WO2016048105A1 - 간세포 성장인자 및 기질세포 유발인자1알파를 이용한 말초동맥질환의 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

간세포 성장인자 및 기질세포 유발인자1알파를 이용한 말초동맥질환의 예방 또는 치료용 조성물 Download PDF

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이정훈
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    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
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    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis

Definitions

  • the present invention provides a hepatocyte growth factor (HGF) or a variant thereof, and stromal cell derived factor 1 alpha (SDF-1 ⁇ ); Or it relates to a composition for the prevention or treatment of peripheral arterial disease comprising a polynucleotide encoding the proteins as an active ingredient.
  • HGF hepatocyte growth factor
  • SDF-1 ⁇ stromal cell derived factor 1 alpha
  • Cardiovascular disease is a disease caused by narrowing or occlusion of blood vessels due to atherosclerosis, and can be largely divided into coronary artery disease (CAD) and peripheral artery disease (PAD). have. Among these, a representative type of peripheral artery disease is ischemic limb disease.
  • cardiovascular diseases are mainly made up of the use of drugs to expand blood vessels and surgical operations.
  • the rotting pain is so severe that some patients take anti-systemic painkillers and severely cut their legs or even die, requiring fundamental treatment.
  • WO 2000/040737 expression vectors as gene carriers for gene therapy are described in WO 2000/040737.
  • WO 2003/078568 describes the effect of treating ischemic lower limb disease using the HGF gene.
  • HGF Hepatocyte Growth Factor
  • SDF-1 ⁇ Stromal Cell derived Factor 1 alpha
  • an object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of peripheral artery diseases.
  • Another object of the present invention to provide a method of preventing or treating peripheral artery disease (Peripheral Artery Disease).
  • the present invention provides a method for preparing an antibody comprising (a) Hepatocyte Growth Factor (HGF) or a variant thereof, and Stromal Cell derived Factor 1 ⁇ (SDF-1 ⁇ ); Or (b) provides a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of peripheral arterial disease comprising a polynucleotide encoding HGF and a polynucleotide encoding SDF-1 ⁇ as an active ingredient.
  • HGF Hepatocyte Growth Factor
  • SDF-1 ⁇ Stromal Cell derived Factor 1 ⁇
  • HGF Hepatocyte Growth Factor
  • SDF-1 ⁇ Stromal Cell derived Factor 1 alpha
  • the therapeutic strategies of the present invention can be broadly classified into two groups: protein therapy and gene therapy.
  • HGF or a variant thereof, and SDF-1 ⁇ protein are used in combination.
  • SDF-1 ⁇ protein are used in combination.
  • one or more nucleotide sequences encoding HGF and one or more nucleotide sequences encoding SDF-1 ⁇ are administered.
  • One or more nucleotide sequences encoding HGF and one or more nucleotide sequences encoding SDF-1 ⁇ may be provided as one polynucleotide or may be provided as separate polynucleotides.
  • one or more nucleotide sequences encoding HGF of the invention and one or more nucleotide sequences encoding SDF-1 ⁇ are provided as separate polynucleotides.
  • isoform of HGF has an amino acid sequence that is at least 80% identical to a naturally occurring HGF amino acid sequence in an animal, including all allelic variants.
  • HGF polypeptide For example, HGF variants have the meaning encompassing both the normal form or wild type of HGF, and various variants of HGF (eg, splicing variants and deletion variants).
  • prevention refers to any action that inhibits or delays the progression of peripheral arterial disease by administration of a composition of the present invention.
  • treatment refers to (a) inhibition of the development of peripheral arterial disease; (b) alleviation of peripheral arterial disease; Or (c) elimination of peripheral arterial disease.
  • the HGF of the invention comprises recombinant human HGF protein. According to another embodiment of the present invention, the HGF of the present invention comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 sequence.
  • the HGF isoforms of the present invention include full length HGF (flHGF) and deleted variant HGF (dHGF).
  • flHGF refers to amino acid 1-728 sequence of animal HGF, in one embodiment amino acid 1-728 sequence of mammalian HGF, and in another embodiment to amino acid 1-728 sequence of human HGF. .
  • the term “dHGF” refers to a deleted variant of an HGF protein produced by selective splicing of an animal HGF gene, according to one embodiment a mammalian HGF gene.
  • the dHGF of the present invention is a human consisting of 723 amino acids lacking 5 amino acids (F, L, P, S and S) in the first Kringle domain of the alpha chain from the full length HGF sequence. HGF.
  • the full length HGF of the present invention comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2
  • the deleted variant HGF of the present invention comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3.
  • SDF-1 ⁇ of the present invention comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 8 sequence.
  • HGF and SDF-1 ⁇ proteins of the present invention were combined with HUVEC, the degree of vascular endothelial cell migration and angiogenesis was more effectively promoted than when each protein was treated alone.
  • the combination of HGF and SDF-1 ⁇ protein was confirmed to be effectively used for the prevention or treatment of peripheral arterial disease.
  • the variants of HGF of the invention are encoded by separate nucleotide sequences or by a single polynucleotide.
  • the pharmaceutical composition of the present invention comprises two or more polynucleotides when the variant of HGF is encoded by a separate polynucleotide, and the single polynucleotide when the variant of HGF is encoded by a single polynucleotide. At least one polynucleotide.
  • the polynucleotides of the present invention may be operably linked to one or more regulatory sequences (eg, promoters or enhancers) that regulate the expression of HGF isoforms.
  • expression cassettes can be constructed in two ways.
  • an expression cassette is constructed by connecting an expression control sequence to a CDS (coding sequence) for each of the variants.
  • an expression cassette was constructed using an internal ribosomal entry site (IRES) or 2A peptide in the same manner as "expression control sequence-first heterologous CDS-IRES-second heterologous CDS-transcription sequence". do.
  • IRES allows the translation of a gene to begin in the IRES sequence so that two or more genes of interest are expressed in the same construct.
  • an isoform of HGF is encoded by a single polynucleotide
  • the polynucleotide encoding all of these isoforms is operably linked to a single expression control sequence.
  • a variant of HGF may be encoded by a hybrid HGF gene which simultaneously expresses two or more different types of variants, such as flHGF and dHGF.
  • the hybrid HGF gene corresponds to a sequence corresponding to exons 1 to 4 of the human HGF gene, an intron 4 or a fragment sequence thereof, and an exon 5 to 18 of the human HGF gene. Sequence.
  • the hybrid HGF gene including the intron 4 is 7113 bp in length and includes the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 7.
  • the hybrid HGF gene may optionally comprise a fragment of intron 4 between exons 4 and 5 of HGF cDNA.
  • the hybrid HGF gene comprises the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5.
  • HGF isoform of the present invention, a hybrid HGF gene (eg HGF-X7), has been reported in WO 2003/078568, the disclosure of which is incorporated herein by reference in its entirety.
  • the amino acid or nucleotide sequence of the HGF isoforms usable in the present invention is to be interpreted to include amino acid or nucleotide sequences that show substantial identity with the sequence of wild type human HGF isoforms.
  • the substantial identity is minimal when the amino acid or nucleotide sequence of the wild-type human HGF isoform is aligned with the maximal correspondence of any other sequence, and the aligned sequence is analyzed using algorithms commonly used in the art.
  • the polynucleotides encoding SDF-1 ⁇ of the present invention comprises the sixth sequence.
  • the peripheral arterial disease of the present invention is ischemic limb disease (Ischemic Limb Disease).
  • ischemic limb disease Ischemic Limb Disease
  • the composition of the present invention continued in steady state, unlike the leg condition of the pCK-administered group, the pCK-SDF-1a-administered group and the pCK-HGF-administered group worsened in a mouse model inducing lower limb ischemia. It is effective to keep it.
  • the polynucleotide of the present invention is a nucleotide contained in naked DNA or a gene carrier.
  • the compositions of the present invention can be applied in vivo through various delivery methods commonly known in the art of gene therapy, and such gene carriers include, but are not limited to, for example, vectors, plasmids and viral vectors.
  • Plasmids can be used as carriers to carry the polynucleotides of the invention.
  • the polynucleotides included in the vector are preferably present in a suitable expression cassette.
