WO2015178639A1 - 신규 베타-갈락토시다아제 - Google Patents

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WO2015178639A1
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galactosidase
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recombinant
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최재열
반재구
박승환
김의중
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    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2468—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1) acting on beta-galactose-glycoside bonds, e.g. carrageenases (3.2.1.83; 3.2.1.157); beta-agarase (3.2.1.81)
    • C12N9/2471—Beta-galactosidase (3.2.1.23), i.e. exo-(1-->4)-beta-D-galactanase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/04—Polysaccharides, i.e. compounds containing more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic bonds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01023—Beta-galactosidase (3.2.1.23), i.e. exo-(1-->4)-beta-D-galactanase

Definitions

  • the present invention relates to novel beta-galactosidase, and more particularly, novel beta-galactosidase from Bacillus circulans, genes encoding the same, recombinant vectors and recombinant microorganisms containing the genes, It relates to a method for producing beta-galactosidase using the recombinant microorganisms and a method for producing galactooligosaccharides using the beta-galactosidase.
  • Beta-galactosidase hydrolyzes non-reducing terminal beta-D-galactose from beta-D-galactopyranoside, such as lactose Or catalyze the transfer reaction of galactose.
  • the enzyme has two properties, hydrolytic activity and sugar transfer activity, both of which are industrially applicable.
  • the hydrolytic activity hydrolyzes the lactose of milk and dairy products to prevent lactose intolerance and enhances the sweetness.
  • the sugar transfer activity is used to produce galactooligosaccharides that promote the growth of lactic acid bacteria, a useful microorganism in the human intestine. .
  • Beta-galactosidase is found in a variety of microorganisms, plants, and animals, but the majority of beta-galactosidase currently used industrially is isolated from microorganisms. Beta-galactosidase with different specificity of sugar transfer reaction was isolated from Bacillus sp, Aspergillus sp, Saccharomyces sp and others from other thermophilic microorganisms. Various studies have been conducted on heat-resistant enzymes.
  • beta-galactosidase used in the production of galactooligosaccharides worldwide is mostly derived from Bacillus or Aspergillus, especially from Bacillus, specifically, from Bacillus Circulans, It is one of the most used commercially because of the activity temperature of 60 °C and high sugar transfer activity, in particular, beta-galactosidase derived from Bacillus Circulus ATCC 31382 is sold under the name BIOLACTA (Amano).
  • BIOLACTA Bacillus Circulus ATCC 31382
  • beta-galactosidase from Bacillus circulat ATCC 31382 have been reported in various literatures.
  • the microorganisms reported the presence of three structural isoforms of beta-galactosidase, and according to protein size, 212 kDa beta-galactosidase I, 145 kDa beta-galactosidase II, and 86 It is named beta-galactosidase III of kDa.
  • the gene sequences of the three subtypes are beta-galactosidase I at Amano (WO2010 / 140435), beta-galactosidase II at GenoFocus (Korean Patent No.
  • beta-galacto Cedarase III was identified in the Ito group (Ito Y. et al., Biosci Biotechnol Biochem., 61: 1270-6, 1997). Of these three subtypes, beta-galactosidase I and II were found to be available for the synthesis of galactooligosaccharides. To date, various groups of studies have reported that there are only three beta-galactosidase genes in Bacillus Circus.
  • beta-galactosidase subtype is present in Bacillus Circus, it is a beta-glycosidase having the properties of another beta-galactosidase, which is different from the three beta-galactosidases identified so far. It was anticipated that genes of the beta-glycosidase family could exist, and as a result, efforts to identify novel beta-glycosidases resulted in three reported beta-galactosidases previously reported in Bacillus Circulans. Except for the existence of another novel beta-galactosidase and its gene sequence was confirmed, the present invention was completed.
  • Another object of the present invention is to provide a gene encoding the novel beta-galactosidase.
  • Still another object of the present invention is to provide a recombinant vector containing the gene and a recombinant microorganism into which the gene or the recombinant vector is introduced.
  • Another object of the present invention to provide a method for producing a novel beta-galactosidase using the recombinant microorganism.
  • Another object of the present invention to provide a method for producing galactooligosaccharides using the novel beta-galactosidase.
  • the present invention provides a beta-galactosidase having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the present invention also provides a gene encoding the beta-galactosidase and a recombinant vector comprising the gene.
  • the present invention also provides a recombinant microorganism in which the gene or the recombinant vector is inserted into a host cell selected from the group consisting of bacteria, fungi and yeasts.
  • the present invention also comprises the steps of culturing the recombinant microorganism to produce beta-galactosidase; And it provides a method for producing beta-galactosidase comprising the step of recovering the generated beta-galactosidase.
  • the present invention also comprises the steps of reacting the beta-galactosidase with a lactose-containing substrate to produce galactoligosaccharides; And it provides a method for producing galactoligosaccharides comprising the step of recovering the prepared galactoligosaccharides.
  • Figure 1 is a schematic diagram showing the size and location of the ORF of the beta-galactosidase gene identified in fragments treated with HpaI restriction enzyme genomic DNA of Bacillus Circulans.
  • Figure 2 shows the results of confirming the protein expression of recombinant beta-galactosidase produced in E. coli DH5 ⁇ / pACE-BgaI.New transformed with recombinant beta-galactosidase gene by SDS-PAGE (M: protein size Marker, 1: DH5 ⁇ / None, 2: DH5 ⁇ / pACE-BgaI.New, arrow: beta-galactosidase).
  • Figure 3 shows the optimal temperature of recombinant beta-galactosidase produced in transformed E. coli DH5 ⁇ / pACE-BgaI.New.
  • the present invention relates to a beta-galactosidase having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and a gene encoding the beta-galactosidase.
  • beta-glycosidase family gene having the properties of another additional beta-galactosidase other than the three beta-galactosidases identified so far in Bacillus Circus.
  • a novel beta-galactosidase gene was isolated from the genome of Bacillus Circulans.
  • the genomic DNA of Bacillus circus ATCC 31382 is cleaved with 23 restriction enzymes to prepare a genomic library for beta-galactosidase cloning, and has beta-galactosidase activity in the library. Strains were selected.
  • the nucleotide sequence of the fragment containing the novel beta-galactosidase gene is shown in SEQ ID NO: 3, the total size of the DNA fragment containing the beta-galactosidase gene is 6731bp, and in the fragment three ORFs ( Open Reading Frames) were found (FIG. 1).
  • the third ORF was composed of a DNA size of 3105bp (SEQ ID NO: 2) and 1035 amino acids (SEQ ID NO: 1), and was confirmed to have beta-galactosidase activity.
