WO2015197981A1 - Sondes moléculaires activables hydrosolubles, intermédiaires pour leur synthèse et procédés de détection assocés - Google Patents

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École Normale Supérieure de Lyon
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École Normale Supérieure de Lyon
École Normale Supérieure - PSL
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    • C12Y305/01—Hydrolases acting on carbon-nitrogen bonds, other than peptide bonds (3.5) in linear amides (3.5.1)
    • C12Y305/01011—Penicillin amidase (3.5.1.11), i.e. penicillin-amidohydrolase

Definitions

  • the invention relates to activating molecular probes useful in the field of diagnosis, incorporating a spacer arm, which in response to a stimulus which may in particular be the presence of an enzyme, a chemical compound or a physicochemical characteristic in which is found the probe, will self-collapse to release a detectable entity of the fluorophore or chromophore type.
  • Enzymes are many biomarkers of various pathologies. They are also involved in many cellular processes and are therefore the subject of innumerable studies by cell biologists. Thus, their detection can give information concerning a particular metabolic or morbid state, for example. As a result, probes capable of detecting enzymatic activity are very useful and have been the subject of much work.
  • a good aqueous solubility of the molecular probes responding to an enzymatic activity is one of the essential criteria to ensure the reliability of the results they deliver.
  • the addition of co-soJvant organic to dissolve a hydrophobic molecule generally decreases the activity of enzymes significantly.
  • the use of weakly concentrated solutions is acceptable for some in vitro tests, switching to cellular incubations or systemic injections in vivo requires the use of solutions at much higher concentrations because they will be diluted important way once injected.
  • the use of a co-solvent in vivo is excluded.
  • a molecule that is too hydrophobic may accumulate in adipose tissue, and not in the target tissues.
  • a second solution is the grafting of water-solubilizing groups on the signalophore used, often sulphonate groups (Tung et al., Tetrahedrun 2006, 62, 578, Shabat et al J. Am Chem Soc 2011, 133, 10960).
  • the yolosolubilization provided by these units is excellent, but this measurement is unattractive because it risks lowering the performance of the signalophore once released from the initial probe following the enzymatic activity.
  • such a solution is simply unthinkable when it is desired to use signalophores in the solid state.
  • the inventors propose a new generation of probes which, on the one hand, offers a solubility in satisfactory water and, on the other hand, are easily synthesized Mes and modulable, because of the presence a piperazine group which one of the nitrogen atoms can carry various water-solubilizing groups.
  • the inventors have chosen to propose a solution which incorporates a hydrosolutifying part on a 3 "* component of the probe, namely in a spacer connecting the signalophore and the substrate which makes it possible to choose at will any enzymatic substrate and any reporter molecule.
  • SE is a leaving group, and in particular an enzymatic substrate
  • A is an aromatic group which after cleavage in aqueous solution of the C (X 2 ) -O bond leads to the release of a diromophore or a fluorophore,
  • R represents a hydrogen atom or - (L) n-GP, with n which is equal to 0 or 1,
  • L is a link arm
  • GP is a water-solubilising group
  • the present invention enables detecting a chemical or enzymatic analyte capable of cleaving the bond X 1 -SE, by detecting the chromophone or fluorophore which will be released after the cyclisab one of the spacer of the piperazinyl-type formula:
  • the substrate according to the invention acts as a molecular probe capable of revealing the presence of a stimulus such as an enzyme, a compound or a physicochemical characteristic of the medium in which the probe is located (in particular a change in pH).
  • a stimulus such as an enzyme, a compound or a physicochemical characteristic of the medium in which the probe is located (in particular a change in pH).
  • the probe is chemically modified by said stimulus, it breaks down via a cascade reaction to release a detectable chromophore or fluorophore. It is possible that the group A also behaves as a chromophore or a fluorophore when it is bound to the rest of the molecule in the probes of formula (I).
  • the group A may be chosen so that the probe of formula (I) is not detectable by absorption or emission of light, before encountering the stimulus, in the form, in particular, of a enzyme, a chemical compound or a physicochemical characteristic of the medium in which the probe is located (that is to say that the probe is called "stealth").
  • OH or AO ' a tautomeric or polymerized form of A-OH)
  • the probe is composed of four molecular components: i) an intelligent spacer which carries, at one end, H) an SE leaving group and, at the other, an organic group A-O linked by a carbamate or thiocarbamate group; spacer which, when released by fragmentation of the spacer-AO conjugate, to give the corresponding enol or enolate compound, leads to the formation of a detectable chromophore or fluorophore, iv) a water-solubilizing group.
  • the presence of the nitrogen atom carrying the R group makes it possible to modulate the properties of the probe and to introduce a third functionalization, beside the leaving group SE and the group A leading, after elimination. SE group and the cydlsation of the spacer, the release of a detectable chromophore or fluorophore.
  • the probes of formula (I) according to the invention comprise a multifunctionalizable piperazine-type spacer which allows the incorporation of a wide choice of enzyme substrates, and an additional group R that will, depending on its nature to make the molecule even more water soluble.
  • the presence of the nitrogen atom makes it possible, from one and the same synthesis intermediate, to lead to different hydrosolubilizing R functionalizations.
  • the probes according to the invention have an improved solubility, relative to their homologs comprising a piperidinyl spacer, exemplified in the applications WO 2013/045854 and WO 2014/020285 and with respect to the commercial reagents not comprising the any spacer such as 4-methyl-7- (phenylacetamyl) coumarin or 4-methylumbelliferyl acetate for example:
  • the probe comprises a pre-organized spacer for its cydization after removal of the SE-X 1 bond which accelerates the self-collapse process of the spacer, while ensuring good enzymatic recognition.
  • groups are introduced to increase the water-solubility
  • the introduction of a charge or the increase in steric hindrance at the level of the R group, and therefore at a position close to the stimulus site of action (FIG. an enzyme, a chemical compound or a variation of a physicochemical characteristic of the medium in which the probe is located, depending on the nature of the group SE), does not modify the reaction obtained under the action of the corresponding stimulus
  • the present invention therefore relates to the compounds of formula (I), whatever their implementation variant described in the present patent application, for the detection in vivo, in humans or animals, in vitro, in vitro. or o ex vivo, a stimulus such as an enzyme, a chemical compound or a physicochemical characteristic of the medium in which the probe is located, the presence of which leads to the removal of the SE-X 1 bond.
  • a stimulus such as an enzyme, a chemical compound or a physicochemical characteristic of the medium in which the probe is located, the presence of which leads to the removal of the SE-X 1 bond.
  • the invention relates to an in vitro method for detecting, by means of a probe of formula (I) according to the invention, the presence of a stimulus such as an enzyme, a chemical compound or a characteristic physicochemical of the medium in which the probe is located, the presence of which leads to the division of the SE-X 1 bond. More precisely, the invention relates to a method for detecting the presence of a stimulus such as an enzyme, a chemical compound or a physicochemical characteristic of the medium in which the probe is located, the presence of which leads to the cleavage of the SE-X 1 bond, comprising the steps of:
  • the sample may be any suitable biological sample.
  • This may include a sample of biological fluid, including a sample of whole blood, serum, plasma, urine, a tissue sample or isolated cells, and in particular a cell medium.
  • This sample may be used as it is, or may be submitted before bringing the probe into contact with an enrichment-type preparation or culture, which is well known to those skilled in the art.
  • the compounds of formula (I) behave as probes operating in an off / on mode, ie before cleavage by the stimulus (ie an enzyme, a chemical compound or a variation a physicochemical characteristic of the medium in which the probe is located, depending on the nature of the group SE), the probe is "invisible”. It is also possible to choose the group A, so as to obtain different spectral properties between i) the group released after cleavage of the CO bond between the carbon atom carrying the atom (X 2 ) and the atom of oxygen carrier group A and ii) the probe of formula (I).
  • the detection method according to the invention can be carried out under physiological conditions, in particular in an aqueous medium buffered at a pH in the range from 4 to 9, and in particular at a pH of the order of 7.4.
  • a fluorophore is released and its analysis comprises the following steps:
  • a chromophore is released and its analysis comprises the following steps:
  • a color change will be detected following the action of the stimulus (ie, an enzyme, a chemical compound or a variation of a physicochemical characteristic of the medium in which the probe is located, depending of the nature of the SE group).
  • the stimulus ie, an enzyme, a chemical compound or a variation of a physicochemical characteristic of the medium in which the probe is located, depending of the nature of the SE group.
  • SE is a labile group, eliminated in aqueous solution under the action of a stimulus which may in particular be the presence of an enzyme, a chemical compound or a physicochemical characteristic of the medium in which the probe is located.
  • the elimination of SE can in particular be carried out in an aqueous medium.
  • the leaving group SE is susceptible to a chemical compound (a target reagent) or an enzyme.
  • An enzyme is defined as a natural protein that catalyzes a chemical reaction.
  • the leaving group SE ensures the recognition of a target (chemical or enzymatic compound, physico-chemical parameter of the medium), and in particular of an enzyme, selectively localized in a targeted tissue or cell type.
  • the SE groups have the characteristic of being able to be cleaved from the rest of the molecule under the action of a stimulus which may notably be the presence of an enzyme, a chemical compound or a physicochemical characteristic of the medium in which find the probe.
  • a stimulus which may notably be the presence of an enzyme, a chemical compound or a physicochemical characteristic of the medium in which find the probe.
  • the enzyme then acts as a catalyst for the cleavage between SE and the X 1 atom to which it is attached.
  • Such a cut is the consequence of hydrolysis in an aqueous medium for which the enzyme will act as a catalyst.
  • the cleavage involves hydrolysis, it will be referred to as splitting under the action of an enzyme which is catalytically active for the hydrolysis reaction.
  • X 1 will be adapted according to the SE group, and in particular the selected enzyme substrate, so as to obtain the desired divide.
  • X 1 will be an oxygen in the case where SE will be an esterase, glycosidase, phosphatase, sulphatase, or glucuronidase substrate
  • X 1 will be NH in the case where SE will be a protease substrate, in particular amidase, or transferase
  • X 1 will be sulfur in the case where X 1 -SE will be a disulfide bridge which will be cleaved by a reducing agent.
  • a person skilled in the art may choose a substrate for at least one enzyme chosen from esterases such as carboxylesterases or lipases; alkaline phosphatases; glucuronidases such as ⁇ -glucuronidase; glycosidases; proteases such as metalloproteases; peptidases and amidases.
  • esterases such as carboxylesterases or lipases; alkaline phosphatases; glucuronidases such as ⁇ -glucuronidase; glycosidases; proteases such as metalloproteases; peptidases and amidases.
  • the SE group will preferably be chosen to be specific for an enzyme of interest.
  • some enzymes have the ability to cleave a set of different SE moieties; among them, there may be mentioned hexosaminidase, and esterases.
  • Such enzyme substrates will in particular be chosen from glycosyl groups bonded by their anomeric carbon to the rest of the molecule, fatty acids linked by their acyl function to the rest of the molecule, peptidyl groups bound to the rest of the molecule by a function acyl borne by their terminal carbon or a side member, or a sulfonyl group forming a sulfonamide with X 1 which then represents NH.
  • SE may be a glycoside substrate, and in particular galactosidase, and correspond to a glycosyl group bonded by its anomeric carbon to the rest of the molecule.
  • glycosidase is meant a fatty acid enzyme which has the ability to catalyze the hydrolysis of glycosidic linkages so as to release at least one osidic compound.
  • glycosyl any sugar, mono- or polysaccharide bound to the rest of the molecule by a glycosyl bond, that is to say via its anomeric carbon.
  • Anomeric carbon can adopt the alpha or beta configuration.
  • group SE mention may be made of mono-glycosyl groups, that is to say formed of a single saccharide and poly-glycosyl unit, that is to say formed of several identical saccharide units. or different.
  • the saccharide units may especially be of the hexose or pentose type, and chosen from galactose, glucose, mannose, gulose, allose, altrose, idose, talose, fucose, fructose, arabinose, lyxose, ribose and xylose, for example.
  • the saccharide units may be of L or D stereochemistry. Any possible glycosyl groups constituting glycosidase substrates may be used as SEs.
  • the glycosyl units may be functionalized or not, in particular with an acetyl or amino group. N-acetylhexosamines are examples of glycosyl groups.
  • the SE group will comprise from 1 to 50 saccharide units. In the case of a polyglycosyl, it may be a homopolymer or a copolymer with a random, alternating or block structure.
  • SE groups acting as glycosidase substrates are given below: mono-glycosyl groups selected from galactosyl, glucosyl, mannosyte, gulosyte, allosyl, altrosyl, lodosyl, talosyl fucosyl, fructosyte, arabinosyte, lyxosyl, ribosyte, xylosyl, glucuronyl and N-acetyl-hexosamyl and polyglycosyl groups consisting of several (especially 2 to 20, preferably 3 to 10, and more particularly from 4 to 6) of these identical or different monoglycosyl groups.
  • glycosidase enzyme which can be targeted by the probes according to the invention, mention may be made of N-acetyl-p-galactosaminidase; N-acetyl- ⁇ -glucosaminidase; ⁇ -amylase; ⁇ -arabinofuranosidase; a-arabinosidase; p-cellobiosidase; ⁇ -chlorosidase; ⁇ -galactosidase; ⁇ -galactosidase; ⁇ -glucosidase; ⁇ -glucosidase; ⁇ -glucurontdase; ⁇ -maltosidase; the a-mannosWase; ⁇ -mannosidase; ⁇ -xylosklase; ⁇ -D-fucosidase; ⁇ -L-fucosidase; ⁇ -L-fucosidase; L-iduronidase and cellula
  • SE can also be a substrate for galactosidase, and in particular ⁇ -galactosidase, induronidase, glucosidase, N-acetyl-D-glucosaminidase, N-acetyl-D-galactosaminidase, mannosidase , fucosidase or glucuronidase, especially ⁇ -glucuronidase.
  • SE groups acting as galactosidase substrates are given below: mono-glycosyl groups selected from D-glucuronyl, L-iduronyl, D-glucopyranosyl, D-galactopyranosyl, N-acetyl -D-glucosaminyl, N-acetyl-D-galactosaminyl, D-mannopyranosyl, L-fucopyranosyl and polyglycosyl groups consisting of several (especially 2 to 20, preferably 3 to 10, and more particularly 4 to 6 ) of these identical or different monoglycosyl groups.
  • SE can also be an esterase substrate, especially lipase.
  • SE is an acyl group, linked by its C (O) function to the rest of the molecule.
  • SE may be -C (O) R 1 with R 1 which represents, for example, an alkyl group preferably of 1 to 20 carbon atoms, alkenyl preferably of 1 to 20 carbon atoms, a benzyl, aryl or heteroaryl.
  • SE can also be a substrate for a protease or a peptidase, in particular a cathepsin or metalloprotease substrate, in particular PSMA (Prostate Specifies Membrane Antigen).
  • a substrate for a protease or a peptidase in particular a cathepsin or metalloprotease substrate, in particular PSMA (Prostate Specifies Membrane Antigen).
  • SE is a peptidyl or amlnoatide group linked by an acyl function carried by its terminal carbon or by a side link to the rest of the molecule.
  • peptidyl group is meant a sequence of at least two amino acids linked together by a peptide bond.
  • the N-terminal function of the terminal amino acid may optionally be salified or functionalized.
  • salified form mention may be made of the hydrochloride, tosylate or trifluoroacetate form.
  • any possible peptidyl or amino groups constituting peptidase substrates can be used as an SE group.
  • Amino acids may or may not be functionalized, particularly at the N-terminus of SE.
  • the peptidyl SE residue has at most 10 amino acids which may be the same or different.
  • the amino acids of the peptidyl residue SE are preferably chosen from natural amino acids.
  • the N-terminus of the amino acid or peptidyl group may be functionalized with an acyl group -CORo, f3 ⁇ 4 being a group (Ci-Q ⁇ lkyle or -O- (Ci-C f e) alkyl
  • acyl group Rost-
  • f3 ⁇ 4 being a group (Ci-Q ⁇ lkyle or -O- (Ci-C f e) alkyl
  • RhCO- acyl group
  • this N-terminal functionalization will be preferred in the case where SE represents a peptidyl group, whereas in the case where SE represents an amino adde, its N-terminal function will be free, or preferably salified in the form of an ammonium.
  • Solid phase peptide synthesis using carbamate protecting groups (which also constitute "acyl” groups in this context) often makes it easier to synthesize a probe having a carbamate at this N-terminus.
  • carbamate protecting groups which also constitute "acyl” groups in this context
  • SE group which represents an amino adde it is preferred to use an SE group which represents an amino adde, while in the case of endopeptidases, it will be preferable to use an SE group which represents a peptidyl group.
  • the following peptidyl groups may be mentioned: Leu (for leudne aminopeptidase), Ser-GIn-Asn-Tyr (the N-terminal part of the preferred cleavage sequence of HIV-1 peptidase), Asp-Glu-Val-Asp- (for Caspase 3), His-Ser-Ser-Lys-Leu-GIn (for prostate-specific antigen "PSA") where the N-terminus may be free or be substituted with a -CORO acyl group, Ro being a (C 1 -C 4) alkyl group or a -O- (C 1 -C 6) alkyl group (for example a -COMe group).
  • the peptidyl or aminoacid group is chosen for its suitability with the known sequence selectivity of the targeted peptidase, which will recognize it.
  • the peptidyl or aminoadde group may be chosen for the preferred action that a peptidase involved in certain diseases will have on the latter, as shown, in particular, in Table 1.
  • Table 1 (Examples of peptidases that can serve as biomarkers for biological phenomena or diseases during imaging
  • SE can also be an amidase substrate, a catalyst for the hydrolysis of non-peptide amide linkages, in particular a substrate for penicillin amidases, fatty acid amide hydrolysis, or malonamidases.
  • SE can also be a transferase substrate, a catalyst for the transfer of a functional group from one substrate to another, in particular a transaminase substrate, or glutathione transferase or gamma-glutamyl / transferase.
  • SE corresponds to a peptidyl or amino acid group e linked by an acyl function carried by its terminal carbon or by a lateral link or sulphonyl group forming a sulphonamide with X 1 which then represents NH.
  • protease substrates are well known and in particular described in the "Handbook of Proteofytic Enzymes” (Ralings and Salvesen, 2013, 3 * “edition, Elsevier Ltd) and in the MEROPS database accessible online. (http://merops.sanger.ac.uk.index.shtml, Bateman et al., Nudeic acid res 2014, 42, D503), which can be referred to for further details.
  • SE may also be a substrate reacting with a chemical compound, and in particular a disulfide bond forming group with X 1 which is a sulfur atom which will be reduced / released by a reducing agent, in particular by dithiottiritol or by cysteine present in the sample to be analyzed, or a substrate reacting by a divide of a labile bond in an acid medium during the acidification of the sample analyzed and in particular an acetate-forming group with X s which is an oxygen atom, such as SE groups corresponding to methyloxymethyl (-CH 2 -O-CH 3 ), methyloxyethyl (-CH 2 -O-CH 2 CH 3 ), methyloxyphenyl (-CH 2 -O-Ph), methyloxyallyl (-CH 2 -O-Allyl) ).
  • X 1 is a sulfur atom which will be reduced / released by a reducing agent, in particular by dithiottiritol or by cysteine present in the sample to
  • A is an aromatic group which after splitting the CXz-O bond allows the formation of a chromophore or fluorophore.
  • This chromophore or fluorophore may correspond directly to the compound released A-OH or to its form AO " which is formed in aqueous solution, or to a compound resulting from a post-distillation reaction of the compound A-OH or AO ' released such that a dimerization or a compound resulting from a post-cleavage rearrangement of the compound A-OH or AO " , for example to lead to a tautomeric form.
  • A comprises, for example, preferably from 4 to 40 carbon atoms and from 0 to 10 heteroatoms selected from nitrogen, oxygen or sulfur atoms.
  • the aromatic groups include aryl and heteroaryl groups, unsubstituted or substituted.
  • phenyl, naphthyl, 2-, 3- or 4-pyridinyl, 2- or 3-furoyl, 2- or 3-thiophenyl, pyrrolyl groups may be mentioned.
  • a chromophore is a molecule capable of absorbing a part of the spectrum of visible light.
  • the hydroxyindolyls may be substituted with one or more identical or different X 3 chosen from chlorine, bromine, iodine or fluorine atoms and positioned at any position on the benzene ring.
  • a fluorophore is a molecule capable of generating fluorescence when subjected to a light excitation of appropriate wavelength.
  • Fluorescence is the property by which a molecule that is excited by light of a given wavelength emits light at a longer wavelength. Fluorescence is a phenomenon that results from the interaction of a fluorophore with an incident photon This process is called excitation. The absorption of the photon causes an electron in the fluorophore to move from its ground state to a higher energy level. Then the electron returns to its original level by emitting a photon. This process is called fluorescence emission.
  • Ced is simply due to the fact that the energy of the emitted photon is lower than that of the absorbed photon, because of the dissipation of energy during the lifetime of the excited state This definition is given in the patent application WO 2004/058787.
  • the -OA group is selected so as to obtain, after divarcing the C-O bond between the carbon atom bearing the atom (X 2 ) and the oxygen atom carrying the group A in the compounds of formula (I), a compound AOH which corresponds to a fluorophore ESIPT, which may or may not precipitate in aqueous solution.
  • An ESIPT fluorophore is a compound that comprises at least one hydroxyl group that is involved in intra-molecular proton transfer, allowing for tautomerization of the fluorophore molecule and fluorescence emission. Examples of such -OA groups correspond to the formula (AA):
  • X 5 is an oxygen atom and X 4 is -NH 2 , -OH, -SH, alkyl, an / le, -O-alkyl, -O-phenyl, -NH-alkyl, -NH-phenyl, -S-alkyl or -S-aryl, wherein said alkyl and phenyl groups may be substituted or unsubstituted, or X 5 represents a nitrogen atom and is bonded to X 4 which then represents CH, O, S, N or NH to form a substituted or unsubstituted heteroaryl, said substituted or unsubstituted heteroaryl being preferably selected from quinazole, imidazole, benzoimidazole, thiazole, benzothlazole, oxazote, benzooxazole, pyridine and quinoline,
  • aryl or heteroaryl for example selected from phenyl, naphthyl, and
  • said groups may be substituted or unsubstituted
  • a fluorophore ESIPT When in a group -OA, which represents in form AOH a fluorophore ESIPT, comprises several hydroxyl groups, then the oxygen atom of the group -OA is the oxygen atom of the hydroxyl group which is involved in the intramolecular proton transfer. .
  • the incorporation of this hydroxyl into the carbamate group of the compounds of formula (I) prevents the formation of the internal hydrogen bond and the tautomerization of the fluorophore.
  • ESIPT fluorophores show a Stokes shift that exceeds 100 nm and often reaches 200 nm. All fluorophores ESIPT lose this fluorescence emission corresponding to a Stokes shift of greater than 100 nm, if the OH group of the phenolic type is alkylated, acylated or otherwise functionalized, which prevents transfer of hydrogen to Chcherroatome X 5 on the illustration given with the formula (AA), during excitation by irradiation, and thus prevents the fluorescence emission characteristic of the proton transfer process.
  • the group A corresponds to a phenyl group which is unsubstituted or substituted and / or which is fused with one or more unsaturated carbocides optionally comprising a heteroatom such as nitrogen.
  • -OA groups of the phenoxy type correspond, for example, to the following preferred structures (BB) or (CC):
  • - T is -NH-C (O, -S-, -O-, -NH, N-alkyl or N-aryl,
  • Ra is hydrogen or an electron-withdrawing carbon substituent, such as -CN or -COORd, with Rd which represents a (C 1 -C 6) alkyl group, or Ra is -CONReRf, with R e and R f, the same or different, which represent hydrogen or a (Ci-Ct) alkyl group, or Ra is -CF 3 or a 2-oxazolyl, 2-thiazotyl, 2-imidazolyl, 2-benzoimidazolyl, 4-pyrimidiron-2 yl or quinazolinon-2-yte,
  • Rb is hydrogen, a chlorine, bromine, iodine or fluorine atom, -OH, -NH2, -NRgRh, -NHRg or -ORg, with Rg and Rh each independently representing a (C1-C-Oalkyl) or else Ra and Rb are linked together to form a saturated or unsaturated, substituted or unsubstituted, 4 or 5-membered hydrocarbon-based chain optionally interrupted by one or more heteroatoms chosen from N, S and O,
  • - Rc is hydrogen, Br, Cl, I or F
  • - T is IMH2, OH, an aryte group, a group (QC, alkyl, SH, NHR'c, OR'c, NR'cR'd or SR'c, with R'c and R'd, identical or different, which represent a (CrC) alkyl or aryte group,
  • R'a is hydrogen or an electron-withdrawing carbon-containing substituent such as -C, or -COOR'e, with R'e which represents a group (C C4) alkyl, or R'a is -CO RfR'g with R'f and R'g, identical or different, which represent hydrogen or a group (Ci-QJalkyl, or R'a is -CF3 or a 2-oxazolyl, 2-thiazolyl, 2-lmidazolyte, 2 enzoimidazolyl, 4-pyrimidinon-2-yl or quinazolinon-2-yl,
  • R'b is hydrogen, a chlorine atom, bromine, iodine or fluorine, -OH, -NH3 ⁇ 4 -NR'hR'i or -OR'h, with R * h and R'i, identical or different, which represent a group (Ci-C-alkyl),
  • R'a and R'b are linked together to form a saturated or unsaturated, substituted or unsubstituted 4 or 5-membered hydrocarbon-based chain optionally interrupted by one or more heteroatoms chosen from N, S and O.
