WO2015167210A1 - 급성 골수성 백혈병 재발의 예후 예측 방법 - Google Patents

급성 골수성 백혈병 재발의 예후 예측 방법 Download PDF

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myeloid leukemia
leukemia
stromal cells
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오일환
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Catholic University of Korea
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    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • G—PHYSICS
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    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/575—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer

Definitions

  • the present invention relates to a method for predicting prognosis of acute myeloid leukemia recurrence.
  • Leukemia is a general term for diseases in which leukocytes proliferate into tumors. Types of leukemias are classified into myeloid leukemia and lymphocytic leukemia according to the leukocytes from which leukemia originated, and are classified into acute leukemia and chronic leukemia according to the progress rate. The clinical manifestations of leukemia vary depending on the type of disease and the nature of the cells involved. Lymphoid leukemia is caused by mutations in lymphoid blood cells, myeloid leukemia in myeloid blood cells, and chronic myeloid leukemia in mature cells.Acute myeloid leukemia (AML) is a relatively early stage of the hematopoietic process.
  • AML acute myeloid leukemia
  • Acute myeloid leukemia usually occurs in adults and the elderly, and in children, about 10 to 15% of all leukemia patients.
  • Acute lymphocytic leukemia mainly occurs in children, and is known to be the most frequent in children 2 to 10 years old.
  • Chronic myeloid leukemia is more likely to occur in elderly people over 60 years, and chronic lymphocytic leukemia is a rare leukemia in Korea.
  • Acute myeloid leukemia is known to account for about 70% of all acute leukemias.
  • Therapies for acute myeloid leukemia include chemotherapy, radiotherapy, or hematopoietic stem cell transplantation, and at first diagnosis, complete remission is usually induced by chemotherapy.
  • leukemia cells cannot be found on bone marrow and blood tests when complete remission is reached, but in theory there are still more than 100 million leukemia cells in the body. Therefore, acute myeloid leukemia has a high risk of recurrence even after complete remission, and acute myeloid leukemia is important for predicting the prognosis of relapse after remission.
  • the present invention is to provide a marker for predicting the prognosis of acute myeloid leukemia recurrence, a method for predicting the prognosis of acute myeloid leukemia recurrence using the marker and a method for providing information for predicting the prognosis of acute myeloid leukemia relapse.
  • the present invention provides a method for providing information for prognostic prediction of acute myeloid leukemia comprising analyzing the composition of stromal cells in a bone marrow sample obtained from a subject.
  • the present invention also provides a method for predicting the prognosis of acute myeloid leukemia comprising analyzing the composition of stromal cells in a bone marrow sample obtained from an individual.
  • the prognosis of recurrence of acute myeloid leukemia can be predicted by analyzing the microenvironmental changes of bone marrow in the initial diagnosis of leukemia.
  • 1C shows alteration of mesenchymal cells in BMs of patients following AMl subtypes by FAB sorting.
  • 2B shows the hierarchical clustering of various 1000 probes. (MAD> 0.04). Heatmaps represent relatively up- (red) and down- (blue) controlled portions.
  • 2C shows the most important 10 GO categories up- and down-regulated in MSCs co-cultured with leukemia CD34 + cells as compared to MSCs co-cultured with normal CD34 + cells.
  • 2D shows an enrichment plot of 105 'cell cycle'-associated gene sets.
  • FIG. 2E relates to the expression levels of cytokine-associated genes, showing the relative expression of 43 genes in the 'CHEMOKINE_RECEPTOR_BINDING' GO category (red for upregulation, blue for down regulation).
  • Figure 3a is a schematic diagram of the experiment of the expression change analysis of cross-talk molecules.
  • 3E shows the results of analysis by flow cytometry of changes in expression of CXCL-12 in normal MSCs by co-culture with normal or leukemia blasts.
  • Figure 3h shows the results of immunohistochemistry analysis of changes in the expression of jagged-1 or CXCL-12 in the BM compartment of AML patients during initial diagnosis and after remission.
  • the portion labeled 'S' indicates a positively stained portion adjacent to the BM sinusoid in reticular cells.
  • the arrow points to the positive staining portion and the dotted line portion to the enlarged area at high magnification (400X).
  • FIG. 4B shows the engraftment of BM cells into human hematopoietic cells (hCD45 +) after transplantation of normal CD34 + cells co-cultured with MSCs of each group into NSG mice treated with radiation (250 rad) (1 ⁇ 10 4 CD34 + cells / mouse) Shows one result.
  • 5A shows MSCs (CD45-31-235a-), endothelial cells (CD45-31-235a-31 +) (EC), MSC progenitors (CD45-31-235a-146 + 166-) (M-progenitors), The number of mature osteoblasts (CD146 + 31-235a-146-166 +) (OB), and CFU-Fs contained in 1 ml of fresh BM is shown.
  • FIG. 5B shows the results of analyzing the AUC values of BM stromal cell composition in order to verify its effectiveness as a biomarker for predicting acute myeloid leukemia recurrence of BM stromal cell composition (boxed if AUS value> 0.8) .
  • FIG. 5C shows the number of biomarkers derived from FIG. 5B in CR and BM of various recurrences (95% confidence intervals).
  • the bottom shows their Receiver operating characteristic (ROC) curves and AUC values (SE ).
  • 5D shows the difference in stromal cell composition according to BM in CR and recurrent AML patients.
  • the number of individual substrate compositions in the early relapse ( ⁇ 1 year) and late relapse (> 1 year) groups is shown compared to the CR group (95% CI).
  • FIG. 6 is a schematic diagram showing alterations of leukemia-induced niches and their clinical significance.
  • AML acute myeloid leukemia
  • HSCs hematopoietic stem cells
  • LSCs leukemia cells and leukemic stem cells
  • Example 1 the composition of the mesenchymal stromal cells of the leukemia bone marrow and the normal bone marrow was analyzed and compared.
  • Acute myeloid leukemia bone marrow showed significant loss of mesenchyaml progenitors (M-progenitors) compared to normal bone marrow, but increased osteoblastic cells (OBs).
  • OBs osteoblastic cells
  • acute myeloid leukemia bone marrow showed a decrease in colony forming ability and proliferative activity, and ⁇ -galactosidase activity was increased. This indicates that in leukemia bone marrow, mesenchymal differentiation has changed.
  • Example 2 In order to confirm whether the above-described changes in the bone marrow microenvironment are caused by leukemia cells, the group of co-culture of leukemia cells and mesenchymal stromal cells, and the mesenchymal stromal cells of co-culture of normal cells and mesenchymal stromal cells Intragene expression patterns were analyzed (Example 2). As a result, in the group co-cultured with leukemia cells, an increase in gene expression related to cytokines and the like and a decrease in gene expression related to cell cycle or proliferation were observed. In addition, in order to confirm that leukemia cells cause cross-talk remodeling of niches, the expression pattern of cross-talk molecules was analyzed (Example 2).
  • the present inventors have found that in acute myeloid leukemia, the leukemia cells change the niche of bone marrow, the change of niche changes the microenvironment in the bone marrow, and the change of the microenvironment is associated with the prognosis of We hypothesized that it would be relevant. It was confirmed through the following examples that the hypothesis is valid, to complete the invention.
  • the present invention provides a method of providing information for predicting the prognosis of acute myeloid leukemia recurrence comprising analyzing changes in the microenvironment in a bone marrow sample obtained from an individual.
  • the invention also provides a method for predicting prognosis of acute myeloid leukemia recurrence comprising analyzing changes in the microenvironment in a bone marrow sample obtained from an individual. Changes in the microenvironment of the bone marrow can be confirmed by analyzing the composition of stromal cells in the bone marrow.
  • stromal cells refer to connective tissue cells of bone marrow and include undifferentiated mesenchymal stromal cells primitive mesenchymal stromal cells; P-MSCs), mesenchymal stromal cells (MSCs), mucosal osteoblastic cells (OB), and the like.
  • analyzing the composition of stromal cells comprises analyzing at least one level selected from the group consisting of undifferentiated mesenchymal stromal cells, differentiated mesenchymal stromal cells and osteoblasts in a bone marrow sample obtained from an individual. can do.
  • undifferentiated mesenchymal stromal cells, differentiated mesenchymal stromal cells and osteoblasts serve as markers for prognostic prediction of acute myeloid leukemia recurrence.
  • Levels of undifferentiated mesenchymal stromal cells, differentiated mesenchymal stromal cells and osteoblasts can be analyzed by identifying the number of each cell. Analysis of the composition of stromal cells can be easily analyzed through flow cytometry performed during bone marrow examination for the diagnosis of acute myeloid leukemia.
  • the subject is an acute myeloid leukemia candidate group, which may be an individual for early diagnosis of leukemia.
  • an acute myeloid leukemia candidate group which may be an individual for early diagnosis of leukemia.
  • the method may further comprise comparing the composition of the stromal cells in a bone marrow sample obtained from a subject without leukemia.
  • a subject without leukemia refers to a subject in a normal state without leukemia and other diseases.
  • a comparison of data from individuals without leukemia with acute myeloid leukemia candidate data indicates that the candidate group had a complete remission of acute myeloid leukemia when the undifferentiated mesenchymal stromal cells and differentiated mesenchymal stromal cells were reduced.
