WO2015176730A1 - Селективные ингибиторы, нарушающие взаимодействие рецептора фактора роста фибробластов и frs2, для профилактики и лечения рака и других заболеваний - Google Patents

Селективные ингибиторы, нарушающие взаимодействие рецептора фактора роста фибробластов и frs2, для профилактики и лечения рака и других заболеваний Download PDF

Info

Publication number
WO2015176730A1
WO2015176730A1 PCT/EA2014/000013 EA2014000013W WO2015176730A1 WO 2015176730 A1 WO2015176730 A1 WO 2015176730A1 EA 2014000013 W EA2014000013 W EA 2014000013W WO 2015176730 A1 WO2015176730 A1 WO 2015176730A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
frs2
inhibitor
interaction
inhibitors
growth factor
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/EA2014/000013
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Сергей Алексеевич ТЮЛЯНДИН
Михаил Юрьевич БЯХОВ
Илья Валерьевич ТИМОФЕЕВ
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
"russian Pharmaceutical Technologies" LLC
Original Assignee
"russian Pharmaceutical Technologies" LLC
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by "russian Pharmaceutical Technologies" LLC filed Critical "russian Pharmaceutical Technologies" LLC
Priority to EP14892456.6A priority Critical patent/EP3146965B1/en
Priority to JP2017513314A priority patent/JP6365999B2/ja
Priority to CN201480079337.4A priority patent/CN106535882B/zh
Priority to ES14892456T priority patent/ES2734649T3/es
Publication of WO2015176730A1 publication Critical patent/WO2015176730A1/ru
Priority to US15/355,506 priority patent/US9957236B2/en
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D239/00—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazine or hydrogenated 1,3-diazine rings
    • C07D239/02—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazine or hydrogenated 1,3-diazine rings not condensed with other rings
    • C07D239/24—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazine or hydrogenated 1,3-diazine rings not condensed with other rings having three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D239/28—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazine or hydrogenated 1,3-diazine rings not condensed with other rings having three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, directly attached to ring carbon atoms
    • C07D239/32—One oxygen, sulfur or nitrogen atom
    • C07D239/42—One nitrogen atom
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/095—Sulfur, selenium, or tellurium compounds, e.g. thiols
    • A61K31/10—Sulfides; Sulfoxides; Sulfones
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/185—Acids; Anhydrides, halides or salts thereof, e.g. sulfur acids, imidic, hydrazonic or hydroximic acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/335—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin
    • A61K31/34—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having five-membered rings with one oxygen as the only ring hetero atom, e.g. isosorbide
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/44—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof
    • A61K31/4418—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof having a carbocyclic group directly attached to the heterocyclic ring, e.g. cyproheptadine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/498—Pyrazines or piperazines ortho- and peri-condensed with carbocyclic ring systems, e.g. quinoxaline, phenazine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/505—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D213/00—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D213/02—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D213/04—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having no bond between the ring nitrogen atom and a non-ring member or having only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom
    • C07D213/24—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having no bond between the ring nitrogen atom and a non-ring member or having only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom with substituted hydrocarbon radicals attached to ring carbon atoms
    • C07D213/36—Radicals substituted by singly-bound nitrogen atoms
    • C07D213/42—Radicals substituted by singly-bound nitrogen atoms having hetero atoms attached to the substituent nitrogen atom
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D239/00—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazine or hydrogenated 1,3-diazine rings
    • C07D239/02—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazine or hydrogenated 1,3-diazine rings not condensed with other rings
    • C07D239/24—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazine or hydrogenated 1,3-diazine rings not condensed with other rings having three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D239/26—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazine or hydrogenated 1,3-diazine rings not condensed with other rings having three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with only hydrogen atoms, hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals, directly attached to ring carbon atoms

