WO2016110228A1 - 基于透明质酸的两亲聚合物、其制备方法与应用 - Google Patents

基于透明质酸的两亲聚合物、其制备方法与应用 Download PDF

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钟伊南
孟凤华
袁建栋
黄仰青
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    • C08B37/0072—Hyaluronic acid, i.e. HA or hyaluronan; Derivatives thereof, e.g. crosslinked hyaluronic acid (hylan) or hyaluronates

Definitions

  • Amphoteric acid-based amphiphilic polymer preparation method and application thereof
  • the present invention relates to a biodegradable polymer material and an application thereof, and particularly to an amphiphilic polymer-based amphiphilic polymer, a nanoparticle prepared therefrom, and an application thereof, and belongs to the field of medical materials.
  • Amphiphilic natural polymers can self-assemble in water using intermolecular interactions to form polymer nanoparticles comprising an outer hydrophilic layer, an inner hydrophobic layer.
  • Nanoparticles enter the body as a drug carrier, which can effectively reduce the phagocytosis of the human reticuloendothelial system (RES) macrophages, can cross the cell gap, and can be absorbed by the smallest capillaries and blood-brain barrier (BBB) of the human body.
  • BBB blood-brain barrier
  • Nanoparticle drug carriers can control drug release at targeted sites, reduce drug dosage, enhance drug efficacy, and reduce drug toxicity.
  • the ideal amphiphilic polymer nanoparticles must have good stability in the blood circulation to avoid premature release of the drug while at the same time rapidly releasing the drug in the tumor cells.
  • Some targeting molecules such as peptides, carbohydrates, antibodies and aptamers can effectively enter the tumor cells through receptor-mediated endocytosis, which greatly enhances the nanoparticles in the tumor site. set. However, this increases the manufacturing cost and may affect the structural size and the like of the nanoparticles.
  • the drug carrier also needs to have good biocompatibility, the metabolite is harmless to the human body, and has a wide range of sources, and has multiple functional groups in the repeating unit, which is easy to modify, so that it can be controlled release of the drug. Has great application potential.
  • a hyaluronic acid-based amphiphilic polymer consisting of a main chain and a side chain, the main chain of which is hyaluronic acid, the carboxyl group of the main chain hyaluronic acid forming an amide bond with a side chain, and the side chain is a group represented by the following formula (1) Formula 1),
  • part A is a divalent group 3 ⁇ 4 # -NH-CH(R)-(CH 2 ) n -NH-*, wherein # represents a point of attachment to the main chain hyaluronic acid, and * represents a group of formula (1) a point of attachment of a lipoyl group in a group;
  • group R represents H or -C00R, where! ⁇ is 11 or C do aliphatic fluorenyl, n represents an integer 2-10; and the hyaluronic acid has a molecular weight of 7 - 500 kDa; and the side chain has a degree of substitution of 5 - 40%.
  • n 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, or 10.
  • the n is 3.
  • the n is 4.
  • the hyaluronic acid (HA) preferably has a molecular weight of 10 to 100 kDa. In another embodiment of the present invention, the hyaluronic acid preferably has a molecular weight of 9 to 37 kDa.
  • the side chain has a degree of substitution of 5 to 40%. In another embodiment of the present invention, the degree of substitution of the side chain is preferably from 10 to 28%.
  • the group R is - COORi, CC 8 is an aliphatic group embankment.
  • the group R is -COOR is H.
  • the group R is -COOR is a C 2 -C 8 aliphatic fluorenyl group.
  • the group R is -COOR!, which is a C 2 -C 6 aliphatic alkyl group.
  • the group R is -COOR!, selected from the group consisting of H, methyl, ethyl, propyl, isopropyl, n-butyl, isobutyl, tert-butyl, sec-butyl, n-pentyl, isuf Base, neopentyl, tert-amyl, hexyl, heptyl, octyl, decyl and fluorenyl.
  • the group R is -COOfc and is a methyl group.
  • the group 1 is 11.
  • the A moiety of the side chain may be an L-amino acid, a derivative thereof or an analog thereof, a D-amino acid, a derivative thereof or an analog thereof, preferably L. -lysine, L-lysine ester, L-ornithine, L-ornithine ester, D-lysine, D-lysine ester, D-ornithine, or D-ornithine More preferred are L-lysine, L-lysine ester, L-ornithine, L-ornithine ester.
  • the side chain may preferably be selected from the group consisting of lysine-lipoyl, lysine-lipoyl, ornithine-lipoyl, and ornithine - lipoyl group.
  • the side chain is lysine-lipoyl or lysine ester-lipoyl.
  • the lysine ester-lipoyl group includes, but is not limited to, for example, lysine methyl ester-lipoyl group, lysine ethyl ester-lipoyl group, lysine propyl ester-lipoyl group, lysine isopropyl group.
  • the side chain is lysine methyl ester-lipoyl group, and the structural formula is as follows:
  • the side chain is ornithine-lipoyl or ornithyl ester-lipoyl.
  • the ornithine ester lipoyl group includes, but is not limited to, for example, the ornithine methyl ester-lipoyl group, ornithine ethyl ester-lipoyl group, ornithine propyl ester-lipoyl group, ornithine Propyl-lipoyl, n-butyl orthoester-lipoyl, isobutyl ornithine-lipoyl, tert-butyl ornithine-lipoyl, sec-butyl ornithine-lipoyl , n-amyl ornithine-lipoyl, isovaleryl-lipoyl, ornithine-lipoyl, andryl heptyl-lipoyl, octyl ornithine
  • the side chain is:
  • 11 is an integer of from 2 to 10, preferably n is 2, 3, 4, or 5; more preferably, ⁇ is 2, 3 or 4.
  • hyaluronic acid ( ⁇ ) is an acid mucopolysaccharide, also known as uronic acid, hyaluronic acid, and the basic structure is composed of two disaccharide units D-glucuronic acid and hydrazine - A large polysaccharide composed of acetylglucosamine.
  • Hyaluronic acid may consist of several hundred, several thousand or even tens of thousands of disaccharide units, wherein D-glucuronic acid and guanidine-acetylglucosamine are linked by ⁇ -1,3-glycosidic bonds, between disaccharide units Linked by ⁇ -1,4-glycosidic linkages.
  • the molecular weight of a disaccharide unit is: 379.3. According to the number of disaccharide units constituting hyaluronic acid, the structural formula of HA of hyaluronic acid is as follows:
  • each repeating unit in the formula is: 379.3, and each repeating unit contains 1 carboxyl group.
  • C r C 1 () aliphatic alkyl group as used in the present invention means a linear or branched aliphatic fluorenyl group having 1 to 10 carbon atoms.
  • Representative examples of d-Cu) aliphatic alkyl groups include methyl, ethyl, propyl, isopropyl, n-butyl, isobutyl, tert-butyl, sec-butyl, n-pentyl, isopentyl , neopentyl, tert-amyl, hexyl, heptyl, octyl, decyl and fluorenyl.
  • degree of substitution as used in the present invention means the degree to which the hydroxyl group of -COOH in the HA molecule is substituted by a side chain. The degree of substitution (DS) is calculated as follows:
  • the degree of substitution can be calculated from the area integrals of the peaks f and a.
  • DS20% HA-Lys has an integral area of f/a 20%.
  • Another object of the present invention is to provide a method for preparing a hyaluronic acid-based amphiphilic polymer according to the present invention, the method comprising the steps of: firstly, hyaluronic acid and N-protected amino acid, and derivatives thereof Or an analog thereof or a C 3 -C u decyl diamine is amidated to be converted to an N-protected amino acid, a derivative thereof or an analog thereof by an amide bond or ( ⁇ - ⁇ The hyaluronic acid of the amine; then deprotected, and the amidated product is amidated with lipoic anhydride to obtain the above hyaluronic acid-based amphiphilic polymer.