  • the invention is a recombinant vector containing the gene encoding the beta-galactosidase and the gene encoding the beta-galactosidase or the recombinant vector is selected from the group consisting of bacteria, fungi and yeast
  • the present invention relates to a recombinant microorganism inserted into a host cell.
  • the term "vector” refers to a DNA preparation containing a DNA sequence operably linked to a suitable regulatory sequence capable of expressing the DNA in a suitable host.
  • the vector may be a plasmid, phage particles, or simply a potential genomic insert. Once transformed into the appropriate host, the vector can replicate and function independently of the host genome, or in some cases can be integrated into the genome itself. Since plasmids are the most commonly used form of current vectors, "plasmid” and “vector” are sometimes used interchangeably in the context of the present invention. However, the present invention includes other forms of vectors having functions equivalent to those known or known in the art. Typical expression vectors for mammalian cell culture expression are based on, for example, pRK5 (EP 307,247), pSV16B (WO 91/08291) and pVL1392 (Pharmingen).
  • expression control sequence refers to a DNA sequence essential for the expression of a coding sequence operably linked in a particular host organism.
  • regulatory sequences include promoters for performing transcription, any operator sequence for regulating such transcription, sequences encoding suitable mRNA ribosomal binding sites, and sequences that control termination of transcription and translation.
  • suitable control sequences for prokaryotes include promoters, optionally operator sequences, and ribosomal binding sites.
  • Eukaryotic cells include promoters, polyadenylation signals, and enhancers. The factor that most influences the amount of gene expression in the plasmid is the promoter.
  • an SR ⁇ promoter a promoter derived from cytomegalovirus, and the like are preferably used.
  • any of a wide variety of expression control sequences can be used in the vector.
  • useful expression control sequences include, for example, early and late promoters of SV40 or adenovirus, lac system, trp system, TAC or TRC system, T3 and T7 promoters, major operator and promoter region of phage lambda, fd Regulatory regions of the code protein, promoters for 3-phosphoglycerate kinase or other glycolysis enzymes, promoters of the phosphatase such as Pho5, promoters of the yeast alpha-crossing system and prokaryotic or eukaryotic cells or viruses thereof And other sequences of constitution and induction known to modulate the expression of the genes, and various combinations thereof.
  • the T7 RNA polymerase promoter ⁇ 10 is two. It can be usefully used to express protein NSP in E. coli.
  • Nucleic acids are "operably linked” when placed in a functional relationship with other nucleic acid sequences. This may be genes and regulatory sequence (s) linked in such a way as to allow gene expression when appropriate molecules (eg, transcriptional activating proteins) bind to regulatory sequence (s).
  • the DNA for a pre-sequence or secretion leader is operably linked to the DNA for the polypeptide when expressed as a shear protein that participates in the secretion of the polypeptide;
  • a promoter or enhancer is operably linked to a coding sequence when it affects the transcription of the sequence;
  • the ribosomal binding site is operably linked to a coding sequence when it affects the transcription of the sequence;
  • the ribosomal binding site is operably linked to a coding sequence when positioned to facilitate translation.
  • "operably linked” means that the linked DNA sequence is in contact, and in the case of a secretory leader, is in contact and present within the reading frame.
  • enhancers do not need to touch. Linking of these sequences is performed by ligation (linking) at convenient restriction enzyme sites. If such sites do not exist, synthetic oligonucleotide adapters or linkers according to conventional methods are used.
  • expression vector generally refers to a fragment of DNA that is generally double stranded as a recombinant carrier into which fragments of heterologous DNA have been inserted.
  • heterologous DNA refers to heterologous DNA, which is DNA not naturally found in host cells.
  • the gene must be operably linked to transcriptional and translational expression control sequences that function in the selected expression host.
  • the expression control sequence and the gene of interest are included in one expression vector including the bacterial selection marker and the replication origin. If the expression host is a eukaryotic cell, the expression vector must further comprise an expression marker useful in the eukaryotic expression host.
  • Host cells transformed or transfected with the expression vectors described above constitute another aspect of the present invention.
  • transformation means introducing DNA into a host so that the DNA is replicable as an extrachromosomal factor or by chromosomal integration.
  • transfection means that the expression vector is accepted by the host cell whether or not any coding sequence is actually expressed.
  • vectors and expression control sequences function equally in expressing the DNA sequences of the present invention.
  • hosts function equally for the same expression system.
  • those skilled in the art can make appropriate choices among various vectors, expression control sequences and hosts without departing from the scope of the present invention without undue experimental burden. For example, in selecting a vector, the host must be considered, since the vector must be replicated in it. The number of copies of the vector, the ability to control the number of copies, and the expression of other proteins encoded by the vector, such as antibiotic markers, must also be considered. In selecting expression control sequences, several factors must be considered.
  • the relative strength of the sequence, the controllability, and the compatibility with the DNA sequences of the present invention should be considered, particularly with regard to possible secondary structures.
  • Single cell hosts may be selected from a host for the selected vector, the toxicity of the product encoded by the DNA sequence of the invention, the secretory properties, the ability to accurately fold the protein, the culture and fermentation requirements, the product encoded by the DNA sequence of the invention from the host. It should be selected in consideration of factors such as the ease of purification. Within the scope of these variables, one skilled in the art can select a variety of vector / expression control sequence / host combinations capable of expressing the DNA sequences of the invention in fermentation or large scale animal culture.
  • binding method binding method
  • panning method panning method
  • film emulsion method film emulsion method
  • substantially pure in the definition of the present invention is meant that the polypeptide according to the present invention and the DAN sequence encoding the polypeptide are substantially free of other proteins derived from bacteria.
  • Host cells for expressing recombinant proteins are widely used by prokaryotic cells such as Escherichia coli and Bacillus subtillis, which are capable of culturing high concentration cells in a short time, are easily genetically engineered, and whose genetic and physiological characteristics are well known. Has been.
  • prokaryotic cells such as Escherichia coli and Bacillus subtillis
  • yeast strains Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae, Hansenula polymorpha
  • coli which is used as a host cell for recombinant protein production from higher organisms such as filamentous fungi, insect cells, plant cells, and mammalian cells, etc.). As well as using other host cells is readily applicable to those of ordinary skill in the art.
  • the present invention comprises the steps of culturing the recombinant microorganism to produce beta-galactosidase; And it relates to a method for producing beta-galactosidase comprising the step of recovering the generated beta-galactosidase.
  • recombinant beta-galactosidase was prepared using transformed recombinant E. coli (DH5 ⁇ / pACE-BgaI.New), and the pACE (GenoFocus, South Korea) vector is a separate protein for expression. Recombinant protein is possible with cell growth and protein expression separated by microbial culture without the need for inducer addition. Beta-galactosidase produced by the above method was confirmed by SDS-PAGE, the band having a size of 120kDa was confirmed (Fig. 2).