Definitions

  • the invention relates to medicine and includes the use of inhibitors that selectively disrupt the interaction of fibroblast growth factor receptor with FRS2, as well as interaction with other components of the FRS2 complex.
  • the use of selective inhibitors described in the present invention leads to a significant increase in antitumor efficacy compared to other inhibitors and monoclonal antibodies, a decrease in the toxicity of the treatment, the ability to use a low concentration of the agent for complete blocking, and prolonged treatment.
  • An advantage of the invention is the development of a new class of drugs for the treatment of malignant neoplasms and other diseases.
  • Proliferation of tumor cells can be caused by various factors that naturally occur in nature. These factors bind to receptors on the surface of tumor, endothelial and other cells, which leads to activation of the receptors and the signal inside the cell, followed by division.
  • FGFR fibroblast growth factor
  • the FGFR family is involved in physiological processes such as angiogenesis, migration, proliferation, differentiation and survival of various cells.
  • Fibroblast growth factor binds specifically to FGFR, represented by five types.
  • FGFR types 1-4 are typical receptors with tyrosine kinase activity, that is, the intracellular part is represented by tyrosine kinase.
  • the processes of tyrosine kinase activation and further signal transmission inside the cell are based on phosphorylation processes inherent in all such receptors.
  • the extracellular part of FGFR consists of 3 immunoglobulin-like domains;
  • the II and III domains contain a ligand-binding region. Thanks to alternative splicing, domain III changes its shape and is in two states - Sch and Sch. This may affect ligand binding strength and activity of therapeutic agents directed against the receptor [Eswarakumar et al. 2005; Brooks et al. 2012].
  • domain III changes its shape and is in two states - Sch and Sch. This may affect ligand binding strength and activity of therapeutic agents directed against the receptor [Eswarakumar et al. 2005; Brooks et al. 2012].
  • FGF belong to the group of heparin binding proteins.
  • FGF In order to transmit a signal to the cell and activate intracellular processes, FGF must bind to the receptor and heparan sulfate (heparin) on the cell surface [Abuharbeid et al. 2006]. This distinguishes the activation mechanism of the FRF receptor from other factors, in particular VEGF, for which heparan sulfate is not needed. Hormone-like RFFs have a low affinity for heparan sulfate. When RFF binds to the receptor, the main intracellular pathways RAS-RAF-MAPK and PI3K-AKT-mTOR are activated with signal propagation to the nucleus [Turner et al. 2010].
  • FRS2 The main component of signal transduction from FGFR to intracellular kinases is the FRS2 protein [Ong et al. 2000; Kouhara et al. 1997].
  • FRS2 is a docking protein that activates upon binding of FGFR to a ligand and forms a complex with Shp2 and Grb2; therefore, activation of FRS2 activates both RAS-RAF-MAPK and PI3K-AKT-mTOR signaling pathways.
  • tyrosine kinase inhibitors As well as monoclonal antibodies.
  • tyrosine kinase inhibitors reduce the activity of intracellular tyrosine kinase by blocking various active parts of one or, as a rule, several receptors. Indiscriminate blocking is associated with a decrease in the efficiency of action on tumor cells, vascular cells, as well as other structures expressing the corresponding type of receptor. It is known that the effectiveness of therapeutic monoclonal antibodies directed against FGFR can be significantly reduced if the domain III of the FGF receptor changes shape (III and III) [Wesche et al.
  • ponatinib, BGJ398, AZD4547, J J-42756493, BAY 1163877 inhibit several types of FGFR and, although to a lesser extent, also vascular endothelial growth factor receptors and some other kinases [Gozgit et al. 2012; Arai et al. 2014; Gavine et al. 2012; Perera et al. 2014; Heroult et al. 2014]. It was shown that cells of a particular tumor express their type of FGFR (for example, kidney cancer - FGFR1 [Tsimafeyeu et al. 2011], luminal type of breast cancer - FGFR1 [Tenhagen et al.
  • ponatinib as the most selective inhibitor of FGFR, inhibits phosphorylation of FGFR with an IC50 in the range of 3-18 nmol / L, and FRS2 only 33-40 nmol / L (Gozgit et al. 2012); highly selective inhibitor of AZD4547, suppressing the activity of FGFR2 with IC50 within 2 nmol / l, inhibits the activity of FRS2 when using a concentration of 100 nmol / l (Gavine et al. 2012). That is, existing inhibitors have a weak indirect inhibitory effect on FRS2, moreover, they do not cause a violation of the interaction of FGFR with FRS2.
  • the present invention describes inhibitors whose mechanism of action includes all of the following:
  • the inhibitors described in the invention disrupt the interaction of FGFR with FRS2, which significantly affects the protein FRS2, the activity of which is reduced (Example 1).
  • the most important in the mechanism of action of the described inhibitors is the lack of influence on the activity of total FGFR, as well as the intracellular part of the receptor represented by tyrosine kinase, and the absence of influence on the activity of other receptors with tyrosine kinase activity (Example 2).
  • the described inhibitors do not interact with the active center of FGFR and do not interfere with the connection of FGFR with the ligand (Example 3).
  • the described inhibitors may not directly affect other components of the RAS-RAF-MAP and PDK-AKT-mTOR signaling pathways, which characterizes their selective effect only with respect to the interaction of FGFR and FRS2 (Examples 4, 5).
  • action against one or more components of the signaling pathways cannot be excluded (Example 6). However, this can be both an independent influence on the structure of the signal path component, and consequence of blocking OPOP-FRS2.
  • the described inhibitors can disrupt the complex of FRS2 with Shp2 and / or Grb2, which can lead to increased action, but is not necessary, since the main thing in limiting signal conduction is blocking the interaction of OPOP-FRS2 (Example 7).
  • the described inhibitors can inhibit only one type of FGFR, as described in Example 8 for FGFR2, or several (Example 6). The dependence of the inhibitor activity on the isoform of a certain type of FGFR in most cases should be excluded (Example 9).
  • Such selective disruption of the interaction of FGFR and FRS2 leads to the necessary therapeutic effects of the described inhibitors, for example, to suppress proliferation and migration of endothelial cells, the formation of tubular structures of the vessel, the growth of mature vessels (Examples 10 and 11), to inhibit the proliferation of tumor cells (Example 12), to inhibition of tumor growth (Example 13), to the development of necrosis in the tumor (Example 14), to inhibition of the development of other diseases (Example 15).
  • the selective effect of the described inhibitors and the absence of influence on other targets leads to a decrease in pronounced toxicity, which is extremely important when using therapeutic agents (Example 16).
  • the main object of the present invention is the use of inhibitors that selectively disrupt the interaction of the fibroblast growth factor receptor with FRS2, as well as interaction with other components of the FRS2 complex, with the properties described above.
  • An example of such an inhibitor that disrupts the interaction of type 2 FGFR and FRS2 can be a substance defined by chemical Formula I.
  • RI, R 2 , R 3 , R-R 5 , R6, R7 S Rs, 9, Rio may be the same or different and may independently include the groups —NH 2 , —N0 2 , —CH 3 , —CH 2 NH 2 , -F, -CI, -Br, -I, -CF 3 , -OCH 3 , -
  • C 2 H 5 , -H substituted or unsubstituted primary, secondary or tertiary alkyl groups, substituted or unsubstituted aryl groups, substituted or unsubstituted alkenyl groups, substituted or unsubstituted alkynyl groups, substituted or unsubstituted heterocyclic groups, substituted or unsubstituted heterocyclylalkyl groups, substituted or unsubstituted alkoxyalkyl groups, substituted or unsubstituted aryloxyalkyl groups, substituted or unsubstituted heterocyclyloxyalkyl groups.
  • X may be represented by CHjN or CH or N.
  • the chemical substance RPT835 shown by Formula II and relating to 3 - can be represented - (pyridin-3-yl) phenyl) sulfamoyl) benzoic acid.
  • the inhibitor described in the invention can combine several components selected from Formulas I, II, III, IV, V.
  • the chemical formula of such a combined substance can be, for example, such (Formula VI).
  • An inhibitor that interferes with the interaction of the fibroblast growth factor receptor and FRS2 can be selected from any class of substances described by Formula VII.
  • Ri, R 2 , R 3 , R4, R 5 , R6, R7, R 8 , R9 may be the same or different and may independently include the groups —NH 2 , —CH 2 NH 2 , —N0 2 , —CH 3 , - F, —CI, —Br, —I, —CF 3 , —OCH 3 , —C 2 H 5 , —H, substituted or unsubstituted primary, secondary or tertiary alkyl groups, substituted or unsubstituted aryl groups, substituted or unsubstituted alkenyl- groups, substituted or unsubstituted alkynyl groups, substituted or unsubstituted heterocyclic groups, substituted or unsubstituted heterocyclylalkyl groups, substituted or unsubstituted alkoxyalkyl groups, substituted e or unsubstituted aryloxyalkyl groups, substituted or unsubstit
  • Formula VII class chemicals are 3- (3-oxo-1,2,3,4-tetrahydroquinoxaline-1-carbonyl) benzoic acid (Formula VIII) and 3- (2-methyl- 3-oxo-1,2,3,4-tetrahydroquinoxaline-1-carbonyl) benzoic acid (Formula IX).
  • An inhibitor that interferes with the interaction of the fibroblast growth factor receptor and FRS2 can also be selected from any class of substances described by Formula X.
  • Ri, R 2 , R3, R4, R 5 , I b , R7, R 8 , R9, Rio, Ri i may be the same or different and may independently include the groups —NH 2 , —CH 2 NH 2 , —N0 2 , —CH 3 , —F, —CI, —Br, —I, —CF 3 , —OCH 3 , —C 2 H 5 , —H, substituted or unsubstituted primary, secondary or tertiary alkyl groups, substituted or unsubstituted aryl groups, substituted or unsubstituted alkenyl groups, substituted or unsubstituted alkynyl groups, substituted or unsubstituted heterocyclic groups, substituted or unsubstituted heterocyclylalkyl groups, substituted or unsubstituted alkoxyalkyl groups, for eschennye or unsubstituted aryloxyalkyl
  • the inhibitor may include all the structures described in formulas I-XI and be a combined substance.
  • Chemicals according to formulas I, II, III, IV, V, VI, VII, VIII, IX, X, XI may be represented by a pharmaceutically acceptable salt, tautomer, pharmaceutically acceptable salt of the tautomer or a combination thereof.
  • inhibitors described in the present invention in therapeutic practice, their administration to a mammal, preferably to a human, is required in a pharmaceutically acceptable form, including intravenous administration, as well as in the following ways: oral, intramuscular, subcutaneous, intraperitoneal, intracerebrospinal, intraarticular, intrasynovial, intrathecal, local or inhaled.
  • Inhibitors can also be administered by the intratumoral, peritumoral, intrafocal and focal pathways to provide local action along with a systemic therapeutic effect.
  • Such administration forms include pharmaceutically acceptable carriers that are inherently neither toxic nor therapeutic.
  • Excipients that are used to prepare a drug based on the inhibitor described in the invention, depending on the effect on the physicochemical characteristics and pharmacokinetics of dosage forms, can be divided into the following groups:
  • Media may be used.
  • carriers are ion exchange agents, alum, aluminum stearate, lecithin, plasma proteins (such as human plasma protein), buffering agents such as phosphates, glycine, sorbic acid, potassium sorbate, partial glyceride mixtures of saturated vegetable fatty acids, water, salts or electrolytes such as protamine sulfate, sodium hydrogen phosphate, potassium hydrogen phosphate, sodium chloride, zinc salts, colloidal silicon oxide, magnesium trisilicate, polyvinylpyrrolidone, cellulose-based substances and polyethylene glycol.
  • buffering agents such as phosphates, glycine, sorbic acid, potassium sorbate, partial glyceride mixtures of saturated vegetable fatty acids, water, salts or electrolytes such as protamine sulfate, sodium hydrogen phosphate, potassium hydrogen phosphate, sodium chloride, zinc salts, colloidal silicon oxide, magnesium trisilicate, polyvinylpyrrolidone, cellulose
  • Carriers for local or gel-based antagonist forms include polysaccharides, such as sodium carboxymethyl cellulose or methyl cellulose, polyvinylpyrrolidone, polyacrylates, polyoxyethylene polyoxypropylene block polymers, polyethylene glycol and alcohols.
  • polysaccharides such as sodium carboxymethyl cellulose or methyl cellulose
  • polyvinylpyrrolidone polyacrylates
  • polyoxyethylene polyoxypropylene block polymers polyethylene glycol and alcohols.
  • conventional dosage forms obtained from warehouses are used.
  • Such forms include, for example, microcapsules, nanocapsules, liposomes, patches, inhalation preparations, aerosols, sublingual tablets, and sustained release preparations.
  • sustained release formulations include semipermeable matrices of solid hydrophobic polymers containing an inhibitor; such matrices have a certain shape, for example, it can be films or microcapsules.
  • sustained release matrices include polyesters, hydrogels [eg, poly (2-hydroxyethyl-methacrylate)] described by Langer et al. (J. Biomed. Mater. Res. 15, 167 (1981) and Langer (Chem. Tech. 12 (1982)) or poly (vinyl alcohol ), polylactides (US Pat. No. 3,773,919), copolymers of L-glutamic acid and gammaethyl L-glutamate described by Sidman et al.
  • stabilization can be achieved by modifying sulfhydryl residues, lyophilizing to remove acidic solutions, controlling moisture content, using appropriate additives, and developing specific polymer matrix compositions.
  • Constant-release inhibitor formulations also include liposome confinement.
  • Liposomes containing inhibitors can be obtained by methods known in the art, such as those described by Epstein et al. (Proc. Nat. Acad. Sci. 82, 3688 (1985); Huang et al. (Procc. Nat. Acad. Sci. 77, 4030 (1980); US Pat. No. 4,485,045 and US Pat. No. 4,544,545.
  • Liposomes are generally small (about 200-800 angstroms) and belong to a single layer type in which the lipid content is higher than 30 mol% cholesterol; the ratio selected may vary to suit the optimal treatment conditions. Long-circulating liposomes are covered by US Pat. 5013556,
  • Another way of using this invention is the incorporation of an inhibitor into products having a specific shape.
  • Such products can be used to modulate endothelial cell growth and angiogenesis.
  • such products can be used to modulate the invasion of tumors and metastases.
  • the described inhibitor can be used in various modes in combination with other therapeutically active and / or adjuvant drugs to enhance therapeutic effect, as well as to reduce the frequency of side effects and adverse events.
  • the required dose of the described inhibitor will depend on the type of disease, on its severity and course, on whether the inhibitor is administered for prophylactic or therapeutic purposes, on previous therapy, on the patient’s medical history and its response to the inhibitor, and on the directions the attending physician.
  • the inhibitor can be administered to the patient in various ways, at a time or as a series of appointments, over a period of time when the inhibitor therapy will be considered effective according to the standard criteria of effectiveness used in practice at the time the inhibitor is prescribed.
  • Tumors and related conditions that can be treated with this, for example, include breast cancer, non-small cell and small cell lung cancer, tracheal tumors, stomach cancer, esophageal cancer, colorectal cancer, liver cancer, pancreatic cancer, gall bladder and biliary tract tumors, gastrointestinal tumors, ovarian cancer, cervical cancer, uterine body cancer, endometrial hyperplasia, endometriosis, sarcomas, head and neck tumors, hepatoblastoma, melanoma, skin cancer, hemangioma, cavernous hemangioma, hemangioblastoma, adrenal cancer cervical, retinoblastoma, astrocytoma, glioblastoma, schwannomas, oligodendrogliomas, medulloblastomas, neuroblastomas, rhabdomyo
  • non-oncological diseases including such as rheumatic diseases, cardiovascular diseases, including atherosclerosis, respiratory diseases, digestive diseases, kidney diseases, including glomerulonephritis, skin diseases, including psoriasis, diabetic and other retinopathies, fibroplasias, neovascular glaucoma, endocrine and metabolic diseases, transplantation of the cornea and other tissues, chronic inflammation, ascites, preeclampsia, pericardial effusion (for example, associated with pericarditis) and pleural effusion, neurological diseases.
  • non-oncological diseases including such as rheumatic diseases, cardiovascular diseases, including atherosclerosis, respiratory diseases, digestive diseases, kidney diseases, including glomerulonephritis, skin diseases, including psoriasis, diabetic and other retinopathies, fibroplasias, neovascular glaucoma, endocrine and metabolic diseases, transplantation of the cornea and other tissues, chronic inflammation, ascites,
  • the initial dose for administration to the patient will be from 0.001 mg / kg to 200 mg / kg, or more preferably from 1 mg / kg to 100 mg / kg, or even more preferably from 10 mg / kg to 50 mg / kg, and may be administered by one or many separate administrations / administrations or by continuous infusion.
  • a typical daily dose may vary from about 1 mg / kg to 100 mg / kg or more, depending on the above factors.
  • treatment is repeated until the desired suppression of the symptoms of the disease is achieved.
  • other dosage regimens may also be used. The success of treatment is easily determined by conventional methods and analyzes, for example, X-ray imaging of tumors.
  • the effectiveness of an inhibitor in the prevention or treatment of diseases can be improved by administering the inhibitor serially or in combination with another substance effective for this purpose, such as, for example, tumor necrosis factor, interferons, interleukins; monoclonal antibodies, traps of growth factors (traps) and other inhibitors capable of neutralizing or inhibiting the activity of vascular endothelial growth factor and / or its receptors and / or hepatocyte growth factor and / or its receptors and / or epidermal growth factor and / or its receptors and / or placental growth factor and / or its receptors and / or insulin-like growth factor and / or its receptors and / or fibroblast growth factor and / or its receptors and / or mTOR and / or other intracellular kinases, or one or more conventional therapeutic in stances, such as, for example, alkylating agents, antibiotics, antimetabolites, anthracyclines, vinca alkaloids, epipod
  • inhibitors described in the invention with anti-inflammatory drugs, drugs for the treatment of cardiovascular disease.
  • drugs for the treatment of cardiovascular disease may be present in the composition to be administered or may be administered separately.
  • the inhibitor according to the method can be administered serially or in combination with radiological treatment.
  • One inhibitor or more is administered to a patient with a tumor in therapeutically effective doses determined, for example, by observing tumor necrosis or its metastatic foci, if any. Such therapy continues until further improvement ceases to be observed, or clinical examination shows that the tumor or its metastases have disappeared. With the progression of the disease, one or more of the substances described above (o) are introduced or other treatment methods are used. Since the effectiveness of additional substances will vary, it is advisable to compare their effect on the tumor by standard screening. Repeated administration of the inhibitor and additional agent is carried out until the desired clinical effect. Alternatively, the inhibitor (s) are administered together and, if desired, together with additional substances. When inhibitors treat other diseases, for example, rheumatoid diseases, standard scales for assessing the therapeutic effect are used.