  • the protecting group for the N-protected amino acid, a derivative thereof or an analog thereof includes, but is not limited to, for example, Boc, Fmoc, Bpoc, Ddz, Cbz, Bn or Tos.
  • the N- protected amino acid with hyaluronic acid, amidation reaction, or derivatives or analogs thereof C 3 -C u embankment diamine coupling agent is Performed under catalysis.
  • Suitable coupling agents include, but are not limited to, for example, 1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride/N-hydroxysuccinimide (EDC/NHS), Carbodiimide/1-hydroxybenzotriazole (EDCI HOBT), carbodiimide/1-hydroxy-7-azobenzotriazole (EDCI HOAT), 2-(7-azobenzotriene) Azole, - ⁇ , ⁇ , ⁇ ', ⁇ '-tetramethylurea hexafluorophosphate (HATU), 4-(4,6-dimethoxytriazin-2-yl)-4-methyl Phytate hydrochloride (DMTMM), benzotriazol-1-yl-oxytri
  • the amidation reaction of the deprotected product with lipoic anhydride is carried out under the catalysis of a coupling agent.
  • Suitable coupling agents include, but are not limited to, for example, 4-(dimethylamino)pyridine (DMAP), diisopropylethylamine (DIPEA), N-methylmorpholine, hydrazine, hydrazine-dimethylaniline , pyridine and substituted pyridine derivatives such as 2,6-lutidine, 2,4,6-trimethylpyridine or 4-dimethylaminopyridine.
  • the hyaluronic acid-based amphiphilic polymer in which the side chain is lysine methyl ester-lipoyl group can be obtained by a two-step amidation reaction: first hyaluronic acid ( ⁇ ) with ⁇ -tert-butoxycarbonyl lysine methyl ester (H-Lys(B OC )-OMe) in 1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride Salt/N-hydroxysuccinimide (EDC/NHS) catalyzed by amidation reaction to convert to hyaluronic acid-N-tert-butoxycarbonyl lysine methyl ester (HA-Lys(B OC )-OMe ) Hyaluronic acid-lysine methyl ester (HA-Lys-OMe) was obtained after protection; HA-Lys-OMe was further amidated with lipoic anhydride (
  • the amphiphilic polymer can self-assemble into a nanoparticle in an aqueous solution, and then crosslinking the lipoyl group by a reducing agent such as dithiothreitol (DTT) to obtain a crosslinked nanoparticle, which can Increase the stability of the nanoparticles.
  • aqueous solution may be selected from the group consisting of: pure water, phosphate buffered solution (PBS), and 4-hydroxyethylpiperazineethanesulfonic acid (Hepes) buffer. Solution, etc.
  • another object of the present invention is to provide a crosslinked nanoparticle composed of the above amphiphilic polymer, the outer hydrophilic layer of the nanoparticle being composed of hyaluronic acid.
  • the inner hydrophobic layer is composed of a five-membered ring cross-linking of the side chain.
  • the crosslinked nanoparticles of the present invention are composed of the above amphiphilic polymer, and the outer layer hydrophilic layer of the nanoparticles is composed of hyaluronic acid, and the inner layer hydrophobic layer is composed of A five-membered ring cross-linking of lysine methyl ester-lipoyl group.
  • Another object of the present invention is to provide a method of preparing the crosslinked nanoparticles, comprising the steps of:
  • the nanoparticles by self-assembly of the amphiphilic polymer, the hydrophilic outer layer of the nanoparticles being composed of hyaluronic acid having active targeting, and the inner hydrophobic layer being composed of side chain groups (eg, lysine) Methyl ester-lipoyl group;
  • side chain groups eg, lysine
  • the inner hydrophobic layer of the nanoparticles in the step (1) is crosslinked, and the nanoparticle structure is stabilized by crosslinking of the five-membered ring of the lipoyl group to obtain crosslinked nanoparticles.
  • the amphiphilic polymer in the above step (1) self-assembles in an aqueous solution to form a hydrophobic group with a side chain group (for example, lysine methyl ester-lipoyl group).
  • the nanoparticles have a particle size of 50 - 300 nm. The dimensions are stable and uniform.
  • crosslinking described in the above step (2) may be carried out by the following method:
  • the disulfide-containing bond in the nanoparticles obtained by the step (1) by 1,4-dithio-D, L-suetyl alcohol (DTT) or glutathione (GSH)
  • DTT 1,4-dithio-D, L-suetyl alcohol
  • GSH glutathione
  • 1,4-dithio-D, L-butanol (DTT) or glutathione (GSH) is used as a parent 5 to 30% of the number of moles of lipoyl group in the polymer, the nanoparticles can be crosslinked, and the stability is greatly improved with respect to the nanoparticles which are not crosslinked, even if the dilution is 1000 times (simulated 1V injection), no dissociation occurs;
  • the aqueous solution of 2 M sodium chloride salt is stable and the particle size is unchanged.
  • the hydrophobic layer of the above amphiphilic polymer may be loaded with a small molecule drug, and the loading of the drug is formed by crosslinking to increase the stability of the drug-loaded nanoparticles, so another object of the present invention is to further provide the above-mentioned amphiphilic polymerization.
  • Another object of the present invention is to provide a drug-loaded nanoparticle comprising a carrier and a small molecule anticancer drug supported on a carrier, the carrier being composed of the amphiphilic polymer of the present invention, the carrier
  • the outer hydrophilic layer is composed of hyaluronic acid
  • the inner hydrophobic layer is composed of the side chain (for example, lysine methyl ester-lipoyl).
  • the lipoyl five-membered ring in the carrier may be crosslinked to obtain a drug-loaded nanoparticle.
  • a drug-loaded nanoparticle comprising a carrier and a small molecule anticancer drug supported on a carrier, the carrier being composed of the amphiphilic polymer described above, the carrier
  • the outer hydrophilic layer is composed of hyaluronic acid
  • the inner hydrophobic layer is composed of a five-membered ring of the side chain (for example, a five-membered ring of lysine methyl ester-lipoyl group).
  • the small molecule anticancer drug may be selected from, but not limited to: doxorubicin, paclitaxel, curcumin, docetaxel, camptothecin, mitomycin, tract Noromycin, bleomycin, calichemycin (Calicheanncm), maytansinoids, Doxorubicin, epirubicin or daunorubicin.
  • the encapsulation efficiency of the carrier for the small molecule anticancer drug is 40% - 91%; the drug loading of the drug-loaded nanoparticle ("DLC", Drug loading Content) is 11% - 22%.
  • the drug-loaded nanoparticles have a particle size of from 50 to 300 nm and a particle size distribution of from 0.02 to 0.30.
  • the present invention also provides a method for preparing the above drug-loaded nanoparticles, comprising the following steps:
  • 1,4-dithio-D, L-subutanol is used in an amount of from 5 to 30% by mole of the lipoyl group in the amphiphilic polymer.
  • the drug-loaded nanoparticles obtained by the above method are cross-linked drug-loaded nanoparticles, which can improve the stability of the drug circulation in the blood.
  • the small molecule drug carrier composed of the above amphiphilic polymer has both active targeting and reducing sensitivity, can improve the stability of the drug circulating in the blood, and increase the amount of the drug to be endocytosed by the tumor cells;
  • the cross-linked nanoparticles of the polymer in the presence of an intracellular reducing agent rapidly decrosslink and rapidly release the drug, thereby improving the bioavailability of the drug; and the amphiphilic polymer cross-linking nanoparticles can be easily excreted.