  • OA group corresponding to a fluorophore of the ESIPT type, mention may be made, more particularly, of the following groups:
  • R can represent a hydrogen atom or - (L) n-GP, with n which is equal to 0 or 1.
  • n 1 and L is a linker, and in particular an arm - (L1) m1- (L2) m2- (l1) l1- (in the piperazine direction - > GP group) with:
  • L1 and I identical or different, which are selected from -O-, -NH-,
  • L 2 which is selected from the following bivalent groups: (C 1 -C 20) alkyl, C 1 -C 20 alkenyl, C 1 -C 20 alkynyl, (C 12 -C 20) aryl, (C 7 -C) alkylaryl, (C 7 -Alkenylaryl, (C7-4-i) alkynylaryl, (C1-4alkyl) cycloalkyl,
  • GP is a water-solubilising group
  • water-solubilising group is meant a hydrophilic group which makes it possible to improve the solubility of the probe, with respect in particular to a probe which differs only in the replacement of the nitrogen atom carrying L-GP with CH 2 / to obtain a piperalkin as described in applications WO 2013/045854 and WO 2014/020285.
  • a water-solubilising group mention may be made of groups capable of forming a charged species in aqueous solution.
  • a water-solubilising group GP By way of example of a water-solubilising group GP, mention may be made of the functions F 1 chosen from amines (primary, secondary, or tertiary), amidine, guanidine or tetrazole; the functions F 2 chosen from anionic functions of the carboxylate, sulphonate or phosphate type; groups comprising one or more of these functions Fi and or F 2 ; polyethylene glycols; sugars or polysaccharides such as glucose, galactose and mannose; peptide groups such as poly-lysine, poly-arginine, TAT-pepbdes, etc.
  • amine functions By way of example of amine functions, mention may be made of -MH 2 / -NH (C 1-6 alkyl) and the dialkylamines in alkyl groups are the same or different and comprise from 1 to 4 carbon atoms, and "groups comprising one or more of these functions Fi and / or F 2 " means alkyl group (such as (C 3 ) alkyl), an anl group (such as an aryl group having 6 carbon atoms), a heteroaryl group (such as a heteroaryl having 6 carbon atoms) in which one or more hydrogen atoms of these groups has (have) been substituted by one or more functions Fi, or by one or more functions F 2 or else at least one hydrogen atom has been substituted by a function Fi and another hydrogen atom was substituted by a function F
  • acyle function we mean a function:
  • alkyl group unless otherwise specified, is meant a hydrocarbon chain, saturated, linear or branched. Alkyl groups having 1 to 6 carbon atoms will be preferred. By way of example of an alkyl group comprising from 1 to 6 carbon atoms, named Ci-e alkyl or (Ci-Ce) alkyl, it is possible to determine, in particular, the methyl, ethyl, propyl, and propyl groups, bub, tert-butyl, sec-butyl, n-pentyl, n-hexyl.
  • aryl group is meant a mono-, bi- or polycydic carbocyde, comprising at least one aromatic group, for example a phenyl, dinamyl or naphthyl group.
  • Aryl groups having from 6 to 12 carbon atoms will be preferred. Phenyl is the most preferred aryl group.
  • a group when it is stated that a group is substituted, it means that it is substituted by one or more substituents, in particular chosen from chlorine, bromine, iodine or fluorine atoms, cyano, alkyl, fluoroalkyl, trifluoromethyl, alkenyl and alkynyl groups.
  • substituents in particular chosen from chlorine, bromine, iodine or fluorine atoms, cyano, alkyl, fluoroalkyl, trifluoromethyl, alkenyl and alkynyl groups.
  • cycloalkyl, aryl, heterocycloalkyl amino, alkylamino, dialkylamino, hydroxy, alkoxy, aryloxy, -COOH, nitro, acyl groups, aromatic groups (especially aryl and heteroaryl), alkenyl, alkynyl, cycloalkyl, heterocycloalkyl, acyte groups and aromatic groups may themselves be unsubstituted or substituted.
  • the terms used for the definition of these substituents are those usually recognized by those skilled in the art.
  • alkenyl denotes a hydrocarbon chain, linear or branched comprising at least one double bond, and preferably having from 2 to 20 carbon atoms, and preferably from 2 to 6 carbon atoms
  • alkynyl denotes a hydrocarbon chain, linear or branched comprising at least one triple bond, and preferably having from 2 to 12 carbon atoms, and preferably from 2 to 6 carbon atoms
  • fluoroalkyl denotes a hydrocarbon chain, saturated, linear or branched in which at least one hydrogen atom has been replaced by a fluorine atom, and preferably having from 2 to 12 carbon atoms, and preferably from 2 to 6 carbon atoms
  • alkoxy and aryloxy
  • cycloalkyl is meant a saturated hydrocarbon group consisting of at least one ring, optionally bridged. Alkyl groups having 3 to 12 carbon atoms will be preferred. By way of example, mention may be made of the cyclopropyl, cyclobutyl, cyclopentyl, cyclohexyl, cycloheptyl and adamantyl groups.
  • heterocycloalkyl is meant a cycloalkyl group as defined above, in which at least one carbon atom is replaced by a heteroatom selected from O, S or N.
  • heterocycloalkyl mention may be made of piperidinyie, piperazinyl, morpholirr / te, tetrahydropyranyl ...
  • heteroaryl group is meant a mono-, bi- or polycydic carbocyde, preferably comprising from 6 to 12 members, and comprising at least one aromatic group and at least one heteroatom chosen from oxygen, nitrogen or sulfur atoms. integrated within the carbocyde.
  • heteroaryl group By way of example of a heteroaryl group, mention may be made of 2-, 3- or 4-pyridinyls, 2- or 3-furoyte, 2- or 3-thiophenyl, pyrrofyl, imidazolyl, pyrazolyl, thiazolyl, oxazolyl, isoxazolyl, pyridinyl, pyrazinyl, pyrimidinyl, tetrazolyl, thiadiazolyl, oxadiazolyl, triazolyl, pyridazinyl, indolyl.
  • (Cr) alkylaryl “,” (Cr 4> alkenylaryl “,” (Cr ”) alkynylaryl” is meant respectively an alkyl, alkenyl or alkynyl chain starting, interrupted or terminating with an aryl group. alkylaryl, alkenylaryl and alkynylaryl groups comprising from 7 to 22 and preferably from 7 to 16 carbon atoms.
  • temporary amine protecting group is meant protecting groups such as those described in Protectlve Groups in Organic Synthesis, Greene TW and PGM Wuts, ed John Wlley and Sons, 2006 and in Pro ecting Groups, Kocienski PJ., 1994, Georg Thieme Verlag.
  • benzyl groups Bn
  • -C (O) OR 'groups with R' 1 which represents an alkyl or alkenyl group of 1 to 12 carbon atoms or a group - (CH 2 ) m3R "i with R” i which represents an aryl, cycloalkyl or fluorenyl group and m3 which is equal to 0, 1, 2 or 3, and in particular carbobenzyloxy (Cbz), tert-butyloxycarbonyl (Boc) and 9-fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc), allyloxycarbonyl (Alloc ).
  • the piperazine cyde is obtained by a reduction of the piperazinone ring (XIII), itself synthesized from a malonate bromide (XIV) and a compound of the ethylene diamine type (X ).
  • R groups different from H which correspond to an L-GP group, may be introduced by nucleophilic substitution, reductive amination or amide bond formation reactions.
  • the link between the L and GP groups can be obtained by innumerable synthetic routes according to the chemical functions present on the linker L.
  • ionization reactions such as nucleophilic substitutions, peptide couplings, cycloaddition such as the cydoaddition of Huisgen or Diels-Alder, paladocatalyzed couplings such as the coupling of Sonogashira or Heck.
  • A, X 1 , X 2 , SE, L l, L 1, L 2, ml, moi, and m 2 are as defined for (I), Z represents C ⁇ CH, 3, an N-oxysuccinimide or maleimide function, and R'p represents a group protecting the amine functions, preferably selected from benzyl groups, -C (O) OR 'groups with R'i which represents an alkyl or alkenyl group of 1 to 12 carbon atoms or a -CCH 2 group) m3R "i with R" i which represents aryie, cycloalkyl or fluorenyl group and m3 which is equal to 0, 1, 2 or 3.
  • R'p preferred group there may be mentioned carbobenzyloxy, tert-butyloxycarbonyl, 9-fluorenylmettiyloxycarbonyl, and allyloxycarbonyl.
  • the starting reagents are commercially available or readily available.
  • the molecules of formula (I) are therefore of relatively simple chemical access, and can be obtained at a relatively low cost of preparation, for the technical field considered.
  • the salts of the compounds according to the invention are prepared according to techniques well known to those skilled in the art.
  • the salts of the compounds of formula (I) according to the present invention include those with acids or bases, depending on the substituents present. These acids or bases may be chosen from inorganic and organic addes and bases which allow a suitable separation or crystallization of the compounds of formula (I), as well as physiologically acceptable salts, that is to say compatible with inventive applications. in vivo and in vitro.
  • Suitable acids are: oxalic acid or an optically active adde, for example tartaric acid, benzoyl triaric acid, mandelic acid or camphorsulfonic acid, and those which form physiologically acceptable salts, such as hydrochloride, hydrobromide, sulphate, hydroxjenosulphate, dihydrogenphosphate, maleate, fumarate, 2-naphthalenesulphonate, para-toluenesulphonate, mesylate, besylate, and lotion.
  • Suitable bases include: lysine, arginine, meglumine, benethamine, benzathine and those which form physiologically acceptable salts, such as sodium, potassium, calcium salts.
  • sorvat means a form of the compound associated with one or more solvent molecules, especially used during its synthesis or during its purification, without being in solution in the latter.
  • the various compounds of formula (I) according to the invention can be found in all forms of possible optical isomers, optionally in a mixture in all proportions, unless specified other.
  • the compounds according to the invention comprising an asymmetric carbon are in a racemic form, the R and S forms being in substantially equal proportions.
  • the compounds of formula (I) of the invention may be in a form enriched in a diastereoisomer or enantiomer, with a diastereoisomeric or enantiomeric excess greater than 80%, or even greater than 95%, or even in a pure isomeric form that is to say with a diastereoisomeric or enantiomeric excess greater than 99%.
  • the compounds (I) may be isolated in a form enriched in a diastereoisomer or enantiomer by conventional separation techniques: it is possible to use, for example, fractional recrystallizations of a racemic salt with an adde or an optically active base whose principle is well known or, most often, conventional techniques of chiral or non-chiral phase chromatography.
  • the probes according to the invention will have one or other of the following characteristics, or all of the following characteristics:
  • R represents L-GP with:
  • the probes according to the invention are attractive for several applications with high sensitivity in the life sciences, and in particular: (1) the high-throughput screening of an activity, in particular of an enzymatic activity, expressed by bacterial colonies on an agar plate (colony analysis); (2) the in vitro detection of an activity, in particular an enzymatic activity, in biological fluids (hematology and others); (3) the detection of an activity, in particular an enzymatic activity, at the level of a single cell by flow cytometry; (4) visualization of an activity, in particular an enzymatic activity, intracellularly in cultured cells (fluorescence microscopy and confocal microscopy); (5) histochemical detection of an enzyme (at the tissue level); and also (6) in vivo molecular imaging.
  • the probes according to the present invention have a large number of potential applications.
  • Examples of such applications include the design of bacterial colony assays. These are currently performed on an agar plate (petri dish) where up to 3000 colonies can be distinguished without having to actively separate them in separate compartments such as wells contained in a multiwell plate. It is possible, for example, to design tests on clinical samples making it possible to identify, among a set of bacterial lines, a pathogenic line of interest.
  • the probes according to the invention can also be used for macroscopic fluorescence imaging, that is to say at the level of an entire organism.
  • the probe will penetrate the cell wall to reach the activity of interest (a stimulus such as an enzyme, a chemical compound or a physicochemical characteristic of the medium in which the probe is located).
  • THF Tetrahydrofuran
  • DCC Dicydohexylcarbodiimide
  • the RN spectra were obtained at 297K using a Bruker AVANCE 300 spectrometer (300 MHz & 75 MHz for * H and U C, respectively) or a Bruker AVANCE 500 (500 MHz & 125 MHz for 1 H and 13 C, respectively) .
  • TLC Thin Layer Chromatography
  • Mass measurements in high resolution were obtained using a MicrOTOFQ spectr mass spectrometer, Bruker.
  • Fluorescence or absorbance measurements were obtained using an EnSpire plate fluorometer, Perkin-Elmer.
  • the crude reaction product is purified by chromatography column on silica gel (eluent: firstly pure DCM then DCM: MeOH / 95: 5 / v: v) to obtain compound 3 in the form of a colorless oil which crystallizes with the time (12.8g, 46mmol, yield: 86%).
  • the organic phase is separated and the aqueous phase is washed twice with ⁇ 3 ⁇ 40 (2x20mL).
  • the organic phases are combined, dried with Na 2 SO 4 , filtered and evaporated.
  • the reaction crude is purified by silica gel chromatography column (eluent: petroleum ether: ethyl acetate / 7: 3 / v: v) to obtain compound 4 in the form of a yellow oil (625 mg, 2%). 0 mmol, yield: 57%).
  • reaction crude is purified by silica gel chromatography column (eluent: petroleum ether: ethyl acetate / 55: 45: v) to obtain compound 7 in viscous solid form (500 mg, 1.16 mmol, yield: 46% on 2 stages).
  • reaction crude is purified by silica gel chromatography column (eluent: gradient of DCM: MeOH / 99: 1, 98: 2, 97: 3 / v: v) to obtain compound 11 in the form of a colorless oil. (160mg, 0.31mmol, yield: 33%).
  • the resulting suspension is filtered and the filtrate is washed twice with saturated aqueous NaHCO 3 solution (2 ⁇ 50 mL).
  • the organic phase is then extracted several times with a 10% aqueous solution of ⁇ 2 ⁇ ⁇ 1 ⁇ 4 until the pH of the aqueous phase is stable around pH 3.
  • DCM 150 ml
  • Recombinant aqueous and aqueous NaOH solution (2M) is added until the pH of the aqueous phase reaches pH 12.
  • the organic phase is withdrawn and the basic aqueous phase is extracted twice with DCM (2 ⁇ 100 mL).
  • reaction crude is purified by silica gel chromatography column (eluent: gradient of DCM: MeOH / 99: 1, 98: 2, 97: 3 / v: v) to obtain compound 15 in the form of a colorless oil. (35mg, 0.31 mmol, yield:
  • reaction crude is purified by silica gel chromatography column (eluent: DCM gradient: MeOH / 100: 0.099: 1, 98: 2, 97: 3,%: 4, 95: 5 / v: v). to give compound 31 as a white powder (19mg, 0.027mmol, yield: 46%).
  • reaction mixture is diluted with DCM (20mL) and washed twice with saturated aqueous NaHG 4 solution (2x50mL) and once with brine (50mL).
  • the organic phase is dried with a 2 S0, filtered and evaporated.
  • the reaction crude is purified by neutral alumina chromatography column (petroleum ether: ethyl acetate / 15:85 / v: v) to obtain compound 33 in the form of a slightly yellow solid (552 mg, yield: quantitative).
  • the crude reaction product is purified by two successive silica gel chromatography columns (petroleum ether: ethyl acetate / 2: 8 / v: v; and DCM gradient: MeOH / 99: 1, 98: 2, 97: 3 / v: v) for obtain compound 38 in the form of a white solid (52 mg, 0.080 mmol, yield: 69%).
  • the water solubility of the compounds was evaluated according to the presence or absence of precipitate in buffered solutions of the compounds in question at different concentrations. These solutions were prepared as follows:
  • a known amount of product is dissolved in a suitable volume of DMSO in order to obtain a clear 100mM stock solution in DMSO (except in the case of commercial AMC-Leucine (denoted AMC-Leu) which gave a cloudy solution under these conditions and the concentration of the stock solution in DMSO had to be lowered to 50 mM).
  • These stock solutions are then diluted in commercial PBS buffer to obtain a range of final concentrations of between 1mM and 50 ⁇ .
  • a compound is declared insoluble if a precipitate appears and persists after dilution.
  • the compounds according to the invention have a better solubility in aqueous solution, with respect to a commercial substrate without a spacer arm, or with respect to a substrate incorporating a spacer arm described in applications WO 2013/045854. and WO 2014/020285.
  • the plate is then incubated at 37 ° C and the fluorescence or absorbance is recorded over time with a multiwell plate reader (EnSpire, Perkin Elmer).
  • EndSpire, Perkin Elmer The resulting curves are the result of triplicates.
  • FIGURE 1 The evolution of the fluorescence following the acuvation of compound 12 by PGA is presented FIGURE 1.
  • FIGURE 2 The evolution of the fluorescence following the acuvation of compound 15 by PGA is presented FIGURE 2.
  • FIGURE 5 The evolution of the absorbance following the acuvation of compound 36 by PGA is presented FIGURE 5.
  • FIGURE 6 The evolution of the fluorescence following the activation of compound 21 by the lipase is presented FIGURE 7.
  • the compounds according to the invention effectively make it possible to detect the presence of an enzymatic activity by means of fluorescence or absorbance measurements. Enzymatic recognition is still good despite (ncorporation of a charge or group relatively sterically bulky on the spacer arm.

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Abstract

L'invention concerne les sondes de formule (I); dans laquelle : X1 s= NH, O ou S; X2 = O ou S; SE est un groupe labile, qui pourra être éliminé sous l'action d'un stimulus qui peut notamment être ta présence d'une enzyme, d'un composé chimique ou d'une caractéristique physicochimique du milieu dans lequel se trouve la sonde; A est un groupe aromatique, qui après clivage en solution aqueuse de la liaison C(X2)-O, conduit à la libération d'un chromophore ou d'un fluorophore, R représente un atome d'hydrogène ou -(L)n-GP, avec n qui est égal à 0 ou 1, L est un bras de liaison, et GP est un groupe hydrosolubisisant, ainsi que leurs sels, solvats ou hydrates, physiologiquement acceptables. L'invention a également pour objet les intermédiaires pour leur synthèse et procédés de détection les mettant en œuvre.

Description

SONDEES MOLECULAIRES ACTIVABLES HYDROSOLUBLES, INTERMEDIAIRES POUR LEUR SYNTHESE ET PROCEDES DE DETECTION ASSOCIES
L'invention concerne des sondes moléculaires activâmes utiles dans le domaine du diagnostic, incorporant un bras espaceur, qui en réponse à un stimulus qui peut notamment être la présence d'une enzyme, d'un composé chimique ou une caractéristique physicochimique dans lequel se trouve la sonde, va s'auto-effondrer pour libérer une entité détectable du type fluorophore ou chromophore.
Dans l'analyse d'un échantillon biologique ou chimique, la détection d'une activité enzymatique peut être très utile. Les organismes entiers, les cellules ou les extraits cellulaires, les liquides biologiques ou les mélanges chimiques sont des exemples d'échantillons biologiques ou chimiques dans lesquels une activité enzymatique peut être détectée. Les enzymes constituent de nombreux biomarqueurs de diverses pathologies. Elles sont impliquées aussi dans de nombreux processus cellulaires et font donc l'objet d'études innombrables de la part des biologistes cellulaires. Ainsi, leur détection peut donner des informations concernant un état métabolique ou morbide particulier, par exemple. De ce fait, des sondes capables de détecter une activité enzymatique sont très utiles et ont fait l'objet de nombreux travaux.
On peut notamment citer les travaux de l'un des inventeurs de la présente demande de brevet correspondant aux demandes WO 2013/045854 qui concerne des substrats de peptidases et WO 2014/020285 qui concerne des substrats de glycosidases qui utilisent un espaceur auto-effondrable reliant un substrat de l'enzyme d'intérêt à un groupe aryle entraînant, après divage du substrat, la cydisation de l'espaceur et la libération d'un fluorophore ESIPT (fluorophore conduisant à un transfert de proton intramoléculaire dans un état excité, nommé ESIPT pour « Excited State Intramolecular Proton Transfer »).
Or, une bonne solubilité aqueuse des sondes moléculaires répondant à une activité enzymatique est un des critères essentiels pour s'assurer de la fiabilité des résultats qu'elles délivrent En effet, l'ajout de co-soJvant organique pour dissoudre une molécule hydrophobe diminue généralement l'activité des enzymes de manière importante. De plus, alors que l'utilisation de solutions faiblement concentrées est acceptable pour certains tests in vitro, le passage à des incubations cellulaires ou des injections systémiques in vivo requiert l'utilisation de solutions à des concentrations bien plus élevées car elles vont être diluées de manière importante une fois injectées. De plus, l'utilisation d'un co- solvant in vivo est exclue. Enfin, une molécule trop hydrophobe risque de s'accumuler dans les tissus adipeux, et non pas dans les tissus ciblés.
Cette question de solubilité est donc depuis longtemps une préoccupation pour les chimistes et plusieurs solutions ont été développées. La première a été d'incorporer des groupements ayant un caractère salin en tant que substrats enzymatiques. Cette solution, telle que rencontrée dans des sondes pour phosphatase (Haugland et at Anal. Biochem. 1992, 207, 32) ou caspase-3 (Llu et al. J. Am. Chem. Soc. 2012, 134, 17972) par exemple, fonctionne très bien mais elle limite le choix des enzymes visées puisque celles qui reconnaissent des substrats apotaires ne peuvent être dblées. De plus, les molécules chargées négativement traversent difficilement la membrane cellulaire ce qui limite donc l'application au ciblage d'enzymes extracellulaires. Une seconde solution est le greffage de groupements hydrosolubilisants sur le signalophore utilisé, souvent des groupements sulfonates (Tung et al. Tetrahedrun 2006, 62, 578 ; Shabat et al. J. Am. Chem. Soc 2011, 133, 10960). Encore une fois, I ydrosolubilisation apportée par ces motifs est excellente, mais cette mesure est peu attractive car elle risque d'abaisser les performances du signalophore une fois relâché de la sonde initiale suite à l'activité enzymatique. De plus, une telle solution est tout simplement inenvisageable lorsque l'on veut employer des signalophores à l'état solide. Ces deux possibilités ne sont donc pas généralisables au plus grand nombre de sondes moléculaires répondant à une activité enzymatique.
A ce jour, il n'existe que très peu de systèmes qui permettent l'association versatile d'une espèce hydrosolubilisants à un substrat enzymatique dans le but de relarguer une molécule optiquement active. Ceux-ci sont généralement basés sur un espaceur éliminant substitué (Shabat et al. J. am. Chem. Soc. 2008, 130, 5434) ou sur une combinaison d'un espaceur cydisant et d'espaceurs éliminants (Shabat et al. Bioorg. Med. Chem. 2007, 15, 7318). Le problème est que les espaceurs éliminants substitués sont connus pour produire des intermédiaires réactionnels hautement toxiques (Rokita, Quinone Methktes, l4" éd. 2009, John Wiley and Sons Inc. ; Bolton et al. Chem. Res. ToxicoJ. 1995, 8, 323 ; Thatcher et al. J. Org. Chem. 1997, 62, 1820). D'autre part, la combinaison cyclisation/élimination est loin d'être Idéale car elle introduit une forte complexité (nécessité d'utiliser deux espaceurs en série) tout en démontrant des cinétiques d'effondrement qui sont loin d'être satisfaisantes (Wu et al. Bioorg. Med. Chem. 2012, 20, 3465), ou bien une instabilité face à l'hydrolyse spontanée non négligeable (Romieu et al Org. Lett 2008, 10, 1517). Certaines constructions livrent leur molécule active en plusieurs dizaines d'heures (Shabat et al. Bioconjugate Chem. 2006, 17, 1432), ce qui les rend difficilement utilisables pour détecter rapidement la présence ou l'absence de certains analytes dans un échantillon donné.
Il est donc souhaitable de développer une nouvelle génération d'espaceurs cydisant permettant l'incorporation versatile de n'importe quel substrat enzymatique, qu'il soit polaire ou apolaire, et qui répondent aux exigences de solubilité. Néanmoins, cet espaceur devra garder une dnétique d'effondrement rapide et devra permettre une reconnaissance enzymatique efficace.