  • complete remission refers to a case in which recurrence does not occur for a period of five or more years or five to eight years after the initial remission decision.
  • the increase in undifferentiated mesenchymal progenitor cells may be indicative of early relapse within one year of acute myeloid leukemia.
  • the increase in differentiated mesenchymal stromal cells and / or osteoblasts may be an indicator of recurrence of more than one year of acute myeloid leukemia.
  • Example 4 In a cohort study, we found that remodeling of the stroma by leukemia cells is associated with the prognosis of acute myeloid leukemia recurrence (Example 4) .In early diagnosis, a high number of undifferentiated mesenchymal stromal cells in the bone marrow It was found that high numbers of differentiated mesenchymal stromal or osteoblasts were associated with late relapse. It was also confirmed that the reduction of undifferentiated mesenchymal stromal cells and differentiated mesenchymal stromal cells is an indicator of complete remission of acute myeloid leukemia.
  • the bone marrow test performed during the initial diagnosis of leukemia can easily analyze the composition of stromal cells in the bone marrow, thereby predicting the possibility of future recurrence of acute myeloid leukemia.
  • the present invention provides a method for analyzing the composition of stromal cells in bone marrow to predict the prognosis of acute myeloid leukemia recurrence.
  • the method for analyzing the composition of myeloid stromal cells may be applied or mutatis mutandis all described in the method for providing information for predicting the prognosis of acute myeloid leukemia recurrence.
  • the present invention also utilizes a high possibility of recurrence of acute myeloid leukemia when the number of leukemia cells affects the matrix of bone marrow, resulting in a large number of undifferentiated mesenchymal stromal cells, differentiated mesenchymal stromal cells and osteoblasts.
  • the present invention also provides a method for screening a relapse inhibitor of acute myeloid leukemia comprising treating a candidate and analyzing whether the candidate inhibits the interaction of leukemia cells with bone marrow stromal cells. If the treatment with the candidate substance inhibits the interaction of the leukemia cells with the myeloid stromal cells as compared to the control without the candidate substance, the candidate substance can be used as an inhibitor of relapse of acute myeloid leukemia.
  • Undifferentiated mesenchymal stromal cells are more likely to cause early relapse of acute myeloid leukemia, and increased numbers of differentiated mesenchymal stromal cells and / or osteoblasts are more likely to relapse at maturity.
  • One or more inhibitors selected from the group consisting of inhibitors of stromal cells, differentiated mesenchymal stromal cells and osteoblasts can be used for the prevention of acute myeloid leukemia recurrence.
  • SAS Statistical Analysis System
  • CFU-F colony forming cells
  • MNCs Myeloid mononuclear cells from patients with acute myeloid leukemia frequently failed to form colonies (13.7% versus 0% for leukemia bone marrow and normal bone marrow, respectively) and aged-related ⁇ -galactosidase activity (senescence) Accelerated growth arrest within passages of subcultures associated with associated ⁇ -galactosidase activities is higher than normal bone marrow (33.3% versus 9.1% for acute myeloid leukemia and normal, respectively). Appeared (FIG. 1B).
  • FIG. 1C colony forming ability
  • FIG. 1D proliferative capacity
  • Aging-associated ⁇ -galactosidase (SA- ⁇ -gal) activity was tested according to the manual using a kit (Cell Signaling, Danver, Mass.). The image is shown at the top of FIG. 1C and the mean ⁇ SEM from the results of three replicate experiments is shown at the bottom.
  • FIG. 1E ⁇ -galactosidase activity was found to be higher in AML-MSC.
  • mesenchymal stromal cells were co-cultured with normal CD34 + cells or leukemia CD34 + cells for 5 days.
  • the gene expression of the separated-purified cells was analyzed by separating-purifying from hematopoietic cells.
  • Gene expression in mesenchymal stromal cells was analyzed by Illumina BeadChip array hybridization analysis. For six expression profiles, highly variable genes (ie, median absolute deviation top 1000 genes) for hierarchical clustering with median absolute deviation (MAD) and average linkage was selected. Transcription profiles of mesenchymal stromal cells co-cultured with leukemia cells were compared to mesenchymal stromal cells co-cultured with hematopoietic progenitors (FIG. 2A).
  • Hierarchical clustering of highly variable genes clearly distinguished normal blast and leukemia blasts from mesenchymal stromal cells (FIG. 2B), showing substantial differences in transcriptomes.
  • Gene Set Enrichment Analysis which analyzes the enrichment of functionally related gene sets from Gene Ontology (GO; MSigDB c5 categories) to identify the functions of candidate molecules associated with changes in these transcripts. ) was performed. Significant normal P values were estimated from 1000 permutations of genes for each GO category. Multiple test adjustments were performed to select the meaningful (FDR ⁇ 0.1) GO category. Overall, 11 and 80 GO categories showed significant (FDR ⁇ 0.1) enrichment of up- and down-regulated genes in mesenchymal stromal cells co-cultured with leukemia CD34 + compared to normal CD34 + group ( 2c).
  • leukemia cells induce markedly different transcriptomic reprogramming from normal hematopoietic cells, accompanied by marked inhibition of cell-cycle associated genes and up-regulation of cytokine-associated genes.
  • bone marrow monocytes were stained with specific antibodies against subsets of mesenchymal cells and endothelial cells and analyzed by flow cytometry.
  • Stain with goat anti-Jagged-1 antibody Sigma-Adrich, St. Louis, MD
  • mouse anti-CXCL12 / SDF-1 antibody mouse anti-CXCL12 / SDF
  • Flow cytometry of jagged-1 or CXCL-12 expression in fresh mesenchymal stromal cells was performed by intracellular staining with -1 antibody (R & D system, Minneapolis, Minn.).
  • jagged-1 was detected by intracellular staining with rabbit anti-jagged-1 antibody (Cell Signaling).
  • rabbit anti-jagged-1 antibody Cell Signaling
  • immunohistochemistry deparaffinize the bone marrow sections and use the SPlink HRP Detection Bulk Kit (Golden Bridge International, Mercalthio, WA). Immunohistochemical staining was performed.
  • the rabbit jagged-1 and CXCL-12s in bone marrow fragments were detected by the rabbit anti-jagged-1 antibody (cell staining company) or mouse anti-CXCL12 / SDF-1 antibody that detects the intracellular domain of each molecule ( R & D System Co., Ltd.). Sections were visualized by counterstain with 3,3'diaminobenzidine substrate and hematoxylin.
  • normal mesenchymal stromal cells showed a sharp increase in jagged-1 (+) cells, while acute myeloid leukemia-mesenchymal stromal cells further reduced it.
  • acute myeloid leukemia-mesenchymal stromal cells To show an apparent response of acute myeloid leukemia-mesenchymal stromal cells in the opposite direction (FIG. 3B).
  • normal hematopoietic progenitor cells co-cultured with acute myeloid leukemia-mesenchymal stromal cells are down-stream notch signals, Hes-1, compared to co-culture with normal mesenchymal stromal cells. Or significant inhibition of Hes-5 (FIG. 3C).
  • BMs of AML patients were screened for cross-talk molecules in fresh, non-cultured mesenchymal stromal cells.
  • AML BMs showed a marked decrease in the percentage of jagged-1 (+) cells among mesenchymal stromal cells compared to normal bone marrow (5.4 ⁇ 1.0 versus 0.5 ⁇ 0.2% for normal and acute myeloid leukemia, respectively) (FIG. 3F). ).
  • the CXCL-12 (+) cells in mesenchymal stromal cells increased significantly among acute myeloid leukemia bone marrow compared to normal bone marrow (42.0 ⁇ 5.2 vs.
  • FIG. 3G reproduced the changes in the cross-talks observed from the in vitro model.
  • these changes observed in the initial diagnosis such as a decrease in jagged-1 (+) or an increase in CXCL-12 (+) mesenchymal stromal cells, were analyzed after the bone marrow of the same patients reached complete remission Reversed (Fig. 3H). This means that leukemia cells cause remodeling of niche cross-talk as a unique part of leukemia progression.
  • leukemia mesenchymal stromal cells were co-cultured with normal or acute myeloid leukemia-mesenchymal stromal cells to analyze the effects of leukemia mesenchymal stromal cells on normal hematopoietic function or leukemia function.
  • Mesenchymal stromal cells were radiotreated (1500 centigray (cGy)) 24 hours prior to co-culture. And 100ng / ml human SCF, 100ng / ml human Flt3L and 20ng / ml human IL-3, IL-6, and G-CSF (ProSpec-Tany TechnoGene Ltd, Rehobot, Israel). In the presence of a cytokine mixture, the mesenchymal stromal cells were combined with normal or leukemia CD34 + cells in long-term culture-initiated cell medium (LTC-IC media; Stem Cell Technology H5100, Vancouver, Canada). Co-culture for 5 days.
  • LTC-IC media Long-term culture-initiated cell medium
  • mice Normal CD34 + cells co-cultured on each group of MSCs were transplanted into radiation treated (250 rad) NSG mice (1 ⁇ 10 4 CD34 + cells / mouse).
  • BM cells were analyzed for engraftment of human hematopoietic cells (hCD45 + ).
