WO2016000678A1 - Verfahren und vorrichtung zur ramanspektroskopischen in-ovo geschlechtsbestimmung von befruchteten und bebrüteten vogeleiern - Google Patents

Verfahren und vorrichtung zur ramanspektroskopischen in-ovo geschlechtsbestimmung von befruchteten und bebrüteten vogeleiern Download PDF

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Definitions

  • the invention relates to a method and a device for Ramanspektroskopischen in-ovo sex determination of fertilized and incubated bird eggs.
  • the document DE 10 2010 006 161 B3 describes a method and a device for determining the sex of fertilized and non-incubated bird eggs, wherein an egg comprises at least one solid calcareous shell, an egg yolk surrounded by the calcareous shell and further egg shells and a germinal disc associated with the egg yolk wherein a probe for measuring a spectrum is passed through a hole of the calcareous shell in the direction of the germinal disc with germinal disc cells,
  • IR and / or NIR spectra are recorded and fed to an evaluation, automatic classification of the spectra based on the spectral fingerprint, for example in proteins, lipids and nucleic acids.
  • the germinal cells are identified on the basis of absorption bands of the nucleic acids (DNA and RNA) and other biochemical compounds in such a way that the gender of the tested egg is determined and displayed.
  • the measurement can be carried out with conventional infrared spectroscopy.
  • At least one egg position support for locking at least one egg
  • At least one height adjustment device with at least one holding arm, at least one optical crystal designed as a probe, which is attached to the holding arm,
  • At least one control unit for the locking egg position support and for the height adjustment device at least one spectral light source relating to at least one wavelength range and emitting an IR and / or NIR light beam,
  • At least one detector for receiving the recirculated IR and / or NIR light beam
  • At least one optical element for guided beam guidance between the light source and the optical crystal and the returned beam guidance from the optical crystal towards the detector
  • an evaluation unit connected to the detector and a display unit, wherein with the height adjustment device the height of the support arm and thus of the optical crystal with respect to the location of the germinal disc is adjustable and the optical crystal can be positioned in the area of the germinal disc in a pane allocation position in which the optical crystal overlaps an evanescent field forming on the seed disc upon total reflection at the exit surface facing the germinal disc, and the nucleobase cells therein interact sexually with the evanescent field to absorb the light from the incident beam path, the light totally reflected at the output surface via the recirculated optical path within the crystal and finally passed over the optical element for registration to the detector, from which the registered spectral signals for evaluation and display of the sex be berffent.
  • a DNA relevant cell material is analyzed by vibrational spectroscopy to determine the sex of bird eggs based on DNA differences: either in the egg after opening with a probe or after removal of the material from the egg and deposition on a substrate.
  • UV resonance spectroscopy is determined at wavelengths of 244 nm or 254 nm.
  • a spectral classification is performed with all existing monitored and non-monitored procedures:
  • DNA-relevant cell material of the bird to be sexually determined is examined with light and the molecular vibrations are measured, whereby the spectrum of the molecule vibrations resulting from the light is detected and compared with predetermined and gender-specific DNA structures of the bird species to be examined from this spectral comparison, based on the DNA content of the cell material based sex assignment of the bird is made.
  • the molecular vibrations are measured using Raman spectroscopy or IR spectroscopy, e.g. the DNA-relevant cell material can be taken from the shaft of a young feather of a bird.
  • the cell material is prepared on a support and scanned with light.
  • the light for measuring the molecular vibrations of the DNA-relevant cell material from unsheathed birds is focused through the eggshell onto the embryo or the germinal disc, whereby the spectrum of the radiation resulting from the molecular vibrations is measured in the egg with a guided through the shell of his probe.
  • the probe For the passage of the probe at least one microscopic hole is drilled through the eggshell to measure the spectrum.
  • the light is focused through the small access through the eggshell directly on the germinal disc as a cell material.
  • the probe is introduced, by means of which the reflected spectrum of the aforementioned molecular movement inside the ice recorded by the probe is measured.
  • the obtained spectral information is compared in a second step with gender-specific reference data and fed to a classification algorithm. These preferably represent statistically obtained data on the bird species to be examined. From this comparison, the gender assignment of the DNA material to be examined is made.
  • One problem is that a large amount of time is required for the introduction of a probe into prefabricated holes in a very large number of bird eggs to be examined.
  • a considerable adjustment effort for an optical imaging with respect to the location of the germinal disc must be operated, whereby from egg to egg the focusing plane can have a different position and thus no determination of the sex can be carried out can.
  • WO 2014/021715 A2 describes a sex determination of bird embryos, wherein the method is carried out by means of a) detection of a marker compound of sugars and amino acids, precursors and metabolites in the allantoic fluid of the egg on the 8th 1.-gross day, b) quantitative determination of the marker by NMR spectroscopy, c) sex determination ng by comparing the amount of the marker to a given initial value.
  • a major disadvantage of the method is that a removal of at least one sample from the egg takes place.
  • the egg opening on day zero leads to greatly reduced hatching rates and irreversible damage to the germinal disk due to the UV radiation at 337 nm.
  • US Pat. No. 7,950,349 B1 discloses a method for determining:
  • the external light source can be either an incandescent lamp, fluorescent lamp, LED or a (pulsed or CW) monochromatic or dichroic laser light source.
  • the first part of the procedure arises from the fact that after exposure to the light source, the fertile birds eggs a higher Intensity of the photons emit than the unfertilized bird eggs.
  • the second part of the procedure results from the fact that after exposure to the light sources mentioned above, bird eggs of the female sex emit a different spectrum of photons than bird eggs of the male sex.
  • the documents WO 2010/1031 11 A1 and US 2012/0058052 A1 describe a non-invasive method and a device for in ovo determination of the sex of bird species.
  • the method comprises the steps of introducing a labeled antibody into the egg that binds to a sex-specific antigen of the embryo and detecting the labeled bound antibody with a detection device outside of the egg.
  • US Pat. No. 7,041,439 B2 describes a method and a device for the automated processing of eggs according to selected characteristics (eg of gender), the following steps being carried out: a) extraction of sample material (allantoic fluid, egg white, egg yolk, egg shell , Albumin, tissue, membrane and / or blood),
  • sample material allantoic fluid, egg white, egg yolk, egg shell , Albumin, tissue, membrane and / or blood
  • a disadvantage is that samples must be taken here, which require a higher effort, at least in the environment for sex determination.
  • the documents WO 2010/150265 A3 and US 2013/0044210 A1 describe a method for sex determination of non-hatched bird eggs by hyperspectral analysis of optical spectra (preferably reflection spectra).
  • the analysis is carried out in a spectral range with wavelengths up to 2500 nm (MIR) in order to be able to filter out the signal generated by CaC03 of the egg's calcareous shell at 2340 nm.
  • MIR 2500 nm
  • the method makes it possible to detect biological components, other than blood, and allows both the detection of fertility before the second day of incubation and the determination of the sex of the chicks in the egg on the twelfth day of incubation.
  • the sensitivity could be increased by using a neural network analysis.
  • PCA Principal component analysis
  • a disadvantage is that with the method a sex determination can be carried out only on the 12th day.
  • US Pat. No. 6,029,080 B1 describes a non-invasive method and a device for determining the sex of bird eggs, in which it is determined by means of nuclear magnetic resonance (NMR) whether the living embyo in the egg has male genitals or female genitalia.
  • NMR nuclear magnetic resonance
  • a disadvantage is that the training of the sex organs only takes place in the developed embryo after substantially several days, whereby at least the implementation requires a high financial outlay.
  • US Pat. No. 6,506,570 B1 describes the presence or absence of an increased sex-specific hormone level, preferably of the estrogen level, in an extraembryonic fluid, preferably the allantoic fluid, for in ovo sex determination of bird eggs.
  • the method is preferably applied to chicken eggs and can be carried out before or during the transfer from the pre-incubator to the hatcher.
  • the document DE 10 2012 023 947 A1 describes a method for structure elucidation through an optically opaque barrier of a biological examination object.
  • an internal structure with different dielectric properties is elucidated by means of electromagnetic spectral analysis
  • the object to be examined is positioned under an array of pulse transmitters and receivers which are arranged in one plane and connected to a computer system in terms of data and information,
  • Electromagnetic energy with a wavelength between about 380nm and 740nm is not using avian embryo invasive sexing, exposing a bird's egg to electromagnetic energy and determining the amount of absorption, diffusion, refraction, reflection, or any combination thereof of the electromagnetic energy through the bird's egg.
  • the sex of the bird embryo is at least partially determined by the presence or absence of color pigment inside the bird egg.
  • the spectrophotometric analysis of the feather color of chicken embryos can only be applied to brow breeds or to breeds with color differences of female chicks or male chicks.
  • CARS spectroscopy a significant difference between linear and nonlinear Raman spectroscopy is the special mode of excitation.
  • CARS spectroscopy a multi-photon process is used to excite the molecular vibrations and generate a coherent signal.
  • CARS gives a signal which is orders of magnitude stronger than that of the spontaneous Raman emission of linear Raman spectroscopy (factor 10 5 ), resulting in a shorter measurement time.
  • the CARS signal is blue shifted and therefore free of fluorescence.
  • the excitation takes place by means of ultrafast NIR lasers, so that the penetration depth is comparable to the penetration depth in NIR Raman spectroscopy and thus light damage is minimized.
  • the sensitivity is not limited by the detection of the CARS photons, but rather by the distinction between resonant and non-resonant parts of the CARS signal.
  • the Raman spectrum can be obtained from the CARS spectrum by a modified Kramers-Kronig transformation or by special computational methods based on the assumption of maximal entropy.
  • the invention is therefore an object of the invention to provide a method and apparatus for Ramanspektroskopischen in-ovo sex determination of fertilized and incubated bird eggs, which are designed so suitable that the sex can be clearly determined in the eggs quickly and reliably, with the female embryo can evolve normally and it can lead to the hatching of the female chick.
  • the object is solved by the features of claims 1, 5 and 30.
  • the method is used for the Ramanspektroskopischen in-ovo sex determination of fertilized and incubated bird eggs, the embryo developing including the extraembryonic structures is mobile in the egg and not yet fixed to the calcareous shell,
  • the introduction of a hole in the calcareous shell by means of a hole generating unit in the form of a laser or mechanical perforation can be performed on the upwardly directed, pointed pole of the egg with diameters of up to 18mm, preferably between 8mm and 15mm.
  • the light in the visible wavelength range may be white light, but the contrast is improved when using blue and / or green light from a light source.
  • a second method is used for Raman spectroscopic in ovo sexing of fertilized and incubated bird eggs, whereby the extraembryonic structures are no longer freely mobile, but a fixation of the chorioallantoic membrane (CAM) begins on the calcareous shell,
  • CAM chorioallantoic membrane
  • CAM chorioallantoic membrane
  • the light of the visible wavelength range may be white or blue or green or blue and green, contrast producing light from a light source.
  • holes with diameters of up to 5 mm, preferably between 0.1 mm and 3 mm, can be formed,
  • a classification is carried out in the evaluation unit to recognize the gender of the respectively measured incubated bird egg before the display of the sex.
  • the Raman scattering of blood of extraembryonic blood vessels and / or blood of embryonic blood vessels can be used for non-invasive in-ovo sex determination in incubated bird egg.
  • the following parameters are used for Raman spectroscopy: Excitation wavelengths of the laser light of the laser source for Raman spectroscopy:> 600 nm, eg HeNe laser 633 nm, solid-state laser (Nd based eg Nd: YAG laser 1064nm, VIS NIR diode laser eg 785 nm), coupling the laser excitation beam directly with mirrors and / or with optical fibers,
  • Raman scattering measurements are made using optical systems with large numerical aperture NA, such as microscope objectives or a Raman fiber probe.
  • the blood vessels used and the chorioallantoic membrane (CAM) formed it can be stated in the respective measuring procedure that the blood vessels form from the second incubation day and the embryonic blood circulates in the bloodstream until the third day of incubation. This means that an immediate sex determination at a very early stage from about the third gross day is appropriate.
  • the egg is preferably pollastig and a hole can be placed in the area of the upturned pointed pole at a hole size of 10 mm and at three grossages. From about the fifth day, the chorioallantoic membrane begins to adhere to the outer membrane and a smaller hole in the calcareous shell may be introduced at gross days longer than five days, with the hole also being possible horizontally. The hole of the egg's calcareous shell ensures visual access to the recognized blood-perfused blood vessel.
  • the laser beam is focused on the selected blood vessel and the tracking by means of a lens is optionally carried out automatically.
  • the applied power of the laser source must not lead to a local and global warming of the egg above 40 ° Celsius.
  • the Raman scattering radiation may preferably be registered with a large numerical aperture lens (NA> 0.3).
  • the Raman scattering radiation can be detected by means of a Raman fiber probe.
  • the detected Raman scattered radiation can be supplied to the spectrometer via fiber cables.
  • the range of 500 cm “1 to 4000 cm “ 1 (Raman shift) is used.
  • the gender specific features are contained in the Raman bands of nucleic acids, carbohydrates, lipids and proteins, whereby the Raman bands are subjected to a mathematical analysis.
  • methods of supported and unsupported classification can be used, whereby the gender-specific characteristics of a characteristic table are stored.
  • the detected Raman scattering radiation can be corrected in the form that background signals are eliminated by fluorescence or other scattering processes and the spectra are normalized in a predetermined form.
  • the chorioallantoic membrane CAM
  • the chorioallantoic membrane can be used for sex determination.
  • the sex determination may be made on any day between the beginning of the incubation and the hatching, preferably in relation to the formation of the blood vessels on the third gross day to the fifth gross day.
  • nonlinear Raman spectroscopy can be used in the form of coherent anti-Stokes Raman scattering spectroscopy (CARS), where the CARS spectrum of the blood of the blood vessel using the same recording configuration as for spontaneous Raman spectroscopy with or without Fiber optics is recorded.
  • CARS coherent anti-Stokes Raman scattering spectroscopy
  • the CARS signal can also be generated by a broadband femto-second laser, which serves as a pump laser and as a Stokes laser.
  • the CARS signal can be generated by means of two laser sources, in particular by means of a broadband laser and a narrow band laser for the use and evaluation of a multiplexed CARS spectroscopy.
  • the CARS spectra can be used for classification.
  • the resonant part of the CARS spectrum [lm (Chi (3) )] can be separated from the non-resonant part [Re (Chi (3) )] and only the resonant part can be used for the classification.
  • Bird eggs are mainly chicken eggs whose gender is determined.
  • the device for determining the Raman spectroscopic in ovo sexing of fertilized and incubated bird eggs uses the aforementioned methods and comprises
  • a blood vessel position evaluator communicating with the egg storage unit
  • a radiation device with light from the visible wavelengths of a light source for detecting at least one blood vessel within the opened calcareous shell
  • a detector for the light for detecting blood vessels wherein the detector is connected to the blood vessel positioning evaluation device, the radiation device and the detector forming at least one vision system,
  • a hole generating unit for creating a hole in the calcareous shell at least in the vicinity of the fixed blood vessel
  • a laser source emitting the laser light, wherein the laser light is focused on at least one blood vessel
  • a spectrometer for receiving the Raman radiation of the
  • control unit for xyz positioning of the device on the
  • a gender determination evaluation unit in communication with the spectrometer and the blood vessel positioning evaluation means and indicating from the processed detected Raman scattered radiation of the spectrometer the sex of the incubated bird egg.
  • the device according to the invention can be assigned as a vision system a device for detecting the position of blood vessels within the egg.