Dans le cadre de l'invention, les inventeurs proposent une nouvelle génération de sondes qui, d'une part, offre une solubilité dans l'eau satisfaisante et, d'autre part, sont facilement synthétisa Mes et modulables, du fait de la présence d'un groupe pipérazine dont l'un des atomes d'azote peut porter divers groupes hydrosolubilisants. Les inventeurs ont choisi de proposer une solution qui incorpore une partie hydrosoJubilisante sur une 3 "* composante de la sonde, à savoir dans un espaceur reliant le signalophore et le substrat ce qui permet de choisir à volonté n'importe quel substrat enzymatique et n'importe quelle molécule rapportrice.
Les sondes selon l'invention répondent à la formule (I) :
Figure imgf000006_0001
dans laquelle :
- X! = NH, O ou S,
- X2 = 0 ou S,
- SE est un groupe labile, et en particulier un substrat enzymatique,
- A est un groupe aromatique, qui après clivage en solution aqueuse de la liaison C(X2)-0 conduit à la libération d'un diromophore ou d'un fluorophore,
R représente un atome d'hydrogène ou -(L)n-GP, avec n qui est égal à 0 ou 1,
L est un bras de liaison,
GP est un groupe hydrosolubilisant,
ainsi que leurs sels, sorvats ou hydrates, physiologiquement acceptables. La présente invention permet de détecter un analyte chimique ou enzymatique capable de cliver la liaison X1-SE, par la détection du chromophone ou fluorophore qui va être libéré suite à la cyclisab'on de l'espaceur du type pipérazinyle de formule :
Figure imgf000006_0002
Le substrat selon l'invention agit comme une sonde moléculaire capable de révéler la présence d'un stimulus tel qu'une enzyme, un composé chimique ou une caractéristique physicochimique du milieu dans lequel se trouve la sonde (notamment un changement de pH). Quand la sonde est modifiée chimiquement par ledit stimulus, elle se fragmente via une réaction en cascade pour libérer un chromophore ou fluorophore détectable. Il est possible que le groupement A se comporte également comme un chromophore ou un fluorophore lorsqu'il est lié au reste de la molécule dans les sondes de formule (I). Dans ce cas de sondes « ratiométriques », ses propriétés spectrales, et en particulier ses propriétés d'absorbance et/ou de fluorescence seront différentes de l'entité libérée sous l'action d'un stimulus tel qu'une enzyme, un composé chimique ou une caractéristique physicochimique du milieu dans lequel se trouve la sonde. De manière avantageuse mais non obligatoire, le groupement A pourra être choisi, de manière à ce que la sonde de formule (I) ne soit pas détectable par absorption ou émission de lumière, avant de rencontrer le stimulus, sous la forme notamment d'une enzyme, d'un composé chimique ou d'une caractéristique physicochimique du milieu dans lequel se trouve la sonde, (c'est-à-dire que la sonde est dite « furtive »).
Le groupe labile SE est tel que son élimination, par exemple par voie enzymatique ou consécutivement à une action purement chimique (telle qu'une variation de pH ou la présence d'un agent réducteur), assure, par réarrangement intra-moléculaire de l'espaceur auto-effbndrable, une libération du fluorophore ou chromophore, notamment sous la forme A-OH ou A-O", ou A'=0 (A'=0 étant une forme obtenue après réarrangement de A-OH, une forme tautomérique ou polymérisée de A-OH). Le divage de la liaison SE-X1 déclenche la libération du fluorophore ou chromophore, notamment sous A-OH ou A-O', ou A'=0 (A'=0 étant une forme obtenue après réarrangement de A-OH ou A-O', une forme tautomérique ou polymérisée de A-OH), par cyclisation de l'espaceur comme illustré sur le Schéma 1 ci-dessous :
Figure imgf000008_0001
La sonde est composée de quatre composants moléculaires i) un espaceur intelligent qui porte, à une extrémité, H) un groupe labile SE et, à l'autre, îîi) un groupe organique A-0 relié par un groupement carbamate ou thiocarbamate de l'espaceur qui, quand il est libéré par fragmentation du conjugué espaceur-A-O, pour donner le composé énollque ou énolate correspondant, conduit à la formation d'un chromophore ou fluorophore détectable, iv) un groupement hydrosolubilisant.
Dans le cadre de (Invention, la présence de l'atome d'azote porteur du groupement R permet de moduler les propriétés de la sonde et d'introduire une troisième fonctionnalisation, à côté du groupe labile SE et du groupe A conduisant, après élimination du groupe SE et à la cydlsation de l'espaceur, à la libération d'un chromophore ou fluorophore détectable.
En effet, les sondes de formule (I) selon l'invention comportent un espaceur de type pipérazine multifonctionnalisable qui permet l'incorporation d'un large choix de substrats enzymatiques, et d'un groupe annexe R qui permettra, en fonction de sa nature, de rendre la molécule encore plus hydrosoluble. La présence de l'atome d'azote, permet à partir d'un même intermédiaire de synthèse de conduire à différentes fonctionnalisations R hydrosolubilisantes.
De plus, les sondes selon l'invention présentent une solubilité améliorée, par rapport à leurs homologues comprenant un espaceur du type pipéridinyle, exemplifiés dans les demandes WO 2013/045854 et WO 2014/020285 et par rapport aux réactifs commerciaux ne comprenant pas du tout d'espaceur tels que la 4-métfiyl-7-(phénylacétamklo)coumarine ou l'acétate de 4-méthylumbelliferyle par exemple :
Figure imgf000009_0001
Par ailleurs, comme dans le cas des demandes WO 2013/045854 et WO 2014/020285, la sonde comporte un espaceur pré-organisé pour sa cydisation après dlvage de la liaison SE-X1 qui accélère le processus d'auto- effondrement de l'espaceur, tout en assurant une bonne reconnaissance enzymarJque. Or, Il n'était nullement évident qu'avec la modification de l'espaceur opérée dans le cadre de l'invention dans laquelle des groupements sont introduits pour augmenter l'hydrosolubilité, il n'y ait pas d'impact sur l'activité rapportrice des sondes. Or, dans le cadre de l'invention, il a été démontré que llntroduction d'une charge ou l'augmentation de l'encombrement stérique au niveau du groupe R, et donc sur une position proche du site d'action du stimulus (te. une enzyme, un composé chimique ou une variation d'une caractéristique physicochimique du milieu dans lequel se trouve la sonde, en fonction de la nature du groupe SE), ne modifiait pas la réaction obtenue sous l'action du stimulus correspondant
La présente invention concerne donc les composés de formule (I), quelle que soit leur variante de mise en œuvre décrite dans la présente demande de brevet, pour la détection in vivo, chez l'homme ou l'animal, in vitro, in ceffu/o ou ex vivo, d'un stimulus tel qu'une enzyme, un composé chimique ou une caractéristique physicochimique du milieu dans lequel se trouve la sonde, dont la présence entraîne le dlvage de la liaison SE-X1.
Selon un autre aspect, l'invention concerne un procédé in vitro pour détecter, au moyen d'une sonde de formule (I) selon l'invention, la présence d'un stimulus tel qu'une enzyme, un composé chimique ou une caractéristique physicochlmique du milieu dans lequel se trouve la sonde, dont la présence entraîne le divage de la liaison SE-X1. Plus précisément, l'invention concerne un procédé pour détecter la présence d'un stimulus tel qu'une enzyme, un composé chimique ou une caractéristique physicochimique du milieu dans lequel se trouve la sonde, dont la présence entraîne le clivage de la liaison SE-X1, comprenant les étapes de :
- mise en contact d'un échantillon suspecté de contenir ledit composé chimique ou ladite enzyme ou de présenter ladite caractéristique physicochimique avec une sonde de formule (I) selon l'invention ;
- l'application de conditions appropriées pour permettre le clivage de la liaison covalente entre X1 et SE, sous l'action dudit stimulus, qui est suivi d'un clivage de la liaison C entre l'atome de carbone porteur de l'atome (X2), et l'atome d'oxygène porteur du groupement A suite à une cydisation de i'espaceur présent dans la sonde de formule (I), et
- analyse quantitative ou qualitative du chromophore ou fluorophore libéré.
L'échantillon pourra être tout échantillon biologique approprié. Il pourra s'agir notamment d'un prélèvement de fluide biologique, notamment un échantillon de sang total, de sérum, plasma, urine, d'un prélèvement tissulaire ou de cellules isolées, et en particulier d'un milieu cellulaire. Ce prélèvement peut être utilisé tel quel, ou bien être soumis avant mise en présence de la sonde, à une préparation de type enrichissement ou culture, bien connue de l'homme de l'art.
De manière avantageuse, les composés de formule (I) se comportent comme des sondes fonctionnant selon un mode éteint/allumé, c'est-à-dire qu'avant clivage par le stimulus (ie. une enzyme, un composé chimique ou une variation d'une caractéristique physicochimique du milieu dans lequel se trouve la sonde, en fonction de la nature du groupe SE), la sonde est « invisible ». Il est également possible de choisir le groupement A, de manière à obtenir des propriétés spectrales différentes entre i) le groupement libéré après clivage de la liaison C-O entre l'atome de carbone porteur de l'atome (X2) et l'atome d'oxygène porteur du groupement A et ii) la sonde de formule (I). En particulier, le procédé de détection selon l'invention peut être mis en œuvre dans des conditions physiologiques, notamment dans un milieu aqueux tamponné à un pH appartenant à la gamme allant de 4 à 9, et notamment à un pH de l'ordre de 7,4.
Dans un mode de réalisation de l'invention, un fluorophore est libéré et son analyse comprend les étapes suivantes :
- exposition du fluorophore à une source lumineuse capable de produire une lumière à une longueur d'onde d'absorption du fluorophore ; et
- détection de la fluorescence résultante.
Dans un autre mode de réalisation de l'invention, un chromophore est libéré et son analyse comprend les étapes suivantes :
- exposition du chromophore à une source lumineuse capable de produire une lumière à une longueur d'onde d'absorption du chromophore ; et
- détection de la lumière absorbée par le chromophore.
Dans le cas où un chromophore est libéré, on détectera un changement de couleur suite à l'action du stimulus (ie. une enzyme, un composé chimique ou une variation d'une caractéristique physicochimique du mitieu dans lequel se trouve la sonde, en fonction de la nature du groupe SE).
De manière préférée, mais non nécessaire, le fluorophore ou le chromophore libéré, en particulier sous la forme A-OH ou A-O-, ou A'=0 (A'=0 étant une forme obtenue après réarrangement de A-OH ou A-O', une forme tautomérique ou polymérisée de A-OH), forme un précipité en solution aqueuse.
L'invention va maintenant être décrite de manière plus détaillée.
Définition des groupes labiles SE
SE est un groupe labile, éliminabte en solution aqueuse sous l'action d'un stimulus qui peut notamment être la présence d'une enzyme, d'un composé chimique ou d'une caractéristique physicochimique du milieu dans lequel se trouve la sonde. L'élimination de SE peut notamment se faire en milieu aqueux. A titre d'exemple d'une propriété physicochimique, on peut citer une variation de pH, ou la variation du potentiel redox, la dernière clivant les ponts disulfures présents notamment dans les cas où X1 = S. De manière préférée, notamment dans les cas où X1 = NH ou 0, le groupe labile SE est susceptible à un composé chimique (un réactif cible) ou une enzyme. Une enzyme est définie comme une protéine naturelle qui catalyse une réaction chimique.
De manière préférée, le groupe labile SE assure la reconnaissance d'une cible (composé chimique ou enzymatique, paramètre physico-chimique du milieu), et notamment d'une enzyme, sélectivement localisée dans un tissu ou dans un type de cellules visé.
Les groupements SE ont la caractéristique de pouvoir être clivés du reste de la molécule sous l'action d'un stimulus qui peut notamment être la présence d'une enzyme, d'un composé chimique ou d'une caractéristique physicochimique du milieu dans lequel se trouve la sonde. Dans le cas où SE est un substrat enzymatique, l'enzyme joue alors le rôle de catalyseur de la coupure entre SE et l'atome X1 auquel il est lié. Une telle coupure est la conséquence d'une hydrolyse en milieu aqueux pour laquelle l'enzyme va jouer le rôle de catalyseur. Bien que dans ce cas également, la coupure mette en jeu une hydrolyse, on parlera de divage sous l'action d'une enzyme qui est catalytiquement active pour la réaction d'hydrolyse.
Le choix de X1 sera adapté en fonction du groupe SE, et notamment du substrat d'enzyme sélectionné, de manière à obtenir le divage souhaité. En particulier, X1 sera un oxygène dans le cas où SE sera un substrat d'estérase, de glycosidase, de phosphatase, de sulfatase, ou de glucuronidase, X1 sera NH dans le cas où SE sera un substrat de protéase, notamment d'amidase, ou de transférase et X1 sera un soufre dans le cas où X1-SE sera un pont disulfure qui sera clivé par un agent réducteur.
En particulier, l'homme du métier, en fonction de l'application visée pour les sondes selon l'invention, pourra choisir un substrat pour au moins une enzyme choisie parmi les estérases telles que les carboxylestérases ou les lipases ; les alkaline-phosphatases ; les glucuronidases telles que la β- glucuronidase ; les glycosidases ; les protéases telles que les métalloprotéases; les peptidases et les amidases. Le groupement SE sera, de préférence, choisi de manière à être spécifique d'une enzyme d'intérêt. En revanche, certaines enzymes ont la capacité de cliver un ensemble de groupements SE différents ; parmi elles, on peut citer la hexosaminidase, et les estérases.
De tels substrats d'enzyme seront notamment choisis parmi les groupes glycosyle liés par leur carbone anomérique au reste de la molécule, des acides gras liés par leur fonction acyle au reste de la molécule, les groupes peptidyle liés au reste de la molécule par une fonction acyle portée par leur carbone terminal ou par un chaînon latéral, ou un groupe sulfbnyle formant un sulfonamide avec X1 qui représente alors NH.
En particulier, SE peut être un substrat de glycosk ase, et notamment de galactosidase et correspondre à groupement glycosyle lié par son carbone anomérique au reste de la molécule.
Par « glycosidase », on entend une enzyme grycoslde ydroiase qui a la capacité de catalyser l'hydrolyse de liaisons glycosidiques, de manière à libérer au moins un composé osidique.
Par groupe « glycosyle », on entend tout sucre, mono ou poty- saccharide lié au reste de la molécule par un lien glycosyle, c'est-à-dire via son carbone anomérique. Le carbone anomérique peut adopter la configuration alpha ou beta. A titre d'exemple de groupe SE, on peut citer les groupements mono-glycosyle, c'est-à-dire formé d'une seule unité saccharidique et poly-glycosyle, c'est-à-dire formé de plusieurs unités saccharidiques identiques ou différentes. Les unités saccharidiques peuvent être notamment du type hexose ou pentose, et choisies parmi le galactose, le glucose, le mannose, le gulose, l'allose, l'altrose, l'idose, le talose, le fucose, le fructose, l'arabinose, le lyxose, le ribose et le xylose, par exemple. Les unités saccharidiques peuvent être de stéréochimie L ou D. Tous les groupements glycosyle possibles constituant des substrats de glycosidase peuvent être utilisés en tant que SE. Les unités glycosyle peuvent être fonctionnalisées ou non, notamment avec un groupement acétyl ou amino. Les N-acétylhexosamines sont des exemples de groupe glycosyle. Le plus souvent, le groupe SE comprendra de 1 à 50 unités saccharidiques. Dans le cas d'un polyglycosyle, il pourra s'agir d'un homopolymère ou d'un copolymère avec une structure aléatoire, alternée ou bloc.
Des exemples de tels groupes SE se comportant comme des substrats de glycosidase sont donnés ci-après : les groupements rnono-glycosylés choisis parmi le galactosyle, le glucosyle, le mannosyte, le gulosyte, l'allosyle, l'altrosyle, lldosyle, le talosyle, le fucosyle, le fructosyte, l'arabinosyte, le lyxosyle, le ribosyte, le xylosyle, le glucuronyle et le N-acétyl-hexosami nyle et les groupements polygtycosylés constitués de plusieurs (notamment 2 à 20, de préférence de 3 à 10, et plus particulièrement de 4 à 6) de ces groupements monoglycosylés identiques ou différents.
A titre d'exemples d'enzyme glycosidase qui peuvent êtres ciblés par les sondes selon l'Invention, on peut citer la N-acé yl-p-galactosaminidase ; la N- acétyl-p-glucosaminidase ; la α-amylase ; la α-arabinofuranosidase ; la a- arabinosidase ; la p-cellobiosidase ; la β-chltobiosidase ; la α-galactosidase ; la β-galactosidase ; la α-glucosidase ; la β-glucosidase ; la β-glucurontdase ; la α-maltosidase ; la a-mannosWase ; la β-mannosidase ; la β-xylosklase ; la β-D-fucosidase ; la α-L-fucosidase ; la β-L-fucosidase ; la L-iduronidase et la cellulase (Orenga, S., James, A. L, Manafi, M., Perry, J. D., & Pincus, D. H. (2009). Enz matic substrates in microbiology. Journal of Microôfofog/caf Methods, 75(2), 139-155).
SE peut également être un substrat de galactosidase, et en particulier de la β-galactosidase, de l'induronidase, de la glucosidase, de la N-acétyi-D- glucosaminidase, de la N-acétyl-D-galactosaminldase, de la mannosidase, de la fucosidase ou de la glucuronidase, notamment de la β-glucuronidase.
Des exemples de tels groupes SE se comportant comme des substrats de galactosidase sont donnés ci-après : les groupements mono-giycosylés choisis parmi le D-glucuronyle, le L-iduronyle, le D-glucopyranosyle, le D- galactopyranosyle, le N-acétyl-D-glucosaminyle, le N-acétyl-D- galactosaminyle, le D-mannopyranosyle, le L-fucopyranosyie et les groupements polyglycosylés constitués de plusieurs (notamment 2 à 20, de préférence de 3 à 10, et plus particulièrement de 4 à 6) de ces groupements monoglycosylés identiques ou différents. SE peut aussi être un substrat d'estérase, notamment de lipase. Dans ce cas, SE est un groupe acyle, lié par sa fonction C(O) au reste de la molécule. En particulier, SE peut être -C(0)Ri avec RI qui représente, par exemple, un groupe alkyle de préférence de 1 à 20 atomes de carbone, alcényle de préférence de 1 à 20 atomes de carbone, un groupe benzyle, aryle ou hétéroaryle.
SE peut aussi être un substrat d'une protéase ou d'une peptidase, notamment un substrat de cathepsine ou de métalloprotéase, notamment de la PSMA (Prostate Spécifie Membrane Antigen).
Dans ce cas, SE est un groupe peptidyle ou amlnoatide lié par une fonction acyle portée par son carbone terminal ou par un chaînon latéral au reste de la molécule.
Par groupe « peptidyle », on entend un enchaînement d'au moins deux acides aminés liés entre eux par une liaison peptidique. Dans le cadre de l'invention, le ou les acides aminés présents dans SE peuvent être des addes aminés naturels ou non, mais seront, de préférence, choisis parmi les 20 acides aminés naturels ( = protéinogéniques), éventuellement sous une forme salifiée ou protégée. La fonction N-terminale de l'acide aminé terminal pourra éventuellement être salifiée ou fonctionnalisée. A titre d'exemple de forme salifiée, on peut citer la forme chlorhydrate, tosylate ou trifluoroacétate.
Tous les groupes peptidyle ou amlnoacides possibles constituant des substrats de peptidases peuvent être utilisés en tant que groupe SE. Les amlnoacides peuvent être fonctionnalisés ou non, en particulier sur l'extrémité N-terminale de SE. Selon des modes de réalisation particuliers, le résidu peptidyle SE a au plus 10 aminoacides qui peuvent être identiques ou différents. Les aminoacides du résidu peptidyle SE sont, de préférence, choisis parmi les aminoacides naturels. Néanmoins, l'extrémité N-terminale de l'aminoacide ou du groupe peptidyle peut être fonctionnalisée avec un groupe acyle -CORo, f¾ étant un groupe (Ci-Q^lkyle ou un groupe -O- (Ci-Cfe)alkyle. La fonctionnalisation possible de l'extrémité N-terminale d'une sonde donnée avec un groupe acyle (RoCO-) provient du fait que certaines endoprotéases n'interagiront pas avec un substrat ayant un groupe amino libre à son extrémité. Aussi, cette fonctionnalisation N-terminale sera préférée dans le cas où SE représente un groupe peptidyle, alors que dans le cas où SE représente un adde aminé, sa fonction N-terminale sera libre, ou de préférence salifiée sous la forme d'un ammonium. La synthèse peptidique en phase solide (SPPS) au moyen de groupes protecteurs de carbamate (qui constituent aussi des groupes "acyle" dans ce contexte) permet souvent de synthétiser plus simplement une sonde présentant un carbamate à cette extrémité N-terminale. Dans le cas des amino-peptidase, on préférera utiliser un groupe SE qui représente un adde aminé, alors que dans le cas des endopeptidases, on préférera utiliser un groupe SE qui représente un groupe peptidyle.
A titre d'exemples, les groupes peptidyle suivants peuvent être cités : Leu (pour la leudne aminopeptidase), Ser-GIn-Asn-Tyr (la partie N-terminale de la séquence de clivage préférée de la peptidase du VIH-1), Asp-Glu-Val- Asp- (pour la caspase 3), His-Ser-Ser-Lys-Leu-GIn (pour l'antigène spécifique à la prostate « PSA ») où l'extrémité N-terminale peut être libre ou être substituée par un groupe acyle -CORo, Ro étant un groupe (Ci-Q)alkyte ou un groupe -0-(Ci-C6)alkyte (par exemple un groupe -COMe).
Le groupe peptidyle ou aminoaclde est choisi pour son adéquation avec la sélectivité de séquence connue de la peptidase ciblée, qui le reconnaîtra. Le groupe peptidyle ou aminoadde peut être choisi pour l'action préférée qu'une peptidase impliquée dans certaines maladies va avoir sur ce dernier, comme présenté, notamment, dans le Tableau 1.
Tableau 1 : (Exemples de peptidases qui peuvent servir de biomarqueurs pour des phénomènes biologiques ou des maladies pendant l'imagerie
Figure imgf000017_0001
SE peut aussi être un substrat d'amidase, catalyseur de l'hydrolyse de liaisons amides non peptidiques, notamment un substrat des pénicilline amidases, dliydrolase d'amide d'acides gras, ou encore des malonamidases.
SE peut aussi être un substrat de transférase, catalyseur du transfert de groupement fonctionnel d'un substrat à un autre, notamment un substrat des transaminases, ou de la glutathione transférase ou de la gamma- glutamyl/transférase. Dans ce cas, SE correspond à un groupe peptidyle ou aminoack e lié par une fonction acyle portée par son carbone terminal ou par un chaînon latéral ou un groupe sulfonyle formant un sulf namide avec X1 qui représente alors NH.
Les substrats de protéases sont bien connus et notamment décrits dans le « Handbook of proteofytic enzymes » (Ralings et Salvesen, 2013, 3*"* éition, Elsevier Ltd) et dans la base de donnée MEROPS accessible en ligne (http://merops.sanger.ac.uk index.shtml, Bateman et al. Nudeic acid res. 2014, 42, D503), auquel on pourra se référer pour plus de détails.
SE peut aussi être un substrat réagissant avec un composé chimique, et notamment un groupe formant un pont disulfure avec X1 qui est un atome de soufre qui sera réduit/dlvé par un agent réducteur, notamment par le dithiottiréitol ou par la cystéine présent dans l'échantillon à analyser, ou un substrat réagissant par divage d'une liaison labile en milieu acide lors de l'acidification de l'échantillon analysé et notamment un groupe formant une liaison acétate avec Xs qui est un atome d'oxygène, tels que des groupements SE correspondant à méthyloxyméthyte (-CH2-O-CH3), méthyloxyéthyle (-CH2-O-CH2CH3), méthyloxyphényl (-CH2-0-Ph), méthyloxyallyle (-CH2-0-Allyl).
Définition des groupes A
A est un groupement aromatique qui après divage de la liaison CXz-0 permet la formation d'un chromophore ou fluorophore. Ce chromophore ou fluorophore peut correspondre directement au composé libéré A-OH ou à sa forme A-O" qui se forme en solution aqueuse, ou à un composé résultant d'une réaction post-divage du composé A-OH ou A-O' libéré telle qu'une dimérisation ou à un composé résultant d'un réarrangement post clivage du composé A-OH ou A-O", par exemple pour conduire à une forme tautomèrique. Un tel composé sera nommé A'=0.
Par « groupe aromatique », on entend un groupe comprenant un ou plusieurs cydes aromatiques substitués ou non substitués, lesdits cycles pouvant comprendre un ou plusieurs hétéroatomes choisis parmi les atomes d'azote, d'oxygène ou de soufre et/ou un ou plusieurs atomes de carbone sous la forme d'un carbonyle C=0. A comprend, par exemple, de préférence de 4 à 40 atomes de carbone et de 0 à 10 hétéroatomes choisis parmi les atomes d'azote, d'oxygène ou de soufre. En particulier, un groupe aromatique A peut être un carbocyde monocydique, un carbocyde bicyclique ou un carbocyde polycyclique avec plus de deux cycles, et comportant de préférence de 5 à 40 chaînons, et préférentiel lement de 6 à 15 chaînons, et comprenant au moins un cycle aromatique, ledit carbocyde comprenant éventuellement au moins un hétéroatome choisi parmi les atomes d'oxygène, azote ou soufre intégré au sein du carbocyde et/ou un ou plusieurs atomes de carbone formant le carbocyde sous la forme d'un carbonyte C=0, un tel carbocyde pouvant être non substitué ou porteur de un ou plusieurs substituants. Les groupes aromatiques comprennent notamment les groupes aryle et hétéroaryle, non substitués ou substitués. A titre d'exemple de tels carbocydes, sous leur forme non-substituée, on peut dter les groupes phényle, naphtyle, 2-, 3- ou 4-pyridinyle, 2- ou 3-furoyle, 2- ou 3-thiophényle, pyrrolyle, imidazolyle, pyrazolyle, thiazolyle, oxazolyle, isoxazolyle, pyridinyle, pyrazinyle, pyrimidinyle, tétrazolyle, thiadiazolyle, oxadiazolyle, triazolyle, pyridazinyle, indolyle, pyronyle.
Un chromophore est une molécule capable d'absorber une parue du spectre de la lumière visible. On peut dter, comme exemple de chromophore, le paranitrophéno! et ses dérivés, les colorants du type Indigoïdes obtenus après dimérisation du dérivé éno! correspondant (et correspondant donc à A'=0) qui forment un précipité en milieu aqueux aérobique, ou encore les composés tels que la cydohexenoesculetine (CHE), l'alizarine ou encore Itiydroxyflavone qui forment un précipité coloré en présence de certains métaux :
Figure imgf000019_0001
Les hydroxyindolyles peuvent être substitués par un ou plusieurs X3 identiques ou différents choisis parmi les atomes de chlore, brome, iode ou fluor et positionnées) sur n'importe quelle position du cycle benzénique.
Un fluorophore est une molécule capable de générer de la fluorescence, lorsqu'elle est soumise à une excitation lumineuse de longueur d'onde adaptée. La « fluorescence » est la propriété par laquelle une molécule qui est excitée par de la lumière d'une longueur d'onde donnée émet de la lumière à une plus grande longueur d'onde. La fluorescence est un phénomène qui résulte de l'Interaction d'un fluorophore avec un photon incident Ce processus est appelé excitation. L'absorption du photon amène un électron dans le fluorophore, à passer de son état fondamental, à un niveau d'énergie supérieur. Ensuite, l'électron revient à son niveau original en émettant un photon. Ce processus est appelé émission de fluorescence. Le fluorophore émet ensuite de la lumière à une plus grande longueur (fonde que celle du photon absorbé. Ced est dû simplement au fait que l'énergie du photon émis est inférieure à celle du photon absorbé, du fait de la dissipation d'énergie pendant la durée de vie de l'état excité. Cette définition est donnée dans la demande de brevet WO 2004/058787.
Des exemples de groupements -OA, permettant de libérer de tels fluorophores sont donnés ci-dessous :
Figure imgf000020_0001
A titre d'exemple de groupe -OA permettant la libération d'un fluorophore après réarrangement de la molécule libérée A-OH ou A-O', on peut citer les fluorophores suivants (le deuxième est décrit par : Shabat et al. J. Am. Chem. Soc 2012, 134, 20412) :
Figure imgf000021_0001
Selon des modes de réalisation particuliers, le groupe -OA est sélectionné de manière à obtenir, après divage de la liaison C-0 entre l'atome de carbone porteur de l'atome (X2) et l'atome d'oxygène porteur du groupement A dans les composés de formule (I), un composé AOH qui correspond à un fluorophore ESIPT, qui peut ou non précipiter en solution aqueuse. Un fluorophore ESIPT est un composé qui comprend au moins un groupement hydroxyle qui intervient dans le transfert de proton intra moléculaire, permettant une tautomérisation de la molécule fluorophore et émission de fluorescence. Des exemples de tels groupements -OA répondent à la formule (AA):
Figure imgf000021_0002
dans laquelle : soit X5 est un atome d'oxygène et X4 est un groupe -NH2, -OH, -SH, alkyle, an/le, -O-alkyte, -O-phényle, -NH-alkyle, -NH-phényle, -S-alkyle ou -S-aryle, lesdits groupes alkyle et phényle pouvant être substitués ou non substitués, soit X5 représente un atome d'azote et est lié à X4 qui représente alors CH, O, S, N ou NH pour former un hétéroaryle substitué ou non substitué, ledit hétéroaryle substitué ou non substitué étant de préférence choisi parmi le quinazole, llmidazoie, le benzoimidazole, le thiazoie, le benzothlazole, l'oxazote, le benzooxazole, la pyridine et la quinoline,
Figure imgf000022_0001
et représente un aryle ou un hétéroaryle, substitué ou non substitué, par exemple choisi parmi les groupes phényle, naphthyle, et :
Figure imgf000022_0002
lesdits groupes pouvant être substitués ou non substitués,
avec X« qui représente S, 0 ou NR", et R" qui représente un atome d'hydrogène ou un groupe (CrQJalkyle.
Lorsque dans un groupe -OA, qui représente sous forme AOH un fluorophore ESIPT, comprend plusieurs groupements hydroxyie, alors l'atome d'oxygène du groupe -OA est l'atome d'oxygène du groupement hydroxyie qui intervient dans le transfert de proton intramoléculaire. Llncorporation de cet hydroxyie dans le groupement carbamate des composés de formule (I) empêche la formation de la liaison hydrogène interne et la tautomérisation du fluorophore.
Les fluorophores ESIPT montrent un déplacement de Stokes qui dépasse les 100 nm et atteint souvent 200 nm. Tous les fluorophores ESIPT perdent cette émission de fluorescence correspondant à un déplacement de Stokes supérieur à 100 nm, si leur groupement OH du type phénolique est alkylé, acylé ou autrement fonctionnalisé, ce qui empêche de transférer un atome d'hydrogène à Chétéroatome X5 sur l'illustration donnée avec la formule (AA), lors de l'excitation par irradiation, et ainsi empêche l'émission de fluorescence caractéristique du processus de transfert de proton.
Le plus souvent dans un tel cas, le groupe A correspond à un groupe phényle qui est non substitué ou substitué et/ou qui est fusionné avec un ou plusieurs carbocydes insaturés comprenant éventuellement un hétéroatome tel que l'azote. Ce groupe sous sa forme phénoxy -OA, lorsqu'il n'est pas lié au substrat, correspond sous sa forme protonée à un composé phénolique HOA qui appartient à la classe des fluorophores ESIPT.
Des groupes -OA du type phénoxy, correspondent, par exemple, aux structures préférées (BB) ou (CC) suivantes :
Figure imgf000023_0001
dans laquelle
- T est -NH-C(0 , -S-, -O-, -NH, N-alkyle ou N-aryle,
- Ra est l'hydrogène ou un substituant carboné attracteur d'électrons, comme -CN ou -COORd, avec Rd qui représente un groupe (Ci-C-})alkyle, ou bien Ra est -CONReRf, avec Re et Rf, identiques ou différents, qui représentent l'hydrogène ou un groupe (Ci-Ct)alkyle, ou bien Ra est -CF3 ou un groupe 2-oxazolyle, 2-thiazotyle, 2-imidazolyle, 2-benzoimidazolyle, 4-pyrimidirton-2-yle ou quinazolinon-2-yte,
- Rb est l'hydrogène, un atome de chlore, brome, iode ou fluor, -OH, -NH2, -NRgRh, -NHRg ou -ORg, avec Rg et Rh qui représentent chacun indépendamment un (Ci-C-Oalkyle, - ou bien Ra et Rb sont liés entre eux pour former une chaîne hydrocarbonée comprenant 4 ou 5 chaînons, saturée ou insaturée, substituée ou non substituée, éventuellement interrompue par un ou plusieurs hétéroatomes choisis parmi N, S et O,
- Rc est l'hydrogène, Br, Cl, I ou F,
Figure imgf000024_0001
dans laquelle :
- T est IMH2, OH, un groupe aryte, un groupe (Q-C alkyle, SH, NHR'c, OR'c, NR'cR'd ou SR'c, avec R'c et R'd, identiques ou différents, qui représentent un groupe (CrC)alkyle ou aryte,
- R'a est l'hydrogène ou un substituant carboné attracteur d'électrons comme -C , ou -COOR'e, avec R'e qui représente un groupe (C C4>alkyle, ou R'a est -CO RfR'g, avec R'f et R'g, identiques ou différents, qui représentent l'hydrogène ou un groupe (Ci-QJalkyle, ou bien R'a est -CF3 ou un 2-oxazolyle, 2-thiazolyle, 2-lmidazolyte, 2- enzoimidazolyle, 4-pyrimidinon-2-yle ou quinazolinon-2-yle,
- R'b est l'hydrogène, un atome de chlore, brome, iode ou fluor, -OH, -NH¾ -NR'hR'i ou -OR'h, avec R*h et R'i, identiques ou différents, qui représentent un groupe (Ci-C-jJalkyie,
- ou bien R'a et R'b sont liés entre eux pour former une chaîne hydrocarbonée comprenant 4 ou 5 chaînons, saturée ou insaturée, substituée ou non substituée, éventuellement interrompue par un ou plusieurs hétéroatomes choisis parmi N, S et O. On pourra notamment se référer aux demandes WO 2013/045854 et WO 2014/020285A qui donnent des exemples de tels ftuorophores ESIPT pour plus de détails.
A titre d'exemple de groupe OA, correspondant à un fluorophore de type ESIPT, on peut citer, plus particulièrement les groupements suivants :
Figure imgf000025_0001
Le très grand déplacement de Stokes de tels fluorophores (approximativement 170 nm pour la HPQ (Hydroxyphénytquinazolinone) présentée à droite ou de tout analogue de la HPQ contribuera à l'excellente sensibilité de la sonde et rendra le fluorophore libéré aisément distinguable de la fluorescence native pouvant provenir de l'échantillon biologique sur lequel l'analyse va être menée.
Définition des groupes R
R peut représenter un atome d'hydrogène ou -(L)n-GP, avec n qui est égal à 0 ou 1.
Bien souvent, pour des raisons de synthèse, n = 1 et L est un bras de liaison, et notamment un bras -(Ll)ml-(L2)m2-(L'l)m'l- (dans le sens pipérazine -> groupe GP) avec :
Ll et L'I, identiques ou différents, qui sont choisis parmi -O-, -NH-,
-N(Ci-6 alkylh -N(phényi)-, -N(aryl)-, -qO)-, -C(0)0-, -OC(0)-, -0C(0)O-, -NHC(0)-0-, -OC(0)-NH-, -NHC(0)-NH-, -S-, -SOr, -N=N-, -NHC(0)- et -CONH-
L2 qui est choisi parmi les groupes bivalents suivants : (Ci-2o)alky)e, (Ci-2o)alcényle, (Ci-2o)alcynyle, (Ce-24)aryle, (C7--M)alkylaryle, (C7-44>alcénylaryle, (C7-4-i)alcynylaryle, (C^jalkylcydoallcyle,
(C7-44)alcénylcydoalkylef (C7-«)alcynylcycloalkyle, (C7- 4>alkylhétérocydoalkyle, (C7-44)alcénylhétérocycloallcylef (C7-44)atcynylhétérocydoa!kyle; lesdits groupes pouvant être interrompus ou se terminer par un groupe triazole et pouvant être non substitués ou substitués, notamment par un ou plusieurs substituants choisis parmi les (Ci io)alcoxy, (C1-10)alkyie, (C&.io)aryte, amido, imido, phosphido, nitrido, (Ci-io)alcényle, (Ci i0)alcynyle et -OH ; et
ml, m'I et ml, identiques ou différents, qui sont égaux à 0 ou 1.
Le bras L, lorsqull est présent, sera choisi pour éloigner le groupe GP de la plpérazine ou pour des questions de synthèse. Selon un mode de réalisation préféré, L représente -{Ll)ml-(L2)m2-(L'l)m'l avec Ll = -C(0)-, ml = m2 = 1, m'I = 1 ou 0 et L2 et L'I tels que définis précédemment et notamment L représente -C(OHCH2)p-L3- avec p qui est égal à 1, 2, 3 ou 4 et L3 qui est un groupe triazole et notamment un groupe l/ l,2,3-triazole.
GP est un groupe hydrosolubilisant
Par « groupe hydrosolubilisant », on entend un groupe hydrophile qui permet d'améliorer la solubilité de la sonde, par rapport notamment à une sonde qui n'en diffère que par le remplacement de l'atome d'azote porteur de L-GP par un CH2/ pour obtenir une pipérkJin telle que décrite dans les demandes WO 2013/045854 et WO 2014/020285. A titre d'exemple de groupe hydrosolubilisant, on peut citer les groupes capables de former une espèce chargée en solution aqueuse. A titre d'exemple de groupe hydrosolubilisant GP, on peut citer les fonctions Fi choisies parmi les aminé (primaire, secondaire, ou tertiaire), amidine, guanidine ou tétrazole ; les fonctions F2 choisies parmi les fonctions anioniques du type carboxylate, sulfonate ou phosphate ; les groupements comprenant une ou plusieurs de ces fonctions Fi et ou F2 ; les polyéthylèneglycols ; les sucres ou polysaccharides tels que le glucose, le galactose et le mannose ; les groupes peptidiques tels que la poly-lysine, la poly-arginine, les TAT-pepbdes... A titre d'exemple de fonctions aminé, on peut citer -MH2/ -NH(Ci-- alkyle, et les dialkylamines dans lesquelles les groupes alkyle sont identiques ou différents et comprennent de 1 à 4 atomes de carbone. Par « groupements comprenant une ou plusieurs de ces fonctions Fi et/ou F2 », on entend un groupement alkyle (tel que les (C3^)alkyles), un groupement an/le (tel qu'un groupement aryle comportant 6 atomes de carbone), un groupement hétéroaryle (tel qu'un hétéroaryle comportant 6 atomes de carbone) dans lequel un ou plusieurs atomes d'hydrogène de ces groupement a(ont) été substitué(s) par une ou plusieurs fonctions Fi, ou par une ou plusieurs fonctions F2 ou bien au moins un atome d'hydrogène a été substitué par une fonction Fi et un autre atome d'hydrogène a été substitué par une fonction F
Définition des termes utilisés dans la définition des sondes Par fonction acyle, on entend une fonction :
Figure imgf000027_0001
Par groupe « alkyle », à moins qui) n'en soit spécifié autrement, on entend une chaîne hydrocarbonée, saturée, linéaire ou ramifiée. Les groupes alkyle comprenant de 1 à 6 atomes de carbone seront préférés. A titre d'exemple de groupe alkyle comprenant de 1 à 6 atomes de carbone, nommés Ci-e alkyle ou (Ci-Ce) alkyle, on peut dter, notamment, les groupes méthyle, éthyle, /hpropyle, /sopropyle, Λ-bub ie, terf-butyle, sec-butyle, n- pentyle, n-hexyle.
Par groupe « aryle », on entend un carbocyde mono-, bi- ou polycydique, comprenant au moins un groupe aromatique, par exemple, un groupe phényle, dnnamyle ou naphtyie. Les groupes aryle comprenant de 6 à 12 atomes de carbone seront préférés. Le phényle est le groupe aryle particulièrement préféré.
Lorsqu'il est indiqué qu'un groupe est substitué, cela signifie qull est substitué par un ou plusieurs substituants, notamment choisis parmi les atomes de chlore, brome, iode ou fluor, les groupes cyano, alkyle, fluoroalkyle, trifluorométhyle, alcényle, alcynyle, cydoalkyle, aryle, hétérocycloalkyle, amino, alkylamino, dialkylamino, hydroxy, akoxy, aryloxy, -COOH, nitro, les groupes acyle, les groupes aromatiques (notamment aryle et hétéroaryle), lesdits groupes alcényle, alcynyle, cydoalkyle, hétérocydoalkyte, groupes acyte et groupes aromatiques peuvent eux- mêmes être non substitués ou substitués. Les termes utilisés pour (a définition de ces substituants sont ceux usuellement reconnus par l'homme du métier.
De manière classique, le terme « alcényle » désigne une chaîne hydrocarbonée, linéaire ou ramifiée comprenant au moins une double liaison, et présentant de préférence de 2 à 20 atomes de carbone, et préférentiellement de 2 à 6 atomes de carbone ; le terme « alcynyle » désigne une chaîne hydrocarbonée, linéaire ou ramifiée comprenant au moins une triple liaison, et présentant de préférence de 2 à 12 atomes de carbone, et préférentiellement de 2 à 6 atomes de carbone ; le terme « fluoroalkyle » désigne une chaîne hydrocarbonée, saturée, linéaire ou ramifiée dans laquelle au moins un atome d'hydrogène a été remplacé par un atome de fluor, et présentant de préférence de 2 à 12 atomes de carbone, et préférentiellement de 2 à 6 atomes de carbone ; les termes « alcoxy » et « aryloxy » désignent respectivement un Oalkyle et un O- aryle.
Par « cycloalkyle », on entend un groupe hydrocarboné saturé constitué d'au moins un cycle, éventuellement ponté. Les groupes alkyle comprenant de 3 à 12 atomes de carbone seront préférés. A titre d'exemple, on peut citer les groupes cydopropyie, cyclobutyle, cyclopentyle, cyclohexyle, cydoheptyle et adamantyle.
Par « hétérocydoalkyle », on entend un groupe cydoalkyle tel que défini ci-dessus, dans lequel au moins un atome de carbone est remplacé par un hétéroatome choisi parmi 0, S ou N. A titre d'exemple d'hétérocydoalkyle, on peut citer les groupes pipéridinyie, pipérazinyle, morpholirr/te, tétérahydropyranyle ...
Par groupe « hétéroaryle », on entend un carbocyde mono-, bi- ou polycydique, comportant de préférence de 6 à 12 chaînons, et comprenant au moins un groupe aromatique et au moins un hétéroatome choisi parmi les atomes d'oxygène, azote ou soufre intégré au sein du carbocyde. A titre d'exemple de groupe hétéroaryle, on peut citer les 2-, 3- ou 4-pyridinyie, 2- ou 3-furoyte, 2- ou 3-thiophényle, pyrrofyle, imidazolyle, pyrazolyle, thiazolyle, oxazolyle, isoxazolyle, pyridinyle, pyrazinyle, pyrimidinyle, tétrazolyle, thiadiazolyle, oxadiazolyle, triazolyle, pyridazinyle, indolyle. Les hétéroaryles comprennent également de tels groupes dans lesquels un ou plusieurs atome(s) de carbone du cycle est(sont) sous la forme d'une fonction carbonyle C=0.
Par « groupe acyle », on entend un groupe lié par le carbone d'une fonction acyle C=0, et notamment un groupe -CONH2, -COOH, -COaryle, -C0(Ci-4)atkyle, -COSH, -CONHR"* -CONR "aR"b ou -COSR"a avec R"a et R identiques ou différents, qui représentent un groupe (CrC) alkyle ou aryle.
Par « (Cr«)alkylaryle », « (Cr 4>alcény1aryle », « (Cr«)alcynylaryle », on entend respectivement une chaîne alkyle, alcényle ou alcynyle, commençant, interrompue ou se terminant par un groupe aryle. On préférera les groupes alkylaryle, alcénylaryle et alcynylaryle comprenant de 7 à 22 et de préférence de 7 à 16 atomes de carbone.
Préparation des sondes selon l'invention
Les composés utilisés dans le cadre de l'invention sont préparés selon des techniques classiques. Ils peuvent, notamment être obtenus selon des procédés analogues à ceux utilisés dans les exemples.
Les composés selon l'invention peuvent être obtenus selon le Schéma 2 ci-après, dans lequel A, X1, X2 et SE sont tels que définis pour les sondes de formule (I) et Pt et P2 sont des groupes protecteurs temporaire des fonctions aminé en particulier dans les conditions de réaction mises en œuvre, Y est un groupe partant du type Cl, para-nitrophénol, imidazole ou N-méthylimidazolium, ou N-hydroxysuccinimkJe, et Rp représente R ou un groupe protecteur temporaires des fonctions aminé en particulier dans tes conditions de réaction mise en uvre ou Rp est un groupe précurseur du groupe R. Schéma 2
Figure imgf000030_0001
Par groupe protecteur temporaire des aminés, on entend les groupes protecteurs tels que ceux décrits dans Protectlve Groups in Organic Synthesis, Greene T.W. et Wuts P.G.M., ed John Wlley et Sons, 2006 et dans Pro ecting Groups, Kocienski PJ., 1994, Georg Thieme Verlag. A titre d'exemple de tels groupements, on peut citer les groupes benzyle (Bn), les groupes -C(0)OR'i avec R'i qui représente un groupe alkyle ou alcényle de 1 à 12 atomes de carbone ou un groupe -(CH2)m3R"i avec R"i qui représente un groupe aryle, cydoalkyle ou fluorényle et m3 qui est égal à 0, 1, 2 ou 3, et en particulier, les groupes carbobenzyloxy (Cbz), ter- butyloxycarbonyl (Boc) et 9-fluorénylméthyloxycarbonyl (Fmoc), allyloxycarbonyle (Alloc).
Les composés (V) pourront notamment être obtenus à partir de la pipérazine commerciale. En suivant une procédure similaire, mais modifiée de celle décrite dans Org. Lett 2010, 12, 176, on peut former le composé (V) à partir de la pipérazine bis-protégée, dont l'un des groupements est un groupement Butyloxycarbonyl (Boc), grâce à une réaction d'ortholithiation, suivie d'une réaction avec du paraformaldéhyde pour former le composé (V) où X1 = 0. Le dérivé aminé (V) où X1 = NH peut être ensuite obtenu par exemple grâce à une synthèse de Gabrielle, tandis que le composé (V) où X1 = S peut être obtenu par substitution nudéophile.
Il est également possible, de manière préférée, d'utiliser les procédés illustrés dans les Schémas 3 et 4 qui nécessitent moins d'étapes dans les cas où X1 = O ou NH pour la préparation des composés de formule (VII). Dans les Schémas 3 et 4, A, X1, X2 et SE sont tels que définis pour les sondes de formule (I) et R2 est un groupe alkyle de 1 à 4 atomes de carbone, s est groupe protecteur temporaire des fonctions aminé en particulier dans les conditions de réactions mise en œuvre, et Y est un groupe partant du type Q ou paranitrophénol, imidazole ou N- méthylimidazolium, ou N-hydroxysuccinimide et Rp représente R ou un groupe protecteur temporaire des fonctions aminé en particulier dans les conditions de réaction mises en œuvre ou Rp est un groupe précurseur du groupe R. Schéma 3 :
Figure imgf000032_0001
Dans la procédure décrite dans le Schéma 3, le cyde pipérazine est obtenu par une double substitution nucléophile d'un composé du type éthylène diamine (X) sur des dérivés du produit de départ commercial du type (XI).
Dans la procédure décrite dans le Schéma 4, le cyde pipérazine est obtenu par une réduction du cycle pipérazinone (XIII), lui-même synthétisé à partir d'un bromure de malonate (XIV) et d'un composé du type éthylène diamine (X).
Les groupements R différents de H, qui correspondent à un groupe L- GP, peuvent être introduits grâce à des réactions du type substitution nucléophile, amination réductrice ou formation de liaison amide. La liaison entre les groupements L et GP peut être obtenue par d'innombrables voies de synthèse selon les fonctions chimiques présentes sur le bras de liaison L. On peut par exemple citer des réactions de Ikjation telles que des substitutions nucléophiles, des couplages peptidiques, des cycloadditions telles que la cydoaddition de Huisgen ou de Diels-Alder, des couplages paladocatalysés tels que le couplage de Sonogashira ou de Heck.
H est possible de former intermédiairement un composé intermédiaire de formule (Π dans laquelle Rp est un groupe précurseur d'un groupe R ou Rp est un groupe protecteur temporaire des aminés. En particulier, font partie intégrante de l'invention, les intermédiaires de formule :
e
Figure imgf000033_0001
ainsi que leurs sels, solvats ou hydrates,
dans lesquels :
A, X1, X2, SE, Ll, L'1, L2, ml, m'1, et m2 sont tels que définis pour (I), Z représente C≡CH, 3, une fonction N-oxysucdnimide ou maléimide, et R'p représente un groupe protecteur des fonctions aminés, de préférence choisi parmi les groupes benzyle, les groupes -C(0)OR'i avec R'i qui représente un groupe alkyle ou alcényle de 1 à 12 atomes de carbone ou un groupe -CCH2)m3R"i avec R"i qui représente un groupe aryie, cycloalkyle ou fluorényle et m3 qui est égal à 0, 1, 2 ou 3. A titre d'exemple de groupe R'p préféré, on peut citer le carbobenzytoxy, ter-butyloxyœrbonyl, 9- fluorénylméttiyloxycarbonyl, et allyloxycarbonyfe.