  • NOD / SCID- ⁇ null (NSG) mice were purchased from the Jackson Laboratory (Bar Harbor, Maine, USA) and stored in a filtered individual ventilation cage. For redistribution analysis, mice (7-10 weeks old) were treated with radiation (250 centigray) and hematopoietic cells were injected intravenously. Eight weeks after transplantation, human cell engraftment was analyzed by flow cytometry by staining.
  • leukemia cells HL-60
  • Ara-C Ara-C
  • CD45 + leukemia cells
  • Example 4 Remodeling of niche as a prognostic parameter in leukemia patients
  • the parameters for heterogeneity in the clinical course of acute myeloid leukemia can serve as potential biomarkers for the prediction of the clinical course of patients with acute myeloid leukemia and in the bone marrow of patients with acute myeloid leukemia in early diagnosis. Substrate changes suggest that this may be a parameter for heterogeneity in the clinical course of this acute myeloid leukemia.

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Abstract

본 발명은 급성 골수성 백혈병 재발의 예후 예측 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따르면 백혈병 초기 진단 시, 골수의 미세환경 변화를 분석함에 의하여, 급성 골수성 백혈병의 재발의 예후를 예측할 수 있다.

Description

급성 골수성 백혈병 재발의 예후 예측 방법
본 발명은 급성 골수성 백혈병 재발의 예후 예측 방법에 관한 것이다.
백혈병(leukemia)은 백혈구가 종양으로 증식하는 질환을 총칭한다. 백혈병의 종류는 백혈병이 기원하는 백혈구에 따라 골수성 백혈병과 림프성 백혈병으로 분류되며, 진행 속도에 따라 급성 백혈병과 만성 백혈병으로 분류된다. 백혈병의 임상양상은 질환의 유형과 침범된 세포의 성질에 따라 다양하다. 림프성 백혈병은 림프계 혈액 세포가, 골수성 백혈병은 골수계 혈액 세포가, 그리고 만성 골수성 백혈병은 성숙기에 있는 세포가 변이해서 발생하며, 급성 골수성 백혈병(acute myeloid leukemia; AML)은 비교적 초기 단계의 조혈 과정에서 분화를 시작하는 골수계 모세포의 장애에 의해 발병된다. 급성 골수성 백혈병은 주로 성인, 고령자에게서 발병하며, 소아의 경우 전체 백혈병 환자의 10 내지 15% 정도이다. 급성 림프구성 백혈병은 주로 소아에서 발생하며, 2 내지 10세의 소아에서 가장 발생 빈도가 높은 것으로 알려져 있다. 만성 골수성 백혈병은 60대 이상의 노년기에 발생 빈도가 높으며, 만성 림프구성 백혈병은 우리나라에서는 매우 드물게 나타나는 백혈병이다. 급성 골수성 백혈병은 전체 급성 백혈병의 약 70%를 차지하는 것으로 알려져 있다.
급성 골수성 백혈병의 치료법으로 화학요법, 방사선요법, 또는 조혈모세포 이식요법이 있고, 최초 진단 시 통상적으로 화학요법에 의하여 완전 관해를 유도하게 된다. 최초 진단 후의 치료요법에 의하여, 완전 관해에 도달하면 골수 및 혈액검사상에서는 백혈병 세포를 발견할 수 없지만, 이론적으로는 여전히 체내에 1억 개 이상의 백혈병 세포가 존재한다. 따라서, 급성 골수성 백혈병은 완전 관해 후에도 재발의 위험이 높으며, 급성 골수성 백혈병은 관해 후의 재발의 예후의 예측이 중요하다.
따라서, 본 발명은 급성 골수성 백혈병 재발의 예후 예측용 마커, 상기 마커를 이용하여 급성 골수성 백혈병 재발의 예후를 예측하는 방법 및 급성 골수성 백혈병 재발의 예후 예측을 위하여 정보를 제공하는 방법을 제공하고자 한다.
본 발명은 개체로부터 수득한 골수 시료 내의 기질 세포의 조성을 분석하는 것을 포함하는 급성 골수성 백혈병의 예후 예측을 위하여 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 개체로부터 수득한 골수 시료 내의 기질 세포의 조성을 분석하는 것을 포함하는 급성 골수성 백혈병의 예후를 예측하는 방법을 제공한다.
본 발명에 따르면 백혈병 초기 진단 시, 골수의 미세환경 변화를 분석함에 의하여, 급성 골수성 백혈병의 재발의 예후를 예측할 수 있다.
도 1a는 정상 공여자 및 AML 환자의 골수에서 중간엽 세포 조성의 비교 결과를 보여준다(평균± SEM(standard error of the mean), AML에 대하여 n=51, 정상 공여자에 대하여 n=11).
도 1b는 공여자 및 AML 환자의 골수에서 중간엽 세포의 콜로니 형성 활성 및 증식능을 비교한 결과를 보여준다(AML에 대하여 n=51, 정상 공여자에 대하여 n=11).
도 1c는 FAB 분류에 의한 AMl 아형에 따른 환자의 BMs에서 중간엽 세포의 변경을 보여준다.
도 1d는 인-비트로에서 60일 동안 계대 배양하는 동안, 2 계대를 지나 계속 증식하는 정상 증식을 나타내는 AML-MSCs의 수를 보여준다(정상 공여자에 대하여n=2, AML 환자에 대하여 n=5).
도 1e는 공여자 및 AML 환자의 골수에서 중간엽 세포의 노화-연관 베타-갈락토시다아제 활성을 비교한 결과를 보여준다(3회 반복 실험, 평균± SEM(standard error of the mean), AML에 대하여 n=12, 정상 공여자에 대하여 n=9).
도 1f는 정상 공여자의 골수 및 이와 동일한 연령의 AML 환자의 골수에서 최초 진단 시의 CFU-F 수를 비교한 결과를 보여준다. 괄호 안의 숫자는 평균 연령을 나타낸다 (AML에 대하여 n=51, 정상 공여자에 대하여 n=11).
도 1g는 완전 관해 후의 AML 환자 및 정상 공여자의 골수에서 CFU-F의 수를 비교한 결과를 보여준다(AML 관해군에 대하여 n=17, 정상 공여자에 대하여 n=11).
도 2a는 AML 아세포 또는 정상 조혈세포와 공동-배양한 MSCs에서의 유전자 발현 분석을 위한 실험 설계를 보여주는 모식도이다(각 군당 n=3).
도 2b는 다양한 1000 개의 프로브의 계층적 군집화를 보여준다. (MAD>0.04). 히트맵(Heatmap)은 상대적으로 상향-(붉은색) 및 하향-(푸른색)조절된 부분을 나타낸다.
도 2c는 정상 CD34+ 세포와 공동-배양한 MSCs와 비교하였을 때, 백혈병 CD34+ 세포와 공동-배양한 MSCs에서, 상향- 및 하향-조절된 가장 중요한 10 GO 범주를 보여준다.
도 2d는 105 '세포 주기'-연관 유전자 세트들의 인리치먼트 플롯(enrichment plot)을 보여준다.
도 2e는 사이토카인-연관 유전자의 발현 수준에 관한 것으로, 'CHEMOKINE_RECEPTOR_BINDING' GO 범주에 속하는 43 개의 유전자의 상대적 발현 (붉은색은 상향 조절, 푸른색은 하향 조절을 나타냄) 수준을 보여준다.
도 3a는 크로스-토크 분자들의 발현 변화 분석을 실험의 모식도이다.
도 3b는 정상 CD34+ 세포의 존재 또는 부존재 하에서, 정상 및 AML-MSCs (M2, M5a)의 jagged-1 또는 CXCL-12 단백질의 발현을 분석한 결과를 보여준다. (4회 반복 실험, 각 군당 n=4, *;p<0.05, ***;p<0.001).
도 3c는 조혈 전구세포의 정상 또는 AML-MSC와의 공동-배양이, 하향-흐름 노치 신호에 미치는 영향을 보여준다. 무-기질 (SF) 조건에서의 레벨과 비교한 전사체의 평균 폴드(mean folds)±SEM를 나타낸다 (3회 반복 실험, 각 군당 n=3).
도 3d는 백혈병 아세포의 존재 또는 부존재 하에서, 배양된 정상 또는 AML-MSCs (M2, M5a)에서의 jagged-1의 발현 퍼센트를 보여준다. (평균±SEM, 3회 반복 실험, 각 군당 n=3).
도 3e는 정상 또는 백혈병 아세포와 공동-배양에 의한, 정상 MSCs에서의 CXCL-12의 발현 변화를 유세포 분석기로 분석한 결과를 보여준다. MSCs의 각 군에서 CXCL-12(+) 세포의 평균 %를 SEM과 함께 보여준다 (3회 반복 실험, 각 군당 n=3).
도 3f및 도 3g는 인-비보에서, 정상 공여자 및 AML 환자의 신선한 BMs의 MSCs에서 jagged-1(도 3f) 및 CXCL-12(도 3g)의 발현 정도를 보여준다(MSCs (CD45-31-235a-) 중에서 jagged-1(+) 또는 CXCL-12 (+) 세포의 평균 %, 정상 공여자군에 대하여 n= 8, AML에 대하여 n=46).