  • the device for determining the position of a blood vessel is connected to the control unit via at least one supply and signaling line.
  • the device for determining the position of a blood vessel may be in communication with a height adjustment device and the egg storage unit.
  • the device for determining the position of a blood vessel, the height adjustment device and the egg storage unit can be connected to the blood vessel position evaluation device by means of program technology for carrying out a coordination of the position of the blood vessel.
  • the optical device may be a flexible optical fiber.
  • the radiation device may preferably emit green light for detection of at least one blood vessel.
  • the evaluation unit can have program-technical means for gender determination evaluation of the detected Raman scattered radiation and of the detected CARS scattered radiation.
  • a hole is introduced into the calcareous shell via a detected blood vessel by means of a hole-forming unit.
  • a laser is focused on the exposed blood vessel and from the same location the Raman scattered radiation is collected through the hole and returned to a spectrometer. All this is done by observing, monitoring and controlling the visible / green lighted egg.
  • a time-dependent formation of at least one blood vessel and the later formation of the chorioallantoic membrane (CAM) can be monitored, so that the beginning of the measurement sequence for the use of the method according to the invention on the temporal formation of the Blood vessel and later the Chorioallantoismembran (CAM) can be tuned.
  • the detection of the blood vessels, in particular in white eggs, can be carried out by using white or green light:
  • the blood vessel system including the embryo, is still mobile. After the opening of the egg, the embryo and thus the vessels sink. The position of the blood vessels is stable after a few minutes, after which a measurement is made via a larger hole, preferably about 10 mm.
  • the Raman scattered radiation is recorded spectrally dissected and processed with predetermined mathematical methods and classified according to gender.
  • the invention :
  • the position of blood vessels is determined by means of green or white or blue light, and at a predetermined point a hole is made in the calcareous shell in which the Raman radiation of blood or tissue is irradiated by laser radiation in the red or near-infrared spectral range is excited behind the calcareous shell, and the Raman scattering / Raman scattered light is registered, fed to a spectral and statistical analysis, and the sex is determined on the basis of characteristic marker bands.
  • the Raman spectroscopic measurements the following measures are taken such that
  • the egg is preferred and the hole is introduced in the area of the pointed pole, this being done especially with a hole size of 10 mm at three grossages or with a smaller hole at gages> 5 days even with a horizontal position of the egg is possible,
  • the hole is introduced into the calcareous shell by means of a laser or by means of a mechanical means,
  • the laser beam is focused on the blood vessel and optionally automatically tracked (real-time tracking),
  • the applied power of the laser does not lead to local and global thermal damage
  • the Raman scattered light is collected with a large numerical aperture lens (typical NA> 0.3),
  • the recorded Raman scattered light is fed to a spectrometer
  • the range of 500 to 4000 cm-1 (Raman shift) is preferably used for the evaluation of the Raman spectra
  • the Raman spectra are corrected in the form that background signals are eliminated by fluorescence or other scattering processes and the spectra are standardized in a suitable form
  • the blood-drawn through CAM can be used for sex determination, - the sex determination can be made every day between the beginning of incubation and slippage.
  • near-infrared light having a wavelength of 785 nm (or 1064 nm) is used to excite Raman scattering.
  • neither a specific compound 30 is focused nor absolute quantities or proportions (compound classes 31) are calculated in comparison to document WO 2014/021715 A2.
  • Supported classification techniques are used to classify the entire spectrum or one or more spectral regions as male or female, based on a training set that can be obtained in advance from known spectra or spectral regions.
  • the respective optical element for beam guidance or for returning beam guidance can be a flexible optical fiber.
  • Fig. 1 is a representation of the difference between the determination levels (compound, compound classes) of the prior art and the invention level (molecular bonds including functional groups),
  • Fig. 2 is a schematic representation of the inventive device for
  • Fig. 3 is a schematic representation of a part of the device for introducing laser light into the hole of the calcareous shell, wherein
  • 3a shows the final part facing the egg for irradiating the at least one determined blood vessel and for detecting the Raman radiation from the sides of the irradiated blood vessel
  • 3b shows an enlarged detail with an insight into the hole of the lime shell and the possible measuring points on at least one blood vessel of the movable embryo
  • 4 shows a spectroscopic representation of the evaluated Raman scattering radiation intensities in a predetermined wavelength range for the detection of the difference between female bird egg and male bird eggs, wherein the solid line represents the mean value spectrum for the female state and the dotted line the mean value spectrum for the male state, and
  • Fig. 5 is a block diagram for explaining the operation for the classification of the returned and detected Raman spectra and thus for sexing the bird egg embryo.
  • FIG. 2 shows, in a schematic illustration, a device 20 for the Raman spectroscopic in-ovo sex determination of a fertilized and incubated bird egg 1,
  • the device 20 at least comprises
  • an egg storage unit 16 on which the egg 1 is stored
  • a blood vessel position evaluation device 14 which is connected to the egg storage unit 16,
  • a spectrometer 8 for receiving the Raman scattered radiation 7
  • control unit 18 for xyz positioning of the device 5 on the hole 2 introduced into the egg 1, a sex determination evaluation unit 9, which communicates with the spectrometer 8 and the blood vessel positioning evaluation device 14 via the control unit 18.
  • the device 20 is associated with a device 34 for determining the position of the blood vessels 21 within the egg 1 - a vision system - in conjunction with the radiation device 19.
  • the device 34 further includes a detector 13 in the form of a camera.
  • the device 34 for detecting the position of a blood vessel 21 is connected via at least one supply and signaling line 17 to the control unit 18 in the form of a coordinative positioning.
  • the device 34 for detecting the position of a blood vessel 21 communicates with a height adjustment device (not shown) and the egg storage unit 16 in conjunction.
  • the means 34 for detecting the position of the blood vessel 21, the height adjustment device, e.g. Within the coordinative positioning unit 18 and the egg storage unit 16 can be connected in the blood vessel position evaluation device 14 by means of programmatic means for coordination and determination of the position of the blood vessel 21.
  • the radiation device 19 for monitoring the formation of blood vessels 21, 27 may consist of the light source 10, a filter 11 and a lens 12 and may be directed to the upper part of the egg 1.
  • the optical device 5 may be a flexible optical fiber.
  • the following measures are taken such that
  • the egg 1 is preferred and the hole 2 is introduced in the region of the upward pole pointed with the hole generating unit 29, wherein Measurements are possible horizontally, especially with a hole size of 10 mm at three grossages, with a smaller hole at grossages> 5 days also horizontally,
  • the hole 2 is introduced into the calcareous shell 28 by means of a laser 29 or by means of a mechanical means,
  • the hole 2 of the calcareous shell 28 ensures the optical access to the previously recognized blood-perfused blood vessel 21,
  • the laser beam 3a is focused on the blood vessel 21 within the hole 2 and optionally automatically tracked,
  • the applied power of the laser source 3 does not lead to local and global thermal damage to the egg 1 (temperature increase ⁇ 1 ° C. during the measurement),
  • the Raman radiation 7 is registered by means of a lens 6 with a large numerical aperture (NA> 0.3),
  • the Raman radiation 7 is recorded with a Raman fiber probe 5
  • the received Raman radiation 7 is supplied to a spectrometer 8 via a fiber line 4b,
  • the Raman spectra are corrected in the form that background signals are eliminated by fluorescence or other scattering processes and the spectra are standardized in a predetermined form
  • FIG. 3 are schematic representations of a portion of the device 5 for introducing laser light 3a in the hole 2 of the calcareous shell 28 shown in Fig. 3a of the egg 1 facing the final part for irradiating the at least one determined blood vessel 21 and for detecting the Raman scattered radiation 7 from the sides of the irradiated blood vessel 21 and in Fig. 3b shows an enlarged section with insight into the hole 2 of the calcareous shell 28 and the possible measuring points on at least the blood vessel 21 of the movable embryo 23 are shown.
  • Fig. 3a from the side of the device 5 a focused on the blood vessel 21 laser light 3a is directed.
  • the blood vessel 21 is located outside the embryo 23.
  • the resulting Raman scattered radiation 7 is detected by the device 5 via the objective 5 and forwarded.
  • the embryo 23 also has blood vessels 27, which can also be the starting point of the measurement of a Raman radiation 7 in FIG. 3b.
  • Fig. 3b an enlarged section 22 of the introduced into the egg 1 hole 2 of Fig. 3a is shown.
  • Below the hole 2 of the calcareous shell 28 of the egg 1 is the embryo 23 (gray area in the hole 2) with its embryonic blood vessels 27 (blackened representations) and several extraembryonic blood vessels 21.
  • Both blood vessels 21 and 27 can be places of measurements and the detection of Raman radiation 7, wherein the possible measuring locations 24, 25, 26 detected depending on the time training of the blood vessels 21 and / or 27 and by means of the program-technical means at least for comparison with stored Ramanspektren in the control and / or evaluation 14, 9 can be set ,
  • FIG. 4 shows a spectroscopic representation of the evaluated Raman scattering radiation intensities in a predetermined wavenumber range 800 cm "1 to 1800 cm " 1 for detecting the difference between female bird eggs and male bird eggs, the solid line representing the mean value spectrum for the female state and the female dotted line represent the mean value spectrum for the male state.
  • At least one or more laser diode (s) or light source (s) may be used with a wavenumber-associated filter, in particular an interference filter based on the predetermined wavenumbers, the wavenumber v being the reciprocal of the wavelength ⁇ (in microns). multiplied by 10000 results.
  • the blood of the blood vessel 21 is identified in the spectrometer 8 in such a way that the gender of the tested bird's egg 1 can be determined and displayed.
  • FIG. 5 shows the mode of operation with the inclusion of the classification of the measured Raman spectra in the context of the evaluation.
  • the signal-to-noise ratio (SNR) of the hemoglobin band (750cm-1) is at least 5: 1
  • a correction of the baseline e.g. with a polynomial function and the offset correction
  • the classification method used can be the SVM - Supporting Vector Machine, LDA - Linear Discriminant Analysis, KNN Nearest Neighbor Classification or ANN-Artificial Neural Networks Method. Other methods, such as e.g. Non-linear methods / methods or supporting devices or SIMCA may be used.
  • the LDA classifies several spectral ranges, ie the intensity values of these ranges,
  • step of the verification whereby for this a reference spectra set with reference spectra "male” and reference spectra "female” with known sexual assignment is needed.
  • the algorithm compares the spectrum with other spectra of the sex class and checks the similarity of the unknown spectrum with the known stored spectra.
  • the method according to the invention and the associated device preferably use the Raman spectra of blood of extraembryonic blood vessels for non-invasive in-ovo sex determination in the incubated bird's egg 1.
  • Laser light 3a > 600 nm, e.g. HeNe laser 633 nm, solid-state laser (Nd based, for example, Nd: YAG 1064nm laser, VIS NIR diode laser, e.g., 785 nm),
  • Raman scattering measurements are made using large numerical aperture optical devices 5 such as microscope objectives 6 or a Raman fiber probe 5,
  • spectrometers 8 in the form of dispersive Raman spectrometers and Fourier transform Raman spectrometers.
  • CAM chorioallantoic membrane
  • the blood vessels 21 form from the second day of incubation. About the third day of incubation, the embryonic blood circulates in the bloodstream. In this time range, the measurement is performed for sex determination.
  • the embryo By the fourth gross day, the embryo, including the extraembryonic structures, is mobile in egg 1, i. they are not fixed to the calcareous shell 28.
  • the measuring procedure is carried out as follows:
  • the vision system 34 preferably with an inline vision camera 13 and a coaxial or lateral illumination with visible light 10a from a light source 10.
  • the visible light 10a may be white light, but the contrast is improved blue and / or green light.
  • the vision camera 13 receives the light 0b.
  • Second variant a measurement takes place for the third gross day.
  • a classification is carried out to identify the gender of the respectively measured incubated bird egg 1 in the evaluation unit 9.
  • non-linear CARS spectroscopy can be used for gender determination.
  • Coherent Anti-Stokes Raman Scattering belongs to the nonlinear Raman scattering.
  • CARS spectroscopy uses a multi-photon process to excite molecular vibrations and generate a coherent signal.
  • CARS a signal is obtained which is orders of magnitude stronger than that of the spontaneous Raman emission (factor 10 5 ), which leads to a shorter measuring time leads.
  • the CARS signal is blue shifted from the excitation wavelength and therefore free of fluorescence.
  • the excitation takes place by means of ultrafast NIR lasers, so that the penetration depth is comparable to the penetration depth in NIR Raman spectroscopy and photodamage is minimized.
  • the sensitivity is not limited by the detection of the CARS photons, but rather by the distinction between resonant and non-resonant parts of the CARS signal.
  • the Raman spectrum can be obtained from the CARS spectrum by a modified Kramers-Kronig transformation or by special computational methods based on the assumption of maximal entropy.
  • the CARS spectrum of the blood of the blood vessel 21, 27 is detected using the same acquisition configuration as for the spontaneous radar spectroscopy depending on the breeding time, with or without fiber optics,
  • the CARS signal can be generated by a broadband femto-second laser as laser source 3 serving as a pump laser and a Stokes laser.
  • the CARS signal can also be generated by two laser sources 3, a broadband laser and a narrowband laser (multiplex CARS),
  • the CARS spectra are used for classification.

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Ramanspektroskopischen in-ovo Geschlechtsbestimmung von befruchteten und bebrüteten Vogeleiern (1), wobei der Embryo einschließlich der extraembryonalen Strukturen beweglich im Ei ist, und zum Zeitpunkt einer Messung noch nicht an der Kalkschale fixiert ist. Dabei werden folgende Schritte durchgeführt: - Überwachung des Zeitverlaufs des Bebrütens bis zur Ausbildung mindestens eines erkennbaren Blutgefäßes (21), - Schaffung eines Lochs (2) in der Kalkschale im Nahbereich des fixierten Blutgefäßes mittels einer Locherzeugungseinheit; - Suchen der sich im Ei ausbildenden Blutgefäße mittels eines Visions-Systems (19, 13) und einer koaxialen oder lateralen Beleuchtung mit Licht (10a) des sichtbaren Wellenlängenbereiches, - Positionieren zumindest eines Blutgefäßes in den Laserfokus einer Laserquelle (3) entweder durch Bewegen des Eis oder Bewegen eines Objektivs (6) einer Vorrichtung (5) zur Einbringung des Laserlichts (3a) und Erfassung der Ramanstreustrahlung (7), - Registrieren der Ramanstreustrahlung des bestrahlten Blutgefäßes mittels der Vorrichtung zur Einbringung des Laserlichts und zur Erfassung der Ramanstreustrahlung, wobei während der Messung eine Bewegung des Blutgefäßes aus dem Fokus heraus durch Nachführung mittels des Visions-Systems vermieden werden kann, - Auswertung der Ramanstreustrahlung in einer Auswerteeinheit, - Bestimmung und Anzeige des Geschlechtes des Embryos im Vogelei.

Description

Verfahren und Vorrichtung zur Ramanspektroskopischen in-ovo
Geschlechtsbestimmung von befruchteten und bebrüteten Vogeleiern
Die Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Ramanspektroskopischen in-ovo Geschlechtsbestimmung von befruchteten und bebrüteten Vogeleiern.
