작용기가 결합된 구조를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.　
본원 명세서 전체에서, "환원 산화 그래핀"이라는 용어는 환원 과정을 거쳐 산소 비율이 줄어든 산화 그래핀을 의미하는 것으로서, 환원된 그래핀 옥사이드 (reduced graphene oxides)라고도 불리우고, "rGOs"로 약칭될 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
이하, 본원의 구현예들을 상세히 설명하였으나, 본원은 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 제 1 측면은, 그래핀 나노구조체(graphene nanostructure)를 유효성분으로서 포함하는 퇴행성 신경 질환의 예방 또는 치료를 위한 약학적 조성물을 제공한다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 약학적 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 추가 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 상기 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제는 약학적 조성물에서 사용가능한 것이라면 제한 없이 사용할 수 있으며, 예를 들어, 바셀린, 라놀린, 폴리에틸렌 글리콜, 알코올 및 이들의 조합들로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 퇴행성 신경질환은 단백질의 미스폴딩에 관련된 질환으로서, 예를 들어, 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅턴병, HIV 치매, 뇌졸중, 노인 전신성 아밀로이드증, 일차 전신성 아밀로이드증, 이차 전신성 아밀로이드증, 제 2 형 당뇨병, 근위축성 아밀로이드증, 혈액투석-관련 아밀로이드증, 전염성 해면상 뇌병증 및 다발성경화증으로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 그래핀 나노구조체는 그래파이트, 그래핀 또는 그래핀 양자점을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
상기 그래핀 양자점은, 예를 들어, 약 1 nm 내지 약 20 nm, 약 5 nm 내지 약 20 nm, 약 10 nm 내지 약 20 nm, 약 15 nm 내지 약 20 nm, 약 1 nm 내지 약 15 nm, 약 1 nm 내지 약 10 nm, 또는 약 1 nm 내지 약 5 nm 범위의 크기일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 그래핀 나노구조체는 약 1 nm 내지 약 100 nm, 예를 들어, 약 10 nm 내지 약 100 nm, 약 30 nm 내지 약 100 nm, 약 50 nm 내지 약 100 nm, 약 70 nm 내지 약 100 nm, 약 90 nm 내지 약 100 nm, 약 1 nm 내지 약 90 nm, 약 1 nm 내지 약 70 nm, 약 1 nm 내지 약 50 nm, 약 1 nm 내지 약 30 nm, 또는 약 1 nm 내지 약 10 nm 범위의 다양한 크기의 그래핀 나노구조체를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 그래핀 나노구조체는 단백질의 미스폴딩(misfolding)에 의한 피브릴 형성을 억제하고, 또한 미스폴딩된 단백질의 전이(transmission)를 억제할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 그래핀 나노구조체는 체내에 축적되지 않으며, 신체에 독성을 나타내지 않는다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 그래핀 나노구조체는 피브릴 상태의 단백질에 의한 미토콘드리아 기능장애를 막는 기작을 통해 뉴론 내의 활성산소종 생성을 억제하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 그래핀 나노구조체의 말단에 있는 작용기에 신경 단백질을 타겟팅하는 물질, 예를 들어, 항-아밀로이드 물질인 콩고 레드나 아밀로이드 탐지 염료(detecting dye)인 티오플라빈(thioflavin) T 또는 S 등이 결합된 것을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원에 따른 상기 작용기는, 산소원자를 함유하는 작용기로서 -OH, -COOH, -C=O 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 그래핀 나노구조체는 원적외선 레이저 조사에 의하여 광열 효과를 나타내는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 본원의 약학적 조성물은, 그래핀 나노구조체의 말단에 결합된 작용기들에 신경 단백질을 타겟팅하는 물질을 연결시켜 신경 단백질을 추적할 수 있다는 장점이 있다. 이러한 방식으로 그래핀 나노구조체를 신경 단백질 근처로 유도한 후 세포에 데미지가 적은 원적외선 레이저를 조사하면 그래핀 나노구조체의 광열 효과를 통해 피브릴화 및 뭉침현상을 억제할 수 있다.