  • the inhibitors described in the invention can be used with supportive and accompanying drugs, for example, with erythropoietins, drugs that stimulate leukopoiesis or increase the number of platelets and / or neutrophils, macrophages, with nutritional support, non-steroidal anti-inflammatory drugs, blood components, corticosteroid acid, antibodies against RANKL, antiemetic drugs and others.
  • supportive and accompanying drugs for example, with erythropoietins, drugs that stimulate leukopoiesis or increase the number of platelets and / or neutrophils, macrophages, with nutritional support, non-steroidal anti-inflammatory drugs, blood components, corticosteroid acid, antibodies against RANKL, antiemetic drugs and others.
  • Example 1 disruption of the interaction of FGFR2 with FRS2 with the addition of an RPT835 inhibitor
  • RPT835 inhibitor characterized by Formula II in the present invention on the phosphorylation of FRS2
  • gastric cancer cells CATO III that express FRF2 were used.
  • FGF-2 at a concentration of 1 mg / ml and heparin 10 mg / ml were added to the cells.
  • RPT835 was added in various concentrations. Some of the cells were left without the addition of an inhibitor, and some of the cells were left without the addition of both an inhibitor and stimulating agents (control groups).
  • FGF stimulates the entire signaling pathway from the FGF receptor to intracellular kinases, including the interaction of FGFR and FRS2.
  • the RPT835 inhibitor does not affect the activity of FGFR, but leads to a disruption in the interaction of FGFR and FRS2, which in turn affects the suppression of the activity of FRS2 in nanomolar concentration.
  • gastric cancer cells CATO III strongly expressing FGFR2 were used. Some cells were stimulated with FGF-2 at a concentration of 1 mg / ml and heparin 10 mg / ml, another part of the cells was left without stimulation. An RPT835 inhibitor was added to the cells at a dose of 1, 10, 100, 1000 pM. The control group was left without the addition of RPT835.
  • Phosphorylation of RFFR was assessed using standard Western blotting and automatic capillary electrophoresis with immunodetection and using an automatic Wes TM system (ProteinSimple; SantaClara, CA).
  • the RPT835 inhibitor had no effect on the phosphorylation of FGFR2 stimulated by FGF-2 ( Figure 4), that is, it did not exhibit tyrosine kinase inhibitory activity even at the maximum concentration.
  • a non-radioactive enzyme-linked immunosorbent assay (non-radioactive enzyme linked FGF2 binding assay) was performed.
  • a recombinant chimeric protein FGFR2-Pc which consisted of human extracellular domain ⁇ 2 ⁇ (Sch) and the Fc fragment of human IgG).
  • ⁇ 2 ⁇ contained all 3 immunoglobulin-like domains and represented the Schw domain of FGFR2 with high affinity for FGF-2.
  • the RFFR2-Pc protein was coated on a 96-well plate, then the following was added to the wells:
  • OD 650 optical density at a wavelength of 650 nm
  • the next task was to evaluate the effect of the RPT835 inhibitor on the binding of FGF-2 and FGFR-Pc.
  • RPT835 at concentrations of 1 to 1000 pM did not affect ligand binding to the receptor ( Figure 6A).
  • another enzyme-linked immunosorbent assay was performed in which the wells were coated with an immobilized anti-FGF-2 antibody.
  • FRF-2 ⁇ RPT835 was added to the wells in various concentrations.
  • RPT835 at concentrations of 1 to 1000 pM did not affect the binding of FGF-2 to anti-FGF-2 antibody ( Figure 6B).
  • RPT835 inhibitor given as an example in the present invention, does not interfere with the binding of the ligand (i.e., FGF-2) to its receptor (i.e., FGFR2).
  • Example 4 (Research Results): violation of the interaction of FGFR with FRS2 when using inhibitors defined by formulas V, IX, XI Inhibitors V, IX, XI, defined in the present invention by the corresponding formulas V, IX, XI, also disrupt the signal transmission from RFFR to FRS2.
  • Snul6 gastric cancer cells expressing FGFR2 were cultured according to standard procedures. Part of the cells was left as a negative control, and FGF-2 (positive control) was added to another part.
  • Therapeutic groups included: the addition of an inhibitor according to formula V and the subsequent stimulation of FGF-2, the addition of an inhibitor according to the formula IX and the subsequent stimulation of FGF-2, the addition of an inhibitor according to the formula XI and the subsequent stimulation of FGF-2.
  • Western blotting was used to assess the phosphorylation level of various kinases.
  • the substances described in formulas V, IX, XI are selective inhibitors of the interaction of FGFR2 and FRS2, which affects the proliferative activity of tumor cells expressing FGFR.
  • Example 5 (Research Results): Assessing the Effect of the Inhibitors of the Invention on Various Intracellular Kinases
  • the level of phosphorylation of intracellular kinases was evaluated, namely, p44 / 42 (MAPK), Akt, mTOR, p70S6.
  • gastric cancer cells CATO III that express RFFR2 were used.
  • FGF-2 was added at a concentration of 1 mg / ml and heparin 10 mg / ml.
  • RPT835 was added in various concentrations. Some of the cells were left without the addition of an inhibitor, and some of the cells were left without the addition of both an inhibitor and stimulating agents (control groups).
  • RPT835 does not affect the phosphorylation of other intracellular kinases.
  • HUVEC endothelial cells Caki-1 type human renal cell carcinoma cancer cells, CATO III stomach cancer cells. All of these cells expressed different types of these receptors.
  • FGF-2 and / or VEGF-A some of the cells were cultured with the inhibitor described by formula VIII, some of the cells were left without stimulation and treatment.
  • FGF-2 strongly stimulated the phosphorylation of all three types of FGFR, as well as PI3K,
  • VEGF-A had no effect on type-FGFR 1-3 and FRS2 (P> 0.3 for all comparisons), but significantly increased the level of phosphorylation of VEGFR1, mTOR, RBC,
  • Example 7 the inhibitors described in the invention can disrupt the complex of FRS2 with Shp2 and / or Grb2
  • FRS2 interacts with Shp2 and Grb2, transmitting a signal to intracellular kinases through these proteins.
  • the aim of this study was to prove that the inhibitors described in the invention can affect the interaction of FRS2 with Shp2 and Grb2, but this is not their determining mechanism of action: the main mechanism is disruption of the interaction of FRGF and FRS2.
  • Gastric cancer cells Snul6 were seeded in 96-well plates with a volume of 90 ⁇ l / well. After 24 hours of incubation in a humidified incubator at a temperature of 37 ° C, 5% C0 2 and 95% air, the test solution dissolved by the formula VI was added to the cells in an amount of 100 ⁇ g / ml and then FGF-2 was added as a stimulant. After a day of cultivation by automated Western blotting in cells, the phosphorylation level of the following proteins was studied: FGFR2, FRS2a, FRS2, Shp2, Grb2. After another day of cultivation, the cells were counted.
  • the inhibitor according to formula VI did not inhibit the phosphorylation of RFFR2 (no differences with the control were revealed), however, it significantly reduced 12 times the phosphorylation of FRS2a and FRS2P (1C50 ⁇ 10 pM). In addition, in some cells, a significant inhibition of the phosphororylation of Shp2 and Grb2 proteins was noted (more than 10 times). In this regard, the cells were divided into two groups according to the phosphorylation factor of Shp2 and / or Grb2:
  • the determining factor that has an inhibitory effect on the proliferation of tumor cells is a violation of the interaction of FGFR and FRS2, while the phosphorylation of Shp2 and / or Grb2 may be different, which does not affect the suppression of proliferative activity by the inhibitor described in the invention.
  • the aim of this study was to evaluate the specific effect of the RPT835 inhibitor, designated by formula II in the present invention, on the interaction of FRGF2 and FRS2 and to assess the effect on the interaction of other types of FRGFR and FRS2.
  • RPT835 inhibitor designated by formula II in the present invention
  • the research methodology was the same as in the previous examples: cells were cultured in the presence of RPT835 followed by stimulation of FGF-2 and heparin. Another part of the cells was cultured in the absence of RPT835. Phosphorylation of FGFR1 (in breast cancer cells) and FGFR2 (in stomach cancer cells), as well as FRS2a (in both cell lines) and some intracellular kinases (in breast cancer cells) was evaluated using manual and automated Western blotting.
  • the RPT835 inhibitor completely reduced the phosphorylation of FRS2a (FRF2 system) to the initial level at a dose of 100 pM. More than 50% inhibition of FRS2a phosphorylation was observed at a concentration of 10 pM ( Figure 2). However, there was no effect on the kinase activity of the receptor itself ( Figure 3).
  • the RPT835 inhibitor did not affect the phosphorylation of FRS2a (FGFR1 system), as well as FGFR1 itself, as well as intracellular kinases ( Figure 9). As can be seen from the figure, a slight increase in the level of phosphorylation was noted for some intracellular kinases and FGFR 1. Thus, this example confirms the selective effect of the RPT835 inhibitor and its activity in the RFFR2 system. The RPT835 inhibitor only affects the disruption of the interaction of FGFR2 with FRS2 and does not affect the interaction of other types of FGFR with FRS2.
  • Example 9 the inhibitors described in the present invention are active regardless of the isoform of FGFR
  • the RPT835 inhibitor significantly inhibited the proliferation of cells of both lines expressing FGFR2 Sch or FGFR2 Sch ( Figure 10). When assessing the level of FRS2a phosphorylation, there were no significant differences between these groups either - the inhibitor completely inhibited phosphorylation ( Figure 11).
  • the RPT835 inhibitor described in the present invention is active against any isoforms within the same type of FGFR.
  • mice 18 mice of hybrids of the 1st generation Fl (C57B1 / 6 x DBA / 2), males weighing 22-30 g.
  • Mice (item number m02.13.0001 1) were obtained from a branch of the Stolbovaya nursery. In the experiment used the technique described previously [Passaniti A., 1992]. In the control and experimental groups there were at least 3 mice. Aliquots (1000 ⁇ l) of Matrigel (BD Biosciences) containing heparin 60 UE / ml, VEGF (200 ng / ml, BD Biosciences) or bFGF (100 ng / ml, BD Biosciences) were prepared on ice.
  • Matrigel BD Biosciences
  • Matrigel containing heparin 60 UE / ml was used as a negative control.
  • Matrigel injection was given to mice subcutaneously in the lateral back. After the injection, Matrigel quickly forms a single, solid gel-like implant. A portion of the inhibitor was dissolved in DMSO to a concentration of 10 " M. Aliquots were frozen at -20 ° C and thawed immediately prior to administration. The solution was not allowed to re-freeze.
  • the test and standard objects were injected intraperitoneally on days 0, 3 and 6 of Matrigel implantation: Bevacizumab at a dose of 10 mg / kg and RPT835 - 15 mg / kg. The groups are described in Table 2. 7 days after Matrigel administration, mice were euthanized with ether to remove the implant. The implants were fixed for 24-36 hours in 10% neutral formalin and enclosed in paraffin for further histological examination.
  • the study found that when administered three times at a dose of 15 mg / kg, the RPT835 inhibitor statistically significantly blocks angiogenesis stimulated by bFGF.
  • Bevacizumab in the same regimen was effective against VEGF-stimulated angiogenesis, but not when using bFGF.
  • RPT835 as an example of the inhibitors described in the present invention, is a promising anti-angiogenic substance with an independent mechanism of action.
  • Example 11 Comparison of the Effects of the Inhibitors of the Present Invention and the Typical ⁇ / VEGFR Tyrosine Kinase Inhibitor - Brivanib on the Proliferative Activity of Endotheliocytes
  • HUVEC endothelial cells were seeded in 96-well plates and cultured for 24 hours. After that, the cells were added:
  • the inhibitors described in the present invention had a pronounced antiproliferative effect on endothelial cells, in contrast to the typical tyrosine kinase inhibitor ⁇ / VEGFR brivanib.
  • Example 12 (Research Results): Effect of an RPT835 Inhibitor on the Proliferation of Tumor Cells with Different Expression of FGFR in Vitro
  • SKOV3 ovarian cancer, ATCC # NTV-77
  • HS578T breast cancer, ATCC # NTV-126
  • T47D breast cancer, ATCC # NTV-1336
  • a modified non-small cell line lung cancer A549 Mel Kog metastatic skin melanoma line
  • RF patent N ° 2287578 a modified non-small cell line lung cancer A549
  • RF patent N ° 2287578 a modified non-small cell line
  • the SVEC-4-10 cell line endothelial cells, ATCC # CRL-2181.
  • Cells were cultured in RPMI-1640 medium (PANECO) (SKOV3, HS578T, T47D, Mel-Kor) or DMEM (PANECO) (SVEC-4-10) containing 10% fetal bovine serum (FCS, HyClone), 2mM glutamine (PANECO), antibiotics (100 IU / mL of penicillin and 100 mg / ml streptomycin (all PANECO)) at 37 ° C and 5% C0 2 . For experiments, cells were used at 70-80% monolayer.
  • Cells were plated at low density (30t cells / ml) in triplets on a 96-well plate in a medium containing 0.1% FCS serum. The next day, the tested RPT835 inhibitor was added to the wells in the required concentrations, and after 6 hours the fibroblast growth factor (100 ng / ml bFGF (BD Bioscience)) was added. The environment, antibiotics and drugs were changed every 3 days. Cell growth was determined by a modified Crystal Violet mitogenic method on day 7 after the start of the experiment. Cells were washed with PBS, fixed with 1% parapharmaldehyde on PBS and stained with 0.5% solution of Crystal Violet (Crystal Violet, Sigma Chemical Co) on ethanol.
  • Crystal Violet Crystal Violet
  • the dye was dissolved in ethanol and measured on a spectrophotometer at 540-560 nm.
  • the cell proliferative activity inhibition curve was constructed according to the percentage of the number of cells (ordinate axis) versus the concentration of the RPT835 inhibitor in the plate well (abscissa axis). The concentration of samples, starting from which the percentage of surviving cells became less than 50% (1C 50 ), was calculated using the GraphPad Prizm 5 program. The experiments were repeated at least 3 times in three replicates in the experiment.
  • the Figure 15 shows the antiproliferative effect of the compound RPT835 on in vitro tumor and endothelial cell cultures.
  • the RPT835 inhibitor inhibited the antiproliferative activity of tumor and endothelial cells to varying degrees.
  • the degree of inhibition of proliferation depended on the expression status of FGFR2: the stronger the receptor was expressed, the more effective the RPT835 inhibitor.
  • the maximum inhibitory effect was noted when using the line SVEC-4-10, which strongly expresses FGFR2.
  • a moderate proliferation effect was detected in cells with low FRGF-2 expression of SKOV3 and HS578T.
  • the studied RPT835 inhibitor did not block the proliferative activity of the Mel Kog metastatic melanoma cell line and T47D breast cancer, which practically did not express FRGF2.
  • mice 8 weeks old were injected with 2x10 6 tumor cells of human cell lines with different expression of FGFR2:
  • mice After the growth of the tumor was established (1 mm), the mice were divided into control and treatment groups according to the type of tumor.
  • Tumor size and animal weight were measured every 3 days. Mice underwent euthanasia when the tumor reached a size of 2000 mm 3 or on day 60 of the experiment.
  • the tumor growth graph in groups 1 is shown in Figure 16, the tumor volume is shown in Table 3.
  • mice that were injected with an RPT835 inhibitor significant inhibition of the aggressive growth of SUM52PE tumor was observed ( ⁇ , ⁇ , starting from day 16 of the experiment).
  • the average tumor volume in the groups differed by more than 2 times and amounted to 2712.2 ⁇ 37 mm3 in the control group and 1080.7 ⁇ 49 mm3 in the treatment group. Inhibition of tumor growth was 60.2%.
  • mice from the control group were euthanized. Observation of the mice from the treatment group was continued.
  • the RPT835 inhibitor demonstrated antitumor efficacy in an in vivo experiment against triple-negative breast cancer SUM52PE, strongly expressing FGFR2.
  • the growth graph of the tumor in groups 2 is presented in Figure 17.
  • the RPT835 inhibitor also exhibited some inhibition of tumor growth in triple-negative breast cancer HS578T, which weakly expresses FGFR2.
  • the differences were less significant than when using the RPT835 inhibitor in a triple-negative breast cancer model with strong expression of FGFR2.
  • the growth graph of the tumor in groups 3 is presented in Figure 18.
  • Immunodeficient mice (Nude, mice were 8 weeks old at the start of treatment; Pushchino nursery) were subcutaneously transplanted with FRFR-2 cells of the SKOV-3 expressing human ovarian cancer line. Upon reaching an average tumor volume of 200 mm3, the mice were randomized into control groups (standard chemotherapy with paclitaxel and caroplatin) and treatment (RPT835 inhibitor). There were 10 mice in each group. An RPT835 inhibitor was administered at a dose of 50 mg / kg daily. Tumor volume was measured twice a week. When the tumor volume reached 2000 mm3, the mice underwent euthanasia. A study was made of the pathomorphism of tumor tissue.
  • the RPT835 inhibitor causes therapeutic pathomorphism of some tumors, in particular, ovarian cancer.
  • Example 15 Results of the in vivo study: the effectiveness of the inhibitors described in the present invention, in rheumatic diseases
  • mice On the 41st day, the mice were euthanized, the tissue was studied.
  • the inhibitors described in the invention can be effective in rheumatic diseases and connective tissue diseases.
  • Example 16 Results of the in vivo study: the inhibitors described in the present invention are not accompanied by the development of severe toxicity
  • the toxicity of the RPT835 inhibitor was evaluated in the in vivo studies described in Example 13. According to the standard method, all adverse events were evaluated, as well as the weight loss of the animals when using the inhibitor compared with the control group. Neither weight loss nor any undesirable side effects of therapy were detected in these studies.
  • the acute toxicity of an RPT835B inhibitor was studied in the following scope: - investigated the acute toxicity of the drug.
  • the results of toxicometry, observation of experimental animals for 14 days after acute administration, as well as necropsy data make it possible to classify the drug as class IV low toxicity (N. Hodge et al. Clinical Toxicology of Commercial Products. Acute Poisoning. Ed. IV, Baltimore, 1975 , 427 p .; KK Sidorov, 1977).
  • the condition of the animals after acute administration indicates good tolerability of the drug in doses exceeding the maximum therapeutic (about 4.3 ⁇ g / kg) tens to hundreds of times.
  • the median lethal dose (LD 50 ) was more than 2000.0 mg / kg;
  • the drug does not have an irritating effect on the mucosa of the gastrointestinal tract with a single injection;
  • the drug does not exhibit allergenic properties detected in the reaction of immune complexes, general anaphylaxis, mast cell degranulation and conjunctival test.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Nitrogen And Oxygen Or Sulfur-Condensed Heterocyclic Ring Systems (AREA)
  • Steroid Compounds (AREA)
  • Pyridine Compounds (AREA)