  • the reducing agent used for decrosslinking may be selected from the group consisting of a thiol-containing molecule such as 1,4-dithio-D, L-subutanol (DTT), glutathione (GSH) or trivalent phosphorus.
  • a compound such as tris(2-carboxyethyl)-phosphine (TCEP); for example, when the concentration of glutathione is 10 mM, the above-mentioned amphiphilic polymer constitutes a crosslinked nanoparticle Particles are de-crosslinked, releasing drugs and treating diseases.
  • the hydrophobic core of the nanoparticles composed of the amphiphilic polymer is loaded with a small molecule anticancer drug; the hydrophilic outer shell hyaluronic acid has the active targeting ability of the tumor, and can be associated with CD44 of various cancer cell surfaces.
  • Body binding, effective endocytosis into tumor cells by receptor-mediated endocytosis, and cross-linking can increase the stability of drug-loaded nanoparticles when transported in vivo, cross-linking drug-loaded nanoparticles into tumor cells, and tumors
  • the intracellular reducing environment is sensitive, can quickly release cross-linking, release drugs, and kill cancer cells efficiently.
  • the tumor is preferably a tumor overexpressing a cell surface CD44 receptor.
  • the present invention has the following advantages compared with the prior art:
  • the present invention discloses for the first time a drug carrier based on a hyaluronic acid amphiphilic polymer, which has high drug coverage, stable circulation in the body, high drug utilization rate, good biocompatibility, small side effects, and can be easily excreted.
  • the hydrophobic portion of the hyaluronic acid amphiphilic polymer disclosed in the present invention is a lipoyl group, and stable crosslinked nanoparticles can be obtained by self-assembly and cross-linking, and the nanoparticles are not easily dissociated outside the cell and in the blood. , thereby ensuring the stability of the nanoparticles encapsulated drugs, increasing
  • the in vivo circulation time of the drug overcomes the defects that the drug in the prior art is easily leaked in the body and has low carrying efficiency; and the nanoparticle has reduction sensitivity, decrosslinks in a reducing environment, releases a drug, and effectively delivers the drug. To the target organization.
  • the hydrophilic portion of the hyaluronic acid amphiphilic polymer-based drug carrier disclosed in the present invention is hyaluronic acid, which can actively target the surface of tumor cells and enter the tumor cells through receptor-mediated endocytosis. Effectively increase the ability of endocytosis of cells, overcoming the problem of low uptake capacity of common nanocarrier cells.
  • the hyaluronic acid amphiphilic polymer-based drug carrier disclosed in the invention can effectively enter the tumor cell without modifying the targeting molecule, and the enrichment rate at the tumor site is high, wherein the HA-Lys-LA reaches 12.71% ID/ g, and when the side chain is -NH-(CH 2 ) n-NH-lipoyl, its enrichment rate at the tumor site is significantly higher than that of HA-Lys-LA (ie, HA-lysine methyl ester-LA) In particular, HA-(aminohexylamino)-LA reaches 15.3% ID/g, which is much higher than the state of the art; it is highly cytotoxic to tumor cells, drug-resistant tumor cells and cancer stem cells.
  • the drug carrier disclosed by the invention has simple preparation, good biocompatibility, no harmful product to the human body, and has a wide range of sources, and has multiple functional groups in the repeating unit, which is easy to be modified; and can be quickly dissected in the tumor part. Dissociation and rapid release of the drug, resulting in an effective therapeutic effect, has great potential for application in the controlled release of drugs.
  • the pharmaceutical carrier based on hyaluronic acid amphiphilic polymer disclosed in the present invention especially when the side chain based on hyaluronic acid amphiphilic polymer is ornithine lipoyl group, the therapeutic effect of HA-DOX on LP1 tumor Very significant, as shown in Fig. 13A, 2/5 of the tumor volume disappeared after 25 days of HA-DOX treatment compared with the phosphate buffer solution (PBS) group; although the free drug group can achieve similar effects, small The mice were intolerant to free drugs.
  • PBS phosphate buffer solution
  • mice in the free drug group decreased significantly, while the HA-DOX group and the PBS group had similar effects on the body weight of the mice, and the body weight change remained insignificant at 24 days after administration ( As shown in Fig. 13C), it can be further found that, in combination with Fig. 13A and Fig. 13D, all of the mice died within 12-15 days of free drug administration, while the survival time of the HA-DOX group mice was more than 50 days, indicating that HA-DOX to mouse LP1 While the tumor has a highly effective therapeutic effect, the mouse is well tolerated.
  • the hyaluronic acid amphiphilic polymer-based drug carrier disclosed in the present invention particularly the drug-loaded HA-ornithine methyl ester-LA cross-linked nanoparticle, has a high enrichment rate at the tumor site, and the circulation time in the mouse body long.
  • the hyaluronic acid amphiphilic polymer-based nanoparticles provided by the present invention particularly when the side chain is ornithine, ornithine ester or a derivative thereof, lipoyl, -NH-(CH 2 ) n-NH
  • the obtained nanoparticles have a small particle diameter and an average particle size distribution of 0.15 or less.
  • the drug encapsulation ratio and the drug loading amount of the drug-loaded cross-linked nanoparticles thus prepared were significantly improved compared with HA-lysine methyl ester-LA.
  • FIG. 1 is a synthetic route diagram of the polymer HA-Lys-LA in the examples; 2 is a graph showing the results of size change of HA-Lys-LA crosslinked nanoparticles in high-dilution and high salinity conditions in Example 15; FIG. 3 is a HA-Lys-LA cross-linked nanoparticle carrying DOX in Example 21. In vitro release results under glutathione triggering; Figure 4 is the cross-linked nanoparticles of HA-Lys-LA cross-linked nanoparticles, DOX, and HA in Example 49.
  • Figure 5 is a graph showing the results of cytotoxicity of different HA-Lys-LA nanoparticles against MCF-7/ADR cells in Example 50;
  • Figure 6 is a graph showing the results of blood circulation of HA-Lys-LA cross-linked nanoparticles carrying DOX in Example 54 in mice;
  • Figure 7 is the HA-Lys-LA cross-linked nanoparticles carrying Cy7 in Example 56. In vivo imaging results of MCF-7/ADR tumor-bearing nude mice;
  • Figure 8 is a graph showing the results of biodistribution of HA-Lys-LA cross-linked nanoparticles carrying DOX in various organs of MCF-7/ADR tumor-bearing nude mice in Example 58;
  • Figure 9 is a graph showing the results of tumor growth of HA-Lys-LA cross-linked nanoparticles carrying DOX in nude mice bearing MCF-7/ADR tumors in Example 59;
  • Figure 10 is a structural formula of HA-Lys conjugate and its 1 H NMR (400 MHz, D 2 0 ) spectrum;
  • Figure 11 is a general route for the preparation of Example 24-27;
  • Figure 12 is a general route for the preparation of Examples 28-34;
  • FIGS. 13A-D are the results of tumor growth changes of HA-Om-LA (HA-ornithine-LA) cross-linked nanoparticles carrying DOX in nude mice bearing LP1 tumor (multiple myeloma) in Example 60.
  • Figure 13A and Figure 13B are graphs of relative tumor volume changes
  • Figure 13C is a graph of relative body weight changes in nude mice
  • Figure 13D shows mouse survival rates;
  • Figure 14 is a graph showing the results of the cycle of HA-ornithine methyl ester-LA cross-linked nanoparticles of DOX in Example 61 in mice;
  • Figure 15 is a diagram showing the biodistribution structure of HA-(aminohexylamino)-LA cross-linked nanoparticles carrying DOX in various organs of MCF-7/ADR tumor-bearing nude mice. detailed description
  • FIG. 1 is a synthetic route diagram of the polymer HA-Lys-LA in the examples.