  • the polynucleotide in the expression cassette is preferably operably linked to a promoter.
  • operably linked refers to a functional binding between a nucleic acid expression control sequence (eg, an array of promoters, signal sequences or transcriptional regulator binding sites) and other nucleic acid sequences, whereby the regulation The sequence will control the transcription and / or translation of said other nucleic acid sequence.
  • a nucleic acid expression control sequence eg, an array of promoters, signal sequences or transcriptional regulator binding sites
  • a promoter bound to a polynucleotide sequence can operate in an animal cell according to one embodiment, a mammalian cell according to another embodiment, and a human cell according to a specific embodiment, thereby controlling transcription of the nucleotide sequence
  • Promoters derived from mammalian viruses and promoters derived from genomes of mammalian cells such as, for example, cytomegalo virus (CMV) promoter, adenovirus late promoter, vaccinia virus 7.5K promoter, SV40 promoter, tk promoter of HSV, RSV promoter, EF1 alpha promoter, metallothionine promoter, beta-actin promoter, promoter of human IL-2 gene, promoter of human IFN gene, promoter of human IL-4 gene, promoter of human lymphotoxin gene and human GM- Include, but are not limited to, promoters of the CSF gene is.
  • CMV cytomegalo virus
  • adenovirus late promoter vac
  • the promoter used in the present invention is a promoter or EF1 alpha promoter derived from an IE (immediately early) gene of human CMV (hCMV), according to another embodiment a promoter / enhancer of CMV IE gene And 5′-UTR (untranslated region) comprising the entire exon 1 sequence up to just before the ATG start codon of exon 2.
  • IE immediate early gene of human CMV
  • 5′-UTR untranslated region
  • Expression cassettes used in the present invention may comprise a polyaninated sequence, for example, from the ectopic growth hormone terminator (Gimmi, ER, et al., Nucleic Acids Res. 17: 6983-6998 (1989)), SV40 Poly adenylation sequence (Schek, N, et al., Mol. Cell Biol. 12: 5386-5393 (1992)), HIV-1 polyA (Klasens, BIF, et al., Nucleic Acids Res. 26: 1870-1876 (1998)), ⁇ -globin polyA (Gil, A., et al, Cell 49: 399-406 (1987)), HSV TK polyA (Cole, CN and TP Stacy, Mol. Cell. Biol. 5: 2104- 2113 (1985)) or polyomavirus polyA (Batt, D. B and GG Carmichael, Mol. Cell. Biol. 15: 4783-4790 (1995)).
  • the gene carrier of the present invention may use a pCK, pCP, pVAX1 or pCY vector, and in accordance with certain embodiments of the present invention, a pCK vector may be used.
  • the pCK vector is disclosed in detail in WO 2000/040737, the disclosure of which is incorporated herein by reference in its entirety.
  • Retroviruses are widely used as gene transfer vectors because they insert their genes into the host genome, carry large amounts of foreign genetic material, and have a broad spectrum of cells that can infect them.
  • the polynucleotide sequence of the present invention is inserted into the retroviral genome instead of the sequence of the retrovirus to produce a nonreplicating virus.
  • a packaging cell line comprising the gag, pol and env genes but no LTR (long terminal repeat) and ⁇ sequences is constructed (Mann et al., Cell, 33: 153-159 (1983)).
  • a recombinant plasmid comprising the polynucleotide sequence, LTR and ⁇ sequence of the present invention
  • the ⁇ sequence enables the production of RNA transcripts of the recombinant plasmid, which transcript is packaged into a virus, and the virus is Discharged into the medium (Nicolas and Rubinstein "Retroviral vectors," In: Vectors: A survey of molecular cloning vectors and their uses, Rodriguez and Denhardt (eds.), Stoneham: Butterworth, 494-513 (1988)).
  • the medium containing the recombinant retrovirus is collected, concentrated and used as a gene delivery system.
  • Adenoviruses are widely used as gene transfer vectors because of their medium genome size, ease of manipulation, high titers, wide range of target cells and excellent infectivity. Both ends of the genome contain 100-200 bp inverted terminal repeats (ITRs), which are cis-elements essential for DNA replication and packaging.
  • ITRs inverted terminal repeats
  • the genome El region (E1A and E1B) encodes proteins that regulate transcription and transcription of host cell genes.
  • the E2 regions (E2A and E2B) encode proteins that are involved in viral DNA replication.
  • the polynucleotide sequence of the present invention is preferably inserted into the deleted E1 region (E1A region and / or E1B region) or E3 region.
  • the nucleotide sequence can be inserted into the deleted E4 region.
  • the term "deletion" as used in connection with a viral genome sequence has the meaning including not only that sequence in its entirety, but also partially deleted.
  • adenovirus can pack up to about 105% of the wild-type genome, about 2 kb can be additionally packaged (Ghosh-Choudhury et al., EMBO J., 6: 1733-1739 (1987)).
  • the above-described foreign sequence inserted into the adenovirus may additionally bind to the genome of the adenovirus.
  • Adenoviruses have 42 different serotypes and subgroups of A-F. Of these, adenovirus type 5 belonging to subgroup C is the most preferred starting material for obtaining the adenovirus vector of the present invention. Biochemical and genetic information for adenovirus type 5 is well known. Foreign genes carried by adenoviruses replicate in the same way as episomes, with very low genetic toxicity to host cells. Therefore, gene therapy using an adenovirus gene delivery system is considered to be safe.
  • Adeno-associated virus is suitable as the gene delivery system of the present invention because it can infect non-dividing cells and has the ability to infect various kinds of cells. Details of the preparation and use of AAV vectors are disclosed in detail in US Pat. Nos. 5,139,941 and 4,797,368.
  • AAV vectors have undergone clinical I as a therapeutic agent for cystic fibrosis.
  • AAV viruses are plasmids containing the gene sequence of interest, with two AAV terminal repeats flanked (McLaughlin et al., J. Virol., 62: 1963-1973 (1988); and Samulski et al. , J. Virol., 63: 3822-3828 (1989)) and expression plasmids comprising wild type AAV coding sequences without terminal repeats (McCarty et al., J. Virol., 65: 2936-2945 (1991)). Prepared by co-transfection.
  • viral vectors can also be used to carry the polynucleotide sequence of the present invention in vivo. Basinian virus (Puhlmann M. et al., Human Gene Therapy 10: 649-657 (1999); Ridgeway, "Mammalian expression vectors," In: Vectors: A survey of molecular cloning vectors and their uses.Rodrigue and Denhardt, eds Stoneham: Butterworth, 467-492 (1988); Baichwal and Sugden, "Vectors for gene transfer derived from animal DNA viruses: Transient and stable expression of transferred genes," In: Kucherlapati R, ed.
  • Liposomes are automatically formed by phospholipids dispersed in the aqueous phase. Examples of successfully delivering foreign DNA molecules into liposomes into cells include Nicolau and Sene, Biochim. Biophys. Acta, 721: 185-190 (1982) and Nicolau et al., Methods Enzymol., 149: 157-176 (1987). Liposomes containing the polynucleotide sequence of the present invention interact with cells through mechanisms such as endocytosis, adsorption to the cell surface, or fusion with plasma cell membranes to transport the polynucleotide sequences into cells.
  • the polynucleotide sequence of the present invention when mounted on naked recombinant DNA molecules or plasmids (vectors), the microinjection method (Capecchi, MR, Cell, 22: 479 (1980); and Harland and Weintraub, J. Cell Biol. 101: 1094-1099 (1985)), calcium phosphate precipitation (Graham, FL et al., Virology, 52: 456 (1973); and Chen and Okayama, Mol. Cell. Biol. 7: 2745 -2752 (1987)), electroporation (Neumann, E. et al., EMBO J., 1: 841 (1982); and Tur-Kaspa et al., Mol.
  • the polynucleotide sequence of the present invention When the polynucleotide sequence of the present invention is constructed based on a viral vector, the polynucleotide sequence may be transported into cells according to various viral infection methods known in the art. Infection of host cells with viral vectors is described in the references cited above.
  • the gene carrier of the invention is a vector.
  • the vector of the invention is a plasmid, and according to certain embodiments of the invention, the plasmid of the invention is pCK.