이하, 본원의 실시예를 통하여 보다 구체적으로 설명하며, 본 실시예에 의하여 본원의 범위가 제한되는 것은 아니다.
[실시예]
제조예 1
GQDs는 2012년 Nano Letters 에 발표된 논문[Nano lett, 12, 844-849 (2012)]을 참고하여 제조하였다. 카본파이버를 황산과 질산을 3 : 1 비율로 섞은 용액에 넣은 후 80℃에서 24 시간 동안 가열하였다(thermo-oxidation process). 반응이 완료된 후, 투석 과정, 진공 여과 등을 통해 정제하여 Rotovap으로 최종적인 파우더 형태의 GQDs를 수득하였다. 이렇게 만들어진 GQDs는 구조적으로 매우 다양한 사이즈(약 5 nm 내지 약 20 nm)를 가진 입자의 형태로 수득되었다(도 1). 제조된 GQDs의 다른 특징들로는 UV 램프에서 형광을 띄게 되고(방출: 490 nm, 및 550 nm)(JASCO FP-8300 Fluorescence Spectrometer)(도 2), 808 nm NIR 레이저를 조사하면 광열(photothermal) 효과를 나타내었다. FT-IR 분석 스펙트럼(Thermo Scientific Nicolet iS 10 FT-IR Spectrometer)를 보게 되면 GQDs 말단의 카르복실기(-COOH)가 1724 cm-1에서, 방향족 C=C 피크가 1614 cm-1에서 관측되었다(도 3). 마지막으로 제타 포텐셜(Malvern Zetasizer Nano ZS)을 통해 분석한 표면의 전하는 약 -20 mV를 보이는 것으로 나타났다(도 4).
제조예 2
상기 제조된 그래핀 나노구조체(GQDs)의 말단에 있는 작용기에 신경 단백질을 타겟팅하는 물질인 콩고 레드를 결합시킨 물질을 하기 반응식과 같이 반응시켜 제조하였다. 상기 콩고 레드의 양을 상이하게 함으로써(100 ㎍/㎖, 250 ㎍/㎖ 및 500 ㎍/㎖) 샘플 1, 2, 및 3을 각각 제조하였다:
Figure PCTKR2015003385-appb-I000001
실험예 1
그래핀 양자점의 피브릴화 억제 효과를 PFFs(pre-formed fibrils)이라는 알파 시뉴클레인(alpha-synuclein) 실험 모델을 사용하여 결정하였다. 구체적으로, PFFs를 뉴런에 주입한 후 일주일 정도 경과하게 되면 피브릴이 형성이 되고 이는 결국 뉴런의 괴사를 유발하게 되었다. 피브릴화는 알파 시뉴클레인의 인산화를 야기하며, 이는 도 5에 나타난 바와 같이 염색된 이미지로서 확인할 수 있다. PFFs(1 ㎍/mL)만을 뉴런에 주입하였을 때는 빽빽하던 p-a-syn(phosphorylated alpha-synuclein)들이 GQDs(1 ㎍/mL)을 주입하자 거의 아무것도 넣지 않은 수준으로 없어지는 것이 확인되었다(도 5). 도 5에서 볼 수 있는 바와 같이, p-a-syn를 약 80%까지 감소시켰으며, 이는 사실상 거의 완전히 피브릴화를 억제하는 수준인 것으로 해석될 수 있다. 또한, 뉴런의 생존율도 약 20% 정도 증가하였다(도 6b). GQDs만을 주입하였을 때 뉴런 생존률(TUNEL 검정으로 분석)은 오히려 PBS 배지만을 주입하였을 때보다 좋은 것으로 나타나 GQDs가 뉴런에 대해 독성을 나타내지 않음이 확인되었다(도 6a 및 6b). 도 6a에서 왼쪽은 손상된 세포가 빨간색 염색으로 표시되는 터널 검정이고, 중간 부분은 세포핵 내의 DNA가 파란색 염색으로 표시되는 DAPI 염색이며, 오른쪽은 이들의 정량(quantification)이다.