Abstract

Изобретение относится к медицине и включает использование ингибиторов, которые избирательно нарушают взаимодействие рецептора фактора роста фибробластов с FRS2, а также взаимодействие с другими компонентами комплекса FRS2. Применение селективных ингибиторов, описанных в настоящем изобретении, приводит к достоверному повышению противоопухолевой эффективности по сравнению с другими ингибиторами и моноклональными антителами, снижению токсичности проводимого лечения, возможности использовать низкую концентрацию агента для полного блокирования, проводить длительное лечение. Преимущество изобретения заключается в разработке нового класса лекарственных препаратов для лечения злокачественных новообразований и других болезней.

Description

СЕЛЕКТИВНЫЕ ИНГИБИТОРЫ, НАРУШАЮЩИЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ РЕЦЕПТОРА ФАКТОРА РОСТА ФИБРОБЛАСТОВ И FRS2, ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ
РАКА И ДРУГИХ ЗАБОЛЕВАНИЙ
Описание
Краткое описание изобретения
Изобретение относится к медицине и включает использование ингибиторов, которые избирательно нарушают взаимодействие рецептора фактора роста фибробластов с FRS2, а также взаимодействие с другими компонентами комплекса FRS2. Применение селективных ингибиторов, описанных в настоящем изобретении, приводит к достоверному повышению противоопухолевой эффективности по сравнению с другими ингибиторами и моноклональными антителами, снижению токсичности проводимого лечения, возможности использовать низкую концентрацию агента для полного блокирования, проводить длительное лечение. Преимущество изобретения заключается в разработке нового класса лекарственных препаратов для лечения злокачественных новообразований и других болезней.
Полное описание изобретения
Известно, что в основе развития злокачественных новообразований лежит избыточная пролиферация клеток, а также образование кровеносных сосудов в опухоли, через которые происходит ее питание (ангиогенез) (J. Folkman et al. Nature; 339, 58 (1989). Образование новых кровеносных сосудов происходит из уже существующего эндотелия и является важным компонентом многих заболеваний и нарушений, в том числе таких, как рост и метастазирование опухолей, ревматоидный артрит, псориаз, атеросклероз, диабетическая ретинопатия, ретролентальная фиброплазия, неоваскулярная глаукома, гемангиомы, иммунное отторжение трансплантированной роговицы и других тканей, а также хронические воспаления.
Пролиферация клеток опухоли, равно как и эндотелиальных клеток, может быть вызвана различными факторами, которые естественным образом встречаются в природе. Данные факторы связываются с рецепторами на поверхности опухолевых, эндотелиальных и других клеток, что приводит к активации рецепторов и проведению сигнала внутрь клетки с последующим делением.
По многочисленным данным, рецепторы с фактора роста фибробластов (ФРФР) часто экспрессированы на клетках опухолей, что приводит к пролиферации клеток самой опухоли и эндотелиоцитов, способствует опухолевой прогрессии. Зачастую активирующие мутации ФРФР также изменяют течения болезни и чувствительность к проводимой терапии.
Семейство ФРФР участвует в физиологических процессах, таких как ангиогенез, миграция, пролиферация, дифференцировка и выживаемость различных клеток.
Семейство насчитывает 18 факторов, которые условно можно разделить на две группы: классические (ФРФ1-10, 16-18 и 20) и гормоноподобные (ФРФ19,21 и 23) [Beenken et al. 2009]. Фактор роста фибробластов (ФРФ) связывается специфически с ФРФР, представленными пятью типами. ФРФР 1-4 типов являются типичными рецепторами с тирозинкиназной активностью, то есть внутриклеточная часть представлена тирозинкиназой. В основе процессов активации тирозинкиназы и дальнейшей передачи сигнала внутри клетки лежат процессы фосфорилирования, присущие для всех подобных рецепторов. Экстрацеллюлярная часть ФРФР состоит из 3 иммуноглобулин-подобных доменов; II и III домены содержат лиганд-связывающий регион. Благодаря альтернативному сплайсингу, домен III изменяет форму и находится в двух состояниях - ШЬ и Шс. Это может влиять на силу связывания с лигандом и активность терапевтических агентов, направленных против рецептора [Eswarakumar et al. 2005; Brooks et al. 2012]. Более того, существуют сведения о различной пролиферативной активности клеток опухоли при связывании ФРФ с различными субъединицами домена Шс - 1а или 1β [Tomlinson et al. 2010]. ФРФ относятся к группе гепаринсвязывающих белков. Для того чтобы передать сигнал в клетку и активировать внутриклеточные процессы, ФРФ должен связаться с рецептором и гепаран сульфатом (гепарином) на поверхности клетки [Abuharbeid et al. 2006]. Это отличает механизм активации рецептора ФРФ от других факторов, в частности VEGF, для которого гепаран сульфат не нужен. Гормоноподобные ФРФ имеют низкую аффинность к гепаран сульфату. При связывании ФРФ с рецептором происходит активация основных внутриклеточных путей RAS-RAF-MAPK и PI3K-AKT- mTOR с распространением сигнала в ядро [Turner et al. 2010]. Главным компонентом передачи сигнала с ФРФР к внутриклеточным киназам является белок FRS2 [Ong et al. 2000; Kouhara et al. 1997]. FRS2 - якорный белок ("docking protein"), активирующийся при связывании ФРФР с лигандом и формирующий комплекс с Shp2 и Grb2, в связи с чем активация FRS2 приводит к активации обоих сигнальных путей RAS-RAF-MAPK и PI3K- AKT-mTOR.
В настоящее время создано большое количество таргетных препаратов, блокирующих/ингибирующих активность различных типов ФРФР. К ним относятся ингибиторы тирозинкиназы, а также моноклональные антитела. Существующие ингибиторы тирозинкиназы снижают активность внутриклеточной тирозинкиназы путем блокирования различных активных частей одного или, как правило, нескольких рецепторов. Неизбирательное блокирование сопряжено со снижением эффективности воздействия на опухолевые клетки, клетки сосудов, а также другие структуры, экспрессирующие соответствующий тип рецептора. Известно, что эффективность терапевтических моноклональных антител, направленных против ФРФР, может существенно снижаться, если домен III рецептора ФРФ меняет форму (ШЬ и Шс) [Wesche et al. 201 1 ; Tsimafeyeu et al. 2012]. Тоже самое происходит, если ФРФР существует на клетке в различных изоформах [Dienstmann et al. 2013]. Существующие низкомолекулярные ингибиторы тирозинкиназы не обладают селективным действием в отношении одного типа рецептора ФРФ, блокируют несколько типов ФРФ, а также другие рецепторы. Так, бриваниб, доватиниб ингибируют ФРФР и рецепторы фактора роста эндотелия сосудов [Ayers et al. 2007; Sarker et al. 2008], понатиниб, BGJ398, AZD4547, J J-42756493, BAY 1163877 ингибируют несколько типов ФРФР и, хоть в меньшей степени, но также рецепторы фактора роста эндотелия сосудов и некоторые другие киназы [Gozgit et al. 2012; Arai et al. 2014; Gavine et al. 2012; Perera et al. 2014; Heroult et al. 2014]. При этом показано, что клетки определенной опухоли экспрессируют свой тип ФРФР (например, рак почки - ФРФР1 [Tsimafeyeu et al. 2011], люминальный тип рака молочной железы - ФРФР1 [Tenhagen et al. 2012], трижды-негативный рак молочной железы - ФРФР2 [Tannheimer et al. 2000], рак желудка - ФРФР2 [Xie et al. 2013], рак мочевого пузыря - ФРФРЗ [Gust et al. 2013] и т.п.). Следовательно, одновременное блокирование нескольких типов ФРФР не требуется и может приводить не только к повышению токсичности, но и к снижению эффективности. Во многих работах показано, что существующие низкомолекулярные ингибиторы тирозинкиназы в наномолярных концентрациях подавляют активность внтуриклеточной тирозинкиназы ФРФР, при этом слабо влияют на фосфорилирование (активность) FRS2. Другими словами, взаимодействие между ФРФР и FRS2 даже при подавлении активности внутриклеточной тирозинкиназы ФРФР представляется важным, а его отсутствие может быть фактором резистентности. Так, например, сведений о действии бриваниба на FRS2 нет (Huynh et al. 2008); довитиниб влияет на фосфорилирование ФРФР 1/3 в наномолярной концентрации, и в меньшей степени подавляет активность FRS2 (Zhang et al. 2014); понатиниб, как наиболее селективный ингибитор ФРФР, ингибирует фосфорилирование ФРФР с IC50 в пределах 3-18 нмоль/л, a FRS2 - только 33-40 нмоль/л (Gozgit et al. 2012); высокоселективный ингибитор AZD4547, подавляя активность ФРФР2 с IC50 в пределах 2 нмоль/л, угнетает активность FRS2 при использовании концентрации 100 нмоль/л (Gavine et al. 2012). To есть существующие ингибиторы имеют слабый опосредованный ингибирующий эффект на FRS2, тем более, не вызывают нарушение взаимодействия ФРФР с FRS2.
В настоящем изобретении описываются ингибиторы, механизм действия которых включает все из перечисленного:
1) нарушение взаимодействия ФРФР и FRS2, что в результате приводит к снижению фосфорилирования и потери активности FRS2, а также, возможно, но необязательно, нарушение взаимодействия с другими компонентами комплекса FRS2;
2) отсутствие влияния на внутриклеточную тирозинкиназу ФРФР и на фосфорилирование самого рецептора;
3) отсутствие воздействия на внутриклеточную тирозинкиназу других рецепторов с тирозинкиназной активностью и на их фосфорилирование;
4) не связываются с активным центром ФРФР и с активным центром других рецепторов;
5) избирательное нарушение взаимодействия FRS2 преимущественно с одним типом ФРФР, или в некоторых случаях - несколькими типами ФРФР;
Также подразумевается отсутствие ингибитор-обусловленной выраженной токсичности как результата селективного действия.
Описываемые в изобретении ингибиторы нарушают взаимодействие ФРФР с FRS2, что существенно влияет на белок FRS2, активность которого снижается (Пример 1). Важнейшим в механизме действия описываемых ингибиторов является отсутствие влияния на активность общего ФРФР, а также внутриклеточной части рецептора, представленной тирозинкиназой, и отсутствие влияния на активность других рецепторов с тирозинкиназной активностью (Пример 2). Это характеризует высокоселективное действие ингибиторов и подчеркивает значение нарушения взаимодействия ΦPΦP-FRS2 без необходимости блокировать киназную активность рецептора и другие механизмы. Важно отметить, что описываемые ингибиторы не взаимодействуют с активным центром ФРФР и не препятствуют связи ФРФР с лигандом (Пример 3).
Снижение активности FRS2 - основного проводника сигнала от рецептора к внутриклеточным белкам, приводит к подавлению сигнальной трансдукции внутри клетки. При этом описываемые ингибиторы могут не влиять непосредственно на другие составляющие сигнальных путей RAS-RAF-MAP и PDK-AKT-mTOR, что характеризует их избирательное действие только в отношении взаимодействия ФРФР и FRS2 (Примеры 4, 5). Для некоторых типов описываемых ингибиторов действие против одного или нескольких компонентов сигнальных путей исключить нельзя (Пример 6). Однако, это может быть как независимым влиянием на структуру компонента сигнального пути, так и следствием блокирования OPOP-FRS2. Также описываемые ингибиторы могут нарушать комплекс FRS2 с Shp2 и/или Grb2, что может привести к усилению действия, но не является обязательным, так как главным в ограничении проведения сигнала является блокирование взаимодействия OPOP-FRS2 (Пример 7). Описываемые ингибиторы могут ингибировать только один тип ФРФР, как описано в Примере 8 для ФРФР2, или несколько (Пример 6). Зависимость активности ингибитора от изоформы определенного типа ФРФР в большинстве случаев должна исключаться (Пример 9).
Такое селективное нарушение взаимодействия ФРФР и FRS2 приводит к необходимым терапевтическим эффектам описываемых ингибиторов, например, к подавлению пролиферации и миграции эндотелиальных клеток, формирования тубулярных структур сосуда, роста зрелых сосудов (Примеры 10 и 11), к угнетению пролиферации опухолевых клеток (Пример 12), к торможению роста опухоли (Пример 13), к развитию некроза в опухоли (Пример 14), к торможению развития других заболеваний (Пример 15). Также селективное действие описываемых ингибиторов и отсутствие влияния на другие мишени приводит к снижению выраженной токсичности, что является крайне важным при использовании терапевтических средств (Пример 16).
Основным объектом настоящего изобретения является использование ингибиторов, которые избирательно нарушают взаимодействие рецептора фактора роста фибробластов с FRS2, а также взаимодействие с другими компонентами комплекса FRS2, с описанными свойствами выше. Примером такого ингибитора, нарушающего взаимодействие ФРФР 2 типа и FRS2, может быть вещество, определенное химической Формулой I.
Фо мула I
Figure imgf000006_0001
о Kg
RI, R2, R3, R-ь R5, R6, R7S Rs, 9, Rio могут быть одинаковыми или различными и могут включать независимо группы -NH2, -N02, -СН3, -CH2NH2, -F, -CI, -Br, -I, -CF3, -OCH3, -
C2H5, -H, замещенные или незамещенные первичные, вторичные или третичные алкильные группы, замещенные или незамещенные арильные группы, замещенные или незамещенные алкенил- группы, замещенные или незамещенные алкинил- группы, замещенные или незамещенные гетероциклические группы, замещенные или незамещенные гетероциклилалкильные группы, замещенные или незамещенные алкоксиалкильные группы, замещенные или незамещенные арилоксиалкильные группы, замещенные или незамещенные гетероциклилоксиалкильные группы.
X может быть представлен CHjN или СН или N.
Как пример ингибитора, избирательно нарушающего взаимодействие рецептора фактора роста фибробластов с FRS2, описываемого общей формулой I, в настоящем изобретении, можно представить химическое вещество RPT835, продемонстрированное Формулой II и относящееся к 3 -(Ы-(4-метил-2-нитро-5 -(пиридин-3 -ил)фенил)сульфамоил)бензойная кислота.
Формула II
■мог
Figure imgf000007_0001
Кроме того, похожий ингибитор может относится к 3-(]ЧГ-(4-метил-2-нитро-5-(пиримидин- 5-ил)фенил)сульфамоил)бензойная кислота и быть представлен Формулой III
Формула III
Figure imgf000007_0002
или относится к 3-(М-(5-(фуран-3-ил)-4-метил-2-нитрофенил)сульфамоил)бензойная кислота и быть представлен Формулой IV,
Формула IV
Figure imgf000007_0003
а может относится к 3-(Т -(2-амино-4-метил-5-(пиримидин-5- ил)фенил)сульфамоил)бензойная кислота и быть описан по Формуле V.
Формула V
Figure imgf000008_0001
Также описываемый в изобретении ингибитор может сочетать в себе несколько компонентов, выбранных из Формул I, II, III, IV, V. Так, химическая формула такой комбинированной субстанции может быть, к примеру, такой (Формула VI).
Формула VI
Figure imgf000008_0002
Ингибитор, нарушающий взаимодействие рецептора фактора роста фибробластов и FRS2, может быть выбран из любого класса веществ, описанных Формулой VII.
Формула VII
Figure imgf000009_0001
Ri, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9 могут быть одинаковыми или различными и могут включать независимо группы -NH2, -CH2NH2, -N02, -СН3, -F, -CI, -Br, -I, -CF3, -OCH3, - C2H5, -H, замещенные или незамещенные первичные, вторичные или третичные алкильные группы, замещенные или незамещенные арильные группы, замещенные или незамещенные алкенил- группы, замещенные или незамещенные алкинил- группы, замещенные или незамещенные гетероциклические группы, замещенные или незамещенные гетероциклилалкильные группы, замещенные или незамещенные алкоксиалкильные группы, замещенные или незамещенные арилоксиалкильные группы, замещенные или незамещенные гетероциклилоксиалкильные группы.