도 3h는 초기 진단 시 및 관해 후의 AML 환자의 BM 구획의 jagged-1 또는 CXCL-12의 발현 변화를 면역조직화학으로 분석한 결과를 보여준다. 'S'로 표시한 부분은 망상 세포(reticular cells)에서 BM 시누소이드(sinusoid)에 인접한 양성 염색된 부분을 가리킨다. 또한 화살표는 양성 염색 부분을 가리키고 점선 부분은 고 배율로 확대한 영역을 가리킨다 (400X).
도 4a는 제대혈의 정상 CD34+ 세포를 무-기질 조건 (SF)에서 5일간 배양하거나, 또는 두 개의 정상 공여자(#1, #2) 유래 MSCs 또는 4 명의 AML 환자 유래 백혈병 MSCs 상에서 5일간 공동-배양한 경우, CD34+ 세포의 총 확장량을 보여준다(3회 반복 실험, 평균 SEM, 각 군당 n= 7, *p<0.05).
도 4b는 각 군의 MSCs와 공동 배양한 정상 CD34+ 세포를 방사선 처리 (250rad)한 NSG 마우스에 이식한 (1X104 의 CD34+ 세포/마우스) 후, BM 세포의 인간 조혈 세포(hCD45+)에의 생착을 분석한 결과를 보여준다.
도 4c는 정상 및 AML-MSCs에서의 LTC-ICs 분석 결과를 보여준다 (장-기간 배양 후, 400개의 CD34+ 세포 유래의 콜로니의 수, 4 회 반복 실험, 각 군당 n=4).
도 4d는 정상 또는 AML-MSCs의 백혈병 세포 증식에 미치는 영향을 보여준다 (평균±SEM, 3회 반복 실험, 각 군당 n=5-6).
도 4e는 각 군의 MSCs와 공동-배양한 백혈병 세포 (HL-60)를 방사선 처리한 NSG 마우스에 이식한 후의, 백혈병 세포의 생착(hCD45+)을 말초 (PB) 및 BMs에서 분석한 결과를 보여준다 (평균 생착 %(SEM), 각 군당 n= 6).
도 4f는 각 군의 MSCs와 공동-배양한 백혈병 세포 (HL-60)의 세포 주기를 형광/ 파이로닌 Y(Hoescht/Pyronin) 염색에 의하여 G0 기에 있는 세포 집단의 %를 분석한 결과를 보여준다 (평균 SEM, 2 회 반복 실험, SF에 대하여 n=2, 공동-배양 군에 대하여 n=5-6, *p<0.05).
도 4g는 공동-배양하는 동안, Ara-C (2uM)를 처리한 백혈병 세포 (HL-60) 중에서, 세포 사멸(apoptosis) 과정에 있는 세포를 유세포 분석기로 분석한 결과를 보여준다 (평균±SEM, 3회 반복 실험, SF에 대하여 n=3, 공동-배양 군에 대하여 n=5-6).
도 5a는 MSCs (CD45-31-235a-), 내피 세포 (CD45-31-235a-31+)(EC), MSC 전구세포 (CD45-31-235a-146+166-)(M-progenitors), 성숙한 조골세포 (CD146+31-235a-146-166+)(OB), 및 1 ml 의 신선한 BM에 함유되어 있는 CFU-Fs의 수를 보여준다.
도 5b는 BM 기질 세포 조성의 급성 골수성 백혈병 재발 예측을 위한 바이오마커로서의 효용성을 검증하기 위하여, BM 기질 세포 조성의 AUC 값을 분석한 결과를 보여준다 (AUS 값이 >0.8 이상인 경우를 박스로 표시).
도 5c의 상단은 CR 및 다양한 재발군의 BM에서의 도 5b에서 도출한 바이오마커의 수를 보여준다(95% 신뢰구간(C.I.). 하단은 이들의 ROC(Receiver operating characteristic) 곡선 및 AUC 값 (SE)을 보여준다.
도 5d는 CR 및 재발AML 환자의 BM에 따른 기질 세포 조성의 차이를 보여준다. 조기 재발(≤1 년) 및 만기 재발(>1 년)군에서의 각 기질 조성의 수를 CR군과 비교하여 나타내었다(95% C.I.).
도 6은 백혈병-유도 니치의 변경 및 그들의 임상적 중요성을 나타낸 모식도이다.
급성 골수성 백혈병 (Acute myeloid leukemia; AML)의 발병 과정은 골수의 미세환경의 변화와 관련됨이 알려져 있다. 조혈모세포(hematopoietic stem cells; HSCs)의 변이로 인하여 백혈병 세포(leukemic cells)가 생성되면, 백혈병 세포, 백혈병 줄기 세포(leukemic stem cells; LSCs)가 주변의 미세환경에 변화를 일으켜 백혈병성 상태를 만들고 유지한다. 본 발명자들은 하기 실시예를 통하여, 정상 HSCs와 유사한 이들 LSCs가, 마우스에 이식되었을 때, 정상 HSCs의 니치(niche)와 경쟁하고, 더욱이 마우스에 이식된 백혈병 세포는 비정상적인 골수 니치를 형성하여 이식된 정상 HSCs을 종양 니치로 바꾸는 것을 확인하였다.
먼저, 급성 골수성 백혈병 환자의 골수 미세환경이 정상 개체와 다른지 확인하기 위하여, 백혈병 골수와 정상 골수의 중간엽 기질 세포의 조성을 분석하여 비교하였다(실시예 1). 급성 골수성 백혈병 골수는 정상 골수에 비하여 중간엽 전구세포(mesenchyaml progenitors; M-progenitors)의 상당한 손실이 나타났으나, 성숙한 조골세포(osteoblastic cells; OBs)는 증가하였다. 또한, 급성 골수성 백혈병 골수에서 콜로니 형성능과 증식능의 감소가 나타났고, β-갈락토시다아제 활성의 증가가 나타났다. 이는 백혈병 골수에서, 중간엽의 분화(mesenchymal differentiation)가 바뀌었음을 나타낸다.
상기와 같은 골수 미세환경의 변화가 백혈병 세포에 기인한 것인지 확인하기 위하여, 백혈병 세포와 중간엽 기질 세포를 공동 배양한 군과, 정상 세포와 중간엽 기질 세포를 공동 배양한 경우의 중간엽 기질 세포 내의 유전자 발현 양상을 분석하였다 (실시예 2). 그 결과, 백혈병 세포와 공동 배양한 군에서, 사이토카인 등과 관련된 유전자 발현의 증가 및 세포 주기 또는 증식 등과 관련된 유전자 발현의 감소가 나타났다. 또한, 백혈병 세포가 니치의 크로스-토크의 리모델링을 일으키는지 확인하고자, 크로스-토크 분자(cross-talk molecules)의 발현 양상을 분석하였다 (실시예 2). 그 결과, 백혈병 세포와 공동 배양한 중간엽 기질 세포에서, 크로스 토크 분자인 jagged-1의 발현 감소 및 CXCL-12의 발현 증가를 확인할 수 있었다. 이러한 결과는 백혈병 세포가 니치의 변화를 야기함을 시사한다.
또한, 이러한 니치의 변화가, 조혈모세포의 기능에까지 영향을 미치는지 알아보기 위하여, 정상 조혈 기능 및 백혈병성 기능에 미치는 영향을 분석하였다. 그 결과, 백혈병 세포에 의한 니치의 변화로 인하여, 정상 조혈 작용이 억제됨을 확인할 수 있었다. 뿐만 아니라, 백혈병 세포에 의한 니치의 변화는 백혈병 세포의 세포사멸(apoptosis)에 대한 저항성 및 화학요법에의 내성을 키워주는 방향으로 작용함을 알 수 있었다 (실시예 3). 이는, 백혈병 세포가 정상 적인 조혈 작용은 망가뜨리는 한편, 백혈병 세포 자신의 생존에는 유리하게끔 기질을 리모델링함을 시사한다.
상기 결과들을 토대로, 본 발명자들은, 급성 골수성 백혈병에서, 백혈병 세포가 골수의 니치를 변화시키고, 이러한 니치의 변화가 골수 내의 미세환경을 변화시키며, 이러한 미세환경의 변화가 급성 골수성 백혈병 재발의 예후와 관련이 있을 것이라는 가설을 세웠다. 상기 가설이 타당하다는 것을 하기 실시예를 통해서 확인하여, 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명은 개체로부터 수득한 골수 시료 내의 미세환경의 변화를 분석하는 것을 포함하는 급성 골수성 백혈병 재발의 예후 예측을 위하여 정보를 제공하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한, 개체로부터 수득한 골수 시료 내의 미세환경의 변화를 분석하는 것을 포함하는 급성 골수성 백혈병 재발의 예후 예측 방법을 제공한다. 골수의 미세환경의 변화는 골수 내의 기질 세포의 조성을 분석함으로써 확인할 수 있다.
본 발명에서 기질 세포(stromal cell)는 골수의 결합 조직(connective tissue) 세포를 의미하며, 미분화된 중간엽 기질 세포 primitive mesenchymal stromal cells; P-MSCs), 분화된 기질 세포(mesenchymal stromal cells; MSCs), 조골세포(muture osteoblastic cells; OB) 등을 포함한다.