  • triethylamine was added to N-tert-butoxycarbonyl lysine methyl ester hydrochloride (H-Lys(Boc)-OMexHCl) (240 mg, 0.80 mmol) in anhydrous methanol (2 mL) at room temperature.
  • H-Lys(Boc)-OMexHCl N-tert-butoxycarbonyl lysine methyl ester hydrochloride
  • HA hyaluronic acid
  • EDC hyaluronic acid
  • NHS N-hydroxysuccinimide
  • H-Lys(B OC )-OMe N-tert-butoxycarbonyl lysine methyl ester hydrochloride
  • the above-obtained lipoic anhydride was dissolved in 0.5 mL of anhydrous treated hydrazine, ⁇ '-dimethylformamide. Under a nitrogen atmosphere, HA-Lys(OMe) (60mg, 27 ⁇ 1 amino) dissolved in 5mL formamide was added to a 50mL three-necked flask, and the lipoic anhydride was dissolved in 0.5mL of N,N'-dimethylformamide.
  • 4-Dimethylaminopyridine (DMAP) (4mg, 33 ⁇ 1), placed in an oil bath at 30 ° C, stirred for 48 hours, then dialyzed in water / ethanol (1/1) and water, lyophilized , yield 95%.
  • the nuclear magnetic resonance results showed that the structure was hyaluronic acid-lysine methyl ester-lipoic acid (HA-Lys-LA), and the degree of substitution (DS) of lysine methyl ester-lipoyl group was 10%.
  • Lipoic acid (12 mg, 58 ⁇ 1) was dissolved in 2.0 mL of dichloromethane, and added to a 25 mL Schlenk vacuum sealed bottle, dissolved in 1.0 mL of DCC in dichloromethane (under nitrogen). 6mg, 29 ⁇ 0 1 ) was added to the sealed bottle, the bottle was placed in an oil bath at 30 ° C, stirred for 22 hours, cooled, filtered to remove the urea formed in the reaction, the filtrate was steamed, and the solvent was removed to obtain the lipoic anhydride. .
  • Lipoic acid (32 mg, 152 ⁇ 1) was dissolved in 2.0 mL of dichloromethane, and added to a 25 mL Schlenk vacuum sealed bottle, dissolved in 1.0 mL of DCC in dichloromethane (under nitrogen). 16 mg, 76 ⁇ 1) was placed in a sealed bottle, the bottle was placed in an oil bath at 30 ° C, stirred for 22 hours, cooled, and the urea formed in the reaction was removed by filtration, and the filtrate was evaporated to remove the solvent to obtain a lipic anhydride.
  • lipoic anhydride was dissolved in 0.5 mL of anhydrous treated hydrazine, ⁇ '-dimethylformamide. Under a nitrogen atmosphere, HA-Lys(OMe) (60 mg, 76 ⁇ 1 amino) dissolved in 5 mL of formamide was added to a 50 mL three-necked flask in turn, and the lipoic anhydride was dissolved in 0.5 mL of hydrazine, ⁇ '-dimethylformamide.
  • Lipoic acid (15 mg, 70 ⁇ 1) was dissolved in 2.0 mL of dichloromethane, and added to a 25 mL Schlenk vacuum sealed bottle, dissolved in 1.0 mL of DCC in dichloromethane (under nitrogen). 7mg, 35 ⁇ 0 1 ) was added to the sealed bottle, the bottle was placed in an oil bath at 30 ° C, stirred for 22 hours, cooled, filtered to remove the urea formed in the reaction, the filtrate was steamed, and the solvent was removed to obtain the lipoic anhydride. .
  • Lipoic acid (12 mg, 58 ⁇ 1) was dissolved in 2.0 mL of dichloromethane, and added to a 25 mL Schlenk vacuum sealed bottle, dissolved in 1.0 mL of DCC in dichloromethane (under nitrogen). 0.384 g, 1.86 mmol) was placed in a sealed bottle, the bottle was placed in an oil bath at 30 ° C, stirred for 22 hours, cooled, filtered to remove urea formed in the reaction, and the filtrate was steamed to remove the solvent to obtain lipoic anhydride. .
  • lipoic anhydride was dissolved in 0.5 mL of anhydrous treated hydrazine, ⁇ '-dimethylformamide.
  • HA-Lys(OMe) 60mg, 27 ⁇ 1 amino
  • sulfuric anhydride and dissolved in 0.5mL N,N'-dimethylformamide were added to a 50mL three-necked flask under nitrogen protection.
  • 4-Dimethylaminopyridine (4 ⁇ 3 ⁇ 4, 33 ⁇ 0 1 )
  • the reactor was placed in an oil bath at 30 ° C, stirred for 48 hours, then dialyzed in water / ethanol (1/1) and water, lyophilized , yield 95%.
  • the nuclear magnetic results showed that the structure was HA-Lys-LA, and the degree of substitution of lysine methyl ester-lipoyl group was 10%.
  • the above-obtained lipoic anhydride was dissolved in 0.5 mL of anhydrous treated hydrazine, ⁇ '-dimethylformamide.
  • HA-Lys(OMe) 60mg, 27 ⁇ 1 amino
  • sulfuric anhydride and dissolved in 0.5mL N,N'-dimethylformamide were added to a 50mL three-necked flask under nitrogen protection.
  • 4-Dimethylaminopyridine (4 ⁇ 3 ⁇ 4, 33 ⁇ 0 1 )
  • the reactor was placed in an oil bath at 30 ° C, stirred for 48 hours, then dialyzed in water / ethanol (1/1) and water, lyophilized .
  • the nuclear magnetic results showed that the structure was HA-Ly S -LA, and the degree of substitution of lysine methyl ester-lipoyl group was 10%.
  • Lipoic acid (12 mg, 58 ⁇ 1) was dissolved in 2.0 mL of dichloromethane, and added to a 25 mL Schlenk vacuum sealed bottle, dissolved in 1.0 mL of DCC in dichloromethane (under nitrogen). 6mg, 29 ⁇ 0 1 ) was added to the sealed bottle, the bottle was placed in an oil bath at 30 ° C, stirred for 22 hours, cooled, filtered to remove the urea formed in the reaction, the filtrate was steamed, and the solvent was removed to obtain the lipoic anhydride. .
  • the above-obtained lipoic anhydride was dissolved in 0.5 mL of anhydrous treated hydrazine, ⁇ '-dimethylformamide.
  • HA-Lys(OMe) 60mg, 27 ⁇ 1 amino
  • sulfuric anhydride and dissolved in 0.5mL N,N'-dimethylformamide were added to a 50mL three-necked flask under nitrogen protection.
  • 4-Dimethylaminopyridine (4 ⁇ 3 ⁇ 4, 33 ⁇ 0 1 )
  • the reactor was placed in an oil bath at 30 ° C, stirred for 48 hours, then dialyzed in water / ethanol (1/1) and water, lyophilized , yield 95%.
  • the nuclear magnetic results showed that the structure was HA-Lys-LA, and the degree of substitution of lysine methyl ester-lipoyl group was 10%.
  • the polymer HA-Lys-LA nanoparticles were prepared by a dialysis method.
  • the resulting solution was stirred for 1 h, and then placed in a previously prepared dialysis bag (SPECTRAPOR, MWCO: 3500), and dialyzed against a phosphate buffer solution (10 mM, pH 7.4) for 24 hours.
  • the average particle diameter of the nanoparticles was 237 nm and the particle size distribution was 0.23.