Самым простым примером химических веществ, относящихся к классу по Формуле VII, могут быть 3-(3-оксо-1,2,3,4-тетрагидрохиноксалин-1-карбонил)бензойная кислота (Формула VIII) и 3-(2-метил-3-оксо-1,2,3,4-тетрагидрохиноксалин-1-карбонил)бензойная кислота (Формула IX).
Формула VIII Формула IX
Figure imgf000009_0002
Ингибитор, нарушающий взаимодействие рецептора фактора роста фибробластов и FRS2, также может быть выбран из любого класса веществ, описанных Формулой X.
Формула X
Figure imgf000010_0001
Ri, R2, R3, R4, R5, Яб, R7, R8, R9, Rio, Ri i могут быть одинаковыми или различными и могут включать независимо группы -NH2, -CH2NH2, -N02, -СН3, -F, -CI, -Br, -I, -CF3, -OCH3, - C2H5, -H, замещенные или незамещенные первичные, вторичные или третичные алкильные группы, замещенные или незамещенные арильные группы, замещенные или незамещенные алкенил- группы, замещенные или незамещенные алкинил- группы, замещенные или незамещенные гетероциклические группы, замещенные или незамещенные гетероциклилалкильные группы, замещенные или незамещенные алкоксиалкильные группы, замещенные или незамещенные арилоксиалкильные группы, замещенные или незамещенные гетероциклилоксиалкильные группы.
Простейшим примером химического вещества, относящегося к этому классу, может быть 3-(хинолин-5-иламино)бензойная кислота с Формулой XI
Фо мула XI
Figure imgf000010_0002
Также ингибитор может включать в свой состав все структуры описанные в формулах I- XI и быть представлять комбинированное вещество.
Химические вещества по формулам I, II, III, IV, V, VI, VII, VIII, IX, X, XI могут быть представлены фармацевтически приемлемой солью, таутомером, фармацевтически приемлемой солью таутомера или их комбинацией.
Терапевтическое использование ингибиторов
Для использования ингибиторов, описанных в настоящем изобретении, в терапевтической практике требуется их введение млекопитающему, предпочтительно человеку, в фармацевтически приемлемой форме, включая введение внутривенно, а также следующими путями: пероральным, внутримышечным, подкожным, интраперитонеальным, интрацереброспинальным, внутрисуставным, внутрисиновиальным, внутриоболочечным, локальным или ингаляционным. Ингибиторы также могут вводиться внутриопухолевым, околоопухолевым, внутриочаговым и околоочаговым путями для обеспечения локального действия наряду с системным терапевтическим действием.
Подобные формы введения включают фармацевтически приемлемые носители, которые по своей природе не обладают ни токсическим, ни терапевтическим действием. Вспомогательные вещества, которые используются для приготовления лекарственного препарата на основе описываемого в изобретении ингибитора, в зависимости от влияния на физико-химические характеристики и фармакокинетику лекарственных форм можно разделить на следующие группы:
• формообразующие
• стабилизирующие
• пролонгирующие
• солюбилизирующие
• корригирующие
Могут использоваться носители. Примерами таких носителей являются ионообменные вещества, квасцы, стеарат алюминия, лецитин, белки плазмы (такие, как белок плазмы человека), буферные вещества, такие как фосфаты, глицин, сорбиновая кислота, сорбат калия, частичные глицеридные смеси насыщенных овощных жирных кислот, вода, соли или электролиты, такие как сульфат протамина, гидрофосфат натрия, гидрофосфат калия, хлорид натрия, соли цинка, коллоидная окись кремния, трисиликат магния, поливинилпирролидон, вещества с целлюлозной основой и полиэтиленгликоль.
Носители для локальной или основанной на геле форм антагонистов включают полисахариды, такие как натриевая соль карбоксиметилцеллюлозы или метилцеллюлозы, поливинилпирролидон, полиакрилаты, полимеры полиоксиэтиленполиоксипропиленового блока, полиэтиленгликоль и спирты. Для введения во всех случаях используются обычные лекарственные формы, получаемые со складов. К таким формам относятся, например, микрокапсулы, нанокапсулы, липосомы, пластыри, ингаляционные препараты, аэрозоли, подъязычные таблетки и препараты с постоянным высвобождением вещества.
Подходящие примеры препаратов с постоянным высвобождением вещества включают полупроницаемые матрицы твердых гидрофобных полимеров, содержащих ингибитор; подобные матрицы имеют определенную форму, например это могут быть пленки или микрокапсулы. К примерам матриц с постоянным высвобождением относятся полиэфиры, гидрогели [например, поли(2-гидроксиэтил-метакрилат)] , описанные Лангером и др. (J. Biomed. Mater. Res. 15, 167 (1981) и Лангером (Chem. Tech. 12 (1982), или поли(винилалкоголь), полилактиды (Патент США N 3773919), сополимеры L- глутаминовой кислоты и гаммаэтил-Ь-глутамата, описанные Сидман и др. (Biopolymers 22, 547 (1983), недеградируемый этиленвинилацетат (Лангер и др. см. выше), деградируемые сополимеры молочной и гликолевой кислот, такие как Lupron Depot™ (инъецируемые микросферы, состоящие из полимеров молочной и гликолевой кислот и ацетата лейпролида), и поли-О-(-)- 3-гидроксибутировой кислоты. В то время, как такие полимеры, как этиленвинилацетат и сополимер молочной и гликолевой кислот, способны к постоянному высвобождению молекул в течение более 100 дней, определенные гидрогели высвобождают белки за более короткие периоды времени. С целью стабилизации могут быть разработаны разумные стратегии, в зависимости от действующего механизма. Например, если обнаружен механизм агрегации, выражающийся в формировании межмолекулярной S-S-связи посредством тиодисульфидного обмена, стабилизация может быть достигнута путем модификации сульфгидрильных остатков, лиофилизации с целью удаления кислых растворов, контролирования влажности, использования соответствующих добавок и разработки специфических полимерных матричных составов.
Составы с постоянным высвобождением ингибитора включают также заключение в липосомы. Липосомы, содержащие ингибиторы, могут быть получены известными в данной области методами, например, описанными Эпстейном и др. (Proc. Nat. Acad. Sci. 82, 3688 (1985); Хуанг и др. (Procc. Nat. Acad. Sci. 77, 4030 (1980); Патент США N 4485045 и Патент США N 4544545. Липосомы, как правило, имеют небольшую величину (величиной около 200-800 ангстрем) и принадлежат к однослойному типу, в котором содержание липидов выше, чем 30 мол.% холестерина; выбранное соотношение может изменяться для подбора оптимальных условий терапии. Липосомы с продолжительным сроком циркуляции покрываются Патентом США N 5013556,
Еще одним путем использования данного изобретения является инкорпорирование ингибитора внутрь изделий, имеющих определенную форму. Такие изделия могут быть использованы для модулирования роста клеток эндотелия и ангиогенеза. Кроме того, такие изделия могут быть использованы для модулирования инвазии опухолей и метастазов.
Возможна конъюгация описываемого ингибитора и другого лечебного средства. Описываемый ингибитор может быть использован в различных режимах в комбинации с другими терапевтически активными и/или адъювантными препаратами для усиления терапевтического действия, а также с целью уменьшения частоты побочных эффектов и нежелательных явлений.
При профилактике или лечении заболевания необходимая доза описываемого ингибитора будет зависеть от типа заболевания, от его степени серьезности и протекания, от того, вводится ли ингибитор с профилактической или терапевтической целью, от предыдущей терапии, от истории болезни пациента и его реакции на ингибитор и от указаний лечащего врача. Ингибитор может вводиться пациенту различными способами, единовременно или в качестве серии назначений, на протяжении времени, когда терапия ингибитором будет считаться эффективной по стандартным критериям эффективности, использующимся в практике на момент назначения ингибитора.
Описываемые в изобретении ингибиторы могут быть использованы для лечения различных неопластических и ненеопластических заболеваний и нарушений. Опухоли и близкие состояния, которые поддаются такому лечению, например, включают рак молочной железы, немелкоклеточный и мелкоклеточный рак легкого, опухоли трахеи, рак желудка, рак пищевода, колоректальный рак, рак печени, рак поджелудочной железы, опухоли желчного пузыря и желчевыводящих путей, гастроинтестинальные опухоли, рак яичников, рак шейки матки, рак тела матки, гиперплазию эндометрия, эндометриоз, саркомы, опухоли головы и шеи, гепатобластому, меланому, рак кожи, гемангиому, кавернозную гемангиому, гемангиобластому, рак надпочечников, ретинобластомы, астроцитому, глиобластому, шванному, олигодендроглиому, медуллобластому, нейробластому, рабдомиосаркому, лейомиосаркому, почечноклеточный рак, рак мочевого пузыря и уротелиальный рак, рак полового члена, рак предстательной железы, опухоль Вилмса, герминогенные опухоли, нейроэндокринные опухоли, опухоли невыявленной первичной локализации, лейкозы и лимфомы, аномальную пролиферацию сосудов, связанную с факоматозами.
Возможно применение описываемых ингибиторов при неонкологических заболеваниях, которые поддаются лечению, включая такие как ревматические болезни, сердечно- сосудистые болезни, в т.ч. атеросклероз, болезни органов дыхания, болезни органов пищеварения, заболевания почек, включая гломерулонефрит, кожные болезни, в т.ч. псориаз, диабетические и другие ретинопатии, фиброплазии, неоваскулярную глаукому, эндокринные заболевания и болезни обмена, трансплантацию роговицы и других тканей, хронические воспаления, асцит, преэклампсию, перикардиальНый выпот (например, связанный с перикардитом) и плевральный выпот, неврологические болезни.
В зависимости от типа заболевания и от степени его серьезности первоначальная доза для введения пациенту будет составлять от 0,001 мг/кг до 200 мг/кг, или более предпочтительно от 1 мг/кг до 100 мг/кг, или еще боле предпочтительно от 10 мг/кг до 50 мг/кг, и может вводиться путем одного или многих отдельных назначений/введений или путем постоянного вливания. Обычная дневная доза может варьировать примерно от 1 мг/кг до 100 мг/кг и более, в зависимости от вышеупомянутых факторов. Для повторного назначения в течение нескольких дней и более, в зависимости от условий, лечение повторяется, пока не будет достигнуто желаемое подавление симптомов болезни. Однако могут использоваться и другие режимы дозировки. Успех лечения легко определяется обычными методами и анализами, например методами рентгено- визуализации опухолей. В соответствии с другим применением изобретения эффективность ингибитора в предотвращении или лечении болезней может быть улучшена путем введения ингибитора серийно или же в комбинации с другим веществом, эффективным для данной цели, таким, например, как фактор некроза опухоли, интерфероны, интерлейкины; моноклональные антитела, "ловушки" факторов роста (traps) и другие ингибиторы, способные нейтрализовать или ингибировать активность фактора роста эндотелия сосудов и/или его рецепторов и/или фактора роста гепатоцитов и/или его рецепторов и/или эпидермального фактора роста и/или его рецепторов и/или фактора роста плаценты и/или его рецепторов и/или инсулиноподобного фактора роста и/или его рецепторов и/или фактора роста фибробластов и/или его рецепторов и/или mTOR и/или других внутриклеточных киназ, или одно или более обычных терапевтических веществ, таких как, например, алкилирующие соединения, антибиотики, антиметаболиты, антрациклины, винкаалкалоиды, эпиподофиллотоксины, другие цитостатики. Также возможно сочетание ингибиторов, описываемых в изобретении, с противовоспалительными препаратами, препаратами для лечения сердечно-сосудистой патологии. Подобные вещества могут присутствовать во вводимом составе или могут вводиться отдельно. Кроме того, ингибитор по способу может вводиться серийно или же в комбинации с радиологическим лечением.
Один ингибитор или более вводятся пациенту с опухолью в терапевтически эффективных дозах, определенных, например, при наблюдении некроза опухоли или ее метастатических фокусов, если они имеются. Такая терапия продолжается до тех пор, пока перестает наблюдаться дальнейшее улучшение, или клиническое обследование показывает, что опухоль или ее метастазы исчезли. При прогрессировании болезни вводится одно или несколько описанных выше веществ(о) или используются другие методы лечения. Поскольку эффективность дополнительных веществ будет варьировать, желательно сравнить их влияние на опухоль путем стандартного скрининга. Производится повторное введение ингибитора и дополнительного агента, пока не будет достигнут желаемый клинический эффект. В альтернативном случае ингибитор(ы) вводятся совместно и, при желании, вместе с дополнительными веществами. При лечении ингибиторами других заболеваний, например, ревматоидных болезней, используются стандартные шкалы оценки терапевтического эффекта.
Ингибиторы, описываемые в изобретении, могут быть использованы с препаратами поддерживающей и сопроводительной терапии, например, с эритропоэтинами, препаратами, стимулирующими лейкопоэз или повышающими количество тромбоцитов и/или нейтрофилов, макрофагов, с нутритивной поддержкой, нестероидными противовоспалительными средствами, компонентами крови, кортикостероидами, золедроновой кислотой, антителами против RANKL, противорвотными препаратами и другими.
Ниже в качестве примеров представлены некоторые доказательства целесообразности использования ингибиторов, описываемых в изобретении. Нижеследующие примеры предлагаются только в качестве иллюстрации и не должны восприниматься как в чем- либо ограничивающие настоящее изобретение.
Пример 1 (Результаты исследования): нарушение взаимодействия ФРФР2 с FRS2 при добавлении ингибитора RPT835
Для оценки эффекта ингибитора RPT835, охарактеризованного в настоящем изобретении формулой II, на фосфорилирование FRS2 были использованы клетки рака желудка КАТО III, которые экспрессируют ФРФР2. Для стимуляции ФРФР к клеткам добавляли ФРФ-2 в концентрации 1 мг/мл и гепарин 10 мг/мл. RPT835 добавляли в различных концентрациях. Часть клеток осталась без добавления ингибитора, а часть клеток - без добавления как ингибитора, так и стимулирующих агентов (контрольные группы).
Для оценки уровня фосфорилирования ФРФР и FRS2 были использованы 2 стандартных методики:
- Вестерн-блоттинг с использованием ручной работы;
- автоматический капиллярный электрофорез и иммунодетекция с использованием автоматической системы Wes™ (ProteinSimple; SantaClara,CA).
Стимуляция клеток КАТО III фактором роста фибробластов приводила к достоверному повышению активности (фосфорилирования) ФРФР (в 4,3 раза), FRS2a (в 11,4 раза), р44/42(МАРК, в 12 раз) и АКТ (в 4 раза) по сравнению с нестимулированными клетками. Фосфорилирования белка mTOR и киназы p70S6 наблюдалось в меньшей степени (Фигура 1). При добавлении к клеткам ингибитора RPT835 наблюдалось нарушение взаимодействия между ФРФР и FRS2, проявляющееся в значительном снижении фосфорилирования FRS2 (Фигура 2) без влияния на фосфорилирование общего ФРФР (Фигура 3). Более того, концентрация полумаксимального ингибирования (IC50) FRS2 при использовании ингибитора RPT835 составила менее 10 пМ.
Основываясь на полученных данных, можно сделать вывод, что ФРФ стимулирует весь сигнальный путь от рецептора ФРФ до внутриклеточных киназ, включая взаимодействие ФРФР и FRS2. Ингибитор RPT835 не влияет на активность ФРФР, но приводит к нарушению взаимодействия ФРФР и FRS2, что в свою очередь сказывается на подавлении активности FRS2 в наномолярной концентрации.
Пример 2 (Результаты исследования): ингибитор RPT835 не влияет на тирозинкиназную активность ФРФР