  • the obtained recombinant beta-galactosidase and 4-nitrophenyl-beta-D-galactopyranoside (4-Nitrophenyl- ⁇ -D-Galactopyranoside) (SIGMA) are used as substrates.
  • the optimum activity temperature of the novel beta-galactosidase of the present invention was confirmed to be 40 ° C.
  • the present invention comprises the steps of reacting the beta-galactosidase with a lactose-containing substrate to produce galactoligosaccharides; And it relates to a method for producing galacto-oligosaccharides comprising the step of recovering the prepared galacto-oligosaccharides.
  • the galactooligosaccharide is liquid milk, dry powder milk, infant milk, baby formula, ice cream, yogurt, cheese, dairy products, beverages, infant food, cereals, bread, biscuits, confectionery, cakes, It may be characterized by one component selected from the group consisting of food supplements, dietary supplements, probiotic foodstuffs, prebiotic foodstuffs, animal feed, livestock feed and pharmaceuticals.
  • the galactoligosaccharide of the novel beta-galactosidase of the present invention was confirmed the synthetic ability, the conversion rate of galactoligosaccharide of beta-galactosidase according to the present invention was about 32%.
  • Bacillus Circus ATCC 31382 was cultured in a basal medium of LB (1% tryptone, 0.5% yeast extract, 1% NaCl) medium and 500 ⁇ g of genomic DNA was isolated from the cultured cells (Genomic DNA extraction kit; RBC). .
  • LB 1% tryptone, 0.5% yeast extract, 1% NaCl
  • the isolated genomic DNA was subjected to 23 restriction enzymes AatII, AflII, ApaI, ApaLI, BamHI, BgalII, BsiWI, ClaI, EcoRI, EcoRV, HindIII, HpaI, KpnI, MluI, NcoI, NdeI, NheI, NotI, NsiI, PciI
  • a library was created containing each vector named -gDNA.flag.
  • the library was transformed into E. coli DH5 ⁇ and cultured in LB agar (1% tryptone, 0.5% yeast extract, 1% NaCl, 1.5% agar, 50ug / ml X-gal) containing X-gal. After 24 hours, X-gal in the transformed E. coli colonies (colony) grown in LB agar to show the green colony was determined to be a strain containing a beta-galactosidase function gene, and recovered. The recovered colonies were each incubated in LB liquid medium, and plasmid vectors were recovered from them (Plasmid mini extraction kit; Bioneer) and subjected to sequencing (SolGent).
  • beta-galactosidase gene As a result, several nucleotide sequences of the previously reported beta-galactosidase gene were confirmed, and a new beta-galactosidase gene was identified in the vector library generated by the single treatment of HpaI restriction enzyme.
  • the fragment containing the novel beta-galactosidase gene is shown in SEQ ID NO: 3, and the total size of the DNA fragment containing the beta-galactosidase gene is 6731 bp, in which three ORFs (Open Reading Frames) ) Was found (FIG. 1).
  • the third ORF was composed of a DNA size of 3105bp (SEQ ID NO: 2) and 1035 amino acids (SEQ ID NO: 1), and was confirmed to have beta-galactosidase activity.
  • Recombinant vectors and recombinant microorganisms were prepared using the new beta-galactosidase gene sequence of Bacillus Circus obtained in Example 1.
  • a primer of SEQ ID NO: 4 and SEQ ID NO: 5 was prepared based on the nucleotide sequence of the beta-galactosidase gene of SEQ ID NO: 2.
  • the genomic DNA of Bacillus circus ATCC 31382 was used as a template, and PCR was performed using primers of SEQ ID NO: 4 and SEQ ID NO: 5. After purification of the PCR product, the restriction enzyme sequences NdeI and PstI inserted into each primer were inserted into the same restriction enzyme site in the pACE (GenoFocus, Korea) vector to prepare a vector named pACE-BgaI.New. , The prepared vector was transformed into E. coli DH5 ⁇ strain.
  • Example 3 Preparation of a novel beta-galactosidase derived from Bacillus circus using recombinant microorganisms
  • Recombinant beta-galactosadase was prepared using the recombinant Escherichia coli (DH5 ⁇ / pACE-BgaI.New) prepared in Example 2.
  • pACE GeneFocus Co., Ltd.
  • pACE vector can produce recombinant protein in a state in which cell growth and protein expression are separated only by microbial culture without the addition of an additional inducer for protein expression.
  • 1 ml Erlenmeyer flask containing sterile 100 ml LB (1% tryptone, 0.5% yeast extract, 1% NaCl) medium was inoculated with 5 ml of the transformed recombinant strain culture which had been fully seeded the day before. And incubated at 30 ° C.
  • the transformed recombinant strain was cultured was separated from the culture by centrifugation, and diluted again to the appropriate concentration in sterile distilled water.
  • the recombinant strain transformed with an ultrasonic grinder (VibraCell) was crushed, and finally, cell debris and beta-galactosidase II were separated by centrifugation, and protein electrophoresis (SDS-PAGE) was performed.
  • the beta-galactosidase band of about 120 kDa was confirmed.
  • beta-galactosidase obtained in Example 3.
  • Activity determination of beta-galactosidase was used as a substrate by dissolving 4-nitrophenyl-beta-D-galactopyranoside (SIGMA) in various buffers. After the reaction at 30 ⁇ 60 °C 10% (w / v) sodium carbonate (Na 2 CO 3) using the enzyme reaction was stopped and developed.
  • SIGMA 4-nitrophenyl-beta-D-galactopyranoside
  • the activity of the enzyme confirmed the concentration of free O-nitrophenol at absorbance at 420 nm.
  • One unit of beta-galactosidase was determined by the amount of enzyme that liberates 1 ⁇ mol of O-nitrophenol per minute under these conditions.
  • the optimum activity temperature of the novel beta-galactosidase was confirmed to be 40 °C.
  • the galactooligosaccharide of beta-galactosidase obtained in Example 3 was confirmed for its synthetic ability. Lactose was used as a substrate of galactoligosaccharide, and lactose was dissolved by applying high temperature to 50 mM phosphate buffer (pH 6.0) at a concentration of 500 g / L. 500 ml of lactose solution of 500 g / L concentration was added to a 1 L reactor, the reaction temperature was fixed at 50 ° C., and the stirring speed was maintained at 100 rpm. The dose of beta-galactosidase was administered so that the final concentration was 10 units (U / lactose g). Synthesis time was performed for 48 hours.