한 구체예에서, 기질 세포의 조성의 분석은 개체로부터 수득한 골수 시료 내의, 미분화된 중간엽 기질 세포, 분화된 중간엽 기질 세포 및 조골세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 수준을 분석하는 것을 포함할 수 있다. 본 발명의 일 예에서, 미분화된 중간엽 기질 세포, 분화된 중간엽 기질세포 및 조골세포는 급성 골수성 백혈병 재발의 예후 예측용 마커로서 기능한다. 미분화된 중간엽 기질 세포, 분화된 중간엽 기질 세포 및 조골세포의 수준은 각각의 세포의 개수를 확인함으로써 분석할 수 있다. 기질 세포의 조성의 분석은 급성 골수성 백혈병 진단을 위한 골수 검사 시 수행되는 유세포 분석 등을 통하여 용이하게 분석할 수 있다.
본 발명의 일 예에서, 개체는 급성 골수성 백혈병 후보군으로, 백혈병 초기 진단을 위한 개체일 수 있다. 본 발명에 따르면, 초기의 급성 골수성 백혈병 진단 시, 추후의 재발의 예후까지 예측할 수 있는 이점이 있다.
한 구체예에서, 백혈병이 없는 개체로부터 수득한 골수 시료 내의 기질 세포의 조성과 비교하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 본 발명에서 백혈병이 없는 개체란 백혈병 기타 질환이 없는 정상 상태의 개체를 의미한다.
한 구체예에서, 백혈병이 없는 개체로부터 얻은 데이터와 급성 골수성 백혈병 후보군 데이터의 비교 결과, 후보군에서, 미분화된 중간엽 기질 세포 및 분화된 중간엽 기질 세포가 감소된 경우 급성 골수성 백혈병의 완전 관해의 지표일 수 있다. 본 발명에서 완전 관해란 최초 관해 판정 후, 5년 이상, 또는 5 년 내지 8년의 기간 동안 재발이 일어나지 않은 경우를 의미한다.
한 구체예에서, 미분화된 중간엽 전구세포의 증가는 급성 골수성 백혈병의 1년 이내의 조기 재발의 지표일 수 있다.
한 구체예에서, 분화된 중간엽 기질 세포 및/또는 조골세포의 증가는 급성 골수성 백혈병의 1년 초과의 만기 재발의 지표일 수 있다.
코호트 연구를 통해서, 백혈병 세포에 의한 기질의 리모델링이 급성 골수성 백혈병 재발의 예후와 관련이 있는지를 알아본 결과(실시예 4), 초기 진단 시 골수 내의 높은 수의 미분화된 중간엽 기질 세포는 조기 재발과 고도로 연관되고, 반면에 분화된 중간엽 기질 세포 또는 조골세포의 높은 수는 만기 재발과 연관됨을 확인할 수 있었다. 또한 미분화된 중간엽 기질 세포 및 분화된 중간엽 기질 세포의 감소는, 급성 골수성 백혈병의 완전 관해의 지표임을 확인할 수 있었다. 이러한 결과는 백혈병 초기 진단 시의 기질 미세환경 분석을 통하여, 급성 골수성 백혈병의 조기 및 만기 재발을 예측할 수 있음을 시사한다. 본 발명에 따르면, 백혈병 초기 진단 시 수행되는 골수 검사만으로도 용이하게 골수 내의 기질 세포의 조성을 분석하여, 급성 골수성 백혈병의 추후의 재발 가능성을 예측할 수 있다.
따라서, 본 발명은 급성 골수성 백혈병 재발 예후를 예측하기 위하여, 골수의 기질 세포의 조성을 분석하는 방법을 제공한다. 골수 기질 세포의 조성을 분석하는 방법은 상기 급성 골수성 백혈병 재발의 예후 예측을 위하여 정보를 제공하는 방법에서 기술한 내용이 모두 적용 또는 준용될 수 있다.
본 발명은 또한, 백혈병 세포가 골수의 기질에 영향을 주는 결과, 미분화된 중간엽 기질 세포, 분화된 중간엽 기질 세포 및 조골 세포의 수가 많을 때 급성 골수성 백혈병의 재발 가능성이 높음을 활용하여, 각종 중간엽 기질 세포와 백혈병 세포간의 상호작용의 억제를 통하여 급성 골수성 백혈병의 재발을 억제하는 방법 및 재발의 억제를 위하여 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 후보 물질을 처리하고 상기 후보 물질이 백혈병 세포와 골수 기질 세포의 상호작용을 억제하는지 여부를 분석하는 것을 포함하는 급성 골수성 백혈병의 재발 억제제를 스크리닝하는 방법을 제공한다. 후보 물질을 처리한 경우가, 후보 물질을 처리하지 않은 대조군과 비교하여 백혈병 세포와 골수 기질 세포의 상호작용을 억제하는 경우, 상기 후보 물질은 급성 골수성 백혈병의 재발 억제제로 사용될 수 있다.
미분화된 중간엽 기질 세포가 증가하는 경우 급성 골수성 백혈병이 조기에 재발될 가능성이 높고, 분화된 중간엽 기질 세포 및/또는 조골세포가 증가하는 경우 만기에 재발될 가능성이 높으므로, 미분화된 중간엽 기질 세포, 분화된 중간엽 기질 세포 및 조골세포의 저해제로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 저해제를 급성 골수성 백혈병 재발의 예방 용도로 사용할 수 있다.
이하에서, 본 발명을 실시예를 통해 상세히 설명한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
이하의 실시예에서 모든 데이터는 통계 분석 시스템(Statistical Analysis System; SAS, 버젼 9.3; 미합중국 노스캐롤라이나주 캐리 소재 SAS Institute Inc.)을 사용하여 분석하였고 유의성의 수준을 P<0.05로 설정하였다.
[실시예 1] AML 환자의 BMs에서의 중간엽 세포의 변화 확인
백혈병 환자의 골수 미세환경에의 잠재적 변화를 알아보기 위하여, 먼저 급성 골수성 백혈병(AML)으로 최초로 진단된 환자들의 전처리 없는 골수 기질 세포(Bone marrow stromal 세포)의 세포 조성을 분석하였다.
모든 실험에 있어서, 성모병원(St. Mary’s hospital) 및 서울성모병원의 기관감사위원회(institutional review board)에 의한 연구의 승인에 따라 사전동의(informed consent)를 받은 후 전처리가 없는 급성 골수성 백혈병 환자들의 골수 샘플들을 수득하여 사용하였다. 피콜-파크 구배 원심분리(Ficoll-Paque gradient centrifugation)에 의하여 급성 골수성 백혈병 환자들의 골수 또는 백혈구분리반출 (leukapheresis) 샘플들로부터 경-밀도(light-density) 단핵세포들(mononuclear cells; MNCs)을 분리하고 그리고 분석을 위하여 동결 저장하였다. 산모들로부터의 탯줄 혈액 세포들 또는 정상 공여자들의 골수들을 사전동의 후 유사하게 수득하였다.
세포 조성 분석 결과, 중간엽 기질 세포(Mesenchymal stromal 세포; MSCs; CD45-31-235a-) 시험에서, 급성 골수성 백혈병 골수는 중간엽 전구세포(mesenchyaml progenitors; M-progenitors; CD45-31-235a-146+166-)의 상당한 손실이 나타났으나, 정상 골수에 비하여 성숙한 조골세포(osteoblastic cells; OBs; CD45-31-235a-146-166+)는 증가하였고(도 1a), 이는 중간엽의 분화(mesenchymal differentiation)가 바뀌었음을 나타낸다.
한편, 미분화된 중간엽 기질 세포는 골수 내에서 니치 세포(niche cell)를 포함하는 콜로니 형성 세포(colony forming cell; CFU-F)로 많이 발현되므로, 정상 및 백혈병 골수들에서의 중간엽 전구세포의 콜로니 형성 및 자기-재생(self-renewal)능을 검사하였다. CFU-F 형성을 위하여, BM MNCs를 14일 동안 플레이팅하였다(1x 106 세포/플레이트). 크리스탈 바이올렛으로 콜로니를 염색하거나 계대배양하였다. 콜로니를 형성하지 않은 BMs(no colony), 콜로니를 형성하였으나 2계대 내에서 성장 정지에 도달한 BMs(growth arrest) 및 3계대 이후 계속 증식한 BMs(normal growth)의 %를 도 1b에 나타내었다 (n= 51; AML, n=11; 정상 BM). 급성 골수성 백혈병 환자로부터의 골수 단핵 세포(MNCs)는 콜로니를 형성함에 있어서 빈번하게 실패(백혈병 골수와 정상 골수 각각에 대하여 13.7% 대 0%)하였고, 노화-연관 β-갈락토시다아제 활성(senescence-associated β-galactosidase activities)과 연관된 계대배양의 2계대(passages) 내에서의 가속된 성장 정지(growth arrest)는 정상 골수 보다 높은 빈도(급성 골수성 백혈병과 정상 각각에 대하여 33.3% 대 9.1%)로 나타났다(도 1b).
또한, FAB 분류에 따른 AML아형에 대한 중간엽 세포의 콜로니 형성능(도 1c) 및 증식능(도 1d)을 알아보았다.
그 결과, 급성 골수성 백혈병의 아형(subtypes)에 관계없이 급성 골수성 백혈병 환자에서 중간엽 기질 세포 기능의 변경이 관찰되었다(도 1c). 3계대 이후 성장을 나타낸 급성 골수성 백혈병-유도된 중간엽 기질 세포(AML-MSCs)에 대해서조차도, 60일의 계대 배양 동안에 보다 빈번한 증식의 감소가 관측되었다(도 1d).
자기 재생능 검사를 위하여, 3 명의 정상 공여자 또는 4 명의 AML 환자 (M1, M2, M5a, AML/골수이형성 아형 포함)로부터 얻은 배양-유도된 MSCs의 노화-연관 β-갈락토시다아제 활성을 분석하였다(정상; n=9, AML; n=12). 키트(미합중국 매사츄세츠 댄버 소재 셀시그널링사(세포 Signaling))를 이용하여, 매뉴얼에 따라 노화-연관 β-갈락토시다아제(SA-β-gal) 활성을 시험하였다. 이미지를 도 1c의 상단에 나타내고, 세 번 반복 실험 결과로부터의 평균±SEM 을 하단에 나타내었다. 도 1e에 도시한 바와 같이, β -갈락토시다아제 활성은 AML-MSC에서 더 높은 것으로 나타났다.
한편, 이러한 중간엽 세포의 변화가, AML의 관해 후에도 유지되는지 알아 보기 위하여, 초기 진단 시의 CFU-F와 관해 후의 CFU-F를 비교 분석하였다. 그 결과, 비록 급성 골수성 백혈병 골수에서의 콜로니 형성 세포들의 총 수가 연령이-일치하는(age-matched) 정상 골수들 보다 더 낮기는 하나, 급성 골수성 백혈병 환자가 완전한 관해(complete remission; CR)에 도달한 경우에는 이러한 차이는 더 이상 관찰되지 않았다(도 1f, 도 1g). 이는 급성 골수성 백혈병 골수에서 중간엽의 변경은 진행 중인 백혈병 유발 활성(leukemogenic activities)을 반영한다는 것을 의미한다.
위의 실험 결과로부터 확인한 중간엽의 변화를, 백혈병 아세포(leukemic blasts)가 직접적으로 야기하는 지를 알아보기 위하여, 중간엽 기질 세포들을 정상 CD34+ 세포 또는 백혈병 CD34+ 세포와 5일 동안 공동-배양하고, 조혈세포로부터 분리-정제하여, 분리-정제된 세포의 유전자 발현을 분석하였다. 중간엽 기질 세포들 내에서의 유전자 발현을 일루민 비드칩 어레이 혼성화 분석(Illumina BeadChip array hybridization analysis)으로 분석하였다. 6개의 발현 프로파일을 위하여, 중위 절대 편차(median absolute deviation; MAD)를 산출하고 평균연관(average linkage)을 갖는 계층적 군집화를 위하여 고도로 가변적인 유전자들(즉, 중위절대편차 상위 1000개의 유전자들)을 선택하였다. 백혈병 세포와 공동-배양한 중간엽 기질 세포의 전사 프로파일(transcrption profiles)을 정상 조혈 전구세포(hematopoietic progenitors)와 공동-배양한 중간엽 기질 세포들과 비교하였다(도 2a).
매우 가변적인 유전자들의 계층적 군집화(hierarchical clustering)는 정상 아세포 및 백혈병 아세포들과 공동-배양된 중간엽 기질 세포들을 명백하게 구별시켜(도 2b) 전사체들(transcriptomes)에서의 실질적인 차이를 나타내었다.
이들 전사체의 변화들과 연관되는 후보 분자의 기능들을 확인하기 위하여, 유전자 온톨로지(Gene Ontology; GO; MSigDB c5 범주들)로부터 기능적으로 연관된 유전자 세트들의 인리치먼트를 분석하는 GSEA(Gene Set Enrichment Analysis)을 수행하였다. 각 GO 범주에 대한 유전자들의 1000 순열에서 유의미한 정상 P값을 추산하였다. 다중 시험 조정(Multiple test adjustment)을 수행하여 유의미한(FDR < 0.1) GO 범주를 선택하였다. 전체적으로, 정상 CD34+ 군에 비하여 백혈병 CD34+로 공동-배양된 중간엽 기질 세포들에서 11 및 80 GO 범주들이 상향- 및 하향-조절된 유전자들의 유의미한(FDR < 0.1) 인리치먼트를 나타내었다(도 2c). 중요한 것은, 백혈병 조건 하에서 하향-조절된 G0 범주들 중에서, ‘세포-주기’ 및 그의 연관된 기능들(예를 들면, ‘염색체’ 및 ‘DNA 복제’)에 대한 유전자들의 유의미한 인리치먼트가 관찰되었다. 이는 급성 골수성 백형병 환자들로부터의 중간엽 기질 세포들에서의 증식의 손실과 일치한다. 105 ‘세포 주기’-연관 유전자 세트들의 인리치먼트 플롯(enrichment plot)은 상위 20 리딩 에지(leading edge) 유전자들에 대하여 나타났다(도 2d 및 표 1). 이와는 대조적으로, 백혈병-배양된 중간엽 기질 세포에서 상향-조절된 G0 범주들 중에서, 2개의 사이토카인-연관된 G0 기능들이 관측되었다(‘케모카인 수용기 결합’ 및 ‘케모카인 활성’)(도 2c 및 도 2e).
이들 결과는 백혈병 세포들은 세포-주기 연관 유전자들의 현저한 억제 및 사이토카인-연관 유전자의 상향-조절을 수반하여 정상 조혈세포와는 명백히 상이한 전사체 리모델링(transcriptomic reprogramming)을 유도함을 나타낸다.
Figure PCTKR2015004233-appb-I000001
[실시예 2] 백혈병 니치의 정상 세포와 백혈병 세포에 대한 미세환경의 크로스-토크(cross-talk)의 재설정
백혈병-유도된 중간엽 기질 세포들의 변경을 알아보기 위하여, 중간엽 기질 세포에서 크로스-토크 분자(cross-talk molecules)들의 발현 변화를 검사하였다. 정상 세포 및 백혈병 세포들과의 공동-배양 동안 니치에서 HSC 자기-재생을 자극하는 크로스-토크 분자인 jagged-1 및 CXCL-12(+)의 중간엽 발현을 검사하였다 (도 3a).
신선한 골수 기질 세포들(fresh bone marrow stromal cells)에 대한 분석을 위하여, 골수 단핵세포들을 중간엽 세포들 및 내피 세포들의 집단(subsets)에 대한 특정의 항체들로 염색하고 유세포 분석기로 분석하였다. 염소 항-jagged-1 항체(goat anti-Jagged-1 antibody; 미합중국 메릴랜드주 세인트루이스 소재 시그마-알드리치사(Sigma-Adrich))로의 염색 또는 마우스 항-CXCL12/SDF-1 항체(mouse anti-CXCL12/SDF-1 antibody; 미합중국 미네소타주 미네아폴리스 소재 알앤디시스템사(R&D system))로의 세포내 염색에 의하여 신선한 중간엽 기질 세포들 내에서의 jagged-1 또는 CXCL-12 발현의 유세포 분석을 수행하였다. 배양된 중간엽 기질 세포들에 대하여는, 토끼 항-jagged-1 항체(셀시그널링사)로의 세포내 염색에 의하여 jagged-1을 검출하였다. 면역조직화학법(immunohistochemistry)을 위하여, 골수 절편들을 탈파라핀화하고, 스프링크 에이치알피 검출 벌크 키트(SPlink HRP Detection Bulk Kit; 미합중국 워싱턴주 머컬티오 소재 골든 브릿지 인터내셔널사(Golden Bridge International))를 이용하여 면역조직화학 염색을 수행하였다. 골수 절편들 내의 상기 jagged-1 및 CXCL-12들을 각 분자의 세포내 도메인(intracellular domain)을 검출하는 토끼 항-jagged-1 항체(셀스테이닝사) 또는 마우스 항-CXCL12/SDF-1 항체(알앤디시스템사)로 검출하였다. 절편들은 3,3’디아미노벤지딘 기질(3,3’diaminobenzidine substrate) 및 헤마톡실린(hematoxylin)로의 대비염색(counterstain)에 의해 가시화하였다.
그 결과, 정상 조혈 전구세포들과의 공동-배양에 반응하여, 정상 중간엽 기질 세포들은 jagged-1(+) 세포들의 급격한 증가를 나타낸 반면에, 급성 골수성 백혈병-중간엽 기질 세포들은 이를 더 감소시켜 반대 방향에서의 급성 골수성 백혈병-중간엽 기질 세포들의 명백한 반응을 나타내었다(도 3b). 따라서, 급성 골수성 백혈병-중간엽 기질 세포들과 공동-배양된 정상 조혈 전구세포들이 정상 중간엽 기질 세포들과의 공동-배양에 비하여 하향-흐름 노치 신호(down-stream notch signals), Hes-1 또는 Hes-5의 유의미한 억제를 나타내었다(도 3c). 이와 대조적으로, 백혈병 아세포들과의 공동-배양 동안, 정상 중간엽 기질 세포들에서 jagged-1(+) 세포들이 증가하지 않았을 뿐만 아니라 급성 골수성 백혈병-중간엽 기질 세포들에서의 감소가 관측되지 않아(도 3d), 백혈병 아세포들 및 정상 조혈 전구세포들이 백혈병 미세환경 하에서 별개의 크로스-토크에 관여함을 나타내고 있다. 이와 유사하게, 정상 세포 또는 백혈병 세포들과 공동-배양하는 동안에, CXCL-12(+) 세포들에서의 중간엽 기질 세포들의 변화에 대하여 검사하였을 때, 급성 골수성 백혈병-중간엽 기질 세포들은 백혈병 세포들에 대하여 반응하여 선택적으로 CXCL-12(+) 세포의 뚜렷한 증가를 나타낸 반면에, 정상 조혈 세포들에 대한 공동-배양 동안에는 감소하였다(도 3e).
생체 내 백혈병 상태 하에서 이들 발견들을 더 탐색하기 위하여, 신선한, 비-배양된 중간엽 기질 세포들에서, 크로스-토크 분자들에 대한 AML 환자들의 BMs을 스크리닝하였다. AML BMs은 정상 골수들에 비하여 중간엽 기질 세포들 중에서도 jagged-1(+) 세포들의 %에서 뚜렷한 감소를 나타내었다(각각 정상 및 급성 골수성 백혈병에 대하여 5.4±1.0 대 0.5±0.2%)(도 3f). 유사하게, 중간엽 기질 세포들 중의 상기 CXCL-12(+) 세포들은 정상 골수들에 비하여 급성 골수성 백혈병 골수들 중에서 유의미하게 증가하여(각각 정상 및 급성 골수성 백혈병에 대하여 42.0±5.2 대 69.9±2.8%)(도 3g), 시험관 모델로부터 관측된 크로스-토크들의 변화를 재현하였다. 흥미롭게도, 초기 진단 시에 관측된 이들 변화들, 즉 jagged-1(+)의 감소 또는 CXCL-12(+) 중간엽 기질 세포들의 증가는 동일한 환자들의 골수들이 완전한 관해에 도달한 후에 분석한 경우에는 역전되었다(도 3h). 이는 백혈병 세포들이 백혈병 진행의 고유한 부분으로서 니치 크로스-토크의 리모델링(remodeling)을 야기함을 의미한다.
[실시예 3] 정상 HSC에 대하여 변형된 미세환경의 기능적 영향(Functional impact of altered microenvironment to normal HSC)
AML에서 중간엽 기질 세포의 변형된 미세환경이 HSC의 기능에 미치는 영향을 알아보았다. 이를 위하여, 백혈병 중간엽 기질 세포들을 정상 또는 급성 골수성 백혈병-중간엽 기질 세포들과 공동-배양하여, 백혈병 중간엽 기질 세포들이 정상 조혈 기능 또는 백혈병성 기능에 대하여 미치는 영향을 분석하였다.
공동-배양 24시간 이전에 중간엽 기질 세포들을 방사능처리(1500 센티그레이(cGy))하였다. 그리고 100ng/㎖ 인간 SCF, 100ng/㎖ 인간 Flt3L 및 20ng/㎖ 인간 IL-3, IL-6, 및 G-CSF(이스라엘 르호봇 소재 프로스펙-타니테크노진 리미티드(ProSpec-Tany TechnoGene Ltd))로 이루어지는 사이토카인 혼합물의 존재 하에서, 장기간 배양-개시 세포 배지(LTC-IC media; 캐나다 밴쿠버 소재 스템셀테크놀로지사(Stem 세포 Technology) H5100) 내에서, 상기 중간엽 기질 세포들을 정상 또는 백혈병 CD34+ 세포들과 5일 동안 공동-배양하였다.
제대혈로부터의 정상 CD34+ 세포를 무-기질 조건(stroma-free conditions; SF), 2 명의 정상 공여자 유래의 MSCs 상에서의 공동-배양(#1, #2) 또는 4 명의 AML 환자 유래의 백혈병 MSCs 조건 하에서 5일 동안 배양하고 CD34+ 세포의 총 증가량을 분석하였다(3회 반복 실험, 각 군당 n= 7). (*;p<0.05)
그 결과, 도 4a에 도시한 바와 같이, 정상 MSCs 상에서 공동-배양한 경우, CD34+ 세포들의 유의미한 생체-외 증가가 관찰되었으나, AML-MSCs 상에서 공동-배양한 경우에는 이러한 증가가 관찰되지 않았다.
각 군의 MSCs 상에서 공동-배양된 정상 CD34+ 세포를 방사선 처리된 (250rad) NSG 마우스에 이식하였다 (1X104 의 CD34+ 세포/마우스). 이식 8 주 후, 인간 조혈 세포 (hCD45+)의 생착 여부를 알아보기 위하여 BM 세포를 분석하였다. NOD/SCID-γnull(NSG) 마우스를 잭슨 라보레토리(Jackson Laboratory; 미합중국 메인주 바하버 소재)로부터 구입하고, 여과된 개체 환기 케이지(filtered individual ventilation cage) 내에서 보관하였다. 재분포 분석을 위하여, 마우스(7 내지 10주령)들을 방사선 처리하고(250 센티그레이), 조혈 세포들을 정맥 내로 주사하였다. 이식 8주 후, 염색에 의하여 유세포분석기로 인간 세포 생착(engraftment)을 분석하였다.
그 결과, 도 4b의 왼쪽 그래프에서, 총 시험 마우스 중에서 양성 반응 (1% 보다 높은 경우)을 보인 마우스의 수를 괄호 안에 나타내었다. 정상 및 백혈병 MSC 군에서 평균 인간 세포 생착 수준을 도 4b의 오른쪽에 나타내었다(*p<0.05). 그 결과, NSG 마우스들 내로 이식한 경우, AML-MSCs 상에서 공동-배양된 정상 조혈 전구세포들은 정상 MSCs 상에서 배양된 세포들에 비하여 낮은 수준의 재분포 활성(repopulating activities)을 나타내었다(도 4b).
장-기간 배양-개시 세포분석(long-term culture-initiating cell(LTC-IC) assay)에 의하여 원시 조혈 세포 집단의 유지에 대한 분석을 위하여, 각각의 MSCs와 공동-배양된 정상 CD34+ 세포를 6주 동안 장-기간 배양한 후, 콜로니 형성을 위하여 반-고체 배지에 플레이팅하였다. 장-기간 배양 후, 400 인풋 CD34+ 유래 콜로니의 수를 분석한 결과(4회 실험, 각 군당 n=4), AML-MSCs 상에서 공동-배양된 CD34+ 세포들에서 장-기간 배양-개시 세포들의 엄청난 손실이 나타났다(도 4c). 반면에, 정상 MSCs 군에서는 손실이 나타나지 않았다. 이는, AML-MSCs가 정상 조혈 작용에 억제 효과를 발휘하고, 원시 조혈 세포는 백혈병 중간엽 기질 세포들의 악영향에 현저하게 영향을 받음을 의미한다.
3일 동안, 무-기질 조건(stroma-free condition; SF) 하에서 AML 아세포 (M1, M3, HL-60)를 배양하거나, 정상 또는 AML-MSCs (M2, M5a)과 공동-배양하고, 백혈병 세포(CD45+)의 수를 분석하였다(3회 실험, 각 군당 n=5-6). 또한, 각 군의 MSCs와 공동-배양된 백혈병 세포 (HL-60)를 방사선 처리한 NSG 마우스에 이식하였다. 이식 6주 후, 말초 혈액(peripheral blood; PB) 및 BMs에서, 백혈병 세포의 생착 (hCD45+)을 분석하였다 (각 군당 n= 6).
그 결과, 장-기간 배양 개시 세포 분석과는 달리, 인 비트로 증식 또는 생체 내 백혈병유발(leukemogenesis)에 있어서는 아무런 차이가 나타나지 않았다(도 4d, 도 4e). 이는, 상기 백혈병 세포들이 백혈병 니치들의 악영향에 대하여 저항성이 있음을 시사한다.
또한, 형광 및 파이로닌(Hoescht and pyronin)으로 염색하는 것에 의하여 각 군의 MSCs와 공동-배양된 백혈병 세포 (HL-60)의 세포 주기를 분석하고 G0기의 % 세포 집단을 분석하였다 (2회 실험, SF; n=2, 공동-배양군; n=5-6).
각 군의 MSCs와 2일간 공동-배양 하는 동안, 백혈병 세포 (HL-60)를 Ara-C (2uM)로 처리하고, 백혈병 세포 (CD45+) 중에서, 세포 사멸(apoptosis; AnnexinV+PI-) 과정에 있는 세포를 유세포 분석기로 분석하였다(3회 실험, SF; n=3, 공동-배양 군; n=5-6).
그 결과, 상기 급성 골수성 백혈병-중간엽 기질 세포들에의 공동-배양이 정상 중간엽 기질 세포들에의 공동-배양 보다 높은 비율의 백혈병 세포들을 정지상태로 이끌고 그리고 Ara-C 처리에 의하여 유도되는 세포사멸(apoptosis)에 더 높은 저항성을 부여하였다(도 4f, 도 4g). 동시에, 이들 결과들은 백혈병 미세환경이 정상 조혈 세포들을 선택적으로 억제하나, 백혈병 세포들의 백혈병 활성 및 화학요법-저항성(chemo-resistance)을 지지하는 방식으로 정상 세포 및 백혈병 세포들에 뚜렷한 영향을 발휘함을 나타낸다.