В предыдущем Примере уже было показано отсутствие влияния ингибитора RPT835 на фосфорилирование общего ФРФР. В настоящем исследовании, для того, чтобы опровергнуть механизм действия RPT835 как ингибитора тирозинкиназы, был оценен уровень общего ФРФР и фосфо-ФРФР до и после добавления RPT835.
Как и в Примере 1 , были использованы клетки рака желудка КАТО III, сильно экспрессирующие ФРФР2. Часть клеток стимулировали ФРФ-2 в концентрации 1 мг/мл и гепарин 10 мг/мл, другую часть клеток оставляли без стимуляции. К клеткам добавляли ингибитор RPT835 в дозе 1, 10, 100, 1000 пМ. Группа контроля оставалась без добавления RPT835.
Уровень фосфорилирования ФРФР оценивали с помощью стандартного Вестерн- блоттинга и автоматического капиллярного электрофореза с иммунодетекцией и использованием автоматической системы Wes™ (ProteinSimple; SantaClara,CA).
Ингибитор RPT835 не оказывал никакого действия на фосфорилирование ФРФР2, стимулированное ФРФ-2 (Фигура 4), то есть не проявлял ингибирующей активности на тирозинкиназу даже в максимальной концентрации.
Пример 3 (Результаты исследования): ингибитор RPT835 не препятствует связыванию ФРФ-2 с ФРФР2
Для того, чтобы оценить влияет ли RPT835 на связывание ФРФР2 и лиганда (ФРФ-
2), был проведен нерадиоактивный иммуноферментный анализ (non-radioactive enzyme linked FGF2 binding assay). В анализе для связывания ФРФ-2 использовался рекомбинантный химерный белок ФРФР2-Рс, который состоял из человеческого экстрацеллюлярного домена ΦΡΦΡ2α (Шс) и Fc-фрагмента человеческого IgG). ΦΡΦΡ2α содержал все 3 иммуноглобулин-подобные домены и представлял собой домен Шс ФРФР2 с высокой аффинностью к ФРФ-2. Белком ФРФР2-Рс покрывали 96-луночный планшет, затем в лунки добавляли:
1) только ФРФ-2
2) ФРФ-2 + гепарин
3) ингибитор RPT835 в различных концентрациях + ФРФ-2 + гепарин
4) часть лунок оставалась без стимуляторов (ФРФ-2 + гепарин) и RPT835 (негативный контроль).
После инкубации был проведен иммуноферментный анализ с использованием соответствующих антител и последующим определением OD650 (оптическая плотность при длине волны 650 нм).
В первой группе без добавления ингибитора и гепарина было показано, что ФРФ-2 хорошо связывается с белком ФРФР2-Рс. Связывание ФРФ-2 с рецептором было дозо-зависимым. Во второй группе добавление гепарина улучшало связывание ФРФ-2 с рецептором. При этом для достижения той же силы связывания ФРФ-2 можно было использовать в меньших дозах, чем без гепарина. В группе негативного контроля сигнал был отрицательный (менее 1% от позитивного контроля). Результаты представлены на Фигуре 5. Они подтверждают значимость данного метода: ФРФ-2 связывается с ФРФР2-Рс в присутствии гепарина или без него.
Следующей задачей было оценить влияния ингибитора RPT835 на связывание ФРФ-2 и ФРФР2-Рс. RPT835 в концентрациях от 1 до 1000 пМ не влиял на связывания лиганда с рецептором (Фигура 6А). Чтобы исключить неспецифическое действие RPT835 на связывание, был проведен еще один иммуноферментный анализ, в котором лунки были покрыты иммобилизованным анти-ФРФ-2 антителом. К лункам добавлялся ФРФ-2 ± RPT835 в различных концентрациях. RPT835 в концентрациях от 1 до 1000 пМ не влиял на связывание ФРФ-2 с анти-ФРФ-2 антителом (Фигура 6В).
Обобщенные результаты исследования доказывают, что ингибитор RPT835, приведенный как пример в настоящем изобретении, не препятствует связыванию лиганда (то есть ФРФ-2) с его рецептором (то есть с ФРФР2).
Пример 4 (Результаты исследования): нарушение взаимодействия ФРФР с FRS2 при использовании ингибиторов, определенных формулами V, IX, XI Ингибиторы V, IX, XI, определенные в настоящем изобретении соответствующими формулами V, IX, XI, также нарушают передачу сигнала от ФРФР к FRS2. Путем химического синтеза были получены указанные соединения. Клетки рака желудка Snul6, экспрессирующие ФРФР2, были культивированы по стандартной методике. Часть клеток была оставлена в качестве негативного контроля, к другой части был добавлен ФРФ-2 (позитивный контроль). Терапевтические группы включали: добавление ингибитора по формуле V и последующую стимуляцию ФРФ-2, добавление ингибитора по формуле IX и последующую стимуляцию ФРФ-2, добавление ингибитора по формуле XI и последующую стимуляцию ФРФ-2. Для оценки уровня фосфорилирования различных киназ использовали метод Вестерн-блоттинга.
Результаты: в клетках без стимуляции и без лечения уровень фосфорилирования ФРФР2, FRS2 были низкие (отсутствие фосфорилирования); клетки после стимуляции ФРФ-2 имели высокий уровень активности ФРФР2 и FRS2 (в 14 и 17 раз выше, чем в негативном контроле); в летках, к которым были добавлены ингибиторы, уровень активности ФРФР2 не менялся по сравнению со стимулированным ФРФ-2 контролем, при этом фосфорилирования FRS2 отмечено не было (во всех случаях ингибирующая концентрация IC50 менее 10 пМ). Кроме того, было показано, что ингибиторы не влияют на другие внутриклеточные киназы, в том числе Akt, Erk 1/2.
Также было подсчитано количество клеток. Клетки без добавления ингибиторов и ФРФ-2 пролиферировали слабо, в отличие от клеток, к которым был добавлен ФРФ-2. Количество клеток при добавлении ингибиторов было сравнимым с группой негативного контроля (р=0,5) и достоверно меньше, чем в группе со стимуляцией ФРФ-2 и без добавления ингибиторов (р<0,0001).
Таким образом, вещества, описанные в формулах V, IX, XI, являются селективными ингибиторами взаимодействия ФРФР2 и FRS2, что влияет на пролиферативную активность клеток опухоли, экспрессирующих ФРФР.
Пример 5 (Результаты исследования): оценка влияния ингибиторов, описываемых в изобретении, на различные внутриклеточные киназы
Для того, чтобы доказать избирательное действие ингибиторов только на передачу сигнала от ФРФР к FRS2 без влияния на внутриклеточные киназы, был оценен уровень фосфорилирования внутриклеточных киназ, а именно р44/42(МАРК), Akt, mTOR, p70S6.
Для оценки эффекта ингибитора RPT835, охарактеризованного в настоящем изобретении формулой II, на фосфорилирование перечисленных киназ были использованы клетки рака желудка КАТО III, которые экспрессируют ФРФР2. Для стимуляции ФРФР к клеткам добавляли ФРФ-2 в концентрации 1 мг/мл и гепарин 10 мг/мл. RPT835 добавляли в различных концентрациях. Часть клеток осталась без добавления ингибитора, а часть клеток - без добавления как ингибитора, так и стимулирующих агентов (контрольные группы).
Для оценки уровня фосфорилирования были использованы 2 стандартных методики:
- Вестерн-блоттинг с использованием ручной работы;
- автоматический капиллярный электрофорез и иммунодетекция с использованием автоматической системы Wes™ (ProteinSimple; SantaClara,CA).
Стимуляция клеток КАТО III фактором роста фибробластов приводила к достоверному повышению активности (фосфорилирования) р44/42(МАРК, в 12 раз), АКТ (в 4 раза), по сравнению с нестимулированными клетками. Фосфорилирования белка mTOR и киназы p70S6 наблюдалось в меньшей степени.
При добавление ингибитора RPT835 активность перечисленных киназ не изменилась по сравнению с клетками, только стимулированными ФРФ-2 (без добавления RPT835). Уровни фосфорилирования представлены на Фигуре 7.
Следовательно, RPT835 не оказывает влияния на фосфорилирование других внутриклеточных киназ.
Пример 6 (Результаты исследования): оценка влияния ингибитора, определенного формулой VIII, на ФРФР1, ФРФР2, ФРФРЗ, VEGFR1 и внутриклеточные киназы
По методике, описанной выше, методом Вестерн-блоттинга, были проанализированы уровни фософорилирования рецепторов фактора роста фибробластов 1-3 типа, FRS2, а также уровни фософорилирования VEGFR1 и внутриклеточных киназ PDK, р44/42(МАРК), Akt, mTOR.
В исследовании использовались эндотелиальные клетки HUVEC, клетки рака человеческого почечноклеточного рака типа Caki-1, клетки рака желудка КАТО III. Все перечисленные клетки экспрессировали различные виды перечисленных рецепторов. Как и в Примере 5, часть клеток стимулировали ФРФ-2 и/или VEGF-A, часть клеток культивировалась с ингибитором, описанным формулой VIII, часть клеток оставалось без стимуляции и лечения.
ФРФ-2 сильно стимулировал фосфорилирование всех трех типов ФРФР, а также PI3K,
Akt и FRS2 по сравнению с нестимулированными клетками (Р<0,0001 для всех сравнений). VEGF-A не оказывал воздействия на ФРФР 1-3 типов и FRS2 (Р>0,3 для всех сравнений), но достоверно повышал уровень фосфорилирования VEGFR1, mTOR, РБК,
МАРК (Р<0,001 для всех сравнений). Ингибитор по формуле VIII достоверно снижал фосфорилирование FRS2 (в 14 раз, Р=0,001) и PI3K (в 10 раз, Р=0,017) и слабо - ФРФР2 (в 1,5 раза) и ФРФРЗ (в 1 ,8 раза), VEGFR1 (в 2,3 раза). На остальные киназы ингибитор не оказывал влияния. При этом уровень фосфорилирования ФРФР1 даже повысился (Фигура 8).
Следовательно, в настоящем исследовании продемонстрировано возможное влияние некоторых ингибиторов, нарушающих взаимодействие ФРФР2 и FRS2, на другие киназы и рецепторы. Это действие нельзя отрицать, и оно может быть связано с основным механизмом - нарушением связи ФРФР и FRS2, что приводит к поэтапному угнетению фосфорилирования нижележащих киназ. Действие на другие рецепторы (например, VEGFR1) не является выраженным, но также возможно как перекрестное. Повышение уровня фосфорилирования ФРФР1 может быть использовано также в дальнейшем как терапевтическое при использовании ингибиторов, описанных в настоящем изобретении.
Пример 7 (Результаты исследования): описываемые в изобретении ингибиторы могут нарушать комплекс FRS2 с Shp2 и/или Grb2
Известно, что FRS2 взаимодействует с Shp2 и Grb2, передавая через эти белки сигнал к внутриклеточным киназам. Целью настоящего исследования было доказать, что описываемые в изобретении ингибиторы могут влиять на взаимодействие FRS2 с Shp2 и Grb2, но это не является определяющим их механизмом действия: главным механизмом является нарушение взаимодействия ФРФР и FRS2.
Клетки рака желудка Snul6 были высеяны в 96-луночных пластинках, объемом 90 мкл/лунка. После 24 часов инкубации в увлажненном инкубаторе при температуре 37С, 5% С02 и 95% воздуха к клеткам были тестируемый растворенный агент, описанный формулой VI, в количестве 100 мкг/мл и затем добавлен ФРФ-2 в качестве стимулятора. После суток культивации методом автоматизированного Вестерн-блоттинга в клетках был изучен уровень фосфорилирования следующих белков: ФРФР2, FRS2a, FRS2 , Shp2, Grb2. Еще через сутки культивирования клетки были подсчитаны.
Ингибитор по формуле VI не угнетал фосфорилирования ФРФР2 (различий с контролем выявлено не было), однако, достоверно, в 12 раз, подавлял фосфорилирование FRS2a и FRS2P (1С50<10 пМ). Кроме того, в некоторых клетках было отмечено достоверное угнетение фософорилирования белков Shp2 и Grb2 (более чем в 10 раз). В связи с этим клетки были разделены на две группы по фактору фосфорилирования Shp2 и/или Grb2:
- группа с угнетением фосфорилирования FRS2 и Shp2 и/или Grb2
- группа с угнетением фосфорилирования FRS2 и без влияния на фосфорилирование Shp2 и/или Grb2. После последующей культивации количество клеток сравнивалось между группами, а также с контролем (стимуляция ФРФ-2, без культивации с ингибитором). В таблице 1 представлены результаты. Как видно из таблицы, ингибитор достоверно угнетал пролиферацию опухолевых клеток по сравнению с контролем вне зависимости от фосфорилирования Shp2 и/или Grb2.
Следовательно, определяющих фактором, оказывающим ингибирующий эффект на пролиферацию опухолевых клеток, является нарушение взаимодействия ФРФР и FRS2, при этом уровень фосфорилирования Shp2 и/или Grb2 может быть разным, что не влияет на подавление пролиферативной активности ингибитором, описанным в изобретении.
Пример 8 (Результаты исследования): селективное нарушение взаимодействия ФРФР 2 с FRS2 при добавлении ингибитора RPT835
Целью настоящего исследования была оценка специфического действия ингибитора RPT835, обозначенного в настоящем изобретении формулой II, на взаимодействие ФРФР2 и FRS2 и оценка влияния на взаимодействие других типов ФРФР и FRS2. Для эксперимента были выбраны 2 клеточные линии:
- рака желудка КАТО III, экспрессирующая ФРФР2, и
- рака молочной железы MDA MB 134, экспрессирующая ФРФР1.
Методика исследования была такой же, как в предыдущих примерах: клетки культивировались в присутствии RPT835 с последующей стимуляцией ФРФ-2 и гепарином. Другая часть клеток культивировалась в отсутствие RPT835. Фосфорилирование ФРФР1 (в клетках рака молочной железы) и ФРФР2 (в клетках рака желудка), а также FRS2a (в обеих клеточных линиях) и некоторых внутриклеточных киназ (в клетках рака молочной железы) оценивалась с помощью ручного и автоматизированного Вестерн-блоттинга.
В клетках КАТО III ингибитор RPT835 полностью снижал фосфорилирование FRS2a (система ФРФР2) до исходного уровня в дозе 100 пМ. Угнетение фосфорилирования FRS2a более чем на 50% наблюдалось в концентрации 10 пМ (Фигура 2). При этом влияния на киназную активность самого рецептора отмечено не было (Фигура 3).
В клетках рака молочной железы MDA MB 134 ингибитор RPT835 не оказывал влияния на фосфорилирование FRS2a (система ФРФР1), равно как и на сам ФРФР1, а также на внутриклеточные киназы (Фигура 9). Как видно из рисунка, отмечено некоторое недостоверное повышение уровня фосфорилирования для некоторых внутриклеточных киназ и ФРФР 1. Таким образом, настоящий пример подтверждает селективное действие ингибитора RPT835 и его активность в системе ФРФР2. Ингибитор RPT835 влияет только на нарушение взаимодействия ФРФР2 с FRS2 и не влияет на взаимодействие других типов ФРФР с FRS2.
Пример 9 (Результаты исследования): ингибиторы, описанные в настоящем изобретении, проявляют активность вне зависимости от изоформы ФРФР
Известно, что появление различных изоформ ФРФР может влиять на терапевтическую активность препаратов, блокирующих эти рецепторы. Задачей настоящего исследования было доказать, что ингибиторы, описываемые в настоящем изобретении, проявляют активность в отношении любых изоформ в пределах одного типа ФРФР.
В исследовании оценивалось влияние ингибитора RPT835, определенного формулой II настоящего изобретения, на нарушение взаимодействия ФРФР2, представленного двумя наиболее часто встречающимися изоформами ШЬ и Шс, с FRS2. Для этого были выбраны человеческая клеточная линия эмбриональных остеобластов (hFOB), экспрессирующая только ФРФР2 Шс, и человеческая клеточная линия рака молочной железы SUM-52, экспрессирующая ФРФР2 ШЬ (все основные варианты изоформы - CI, С2, СЗ).
Клетки были разделены на группы:
la) hFOB
lb) hFOB, стимуляция ФРФ-1 (100 нг/мл)
lc) hFOB, культивирование с RPT835 (1 мкМ) и стимуляция ФРФ-1 (100 нг/мл)
2а) SUM-52
2b) SUM-52, стимуляция ФРФ-1 (100 нг/мл)
2с) SUM-52, культивирование с RPT835 (1 мкМ) и стимуляция ФРФ-1 (100 нг/мл)
Ингибитор RPT835 достоверно подавлял пролиферацию клеток обеих линий, экспрессирующих ФРФР2 Шс или ФРФР2 ШЬ (Фигура 10). При оценке уровня фосфорилирования FRS2a значимых отличий между этими группами также не было - ингибитор полностью угнетал фосфорилирование (Фигура 11).
Следовательно, ингибитор RPT835, описываемый в настоящем изобретении, проявляет активность в отношении любых изоформ в пределах одного типа ФРФР.
Пример 10 (Результаты исследования): антиангиогенная активность ингибиторов, описываемых в настоящем изобретении