Dans certains cas, également, un composé de formule (I) pourra servir d'intermédiaire dans la préparation d'un autre composé de formule (I). C'est notamment le cas des composé de formule (I) dans lesquels GP = -COOH ou -NH2 qui pourront être utilisés notamment pour former des composés dans lesquels L'I = -CONH- ou - HCO- et m'I = 1.
Les réactifs de départ sont disponibles dans le commerce ou facilement accessibles. Les molécules de formule (I) sont donc d'accès chimique relativement simples, et peuvent être obtenues à un relativement faible coût de préparation, pour le domaine technique considéré.
Les sels des composés selon l'invention sont préparés selon des techniques bien connues de l'homme de l'art. Les sels des composés de formule (I) selon la présente invention comprennent ceux avec des acides ou des bases, en fonction des substituants présents. Ces acides ou bases peuvent être choisis parmi les addes et bases minéraux et organiques qui permettent une séparation ou une cristallisation convenable des composés de formule (I), ainsi que des sels physiologlquement acceptables, c'est-à-dire compatibles avec des applications in vivo et in vitro. En tant qu'acide approprié, on peut citer : l'acide oxalique ou un adde optiquement actif, par exemple un acide tartrique, un adde dlbenzoyltartrique, un adde mandélique ou un adde camphorsulfonique, et ceux qui forment des sels physiologlquement acceptables, tels que le chlorhydrate, le bromhydrate, le sulfate, l'hydrcxjénosulfate, le dihydrogénophosphate, le maléate, le fumarate, le 2-naphtalènesulfonate, le para-toluènesulfonate, le mésylate, le bésylate, llsotionate. En tant que base appropriée, on peut citer : la lysine, l'arginine, la méglumine, la bénéthamine, la benzathine et celles qui forment des sels physiologlquement acceptables, tels que des sels de sodium, de potassium, de calcium.
Comme composés sous forme hydratée, on peut citer, à titre d'exemple, les semi-hydrates, monohydrates et polyhydrates.
Par sorvat, on entend une forme du composé associé à une ou plusieurs molécules de solvant, notamment utilisé lors de sa synthèse ou lors de sa purification, sans pour autant être en solution dans ce dernier.
Les différents composés de formule (I) selon l'invention peuvent se trouver sous toutes les formes dlsomères optiques possibles, éventuellement en mélange selon toutes proportions, à moins qu'il n'en soit spécifié autrement. Selon un mode de réalisation particulier, les composés selon I Invention comportant un carbone asymétrique se trouvent sous une forme racémique, les formes R et S se trouvant en proportions sensiblement égales. Selon un autre mode de réalisation, les composés de formule (I) de l'invention peuvent se trouver sous une forme enrichie en un diastéréoisomère ou énantiomère, avec un excès diastéréoisomérique ou énantiomérique supérieur à 80 %, voire même supérieure à 95%, voire sous une forme isomérique pure c'est-à-dire avec un excès diastéréoisomérique ou énantiomérique supérieur à 99 %.
Les composés (I) pourront être isolés sous une forme enrichie en un diastéréoisomère ou énantiomère par les techniques classiques de séparation : on pourra utiliser, par exemple des recristallisations fractionnées d'un sel du racémique avec un adde ou une base optiquement active dont le principe est bien connu ou, le plus souvent, les techniques classiques de chromatographies sur phase chirale ou non chirale.
Dans le cadre de (Invention, toutes les définitions et modes de réalisation préférés pour A, R, X1, X¾ et SE pourront être combinées.
En particulier, les sondes selon l'invention présenteront l'une ou l'autre des caractéristiques suivantes, voire toutes les caractéristiques suivantes :
X2 = 0,
• soit Xj = 0 et SE est un substrat de glycosidase ou glucuronidase et correspond à un groupe glycosyle lié par son carbone anomérique au reste de la molécule, ou SE est un substrat d'estérase et correspond à un groupe -C(0)Ri avec Ri qui représente, par exemple, un groupe alkyle de préférence de 1 à 20 atomes de carbone, alcényle de préférence de 1 à 20 atomes de carbone, un groupe benzyle, aryle ou hétéroaryle, soit X1 = NH et SE est un substrat de protéase ou peptidase et correspond à un groupe peptidyle lié par une fonction acyle portée par son carbone terminal ou par un chaînon latéral,
R représente— L-GP avec :
o L qui représente, de préférence, -(Ll)ml-(L2)m2-(L'l)nri'l avec Ll = -C(OK ml = m2 = 1, m'I = 1 ou 0 et L2 et L'I tels que définis ci-dessus, et notamment L représente -C(0)- (CH2)p-L3- avec p qui est égal à 1, 2, 3 ou 4 et 13 qui est un groupe triazole et notamment un groupe 1H- 1,2,3-triazole, et o GP qui est, de préférence, une fonction Fi choisie parmi les fonctions ammonium, carboxytate, sulfonate et phosphate et les polyéthylèneglycols,
- A est un des groupements spécifiquement décrits dans la présente demande de brevet
Les sondes selon l'invention sont attractives pour plusieurs applications à haute sensibilité dans les sciences de la vie, et notamment : (1) le criblage à haut rendement d'une activité, en particulier d'une activité enzymatique, exprimée par des colonies bactériennes sur une plaque gélosée (analyse de colonies) ; (2) la détection In vitro d'une activité, en particulier d'une activité enzymatique, dans des liquides biologiques (hématologie et autres) ; (3) la détection d'une activité, en particulier d'une activité enzymatique, au niveau d'une cellule unique par cytométrie de flux; (4) la visualisation d'une activité, en particulier d'une activité enzymatique, intracellulaires dans des cellules cultivées (microscopie de fluorescence et microscopie confbcale) ; (5) la détection histochimique d'une enzyme (à l'échelle tissulaire) ; et également (6) l'imagerie moléculaire in vivo.
Ainsi, les sondes selon la présente invention ont un grand nombre d'applications potentielles. Les exemples de telles applications incluent la conception d'analyses sur colonies bactériennes. Celles-ci sont actuellement réalisées sur une plaque gélosée (boîte de Pétri) où jusqu'à 3 000 colonies peuvent être distinguées sans avoir à les séparer activement dans des compartiments séparés comme les puits contenus dans une plaque à puits multiples. Il est, par exemple, possible de concevoir des tests sur échantillons cliniques permettant d'identifier parmi un ensemble de lignées bactériennes une lignée pathogène d'intérêt
Les sondes selon l'invention peuvent servir aussi pour l'imagerie par fluorescence macroscopique, c'est-à-dire au niveau d'un organisme entier. Dans ce cas, la sonde pénétrera dans la paroi cellulaire pour atteindre l'activité d'intérêt (un stimulus tel qu'une enzyme, un composé chimique ou une caractéristique physicochimique du milieu dans lequel se trouve la sonde).
Les exemples suivants illustrent l'invention, mais n'ont aucun caractère limitatif.
Abréviations utilisées
DCM : dichlorométhane TFA : adde trtfluoroacétique
Boc : tert-butytoxycarboxyl Me : méthyl
Ac : acétyi HOBt : 1-hydroxybenzotriazole sBu : sec-butyi HATU : hexafluorophosphate de 1- [Bis(dimét ylamino)methytèn€]-lH- l,2,3-Wazolo[4,5-b]pyridlnium 3-oxyde
Et : éthyl TA : Température Ambiante
DIAD : azodicarboxylate de AMC : 7-amirx>- -rnéthvlcoumarine diisopropyle
THF : Tétrahydrofurane DCC : Dicydohexylcarbodiimide
DM F : N,N^iméthylf rmamide iPr : isopropyt
δ : Déplacement Chimique (ppm) RFU : Unité de fluorescence arbitraire UA : Unité d'absorbance arbitraire λβχ : Longueur d'onde d'excitation
(nm)
λβη · Longueur d'onde d'émission RMN : Résonance magnétique (nm) nucléaire
LC : Chromatographie liquide MS : Spectroscopie de masse
ESI : Ionisation par électrospray Rf : Rapport frontal
J: Constante de couplage H-H (Hz) s : singulet
d : doublet t : triplet
dd : doublet de doublet td : triplet de doublet
m : multiplet br : signal élargi
v : volume Appareillage utilisé pour les caractérisations
Les spectres R N ont été obtenus à 297K grâce à un spectromètre Bruker AVANCE 300 (300 MHz & 75 MHz pour *H et UC, respectivement) ou un Bruker AVANCE 500 (500 MHz & 125 MHz pour lH et 13C, respectivement).
Les mesures de Masse en basse résolution ont été obtenues grâce à un spectromètre de masse couplé à la chromatographie liquide AGILENT 1100 SL.
Les analyses par Chromatographie sur Couche Mince (CCM) ont été réalisées sur des plaques de gel de Silice 60Â déposé sur aluminium (Aldrich).
Les mesures de Masse en haute résolution ont été obtenues grâce à un spectromètre de masse MicrOTOFQ Π, Bruker.
Les mesures de fluorescence ou d'absorbance ont été obtenues grâce à un fluori mètre à plaque EnSpire, Perkin-Elmer.
A - Synthèses :
I - Préparation de Intermédiaire 8. le N^f -tenzvlPiperazin-2-vl^méthvlV2- phénylacétamlde. sous la forme de sel avec l'acide trifluoacétigue
a) Préparation du composé 2: N-Boc-pipérazine
Figure imgf000038_0001
A une solution de pipérazine 1 (10,0g, lOOmmol, 2,0eq.) dans du DCM (300mL) est ajoutée goutte à goutte une solution de B0C2O (8,07g, 50mmol, l,0eq.) dans du DCM (150mL) sur une période de 3h à température ambiante (TA). A la fin de l'addition, le mélange réactionnel est agité à TA pendant 18h. Le mélange est ensuite concentré par évaporation, afin d'obtenir un volume final approximatif de lOOmL Cette solution est ensuite lavée avec une solution aqueuse saturée de NaH b (2xl00mL) et une fois avec de la saumure (lOOmL). La phase organique est séchée avec du Na2S04, filtrée et évaporée pour obtenir le composé 2 sous forme d'une huile incolore qui cristallise avec le temps (7,57g, 40mmol, rendement: 81%).
Ή-RMN (300 MHz, CDCh): δ = 3.33 (t, J=5Hz, 4H), 2.75 (t, J=5Hz, 4H), 1.67 (s, 1H), 1.41 (s, 9H) ppm.
13C-RMN (75 MHz, CDCb): δ = 154.9, 79.5, 56.3, 46.0, 44.8, 30.4, 28.5 ppm. MS: ESI: [M+H]+ m z trouvée 187.3, calculée 187.3
b) Préparation du composé 3: N-Boc-N'-benzyl-pipérazine
Figure imgf000039_0001
A une solution du composé 2 (10,0g, 5,7mmol, l,0eq.), de benzaldéhyde (5,5mL, 53,7mmol, l,0eq.) et de tamis moléculaire 4Â dans du DCM (200ml_) refroidie à 0°C est ajouté en plusieurs portions du NaBH(OAc)3 (17,6g, 80,6mmol, l,5eq.). Le milieu réaction est agité à 0°C pendant lh puis à TA pendant 2h. A la fin de la réaction, le mélange est filtré et le filtrat est lavé trois fois avec une solution aqueuse saturée de NaHCCh (3xl50mL). La phase organique est séchée avec du Na2SO-i, filtrée et évaporée. Le brut réactionnel est purifié par colonne de chromatographie sur gel de silice (éluant : d'abord pur DCM puis DCM : MeOH / 95:5 / v:v) pour obtenir le composé 3 sous forme d'une huile incolore qui cristallise avec le temps (12,8g, 46mmol, rendement: 86%).
*H-RMN (300 MHz, CDCfe): δ = 7.29 (m, 5H ), 3.52 (s, 2H), 3.45 (t, J=5Hz, 4H), 2.40 (t, J=5Hï), 1.48 (s, 9H) ppm.
13C NMR (75 MHz, CDd3) δ = 154.90, 137.98, 129.25, 128.38, 127.26, 79.63, 63.18, 52.98, 43.61, 28.54 ppm.
MS: ESI: [M+H]+ m/z trouvée 277.3, calculée 277.3
Rr = 0.32 (éther de pétrole : acétate d'éthyle / 8:2 / v:v) c) Préparation du composé 4: tert-butyl 4-benzyl-2- (hydroxyméthyl)pipérazine-l-carboxylate
Figure imgf000040_0001
Dans un ballon préalablement séché et placé sous atmosphère Inerte d'Argon est dissout le composé 3 (1,0g, 3,6mmol, l,0eq.) dans du THF anhydre (20mL). Cette solution est refroidie à -30°C et le sBuU (1,3M dans du Cyclohexane, 4,2mL, l,5eq.) est ajouté goutte à goutte. Le mélange réactionnel est agité à -30°C pendant 6 minutes avant que le paraformaldéhyde (350mg, ll,6mmol, 3,2eq.) ne soit introduit rapidement en une seule portion. Cette suspension est agitée à -30°C pendant 30minutes, et lh30 à TA avant d'être quenchée grâce à une solution aqueuse saturée de NH4Q (20mL). La phase organique est séparée et la phase aqueuse est lavée deux fois avec ί¾0 (2x20mL). Les phases organiques sont combinées, séchées avec du Na2S04, filtrées et évaporées. Le brut réactionnel est purifié par colonne de chromatographie sur gel de silice (éluant : éther de pétrole : acétate d'éthyle / 7:3 / v:v) pour obtenir le composé 4 sous forme d'une huile jaune (625mg, 2,0mmol, rendement: 57%).
^ M (500 MHz, CDCb): δ= 7.32 (m, 5H), 4.12 (br s, 1H), 3.92 (m, 3H), 3.54 (s, 2H), 3.40 (br s, 1H), 3.04 (d, J=U.6Hz, 1H), 2.86 (d, J=8.7Hz, 1H), 2.33 (dd, 3=U.6Hz, 3.9Hz, 1H), 2.13 (td, 3=11.6Hz, 3.9Hz, 1H), 1.49 (s, 9H) ppm.
13C-RMN (125 MHZ, CDCI3): δ = 155.3, 137.3, 129.0, 128.6, 127.5, 80.0, 66.5, 63.1, 55.1, 52.6, 51.4, 41.7, 28.5 ppm.
MS: ESI: [M+H]+ m/z trouvée 307.2, calculée 307.2
Rr = 0.28 (éther de pétrole : acétate d'éthyle / 7:3 / v:v) d) Préparation du composé 5: tert-butyl 4-benzyl-2-((l,3- dioxoisoindolin-2-yl)métliyl)pipérazine-l-carboxylate
Figure imgf000041_0001
A une solution refroidie à 0°C du composé 4 (1,03g, 3,36mmol, l,0eq.), de triphénylphosp ine (1,07g, 4,03mmol, l,2eq.) et de phthaiimide (600mg, 4,03mmol, l,2eq.) dans du THF anhydre (20mL) est ajouté goutte à goutte le DIAD (845μΙ_, ,03(7117101, l,2eq.). Le mélange réactionnel est agité à 0°C pendant 30min puis à TA pendant 18h. Les volatiles sont évaporés et l'huile résultante est purifiée par colonne de chromatographie sur gel de silice (éluant : éther de pétrole : acétate d'éthyie / 8:2 / v:v) pour obtenir le composé 5 sous forme de solide blanc (1,20g, 2,76mmol, rendement: 82%). 1H-RMN (500 MHz, CDCb): 5 = 7.79 (m, 4H), 7.30 (m, 5H), 4.55(m, 1.5H), 4.45 (m, 0.5H), 3.98 (d, J=13Hz, 0.6H), 3.75 (d, J=12Hz, 0.4H), 3.48 (m, 4H), 2.28 (m, 2H), 2.18 (m, 1H), 2.05 (m, 1H), 1.08 + 1.03 (2xs, 9H) ppm. "C-RMN (125 MHz, CDd3): δ = 168.5, 168.2, 167.9, 155.1, 154.4, 138.2, 134.5, 134.1, 133.7, 132.8, 132.4, 129.0, 128.7, 128.5, 127.4, 123.7, 123.4, 123.3, 79.7, 62.9, 54.5, 53.3, 50.3, 48.8, 40.1, 38.6, 37.8, 28.4, 27.9 ppm. MS: ESI: [M+H]+ m/z trouvée 436.3, calculée 436.2
Rr = 0.32 (éther de pétrole : acétate d'éthyie / 8:2 / v:v)
e) Préparation du composé 6: tert-butyl 2-(aminométhyl)-4- benzylpipérazine-l-carboxyiate
Figure imgf000041_0002
A une solution du composé 5 (1,20g, 2,76mmol, l,0eq.) dans ΙΈίΟΗ (30mL) est ajoutée l'hydrazine monohydrate (620mg, 12mmol, 4,0eq.) et le mélange réactionnel est porté à reflux pendant 18h. A la fin de la réaction, la suspension est refroidie à TA et est filtrée. Le filtrat est évaporé sous pression réduite pour donner un solide qui est re-suspendu dans du DCM (50ml_), filtré une fois de plus et le filtrat est lavé deux fois avec une solution aqueuse saturée de NaHCC (2x50mL) et une fois avec de la saumure (50mL). La phase organique est séchée avec du M 2S04, filtrée et évaporée pour obtenir le composé 6 (610mg) sous forme d'huile. Ce produit est utilisé dans l'étape suivante sans autre purification.
*H-RMN (500 MHz, CDCh): δ = 7.35 (m,5H), 3.97 (br s, 2H), 3.57 (d, 3 = 13.2 Hz, 1H), 3.43 (d, 3 = 13.2 Hz, 1H), 3.07 (dd, 3 = 13.1, 7.0 Hz, 1H), 2.94 (dd, 3 = 13.1, 7.0 Hz, 1H), 2.81 (m, 2H), 2.10 (m, 2H), 1.50 (s, 9H) ppm.
13C-RMN (125 MHz, CDCI3): δ = 155.33, 138.36, 128.76, 128.49, 128.35, 128.13, 127.19, 79.74, 62.82, 53.55, 53.30, 53.13, 48.55, 41.64, 28.48, 21.99 ppm.
MS: ESI: [M+H]+ m/z trouvée 306.3, calculée 306.2
f) Préparation du composé 7: tert-butyl 4-benzy1-2-((2- phénylacé amldo)méthyl)pipéi^ine-l-carboxylate
Figure imgf000042_0001
6 7
A une solution refroidie à 0°C du composé 6 (600mg, l,96mmol, l,0eq.) et de diisopropyléthylamine (DIPEA) (530pL, 3,0mmol, l,5eq.) dans du DCM anhydre (15mL) est ajoutée goutte à goutte une solution de chlorure de phénylacétyle (318pL, 2,35mmoi, l,2eq.) dans du DCM anhydre (5mL). Le mélange réactionnel est agité à 0°C pendant 30min puis à TA pendant lh30. A la fin de la réaction, le mélange est lavé trois fois avec une solution aqueuse saturée de NaHCCb (3x20mL). La phase organique est séchée avec du a2S04, filtrée et évaporée. Le brut réacrJonnel est purifié par colonne de chromatographie sur gel de silice (éiuant : éther de pétrole : acétate d'éthyle / 55:45 / v:v) pour obtenir le composé 7 sous forme solide visqueux (500mg, 1.16mmol, rendement: 46% sur 2 étapes).
lH-RMN (500 MHz, CDa3): J= 7.27 - 7.06 (m, 10H), 6.12 (s, 1H), 4.08 (s, 1H), 3.43 - 3.36 (m, 3H), 3.21 (d, J = 13.0 Hz, 1H), 2.61 (d, J = 11.6 Hz, 1H), 2.57 (d, J= 11.6 Hz, 1H), 1.99 (dd, J = 11.6, 3.8 Hz, 1H), 1.92 (td, J = 11.6, 3.8 Hz, 1H), 1.36 (s, 9H) ppm.
13C-RMN (125 MHz, CDCb): δ = 171.0, 137.8, 135.1, 129.4, 128.9, 128.9, 128.8, 128.4, 127.3, 127.2, 80.1, 62.8, 54.2, 53.0, 49.7, 43.9, 41.0, 40.1, 28.5 ppm.
MS: ESI: [M+H]+ m/z trouvée 424.3, calculée 424.3
Rr = 0,23 (éther de pétrole : acétate d'éthyle / 6:4 / v:v)
g) Préparation du composé 8: N-((4-benzylpipérazin-2-y1)méthyl)- 2-phénylacétamide, sous la forme de sel avec l'acide trffluoacétique
Figure imgf000043_0001
A une solution du composé 7 (500mg, 1.18m mol, l.Oeq.) dans du DCM (4mL) est ajouté de l'acide trifluoroacétique (TFA) (4mL) et le mélange réacbonnel est agité à TA pendant 3h. A la fin de la réaction, te mélange réactionnel est évaporé sous pression réduite, redissout dans du DCM et évaporé une nouvelle fois. Cette opération est répétée deux autres fois. L'huile résultant est dissoute dans du MeOH et le produit est précipité dans de ΙΈί20. La suspension est filtrée et séchée à l'air pour obtenir le composé 8 sous forme d'une poudre blanche (401mg, 0,92mmol, rendement: 78%). 1H-RMN (500 MHz, CD3OD): δ = 7.42 - 7.22 (m, 9H), 3.70 - 3.59 (m, 2H), 3.57 (s, 2H), 3.53 - 3.46 (m, 1H), 3.41 - 3.36 (m, 3H), 3.15 (td, J = 11.3, 3.5 Hz, 1H), 2.98 (d, J= 11.3 Hz, 2H), 2.44 (t, J= 11.3 Hz, 1H), 2.24 (t, J = 11.3 Hz, 1H) ppm.
l3C-RMN (125 MHz, CD3OD): δ = 175.40, 136.40, 130.39, 130.26, 129.70, 129.62, 128.85, 128.13, 63.15, 56.87, 53.89, 50.29, 49.54, 44.80, 43.69, 40.74 ppm.
MS: ESI: [ +H]+ m/z trouvée 324.3, calculée 324.3
II - Préparation de l'intermédiaire 10. le : 4-méthvl-2-oxo-2H-dirornèn-7-vl carbonochloridate
Figure imgf000044_0001
A une solution refroidie à 0°C de triphosgène (420 mg, 1,4 mmol, 0,7 eq) dans du DCM (10 mL) est ajoutée la 4-méthylun elli érone 9 (360 mg, 2,0 mmol) en une portion. A cette suspension est additionnée goutte à goutte une solution aqueuse de IMaOH (2M, 1,1 mL, 2,2 mmol, 1,1 eq) et le mélange réactionnel est agité à 0 °C pendant lh puis à TA pendant 18h. La suspension est ensuite filtrée et le solide résultant est lavé deux fois avec du DCM et séché à l'air pour donner environ la moitié de la masse de composé 10 attendue (202 mg, 0,85 mmol). Le filtrat est alors lavé deux fois avec de l'eau et la phase organique est séchée avec du Na2SO^, filtrée et évaporée pour donner une autre portion de composé 10 (240 mg, 1,0 mmol) sous forme d'une poudre blanche. Le rendement global de cette réaction est de 93 %.
AH-RMN (300 MHz, CDCI3): <5 = 7.69-7.62 (m, 1H), 7.33-7.19 (m, 2H), 6.31 (s, 1H), 2.46 (s, 3H,) ppm.
Rf = 0.47 (cyclohexane : acétate d'éthyle / 6:4 / v:v) ΙΠ - Préparation du composé 12. lîiydrochlorure de 4-roéthvt-2-oxo-2H- c romen-7-yt 2-((2-phenylacetamido) mettiy1)pirjerazine-l arboxylate f EXEMPLE 1)
a) Préparation du composé 11: 4-méthyl-2-oxo-2H-chromen-7-yl-4- benzy1-2-((2-phénylacétamido)mét)iyl)p^
Figure imgf000045_0001
A une solution refroidie à 0°C du composé 10 (230mg, 0,96mmol, l,05eq.) dans du DCM anhydre (lOmL) sous une atmosphère inerte d'argon est additionnée goutte à goutte une solution du composé 8 (400mg, 0,91mmol, l,0eq.) et de DIPEA (480p 2,73mmol, 3,0eq.) dans du DCM anhydre (5mL). Le mélange réactionnel est ensuite agité à 0°C pendant 30min puis à TA pendant 4b. A la fin de la réaction, le mélange réactionnel est lavé trois fois avec une solution aqueuse saturée de NaHCC (3x20mL) et la phase organique est séd ée avec du Na2S04/ filtrée et évaporée. Le brut réactionnel est purifié par colonne de chromatographie sur gel de silice (éluant : gradient de DCM : MeOH / 99:1, 98:2, 97:3 / v:v) pour obtenir le composé 11 sous forme d'une huile incolore (160mg, 0,31mmol, rendement: 33%).
*H-RMN (500 MHz, OX¾): δ = 7.46 (2xd, J - 8.5 Hz, 1H), 7.26 - 7.06 (m, 10H), 7.02 (d, J= 9.7 Hz, 1H), 6.97 (t, 7= 7.4 Hz, 1H), 6.25 (s, 0.5H), 6.13 (br s, 1H), 6.04 (s, 0.5H), 4.33 (s, 0.5H), 4.16 (s, 0.5H), 4.06 - 3.99 (m, 0.5H), 3.91 (t, = 13.2 Hz, 1H), 3.70 - 3.61 (m, 0.5H), 3.50 - 3.34 (m, 4H), 3.28 (t, J = 12.6 Hz, 1H), 3.20 - 3.05 (m, 1H), 2.72 (d, J = 11.9 Hz, 1H), 2.65 (d, J = 11.8 Hz, 1H), 2.31 (d, J = 7.7 Hz, 3H), 2.13 (dd, J= 11.9, 4.0 Hz, 1H), 2.06 (t, J= 11.8 Hz, 1H) ppm.
"C-RMN (125 MHz, CDCb): δ = 171.23, 160.68, 154.08, 153.82, 153.40, 152.76, 152.12, 137.53, 134.76, 129.38, 129.31, 128.90, 128.88, 128.44, 127.40, 127.24, 125.22, 118.11, 117.96, 117.37, 117.24, 114.20, 114.12, 110.29, 110.07, 62.63, 54.00, 53.85, 53.51, 52.74, 51.14, 43.79, 40.97, 40.46, 40.37, 18.72 ppm.
MS: ESI: [M+H]+ m/z trouvée 526.3, calculée 526.3
Rr = 0.38 (DCM : MeOH / 97:3 / v:v)
b) Préparation du 12: hydrochlorure de 4-méthyt-2-oxo-2H- diromen-7-yi 2-((2-phény1acétamido)mé1iiy1)pipérazine-l- carboxylate
Figure imgf000046_0001
Un ballon contenant une solution du composé 11 (120mg, 0,23mmol, l,0eq.) et du 1,1,2-tritfiloiOéthane (25pL, 0,25mmol, l,leq.) dans du MeOH (5mL) est purgée pendant 5min avec du H2. Le Pd/C (10%, 24mg) est ajouté et le ballon est de nouveau purgé avec du H2 pendant 5min. Le mélange réactionnel est ensuite agité à TA pendant 18h sous une atmosphère de H2. A la fin de la réaction, le mélange est filtré sur Celite® et le filtrat est évaporé sous pression réduite jusqu'à un volume approximatif de 2mL Et2Û est alors ajouté pour faire précipiter le produit. La suspension résultante est filtrée et séchée à l'air pour donner le composé 12 sous forme d'une poudre blanche (85mg, 0.18mmol, rendement: 78%).
1H- MN (500 MHz, C¾00): δ = 7.80 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.35 - 7.07 (m, 7H), 6.33 (s, 1H), 4.63 (2xs, 1H), 4.33 (2xs, 1H), 3.78 - 3.66 (m, 1H), 3.53 (s, 3H), 3.45 - 3.32 (m, 3H), 3.21 (s, 1H), 2.49 (s, 3H) ppm.
1 C-RMN (125 MHz, CD3OD): δ = 175.07, 162.63, 155.25, 155.00, 136.46, 130.19, 129.71, 128.09, 127.15, 119.38, 119.02, 114.83, 111.09, 50.92, 50.42, 44.39, 44.04, 43.75, 38.60, 38.32, 37.44, 37.39, 18.72 ppm.
HRMS: C24H26N3O5 [M+H]+ m/z trouvée 436.1858 calculée 436.1867
Figure imgf000047_0001
A une suspension d'adde p énylacétique (1,54g, ll,2mmol, l,0eq.) et d'HOBt (1,66g, 12,3 mmol, 1,1 eq) dans du DCM (30 mL) est additionnée une solution de dkydohexylcarbodiimide (2,56g, 12,3 mmol, 1,1 eq) dans du DCM (10 mL). Le mélange résultant est agité à TA pendant 30min avant que la 2-(amiiwméthyl)pipéridine 13 (l,4mL, 11,2 mmol, 1,0 eq) ne soit ajoutée. Le mélange réactionnel est ensuite agité à TA pendant 2h. La suspension résultante est filtrée et le filtrat est lavé deux fois avec une solution aqueuse saturée de NaHCOa (2x50 mL). La phase organique est ensuite extraite plusieurs fois avec une solution aqueuse à 10% de ΚΗ2Ρ<¼ jusqu'à ce que le pH de la phase aqueuse soit stable autour de pH 3. Du DCM (150 mL) est ensuite ajouté aux phases aqueuses recombinées et une solution aqueuse de NaOH (2M) est additionnée jusqu'à ce que le pH de la phase aqueuse atteigne pH 12. La phase organique est soutirée et la phase aqueuse basique est extraite deux fois avec du DCM (2x100 mL). Les phases organiques sont combinées, séchées avec du Na2SCM, filtrées et évaporées pour donner le composé 14 sous forme de solide blanc (2,07g, 8,9mmol, rendement: 80%). 1H-RMN (200 MHz, CDCI3): δ = 7.83 (m, 5H), 5.80 (s, 1H), 3.57 (s, 2H), 3.25 (m, 1H), 3.04 (m, 2H), 2.59 (m, 2H), 1.75 (m, 1H), 1.56 (m, 2H), 1.32 (m, 4H), 1.03 (m, 1H) ppm.
MS: ESI: [M+H]+ m/z trouvée 233.3, calculée 233.3 V - Préparation du composé 15, le 4-méthyl-2-oxo-2H-chromen-7-vt 2-ff2- phénylacétamido)méthynpipéridir«-l^rboxylatie (comparatif 1)
Figure imgf000048_0001
A une suspension refroidie à 0°C du composé 10 (39mg, 0,16mmol, l,05eq.) dans du DCM anhydre (5mL) sous une atmosphère inerte d'argon, est additionné le composé 14 (25mg, 0,15mmol, l,0eq.) suivi par la DIPEA (55μί, 0,30mmol, 2,0eq.). Le mélange réactionnet est agité à 0°C pendant 30min et à TA pendant 4h. A la fin de la réaction, le mélange réactionnei est lavé trois fois avec une solution aqueuse saturée de NaHCC (3x20mL) et la phase organique est séchée avec du Na2S04, filtrée et évaporée. Le brut réactionnei est purifié par colonne de chromatographie sur gel de silice (éluant : gradient de DCM : MeOH / 99:1, 98:2, 97:3 / v:v) pour obtenir le composé 15 sous forme d'une huile incolore (35mg, 0.31 mmol, rendement:
Figure imgf000048_0002
AH- MN (500 MHz, CDCI3): δ = 7.49 (s, 1H), 7.30 - 7.04 (m, 5H), 7.04 - 6.88 (m, 2H), 6.16 (s, 1H), 5.90 (s, 1H), 4.48 - 4.23 (m, 1H), 4.03 (d, 7 = 13.5 Hz, 1H), 3.82 (s, 1H), 3.64 - 3.27 (m, 3H), 3.12 (s, 1H), 2.35 (s, 3H), 1.77 - 1.36 (m, 6H) ppm.
"C- MN (125 MHz, CDCI3): δ = 171.42, 160.73, 154.14, 153.99, 153.83, 152.12, 134.62, 129.75, 129.36, 129.00, 128.38, 127.35, 126.76, 125.19, 118.10, 117.32, 114.20, 110.34, 53.51, 51.09, 50.93, 46.72, 43.69, 41.28, 40.83, 40.64, 39.53, 38.94, 31.69, 26.53, 25.28, 24.39, 23.04, 19.09, 18.76 ppm.
HRMS: CzsHzeNzNaOs [M+Na]+ m/z trouvée 457.1734 calculée 457.1734 Rf = 0.27 (DCM : MeOH / 98:2 / v:v) VI - Préparation de [Intermédiaire 19. le(4-ber z^DiDérazin-2-y1^mét vl octanoate sous la forme de sel avec l'acide trifluoroacétiaue
a) Préparation du composé 17 : chlorure d'octanoyle
Figure imgf000049_0001
A de l'acide octanoïque 16 (10,0g, 69mmol, l,0eq.) est additionné goutte à goutte du chlorure de thionyle (30mL, 410mmol, 6,0eq.). Ce mélange réactionnel est ensuite porté à reflux pendant 2h, puis refroidi à TA et les volatiles sont évaporés sous pression réduite. L'huile résultante est reprise dans du DCM et la solution est à nouveau évaporée. Cette procédure est répétée deux fois supplémentaires pour obtenir le composé 17 sous forme d'un liquide jaune très odorant (11,0g, 66,7mmol, rendement: 97%).
1H- NM (300 MHz, CDCI3): δ= 2.87 (t, 7 = 7.3 Hz, 2H), 1.70 (q, = 7.3 Hz, 2H), 1.42 - 1.22 (m, 8H), 0.88 (t, 7= 6.6 Hz, 3H) ppm.
"C-RN (75 MHz, CDCI3) δ = 173.89, 47.23, 31.64, 28.85, 28.51, 25.20, 22.65, 14.11 ppm.
b) Préparation du composé 18 : tert-butyl 4-benzyl-2- ((octanoyk>xy)méthyl)pipérazine-l-carboxy1ate
Figure imgf000049_0002
A une solution refroidie à 0°C du composé 4 (800mg, 3,72mmol, l,0eq.) et de triéthylamine (780μί, 5,6mmol, l,5eq.) dans du DCM anhydre (lOmL) est additionnée goutte à goutte une solution du composé 17 (667mg; 4,lmmol, l,leq.) dans du DCM anhydre (5mL). Le mélange réactionnel est agité à 0°C pendant 30min puis à TA pendant 2h30. Il est ensuite dilué avec du DCM (35mL) et lavé une fois avec une solution aqueuse saturée de NaHCC {50mL), une fois avec de l'eau (50mL), une fois avec une solution aqueuse d*HCI (1M - 50ml_) et une fois avec de la saumure (50mL). La phase organique est séchée avec du a2S04, filtrée et évaporée. Le brut réactionnel est purifié par colonne de chromatographie sur gel de silice (DCM pur, puis DCM : acétate d'éthyle / 90:10) pour obtenir 18 sous forme d'une huile jaune (710mg, 1.64mmol, rendement : 44%).
lH-RMN (500 MHz, CD3OD): δ = 7.34 - 7.16 (m, 5H), 4.39 - 4.18 (m, 3H), 3.88 (s, 1H), 3.53 (d, 7 = 13.1 Hz, 1H), 3.37 (d, J = 13.1 Hz, 1H), 3.09 (t, J = 11.3 Hz, 1H), 2.77 (d, 7 = 11.5 Hz, 2H), 2.20 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 2.14 - 1.95 (m, 2H), 1.60 - 1.49 (m, 2H), 1.44 (s, 9H), 1.25 (S, 8H), 0.87 (t J = 6.4 Hz, 3H) ppm.
l3C- MN (125 MHz, CD3OD): δ = 173.72, 154.91, 138.16, 128.93, 128.42, 127.29, 79.97, 62.83, 61.56, 53.10, 52.82, 34.36, 31.80, 29.25, 29.04, 28.52, 24.95, 22.73, 14.20 ppm.
MS: Kl: [M+H]+ m z trouvée 433.3, calculée 433.3
c) Préparation du composé 19: (4-benzy1pipérazin-2-yl)méthy1 octanoate sous la forme de sel avec l'acide trifluoroacétique
Figure imgf000050_0001
La procédure utilisée est la même que celle décrite pour la synthèse du composé 8, mais en utilisant le composé 18 (700mg, l,62mmol, ,.0eq.) dans du DCM (5mL) et du TFA (5mL) pour donner le composé 19 sous forme d'une poudre blanche (775mg, rendement: quantitatif).
*H-RMN (500 MHz, CD3OD): δ = 7.41 - 7.27 (m, 5H), 4.30 (dd, J= 12.5, 3.9 Hz, 1H), 4.22 (dd, J = 12.5, 6.4 Hz, 1H), 3.70 - 3.63 (m, 1H), 3.46 (d, J = 13.2 Hz, 1H), 3.28 - 3.12 (m, 3H), 2.71 (td, J= 12.2, 12.2, 2.6 Hz, 1H), 2.61 (t, J = 11.8 Hz, 1H), 2.38 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 1.66 - 1.52 (m, 2H), 1.30 (s, 8H), 0.89 (t, J= 6.7 Hz, 3H) ppm. l3C-RMN (125 MHz, CD3OD): δ = 174.57, 162.06, 161.77, 135.40, 130.95, 129.86, 129.62, 118.70, 116.40, 62.75, 62.55, 54.98, 52.20, 49.86, 43.97, 34.47, 32.84, 30.13, 30.07, 25.72, 23.65, 14.38 ppm.
MS: ESI: [M+H]+ m/z trouvée 333.3, calculée 333.2
VII- Préparation du composé 21. I' hvdrochlorure de 4-méthyl-2-oxo-2H- chromen-7-yl 2-f((x±anovloxv^i énivl^DiDérazine-l- arboxvlate (EXEMPLE 2
a) Préparation du composé 20: 4-méthyl-2-oxo-2H-chromen-7-yl 4- benzy1-2-((octanoyloxy)méfthyl)pip^
Figure imgf000051_0001
La procédure utilisée est la même que celle décrite pour la synthèse du composé 11, avec le composé 10 (400mg, l,67mmol, l,0eq.), le composé 19 (750mg, l,67mmol, l,0eq.) et la DIPEA (880pL, 5,02mmol, 3,0eq.) dans du DCM anhydre (20mL). Après chromatographie sur gel de silice (éther de pétrole : acétate d'éthyle / 7:3 / v:v), on obtient le composé 20 sous forme d'un solide incolore (190mg, 0,36mmoi, rendement: 22%).
lH-RMN (500 MHz, CD3OD): δ = 7.52 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 7.24 - 7.16 (m, 1H), 7.11 - 7.00 (m, 2H), 6.18 (S, 1H), 4.57 - 4.38 (m, 2H), 4.27 (s, 1H),
4.09 - 3.95 (m, 1H), 3.54 (d, J = 13.1 Hz, 1H), 3.39 (d, J = 13.0 Hz, 1H), 3.23 (t, J = 11.9 Hz, 0.5H), 2.82 (d, J = 11.3 Hz, 2H), 2.36 (s, 3H), 2.21 -
2.10 (m, 3H), 1.55 - 1.43 (m, 2H), 1.26 - 1.12 (m, 8H), 0.87 - 0.75 (m, 3H) ppm.
13C-RMN (125 MHz, CD3OD): δ 173.46, 160.56, 154.10, 153.82, 152.88, 152.00, 137.65, 128.76, 128.35, 127.29, 125.17, 118.11, 117.90, 117.29, 114.14, 110.25, 110.05, 62.57, 61.57, 61.28, 52.75, 52.62, 51.16, 50.57, 41.02, 40.21, 34.13, 31.58, 29.03, 28.86, 24.76, 22.54, 18.65, 14.03 ppm. MS: ESI: [M+H]+ m/z trouvée 535.3, calculée 535.3
Rf = 0.26 (éther de pétrole : acétate d'éthyle / 7:3 / v:v)
b) Préparation du composé 21: hydrochlorure de 4-méthy1-2-oxo-
2H-chromen-7-y12-((octanoy1oxy)méthyl)pipérazine-l-cartx>xylate
Figure imgf000052_0001
La procédure utilisée est la même que celle décrite pour la synthèse du composé 12, avec le composé 20 (180mg, 0,33mmol, l,0eq.), du 1,1,2- trichloroéthane (37uL, 0,39mmol, l,leq.), du Pd/C (38mg, 20%w) dans du MeOH (5mL) pour obtenir le composé 21 sous forme d'une poudre blanche (95mg, 0,20mmol, rendement: 61%).
1H-RMN (500 MHz, CD3OD): δ = 7.82 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 7.32 - 7.13 (m, 2H), 6.34 (s, 1H), 4.67 (s, 1H), 4.43 - 4.22 (m, 2H), 3.53 (d, J = 13.4 Hz, 2H), 3.45 (d, J = 11.7 Hz, 3H), 3.26 (s, 1H), 2.49 (s, 3H), 2.35 (t J = 7.5 Hz, 2H), 1.57 (s, 2H), 1.26 (dd, J = 28.7, 21.9 Hz, 9H), 0.84 (t, J = 6.8 Hz, 3H) ppm.
^C-RMN (125 MHz, CD3OD): δ = 174.84, 162.51, 155.27, 154.96, 154.90, 154.05, 127.20, 119.25, 119.06, 114.87, 111.01, 61.14, 43.94, 43.50, 34.83, 32.80, 30.17, 30.07, 25.89, 23.63, 18.67, 14.36 ppm.
HRMS: C24H33N2O6 [M+H]+ m/z trouvée 445.2318 calculée 445.2333
πΐ - Préparation du composé 22. l'adde 4-(4-(((4-methyl-2-oxo-2H- chromerh7-yltoxylCTrbonyl) ^ioctanoyloxy¾m
sulfonioue (EXEMPLE 3¾
Figure imgf000053_0001
A une suspension du composé 21 (25mg, 0,052mmol, l#0eq.) dans l'acétate d'éthyte (lOmL) est ajoutée une solution aqueuse de aHCO (1M, lOmL). La phase organique est soutirée et la phase aqueuse est lavée trois fois avec de l'acétate d'é hyle (3xl0mL). Les phases organiques combinées sont séchées avec du Na2S04, filtrées et évaporées pour donner une huile incolore. Cette huile est dissoute dans du THF anhydre (2,5mL), et de la butane sultone est ajoutée (2 gouttes) et le mélange réacttonnel est chauffé à reflux pendant 48h. A la fin de la réaction, il est dilué avec du THF (2,5mL) et de ΙΈί (5mL) et de l'eau est ajoutée (lOmL). La phase aqueuse est séparée et lyophilisée pour donner le composé 22 sous forme d'un solide blanc très hygroscopique (13mg, 0,022mmol, rendement: 43%).
*H-RMN (500 MHz, CD3OD): δ = 7.72 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 7.21 - 7.03 (m, 2H), 6.23 (d, J = 1.1 Hz, 1H), 4.59 (s, 1H), 4.38 - 4.12 (m, 2H), 3.62 - 3.24 (m, 4H), 3.12 - 2.83 (m, 3H), 2.80 (t, J = 6.9 Hz, 2H), 2.42 - 2.35 (m, 3H), 2.29 - 2.17 (m, 2H), 1.91 - 1.73 (m, 4H), 1.47 (s, 2H), 1.25 - 0.98 (m, 10H), 0.74 (t, J- 6.9 Hz, 3H) ppm.
UC-RMN (125 MHz, CD3OD): δ = 162.54, 155.30, 155.02, 154.93, 127.23, 119.30, 118.88, 114.88, 34.89, 32.83, 30.21, 30.10, 25.92, 23.67, 23.24, 18.71, 14.40 ppm.
H MS: CaH-w^ïtaOeS [M+Na]+ m/z trouvée 603.2339 calculée 603.2347 IX - Préparation du composé 27. le 4-méthyl-2-oxo-2H-c romen-7-yi 2- ffoctano^oxv méthvnDioéridine-l-carboxvlate (comparatif 2)
a) Préparation du composé 24: N-Boc-2-(hydroxyrnéthyl)pipéridine
Figure imgf000054_0001
A une solution refroidie à 0°C du composé 23 (5g, 43mmol, l,0eq.) dans du DCM (20mL) est ajoutée goutte à goutte une solution de Boc20 (6,6g, 47mmol, l,leq.) dans du DCM (lOmL). Le mélange réacrJonnel est agité à 0°C pendant 30min, puis à TA pendant 3h. Il est ensuite dilué avec du DCM (30mL) et lavé une fois avec une solution aqueuse saturée de NaHCQ» (3x60mL). La phase organique est séchée avec du ^SO,, filtrée et évaporée pour obtenir le composé 24 (6,02g, 28mmo1, rendement: 65%) sous forme d'un solide jaune.
H-RMN (300 MHz, CDCb) δ = 4.36 - 4.22 (m, 1H), 3.94 (d, J = 12.3 Hz, 1H), 3.88 - 3.75 (m, 1H), 3.67 - 3.53 (m, 1H), 2.87 (t, J = 12.3 Hz, 1H), 2.01 (br s, 1H), L73 - 1.52 (m, 4H), 1.52 - 1.38 (m, 11H) ppm.
13C-RMN (75 MHz, CTXfe) δ = 156.43, 79.92, 61.86, 52.68, 40.14, 28.57, 25.39, 25.35, 19.76 ppm.
b) Préparation du composé 25: N-Boc-2- ((octanoyloxy)méthy1)pipéridine
Figure imgf000054_0002
A une solution refroidie à 0°C du composé 17 (6,0g, 27,8mmol, l,0eq.) et de triéthylamine (6mL, 42mmol, l,5eq.) dans du DCM sec (40mL) est ajoutée goutte à goutte une solution du composé 24 (5,0g, 30,6mmol, l,leq.) dans du DCM sec (20mL). Le mélange réacb'onnel est agité à 0°C pendant 30min et à TA pendant 3h. Il est ensuite dilué avec du DCM (40mL) et lavé une fois avec de IUCI 1M (lOOmL), une fois avec de l'eau (50mL), une fois avec aOH 1M (lOOmL), et une fois avec de la saumure (lOOmL). La phase organique est séchée avec du Na2SO-i, filtrée et évaporée à sec pour donner le composé 25 (9,82g, rendement quantitatif) sous la forme d'un liquide jaune utilisé sans autre purification.
*H-RMN (300 MHz, CDCI3) δ = 4.40 (s, 0.6H), 4.26 - 4.11 (mf 0.9H), 4.10 - 3.99 (m, 1.3H), 3.99 - 3.80 (m, 0.8H), 3.76 - 3.64 (m, 0.2H), 3.59 - 3.47 (m, 0.2H), 2.86 - 2.65 (m, 0.8H), 2.48 (s, 0.2H), 2.37 (t, J = 7.5 Hz, 0.2H), 2.21 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 1.68 - 1.43 (m, 6H), 1.43 - 1.30 (m, 9H), 1.30 - 1.08 (m, 10H), 0.80 (t, 7= 5.9 Hz, 3H) ppm.
13C-RMN (75 MHz, CDQ3) δ = 173.77, 155.15, 79.54, 61.71, 34.38, 31.75, 29.21, 28.99, 28.52, 25.50, 25.35, 24.98, 22.67, 19.42, 14.13 ppm.
c) Préparation du composé 26: pipéridine-2-ylmét yl octanoate sous la forme de sel avec l'acide trifluoroacétîque
Figure imgf000055_0001
La procédure utilisée est la même que celle décrite pour la synthèse du composé 8, mais en utilisant le composé 25 (700mg, 1,62m mol, l,0eq.) dans du DCM (3mL) et du TFA (3mL) pour donner le composé 26 sous forme d'une poudre blanche (910mg, 2,56mmol, rendement : 88%).
1H-RMN (300 MHz, CDCI3) δ= 8.93 (s, 1H), 8.25 (s, 1H), 4.54 (d, 7= 5.4 Hz, 0.1H), 4.32 (d, J = 3.4 Hz, 0.3H), 4.28 (d, J= 3.4 Hz, 0.6H), 4.23 - 4.07 (m, 1H), 3.50 (d, J = 12.7 Hz, 1H), 3.43 - 3.26 (m, 1H), 3.03 - 2.83 (m, 1H), 2.30 (t, J= 7.6 Hz, 1H), 2.06 - 1.46 (m, 8H), 1.39 - 1.17 (m, 9H), 0.87 (t, J = 5.7 Hz, 3H) ppm.
l3C-RMN (75 MHz, CDCI3) δ = 173.81, 161.67, 117.60, 63.67, 56.40, 45.11,
Figure imgf000055_0002
33.69, 31.71, 29.06, 28.95, 25.16, 24.67, 22.66, 22.06, 21.97, 14.10 ppm.
MS: ESI: [M+H]+ m/z trouvée 241.2, calculée 241.2 d) Préparation du composé 27: 4-mét yl-2-oxo-2H-c ronien-7-yl 2- ((octai )yloxy)méthy1)pipéridine-l-carboxylate
TFA
Figure imgf000056_0001
La procédure utilisée est la même que celle décrite pour la synthèse du composé 11, avec le composé 10 (190mg, 0,79mmol, l,0eq.) ie composé 26 (285mg 0,79mmol, l,0eq.) et la DIPEA (700uL, 3,95mmol, 4,0eq.) dans du DCM anhydre (lOmL). Après chrornatographle sur gel de silice (éther de pétrole : acétate d'éthyle / 75:25 / v:v), on obtient le composé 27 sous forme d'une huile Incolore (150mg, 0,34mol, rendement 43%).