  • Recombinant vectors comprising a single polynucleotide expressing two or more isoforms of HGF using pCK are described in detail in WO 2000/040737 and WO 2003/078568.
  • composition of the present invention may comprise a pharmaceutically acceptable carrier.
  • Pharmaceutically acceptable carriers included in the compositions of the present invention are those commonly used in the formulation, lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, starch, acacia rubber, calcium phosphate, alginate, gelatin, calcium silicate , Microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, cellulose, water, syrup, methyl cellulose, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate, mineral oil, and the like, but are not limited thereto. no.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may further include a lubricant, a humectant, a sweetener, a flavoring agent, an emulsifier, a suspending agent, a preservative, and the like.
  • a lubricant e.g., talc, kaolin, kaolin, kaolin, kaolin, kaolin, kaolin, kaolin, kaolin, kaolin, a kaolin, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, mannitol, mannitol, mannitol, mannitol, mannitol, mannitol, mannitol, mannitol, mannitol, mann
  • the pharmaceutical composition of the invention is administered parenterally.
  • intravenous administration, intraperitoneal administration, subcutaneous administration, intradermal administration, spinal cord administration, intrathecal administration, intraventricular administration, intraparenchymal administration, intracranial administration, intramuscular administration or topical administration may be used.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be administered intramuscularly, intrathecal, intrathecal, intraventricular, intraventricular, intracranial.
  • compositions of the invention can be formulated and administered by injection. Suitable dosages of the pharmaceutical compositions of the present invention vary depending on factors such as the formulation method, mode of administration, age, weight, sex of the patient, degree of disease symptom, time of administration, route of administration, rate of excretion and response to reaction, Usually an experienced physician can easily determine and prescribe a dosage effective for the desired treatment.
  • the HGF, isoforms, and SDF-1 ⁇ of the present invention are administered at a dosage of 10 ng to 100 mg, respectively, wherein the polynucleotides encoding the protein are each 1 ⁇ g to 100 mg It is administered at a dose of.
  • the dosage may be the same or different each time when the administration of the HGF, isoforms thereof, SDF-1 ⁇ or polynucleotides encoding it is repeated more than once.
  • compositions of the present invention are prepared in unit dosage form by being formulated with pharmaceutically acceptable carriers and / or excipients, according to methods which may be readily practiced by those skilled in the art. Or may be prepared by incorporation into a multi-dose container.
  • the formulation may be in the form of a solution, suspension or emulsion in an oil or an aqueous medium, or may be in the form of extracts, powders, granules, tablets or capsules, and may further include a dispersant or stabilizer.
  • the present invention provides (a) Hepatocyte Growth Factor (HGF) or a variant thereof, and Stromal Cell derived Factor 1 alpha (SDF-1 ⁇ ); Or (b) administering to a subject in need thereof a composition comprising a polynucleotide encoding HGF and a polynucleotide encoding SDF-1 ⁇ as an active ingredient to a subject in need thereof.
  • HGF Hepatocyte Growth Factor
  • SDF-1 ⁇ Stromal Cell derived Factor 1 alpha
  • administering refers to the formation of the same amount in a subject's body by directly administering a therapeutically effective amount of a composition of the invention to an individual in need thereof (ie, a subject). Say what you can.
  • administration includes the injection of a composition of the present invention into a lesion site, so the term “administer” is used in the same sense as "inject”.
  • a “therapeutically effective amount” of a composition means a content of the composition that is sufficient to provide a therapeutic or prophylactic effect to the individual to whom the composition is to be administered, and includes a “prophylactically effective amount” as used herein.
  • the term “individual” includes, without limitation, human, mouse, rat, guinea pig, dog, cat, horse, cow, pig, monkey, chimpanzee, baboon, or rhesus monkey, specifically, an individual of the present invention is a human to be.
  • a method for preventing or treating peripheral arterial disease is a method comprising administering a pharmaceutical composition for preventing or treating peripheral arterial disease, which is an aspect of the present invention, and thus, overlapping descriptions thereof are excessive. It is omitted to avoid complexity.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating peripheral artery disease (PAD).
  • PAD peripheral artery disease
  • 2A and 2B show the effect of the combination of HGF and SDF-1 ⁇ on blood vessel production.
  • FIG. 3 shows the effect of combination of pCK-HGF and pCK-SDF-1 ⁇ on the leg status of the ischemic mouse model over time.
  • HUVECs obtained by culturing single cells from cultured human umbilical cords and culturing single cells were purchased from Lonza.
  • HGF (SEQ ID NO: 1, R & D systems Cat No. 294-HG-025 / CF, USA) and SDF-1 ⁇ (SEQ ID NO: 4, R & D systems Cat No. 350-NS-010 /) in the cell strain of HUVEC CF, USA) was coated with 1% gelatin transwell (Corning, cat # 3422) and then seeded 2 ⁇ 10 4 cells per well. After culturing for one hour to allow the cells to adhere, the experimental groups were organized as follows (50 ng / ml HGF; 50 ng / ml SDF-1 ⁇ ; 25 ng / ml HGF + 25 ng / ml SDF-1 ⁇ ). Each experimental group was treated with the protein for two hours, and the cells were stained with crystal violet in order to measure the degree of cell migration, and then the number of cells moved through the transwell was measured using a microscope.
  • Example 2 Matrigel Plug Analysis ( Matrigel in a plug assay With HGF SDF - 1 ⁇ Identify the efficacy of combinations on angiogenesis
  • Matrigel plug analysis was used to determine the effect of HGF and SDF-1 ⁇ on blood vessel formation.
  • mice Five-week-old C57BL / 6 mice were divided into the following groups (PBS; 300 ng HGF; 150 ng HGF + 150 ng SDF-1 ⁇ ). One unit of heparin was added to a 400 ⁇ l Matrigel matrix (Corning, cat # 356231), and proteins corresponding to the experimental groups were added. The resulting Matrigel mixture was injected subcutaneously into the mouse abdomen. After 7 days, the mice were sacrificed and the transplanted Matrigel matrix was isolated, and the hemoglobin level contained in each Matrigel was measured by Drabkin's assay to quantify the degree of blood vessel formation.
  • the hemoglobin level of the group containing 300 ng HGF was about 1.8 times higher than that of the group containing PBS.
  • the hemoglobin level of the group containing 150 ng of HGF and SDF-1 ⁇ was higher than that of the PBS group.
  • About 2.3-fold increase it was confirmed that the degree of angiogenesis was improved compared to the administration of HGF alone (FIGS. 2A and 2B).
  • the pCK vector is a vector constructed so that the subject to be expressed is under the control of an enhancer / promoter of human cytomegalovirus (hCMV), and Lee et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 272: 230 (2000); It is disclosed in detail in WO 2000/040737.
  • the pCK-HGF plasmid used in the present invention is a hybrid gene (i.e., HGF-X7) having a fragment sequence of intron 4 of the human HGF gene inserted between exons 4 and 5 of the human HGF gene according to the method described in WO 2003/078568. Gene; SEQ ID NO: 5) was inserted into the pCK vector.
  • Example 3-2 lower limb ischemia ( HLI ) Mouse Model Preparation and Plasmid DNA Administration
  • the HLI mouse model is the most representative mouse model that mimics human critical Limb Ischemia (CLI) [1, 2].
  • the manufacturing method of the mouse model is as follows. Seven-week-old male Balb / c mice were anesthetized with a mixture of zoletil and rumpun, and the thigh-sided skin was incised approximately 1 cm. Then, the location of the femoral artery in the inner thigh (final artery) was found and tied the length of about 1 cm of the artery well with 6-0 thick thread, the tissue between them was cut out to remove the blood vessels. In this way, ischemic conditions can be induced by removing blood vessels that fall down the thighs. Simultaneously with HLI induction, the plasmid DNA to be evaluated was administered to muscles near the removed blood vessel. Thereafter, the incision was well closed and watched to see if the mouse recovered well from anesthesia.
  • CLI human critical Limb Ischemia
  • the HLI mouse model was organized into 6 rats per group, each administered the following plasmids: 200 ⁇ g pCK; 200 ⁇ g pCK-HGF; 200 ⁇ g pCK-SDF-1 ⁇ ; 200 ⁇ g pCK-HGF + 200 ⁇ g pCK-SDF-1 ⁇ ) was administered.
  • the condition of the legs was observed at 3, 10, 17, 22 and 27 days after dosing respectively and scored according to certain criteria and quantified.

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Abstract

본 발명은 (a) 간세포 성장인자(Hepatocyte Growth Factor: HGF) 또는 이의 이형체, 및 기질세포 유발인자1알파(Stromal Cell derived Factor 1α: SDF-1α); 또는 (b) HGF를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 및 SDF-1α를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 유효성분으로 포함하는 말초동맥질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 조성물을 이용하는 경우 혈관 내피 세포의 유주 및 혈관 생성의 현저한 촉진을 통하여 HGF, 이의 이형체, SDF-1α 또는 이의 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 단독으로 이용한 경우보다 말초동맥질환(예컨대, 허혈성 지체질환)을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있다.

Description

간세포 성장인자 및 기질세포 유발인자1알파를 이용한 말초동맥질환의 예방 또는 치료용 조성물
본 발명은 간세포 성장인자(Hepatocyte Growth Factor: HGF) 또는 이의 이형체, 및 기질세포 유발인자1알파(Stromal Cell derived Factor 1α: SDF-1α); 또는 상기 단백질들을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 유효성분으로 포함하는 말초동맥질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
본 특허출원은 2014년 9월 26일에 대한민국 특허청에 제출된 대한민국 특허출원 제10-2014-0129361호에 대하여 우선권을 주장하며, 상기 특허출원의 개시 사항은 본 명세서에 참조로서 삽입된다. 심혈관 질환(Cadiovascular disease)은 동맥경화 등의 원인으로 혈관이 좁아지거나 폐색되어 발생하는 질환으로, 크게 관상동맥질환(Coronary Artery Disease; CAD)과 말초동맥질환(Peripheral Artery Disease; PAD)으로 크게 나뉠 수 있다. 이 중 말초동맥질환의 대표적인 종류로 허혈성 지체질환(Ischemic Limb Disease)이 있다.
현재까지 심혈관 질환의 치료는 혈관을 확장시키는 약물의 사용이나 외과적 수술이 대부분을 차지하고 있다. 그러나 허혈성 지체질환의 경우 썩어 들어가는 고통이 너무 심해 환자에 따라 항전신성 진통제를 복용하고 심해지면 다리를 절단하거나 사망에 이르는 경우도 있어 근본적인 치료가 필요한 실정이다.
한편, 유전자 치료를 위한 유전자 전달체로서의 발현벡터들은 WO 2000/040737에 기재되어 있다. 또한, WO 2003/078568에는 HGF 유전자를 이용한 허혈성 하지질환치료 효과에 대하여 기재하고 있다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명자들은 말초동맥질환을 예방 또는 치료할 수 있는 약물을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 간세포 성장인자(Hepatocyte Growth Factor: HGF) 또는 이의 이형체, 및 기질세포 유발인자1알파(Stromal Cell derived Factor 1α: SDF-1α); 또는 상기 단백질들을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 병용하는 경우 HGF, SDF-1α 또는 이의 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 각각을 단독으로 이용하는 경우보다 말초동맥질환에 대한 치료 효과가 현저함을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 말초동맥질환(Peripheral Artery Disease)의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 말초동맥질환(Peripheral Artery Disease)의 예방 또는 치료방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 간세포 성장인자(Hepatocyte Growth Factor: HGF) 또는 이의 이형체, 및 기질세포 유발인자1알파(Stromal Cell derived Factor 1α: SDF-1α); 또는 (b) HGF를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 및 SDF-1α를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 유효성분으로 포함하는 말초동맥질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명자들은 말초동맥질환을 예방 또는 치료할 수 있는 약물을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 간세포 성장인자(Hepatocyte Growth Factor: HGF) 또는 이의 이형체, 및 기질세포 유발인자1알파(Stromal Cell derived Factor 1α: SDF-1α); 또는 상기 단백질들을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 병용하는 경우 HGF, SDF-1α 또는 이의 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 각각을 단독으로 이용하는 경우보다 말초동맥질환에 대한 치료 효과가 현저함을 확인하였다.
본 발명의 치료 전략은 크게 단백질 치료 및 유전자 치료 두 가지로 분류될 수 있다. 본 발명의 단백질 치료제 전략에 따르면, HGF 또는 이의 이형체, 및 SDF-1α 단백질을 병용한다. 한편, 본 발명의 유전자 치료제 전략에 따르면, HGF를 암호화하는 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열 및 SDF-1α를 암호화하는 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열을 투여한다. HGF를 암호화하는 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열 및 SDF-1α를 암호화하는 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열은 하나의 폴리뉴클레오타이드로 제공되거나 별도의 폴리뉴클레오타이드로 제공될 수 있다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 HGF를 암호화하는 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열 및 SDF-1α를 암호화하는 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열은 별도의 폴리뉴클레오타이드로 제공된다.
이하, 본 발명에 대하여 상세히 기재한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "HGF의 이형체(isoform)"는 모든 대립 유전자 변형체들(variants)을 포함하는, 동물에서 자연적으로 생성되는(naturally occurring) HGF 아미노산 서열과 적어도 80％ 동일한 아미노산 서열을 갖는 HGF 폴리펩타이드를 의미한다. 예를 들어, HGF 이형체는 HGF의 정상형(normal form) 또는 야생형(wild type), 그리고 HGF의 다양한 변이체(예컨대, 스플라이싱 변이체 및 결손 변이체)를 모두 포괄하는 의미를 갖는다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “예방”은 본 발명의 조성물의 투여로 말초동맥질환을 억제시키거나 진행을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “치료”는 (a) 말초동맥질환의 발전의 억제; (b) 말초동맥질환의 경감; 또는 (c) 말초동맥질환의 제거를 의미한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 HGF는 재조합 인간 HGF 단백질을 포함한다. 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 HGF는 서열목록 제1서열의 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 HGF 이형체는 전장 HGF(full length HGF; flHGF) 및 결손된 변이형 HGF(deleted variant HGF; dHGF)를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "flHGF"는 동물 HGF의 아미노산 1-728 서열, 일 구현예에 따르면 포유동물 HGF의 아미노산 1-728 서열, 다른 구현예에 따르면 인간 HGF의 아미노산 1-728 서열을 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "dHGF"는 동물 HGF 유전자, 일 구현예에 따르면 포유동물 HGF 유전자의 선택적 스플라이싱에 의해 생성되는 HGF 단백질의 결손된 변형체를 의미한다. 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 dHGF는 전장 HGF 서열로부터 알파 사슬의 첫 번째 크링글 도메인에서 5 개의 아미노산(F, L, P, S 및 S)이 결손된 723개의 아미노산으로 이루어지는 인간 HGF이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 전장 HGF는 서열목록 제2서열의 아미노산 서열을 포함하고, 본 발명의 결손된 변이형 HGF는 서열목록 제3서열의 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 SDF-1α는 서열목록 제4서열 또는 서열목록 제8서열의 아미노산 서열을 포함한다.
하기 실시예에서 입증한 바와 같이, 본 발명의 HGF 및 SDF-1α 단백질을 HUVEC에 병용처리한 경우 각각의 단백질을 단독으로 처리한 경우보다 혈관 내피 세포의 유주 정도 및 혈관 생성 정도를 더욱 효과적으로 촉진한바, HGF 및 SDF-1α 단백질의 병용 투여가 말초동맥질환의 예방 또는 치료에 효과적으로 이용될 수 있음을 확인하였다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 HGF의 이형체는 별도의 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화되거나, 또는 단일의 폴리뉴클레오타이드에 의하여 암호화된다. 본 발명인 약제학적 조성물은, HGF의 이형체가 별도의 폴리뉴클레오타이드에 의하여 암호화되는 경우에 둘 이상의 폴리뉴클레오타이드를 포함하고, HGF의 이형체가 단일의 폴리뉴클레오타이드에 의하여 암호화되는 경우에는 상기 단일의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 HGF 이형체의 발현을 조절하는 하나 이상의 조절 서열(예컨대, 프로모터 또는 인핸서)에 작동가능하게 연결될 수 있다.
HGF의 이형체들이 별도의 폴리뉴클레오타이드에 의하여 암호화되는 경우, 두 가지 방식으로 발현 카세트를 구축할 수 있다. 첫 번째 방식에 따르면, 이형체 각각에 대한 CDS(coding sequence)에 발현 조절 서열을 연결하여 발현 카세트를 구축한다. 두 번째 방식에 따르면, "발현조절서열-제 1 이형체 CDS-IRES-제 2 이형체 CDS-전사종결 서열"과 같은 방식으로 IRES(internal ribosomal entry site) 또는 2A 펩타이드를 이용하여 발현 카세트를 구축한다. IRES 는 유전자의 번역이 IRES 서열에서 시작되도록 함으로써 2 개 이상의 관심 유전자가 동일한 구조물에서 발현되도록 한다.
HGF의 이형체가 단일의 폴리뉴클레오타이드에 의하여 암호화되는 경우, 상기 이형체들을 모두 암호화하고 있는 폴리뉴클레오타이드는 단일의 발현조절서열에 작동가능하게 연결된다.
본 발명에 있어서, HGF의 이형체는 둘 이상의 서로 다른 종류의 이형체, 예컨대 flHGF 및 dHGF를 동시에 발현하는 하이브리드(hybrid) HGF 유전자에 의해 암호화될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 하이브리드 HGF 유전자는 인간 HGF 유전자의 엑손 1 내지 4에 해당하는 서열, 인간 HGF 유전자의 인트론 4 또는 그의 단편 서열, 및 인간 HGF 유전자의 엑손 5 내지 18에 해당하는 서열을 포함한다.
상기 인트론 4를 포함하는 하이브리드 HGF 유전자는 7113bp 길이이며, 서열목록 제7서열의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 상기 하이브리드 HGF 유전자는 선택적으로 HGF cDNA의 엑손 4와 5 사이에 인트론 4의 단편을 포함할 수 있다. 본 발명의 특정 구현예에 따르면, 상기 하이브리드 HGF 유전자는 서열목록 제5서열의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
본 발명의 “HGF 이형체”, 하이브리드 HGF 유전자(예컨대, HGF-X7)에 관하여서는 WO 2003/078568에 보고된 바 있으며, 상기 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입된다.
본 발명에서 이용 가능한 HGF 이형체의 아미노산 또는 뉴클레오타이드 서열은 야생형 인간 HGF 이형체의 서열과 실질적인 동일성을 나타내는 아미노산 또는 뉴클레오타이드 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기 실질적인 동일성은, 야생형 인간 HGF 이형체의 아미노산 또는 뉴클레오타이드 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 80％의 상동성, 보다 바람직하게는 최소 90％의 상동성, 가장 바람직하게는 최소 95％의 상동성을 나타내는 아미노산 서열 또는 뉴클레오타이드 서열을 의미한다. 서열비교를 위한 얼라인먼트 방법은 당업계에 공지되어 있다. 얼라인먼트에 대한 다양한 방법 및 알고리즘은 Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981); Needleman and Wunsch, J. Mol. Bio. 48:443 (1970); Pearson and Lipman, Methods in Mol. Biol. 24: 307-31 (1988); Higgins and Sharp, Gene 73:237-44 (1988); Higgins and Sharp, CABIOS 5:151-3 (1989); Corpet et al., Nuc. Acids Res. 16:10881-90 (1988); Huang et al., Comp. Appl. BioSci. 8:155-65 (1992) 및 Pearson et al., Meth. Mol. Biol. 24:307-31 (1994)에 개시되어 있다. NCBI Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) (Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-10 (1990))은 NBCI (National Center for Biological Information) 등에서 접근 가능하며, 인터넷 상에서 blastp, blasm, blastx, tblastn 및 tblastx 와 같은 서열 분석 프로그램과 연동되어 이용할 수 있다. BLSAT 는 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/에서 접속 가능하다. 이 프로그램을 이용한 서열 상동성 비교 방법은 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/blast_help.html 에서 확인할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 SDF-1α를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 서열목록 제6서열을 포함한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 말초동맥질환은 허혈성 지체질환(Ischemic Limb Disease)이다. 하기 실시예에서 입증한 바와 같이, 본 발명의 조성물은 하지 허혈을 유도한 마우스 모델에서 pCK 투여군, pCK-SDF-1a 투여군 및 pCK-HGF 투여군의 다리 상태가 나빠지는 것과는 상이하게, 정상상태를 계속적으로 유지하게 하는 효과가 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 네이키드 DNA(naked DNA) 또는 유전자 운반체에 포함되어 있는 뉴클레오타이드이다. 본 발명의 조성물은 유전자 치료 분야에서 통상적으로 공지된 다양한 운반 방법을 통하여 생체 내에 적용될 수 있으며, 상기 유전자 운반체는 예컨대 벡터, 플라스미드 및 바이러스 벡터를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
(i) 플라스미드(벡터)
본 발명의 폴리뉴클레오타이드를 운반하는 운반체로서 플라스미드(벡터)가 이용될 수 있다. 벡터에 포함되는 폴리뉴클레오타이드는 적합한 발현 카세트 내에 존재하는 것이 바람직하다. 상기 발현 카세트에서 폴리뉴클레오타이드는 프로모터에 작동적으로 연결되는 것이 바람직하다.
본 명세서에서 사용된 용어 "작동적으로 연결된"은 핵산 발현조절 서열(예: 프로모터, 시그널 서열 또는 전사조절인자 결합 위치의 어레이)과 다른 핵산 서열 사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 해독을 조절하게 된다.
본 발명에 있어서, 폴리뉴클레오타이드 서열에 결합된 프로모터는 일 구현예에 따르면 동물세포, 다른 구현예에 따르면 포유동물 세포, 특정 구현예에 따르면 인간 세포에서 작동하여 뉴클레오타이드 서열의 전사를 조절할 수 있는 것으로서, 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터 및 포유동물 세포의 지놈으로부터 유래된 프로모터를 포함하며, 예컨대, CMV(cytomegalo virus) 프로모터, 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, HSV의 tk 프로모터, RSV 프로모터, EF1 알파 프로모터, 메탈로티오닌 프로모터, 베타-액틴 프로모터, 인간 IL-2 유전자의 프로모터, 인간 IFN 유전자의 프로모터, 인간 IL-4 유전자의 프로모터, 인간 림포톡신 유전자의 프로모터 및 인간 GM-CSF 유전자의 프로모터를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명에서 이용되는 프로모터는 인간 CMV(hCMV)의 IE(immediately early) 유전자로부터 유래된 프로모터 또는 EF1 알파 프로모터이며, 다른 구현예에 따르면 CMV IE 유전자의 프로모터/인핸서 및 엑손 1 전체서열부터 엑손 2 의 ATG 개시코돈 직전까지를 포함하는 5'-UTR (untranslated region)이다.
본 발명에서 이용되는 발현 카세트는 폴리아네닐화 서열을 포함할 수 있으며, 예를 들어 소성장 호르몬 터미네이터(Gimmi, E. R., et al., Nucleic Acids Res. 17:6983-6998 (1989)), SV40 유래 폴리 아데닐화 서열(Schek, N, et al., Mol. Cell Biol. 12:5386-5393 (1992)), HIV-1 polyA(Klasens, B. I. F., et al., Nucleic Acids Res. 26:1870-1876 (1998)), β-글로빈 polyA(Gil, A., et al, Cell 49:399-406 (1987)), HSV TK polyA(Cole, C. N. and T. P. Stacy, Mol. Cell. Biol. 5:2104-2113 (1985)) 또는 폴리오마바이러스 polyA(Batt, D. B and G. G. Carmichael, Mol. Cell. Biol. 15:4783-4790 (1995))를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 유전자 운반체는 pCK, pCP, pVAX1 또는 pCY 벡터를 이용할 수 있으며, 본 발명의 특정 구현예에 따르면 pCK 벡터를 이용할 수 있다. 상기 pCK 벡터는 WO 2000/040737에 상세히 개시되어 있으며, 상기 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입된다.
(ii) 레트로바이러스
레트로바이러스는 자신의 유전자를 숙주의 지놈으로 삽입시키고, 대량의 외래 유전 물질을 운반할 수 있으며, 감염시킬 수 있는 세포의 스펙트럼이 넓기 때문에 유전자 전달 벡터로서 많이 이용되고 있다.
레트로바이러스 벡터를 구축하기 위하여, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 서열은 레트로바이러스의 서열 대신에 레트로바이러스 지놈에 삽입되어 복제 불능의 바이러스를 생산한다. 비리온을 생산하기 위하여, gag, pol 및 env 유전자를 포함하지만 LTR (long terminal repeat)와 ψ서열은 없는 패키징 세포주를 구축한다 (Mann et al., Cell, 33:153-159 (1983)). 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 서열, LTR 및 ψ서열을 포함하는 재조합 플라스미드를 상기 세포주에 이입하면, ψ서열은 재조합 플라스미드의 RNA 전사체의 생산을 가능하게 하며, 이 전사체는 바이러스로 패키징되고, 바이러스는 배지로 배출된다(Nicolas and Rubinstein "Retroviral vectors," In: Vectors: A survey of molecular cloning vectors and their uses, Rodriguez and Denhardt (eds.), Stoneham: Butterworth, 494-513 (1988)). 재조합 레트로바이러스를 함유하는 배지를 수집하고 농축하여 유전자 전달 시스템으로 이용한다.
2 세대 레트로바이러스 벡터를 이용한 유전자 전달이 발표되었다. Kasahara 등(Science, 266:1373-1376 (1994))은 몰로니 뮤라인 류케미아 바이러스의 변이체를 제조하였고, 여기에서 EPO (erythropoietin) 서열을 엔벨로프 부위에 삽입하여 새로운 결합 특성을 갖는 키메릭 단백질을 생산하였다. 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 서열도 이와 같은 2 세대 레트로바이러스 벡터의 구축 전략에 따라 레트로바이러스에 탑재될 수 있다.
(iii) 아데노바이러스
아데노바이러스는 중간 정도의 지놈 크기, 조작의 편의성, 높은 타이터, 광범위한 타깃세포 및 우수한 감염성 때문에 유전자 전달 벡터로서 많이 이용되고 있다. 지놈의 양 말단은 100-200bp 의 ITR (inverted terminal repeat)를 포함하며, 이는 DNA 복제 및 패키징에 필수적인 시스-엘리먼트이다. 지놈의 E1 영역 (E1A 및 E1B)은 전사 및 숙주세포 유전자의 전사를 조절하는 단백질을 암호화한다. E2 영역 (E2A 및 E2B)은 바이러스 DNA 복제에 관여하는 단백질을 암호화한다.
현재 개발된 아데노바이러스 벡터 중에서, E1 영역이 결여된 복제 불능 아데노바이러스가 많이 이용되고 있다. 한편, E3 영역은 통상적인 아데노바이러스 벡터에서 제거되어 외래 유전자가 삽입되는 자리를 제공한다(Thimmappaya, B. et al., Cell, 31:543-551 (1982); 및 Riordan, J. R. et al., Science, 245:1066-1073 (1989)). 따라서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 서열은 결실된 E1 영역 (E1A 영역 및/또는 E1B 영역) 또는 E3 영역에 삽입되는 것이 바람직하다. 또한, 상기 뉴클레오타이드 서열은 결실된 E4 영역에도 삽입될 수 있다. 본 명세서에서 바이러스 지놈 서열과 관련하여 사용되는 용어, "결실" 은 해당 서열이 완전히 결실된 것뿐만 아니라, 부분적으로 결실된 것도 포함하는 의미를 가진다. 또한, 아데노바이러스는 야생형 지놈의 약 105％ 까지 패킹할 수 있기 때문에, 약 2 kb 를 추가적으로 패키징 할 수 있다(Ghosh-Choudhury et al., EMBO J., 6:1733-1739 (1987)). 따라서, 아데노바이러스에 삽입되는 상술한 외래 서열은 아데노바이러스의 지놈에 추가적으로 결합시킬 수도 있다.
아데노바이러스는 42개의 상이한 혈청형 및 A-F의 서브그룹을 갖는다. 이 중에서, 서브그룹 C 에 속하는 아데노바이러스 타입 5가 본 발명의 아데노바이러스 벡터를 얻기 위한 가장 바람직한 출발물질이다. 아데노바이러스 타입 5 에 대한 생화학적 및 유전적 정보는 잘 알려져 있다. 아데노바이러스에 의해 운반되는 외래 유전자는 에피좀과 동일한 방식으로 복제되며, 이에 숙주세포에 대해 유전적 독성이 매우 낮다. 따라서, 아데노바이러스 유전자 전달 시스템을 이용한 유전자 치료가 안전할 것으로 판단된다.
(iv) AAV 벡터
아데노-관련 바이러스 (AAV)는 비분열 세포를 감염시킬 수 있고, 다양한 종류의 세포에 감염할 수 있는 능력을 갖고 있기 때문에 본 발명의 유전자 전달 시스템으로 적합하다. AAV 벡터의 제조 및 용도에 대한 상세한 설명은 미국 특허 제 5,139,941 호 및 제 4,797,368 호에 상세하게 개시되어 있다.
유전자 전달 시스템으로서의 AAV 에 대한 연구는 LaFace et al, Viology, 162:483486 (1988), Zhou et al., Exp. Hematol. (NY), 21:928-933 (1993), Walsh et al, J. Clin. Invest., 94:1440-1448 (1994) 및 Flotte et al., Gene Therapy, 2:29-37 (1995)에 개시되어 있다. 최근에, AAV 벡터는 낭포성 섬유증의 치료제로서 임상 I 을 실시하고 있다.
전형적으로, AAV 바이러스는 두 개의 AAV 말단 리피트가 옆에 위치되어 있는 목적의 유전자 서열을 포함하는 플라스미드(McLaughlin et al., J. Virol., 62:1963-1973 (1988); 및 Samulski et al., J. Virol., 63:3822-3828 (1989)) 및 말단 리피트가 없는 야생형 AAV 코딩 서열을 포함하는 발현 플라스미드 (McCarty et al., J. Virol., 65:2936-2945 (1991))를 동시 형질전환 시켜 제조된다.
(v) 다른 바이러스 벡터
다른 바이러스 벡터들도 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 서열을 생체 내로 운반하는 데 이용할 수 있다. 배시니아 바이러스 (Puhlmann M. et al., Human Gene Therapy 10:649-657 (1999); Ridgeway, "Mammalian expression vectors," In: Vectors: A survey of molecular cloning vectors and their uses. Rodriguez and Denhardt, eds. Stoneham: Butterworth, 467-492 (1988); Baichwal and Sugden, "Vectors for gene transfer derived from animal DNA viruses: Transient and stable expression of transferred genes," In: Kucherlapati R, ed. Gene transfer. New York: Plenum Press, 117-148 (1986) 및 Coupar et al., Gene, 68:1-10 (1988)), 렌티바이러스 (Wang G. et al., J. Clin. Invest. 104(11):R55-62 (1999)) 또는 헤르페스 심플렉스 바이러스 (Chamber R., et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 92:1411-1415 (1995)) 로부터 유래된 벡터들도 상기 폴리뉴클레오타이드를 세포 내로 운반할 수 있는 운반 시스템으로 이용할 수 있다.
(vi) 리포좀
리포좀은 수상에 분산된 인지질에 의해 자동적으로 형성된다. 외래 DNA 분자를 리포좀으로 성공적으로 세포 내로 운반한 예는 Nicolau 및 Sene, Biochim. Biophys. Acta, 721:185-190 (1982) 및 Nicolau et al., Methods Enzymol., 149:157-176 (1987)에 개시되어 있다. 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 서열을 내포한 리포좀은 엔도사이토시스, 세포 표면에로의 흡착 또는 플라즈마 세포막과의 융합 등의 기전을 통해 세포와 상호작용하여 세포 내로 폴리뉴클레오타이드 서열을 운반한다.