В исследовании использованы 18 мышей гибридов 1 поколения Fl (С57В1/6 х DBA/2), самцов массой 22-30 г. Мыши (номенклатурный номер м02.13.0001 1) были получены из филиала питомника «Столбовая». В эксперименте использовали методику, описанную ранее [Passaniti А., 1992]. В контрольных и опытных группах было не менее 3 мышей. Аликвоты (1000 мкл) Матригеля (BD Biosciences), содержащие гепарин 60 У.Е./мл, VEGF (200 ng/ml, BD Biosciences) или bFGF (100 ng/ml, BD Biosciences), готовили на льду. В качестве отрицательного контроля использовали введение Матригеля, содержащего гепарин 60 У.Е./мл. Инъекцию Матригеля проводили мышам подкожно, в боковую часть спины. После инъекции Матригель быстро образует одиночный, твердый гелеобразный имплантат. Навеску ингибитора растворяли в ДМСО до концентрации 10" М. Аликвоты замораживали при -20°С и размораживали непосредственно перед введением. Повторного замораживания раствора не допускали. Испытуемый и стандартный объекты вводили внутрибрюшинно на 0, 3 и 6 день имплантации Матригеля: Бевацизумаб в дозе 10 мг/кг и RPT835 - 15 мг/кг. Описание групп представлено в Таблице 2. Через 7 дней после введения Матригеля мышей усыпляли медицинским эфиром для удаления имплантата. Имплантаты фиксировали в течение 24-36 часов в 10% нейтральном формалине и заключали в парафин для дальнейшего гистологического исследования.
Подкожная инъекция 1000 мкл Матригеля, не содержащего ростовые факторы, не индуцировала формирования микрокрососудов и миграцию стромальных и эндотелиальных клеток в имплантат.
В инъекции Матригеля, содержащего 100 нг/мл bFGF, наблюдали значительное увеличение количества микрососудов, тубулярных структур и мигрировавших клеток в целом (для всех показателей р<0,001). Аналогичный эффект показан при введении 200 нг/мл VEGF (для всех показателей р<0,001).
Наблюдали значительное снижение количества мигрировавших клеток, тубулярных структур и функциональных микрососудов при введении субстанций, блокирующих активность соответствующего стимулятора. Введение Бевацизумаба полностью блокировало ангиогенез в имплантатах, содержащих VEGF (для всех оцениваемых параметров р<0,001), но не ангиогенез, индуцированный bFGF (для всех оцениваемых параметров р>0,05). Ингибитор RPT835 эффективно ингибировал ангиогенез, стимулированный bFGF. Количество мигрировавших клеток (р<0,001); тубулярных структур (р=0,016) и функциональных микрососудов (р<0,001) снижалось по сравнению с контрольной группой более чем в 2 раза. Результаты исследования представлены на Фигурах 12 и 13.
Таким образом, в исследовании установлено, что при трехкратном введении в дозе 15 мг/кг ингибитор RPT835 статистически значимо блокирует ангиогенез, стимулированный bFGF. Бевацизумаб в том же режиме применения был эффективен против VEGF- стимулированного ангиогенеза, но не при использовании bFGF.
Полученные данные свидетельствуют, что RPT835, как пример ингибиторов, описываемых в настоящем изобретении, является перспективным антиангиогенным веществом с самостоятельным механизмом действия.
Пример 11 (Результаты исследования): сравнение влияния ингибиторов, описываемых в настоящем изобретении, и типичного ингибитора тирозинкиназы ΦΡΦΡ/VEGFR - бриваниба на пролиферативную активность эндотелиоцитов
Эндотелиальные клетки HUVEC были высеяны в 96-луночных пластинках и культивированы в течение 24 часов. После этого к клеткам были добавлены:
1) ингибитор RPT835, или
2) ингибитор, описываемый формулой IX в настоящем изобретении, или
3) бриваниб - мультикиназный ингибитор ΦΡΦΡ/VEGFR, а также ко всем клеткам - ФРФ-2 в концентрации 25 нг/мл.
Клетки культивировались еще в целом 96 часов и затем были посчитаны.
Результаты пролиферации клеток представлены на Фигуре 14.
Ингибиторы, описываемые в настоящем изобретении (RPT835 и ингибитор по формуле IX), оказывали выраженное антипролиферативное действие на эндотелиальные клетки в отличие от типичного ингибитора тирозинкиназы ΦΡΦΡ/VEGFR бриваниба.
Пример 12 (Результаты исследования): влияние ингибитора RPT835 на пролиферацию опухолевых клеток с различной экспрессией ФРФР in vitro
Подавление пролиферативной активности опухолевых клеток при культивировании с ингибиторами, описываемыми в настоящем изобретении, уже приводилось в Примерах 4, 7, 9.
В данном исследовании были использованы дополнительные клеточные линии: SKOV3 (рак яичников, АТСС # НТВ-77), HS578T (рак молочной железы, АТСС # НТВ- 126), T47D (рак молочной железы, АТСС #НТВ-1336), модифицированная линия немелкоклеточного рака легкого А549, линия метастатической меланомы кожи Mel Ког (патент РФ N°2287578), и для дополнительного изучения антиангиогенной активности - клеточная линия SVEC-4-10 (эндотелиальные клетки, АТСС #CRL-2181).
Клетки культивировали в среде RPMI-1640 (ПАНЭКО) (SKOV3, HS578T, T47D, Mel-Kor) или DMEM (ПАНЭКО) (SVEC-4-10), содержащей 10% эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота (FCS, HyClone), 2mM глутамина (ПАНЭКО), антибиотики (100 IU/mL пенициллина и 100 mg/ml стрептомицина (все ПАНЭКО)) при 37°С и 5% С02. Для экспериментов использовали клетки при 70-80% монослоя.
Клетки высаживали в низкой плотности (30т клеток/мл) в триплетах на 96-луночный планшет в среде, содержащей 0,1% сыворотки FCS. На следующий день в лунки добавляли тестируемый ингибитор RPT835 в необходимых концентрациях, а через 6 часов - фактор роста фибробластов (100 нг/мл bFGF (BD Bioscience)). Среду, антибиотики и препараты меняли раз в 3 дня. Рост клеток определяли модифицированным «митогенным методом по Crystal Violet» на 7 сутки после начала опыта. Клетки промывали PBS, фиксировали 1% парафармальдегидом на PBS и окрашивали 0,5% раствором Кристаллического фиолетового (Crystal Violet, Sigma Chemical Co) на этаноле. Краситель растворяли в этаноле и измеряли на спектрофотометре при 540-560 нм. Кривую ингибирования пролиферативной активности клеток строили по зависимости процента количества клеток (ось ординат) от концентрации ингибитора RPT835 в лунке планшета (ось абсцисс). Концентрацию образцов, начиная с которой процент выживших клеток становился меньше 50% (1С50) вычисляли в программе GraphPad Prizm 5. Эксперименты повторяли не менее 3 раз по три повтора в опыте.
На Фигуре 15 представлено антипролиферативное действие соединения RPT835 на культурах опухолевых и эндотелиальных клеток in vitro.
Как видно из графика, ингибитор RPT835 угнетал антипролиферативную активность опухолевых и эндотелиальных клеток в различной степени. Степень ингибирования пролиферации зависела от статуса экспрессии ФРФР2: чем сильнее был экспрессирован рецептор, тем эффективнее оказался ингибитор RPT835. Так, максимальный ингибирующий эффект отмечен при использовании линии SVEC-4-10, которая сильно экспрессирует ФРФР2. Умеренный эффект на пролиферацию выявлен в клетках с низкой ФРФР2-экспрессией SKOV3 и HS578T. Исследуемый ингибитор RPT835 не блокировал пролиферативную активность клеточной линии метастатической меланомы Mel Ког и рака молочной железы T47D, которые практически не экспрессировали ФРФР2.
Наибольший ингибирующий эффект достигнут при культивировании ингибитора RPT835 с модифицированной линия немелкоклеточного рака легкого А549, которая имела выраженную экспрессию ФРФР2 (1С 50=10 nM/L).
Таким образом, в исследовании in vitro показано, что ингибитор RPT835 оказывает антипролиферативное действие на опухолевые и эндотелиальные клетки, которое коррелирует со степенью выраженности экспрессии ФРФР2. Это подчеркивает специфическую активность ингибитора. Пример 13 (Результаты исследования): ингибирование роста опухоли in vivo в зависимости от уровня экспрессии ФРФР2 при использовании ингибитора RPT835
Самкам иммуно дефицитных мышей (nude) возрастом 8 недель были введены 2x106 опухолевых клеток человеческих клеточных линий с различной экспрессией ФРФР2:
- клеточная линия трижды-негативного рака молочной железы SUM52PE, сильно экспрессирующая ФРФР2 (приобретена в Asterand, Inc. (Detroit, MI)
- клеточная линия трижды-негативного рака молочной железы HS578T, слабо экспрессирующая ФРФР2 (приобретена в АТСС (CRL-125)
- клеточная линия немелкоклеточного рака легкого NCI-H226, не экспрессирующая ФРФР2 (приобретена в АТСС (CRL-5826)
После того, как установился рост опухоли (1 мм ), мыши были разделены на контрольные и лечебные группы в соответствии с видом опухоли.
Контрольная группа 1 (N=10): SUM52PE, введение воды через желудочный зонд, ежедневно
Лечебная группа 1 (N=10): SUM52PE, введение ингибитора RPT835 через желудочный зонд в дозе 30 мг/кг, ежедневно
Контрольная группа 2 (N=10): HS578T, введение воды через желудочный зонд, ежедневно Лечебная группа 2 (Ν=10): HS578T, введение ингибитора RPT835 через желудочный зонд в дозе 30 мг/кг, ежедневно
Контрольная группа 3 (N=10): NCI-H226, введение воды через желудочный зонд, ежедневно
Лечебная группа 3 (N=10): NCI-H226, введение ингибитора RPT835 через желудочный зонд в дозе 30 мг/кг, ежедневно.
Размер опухоли и вес животных измеряли каждые 3 дня. Мыши подвергались эвтаназии при достижении опухоли размера 2000 мм3 или на 60 день эксперимента.
График роста опухоли в группах 1 представлен на Фигуре 16, объем опухоли - в таблице 3. У тех мышей, которым вводился ингибитор RPT835, отмечено достоверное торможение агрессивного роста опухоли SUM52PE (ΡΟ,ΟΟΟ, начиная с 16 дня эксперимента). На 31 день средний объем опухоли в группах отличался более, чем в 2 раза и составил в контрольной группе 2712.2 ± 37 ммЗ, в лечебной - 1080.7 ± 49 ммЗ. Торможение опухолевого роста было 60,2%. Согласно правилам исследования (объем опухоли >2000 ммЗ), мыши из контрольной группы были подвергнуты эвтаназии. Наблюдение за мышами из лечебной группы было продолжено. В группе выявлена стабилизация болезни (отсутствие опухолевого роста в течение последующего периода наблюдения), что расценивается как положительный эффект. Следовательно, ингибитор RPT835 продемонстрировал противоопухолевую эффективность в эксперименте in vivo в отношении трижды-негативного рака молочной железы SUM52PE, сильно экспрессирующего ФРФР2.
График роста опухоли в группах 2 представлен на Фигуре 17.
Как видно из рисунка, ингибитор RPT835 также оказывал некоторое угнетение роста опухоли трижды-негативного рака молочной железы HS578T, слабо экспрессирующего ФРФР2. Однако, различия были менее значимыми, чем при использовании ингибитора RPT835 в модели трижды-негативного рака молочной железы с сильной экспрессией ФРФР2. Так, средний объем опухоли в лечебной и контрольной группах 2 на 31 день исследования составил 703±89.1 ммЗ и 1053±179.8 ммЗ, а на 40 день - 1104±162.2 ммЗ и 1592±335 ммЗ (Р=0.01), соответственно. Торможение роста опухоли на 31 и 40 дни было 33,2% и 30,6%.
График роста опухоли в группах 3 представлен на Фигуре 18.
На 31 день эксперимента достоверных отличий в росте немелкоклеточного рака легкого NCI-H226, не экспрессирующего ФРФР2, между контрольной и лечебной группами 3 выявлено не было: средний объем опухоли составил 1114±280.6 ммЗ и 1053±259.7 ммЗ, соответственно (Р=0.619).
По результатам исследования in vivo были сделаны основные выводы: 1) ингибитор RPT835 оказывает выраженное противоопухолевое действие; 2) Степень торможения роста опухоли при использовании ингибитора RPT835 зависит от уровня экспрессии ФРФР2.
Пример 14 (Результаты исследования in vivo): ингибитор RPT835 вызывает лечебный патоморфоз некоторых опухолей
Иммунодефицитным мышам (Nude, возраст мышей на момент начала лечения 8 недель; питомник «Пущино») были подкожно перевиты клетки ФРФР-2 экспрессирующей человеческой линии рака яичников SKOV-3. При достижении среднего объема опухоли в 200 ммЗ мыши были рандомизированы в группы контроля (стандартная химиотерапия паклитакселом и кароплатином) и лечения (ингибитор RPT835). В каждой группе было 10 мышей. Ингибитор RPT835 назначался в дозе 50 мг/кг, ежедневно. Измерение объема опухоли проводилась дважды в неделю. При достижении объема опухоли 2000 ммЗ мыши подвергались эвтаназии. Проводилось изучение патоморфоза опухолевой ткани.
В группе контроля патоморфоз выявлен не был (Фигура 19). Опухолевая ткань была без изменений. В лечебной группе при применении ингибитора RPT835 наблюдался выраженный терапевтический патоморфоз как макроскопически, так и микроскопически (Фигура 20). В опухоли были выявлены обширные некрозы (более 75% опухоли представлены массивными некрозами, живые опухолевые клетки сохранились только по периферии опухоли). Также отмечалось раннее повреждение сосудов внутри пока еще жизнеспособной ткани. В опухолевых клетках наблюдалась дистрофия.
Таким образом, был сделан вывод, что ингибитор RPT835 вызывает лечебный патоморфоз некоторых опухолей, в частности, рака яичников.
Пример 15 (Результаты исследования in vivo): эффективность ингибиторов, описываемых в настоящем изобретении, при ревматических болезнях
В исследовании была использована модель коллаген-индуцированного артрита (Collagen- Induced Arthritis). Артрит у мышей вызывался внутридерамальными инъекциями коллагена II типа, комбинированного с адъювантом Фрейнда. Мыши были рандомизированы в 2 группы по 5 животных в каждой:
- группа 1 : контроль, вода через зонд, в течение 40 дней
- группа 2: ингибитор, описанный формулой III в настоящем изобретении, 100 мг/кг, через зонд, в течение 40 дней
На 41-й день мыши подвергались эвтаназии, ткань изучалась.
В контрольной группе был выявлен синовиит, разрушение хряща, массивная периартикулярная инфильтрация ткани Т- и В- лимфоцитами, нейтрофилами.
В лечебной группе была выявлена только незначительная инфильтрация единичными нейтрофилами.
Таким образом, ингибиторы, описываемые в изобретении, могут быть эффективны при ревматических болезнях и болезнях соединительной ткани.
Пример 16 (Результаты исследования in vivo): ингибиторы, описываемые в настоящем изобретении, не сопровождаются развитием выраженной токсичности
Токсичность ингибитора RPT835 была оценена в исследованиях in vivo, описанных в Примере 13. Согласно стандартной методике, оценивались все нежелательные явления, равно как и потеря веса животных при использовании ингибитора в сравнении с группой контроля. Ни потери веса, ни каких-либо нежелательных побочных эффектов терапии в этих исследованиях выявлено не было.
Кроме того, в отдельном исследовании проводилось изучение острой токсичности ингибитора RPT835B следующем объеме: - исследована острая токсичность препарата. Результаты токсикометрии, данные наблюдений за экспериментальными животными на протяжении 14 дней после острого введения, а также данные некропсии позволяют отнести препарат к IV классу малотоксичных (Н. Hodge et al. Clinical Toxicology of Commercial Products. Acute Poisoning. Ed. IV, Baltimore, 1975, 427 p.; K.K. Сидоров, 1977). Состояние животных после острого введения свидетельствует о хорошей переносимости препарата в дозах, превышающих максимальные терапевтические (порядка 4,3 мкг/кг) в десятки - сотни раз. Среднесмертельная доза (ЛД50) составила более 2000,0 мг/кг;
- по результатам макро и микроскопии препарат не обладает раздражающим действием на слизистую желудочно-кишечного тракта при однократном введении;
- по результатам исследования мутагенного действия (хромосомные аберрации) препарат не обладает мутагенными свойствами;
- препарат не проявляет аллергенных свойств, выявляемых в реакции иммунных комплексов, общей анафилаксии, дегрануляции тучных клеток и конъюнктивальной пробе.
По результатам этих исследований был сделан вывод об отсутствии выраженной токсичности при применении ингибитора RPT835, как примера ингибиторов, описываемых в настоящем изобретении.