  • the analysis of galactoligosaccharides was determined by HPLC (Agilent) with RI detector using a Polyamine II (YMC) column. At this time, the mobile phase was used so that the ratio of acetonitrile and purified water was 65% / 35% (v / v). The flow rate of the mobile phase was 1.0 ml / min.
  • the analysis results of the galactoligosaccharide after the completion of the reaction are shown in Table 1.
  • the conversion rate of galactooligosaccharide was calculated as follows. The amount expressed below represents the peak area measured by HPLC and defines the galactoligosaccharide as the sugar or more sugars except for the monosaccharides glucose, galactose and disaccharide lactose in the product from the lactose substrate.
  • The% content is the ratio for each sugar in the sum of the total sugars (glucose, galactose, lactose and oligosaccharides). Therefore, the conversion rate of galactooligosaccharide by beta-galactosidase according to the present invention was about 32%.

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Abstract

본 발명은 신규 베타-갈락토시다제에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 바실러스 서큘란스 (Bacillus circulans) 유래의 신규 베타-갈락토시다제, 이를 코딩하는 유전자, 상기 유전자를 함유하는 재조합 벡터 및 재조합 미생물, 상기 재조합 미생물을 이용한 베타-갈락토시다제의 제조방법 및 상기 베타-갈락토시다제를 이용한 갈락토올리고당의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 신규 베타-갈락토시다아제를 사용하면, 갈락토올리고당을 효율적으로 대량 생산할 수 있다.

Description

신규 베타-갈락토시다아제
본 발명은 신규 베타-갈락토시다제에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 바실러스 서큘란스 (Bacillus circulans) 유래의 신규 베타-갈락토시다제, 이를 코딩하는 유전자, 상기 유전자를 함유하는 재조합 벡터 및 재조합 미생물, 상기 재조합 미생물을 이용한 베타-갈락토시다제의 제조방법 및 상기 베타-갈락토시다제를 이용한 갈락토올리고당의 제조방법에 관한 것이다.
베타-갈락토시다제(β-galactosidase)는 유당과 같은 베타-D-갈락토피라노사이드(β-D-galactopyranoside)에서 비환원 말단 베타-D-갈락토스(β-D-galactose)를 가수분해하거나, 갈락토스(Galactose)의 전이반응을 촉매한다. 일반적으로 이 효소는 가수분해 활성과 당 전이 활성의 두 가지 특성을 가지고 있는데, 모두 산업적으로 응용성이 있다. 가수분해 활성은 우유와 유제품의 유당을 가수분해하여 유당불내증을 막아주며 감미도를 높여 주고, 당 전이 활성은 인간의 장내 유용미생물인 유산균의 성장을 증진시키는 갈락토올리고당(Galactooligosaccharide)의 제조에 이용된다.
베타-갈락토시다제는 여러 종류의 미생물, 식물, 그리고 동물에서 발견되나, 현재 산업적으로 이용되는 대다수의 베타-갈락토시다제는 미생물에서 분리된 것이다. 당 전이 반응의 특이성이 다른 베타-갈락토시다제가 바실러스 속(Bacillus sp), 아스퍼질러스 속(Aspergillus sp), 사카로마이세스 속(Saccharomyces sp) 등에서 분리되었으며, 그 외의 고온성 미생물에서 분리된 내열성 효소에 관한 연구도 다양하게 진행되었다.
현재 전세계적으로 갈락토올리고당 생산에 사용되는 베타-갈락토시다제는 바실러스 또는 아스퍼질러스 유래의 것이 대다수이며, 특히 바실러스 유래, 구체적으로, 바실러스 서큘란스 유래의 베타-갈락토시다제는 50~60℃의 활성온도와 높은 당 전이 활성 때문에 상업적으로 가장 많이 사용되는 것 중의 하나이며, 특히, 바실러스 서큘란스 ATCC 31382 유래의 베타-갈락토시다제는 BIOLACTA(Amano사)라는 제품명으로 판매되고 있다. 상기 효소는 적절한 배양배지에 바실러스 서큘란스를 배양시킨 후, 세포파쇄 또는 배양배지로부터 회수하는 방법으로 생산된다고 알려져 있다.
또한, 바실러스 서큘란스 ATCC 31382 유래의 베타-갈락토시다제의 특성은 여러 문헌에 보고되어 있다. 상기 미생물에는 3개의 구조적 아형(Isoform)의 베타-갈락토시다제가 존재한다고 보고 하였으며, 단백질 크기에 따라 212 kDa의 베타-갈락토시다제 I, 145 kDa의 베타-갈락토시다제 II, 그리고 86 kDa의 베타-갈락토시다제 III로 명명된다. 상기 3가지 아형 의 유전자 염기서열은 베타-갈락토시다제 I은 Amano사(WO2010/140435)에서, 베타-갈락토시다제 II는 GenoFocus사(대한민국 등록특허 제1,121,161호)에서, 베타-갈락토시다제 III는 Ito 그룹(Ito Y. et al., Biosci Biotechnol Biochem., 61:1270-6, 1997)에서 확인하였다. 이 3가지의 아형중 베타-갈락토시다제 I과 II가 갈락토올리고당 합성에 이용될 수 있다고 확인되었다. 지금까지 다양한 그룹의 연구에서 바실러스 서큘란스에는 3가지의 베타-갈락토시다제 유전자만이 존재한다고 보고하였다.
본 발명자들은 바실러스 서큘란스에 베타-갈락토시다제 아형이 존재한다면, 지금까지 확인된 3종의 베타-갈락토시다제와는 또 다른 추가 베타-갈락토시다제의 특성을 가지는 베타-글리코시다제(beta-glycosidase) 계열의 유전자가 존재할 수 있을 것이라 예상하였고, 이를 바탕으로, 신규 베타-글리코시다제를 확인하기 위하여 노력한 결과, 바실러스 서큘란스에서 기존의 보고된 3가지의 베타-갈락토시다제외에 또 다른 신규한 베타-갈락토시다제의 존재와 이의 유전자 염기서열을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
발명의 요약
본 발명의 목적은 바실러스 서큘란스 유래의 신규 베타-갈락토시다제를 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 신규 베타-갈락토시다제를 코딩하는 유전자를 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 유전자를 함유하는 재조합 벡터 및 상기 유전자 또는 상기 재조합 벡터가 도입되어 있는 재조합 미생물을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 재조합 미생물을 이용한 신규 베타-갈락토시다제의 제조방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 신규 베타-갈락토시다제를 이용한 갈락토올리고당의 제조방법을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 베타-갈락토시다아제를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 베타-갈락토시다아제를 코딩하는 유전자 및 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 유전자 또는 상기 재조합 벡터가 박테리아, 곰팡이 및 효모로 구성된 군에서 선택되는 숙주세포에 삽입되어 있는 재조합 미생물을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 재조합 미생물을 배양하여 베타-갈락토시다제를 생성시키는 단계; 및 상기 생성된 베타-갈락토시다제를 회수하는 단계를 포함하는 베타-갈락토시다제의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 베타-갈락토시다제를 락토스 함유 기질과 반응시켜 갈락토올리고당을 제조하는 단계; 및 상기 제조된 갈락토올리고당을 회수하는 단계를 포함하는 갈락토올리고당의 제조방법을 제공한다.