In der Druckschrift DE 10 2010 006 161 B3 sind ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Bestimmung des Geschlechts von befruchteten und nicht bebrüteten Vogeleiern beschrieben, wobei ein Ei zumindest eine feste Kalkschale, ein von der Kalkschale und weiteren Eihüllen umgebenes Eidotter und eine dem Eidotter zugeordnete Keimscheibe enthält, wobei eine Sonde zur Messung eines Spektrums durch ein Loch der Kalkschale hindurch in Richtung zur Keimscheibe mit Keimscheibenzellen geführt wird,
wobei das Verfahren folgende Schritte aufweist:
- Positionierung der Sonde im Bereich der Keimscheibe,
- spektroskopische in-ovo Charakterisierung der Keimscheibenzellen,
- Erkennung des Geschlechts durch eine automatische Klassifizierung der re- flektiven Spektren, wobei als Sonde ein optischer Kristall eingesetzt wird, mit dem eine schnelle und rückwirkungsfreie Aufnahme eines Infrarot- und/oder Nahinfrarotspektrums bei Nutzung der abgeschwächten Totalreflexion innerhalb des optischen Kristalls durch das evaneszente Feld im Bereich der Keimscheibe durchgeführt wird, wobei die Extinktion infolge einer spektralen Absorption von geschlechtsspezifischen Keimscheibenzellen erfolgt,
wobei die Positionierung des optischen Kristalls durch eine permanente automatische Auswertung der rückgeführten Spektren bis zur Bestimmung von geschlechtsspezifischen Keimscheibenzellen begleitet wird, bis das Spektrum aus- gewertet und das Geschlecht des befruchteten Eies eindeutig angezeigt wird.
Während des Positionierungsvorgangs werden permanent rückgeführte IR- und/oder NIR-Spektren aufgezeichnet und einer Auswertung zugeführt, wobei eine automatische Klassifizierung der Spektren anhand des spektralen Fingerab- druckes zum Beispiel in Proteinen, Lipiden und Nukleinsäuren erfolgt.
Bei der geschlechtsspezifischen Absorption des einfallenden IR- und/oder NIR- Lichts werden die Keimscheibenzellen anhand von Absorptionsbanden der Nukleinsäuren (DNA und RNA) sowie weiterer biochemischer Verbindungen derart identifiziert, dass das Geschlecht des geprüften Eies bestimmt und angezeigt wird.
Die Messung kann mit einer herkömmlichen Infrarot-Spektroskopie durchgeführt werden.
Die in der Druckschrift DE 10 2010 006 161 B3 beschriebene zugehörige Vorrichtung enthält
- mindestens eine Eipositions-Auflage zur Arretierung mindestens eines Eies,
- mindestens eine Höhenverstelleinrichtung mit mindestens einem Haltearm, - mindestens einen als Sonde ausgebildeten optischen Kristall, der an dem Haltearm befestigt ist,
- mindestens eine Steuereinheit für die eiarretierende Eipositions-Auflage und für die Höhenverstelleinrichtung, - mindestens eine auf mindestens einen Wellenlängenbereich bezogene spektrale Lichtquelle, die einen IR- und/oder NIR-Lichtstrahl aussendet,
- mindestens einen Detektor zur Aufnahme des rückgeführten IR- und/oder NIR-Lichtstrahls,
- mindestens ein optisches Element zur geführten Strahlführung zwischen der Lichtquelle und dem optischen Kristall und zur rückgeführten Strahlführung vom optischen Kristall hin zum Detektor, sowie
- eine mit dem Detektor verbundene Auswerteeinheit und eine Anzeigeeinheit, wobei mit der Höhenverstelleinrichtung die Höhe des Haltearms und somit des optischen Kristalls in Bezug auf den Ort der Keimscheibe einstellbar ist und der optischen Kristall im Bereich der Keimscheibe in einer Scheibenzuordnungsposition positionierbar ist, in der über den optischen Kristall ein sich bei Totalreflexion an der zur Keimscheibe gerichteten Ausgangsfläche ausbildendes evaneszentes Feld auf die Keimscheibe übergreift und die darin befindlichen Keimscheibenzel- len wechselwirkend mit dem evaneszenten Feld eine geschlechtsspezifische Absorption des Licht aus dem einfallenden Strahlengang vornehmen, wobei das an der Ausgangsfläche totalreflektierte Licht über den rückgeführten Strahlengang innerhalb des Kristalls und schließlich über das optische Element zur Registrierung zum Detektor geführt ist, von dem aus die registrierten spektralen Signale zur Auswertung und Anzeige des Geschlechts übermittelt werden.
In der Druckschrift DE 10 2007 013 107 A1 wird ein DNA relevantes Zellmaterial durch Schwingungsspektroskopie analysiert, um das Geschlecht von Vogeleiern anhand von DNA-Unterschieden zu bestimmen: Entweder im Ei nach Öffnung mit einer Sonde oder nach Entnahme des Materials aus dem Ei und Deposition auf einem Substrat. Die UV-Resonanzraman-Spektroskopie wird bei Wellenlängen von 244 nm oder 254 nm festgelegt. Dabei wird eine Spektrenklassifikation mit allen existierenden überwachten und nichtüberwachten Verfahren durchgeführt:
- mit einem DNA-relevanten Material, mit speziellem Bezug zur Federpulpa und der Keimscheibe und
- einer UV-Raman-Spektroskopie bei einer Wellenlänge von 244 nm oder 257 nm. Bei diesem Verfahren wird somit DNA-relevantes Zellmaterial des geschlechtlich zu bestimmenden Vogels mit Licht untersucht und die Molekülschwingungen gemessen, wobei das durch das Licht entstehende Spektrum der Molekülschwingungen erfasst und mit vorgegebenen sowie geschlechtsspezifische DNA- Strukturen der zu untersuchenden Vogelart repräsentierenden Referenzspektren verglichen wird und wobei aus diesem Spektralvergleich eine auf Grundlage des DNA-Gehalts des Zellmaterials basierende Geschlechtszuordnung des Vogels getroffen wird.
Die Molekülschwingungen werden dabei mittels Anwendung der Raman- Spektroskopie oder der IR-Spektroskopie gemessen, wobei z.B. das DNA- relevante Zellmaterial aus dem Schaft einer jungen Feder eines Vogels entnommen werden kann. Das Zellmaterial wird auf einem Träger präpariert und mit Licht abgetastet. In einem anderen in der Druckschrift DE 10 2007 013 107 A1 beschriebenen Teilverfahren wird das Licht zur Messung der Molekülschwingungen des DNA- relevanten Zellmaterials von ungeschlüpften Vögeln durch die Eierschale hindurch auf den Embryo oder die Keimscheibe fokussiert, wobei das Spektrum der durch die Molekülschwingungen entstehenden Strahlung im Ei mit einer durch dessen Schale hindurch geführten Sonde gemessen wird.
Für die Hindurchführung der Sonde wird zur Messung des Spektrums wenigstens ein mikroskopisch kleines Loch durch die Eischale hindurch gebohrt. Das Licht wird durch den kleinen Zugang durch die Eischale unmittelbar auf die Keimscheibe als Zellmaterial fokussiert. Durch den gleichen oder einen anderen Zugang geringer Öffnungsgröße wird die Sonde eingeführt, mittels der das reflektierte und von der Sonde aufgenommene Spektrum der vorgenannten Molekülbewegung im Innern des Eis gemessen wird.
Die erhaltenen spektralen Informationen werden in einem zweiten Schritt mit ge- schlechtsspezifischen Referenzdaten verglichen und einem Klassifizierungsalgorithmus zugeführt. Diese repräsentieren vorzugsweise statistisch gewonnene Daten über die zu untersuchenden Vogelspezies. Aus diesem Vergleich wird die Geschlechtszuordnung des zu untersuchenden DNA-Materials getroffen. Ein Problem besteht darin, dass für die Einbringung einer Sonde in vorgefertigte Löcher bei einer sehr großen Anzahl von zu untersuchenden Vogeleiern ein großer zeitlicher Aufwand erforderlich ist. Außerdem muss bei einer Fokussierung des Lichts aus der Sonde auf die Keimscheibe ein erheblicher Justierungsaufwand für eine optische Abbildung in Bezug auf den Ort der Keimscheibe betrieben werden, wobei von Ei zu Ei die Fokussierungsebene eine andere Lage aufweisen kann und damit keine Bestimmung des Geschlechts durchgeführt werden kann.
Problematisch an diesen Untersuchungen ist weiterhin, dass das zur Untersuchung der Keimscheiben notwendige Einbringen der Löcher in die Kalkschale einschließlich der Eischalenmembran am Tag„Null" zu einer Beeinträchtigung der Emryonalentwicklung und zu stark sinkenden Schlupfraten führt, wie in den Druckschriften S. Klein: Analysis of chicken embryonic development after removal of blastodermal cells for sexing. British Poultry Science (39), 1998, S. 482-487; einschließlich darin zitierter Literatur: J. Brake, T. W. (1997). Egg handling and storage. Poultry science (76), S. 144-151 beschrieben ist. In der Druckschrift WO 2014/021715 A2 wird eine Geschlechtsbestimmung von Vogelembryonen beschrieben, wobei das Verfahren durchgeführt wird mittels a) Detektion einer Markerverbindung von Zuckern und Aminosäuren, Vorstufen und Metaboliten in der Allantoisflüssigkeit des Eies am 8.-1 1. Bruttag, b) Quantitative Bestimmung des Markers mittels NMR-Spektroskopie, c) Geschlechtsbestimmung durch Vergleich der Menge des Markers zu einem vorgegebenen Ausgangswert.
Dabei erfolgt eine
- Bestimmung der absoluten Mengen oder von Mengenverhältnissen von Verbindungen (Glukose, Cholin, Valin), um sie mit einem Basiswert zu vergleichen, - Anwendung von unsupervised chemometrischen Verfahren (wie least- square modeling oder PCA) auf quantitative Mengen oder Mengenverhältnissen zur Geschlechtsbestimmung.
Ein wesentlicher Nachteil des Verfahrens besteht darin, dass eine Entnahme mindestens einer Probe aus dem Ei erfolgt.
In den Druckschriften US 8 364 247 B2 und EP 2 336 751 A1 wird ein Verfahren zur Bestimmung des Geschlechts an Vogeleiern beschrieben, bei dem mit einer Strahlungsquelle elektromagnetische Strahlung auf die Keimscheibe eines Eies emittiert und nach dem Abschalten der Strahlungsquelle am bestrahlten Bereich der Keimscheibe das Abklingverhalten der angeregten Eigenfluoreszenzintensität zeit- und spektralaufgelöst für mindestens eine Wellenlänge der Eigenfluoreszenz mit einem Detektor erfasst wird. Mit den ermittelten Intensitätsmesswerten wird die fraktale Dimension berechnet und der Wert der fraktalen Dimension DF mit einem art- und geschlechtsspezifischen Grenzwert verglichen; wobei bei Überschreiten des Grenzwertes das jeweilige Ei als weiblich und bei Unterschreiten als männlich eingestuft wird.
Die Ei-Öffnung am Tag„Null" führt zu stark reduzierten Schlupfraten. Es besteht weiterhin eine mögliche irreparable Schädigung der Keimscheibe durch die ein- gesetzte UV-Strahlung bei 337nm.
In der Druckschrift US 7 950 349 B1 wird ein Verfahren zur Bestimmung:
1) der Fruchtbarkeit eines Vogeleies durch Messung der Lumineszenz und der Biophotonenintensität (Photonen pro Sekunde) des Eies nach Einwirkung einer externen Lichtquelle und
2) des Geschlechtes eines Vogeleies durch Messen des Photonenspektrums der Biophotonenemission und Lumineszenz des Eies nach Einwirkung einer externen Lichtquelle
beschrieben.
Dabei kann die externe Lichtquelle entweder eine Glühlampe, Leuchtstofflampe, LED oder eine (gepulste oder CW) monochromatische oder dichromatische Laserlichtquelle sein. Der erste Teil des Verfahrens ergibt sich aus der Tatsache, dass nach Exposition mit der Lichtquelle, die fruchtbaren Vogeleier eine höhere Intensität der Photonen als die der unbefruchteten Vogeleier emittieren. Der zweite Teil des Verfahrens ergibt sich aus der Tatsache, dass nach Exposition mit den genannten Lichtquellen, Vogeleier des weiblichen Geschlechts ein anderes Spektrum von Photonen als Vogeleier des männlichen Geschlechts emittieren.
In den Druckschriften WO 2010/1031 11 A1 und US 2012/0058052 A1 werden ein nicht-invasives Verfahren und eine Vorrichtung zur in-ovo-Bestimmung des Geschlechts von Vogelarten beschrieben. Das Verfahren umfasst die Schritte der Einführung eines markierten Antikörpers in das Ei, der sich an ein geschlechts- spezifisches Antigen des Embryos anbindet, und die Detektion des markierten gebundenen Antikörpers mit einer Erfassungseinrichtung außerhalb des Eies.
In der Druckschrift US 7 041 439 B2 werden ein Verfahren und eine Vorrichtung für die automatisierte Prozessführung von Eiern nach ausgewählten Charakteris- tika (z.B. des Geschlechtes) beschrieben, wobei folgende Schritte ablaufen: a) Extraktion von Probenmaterial (Allantoisflüssigkeit, Eiweiß, Eigelb, Eischale, Albumin, Gewebe, Membran und / oder Blut),
b) Analyse des extrahierten Materials zur Bestimmung der ausgewählten Charakteristika und
c) selektive Prozessführung der identifizierten Eier.
Beispielsweise wird darin ein Verfahren zur Verarbeitung von Eiern auf der Basis des Geschlechts dargestellt, welches aus folgenden Schritten besteht:
1) Identifizierung lebender Eier,
2) Extraktion von Allantoisflüssigkeit aus den als lebend identifizierten Eiern, 3) Ermittlung des östrogengehaltes und einer Farbveränderung in der extrahierten Allantois-Flüssigkeit zur Geschlechtserkennung,
4) selektive Injektion eines Impfstoffs in Abhängigkeit des Geschlechtes.
Ein Nachteil besteht darin, dass die Untersuchung der Allantoisflüssigkeit am Tag 13 bis 18 erfolgt. Auch hier ist eine Probenentnahme notwendig.
In der Druckschrift US 6 365 339 B1 ist ein Verfahren zur Geschlechtsbestimmung von Vogelembryonen beschrieben, bei dem während des Brutprozesses nach Aufbohren der Kalkschale Proben von der Allantoisflüssigkeit des Embryos genommen und in einem lonenmobilitätsspektrometer (IMS) analysiert werden. Die resultierenden Spektren enthalten relevante Markerpeaks, die mit geschlechtsspezifischen Mobilitäten korrelieren.
Ein Nachteil besteht darin, dass auch hier Proben entnommen werden müssen, die einen höheren Aufwand zumindest im Umfeld zur Geschlechtsbestimmung bedingen.