  • the solution of the polymer nanoparticles (0.5 mg/ml, 2 ml) formed above was adjusted to pH 8.5, and nitrogen gas was passed for 10 minutes, and 1 mg/mL l,4- was added. 4 mL of dithio-D,L-butanol (DTT), and the mixture was stirred and reacted under nitrogen atmosphere for 24 hours.
  • the resulting crosslinked nanoparticles were dialyzed against a phosphate buffer solution to remove unreacted DTT.
  • the crosslinked nanoparticles have a size of 219 nm and a particle size distribution of 0.27.
  • the solution of the polymer nanoparticles (0.5 mg/ml, 2 ml) formed above was adjusted to pH 8.5, and nitrogen gas was passed for 10 minutes, and 1 mg/mL l,4- was added.
  • the resulting crosslinked nanoparticles were dialyzed against a phosphate buffer solution to remove unreacted DTT.
  • the crosslinked nanoparticles have a size of 152 nm and a particle size distribution of 0.16.
  • the solution of the polymer nanoparticles (0.5 mg/ml, 2 ml) formed above was adjusted to pH 8.5, and nitrogen gas was passed for 10 minutes, and 1 mg/mL l,4- was added. 4 mL of dithio-D,L-butanol (DTT), and the mixture was stirred and reacted under nitrogen atmosphere for 24 hours.
  • the resulting crosslinked nanoparticles were dialyzed against a phosphate buffer solution to remove unreacted DTT.
  • the crosslinked nanoparticles have a size of 199 nm and a particle size distribution of 0.23.
  • the solution of the polymer nanoparticles (0.5 mg / ml, 2 ml) formed above was adjusted to pH 8.5, and nitrogen gas was passed for 10 minutes, and 1 mg/mL l,4- was added.
  • the resulting crosslinked nanoparticles were dialyzed against a phosphate buffer solution to remove unreacted DTT.
  • the crosslinked nanoparticles have a size of 164 nm and a particle size distribution of 0.11.
  • the solution of the polymer nanoparticles (0.5 mg/ml, 2 ml) formed above was adjusted to pH 8.5, and nitrogen gas was passed for 10 minutes, and 1 mg/mL l,4- was added.
  • the resulting crosslinked nanoparticles were dialyzed against a phosphate buffer solution to remove unreacted DTT.
  • the crosslinked nanoparticles have a size of 148 nm and a particle size distribution of 0.23.
  • GSH glutathione
  • HA-Lys-LA polymer cross-linked nanoparticles 0.001 mg/ml
  • the concentration of the peptide was 10 mM
  • the parallel control sample was set up without glutathione.
  • the glass sample cell was sealed with a rubber stopper, shaken evenly, and placed in a 37 ° C constant temperature shaker (200 rpm) at the selected time.
  • the particle size change of the particles was measured by dynamic laser light scattering (DLS) at 37 °C.
  • the particle size of the rice particles increased from 175 nanometers to several thousand nanometers. After 1000 times dilution, the particle size decreased to a few nanometers, indicating that the crosslinked nanoparticles were decrosslinked.
  • Example 21 wrapped small molecule anticancer drug doxorubicin and its glutathione trigger release
  • SPECTRA/ POR SPECTRA/ POR, MWCO: 3500
  • the formed drug-loaded polymer nanoparticle solution was taken in half volume, the pH was adjusted to 8.5, and nitrogen gas was passed for 10 minutes, and 1 mg/mL 1,4-dithio-D, L-butanol (DTT) was added. 17.5 mL, the mixture was stirred at room temperature under nitrogen for 24 hours.
  • the crosslinked drug-loaded nanoparticle solution was dialyzed against a phosphate buffer solution to remove unreacted DTT.
  • DOX-loaded cross-linked nanoparticles were diluted 100-fold with PBS (10 mM, pH 7.4) into two portions: one in an equal volume of GSH in PBS (10 mM) and the other in an equal volume of PBS solution.
  • PBS 10 mM, pH 7.4
  • the solutions were immediately transferred to a dialysis bag and placed in a 37 ° C constant temperature shaker (200 rpm).
  • the former was immersed in 25 mL of the same GSH concentration, the same temperature of PBS, the latter was immersed in 25 mL of the same temperature of PBS (20 mM), and a 6 mL dialysate outside the dialysis bag was taken for a certain period of time to determine the fluorescence intensity and 6 mL The corresponding fresh liquid is added to the outside of the dialysis bag.
  • Encapsulation ratio (mass of doxorubicin in nanoparticles / quality of doxorubicin input) 100 %
  • Drug loading (the mass of doxorubicin in the nanoparticles / the mass of the nanoparticles and the mass of the doxorubicin input) ⁇ ⁇ %
  • HA-Lys-LA 1() The encapsulation efficiency of the nanoparticle to doxorubicin was 54.5%, and the actual drug loading was 12%.
  • Figure 3 is a graph showing the in vitro release of HA-Lys-LA crosslinked nanoparticles loaded with DOX under the trigger of glutathione (GSH).
  • GSH glutathione
  • formamide solution 5mg/mL, lmL
  • DOX doxorubicin
  • dimethyl sulfoxide 5mg / mL, 0.25) mL
  • the formed drug-loaded polymer nanoparticle solution was taken in half volume, adjusted to pH 8.5, and passed through nitrogen for 10 minutes, added 1 mg of 1,4-dithio-D, L-suetyl alcohol (DTT), 1 mg, was stirred at room temperature under nitrogen for 24 hours.
  • the crosslinked drug-loaded nanoparticle solution was dialyzed against a phosphate buffer solution to remove unreacted DTT.
  • DOX-loaded cross-linked nanoparticles were diluted 100-fold with PBS (10 mM, pH 7.4) into two portions: one in an equal volume of GSH in PBS (10 mM) and the other in an equal volume of PBS solution.
  • PBS 10 mM, pH 7.4
  • the solutions were immediately transferred to a dialysis bag and placed in a 37 ° C constant temperature shaker (200 rpm).
  • the former was immersed in 25 mL of the same GSH concentration, the same temperature of PBS, the latter was immersed in 25 mL of the same temperature of PBS (20 mM), and a 6 mL dialysate outside the dialysis bag was taken for a certain period of time to determine the fluorescence intensity and 6 mL The corresponding fresh liquid is added to the outside of the dialysis bag.
  • Encapsulation ratio (mass of doxorubicin in nanoparticles / quality of doxorubicin input) 100 %
  • Drug loading (the mass of doxorubicin in the nanoparticles / the mass of the nanoparticles and the sum of the quality of the input doxorubicin) ⁇ ⁇ %
  • the theoretical drug loading is 25%, HA-Lys-LA 4 .
  • the encapsulation efficiency of cross-linked nanoparticles to doxorubicin was 74.5%, and the actual drug loading was 20%.
  • the crosslinked nanoparticles loaded with DOX were decrosslinked quickly at 10 mM GSH at 37 ° C, and DOX released about 78% in 22 hours; while the crosslinked nanoparticles loaded with DOX were in the absence of GSH. It is stable under conditions and has very little release, only 19%.
  • Example 23 Encapsulation of the small molecule anticancer drug paclitaxel (PTX) and its DTT trigger release
  • SPECTRA POR SPECTRA POR, MWCO: 3500
  • the formed drug-loaded polymer nanoparticle solution was taken in half volume, the pH was adjusted to 8.5, and nitrogen gas was passed for 10 minutes, and 1 mg/mL 1,4-dithio-D, L-butanol (DTT) was added. 17.5 mL, the mixture was stirred at room temperature under nitrogen for 24 hours.
  • the crosslinked drug-loaded nanoparticle solution was dialyzed against a phosphate buffer solution to remove unreacted DTT.