Claims

Формула
1. Ингибиторы, механизм действия которых включает всё из перечисленного:
1) нарушение взаимодействия рецептора фактора роста фибробластов и FRS2, что в результате приводит к снижению фосфорилирования и потери активности FRS2, а также, возможно, но необязательно, нарушение взаимодействия с другими компонентами комплекса FRS2;
2) отсутствие влияния на внутриклеточную тирозинкиназу рецептора фактора роста фибробластов и на фосфорилирование самого рецептора;
3) отсутствие воздействия на внутриклеточную тирозинкиназу других рецепторов с тирозинкиназной активностью и на их фосфорилирование;
4) отсутствие взаимодействия с активным центром рецептора фактора роста фибробластов и взаимодействия с активным центром других рецепторов;
5) избирательное нарушение взаимодействия FRS2 преимущественно с одним типом рецептора фактора роста фибробластов, или в некоторых исключительных случаях - несколькими типами рецептора фактора роста фибробластов;
2. Ингибиторы по п.1, представленные химическими формулами I-XI, описанными в настоящем изобретении.
3. Ингибитор по п. 1, представленный в настоящем изобретении химической формулой II, относящийся к 3-( -(4-метил-2-нитро-5-(пиридин-3-ил)фенил)сульфамоил)бензойная кислота, нарушающий взаимодействие рецептора фактора роста фибробластов 2 типа и FRS2.
4. Фармацевтически приемлемые соли и композиции ингибиторов по п. 1, а также комбинации ингибиторов по п. 1 с другими терапевтически активными агентами.
5. Способ использования ингибиторов по п.1 для профилактики и лечения рака и других заболеваний.
PCT/EA2014/000013 2014-05-22 2014-06-06 Селективные ингибиторы, нарушающие взаимодействие рецептора фактора роста фибробластов и frs2, для профилактики и лечения рака и других заболеваний Ceased WO2015176730A1 (ru)

Priority Applications (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP14892456.6A EP3146965B1 (en) 2014-05-22 2014-06-06 Selective inhibitors interfering with fibroblast growth factor receptor and frs2 interaction for the prevention and treatment of cancer and other diseases
JP2017513314A JP6365999B2 (ja) 2014-05-22 2014-06-06 癌の予防及び治療のための線維芽細胞増殖因子受容体とｆｒｓ２との相互作用に干渉する選択的阻害剤
CN201480079337.4A CN106535882B (zh) 2014-05-22 2014-06-06 干扰成纤维细胞生长因子受体和frs2相互作用用于预防和治疗癌症和其他疾病的选择性抑制剂
ES14892456T ES2734649T3 (es) 2014-05-22 2014-06-06 Inhibidores selectivos que interfieren con la interacción del receptor del factor de crecimiento de fibroblastos y FRS2 para la prevención y el tratamiento de cáncer y otras enfermedades
US15/355,506 US9957236B2 (en) 2014-05-22 2016-11-18 Selective inhibitors interfering with fibroblast growth factor receptor and FRS2 interaction for the prevention and treatment of cancer and other diseases

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EA201400495A EA028614B1 (ru) 2014-05-22 2014-05-22 Селективные ингибиторы, нарушающие взаимодействие рецептора фактора роста фибробластов и frs2, для профилактики и лечения рака
EA201400495 2014-05-22

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
US15/355,506 Continuation US9957236B2 (en) 2014-05-22 2016-11-18 Selective inhibitors interfering with fibroblast growth factor receptor and FRS2 interaction for the prevention and treatment of cancer and other diseases

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2015176730A1 true WO2015176730A1 (ru) 2015-11-26

Family

ID=54553457

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/EA2014/000013 Ceased WO2015176730A1 (ru) 2014-05-22 2014-06-06 Селективные ингибиторы, нарушающие взаимодействие рецептора фактора роста фибробластов и frs2, для профилактики и лечения рака и других заболеваний

Country Status (7)

Country Link
US (1) US9957236B2 (ru)
EP (1) EP3146965B1 (ru)
JP (1) JP6365999B2 (ru)
CN (1) CN106535882B (ru)
EA (1) EA028614B1 (ru)
ES (1) ES2734649T3 (ru)
WO (1) WO2015176730A1 (ru)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109251983B (zh) * 2018-08-15 2022-03-25 深圳市罗湖区人民医院 Frs2基因的拷贝数扩增及其应用、检测拷贝数扩增的特异性引物对
WO2020104822A1 (en) 2018-11-23 2020-05-28 Grey Wolf Therapeutics Limited Compounds
WO2020131627A1 (en) 2018-12-19 2020-06-25 Array Biopharma Inc. Substituted pyrazolo[1,5-a]pyridine compounds as inhibitors of fgfr tyrosine kinases
EP3898615A1 (en) 2018-12-19 2021-10-27 Array Biopharma, Inc. 7-((3,5-dimethoxyphenyl)amino)quinoxaline derivatives as fgfr inhibitors for treating cancer
EP4161513A1 (en) * 2020-06-08 2023-04-12 Universität Zürich Small-molecule inhibitors of the frs2-fgfr interaction

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004087814A1 (en) * 2003-04-02 2004-10-14 Avecia Inkjet Limited Magenta metal chelate dyes and their use in ink-jet printers
US20120277295A1 (en) * 2006-03-23 2012-11-01 Tmrc Co., Ltd. Kit for cancer treatment and pharmaceutical composition for cancer treatment
US20120329861A1 (en) * 2004-01-21 2012-12-27 New York University Treatment of cancer using benzoic acid derivatives

Family Cites Families (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US439179A (en) 1890-10-28 Boot or shoe polishing machine
US3773919A (en) 1969-10-23 1973-11-20 Du Pont Polylactide-drug mixtures
US4485045A (en) 1981-07-06 1984-11-27 Research Corporation Synthetic phosphatidyl cholines useful in forming liposomes
US4544545A (en) 1983-06-20 1985-10-01 Trustees University Of Massachusetts Liposomes containing modified cholesterol for organ targeting
US5013556A (en) 1989-10-20 1991-05-07 Liposome Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
US7105682B2 (en) 2001-01-12 2006-09-12 Amgen Inc. Substituted amine derivatives and methods of use
AU2003247141A1 (en) 2002-08-01 2004-02-23 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem 4-anilido substituted quinazolines and use thereof as inhibitors of epidermal growth factor receptor kinases
US7872016B2 (en) * 2004-05-25 2011-01-18 Yale University Method for treating skeletal disorders resulting from FGFR malfunction
TW200820970A (en) * 2006-09-21 2008-05-16 Nicholas Piramal India Ltd Compounds for the treatment of metabolic disorders
PE20081581A1 (es) * 2006-12-21 2008-11-12 Plexxikon Inc COMPUESTOS PIRROLO[2,3-b]PIRIDINAS COMO MODULADORES DE QUINASA
US7776877B2 (en) 2007-06-22 2010-08-17 Chemocentryx, Inc. N-(2-(hetaryl)aryl) arylsulfonamides and N-(2-(hetaryl) hetaryl arylsulfonamides
CN103209960A (zh) * 2010-07-26 2013-07-17 百时美施贵宝公司 用作cyp17抑制剂的磺酰胺化合物
WO2012042915A1 (en) * 2010-10-01 2012-04-05 Raqualia Pharma Inc. Sulfamoyl benzoic acid heterobicyclic derivatives as trpm8 antagonists
EA026953B1 (ru) * 2012-02-28 2017-06-30 Астеллас Фарма Инк. Азотсодержащее ароматическое гетероциклическое соединение
US20150072019A1 (en) * 2012-03-30 2015-03-12 Novartis Ag Fgfr inhibitor for use in the treatment of hypophosphatemic disorders

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004087814A1 (en) * 2003-04-02 2004-10-14 Avecia Inkjet Limited Magenta metal chelate dyes and their use in ink-jet printers
US20120329861A1 (en) * 2004-01-21 2012-12-27 New York University Treatment of cancer using benzoic acid derivatives
US20120277295A1 (en) * 2006-03-23 2012-11-01 Tmrc Co., Ltd. Kit for cancer treatment and pharmaceutical composition for cancer treatment

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
STEPANOVA EVGENIA ET AL.: "Targeting angiogenesis driven by fibroblast growth factor using RPT835, an FGFR2 inhibitor.", J CLIN ONCOL, 2013, XP008184214, Retrieved from the Internet <URL:http://meetinglibrary.asco.org/content/I 16060-132> *

Also Published As

Publication number Publication date
EA028614B1 (ru) 2017-12-29
CN106535882B (zh) 2019-06-04
EP3146965B1 (en) 2019-05-01
EA201400495A1 (ru) 2015-11-30
US20170183315A1 (en) 2017-06-29
ES2734649T3 (es) 2019-12-11
US9957236B2 (en) 2018-05-01
EP3146965A4 (en) 2018-01-03
JP2017530111A (ja) 2017-10-12
JP6365999B2 (ja) 2018-08-01
EP3146965A1 (en) 2017-03-29
CN106535882A (zh) 2017-03-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Zhu et al. AXL receptor tyrosine kinase as a promising anti-cancer approach: functions, molecular mechanisms and clinical applications
Xiao et al. Targeting EphA2 in cancer
Li et al. Copper improves the anti-angiogenic activity of disulfiram through the EGFR/Src/VEGF pathway in gliomas
Venkatesh et al. Targeting Notch signalling pathway of cancer stem cells
AU2016244262B2 (en) Combination therapy for the treatment of glioblastoma
Liang et al. VEGF signal system: the application of antiangiogenesis
WO2015176730A1 (ru) Селективные ингибиторы, нарушающие взаимодействие рецептора фактора роста фибробластов и frs2, для профилактики и лечения рака и других заболеваний
KR20160126984A (ko) 아필리모드 조성물 및 이를 사용하기 위한 방법
US10703747B2 (en) Benzothiophene-based selective mixed estrogen receptor downregulators
CN105283178A (zh) 用于治疗癌症的包含mps-1激酶抑制剂和有丝分裂抑制剂的组合
US20180250260A1 (en) Methods for treating cancer
Beyer et al. Are tyrosine kinase inhibitors promising for the treatment of systemic sclerosis and other fibrotic diseases?
CA2983013A1 (en) Methods for treating cancer
WO2020139999A1 (en) Pancreatic cancer treatment
UA79733C2 (en) Pharmaceutical composition which interfere with vegf/vegf and angiopoietin/tie receptor function and their use (ii)
Koli et al. Lung cancer receptors and targeting strategies
US20230112450A1 (en) Combined use of ctb006 and ponatinib
Xiong et al. Anlotinib inhibits cervical cancer cell proliferation and invasion by suppressing cytokine secretion in activated cancer-associated fibroblasts
CN116327772B (zh) SMO抑制剂Sonidegib对管腔型乳腺癌骨转移的靶向治疗方法
JP2025509613A (ja) がん治療のためのＭｅｔＡＰ２阻害剤を含む組み合わせ
TW202604478A (zh) 用於治療實體腫瘤之組合療法
Distler Are tyrosine kinase inhibitors promising for the treatment of systemic sclerosis and other fibrotic diseases?
US20200062839A1 (en) Use of dianhydrogalactitol or analogs and derivatives in combination with vegf inhibitors to treat cancer
Leng et al. A Polysaccharides-Based Organohydrogel Delivers Ezh2 Inhibitor to Epigenetically Reprogram Chemo/Immuno-Resistance in Unresectable Metastatic Melanoma
Xie The role of mesenchymal-epithelial transition factor (c-MET) in cancer development and treatments

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 14892456

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

REEP Request for entry into the european phase

Ref document number: 2014892456

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2014892456

Country of ref document: EP

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2017513314

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE