WO2016010002A1 - タンパク質のエピトープを同定するための方法 - Google Patents

タンパク質のエピトープを同定するための方法 Download PDF

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    • C12N2506/45—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from artificially induced pluripotent stem cells

Definitions

  • the present invention relates to a method for identifying a protein having immunogenicity and the like, for example, a method for identifying an epitope that may play a causative role in induction of immunogenicity. Also related.
  • biopharmaceuticals antibody drugs, biologics, hormones, proteins, etc.
  • the immunogenicity of these biopharmaceuticals is a problem.
  • a biopharmaceutical can act as an antigen and induce the production of antibodies in the patient's body.
  • neutralizing antibodies may be produced against the biopharmaceutical and treatment efficiency may be reduced.
  • allergic reactions, leaching reactions, infusion reactions and the like can be caused.
  • antibodies that produce autoimmune diseases and the like by neutralizing endogenous self-proteins corresponding to biopharmaceuticals can be produced.
  • an antigen is presented on a major histocompatibility complex (also referred to as MHC molecule) present on the cell surface of an antigen-presenting cell (APC) (this is referred to as “antigen presentation”).
  • MHC molecules involved in antigen presentation MHCI molecules (class I) and MHC II molecules (class II) are known.
  • MHCI molecules act on killer T cells (CD8 positive T cells), and MHCII molecules act on helper T cells (CD4 positive T cells).
  • MHCI molecules act on endogenous antigens in their own cells, while MHCII molecules act on foreign antigens.
  • an antigen-antibody reaction or the like can be caused by an antigen presentation via an MHCI molecule for a cancer antigen produced in a cancer cell.
  • antigen-antibody reaction and the like can be caused by antigen presentation via MHCII molecules.
  • the endogenous protein in its own cell is degraded into small peptides by the proteasome.
  • the peptide then binds to MHCI molecules synthesized in the endoplasmic reticulum to form a complex. Thereafter, the complex is transported to the cell surface, so that the peptide is presented as an epitope on the MHCI molecule.
  • the MHCII molecule when used, first, the foreign protein is taken up into the antigen-presenting cell by endocytosis. The incorporated protein is then broken down into small peptides by lysosomes and then combined with MHCII molecules to form a complex. Thereafter, the complex is transported to the cell surface, so that the peptide is presented as an epitope on the MHCII molecule. The T cell receptor of helper T cells can then bind to the antigen presenting cell via the peptide.
  • peptide sequences presented on MHC molecules In order to avoid the immunogenicity of antibody drugs and the like, studies have been conducted to identify peptide sequences presented on MHC molecules. This makes it possible to predict the immunogenicity of a protein or peptide intended to be administered to a living body. Further, for example, based on the information of the epitope sequence, the epitope can be modified by site-directed mutagenesis for the purpose of producing a non-immunogenic protein.
  • Known methods for identifying peptide sequences include methods using in silico prediction algorithms and T cell proliferation assays (for example, measuring the proliferation ability of helper T cells by incorporating tritium-labeled thymidine). .
  • the protein is brought into contact with an antigen-presenting cell such as a dendritic cell (DC) to induce antigen presentation, and a peptide derived from the protein is presented on the MHC molecule on the cell.
  • an antigen-presenting cell such as a dendritic cell (DC)
  • DC dendritic cell
  • a peptide derived from the protein is presented on the MHC molecule on the cell.
  • PBMC peripheral blood mononuclear cells
  • monocytes monocytes
  • peptide sequences derived from proteins in serum may also be detected.
  • the amount of PBMC that can be obtained is limited, so often PBMCs from multiple donors are often pooled and used in bulk. It was not easy to determine if it was involved in induction of patient immunogenicity.
  • antigen-presenting cells specifically, cells expressing major histocompatibility complex (MHC molecule)
  • MHC molecule major histocompatibility complex
  • a method for identifying an epitope of a protein comprising: The following steps: (A) A step of bringing a target protein into contact with a cell expressing a major histocompatibility complex (MHC molecule) differentiated from a stem cell or a progenitor cell derived therefrom; (B) isolating the complex of the peptide contained in the target protein and the MHC molecule from the cell expressing the MHC molecule; and (C) eluting the peptide from the complex and identifying it. Including the method.
  • MHC molecule major histocompatibility complex
  • the method according to [1] comprising the step of verifying whether the identified peptide is an epitope that induces immunogenicity.
  • the stem cells are selected from the group consisting of induced pluripotent stem cells (iPS cells), embryonic stem cells (ES cells), nuclear transfer ES cells (ntES cells), embryonic germ stem cells (EG cells) and adult stem cells The method according to [1] or [2].
  • iPS cells induced pluripotent stem cells
  • ES cells embryonic stem cells
  • ntES cells nuclear transfer ES cells
  • EG cells embryonic germ stem cells
  • adult stem cells The method according to [1] or [2].
  • [4] The method according to any one of [1] to [3], wherein the MHC molecule is an MHCII molecule.
  • the MHCII molecule is HLA-DR, HLA-DQ, or HLA-DP.
  • the dendritic cell is The following steps: (A) a step of differentiating a stem cell or a progenitor cell derived therefrom to obtain a mesoderm progenitor cell; (B) differentiating the mesodermal progenitor cells to obtain monocytic cells; and (c) differentiating the monocyte cells to obtain immature dendritic cells, and optionally, immature dendritic cells Further produced by a method comprising the step of stimulating to obtain mature dendritic cells, Furthermore, the method according to any one of [1] to [10], wherein a serum-free medium is used in at least the step (c) among the steps (a) to (c).
  • the mesoderm progenitor cells are differentiated in a serum-free medium containing granulocyte / macrophage colony stimulating factor (GM-CSF) and macrophage colony stimulating factor (M-CSF).
  • GM-CSF granulocyte / macrophage colony stimulating factor
  • M-CSF macrophage colony stimulating factor
  • the dendritic cell is an immature dendritic cell, and the immature dendritic cell is induced into the mature dendritic cell by contacting with a target protein having immunogenicity.
  • the target protein is selected from one or more members selected from the group consisting of cytokines, chemokines, growth factors, antibodies, enzymes, structural proteins, hormones, and fragments thereof.
  • [1] The method according to any one of [14] to [14].
  • [16] A method for producing a protein with reduced or eliminated immunogenicity, The following steps: (1) identifying a protein epitope according to the method of any one of [1] to [15]; (2) modifying the epitope such that binding to MHC molecules is reduced or eliminated; and (3) producing a protein having the modified epitope.
  • [17] A protein obtainable according to the method of [16].
  • a method for predicting whether a protein is immunogenic in a subject (I) providing a cell that expresses one or more allotypes of an MHC molecule of interest intended to be administered a target protein, wherein the cell is differentiated from a stem cell or a progenitor cell derived therefrom A process characterized by: (II) a step of bringing a target protein into contact with the “cell expressing one or more allotypes of MHC molecules”; (III) isolating a complex of a peptide contained in the target protein and an MHC molecule from the “cell expressing one or more allotypes of the MHC molecule”; (IV) eluting and identifying the peptide from the complex; and (V) optionally verifying whether the identified peptide is an epitope that induces immunogenicity, A method that indicates that the target protein is immunogenic in the subject when the identified peptide is an epitope that induces immunogenicity.
  • a method for producing dendritic cells from stem cells or progenitor cells derived therefrom The following steps: (A ′) a step of differentiating a stem cell or a progenitor cell derived therefrom to obtain a mesoderm progenitor cell; (B ′) a step of obtaining monocytic cells by differentiating the mesoderm progenitor cells under a serum-free medium containing granulocyte / macrophage colony stimulating factor (GM-CSF) and macrophage colony stimulating factor (M-CSF); And (c ′) a step of differentiating the monocyte cells under serum-free medium to obtain immature dendritic cells, and optionally further stimulating the immature dendritic cells to obtain mature dendritic cells.
  • GM-CSF granulocyte / macrophage colony stimulating factor
  • M-CSF macrophage colony stimulating factor
  • the step (c ′) (C1 ′) a step of obtaining immature dendritic cells by differentiating the monocyte cells in a serum-free medium containing granulocyte / macrophage colony stimulating factor (GM-CSF) and interleukin 4 (IL-4). Including, and in some cases, (C2 ′) comprising inducing the immature dendritic cells into mature dendritic cells by contacting the immunogen and optionally inflammatory cytokines, The method according to [23]. [25] A dendritic cell obtainable by the method according to [23] or [24].
  • GM-CSF granulocyte / macrophage colony stimulating factor
  • IL-4 interleukin 4
  • the stem cells that express different MHC molecule allotypes
  • the present invention uses stem cells or progenitor cells derived therefrom as starting material as a starting material for antigen-presenting cells for MAPPs, as compared to a system using PBMC as the starting material. It is suggested.
  • stem cells are not limited in the number of cell divisions, and methods for proliferation and maintenance have been established, so that antigen-presenting cells that express allotypes of necessary MHC molecules can be produced and supplied in a stable manner in large quantities. It is also possible from the viewpoint of manufacturing cost and simplicity.
  • DC refers to dendritic cells.
  • An example of a scheme for differentiating human iPS cells to obtain dendritic cell-like cells is shown.
  • numerator expressed on the cell surface of the monocyte-like cell produced from Ticline obtained by the flow cytometer analysis is shown.
  • numerator expressed on the cell surface of the monocyte-like cell produced from Ticline obtained by the flow cytometer analysis is shown.
  • numerator expressed on the cell surface of the monocyte-like cell produced from 201B7 line obtained by the flow cytometer analysis is shown.
  • numerator expressed on the cell surface of the monocyte-like cell produced from 201B7 line obtained by the flow cytometer analysis is shown.
  • numerator expressed on the cell surface of the dendritic cell-like cell produced from Ticline obtained by the flow cytometer analysis is shown.
  • numerator expressed on the cell surface of the dendritic cell-like cell produced from Ticline obtained by the flow cytometer analysis is shown.
  • the amino acid sequence of Bet v1a is also shown.
  • peptides were broadly detected at the positions corresponding to 4 positions.
  • Analysis results of amino acid sequences of peptides detected when exposed to Bet v1a in MAPPs using dendritic cell-like cells derived from human iPS cells (201B7 line) (FIG. 8 (a)), and Bet v1a
  • the analysis result (FIG. 8 (b)) of the amino acid sequence of the peptide detected even when exposed to Bet v1a detected under no treatment conditions is shown.
  • the amino acid sequence of Bet v1a is also shown. In the amino acid sequence of Bet v1a, peptides were detected at roughly three locations.
  • the analysis result (a) of the amino acid sequence of the peptide detected when exposed to Infliximab in MAPPs using dendritic cell-like cells derived from human iPS cells is shown.
  • the amino acid sequences of H chain and L chain of Infliximab are also shown.
  • Analysis result of amino acid sequence of peptide detected even when exposed to Infliximab, detected under Infliximab untreated conditions in MAPPs using dendritic cell-like cells derived from human iPS cells (Tic line) (b) Indicates.
  • the amino acid sequences of H chain and L chain of Infliximab are also shown.
  • FIG. 10B is a continuation of FIG. 10A.
  • 10B is a continuation of FIG. 10B.
  • 10C is a continuation of FIG. 10C.
  • 10D is a continuation of FIG. 10D.
  • FIG. 10E shows a continuation of FIG. 10E.
  • FIG. 10F shows a continuation of FIG. 10F.
  • FIG. 10G shows a continuation of FIG. 10G.
  • the analysis result of the amino acid sequence of the peptide detected when exposed to Phl p1 in MAPPs using dendritic cell-like cells derived from human iPS cells is shown.
  • numerator expressed on the cell surface of the monocyte cell obtained by the flow cytometer analysis is shown.
  • numerator expressed on the cell surface of the dendritic cell obtained by the flow cytometer analysis is shown.
  • numerator expressed on the cell surface of the dendritic cell obtained by the flow cytometer analysis is shown.
  • the analysis result of the amino acid sequence of the peptide detected in the MAPPs using PBMC derived dendritic cells of human donor under the Bet v1a addition condition and non-addition condition (control) is shown.
  • the analysis result of the amino acid sequence of the peptide detected in the MAPPs using PBMC derived dendritic cells of human donor under the Bet v1a addition condition and non-addition condition (control) is shown.
  • the analysis result of the amino acid sequence of the peptide detected in the MAPPs using PBMC derived dendritic cells of human donor under the Bet v1a addition condition and non-addition condition (control) is shown.
  • the analysis result of the amino acid sequence of the peptide detected in the MAPPs using PBMC derived dendritic cells of human donor under the Bet v1a addition condition and non-addition condition (control) is shown.
  • the analysis result of the amino acid sequence of the peptide detected in the MAPPs using PBMC derived dendritic cells of human donor under the Bet v1a addition condition and non-addition condition (control) is shown.
  • the analysis result of the amino acid sequence of the peptide detected in the MAPPs using PBMC derived dendritic cells of human donor under the Bet v1a addition condition and non-addition condition (control) is shown.
  • FIG. 21B is a continuation of FIG. 21A.
  • the protein may be, for example, a natural protein, a recombinant protein, or a synthetic peptide prepared by artificially combining amino acids. It is understood that a protein may be a single protein or a mixture of different proteins. The protein may include unnatural amino acids. For example, it may be glycosylated when produced in vivo.
  • the protein is preferably a protein (eg, antibody, hormone, etc.) associated with the treatment or prevention of an animal (preferably human).
  • the protein may be selected from one or more, preferably from the group consisting of cytokines, chemokines, growth factors, antibodies, enzymes, structural proteins, hormones, and fragments of any of these.
  • Proteins are presented as antigens in complex with MHC molecules after being taken up by cells and broken down, or after being taken up by cells but without being broken down or after being broken down in cells.
  • the length of the amino acid sequence of the protein is not particularly problematic.
  • the protein may be a peptide itself that forms a complex with an MHC molecule and presents an antigen.
  • an epitope refers to a specific structural unit of an antigen that is recognized and bound by an antibody.
  • An epitope is the smallest unit for antigenicity and is also called an antigenic determinant.
  • differentiation refers to a state or aspect in which individual cells or cell populations that were originally single or identical are complicated or heterogeneous due to structural and / or functional changes. You may point to.
  • differentiation may be used interchangeably with differentiation induction, and includes a state where differentiation induction is started, a state where differentiation induction is continued, a state where differentiation induction is completed, and the like. It is understood that a state in which a cell or a cell population that has completed is proliferating is naturally included.
  • the induction may mean an action that promotes differentiation of a certain cell or cell population into another cell or cell population structurally and / or functionally, and is not particularly limited as long as differentiation can be achieved.
  • the stem cell means a pluripotent stem cell and is not particularly limited as long as it has differentiation pluripotency and self-replication ability.
  • stem cells include artificial pluripotent stem cells (iPS cells), embryonic stem cells (ES cells), nuclear transplant ES cells (ntES cells), embryonic germ stem cells (EG cells), and adult stem cells (WO2012 / 115276). These stem cells are preferably derived from mammals, more preferably from humans.
  • ES cells are embryonic stem cells derived from the 8-cell stage of a fertilized egg, the inner cell mass of a blastocyst, which is an embryo after the morula.
  • ES cells can be established by taking an inner cell mass from a blastocyst of a fertilized egg of a target animal and culturing the inner cell mass on a fibroblast feeder, and its establishment and maintenance method is known. (For example, US Patent No. 5,843,780 etc.).
  • the selection of ES cells may be performed by Real-Time PCR using, for example, the expression of gene markers such as alkaline phosphatase, OCT-3 / 4, NANOG as an index.
  • the expression of gene markers such as OCT-3 / 4, NANOG, FBX15, FGF4, REX1, ECAD may be used as an index (E. Kroon et al. (2008), Nat. Biotechnol., 26: 443-452).
  • embryos used in producing human ES cells are, for example, returned to the mother in infertility treatment by in vitro fertilization.
  • Unfertilized eggs may be used that have no intrinsic ability to grow into humans and whose cell division and growth is based on parthenogenesis.
  • ES cells may be produced using only a single blastomere of the cleavage stage before the blastocyst stage without destroying the embryo's developmental potential and without destroying the fertilized egg (Chung Y , Klimanskaya I, Becker S, Marh J, Lu SJ, Johnson J, Meisner L, Lanza R. (2006).
  • ES cells may be generated from human embryos that have stopped developing (Zhang X, Stojkovic P, Przyborski S, Cooke M, Armstrong L, Lako M, Stojkovic M. (2006). Stem Cells 24: 2669- 2676.).
  • iPS cells can be produced by introducing specific reprogramming factors into somatic cells in the form of DNA or protein, and have almost the same properties as ES cells, such as differentiation pluripotency and self-renewal ability.
  • Artificial stem cells derived from somatic cells K. Takahashi and S. Yamanaka (2006) Cell, 126: 663-676; K. Takahashi et al. (2007), Cell, 131: 861-872; J. Yu et. al. (2007), Science, 318: 1917-1920; Nakagawa, M. et al., Nat. Biotechnol. 26: 101-106 (2008); WO2007 / 069666).
  • the somatic cell may refer to any animal cell (preferably, a mammalian cell including a human) excluding germ line cells and pluripotent stem cells.)
  • the reprogramming factor is a gene specifically expressed in ES cells, its gene product or non-cording RNA, or a gene that plays an important role in maintaining undifferentiation of ES cells, its gene product or non-cording RNA Alternatively, it may be a low molecular compound.
  • OCT3 / 4 SOX2, SOX1, SOX3, SOX15, SOX17, KLF4, KLF2, c-MYC, N-MYC, L-MYC, NANOG, LIN28, FBX15, ERAS, ECAT15-2, TCLL , Beta-catenin, LIN28B, SALL1, SALL4, ESRRB, NR5A2, TBX3.
  • initialization factors may be used alone or in combination. Examples of combinations of initialization factors include the following combinations.
  • OCT gene, KLF gene, SOX gene or combinations of reprogramming factors include, for example, WO2007 / 069666, WO2008 / 118820, WO2009 / 007852, WO2009 / 032194, WO2009 / 058413, WO2009 / 057831, WO2009 / 075119 , WO2009 / 079007, WO2009 / 091659, WO2009 / 101084, WO2009 / 101407, WO2009 / 102983, WO2009 / 114949, WO2009 / 117439, WO2009 / 126250, WO2009 / 126251, WO2009
  • the reprogramming factor or the factor that promotes reprogramming examples include MEK inhibitors, DNA methyltransferase inhibitors, histone deacetylase (HDAC) inhibitors, and histone methyltransferase inhibitors that are known to those skilled in the art. , P53 inhibitors may be mentioned.
  • the reprogramming factor is used in a somatic cell according to a method known to those skilled in the art such as a calcium phosphate method, a lipofection method, a microinjection method, or the like using a vector (for example, a viral vector, a plasmid vector, an artificial chromosome vector) or the like. May be introduced.
  • DMEM DMEM / F12 or DME medium containing 10-15% FBS (these are leukemia inhibitory factor (LIF), penicillin / streptomycin, puromycin, L-glutamine, non-essential) Amino acids, ⁇ -mercaptoethanol and the like may further be included as appropriate.
  • LIF leukemia inhibitory factor
  • penicillin / streptomycin penicillin / streptomycin
  • puromycin puromycin
  • L-glutamine non-essential Amino acids
  • ⁇ -mercaptoethanol a commercially available medium known to those skilled in the art may be used as appropriate.
  • iPS cell culture may be appropriately set according to the composition of the medium. For example, in the presence of 5% CO 2 at 37 ° C., using 10% FBS-containing DMEM or DMEM / F12 medium, somatic cells are brought into contact with reprogramming factors and cultured for about 4 to 7 days.
  • Prime ES cell culture containing basic fibroblast growth factor (bFGF) about 10 days after contact with somatic cells and reprogramming factors after repopulating on cells (eg, mitomycin C-treated STO cells, SNL cells)
  • the iPS-like colonies may be generated from about 30 to about 45 days after the contact and cultured in a working medium.
  • 10% FBS-containing DMEM medium (these are LIF, penicillin / streptomycin, puromycin, L-glutamine, on a feeder cell (for example, mitomycin C-treated STO cell, SNL cell) in the presence of 5% CO 2 at 37 ° C. It may further contain non-essential amino acids, ⁇ -mercaptoethanol, etc.), and may give rise to iPS-like colonies from about 25 to about 30 days or later.
  • feeder cells reprogrammed somatic cells themselves may be used, or an extracellular matrix or Matrigel (BD) may be used.
  • cultivate using a serum-free medium (Sun N, et al. (2009), Proc Natl Acad Sci USA 106.15720-15725).
  • IPS cells may be selected according to the shape of the formed colonies (for example, can a cell cluster showing a shape close to a sphere be obtained).
  • a drug resistance gene that is expressed in conjunction with a gene that is expressed when somatic cells are initialized for example, alkaline phosphatase, OCT3 / 4, NANOG
  • a medium containing the corresponding drug for example, alkaline phosphatase, OCT3 / 4, NANOG
  • the established iPS cells can be selected by culturing in.
  • the marker gene is a fluorescent protein gene
  • iPS cells can also be selected by observing with a fluorescence microscope.
  • the cells may be cultured in vitro by a known differentiation method, and determined as iPS cells using the ability to differentiate into desired cells as an index.
  • the cells are transplanted subcutaneously in immunodeficient mice, and the tumor tissue formed after a lapse of a predetermined period is analyzed to confirm that teratomas (teratomas) that contain various tissues are formed. It may be determined that Alternatively, it may be determined to be an iPS cell by confirming that a marker gene specifically expressed in the ES cell is expressed. Alternatively, a gene-wide gene expression pattern may be detected by a microarray or the like, and a cell highly correlated with an ES cell expression pattern may be determined as an iPS cell.
  • the established iPS cells may be sold and used.
  • ntES cell is an ES cell derived from a cloned embryo produced by nuclear transfer technology, and has almost the same characteristics as an ES cell derived from a fertilized egg (T. Wakayama et al. (2001), Science, 292: 740-743; S. Wakayama et al. (2005), Biol. Reprod., 72: 932-936; J. Byrne et al. (2007), Nature, 450: 497-502). That is, an ES cell established from an inner cell mass of a blastocyst derived from a cloned embryo obtained by replacing the nucleus of an unfertilized egg with the nucleus of a somatic cell is an ntES cell.
  • ntES cells For the production of ntES cells, a known nuclear transfer technology (for example, JB Cibelli et al. (1998), Nature Biotechnol., 16: 642-646) may be combined with a known ES cell production technology ( Wakayama Kiyoka et al. (2008), Experimental Medicine, 26, 5 (extra number), 47-52).
  • somatic cell nuclei may be injected into an enucleated unfertilized egg of a mammal and initialized by culturing for several hours.
  • EG cells are cells that are established from embryonic primordial germ cells and have the same pluripotency as ES cells (Y. Matsui et al. (1992), Cell, 70: 841-847). It may be established by culturing primordial germ cells in the presence of LIF, bFGF, Stem Cell Factor (STF), etc. (Y. Matsui et al. (1992), Cell, 70: 841-847).
  • Adult stem cells are cells that are not terminally differentiated and are found in vivo, and exist as a source of progenitor cells to terminally differentiated cells.
  • Adult stem cells exist in each tissue in the living body, and the types of cells that can be differentiated are usually limited.
  • hematopoietic stem cells that can be differentiated into monocytes, macrophages, dendritic cells and the like are particularly preferable as examples of adult stem cells.
  • a hematopoietic progenitor cell refers to a cell differentiated from a hematopoietic stem cell.
  • a stem cell-derived progenitor cell refers to any cell (for example, mesoderm progenitor) observed in the process of obtaining an antigen-presenting cell (specifically, a cell that expresses an MHC molecule) by differentiating the stem cell.
  • Cell hematopoietic progenitor cell, granulocyte / macrophage colony forming cell, lymphoblast, monoblast, pre-monocyte or monocyte).
  • MHCI molecules Peter Parham (2007), Essential Immunology; The Human Protein Atlas, http://www.proteinatlas.org/
  • Proteins can be presented to killer T cells via MHCI molecules.
  • specific cells have MHCII molecules in addition to MHCI molecules, and foreign antigens can be presented to helper T cells via MHCII molecules (also called professional antigen-presenting cells).
  • antigen presenting cells may include both of these cell types.
  • the antigen-presenting cell is the latter type, for example, dendritic cells, macrophages, monocytes, and B cells are preferable.
  • cytokines such as interferon and MHCII molecules are induced, thyroid follicular cells, fibroblasts, vascular endothelial cells, etc. also function as antigen-presenting cells, so these cells are also listed as the latter type. May be.
  • the antigen-presenting cell specifically, a cell that expresses an MHC molecule, such as a dendritic cell, a macrophage, a monocyte, or a B cell
  • MHCI molecule and / Or cells expressing MHCII molecules may be used as an indicator, and at least one of CD11a, CD11b, CD11c, CD14, CD15, CD40, CD80, CD83, CD86, CD123, CD205, CD206, CD209, CCR7 It is more preferable to use as an index a cell expressing.
  • dendritic cells are advantageous as antigen-presenting cells because they have strong antigen-presenting ability and helper T-cell activation ability.
  • dendritic cells are cells having cell processes and exhibiting a dendritic or dendritic morphology.
  • at least one of CD11b, CD11c, CD40, CD80, CD83, CD86, CD123, CD205, CD206, CD209, and CCR7 can be used as a criterion for determining whether or not the dendritic cell has characteristics. May be used as an index, and it is more preferable to use as an index whether all of the MHCII molecules, CD80, CD86, CD206, and CD209 are expressed.
  • dendritic cells that express all of the MHCII molecules, CD80, CD86, CD206, and CD209 and are negative for CD14.
  • a criterion for determining whether or not it has characteristics as a macrophage cell for example, it may be used as an index whether CD11b is further expressed in addition to the MHCII molecule.
  • CD80 and CD86 are known to transmit signals to helper T cells to activate the cells.
  • the dendritic cell-like cells obtained in this example have similar properties to monocyte-derived dendritic cells in terms of cell shape, cell surface molecule expression, and helper T cell stimulation ability. It may be included in the dendritic cells in the specification. Similarly, the monocyte-like cells obtained in this example may be included in the monocyte cells herein.
  • the antigen-presenting cell is preferably derived from a mammal, more preferably from a human.
  • the MHC molecule may be either an MHCI molecule or an MHCII molecule, but an MHCII molecule is more preferable.
  • Human MHC is called human leukocyte antigen (HLA).
  • MHCI molecules are further divided into classical class I molecules (class Ia) and nonclassical class I molecules (class Ib).
  • Classical class I molecules include HLA-A, HLA-B, and HLA-C in humans, and nonclassical class I molecules include HLA-E, HLA-F, and HLA-G in humans.
  • examples of MHCII molecules include HLA-DR, HLA-DQ, and HLA-DP in humans.
  • MHC molecules are slightly different in individual amino acid sequences even among homologous animals, and can be divided into several types called allotypes. For example, in the case of HLA-DR, many allotypes such as DR1, DR2, DR3, DR4... Are known. Since allotypes are linked to each other on the MHC gene, they are inherited from a parent to a child as a pair unless genetic recombination occurs in this region. This unit is called the halotype. In patient-derived stem cells (for example, iPS cells), even if they are subcultured and differentiated, the patient's MHC gene sequence is basically retained as it is. Thus, antigen-presenting cells obtained by differentiating the stem cells The allotype of the MHC molecule possessed by is maintained.
  • allotypes for example, in the case of HLA-DR, many allotypes such as DR1, DR2, DR3, DR4... are known. Since allotypes are linked to each other on the MHC gene, they are
  • Each allotype can form a complex with a different antigenic peptide fragment (epitope) and present the epitope on the cell surface, so for each allotype set, in other words, for each patient with that allotype set.
  • epitope an antigenic peptide fragment
  • the presence or absence of immunogenicity and side effects on the target protein varies. Since allotypes and haplotypes have patterns characteristic of race and ethnicity, they can be used for analysis of the presence or absence of side effects and other immunogenicity to target proteins for each race and ethnicity.
  • allotypes possessed by individuals can be determined by genetic analysis (for example, DNA amplified by polymerase chain reaction (PCR) is hybridized with beads to which probes are immobilized, the fluorescence intensity is digitized, and data analysis is performed. Therefore, it is possible to determine whether the target protein has immunogenicity, side effects, or the like based on the specified allotype information.
  • genetic analysis for example, DNA amplified by polymerase chain reaction (PCR) is hybridized with beads to which probes are immobilized, the fluorescence intensity is digitized, and data analysis is performed. Therefore, it is possible to determine whether the target protein has immunogenicity, side effects, or the like based on the specified allotype information.
  • Other specific examples of the genetic diagnosis include the method described in International Journal of Immunogenetics, 2011; 38: 6, pp.463-473.
  • the antigen-presenting cell may express one or more allotypes of the MHC molecule of a subject (eg, a mammal, preferably a human) intended to be administered the target protein.
  • a subject eg, a mammal, preferably a human
  • the stem cell or progenitor cell derived therefrom in the present invention is a cell that expresses one or more allotypes of MHC molecules possessed by a subject (eg, a human patient or a healthy human subject) intended for analysis.
  • a subject eg, a human patient or a healthy human subject
  • one or more cells expressing one or more allotypes of the MHC molecule of the subject may be used so that all sets of allotypes of the MHC molecule possessed by the subject are included.
  • cells that express one or more allotypes of MHC molecules that are highly expressed in the race or ethnic group that is intended for analysis may be prepared.
  • the race, Immunogenicity may be analyzed by covering a certain percentage of the population (for example, 30% to 80% or more). As appropriate, for example, it is advantageous to perform comparative analysis of human patients, human patients and healthy human subjects, and healthy human subjects.
  • the method for differentiating stem cells or progenitor cells derived therefrom into antigen-presenting cells is not particularly limited as long as it is a method known to those skilled in the art.
  • methods for differentiating stem cells such as ES cells and iPS cells into monocytes, macrophages, B cells, or dendritic cells include WO2009 / 120891; WO2009 / 074341; Regen. Med.
  • BMP-4 Bone Morphogenetic Protein-4
  • GM-CSF Granulocyte Macrophage-Colony Stimulating Factor
  • SCF Stem Cell Factor
  • VEGF Vascular Endothelial Growth Factor
  • monocytes Differentiating into monocytes; then the monocytes are further differentiated into immature dendritic cells using GM-CSF and Interleukin-4 (IL-4); Is differentiated into mature dendritic cells using a maturation cocktail consisting of GM-MSF, TNF- ⁇ , Interleukin-1 ⁇ (IL-1 ⁇ ), Interferon- ⁇ (IFN- ⁇ ), and PGE2. Is disclosed. Moreover, PLoS One, April 2013, Vol. 8, Issue 4, e59243 discloses that functional macrophages and dendritic cells were obtained based on monocytes differentiated from ES cells and iPS cells. Yes.
  • NATURE IMMUNOLOGY Vol.5, No.4, 2004, pp.410-417 describes the method of producing T cells from ES cells, but B cells can also be produced during the production process.
  • B cells can also be produced during the production process.
  • WO2012 / 115276 may preferably be referred to as a specific method for differentiating stem cells or progenitor cells derived therefrom into antigen-presenting cells.
  • the antigen-presenting cell is a dendritic cell
  • following the step of providing a stem cell or a progenitor cell derived therefrom the following step: (A) a step of differentiating a stem cell or a progenitor cell derived therefrom to obtain a mesoderm progenitor cell; (B) differentiating the mesodermal progenitor cells to obtain monocytic cells; and (c) differentiating the monocyte cells to obtain immature dendritic cells, and optionally, immature dendritic cells
  • a step of further stimulating to obtain mature dendritic cells may be included.
  • a serum-free medium may be used at least in the step (c), and a serum-free medium may be used in both the steps (b) and (c).
  • a serum-free medium is used in all of the steps (a) to (c).
  • the serum may refer to mammal-derived serum such as human serum, monkey serum, fetal bovine serum, sheep serum, rabbit serum, rat serum, guinea pig serum, mouse serum.
  • the serum-free medium refers to a medium to which no serum is added and no commercially available serum substitute such as B-27 is added, preferably albumin or albumin substitute, transferrin or transferrin substitute , Insulin or an insulin substitute, and a medium containing at least one of selenite. More preferably, it may be a medium containing Insulin-Transferrin-Selenium-X Supplement (ITS).
  • ITS Insulin-Transferrin-Selenium-X Supplement
  • Preferred serum-free media include, for example, minimal essential medium (MEM), Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM), Iskov's modified Dulbecco medium (IMDM), StemPro-34 medium (Life Tech), Stemline II (SIGMA), or Primate ES cell Examples include a medium in which ITS is added to medium (ReproCELL) or the like.
  • MEM minimal essential medium
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle medium
  • IMDM Iskov's modified Dulbecco medium
  • SIGMA Stemline II
  • Primate ES cell Examples include a medium in which ITS is added to medium (ReproCELL) or the like.
  • stem cells or progenitor cells derived therefrom are cultured in a medium containing a BMP family protein and then cultured in a medium containing growth factors and hematopoietic factors, or in a medium containing VEGF.
  • a step of obtaining mesoderm progenitor cells by culturing in a medium containing a hematopoietic factor after culturing may be included.
  • the step (b) may include a step of culturing in a medium containing a hematopoietic factor to obtain monocytic cells by differentiating the mesodermal progenitor cells.
  • the step (a) and the step (b) can be performed continuously.
  • the BMP family protein may refer to a cytokine having about 20 subtypes belonging to the TGF- ⁇ superfamily.
  • a preferred BMP family protein in the present invention is BMP2 and / or BMP4, more preferably BMP4.
  • the growth factor may be preferably VEGF, specifically, VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, VEGF-E, PlGF (placental growth factor) -1, PlGF-2 Or these alternative splicing variants (for example, variants of 121, 165, 189 or 206 amino acids are known for VEGF-A).
  • a preferred VEGF in the present invention is VEGF-A.
  • the growth factor may contain bFGF in addition to VEGF.
  • the hematopoietic factor is a factor that promotes the differentiation and proliferation of blood cells.
  • SCF Stem Cell Factor
  • G-CSF granulocyte colony stimulating factor
  • GM-CSF granulocyte / macrophage colony stimulating factor
  • M-CSF macrophage colony stimulating factor
  • EPO erythropoietin
  • TPO thrombopoietin
  • IL interleukins
  • the interleukins may be IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, or IL-9.
  • the preferred hematopoietic factor in the step (b) may be selected from the group consisting of SCF, TPO, IL-3, Flt3-ligand, GM-CSF and M-CSF. Hematopoietic factors may be used alone or in combination.
  • the step (a) using a combination of VEGF as a growth factor and SCF as a hematopoietic factor may be performed.
  • the step (b) it is preferable to culture by changing the medium every several days (for example, every 3 to 4 days).
  • non-adherent cells (monocyte cells (like cells)) are obtained by the step (b), they may be used as monocytes in the step (c).
  • the non-adherent cells have the characteristics of monocytes, for example, using flow cytometry, etc., in addition to the expression of MHCII molecules, CD14, CD45 hi , CD11a, CD11b, which are markers of monocytes, The expression of CD15 etc. can be determined as an index.
  • monocytes used for induction into dendritic cells by separating only CD14 positive cells from non-adherent cells using the magnetic bead method or the like. Can increase the percentage of cells.
  • the step (c) further includes: (Ci) culturing the monocytes (floating) in a medium containing a hematopoietic factor and obtaining immature dendritic cells (like cells) by differentiation, and optionally, (Cii) a step of inducing the resulting immature dendritic cell (like cell) into an mature dendritic cell (like cell) by further contacting with an immunogen and optionally an inflammatory cytokine. It's okay.
  • the immature dendritic cell-like cell or the mature dendritic cell-like cell has the characteristics of a dendritic cell, for example, using flow cytometry or the like, in addition to the expression of MHCII molecule, Whether or not at least one of a certain CD11b, CD11c, CD40, CD80, CD83, CD86, CD123, CD205, CD206, CD209, and CCR7 is further expressed may be used as an index. Furthermore, whether dendritic cells have the characteristics of immature dendritic cells or mature dendritic cells is verified using, for example, the expression variation of MHCII molecules (HLA-DR, etc.) as an index. can do.
  • the hematopoietic factor may be the aforementioned factor.
  • a combination of GM-CSF, IL-3 and IL-4, or a combination of GM-CSF and IL-4 may be used.
  • the immunogen and the inflammatory cytokine When the immunogen and the inflammatory cytokine are brought into contact with immature dendritic cells, they can be induced into mature dendritic cells by pulsing the cells. While immature dendritic cells have high antigen phagocytic ability but low antigen presenting ability, they mature into mature dendritic cells due to invasion of antigen into the living body, and proteins such as MHCII molecules required for antigen presentation Expression can be enhanced to improve antigen presenting ability.
  • the immunogen may be any substance that causes an immune response when introduced into a living body, and includes, for example, lipopolysaccharide (LPS, present in pathogens).
  • LPS lipopolysaccharide
  • the protein to be evaluated has immunogenicity, it can be understood by those skilled in the art that the protein can act as an immunogen.
  • the immature dendritic cells are induced into mature dendritic cells by contacting the immunogenic target protein.
  • the inflammatory cytokine may be, for example, Tumor Necrosis Factor- ⁇ (TNF- ⁇ ), TNF- ⁇ , IL-12, or IFN- ⁇ .
  • TNF- ⁇ Tumor Necrosis Factor- ⁇
  • TNF- ⁇ Tumor Necrosis Factor- ⁇
  • IL-12 IL-12
  • IFN- ⁇ IFN- ⁇ .
  • the immunogen and the inflammatory cytokine may be used alone or in combination as appropriate.
  • step (D) You may perform the process of differentiating the said monocyte cell and obtaining a macrophage.
  • the monocyte cells can be differentiated into macrophages, preferably using GM-CSF or M-CSF as a hematopoietic factor.
  • M1 macrophages by adding, for example, IFN- ⁇ or LPS
  • M2 macrophages by adding, for example, IL-4 or IL-13
  • Macrophages are It is known to be activated by receiving cytokines produced by helper T cells, and classical activation (M1 macrophage) and selective activation (M2 macrophage) are known.
  • the concentrations of growth factors, hematopoietic factors, cytokines, and the like used in the above-described steps may be any concentrations that can obtain the target antigen-presenting cells, and can be appropriately determined by those skilled in the art.
  • the concentration of BMP4 may be, for example, 5 to 150 ng / ml, more preferably 10 to 100 ng / ml, and further preferably 20 to 80 ng / ml.
  • the concentration of VEGF may be, for example, 20 to 100 ng / ml, more preferably 30 to 70 ng / ml, and further preferably 40 to 50 ng / ml.
  • the concentration of bFGF may be, for example, 10 to 100 ng / ml, and more preferably 20 to 50 ng / ml.
  • the concentration of SCF may be, for example, 20 to 100 ng / ml, more preferably 30 to 70 ng / ml, and further preferably 40 to 50 ng / ml.
  • the concentration of IL-3 may be, for example, 5 to 100 ng / ml, and more preferably 30 to 70 ng / ml.
  • the concentration of TPO may be, for example, 1 to 25 ng / ml, and more preferably 1 to 10 ng / ml.
  • the concentration of Flt3-ligand may be, for example, 10 to 100 ng / ml, and more preferably 30 to 70 ng / ml.
  • the concentration of GM-CSF may be, for example, 5 to 250 ng / ml, and more preferably 50 to 200 ng / ml.
  • the concentration of M-CSF may be, for example, 5 to 100 ng / ml, and more preferably 30 to 70 ng / ml.
  • the concentration of IL-4 may be, for example, 3 to 100 ng / ml, and more preferably 10 to 70 ng / ml.
  • the concentration of TNF- ⁇ may be, for example, 0.05 to 50 ng / ml, and more preferably 0.1 to 20 ng / ml. In the case of LPS, for example, 0.01 to 100 ⁇ g / ml may be used, and 0.1 to 10 ⁇ g / ml is more preferable.
  • growth factors, hematopoietic factors, cytokines and the like may be used in appropriate combinations according to the purpose, and those skilled in the art can appropriately determine the optimum concentration.
  • the concentration of the (target) protein to be evaluated may be a concentration that can identify the epitope of the protein, for example, depending on the purpose, or the protein is a target (for example, a mammal, preferably a human). Any concentration that can evaluate whether or not it has immunogenicity may be used, or any concentration that can induce immature dendritic cells to be induced into mature dendritic cells. Those skilled in the art appropriately determine the concentration. it can. Such a concentration may be, for example, 0.01 to 1000 ⁇ g / ml, and more preferably 0.1 to 100 ⁇ g / ml.
  • the period of the step (a) may be, for example, 2 days or more, preferably 2 to 10 days, and more preferably 5 to 8 days.
  • the period of the step (b) may be, for example, 1 day or longer, preferably 20 to 200 days, more preferably 50 to 150 days.
  • the period of the step (ci) may be, for example, 1 day or more, preferably 1 to 10 days, and more preferably 4 to 6 days.
  • the period of the step (cii) may be, for example, 12 hours or more, preferably 12 to 36 hours, and more preferably 24 hours (1 day).
  • the period of the step (d) may be, for example, 1 day or more, preferably 1 to 20 days.
  • the macrophages may be further differentiated into M1 macrophages or M2 macrophages.
  • those skilled in the art can appropriately determine the optimum culture period in consideration of each culture condition.
  • the present invention also includes a method for producing a dendritic cell (in vitro) from a stem cell or a progenitor cell derived therefrom, including the steps (a) to (c), and whether or not the method has been obtained or obtained.
  • Good for dendritic cells that can be made. That is, dendritic cells produced by this method express not only MHCII molecules, but also CD80 and CD86, which are costimulatory molecules for helper T cells, and CD206 and CD209 that are sugar chain receptors. It was suggested that it has the ability to activate helper T cells and resistance to viruses and the like. Analysis of protein epitopes using dendritic cells obtained by this method contributes to the development of proteins with low immunogenicity, and is an excellent material for research on antigen-presenting cells against autoimmune diseases and viruses. Is expected to be.
  • a method for producing a dendritic cell (in vitro) from a stem cell or a progenitor cell derived therefrom comprising the following steps: (A ′) a step of differentiating a stem cell or a progenitor cell derived therefrom to obtain a mesoderm progenitor cell; (B ′) a step of obtaining monocytic cells by differentiating the mesoderm progenitor cells under a serum-free medium containing granulocyte / macrophage colony stimulating factor (GM-CSF) and macrophage colony stimulating factor (M-CSF); And (c ′) a step of differentiating the monocyte cells under serum-free medium to obtain immature dendritic cells, and optionally further stimulating the immature dendritic cells to obtain mature dendritic cells.
  • a ′ a step of differentiating a stem cell or a progenitor cell derived therefrom to obtain a mesoderm progenitor cell
  • the step (c ′) (C1 ′) a step of obtaining immature dendritic cells by differentiating the monocyte cells in a serum-free medium containing granulocyte / macrophage colony stimulating factor (GM-CSF) and interleukin 4 (IL-4). Including, and in some cases, (C2 ′) comprising inducing the immature dendritic cells into mature dendritic cells by contacting the immunogen and optionally inflammatory cytokines, The method according to [23]. [25] A dendritic cell obtainable by the method according to [23] or [24].
  • GM-CSF granulocyte / macrophage colony stimulating factor
  • IL-4 interleukin 4
  • a cell composition comprising the dendritic cell according to any one of [25] to [27].
  • the dendritic cell or the cell composition is used for controlling immune response for the purpose of performing immune cell therapy against infectious diseases or malignant tumors, or treating rejection associated with autoimmune disease or organ transplantation. May be used as a cell medicine.
  • the cell medicine may be used in an appropriate combination of auxiliaries such as a medium for the purpose of stably holding dendritic cells.
  • this invention is the method for identifying the epitope of protein in one aspect
  • mode Comprising: The following processes: (A) A step of bringing a target protein into contact with a cell expressing a major histocompatibility complex (MHC molecule) differentiated from a stem cell or a progenitor cell derived therefrom; (B) isolating the complex of the peptide contained in the target protein and the MHC molecule from the cell expressing the MHC molecule; and (C) eluting the peptide from the complex and identifying it.
  • Including a method the method comprises the following steps: (D) A step of verifying whether the identified peptide is an epitope that induces immunogenicity may be included. The method can perform the entire process in vitro.
  • the step (A) is preferably performed in the absence of serum.
  • the amount of cells that express MHC molecules necessary to obtain 100 ng MHC molecules can depend on the number of cells, the expression intensity of MHC molecules, and the degree of expression.
  • the amount of cells can be determined.
  • Each allotype of the MHCII molecule (eg, HLA-DQ1) can hold about 500 to 1000 different peptide fragments (Chicz R M et al., J Exp. Med. 1993, 178, 27-47; Chicz R M & Urban R G, Immunol. Today, 1993, 15, 155-160).
  • the majority of these different peptides only reach very low copy numbers and are therefore not very likely to play a physiological role in vivo.
  • peptide fragments that are involved in immunogenicity for example, activate helper T cells, reach moderate to high copy numbers (Latek R & Unanue E R, Immunol. Rev. 1999, 172: 209-228) .
  • These medium to high copy number peptides account for about 40-50% of the total amount of peptides eluted from MHCII molecules and may correspond to about 10-200 individual peptides.
  • the peptide is a peptide that is derived from the target protein (its amino acid sequence) and can form a complex with an MHC molecule on the surface of an antigen-presenting cell (specifically, a cell that expresses an MHC molecule).
  • the peptide may be bound to intracellular or extracellular MHC molecules.
  • Each allotype of the MHCII molecule can form a complex with various peptides, and the amount of peptide required for sequencing each eluted peptide may be, for example, only a femtomole amount.
  • an approximately femtomolar amount of a peptide fragment bound to the molecule can be isolated, and the sequence of the peptide can be identified.
  • the cell membrane of the cell may be solubilized.
  • the lysis may be performed by methods known to those skilled in the art, such as freeze-thawing, use of a surfactant, or a combination thereof.
  • a surfactant for example, Triton X-100 (TX100), Nonidet P-40 (NP-40), Tween 20, Tween 80, n-octyl glucoside, ZWITTERGENT, Lubrol, or CHAPS may be used.
  • TX100 Triton X-100
  • NP-40 Nonidet P-40
  • Tween 20 Tween 80
  • n-octyl glucoside ZWITTERGENT
  • Lubrol Lubrol
  • CHAPS CHAPS
  • the cell lysate containing the solubilized MHC molecule-peptide complex may be subjected to immunoprecipitation or immunoaffinity chromatography to purify the MHC molecule-peptide complex.
  • immunoprecipitation or immunoaffinity chromatography antibodies specific for MHC molecules and suitable for these methods (anti-MHCI molecular antibodies such as anti-HLA-A antibody, anti-HLA-B antibody, anti-HLA-C Antibody or anti-HLA-ABC antibody; or anti-MHCII molecule antibody, preferably anti-HLA-DR antibody, anti-HLA-DQ antibody or anti-HLA-DP antibody) may be used.
  • the specific antibody is preferably a monoclonal antibody and may be covalently or non-covalently bound to beads (eg, Sepharose beads or agarose beads) via, for example, Protein A.
  • beads eg, Sepharose beads or agarose beads
  • the amino group of an antibody may be covalently bonded to CNBr-activated sepharose to form a solid layer.
  • the monoclonal antibody may be purchased commercially or may be purified from the corresponding supernatant of each hybridoma cell using protein A- or protein G-affinity chromatography.
  • immunoisolation of MHC molecules may be performed by incubating antibody-beads with cell lysate while rotating for several hours.
  • the washing of the antibody-bead bound with the MHC molecule-peptide complex may be performed in an Eppendorf tube.
  • the result of immunoprecipitation may be analyzed by SDS-PAGE and Western blotting using an antibody that recognizes denatured MHC molecules.
  • the peptide can be obtained by methods known to those skilled in the art, for example, diluted acid, such as diluted acetonitrile (Jardetzky T S et al., Nature 1991 353, 326-329), diluted acetic acid and heated (Rudensky A Y et al. ., Nature 1991, 353, 622-626; Chicz® M et al, Nature 1992, 358, 764-768, or diluted trifluoroacetic acid (Kropshofer H et al., J Exp Med 1992, 175, 1799- 1803) may be used for elution.
  • Peptides are preferably eluted with diluted trifluoroacetic acid, for example at 37 ° C.
  • the MHC molecule-peptide complex Before the peptide is eluted from the MHC molecule-peptide complex, it may be washed with water or a low salt buffer to remove the remaining surfactant.
  • a low salt buffer a Tris buffer solution, a phosphate buffer solution, or an acetate buffer solution having a concentration of 0.5 to 10 mM may be used.
  • the MHC molecule-peptide complex may be washed with ultra high purity water for HPLC.
  • the washing may be performed by ultrafiltration. Ultrafiltration may be performed, for example, in an ultrafiltration tube having a cutoff value of 30 kD, 20 kD, 10 kD, or 5 kD and a tube volume of 0.5 to 1.0 ml. Washing in the ultrafiltration tube may be performed 4 to 12 times, for example, in a volume several tens of times the volume of the beads holding the MHC molecule-peptide complex.
  • the peptide may be eluted from the MHC molecule-peptide complex using this ultrafiltration tube.
  • the eluted peptide may then be lyophilized or dried by a centrifugal evaporator.
  • Each peptide (its amino acid sequence) may be identified by fractionating and analyzing the sequence of the eluted peptide mixture using liquid chromatography mass spectrometry (LC / MS).
  • LC / MS liquid chromatography mass spectrometry
  • amino acid sequence of each peptide in the peptide mixture can be revealed by known methods sufficient to sequence femtomolar amounts of the peptide.
  • Identification reveals the protein from which the peptide is derived and to which sequence in the protein the peptide is derived.
  • the eluted peptide mixture is preferably fractionated by, for example, a combination of reverse phase chromatography and anion exchange chromatography or cation exchange chromatography, or by reverse phase chromatography alone. Fractionation uses a fused-silica micro-capillary column connected to either the nanoflow electrospray source of the mass spectrometer or to a micro fractionator that spots the fraction on a MALDI analysis plate It may be performed in the HPLC mode.
  • ESI-MS electrospray ionization tandem mass spectrometry
  • PSD MALDI-post source decay
  • amino acid sequence analysis of each peptide may be determined using various means known to those skilled in the art. Sequence analysis may be performed by computer analysis of peptide fragment spectra, for example using the MASCOT algorithm or SEQUEST algorithm. These algorithms preferably use protein and nucleotide sequence databases to perform cross-correlation analysis of experimentally and theoretically generated tandem mass spectra. This allows for automated high-throughput sequence analysis.
  • MALDI-TOF matrix-assisted laser desorption / ionization time-of-flight mass spectrometry
  • the passage through the microcapillary column may be analyzed using a UV detector at a detection wavelength of 214 nm.
  • the amount of peptide may be estimated by comparing the peak area of the peptide to be analyzed to the peak area of a graded amount of standard peptide (control).
  • Elution of peptides from MHC molecules provides a set of peptides derived from the target protein and naturally fragmented in the antigen-presenting cells.
  • To identify and eliminate false positive peptides in addition to a set of antigen-presenting cells exposed to the target protein, as a negative control, prepare a set of antigen-presenting cells that are not exposed to the target protein for comparative analysis. Is preferred. Peptides that can only be detected in antigen-presenting cells exposed to the target protein compared to antigen-presenting cells that are not exposed to the target protein may function as epitopes of the protein from which the peptide is derived and may be identified as antigenic .
  • MHC binding motif means a structural feature common to peptides that bind to a specific MHC molecule (allelic polymorphism), which is necessary to form a stable complex with the MHC molecule.
  • the peptide length varies from 12 to 18 amino acids, and even longer peptides can be bound because both ends of the peptide binding groove are open.
  • Many MHCII molecules contain up to four residues (called “anchor residues”) related to binding in the relative positions contained in the 9-mer nonameric core region: P1, P4 , P6, and P9. However, this core region can vary in distance from the N-terminus of the peptide. Often 2 to 4 N-terminal residues precede the core region.
  • the P1 anchor residue is located at position 3, 4, or 5 of many peptides capable of forming a complex with the MHCII molecule.
  • peptides eluted from HLA-DR molecules may share a hydrophobic P1 anchor, such as tyrosine, phenylalanine, tryptophan, methionine, leucine, isoleucine, or valine.
  • the position and type of anchor residues can be deduced from the peptide binding motifs of frequent MHC molecules.
  • a computer algorithm capable of verifying a peptide sequence motif can be obtained from, for example, “Tepitope” (www.vaccinome.com, J. Hammer, Nutley, USA).
  • the MHC binding ability may be verified by a method known to those skilled in the art using the detected peptide itself (for example, a synthetic peptide may be used) and a desired MHC molecule (Kropshofer H et al., J Exp. Med. 1992, 175, 1799-1803; Vogt A B et al., J. Immunol. 1994, 153, 1665-1673; Sloan V S et al., Nature 1995, 375, 802-806).
  • the MHC binding ability may be verified using a cell binding assay that utilizes a cell line expressing MHC molecules and a biotinylated peptide (Arndt S O et al, EMBO J., 2000, 19 , 1241-1251).
  • the relative binding capacity of the peptide to MHC may be determined by measuring the concentration (IC50) required to reduce the binding of the labeled reporter peptide by 50%.
  • IC50 concentration required to reduce the binding of the labeled reporter peptide by 50%.
  • each identified peptide may be used, or a peptide having a sequence (core sequence) common to the identified peptides may be used.
  • the peptide to be detected is considered to depend on the type of allotype of the MHC molecule, the strength of binding affinity for the MHC molecule, and the like.
  • helper T cells The ability to stimulate helper T cells is particularly important in verifying whether the identified peptide functions as an epitope.
  • the identified peptide When the identified peptide stimulates helper T cells, it may be one of the indicators for determining that the peptide has immunogenicity. As the determination method, it may be tested whether the peptide identified by the method of the present invention is capable of activating helper T cells.
  • each identified peptide may be used, or a peptide having a sequence (core sequence) common to the identified peptides may be used.
  • helper T cells The cellular response of helper T cells may be measured by various in vitro methods known to those skilled in the art. For example, in the presence of the peptide to be evaluated, cells that express MHC molecules (for example, monocytes, macrophages, dendritic cells, etc.) are cultured together with helper T cells, and DNA proliferation is used as an indicator of cell proliferation of helper T cells. Whether thymidine (T) labeled with a radioactive substance is incorporated during replication may be measured. Alternatively, 5-bromo-2'-deoxyuridine (BrdU) may be used instead of thymidine.
  • MHC molecules for example, monocytes, macrophages, dendritic cells, etc.
  • the amount of BrdU incorporation may be measured using an enzyme or fluorescently labeled secondary antibody (for example, 5-Bromo-2'-deoxyuridine Labeling & Detection Kit III, Roch-Biochem, Cat No. 1 444 611). Alternatively, it is measured by Naive Primary T cell Assay (Proimmune) using a flow cytometry method with the indicator that the fluorescent dye label 5,6-carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) is diluted by helper T cell proliferation. Also good.
  • an enzyme or fluorescently labeled secondary antibody for example, 5-Bromo-2'-deoxyuridine Labeling & Detection Kit III, Roch-Biochem, Cat No. 1 444 611).
  • it is measured by Naive Primary T cell Assay (Proimmune) using a flow cytometry method with the indicator that the fluorescent dye label 5,6-carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) is diluted by helper T
  • helper T cells may be evaluated by measuring various cytokines produced from helper T cells.
  • cytokines include IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-12, IFN- ⁇ , or transforming growth factor- ⁇ (TGF- ⁇ ).
  • Cytokine measurement methods include various methods known to those skilled in the art, such as ELISA or ELISPOT.
  • dendritic cells produced by a method of producing dendritic cells from stem cells or progenitor cells derived therefrom may be used.
  • Cells that express MHC molecules may be rendered non-proliferative by, for example, treatment with ionizing radiation or mitomycin C prior to assay.
  • the present invention provides a method for producing a protein with reduced or eliminated immunogenicity, comprising the following steps: (1) identifying a protein epitope according to the method described above; (2) a method comprising modifying the epitope such that binding to MHC molecules is reduced or eliminated; and (3) producing a protein having the modified epitope.
  • the present invention also relates to a protein obtained or obtainable in accordance with the above production method in still another embodiment.
  • the “obtainable protein” may mean a protein that can be obtained by using the production method.
  • the peptide in which the epitope has been identified is modified so that the binding to the MHC molecule is reduced or eliminated, or the immunogenicity can be reduced or eliminated. Or it can be modified.
  • the reduction or disappearance of immunogenicity is not particularly limited as long as it is a method known to those skilled in the art.
  • the above-described MHC binding motif, MHC binding ability, or recognition by helper T cells is determined as an index. Also good.
  • in silico epitope prediction algorithms may be combined as appropriate.
  • alteration or modification may be performed according to a method known to those skilled in the art.
  • a DNA nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of a protein containing an epitope one or more desired nucleotides of the DNA sequence can be inserted, substituted, for example, using site-directed mutagenesis or homologous recombination, or It may be deleted.
  • one or more anchor residues important for binding to the MHC molecule can be changed to other amino acid residues, thereby reducing or eliminating immunogenicity.
  • an amino acid residue important for epitope recognition by a T cell receptor of a helper T cell or a B cell receptor of a B cell may be changed to another amino acid residue.
  • the P1 anchor of the HLA-DR1-restricted T cell epitope may be substituted with alanine, proline, glycine or a charged amino acid residue (Kropshofer et al., EMBO J. 15, 1996, 6144-6154).
  • the protein having a modified epitope may be chemically synthesized, or genetically or biologically synthesized.
  • host cells or animals that temporarily or permanently retain the gene of a protein having a modified epitope may be used.
  • Host cells and animals can be used, for example, as production systems for protein production and expression.
  • a host cell a eukaryotic cell or a prokaryotic cell may be used.
  • Examples of eukaryotic cells that can be used as host cells include animal cells, plant cells, and fungal cells.
  • Animal cells include mammalian cells such as CHO (Puck et al., (1958) J. Exp. Med. 108 (6): 945-956), COS, HEK293, 3T3, myeloma, BHK (baby hamster kidney) And amphibian cells such as Xenopus oocytes (Valle et al., Nature (1981) 291: 338-340) and insect cells such as Sf9, Sf21, and Tn5.
  • CHO cells are preferred for mass expression purposes.
  • a vector having a gene of a protein having a modified epitope for a host cell for example, calcium phosphate method, DEAE dextran method, method using cationic ribosome DOTAP (Boehringer Mannheim), electroporation method, lipofection, etc. It may be introduced by this method.
  • plant cells for example, cells derived from Nicotiana tabacum and Lemna minor are known as protein production systems, and proteins may be produced by a method of culturing these cells.
  • fungal cells examples include yeast, for example, cells of the genus Saccharomyces (Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces pombe, etc.), or filamentous fungi, for example, cells of the genus Aspergillus. -A protein expression system using niger (Aspergillus niger, etc.) may be used.
  • prokaryotic cells a production system using bacterial cells may be used.
  • bacterial cells for example, E. coli and Bacillus subtilis may be used.
  • animals include genetically modified animals and transgenic animals.
  • the type of animal is not limited, and for example, cows, sheep, mice, and the like may be used. In such a case, for example, a protein secreted in a body fluid such as milk may be collected.
  • a protein having a modified epitope may be mass-produced continuously or commercially.
  • the produced protein or a composition (for example, pharmaceutical composition) containing the protein is also included in the present invention.
  • the present invention in another aspect, is a method for predicting whether a protein is immunogenic in a subject, (I) providing a cell that expresses one or more allotypes of an MHC molecule of interest intended to be administered a target protein, wherein the cell is differentiated from a stem cell or a progenitor cell derived therefrom
  • a process characterized by: (II) a step of bringing a target protein into contact with the “cell expressing one or more allotypes of MHC molecules”; (III) isolating a complex of a peptide contained in the target protein and an MHC molecule from the “cell expressing one or more allotypes of the MHC molecule”; (IV) eluting and identifying the peptide from the complex; and (V) optionally verifying whether the identified peptide is an epitope that induces immunogenicity, When the identified peptide is an epitope that induces immunogenicity, it relates to a method that indicates that the target protein is immunogenic
  • the prediction method also makes it possible to compare the presence or absence or degree of immunogenicity based on each allotype or allotype set of MHC molecules for a given protein.
  • the prediction method further provides one or a plurality of cells expressing one or more allotypes of the target MHC molecule so that all sets of allotypes of the MHC molecule possessed by the target are included.
  • the stem cells are still more preferably stem cells (eg, iPS cells or ES cells) derived from the subject (eg, mammals, preferably humans). This is because antigen-presenting cells obtained by differentiating stem cells maintain the allotype of the MHC molecule.
  • stem cells derived from the subject antigen presentation with all the set of allotypes of the MHC molecule that the subject has Based on the ability to produce cells.
  • the prediction method also relates to a method for selecting a subject (for example, a patient) having immunogenicity or a method for selecting a subject (for example, a patient) having no immunogenicity.
  • the prediction method also relates to a method that indicates that one or more specific allotypes of the MHC molecule are involved in immunogenicity in relation to the protein intended for administration.
  • stem cells eg, iPS cells or ES cells
  • stem cells derived from the subject (eg, mammals, preferably humans) may be prepared from any somatic cell of the subject as long as the MHC molecule allotype is maintained.
  • iPS cells can also be produced from PBMC isolate
  • Such reports include, for example, Soares FA, Pedersen RA, Vallier L., Generation of Human Induced Pluripotent Stem Cells from Peripheral Blood Mononuclear Cells, Using Sendai Virus, Methods QuartiB: 2015 ., Generation of Patient-Specific induced Pluripotent Stem Cell from Peripheral Blood Mononuclear Cells by Sendai Reprogramming Vectors, Methods Mol Biol. 2014 Dec 19; Su RJ, Neisses A, ZhangXB. Episomal Vectors, Methods Mol Biol.
  • the cell can be used in the prediction method.
  • the cell derived from the subject used for the production of stem cells such as iPS cells is a cell that can identify an MHC molecule allotype (HLA genotype in humans) or an MHC molecule allotype. Cells (or predicted). Alternatively, iPS cells in which the allotype of the MHC molecule is already known (or predicted) may be used.
  • the present invention provides a composition for treating and / or preventing a disease associated with the protein in a subject, comprising the protein as an active ingredient, wherein the subject is It relates to a composition, characterized in that it is selected from (only) subjects that are predicted to be non-immunogenic to the protein.
  • the “therapeutic and / or prophylactic composition” preferably contains a therapeutically and / or prophylactically effective amount of the protein, and those skilled in the art can appropriately determine the effective amount of the protein.
  • the “treatment and / or prevention composition” may include one or more other agents.
  • protein was predicted to be non-immunogenic means that the target protein does not elicit immunogenicity in the subject or is immunized only to an extent that is acceptable from the standpoint of efficacy and safety. It may mean not to cause primality.
  • the composition is preferably a pharmaceutical composition.
  • the protein when used in a (pharmaceutical) composition, it can be formulated by a known pharmaceutical manufacturing method.
  • the protein is contained orally as a tablet, capsule, elixir, or microcapsule with sugar coating as necessary, or in water or other pharmaceutically acceptable liquid It can be used parenterally (eg, transdermally, intranasally, transbronchially, intramuscularly, or intravenously) in the form of a solution or suspension.
  • the (pharmaceutical) composition may be produced by appropriately including a pharmaceutically acceptable carrier, flavoring agent, excipient, vehicle, preservative, stabilizer, or binder.
  • a liquid carrier such as fats and oils can be further contained.
  • Sterile solutions for injection can be formulated according to methods well known to those skilled in the art using a vehicle such as distilled water for injection.
  • Aqueous solutions for injection include, for example, isotonic solutions containing physiological saline, glucose and other adjuvants such as D-sorbitol, D-mannose and D-mannitol.
  • a suitable solubilizing agent such as an alcohol such as ethanol, a polyalcohol such as propylene glycol or polyethylene glycol, a polyionic salt such as polysorbate 80 (TM) or HCO-50 may be used in combination.
  • the oily liquid include sesame oil and soybean oil.
  • a solubilizing agent for example, benzyl benzoate or benzyl alcohol may be used in combination.
  • the prepared injection solution may be used by filling a suitable ampoule.
  • the dosage, administration method, administration interval, etc. of the protein or the therapeutic and / or prophylactic composition containing the protein as an active ingredient vary depending on the body weight, age, symptoms, etc. of the patient. It can be selected and determined as appropriate.
  • the protein and the disease related to the protein are not particularly limited. It is still preferred if the protein is a protein that can cause problems with immunogenicity, efficacy or safety when administered in vivo.
  • Diseases are not limited, but include, for example, autoimmune diseases (for example, Rheumatoid arthritis, type I diabetes, multiple sclerosis (MS), coeliac disease, myasthenia gravis (MG) or systemic lupus erythematosus (SLE)), cancer (eg Examples include melanoma, breast cancer, B cell lymphomas, prostate cancer, renal cancer) or infectious diseases (eg diseases diseased by HIV, hepatitis C virus, measles virus, mycobacteria).
  • autoimmune diseases for example, Rheumatoid arthritis, type I diabetes, multiple sclerosis (MS), coeliac disease, myasthenia gravis (MG) or systemic lupus erythematosus (SLE)
  • cancer eg Examples include melanom
  • a specific combination of a protein and a disease related to the protein is not limited, but Muromanab and Allograft rejection; Abciximab and PTCA adjunct; Rituximab and Non-Hodgkin lymphoma; Daclizumab and Transplant rejection; Trastuzumab and Breast, respectively.
  • the present invention provides: [30] A method for the treatment and / or prevention of a disease associated with a protein, the method comprising the step of administering the protein to a subject in need of the treatment and / or prevention, and the subject comprising the aforementioned prediction method
  • the protein is selected from (only) a subject that is predicted not to be immunogenic.
  • the present invention provides: [31] Use of the protein for the manufacture of a medicament for treatment and / or prevention of a disease associated with the protein, and the subject of the treatment and / or prevention is the protein according to the prediction method described above For use, characterized in that it is selected from (only) subjects that are predicted to be non-immunogenic.
  • the present invention relates to the use of stem cells, progenitor cells derived therefrom, or cells that express differentiated MHC molecules in the various methods of the present invention described above.
  • Method-Cells used- Human iPS cells Tic (JCRB1331), introduced from JCRB cell bank; 201B7, introduced from iPS Academia Japan.
  • Feeder cells EmbryoMax Primary Mouse Embryonic Fibroblasts (MEF), Hygro resistant, C57BL / 6 (purchased from Nihon Millipore, Cat.:PMEF-HL); SNL 76/7 feeder cells (SNL) (purchased from Cell Biolabs, Inc, Cat .: CBA-316).
  • Feeder cells MEF
  • FBS Embryonic Stem Cell Fetal Bovine Serum
  • 10% L-glutamine
  • Penicillin / Suspend it in DMEM Gibco, Cat.:10569-010
  • Streptomycin Invitrogen, Cat.:15140-122
  • dilute to 1–2 ⁇ 10 5 cells / mL and add to gelatin-coated dishes. 4 mL each was seeded and cultured at 37 ° C under 5% CO 2 for 1 day. 3.
  • iPSellon cardiac, Cat.:007101
  • bFGF basic fibroblast growth factor
  • Feeder cells were adhered to the bottom of the dish and separated from human iPS cell colonies. 4. Collect all non-adherent colonies of human iPS cells from gelatin-coated dishes and dilute insulin-transferrin-selenium-X 100X (ITS) (Life Tech, Cat .: 51500-056) to 1/100 times. Suspended in Primate ES cell medium added as above, seeded 3 mL each in MG dishes from which the supernatant was removed, and cultured for 1 day at 37 ° C and 5% CO 2 (see the upper left figure in Fig. 2) . 5.
  • ITS insulin-transferrin-selenium-X 100X
  • ITS was reduced to 1/100 times, recombinant human Vascular Endothelial Growth Factor 165 (rhVEGF165) (R & D Systems, Cat.:293-VE) was 40 ng / mL, recombinant human Stem Cell Factor (rhSCF) (R & D Systems, Cat.:255-SC) was added at a rate of 4 mL of Prime ES cell medium supplemented at 50 ng / mL, and the cells were cultured for 2 days at 37 ° C and 5% CO 2 . (Refer to the photo on the right in Fig. 2). 7.
  • rhVEGF165 Vascular Endothelial Growth Factor 165
  • rhSCF recombinant human Stem Cell Factor
  • ITS is reduced to 1/100 times, recombinant human Granulocyte Macrophage colony-stimulating Factor (rhGM-CSF) (Humanzyme, Cat.:HZ-1082) is 100 ng / mL, recombinant human Macrophage colony-stimulating StemPro-34 medium (Life Tech., Cat .: 10640) with factor (rhM-CSF) (Humanzyme, Cat .: HZ-1039) added to 50 ng / mL was added in 5 mL portions, at 37 ° C, 5 ° C. The cells were cultured under% CO 2 conditions, and the culture solution was changed every 3 to 4 days (see the middle photo in FIG. 2). 8.
  • rhGM-CSF Granulocyte Macrophage colony-stimulating Factor
  • Non-adherent cells appeared around 50 days in culture, and the non-adherent cells in the dish were collected once every 7 to 14 days to form monocyte-like cells. 9. Collect some monocyte-like cells, anti-HLA-DR antibody (BD biosciences, Cat.:347364), anti-human HLA-DQ antibody (BD biosciences, Cat.:555563), anti-human HLA- DP antibody (Santa Cruz Biotechnology, Cat.:sc-53308), anti-human HLA-ABC antibody (BD biosciences, Cat.:555552), anti-human CD14 antibody (BD biosciences, Cat.:558121), anti-human CD80 antibody ( BD biosciences, Cat.:561134), anti-human CD86 antibody (BD biosciences, Cat.:561128), anti-human CD206 antibody (BD biosciences, Cat.:551135), anti-human CD209 antibody (BD biosciences, Cat.:551545) , Anti-human CD
  • Betula verrucosa birch pollen allergen 1, Isoform a (Bet v1a) (#Bet v 1.0101; Biomay) (amino acid sequence: SEQ ID NO: 1)
  • Infliximab (trade name: REMICADE (registered trademark) (Mitsubishi Tanabe Pharma Corporation) (amino acid sequence: Heavy chain variable region: SEQ ID NO: 2; Heavy chain constant region: SEQ ID NO: 3; Light chain variable region: SEQ ID NO: 4; Light chain constant region: SEQ ID NO: 5)
  • Infliximab has been confirmed to be an anti-drug antibody (ADA) in clinical practice and has an epitope sequence (Self / Nonself 2010; 1 (4) pp.314-322; Current Rheumatology Report 2005; 7: 3-9; Current Opinion in Monoclonal Thrapeutics 2003; 5 (2): 172-179).
  • RhFVIII Recombinant Human Factor VIII (trade name: ADVATE (registered trademark) (Baxter) (amino acid sequence: SEQ ID NO: 112)
  • rhFVIII has been confirmed to be an anti-drug antibody (ADA) in clinical practice and has an epitope sequence (Simon D. Van Haren et al, Mol Cell Proteomics 2011: 10: M110 .002246).
  • RhFVIII has a molecular weight about twice that of a normal IgG antibody.
  • Phl p1 Phleum pretense, timothy grass pollen allergen 1 (Phl p1) (trade name: Phl p 1.0102 (Biomay) (amino acid sequence: SEQ ID NO: 113) Phl p1 is a grass pollen antigen, and an epitope sequence has been reported (Carla Oseroff et al, J of immunol 2010: 185 (2): 943-955).
  • rhGM-CSF 200 ng / mL
  • rhIL-4 Human Interleukin-4 (Humanzyme, Cat .: HZ-1075) Suspended in StemPro-34 medium with 10 ng / mL at a cell concentration of 1 ⁇ 10 5 cells / mL, seeded in 3 mL each in a 6-well plate, and cultured at 37 ° C under 5% CO 2 for 5 days. Culture was performed. 2.
  • rhFVIII and Phl p1 remove 2 mL of culture supernatant from each well, then add rhFVIII 30 ⁇ g / mL or Phl p1 10 ⁇ g / mL, followed by rhTNF- ⁇ 10 ng / mL, 37 ° C., 5
  • the cells were cultured for 1 day under% CO2 conditions to obtain dendritic cell-like cells. 3. All the dendritic cell-like cells were collected from the 6-well plate, spun down at 1200 rpm for 5 minutes at 4 ° C, and all the supernatant was removed and suspended in 1 mL of DPBS at 4 ° C.
  • Anti-HLA-DR antibody G46-6 (BD Biosciences, Cat .: 555809) was solidified on CNBr-activated Sepharose beads (GE Healthcare, Cat .: 17-0430-01) at a final concentration of 1 mg / mL, Anti-HLA-DR antibody immobilized beads were used. 2. Anti-HLA-DR antibody solidified beads were stored in PBS (Wako, Cat .: 041-20211) containing 0.02% sodium azide (Wako, Cat .: 190-14901).
  • Lysis Buffer was added to a frozen pellet of dendritic cell-like cells in a 10-fold amount under ice-cooling conditions, and shaken at 1100 rpm for 1 hour at 4 ° C in Thermomixer Confort (Eppendorf) to obtain a lysate. 3. Spin down at 14000 rpm for 10 minutes at 4 ° C to separate the lysate from cell debris and cell nuclei. 4. Add 5-10 ⁇ L of anti-HLA-DR antibody-immobilized beads to 100 ⁇ L of lysate, shake at 1100 rpm, 4 ° C. overnight with a horizontal shaker, and HLA-DR-peptide in lysate The complex was bound to anti-HLA-DR antibody immobilized beads. 5.
  • HLA-DR-peptide complex bound to HLA-DR antibody-immobilized beads is suspended in 400 ⁇ L of ultrapure water, transferred to Ultrafree-MC filter (Durapore PVDF, 0.22 um) (Millipore), 14000 rpm, 10 Spin down at 4 ° C for 2 seconds. 2. The ultrapure water dropped on the bottom of the tube was removed, and 400 ⁇ L of ultrapure water was added onto the filter, and the washing operation was repeated 10 times at 14000 rpm for 10-30 seconds at 4 ° C. 3.
  • LC analysis conditions are as described in EP1715343A1, or similar conditions known to those skilled in the art, using a combination of reversed-phase material and ion-exchange material, or a column of reversed-phase material alone and appropriate buffering. It can carry out using a liquid.
  • the HPLC column was connected to an Orbitrap Elite (Thermo) equipped with a nano-LC electrospray ionization source, and full scan precision mass spectrometry and mass spectrometry by MS-MS were performed according to the manufacturer's protocol. 2.
  • Peptide sequence analysis was performed using the SEQUEST algorithm.
  • FIG. 3A and FIG. 3B show the results of examining molecules expressed on the cell surface of monocyte-like cells prepared using Tic obtained by flow cytometer analysis.
  • expression of CD14 which is a specific marker of monocytes, was observed, as well as expression of CD80, CD86, which are T cell activation molecules, and CD11b, CD11c, which are adhesion molecules.
  • CD14 which is a specific marker of monocytes
  • CD80, CD86 which are T cell activation molecules
  • CD11b, CD11c which are adhesion molecules.
  • FIG. 4A and FIG. 4B show the results of examining molecules expressed on the cell surface of monocyte-like cells prepared using 201B7, obtained by flow cytometer analysis.
  • the monocyte-like cells obtained by this example were not only the monocyte-like cells produced using Tic, but also the expression of CD14, which is a specific monocyte marker, and T cell activation molecules. Expression of certain CD80, CD86, and adhesion molecules CD11b, CD11c was observed.
  • FIG. 5A and FIG. 5B show the results of examining molecules expressed on the cell surface of dendritic cell-like cells prepared using Tic obtained by flow cytometer analysis.
  • expression of antigen-presenting molecules HLA-DR, HLA-DQ, HLA-DP and HLA-ABC, and dendritic cell specific markers CD206 and CD209 were observed.
  • expression of T80 activation molecules CD80 and CD86 and adhesion molecules CD11b and CD11c was observed.
  • Increased expression of CD11c was observed compared to monocyte-like cells.
  • the expression of CD14 a specific monocyte marker, decreased. Since each marker had a single peak, it was considered that cells having the characteristics of dendritic cells were uniformly produced.
  • FIG. 6A and FIG. 6B show the results of examining the molecules expressed on the cell surface of dendritic cell-like cells prepared using 201B7, obtained by flow cytometer analysis.
  • the antigen-presenting molecules HLA-DR, HLA-DQ, HLA-DP and HLA-ABC, as well as dendritic cell specificities similar to the dendritic cell-like cells prepared from Tic
  • CD206 and CD209 which are genetic markers, was observed.
  • CD80 and CD86 which are T cell activation molecules
  • CD11b and CD11c which are adhesion molecules
  • FIG. 7 shows the analysis result of the amino acid sequence of the peptide detected when dendritic cell-like cells prepared from Tic were exposed to Bet v1a (a).
  • a part of the amino acid sequence of Bet v1a was detected from the peptide separated from the HLA-DR molecule extracted from the dendritic cell-like cells exposed to Bet v1a in this example.
  • FIG. 7 shows the analysis result of the amino acid sequence of the peptide detected when exposed to Bet v1a, which was detected under the condition (control) when Bet v1a was not treated (b).
  • epitope number indicates a group of detected peptides that are seen in order from the N-terminus in the amino acid sequence of Bet v1a. For example, 18 types of peptides were detected in epitope number 1.
  • FIG. 8 shows the analysis result of the amino acid sequence of the peptide detected when dendritic cell-like cells prepared from 201B7 were exposed to Bet v1a (a).
  • a part of the amino acid sequence of Bet v1a was detected from the peptide separated from the HLA-DR molecule extracted from the dendritic cell-like cells exposed to Bet v1a in this example.
  • FIG. 8 shows the analysis result of the amino acid sequence of the peptide detected when exposed to Bet v1a, which was detected under the condition (control) when Bet v1a was not treated (b).
  • FIG. 9A shows the analysis result of the amino acid sequence of the peptide detected when dendritic cell-like cells prepared from Tic were exposed to Infliximab (a).
  • a part of the amino acid sequence found in the H chain and L chain of Infliximab was detected from the peptide separated from the HLA-DR molecule extracted from the dendritic cell-like cells exposed to Infliximab in this Example.
  • FIG. 9B shows the analysis result of the amino acid sequence of the peptide detected when exposed to Infliximab, which was detected under the condition (control) when Infliximab was not treated (b). Only part of the amino acid sequence found in the H chain of Infliximab was detected.
  • FIGS. 10A to 10H show the analysis results of the amino acid sequences of peptides detected when dendritic cell-like cells prepared from Tic were exposed to rhFVIII.
  • a part of the amino acid sequence of rhFVIII was detected from the peptide separated from the HLA-DR molecule extracted from the dendritic cell-like cells exposed to rhFVIII in this Example.
  • FIG. 11 shows the analysis result of the amino acid sequence of the peptide detected when dendritic cell-like cells prepared from Tic were exposed to Phl p1. In this example, a part of the amino acid sequence of Phl p1 was detected.
  • the peptide presented on the HLA-DR molecule of the dendritic cell-like cell exposed to the antigen is separated as an HLA-DR-peptide complex using anti-HLA-DR beads.
  • the sequence of each presented peptide was identified by ion trap MS / MS mass spectrometry.
  • HLA-DQ molecules, HLA-DP molecules, HLA-A molecules, HLA are present in antigen-presenting cells such as monocyte-like cells and dendritic cell-like cells.
  • -B molecule and HLA-C molecule were confirmed to be expressed.
  • MHCII molecules for example, HLA-DQ molecule or HLA-DP molecule
  • MHCI molecules instead of HLA-DR molecules, as well as peptides that are presented as antigens. Can be detected and identified.
  • MAPPs are also differentiated from stem cells in the present invention or progenitor cells derived therefrom in cells expressing other MHCII molecules such as HLA-DQ molecules and HLA-DP molecules.
  • MHCII molecules such as HLA-DQ molecules and HLA-DP molecules.
  • MAPPs using MHCI molecules are also disclosed in, for example, Wahl A, Schafer F, Bardet W, Buchli R, Air GM, Hildebrand WH., HLA class I molecules consistently present internal influenza epitopes.Proc Natl Acad Sci US A. 2009 Jan 13; 106 (2): 540-5.
  • a cell line expressing a specific allotype of HLA-B molecule is sensitized to influenza virus, and detection of the influenza virus-derived peptide sequence presented on the HLA-B molecule by MAPPs is performed.
  • MHCI molecules are known to be expressed in many cell types. From the viewpoint of easy detection of MHCI molecule-peptide complexes, cells in which MHCI molecules are highly expressed It is desirable to use
  • the MAPPs using MHCI molecules may use dendritic cells differentiated from the stem cells in the present invention or progenitor cells derived therefrom.
  • PBMC peripheral blood mononuclear cells
  • human peripheral blood mononuclear cells After 15 minutes of standing, human peripheral blood mononuclear cells add 20mL of DPBS containing 0.5% Human Serum Alubmin low IgG and 2mM EDTA 0.5M stock solution pH8.0, and spin at 1200rpm for 5 minutes at 4 °C After down, all the supernatant was removed. This operation was performed twice. 3. To human peripheral blood mononuclear cells from which the supernatant has been removed, add DPBS containing 0.5% Human Serum Alubmin low IgG and 2 mM EDTA 0.5M stock solution pH 8.0 to 1.2 ⁇ 10 8 cells / mL. The collected human peripheral blood mononuclear cells were passed through a separation magnet LS Column (Miltenyi, Cat .: 130-042-401) and used as monocyte cells.
  • white birch pollen allergens Betula verrucosa, birch pollen allergen 1, Isoform a (Bet v1a) (#Bet v 1.0101; Biomay) (amino acid sequence: SEQ ID NO: 1) were used.
  • Mononuclear cells from which the supernatant was removed were treated with 10% Fetal Bovine Serum (FBS) (Gibco, Cat .: 10270, 26140), 1% Non Essential amino acids (Gibco, Cat .: 11140-035), Na-Pyruvate (Gibco, Cat .: 11360-039) 1%, Kanamycine (Gibco, Cat .: 15160-047) 1%, recombinant human Granulocyte Macrophage colony-stimulating Factor (rhGM-CSF) (R & Dsystems, Cat.
  • FBS Fetal Bovine Serum
  • rhGM-CSF Granulocyte Macrophage colony-stimulating Factor
  • RPMI 1640 Life Tech, Cat .: 11875
  • 50 ng / mL and recombinant human Interleukin-4 (rhIL-4) R & Dsystems, Cat.:204-IL
  • rhIL-4 R & Dsystems, Cat.:204-IL
  • FIG. 12 shows the results of examining molecules expressed on the cell surface of monocytes obtained by flow cytometer analysis.
  • the monocyte cells obtained by the comparative example showed expression of CD14, which is a specific marker for monocytes, and expression of HLA-DR, which is an antigen-presenting molecule, as well as expression of CD86, which is an activation molecule for T cells. Admitted.
  • 13A and 13B show the results of examining molecules expressed on the cell surface of dendritic cells obtained by flow cytometer analysis.
  • the expression of antigen-presenting molecules HLA-DR, HLA-DQ and HLA-ABC, specific markers of dendritic cells CD206 and CD209, and T cell Expression of CD80 and CD86 as activation molecules and CD11b and CD11c as adhesion molecules was observed.
  • CD14 expression was not observed.
  • FIG. 14 shows analysis results of amino acid sequences of peptides detected in (control) (FIG. 14, FIG. 15, FIG. 16, FIG. 17, FIG. 18, FIG. 19, FIG. 20 (b)). These detected specific amino acid sequences are also shown in Tables 2 to 8 (corresponding to FIGS. 14 to 20, respectively). In the table, the epitope number indicates a group of detected peptides that are seen in order from the N-terminus in the amino acid sequence of Bet v1a.
  • FIG. 21A and FIG. 21B show the case of using two types of human iPS cell-derived dendritic cell-like cells and the case of using PBMC-derived dendritic cells for the amino acid sequences of peptides detected under the Bet v1a addition conditions. A comparison of is shown. In the analysis using dendritic cells derived from PBMC, it was considered that there was a difference in the amino acid sequence of the detected peptide between donors because it had different MHCII molecules between donors.
  • the detected sequences differ between the lines because the donor had different types of MHCII molecules. It is thought that occurred. Nevertheless, most of the common sequences in peptides detected under Bet v1a addition conditions using human iPS cell-derived dendritic cell-like cells were detected when using PBMC-derived dendritic cells. Was consistent with the sequence.
  • the detected peptide sequence 140-155 coincided with the sequence reported as the epitope sequence part in S. Mutschlener et al., Journal of Allergy and Clinical Immunology Vol. 125 (3), 2010.
  • MAPPs using stem cells or progenitor cells derived therefrom were suggested to be more effective than MAPPs using PBMC, and were considered to be useful means for reducing protein immunogenicity.
  • the present invention can be used in various biopharmaceutical diagnosis and medical fields by applying, for example, protein epitope sequence analysis.
  • Bet v1a and Phl p1 which are foreign proteins derived from pollen
  • Infliximab which is an antibody drug
  • rhFVIII which is a drug that has the same amino acid sequence as the endogenous protein
  • SEQ ID NO: 133 to 150 Partial peptide of H chain of Infliximab
  • SEQ ID NO: 151 Partial peptide of L chain of Infliximab
  • SEQ ID NO: 152 to SEQ ID NO: 153 Partial peptide of H chain of Infliximab

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Abstract

　一態様において、タンパク質のエピトープを同定するための方法であって、次の工程：（Ａ）幹細胞又はこれに由来する前駆細胞から分化された、主要組織適合遺伝子複合体（MHC分子）を発現する細胞に、標的タンパク質を接触させる工程；（Ｂ）前記MHC分子を発現する細胞から、前記標的タンパク質に含まれるペプチドとMHC分子との複合体を単離する工程；及び（Ｃ）前記複合体から、前記ペプチドを溶出し、同定する工程 を含む、タンパク質のエピトープを同定するための改良された方法等を提供する。

Description

タンパク質のエピトープを同定するための方法
　本発明は、一態様において、免疫原性を有するタンパク質を同定するための方法等に関し、例えば、免疫原性の誘導において、原因となる役割を果たす可能性のあるエピトープを同定するための方法にも関する。
　近年、多くのバイオ医薬品（抗体医薬、生物製剤、ホルモン、タンパク質等）が医療の革新に貢献している。しかしながら、例えば有効性と安全性の観点から、これらのバイオ医薬品が有する免疫原性が問題となっている。一般に、抗原が抗体の産生や細胞性免疫を誘導する性質を、免疫原性という。バイオ医薬品は抗原として作用することで、患者の体内で抗体の産生を誘導し得る。かかる場合、バイオ医薬品に対して中和抗体が産生されて治療効率が低下する場合がある。あるいは、アレルギー反応、浸出反応、インフュージョン反応等が引き起こされ得る。あるいは、バイオ医薬品に対応する、内在性の自己タンパク質の中和による自己免疫疾患等を生じさせる抗体が産生され得る。
　抗体産生のプロセスには、抗原提示細胞（APC）の細胞表面に存在する主要組織適合遺伝子複合体（MHC分子ともいう。）上に抗原が提示される（これを「抗原提示」という。）ことが重要である。抗原提示に関与するMHC分子としては、MHCI分子（クラスI）とMHCII分子（クラスII）が知られている。例えば、MHCI分子はキラーT細胞（CD8陽性T細胞）に作用し、MHCII分子はヘルパーT細胞（CD4陽性T細胞）に作用する。MHCI分子は自己の細胞内の内因性抗原に対して作用する一方で、MHCII分子は外来性の抗原に対して作用する。したがって、例えば、がん細胞内で産生されるがん抗原に対しては、MHCI分子を介した抗原提示により抗原抗体反応等が引き起こされ得る。一方、バイオ医薬品のような外来性の抗原や毒物に対しては、MHCII分子を介した抗原提示により抗原抗体反応等が引き起こされ得る。
　より具体的には、MHCI分子を介する場合、自己の細胞内の内因性タンパク質はプロテアソームによって小さいペプチドに分解される。次いで、ペプチドは小胞体で合成されたMHCI分子と結合して複合体を形成する。その後、細胞表面へと当該複合体が運ばれることで、MHCI分子上に当該ペプチドがエピトープとして提示される。
　一方、MHCII分子を介する場合、初めに、外来性のタンパク質は抗原提示細胞中にエンドサイトーシスで取り込まれる。次いで、取り込まれたタンパク質はリソソームによって小さいペプチドに分解された後、MHCII分子と結合して複合体を形成する。その後、細胞表面へと当該複合体が運ばれることで、MHCII分子上に当該ペプチドがエピトープとして提示される。次いで、ヘルパーT細胞のT細胞受容体が当該ペプチドを介して抗原提示細胞に結合できる。
　しかしながら、これらの経路は確定的なものではなく、外来性の抗原であっても、MHCI分子による抗原提示経路によって処理され得る（これを「クロスプライミング」という。）。
　抗体医薬等の免疫原性を回避するために、MHC分子上に提示されたペプチド配列を同定する研究が行われてきた。これにより、生体に投与することが意図されたタンパク質やペプチドの免疫原性を予測することが可能となる。さらに、例えば、エピトープ配列の情報を元に、非免疫原性タンパク質を製造する目的で、部位特異的突然変異によってエピトープを修飾することができる。ペプチド配列の同定方法としては、in　silicoでの予測アルゴリズムを用いた方法や、T細胞増殖アッセイ（例えば、トリチウム標識チミジンの取り込みにより、ヘルパーT細胞の増殖能等を測定する）が知られている。しかしながら、例えば、エピトープの候補ペプチドとMHC分子との間の結合親和性だけから、エピトープの配列を予測することは困難であった。したがって、MHC分子上に提示されるペプチドの配列を直接同定することで、免疫原性の誘導において原因となる役割を果たす可能性のあるエピトープをより正確に予測することが望まれていた。
　樹状細胞（DC）のような抗原提示細胞にタンパク質を接触させて抗原提示を誘導し、当該細胞上のMHC分子上に当該タンパク質に由来するペプチドを提示させた後、当該MHC分子とペプチドとの複合体を分離・精製してから、ペプチドを溶出させて、液体クロマトグラフ質量分析（LC/MS）等を用いてペプチドの配列を直接同定する方法が開発されている（特許文献１、特許文献２、非特許文献１）。当該方法は、MAPPs（MHC-associated　peptide　proteomics）と称されている。
欧州特許出願公開第1715343号明細書 欧州特許出願公開第1826217号明細書
Kropshofer,　H,　et　al.,　J.　Immunotoxicol.,　3,　131,　2006
　一態様において、特許文献１の方法では、抗原提示細胞として、ヒトから採血して分離したヒト末梢血単核細胞（PBMC）を初代細胞とし、これからさらに分離した単球（細胞）（monocyte）を分化誘導して得た樹状細胞を利用する。しかしながら、単球はPBMC中、約10％しか存在せず、分裂回数も有限であることから、取得できる細胞数に制限がある。さらに、ドナーが異なれば、MHC分子のアロタイプも変わり得ることから、常に所望のMHC分子のアロタイプを得られるわけでもなく、MAPPsによって同定されるペプチドも変わり得る。また、患者の状態によって血中の各成分も変動することから、常に同一の条件でPBMCを単離できるわけでもない。したがって、多様なMHC分子のアロタイプを有する抗原提示細胞を複数、安定的に確保できることが求められている。
　また、別の態様において、多くの場合、単球から樹状細胞を分化誘導するには血清を添加するため、血清中のタンパク質に由来したペプチド配列も検出されてしまう恐れがあった。
　また、別の態様において、現状、PBMCを取得できる量にも制限があることから、しばしば複数のドナー由来のPBMCをプールしてバルクで使うことも多く、同定されたペプチドのうちどのペプチドがどの患者の免疫原性の誘導に関与しているのかを決定することは容易とはいえなかった。
　本発明者は、鋭意検討の結果、幹細胞又はこれに由来する前駆細胞から分化させた、抗原提示細胞（具体的には、主要組織適合遺伝子複合体（MHC分子）を発現する細胞）をMAPPsに適用することで、驚くべきことに、上記課題の一部又は全てを解決して本発明を完成させた。
　すなわち、例示として、本発明は以下の態様を提供する：
［１］タンパク質のエピトープを同定するための方法であって、
　以下の工程：
（Ａ）幹細胞又はこれに由来する前駆細胞から分化された、主要組織適合遺伝子複合体（MHC分子)を発現する細胞に、標的タンパク質を接触させる工程；
（Ｂ）前記MHC分子を発現する細胞から、前記標的タンパク質に含まれるペプチドとMHC分子との複合体を単離する工程；及び
（Ｃ）前記複合体から、前記ペプチドを溶出し、同定する工程
を含む、方法。
［２］さらに、以下の工程：
（Ｄ）同定したペプチドが免疫原性を誘導するエピトープであるか否かを検証する工程
を含む、［１］に記載の方法。
［３］前記幹細胞は、人工多能性幹細胞（iPS細胞）、胚性幹細胞（ES細胞）、核移植ES細胞（ntES細胞）、胚性生殖幹細胞（EG細胞）及び成体幹細胞からなる群から選択される、［１］又は［２］に記載の方法。
［４］前記MHC分子は、MHCII分子である、［１］～［３］のいずれか一項に記載の方法。
［５］前記MHCII分子はHLA-DR、HLA-DQ又はHLA-DPである、［４］に記載の方法。
［６］前記MHC分子を発現する細胞は、さらに、CD80、CD86、CD206及びCD209の少なくとも１つを発現している、［１］～［５］のいずれか一項に記載の方法。
［７］前記MHC分子を発現する細胞は、CD80、CD86、CD206及びCD209の全てを発現している、［６］に記載の方法。
［８］前記MHC分子を発現する細胞は、樹状細胞である、［１］～［７］のいずれか一項に記載の方法。
［９］前記MHC分子を発現する細胞は、前記標的タンパク質を投与することが意図される対象のMHC分子の１又は複数のアロタイプを発現する、［１］～［８］のいずれか一項に記載の方法。
［１０］前記工程（Ａ）を無血清下で行う、［１］～［９］のいずれか一項に記載の方法。
［１１］前記樹状細胞は、
　以下の工程：
（ａ）幹細胞又はこれに由来する前駆細胞を分化させて中胚葉前駆細胞を得る工程；
（ｂ）前記中胚葉前駆細胞を分化させて単球細胞を得る工程；及び
（ｃ）前記単球細胞を分化させて未成熟樹状細胞を得、及び場合により、前記未成熟樹状細胞をさらに刺激して成熟樹状細胞を得る工程
を含む方法によって製造され、
　さらに、前記工程（ａ）～（ｃ）のうち、少なくとも前記工程（ｃ）において無血清培地が用いられる、［１］～［１０］のいずれか一項に記載の方法。
［１２］前記工程（ｂ）が、顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）及びマクロファージコロニー刺激因子（M-CSF）を含む無血清培地下で、前記中胚葉前駆細胞を分化させて単球細胞を得る工程を含む、［１１］に記載の方法。
［１３］前記工程（ｃ）が、
（ｃ１）顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）及びインターロイキン4（IL-4）を含む無血清培地下で、前記単球細胞を分化させて未成熟樹状細胞を得る工程を含み、及び場合により、
（ｃ２）前記未成熟樹状細胞を免疫原、及び、場合により炎症性サイトカインに接触させることで、成熟樹状細胞へと誘導する工程を含む、［１１］又は［１２］に記載の方法。
［１４］前記樹状細胞が未成熟樹状細胞であり、前記未成熟樹状細胞は、免疫原性を有する標的タンパク質に接触することで、成熟樹状細胞に誘導される、［８］～［１３］のいずれか一項に記載の方法。
［１５］前記標的タンパク質が、サイトカイン、ケモカイン、成長因子、抗体、酵素、構造タンパク質、ホルモン、及び、これらのいずれかの断片からなる群の1種又は1種以上から選択される、［１］～［１４］のいずれか一項に記載の方法。
［１６］免疫原性が減少又は消失したタンパク質の製造方法であって、
　以下の工程：
（１）［１］～［１５］のいずれか一項に記載の方法に従って、タンパク質のエピトープを同定する工程；
（２）MHC分子への結合が減少又は消失するように、前記エピトープを修飾する工程；及び
（３）修飾されたエピトープを有するタンパク質を製造する工程
を含む、方法。
［１７］［１６］に記載の方法に従って得られうる、タンパク質。
［１８］タンパク質が対象において免疫原性を有するか否かを予測する方法であって、
（Ｉ）標的タンパク質を投与することが意図される対象のMHC分子の１又は複数のアロタイプを発現する細胞を提供する工程であって、前記細胞は幹細胞又はこれに由来する前駆細胞から分化されることを特徴とする、工程；
（ＩＩ）前記「MHC分子の１又は複数のアロタイプを発現する細胞」に、標的タンパク質を接触させる工程；
（ＩＩＩ）前記「MHC分子の１又は複数のアロタイプを発現する細胞」から、前記標的タンパク質に含まれるペプチドとMHC分子との複合体を単離する工程；
（ＩＶ）前記複合体から、前記ペプチドを溶出し、同定する工程；及び
（Ｖ）場合により、同定したペプチドが免疫原性を誘導するエピトープであるか否かを検証する工程
を含み、
　前記同定したペプチドが免疫原性を誘導するエピトープである場合に、前記標的タンパク質が前記対象において免疫原性を有することを指し示す、方法。
［１９］前記対象が有するMHC分子のアロタイプの全てのセットが含まれるように、前記対象のMHC分子の１又は複数のアロタイプを発現する細胞を１又は複数提供する、［１８］に記載の方法。
［２０］前記幹細胞が、前記対象に由来する人工多能性幹細胞（iPS細胞）である、［１８］又は［１９］に記載の方法。
［２１］タンパク質を有効成分として含む、対象における、前記タンパク質に関連した疾患の治療及び／又は予防用組成物であって、
　前記対象は、［１８］～［２０］のいずれか一項に記載の方法に従って、前記タンパク質に免疫原性を有さないことが予測された対象から選択されることを特徴とする、組成物。
［２２］幹細胞もしくはこれに由来する前駆細胞、又は、これから分化されたMHC分子を発現する細胞の、［１］～［１６］及び［１８］～［２０］のいずれか一項に記載の方法における使用。
［２３］幹細胞又はこれに由来する前駆細胞から樹状細胞を製造する方法であって、
　以下の工程：
（ａ’）幹細胞又はこれに由来する前駆細胞を分化させて中胚葉前駆細胞を得る工程；
（ｂ’）顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）及びマクロファージコロニー刺激因子（M-CSF）を含む無血清培地下で、前記中胚葉前駆細胞を分化させて単球細胞を得る工程；及び
（ｃ’）無血清培地下で、前記単球細胞を分化させて未成熟樹状細胞を得、及び場合により、前記未成熟樹状細胞をさらに刺激して成熟樹状細胞を得る工程
を含む、方法。
［２４］前記工程（ｃ’）が、
（ｃ１’）顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）及びインターロイキン4（IL-4）を含む無血清培地下で、前記単球細胞を分化させて未成熟樹状細胞を得る工程を含み、及び場合により、
（ｃ２’）前記未成熟樹状細胞を、免疫原、及び、場合により炎症性サイトカインに接触させることで、成熟樹状細胞へと誘導する工程を含む、
［２３］に記載の方法。
［２５］［２３］又は［２４］に記載の方法によって得られうる、樹状細胞。
［２６］MHCII分子に加えて、さらに、CD80、CD86、CD206及びCD209の少なくとも１つを発現している、［２５］に記載の樹状細胞。
［２７］CD80、CD86、CD206及びCD209の全てを発現している、［２６］に記載の樹状細胞。
［２８］［２５］～［２７］のいずれかに記載の樹状細胞を含む、細胞組成物。
［２９］また、上記に記載の１又は複数の態様を任意に組み合わせたものも、当業者の技術常識に基づいて技術的に矛盾しない限り、本発明に含まれることが当業者には当然に理解される。
　一態様において、例えば、異なるMHC分子のアロタイプを発現する幹細胞を複数用意することにより、多様なMHC分子のアロタイプを有する抗原提示細胞を安定的に確保することが可能となり、従来では容易にはなし得なかった、患者が有するMHC分子のアロタイプの１又は複数、好ましくは全てを発現する、１又は複数の抗原提示細胞を提供して、所望のタンパク質が患者において免疫原性を有するか否かを予測する、複合的な解析が可能となる。
　別の態様において、MAPPs用の抗原提示細胞の出発材料として、PBMCを出発材料とする系と比較して、幹細胞又はこれに由来する前駆細胞を出発材料として用いる本発明では、より高感度であることが示唆される。
　別の態様において、幹細胞は細胞分裂回数に制限がなく、増殖・維持の方法が確立されていることから、必要なMHC分子のアロタイプを発現する抗原提示細胞を大量かつ安定的に製造・供給することが可能であり、製造コスト、簡便性の観点からも優れている。
　別の態様において、幹細胞からの抗原提示細胞への分化の過程で無血清培地を用いることにより、血清中のタンパク質に由来するペプチド配列を検出する可能性を回避できる。
MAPPs（MHC-associated　peptide　proteomics）技術のうち、MHCII分子を用いた場合の技術の概要の一例を示す。図中、DCは樹状細胞を指す。 ヒトiPS細胞を分化させて樹状細胞様細胞を得るスキームの一例を示す。 フローサイトメーター解析により得られたTic　lineから作製した単球様細胞の細胞表面に発現する分子を調べた結果を示す。 フローサイトメーター解析により得られたTic　lineから作製した単球様細胞の細胞表面に発現する分子を調べた結果を示す。 フローサイトメーター解析により得られた201B7　lineから作製した単球様細胞の細胞表面に発現する分子を調べた結果を示す。 フローサイトメーター解析により得られた201B7　lineから作製した単球様細胞の細胞表面に発現する分子を調べた結果を示す。 フローサイトメーター解析により得られたTic　lineから作製した樹状細胞様細胞の細胞表面に発現する分子を調べた結果を示す。 フローサイトメーター解析により得られたTic　lineから作製した樹状細胞様細胞の細胞表面に発現する分子を調べた結果を示す。 フローサイトメーター解析により得られた201B7　lineから作製した樹状細胞様細胞の細胞表面に発現する分子を調べた結果を示す。 フローサイトメーター解析により得られた201B7　lineから作製した樹状細胞様細胞の細胞表面に発現する分子を調べた結果を示す。 ヒトiPS細胞(Tic　line)由来の樹状細胞様細胞を用いたMAPPsでの、Bet　v1aに暴露した場合に検出されたペプチドのアミノ酸配列の解析結果（図7（ａ））、及び、Bet　v1a無処置条件で検出された、Bet　v1aに暴露した場合にも検出されたペプチドのアミノ酸配列の解析結果（図7（ｂ））を示す。Bet　v1aのアミノ酸配列を併せて示す。Bet　v1aのアミノ酸配列中、大きく分けて、４か所に対応する箇所でペプチドが検出された。 ヒトiPS細胞(201B7　line)由来の樹状細胞様細胞を用いたMAPPsでの、Bet　v1aに暴露した場合に検出されたペプチドのアミノ酸配列の解析結果（図8（ａ））、及び、Bet　v1a無処置条件で検出された、Bet　v1aに暴露した場合にも検出されたペプチドのアミノ酸配列の解析結果（図8（ｂ））を示す。Bet　v1aのアミノ酸配列を併せて示す。Bet　v1aのアミノ酸配列中、大きく分けて、３か所に対応する箇所でペプチドが検出された。 ヒトiPS細胞(Tic　line)由来の樹状細胞様細胞を用いたMAPPsでの、Infliximabに暴露した場合に検出されたペプチドのアミノ酸配列の解析結果（ａ）を示す。InfliximabのH鎖及びL鎖のアミノ酸配列をそれぞれ併せて示す。 ヒトiPS細胞(Tic　line)由来の樹状細胞様細胞を用いたMAPPsでの、Infliximab無処置条件で検出された、Infliximabに暴露した場合にも検出されたペプチドのアミノ酸配列の解析結果（ｂ）を示す。InfliximabのH鎖及びL鎖のアミノ酸配列をそれぞれ併せて示す。 ヒトiPS細胞(Tic　line)由来の樹状細胞様細胞を用いたMAPPsでの、recombinant　human　Factor　VIIIに暴露した場合に検出されたペプチドのアミノ酸配列の解析結果を示す。 図１０Ａの続きを示す。 図１０Ｂの続きを示す。 図１０Ｃの続きを示す。 図１０Ｄの続きを示す。 図１０Ｅの続きを示す。 図１０Ｆの続きを示す。 図１０Ｇの続きを示す。 ヒトiPS細胞(Tic　line)由来の樹状細胞様細胞を用いたMAPPsでの、Phl　p1に暴露した場合に検出されたペプチドのアミノ酸配列の解析結果を示す。 フローサイトメーター解析により得られた単球細胞の細胞表面に発現する分子を調べた結果を示す。 フローサイトメーター解析により得られた樹状細胞の細胞表面に発現する分子を調べた結果を示す。 フローサイトメーター解析により得られた樹状細胞の細胞表面に発現する分子を調べた結果を示す。 ヒトドナーのPBMC由来樹状細胞を用いたMAPPsでの、Bet　v1a添加条件及び非添加条件（対照）で検出されたペプチドのアミノ酸配列の解析結果を示す。 ヒトドナーのPBMC由来樹状細胞を用いたMAPPsでの、Bet　v1a添加条件及び非添加条件（対照）で検出されたペプチドのアミノ酸配列の解析結果を示す。 ヒトドナーのPBMC由来樹状細胞を用いたMAPPsでの、Bet　v1a添加条件及び非添加条件（対照）で検出されたペプチドのアミノ酸配列の解析結果を示す。 ヒトドナーのPBMC由来樹状細胞を用いたMAPPsでの、Bet　v1a添加条件及び非添加条件（対照）で検出されたペプチドのアミノ酸配列の解析結果を示す。 ヒトドナーのPBMC由来樹状細胞を用いたMAPPsでの、Bet　v1a添加条件及び非添加条件（対照）で検出されたペプチドのアミノ酸配列の解析結果を示す。 ヒトドナーのPBMC由来樹状細胞を用いたMAPPsでの、Bet　v1a添加条件及び非添加条件（対照）で検出されたペプチドのアミノ酸配列の解析結果を示す。 ヒトドナーのPBMC由来樹状細胞を用いたMAPPsでの、Bet　v1a添加条件及び非添加条件（対照）で検出されたペプチドのアミノ酸配列の解析結果を示す。 Bet　v1a添加条件において検出されたペプチドのアミノ酸配列について、ヒトiPS細胞由来の樹状細胞様細胞を用いた場合とPBMC由来の樹状細胞を用いた場合との比較を示す。 図２１Ａの続きを示す。
　以下に、本発明の好ましい実施形態を説明する。
　本明細書中、タンパク質とは、例えば、天然のタンパク質、組換えタンパク質又はアミノ酸同士を人工的に結合して調製された合成ペプチドであってよい。タンパク質は、1種のタンパク質、又は複数の異なるタンパク質の混合物であってもよいと理解される。タンパク質は非天然アミノ酸を含んでもよい。また、例えば生体内で産生される際にグリコシル化されていてもよい。タンパク質は、動物（好ましくはヒト）の治療又は予防に関連したタンパク質（例えば、抗体、ホルモン等）であるのが好ましい。一実施態様において、タンパク質は、サイトカイン、ケモカイン、成長因子、抗体、酵素、構造タンパク質、ホルモン、及び、これらのいずれかの断片からなる群の1種以上、好ましくは1種から選択されてよい。
　タンパク質は、細胞に取り込まれて分解された後に、あるいは、細胞に取り込まれたものの分解されずに、あるいは、細胞内で生成後に分解された後に、MHC分子と複合体を形成して抗原提示されるのであれば、当該タンパク質のアミノ酸配列の長さは特に問題とならない。当該タンパク質は、MHC分子と複合体を形成して抗原提示されるペプチドそのものであってもよい。
　本明細書中、エピトープとは、抗体が認識して結合する抗原の特定の構造単位を指す。エピトープは抗原性のための最小単位であり、抗原決定基(antigenic　determinant)とも呼ばれる。
　本明細書中、分化とは、本来は単一もしくは同一であった個々の細胞又は細胞集団などが構造及び／又は機能的に変化することで、複雑化したり、異質化していく状態又は態様などを指してよい。例えば、分化は、分化誘導と互換的に用いられてもよく、分化誘導が開始された状態や分化誘導が継続されている状態、分化誘導が終了した状態などが含まれるが、さらに、分化誘導が終了した細胞又は細胞集団が増殖している状態なども当然に包含することが理解される。なお、誘導とは、ある細胞又は細胞集団などが構造及び／又は機能的に別の細胞又は細胞集団などへ分化を促す働きかけを意味してよく、分化を達成できるのであれば特に限定されない。
　本明細書中、幹細胞とは、多能性幹細胞を意味し、分化多能性と自己複製能を有する細胞であれば特に限定されない。幹細胞としては、例えば、人工多能性幹細胞（iPS細胞）、胚性幹細胞（ES細胞）、核移植ES細胞（ntES細胞）、胚性生殖幹細胞（EG細胞）、成体幹細胞が挙げられる（WO2012/115276）。これらの幹細胞は哺乳動物に由来するのが好ましく、ヒトに由来するのがより好ましい。
　ES細胞は、受精卵の8細胞期、桑実胚後の胚である胚盤胞の内部細胞塊などに由来する胚由来の幹細胞である。ES細胞は、対象動物の受精卵の胚盤胞から内部細胞塊を取出し、内部細胞塊を線維芽細胞のフィーダー上で培養することによって樹立することができ、その樹立及び維持方法は公知である（例えば、US　Patent　No.5,843,780等）。ES細胞の選択は、例えば、アルカリホスファターゼ、OCT-3/4、NANOG等の遺伝子マーカーの発現を指標にしてReal-Time　PCR法で行ってよい。特に、ヒトES細胞の選択では、OCT-3/4、NANOG、FBX15、FGF4、REX1、ECADなどの遺伝子マーカーの発現を指標としてよい(E.　Kroon　et　al.　(2008),　Nat.　Biotechnol.,　26:　443-452)。　
　一態様において、ヒトになり得る受精卵や胚を破壊する事に対して生じ得る倫理的問題から、ヒトES細胞を作製する際に用いる胚としては、例えば、体外受精による不妊治療において母体に戻されなかった凍結保存されている胚のうち、破棄されることが決定した余剰胚を利用したり、体外受精プロセスで得られる発生過程が停止してしまった胚を利用したり、あるいは、それ自体でヒトへと成長する内在的能力を備えない、細胞分裂と成長が単為生殖に基づく未授精卵を利用してもよい。あるいは、胚盤胞期以前の卵割期の胚の単一割球のみを用いて、胚の発生能を損なうことなく、受精卵を破壊せずにES細胞を作製してもよい（Chung　Y,　Klimanskaya　I,　Becker　S,　Marh　J,　Lu　SJ,　Johnson　J,　Meisner　L,　Lanza　R.　(2006).　Nature　439:　216-219.;Klimanskaya　I,　Chung　Y,　Becker　S,　Lu　SJ,　Lanza　R.　(2006).　Nature　444:　481-485.;Chung　Y,　Klimanskaya　I,　Becker　S,　Li　T,　Maserati　M,　Lu　SJ,　Zdravkovic　T,　Ilic　D,　Genbacev　O,　Fisher　S,　Krtolica　A,　Lanza　R.　(2008).　Cell　Stem　Cell　2:　113-117.)。あるいは、発生が停止したヒトの胚からES細胞を作製してもよい(Zhang　X,　Stojkovic　P,　Przyborski　S,　Cooke　M,　Armstrong　L,　Lako　M,　Stojkovic　M.　(2006).　Stem　Cells　24:　2669-2676.）。
　iPS細胞は、特定の初期化因子を、DNA又はタンパク質の形態で体細胞に導入することによって作製することができる、ES細胞とほぼ同等の特性、例えば分化多能性と自己複製能を有する、体細胞由来の人工の幹細胞である（K.　Takahashi　and　S.　Yamanaka　(2006)　Cell,　126:　663-676;　K.　Takahashi　et　al.　(2007),　Cell,　131:　861-872;　J.　Yu　et　al.　(2007),　Science,　318:　1917-1920;　Nakagawa,　M.　et　al.,　Nat.　Biotechnol.　26:　101-106　(2008);　WO2007/069666）。（ここで、体細胞とは、生殖系列細胞、多能性幹細胞を除くあらゆる動物細胞（好ましくは、ヒトを含む哺乳動物細胞）を指してよい。）　
　初期化因子は、ES細胞に特異的に発現している遺伝子、その遺伝子産物もしくはnon-cording　RNA、又は、ES細胞の未分化維持に重要な役割を果たす遺伝子、その遺伝子産物もしくはnon-cording　RNA、あるいは低分子化合物であってもよい。初期化因子として、例えば、OCT3/4、SOX2、SOX1、SOX3、SOX15、SOX17、KLF4、KLF2、c-MYC、N-MYC、L-MYC、NANOG、LIN28、FBX15、ERAS、ECAT15-2、TCLL、beta-catenin、LIN28B、SALL1、SALL4、ESRRB、NR5A2、TBX3を挙げてもよい。これらの初期化因子は、単独又は組み合わせて用いてもよい。初期化因子の組み合わせとしては、例えば以下の組み合わせを挙げることができる。
（i）OCT遺伝子、KLF遺伝子、SOX遺伝子、MYC遺伝子；
（ii）OCT遺伝子、SOX遺伝子、NANOG遺伝子、LIN28遺伝子；
（iii）OCT遺伝子、KLF遺伝子、SOX遺伝子、MYC遺伝子、hTERT遺伝子、SV40　large　T遺伝子；
（iv）OCT遺伝子、KLF遺伝子、SOX遺伝子
　あるいは、初期化因子の組み合わせとしては、例えば、WO2007/069666、WO2008/118820、WO2009/007852、WO2009/032194、WO2009/058413、WO2009/057831、WO2009/075119、WO2009/079007、WO2009/091659、WO2009/101084、WO2009/101407、WO2009/102983、WO2009/114949、WO2009/117439、WO2009/126250、WO2009/126251、WO2009/126655、WO2009/157593、WO2010/009015、WO2010/033906、WO2010/033920、WO2010/042800、WO2010/050626、WO2010/056831、WO2010/068955、WO2010/098419、WO2010/102267、WO2010/111409、WO2010/111422、WO2010/115050、WO2010/124290、WO2010/147395、WO2010/147612、WO2012/115276に記載の組み合わせを用いてもよい。初期化因子又は初期化を促進する因子としては、例えば、当業者に公知の阻害剤である、MEK阻害剤、DNAメチルトランスフェラーゼ阻害剤、ヒストンデアセチラーゼ（HDAC）阻害剤、ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤、p53阻害剤を挙げてもよい。初期化因子は、場合によりベクター（例えば、ウイルスベクター、プラスミドベクター、人工染色体ベクター）等を用いて、例えば、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、マイクロインジェクション法等の当業者に公知の方法に従って体細胞内に導入してよい。iPS細胞誘導のための培地としては、例えば、10～15％FBSを含有するDMEM、DMEM/F12又はDME培地（これらは白血病抑制因子(LIF)、penicillin/streptomycin、puromycin、L-glutamine、非必須アミノ酸類、β-メルカプトエタノール等をさらに適宜含んでよい。）、又は、当業者に公知の市販の培地を適宜用いてもよい。
　iPS細胞の培養は、培地の組成等に応じて適宜設定してよい。例えば、37℃、5％CO2存在下で、10％FBS含有DMEM又はDMEM/F12培地を用いて、体細胞と初期化因子とを接触させ約4～7日間培養し、その後、細胞をフィーダー細胞（例えば、マイトマイシンC処理STO細胞、SNL細胞）上に撒き直し、体細胞と初期化因子の接触から約10日後に、塩基性線維芽細胞成長因子(bFGF)を含有させたPrimate　ES細胞培養用培地で培養し、当該接触から約30～約45日又はそれ以降にiPS様コロニーを生じさせてもよい。あるいは、37℃、5%CO2存在下で、フィーダー細胞（例えば、マイトマイシンC処理STO細胞、SNL細胞）上で10％FBS含有DMEM培地（これらはLIF、penicillin/streptomycin、puromycin、L-グルタミン、非必須アミノ酸類、β-メルカプトエタノール等をさらに適宜含んでよい。）で培養し、約25～約30日又はそれ以降にiPS様コロニーを生じさせてもよい。フィーダー細胞の代わりに、初期化される体細胞そのものを用いるか、細胞外基質やマトリゲル（BD社）を用いてもよい。また、無血清培地を用いて培養してもよい（Sun　N,　et　al.　(2009),　Proc　Natl　Acad　Sci　U　S　A.　106:　15720-15725）。
　iPS細胞の選択は、形成されたコロニーの形状（例えば、球状に近い形状を示す細胞塊が得られるか）により選択してもよい。あるいは、体細胞が初期化された場合に発現する遺伝子（例えば、アルカリホスファターゼ、OCT3/4、NANOG）と連動して発現する薬剤耐性遺伝子をマーカー遺伝子として導入した場合は、対応する薬剤を含む培地で培養を行うことにより、樹立したiPS細胞を選択することができる。マーカー遺伝子が蛍光タンパク質遺伝子の場合には蛍光顕微鏡で観察することによってもiPS細胞を選択することができる。あるいは、公知の分化方法により細胞をin　vitroで培養して、所望の細胞に分化できることを指標としてiPS細胞と判定してもよい。あるいは、細胞を免疫不全マウスの皮下に移植し、所定の期間経過後に形成される腫瘍組織を解析して、様々な組織が混在する奇形腫（テラトーマ）が形成されることを確認してiPS細胞であると判定してもよい。あるいは、ES細胞で特異的に発現しているマーカー遺伝子が発現していることを確認してiPS細胞であると判定してもよい。あるいは、ゲノムワイドな遺伝子の発現パターンをマイクロアレイ等で検出し、ES細胞の発現パターンと相関の高い細胞をiPS細胞と判定してもよい。
　あるいは、樹立されたiPS細胞の分譲を受けて使用してもよい。
　ntES細胞は、核移植技術によって作製されたクローン胚由来のES細胞であり、受精卵由来のES細胞とほぼ同じ特性を有している(T.　Wakayama　et　al.　(2001),　Science,　292:　740-743;　S.　Wakayama　et　al.　(2005),　Biol.　Reprod.,　72:　932-936;　J.　Byrne　et　al.　(2007),　Nature,　450:　497-502）。すなわち、未受精卵の核を体細胞の核と置換することによって得られたクローン胚由来の胚盤胞の内部細胞塊から樹立されたES細胞がntES細胞である。ntES細胞の作製のためには、公知の核移植技術（例えば、J.B.　Cibelli　et　al.　(1998),　Nature　Biotechnol.,　16:642-646）と、公知のES細胞作製技術とを組み合わせてよい（若山清香ら(2008),実験医学,26巻,5号(増刊),　47～52頁）。核移植では、哺乳動物の除核した未受精卵に、体細胞の核を注入し、数時間培養することで初期化してよい。
　EG細胞は、胎生期の始原生殖細胞から樹立される、ES細胞と同様な多能性をもつ細胞である(Y.　Matsui　et　al.　(1992),　Cell,　70:　841-847)。LIF、bFGF、Stem　Cell　Factor（STF）等の存在下で、始原生殖細胞を培養することによって樹立してもよい(Y.　Matsui　et　al.　(1992),　Cell,　70:　841-847)。
　成体幹細胞は、生体内に見られる最終分化していない細胞であり、最終分化細胞への前駆細胞の供給源として存在する。成体幹細胞は生体内の各組織に存在し、通常は分化できる細胞の種類が限定されている。本発明において、成体幹細胞の例としては、単球、マクロファージ、樹状細胞等に分化できると考えられる、造血幹細胞が特に好ましい。なお、造血前駆細胞は、造血幹細胞から分化した細胞を指す。
　本明細書中、幹細胞に由来する前駆細胞とは、幹細胞を分化させて抗原提示細胞（具体的には、MHC分子を発現する細胞）を得る過程で観察されるあらゆる細胞（例えば、中胚葉前駆細胞、造血前駆細胞、顆粒球・マクロファージコロニー形成細胞、リンパ芽球、単芽球、前単球又は単球）を含んでよい。ここで、ほとんど全ての有核細胞はMHCI分子を有し（Peter　Parham　(2007),　エッセンシャル免疫学；　The　Human　Protein　Atlas,　http://www.proteinatlas.org/）、自己の細胞内の内因性タンパク質をMHCI分子を介してキラーT細胞に抗原提示できる。一方、特定の細胞はMHCI分子以外にMHCII分子を有しており、MHCII分子を介して外来性抗原をヘルパーT細胞に提示することができる（プロフェッショナル抗原提示細胞とも呼ばれる。）。
　本明細書中、抗原提示細胞は、これら両方の細胞のタイプを含んでよい。抗原提示細胞が後者のタイプの場合には、例えば、樹状細胞、マクロファージ、単球、B細胞が好ましくは挙げられる。さらに、インターフェロン等のサイトカインにより活性化されてMHCII分子が誘導されると、甲状腺濾胞細胞、線維芽細胞、血管内皮細胞等は抗原提示細胞としても働くことから、これらの細胞も後者のタイプとして挙げてもよい。抗原提示細胞（具体的には、MHC分子を発現する細胞、例えば、樹状細胞、マクロファージ、単球、B細胞。）としての特性を有しているかの判定基準としては、例えば、MHCI分子及び／又はMHCII分子を発現している細胞を指標としてもよく、さらに、CD11a、CD11b、CD11c、CD14、CD15、CD40、CD80、CD83、CD86、CD123、CD205、CD206、CD209、CCR7の少なくとも1つ以上を発現している細胞を指標とするのがより好ましい。　
　また、特に、樹状細胞は抗原提示能が強く、ヘルパーT細胞の活性化能が強いことから、抗原提示細胞として有利である。また、抗原提示細胞としては、未成熟樹状細胞が最も好ましい。樹状細胞は、細胞突起を有し、樹状又は樹枝状の形態を呈する細胞である。樹状細胞としての特性を有しているかの判定基準としては、例えば、MHCII分子に加えて、CD11b、CD11c、CD40、CD80、CD83、CD86、CD123、CD205、CD206、CD209、CCR7の少なくとも１つをさらに発現しているかを指標としてもよく、MHCII分子、CD80、CD86、CD206、CD209の全てを発現しているかを指標とするのがより好ましい。MHCII分子、CD80、CD86、CD206、CD209の全てを発現していて、かつ、CD14陰性の樹状細胞がさらに好ましい。マクロファージ細胞としての特性を有しているかの判定基準としては、例えば、MHCII分子に加えて、CD11bをさらに発現しているかを指標としてもよい。なお、CD80及びCD86は、ヘルパーT細胞にシグナルを伝達して当該細胞を活性化させることで知られる。本実施例で得られた樹状細胞様細胞は、細胞の形状、細胞表面分子の発現、ヘルパーT細胞刺激能力という点で単球に由来する樹状細胞と類似した性質を有することから、本明細書における樹状細胞に含まれてよい。同様に、本実施例で得られた単球様細胞は、本明細書における単球細胞に含まれてよい。
　抗原提示細胞は、哺乳動物に由来するのが好ましく、ヒトに由来するのがより好ましい。
　本明細書中、MHC分子は、MHCI分子又はMHCII分子のいずれであってもよいが、MHCII分子がより好ましい。ヒトのMHCはヒト白血球型抗原（HLA）と呼ばれる。MHCI分子はさらに古典的クラスI分子（クラスIa）と非古典的クラスI分子（クラスIb）に分けられる。古典的クラスI分子としては、ヒトではHLA-A、HLA-B、HLA-Cが挙げられ、非古典的クラスI分子としては、ヒトではHLA-E、HLA-F、HLA-Gが挙げられる。一方、MHCII分子としては、ヒトでは、HLA-DR、HLA-DQ、HLA-DPが挙げられる。
　MHC分子は同種動物間であっても個体のアミノ酸配列に若干相違があり、アロタイプと呼ばれるさらなるいくつかのタイプに分けられる。例えば、HLA-DRであれば、DR1、DR2、DR3、DR4・・・と多数のアロタイプが知られている。それぞれのアロタイプはMHC遺伝子上で互いに連鎖しているため、この領域に遺伝子組換えが生じない限り、これらは組となって親から子へと遺伝する。この単位はハロタイプと呼ばれる。患者由来の幹細胞（例えばiPS細胞）では、継代・分化させても、基本的に、患者のMHC遺伝子配列がそのまま保持されることから、当該幹細胞を分化させて得た抗原提示細胞では、患者が有するMHC分子のアロタイプが維持されることになる。
　それぞれのアロタイプは、それぞれ、異なる抗原ペプチド断片（エピトープ）と複合体を形成して、細胞表面にエピトープを提示し得ることから、アロタイプのセットごとに、言い換えれば、当該アロタイプのセットを有する患者ごとに、標的タンパク質に対する免疫原性や副作用等の有無や程度が変わってくる。アロタイプやハプロタイプは、人種、民族に特徴的なパターンを有することから、人種、民族ごとの、標的タンパク質への免疫原性や副作用等の有無の解析等に利用できる。
　したがって、一定の集団（人種、民族等）に対するタンパク質の免疫原性を予測するために、当該集団のMHC分子のアロタイプを有する、一連の抗原提示細胞を使用するのが有利である。
　さらに、個人が有するアロタイプは、遺伝子診断（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）で増幅させたDNAを、プローブが固定されたビーズとハイブリダイズさせ、その蛍光強度を数値化してデータ解析を行ってHLA遺伝子型を特定する、HLA遺伝子型解析法）等によって簡便に特定できるため、特定したアロタイプの情報に基づいて、標的タンパク質に対して免疫原性や副作用等を有するかどうかを決定できる。遺伝子診断法のその他の具体例としては、例えばInternational　Journal　of　Immunogenetics,　2011;　38:6,　pp.463-473に記載の方法が挙げられる。
　したがって、好ましい一実施態様において、抗原提示細胞は、標的タンパク質を投与することが意図される対象（例えば哺乳動物、好ましくはヒト）のMHC分子の１又は複数のアロタイプを発現してよい。
　好ましい一態様において、本発明における幹細胞又はこれに由来する前駆細胞としては、解析を意図している対象（例えば、ヒト患者やヒト健常者）が有するMHC分子の１又は複数のアロタイプを発現する細胞を用いてよく、例えば、前記対象が有するMHC分子のアロタイプの全てのセットが含まれるように、前記対象のMHC分子の１又は複数のアロタイプを発現する細胞を１又は複数用いてもよい。あるいは、解析を意図している人種、民族において発現頻度が高いMHC分子の１又は複数のアロタイプを発現する細胞を揃えてよく、例えば、このような細胞を複数揃えることにより、前記人種、民族のうち、一定の割合（例えば30%～80%以上）の人口をカバーして免疫原性を解析してもよい。適宜、例えば、ヒト患者同士、ヒト患者とヒト健常者、ヒト健常者同士等を比較解析するのが有利である。
　本発明において、幹細胞又はこれに由来する前駆細胞を抗原提示細胞へと分化させる方法としては、当業者に公知の方法であれば特に限定されない。例えば、ES細胞やiPS細胞等の幹細胞を単球、マクロファージ、B細胞、又は樹状細胞等に分化させる方法としては、WO2009/120891；WO2009/074341；Regen.　Med.　(2009)　4(4),　p.513-526;　WO2012/115276;　WO2012/043651;　PLoS　One,　July　2011,　Vol.6,　Issue7,　e22261;　Gene　Therapy　(2011),　1-1024　March　2011,　doi:10.1038/gt.2011.22;　科学技術進行機構　CREST　戦略的創造研究推進事業　人工多能性幹細胞　(iPS細胞)　作製・制御等の医療基盤技術でのH20-23研究報告;　International　Journal　of　Cancer　2013　Jul　3.　doi:　10.1002/ijc.28367;　Zhuang,　L.　et　al.　J.　Immunol.　Methods　(2012);　PLoS　One,　April　2013,　Vol.8,　Issue4,　e59243;　NATURE　IMMUNOLOGY　Vol.5,　No.4,　2004,　pp.410-417に記載される方法を用いてもよい。例えば、Regen.　Med.　(2009)　4(4),　p.513-526には、無血清培地下でのヒトES細胞からの樹状細胞へのin　vitro分化誘導法が開示されている。当該方法では、Bone　Morphogenetic　Protein-4(BMP-4)、Granulocyte　Macrophage-Colony　Stimulating　Factor(GM-CSF)、Stem　Cell　Factor(SCF)、及びVascular　Endothelial　Growth　Factor（VEGF）を用いて、ヒトES細胞を単球へと分化させ；次いで、当該単球を、さらに、GM-CSF及びInterleukin-4（IL-4）を用いて、未成熟樹状細胞へと分化させ；さらに、当該未成熟樹状細胞を、GM-MSF、TNF-α、Interleukin-1β（IL-1β）、Interferon-γ（IFN-γ）、及びPGE2からなる成熟化カクテル（maturation　cocktail）を用いて、成熟樹状細胞へと分化させる方法が開示されている。また、PLoS　One,　April　2013,　Vol.8,　Issue4,　e59243には、ES細胞及びiPS細胞から分化された単球に基づいて、機能的なマクロファージ及び樹状細胞が得られたことが開示されている。さらに、NATURE　IMMUNOLOGY　Vol.5,　No.4,　2004,　pp.410-417には、ES細胞からT細胞を作製する方法が主題として記載されているが、その作製の過程でB細胞も作製できたことが開示されている（例えば当該文献中、p.411の右欄第2段落～p.412の左欄第2段落；Fig.1）。
　このように、幹細胞を抗原提示細胞（MHC分子を発現する細胞）に分化する技術それ自体については関連技術が報告されている。しかしながら、これらの文献はいずれも、再生医療や免疫療法への利用を目的としてきたものであり、タンパク質のエピトープ配列解析への応用を意図したものではない。
　本発明において、幹細胞又はこれに由来する前駆細胞を抗原提示細胞へと分化させる具体的な方法としては、好ましくは、WO2012/115276を参照してよい。当該方法は、例えば、抗原提示細胞が樹状細胞の場合には、幹細胞又はこれに由来する前駆細胞を提供する工程に続いて、以下の工程：
（ａ）幹細胞又はこれに由来する前駆細胞を分化させて中胚葉前駆細胞を得る工程；
（ｂ）前記中胚葉前駆細胞を分化させて単球細胞を得る工程；及び
（ｃ）前記単球細胞を分化させて未成熟樹状細胞を得、及び場合により、前記未成熟樹状細胞をさらに刺激して成熟樹状細胞を得る工程
を含んでよい。また、前記工程（ａ）及び前記工程（ｂ）は連続して行うことができる。さらに、前記工程（ａ）～（ｃ）のうち、少なくとも前記工程（ｃ）において無血清培地が用いられてよく、前記工程（ｂ）と（ｃ）の両方で無血清培地が用いられることが好ましく、前記工程（ａ）～（ｃ）の全てで無血清培地が用いられることがより好ましい。
　前記血清とは、ヒト血清、サル血清、ウシ胎児血清、羊血清、ウサギ血清、ラット血清、モルモット血清、マウス血清等の哺乳動物由来の血清を指してよい。
　前記無血清培地とは、血清が添加されておらず、かつ、B-27等の市販の血清代替物が添加されていない培地を指し、好ましくは、アルブミンもしくはアルブミン代替物、トランスフェリンもしくはトランスフェリン代替物、インシュリンもしくはインシュリン代替物、及び、亜セレン酸の少なくとも1つを含有した培地であってよい。より好ましくは、Insulin-Transferrin-Selenium-X　Supplement(ITS)を含有した培地であってよい。好ましい無血清培地としては、例えば、最小必須培地（MEM）、ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）、イスコフ改変ダルベッコ培地（IMDM）、StemPro-34　medium(Life　Tech)、Stemline　II(SIGMA)又はPrimate　ES　cell　medium(ReproCELL)等へITSを添加した培地が挙げられる。
　前記工程（ａ）は、幹細胞又はこれに由来する前駆細胞を、BMPファミリータンパク質を含有する培地で培養し、次いで、増殖因子及び造血因子を含有する培地で培養するか、VEGFを含有する培地で培養した後に造血因子を含有する培地で培養することにより、中胚葉前駆細胞を得る工程を含んでよい。また、前記工程（ｂ）は、造血因子を含有する培地で培養して、前記中胚葉前駆細胞を分化させて単球細胞を得る工程を含んでよい。前記工程（ａ）及び前記工程（ｂ）は連続して行うことができる。
　前記BMPファミリータンパク質とは、TGF-βスーパーファミリーに属する、約20種類のサブタイプを有するサイトカインを指してよい。本発明において好ましいBMPファミリータンパク質は、BMP2及び／又はBMP4であり、さらに好ましくはBMP4である。
　前記増殖因子は、好ましくはVEGFであってよく、具体的には、VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E、PlGF（placental　growth　factor）-1、PlGF-2又はこれらの選択的スプライシングバリアント（例えば、VEGF-Aでは121個、165個、189個又は206個のアミノ酸から成るバリアントが知られている。）であってよい。本発明において好ましいVEGFはVEGF-Aである。さらに、前記増殖因子は、VEGFに加えて、bFGFを含んでもよい。
　前記造血因子は、血球の分化・増殖を促進する因子であり、例えば、Stem　Cell　Factor（SCF）、顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）、顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）、マクロファージコロニー刺激因子（M-CSF）、エリスロポエチン（EPO）、トロンボポエチン（TPO）、インターロイキン（IL）類又はFlt3-ligandであってよい。前記インターロイキン類としては、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、又はIL-9等であってよい。
　前記工程（ｂ）において好ましい造血因子は、SCF、TPO、IL-3、Flt3-ligand、GM-CSF及びM-CSFから成る群から選択されてよい。造血因子は、単独でも組み合わせて用いてもよい。
　より好ましくは、増殖因子としてVEGFと造血因子としてSCFとを組み合わせて用いて前記工程（ａ）を行った後に、続けて、造血因子としてGM-CSFとM-CSFの組み合わせを用いて前記工程（ｂ）を行ってよい。前記工程（ｂ）では、培地を数日おき（例えば3～4日おき）に交換して培養するのが好ましい。
　前記工程（ｂ）により非接着性細胞（単球細胞（様細胞））を得たら、前記工程（ｃ）における単球として用いてよい。前記非接着性細胞が単球細胞の特性を有するかについては、例えばフローサイトメトリー等を用いて、MHCII分子の発現に加えて、単球細胞のマーカーであるCD14、CD45hi、CD11a、CD11b又はCD15等の発現を指標として判定できる。また、樹状細胞への誘導効率を向上させる観点から、例えば、非接着性細胞からCD14陽性細胞のみを、磁気ビーズ法等を用いて分離することにより、樹状細胞への誘導に用いる単球の細胞割合を高めることができる。
　前記工程（ｃ）は、さらに、
（ｃｉ）造血因子を含む培地で前記単球を（浮遊）培養し、分化させることで未成熟樹状細胞（様細胞）を得る工程を含み、及び場合により、
（ｃｉｉ）得られた未成熟樹状細胞（様細胞）を、さらに、免疫原、及び、場合により炎症性サイトカインに接触させることで、成熟樹状細胞（様細胞）へと誘導する工程
を含んでよい。
　前記未成熟樹状細胞様細胞又は成熟樹状細胞様細胞が樹状細胞の特性を有するかについては、例えばフローサイトメトリー等を用いて、MHCII分子の発現に加えて、樹状細胞のマーカーであるCD11b、CD11c、CD40、CD80、CD83、CD86、CD123、CD205、CD206、CD209、CCR7の少なくとも1つをさらに発現しているかを指標としてもよい。さらに、樹状細胞が未成熟樹状細胞の特性を有するか、それとも、成熟樹状細胞の特性を有するかについては、例えば、MHCII分子（HLA-DR等）の発現変動等を指標にして検証することができる。
　前記造血因子は、上述の因子であってもよい。好ましくは、造血因子としては、GM-CSF、IL-3及びIL-4の組み合わせや、GM-CSF及びIL-4の組み合わせを用いてよい。
　前記免疫原及び前記炎症性サイトカインは、未成熟樹状細胞に接触すると、当該細胞を刺激（pulse）することにより、成熟樹状細胞へと誘導できる。未成熟樹状細胞は、抗原貪食能は高いが抗原提示能は低い一方で、抗原の生体内への侵入等により成熟樹状細胞へと成熟し、抗原提示に必要なMHCII分子等のタンパク質の発現を増強させて、抗原提示能を向上させることができる。
　前記免疫原は、生体内に導入されたときに免疫応答を引き起こす任意の物質であってよく、例えば、リポ多糖（LPS、病原体に存在する）が挙げられる。本発明において、評価しようとするタンパク質が免疫原性を有する場合、当該タンパク質は免疫原として作用できることが当業者には理解できる。したがって、好ましい一実施態様において、前記未成熟樹状細胞は、免疫原性を有する標的タンパク質に接触することで、成熟樹状細胞に誘導される。
　前記炎症性サイトカインは、例えば、Tumor　Necrosis　Factor-α（TNF-α）、TNF-β、IL-12、又はIFN-γであってよい。前記免疫原及び前記炎症性サイトカインは、適宜、単独又は組み合わせて用いてもよい。
　なお、抗原提示細胞として、樹状細胞の代わりにマクロファージを得たい場合には、PLoS　One,　April　2013,　Vol.8,　Issue4,　e59243に記載の方法に準じて、前記工程（ｃ）の代わりに、下記の工程：
（ｄ）前記単球細胞を分化させてマクロファージを得る工程
を行ってもよい。かかる場合、造血因子として好ましくはGM-CSF又はM-CSFを用いて、前記単球細胞をマクロファージへと分化させることができる。さらに、例えばIFN-γ又はLPSを添加することによりM1マクロファージへと分化させることができ、あるいは、例えばIL-4又はIL-13を添加することによりM2マクロファージへと分化させることができる（マクロファージはヘルパーT細胞の産生するサイトカインを受け取ることにより活性化することが知られており、古典的活性化(M1マクロファージ)と選択的活性化(M2マクロファージ)が知られている。）。
　前述の各工程で用いる増殖因子、造血因子、サイトカイン等の各濃度は、目的の抗原提示細胞が得られる濃度であればよく、当業者は適宜決定できる。BMP4の濃度は、例えば、5～150ng/mlでもよく、10～100ng/mlがより好ましく、20～80ng/mlがさらに好ましい。VEGFの濃度は、例えば、20～100ng/mlでもよく、30～70ng/mlがより好ましく、40～50ng/mlがさらに好ましい。bFGFの濃度は、例えば、10～100ng/mlでもよく、20～50ng/mlがより好ましい。SCFの濃度は、例えば、20～100ng/mlでもよく、30～70ng/mlがより好ましく、40～50ng/mlがさらに好ましい。IL-3の濃度は、例えば、5～100ng/mlでもよく、30～70ng/mlがより好ましい。TPOの濃度は、例えば、1～25ng/mlでもよく、1～10ng/mlがより好ましい。Flt3-ligandの濃度は、例えば、10～100ng/mlでもよく、30～70ng/mlがより好ましい。GM-CSFの濃度は、例えば、5～250ng/mlでもよく、50～200ng/mlがより好ましい。M-CSFの濃度は、例えば、5～100ng/mlでもよく、30～70ng/mlがより好ましい。IL-4の濃度は、例えば、3～100ng/mlでもよく、10～70ng/mlがより好ましい。TNF-αの濃度は、例えば、0.05～50ng/mlでもよく、0.1～20ng/mlがより好ましい。LPSの場合は、例えば、0.01～100μg/mlでもよく、0.1～10μg/mlがより好ましい。これらの増殖因子、造血因子、サイトカイン等を、目的に応じて、適宜、組み合わせて使用してもよく、最適の濃度を当業者は適宜決定できる。
　また、評価しようとする（標的）タンパク質の濃度は、目的に応じて、例えば、当該タンパク質のエピトープを同定できる濃度であればよく、あるいは、当該タンパク質が対象（例えば哺乳動物、好ましくはヒト）において免疫原性を有するか否かを評価できる濃度であればよく、あるいは、未成熟樹状細胞を刺激して成熟樹状細胞へと誘導できる濃度であればよく、当業者はその濃度を適宜決定できる。そのような濃度としては、例えば0.01～1000μg/mlであってもよく、0.1～100μg/mlがより好ましい。
　目的の抗原提示細胞が得られるように、当業者は、細胞に添加する因子の種類や組み合わせも考慮して、適宜、各工程の期間を最適化できる。前記工程（ａ）の期間は、例えば、2日以上であってよく、2～10日が好ましく、5～8日がより好ましい。前記工程（ｂ）の期間は、例えば、1日以上であってよく、20～200日が好ましく、50～150日がより好ましい。前記工程（ｃ）のうち、前記工程（ｃｉ）の期間は、例えば、1日以上であってよく、1～10日が好ましく、4～6日がより好ましい。前記工程（ｃｉｉ）の期間は、例えば、12時間以上であってよく、12～36時間が好ましく、24時間（1日）がより好ましい。前記工程（ｄ）の期間は、例えば、1日以上であってよく、1～20日が好ましく、例えば5～15日目に、マクロファージをさらにM1マクロファージ又はM2マクロファージへと分化させてもよい。しかしながら、当業者は、各培養条件を考慮して、適宜、最適の培養期間を決定できることは言うまでもない。
　また、本発明は、前記工程（ａ）～（ｃ）を含む、幹細胞又はこれに由来する前駆細胞から（in　vitroで）樹状細胞を製造する方法、及び、当該方法によって得られたか、得られうる樹状細胞に関してよい。すなわち、当該方法で製造された樹状細胞は、MHCII分子のみならず、ヘルパーT細胞の共刺激分子であるCD80、CD86を発現し、かつ、糖鎖レセプターであるCD206、CD209を発現することから、ヘルパーT細胞活性化能及びウイルス等への抵抗性を有することが示唆された。当該方法で得られる樹状細胞を用いた、タンパク質のエピトープの配列解析は、免疫原性の低いタンパク質の開発に寄与する他、自己免疫疾患やウイルス等に対する抗原提示細胞の研究にも優れた材料になることが期待される。
　すなわち、本発明は、さらに、別の態様として、例えば、以下の態様を提供する：
［２３］幹細胞又はこれに由来する前駆細胞から（in　vitroで）樹状細胞を製造する方法であって、以下の工程：
（ａ’）幹細胞又はこれに由来する前駆細胞を分化させて中胚葉前駆細胞を得る工程；
（ｂ’）顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）及びマクロファージコロニー刺激因子（M-CSF）を含む無血清培地下で、前記中胚葉前駆細胞を分化させて単球細胞を得る工程；及び
（ｃ’）無血清培地下で、前記単球細胞を分化させて未成熟樹状細胞を得、及び場合により、前記未成熟樹状細胞をさらに刺激して成熟樹状細胞を得る工程
を含む、方法。
［２４］前記工程（ｃ’）が、
（ｃ１’）顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）及びインターロイキン4（IL-4）を含む無血清培地下で、前記単球細胞を分化させて未成熟樹状細胞を得る工程を含み、及び場合により、
（ｃ２’）前記未成熟樹状細胞を、免疫原、及び、場合により炎症性サイトカインに接触させることで、成熟樹状細胞へと誘導する工程を含む、
［２３］に記載の方法。
［２５］［２３］又は［２４］に記載の方法によって得られうる、樹状細胞。
［２６］MHCII分子に加えて、さらに、CD80、CD86、CD206及びCD209の少なくとも１つを発現している、［２５］に記載の樹状細胞。
［２７］CD80、CD86、CD206及びCD209の全てを発現している、［２６］に記載の樹状細胞。
［２８］［２５］～［２７］のいずれかに記載の樹状細胞を含む、細胞組成物。
　前記樹状細胞又は前記細胞組成物は、感染症又は悪性腫瘍に対する免疫細胞療法を行うため、又は、自己免疫疾患や臓器移植に伴う拒絶反応等を治療する目的で、免疫応答の制御に用いるための、細胞医薬として用いてよい。当該細胞医薬は、樹状細胞を安定的に保持することを目的として、助剤、例えば培地等を適宜組み合わせて用いてよい。
　また、本発明は、一態様において、タンパク質のエピトープを同定するための方法であって、以下の工程：
（Ａ）幹細胞又はこれに由来する前駆細胞から分化された、主要組織適合遺伝子複合体（MHC分子)を発現する細胞に、標的タンパク質を接触させる工程；
（Ｂ）前記MHC分子を発現する細胞から、前記標的タンパク質に含まれるペプチドとMHC分子との複合体を単離する工程；及び
（Ｃ）前記複合体から、前記ペプチドを溶出し、同定する工程
を含む、方法に関する。さらに、当該方法は、以下の工程：
（Ｄ）同定したペプチドが免疫原性を誘導するエピトープであるか否かを検証する工程
を含んでよい。当該方法は、全行程をin　vitroで実施できる。
　なお、血清中のタンパク質に由来したペプチドのアミノ酸配列の検出を避けるために、前記工程（Ａ）は無血清下で行うのが好ましい。
　前記タンパク質のエピトープを同定するための方法を用いて、例えば、異なるタンパク質間、異なるタンパク質製剤間、又は異なるバイオ医薬品間における、免疫原性（又は抗原性）の程度の比較を行うことも可能となる。さらに、製造したタンパク質の品質管理にも利用することができる。
　本発明において、例えば、100ng　MHC分子を得るために必要な、MHC分子を発現する細胞の細胞量は、細胞数、MHC分子の発現強度、発現の程度に依存し得、当業者は、適宜最適な細胞量を決定できる。
　MHCII分子の各アロタイプ（例えば、HLA-DQ1）は、約500～1000個の異なるペプチド断片を保持できる（Chicz　R　M　et　al.,　J　Exp.　Med.　1993,　178,　27-47;　Chicz　R　M　&　Urban　R　G,　Immunol.　Today,　1993,　15,　155-160）。しかしながら、これらの異なるペプチドの大部分は、非常に低いコピー数にしか達しないので、生体内において、生理学的役割を果たす可能性はあまり高くない。一方、免疫原性に関与し、例えばヘルパーT細胞を活性化するペプチド断片は、中程度～高いコピー数に達する（Latek　R　R　&　Unanue　E　R,　Immunol.　Rev.　1999,　172:　209-228）。これらの中程度～高いコピー数のペプチドは、MHCII分子から溶出されるペプチドの総量の約40～50%を占め、約10～200個の個々のペプチドに相当し得る。
　MHCII分子と複合体を形成するペプチド断片の多くは、T細胞受容体による認識に不可欠な約10～13の共通コア配列を共有する、2～5個のC末-及びN末がトランケートされたバリアントとして提示される（Rudensky　AY　et　al,　Nature　1992,　359,　429-431;　Chicz　et　al.　Nature　1992,　358:　764-768）。これらのバリアントは同じエピトープを構成する。これは、重要な、異なるエピトープの数が実際にはより小さく、例えば、約5～70個の範囲にあることを意味する。
　前記ペプチドは、標的タンパク質（のアミノ酸配列）に由来し、抗原提示細胞（具体的には、MHC分子を発現する細胞）の表面上のMHC分子と複合体を形成できるペプチドである。当該ペプチドは、細胞内又は細胞外のMHC分子と結合していてもよい。MHCII分子の各アロタイプは、多様なペプチドと複合体を形成することができ、溶出される各ペプチドの配列決定に必要なペプチド量は、例えば、フェムトモル量のみでよい。本発明の方法により、例えば、約0.1～5μgのMHC分子から、およそフェムトモル量の、当該分子に結合したペプチド断片を単離でき、かつ、当該ペプチドの配列を同定することが可能である。
　抗原提示細胞からMHC分子と前記ペプチドとの複合体を単離するために、当該細胞の細胞膜を可溶化してよい。当該溶解は、当業者に公知の方法、例えば、凍結融解、界面活性剤の使用、又はこれらを組み合わせて実施してよい。界面活性剤としては、例えば、Triton　X-100(TX100)、Nonidet　P-40(NP-40)、Tween20、Tween80、n-オクチルグルコシド、ZWITTERGENT、Lubrol、又はCHAPSを用いてよい。細胞細片及び核は、遠心分離によって、可溶化されたMHC分子-ペプチド複合体を含む細胞溶解物から除去する。
　可溶化されたMHC分子-ペプチド複合体を含む細胞溶解物に免疫沈降又は免疫アフィニティークロマトグラフィーを行って、MHC分子-ペプチド複合体を精製してもよい。免疫沈降又は免疫アフィニティークロマトグラフィー用に、MHC分子に特異的で、かつ、これらの方法に適した抗体（抗MHCI分子抗体、例えば、抗HLA-A抗体、抗HLA-B抗体、抗HLA-C抗体、若しくは、抗HLA-ABC抗体等；あるいは、抗MHCII分子抗体、好ましくは、抗HLA-DR抗体、抗HLA-DQ抗体又は抗HLA-DP抗体）を用いてよい。当該特異的抗体はモノクローナル抗体であることが好ましく、共有結合又は非共有結合的に、例えばプロテインAを介して、ビーズ（例えばセファロースビーズ又はアガロースビーズ）に結合させてもよい。例えば、CNBr-activatedセファロースに対して、抗体のアミノ基を共有結合で結合させて固層化させてもよい。当該モノクローナル抗体は市販品を購入してもよく、又は、プロテインA-もしくはプロテインG-アフィニティークロマトグラフィーを使用して、対応するそれぞれのハイブリドーマ細胞の上清から精製してもよい。
　MHC分子の免疫分離（immunoisolation）は、例えば、抗体-ビーズを細胞溶解物とともに数時間回転しながらインキュベートして行ってもよい。また、MHC分子-ペプチド複合体が結合した抗体-ビーズの洗浄は、エッペンドルフチューブ内で行ってもよい。免疫沈降の結果は、変性したMHC分子を認識する抗体を使用して、SDS-PAGE及びウエスタンブロッティング法によって解析してもよい。
　MHC分子と複合体を形成していたペプチドを溶出することにより、標的タンパク質に由来し、抗原提示細胞によって分解されたペプチドの混合物が得られる。
　当該ペプチドは、当業者に公知の方法によって、例えば、希釈した酸、例えば希釈したアセトニトリル（Jardetzky　T　S　et　al.,　Nature　1991　353,　326-329)、希釈した酢酸及び加熱(Rudensky　A　Y　et　al.,　Nature　1991,　353,　622-626;　Chicz　R　M　et　al,　Nature　1992,　358,　764-768)、又は、希釈したトリフルオロ酢酸（Kropshofer　H　et　al.,　J　Exp　Med　1992,　175,　1799-1803）を使用することによって溶出してもよい。ペプチドを、希釈したトリフルオロ酢酸で、例えば37℃で、溶出するのが好ましい。
　MHC分子-ペプチド複合体からペプチドを溶出する前に、残留する界面活性剤を除去するために、水又は低塩緩衝液で洗浄してもよい。低塩緩衝液は、0.5～10mMの濃度のTris緩衝液、リン酸緩衝液、又は酢酸緩衝液を用いてもよい。あるいは、MHC分子-ペプチド複合体は、HPLC用の超高純度水で洗浄してよい。当該洗浄は限外濾過によって行ってもよい。限外濾過は、例えば、30kD、20kD、10kD、又は5kDのカットオフ値及び0.5～1.0mlのチューブ体積を有する限外濾過チューブ内で行ってもよい。限外濾過チューブ内の洗浄は、MHC分子-ペプチド複合体を保持するビーズの体積の数十倍の体積で、例えば、4～12回行ってよい。
　この限外濾過チューブを使用して、MHC分子-ペプチド複合体からペプチドを溶出してもよい。次いで、溶出したペプチドを凍結乾燥又は遠心エバポレーターによって乾燥してもよい。
　溶出したペプチドの混合物を、液体クロマトグラフ質量分析（LC/MS）を利用して、分画し、配列解析することで、各ペプチド（のアミノ酸配列）を同定してよい。
　配列解析により、ペプチド混合物中の各ペプチドのアミノ酸配列が、フェムトモル量のペプチドを配列決定するのに十分な公知の方法によって明らかにできる。
　同定により、ペプチドが由来するタンパク質、及び、当該タンパク質におけるどの配列に当該ペプチドが由来するのかが明らかになる。
　溶出したペプチドの混合物は、例えば、逆相クロマトグラフィーと陰イオン交換クロマトグラフィーもしくは陽イオン交換クロマトグラフィーとを組み合わせて、あるいは逆相クロマトグラフィー単独で分画するのが好ましい。分画は、質量分析計のナノフローエレクトロスプレー供与源に、又は、MALDI解析用プレート上に画分をスポットするマイクロ分画装置のいずれかに接続された、fused-silica　micro-capillary　columnを利用するHPLCモードで行ってもよい。
　質量分析技法としては、エレクトロスプレーイオン化タンデム型質量分析（ESI-MS）又はMALDI-post　source　decay（PSD）MSを用いてよく、ESI-MSが好ましい。
　各ペプチドのアミノ酸配列解析は、当業者に公知の種々の手段を用いて決定してよい。配列解析は、例えばMASCOTアルゴリズム又はSEQUESTアルゴリズムを使用した、ペプチド断片スペクトルのコンピューター解析によって行ってよい。これらのアルゴリズムは、実験的及び理論的に作製されたタンデム質量スペクトルの相互相関解析を行うために、タンパク質及びヌクレオチド配列データベースを使用するのが好ましい。これにより、自動化ハイスループット配列解析が可能になる。
　溶出によって得られる全ペプチドの定性分析のために、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間質量分析（MALDI-TOF）を行ってもよい。MALDI-TOF解析により、ペプチド混合物の複雑性及び主要なペプチドの存在に関する大まかな概要が提供され得る。
　MHC分子との複合体から溶出されるそれぞれの単一ペプチドの量を推定するために、マイクロキャピラリーカラムの通過物を、214nmの検出波長にて、UV検出器を用いて解析してもよい。解析しようとするペプチドのピーク面積を、段階的な量の標準ペプチド（対照）のピーク面積と比較して、ペプチドの量を推定してもよい。
　MHC分子からペプチドを溶出することより、標的タンパク質に由来し、抗原提示細胞中で天然に断片化された、ペプチドのセットが得られる。偽陽性のペプチドを同定し、排除するために、標的タンパク質に暴露した抗原提示細胞のセットに加えて、陰性対照として、標的タンパク質に暴露させない抗原提示細胞のセットを用意して、比較解析することが好ましい。標的タンパク質に暴露させない抗原提示細胞と比較して、標的タンパク質に暴露した抗原提示細胞でのみ検出できたペプチドは、ペプチドが由来するタンパク質のエピトープとして機能し、抗原性があると同定してもよい。
　同定されたペプチドは、MHC結合モチーフ、MHC結合能、又はヘルパーT細胞による認識等を指標として、エピトープとして機能するか否かを検証することができる。あるいは、in　silicoのエピトープ予測アルゴリズムを適宜組み合わせてもよい。
　MHC結合モチーフは、MHC分子と安定的な複合体を形成するために必要な、特定のMHC分子（対立遺伝子多型）と結合するペプチドに共通の構造的特徴を意味する。MHCII分子の場合、ペプチド長は12～18アミノ酸と様々であり、ペプチド結合溝の両端が開放されているためにより長いペプチドでさえも結合できる。多くのMHCII分子は、結合に関連した最大4個の残基（「アンカー残基」と称される）を、9量体のコア領域（nonameric　core　region）に含まれる相対的位置：P1、P4、P6、及びP9において収容できる。しかしながら、このコア領域は、ペプチドのN末端からの距離が変動し得る。多くの場合、2～4個のN末端残基がコア領域の前にある。したがって、P1アンカー残基は、MHCII分子と複合体を形成できる多くのペプチドの位置3、4、又は5に位置する。例えば、HLA-DR分子から溶出されるペプチドは、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、メチオニン、ロイシン、イソロイシン、又はバリンのような、疎水性P1アンカーを共有し得る。アンカー残基の位置及び種類は、頻出するMHC分子のペプチド結合モチーフから推定できる。ペプチド配列のモチーフ検証が可能なコンピューターアルゴリズムは、例えば、「Tepitope」（www.vaccinome.com、J.　Hammer,　Nutley、USA）より入手できる。
　MHC結合能は、検出されたペプチド自身（例えば、合成ペプチドを利用してよい）と所望のMHC分子を用いて、当業者に公知の方法で検証してもよい（Kropshofer　H　et　al.,　J.　Exp.　Med.　1992,　175,　1799-1803;　Vogt　A　B　et　al.,　J.　Immunol.　1994,　153,　1665-1673;　Sloan　V　S　et　al.,　Nature　1995,　375,　802-806）。あるいは、MHC分子を発現する細胞株とビオチン化されたペプチドを利用する細胞結合アッセイ法を使用して、MHC結合能を検証してもよい（Arndt　S　O　et　al,　EMBO　J.,　2000,　19,　1241-1251）。ペプチドのMHCへの相対結合能は、標識したレポーターペプチドの結合を50%まで減少させるために必要な濃度（IC50）を測定することで決定してよい。なお、ペプチドとしては、同定された各ペプチドを用いてもよいし、あるいは、同定されたペプチドに共通する配列（コア配列）を有するペプチドを用いてもよい。なお、検出されるペプチドは、MHC分子のアロタイプの種類やMHC分子に対する結合親和性の強さ等に依存すると考えられる。
　ヘルパーT細胞を刺激する能力は、同定したペプチドがエピトープとして機能するかを検証するうえで特に重要である。同定したペプチドがヘルパーT細胞を刺激する場合には、当該ペプチドが免疫原性を有すると判定する指標の1つとしてもよい。当該判定方法としては、本発明の方法によって同定されるペプチドがヘルパーT細胞を活性化する能力があるかを試験してもよい。なお、ペプチドとしては、同定された各ペプチドを用いてもよいし、あるいは、同定されたペプチドに共通する配列（コア配列）を有するペプチドを用いてもよい。
　ヘルパーT細胞の細胞応答は、当業者に公知の様々なin　vitroの方法によって測定してよい。例えば、評価したいペプチドの存在下で、ヘルパーT細胞とともにMHC分子を発現する細胞（例えば、単球、マクロファージ、又は樹状細胞等）を培養して、ヘルパーT細胞の細胞増殖を指標として、DNA複製の際に放射性物質で標識したチミジン（T）が取り込まれるかを測定してもよい。あるいは、チミジンの代わりに5-bromo-2'-deoxyuridine　(BrdU)を用いてもよく、かかる場合、BrdUをDNA複製の際に取り込んだヘルパーT細胞を、BrdUに対するモノクローナル抗体で処理した後、次いで、酵素もしくは蛍光標識された二次抗体を使用して、BrdUの取込量を測定してもよい（例えば、5-Bromo-2’-deoxyuridine　Labeling　&　Detection　Kit　III,　Roch-Biochem,Cat　No.1　444　611）。あるいは、ヘルパーT細胞の増殖により蛍光色素ラベル5,6-carboxyfluorescein　diacetate　succinimidyl　ester（CFSE）が希釈されることを指標とする、フローサイトメトリー法を用いるNaive　Primary　T　cell　Assay（Proimmune）で測定してもよい。あるいは、細胞増殖を測定する代わりに、ヘルパーT細胞から産生される各種サイトカインを測定することで、ヘルパーT細胞の細胞応答を評価してもよい。そのようなサイトカインとしては、例えば、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-12、IFN-γ、又はTransforming　growth　factor-β(TGF-β)が挙げられる。サイトカインの測定法としては、当業者に公知の種々の方法、例えば、ELISA又はELISPOT等が挙げられる。
　MHC分子を発現する細胞としては、好ましくは、本発明において、前述したように、幹細胞又はこれに由来する前駆細胞から樹状細胞を製造する方法によって製造される樹状細胞を用いてよい。MHC分子を発現する細胞は、アッセイの前に、例えば電離放射線又はマイトマイシンCで処理することによって非増殖性にしてもよい。
　また、本発明は、別の態様において、免疫原性が減少又は消失したタンパク質の製造方法であって、以下の工程：
（１）上述の方法に従って、タンパク質のエピトープを同定する工程；
（２）MHC分子への結合が減少又は消失するように、前記エピトープを修飾する工程；及び
（３）修飾されたエピトープを有するタンパク質を製造する工程
を含む、方法に関する。また、本発明は、さらなる別の態様において、前記製造方法に従って得られた（obtained）タンパク質、又は得られ得る（obtainable）タンパク質にも関する。「得られ得る（obtainable）タンパク質」とは、前記製造方法を用いれば得ることが可能なタンパク質を意味してよい。
　前記工程（２）に関連して、エピトープが同定されたペプチドは、MHC分子への結合が減少又は消失するように、あるいは、免疫原性を減少又は消失できるように、エピトープのアミノ酸配列を改変又は修飾することができる。免疫原性の減少又は消失は、当業者に公知の方法であれば特に限定はされないが、例えば、上述した、MHC結合モチーフ、MHC結合能、又はヘルパーT細胞による認識等を指標として決定してもよい。あるいは、in　silicoのエピトープ予測アルゴリズムを適宜組み合わせてもよい。
　当該改変又は修飾は、当業者に公知の方法に従って行ってよい。例えば、エピトープを含むタンパク質のアミノ酸配列をコードするDNAヌクレオチド配列において、DNA配列の所望の１又は複数のヌクレオチドを、例えば部位特異的変異導入法や相同組換え法を用いて、挿入、置換、又は欠失等させてもよい。例えば、MHC分子に対する結合に重要な１又は複数のアンカー残基を他のアミノ酸残基に変更し、これにより免疫原性を減少又は消失できるのが好ましい。あるいは、例えば、ヘルパーT細胞のT細胞受容体、又はB細胞のB細胞受容体等によるエピトープの認識に重要なアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に変更してもよい。MHC分子に対する結合に重要なアンカー残基を交換するための方法は、当業者に周知である。例えば、アラニン、プロリン、グリシン又は荷電アミノ酸残基で、HLA-DR1拘束性T細胞エピトープのP1アンカーを置換してもよい（Kropshofer　et　al.,　EMBO　J.　15,　1996,　6144-6154）。
　前記工程（３）に関連して、修飾されたエピトープを有するタンパク質は、化学合成してもよく、又は、遺伝的もしくは生物学的に合成してもよい。遺伝的又は生物学的に合成する場合、修飾されたエピトープを有するタンパク質の遺伝子を一過性又は永続的に保持する、宿主細胞や動物を利用してもよい。宿主細胞や動物は、例えば、タンパク質の製造や発現のための産生系として使用することができる。宿主細胞としては、真核細胞又は原核細胞を用いてよい。
　宿主細胞として使用できる真核細胞としては、例えば、動物細胞、植物細胞、真菌細胞が挙げられる。動物細胞としては、哺乳類細胞、例えば、CHO(Puck　et　al.,　(1958)　J.　Exp.　Med.　108(6):　945-956)、COS、HEK293、3T3、ミエローマ、BHK(baby　hamster　kidney)、HeLa、Vero等、両生類細胞、例えばアフリカツメガエル卵母細胞（Valle　et　al.,　Nature　(1981)　291:　338-340）、及び、昆虫細胞、例えば、Sf9、Sf21、Tn5が例示される。動物細胞において、大量発現を目的とする場合にはCHO細胞が好ましい。宿主細胞への、修飾されたエピトープを有するタンパク質の遺伝子を有するベクターを、例えば、リン酸カルシウム法、DEAEデキストラン法、カチオニックリボソームDOTAP（Boehringer　Mannheim製）を用いた方法、エレクトロポレーション法、又はリポフェクション等の方法により導入してよい。植物細胞としては、例えば、ニコチアナ・タバカム（Nicotiana　tabacum）由来の細胞及びウキクサ（Lemna　minor）がタンパク質生産系として知られており、これらの細胞をカルス培養する方法によりタンパク質を産生させてもよい。真菌細胞としては、酵母、例えば、サッカロミセス（Saccharomyces）属の細胞（サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces　cerevisiae）、サッカロミセス・ポンベ（Saccharomyces　pombe）等）、又は糸状菌、例えば、アスペルギルス（Aspergillus）属の細胞（アスペルギルス・ニガー（Aspergillus　niger）等）を用いたタンパク質発現系を用いてよい。原核細胞を使用する場合、細菌細胞を用いる産生系を用いてもよい。細菌細胞としては、例えば、大腸菌（E.coli）、枯草菌を用いてもよい。
　動物としては、例えば、遺伝子組換動物又はトランスジェニック動物が挙げられ、動物の種類としては、限定はされないが、例えばウシ、ヒツジ、マウス等を用いてもよい。かかる場合、例えば、乳などの体液中にタンパク質を分泌させたものを回収してもよい。
　本発明において、修飾されたエピトープを有するタンパク質は、継続的に、又は、商業的に大量生産してもよい。生産されたタンパク質、又は、当該タンパク質を含む組成物（例えば、医薬組成物）も、本発明に含まれる。
　また、本発明は、別の態様において、タンパク質が対象において免疫原性を有するか否かを予測する方法であって、
（Ｉ）標的タンパク質を投与することが意図される対象のMHC分子の１又は複数のアロタイプを発現する細胞を提供する工程であって、前記細胞は幹細胞又はこれに由来する前駆細胞から分化されることを特徴とする、工程；
（ＩＩ）前記「MHC分子の１又は複数のアロタイプを発現する細胞」に、標的タンパク質を接触させる工程；
（ＩＩＩ）前記「MHC分子の１又は複数のアロタイプを発現する細胞」から、前記標的タンパク質に含まれるペプチドとMHC分子との複合体を単離する工程；
（ＩＶ）前記複合体から、前記ペプチドを溶出し、同定する工程；及び
（Ｖ）場合により、同定したペプチドが免疫原性を誘導するエピトープであるか否かを検証する工程
を含み、
　前記同定したペプチドが免疫原性を誘導するエピトープである場合に、前記標的タンパク質が前記対象において免疫原性を有することを指し示す、方法に関する。
　前記予測方法は、本明細書において上述に説明した１又は複数の技術的特徴を適宜組み合わせて実施できることが当業者には理解できる。
　前記予測方法は、所定のタンパク質に対する、MHC分子の各アロタイプ又はアロタイプのセットに基づいた、免疫原性の有無又は程度の比較も可能とする。
　前記予測方法は、さらに、前記対象が有するMHC分子のアロタイプの全てのセットが含まれるように、前記対象のMHC分子の１又は複数のアロタイプを発現する細胞を１又は複数提供することが好ましい。前記幹細胞は、前記対象（例えば哺乳動物、好ましくはヒト）に由来する幹細胞（例えばiPS細胞やES細胞）であればなお好ましい。これは、幹細胞を分化させた抗原提示細胞では、MHC分子のアロタイプが維持されることから、前記対象由来の幹細胞を用いることにより、当該対象が有するMHC分子のアロタイプのセットを全て備えた抗原提示細胞を製造し得ることに基づく。当該抗原提示細胞を用いることにより、個々の対象（例えば、ヒト患者や健常人）において標的タンパク質が免疫原性を有するか否かを個別に評価することも可能となる（個別化医療の実現）。言い換えれば、当該予測方法は、免疫原性を有する対象（例えば患者）の選択方法、又は、免疫原性を有しない対象（例えば患者）の選択方法にも関する。あるいは、当該予測方法は、MHC分子の１又は複数の特定のアロタイプが、投与を意図するタンパク質との関係で免疫原性に関与することを指し示す方法にも関する。
　MHC分子のアロタイプ（ヒトにおいては、HLA遺伝子型）を規定する遺伝子は同一個体の体細胞のほぼすべてに維持されていると考えられている。したがって、前記対象（例えば哺乳動物、好ましくはヒト）に由来する幹細胞（例えばiPS細胞やES細胞）は、MHC分子のアロタイプが維持される限り、前記対象のあらゆる体細胞等から作製されてもよい。体細胞の例としては特に限定はされないが、例えば、ヒト等から分離したPBMCからiPS細胞を作製することもできる。そのような報告としては、例えば、Soares　FA,　Pedersen　RA,　Vallier　L.,　Generation　of　Human　Induced　Pluripotent　Stem　Cells　from　Peripheral　Blood　Mononuclear　Cells　Using　Sendai　Virus,　Methods　Mol　Biol.　2015　Feb　17;　Quintana-Bustamante　O,　Segovia　JC.,　Generation　of　Patient-Specific　induced　Pluripotent　Stem　Cell　from　Peripheral　Blood　Mononuclear　Cells　by　Sendai　Reprogramming　Vectors,　Methods　Mol　Biol.　2014　Dec　19;　Su　RJ,　Neises　A,　Zhang　XB.,　Generation　of　iPS　Cells　from　Human　Peripheral　Blood　Mononuclear　Cells　Using　Episomal　Vectors,　Methods　Mol　Biol.　2014　Nov　18;　Riedel　M,　Jou　CJ,　Lai　S,　Lux　RL,　Moreno　AP,　Spitzer　KW,　Christians　E,　Tristani-Firouzi　M,　Benjamin　IJ.,　Functional　and　pharmacological　analysis　of　cardiomyocytes　differentiated　from　human　peripheral　blood　mononuclear-derived　pluripotent　stem　cells,　Stem　Cell　Reports.　2014　May　29;3(1):131-41.が挙げられる。また、iPS細胞などの幹細胞から樹状細胞等の抗原提示細胞を樹立する方法は、本明細書で挙げたように多数の方法が報告されている。したがって、当業者であれば、例えば、所定の対象（例えばヒト患者）から分離したPBMC等の細胞からiPS細胞などの幹細胞を作製した後に、当該幹細胞を用いて樹状細胞等の抗原提示細胞を樹立することで、前記予測方法に当該細胞を利用できることを当然に理解できる。この際、iPS細胞などの幹細胞の作製に用いる前記対象由来の細胞としては、MHC分子のアロタイプ（ヒトにおいては、HLA遺伝子型）を特定することができる細胞か、MHC分子のアロタイプがあらかじめ判明している（又は予測されている）細胞であってもよい。あるいは、MHC分子のアロタイプが既に判明している（又は予測されている）iPS細胞を用いてよい。
　本発明は、さらなる別の態様において、タンパク質を有効成分として含む、対象における、前記タンパク質に関連した疾患の治療及び／又は予防用組成物であって、前記対象は、前述の予測方法に従って、前記タンパク質に免疫原性を有さないことが予測された対象（のみ）から選択されることを特徴とする、組成物に関する。当該「治療及び／又は予防用組成物」は、治療及び／又は予防に有効な量のタンパク質を含むのが好ましく、当業者はタンパク質の有効量を適宜決定できる。また、当該「治療及び／又は予防用組成物」は、１又は複数の他の剤を含んでもよい。
　用語「タンパク質に免疫原性を有さないことが予測された」とは、標的タンパク質が対象において免疫原性を惹起しないか、又は、有効性や安全性等の観点から許容できる程度にしか免疫原性を惹起しないことを意味してよい。
　人種、民族、集団、又は個人に合わせてMHC分子の１又は複数のアロタイプを発現する細胞を揃え、タンパク質の免疫原性を評価することにより、免疫原性を有さないことが予測された対象のみに、当該タンパク質、又は、当該タンパク質を有効成分として含む治療及び／又は予防用組成物を投与することが好ましい。当該組成物は医薬組成物であることが好ましい。
　当該タンパク質を（医薬）組成物に含めて用いる場合には、公知の製剤学的製造法により製剤化して用いることができる。例えば、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、又はマイクロカプセル剤として経口的に、あるいは、水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液に当該タンパク質を含有させた無菌性溶液又は懸濁液の形態で非経口的（例えば、経皮的、鼻腔内的、経気管支的、筋内的、又は静脈内）に使用できる。当該（医薬）組成物には、薬学的に許容される担体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤、又は結合剤を適宜含めて製造してもよい。錠剤、カプセル剤に混和することができる添加剤としては、例えばゼラチン、コーンスターチ、トラガントガム、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸のような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖又はサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油又はチェリーのような香味剤を用いてよい。調剤単位形態がカプセルである場合には、上記の材料に加えて、油脂のような液状担体をさらに含有させることができる。注射用の無菌性溶液は、注射用蒸留水のようなベヒクルを用いて、当業者に周知の方法に従って処方することができる。注射用の水溶液としては、例えば生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液、例えばD-ソルビトール、D-マンノース、D-マンニトールが挙げられる。さらに、適当な溶解補助剤、例えば、エタノールのようなアルコール、プロピレングリコールもしくはポリエチレングリコールのようなポリアルコール、ポリソルベート80（TM）もしくはHCO-50のような非イオン性界面活性剤を併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油が挙げられ、溶解補助剤として、例えば、安息香酸ベンジル又はベンジルアルコールと併用してもよい。また、例えばリン酸塩緩衝液又は酢酸ナトリウム緩衝液のような緩衝剤、例えば塩酸プロカインのような無痛化剤、例えばベンジルアルコール又はフェノールのような安定剤、又は酸化防止剤と配合してもよい。調製された注射液は通常、適当なアンプルに充填させて使用してよい。
　当該タンパク質、又は、当該タンパク質を有効成分として含む治療及び／又は予防用組成物の投与量、投与方法、投与間隔等は、患者の体重、年齢、症状等により変動するが、当業者であれば適宜選択し、決定することができる。
　前記「タンパク質に関連した疾患」において、タンパク質と、当該タンパク質に関連した疾患は、特に限定はされない。タンパク質は、生体内に投与した場合に、例えば免疫原性、有効性又は安全性の問題が生じ得るタンパク質であればなお好ましい。また、疾患は、限定はされないが、例えば、autoimmune　diseases(例えば、Rheumatoid　arthritis,　type　I　diabetes,　multiple　sclerosis(MS),　coeliac　disease,　myasthenia　gravis(MG)又はsystemic　lupus　erythematosus(SLE)),　cancer(e.g.　melanoma,　breast　cancer,　B　cell　lymphomas,　prostate　cancer,　renal　cancer)又はinfectious　diseases(e.g.　diseases　caused　by　HIV,　hepatitis　C　virus,　measles　virus,　mycobacteria)が挙げられる。
　そのようなタンパク質と当該タンパク質に関連した疾患の組み合わせとしては、例えば、Self/Nonself　2010;1(4)　pp.314-322;　PHARM　TECH　JAPAN　Vol.28,　No.10　(2012),　pp.117(2065)-126(2074);　Sorensen,　P.S.,　et　al.,　Neurology,　67(9),　1681-3　(2006);　Hesse,　D.,　et　al.,　Eur.　J.　Neurol.,　14(8),　850-9　(2007);　Casadevall,　N.,　et　al.,　N.　Engl.　J.　Med.,　346(7),　469-75　(2002);　Gershon,　S.K.,　et　al.,　N.　Eng.　J.　Med.,　346(20),　1584-6　(2002);　Locatelli　F.,　et　al.,　Perit.　Dial.　Int.,　27(Suppl2),　S303-7　(2006)に記載の例を挙げてもよい。
　例えば、タンパク質と当該タンパク質に関連した疾患の具体的な組み合わせとしては、限定はされないが、それぞれ、MuromanabとAllograft　rejection;　AbciximabとPTCA　adjunct;　RituximabとNon-Hodgkin　lymphoma;　DaclizumabとTransplant　rejection;　TrastuzumabとBreast　cancer;　PalivizumabとRSV　prophylaxis;　BasiliximabとTransplant　rejection;　InfliximabとRheumatoid　arthritis又はCrohn;　ArcitumomabとColorectal　cancer;　CanakinumabとCryopirin-associated　periodic　syndrome;　FanolesomabとImaging　for　appendicitis;　ImciromabとCardiac　imaging　for　MI;　CapromabとProstate　cancer　diagnostic;　NofetumomabとDetection　of　SCLC;　GemtuzumabとAcute　myeloid　leukemia;　AlemtuzumabとB　cell　chronic　lymphocytic　leukemia;　IbritumomabとNon-Hodgkin　lymphoma;　AdalimumabとRheumatoid　arthritis,　Crohn,　PsA,　JIA,　Ankylosing　spondylitis又はplaque　psoriasis;　OmalizumabとAsthma;　EfalizumabとPsoriasis;　TositumomabとNon-Hodgkins　lymphoma;　CetuximabとColorectal　cancer;　BevacizumabとColorectal,　Breast,　Renal　又はNSCL　cancer;　PanitumumabとColorectal　cancer;　RanibizumabとMacular　degeneration;　EculizumabとParoxysmal　nocturnal　hemoglobinuria;　Natalizumabとmultiple　sclerosis(MS)又はCrohn;　GolimumabとRheumatoid　arthritis,　PsA,　Ankylosing　spondylitis;　Cetolizumab　pegolとRheumatoid　arthritis又はCrohn;　OfatumumabとCLL;　UstekinumabとPlaque　psoriasis;　TocilizumabとRheumatoid　arthritis;　DenosumabとOsteoporosis;　Prolastinとα1-antitrypsin　deficiency;　Aralastとα1-antitrypsin　deficiency;　Zemairaとα1-antitrypsin　deficiency;　Kogenate　FSとHemophilia　A;　ReFactoとHemophilia　A;　ZynthaとHemophilia　A;　NovoSevenとHemophilia;　BenefixとHemophilia　B;　ATrynとThromboembolism;　BabyBIGとInfant　botulism;　BerinertとAngioedema;　CinryzeとAngioedema;　RhophylacとITP;　EvithromとCoagulation;　RecothromとCoagulation;　WilateとCoagulation;　CerezymeとGacher　Disease;　Exenatide又はByettaとType　II　diabetes;　IntronAとLeukemia,　Kaposi　sarcoma,　hepatitis　B/C;　BetaseronとMultiple　sclerosis;　NovoLogとType　II　diabetes;　LeukineとPreventing　infection　in　cancer;　NEUPOGENとPreventing　infection　in　cancer;　RetavaseとMyocardial　infarction又はpulmonary　embolism;　HumatropeとDwarfism;　AdagenとInherited　immunodeficiency;　PulmozymeとCystic　fibrosis;　ProcritとAnemia　in　chronic　renal　disease;　ProleukinとOncology等が挙げられる。
　本発明は、さらなる別の態様において、
［３０］タンパク質に関連した疾患の治療及び／又は予防方法であって、前記治療及び／又は予防を必要とする対象に前記タンパク質を投与する工程を含み、かつ、前記対象は、前述の予測方法に従って、前記タンパク質に免疫原性を有さないことが予測された対象（のみ）から選択されることを特徴とする、治療及び／又は予防方法に関する。
　本発明は、さらなる別の態様において、
［３１］タンパク質に関連した疾患の治療及び／又は予防用医薬の製造のための、前記タンパク質の使用であって、かつ、前記治療及び／又は予防の対象は、前述の予測方法に従って、前記タンパク質に免疫原性を有さないことが予測された対象（のみ）から選択されることを特徴とする、使用に関する。
　本発明は、さらなる別の態様において、幹細胞もしくはこれに由来する前駆細胞、又は、これから分化されたMHC分子を発現する細胞の、前述した、本発明における各種の方法における使用に関する。
　これらの本発明は、本明細書において説明する１又は複数の技術的特徴を適宜組み合わせて実施できることが当業者には当然に理解できる。
　本明細書に記載の１又は複数の態様を任意に組み合わせたものも、当業者の技術常識に基づいて技術的に矛盾しない限り、本発明に含まれることが当業者には当然に理解される。
　本明細書で用いられる用語は、特定の実施態様を説明するために用いられ、発明を限定する意図として理解されてはならない。異なる定義が明示されていない限り、本明細書で用いられる用語（技術用語及び科学用語を含む。）は、本発明が属する技術分野における当業者によって広く理解されるものと同じ意味を有するものとして解釈され、かつ、理想化され、又は、過度に形式的な意味において解釈されるべきではない。
　本明細書で用いられる用語「含む」は、文脈上明らかに異なる理解をすべき場合を除き、記述された事項（部材、工程、要素、数字等）が存在することを意図するものであり、それ以外の事項（部材、工程、要素、数字等）が存在することを排除しない。
　本発明の実施態様は模式図を参照しつつ説明される場合があるが、説明を明確にするために誇張されて表現される場合がある。
　本明細書に記載の全ての文献（特許文献、非特許文献）は、その内容の全てが参照により本明細書に援用されてよく、当業者は技術常識に照らしてその内容を適宜参酌して、本発明を理解できる。
　本明細書に記載の数値は、文脈に反しない限り、当業者の技術常識に従って、一定の幅を有する値であると理解される。例えば「1mg」の記載は「約1mg」と記載されているものと理解され、一定の変動量を包含するものとして理解される。また、本明細書において、例えば、「1～5個」と記載されている場合、文脈に反しない限り、「1個、2個、3個、4個、5個」と、それぞれの値が個別具体的に記載されているものと理解される。
　以下において、本発明を、実施例を参照してより詳細に説明する。しかしながら、本発明は、いろいろな態様により具現化することができ、ここに記載される実施例に限定されるものとして解釈されてはならない。
　本明細書及び請求の範囲において、特に明示されていない場合であって、文脈において矛盾しない限り、本明細書及び請求の範囲に記載の各名詞が表す対象は、１又は複数存在してもよいことが意図される。
　Ａ．方法
　－使用細胞－
ヒトiPS細胞:Tic(JCRB1331),　JCRB細胞バンクより導入；201B7，iPSアカデミアジャパン株式会社より導入。
フィーダー細胞：EmbryoMax　Primary　Mouse　Embryonic　Fibroblasts(MEF),　Hygro　resistant,　C57BL/6(日本ミリポアより購入，Cat.:PMEF-HL)；SNL　76/7　feeder　cells　(SNL)(Cell　Biolabs,　Incより購入，Cat.:CBA-316)。
　－ヒトiPS細胞(Tic)の未分化を維持する培養方法－
1.　蒸留水により0.1%に希釈されたgelatin　from　porcine　skin(SIGMA，Cat.:G1890)を温めゾル状にし，60mmディッシュに2mLずつ添加し37℃，5%CO2条件下に30～180分置き，ゼラチンコートディッシュとした。
2.　フィーダー細胞(MEF)を，Embryonic　Stem　Cell　Fetal　Bovine　Serum(FBS)(Gibco，Cat.:10439-024)を10%，L-glutamine(Invitrogen，Cat.:25030-081)を2mM，Penicillin/Streptomycin(Invitrogen，Cat.:15140-122)を0.5%加えたDMEM(Gibco，Cat.:10569-010)に懸濁し，1～2×105cells/mLとなるよう希釈し，ゼラチンコートディッシュに4mLずつ播種し，37℃，5%CO2条件下で1日培養した。
3.　basic　fibroblast　growth　factor(bFGF)(WAKO，Cat.:064-04541)を10ng/mLとなるように加えたiPSellon(cardio，Cat.:007101)を用いて，フィーダー細胞を播種した60mmディッシュにて，37℃，5%CO2条件下で，ヒトiPS細胞の未分化を維持した培養を実施した。
4.　細胞の増殖に応じて，分化が生じたコロニーをスクレーパーにより除去し，Neutral　protease,　grade　I(Roche　Applied　Science,Cat.:04　942　086　001)2U/mLと反応させ，先に剥がれるフィーダー細胞をディッシュより除去した後，ヒトiPS細胞のコロニーをスクレーパーを用いてディッシュより回収し，bFGFを10ng/mLとなるように加えたiPSellonに懸濁し，新たにフィーダー細胞を播種した60mmディッシュに播種し，37℃，5%CO2条件下で培養を継続した。
　－ヒトiPS細胞(201B7)の未分化を維持する培養方法－
1.　蒸留水により0.1%に希釈されたgelatin　from　porcine　skinを温めゾル状にし，60mmディッシュに2mLずつ添加し37℃，5%CO2条件下に30～180分置き，ゼラチンコートディッシュとした。
2.　フィーダー細胞(SNL)を，FBSを7%，L-glutamineを2mM，Penicillin/Streptomycinを0.5%加えたDMEM(Gibco，Cat.:10569-010)に懸濁し，1～2×105cells/mLとなるよう希釈し，ゼラチンコートディッシュに4mLずつ播種し，37℃，5%CO2条件下で1日培養した。
3.　bFGFを4ng/mLとなるように加えたPrimate　ES　cell　medium(ReproCELL，Cat.:RCHEMD001)を用いて，フィーダー細胞を播種した60mmディッシュにて，37℃，5%CO2条件下で，ヒトiPS細胞の未分化を維持した培養を実施した。
4.　細胞の増殖に応じて，分化が生じたコロニーをスクレーパーにより除去し，Neutral　protease,　grade　I　2U/mLと反応させ，先に剥がれるフィーダー細胞をディッシュより除去した後，ヒトiPS細胞のコロニーをスクレーパーを用いてディッシュより回収し，bFGFを4ng/mLとなるように加えたPrimate　ES　cell　mediumに懸濁し，新たにフィーダー細胞を播種した60mmディッシュに播種し，37℃，5%CO2条件下で培養を継続した。
　－ヒトiPS細胞から単球様細胞を分化する方法－
1.　DMEM(Gibco，Cat.:10569-010)により40倍に希釈したMatrigel,　growth-factor　reduced(BD　biosciences,Cat.:356230)を60mmディッシュに2mLずつ添加し，37℃，5%CO2条件下に12～72時間置き，MGディッシュとした。
2.　蒸留水により0.1%に希釈されたgelatin　from　porcine　skin(SIGMA，Cat.:G1890)を温めゾル状にし，60mmディッシュに2mLずつ添加し37℃，5%CO2条件下に30～180分置き，ゼラチンコートディッシュとした。
3.　未分化を維持したまま培養されているヒトiPS細胞のコロニーについて，Neutral　protease,　grade　I(Roche　Applied　Science,Cat.:04　942　086　001)2U/mLをディッシュに加え，先に剥がれるフィーダー細胞をディッシュより除去した後，ヒトiPS細胞の未分化コロニーをスクレーパーを用いてディッシュより回収し，Fetal　Bovine　Serum,　embryonic　stem　cell-qualified　(FBS)(Life　Tech,Cat.:16141)を20%，　L-glutamine(Invitrogen，Cat.:25030-081)を1%，Penicillin/Streptomycin(Invitrogen，Cat.:15140-122)を0.5%，2-mercaptoethanol(Invitrogen，Cat.:21985-023)を55μM加えたMEM　Alpha　1x　+　GlutamaxＩ(Life　Tech，Cat.:32561-037)に懸濁し，上清を除去したゼラチンコートディッシュに4mLずつ播き，1時間，37℃，5%CO2条件下で培養を行い，フィーダー細胞をディッシュ底面に接着させヒトiPS細胞のコロニーと分離した。
4.　ヒトiPS細胞の未接着コロニーをゼラチンコートディッシュより全量回収し，Insulin-Transferrin-Selenium-X　100X(ITS)(Life　Tech,Cat.:51500-056)を1/100倍の希釈倍率となるように加えたPrimate　ES　cell　mediumに懸濁し，上清を除去したMGディッシュに3mLずつ播種し，37℃，5%CO2条件下で1日培養を実施した（図２上段左の写真参照）。
5.　ディッシュより培地を全量除去した後，ITSを1/100倍，recombinant　human　bone　morphogenetic　protein　4(rhBMP4)(Humanzyme，Cat.:314-BP)を50ng/mLとなるように加えたPrimate　ES　cell　mediumを7mLずつ添加し，37℃，5%CO2条件下で4日間の培養を実施した（図２上段中央の写真参照）。
6.　ディッシュより培地を全量除去した後，ITSを1/100倍，recombinant　human　Vascular　Endothelial　Growth　Factor　165(rhVEGF165)(R&D　Systems,Cat.:293-VE)を40ng/mL,recombinant　human　Stem　Cell　Factor(rhSCF)(R&D　Systems,Cat.:255-SC)を50ng/mLとなるように加えたPrimate　ES　cell　mediumを4mLずつ添加し，37℃，5%CO2条件下で2日間の培養を実施した（図２上段右の写真参照）。
7.　培地を全量除去した後，ITSを1/100倍，recombinant　human　Granulocyte　Macrophage　colony-stimulating　Factor(rhGM-CSF)(Humanzyme,Cat.:HZ-1082)を100ng/mL,recombinant　human　Macrophage　colony-stimulating　factor(rhM-CSF)(Humanzyme,Cat.:HZ-1039)を50ng/mLとなるように加えたStemPro-34　medium(Life　Tech.,Cat.:10640)を5mLずつ添加し，37℃，5%CO2条件下で培養し3～4日間置きに培養液を交換した（図２下段中央の写真参照）。
8.　7.項の操作を120日間継続した。培養50日頃より非接着性細胞が出現し，7日～14日に1度の頻度でディッシュ中の非接着細胞を回収し，単球様細胞とした。
9.　作製した単球様細胞の一部を回収し，抗HLA-DR抗体(BD　biosciences，Cat.:347364)，抗ヒトHLA-DQ抗体(BD　biosciences，Cat.:555563)，抗ヒトHLA-DP抗体(Santa　Cruz　Biotechnology,　Cat.:sc-53308)，抗ヒトHLA-ABC抗体(BD　biosciences，Cat.:555552),抗ヒトCD14抗体(BD　biosciences，Cat.:558121)，抗ヒトCD80抗体(BD　biosciences，Cat.:561134)，抗ヒトCD86抗体(BD　biosciences，Cat.:561128)，抗ヒトCD206抗体(BD　biosciences，Cat.:551135)，抗ヒトCD209抗体(BD　biosciences，Cat.:551545)，抗ヒトCD11b抗体(BD　biosciences，Cat.:555388)，及び抗ヒトCD11c抗体(BD　biosciences，Cat.:340544)を用いて染色し，フローサイトメーター解析装置BD　FACSCanto(商標)II（BD　Bioscience）を用いて分析した。
　－使用抗原－
　免疫原性を有するタンパク質として，陽性対照として以下のタンパク質を使用した。
(1)白樺花粉アレルゲンであるBetula　verrucosa,　birch　pollen　allergen　1,　Isoform　a(Bet　v1a)(#Bet　v　1.0101;　Biomay)（アミノ酸配列：配列番号１）
(2)Infliximab（商品名：REMICADE(登録商標)(田辺三菱製薬)（アミノ酸配列：Heavy　chain　variable　region：配列番号２；Heavy　chain　constant　region：配列番号３；Light　chain　variable　region：配列番号４；Light　chain　constant　region：配列番号５）
　なお，Infliximabは，臨床において抗薬物抗体(Anti-drug　antibody;　ADA)が確認されており，エピトープ配列が存在すると考えられている（Self/Nonself　2010;1(4)　pp.314-322;Current　Rheumatology　Report　2005;7:3-9;Current　Opinion　in　Monoclonal　Thrapeutics　2003;5(2):172-179）。
(3)Recombinant　Human　Factor　VIII(rhFVIII)（商品名：ADVATE(登録商標)(Baxter)（アミノ酸配列：配列番号１１２）
　なお，rhFVIIIは，臨床において抗薬物抗体(Anti-drug　antibody;　ADA)が確認されており，エピトープ配列が存在すると考えられている（Simon　D.Van　Haren　et　al,　Mol　Cell　Proteomics　2011:10:M110.002246）。また，rhFVIIIは通常のIgG抗体の2倍程度の分子量を有する。
(4)Phleum　pretense,　timothy　grass　pollen　allergen　1　(Phl　p1)(商品名:Phl　p　1.0102　(Biomay)（アミノ酸配列：配列番号１１３）
　なお，Phl　p1はイネ科花粉抗原であり，エピトープ配列が報告されている（Carla　Oseroff　et　al,　J　of　immunol　2010:185(2):943-955）。
　－樹状細胞への成熟及び抗原への曝露－
1.　回収した単球様細胞について，培地を除去し，ITSを1/100倍，rhGM-CSFを200ng/mL，recombinant　human　Interleukin-4(rhIL-4)(Humanzyme，Cat.:HZ-1075)を10ng/mLとなるように加えたStemPro-34　mediumに細胞濃度1×105cells/mLで懸濁し，6ウェルプレートに3mLずつ播種し，37℃，5%CO2条件下で5日間の培養を実施した。
2.　各ウェルにBet　v1a　3.3μg/mL又はInfiximab　10μg/mLを加え,続いてrecombinant　human　Tumor　Necrosis　Factor-α(rhTNF-α)(Humanzyme，Cat.:HZ-1014)10ng/mLを加え，37℃，5%CO2条件下で1日培養し，樹状細胞様細胞とした。rhFVIII，Phl　p1の添加においては，各ウェルより培養上清を2mL除去した後，rhFVIII　30μg/mL又は,Phl　p1　10μg/mLを加え，続いてrhTNF-α　10ng/mLを加え，37℃，5%CO2条件下で1日培養し，樹状細胞様細胞とした。
3.　樹状細胞様細胞を6ウェルプレートより全量回収し，1200rpm，5分，4℃でスピンダウンした後，上清を全て除去し，4℃のDPBS　1mLに懸濁した。次いで，全量をエッペンドルフチューブに移し，2500rpm，5分，4℃でスピンダウンし，上清を全て除去し，細胞のペレットを作製し，-80℃で保管した。
4.　作製した樹状細胞様細胞の一部を回収し，抗ヒトHLA-DR抗体，抗ヒトHLA-DQ抗体，抗ヒトHLA-DP抗体，抗ヒトHLA-ABC抗体，抗ヒトCD14抗体，抗ヒトCD80抗体，抗ヒトCD86抗体，抗ヒトCD206抗体，抗ヒトCD209抗体，抗ヒトCD11b抗体，及び抗ヒトCD11c抗体を用いて染色し，フローサイトメーター解析装置BD　FACSCanto(商標)IIを用いて分析した。
　－抗HLA-DRビーズの生成－
1.　抗HLA-DR抗体G46-6(BD　Biosciences,Cat.:555809)を,CNBr-activated　Sepharose　beads(GE　Healthcare，Cat.:17-0430-01)に終濃度1mg/mLで固層化し，抗HLA-DR抗体固層化ビーズとした。
2.　抗HLA-DR抗体固層化ビーズについては0.02%アジ化ナトリウム(Wako，Cat.:190-14901)を含むPBS(Wako，Cat.:041-20211)中で保管した。
　－HLA-DR-ペプチド複合体のナノスケール精製－
1.　Tris(SIGMA，Cat.:T1503-1KG)20mM,　MgCl2(MERCK，Cat.:1.05833.0250)5mMを加え，HCl(MERCK，Cat.:1.00316.1000)を用いてpH7.8に調製した超純水(Wako，Cat.:210-01303)溶液に，10%　TritonX-100(Roche　Diag,Cat.:11332481001)を1/10倍,　protease　inhibitor　mix(11.6mg/mL　PMSF(nakalai,Cat.:27327-94),　1.7mg/mL　pepstatin　A(SIGMA,Cat.:P4265-25MG),　1.7mg/mL　chymostatin(Roche　Diag,Cat.:11004638001),　0.8mg/mL　leupeptin(SIGMA,Cat.:L9783-25MG),及び133mg/mLアジ化ナトリウム(Wako,Cat.:190-14901)のmixture)を17/5000倍となるよう加え，Lysis　Bufferを調製した。
2.　樹状細胞様細胞の凍結ペレットにLysis　Bufferを氷冷条件下で10倍量加え，Thermomixer　Confort(Eppendorf)にて1100rpm，1時間，4℃で振とうし，ライセートを取得した。
3.　14000rpm，10分，4℃でスピンダウンし，ライセートを細胞片や細胞核と分離した。
4.　抗HLA-DR抗体固層化ビーズをライセート100μLに対して5-10μL加え，水平振とう機（horizontal　shaker）で1100rpm，4℃，一晩振とうし，ライセート中のHLA-DR-ペプチド複合体を抗HLA-DR抗体固層化ビーズに結合させた。
5.　抗HLA-DR抗体固層化ビーズに結合したHLA-DR-ペプチド複合体を3000rpm，1分，4℃でスピンダウンした後，Lysis　buffer　500μLで1回,さらに0.1%　Zwittergent　3-12(Calbiochem,Cat.:693015)を含むPBS　500μLで2回洗浄した。
　－HLA-DR-関連ペプチドの溶出－
1.　HLA-DR抗体固層化ビーズに結合したHLA-DR-ペプチド複合体を400μLの超純水に懸濁し，Ultrafree-MC　filter(Durapore　PVDF,　0.22um)(Millipore)に移し，14000rpm，10秒，4℃でスピンダウンした。
2.　チューブ底に落とした超純水を除去し，400μLの超純水をフィルタ上に加え14000rpm，10-30秒，4℃でスピンダウンする洗浄操作を10回繰り返し実施した。
3.　0.1%　trifluoracetic　acid(Thermo　Fisher　Scientific，Cat.:28904)を含む超純水60uLを加え，37℃，30分インキュベートし，HLA-DR-ペプチド複合体よりペプチド混合物を溶出させた後，14000rpm，3分，18℃でスピンダウンし,vacuum　centrifuge　5305C(Eppendorf)により溶出したペプチド混合物を乾燥した。
　－イオントラップMS/MS質量分析によるペプチドの配列解析－
1.　乾燥したペプチド混合物を2%　acetonitrile(Wako,Cat.:018-19853),0.5%　acetic　acid(MERCK,Cat.:1.00066.0250),1%　formic　acid(MERCK，Cat.:1.11670.1000)を含む超純水15μLに再溶解し，そのうち5μLをMSに接続したnano-LC　Ultimate　3000　RSLCnano　system(Dionex)に注入した。LC分析条件としては，EP1715343A1に記載の条件，又はこれに類似する当業者に公知の条件で，逆相材料及びイオン交換材料を組み合わせたカラム，あるいは逆相材料単独のカラムを用い，適切な緩衝液を用いて行うことができる。HPLCカラムをナノ-LC　エレクトロスプレーイオン化源を設置したOrbitrap　Elite(Thermo)に連結し，製造元のプロトコルに従い，full　scan精密質量分析及びMS-MSによる質量分析を実施した。
2.　ペプチドの配列解析をSEQUESTアルゴリズムにより実施した。
　Ｂ．結果
　－分化した細胞の特性－
　図３Ａ、図３Ｂに、フローサイトメーター解析により得られた、Ticを用いて作成した単球様細胞の細胞表面に発現する分子を調べた結果を示す。本実施例により得られた単球様細胞は単球の特異的マーカーであるCD14の発現が認められた他、T細胞の活性化分子であるCD80，CD86，接着分子であるCD11b，CD11cの発現が認められた。
　図４Ａ、図４Ｂに、フローサイトメーター解析により得られた、201B7を用いて作成した単球様細胞の細胞表面に発現する分子を調べた結果を示す。本実施例により得られた単球様細胞はTicを用いて作成した単球様細胞と同様に、単球の特異的マーカーであるCD14の発現が認められた他、T細胞の活性化分子であるCD80，CD86，接着分子であるCD11b，CD11cの発現が認められた。
　図５Ａ、図５Ｂに、フローサイトメーター解析により得られた、Ticを用いて作成した樹状細胞様細胞の細胞表面に発現する分子を調べた結果を示す。本実施例により得られた樹状細胞様細胞では抗原提示分子であるHLA-DR，HLA-DQ，HLA-DP及びHLA-ABC,樹状細胞の特異的マーカーであるCD206，CD209の発現が認められた他、単球様細胞と同様にT細胞の活性化分子であるCD80，CD86，接着分子であるCD11b，CD11cの発現が認められた。CD11cは単球様細胞時と比較して発現の増加が認められた。一方で単球の特異的マーカーであるCD14の発現が減少した。それぞれのマーカーのピークが単一であることから、樹状細胞の特徴を有する細胞が均一に作製されたと考えられた。
　図６Ａ、図６Ｂに、フローサイトメーター解析により得られた、201B7を用いて作成した樹状細胞様細胞の細胞表面に発現する分子を調べた結果を示す。201B7より作製した樹状細胞様細胞においても、Ticより作製した樹状細胞様細胞と同様、抗原提示分子であるHLA-DR，HLA-DQ，HLA-DP及びHLA-ABC,樹状細胞の特異的マーカーであるCD206，CD209の発現が認められた。単球様細胞と同様にT細胞の活性化分子であるCD80，CD86，接着分子であるCD11b，CD11cの発現も認められた。
　－Bet　v1aを用いた結果－
　図７に、Ticより作製した樹状細胞様細胞をBet　v1aに暴露した場合に検出されたペプチドのアミノ酸配列の解析結果を示す（ａ）。本実施例でBet　v1aに暴露させた樹状細胞様細胞より抽出したHLA-DR分子より分離されるペプチドからは、Bet　v1aのアミノ酸配列の一部が検出された。
　また、図７に、Bet　v1a無処置時の条件(対照)において検出された、Bet　v1aに暴露した場合にも検出されたペプチドのアミノ酸配列の解析結果を示す（ｂ）。
　また、これらの、検出された具体的なアミノ酸配列を表１Ａ，表１Ｂにも示す。表中、エピトープ番号は、Bet　v1aのアミノ酸配列において、N末端から順に見られた、検出されたペプチドの群を示す。例えばエピトープ番号1では18種類のペプチドが検出された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　（表１Ａに記載のペプチドを配列番号６～３６に記載した。）
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　（表１Ｂに記載のペプチドを配列番号３７～６０に記載した。）
　2回の測定（duplicate）でほぼ同様の結果が得られ、再現性が得られた（2回目のデータ示さず）。また、異なったタイミング（非接着性細胞を回収してGM-CSF及びIL-4を添加するタイミングを変えた場合）で樹状細胞様細胞への分化を行い、HLA-DR等の発現の上昇を促した場合でも、同様のペプチド配列が検出された（データ示さず）。
　図８に、201B7より作製した樹状細胞様細胞をBet　v1aに暴露した場合に検出されたペプチドのアミノ酸配列の解析結果を示す（ａ）。本実施例でBet　v1aに暴露させた樹状細胞様細胞より抽出したHLA-DR分子より分離されるペプチドからは、Bet　v1aのアミノ酸配列の一部が検出された。
　また、図８に、Bet　v1a無処置時の条件(対照)において検出された、Bet　v1aに暴露した場合にも検出されたペプチドのアミノ酸配列の解析結果を示す（ｂ）。
　また、これらの、検出された具体的なアミノ酸配列を表１Ｃ，表１Ｄにも示す。表中、エピトープ番号は、Bet　v1aのアミノ酸配列において、N末端から順に見られた、検出されたペプチドの群を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　（表１Ｃに記載のペプチドを配列番号114～131に記載した。）
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　（表１Ｄに記載のペプチドを配列番号132に記載した。）
　2回の測定（duplicate）でほぼ同様の結果が得られ、再現性が得られた（2回目のデータ示さず）。
　－Infliximabを用いた結果－
　図９Ａに、Ticより作製した樹状細胞様細胞をInfliximabに暴露した場合に検出されたペプチドのアミノ酸配列の解析結果を示す（ａ）。本実施例でInfliximabに暴露させた樹状細胞様細胞より抽出したHLA-DR分子より分離されるペプチドからは、InfliximabのH鎖及びL鎖に認められるアミノ酸配列の一部が検出された。
　（図９Ａに記載のペプチドを配列番号133～151に記載した。）
　また、図９Ｂに、Infliximab無処置時の条件(対照)において検出された、Infliximabに暴露した場合にも検出されたペプチドのアミノ酸配列の解析結果を示す（ｂ）。InfliximabのH鎖に認められるアミノ酸配列の一部のみが検出された。
　（図９Ｂに記載のペプチドを配列番号152～153に記載した。）
　2回の測定（duplicate）でほぼ同様の結果が得られ、再現性が得られた（2回目のデータ示さず）。また、異なったタイミング（非接着性細胞を回収してGM-CSF及びIL-4を添加するタイミングを変えた場合）で樹状細胞様細胞への分化を行い、HLA-DR等の発現の上昇を促した場合でも、同様のペプチド配列が検出された（データ示さず）。
　－rhFVIIIを用いた結果－
　図１０Ａ～図１０Ｈに、Ticより作製した樹状細胞様細胞をrhFVIIIに暴露した場合に検出されたペプチドのアミノ酸配列の解析結果を示す。本実施例でrhFVIIIに暴露させた樹状細胞様細胞より抽出したHLA-DR分子より分離されるペプチドからはrhFVIIIのアミノ酸配列の一部が検出された。
　（図１０Ａ～図１０Ｈに記載のペプチドを配列番号154～250に記載した。）
　2回の測定（duplicate）でほぼ同様の結果が得られ、再現性が得られた（2回目のデータ示さず）。
　－Phl　p1を用いた結果－
　図１１に、Ticより作製した樹状細胞様細胞をPhl　p1に暴露した場合に検出されたペプチドのアミノ酸配列の解析結果を示す。本実施例でPhl　p1のアミノ酸配列の一部が検出された。
　（図１１に記載のペプチドを配列番号251～253に記載した。）
　2回の測定（duplicate）でほぼ同様の結果が得られ、再現性が得られた（2回目のデータ示さず）。また、異なったタイミングでヒトiPS細胞から単球様細胞の分化を開始し、非接着性細胞を回収し、樹状細胞様細胞への分化を行い、HLA-DR等の発現の上昇を促した場合でも、同様のペプチド配列が検出された（データ示さず）。
　なお、上述の方法では、抗原に暴露させた樹状細胞様細胞のHLA-DR分子上に提示されたペプチドを、抗HLA-DRビーズを利用して、HLA-DR-ペプチド複合体として分離・精製し、イオントラップMS/MS質量分析によって、提示された各ペプチドの配列を同定した。ここで、例えば図３Ｂ、図４Ｂ、図５Ｂで明らかなとおり、単球様細胞や樹状細胞様細胞などの抗原提示細胞では、HLA-DQ分子、HLA-DP分子、HLA-A分子、HLA-B分子、HLA-C分子が発現していることが確認された。したがって、当業者であれば、HLA-DR分子の代わりに、他のMHCII分子（例えばHLA-DQ分子もしくはHLA-DP分子）、又は、MHCI分子を利用しても、同様に抗原提示されるペプチドを検出し、同定可能であることが理解できる。　
　例えば、Karbach　J,　Pauligk　C,　Bender　A,　Gnjatic　S,　Franzmann　K,　Wahle　C,　Jager　D,　Knuth　A,　Old　LJ,　Jager　E.,　Identification　of　new　NY-ESO-1　epitopes　recognized　by　CD4+　T　cells　and　presented　by　HLA-DQ　B1　03011,　Int　J　Cancer.　2006　Feb　1;118(3):668-74.では、癌抗原の一つであるNY-ESO-1を提示させた樹状細胞を用いて、抗原特異的T細胞を作製し、同様の抗原を提示させたHLA-DQ分子発現EBV-B細胞株との再刺激により、HLA-DQ分子に提示されるNY-ESO-1中のペプチド配列を検出できたことを示しており、抗原提示されたT細胞エピトープをHLA-DQ分子を用いて同定できることが示されている。また、例えば、Duquesnoy　RJ,　Marrari　M,　Tambur　AR,　Mulder　A,　Sousa　LC,　da　Silva　AS,　do　Monte　SJ,　First　report　on　the　antibody　verification　of　HLA-DR,　HLA-DQ　and　HLA-DP　epitopes　recorded　in　the　HLA　Epitope　Registry,　Hum　Immunol.　2014　Nov;75(11):1097-103.では、データベースからHLA-DR分子、HLA-DQ分子、HLA-DP分子に提示されやすい配列が予測されており、HLA-DQ分子やHLA-DP分子が、HLA-DR分子と同様に、特定の配列を抗原提示することが示されている。これらの技術常識に基づいて、MAPPsを、本発明における幹細胞又はこれに由来する前駆細胞から分化された、HLA-DQ分子やHLA-DP分子などの他のMHCII分子を発現する細胞にも同様に適用できることが、当業者には理解されよう。　　
　また、MHCI分子を用いたMAPPsも、例えば、Wahl　A,　Schafer　F,　Bardet　W,　Buchli　R,　Air　GM,　Hildebrand　WH.,　HLA　class　I　molecules　consistently　present　internal　influenza　epitopes.　Proc　Natl　Acad　Sci　U　S　A.　2009　Jan　13;106(2):540-5.において既に報告されている。当該文献では、特定のアロタイプのHLA-B分子を発現させた細胞株をインフルエンザウイルスに感作させ、MAPPsによりHLA-B分子上に提示されるインフルエンザウイルス由来ペプチド配列の検出を実施している。なお、上述の通り、MHCI分子は多くの細胞種で発現していることが知られているところ、MHCI分子-ペプチド複合体の検出の容易さの観点から、MHCI分子が高発現している細胞を利用することが望ましい。一実施態様において、MHCI分子を用いたMAPPsには、本発明における幹細胞又はこれに由来する前駆細胞から分化された、樹状細胞を用いてよい。
　［比較例］
　Ａ．方法
　－使用細胞－
ヒト末梢血単核球細胞（PBMC）:(Lonza　co.,ltd.より購入)。
　－ヒト末梢血単核球細胞からの単球細胞の分離－
1.　ヒト末梢血単核球細胞に対し，Human　Serum　Alubmin　low　IgG(SIGMA，Cat.:A3782)を0.5%、EDTA　0.5M　stock　solution　pH8.0(Invitrogen,Cat.:15575)を2mMとなるよう加えたDPBS(Invitrogen，Cat:14190)を80μL/107cells,　CD14　micro　beads(Miltenyi，Cat.:130-050-201)を20μL/107cellsとなるよう加え，ボルテックスミキサーにより懸濁し，4℃，遮光下の条件で15分静置した。
2.　15分静置後のヒト末梢血単核球細胞にHuman　Serum　Alubmin　low　IgGを0.5%、EDTA　0.5M　stock　solution　pH8.0を2mM含むDPBSを20mL加え，1200rpm，5分，4℃でスピンダウンした後，上清を全て除去した。本操作は2回行った。
3.　上清を除去したヒト末梢血単核球細胞にHuman　Serum　Alubmin　low　IgGを0.5%、EDTA　0.5M　stock　solution　pH8.0を2mM含むDPBSを1.2×108cells/mLとなるよう加え，細胞分離用磁石LS　Column(Miltenyi，Cat.:130-042-401)に通し，回収したヒト末梢血単核球細胞を単球細胞とした。
　－使用抗原－
　本発明の実施例と同様に，白樺花粉アレルゲンであるBetula　verrucosa,　birch　pollen　allergen　1,　Isoform　a(Bet　v1a)(#Bet　v　1.0101;　Biomay)（アミノ酸配列：配列番号１）を用いた。
　－樹状細胞への分化及び抗原への曝露－
1.　回収した単球細胞にHuman　Serum　Alubmin　low　IgGを0.5%、EDTA　0.5M　stock　solution　pH8.0を2mM含むDPBSを20mL加え，1200rpm，5分，4℃でスピンダウンした後，上清を全て除去した。
2.　上清を除去した単球細胞を，Fetal　Bovine　Serum　(FBS)　(Gibco，Cat.:10270，26140)を10%、Non　Essential　amino　acids(Gibco,Cat.:11140-035)を1%,Na-Pyruvate(Gibco,Cat.:11360-039)を1%,Kanamycine(Gibco,Cat.:15160-047)を1%,recombinant　human　Granulocyte　Macrophage　colony-stimulating　Factor(rhGM-CSF)(R&Dsystems,Cat.:215-GM)を50ng/mL,recombinant　human　Interleukin-4(rhIL-4)(R&Dsystems,Cat.:204-IL)を3ng/mLとなるよう加えたRPMI　1640(Life　Tech，Cat.:11875)を用いて，3×105cells/mLの細胞密度に懸濁し，6ウェルプレートに3mLずつ播種し，37℃，5%CO2条件下で5日間の培養を実施し，培養5日後の単球細胞を樹状細胞とした。
3.　培養5日後の各ウェルより上清を2mL/ウェル除去し，Bet　v1a　3.3μg/mLを加え，続いてLipopolysaccharides　from　Salmonella　enterica　serotype　abortusequi(LPS)(SIGMA，Cat.:L5886)を1μg/mL加え，37℃，5%CO2条件下で1日培養した。
4.　1日培養後の樹状細胞を6ウェルプレートより全量回収し，1200rpm，5分，4℃でスピンダウンした後，上清を全て除去し，4℃のDPBS　1mLに懸濁した。次いで，全量をエッペンドルフチューブに移し，2500rpm，5分，4℃でスピンダウンし，上清を全て除去し，細胞のペレットを作製し，-80℃で保管した。
5.　樹状細胞の一部を回収し，抗ヒトHLA-DR抗体，抗ヒトHLA-DQ抗体，抗ヒトHLA-DP抗体，抗ヒトHLA-ABC抗体,抗ヒトCD14抗体，抗ヒトCD80抗体，抗ヒトCD86抗体，抗ヒトCD206抗体，抗ヒトCD209抗体，抗ヒトCD11b抗体，及び抗ヒトCD11c抗体を用いて染色し，フローサイトメーター解析装置BD　FACSCantoTMIIを用いて分析した。
　－抗HLA-DRビーズの生成－
　本発明の実施例と同様に調整した。
　－HLA-DR-ペプチド複合体のナノスケール精製－
　本発明の実施例と同様に調整した。
　－HLA-DR-関連ペプチドの溶出－
　本発明の実施例と同様に調整した。
　－イオントラップMS/MS質量分析によるペプチドの配列解析－
　本発明の実施例と同様に調整した。
　Ｂ．結果
　－分化した細胞の特性－
　図１２に、フローサイトメーター解析により得られた単球細胞の細胞表面に発現する分子を調べた結果を示す。比較例により得られた単球細胞は単球の特異的マーカーであるCD14の発現及び抗原提示分子であるHLA-DRの発現が認められた他、T細胞の活性化分子であるCD86の発現が認められた。
　また、図１３Ａ、図１３Ｂに、フローサイトメーター解析により得られた樹状細胞の細胞表面に発現する分子を調べた結果を示す。比較例により得られた樹状細胞では抗原提示分子であるHLA-DR，HLA-DQ及びHLA-ABC,樹状細胞の特異的マーカーであるCD206，CD209の発現が認められた他，T細胞の活性化分子であるCD80，CD86，接着分子であるCD11b，CD11cの発現が認められた。一方でCD14の発現は認めらなかった。
　－Bet　v1aを用いた結果－
　図１４～図２０に，評価に供した各ヒトドナー毎のBet　v1a添加条件（図１４，図１５，図１６，図１７，図１８，図１９，図２０の（ａ））及び非添加条件（対照）（図１４，図１５，図１６，図１７，図１８，図１９，図２０の（ｂ））で検出されたペプチドのアミノ酸配列の解析結果を示す。また、これらの検出された具体的なアミノ酸配列を、それぞれ、表２～表８にも示す（図１４～図２０にそれぞれ対応する。）。表中、エピトープ番号は、Bet　v1aのアミノ酸配列において、N末端から順に見られた、検出されたペプチドの群を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　（表２に記載のペプチドを配列番号61～63に記載した）
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　（表３に記載のペプチドを配列番号64～70に記載した）
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　（表４に記載のペプチドを配列番号71～73に記載した）
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
　（表５に記載のペプチドを配列番号74～79に記載した）
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
　（表６に記載のペプチドを配列番号80～92に記載した）
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
　（表７に記載のペプチドを配列番号93～95に記載した）
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
　（表８に記載のペプチドを配列番号96～111に記載した）
　Bet　v1a非添加条件で検出されたペプチド（対照）からは、Bet　v1a添加条件で検出されたペプチドの一部が検出された。しかしながら，Bet　v1a添加条件では，Bet　v1a非添加条件よりも多くのペプチドが検出された。
　－ヒトiPS細胞由来の樹状細胞様細胞を用いたMAPPsとPBMC由来樹状細胞を用いたMAPPsとの比較－
　図２１Ａ、図２１Ｂに、Bet　v1a添加条件において検出されたペプチドのアミノ酸配列について、2種類のヒトiPS細胞由来の樹状細胞様細胞を用いた場合とPBMC由来の樹状細胞を用いた場合との比較を示す。PBMC由来の樹状細胞を用いた解析では、ドナー間で異なるMHCII分子を有していたために、検出されるペプチドのアミノ酸配列にドナー間で違いが見られたと考えられる。また、2種類のiPS細胞由来の樹状細胞様細胞間で検出されたアミノ酸配列の違いについても、元となったドナー間で異なるタイプのMHCII分子を有していたためLine間で検出配列に違いが生じたと考えられる。それにも関わらず、ヒトiPS細胞由来の樹状細胞様細胞を用いてBet　v1a添加条件において検出されたペプチドで共通した配列の多くは、PBMC由来の樹状細胞を用いた場合に検出されたペプチドの配列と一致していた。検出されたペプチド配列140-155に関しては、S.　Mutschlener　et　al.,　Journal　of　Allergy　and　Clinical　Immunology　Vol.125　(3),　2010でエピトープ配列部分として報告された配列と一致した。
　さらに、ヒトiPS細胞由来の樹状細胞様細胞を用いた場合では、PBMC由来樹状細胞を用いた場合よりも多くのペプチドが検出され、より多くの抗原が提示された。したがって、幹細胞又はこれに由来する前駆細胞から分化させた樹状細胞を用いた場合には、PBMCに由来する樹状細胞を用いた場合よりも高感度であることが示唆された。これは、本発明の予測できない顕著な効果を示すものである。
　以上の結果より、幹細胞又はこれに由来する前駆細胞を用いたMAPPsは、PBMCを用いたMAPPs以上の感度が示唆され、タンパク質の免疫原性の低減に有用な手段と考えられた。
　本発明は、例えば、タンパク質のエピトープ配列解析を応用することで、様々なバイオ医薬品の診断や医療の分野に用いることができる。本検討では、花粉由来の外来性タンパク質であるBet　v1a、Phl　p1、抗体医薬品であるInfliximab及び内因性タンパク質と同様のアミノ酸配列を持つ医薬品であるrhFVIIIにおいて、いずれもMHC　classII分子に提示される配列が検出された。本発明のMAPPsでは天然・非天然あるいは外因性・内因性等の特徴を問わず、バイオ医薬品をはじめとした様々なタンパク質について、エピトープ配列を検出することが可能であり、医薬品の開発の他、アレルゲンや自己免疫疾患におけるエピトープの解析など、広範な用途に応用できる可能性が考えられた。
配列番号133～配列番号150：InfliximabのH鎖の部分ペプチド
配列番号151：InfliximabのL鎖の部分ペプチド
配列番号152～配列番号153：　InfliximabのH鎖の部分ペプチド

Claims (28)

  1. 　タンパク質のエピトープを同定するための方法であって、
    　以下の工程：
    （Ａ）幹細胞又はこれに由来する前駆細胞から分化された、主要組織適合遺伝子複合体（MHC分子)を発現する細胞に、標的タンパク質を接触させる工程；
    （Ｂ）前記MHC分子を発現する細胞から、前記標的タンパク質に含まれるペプチドとMHC分子との複合体を単離する工程；及び
    （Ｃ）前記複合体から、前記ペプチドを溶出し、同定する工程
    を含む、方法。
  2. 　さらに、以下の工程：
    （Ｄ）同定したペプチドが免疫原性を誘導するエピトープであるか否かを検証する工程
    を含む、請求項１に記載の方法。
  3. 　前記幹細胞は、人工多能性幹細胞（iPS細胞）、胚性幹細胞（ES細胞）、核移植ES細胞（ntES細胞）、胚性生殖幹細胞（EG細胞）及び成体幹細胞からなる群から選択される、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 　前記MHC分子は、MHCII分子である、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 　前記MHCII分子はHLA-DR、HLA-DQ又はHLA-DPである、請求項４に記載の方法。
  6. 　前記MHC分子を発現する細胞は、さらに、CD80、CD86、CD206及びCD209の少なくとも１つを発現している、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
  7. 　前記MHC分子を発現する細胞は、CD80、CD86、CD206及びCD209の全てを発現している、請求項６に記載の方法。
  8. 　前記MHC分子を発現する細胞は、樹状細胞である、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
  9. 　前記MHC分子を発現する細胞は、前記標的タンパク質を投与することが意図される対象のMHC分子の１又は複数のアロタイプを発現する、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
  10. 　前記工程（Ａ）を無血清下で行う、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
  11. 　前記樹状細胞は、
    　以下の工程：
    （ａ）幹細胞又はこれに由来する前駆細胞を分化させて中胚葉前駆細胞を得る工程；
    （ｂ）前記中胚葉前駆細胞を分化させて単球細胞を得る工程；及び
    （ｃ）前記単球細胞を分化させて未成熟樹状細胞を得、及び場合により、前記未成熟樹状細胞をさらに刺激して成熟樹状細胞を得る工程
    を含む方法によって製造され、
    　さらに、前記工程（ａ）～（ｃ）のうち、少なくとも前記工程（ｃ）において無血清培地が用いられる、
    請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
  12. 　前記工程（ｂ）が、顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）及びマクロファージコロニー刺激因子（M-CSF）を含む無血清培地下で、前記中胚葉前駆細胞を分化させて単球細胞を得る工程を含む、請求項１１に記載の方法。
  13. 　前記工程（ｃ）が、
    （ｃ１）顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）及びインターロイキン4（IL-4）を含む無血清培地下で、前記単球細胞を分化させて未成熟樹状細胞を得る工程を含み、及び場合により、
    （ｃ２）前記未成熟樹状細胞を免疫原、及び、場合により炎症性サイトカインに接触させることで、成熟樹状細胞へと誘導する工程を含む、
    請求項１１又は１２に記載の方法。
  14. 　前記樹状細胞が未成熟樹状細胞であり、前記未成熟樹状細胞は、免疫原性を有する標的タンパク質に接触することで、成熟樹状細胞に誘導される、請求項８～１３のいずれか一項に記載の方法。
  15. 　前記標的タンパク質が、サイトカイン、ケモカイン、成長因子、抗体、酵素、構造タンパク質、ホルモン、及び、これらのいずれかの断片からなる群の1種又は1種以上から選択される、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。
  16. 　免疫原性が減少又は消失したタンパク質の製造方法であって、
    　以下の工程：
    （１）請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法に従って、タンパク質のエピトープを同定する工程；
    （２）MHC分子への結合が減少又は消失するように、前記エピトープを修飾する工程；及び
    （３）修飾されたエピトープを有するタンパク質を製造する工程
    を含む、方法。
  17. 　請求項１６に記載の方法に従って得られうる、タンパク質。
  18. 　タンパク質が対象において免疫原性を有するか否かを予測する方法であって、
    （Ｉ）標的タンパク質を投与することが意図される対象のMHC分子の１又は複数のアロタイプを発現する細胞を提供する工程であって、前記細胞は幹細胞又はこれに由来する前駆細胞から分化されることを特徴とする、工程；
    （ＩＩ）前記「MHC分子の１又は複数のアロタイプを発現する細胞」に、標的タンパク質を接触させる工程；
    （ＩＩＩ）前記「MHC分子の１又は複数のアロタイプを発現する細胞」から、前記標的タンパク質に含まれるペプチドとMHC分子との複合体を単離する工程；
    （ＩＶ）前記複合体から、前記ペプチドを溶出し、同定する工程；及び
    （Ｖ）場合により、同定したペプチドが免疫原性を誘導するエピトープであるか否かを検証する工程
    を含み、
    　前記同定したペプチドが免疫原性を誘導するエピトープである場合に、前記標的タンパク質が前記対象において免疫原性を有することを指し示す、方法。
  19. 　前記対象が有するMHC分子のアロタイプの全てのセットが含まれるように、前記対象のMHC分子の１又は複数のアロタイプを発現する細胞を１又は複数提供する、請求項１８に記載の方法。
  20. 　前記幹細胞が、前記対象に由来する人工多能性幹細胞（iPS細胞）である、請求項１８又は１９に記載の方法。
  21. 　タンパク質を有効成分として含む、対象における、前記タンパク質に関連した疾患の治療及び／又は予防用組成物であって、
    　前記対象は、請求項１８～２０のいずれか一項に記載の方法に従って、前記タンパク質に免疫原性を有さないことが予測された対象から選択されることを特徴とする、組成物。
  22. 　幹細胞もしくはこれに由来する前駆細胞、又は、これから分化されたMHC分子を発現する細胞の、請求項１～１６及び１８～２０のいずれか一項に記載の方法における使用。
  23. 　幹細胞又はこれに由来する前駆細胞から樹状細胞を製造する方法であって、
    　以下の工程：
    （ａ’）幹細胞又はこれに由来する前駆細胞を分化させて中胚葉前駆細胞を得る工程；
    （ｂ’）顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）及びマクロファージコロニー刺激因子（M-CSF）を含む無血清培地下で、前記中胚葉前駆細胞を分化させて単球細胞を得る工程；及び
    （ｃ’）無血清培地下で、前記単球細胞を分化させて未成熟樹状細胞を得、及び場合により、前記未成熟樹状細胞をさらに刺激して成熟樹状細胞を得る工程
    を含む、方法。
  24. 　前記工程（ｃ’）が、
    （ｃ１’）顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）及びインターロイキン4（IL-4）を含む無血清培地下で、前記単球細胞を分化させて未成熟樹状細胞を得る工程を含み、及び場合により、
    （ｃ２’）前記未成熟樹状細胞を、免疫原、及び、場合により炎症性サイトカインに接触させることで、成熟樹状細胞へと誘導する工程を含む、
    請求項２３に記載の方法。
  25. 　請求項２３又は２４に記載の方法によって得られうる、樹状細胞。
  26. 　MHCII分子に加えて、さらに、CD80、CD86、CD206及びCD209の少なくとも１つを発現している、請求項２５に記載の樹状細胞。
  27. 　CD80、CD86、CD206及びCD209の全てを発現している、請求項２６に記載の樹状細胞。
  28. 　請求項２５～２７のいずれか一項に記載の樹状細胞を含む、細胞組成物。
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