1H-RMN (500 MHz, COC ) δ= 7.57 (d, J= 8.6 Hz, 1H), 7.16 - 7.05 (m, 2H), 6.24 (s, 1H), 4.68 (s, 1H), 4.41 (t, 7= 9.9 Hz, 1H), 4.22 - 4.10 (m, 2H), 3.13 (br s, 0.5H), 2.98 (br s, 0.5H), 2.42 (s, 3H), 2.28 (t, J= 6.8 Hz, 2H), 1.85 - 1.66 (m, 4H), 1.65 - 1.50 (m, 4H), 1.24 (br s, 8H), 0.84 (t, J = 6.6 Hz, 3H) ppm.
13C-RMN (125 MHz, CDCI3) δ = 173.77, 160.82, 154.33, 154.20, 153.29, 152.12, 125.22, 118.25, 117.39, 114.31, 110.39, 61.67, 50.35, 50.00, 40.89, 40.09, 34.37, 31.75, 29.22, 29.03, 25.81, 25.12, 24.99, 22.70, 19.32, 18.85, 14.17 ppm.
HRMS: C^NNaC* [M+Na]+ m/z trouvée: 466.2179 calculée 466.200 Rf = 0.34 (éther de pétrole : acétate d'éthyle / 75:25 / v:v)
X - Préparation du composé 31. le 4-méthyl-2-oxo-2H-chromen-7-yl 4-f3-fl- (2^2-f2-mé hox fétrto)^
Dhenvlacétamido1méthvltoiDérazir>e»l-arboxvlate ( EXEMPLE 4)
a) Préparation du composé 29, l-azido-2-(2-(2- méthox éthoxy)éthoxy)éthane
Figure imgf000056_0002
A une solution du composé 28 (2,0g, 6,28mmol, l,0eq.) dans un mélange DMF (15mL) et eau (8mL) est additionné le NaN3 (2,04g, 31,40mmol, 5,0eq.) en une portion. Ce mélange réactionnel est ensuite chauffé à 70°C pendant 18h. Les volatiles sont ensuite évaporés et le solide résultant est repris dans l'acétate d'éthyle (50mL). La suspension est filtrée et le filtrat est lavé deux fois avec une solution aqueuse saturée de NaHC03 (2x50mL), puis une fois avec de la saumure (50mL). La phase organique est séchée avec du Na2S04, filtrée et évaporée pour donner le composé 29 sous forme d'une huile incolore (820mg, 4,33mmol, rendement : 69%).
1H-R N (300 MHz, CDd3) δ = 3.68 - 3.57 (m, 8H), 3.55 - 3.48 (m, 2H), 3.38 - 3.32 (m, 5H) ppm.
13C-RMN (75 MHz, CDCfe) δ « 71.94, 70.71, 70.68, 70.63, 70.05, 59.04, 50.69 ppm.
f = 0.56 (éther de pétrole : acétate d'éthyle/ 1:1 / v:v)
b) Préparation du composé 30, 4-méthyl-2-oxo-2H-chromeii-7-yl 4~ (pent-4-ynoyl)-2-((2-phény1acétamido)méth^
carboxytate
Figure imgf000057_0001
A une suspension du composé 12 (50mg, 0,106mmol, l,0eq.), d'acide pentynotque (12mg, 0,117mmol, l,leq.) et de HATU (46mg, 0,117m mol, l,leq.) dans du DCM anhydre (5mL) sous atmosphère inerte d'argon, est additionnée la DIPEA (42pL, 0,240mmol, 2,2eq.) et le mélange réactionnel est agité à TA pendant 2h30. A la fin de la réaction, le mélange réactionnel est dilué avec du DCM (20mL) et lavé deux fois avec une solution aqueuse saturée de NaHCÛ3 (2x20mL) et une fois avec de la saumure (20mL). La phase organique est séchée avec du a2S04, filtrée et évaporée. Le brut réactionnel est purifié par colonne de chromatographie sur alumine neutre (Ether de pétrole : Acétate d'éthyte / 1:9 / v:v) pour obtenir le composé 30 sous forme d'une huile incolore (60mg, rendement: quantitatif).
lH-RMN (500 MHz, CDCI3) δ = 7.59 (dd, J = 14.8, 8.6 Hz, 1H), 7.36 - 7.27 (m, 2H), 7.27 - 7.21 (m, 2H), 7.21 - 7.02 (m, 2H), 6.73 - 6.45 (m, 1H), 6.32 - 6.04 (m, 1H), 4.67 - 4.25 (m, 2H), 4.17 - 3.69 (m, 3H), 3.66 - 3.47 (m, 3H), 3.45 - 3.18 (m, 2H), 3.18 - 2.89 (m, 2H), 2.81 (s, 3H), 2.74 - 2.63 (m, 1H), 2.60 - 2.47 (m, 3H), 2.44 (s, 3H), 2.20 (S, 1H), 2.13 - 1.96 (m, 1H) ppm.
13C- MN (125 MHz, CDCI3) δ = 171.52, 171.36, 170.69, 170.37, 170.27, 165.73, 160.62, 154.03, 153.52, 153.23, 152.78, 152.16, 134.78, 134.65, 129.23, 128.97, 128.88, 127.33, 127.21, 125.35, 117.97, 117.58, 117.45, 114.33, 114.22, 110.28, 110.16, 83.32, 83.05, 69.34, 69.03, 53.52, 51.33, 45.59, 45.20, 45.03, 43.62, 42.37, 42.19, 41.21, 40.48, 40.19, 39.98, 38.62, 38.05, 37.50, 31.77, 18.74, 14.66, 14.36 ppm.
MS: ESI: [M+H]+ m/z trouvée 515.3, calculée 515.2
, = 0.20 (éther de pétrole : acétate d'éthyle/ 1:9 / v:v)
c) Préparation du composé 31, 4-méthyl-2 xo-2H-chromen-7-y1 4- (3-(l-(2-(2 2-méthoxyé^oxy)é^oxy)étliy1)-lH-lf2,3-triazol-4- y1)propanoyl)-2-((2-pheny1acétamido)méthyl)pipérazjne-l- carboxylate
Figure imgf000058_0001
A une solution du composé 30 (30mg, 0,058mmol, l,0eq.) et du composé 28 (24mg, 0,128m mol, 2,2eq.) dans un mélange DCM (lmL) et eau (lmL) sont additionnés le C11SO4.5H2O (9mg, 0,04mmol, 0,6eq.) et l'ascorbate de sodium (16mg, 0,08mmol, l,2eq.) en une portion. Ce mélange réactionne] est ensuite agité à TA pendant 2h. A la fin de la réaction, le mélange réactionnel est dilué avec du DCM (lOmL) et de l'eau (lOmL). La phase organique est soutirée et la phase aqueuse est lavée trois fois avec du DCM (3xl0mL). Les phases organiques combinées sont séchées avec du Na2SQ filtrées et évaporées. Le brut réacrJonnel est purifié par colonne de chromatographie sur gel de silice (éluant : gradient de DCM : MeOH / 100 : 0, 99:1, 98:2, 97:3, % : 4, 95 : 5 / v:v) pour donner le composé 31 sous forme d'une poudre blanche (19mg, 0,027mmol, rendement : 46%).
^-R (500 MHz, CDCI3) δ = 7.96 (s, 0.25H), 7.47 (m 1.5H), 7.32 - 6.94 (m, 7H), 6.61 (s, 0.2H), 6.21 (m, , 1H), 5.86 (s, 0.2H), 4.73 (s, 0.25H), 4.55 - 4.17 (m, 3H), 4.01 - 3.69 (m, 4.5H), 3.65 - 3.61 (m, 1.5H), 3.59 - 3.50 (m, 6.5H), 3.50 - 3.38 (m, 3H), 3.31 (d, J = 5.4 Hz, 2.5H), 3.26 - 2.55 (m, 6.5H), 2.36 (s, 3H), 1.74 (s, 1H) ppm.
"C-RMN (125 MHz, ΟΧ½) δ = 172.66, 171.54, 170.71, 160.77, 154.23, 153.64, 152.93, 152.10, 135.49, 134.96, 134.70, 129.42, 129.03, 128.85, 127.35, 127.14, 125.36, 122.%, 118.17, 117.60, 114.42, 110.45, 72.04, 70.64, 69.56, 67.21, 59.18, 51.27, 50.71, 50.21, 45.48, 45.21, 44.77, 44.02, 43.86, 42.43, 42.22, 41.15, 40.55, 40.24, 40.00, 39.36, 38.12, 37.72, 37.42, 32.04, 31.66, 29.81, 28.81, 21.34, 20.57, 18.86 ppm.
MS: ESI: [M+H]+ m/z trouvée 704.5, calculée 704.3
Rf = 0.30 (DCM : MeOH/ 95:5 / v:v)
XI - Préparation de Intermédiaire 34. N-(f4-fpent-4-ynoyl)plpérazin-2- vl mémylV2-phénylacétamide sous forme de sel avec l'acide trtfluoroacétique a) Préparation du composé 32, tert-butyl 2-((2- phény1acétamido)méthy )pipérazine- 1-carfooxylate sel dTiydrochloriire
Figure imgf000059_0001
La procédure utilisée est la même que celle décrite pour la synthèse du composé 12, avec le composé 7 (605mg, l,53mmol, l,0eq.), du 1,1,2- trichloroé hane (161μΙ_, l,70mmol, l,leq.), du Pd/C (121mg, 20%massique) dans du MeOH (30mL) pour obtenir le composé 32 sous forme d'une poudre blanche (430mg, l,16mmol, rendement: 76%).
1H-RMN (300 MHz, CDQ3) δ = 7.43 - 7.15 (m, 5H), 6.25 (s, 1H), 4.47 - 4.15 (m, 2H)r 4.00 - 3.57 (m, 2.7H), 3.52 (d, J - 2.9 Hz, 2H), 3.33 (m, 0.7H), 3.28 - 2.85 (m, 2.8H), 2.68 - 2.29 (m, 4.5H), 2.00 (d, J= 8.4 Hz, 1H), 1.47 (s, 9H) ppm.
13C-RMN (75 MHz, CDC ) δ = 171.53, 171.33, 170.51, 170.26, 165.70, 154.91, 134.84, 129.22, 128.92, 128.78, 127.26, 127.09, 83.36, 83.06, 80.81, 69.19, 68.90, 53.49, 49.97, 45.37, 43.60, 42.10, 41.32, 31.77, 31.69, 28.29, 14.55, 14.29 ppm.
MS: ESI: [M+H]+ m/z trouvée 333.2, calculée 333.2
b) Préparation du composé 33, tert-butyl 4-(pent-4-ynoy1)-2-((2- phénylacétamldo)méthyl)pipérazine-l- arboxylate
Figure imgf000060_0001
A une suspension refroidie à 0°C du composé 32 (410mg, lfllmmol, l,0eq.), d'acide pentynoîque (122mg, l,22mmol, l,leq.) et de HATU (473mg, l,22mmol, l,leq.) dans du DCM anhydre (30mL) sous atmosphère inerte d'argon, est additionnée la DIPEA (395μΙ_, 2 ;25mmol, 2 ;2eq.) et le mélange réacbonnel est agité à 0°C pendant 15min, puis à TA pendant 2hl5. A la fin de la réaction, le mélange réactionnel est dilué avec du DCM (20mL) et lavé deux fois avec une solution aqueuse saturée de NaHG¼ (2x50mL) et une fois avec de la saumure (50mL). La phase organique est séchée avec du a2S0 , filtrée et évaporée. Le brut réactionnel est purifié par colonne de chromatographie sur alumine neutre (éther de pétrole : acétate d'éthyie / 15:85 / v:v) pour obtenir le composé 33 sous forme d'un solide légèrement jaune (552mg, rendement: quantitatif)* *H-RMN (300 MHz, CDCI3) δ = 7 A3 - 7.15 (m, 5Η), 6.25 (s, 1H), 4.47 - 4.15 (m, 2H), 4.00 - 3.57 (m, 2.7H), 3.52 (d, J = 2.9 Hz, 2H), 3.33 (m, 0.7H), 3.28 - 2.85 (m, 2.8H), 2.68 - 2.29 (m, 4.5H), 2.00 (d, .7 = 8.4 Hz, 1H), 1.47 (s, 9H) ppm.
13C-RMN (75 MHz, CDCI3) δ = 171.53, 171.33, 170.51, 170.26, 165.70, 154.91, 134.84, 129.22, 128.92, 128.78, 127.26, 127.09, 83.36, 83.06, 80.81, 69.19, 68.90, 53.49, 49.97, 45.37, 43.60, 42.10, 41.32, 31.77, 31.69, 28.29, 14.55, 14.29 ppm.
MS: ESI: [M+H]+ m/z trouvée 413.3, calculée 413.2
Rf = 0.29 (éther de pétrole : acétate d'éthyle/ 2:8 / v:v)
c) Préparation du composé 34, N-((4-(pent-4-ynoyl)pipérazin-2- yl)méthyl)-2-phény1acétamide sous forme de sel avec l'acide trffluoroacé ique
Figure imgf000061_0001
La procédure utilisée est la même que celle décrite pour la synthèse du composé 8, mais en utilisant le composé 33 (550mg, l,33mmol, l,0eq.) dans du DCM (5mL) et du TFA (5mL) pour donner le composé 34 sous forme d'une poudre blanche (500mg, l,17mmol rendement: 88%).
1H-RMN (500 MHz, MeOD) δ = 7.33 - 7.22 (m, 4H), 7.22 - 7.15 (m, 1H), 4.45 (t, J= 13.4 Hz, 1H), 3.97 (t, J = 13.4 Hz, 1H), 3.45 - 3.11 (m, 6.5H), 3.06 (t, J= 10.6 Hz, 0.5H), 3.01 - 2.81 (m, 2H), 2.67 - 2.46 (m, 2H), 2.42 (m, 2H), 2.24 (d, 7= 1.6 Hz, 1H), 1.34 - 1.26 (m, 1H) ppm.
13C-RMN (125 MHz, MeOD) δ = 175.33, 172.22, 172.09, 163.50, 163.23, 162.96, 162.68, 136.48, 136.39, 130.30, 130.27, 130.17, 129.70, 129.65, 128.09, 128.03, 83.85, 70.32, 70.26, 56.37, 56.22, 55.75, 54.81, 46.53, 44.58, 44.48, 43.72, 43.66, 43.55, 43.26, 42.64, 40.34, 40.19, 40.08, 39.63, 39.42, 32.73, 32.59, 18.65, 15.11, 13.09 ppm. MS: ESI: [M+H]+ m/z trouvée 313.2, calculée 313.2
XII - Préparation du composé 36. 4-nitrophényl 4-(3-(l-(2-(2-(2- métiToxyétrroxytéthoxy)é^^
Dhénylacétamido méthv piDérazine-l-cartx>xylate f EXEMPLE 51
a) Préparation du composé 35, 4-nitrophényl 4-(pent-4-ynoyl)-2-
((2-phény1acétamido)mé^yl)pipérazine-l-carboxylate
Figure imgf000062_0001
A une solution refroidie à 0°C et sous atmosphère inerte d'argon du composé 34 (50mg, 0,117mmol, l,0eq.) et de DIPEA (55pL, 0,30mmol, 2,5eq.) dans du DCM anhydre (2mL) est ajouté le para- nitrophénolcriloro omiate (28mg, 0,130mmol, l,leq.) en une fois. Le mélange réactionnel est agité à 0°C pendant 30min puis à TA pendant 2h. A la fin de la réaction, le mélange réactionnel est dilué avec du DCM (20mL) et lavé deux fois avec une solution aqueuse saturée de NaHCÛ3 (2x25mL) et une fois avec de la saumure (25mL). La phase organique est séchée avec du Na^SO-i, filtrée et évaporée. Le brut réactionnel est purifié par colonne de chromatographie sur gel de silice (éther de pétrole : acétate d'éthyte / 2:8 / v:v) pour obtenir le composé 35 sous forme d'un solide incolore (60mg, rendement: quantitatif).
'H-RMN (500 MHz, CDa3) δ= 8.15 (t, 7 = 9.8 Hz, 2H), 7.33 - 7.01 (m, 7H)# 6.23 (s, 0.4H), 6.08 - 5.82 (m, 0.6H), 4.60 - 4.36 (m, 1.5H), 4.32 - 4.17 (m, 0.5H), 4.05 - 3.88 (m, 1.4H), 3.84 (m, 0.8H), 3.77 - 3.62 (m, 0.8H), 3.62 - 3.16 (m, 4.5H), 3.12 (t, J = 12.0 Hz, 0.5H), 2.% - 2.65 (m, 1.8H), 2.65 - 2.26 (m, 4.2H), 2.08 - 1.86 (m, 1.5H), 1.29 - 1.13 (m, 0.5H) ppm.
13C-RMN (125 MHz, CDCI3) δ = 171.59, 171.35, 170.80, 170.40, 170.28, 155.85, 152.84, 152.40, 145.05, 144.94, 134.69, 134.48, 129.35, 129.25, 129.08, 128.96, 127.50, 127.33, 125.17, 122.27, 122.13, 121.85, 83.28, 83.03, 69.37, 69.10, 53.54, 51.50, 51.25, 45.58, 45.23, 45.03, 43.68, 42.43, 42.09, 41.20, 40.59, 40.18, 38.70, 38.10, 37.48, 31.86, 31.75, 14.71, 14.40 ppm.
MS: ESI: [ +H]+ m/z trouvée 478.3, calculée 478.3
Rf = 0.32 (éther de pétrole : acétate d'éthyle/ 2:8 / v:v)
b) Préparation du composé 36, 4-nrtrophényi A-iS-il-il-Çl-il' méthoxyétrroxy)éthoxy)ét y1)-lH-l,2,3^
((2-phénylacétamido)mé hyl)pipérazine-l-carboxylate
Figure imgf000063_0001
La procédure utilisée est la même que celle décrite pour la synthèse du composé 31, avec le composé 35 (30mg, 0,063mmol, l,0eq.), le composé 28 (26mg, 0,138mmol, 2,2eq.), CuS04.5H20 (9mg, 0,04mmol, 0,6eq.) et l'ascorbate de sodium (16mg, 0,08mmol, l,2eq.) dans un mélange DCM (lmL) et eau (lmL). Après purification, on obtient le composé 36 sous forme d'une huile légèrement jaune (39mg, 0,058mmol, rendement : 93%).
*H-RMN (500 MHz, CDCI3) δ = 8.29 - 8.01 (m, 2H), 7.54 - 7.01 (m, 7H), 4.56 - 4.24 (m, 5H), 4.05 - 3.66 (m, 5H), 3.66 - 3.37 (m, 12H), 3.31 (d, J= 4.7 Hz, 3H), 3.25 - 2.55 (m, 7H), 2.18 - 1.84 (m, 1H) ppm.
13C-RMN (125 MHz, CDCI3) δ = 172.78, 171.62, 156.11, 155.95, 152.46, 145.10, 144.97, 135.45, 134.92, 129.38, 128.97, 128.80, 127.31, 127.10, 125.18, 122.21, 72.00, 70.64, 70.60, 69.43, 59.14, 51.47, 51.26, 50.69, 50.44, 50.18, 45.45, 45.20, 44.63, 44.03, 43.80, 42.40, 42.09, 41.06, 40.63, 40.25, 40.10, 39.39, 38.05, 37.72, 37.48, 31.85, 31.39, 30.40, 29.77, 29.51, 28.59, 26.99, 21.36, 20.53 ppm.
MS: ESI: [M+H]+ m/z trouvée 667.3, calculée 667.3
Rf = 0.31 (DCM : MeOH/ 95:5 / v:v) ΧΠΙ - Préparation du compose 39. 4~chtoro-2- 6-chk.ro-4-oxQ-3.4- dihydroquinazolin-2-Yl)phényl 4^3-(l-(2^2^2-méttoxyétt^^
lH-1.23-tria∞l^y0proDarKwlV2-((2-phén^
carboxylate ( EXEMPLE 61
a)Prépa ration du compose 38, 4-chloro-2-(6-chloro-4-oxo-3A- dihydroquinazoiîn-2-yl)phényl 4-(pent- -ynoyl)-2-((2- phénylacétamido)méthyl)pipérazine-l-carboxylate
Figure imgf000064_0001
A une suspension refroidie à 0°C et sous une atmosphère inerte d'argon du composé 37 (40mg, 0,13mmol, l,leq) dans du DCM anhydre (5mL) est ajoutée une solution de trlphosgène (130mg, 0,43mmol, 3,3eq.) dans du DCM anhydre (2mL) suivie par l'ajout de DIPEA (80uL, 0,43mmol, 3,3eq.). Ce mélange réactionnel est agité à 0°C pendant 30min puis à TA pendant 18h. Les volatiles sont alors enlevés par évaporabon sous pression réduite et le solide résultant est repris dans du DCM anhydre (5mL). A cette nouvelle suspension est ajoutée une solution du composé 34 (50mg, 0,H7mmol, l,Oeq.) dans du DCM anhydre (2mL), suivi par de la DIPEA (85pL, 0,47mmol, 4,0eq.)., et ce mélange réactionnel est agité à TA pendant 18h. A la fin de la réaction, le mélange réactionnel est dilué avec du DCM (20mL) et lavé deux fois avec une solution aqueuse saturée de NaHC03 (2x25mL) et une fois avec de la saumure (25mL). La phase organique est séchée avec du NazSCM, filtrée et évaporée. Le brut réactionnel est purifié par deux colonnes de chromatographie sur gel de silice successives (éther de pétrole : acétate d'éthyle / 2:8 / v:v ; et gradient DCM : MeOH / 99:1, 98:2, 97:3 / v:v) pour obtenir le composé 38 sous forme d'un solide blanc (52mg, 0,080mmol, rendement: 69%).
1H- MN (500 MHz, ΟΧ¾) δ= 11.12 - 10.16 (m, 0.8H), 8.14 (Sf 0.7H), 8.01 - 7.70 (m, 0.9H), 7.64 (s, 1.5H), 7.41 (s, 0.9H), 7.30 - 6.88 (m 5.3H), 6.82 - 6.46 (m, 0.9H), 6.10 (s, 0.3H), 4.56 - 4.01 (m, 2H), 4.05 - 2.99 (m, 7.1H), 2.99 - 2.60 (m, 1.8H), 2.60 - 2.15 (m, 3.6H), 2.10 - 1.59 (m, 1.6H), 1.23 (m, 1.3H) ppm.
"C-RMN (125 MHz, CDCI3) δ = 173.05, 171.80, 170.88, 170.50, 170.31, 161.41, 153.40, 153.05, 152.46, 149.57, 149.45, 147.43, 147.20, 147.09, 135.64, 135.41, 135.19, 134.83, 134.72, 134.55, 133.55, 133.39, 133.14, 132.11, 131.72, 130.88, 130.52, 130.29, 129.61, 129.43, 129.27, 129.20, 129.05, 128.85, 127.99, 127.66, 127.45, 127.20, 127.16, 125.96, 125.80, 124.81, 124.35, 124.16, 122.27, 122.06, 121.85, 83.37, 83.08, 82.95, 69.53, 69.39, 69.06, 68.97, 51.86, 51.67, 45.26, 45.09, 44.96, 43.58, 43.38, 42.44, 41.78, 41.11, 40.58, 40.37, 39.74, 39.33, 38.86, 38.41, 38.02, 31.76, 29.72, 14.68, 14.33 ppm.
MS: ESI: [M+H]+ m/z trouvée 645.3, calculée 645.2
Rr = 0.19 (DCM : MeOH/ 97:3 / v:v)
b) Préparation du composé 39, 4-chtoro-2-(6-chloro-4-oxo-3,4- dihydroquinazolin-2-yt)phényl 4-(3-(l-{2-{2'(2' méthoxyétlH xy)éthoxy)éthyl)-lH-lr2,3-triazol^yl)
((2-phénytacétamido)mét yl)pipérazine-l-carboxylate
Figure imgf000066_0001
La procédure utilisée est la même que celle décrite pour la synthèse du composé 31, avec le composé 38 (50mg, 0,077mmol, l,0eq.), le composé 28 (31mgf 0,170mmol, 2,2eq.), C SO .5H2O (12mg, 0,05mmol, 0,6eq.) et l'ascorbate de sodium (20mg, 0,10mmol, l,2eq.) dans un mélange DCM (2m L) et eau (2mL). Après purification, on obtient le composé 39 sous forme d'une huile légèrement jaune (50mg, 0,060mmol, rendement : 78%).