  • PTX-loaded cross-linked NPs were diluted 100-fold with PBS (10 mM, pH 7.4) into two portions: one PBS solution (10 mM) added with an equal volume of DTT, and the other was added only.
  • the former was immersed in 25mL of the same DTT concentration, the same temperature of PBS, the latter was immersed in 25mL of the same temperature of PBS (10mM), to a certain point in time to take 6mL of dialysate outside the dialysis bag to determine the drug release concentration, and Add 6 mL of the corresponding fresh liquid to the outside of the dialysis bag.
  • Encapsulation ratio (mass of paclitaxel in nanoparticles / quality of paclitaxel administered) 100 %
  • Drug loading (the mass of paclitaxel in the nanoparticles / the mass of the nanoparticles and the mass of the input paclitaxel) ⁇ ⁇ %
  • PTX does not affect the formation of nanoparticles and the size is basically unchanged, and when the theoretical drug loading is At 30%, the encapsulation efficiency of HA-Lys-LA 10 cross-linked nanoparticles for paclitaxel was 67.2%, and the actual drug loading was 22%.
  • the crosslinked nanoparticles loaded with PTX were decrosslinked quickly at 10 mM DTT at 37 ° C, and PTX released about 82% in 22 hours.
  • Lipoic acid (12mg, 58 ⁇ 1) was dissolved in 2.0 mL of dichloromethane, and added to a 25 mL Schlenk vacuum sealed bottle, dissolved in 1.0 mL of DCC in dichloromethane (under nitrogen). 6mg, 29 ⁇ 0 1) was added to the sealed bottle, the bottle was placed in an oil bath at 30 ° C, stirred for 22 hours, cooled, filtered to remove the urea formed in the reaction, the filtrate was steamed, and the solvent was removed to obtain the lipoic anhydride. .
  • 6 mL of trifluoroacetic acid / 2 M hydrochloric acid (v / vl : l ) was added in sequence, and the reaction was stirred for 6 h.
  • the pH of the solution was adjusted to 7.0, dialyzed, lyophilized, and produced. The rate is 92%.
  • the results of nuclear magnetic resonance showed that the structure was HA-Om, and the degree of substitution of ornithine was 28%.
  • Lipoic acid (32 mg, 152 ⁇ 1) was dissolved in 2.0 mL of dichloromethane, and added to a 25 mL Schlenk vacuum sealed bottle, dissolved in 1.0 mL of DCC in dichloromethane (under nitrogen). 16mg, 76 ⁇ 0 1) was added to a sealed bottle, placed in an oil bath at 30 ° C, stirred for 22 hours, cooled, filtered to remove urea formed in the reaction, the filtrate was steamed, and the solvent was removed to obtain lipoic anhydride. .
  • Lipoic acid (32mg, 152 ⁇ 1) was dissolved in 2.0 mL of dichloromethane, and added to a 25 mL Schlenk vacuum sealed bottle, dissolved in 1.0 mL of DCC in dichloromethane (under nitrogen). 16mg, 76 ⁇ 0 1) was added to a sealed bottle, placed in an oil bath at 30 ° C, stirred for 22 hours, cooled, filtered to remove urea formed in the reaction, the filtrate was steamed, and the solvent was removed to obtain lipoic anhydride. .
  • HA Ethyl alcohol
  • NHS 140 mg, 1.22 mmol
  • Orn(Boc)/methanol solution of the hydrochloride salt were added to the aqueous solution of 300
  • Lipoic acid (32 mg, 152 ⁇ 1) was dissolved in 2.0 mL of dichloromethane, and added to a 25 mL Schlenk vacuum sealed bottle, dissolved in 1.0 mL of DCC in dichloromethane under nitrogen. 16mg, 76 ⁇ 0 1 ) was added to a sealed bottle, the bottle was placed in an oil bath at 30 ° C, stirred for 22 hours, cooled, filtered to remove urea formed in the reaction, and the filtrate was steamed to remove the solvent to obtain lipoic anhydride. .
  • the lipoic acid (6 ⁇ 3 ⁇ 4, 29 ⁇ 1) was dissolved in 1.0 mL of dichloromethane, and added to a 13 mL Schlenk vacuum sealed bottle, dissolved in 0.5 mL of DCC in 0.5 mL of dichloromethane. 0.192 g, 0.93 mmol) was placed in a sealed bottle, the bottle was placed in an oil bath at 30 ° C, stirred for 22 hours, cooled, filtered to remove urea formed in the reaction, and the filtrate was steamed to remove the solvent to obtain lipoic anhydride. .
  • Lipoic acid (32 mg, 152 ⁇ 1) was dissolved in 2.0 mL of dichloromethane, and added to a 25 mL Schlenk vacuum sealed bottle, DCC dissolved in 1.0 mL of methylene chloride under nitrogen. 16 mg, 76 ⁇ 1) was placed in a sealed bottle, the bottle was placed in an oil bath at 30 ° C, and the reaction was stirred for 22 hours, then cooled, and the urea formed in the reaction was removed by filtration, and the filtrate was evaporated to remove the solvent to obtain the sulphuric acid anhydride. [00165] The above obtained lipoic anhydride was dissolved in 0.5 mL of anhydrous treated hydrazine, ⁇ '-dimethylformamide.
  • HA-Om (OBu) 113.8 mg, 76 ⁇ 1 amino
  • formamide formamide
  • the lipoic anhydride was dissolved in 0.5 mL of N,N'-dimethyl 4-dimethylaminopyridine (10mg, 83 ⁇ 0 1 ) in the amide
  • the reactor was placed in an oil bath at 30 ° C, stirred for 48 hours, then dialyzed in water / ethanol (1/1) and water, frozen dry.
  • the nuclear magnetic results showed that the structure was HA-Om(OBu)-LA, and the degree of substitution of ornithine butyl ester-lipoyl group was 28%.
  • the solution of the polymer nanoparticles (0.5 mg/ml, 2 ml) formed above was adjusted to pH 8.5, and nitrogen gas was passed for 10 minutes, and 1 mg/mL l,4- was added.
  • the resulting crosslinked nanoparticles were dialyzed against a phosphate buffer solution to remove unreacted DTT.
  • the cross-linked nanoparticles have a size of 150 nm and a particle size distribution of 0.13. They have high stability (simulated intravenous injection) and high salinity (2 M) with significant stability.
  • the solution of the polymer nanoparticles (0.5 mg/ml, 2 ml) formed above was adjusted to pH 8.5, and nitrogen gas was passed for 10 minutes, and 1 mg/mL l,4- was added.
  • Dithio-D, L-butanol (DTT) 20 mL was adjusted to pH 8.5, and nitrogen gas was passed for 10 minutes, and 1 mg/mL l,4- was added.
  • the resulting crosslinked nanoparticles were dialyzed against a phosphate buffer solution to remove unreacted DTT.
  • the cross-linked nanoparticles have a size of 149 nm and a particle size distribution of 0.13. They have high stability (simulated intravenous injection) and high salinity (2 M) with significant stability.
  • the solution of the polymer nanoparticles (0.5 mg/ml, 2 ml) formed above was adjusted to pH 8.5, and nitrogen gas was passed for 10 minutes, and 1 mg/mL l,4- was added.
  • Dithio-D, L-butanol (DTT) 20 mL was adjusted to pH 8.5, and nitrogen gas was passed for 10 minutes, and 1 mg/mL l,4- was added.
  • the resulting crosslinked nanoparticles were dialyzed against a phosphate buffer solution to remove unreacted DTT.