본 발명에서 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 서열이 네이키드(naked) 재조합 DNA 분자 또는 플라스미드(벡터)에 탑재된 경우에는, 미세 주입법(Capecchi, M.R., Cell, 22:479 (1980); 및 Harland 와 Weintraub, J. Cell Biol. 101:1094-1099 (1985)), 칼슘 포스페이트 침전법(Graham, F.L. et al., Virology, 52:456 (1973); 및 Chen 과 Okayama, Mol. Cell. Biol. 7:2745-2752 (1987)), 전기 천공법(Neumann, E. et al., EMBO J., 1:841 (1982); 및 Tur-Kaspa et al., Mol. Cell Biol., 6:716-718 (1986)), 리포좀-매개 형질감염법(Wong, T.K. et al., Gene, 10:87 (1980); Nicolau 및 Sene, Biochim. Biophys. Acta, 721:185-190 (1982); 및 Nicolau et al., Methods Enzymol., 149:157-176 (1987)), DEAE-덱스트란 처리법(Gopal, Mol. Cell Biol., 5:1188-1190 (1985)) 및 유전자 밤바드먼트(Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 87:9568-9572 (1990)) 방법에 의해 폴리뉴클레오타이드 서열을 세포 내로 이입시킬 수 있다.
본 발명의 폴리뉴클레오타이드 서열이 바이러스 벡터에 기초하여 제작된 경우에는 당업계에 공지된 다양한 바이러스 감염 방법에 따라 폴리뉴클레오타이드 서열을 세포 내로 운반할 수 있다. 바이러스 벡터를 이용한 숙주 세포의 감염은 상술한 인용문헌에 기재되어 있다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 유전자 운반체는 벡터이다.
본 발명의 어떠한 구체예에 따르면, 본 발명의 벡터는 플라스미드이고, 본 발명의 특정 구현예에 따르면, 본 발명의 플라스미드는 pCK이다. pCK를 이용하여 HGF의 둘 이상의 이형체를 발현하는 단일 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터들은 WO 2000/040737 및 WO 2003/078568에 자세히 기재되어 있다.
본 발명의 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다. 본 발명의 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences(19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 약제학적 조성물은 비경구로 투여한다. 예컨대, 정맥내 투여, 복강내 투여, 피하 투여, 피내투여, 척수내 투여, 척수강내 투여, 뇌실내 투여, 뇌실질내 투여, 두개강내 투여, 근육내 투여 또는 국부 투여를 이용하여 투여할 수 있다. 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 약제학적 조성물은 근육내, 척수내, 척수강내, 뇌실내, 뇌실질내, 두개강내 투여할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 주사로 제제화되어 투여될 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 질병 증상의 정도, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 목적하는 치료에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 HGF, 이의 이형체, 및 SDF-1α은 각각 10 ng 내지 100 mg의 투여량으로 투여되며, 상기 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 각각 1 μg 내지 100 mg의 투여량으로 투여된다. 상기 HGF, 이의 이형체, SDF-1α 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드의 투여가 일회를 초과하여 반복될 때 투여량은 매회 동일하거나 다를 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 됨으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 간세포 성장인자(Hepatocyte Growth Factor: HGF) 또는 이의 이형체, 및 기질세포 유발인자1알파(Stromal Cell derived Factor 1α: SDF-1α); 또는 (b) HGF를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 및 SDF-1α를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 유효성분으로 포함하는 조성물을 이를 필요로 하는 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 말초동맥질환의 예방 또는 치료방법을 제공한다.
본 명세서에서 사용된 용어, "투여"또는"투여하다"는 본 발명의 조성물의 치료적 유효량을 상기 조성물을 필요로 하는 개체(즉, 대상체)에 직접적으로 투여함으로써 대상체의 체내에서 동일한 양이 형성되도록 하는 것을 말한다. 따라서, 용어 "투여"는 본 발명의 조성물을 병변 부위에 주입하는 것을 포함하므로, 용어"투여하다"는"주입하다"와 같은 의미로 사용된다.
조성물의“치료적 유효량"은 조성물을 투여하고자 하는 개체에게 치료적 또는 예방적 효과를 제공하기에 충분한 조성물의 함량을 의미하며, 이에 "예방적 유효량"을 포함하는 의미이다. 본 명세서에서 사용된 용어, "개체"는 제한 없이 인간, 마우스, 래트, 기니아 피그, 개, 고양이, 말, 소, 돼지, 원숭이, 침팬지, 비비 또는 붉은털 원숭이를 포함한다. 구체적으로는, 본 발명의 개체는 인간이다.
본 발명인 말초동맥질환의 예방 또는 치료방법의 경우, 본 발명의 일 양태인 말초동맥질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 방법이므로, 중복되는 내용에 대해서는 본 명세서 기재의 과도한 복잡성을 피하기 위해 생략하도록 한다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(a) 본 발명은 말초동맥질환(Peripheral Artery Disease; PAD) 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
(b) 본 발명의 조성물을 이용하면 혈관 내피 세포의 유주 및 혈관 생성의 현저한 촉진을 통하여 HGF, 이의 이형체, SDF-1α 또는 이의 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 단독으로 이용한 경우보다 말초동맥질환(예컨대, 허혈성 지체질환)을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있다.
도 1은 HGF 및 SDF-1α의 병용이 HUVEC의 세포 유주에 미치는 영향을 보여준다.
도 2a 및 2b는 HGF 및 SDF-1α의 병용이 혈관 생성에 미치는 영향을 보여준다.
도 3은 시간 경과에 따라 pCK-HGF 및 pCK-SDF-1α의 병용이 하지 허혈 마우스 모델의 다리 상태에 미치는 영향을 보여준다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
실시예 1. HUVEC (Human Umbilical vein endothelial cell)의 세포 유주에 HGF와 SDF - 1α의 조합이 미치는 효능 확인실험방법
인간의 탯줄로부터 정맥의 내피세포만을 취하여 단일 세포화한 뒤 배양하여 얻은 HUVEC을 Lonza에서 구매하였다.
HUVEC의 세포 유주에서 HGF(서열목록 제1서열, R&D systems Cat No. 294-HG-025/CF, 미국) 및 SDF-1α(서열목록 제4서열, R&D systems Cat No. 350-NS-010/CF, 미국)가 미치는 영향을 확인하기 위해 트랜스웰(Corning, cat#3422)을 1% 젤라틴으로 코팅한 후 웰당 2×104개의 세포를 파종하였다. 세포가 붙을 수 있도록 한 시간 동안 배양한 후, 각각 다음과 같이 실험군을 편성하였다(50 ng/ml HGF; 50 ng/ml SDF-1α; 25 ng/ml HGF + 25 ng/ml SDF-1α). 각 실험군에 해당 단백질을 두 시간 동안 처리하였고, 세포 유주의 정도를 측정하기 위하여 세포를 크리스탈 바이올렛으로 염색한 뒤 현미경을 이용하여 트랜스웰을 이동한 세포의 개수를 측정하였다.
그 결과, 50 ng/ml HGF를 단독으로 처리한 경우 대조군에 비하여 1.8배 세포 유주가 증가하였고, 50 ng/ml SDF-1α를 단독으로 처리한 경우 대조군에 비하여 1.5배 세포 유주가 증가하였다. HGF 및 SDF-1α를 각 25 ng/ml씩 같이 처리한 경우에는 세포 유주가 대조군에 비하여 2.5배 증가하여 각각을 단독으로 처리한 것보다 세포 유주에 대한 효과가 더 좋은 것을 확인하였다(도 1).
실시예 2. 마트리젤 플러그 분석( Matrigel plug assay)에서 HGF와 SDF - 1α의 조합이 혈관생성에 미치는 효능 확인
마트리젤 플러그 분석를 이용하여 혈관 생성에 HGF와 SDF-1α가 미치는 영향을 확인하였다.
5주령의 C57BL/6 마우스를 다음과 같이 나누어 실험군을 편성하였다(PBS; 300 ng HGF; 150 ng HGF + 150 ng SDF-1α). 400 μl 마트리젤 매트릭스(Corning, cat#356231)에 헤파린 1 유닛을 넣고 각각 실험군에 해당하는 단백질을 첨가하였다. 이렇게 만들어진 마트리젤 혼합물을 마우스 복부에 피하주사 하였다. 7일 후에 마우스를 희생시킨 뒤 이식한 마트리젤 매트릭스를 분리하였고, 혈관 생성 정도를 정량화하기 위해 각각의 마트리젤에 포함된 헤모글로빈(hemoglobin) 수치를 Drabkin’s assay를 통하여 측정하였다.