1H-RMN (500 MHz, CDCI3) δ = 11.12 (s, 0.4H), 10.89 (s, 0.2H), 10.14 - 9.90 (m, 0.2H), 8.33 - 7.94 (m, 2H), 7.91 - 7.71 (m, 2H), 7.70 - 7.48 (m, 1.5H), 7.43 - 7.32 (m, 2H), 7.30 - 7.12 (m, 3.5H), 4.54 (m, 4H), 3.93 (m, 4H), 3.77 - 3.50 (m, 10H), 3.45 - 2.72 (m, 10H), 2.39 (s, 0.5H), 1.66 (s, 3H) ppm. l3C- MN (125 MHz, CDCI3) δ = 174.00, 173.14, 172.10, 171.24, 161.27, 152.45, 152.24, 149.84, 149.71, 147.59, 147.54, 147.30, 147.19, 135.53, 135.30, 135.16, 135.11, 134.89, 133.08, 133.02, 132.14, 132.09, 131.98, 131.67, 131.54, 131.04, 129.79, 129.44, 129.35, 128.84, 128.78, 128.68, 127.64, 127.19, 126.97, 126.04, 125.83, 125.11, 124.32, 124.22, 122.54, 72.01, 70.64, 70.59, 70.43, 69.27, 59.15, 52.06, 51.86, 51.50, 50.90, 50.58, 45.62, 45.47, 45.38, 45.17, 44,54, 44.01, 43.88, 43.72, 43.53, 41.87, 41.17, 40.84, 40.42, 40.00, 39.20, 39.11, 38.30, 38.28, 30.34, 29.70, 29.43, 21.39, 20.64 ppm.
MS: ESI: [M+H]+ m/z trouvée 834.5, calculée 834.3
Rf = 0.13 (DCM : MeOH/ 96:4 / v:v)
B - Evaluation de Itiydrosolubilité des composés :
L hydrosolubilité des composés a été évaluée en fonction de la présence ou de l'absence de précipité dans des solutions tamponnées des composés en question à différentes concentrations. Ces solutions ont été préparées comme suit :
Une quantité connue de produit est dissoute dans un volume de DMSO approprié afin d'obtenir une solution mère limpide à lOOmM dans le DMSO (sauf dans le cas de l'AMC-Leucine commerciale (notée AMC-Leu) qui a donné une solution trouble dans ces conditions et la concentration de la solution mère dans le DMSO a dû être abaissée à 50mM). Ces solution mères sont ensuite diluées dans un tampon PBS commercial afin d'obtenir un éventail de concentrations finales comprises entre ImM et 50μΜ. Un composé est déclaré insoluble si un précipité apparaît et persiste après dilution.
Le Tableau 2 ci-dessous présente les résultats de ces tests de solubilité.
Tableau 2
Figure imgf000068_0001
Conclusions : Dans tous les cas présentés, les composés selon l'invention présentent une meilleure solubilité en solution aqueuse, par rapport à un substrat commercial sans bras espaceur, ou par rapport à un substrat incorporant un bras espaceur décrit dans les demandes WO 2013/045854 et WO 2014/020285.
Activatlon enzymatique :
Certains des composés ont été testés pour évaluer la fluorescence détectée sous activité enzymatique. A une solution de sonde selon l'invention dans du PBS dans une plaque 96-puits (noire pour la fluorescence ou transparente pour l'absorba nce) est ajoutée une solution de PGA (Penicillin G Amidase de Escherichia Coiï, Waterstone Tech.) dans du tampon PBS ou une solution de Upase (Upase de Candtda Rugosa, Sigma-AWrich) dans du tampon PBS.
Concentration finale de sonde: comprise entre ΙΟμΜ et 50μΜ
Concentration finale de PGA: 5U
Ou concentration finale de lipase : 4U
La plaque est ensuite incubée à 37 °C et la fluorescence ou l'absorba nce est enregistrée au cours du temps avec un lecteur de plaque multi-puits (EnSpire, Perkin Elmer). Les courbes résultantes sont le résultat de triplicats.
Pour la 4-méthylumbéliférone (composés 12, 15, 31, 21 et 27) : Fluorescence : K* - 370 nm, λβη= 445 nm.
Pour la 6-chloitH2-(5- ^k o-2-hydrOxyphenyl)quin
(composé 39): Ruorescence : A* = 365 nm, Aem= 530 nm.
Pour la paranitr phénolate (composé 36): Absorbance : h* = 405 nm. Les résultats sont présentés sur les FIGURES 1 à 8 annexées.
L'évolution de la fluorescence suite à l'acuvation du composé 12 par la PGA est présentée FIGURE 1.
L'évolution de la fluorescence suite à l'acuvation du composé 15 par la PGA est présentée FIGURE 2.
L'évolution de la fluorescence suite à l'acuvation du composé 31 par la PGA est présentée FIGURE 3.
La comparaison des vitesses de réponse des composés 12 et 31 selon l'invention, et du composé 15 utilisé en tant que comparatif, suite à leur activa on par la PGA est présentée en FIGURE 4.
L'évolution de l'absorbance suite à l'acuvation du composé 36 par la PGA est présentée FIGURE 5.
L'évolution de la fluorescence suite à l'acuvation du composé 39 par la
PGA est présentée FIGURE 6. L'évolution de la fluorescence suite à l'activation du composé 21 par la lipase est présentée FIGURE 7.
La comparaison des vitesses de réponse du composé 21 selon l'invention, et du composé 27 utilisé en tant que comparatif, suite à leur activation par la Lipase est présentée en FIGURE 8.
Conclusions : les composés selon l'invention permettent effectivement de détecter la présence d'une activité enzymatique grâce à des mesures de fluorescence ou d'absorbance. La reconnaissance enzymatique est toujours bonne malgré ( ncorporation d'une charge ou d'un groupement relativement encombrant d'un point de vue stérique sur le bras espaceur.

Claims

69
REVENDICATIONS
1 - Sondes de formule (I) :
Figure imgf000071_0001
dans laquelle :
- X1 = NH, O ou S,
- Xz = O ou S,
- SE est un groupe la ile, qui pourra être éliminé en solution aqueuse sous l'action d'un stimulus qui peut notamment être la présence d'une enzyme/ d'un composé chimique ou d'une caractéristique physicochimique du milieu dans lequel se trouve la sonde,
- A est un groupe aromatique, qui après clivage en solution aqueuse de la liaison C(X2)-0, conduit à la libération d'un chromophore ou d'un fluorophore,
- R représente un atome d'hydrogène ou -(L)n-GP, avec n qui est égal à 0 ou 1,
L est un bras de liaison,
• GP est un groupe hydrosolubilisant,
ainsi que leurs sels, soK ats ou hydrates, physiologiquement acceptables.
2 - Sondes selon la revendication 1 caractérisées en ce que le groupe labite SE est un substrat enzymatlque.
3 - Sondes selon la revendication 1 caractérisées en ce que :
- soit X1 est un oxygène et SE est un substrat cfestérase, glycosldase, phosphatase, sulfatase, ou giucuronidase ou X1-SE forment une liaison acétaie qui est ciivabte en milieu acide,
- soit X1 représente NH et SE est un substrat de protéase ou transférase,
- soit X1 est un soufre et X1-SE est un pont disul ure qui est cltvabie par un agent réducteur. 4 - Sondes selon Tune quelconque des revendications 1 à 3 caractérisées en ce que ie groupe iabile SE est un substrat pour au moins une enzyme choisie parmi les estérases telles que les carboxylestérases ou les lipases ; les aikaline-phosphatases ; les giucuronidases telles que la β-glucuronidase ; les glycosidases ; les protéases telles que les métalloprotéases; les peptidases et les amidases.
5 - Sondes sek>n l'une quelconque des revendications 1 à 4 caractérisées en ce que SE est choisi parmi les groupes glycosyie liés par leur carbone artomérique au reste de la molécule et les groupes peptidyle liés au reste de la molécule par une fonction acyle portée par leur carbone terminai ou par un chaînon latéral.
6 - Sondes selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 caractérisées en ce que SE est un substrat de glycosklase, par exemple de la N-acétyl-β- galactosamlnidase ; la N-acéty}-p-glucosamlnidase ; la a-amytase ; la a- arabir»furanos!ddse ; la α-ara binosidase ; la β-celto iosidase ; la β- chitobiosldase ; la α-galactosldase ; la β-galactosldase ; la -glucosidase ; la β-g!ucosidase ; la β-glucuronldase ; la α-maltosidase ; la u-mannosidase ; la β-mannosldase ; la β-xvtosidase ; la β-D-fucosidase ; la α-L-fucosidase ; la β-L-fucosidase ; la L-iduronkiase ou de la cellulase ; et correspond à groupement glycosyie lié par son carbone anomérique au reste de la molécule, et notamment, SE est un groupement mono-glycosyté choisi parmi le galactosyle, le glucosyle, le mannosyte, le gutosyle, l'altosyle, l'altrosyte, ITdosyle, le talosyle, le fucosyle, le fructosyle, i'arablnosyie, ie lyxosyie, le ribosyle, le xytosyle, le glucurorryle et le N-acétyl-hexosaminyie ou un groupement poryglycosyfé constitué de plusieurs, par exemple de 2 à 20, de préférence de 3 à 10, et plus particulièrement de 4 à 6, de ces groupements monoglycosylés identiques ou différents.
7 - Sondes selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 caractérisées en ce que SE est un substrat de de galactosklase, par exemple de la β - galactosklase, de PJnduronidase, de la glucosidase, de la N-acétyi-D- glucosaminkJase, de la N-acétyl-D-galactosamlnidase, de la mannosidase, de la fucosfdase ou de la glucuronidase, notamment de la β -glucuronidase ; et correspond à groupement glycosyte lié par son carbone anomérique au reste de la molécule, et notamment, SE est un groupement rnono-glycosyié choisi parmi le D-glucuronyle, te L-iduronyte, le D-glucopyranosyle, le D- galactopyranosyte, le N-acéty-D-glucosaminyle, le -acétyl-D- galactosaminyle, le D-mannopyranosyie, le L-fucopyranosyte ou un groupement polyglycosylé constitué de plusieurs, par exemple de 2 à 20, de préférence de 3 à 10, et plus particulièrement de 4 à 6, de ces groupements monoglycosylés Identiques ou différents.
8 - Sondes selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 caractérisées en ce que SE est :
- soit un substrat d'une protéase ou d'une peptidase, notamment un substrat de cathepsine ou de métailoprotéase, notamment de la PSMA (Prostate Spécifie Membrane Antigen) ; et SE correspond à un groupe peptidyle ou aminoadde lié au reste de la molécule par une fonction aeyie portée par son carbone terminal ou par un chaînon latéral ;
- soit un substrat d'une transfërase, notamment un substrat de la glutathione transférase ou de la gamma-glutamyl transfërase, et SE correspond à un groupe peptfdyte ou aminoadde lié au reste de la molécule par une fonction aeyie portée par son carbone terminai ou par un chaînon latéral ou SE correspond à un groupe sutfonyle formant une suifonamide avec X1 qui représente alors NH.
9 - Sondes selon l'une quelconque des revendications 1 à 8 caractérisées en ce que A est un composé aromatique comprenant un ou plusieurs cycles aromatiques substitués ou non substitués, tesdits cydes pouvant comprendre un au plusieurs hétéroatomes choisis parmi tes atomes d'azote, d'oxygène ou de soufre etyou un ou plusieurs atomes de carbone sous la forme d'un carbonyle C=0.
10 - Sondes selon l'une quelconque des revendications 1 à 9 caractérisées en ce que A est un composé aromatique conduisant à la libération d'un chromophore choisi parmi le paranitrophénoi et ses dérivés, les indigoktes, la cydohexenoescutetine, l'alizarin et l'hydroxyflavone. 72
11 - Sondes selon Tune quelconque des revendications 1 à 9 caractérisées en ce que A est un composé aromatique avec -ΟΛ choisi parmi :
Figure imgf000074_0001
12 - Sondes selon l'une quelconque des revendications 1 à 9 caractérisées en ce que A est un composé aromatique avec -ΟΛ qui répond à la formule (AA):
Figure imgf000074_0002
dans laquelle :
soit X5 est un atome d'oxygène et X* est un groupe - H2/ -OH, -SH, alkyie, aryle, -O-aiJcyfe, -O-phényle, -NH-alkyie, -NH-phényle, -S-alkyle ou -S-aryle, lesdits groupes alkyie et phényie pouvant être substitués ou non substitués, soit Xs représente un atome d'azote et est lié à * qui représente alors CH, 0, S, N ou NH pour former un hétéroaryie substitué ou non substitué,
Figure imgf000075_0001
et représente un aryle ou un hétéroaryle, substitué ou non substitué, par exemple choisi parmi les groupes phényie, naphthyle, et :
Figure imgf000075_0002
iesdits groupes pouvant être substitués ou non substitués,
avec X« qui représente S, O ou NR", et R" qui représente un atome d'hydrogène ou un groupe (Ci-0)alkyle ;
de préférence, -OA est du type phénoxy, et correspond, aux structures préférées (BB) ou (CC) suivantes :
Figure imgf000075_0003
dans laquelle
- T est -NH-C(0)-, -S-, -O-, - H, N-aikyie ou N-aryle,
- Ra est l'hydrogène ou un substituant carboné attracteur d'électrons, comme -C ou -COORd, avec Rd qui représente un groupe (Ci-C-Oalkyie, ou bien Ra est -CO ReRf, avec Re et Rf, identiques ou différents, qui représentent l'hydrogène ou un groupe (Ci-0)aikyte, ou bien Ra est -CFj ou un groupe 2-oxazolyie, 2-thiazoiyle, 2-imldazor te, 2-benzoimidazolyle, -pyrimidinon-2-yle ou quinazolinon-2-yie, - b est l'hydrogène, un atome de chlore, brome, iode ou fluor, -OH, -NH2, -N gRh, - HRg ou -O g, avec Rg et Rh qui représentent chacun indépendamment un (G-C- aikyte,
- ou bien Ra et Rb sont liés entre eux pour former une chaîne hydrocarbonée comprenant 4 ou 5 chaînons, saturée ou Insaturée, substituée ou non substituée, éventuellement Interrompue par un ou plusieurs hétéroatomes choisis parmi N, S et O,
- Rc est l'hydrogène, Br, Q, I ou F,
Figure imgf000076_0001
dans laquelle :
- V est NH2, OH, un groupe aryle, un groupe (CrC aikyte, SH, NHR'c, OR'c, NR'cR'd ou SR'c, avec R'c et R'd, identiques ou différents, qui représentent un groupe (Ci-C«)alkyle ou aryle,
- R'a est l'hydrogène ou un substituant carboné attracteur d'électrons comme -CN, ou -COOR'e, avec R'e qui représente un groupe (G-C a!kyle, ou R'a est -CO RfR'g, avec RT et R'g, Identiques ou différents, qui représentent l'hydrogène ou un groupe (G-Gi)alkyte, ou bien R'a est -C ou un 2-oxazolyte, 2-thiazolyfe, 2-imidazolyle, 2-benzoimldazolyte, 4-pyrimidinon-2-yle ou qulnazollnon-2-yte,
- R'b est l'hydrogène, un atome de chlore, brome, tode ou fluor, -OH, -Nr¼, -NR iR'l ou -ORTi, avec R"h et R'i, Identiques ou différents, qui représentent un groupe (Q-C- alkyte,
- ou bien R'a et R'b sont liés entre eux pour former une chaîne hydrocarbonée comprenant 4 ou 5 chaînons, saturée ou insaturée, substituée ou non substituée, éventuellement interrompue par un ou plusieurs hétéroatomes choisis parmi N, S et O.
13 - Sondes selon l'une quelconque des revendications 1 à 9 caractérisées en ce que A est un composé aromatique avec -ΟΛ qui répond à l'une des formules suivantes :
Figure imgf000077_0001
14 - Sondes selon l'une quelconque des revendications 1 à 13 caractérisées en ce que R représente -(L)n-GP avec n = 1 et L est un bras de liaison, et notamment un bras ~{Ll)ml-(L2)ni2-(l.'l)iii'l-, défini dans le sens pipérazine -> groupe GP avec :
- Il et L' , identiques ou différents, qui sont choisis parmi -O-, -NH, -N(CW alkylh -N(phényl)-, -N(arylh qpy, -qo)o, -oqoh -oc(0)-o, -NHCXOHK -OC(0)-NH-, -
NHC(0)-NH- -S-, -SOr, -N=N-, -NHC{0> et -CONH- ;
L2 qui est choisi parmi les groupes bivalents suivants : (Ci-2o)alkyle, (Ci-2o)alcényle, (Ci-2o)alcynyte, (Crwjaryfe, (Cr )alkyiaryie, (C7-«)alcénylaryte, (C )alcynyiaryle, (Cr4«)alkylcydoalkyie, (Cr4 )alcénylcydoa}kyle, (Cr*)alcyriylcydoaÈtyle, (Cr4 >alkylhétérocycloallcyle, (Cr«4)alcényliiétérocyctoaikyle, (C7- )alcynylhé^éiOcydoalkyfe ; lesdlts groupes pouvant être interrompus ou se terminer par un groupe triazote et pouvant être non substitués ou substitués, notamment par un ou plusieurs substituants choisis parmi les (Ci-io)alcoxy, (Ct-io)aikyle, (C6-io)aryte, amldo, imido, phosphido, nitrldo, (Ci-io)alcényte, (Ci-io)alcynyle et -OH ;
- ml, m'I et m2, identiques ou différents, qui sont égaux à 0 ou 1 et
- GP étant tel que défini à la revendication 1.
15 - Sondes selon la revendication 14 caractérisées en ce que L représente -{Ll)ml-<L2)m2-{l-'l)m'l avec Ll = -C(Oh ml = m2 = 1, m'I = 1 ou 0 et L2 et L'I tels que définis à la revendication 14, et notamment L représente -C(OHCH2)p-L3- avec p qui est égal à 1, 2, 3 ou 4 et 13 qui est un groupe triazole et notamment un groupe 1 f 1,2,3-triazole.
16 - Sondes selon l'une quelconque des revendications 1 à 15 caractérisées en ce que R représente -(L)n-GP avec n et L définis à l'une quelconque des revendications 1 à 15 et GP est un groupe hydrosolubilisant capable de former une espèce chargée en solution aqueuse.
17 - Sondes selon l'une quelconque des revendications 1 à 15 caractérisées en ce que R représente -(lOn-GP avec n et L définis à l'une quelconque des revendications 1 à 15 et GP est une fonction Fi choisie parmi les aminés primaires, tertiaires et secondaires, amkfine, la guanidine, le tétrazoie ; une fonction Fa anionique du type, carboxylate, sulfonate ou phosphate ; un groupement comprenant une ou plusieurs de ces fonctions F* et ou F ; un polyéthyièneglycol ; un sucre ou polysaccharfde tel que le glucose, le galactose et te mannose ; un groupe peptidlque tel que la poly-lysine, la poiy-arglnine et les TAT-peptldes.
18 - Sondes selon l'une quelconque des revendications 1 à 17 caractérisées en ce que X2 est un atome d'oxygène.
19 - Sondes selon l'une quelconque des revendications 1 à 18 caractérisées en ce que :
- Xa est un atome d'oxygène,
- sot X1 est un atome d'oxygène et SE est un substrat de glycosidase ou glucuronidase et correspond à un groupe giycosyle lié par son carbone anomérique au reste de la molécule ou SE est un substrat d'estérase et correspond à un groupe -C(0) I avec Ri qui représente, par exemple, un groupe alkyie de préférence de 1 à 20 atomes de carbone, un groupe alcényie de préférence de 1 à 20 atomes de carbone, un groupe benzyle, aryle ou hétéroaryie,
- soit X1 représente NH et SE est un substrat de protéase ou peptâdase et correspond à un groupe pepttdyle lié au reste de la molécule par une fonction acyie portée par son carbone termina! ou par un chaînon latéral; et
- R représente -L-GP avec :
o L qui représente - Ll)ml-(L2)m2-(L'l)m'l avec Ll = - QO)-, ml = m2 = 1, m'I = 1 ou 0 et L2 et L'I tels que définis à la revendication 14, et notamment L représente - C OHCH2) ~L3~ avec p qui est égal à 1, 2, 3 ou 4 et L3 qui est un groupe triazoie et notamment un groupe 1 1,2,3- triazofe, et
o GP qui est tel que défini à ia revendication 1, 16 ou 17 et qui représente, de préférence, une fonction Fi choisie parmi les fonctions ammonium, carbox iate, suifonate et phosphate et les poiyéthylènegiycols.
20 - Sondes selon ia revendication 1 choisies parmi :
hydrochlorure de 4-métrryl-2-co<o-2H hix>men-7-yl 2-((2- phénylacé amido)mé^yl)pipé azirïe-l arboxylate (Composé 12) :
Figure imgf000079_0001
hydrochlorure de 4-rnéfryl-2-oxc-2H-chromer^7-yi
((c>ctanoyloxy)rnéthyi)pipérazI ne- 1 -ca rboxyiate (Composé 21)
Figure imgf000079_0002
acide 4^4 ((4-rrréthyl-2-oxc-2H-chrc^n^
((octer»yk)xy)rf>é^)pipéra2in-l-yl)butar^l^lfonique (Composé 22)
Figure imgf000080_0001
4-méthy{-2-oxo-2H-chromen-7-yf 4-(3-(H2-(2-(2« rnéth(^thoxy)éthoxy)éth^
phenylacétamicto)métyl)pfpéra^ (Composé 31)
Figure imgf000080_0002
4-nltrophényl -(3 1^ 2 2→néthoxyé« )xy)éthoxy)^
4-yl)prapanoy1)-2-{(2-phénYlac^
(Composé 36)
Figure imgf000080_0003
4 ritoro-2-(6-chlorO- ^xo-3 ^ 4-(3-(l-(2-(2- (2-méthoxyéthoxy)éthoxy)éthyl>
phényiacétamido)mé y))pipéi3zine-l ai ^^ (Composé 39)
Figure imgf000081_0001
21 - Intermédiaires de formule :
Figure imgf000081_0002
dans lesquelles :
A, X1, X¾ SE, Ll, L'I, L2, ml, m'1, et m2 sont tels que définis pour (I) aux revendications 1 à 15 et 18 et 19, Z représente C≡CH, 3, une fonction N-oxysucdnlmlde ou maléimkje, et
R'p représente un groupe protecteur des fonctions aminés, de préférence choisi parmi tes groupes benzyle, tes groupes -C(0)O 'i avec R'i qui représente un groupe alkyte ou aicényie de 1 à 12 atomes de carbone ou un groupe -CCH2)m3Rwi avec R"i qui représente un groupe aryle, cyctoaikyle ou fluorényte et m3 qui est égal à 0, 1, 2 ou 3, tel que les groupes carbobenzyloxy, fe^butyloxycarbonyl, -fluoférr/lrrié¾hyk3xy(art>CH^I# et allyloxycarbonvie,
ainsi que leurs sels, solvats ou hydrates.
22 - Sondes selon Tune quelconque des revendications 1 à 20, pour la détection in vivo, chez l'homme ou ranimai, d'un stimulus tel qu'une enzyme, un composé chimique ou une caractéristique physicochimique du milieu dans lequel se trouve la sonde, dont la présence entraîne le divage de la liaison SE-X1
23 - Procédé in vitro pour détecter, au moyen d'une sonde selon l'une quelconque des revendications 1 à 20, fa présence d'un stimulus tel qu'une enzyme, un composé chimique ou une caractéristique physicochimique du milieu dans lequel se trouve la sonde, dont la présence entraîne le divage de la liaison SE-Xt.
24 - Procédé selon la revendication 23 comprenant les étapes successives suivantes :
- la mise en contact d'un échantillon, suspecté de contenir ledit stimulus, avec une sonde selon l'une quelconque des revendications 1 à 20 ;
- l'application de conditions appropriées pour permettre te divage de la liaison covalente entre Xt et SE, sous l'action du stimulus, qui est suivi d'un divage de la liaison entre te Cpfe) et te groupe -ΟΛ suite à une cydlsation de l'espaceur présent dans la sonde de formule (I), et
- l'analyse quantitative ou qualitative du chromophore ou fluorophore libéré.
25 - Procédé selon la revendication 23 ou 24 caractérisé en ce qu'il est mis en œuvre dans des conditions physiologiques, rwtamment dans un milieu aqueux, de préférence tamponné à un pH appartenant à la gamme allant de 4 à 9, et par exempte à un pH de l'ordre de 7,4. 26 - Procédé selon l'une quelconque des revendications 23 à 25 caractérisé en ce qu'un fiuorophore est libéré et son analyse comprend les étapes suivantes :
- exposition du fiuorophore à une source lumineuse capable de produire une lumière à une longueur d'onde d'absorption du fiuorophore ; et
- détection de la fluorescence résultante.
27 - Procédé selon Tune quelconque des revendications 23 à 25 caractérisé en ce qu'un chromophore est libéré et son analyse comprend les étapes suivantes :
- exposition du chromophore à une source lumineuse capable de produire une lumière à une longueur d'onde d'absorption du chromophore ; et
- détection de la lumière absorbée par le chromophore, correspondant à un changement de couleur.
28 - Procédé selon l'une quelconque des revendications 23 à 27 caractérisé en ce que te fiuorophore ou le chromophore libéré, en particulier sous la forme d'un composé A-OH, A-O" ou d'une forme obtenue après réarrangement, ou d'une forme tautomérique ou polymérisée de A-OH ou A- O", forme un précipité en solution aqueuse.
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