  • the cross-linked nanoparticles have a size of 132 nm and a particle size distribution of 0.09. They have high stability (simulated intravenous injection) and high salinity (2 M) with significant stability.
  • the solution of the polymer nanoparticles (0.5 mg/ml, 2 ml) formed above was adjusted to pH 8.5, and nitrogen gas was passed for 10 minutes, and 1 mg/mL l,4- was added.
  • the resulting crosslinked nanoparticles were dialyzed against a phosphate buffer solution to remove unreacted DTT.
  • the cross-linked nanoparticles have a size of 141 nm and a particle size distribution of 0.14. They are highly dilute (simulated intravenous) and high salinity (2 M) with significant stability.
  • Example 45 Encapsulation of small molecule anticancer drug doxorubicin (DOX) and its glutathione trigger release
  • DOX doxorubicin
  • dimethyl sulfoxide 5 mg/mL, 0.25 mL
  • the formed drug-loaded polymer nanoparticle solution was taken in half volume, the pH was adjusted to 8.5, and nitrogen gas was passed for 10 minutes, and 1 mg/mL 1,4-dithio-D, L-subutanol (DTT) was added. 17.5 mL, the mixture was stirred at room temperature under nitrogen for 24 hours.
  • the crosslinked drug-loaded nanoparticle solution was dialyzed against a phosphate buffer solution to remove unreacted DTT.
  • DOX-loaded cross-linked nanoparticles were diluted 100-fold with PBS (10 mM, pH 7.4) into two portions: one in an equal volume of GSH in PBS (10 mM) and the other in an equal volume of PBS solution.
  • the temperature is 37 ° C, these solutions are immediately divided Do not transfer to a dialysis bag and place in a 37 ° C constant temperature shaker (200 rpm).
  • the former was immersed in 25 mL of the same GSH concentration, the same temperature of PBS, the latter was immersed in 25 mL of the same temperature of PBS (20 mM), and a 6 mL dialysate outside the dialysis bag was taken for a certain period of time to determine the fluorescence intensity and 6 mL The corresponding fresh liquid is added to the outside of the dialysis bag.
  • Encapsulation ratio (mass of doxorubicin in nanoparticles / quality of doxorubicin input) 100 %
  • Drug loading (the mass of doxorubicin in the nanoparticles / the mass of the nanoparticles and the sum of the quality of the input doxorubicin) ⁇ ⁇ %
  • Example 46 Encapsulation of the small molecule anticancer drug doxorubicin (DOX) and its glutathione trigger release
  • SPECTRA POR MWCO: 3500
  • the formed drug-loaded polymer nanoparticle solution was taken in half volume, the pH was adjusted to 8.5, and nitrogen gas was passed for 10 minutes, and 1 mg/mL 1,4-dithio-D, L-subutanol (DTT) was added. 17.5 mL, the mixture was stirred at room temperature under nitrogen for 24 hours.
  • the crosslinked drug-loaded nanoparticle solution was dialyzed against a phosphate buffer solution to remove unreacted DTT.
  • DOX-loaded cross-linked nanoparticles were diluted 100-fold with PBS (10 mM, pH 7.4) into two portions: one was added to an equal volume of GSH in PBS (10 mM), and the other was added to an equal volume of PBS solution. The temperature was 37 ° C, and these solutions were immediately transferred to a dialysis bag and placed in a 37 ° C constant temperature shaker (QOO rpm).
  • the former was immersed in 25 mL of the same GSH concentration, the same temperature of PBS, the latter was immersed in 25 mL of the same temperature of PBS (20 mM), and a 6 mL dialysate outside the dialysis bag was taken for a certain period of time to determine the fluorescence intensity and 6 mL The corresponding fresh liquid is added to the outside of the dialysis bag.
  • Drug loading (the mass of doxorubicin in the nanoparticles / the mass of the nanoparticles and the sum of the quality of the input doxorubicin) ⁇ ⁇ %
  • SPECTRA POR SPECTRA POR, MWCO: 3500
  • the formed drug-loaded polymer nanoparticle solution was taken in half volume, the pH was adjusted to 8.5, and nitrogen gas was passed for 10 minutes, and 1 mg/mL 1,4-dithio-D, L-suetyl alcohol (DTT) was added. 17.5 mL, the mixture was stirred at room temperature under nitrogen for 24 hours.
  • the crosslinked drug-loaded nanoparticle solution was dialyzed against a phosphate buffer solution to remove unreacted DTT.
  • DOX-loaded cross-linked nanoparticles were diluted 100-fold with PBS (10 mM, pH 7.4) into two portions: one in an equal volume of GSH in PBS (10 mM) and the other in an equal volume of PBS solution.
  • PBS 10 mM, pH 7.4
  • the solutions were immediately transferred to a dialysis bag and placed in a 37 ° C constant temperature shaker (200 rpm).
  • the former was immersed in 25 mL of the same GSH concentration, the same temperature of PBS, the latter was immersed in 25 mL of the same temperature of PBS (20 mM), and a 6 mL dialysate outside the dialysis bag was taken for a certain period of time to determine the fluorescence intensity and 6 mL The corresponding fresh liquid is added to the outside of the dialysis bag.
  • Encapsulation ratio (mass of doxorubicin in nanoparticles / quality of doxorubicin input) 100 %
  • Drug loading (the mass of doxorubicin in the nanoparticles / the mass of the nanoparticles and the sum of the quality of the input doxorubicin) ⁇ ⁇ %
  • the crosslinked nanoparticles loaded with DOX were decrosslinked quickly at 10 mM GSH at 37 ° C, and DOX released about 83% in 22 hours; while the crosslinked nanoparticles loaded with DOX were in the absence of GSH. It is stable under conditions and has very little release, only 15%.
  • the mixture was stirred for 1 hour with DOX/dimethyl sulfoxide (5 mg/mL, 0.25 mL), and 4 mL of a phosphate buffer solution was added dropwise thereto under stirring at 25 °C. After the resulting solution was stirred for 1 h, it was placed in a pre-prepared dialysis bag (SPECTRA POR, MWCO: 3500) and dialyzed against a phosphate buffer solution to form a drug-loaded polymer nanoparticle solution.
  • SPECTRA POR SPECTRA POR, MWCO: 3500
  • the formed drug-loaded polymer nanoparticle solution was taken in half volume, the pH was adjusted to 8.5, and nitrogen gas was passed for 10 minutes, and 1 mg/mL 1,4-dithio-D, L-subutanol (DTT) was added. 17.5 mL, the mixture was stirred at room temperature under nitrogen for 24 hours.
  • the crosslinked drug-loaded nanoparticle solution was dialyzed against a phosphate buffer solution to remove unreacted DTT.
  • DOX-loaded cross-linked nanoparticles were diluted 100-fold with PBS (10 mM, pH 7.4) into two portions: one in an equal volume of GSH in PBS (10 mM) and the other in an equal volume of PBS solution.
  • PBS 10 mM, pH 7.4
  • the solutions were immediately transferred to a dialysis bag and placed in a 37 ° C constant temperature shaker (200 rpm).
  • the former was immersed in 25 mL of the same GSH concentration, the same temperature of PBS, the latter was immersed in 25 mL of the same temperature of PBS (20 mM), and a 6 mL dialysate outside the dialysis bag was taken for a certain period of time to determine the fluorescence intensity and 6 mL The corresponding fresh liquid is added to the outside of the dialysis bag.
  • Encapsulation ratio (mass of doxorubicin in nanoparticles / quality of doxorubicin input) 100 %
  • Drug loading (the mass of doxorubicin in the nanoparticles / the mass of the nanoparticles and the sum of the quality of the input doxorubicin) ⁇ ⁇ %
  • MCF-7/ADR cells were first plated at a density of 5 cells/well in cell culture plates at 37 ° C, 5% carbon dioxide, in 10% serum, 100 IU/mL antibiotic penicillin and 10 ( ⁇ g/mL streptomycin in lmL1640 medium for 24h, so that the cell monolayer coverage reached 70%.