도 1은 바실러스 서큘란스의 게놈 DNA를 HpaI 제한효소로 처리한 단편에서 확인된 베타-갈락토시다제 유전자의 ORF의 크기 및 위치를 나타낸 모식도이다.
도 2는 재조합 베타-갈락토시다제 유전자가 형질전환된 대장균 DH5α/pACE-BgaI.New에서 생산된 재조합 베타-갈락토시다제의 단백질 발현 양상을 SDS-PAGE로 확인한 결과이다 (M: 단백질 사이즈 마커, 1: DH5α /None, 2: DH5α/pACE-BgaI.New, 화살표: 베타-갈락토시다제).
도 3은 형질전환된 대장균 DH5α/pACE-BgaI.New에서 생산된 재조합 베타-갈락토시다제의 최적 온도를 나타낸 것이다.
발명의 상세한 설명 및 바람직한 구현예
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법 및 이하에 기술하는 실험 방법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
일 관점에서, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 베타-갈락토시다아제 및 상기 베타-갈락토시다아제를 코딩하는 유전자에 관한 것이다.
본 발명에서는 바실러스 서큘란스에서 지금까지 확인된 3종의 베타-갈락토시다제 이외의 또 다른 추가 베타-갈락토시다제의 특성을 가지는 베타-글리코시다제(beta-glycosidase) 계열의 유전자가 존재할 수 있을 것이라 예상하고, 바실러스 서큘란스의 게놈으로부터 신규 베타-갈락토시다아제 유전자를 분리하였다.
본 발명의 일 양태에서는 바실러스 서큘란스 ATCC 31382의 게놈 DNA를 23종의 제한효소로 절단하여, 베타-갈락토시다아제 클로닝용 게놈 라이브러리를 제작하고, 상기 라이브러리에서 베타-갈락토시다아제 활성을 가지는 균주를 선별하였다.
상기 선별된 베타-갈락토시다아제 활성을 가지는 균주가 함유하는 바실러스 서큘란스 게놈 단편을 서열분석을 수행한 결과, 기존에 알려진 바실러스 서큘란스 유래의 베타-갈락토시다아제 유전자를 외에 신규한 서열을 가지는 베타-갈락토시다아제 유전자를 함유하는 단편을 확인하였다.
상기 신규 베타-갈락토시다제 유전자를 함유하는 단편의 염기서열은 서열번호 3에 나타내었으며, 베타-갈락토시다제 유전자가 포함된 DNA 단편의 전체크기는 6731bp이고, 상기 단편에서는 3개의 ORF(Open Reading Frames)가 발견되었다(도 1). 그 중 세번째 ORF가 3105bp의 DNA 크기(서열번호 2)와 1035개의 아미노산(서열번호 1)으로 이루어졌으며, 베타-갈락토시다아제 활성을 갖는 것으로 확인되었다.
다른 관점에서, 본 발명은 상기 베타-갈락토시다아제를 코딩하는 유전자를 함유하는 재조합 벡터 및 상기 베타-갈락토시다아제를 코딩하는 유전자 또는 상기 재조합 벡터가 박테리아, 곰팡이 및 효모로 구성된 군에서 선택되는 숙주세포에 삽입되어 있는 재조합 미생물에 관한 것이다.
본 발명에서 용어 "벡터 (vector)"는 적합한 숙주 내에서 DNA를 발현시킬 수 있는 적합한 조절 서열에 작동가능하게 연결된 DNA 서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 벡터는 플라스미드, 파지 입자, 또는 간단하게 잠재적 게놈 삽입물일 수 있다. 적당한 숙주로 형질전환되면, 벡터는 숙주 게놈과 무관하게 복제하고 기능할 수 있거나, 또는 일부 경우에 게놈 그 자체에 통합될 수 있다. 플라스미드가 현재 벡터의 가장 통상적으로 사용되는 형태이므로, 본 발명의 명세서에서 "플라스미드 (plasmid)" 및 "벡터 (vector)"는 때로 상호 교환적으로 사용된다. 그러나, 본 발명은 당업계에 알려진 또는 알려지게 되는 바와 동등한 기능을 갖는 벡터의 다른 형태를 포함한다. 포유동물 세포 배양물 발현을 위한 전형적인 발현 벡터는 예를 들면 pRK5 (EP 307,247호), pSV16B (WO 91/08291호) 및 pVL1392 (Pharmingen)을 기초로 한다.
"발현 조절 서열 (expression control sequence)"이라는 표현은 특정한 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열의 발현에 필수적인 DNA 서열을 의미한다. 그러한 조절 서열은 전사를 실시하기 위한 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함한다. 예를 들면, 원핵생물에 적합한 조절 서열은 프로모터, 임의로 오퍼레이터 서열 및 리보좀 결합 부위를 포함한다. 진핵세포는 프로모터, 폴리아데닐화 시그날 및 인핸서가 이에 포함된다. 플라스미드에서 유전자의 발현 양에 가장 영향을 미치는 인자는 프로모터이다. 고 발현용의 프로모터로서 SRα 프로모터와 사이토메가로바이러스 (cytomegalovirus) 유래 프로모터 등이 바람직하게 사용된다.
본 발명의 DNA 서열을 발현시키기 위하여, 매우 다양한 발현 조절 서열중 어느 것이라도 벡터에 사용될 수 있다. 유용한 발현 조절서열의 예에는, 예를 들어, SV40 또는 아데노바이러스의 초기 및 후기 프로모터들, lac 시스템, trp 시스템, TAC 또는 TRC 시스템, T3 및 T7 프로모터들, 파지 람다의 주요 오퍼레이터 및 프로모터 영역, fd 코드 단백질의 조절 영역, 3-포스포글리세레이트 키나제 또는 다른 글리콜분해 효소에 대한 프로모터, 상기 포스파타제의 프로모터들, 예를 들어 Pho5, 효모 알파-교배 시스템의 프로모터 및 원핵세포 또는 진핵 세포 또는 이들의 바이러스의 유전자의 발현을 조절하는 것으로 알려진 구성과 유도의 기타 다른 서열 및 이들의 여러 조합이 포함된다. T7 RNA 폴리메라아제 프로모터 Φ10은 이. 콜라이에서 단백질 NSP를 발현시키는데 유용하게 사용될 수 있다.