In den Druckschriften WO 2010/150265 A3 und US 2013/0044210 A1 wird ein Verfahren zur Geschlechtsbestimmung unbebrüteter Vogeleier durch hyperspekt- rale Analyse optischer Spektren (bevorzugt Reflexionsspektren) beschrieben. Die Analyse erfolgt in einem Spektralbereich mit Wellenlängen bis zu 2500 nm (MIR), um das vom CaC03 der Kalkschale des Eies erzeugte Signal bei 2340 nm herausfiltern zu können. Das Verfahren ermöglicht es, biologische Komponenten, andere als Blut, zu detektieren und ermöglicht sowohl die Erfassung der Frucht- barkeit vor dem zweiten Bebrütungstag als auch die Bestimmung des Geschlechts der Küken im Ei am zwölften Bebrütungstag. Die Sensitivität konnte durch die Verwendung einer neuronalen Netzwerkanalyse erhöht werden. Mittels der Hauptkomponentenanalyse (PCA) werden die spektralen Merkmale bestimmt, die für die Varianzen zwischen den unbefruchteten Kontrolleiern und den Probeneiern verantwortlich sind. Mittels einer neuronalen Netzwerkanalyse auf der Grundlage der PCA-Ergebnisse werden dann die kleinen, aber signifikanten Veränderungen zwischen den Kontroll- und experimentellen Eier erhalten. Die Methode ermöglicht die Bestimmung der Fruchtbarkeit mit mehr als 90% Genauigkeit am Tag„Null" (Tag der Eiablage) und des Geschlechtes der Küken mit mehr als 75% Genauigkeit am zwölften Bruttag.
Ein Nachteil besteht darin, dass mit dem Verfahren eine Geschlechtsbestimmung erst am 12. Tag durchgeführt werden kann.
In der Druckschrift US 6 029 080 B1 werden ein nichtinvasives Verfahren und eine Vorrichtung zur Geschlechtsbestimmung von Vogeleiern dargestellt, bei dem mittels magnetischer Kernresonanz (NMR) bestimmt wird, ob der lebende Embyo im Ei männliche Geschlechtsorgane oder weibliche Geschlechtsorgane aufweist. Ein Nachteil besteht darin, dass die Ausbildung der Geschlechtsorgane erst im entwickelten Embryo nach wesentlichen mehreren Tagen erfolgt, wobei zumindest die Durchführung eines hohen finanziellen Aufwandes bedarf.
In der Druckschrift US 6 506 570 B1 wird zur in-ovo Geschlechtsbestimmung von Vogeleiern die An- oder Abwesenheit eines erhöhten geschlechtsspezifischen Hormonspiegels, vorzugsweise des Östrogenspiegels, in einer extraembryonalen Flüssigkeit, vorzugsweise der Allantoisflüssigkeit, bestimmt. Das Verfahren wird vorzugsweise auf Hühnereier angewendet und kann vor oder während der Umla- gerung aus dem Vorbrüter in den Schlupfschrank durchgeführt werden.
In der Druckschrift DE 10 2012 023 947 A1 ist ein Verfahren zur Strukturaufklärung durch eine optisch undurchsichtige Barriere eines biologischen Untersu- chungsobjektes hindurch beschrieben. Bei dem Untersuchungsobjekt wird eine innere Struktur mit unterschiedlichen dielektrischen Eigenschaften mittels elektromagnetischer Spektralanalyse aufgeklärt,
wobei das Untersuchungsobjekt unter einem Array von Pulssendern und Empfängern, welche in einer Ebene angeordnet und daten- sowie informationsleitend mit einem Computersystem verbunden sind, positioniert wird,
wobei durch die Pulssender elektromagnetischen Pulse im Spektralbereich 0,01 bis 1 THz auf das positionierte Untersuchungsobjekt ausgesendet werden, wobei die vom Untersuchungsobjekt ausgehende Strahlung von den Empfängern aufgenommen und dem Computer über daten- sowie informationsleitende Ver- bindungen für ein bildgebendes Verfahren zugeleitet wird.
Da die THz-Strahlung sehr schwach ist, treten lange Messzeiten auf, die zur Durchführung einer schnellen Geschlechtsbestimmung hinderlich sind. Außerdem erfordert eine starke Absorption von begleitendem Wasserdampf im THz- Bereich eine extrem niedrige bzw. konstante Luftfeuchtigkeit in der Brüterei, was wiederum einen hohen technischen Zusatzaufwand bedeutet.
In der Druckschrift DE 20 2013 011 765 U1 ist eine spektralphotometrische Analyse der Federfarbe von Hühnerembryos beschrieben. Dabei wird elektromagnetische Energie mit einer Wellenlänge zwischen etwa 380nm und 740nm zur nicht invasiven Bestimmung der Geschlechts von Vogelembryos verwendet, wobei ein Vogelei der elektromagnetischen Energie ausgesetzt und die Menge an Absorption, Diffusion, Refraktion, Reflexion oder einer beliebeigen Kombination davon der elektromagnetischen Energie durch das Vogelei bestimmt wird. Es wird über das Vorliegen oder Fehlen von Farbpigment im Inneren des Vogeleies das Geschlecht des Vogelembryos wenigstens teilweise bestimmt.
Die spektralphotometrische Analyse der Federfarbe von Hühnerembryos kann nur auf braue Rassen bzw. auf Rassen mit Farbunterschied von weiblichen Küken oder männlichen Küken angewendet werden.
Im Folgenden wird eine Zusammenfassung der Nachteile der Verfahren aus den genannten Druckschriften angegeben:
1. die Geschlechtsbestimmung am Tage„Null" bedingt einen Zugang zur festgestellten Position der Keimscheibe, was nach bisherigen Erfahrungen eine Beeinträchtigung der Embryonalentwicklung und stark sinkende Schlupfraten mit sich bringen.
2. bei der späten Geschlechtbestimmung mit Inkubationstagen von 7 bis 21 Tagen spielen erstens tierschutzrechtliche Aspekte
- wobei ab dem 7. Inkubationstag das Schmerzempfinden des Vogelembry- os beginnt und
- wobei ein spätes Abtöten weit entwickelter Vogelembryonen durchgeführt wird, weil mit steigender Inkubation der Ei-Inhalt aus dem Vogelembryo selbst besteht,
und zweitens ökonomische Aspekte
- wobei bei der späten Geschlechtsbestimmung die männlichen Eier länger im Brutschrank sind, was eine weitgehend schlechtere Auslastung der Brutschränke und somit höhere Stromkosten bedingen
eine wesentliche Rolle.
3. Bei einer Geschlechtsbestimmung mit einer Entnahme von Probenmaterial können folgende Probleme auftreten:
- die nach jeder Messung notwendige zusätzliche Reinigung und Desinfektion bzw. Ersatz von Geräten oder Geräteteilen (z.B. Kanülen) erhöht laufende Verbrauchskosten deutlich, - es ergibt sich eine erschwerte Automatisierbarkeit gegenüber kontaktlosen Verfahren und
- das Infektionsrisiko wird stark erhöht, so dass sich eine Gefahr der reduzierten Schlupfraten ergeben kann.
Alle in den oben genannten Druckschriften beschriebenen Verfahren und Vorrichtungen zur Geschlechtsbestimmung können in die schematisch in Fig. 1 dargestellten Auswertungs-Ebenen-Bereichsdarstellung 33 innerhalb der beiden inneren geschlossenen Gebiete 30, 31 der in Fig. 1 dargestellten drei Gebiete 30, 31 , 32 eingeordnet werden. Die bekannten Verfahren umfassen in der Ebenen- Bereichsdarstellung 33 aber nicht den Restbereich 32, auf dem sich das vorliegende erfindungsgemäße Verfahren favorisiert.
In der Druckschrift: "Vibrational imaging and microspectroscopies based on co- herent anti-Stokes Raman scattering microscopy", Andreas Volkmer, J. Phys. D: Appl. Phys. 38 (2005) R59-R81 doi:10.1088/0022-3727/38/5/R01", einschließlich der darin enthaltenen Referenzen, wird die kohärente Anti-Stokes-Raman- Streuung Spektroskopie (Coherent Anti-Stokes Raman Scattering (CARS) spectroscopy) Theorie beschrieben, die zur nichtlinearen Ramanspektroskopie gehört. Mittels CARS-Spektroskopie werden die gleichen Molekülschwingungen wie bei der linearen Ramanspektroskopie untersucht.
Aber ein wesentlicher Unterschied zwischen der linearen und nichtlinearen Ramanspektroskopie besteht jedoch in der besonderen Anregungsart. Bei der CARS-Spektroskopie wird ein Multi-Photonen-Prozess zur Anregung der Mole- külschwingungen genutzt und ein kohärentes Signal erzeugt. Im Ergebnis wird mittels CARS ein Signal erhalten, welches um Größenordnungen stärker als das der spontanen Ramanemission der linearen Ramanspektroskopie ist (Faktor 105), was zu einer kürzeren Messzeit führt. Weiterhin ist das CARS-Signal blau verschoben und deshalb frei von Fluoreszenz.
Die Anregung erfolgt mittels ultraschneller NIR-Laser, sodass die Eindringtiefe vergleichbar mit der Eindringtiefe bei der NIR-Ramanspekrtroskopie ist und dadurch Lichtschäden minimiert sind. Die Sensitivität wird nicht durch die Detektion der CARS-Photonen limitiert, sondern eher durch die Unterscheidung zwischen resonanten und nichtresonanten Anteilen des CARS-Signals. Verschiedene bekannte Verfahren existieren zum Separieren des resonanten Anteiles durch spezielle Konfigurationen zur Anre- gung/ Sammlung des Lichtes:
- Die polarisationssensitive Detektion,
- die zeitaufgelöste Detektion und
- die spektrale und räumliche Phasenkontrolle.
Alternativ kann das Ramanspektrum aus dem CARS-Spektrum durch eine modi- fizierte Kramers-Kronig-Transformation oder durch spezielle Rechenmethoden, basierend auf der Annahme maximaler Entropie, erhalten werden.
Verschiedene Anwendungen der Hochgeschwindigkeits-CARS-Spectroskopie sind in den Druckschriften:
„Unterscheidung biochemischer Komponentendiscrimination" A. Dogariu, Y. Hu- ang, Y. Avitzour, R. K. Murawski, and M. O. Scully, und
"Sensitive femtosecond CARS discrimination between 2,6 Dipicolinic acid and 3,5 Dipicolinic acid," Opt. Lett., Vol. 31, No. 21, 3176 (2006);
Y. Huang, A. Soroka, K. Cohen, and A. Dogariu, und
"Backscattered Coherent Anti-Stokes Raman Scattering for At Range Detection of Dipicolinic Acid and Four-Wave Mixing Multiple Scattering," J. Mod. Optics Vol. 54, No. 16, 2473 (2007)), und
"Detektion von Bakterien" D. Pestov, X. Wang, G. O. Ariunbold, R. K. Murawski, V. A. Sautenkov, A. Dogariu, A. V. Sokolov, and M. O. Scully, und
"Single-shot Detection of Bacterial Endospores via Coherent Raman Spectros- copy," Proc. Nat. Acad. Sei. USA 105, 422 (2008); und
A. Dogariu, A. Goltsov, D. Pestov, A. V. Sokolov, and M. O. Scully, und "Realtime detection of bacterial spores using Coherent anti-Stokes Raman Spectros- copy," J. Appl. Phys. 103, 036103 (2008) und
die Echtzeitdetektion von Sprengstoffen in der Druckschrift
Coherent Anti-Stokes Raman Spectroscopy for detecting explosives in real-time, Arthur Dogariu and Alex Pidwerbetsky, Proc. of SPIE Vol. 8358, doi: 10.1117/12.919568) beschrieben. Das genannte Ramanspektroskopische Verfahren kann ebenso an CARS- Spektren von Blut in Echtzeitmessungen demonstriert werden. Die CARS Schwingungsspektren der roten Blutzellen können in wenigen Picolitern und Milli- Sekunden registriert werden, wie in folgenden Druckschriften
A. Dogariu, A. Goltsov, and M. O. Scully, "Real-time monitoring of blood using coherent anti-Stokes Raman spectroscopy," J. Biomed. Opt. 13, 54004 (2008) und Rinia HA, Bonn M, Vartiainen EM, Schaffer CB, Müller M: Spectroscopic analysis of the oxygenation State of hemoglobin using coherent anti-stokes raman scattering. J. Biomed. Opt. 11(5):050502-050502-3 beschrieben ist.
Der Erfindung liegt deshalb die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Ramanspektroskopischen in-ovo Geschlechtsbestimmung von befruchteten und bebrüteten Vogeleiern anzugeben, die derart geeignet ausgebildet sind, dass das Geschlecht bereits in den Eiern schnell und zuverlässig eindeutig bestimmt werden kann, wobei sich der weibliche Embryo normal weiterentwickeln und es zum Schlupf des weiblichen Kükens kommen kann.
Die Aufgabe wird durch die Merkmale der Patentansprüche 1 , 5 und 30 gelöst. Das Verfahren dient zur Ramanspektroskopischen in-ovo Geschlechtsbestimmung von befruchteten und bebrüteten Vogeleiern, wobei der sich ausbildende Embryo einschließlich der extraembryonalen Strukturen beweglich im Ei und noch nicht an der Kalkschale fixiert ist,
wobei gemäß dem Kennzeichenteil des Patentanspruchs 1
folgende Schritte durchgeführt werden:
- Überwachung des Zeitverlaufs des Bebrütens bis zur Ausbildung mindestens eines erkennbaren Blutgefäßes,
- Schaffung eines Lochs in der Kalkschale zumindest im Nahbereich des fixierten Blutgefäßes mittels einer Locherzeugungseinheit mittels eines Lasers o- der mittels mechanischer Perforation,
- Suchen der sich im Ei ausbildenden Blutgefäße mittels eines Vision-Systems und einer koaxialen oder lateralen Beleuchtung mit Licht im sichtbarem Wellenlängenbereich, - Positionieren zumindest eines Blutgefäßes in den Laserfokus einer Laserquelle entweder durch Bewegen des Eies oder eines Objektives,
- Registrieren der Ramanstreustrahlung des bestrahlten Blutgefäßes, wobei während der Messung eine Bewegung des Blutgefäßes aus dem Fokus her- aus durch Nachführung der Gefäße oder eines Objektivs erfolgen kann,
- Auswertung der Ramanstreustrahlung in einer Auswerteeinheit,
- Bestimmung des Geschlechts und Anzeige des Geschlechtes des Embryos im Vogelei.
Das Einbringen eines Loches in die Kalkschale mittels einer Locherzeugungseinheit in Form eines Lasers oder mechanischer Perforation kann am nach oben gerichteten, spitzen Pol des Eies mit Durchmessern mit bis zu 18mm, vorzugsweise zwischen 8mm und 15mm durchgeführt werden. Das Licht im sichtbaren Wellenlängenbereich kann weißes Licht sein, jedoch wird der Kontrast verbessert bei Einsatz von blauem und/oder grünem Licht aus einer Lichtquelle.
Während der Messung kann eine Bewegung des Blutgefäßes aus dem Fokus heraus durch Nachführung der Blutgefäße oder des zugehörigen Objektivs, ausgelöst durch das überwachende Vision-System, erfolgen.
Ein zweites Verfahren dient zur Ramanspektroskopischen in-ovo Geschlechtsbestimmung von befruchteten und bebrüteten Vogeleiern, wobei die extraembryo- nalen Strukturen nicht mehr frei beweglich sind, sondern eine Fixierung der Cho- rioallantoismembran (CAM) an der Kalkschale beginnt,
wobei gemäß dem Kennzeichenteil des Patentanspruchs 5
folgende Schritte durchgeführt werden:
- Überwachung des Zeitverlaufs des Bebrütens solange, bis eine Fixierung der Chorioallantoismembran (CAM) an der Kalkschale beginnt und bereits Blutgefäße vorhanden sind,
- Identifikation der Blutgefäßposition mittels Durchleuchtung mit Licht des sichtbaren Wellenlängenbereiches, - Einbringen eines Loches in die Kalkschale zumindest im Nahbereich des fixierten Blutgefäßes mittels einer Locherzeugungseinheit in Form eines Lasers oder mechanischer Perforation,
- Positionieren der Blutgefäße in den Laserfokus einer Laserquelle entweder durch Bewegen des Eies oder eines Objektives,
- Registrieren der Ramanstreustrahlung zumindest eines bestrahlten Blutgefäßes, wobei die Messung des Blutes in den Kapillaren oder in größeren Gefäßen innerhalb oder unterhalb der Chorioallantoismembran (CAM) durchgeführt wird,
- Auswertung der Ramanstreustrahlung in einer Auswerteeinheit,
- Bestimmung des Geschlechtes und Anzeige des Geschlechtes des Embryos im Vogelei.