또한, 사용된 그래핀 나노구조체가 피브릴 상태의 단백질에 의한 미토콘드리아 기능장애를 막는 기작을 통해 뉴런 내의 활성산소종 생성을 억제하는 것에 대한 실험으로, 일차 배양된 뉴런을 8-OHG(DNA 산화의 주요 산물인 8-oxo-2'-deoxyguanosine)로 염색하여 분석하였다(도 7a). 도 7a에서 보이는 것처럼 활성산소종의 영향으로 생성되는 8-OHG의 양이 그래핀 나노구조체를 넣어줌으로써 현저하게 떨어진 것이 확인되었다. 미토콘드리아 기능장애에 대한 실험은 세포의 기초 호흡 속도(basal respiratory rate), 최대 호흡 속도(maximal respiratory rate) 및 미토콘드리아의 Complex I 활성 분석을 통해 확인되었다(도 7b). 도 7b의 그래프에서 나타나는 것처럼 PFFs만 뉴런에 주입하였을 때는 미토콘드리아의 호흡 속도가 현저하게 저하되고 Complex I 활성 또한 감소하였지만, GQDs와 PFFs를 함께 뉴런에 주입하였을 때는 정상수준으로 회복되는 것이 확인되었다. 이 실험예에서의 미토콘드리아 기능장애에 대한 분석결과는 도 6b의 뉴런 생존율과 부합되는 중요한 결과라고 생각된다.
실험예 2
단순히 피브릴화를 억제하고 뉴런의 생존률을 높이는 것도 중요하지만 퇴행성 신경 질환의 치료 및 질병의 진행속도를 늦추기 위해서는 주변의 뉴런들로 전이 (transmission)되는 것을 막아주는 것이 매우 중요하다. 그 사실을 확인하기 위하여 미세유동 디바이스(microfluidic device)를 셋팅하고 GQDs를 어떠한 챔버안에 넣어주었을 때 전이가 되는 과정을 막을 수 있는지 확인하였다. 도 8a는 간단한 실험의 모식도이며, 도 8b는 이 실험의 결과를 나타낸 것이다. C1(chamber 1)의 경우 첫 번째 챔버에 있는 뉴런에 GQDs를 주입하였고 C2(chamber 2)의 경우 두 번째 챔버에 있는 뉴런에 GQDs를 주입한 후 알파시뉴클레인의 피브릴화가 주변 뉴런으로 퍼지는 것을 확인하였다. GQDs 없이 PFFs만 있는 양성 대조군의 경우 피브릴화가 진행된 알파시뉴클레인이 챔버 1 번부터 3 번까지 전이가 된 것이 관찰되었다. 두 번째 1 번 뉴런에 GQDs를 넣어준 디바이스의 경우 애초에 피브릴화가 잘 진행되지 않았고 그에 따라 두 번째 및 세 번째 뉴런에서도 알파 시뉴클레인의 피브릴화가 거의 관측되지 않았다. 마지막 가운데 뉴런에 GQDs를 넣어준 디바이스에서는 제일 처음 챔버에서 어느 정도 피브릴화가 진행되었지만 GQDs가 들어있는 두 번째 뉴런부터는 그 양이 확연하게 줄어들었고 이어지는 마지막 뉴런에서는 거의 피브릴화가 진행되지 않음이 관찰되었다. 이 디바이스에서 양성 대조인 PFFs만 넣어준 디바이스보다 초기 피브릴화 정도가 다른 것은 디바이스의 내재된 에러로서, GQDs가 디바이스 상에서 각 뉴런마다 완벽하게 분리될 수 없었기 때문으로 생각된다.
실험예 3.