핵산은 다른 핵산 서열과 기능적 관계로 배치될 때 "작동가능하게 연결 (operably linked)"된다. 이것은 적절한 분자 (예를 들면, 전사 활성화 단백질)은 조절 서열(들)에 결합될 때 유전자 발현을 가능하게 하는 방식으로 연결된 유전자 및 조절 서열(들)일 수 있다. 예를 들면, 전서열(pre-sequence) 또는 분비 리더 (leader)에 대한 DNA는 폴리펩타이드의 분비에 참여하는 전단백질로서 발현되는 경우 폴리펩타이드에 대한 DNA에 작동가능하게 연결되고; 프로모터 또는 인핸서는 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩서열에 작동가능하게 연결되거나; 또는 리보좀 결합 부위는 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결되거나; 또는 리보좀 결합 부위는 번역을 용이하게 하도록 배치되는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 일반적으로, "작동가능하게 연결된"은 연결된 DNA 서열이 접촉하고, 또한 분비 리더의 경우 접촉하고 리딩 프레임 내에 존재하는것을 의미한다. 그러나, 인핸서 (enhancer)는 접촉할 필요가 없다. 이들 서열의 연결은 편리한 제한 효소 부위에서 라이게이션(연결)에 의해 수행된다. 그러한 부위가 존재하지 않는 경우, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터 (oligonucleotide adaptor) 또는 링커(linker)를 사용한다.
본원 명세서에 사용된 용어 "발현 벡터"는 통상 이종의 DNA의 단편이 삽입된 재조합 캐리어 (recombinant carrier)로서 일반적으로 이중 가닥의 DNA의 단편을 의미한다. 여기서, 이종 DNA는 숙주 세포에서 천연적으로 발견되지 않는 DNA인 이형 DNA를 의미한다. 발현 벡터는 일단 숙주 세포내에 있으면 숙주 염색체 DNA와 무관하게 복제할 수 있으며 벡터의 수 개의 카피 및 그의 삽입된 (이종) DNA가 생성될 수 있다.
당업계에 주지된 바와 같이, 숙주세포에서 형질감염 유전자의 발현 수준을 높이기 위해서는, 해당 유전자가, 선택된 발현 숙주 내에서 기능을 발휘하는 전사 및 해독 발현 조절 서열에 작동가능하도록 연결되어야만 한다. 바람직하게는 발현 조절서열 및 해당 유전자는 세균 선택 마커 및 복제 개시점 (replication origin)을 같이 포함하고 있는 하나의 발현 벡터 내에 포함되게 된다. 발현 숙주가 진핵세포인 경우에는, 발현 벡터는 진핵 발현 숙주 내에서 유용한 발현 마커를 더 포함하여야만 한다.
상술한 발현 벡터에 의해 형질전환 또는 형질감염된 숙주 세포는 본 발명의 또 다른 측면을 구성한다. 본원 명세서에 사용된 용어 "형질전환"은 DNA를 숙주로 도입하여 DNA가 염색체외 인자로서 또는 염색체 통합완성에 의해 복제가능하게 되는 것을 의미한다. 본원 명세서에 사용된 용어 "형질감염"은 임의의 코딩 서열이 실제로 발현되든 아니든 발현 벡터가 숙주 세포에 의해 수용되는 것을 의미한다.
모든 벡터와 발현 조절 서열이 본 발명의 DNA 서열을 발현하는데 모두 동등하게 기능을 발휘하지는 않는다는 것을 이해하여야만 한다. 마찬가지로 모든 숙주가 동일한 발현 시스템에 대해 동일하게 기능을 발휘하지는 않는다. 그러나, 당업자라면 과도한 실험적 부담없이 본 발명의 범위를 벗어나지 않는 채로 여러 벡터, 발현 조절 서열 및 숙주 중에서 적절한 선택을 할 수 있다. 예를 들어, 벡터를 선택함에 있어서는 숙주를 고려하여야 하는데, 이는 벡터가 그 안에서 복제되어야만 하기 때문이다. 벡터의 복제 수, 복제 수를 조절할 수 있는 능력 및 당해 벡터에 의해 코딩되는 다른 단백질, 예를 들어 항생제 마커의 발현도 또한 고려되어야만 한다. 발현 조절 서열을 선정함에 있어서도, 여러 가지 인자들을 고려하여야만 한다. 예를 들어, 서열의 상대적 강도, 조절가능성 및 본 발명의 DNA 서열과의 상용성 등, 특히 가능성있는 이차 구조와 관련하여 고려하여야 한다. 단세포 숙주는 선정된 벡터, 본 발명의 DNA 서열에 의해 코딩되는 산물의 독성, 분비 특성, 단백질을 정확하게 폴딩시킬 수 있는 능력, 배양 및 발효 요건들, 본 발명 DNA 서열에 의해 코딩되는 산물을 숙주로부터 정제하는 것의 용이성 등의 인자를 고려하여 선정되어야만 한다. 이들 변수의 범위내에서, 당업자는 본 발명의 DNA 서열을 발효 또는 대규모 동물 배양에서 발현시킬 수 있는 각종 벡터/발현 조절 서열/숙주 조합을 선정할 수 있다. 발현 클로닝에 의해 NSP 단백질의 cDNA를 클로닝 하려고 할 때의 스크리닝법으로서 바인딩법(binding법), 페닝법(panning법), 필름에멀션법(film emulsion 법)등이 적용될 수 있다.
본 발명의 정의상 "실질적으로 순수한"이란 본 발명에 따른 폴리펩타이드 및 폴리펩타이드를 코딩하는 DAN 서열이 박테리아로부터 유래된 다른 단백질을 실질적으로 포함하지 않는 것을 의미한다.