Das Licht des sichtbaren Wellenlängenbereiches kann weißes oder blaues oder grünes oder blaues und grünes, Kontrast erzeugendes Licht aus einer Lichtquelle sein.
Durch das Einbringen eines Loches in die Kalkschale mittels eines Lasers oder mittels mechanischer Perforation können Löcher mit Durchmessern mit bis zu 5mm, vorzugsweise zwischen 0,1 mm und 3mm ausgebildet werden,
Nach den jeweiligen Messabläufen und Verfahrensschritten erfolgt in der Auswerteeinheit eine Klassifizierung zur Erkennung des Geschlechtes des jeweils ausgemessenen bebrüteten Vogeleies vor der Anzeige des Geschlechtes.
Damit kann die Ramanstreustrahlung von Blut extraembryonaler Blutgefäße und/oder von Blut embryonaler Blutgefäße zur nicht invasiven in-ovo Geschlechtsbestimmung im bebrüteten Vogelei genutzt werden. Folgende Parameter werden für die Ramanspektroskopie eingesetzt: Anregungswellenlängen des Laserlichts der Laserquelle für die Ra- manspektroskopie: > 600 nm, z.B. HeNe-Laser 633 nm, Festkörperlaser (Nd basiert z.B. Nd:YAG Laser 1064nm, VIS NIR Diodenlaser z.B. 785 nm), Einkopplung des Laseranregungsstrahles direkt mit Spiegeln und/oder mit optischen Fasern,
Ramanstreustrahlungsmessungen werden unter Nutzung von optischen, mit großer numerischer Apertur NA ausgebildeten Systemen wie Mikroskop- Objektiven oder einer Raman-Fasersonde durchgeführt,
Direkte Auskopplung der gesammelten Ramanstreustrahlung mit Spiegeln zum Spektrometer oder für den Transport mit optischen Fasern,
Anwendung von dispersiven Ramanspektrometern und Fourier Transform Raman Spektrometern.
Zur Bildung der genutzten Blutgefäße und der sich gebildeten Chorioallantois- membran (CAM) kann im jeweiligen Messablauf angegeben werden, dass sich die Blutgefäße ab dem zweiten Bebrütungstag bilden und bis zum dritten Bebrü- tungstag das embryonale Blut im Blutkreislauf zirkuliert. Das bedeutet, dass eine sofortige Geschlechtsbestimmung sehr frühzeitig etwa ab dem dritten Bruttag zweckmäßig ist.
Während des Positionierungsvorgangs des Vogeleies können permanent rückgeführte Ramanspektren aufgezeichnet und einer Auswertung zugeführt werden, wobei eine automatische Klassifizierung der Ramanstreustrahlung anhand des spektralen Fingerabdruckes des Blutes erfolgt.
Das Ei wird vorzugsweise pollastig gestellt und ein Loch kann im Bereich des nach oben gerichteten spitzen Pols bei einer Lochgröße von 10 mm und bei drei Bruttagen eingebracht werden. Etwa ab dem fünften Tag beginnt die Chorioallan- toismembran an der äußeren Membran zu haften und es kann ein kleineres Loch in der Kalkschale bei Bruttagen mit länger als fünf Tagen, wobei das Loch auch horizontal möglich ist, eingebracht werden. Das Loch der Kalkschale des Eies gewährleistet den optischen Zugang zu dem erkannten blutdurchflossenen Blutgefäß.
Der Laserstrahl wird auf das ausgewählte Blutgefäß fokussiert und die Nachfüh- rung mittels eines Objektivs gegebenenfalls automatisch durchgeführt.
Die eingebrachte Leistung der Laserquelle darf nicht zu einer lokalen und globalen Erwärmung des Eies über 40° Celsius führen. Die Ramanstreustrahlung kann vorzugsweise mit einem Objektiv mit großer numerischer Apertur (NA > 0,3) registriert werden.
Die Ramanstreustrahlung kann mittels einer Raman-Fasersonde erfasst werden. Die erfasste Ramanstreustrahlung kann über Faserleitungen dem Spektrometer zugeführt werden.
Für die Auswertung der Ramanbanden in der Auswerteeinheit wird vorzugsweise der Bereich von 500 cm"1 bis 4000 cm"1 (Raman-Verschiebung) genutzt.
Die geschlechtsspezifischen Merkmale sind in den Ramanbanden der Nukleinsäuren, Kohlenhydrate, Lipide und Proteine enthalten, wobei die Ramanbanden einer mathematischen Analyse zugeführt werden. Für die mathematische Analyse können Verfahren der gestützten und nicht gestützten Klassifizierung eingesetzt werden, wobei die geschlechtsspezifischen Merkmale einer Merkmalstabelle abgelegt sind.
Die erfasste Ramanstreustrahlung kann in der Form korrigiert werden, dass Untergrundsignale durch Fluoreszenz oder andere Streuprozesse eliminiert werden und die Spektren in vorgegebener Form normiert werden. Zur Geschlechtsbestimmung kann somit neben Blut auch die mit Kapillargefäßen durchzogene Chorioallantoismembran (CAM) herangezogen werden.
Die Geschlechtsbestimmung kann an jedem Tag zwischen dem Beginn der Be- brütung und dem Schlupf vorgenommen werden, vorzugsweise in Bezug auf die Ausbildung der Blutgefäße etwa am dritten Bruttag bis zum fünften Bruttag.
Anstelle der linearen Ramanspektroskopie kann die nichtlineare Ra- manspektroskopie in Form der kohärenten Anti-Stokes-Raman-Streuung- Spektroskopie (CARS) genutzt werden, wobei das CARS-Spektrum vom Blut des Blutgefäßes unter Nutzung derselben Aufnahmekonfiguration wie für die spontane Ramanspektroskopie mit oder ohne Faseroptik aufgenommen wird.
Das CARS-Signal kann auch durch einen breitbandigen Femto-Sekundenlaser generiert werden, der als Pumplaser und als Stokeslaser dient.
Das CARS-Signal kann mittels zwei Laserquellen generiert werden, insbesondere mittels eines Breitbandlasers und eines Schmalbandlasers zur Nutzung und Auswertung einer multiplexen CARS-Spektroskopie.
Die CARS-Spektren können zur Klassifikation genutzt werden.
Der resonante Anteil des CARS-Spektrum [lm(Chi(3))] kann vom nichtresonanten Anteil [Re(Chi(3))] separiert und nur der resonante Anteil kann für die Klassifikati- on herangezogen werden.
Für die CARS-Spektroskopie kann eine gleiche Klassifikationsstrategie wie für die herkömmliche Ramanspektren durchgeführt werden. Als Vogeleier kommen hauptsächlich Hühnereier in Betracht, deren Geschlecht bestimmt wird. Die Vorrichtung zur Bestimmung der zur Ramanspektroskopischen in-ovo Geschlechtsbestimmung von befruchteten und bebrüteten Vogeleiern nutzt die vorgenannten Verfahren und umfasst
gemäß dem Kennzeichenteil des Patentanspruchs 30 zumindest
- eine Ei-Lagerungseinheit,
- eine Blutgefäß-Positions-Auswerteeinrichtung, die mit der Ei-Lagerungseinheit in Verbindung steht,
- eine Strahlungseinrichtung mit Licht aus dem sichtbaren Wellenlängen be- reich einer Lichtquelle zur Erkennung mindestens eines Blutgefäßes inner- halb der geöffneten Kalkschale,
- einen Detektor für das Licht zur Erkennung von Blutgefäßen, wobei der Detektor mit der Blutgefäß-Positionier-Auswerteeinrichtung in Verbindung steht, wobei die Strahlungseinrichtung und der Detektor zumindest ein Visions-System bilden,
- eine Locherzeugungseinheit zur Schaffung eines Lochs in der Kalkschale zumindest im Nahbereich des fixierten Blutgefäßes,
- eine Vorrichtung zur Einbringung von Laserlicht in die geöffnete Kalkschale, wobei die Vorrichtung zumindest in Verbindung steht mit
- einer das Laserlicht emittierenden Laserquelle, wobei das Laser- licht auf mindestens ein Blutgefäß fokussiert gerichtet ist,
- einem Spektrometer zur Aufnahme der Ramanstreustrahlung des
Blutes des vom Laserlicht bestrahlten Blutgefäßes über mindestens eine Leitung und
- einer Steuereinheit zu xyz-Positionierung der Vorrichtung auf das
in das Ei eingebrachte Loch,
- eine Geschlechtsbestimmungs-Auswerteeinheit, die mit dem Spektrometer und der Blutgefäß-Positionier-Auswerteeinrichtung in Verbindung steht und aus der verarbeiteten erfassten Ramanstreustrahlung des Spektrometers das Geschlecht des bebrüteten Vogeleies angibt.
Der erfindungsgemäßen Vorrichtung kann als Visions-System eine Einrichtung zur Feststellung der Lage von Blutgefäßen innerhalb des Eies zugeordnet sein. Die Einrichtung zur Feststellung der Lage eines Blutgefäßes ist über mindestens eine versorgungs- und signaltechnische Leitung mit der Steuereinheit verbunden.
Die Einrichtung zur Feststellung der Lage eines Blutgefäßes kann mit einer Hö- henverstelleinrichtung und der Ei-Lagerungseinheit in Verbindung stehen.
Die Einrichtung zur Feststellung der Lage eines Blutgefäßes, die Höhenverstell- einrichtung und die Ei-Lagerungseinheit können mit der Blutgefäß-Positions- Auswerteeinrichtung mittels programmtechnischer Mittel zur Durchführung einer Koordinierung der Lage des Blutgefäßes verbunden sein.
Die optische Vorrichtung kann eine flexible optische Faser sein.
Die Strahlungseinrichtung kann vorzugsweise grünes Licht zur Erkennung zu- mindest eines Blutgefäßes emittieren.
Die Auswerteeinheit kann programmtechnische Mittel zur Geschlechtsbestim- mungs-Auswertung der erfassten Ramanstreustrahlung und der erfassten CARS-Streustrahlung aufweisen.
Im Folgenden wird die Funktionsweise der erfindungsgemäßen Vorrichtung naher erläutert:
Über einem detektierten Blutgefäß wird ein Loch in die Kalkschale mittels einer Locherzeugungseinheit eingebracht. Auf das freigelegte Blutgefäß wird ein Laser fokussiert und vom gleichen Ort wird durch das Loch hindurch die Ramanstreustrahlung gesammelt und zurück zu einem Spektrometer zugeführt. Das alles geschieht unter Beobachtung, Überwachung und Kontrolle des mit sichtbarem/grünem Licht durchleuchteten Eies.
Mit einer ständigen Durchleuchtung des Eies kann eine zeitabhängige Bildung mindestens eines Blutgefäßes und der späteren Bildung auch der Chorioallan- toismembran (CAM) überwacht werden, so dass der Beginn des Messablaufs für den Einsatz des erfindungsgemäßen Verfahrens auf die zeitliche Ausbildung des Blutgefäßes und später auch der Chorioallantoismembran (CAM) abgestimmt werden kann.
Es kann die Detektion der Blutgefäße insbesondere bei weißen Eiern mittels Ein- satzes von weißem oder grünem Licht durchgeführt werden:
1. Variante: vom Bruttag 0 an bis maximal 4,5 Bruttage ist das Blutgefäßsystem einschließlich des Embryos noch beweglich. Nach der Öffnung des Eies erfolgt ein Absinken des Embryos und somit der Gefäße. Die Lage der Blutgefäße ist nach wenigen Minuten stabil, danach erfolgt eine Mes- sung über ein größeres Loch vorzugsweise etwa 10 mm.
2. Variante: vom Bruttag 4,5 bis Bruttag 21 beginnt sich die Chorioallantoismembran (CAM) zu entwickeln und die Chorioallantoismembran beginnt fest an der Kalkschale zu haften. Dann kann die Messung bei einem kleineren Loch mit 0,1 mm bis 4 mm Durchmesser durchgeführt werden.
Die Ramanstreustrahlung wird spektral zerlegt aufgezeichnet und mit vorgegebenen mathematischen Verfahren bearbeitet und gemäß dem Geschlecht klassifiziert. Zusammenfassend weist die Erfindung:
Verfahren und Vorrichtung zur Ramanspektroskopischen in-ovo Geschlechtsbestimmung von Vogeleiern, insbesondere von Hühnereiern,
folgende Schritte auf:
In einem geschlossenen und bebrüteten Ei wird mittels grünem oder weißem o- der blauem Licht die Lage von Blutgefäßen bestimmt und an vorgegebener Stelle wird ein Loch in die Kalkschale eingebracht, in dem mittels Laserstrahlung im roten oder nahen-infrarotem Spektralbereich die Ramanstreustrahlung von Blut oder Gewebe hinter der Kalkschale angeregt wird, sowie die Ramanstreustrah- lung/das Ramanstreulicht registriert, einer spektralen und statistischen Auswer- tung zugeführt und das Geschlecht anhand charakteristischer Markerbanden bestimmt werden. Für die Ramanspektroskopischen Messungen werden folgende Maßnahmen derart getroffen, dass
- das Ei bevorzugt steht und das Loch im Bereich des spitzen Pols eingebracht wird, wobei dies vor allem bei einer Lochgröße 10 mm bei drei Bruttagen er- folgt oder bei kleinerem Loch an Bruttagen > 5 Tage auch bei horizontaler Lage des Eies möglich ist,
- das Loch mittels eines Lasers oder mittels eines mechanischen Mittels in die Kalkschale eingebracht wird,
- das Loch der Kalkschale den optischen Zugang zu einem blutdurchflossenen Blutgefäß oder der Chorioallantoismembran (CAM) gewährleistet,
- der Laserstrahl auf das Blutgefäß fokussiert wird und gegebenenfalls automatisch nachgeführt wird (real-time tracking),
- die eingebrachte Leistung des Lasers nicht zu einer lokalen und globalen thermischen Schädigung führt,
- das Ramanstreulicht mit einem Objektiv mit großer numerischer Apertur (typische NA>0.3) gesammelt wird,
- das Ramanstreulicht mit einer Raman-Fasersonde aufgenommen wird,
- das aufgenommene Ramanstreulicht einem Spektrometer zugeführt wird,
- für die Auswertung der Ramanspektren vorzugsweise der Bereich von 500 bis 4000 cm-1 (Raman-Verschiebung) genutzt wird,
- die geschlechtsspezifischen Merkmale in den Ramanbanden verschiedener funktioneller Gruppen die z.B in Nukleinsäuren, Lipiden, Kohlenhydraten und Proteinen enthalten sind, die einer mathematischen Analyse zugeführt werden,
- für die mathematische Analyse Verfahren der gestützten und nicht gestützten Klassifizierung eingesetzt werden, wobei die geschlechtsspezifischen Merkmale in einer Merkmalstabelle abgelegt sind,
- die Ramanspektren in der Form korrigiert werden, dass Untergrundsignale durch Fluoreszenz oder andere Streuprozesse eliminiert werden und die Spektren in geeigneter Form normiert werden,
- zur Geschlechtsbestimmung neben dem Blut auch die von Blutkapillaren durchzogene CAM herangezogen werden kann, - die Geschlechtsbestimmung an jedem Tag zwischen dem Beginn der Bebrütung und dem Schlupf vorgenommen werden kann.