[실시예 4] 백혈병 환자의 예후 마커로서 니치의 리모델링(Remodeling of niche as a prognostic parameter in leukemia patients)
정상 조혈 작용 및 백혈병 유발 활성들에 대한 기질 리모델링(stromal remodeling)의 기능상 영향을 발견하고, 이러한 기질 리모델링에서의 차이가 급성 골수성 백혈병 환자들의 임상과정에서의 이질성(heterogeneity)에 대하여 기여할 수 있다는 가설을 세웠다. 그 가능성을 시험하기 위하여, 급성 골수성 백혈병의 초기 진단에서의 골수 기질 변화들과 관해 후 5 내지 8년 동안의 이들의 후속하는 임상과정들 사이의 상관관계를 조사하는 코호트 연구(cohort study)를 설계하였다. 코호트 연구를 위하여, 완전 관해 후 5 내지 8년 동안의 완전한 추적 데이터를 갖는 급성 골수성 백혈병 환자들의 원시 골수 샘플들을 수집하였다(표 2). 관해 후 5 내지 8년 동안 완전한 관해를 유지한 급성 골수성 백혈병 환자군(CR, n=29), 그 후 재발된 급성 골수성 백혈병 환자군(relapse; R; n=14) 및 화학요법에 대하여 난치반응을 나타내는 급성 골수성 백혈병 환자군(refractory; Rf; n=5)에 대한 정상 공여자(normal donors; Nr; n=12)들로부터의 BM과 함께 기질 세포 조성을 검사하였다.
Figure PCTKR2015004233-appb-I000002
비록 과도한 이질성이 급성 골수성 백혈병 환자들에서 관측되기는 하였으나, 골수의 기질 성분들에서 유의미한 차이점들이 발견되었다. 즉, 골수 내의 미분화 중간엽 기질 세포들 (CD45-31-235a-146+166-; P-MSCs) 및 콜로니 형성 세포들은 완전히 관해된 정상 골수들 보다 더 낮은 반면에, 분화된 중간엽 기질 세포들(MSCs; CD45-31-235a-) 및 조골세포들 (CD146+31-235a-146-166+; OB)은 완전 관해군 보다 재발군에서 더 높았다(도 5a). 그러나, 상기 환자군 중에서 내피 세포(EC; CD45-31-235a-31+) 함량에서는 유의미한 차이가 없었다.
따라서, 관해된 급성 골수성 백혈병 환자들의 재발의 예측을 위하여, 기질 패턴들에서의 이들 차이점들이 이러한 고-위험 환자들을 동정하는 데 사용할 수 있는지 여부를 알아보기로 하였다. 이를 위하여, ROC (receiver operating characteristic) 곡선 및 그에 의하여 측정되는 ‘곡선하면적(area under the curve; AUC)’을 적용하는 것에 의하여 각 기질 성분에 대한 재발의 예측가능성(predictability)을 분석하였다.
그 결과, 도 5b에 도시한 바와 같이, 분화된 중간엽 기질 세포들(0.78±0.07)에 의하거나, 미분화 중간엽 기질 세포들(0.72±0.09)에 의하거나 또는 조골세포들(0.7±0.09)에 의한 전체 재발 군의 예측을 위한 AUC 값은 EC(0.63±0.09) 콜로니 형성 세포(0.68±0/09)에 의한 것보다 더 높았다(도 5b). 중요한 것은, 재발에 대한 예측은 조기(1년 이내; n=10) 및 만기(1년 초과; n=4) 재발을 개별적으로 분석하는 경우에 보다 더 유의미하게 되었다. 골수에서 미분화된 중간엽 기질 세포들의 높은 수는 조기 재발(1년 이내)의 높은 예측가능성을 나타내며(AUC = 0.8± 0.08)(도 5b 및 도 5d), 이는 관해 후 6개월 이내의 재발에 대하여 훨씬 유의미하였다(AUC = 0.88±0.06)(도 5c).
이와는 대조적으로, 만기 재발(1년 초과)의 환자들에 대하여 놀라운 차이가 나타났으며, 즉, 만기 재발에 대하여 높은 예측가능성을 갖는 완전 관해에 비하여 만기 재발 군에서 분화된 중간엽 기질 세포들 또는 조골세포들의 유의미하게 높은 수들이 관측되었다(각각 분화된 중간엽 기질 세포에 대하여는 AUC = 0.91±0.06, 조골세포에 대하여는 AUC = 0.88±0.08)(도 5c).
이들 결과를 종합하여, 도 6에 모식도로 나타내었다. 요약하면, 골수 내의 높은 수의 미분화된 중간엽 기질 세포는 조기 재발과 고도로 연관되고, 반면에 분화된 중간엽 기질 세포 또는 조골세포의 높은 수는 만기 재발과 연관된다. 즉, 급성 골수성 백혈병의 조기 및 만기 재발은 기질의 미세환경과 분명하게 연관되는 것이다(도 6).
따라서, 급성 골수성 백혈병의 임상과정에서의 이질성에 대한 파라미터는 급성 골수성 백혈병 환자의 임상과정의 예측을 위한 잠재적인 바이오마커(biomarker)로서 기능할 수 있고, 초기 진단에서 급성 골수성 백혈병 환자들의 골수에서의 기질 변화가, 이러한 급성 골수성 백혈병의 임상과정에서의 이질성에 대한 파라미터가 될 수 있음을 시사한다.

Claims (14)

  1. 개체로부터 수득한 골수 시료 내의 기질 세포의 조성을 분석하는 것을 포함하는 급성 골수성 백혈병 재발의 예후 예측을 위하여 정보를 제공하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 기질 세포의 조성의 분석은 개체로부터 수득한 골수 시료 내의, 미분화된 중간엽 기질 세포, 분화된 중간엽 기질 세포 및 조골세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 수준을 분석하는 것을 포함하는 급성 골수성 백혈병 재발의 예후 예측을 위하여 정보를 제공하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 개체는 급성 골수성 백혈병 후보군으로, 백혈병 초기 진단을 위한 개체인 급성 골수성 백혈병 재발의 예후 예측을 위하여 정보를 제공하는 방법.
  4. 제1항에 있어서, 백혈병이 없는 개체로부터 수득한 골수 시료 내의 기질 세포의 조성과 비교하는 것을 추가로 포함하는 급성 골수성 백혈병 재발의 예후 예측을 위하여 정보를 제공하는 방법.
  5. 제2항에 있어서, 미분화된 중간엽 기질 세포 및 분화된 중간엽 기질 세포의 감소는 급성 골수성 백혈병의 완전 관해의 지표인 급성 골수성 백혈병 재발의 예후 예측을 위하여 정보를 제공하는 방법.
  6. 제2항에 있어서, 미분화된 중간엽 기질 세포의 증가는 급성 골수성 백혈병의 1년 이내의 조기 재발의 지표인 급성 골수성 백혈병 재발의 예후 예측을 위하여 정보를 제공하는 방법.
  7. 제2항에 있어서, 분화된 중간엽 기질 세포 및/또는 조골세포의 증가는 급성 골수성 백혈병의 1년 초과의 만기 재발의 지표인 급성 골수성 백혈병 재발의 예후 예측을 위하여 정보를 제공하는 방법.
  8. 개체로부터 수득한 골수 시료 내의 기질 세포의 조성을 분석하는 것을 포함하는 급성 골수성 백혈병 재발의 예후를 예측하는 방법.
  9. 제8항에 있어서, 기질 세포의 조성의 분석은 개체로부터 수득한 골수 시료 내의, 미분화된 중간엽 기질 세포, 분화된 중간엽 기질 세포 및 조골세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 수준을 분석하는 것을 포함하는 급성 골수성 백혈병 재발의 예후를 예측하는 방법.
  10. 제8항에 있어서, 개체는 급성 골수성 백혈병 후보군으로, 백혈병 초기 진단을 위한 개체인 급성 골수성 백혈병 재발의 예후를 예측하는 방법.
  11. 제8항에 있어서, 백혈병이 없는 개체로부터 수득한 골수 시료 내의 기질 세포의 조성과 비교하는 것을 추가로 포함하는 급성 골수성 백혈병 재발의 예후를 예측하는 방법.
  12. 제9항에 있어서, 미분화된 중간엽 기질 세포 및 분화된 중간엽 기질 세포의 감소는 급성 골수성 백혈병의 완전 관해의 지표인 급성 골수성 백혈병 재발의 예후를 예측하는 방법.
  13. 제9항에 있어서, 미분화된 중간엽 기질 세포의 증가는 급성 골수성 백혈병의 1년 이내의 조기 재발의 지표인 급성 골수성 백혈병 재발의 예후를 예측하는 방법.
  14. 제9항에 있어서, 분화된 중간엽 기질 세포 및/또는 조골세포의 증가는 급성 골수성 백혈병의 1년 초과의 만기 재발의 지표인 급성 골수성 백혈병 재발의 예후를 예측하는 방법.
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