세포 내 실험과 동일한 방식으로 샘플링을 진행하여(1 ㎍/ml GQDs와 1 ㎍/ml PFFs를 37℃에서 인큐베이션한 후 실리카 기재 상에 샘플링) GQDs에 의한 피브릴화 억제를 OM(optical microscope)을 통해 분석한 결과, PFFs만 인큐베이션했을 때에는 피브릴들의 뭉침으로 예상되는 큰 덩어리가 관찰된 반면(도 9의 (a) 및 (b)), GQDs를 함께 인큐베이션했을 때에는 GQDs와 알파 시뉴클레인 올리고머들이 엉켜있는 듯한 이미지가 관찰되었다(도 9의 (c) 및 (d)). 본 결과의 총 알파시뉴클레인 및 GQDs의 양이 과했고, 이들의 구조를 명확히 밝혀줄만큼 이미지가 분명하진 않았지만 두 샘플의 결과가 명확히 다른 것은 확인할 수 있었다.
OM 분석 때 준비했던 샘플링과 동일한 방식으로 샘플링을 준비하여 GQDs에 의한 피브릴화 억제를 AFM(atomic force microscope)을 통해 분석한 결과, PFF만 인큐베이션했을 때에는 피브릴과 PFFs가 뭉친 루이 소체(lewy body)의 형성이 관찰된 반면(도 10의 (b)), GQDs를 함께 인큐베이션했을 때에는 GQDs와 알파 시뉴클레인 올리고머들이 엉켜있는 듯한 이미지가 관찰되었다(도 10의 (d)).
상기 OM 및 AFM 분석과 같은 방법으로 TEM(transmission electron microscopy) 그리드 위에 샘플링하여 고해상 투과전자현미경(high resolution-transmission electron microscope)을 통해 분석하였다. 도 11a는 PFFs만을 TEM grid 위에 샘플링한 후 분석한 데이터이다. 이미지에서 볼 수 있는 것처럼, 매우 두껍고 긴 피브릴 번들이 형성된 것이 관찰되었다. 반면에, GQDs를 함께 넣어준 샘플에서는 AFM 이미지에서 보였던 것처럼 GQDs와 알파시뉴클레인 올리고머들이 엉켜있는 듯한 이미지를 얻을 수 있었다(도 11b).
도 9 내지 11에서 보여졌던 이미지들이 PFFs에 GQDs를 주입하였을 때와 주입하지 않았을 때 현격한 차이를 보여주기는 했지만 이러한 이미지들은 건조된 상태에서 얻어진 것이기 때문에 GQDs를 주입하고 난 후 정확한 PFFs의 상태를 보여주는데에는 한계가 있었다. 더 자세한 분석을 위해 BN-PAGE(blue native polyacrylamide gel electrophoresis)를 통해 분석한 결과 놀라운 점을 확인할 수 있었다(도 12). 도 12에서, 1 번은 음성 대조로서 GQDs만을 넣어주었을 경우이고, 2 번 및 4 번 컬럼은 PFFs만을 넣은 경우이며, 3 번 및 5 번 컬럼은 PFFs에 GQDs를 함께 넣어준 샘플로서, 겔을 내린 결과 GQDs를 넣어주었을 때 알파시뉴클레인 단위체(14.46 kDa)에 해당하는 영역에 많은 양이 검출된 것을 확인할 수 있었다. 이는 PFFs에 GQDs를 넣어주게 되면 PFFs가 피브릴화되는 것을 막아줄 뿐만 아니라 오히려 단위체로 돌아간다는 것을 보여주는 아주 중요한 데이터이다.
실험예 4
상기 제조예 1에서 제조된 GQDs와 콩고 레드 용액(대조군)에 적외선 레이저를 조사하여 형광 발광 현상을 어두운 곳에서 촬영하였으며, 그 결과를 도 13에 나타내었다.
또한, NIR 레이저를 조사하였을 때 콩고 레드나 증류수(distilled water)에 비하여 높은 광열 효과를 나타내며, GQD의 농도(500 ㎍/mL, 250 ㎍/mL, 100 ㎍/mL)에 따라 농도가 증가할수록 온도가 증가하는 것을 도 14에 나타내었다.
실험예 5
다양한 시료들(상기 제조예 1 및 2에서 제조된 GQDs, 샘플 1, 샘플 2, 샘플 3, 및 비교예로서 콩고 레드 용액)을 이용하여 FT-IR 분석, 형광 발광 측정 실험을 수행하였다.
FT-IR 분석 스펙트럼을 나타낸 도 15를 보면, 콩고 레드(congo red, CR)의 -NH2 피크인 3419 cm-1 에서는 콩고 레드 농도의 증가에 따라 피크가 감소되었으며, GQDs 말단의 카르복실기(-COOH)의 1710 cm-1 피크에서도 콩고 레드 농도의 증가에 따라 피크가 감소되었고, 펩티드 결합(-CONH) 피크인 1660 cm-1 는 GQDs와 콩고 레드 결합에 의해 점차 생성되었고, 방향족 C=C 피크인 1614 cm-1 피크는 예상대로 모든 샘플들에서 유지되었다.
한편, 상기 시료들의 파장에 따른 형광 발광 특성을 측정하여 도 16에 나타내었다. 여기서, 콩고 레드는 대조군으로서 사용되었으며, 샘플 1의 형광 발광 피크가 가장 높게 나타났다.
전술한 본원의 설명은 예시를 위한 것이며, 본원이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본원의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 예를 들어, 단일형으로 설명되어 있는 각 구성요소는 분산되어 실시될 수도 있으며, 마찬가지로 분산된 것으로 설명되어 있는 구성요소들도 결합된 형태로 실시될 수 있다.
본원의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미 및 범위, 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본원의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (10)

  1. 그래핀 나노구조체(graphene nanostructure)를 유효성분으로서 포함하는, 퇴행성 신경 질환의 예방 또는 치료를 위한 약학적 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서,
    약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 추가 포함하는, 퇴행성 신경 질환의 예방 또는 치료를 위한 약학적 조성물.
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 퇴행성 신경 질환은 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅턴병, HIV 치매, 뇌졸중, 노인 전신성 아밀로이드증, 일차 전신성 아밀로이드증, 이차 전신성 아밀로이드증, 제 2 형 당뇨병, 근위축성 아밀로이드증, 혈액투석-관련 아밀로이드증, 전염성 해면상 뇌병증, 및 다발성경화증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 퇴행성 신경 질환의 예방 또는 치료를 위한 약학적 조성물.
  4. 제 2 항에 있어서,
    상기 담체 또는 부형제는 바셀린, 라놀린, 폴리에틸렌 글리콜, 알코올 및 이들의 조합들로 이루어진 군으로부터 선택된 것인, 퇴행성 신경 질환의 예방 또는 치료를 위한 약학적 조성물.
  5. 제 1 항에 있어서,
    상기 그래핀 나노구조체는 그래파이트, 그래핀 또는 그래핀 양자점을 포함하는 것인, 퇴행성 신경 질환의 예방 또는 치료를 위한 약학적 조성물.
  6. 제 1 항에 있어서,
    상기 그래핀 나노구조체는 단백질의 미스폴딩(misfolding)에 의한 피브릴 형성을 억제하는 것인, 퇴행성 신경 질환의 예방 또는 치료를 위한 약학적 조성물.
  7. 제 1 항에 있어서,
    상기 그래핀 나노구조체는 미스폴딩된 단백질의 전이(transmission)를 억제하는 것인, 퇴행성 신경 질환의 예방 또는 치료를 위한 약학적 조성물.
  8. 제 1 항에 있어서,
    상기 그래핀 나노구조체는 체내에 축적되지 않는 것인, 퇴행성 신경 질환의 예방 또는 치료를 위한 약학적 조성물.
  9. 제 1 항에 있어서,
    상기 그래핀 나노구조체의 말단에 있는 작용기에 신경 단백질을 타겟팅하는 물질이 결합된 것을 포함하는 것인, 퇴행성 신경 질환의 예방 또는 치료를 위한 약학적 조성물.
  10. 제 1 항에 있어서,
    상기 그래핀 나노구조체는 원적외선 레이저 조사에 의하여 광열 효과를 나타내는 것인, 퇴행성 신경 질환의 예방 또는 치료를 위한 약학적 조성물.
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