In dem erfindungsgemäßen Verfahren wird Nahinfrarotlicht mit einer Wellenlänge von 785 nm (oder 1064 nm) zur Anregung der Ramanstreuung genutzt.
Die Vorteile der erfindungsgemäßen Geschlechtsbestimmung sind
- keine Beeinträchtigung des Schlupfes und der nachfolgenden Entwicklung des Kükens,
- Durchführung der Geschlechtsbestimmung mit hoher Genauigkeit, wobei vor- zugsweise eine sichere Bestimmung der späteren geschlüpften Küken, insbesondere zu einem sehr frühen Zeitpunkt und eine kontaktlose Bestimmung ohne Probenentnahme erfolgen als es in den Verfahren und Vorrichtungen des Standes der Technik geschehen ist. Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren werden gemäß Fig. 1 keine Informationen über Verbindungen 30, sondern nur über molekulare Bindungen 32, unabhängig von den Verbindungen, erfasst, in denen die molekularen Bindungen 32 vorkommen. Zum Beispiel: Phosphatbindungen können in RNA, DNA, Phospho- lipiden usw. enthalten sein. Damit wird in der übergeordneten Ebene 32 gegen- über den die Realisierungs-Ebenen 30, 31 darstellenden, bereits veröffentlichten Druckschriften analysiert. In Relation zum Stand der Technik wird festgestellt, dass es generelle Unterschiede zu allen herkömmlichen chemisch-basierten Verfahren (spektroskopischen und nichtspektroskopischen) gibt:
Alle in den im Stand der Technik angegebenen Druckschriften genannten Verfah- ren erfassen die Anwesenheit/Quantität einzelner spezifischer Verbindungen 30 und Verbindungsklassen 31 (entweder DNA, Eiweiße, Zucker, Hormone).
In dem erfindungsgemäßen Verfahren und der zugehörigen Vorrichtung wird weder auf eine spezifische Verbindung 30 fokussiert noch werden absolute Mengen oder Mengenverhältnisse (Verbindungsklassen 31) im Vergleich zur Druckschrift WO 2014/021715 A2 berechnet. Es werden gestützte Klassifikationsverfahren angewendet, um das gesamte Spektrum oder einen oder mehrere Spektralbereiche als männlich oder weiblich zu klassifizieren, basierend auf einem Trainingsset, das vorab aus bekannten Spektren oder Spektralbereichen erhalten werden kann.
Das jeweilige optische Element zur Strahlführung oder zur rückführenden Strahlführung kann eine flexible optische Faser sein.
Weiterbildungen und weitere Ausgestaltungen der Erfindung werden in weiteren Unteransprüchen angegeben.
Die Erfindung wird mittels eines Ausführungsbeispieles anhand zumindest einer Zeichnung näher erläutert.
Es zeigt:
Fig. 1 eine Darstellung des Unterschiedes zwischen den Bestimmungs- Ebenen (Verbindung, Verbindungsklassen) des Standes der Technik und der Erfindungsebene (molekulare Bindungen einschließlich funktioneller Gruppen), Fig. 2 eine schematische Darstellung der erfindungsgemäßen Vorrichtung zur
Bestimmung des Geschlechtes von befruchteten und bebrüteten Vogeleiern,
Fig. 3 eine schematische Darstellung eines Teils der Vorrichtung zur Einbrin- gung von Laserlicht in das Loch der Kalkschale, wobei
Fig. 3a den dem Ei zugewandten finalen Teil zur Bestrahlung des zumindest einen ermittelten Blutgefäßes und zur Erfassung der Ramanstreustrahlung von Seiten des bestrahlten Blutgefäßes aus und
Fig. 3b einen vergrößerten Ausschnitt mit Einblick in das Loch der kalkschale und den möglichen Messpunkten an mindestens einem Blutgefäß des beweglichen Embryos zeigen, Fig. 4 eine spektroskopische Darstellung der ausgewerteten Ramanstreu- strahlungs-lntensitäten in einem vorgegebenen Wellenlängenbereich zur Erkennung des Unterschiedes zwischen weiblichen Vogeleiem und männlichen Vogeleiern, wobei die durchgezogene Linie das Mittelwertspektrum für den weiblichen Zustand und die gepunktete Linie das Mittelwertspektrum für den männlichen Zustand darstellen, und
Fig. 5 ein Blockschema zur Erläuterung der Funktionsweise zur Klassifizierung der rückgeführten und detektierten Ramanspektren und damit zur Geschlechtsbestimmung des Vogeleiembryos.
In Fig. 2 ist in einer schematischen Darstellung eine Vorrichtung 20 zur Raman- spektroskopischen in-ovo Geschlechtsbestimmung eines befruchteten und bebrüteten Vogeleies 1 gezeigt,
wobei die Vorrichtung 20 zumindest umfasst
- eine Ei-Lagerungseinheit 16, auf der das Ei 1 gelagert ist,
- eine Blutgefäß-Positions-Auswerteeinrichtung 14, die mit der Ei-Lagerungseinheit 16 in Verbindung steht,
- eine Strahlungseinrichtung 19 mit sichtbarem oder grünem Licht 10a einer Lichtquelle 10 zur Erkennung zumindest eines Blutgefäßes 21 ,
- einen Detektor 13 für sichtbares oder grünes Licht 10b zur Erkennung von Blutgefäßen 21 , wobei der Detektor 13 mit der Blutgefäß-Positionier- Auswerteeinrichtung 14 in Verbindung steht,
- eine Locherzeugungseinheit 29 für ein Loch 2 in der Kalkschale 28 zumindest im Nahbereich des fixierten Blutgefäßes 21,
- eine Vorrichtung 5 zur Einbringung von Laserlicht 3a in das Ei 1 ,
die zumindest in Verbindung steht mit
- einer das Laserlicht 3a emittierende Laserquelle 3 und
- einem Spektrometer 8 zur Aufnahme der Ramanstreustrahlung 7 und
- einer Steuereinheit 18 zu xyz-Positionierung der Vorrichtung 5 auf das in das Ei 1 eingebrachte Loch 2, - eine Geschlechtsbestimmungs-Auswerteeinheit 9, die mit dem Spektrome- ter 8 und der Blutgefäß-Positionier-Auswerteeinrichtung 14 über der Steuereinheit 18 in Verbindung steht. Der Vorrichtung 20 ist eine Einrichtung 34 zur Feststellung der Lage der Blutgefäße 21 innerhalb des Eies 1 - ein Visions-System - in Verbindung mit der Strahlungseinrichtung 19 zugeordnet.
Die Einrichtung 34 enthält des Weiteren einen Detektor 13 in Form einer Kamera. Die Einrichtung 34 zur Feststellung der Lage eines Blutgefäßes 21 ist über mindestens eine versorgungs- und signaltechnische Leitung 17 mit der Steuereinheit 18 in Form einer koordinativen Positioniereinheit verbunden.
Die Einrichtung 34 zur Feststellung der Lage eines Blutgefäßes 21 steht mit einer Höhenverstelleinrichtung (nicht eingezeichnet) und der Ei-Lagerungseinheit 16 in Verbindung.
Die Einrichtung 34 zur Feststellung der Lage des Blutgefäßes 21 , die Höhenverstelleinrichtung, z.B. innerhalb der koordinativen Positioniereinheit 18 und die Ei- Lagerungseinheit 16 können in der Blutgefäß-Positions-Auswerteeinrichtung 14 mittels programmtechnischer Mittel zu einer Koordinierung und Feststellung der Lage des Blutgefäßes 21 verbunden sein.
Die Strahlungseinrichtung 19 zur Überwachung der Ausbildung von Blutgefäßen 21 , 27 kann aus der Lichtquelle 10, einem Filter 11 und einer Linse 12 bestehen und kann auf den oberen Teil des Eies 1 gerichtet sein.
Die optische Vorrichtung 5 kann eine flexible optische Faser sein. Dazu werden folgende Maßnahmen derart getroffen, dass
- das Ei 1 bevorzugt steht und das Loch 2 im Bereich des nach oben gerichteten spitzen Pols mit der Locherzeugungseinheit 29 eingebracht wird, wobei Messungen vor allem bei einer Lochgröße 10 mm bei drei Bruttagen, bei kleinerem Loch bei Bruttagen > 5 Tage auch horizontal möglich sind,
- das Loch 2 in der Kalkschale 28 mittels eines Lasers 29 oder mittels eines mechanischen Mittels eingebracht wird,
- das Loch 2 der Kalkschale 28 den optischen Zugang zu dem vordem erkannten blutdurchflossenen Blutgefäß 21 gewährleistet,
- der Laserstrahl 3a auf das Blutgefäß 21 innerhalb des Loches 2 fokussiert wird und gegebenenfalls automatisch nachgeführt wird,
- die eingebrachte Leistung der Laserquelle 3 nicht zu einer lokalen und globa- len thermischen Schädigung des Eies 1 führt (Temperaturanstieg <1°C während der Messung) ,
- die Ramanstreustrahlung 7 mittels eines Objektivs 6 mit großer numerischer Apertur (NA>0,3) registriert wird,
- die Ramanstreustrahlung 7 mit einer Raman-Fasersonde 5 aufgenommen wird,
- die aufgenommene Ramanstreustrahlung 7 einem Spektrometer 8 über einer Faserleitung 4b zugeführt wird,
- für die Auswertung der Ramanbanden vorzugsweise der Bereich von 500cm"1 bis 4000cm 1 (Raman-Verschiebung) genutzt wird,
- die geschlechtsspezifischen Merkmale in den Ramanbanden einer mathematischen Analyse zugeführt werden,
- für die mathematische Analyse Verfahren der gestützten und nicht gestützten Klassifizierung eingesetzt werden, wobei die geschlechtsspezifischen Merkmale in einer Merkmalstabelle abgelegt sind,
- die Ramanspektren in der Form korrigiert werden, dass Untergrundsignale durch Fluoreszenz oder andere Streuprozesse eliminiert werden und die Spektren in vorgegebener Form normiert werden,
- zur erweiterten Geschlechtsbestimmung auch Membranen und Flüssigkeiten des Eies herangezogen werden können,
- die Geschlechtsbestimmung an jedem Tag zwischen dem Beginn der Bebrütung und dem Schlupf vorgenommen werden kann. In Fig. 3 sind schematische Darstellungen eines Teils der Vorrichtung 5 zur Einbringung von Laserlicht 3a in das Loch 2 der Kalkschale 28 gezeigt, wobei in Fig. 3a der dem Ei 1 zugewandte finale Teil zur Bestrahlung des zumindest einen ermittelten Blutgefäßes 21 und zur Erfassung der Ramanstreustrahlung 7 von Sei- ten des bestrahlten Blutgefäßes 21 aus und in Fig. 3b ein vergrößerter Ausschnitt mit Einblick in das Loch 2 der Kalkschale 28 und den möglichen Messpunkten an mindestens dem Blutgefäß 21 des beweglichen Embryos 23 gezeigt sind.
In Fig. 3a wird von Seiten der Vorrichtung 5 ein auf das Blutgefäß 21 fokussiertes Laserlicht 3a gerichtet. Das Blutgefäß 21 befindet sich außerhalb des Embryos 23. Die entstehende Ramanstreustrahlung 7 wird über das Objektiv 6 von der Vorrichtung 5 erfasst und weitergeleitet. Der Embryo 23 besitzt ebenfalls Blutgefäße 27, die in Fig. 3b ebenfalls Ausgangsort der Messung einer Ramanstreustrahlung 7 sein können. In Fig. 3b ist ein vergrößerter Ausschnitt 22 des in das Ei 1 eingebrachten Loches 2 aus der Fig. 3a gezeigt. Unterhalb des Loches 2 der Kalkschale 28 des Eies 1 befindet sich der Embryo 23 (Graufläche in dem Loch 2) mit seinen embryonalen Blutgefäßen 27 (geschwärzte Darstellungen) sowie mehrere extraembryonale Blutgefäße 21. Beide Blutgefäße 21 und 27 können Orte der Messungen und der Erfassung der Ramanstreustrahlung 7 sein, wobei die möglichen Messorte 24, 25, 26 je nach zeitlicher Ausbildung der Blutgefäße 21 und/oder 27 erkannt und mittels der programmtechnischen Mittel zumindest zum Vergleich mit gespeicherten Ramanspektren in den Steuer- und/oder Auswerteeinheiten 14, 9 festgelegt sein können. In Fig. 4 ist eine spektroskopische Darstellung der ausgewerteten Ramanstreu- strahlungs-lntensitäten in einem vorgegebenen Wellenzahlbereich 800cm"1 bis 1800cm"1 zur Erkennung des Unterschiedes zwischen weiblichen Vogeleiern und männlichen Vogeleiern gezeigt, wobei die durchgezogene Linie das Mittelwertspektrum für den weiblichen Zustand und die gepunktete Linie das Mittelwert- spektrum für den männlichen Zustand darstellen. Es gibt zwischen den Geschlechtskurven deutliche auf die jeweiligen Wellenzahlbereiche bezogenen Unterschiede bzw. Abstände zwischen den beiden Intensitäts-Wellenzahl-Kurven. Die Untersuchungen und die Fig. 4 zeigen, dass z.B. drei bis vier spektrale Bereiche für die Geschlechtsbestimmung ausreichen können, z.B. kann für eine Geschlechtsbestimmung ein Vergleich der Intensitäten in den absoluten Beträgen durchgeführt werden: für das weibliche Geschlecht (durchgezogene Linie) ist der Intensitätsverlauf zwischen den vorgegebenen Wellenzahlen größer oder kleiner als der Intensitätsverlauf für das männliche Geschlecht (gepunktete Linie) zwischen den gleichen Wellenzahlen, so dass in einem der Wellenzahlbereiche wenigstens ein Intensitätsvergleich stattfinden kann. Es kann auch eine Ausführung der Lichtquelle mit optischen Filtern der entsprechenden Wellenzahlen vorgesehen sein. Es kann anstelle eines teuren Spektro- meters zumindest eine oder mehrere Laserdiode/n oder Lichtquelle/n mit einem wellenzahlzugeordneten Filter, insbesondere einem Interferenzfilter bezogen auf die vorgegebenen Wellenzahlen eingesetzt sein, wobei sich die Wellenzahl v aus dem Kehrwert der Wellenlänge λ (in Mikrometer) multipliziert mit 10000 ergibt.
Bei der geschlechtsspezifischen Ramanstreuung des einfallenden IR- und/oder NIR-Lichts wird das Blut des Blutgefäßes 21 im Spektrometer 8 derart identifiziert, dass das Geschlecht des geprüften Vogeleis 1 bestimmt und angezeigt werden kann.
Die spektroskopische Auswertung erfolgt in der Auswerteeinheit 9 unter Einbeziehung mathematischer Klassifizierungsalgorithmen. In Fig. 5 ist die Funktionsweise mit Einbeziehung der Klassifizierung der gemessenen Ramanspektren im Rahmen der Auswertung dargestellt.