그 결과, 300 ng HGF를 넣은 군의 경우 PBS를 넣은 군에 비해 헤모글로빈의 수치가 약 1.8배 증가하였고, HGF 및 SDF-1α를 각각 150 ng씩 넣은 군의 경우 PBS군에 대비하여 헤모글로빈의 수치가 약 2.3배 증가하여, HGF 단독 투여 시보다 혈관 생성 정도가 향상된 것을 확인하였다(도 2a 및 2b).
실시예 3. 하지 허혈( hindlimb ischemia ; HLI ) 마우스 모델에의 HGF 및 SDF -1α의 투여 효능 확인
실시예 3-1:　플라스미드 DNA의 제조
pCK - HGF 플라스미드의 제조
하지 허혈 마우스 모델에 대한 실험에 앞서, 사용할 플라스미드 DNA를 다음과 같은 방식으로 제조하였다. pCK 벡터는 발현하고자 하는 대상을 인간 사이토메갈로바이러스(hCMV)의 인핸서/프로모터의 조절 하에 있도록 구축된 벡터이며, Lee et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 272:230 (2000); WO 2000/040737에 상세히 개시되어 있다. 본 발명에서 이용한 pCK-HGF 플라스미드는 WO 2003/078568에 기재되어 있는 방법에 따라 인간 HGF 유전자의 엑손 4 및 5 사이에 인간 HGF 유전자의 인트론 4의 단편 서열이 삽입된 하이브리드 유전자(즉, HGF-X7 유전자; 서열목록 제5서열)를 pCK 벡터로 삽입하여 제작하였다.
pCK - SDF - 1α 플라스미드의 제조
인간 SDF-1α의 유전자 정보(NCBI Reference Sequence: NM_199168.3)를 바탕으로 양 끝에 NheI과 NotI 제한효소 서열을 추가하여 유전자 합성을 하였다. 합성된 인간 SDF-1α 조각을 NheI과 NotI을 이용하여 pCK 벡터에 삽입하였다. pCK 벡터에 삽입된 인간 SDF-1α 유전자의 서열은 서열목록 제6서열과 같다.
실시예 3-2: 하지 허혈( HLI ) 마우스 모델 제조 및 플라스미드 DNA의 투여
HLI 마우스 모델은 인간의 중증 하지 허혈(Critical Limb Ischemia; CLI)을 모방하는 가장 대표적인 마우스 모델이다[1, 2]. 상기 마우스 모델의 제작방법은 다음과 같다. Balb/c 마우스 7주령 수컷을 졸레틸(zoletil)과 럼펀(rumpun) 혼합액으로 마취시킨 후, 허벅지 쪽 피부를 약 1 cm 절개시켰다. 그 후, 허벅지 안쪽에 있는 대퇴부 동맥(femoral artery)의 위치를 찾아내어 6-0 굵기의 실로 동맥의 약 1 cm 정도의 길이를 잘 묶어주고, 그 사이의 조직을 잘라내어 혈관을 제거하였다. 이러한 방법을 통해 허벅지 아래로 내려가는 혈관을 제거함으로써 허혈 조건을 유도할 수 있다. HLI 유도와 동시에, 제거한 혈관 근처의 근육에 평가하고자 하는 플라스미드 DNA를 투여하였다. 이후, 절개한 부분을 잘 봉합해주고 마우스가 마취로부터 잘 회복하는지 지켜보았다.
HLI 마우스 모델은 군당 6마리씩 편성하여 하기의 플라스미드를 각각 투여하였다: 200 μg pCK; 200 μg pCK-HGF; 200 μg pCK-SDF-1α; 200 μg pCK-HGF + 200 μg pCK-SDF-1α)의 플라스미드를 투여하였다. 투여 후 각각 3일, 10일, 17일, 22일 및 27일에 다리의 상태를 관찰하여 일정한 기준에 의해 점수를 매겨 수치화하였다. 이때 사용한 기준은 하기와 같다 [3]: 0 = 정상 상태; 1 = 발톱의 괴사; 2 = 발가락의 괴사; 3 = 발 조직의 괴사.
그 결과, HLI를 유도한 후 pCK 투여군의 경우 다리의 평균적인 상태가 서서히 나빠지기 시작하여 약 2주 후의 점수가 1.83 정도로 올라갔다. pCK-HGF 투여군의 경우 역시 시간이 지남에 따라 점수가 0.66-0.83 정도로 올라갔다. 반면, pCK-HGF 및 pCK-SDF-1α 병용 투여군의 경우 HLI 유도 후 점수가 0으로 유지되었다(도 3).
결과적으로, 상기의 실시예 1-3을 통하여 HGF 및 SDF-1α 의 병용 투여, HGF 및 SDF-1α를 각각 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 병용 투여한 경우 각각의 단백질 또는 폴리뉴클레오타이드를 단독으로 투여한 경우보다 혈관 내피 세포의 유주 및 혈관 생성 촉진 효과, 그리고 허혈성 지체질환에 대한 치료 효과가 현저함을 확인할 수 있었다.
참고문헌
1. Limbourg, A., et al., Evaluation of postnatal arteriogenesis and angiogenesis in a mouse model of hind-limb ischemia. Nat Protoc. 4(12): p. 1737-46, 2009.
2. Couffinhal, T., et al., Mouse model of angiogenesis. Am J Pathol. 152(6): p. 1667-79, 1998.
3. Clayton, J.A., D. Chalothorn, and J.E. Faber, Vascular endothelial growth factor-A specifies formation of native collaterals and regulates collateral growth in ischemia. Circ Res. 103(9): p. 1027-36, 2008.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (14)

  1. (a) 간세포 성장인자(Hepatocyte Growth Factor: HGF) 또는 이의 이형체, 및 기질세포 유발인자1알파(Stromal Cell derived Factor 1α: SDF-1α); 또는 (b) HGF를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 및 SDF-1α를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 유효성분으로 포함하는 말초동맥질환(Peripheral Artery Disease; PAD)의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 HGF는 서열목록 제1서열의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 HGF의 이형체는 전장 HGF(full length HGF; flHGF) 및 결손된 변이형 HGF(deleted variant HGF; dHGF)를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  4. 제 3 항에 있어서, 상기 전장 HGF는 서열목록 제2서열의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 결손된 변이형 HGF는 서열목록 제3서열의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  5. 제 1 항에 있어서, 상기 SDF-1α는 서열목록 제4서열 또는 서열목록 제8서열의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  6. 제 1 항에 있어서, 상기 HGF를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 인간 HGF 유전자의 엑손 1 내지 4에 해당하는 서열, 인간 HGF 유전자의 인트론 4 또는 그의 단편 서열, 및 인간 HGF 유전자의 엑손 5 내지 18에 해당하는 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  7. 제 6 항에 있어서, 상기 HGF를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 서열목록 제5서열인 것을 특징으로 하는 조성물.
  8. 제 1 항에 있어서, 상기 SDF-1α를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 서열목록 제6서열의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  9. 제 1 항에 있어서, 상기 말초동맥질환은 허혈성 지체질환(Ischemic Limb Disease)인 것을 특징으로 하는 조성물.
  10. 제 1 항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 네이키드 DNA(naked DNA) 또는 유전자 운반체에 포함되어 있는 뉴클레오타이드인 것을 특징으로 하는 조성물.
  11. 제 10 항에 있어서, 상기 유전자 운반체는 벡터인 것을 특징으로 하는 조성물.
  12. 제 11 항에 있어서, 상기 벡터는 플라스미드인 것을 특징으로 하는 조성물.
  13. 제 12 항에 있어서, 상기 플라스미드는 pCK인 것을 특징으로 하는 조성물.
  14. (a) 간세포 성장인자(Hepatocyte Growth Factor: HGF) 또는 이의 이형체, 및 기질세포 유발인자1알파(Stromal Cell derived Factor 1α: SDF-1α); 또는 (b) HGF를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 및 SDF-1α를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 유효성분으로 포함하는 조성물을 이를 필요로 하는 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 말초동맥질환의 예방 또는 치료방법.
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