재조합 단백질을 발현하기 위한 숙주세포는 짧은 시간 내 고농도 균체 배양이 가능하고 유전자 조작이 용이하고 유전학적, 생리적 특징이 잘 밝혀져 있는 대장균 (Escherichia coli), 고초균 (Bacillus subtillis) 등과 같은 원핵세포가 널리 이용되어 왔다. 그러나, 단백질의 번역 후 수식 (post-translational modification), 분비과정 및 활성형의 3차원 구조, 단백질의 활성상태의 문제점들을 해결하기 위해 최근 단세포 진핵세포인 효모 계열 (Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae, Hansenula polymorpha 등), 사상성 진균류 (filamentous fungi), 곤충세포 (insect cells), 식물세포, 포유동물세포 (mammalian cells) 등 고등생물에 이르기까지 재조합 단백질 생산의 숙주세포로 활용하고 있으므로, 실시예에서 예시된 대장균 뿐만 아니라 다른 숙주세포를 이용하는 것은 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 용이하게 적용가능하다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 상기 재조합 미생물을 배양하여 베타-갈락토시다제를 생성시키는 단계; 및 상기 생성된 베타-갈락토시다제를 회수하는 단계를 포함하는 베타-갈락토시다제의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명의 일 양태에서는 형질전환된 재조합 대장균 (DH5α/pACE-BgaI.New)를 이용하여 재조합 베타-갈락토시다제를 제조하였으며, 상기 pACE(GenoFocus사,한국) 벡터는 단백질 발현을 위해 별도의 유도제(Inducer) 첨가가 필요 없이 미생물 배양만으로 세포성장과 단백질 발현이 분리된 상태로 재조합 단백질이 가능하다. 상기 방법으로 생산된 베타-갈락토시다제는 SDS-PAGE로 확인결과 120kDa의 크기를 가지는 밴드가 확인되었다(도 2).
본 발명의 다른 양태에서는, 상기 수득한 재조합 베타-갈락토시다제와 4-니트로페닐-베타-D-갈락토피라노사이드(4-Nitrophenyl-β-D-Galactopyranoside)(SIGMA사)를 기질로 하여, 효소 반응의 최적 온도를 확인한 결과, 본 발명의 신규 베타-갈락토시다제의 최적 활성 온도는 40℃로 확인되었다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 상기 베타-갈락토시다제를 락토스 함유 기질과 반응시켜 갈락토올리고당을 제조하는 단계; 및 상기 제조된 갈락토올리고당을 회수하는 단계를 포함하는 갈락토올리고당의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 갈락토올리고당은 액상유, 건조분말우유, 유아 우유, 유아 조제식 (baby formula), 아이스크림, 요거트, 치즈, 유제품, 음료, 유아 식품, 시리얼, 빵, 비스켓, 제과류, 케이크, 식품보조제, 식이보충제, 프로바이오틱 식료품, 프리바이오틱 식료품, 동물 사료, 가축 사료 및 약제로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나의 구성성분인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 또다른 양태에서는 락토스를 기질로 사용하여, 본 발명의 신규 베타-갈락토시다제의 갈락토올리고당을 합성능을 확인하였으며, 본 발명에 따른 베타-갈락토시다제의 갈락토올리고당 전환율은 32% 정도로 확인되었다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 바실러스 서큘란스 유래 신규 베타-갈락토시다제의 클로닝
바실러스 서큘란스 ATCC 31382는 기본 배지인 LB(1% 트립톤, 0.5% 효모추출물, 1% NaCl)배지에서 배양하였으며, 배양된 세포로부터 게놈 DNA 500㎍을 분리(Genomic DNA extraction kit; RBC사)하였다. 상기 분리된 게놈 DNA를 23종의 제한효소 AatII, AflII, ApaI, ApaLI, BamHI, BgalII, BsiWI, ClaI, EcoRI, EcoRV, HindIII, HpaI, KpnI, MluI, NcoI, NdeI, NheI, NotI, NsiI, PciI, PsiI, PstI, PvuI, PvuII, SacI, SalI, ScaI, SpeI, SphI, StuI, XbaI, XhoI 및 XmaI으로 각각 단일 처리하고, 각 제한효소로 잘려진 게놈 DNA 단편 중 1~8 kb의 DNA 단편의 혼합물을 클레노브효소(klenow fragment enzyme; TaKaRa사)로 처리하여 제한효소로 잘려진 DNA 단편의 양 말단을 블런트화(blunt end) 시키고, T-blunt(SolGent사) 벡터에 라이게이션(ligation)하여, T-gDNA.flag로 명명한 각각의 벡터를 함유하는 라이브러리를 제작하였다.
상기 라이브러리를 대장균 DH5α에 형질전환 시키고, X-gal이 함유된 LB agar(1% 트립톤, 0.5% 효모추출물, 1% NaCl, 1.5% 한천, 50ug/ml X-gal)에 배양하였다. 24시간 후 LB agar에서 성장한 형질전환 대장균 콜로니(colony) 중 X-gal을 분해하여 초록색 콜로니를 보이는 것을 베타-갈락토시다제 기능의 유전자를 함유하는 균주로 판단하고, 회수하였다. 회수된 콜로니들을 각각 LB 액체 배지에 배양하고, 이들로부터 플라스미드 벡터를 회수(Plasmid mini extraction kit; Bioneer사)하고, 염기서열 분석(SolGent사)을 하였다.
그 결과, 기존에 보고된 베타-갈락토시다제 유전자의 염기서열이 여러 확인 되었고, HpaI 제한효소를 단일 처리하여 생성한 벡터 라이브러리에서 신규 베타-갈락토시다제 유전자가 확인되었다.
상기 신규 베타-갈락토시다제 유전자를 함유하는 단편을 서열번호 3에 나타내었으며, 베타-갈락토시다제 유전자가 포함된 DNA 단편의 전체크기는 6731bp이고, 상기 단편에서는 3개의 ORF(Open Reading Frames)가 발견되었다(도 1).
그 중 세번째 ORF가 3105bp의 DNA 크기(서열번호 2)와 1035개의 아미노산(서열번호 1)으로 이루어졌으며, 베타-갈락토시다아제 활성을 갖는 것으로 확인되었다.
실시예 2: 베타-갈락토시다제 II 유전자를 함유한 재조합 벡터 및 재조합 미생물의 제조
실시예 1에서 확보된 바실러스 서큘란스의 신규 베타-갈락토시다제 유전자 염기서열을 이용하여 재조합 벡터 및 재조합 미생물을 제조하였다.
서열번호 2의 베타-갈락토시다제유전자의 염기서열을 토대로 하기와 같은 서열번호 4와 서열번호 5의 프라미어(primer)를 제작하였다.
서열번호 4: aaaaatgtcacaattaacgtatga
서열번호 5: aaaactgcagttagtgtaaggtaaatgaat
바실러스 서큘란스 ATCC 31382의 게놈 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 4와 서열번호 5의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다. PCR 산물을 정제 후, 각각의 프라이머에 삽입한 제한효소 서열 NdeI과 PstI을 이용하여, pACE(GenoFocus사, 한국) 벡터에 동일 제한효소 부위에 삽입하여 pACE-BgaI.New로 명명한 벡터를 제조하였고, 상기 제조된 벡터를 대장균 DH5α 균주에 형질전환 시켰다.