Für die Durchführung der spektralen Klassifizierung und deren Ergebnisausgabe wird ein mehrstufiger Prozess angegeben:
1. Schritt der Messung der Ramanspektren des zu untersuchenden Eies 1 , 2. Schritt des Qualitätstests der durchgeführten Messung zum Erkennen der Spektren und Eliminieren von unzureichend erkannten Spektren, mit denen keine Auswertung durchgeführt werden kann, wobei geprüft wird, ob die er- fassten Spektren folgenden Anforderungen/Kriterien genügen: - das Verhältnis der integralen Intensitäten der CH2/CH3 - Streckschwingungen muss dem des Blutes entsprechen (abweichend vom umgebenden Gewebe oder Flüssigkeiten), bzw. das Verhältnis der Intensitäten von CH2/CH3 < 0.3.
- das Signal-Rausch-Verhältnis (SNR) der Hämoglobin-Bande (750cm-1) hat mindestens eine Größe von 5:1
Schritt der Messwiederholung, falls die beiden Kriterien des vorhergehenden Schrittes nicht erreicht werden,
Schritt der Datenvorbehandlung mit
- einer Reduzierung des spektralen Bereiches auf einen Wellenzahlbereich zwischen 500 cm*1 und 4000 cm"1,
- einer Unterdrückung des Rauschens mittels Savitzky-Golayfilter,
- einer Korrektur der Basislinie, z.B. mit einer polynomen Funktion und der Korrektur des Offsets,
- einer Normierung der Spektren auf integrale Intensität durch Flächen- oder Vektornormierung.
Schritt der spektralen Klassifizierung mit
der Anwendung einer unterstützten (engl, supervised) Klassifizierung. Als Klassifizierungsverfahren kann die SVM - Supporting Vector Machine, LDA - Lineare Diskriminanz Analyse, KNN-Nearest-Neighbour Klassification oder ANN-Artificial Neural Networks Verfahren - eingesetzt werden. Auch andere Verfahren, wie z.B. nichtlineare Verfahren/Methoden oder unterstützende Einrichtungen oder SIMCA, können eingesetzt werden. Die LDA klassifiziert mehrere spektrale Bereiche, also die Intensitätswerte dieser Bereiche,
gegebenenfalls Schritt der Verifizierung, wobei hierzu ein Referenzspektren- Set mit Referenzspektren„männlich" und Referenzspektren„weiblich" mit bekannter geschlechtlicher Zuordnung benötigt wird. Der Algorithmus vergleicht das Spektrum mit anderen Spektren der Geschlechtsklasse und überprüft die Ähnlichkeit des unbekannten Spektrums mit den bekannten gespeicherten Spektren.
Schritt zur Ausgabe der Ergebnisse der Bestimmung des jeweiligen Geschlechts der Vogeleier, wobei das Ei 1 aussortiert wird, wenn die Mindestsi- cherheit für„männlich" gleich oder unter 45% erreicht wird. Andernfalls liegt ein weibliches Ei 1 vor, das weiter bebrütet wird.
Das erfindungsgemäße Verfahren und die zugehörige Vorrichtung nutzen die Ramanspektren vorzugsweise von Blut extraembryonaler Blutgefäße zur nicht invasiven in-ovo Geschlechtsbestimmung im bebrüteten Vogelei 1.
Folgende Parameter für die Ramanspektroskopie werden eingesetzt:
- Anregungswellenlängen Laserlicht 3a: > 600 nm, z.B. HeNe Laser 633 nm, Festkörperlaser (Nd basiert z.B. Nd:YAG Laser 1064nm, VIS NIR Diodenlaser z.B. 785 nm),
- Einkopplung des Laseranregungsstrahles 3a direkt mit Spiegeln und/oder mit optischen Fasern,
Ramanstreustrahlungsmessungen werden unter Nutzung der optischen Vor- richtungen 5 mit großer numerischer Apertur wie Mikroskop-Objektiven 6 oder einer Raman-Fasersonde 5 durchgeführt,
Direkte Auskopplung der gesammelten Ramanstreustrahlung 7 mit Spiegeln zum Spektrometer oder Transport mit optischen Fasern,
- Anwendung von Spektrometern 8 in Form von dispersiven Ramanspektrome- tern und Fourier Transform Raman Spektrometern.
Zur Bildung der genutzten Blutgefäße 21 und der sich gebildeten Chorioallantois- membran (CAM) wird Folgendes angegeben:
Die Blutgefäße 21 bilden sich ab dem zweiten Bebrütungstag. Etwa am dritten Bebrütungstag zirkuliert das embryonale Blut im Blutkreislauf. In diesem Zeitbereich wird die Messung zur Geschlechtsbestimmung durchgeführt.
Folgende zwei erfindungsgemäße Verfahren werden somit genutzt:
Abhängig vom Bruttag existieren zwei Varianten zur Ramanstreustrahlungsmes- sung:
1. Abschnitt der Zeitdauer der Bewegung des Embryos 23 und
2. Abschnitt der Zeitdauer der Ausbildung der Chorioallantoismembran (CAM) und somit Fixierung des Embryos 23. Erste Variante:
Bis zum ca. vierten Bruttag ist der Embryo einschließlich der extraembryonalen Strukturen beweglich im Ei 1, d.h. sie sind nicht an der Kalkschale 28 fixiert. Der Messablauf wird wie folgt durchgeführt:
- Überwachung bzw. Beobachtung des Zeitverlaufs des Bebrütens bis maximal zum vierten Bruttag,
- Einbringen eines Loches 2 in die Kalkschale 28 mittels Laser 29 oder mechanischer Perforation, vorzugsweise am spitzen Pol der Kalkschale 28 des Eies 1 mit einem Laser 29, mit Durchmessern mit bis zu 18mm, vorzugsweise zwischen 8mm und 15mm,
- Suchen der Blutgefäße 21 mittels des Visions-Systems 34, vorzugsweise mit einer inline Visions-Kamera 13 und einer koaxialen oder lateralen Beleuchtung mit sichtbarem Licht 10a aus einer Lichtquelle 10. Das sichtbare Licht 10a kann weißes Licht sein, jedoch wird der Kontrast verbessert bei blauem und/oder grünem Licht. Die Visions-Kamera 13 nimmt das Licht 0b auf.
Bringen der Blutgefäße 21 in den Laserfokus der Laserquelle 3, entweder durch Bewegen des Eies 1 oder des Objektives 6.
- Registrieren der Ramanstreustrahlung 7, wobei während der Messung eine mögliche Bewegung des Blutgefäßes 21 aus dem Fokus heraus durch real- time Tracking der Blutgefäße 21 durch die Überwachung mittels des Visions- Systems 34 vermieden werden kann.
Vorzugsweise erfolgt eine Messung zum dritten Bruttag. Zweite Variante:
Ab dem fünften Bruttag sind die extraembryonalen Strukturen nicht mehr frei beweglich, d.h. die Fixierung der Chorioallantoismembran (CAM) an der Kalkschale 28 wird vollführt. Ab diesem Brutzeitpunkt gibt es eine Variante für den Messablauf, der wie folgt durchgeführt wird: - Überwachung bzw. Beobachtung des Zeitverlaufs des Bebrütens ab dem fünften Bruttag, - Identifikation der Position 25, 26 der Blutgefäße 21 oder der Position 24 der Blutgefäße 27 gemäß Fig. 3, 3a mittels Durchleuchtung mit weißem oder blauem oder grünem oder blauem und grünem Licht 10a,
- Einbringen eines Loches 2 in die Kalkschale 28 im Bereich des identifizier- ten Blutgefäßes 21 , 27 mittels eines Lasers 29 oder mechanischer Perforation, vorzugsweise mit einem Laser, wobei die Löcher 2 mit Durchmessern bis zu 5mm, vorzugsweise zwischen 0.1 mm und 3mm ausgebildet werden,
- Bringen der Blutgefäße 21 in den Laserfokus entweder durch Bewegen des Eies 1 oder Bewegen des Objektives 6,
- Registrieren der Ramanstreustrahlung 7 in den Blutgefäßen 21 , d.h. es erfolgt eine Messung des Blutes in den Kapillaren oder in größeren Blutgefäßen innerhalb oder unterhalb der Chorioallantoismembran (CAM).
Nach den jeweiligen Messabläufen erfolgt eine Klassifizierung zur Erkennung des Geschlechtes des jeweils ausgemessenen bebrüteten Vogeleies 1 in der Auswerteeinheit 9.
Anstelle der herkömmlichen linearen Ramanspektroskopie kann erfindungsge- mäß die nichtlineare CARS-Spektroskopie zur Geschlechtsbestimmung genutzt werden.
Die kohärente Anti-Stokes-Raman-Streuung (Coherent Anti-Stokes Raman Scat- tering - CARS -) gehört zur nichtlinearen Ramanstreuung. Mittels CARS- Spektroskopie werden die gleichen Molekülschwingungen untersucht, jedoch besteht der Unterschied zur (linearen) Raman-Spektroskopie in der besonderen Anregungsart. Bei der CARS Spektroskopie wird ein Multi-Photonen Prozess zur Anregung der Molekülschwingungen genutzt und ein kohärentes Signal erzeugt. Im Ergebnis wird mittels CARS ein Signal erhalten, welches um Größenordnun- gen stärker als das der spontanen Ramanemission ist (Faktor 105), was zu einer kürzeren Messzeit führt. Weiterhin ist das CARS Signal gegenüber der Anregungswellenlänge blau verschoben und deshalb frei von Fluoreszenz.
Die Anregung erfolgt mittels ultraschneller NIR-Laser, sodass die Eindringtiefe vergleichbar mit der Eindringtiefe bei der NIR-Ramanspektroskopie ist und die Lichtschäden minimiert sind.
Die Sensitivität wird nicht durch die Detektion der CARS Photonen limitiert, sondern eher durch die Unterscheidung zwischen resonanten und nichtresonanten Anteilen des CARS Signals. Verschiedene Verfahren existieren zum Separieren des resonanten Anteiles durch spezielle Konfigurationen zur Anregung/ Samm- lung des Lichtes:
- Die polarisationssensitive Detektion,
- die zeitaufgelöste Detektion und
- die spektrale Phasenkontrolle und räumliche Phasenkontrolle.
Alternativ kann das Ramanspektrum aus dem CARS-Spektrum durch eine modi- fizierte Kramers-Kronig-Transformation oder durch spezielle Rechenmethoden, basierend auf der Annahme maximaler Entropie, erhalten werden.
Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens gemäß CARS erfolgt Folgendes:
- Das CARS-Spektrum vom Blut des Blutgefäßes 21 , 27 wird erfasst unter Nutzung derselben Aufnahmekonfiguration wie für die spontane Ra- manspektroskopie abhängig vom Brutzeitpunkt, mit oder ohne Faseroptik,
- Das CARS-Signal kann durch einen breitbandigen Femto-Sekundenlaser als Laserquelle 3 generiert werden, der als Pumplaser und Stokeslaser dient,
- Das CARS-Signal kann aber auch durch zwei Laserquellen 3 generiert werden, einen Breitbandlaser und einen Schmalbandlaser (multiplex CARS),
- Die CARS-Spektren werden zur Klassifikation genutzt.
- Der resonante Anteil des CARS-Spektrum [lm(Chi(3))] wird vom nichtresonanten Anteil [Re(Chi(3))J separiert und nur der resonante Anteil wird für die Klassifikation herangezogen. Schließlich erfolgt eine gleiche Klassifikationsstrategie der CARS-Spektroskopie wie für die herkömmlichen linearen Ramanspektren gemäß dem Stand der Technik.
Bezugszeichenliste
1 Ei
2 Loch in der Kalkschale
3 Laserquelle/Laserquellen
3a in das Loch der Kalkschale eingebrachtes Laserlicht
4a Laserlicht zum Ei führende optische Glasfaser
4b Ramanstreustrahlung zum Spektrometer/Detektor führende optische Glasfaser
5 Vorrichtung zur Einbringung des Laserlichtes in das Ei/ Fasersonde
6 Linse zur Fokussierung des Laserlichtes und zum Sammeln der Ramanstreustrahlung
7 Ramanstreustrahlung/Ramanstreulicht
8 Spektrometer mit Detektor
9 Auswerteeinheit
10 Lichtquelle
10a Licht, mit dem das Ei bestrahlt wird
10b transmittertes bzw. gestreutes sichtbares Licht
11 Filter grün
12 Linse
13 Kamera zur Detektion von Licht 10b
14 Blutgefäß-Positions-Auswerteeinrichtung
15 Steuerleitung
16 xyz-Positioniereinheit zur Ei-Lagesteuerung
17 Steuerleitungen
18 koordinative xyz-Positioniereinheit/Steuereinheit
19 Strahlungseinrichtung
20 erfindungsgemäße Vorrichtung
21 extraembryonales Blutgefäß
22 Ausschnitt aus Kalkschale
23 Embryo
24 Ort der Erfassung der Ramanstreustrahlung eines embryonalen Blutgefäßes 27 Orte der Erfassung der Ramanstreustrahlung eines extraembryonalen Blutgefäßes 21
Orte der Erfassung der Ramanstreustrahlung eines extraembryonalen Blutgefäßes 21
embryonales Blutgefäß
Kalkschale
Locherzeugungseinheit /Laser/mechanische Perforation
Gebiet der Verbindung
Gebiet der Verbindungsklassen
Gebiet der molekularen Bindungen
Erkennungs-Ebenen-Darstellung
Einrichtung zur Feststellung der Lage von Blutgefäßen/Visions-System Leitung

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Ramanspektroskopischen in-ovo Geschlechtsbestimmung von befruchteten und bebrüteten Vogeleiern (1), wobei der Embryo (23) ein- schließlich der extraembryonalen Strukturen beweglich im Ei (1) ist und noch nicht zum Zeitpunkt einer Messung der Ramanstreustrahlung (7) an der Kalkschale (28) fixiert ist,
gekennzeichnet durch folgende Schritte:
- Überwachung des Zeitverlaufs des Bebrütens bis zur Ausbildung mindes- tens eines erkennbaren Blutgefäßes (21 , 27),
- Schaffung eines Lochs (2) in der Kalkschale (28) im Nahbereich des fixierten Blutgefäßes (21 , 27) mittels einer Locherzeugungseinheit (29),
- Suchen der sich im Ei (1) ausbildenden Blutgefäße (21 , 27) mittels eines Visions-Systems (34; 19, 13) und einer koaxialen oder lateralen Beleuch- tung mit Licht (10a) des sichtbaren Wellenlängenbereiches,
- Positionieren zumindest eines Blutgefäßes (21, 27) in den Laserfokus einer Laserquelle (3) entweder durch Bewegen des Eies (1) oder Bewegen eines Objektives (6) einer Vorrichtung (5) zur Einbringung des Laserlichts (3a) und Erfassung der Ramanstreustrahlung (7),
- Registrieren der Ramanstreustrahlung (7) des bestrahlten Blutgefäßes (21 , 27) mittels der Vorrichtung (5) zur Einbringung des Laserlichts (3a) und zur Erfassung der Ramanstreustrahlung (7), wobei während der Messung eine Bewegung des Blutgefäßes (21 , 27) aus dem Fokus heraus durch Nachführung mittels des Visions-Systems (34; 19, 13) vermieden werden kann, - Auswertung der Ramanstreustrahlung (7) in einer Auswerteeinheit (9),
- Bestimmung und Anzeige des Geschlechtes des Embryos (23) im Vogelei (1).
2. Verfahren nach Anspruch 1 ,
dadurch gekennzeichnet, dass ein Loch (2) am nach oben gerichteten, spitzen Pol des Eies (1) einen Durchmesser bis zu 18mm, vorzugsweise zwischen 8mm und 15mm mittels einer Lochöffnungseinrichtung (29) ausgebildet wird.
Verfahren nach Anspruch 1 ,
dadurch gekennzeichnet,
dass zur Überwachung des Zeitverlaufs der Vorgänge beim Bebrüten des Vogeleies (1) ein Licht (10a) des sichtbaren Wellenlängen bereiches weißes oder blaues und/oder grünes Licht aus der Lichtquelle (10) der Strahlungseinrichtung (19) des Visions-Systems (34) eingesetzt wird.
Verfahren nach Anspruch 1 bis 3,
dadurch gekennzeichnet,
dass das Verfahren zur Ramanspektroskopischen in-ovo Geschlechtsbestimmung von befruchteten und bebrüteten Vogeleiern (1) ab dem dritten Bruttag durchgeführt wird.
Verfahren zur Ramanspektroskopischen in-ovo Geschlechtsbestimmung von befruchteten und bebrüteten Vogeleiern (1), wobei die extraembryonalen Strukturen nicht mehr frei beweglich sind und wobei eine Fixierung der Chori- oallantoismembran (CAM) an der Kalkschale (28) beginnt,
gekennzeichnet durch folgende Schritte:
- Überwachung des Zeitverlaufs des Bebrütens bis eine Fixierung der Cho- rioallantoismembran (CAM) an der Kalkschale (28) beginnt und bereits Blutgefäße (21, 27) vorhanden sind,
- Identifikation der Blutgefäßposition (24, 25, 26) mittels Durchleuchtung mit Licht (10a) des sichtbaren Wellenlängebereiches aus einer Lichtquelle (10),
- Einbringen eines Loches (2) in die Kalkschale (28) mittels einer Locherzeugungseinheit (29) in Form eines Lasers oder mittels mechanischer Perforation im Nahbereich des fixierten Blutgefäßes (21 , 27), - Positionieren der Blutgefäße (21 , 27) in den Laserfokus einer Laserquelle (3) entweder durch Bewegen des Eies (1) oder eines Objektivs (6) einer Vorrichtung (5) zur Einbringung des Laserlichts (3a) und Erfassung der Ramanstreustrahlung (7),
- Registrieren der Ramansteustrahlung (7) zumindest eines bestrahlten Blutgefäßes (21, 27) und Messung des Blutes in den Kapillaren oder in größeren Blutgefäßen innerhalb oder unterhalb der Chorioallantois- membran (CAM),
- Auswertung der Ramanstreustrahlung (7) in einer Auswerteeinheit (9),
- Bestimmung und Anzeige des Geschlechtes des Embryos (23) im Vogelei (1).
. Verfahren nach Anspruch 5,
dadurch gekennzeichnet,
dass ein Loch (2) mit einem Durchmesser bis zu 5 mm, vorzugsweise zwischen 0,1 mm und 3 mm mittels einer Locherzeugungseinheit (29) ausgebildet wird.
,7. Verfahren nach Anspruch 5,
dadurch gekennzeichnet,
dass zur Überwachung des Zeitverlaufs der Vorgänge beim Bebrüten des Vogeleies (1) als Licht (10a) des sichtbaren Wellenlängenbereiches weißes oder blaues und/oder grünes oder blaues und grünes Licht aus der Lichtquelle (10) der Strahlungseinrichtung (19) des Visions-Systems (34) eingesetzt wird. 8. Verfahren nach Anspruch 5 bis 7,
dadurch gekennzeichnet,
dass das Verfahren zur Ramanspektroskopischen in-ovo Geschlechtsbestimmung von befruchteten und bebrüteten Vogeleiern (1) etwa oder ab dem fünften Bruttag durchgeführt wird.
9. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 8,
dadurch gekennzeichnet, dass nach den jeweiligen Messabläufen eine Klassifizierung zur Erkennung des Geschlechtes des jeweils ausgemessenen bebrüteten Vogeleies (1) vor der Anzeige des Geschlechtes erfolgt. 10. Verfahren nach Anspruch 1 oder 5,
dadurch gekennzeichnet,
dass die Ramanstreustrahlung (7) von Blut extraembryonaler Blutgefäße (21) und/oder von Blut embryonaler Blutgefäße (27) zur nicht invasiven in-ovo Geschlechtsbestimmung im bebrüteten Vogelei (1) genutzt werden.
11. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 10,
dadurch gekennzeichnet,
dass folgende Parameter für die Ramanspektroskopie eingesetzt werden:
- Anregungswellenlängen des Laserlichts (3a) der Laserquelle (3): > 600 nm (z.B. HeNe Laser 633 nm, Festkörperlaser (Nd basiert z.B. Nd:YAG Laser
1064nm, VIS NIR Diodenlaser z.B. 785 nm),
- Einkopplung des Laseranregungsstrahles (3a) direkt mit Spiegeln und/oder mit optischen Fasern (4a),
- Ramanstreustrahlungsmessungen werden unter Nutzung von optischen Vorrichtungen (5) mit großer numerischer Apertur wie Mikroskop-Objektiven
(6) oder einer Raman-Fasersonde durchgeführt,
- Direkte Auskopplung der gesammelten Ramanstreustrahlung (7) mit Spiegeln zum Spektrometer (8) oder mittels Transports mit optischen Fasern (4b),
- Einsatz eines Spektrometers (8) in Form von dispersivem Ramanspektro- meter und Fourier Transform Raman Spektrometer.
12. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 11 ,
dadurch gekennzeichnet,
dass während des Positionierungsvorgangs des Vogeleis (1) permanent rückgeführte Ramanspektren aufgezeichnet und einer Auswertung zugeführt werden, wobei eine automatische Klassifizierung der Ramanstreustrahlung (7) anhand des spektralen Fingerabdruckes des Blutes erfolgt.
13. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 12,
dadurch gekennzeichnet,
dass das Ei (1) pollastig gestellt wird und ein Loch (2) im Bereich des nach oben gerichteten spitzen Pols bei einer Lochgröße von 10 mm bei drei Bruttagen oder bei kleinerem Loch, auch in möglicher Horizontallage, an Bruttagen, die länger als fünf Tage dauern, eingebracht wird.
14. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 13,
dadurch gekennzeichnet,
dass das Loch (2) der Kalkschale (28) des Eies (1) den optischen Zugang zu einem blutdurchflossenen Blutgefäß (21 , 27) gewährleistet.
15. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 14,
dadurch gekennzeichnet,
dass der Laserstrahl (3a) auf das Blutgefäß (21 , 27) automatisch fokussiert wird.
16. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 15,
dadurch gekennzeichnet,
dass die eingebrachte Leistung der Laserquelle (3) nicht zu einer lokalen und globalen Erwärmung des Eies (1) über 40° Celsius führt.
17. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 16,
dadurch gekennzeichnet,
dass die Ramanstreustrahlung (7) mit einem Objektiv (6) mit großer numerischer Apertur (NA > 0,3) registriert wird.
18. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 17,
dadurch gekennzeichnet,
dass die Ramanstreustrahlung (7) mit einer Raman-Fasersonde aufgenommen wird.
19. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 18,
dadurch gekennzeichnet,
dass die erfasste Ramanstreustrahlung (7) über Faserleitungen (4b) dem Spektrometer (8) zugeführt wird.
20. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 19,
dadurch gekennzeichnet,
dass für die Auswertung der Ramanbanden in der Auswerteeinheit (9) der Bereich von 500 cm"1 bis 4000 cm"1 (Raman-Verschiebung) genutzt wird.
21.Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 20,
dadurch gekennzeichnet,
dass die geschlechtsspezifischen Merkmale - genetischer Fingerabdruck - in den Ramanbanden der Nukleinsäuren, Kohlenhydrate, Lipide und Proteine enthalten sind, die einer mathematischen Analyse zugeführt werden.
22. Verfahren nach Anspruch 21 ,
dadurch gekennzeichnet,
dass für die mathematische Analyse Verfahren der gestützten und nicht ge- stützten Klassifizierung eingesetzt werden, wobei die geschlechtsspezifischen Merkmale in einer Merkmalstabelle einer Auswerteeinheit (9) abgelegt sind.
23. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 22,
dadurch gekennzeichnet,
dass die erfasste Ramanstreustrahlung (7) in der Form korrigiert wird, dass Untergrundsignale durch Fluoreszenz oder andere Streuprozesse eliminiert werden und die Spektren in vorgegebener Form normiert werden.
24. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 23,
dadurch gekennzeichnet,
dass als Ramanspektroskopie die nichtlineare kohärente Anti-Stokes-Raman- Streuung-Spektroskopie (CARS) genutzt wird, wobei die CARS- Streustrahlung vom Blut des Blutgefäßes (21 , 27) unter Nutzung derselben Vorrichtung (20) wie für die spontane lineare Ramanspektroskopie mit oder ohne Faseroptik (5) aufgenommen wird.
25. Verfahren nach Anspruch 24,
dadurch gekennzeichnet,
dass das CARS-Signal durch einen breitbandigen Femto-Sekundenlaser als Laserquelle (3) generiert wird, der als Pumplaser und als Stokeslaser dient.
26. Verfahren nach Anspruch 25,
dadurch gekennzeichnet,
dass das CARS-Signal durch zwei Laser generiert wird, durch einen Breitbandlaser und einen Schmalbandlaser als Laserquellen (3) zur Nutzung und Auswertung einer multiplexen CARS-Spektroskopie. 27. Verfahren nach den Ansprüchen 24 bis 26,
dadurch gekennzeichnet,
dass die CARS-Spektren zur Klassifikation genutzt werden.
28. Verfahren nach den Ansprüchen 24 bis 27,
dadurch gekennzeichnet,
dass der resonante Anteil des CARS-Spektrum [lm(Chi(3))] vom nichtresonan- ten Anteil [Re(Chi(3))] separiert und nur der resonante Anteil für die Klassifikation herangezogen werden. 29. Verfahren nach den Ansprüchen 24 bis 28,
dadurch gekennzeichnet,
dass für die CARS-Spektroskopie eine gleiche Klassifikationsstrategie wie für die linearen Ramanspektren durchgeführt wird. 30. Vorrichtung (20) zur Bestimmung der zur Ramanspektroskopischen in-ovo Geschlechtsbestimmung von befruchteten und bebrüteten Vogeleiern (1), unter Verwendung der Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 29, zumindest umfassend - eine Ei-Lagerungseinheit (16),
- eine Blutgefäß-Positions-Auswerteeinrichtung (14), die mit der Ei-Lagerungseinheit (16) in Verbindung steht,
- eine Strahlungseinrichtung (19) mit Licht (10a) einer Lichtquelle (10) zur Er- kennung mindestens eines Blutgefäßes (21 , 27), wobei die Strahlungseinrichtung (19) zumindest einen Teil des Eies (1) durchstrahlt,
- einen Detektor (13) für das Licht (10b) zur Erkennung von Blutgefäßen (21 , 27), wobei der Detektor (13) mit der Blutgefäß-Positionier-Auswerteeinrich- tung (14) in Verbindung steht, wobei die Strahlungseinrichtung (19) und der Detektor (13) zumindest ein Visions-System (34, 19, 13) bilden,
- eine Locherzeugungseinheit (29) zur Schaffung eines Lochs (2) in der Kalkschale (28) im Nahbereich des fixierten Blutgefäßes (21 , 27),
- eine Vorrichtung (5) zur Einbringung von Laserlicht (3a) in das geschaffene Loch (2) des Ei (1) und zur Erfassung der Ramanstreustrahlung (7), die zumindest in Verbindung steht mit
- einer das Laserlicht (3a) emittierenden Laserquelle (3), wobei das Laserlicht (3a) auf mindestens ein Blutgefäß (21 , 27) fokussiert gerichtet ist,
- einem Spektrometer (8) zur Aufnahme der Ramanstreustrahlung (7) des Blutes des vom Laserlicht (3a) bestrahlten Blutgefäßes (21 , 27) über min- destens eine Leitung (4b) und
- einer Steuereinheit (18) zur xyz-Positionierung der Vorrichtung (5) auf ein in das Ei (1) eingebrachtes Loch (2),
- eine Geschlechtsbestimmungs-Auswerteeinheit (9), die mit dem Spektrometer (8) und der Blutgefäß-Positionier-Auswerteeinrichtung (14) in Verbindung steht und aus der verarbeiteten erfassten Ramanstreustrahlung (7) des
Spektrometers (8) das Geschlecht des bebrüteten Vogeleies (1) angibt.
31. Vorrichtung nach Anspruch 30,
dadurch gekennzeichnet,
dass die Locherzeugungseinheit (29) in Form eines Lasers oder einer Einrichtung zur mechanischen Perforation mit der Blutgefäß-Positions-Auswerteein- richtung (14) über Leitung (35) in Verbindung steht.
32 .Vorrichtung nach Anspruch 30,
dadurch gekennzeichnet,
dass das Visions-System (34) eine Einrichtung zur Feststellung der Lage der Blutgefäße (21 , 27) mit einem Detektor (13) ist.
33. Vorrichtung nach Anspruch 32,
dadurch gekennzeichnet,
dass die Einrichtung (34) zur Feststellung der Lage eines Blutgefäßes (21 , 27) über mindestens eine versorgungs- und signaltechnische Leitung ( 7) mit der Steuereinheit (18) verbunden ist.
34. Vorrichtung nach den Ansprüchen 32 und 33,
dadurch gekennzeichnet,
dass die Einrichtung (34) zur Feststellung der Lage eines Blutgefäßes (21 , 27) mit einer Höhenverstelleinrichtung und der Ei-Lagerungseinheit (16) in Verbindung steht.
35. Vorrichtung nach den Ansprüchen 32 bis 34,
dadurch gekennzeichnet,
dass die Einrichtung (34) zur Feststellung der Lage des Blutgefäßes (21 , 27), die Höhenverstelleinrichtung und die Ei-Lagerungseinheit (16) in der Blutge- fäß-Positions-Auswerteeinrichtung (14) mittels programmtechnischer Mittel zur Durchführung einer Koordinierung der Lage des Blutgefäßes (21 , 27) verbunden sind.
36. Vorrichtung nach den Ansprüchen 30 bis 35,
dadurch gekennzeichnet,
dass die optische Vorrichtung (5) eine flexible optische Faser ist. 37.Vorrichtung nach den Ansprüchen 30 bis 36,
dadurch gekennzeichnet, dass die Strahlungseinrichtung (19) Licht (10a) des sichtbaren Wellenlängenbereiches, zumindest grünes Licht (10a) zur Erkennung mindestens eines Blutgefäßes (21 , 27) emittiert.
38. Vorrichtung nach den Ansprüchen 30 bis 37,
dadurch gekennzeichnet,
dass die Auswerteeinheit (9) programmtechnische Mittel zur Geschlechts- bestimmungs-Auswertung der erfassten Ramanstreustrahlung (7) und der erfassten CARS-Streustrahlung aufweist.
39. Vorrichtung nach den Ansprüchen 30 bis 38,
dadurch gekennzeichnet,
dass die Vorrichtung (5) zur Einbringung des Laserlichts (3a) und der Erfassung der Ramanstreustrahlung (7) mit der Steuereinheit (18) in Verbindung steht, die das Laserlicht (3a) bei beweglichem Embryo (23) auf das ermittelte erfassbare Blutgefäß (21 , 27) fokussieren hilft.
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