실시예 3: 재조합 미생물을 이용한 바실러스 서큘란스 유래의 신규 베타-갈락토시다제 제조
실시예 2에서 제작된 재조합 대장균 (DH5α/pACE-BgaI.New)을 이용하여 재조합 베타-갈락토사다제를 제조하였다. pACE(GenoFocus사,한국) 벡터는 단백질 발현을 위해 별도의 유도제(Inducer) 첨가가 필요 없이 미생물 배양만으로 세포성장과 단백질 발현이 분리된 상태로 재조합 단백질을 생산할 수 있다. 따라서, 멸균된 100 ml LB(1% 트립톤, 0.5% 효모추출물, 1% NaCl)배지가 들어있는 1 L의 삼각플라스크에 전날 충분히 종 배양한 상기 형질전환된 재조합 균주 배양물 5 ml을 접종하였고, 30℃에서 교반속도 200 rpm으로 24시간 배양하였다. 배양이 완료된 상기 형질전환된 재조합 균주는 원심분리에 의해 배양액과 분리하였으며, 멸균 증류수에 적정 농도로 다시 희석하였다. 초음파분쇄기(VibraCell사)로 형질전환된 재조합 균주를 파쇄하고 원심분리로 세포 찌꺼기와 베타-갈락토시다제 II를 최종적으로 분리하여, 단백질 전기영동(SDS-PAGE)을 수행하였다.
그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, 약 120 kDa 정도의 베타-갈락토시다제 밴드를 확인하였다.
실시예 4: 신규 베타-갈락토시다제의 최적 온도 활성 확인
실시예 3에서 수득한 재조합 베타-갈락토시다제를 이용해 최적 온도를 확인하였다. 베타-갈락토시다제의 활성 결정은 다양한 완충액 중에 4-니트로페닐-베타-D-갈락토피라노사이드(4-Nitrophenyl-β-D-Galactopyranoside)(SIGMA사)를 용해시켜 기질로 사용하였으며, 30~60℃에서 반응후 10% (w/v) 소디움 카보네이트(Na2CO3)를 이용하여 효소 반응을 중지시키고 발색시켰다.
상기 효소의 활성은 420 nm에서의 흡광도에서 유리된 O-니트로페놀의 농도를 확인하였다. 베타-갈락토시다제 1 unit는 상기 조건에서 1분당 1 μmol의 O-니트로페놀을 유리시키는 효소의 양으로 결정하였다.
도 3에 나타난 바와 같이, 신규 베타-갈락토시다제의 최적 활성온도는 40℃로 확인되었다.
실시예 5: 신규 베타-갈락토시다제를 이용한 올리고당의 합성
실시예 3에서 수득한 베타-갈락토시다제의 갈락토올리고당을 합성능을 확인하였다. 갈락토올리고당의 기질로서는 락토스를 사용하였으며, 락토스를 500 g/L의 농도로 50mM 인산 완충액(pH 6.0)에 고온을 가해 용해시켰다. 1 L 용량의 반응기에 500g/L 농도의 락토스 용액 500ml을 첨가하였으며, 반응온도는 50℃로 고정하고, 교반속도는 100 rpm을 유지하였다. 베타-갈락토시다제의 투입양은 최종 농도가 10 units(U/락토스 g)가 되도록 투여하였다. 합성시간은 48시간을 수행하였다.
갈락토올리고당의 분석은 폴리아민 II(Polyamine II; YMC사) 컬럼을 사용하여 RI 검출기가 부착된 HPLC(Agilent사)로 측정하였다. 이때 이동상은 아세토니트릴(Acetonitrile)과 정제수의 비율이 65%/35%(v/v)가 되도록 사용하였다. 이때 이동상의 흐름속도는 1.0 ml/min이었다. 상기 반응 완료 후의 갈락토올리고당의 분석결과는 표 1에 나타내었다.
갈락토올리고당의 전환율은 다음과 같이 계산하였다. 이하에 표현하는 양은 HPLC에 측정된 피크(peak) 면적을 나타내며, 락토스 기질로부터의 생성물에서 단당류인 글루코스, 갈락토스와 이당류의 락토스를 제외한 이당류 이상의 당류를 갈락토올리고당으로 정의한다.
갈락토올리고당 전환율(%)
=[전체 당의 양]-[글루코스 양]-[갈락토스 양]-[락토스 양]
표 1
당 조성 4당류 갈락토올리고당 3당류 갈락토올리고당 2당류 갈락토올리고당 락토스 글루코스+갈락토스 총 갈락토올리고당
함량(%) 3.45 19.72 8.87 56.30 11.65 32.04
상기 함량(%)은 전체 당 (글루코스, 갈락토스, 락토스 및 올리고당)의 합에서 각각의 당에 대한 비율이다. 따라서, 본 발명에 따른 베타-갈락토시다제에 의한 갈락토올리고당 전환율은 32% 정도였다.
본 발명에 따른 신규 베타-갈락토시다아제를 사용하면, 갈락토올리고당을 효율적으로 대량 생산할 수 있다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
전자파일 첨부하였음.

Claims (8)

  1. 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 베타-갈락토시다아제.
  2. 제1항의 베타-갈락토시다아제를 코딩하는 유전자.
  3. 제2항에 있어서, 상기 베타-갈락토시다제를 코딩하는 유전자는 서열번호 2의 염기서열을 가지는 것을 특징으로 하는 유전자.
  4. 제2항의 유전자를 포함하는 재조합 벡터.
  5. 제2항의 유전자 또는 제4항의 재조합 벡터가 박테리아, 곰팡이 및 효모로 구성된 군에서 선택되는 숙주세포에 삽입되어 있는 재조합 미생물.
  6. 제5항의 재조합 미생물을 배양하여 베타-갈락토시다제를 생성시키는 단계; 및 상기 생성된 베타-갈락토시다제를 회수하는 단계를 포함하는 베타-갈락토시다제의 제조방법.
  7. 제1항의 베타-갈락토시다제를 락토스 함유 기질과 반응시켜 갈락토올리고당을 제조하는 단계; 및 상기 제조된 갈락토올리고당을 회수하는 단계를 포함하는 갈락토올리고당의 제조방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 갈락토올리고당은 액상유, 건조분말우유, 유아 우유, 유아 조제식 (baby formula), 아이스크림, 요거트, 치즈, 유제품, 음료, 유아 식품, 시리얼, 빵, 비스켓, 제과류, 케이크, 식품보조제, 식이보충제, 프로바이오틱 식료품, 프리바이오틱 식료품, 동물 사료, 가축 사료 및 약제로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나의 구성성분인 것을 특징으로 하는 갈락토올리고당의 제조방법.
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