  • DOX-loaded HA-Lys-LA cross-linked nanoparticles to each well or Free DOX solution, where the final concentration of DOX in the well was 5. ( ⁇ g/mL. After incubation for 10 h at 37 ° C, 5% carbon dioxide, remove the medium and wash 3 times with PBS solution. Then use 4% The paraformaldehyde solution was fixed at 15 mm and dissolved in PBS. Wash the liquid 3 times. The cytoskeleton was then stained with FITC-labeled phalloidin for 1 h and washed 3 times with PBS solution.
  • the nuclei were stained 15 mm with DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride) and washed 3 times with PBS solution.
  • the free HA solution (5 mg/mL) was incubated with the cells for 4 h before the addition of DOX-loaded HA-Lys-LA cross-linked nanoparticles in the blocking receptor experiment, the next step being as described above.
  • the prepared samples were observed and photographed using a confocal laser scanning microscope.
  • FIG. 4 is a graph showing drug release results of drug-loaded HA-Lys-LA cross-linked nanoparticles, DOX, and HA-blocked cross-linked nanoparticles in MCF-7/ADR cells (I is drug-loaded nanoparticles, II is Free drug, III is a drug-loaded nanoparticle blocked with free HA).
  • the results showed that the HA-Lys-LA cross-linked nanoparticles loaded with DOX could be endocytosed rapidly and release DOX in the cells. After 10 hours of culture, the DOX fluorescence in the cells almost all entered the nucleus, and the intensity was A control group that was significantly stronger than free DOX and free HA blocked, indicating that the nanoparticles have significant targeting and ability to reverse tumor cell resistance.
  • 1640 suspension of ⁇ cells (10% fetal bovine serum, 100 IU/mL penicillin and 100/mL streptomycin in 1640 medium) was plated in a 96-well culture plate to give a final cell density of 1 > ⁇ 10 4 / well, and placed at 37 ° C, 5% carbon dioxide for 24h to achieve a single layer of cell coverage of 70 ⁇ 80%.
  • the culture medium containing MTT was removed, 15 ( ⁇ L DMSO was added to each well to dissolve the living cells and purple formazan crystals produced by MTT, and the absorption of each well at 570 nm was measured using a microplate reader (BioTek). The relative cell viability was obtained by comparison with the absorption of the control wells with only blank cells at 570 nm.
  • the experimental data were performed in parallel four groups.
  • the 1640 suspension of 100 MCF-7/ADR cells was plated in a 96-well culture plate to give a final density of lxlO 4 cells/well, and cultured at 37 ° C for 24 h under 5% carbon dioxide to make monolayer cells. The coverage rate is 70 ⁇ 80%.
  • FIG. 4h is a graph showing the cytotoxicity results of different HA-Lys-LA nanoparticles against MCF-7/ADR cells. The results showed that: HA-Lys-LA cross-linked nanoparticles have good biocompatibility, while DOX-loaded cross-linked nanoparticles have anti-tumor activity, and their anti-tumor activity reaches the highest when the degree of substitution is 10%, because When the degree of substitution is too low, the crosslinked nanoparticles formed are less stable, and excessive modification of hyaluronic acid affects its targeting ability.
  • 1640 suspension of ⁇ cells (10% fetal bovine serum, 100 IU/mL penicillin and 100 M g/mL streptomycin in 1640 medium) was plated in 96-well plates to give the final density of the cells. 1 > ⁇ 10 4 /well, and placed at 37 ° C, 5% carbon dioxide for 24h to achieve a single layer of cell coverage of 70 ⁇ 80%.
  • the culture medium containing MTT was removed, 15 ( ⁇ L DMSO was added to each well to dissolve the living cells and purple formazan crystals produced by MTT, and the absorption of each well at 570 nm was measured using a microplate reader (BioTek). The relative cell viability was obtained by comparison with the absorption of the control wells with only blank cells at 570 nm.
  • the experimental data were performed in parallel four groups.
  • the 1640 suspension of ⁇ MCF-7/ADR cells was plated in a 96-well culture plate to give a final density of lxlO 4 cells/well, and placed at 37 ° C for 24 h under 5% carbon dioxide to make a single layer. The cell coverage rate is 70-80%.
  • 100 cells of DMEM low-sugar medium (DMEM low-sugar medium containing 10% fetal bovine serum, 100 IU/mL penicillin and lOO ⁇ !g/mL streptomycin) were plated in 96-well culture plates to make the cells final. The density is lx lO 4 / hole, and placed at 37 ° C, The coverage of monolayer cells reached 70-80% after culturing for 24 h under 5% carbon dioxide.
  • the culture medium containing MTT was removed, and 150 ⁇ l of DMSO was added to each well to dissolve the living cells and the purple formazan crystals produced by MTT, and the enzyme was used.
  • the BioTek assay measures the absorbance of each well at 570 nm. The relative cell viability is obtained by comparison with the absorbance of the control wells with only blank cells at 570 nm.
  • the experimental data were performed in parallel four groups.
  • the toxicity in U87MG cells was determined by the MTT method.
  • 100 cells of DMEM low-sugar medium (DMEM low-sugar medium containing 10% fetal bovine serum, 100 IU/mL penicillin and 10 ( ⁇ g/mL streptomycin) were plated in 96-well culture plates to make the final cells The density is ⁇ ⁇ ⁇ 4 / hole, and placed at 37 ° C, 5% carbon dioxide for 24 h to achieve a single layer of cell coverage of 70 ⁇ 80%.
  • the culture medium containing MTT was removed, 15 ( ⁇ L DMSO was added to each well to dissolve the crystals of purple formazan produced by living cells and MTT, and the absorbance of each well at 570 nm was measured using a microplate reader (BioTek). The relative survival rate was obtained by comparison with the absorption of the control wells with only blank cells at 570 nm.
  • the experimental data were all in parallel. ongoing.
  • the anticancer activity of DOX-loaded HA-Lys-LA nanoparticles was determined by a method similar to the above-described empty nanoparticle cytotoxicity. 10 ( ⁇ L U87MG cells in DMEM low-sugar medium were plated in 96-well culture plates, the final density of the cells was lx lO 4 /well, and placed at 37 ° C, 5% carbon dioxide for 24 h to make a single layer Cell coverage reached 70-80%. Then add 20 HA-Lys-LA cross-linked or uncrosslinked nanoparticles or free DOX in PBS containing DOX to each well to make DOX in the cell well.
  • the final concentration in the medium is 0.0023 ⁇ 100 ⁇ ⁇ / ⁇ .
  • the original medium is removed and the same amount of fresh medium is added.
  • 2 ( ⁇ L MTT solution (5 mg/mL) is added to each well. And placed in the incubator for 4h.
  • the subsequent experimental treatment and toxicity determination are consistent with the above.
  • the free HA solution (5mg) is added before the DOX-loaded HA-Lys-LA cross-linked nanoparticles are added. /mL ) Incubate with the cells for 4 h, the next steps are the same as above.
  • DOX DOX dosage is 15mg/kg
  • the blood sample was weighed and dissolved in 100 1% Triton solution, then 1 mL of 0.75 mol L isopropyl alcohol solution was added, and allowed to stand overnight at -20 ° C in the dark, after centrifugation. The supernatant was taken for fluorescence testing.
  • %ID/g (FL sample x(V Triton +V hydrochloric acid))/(M blood xFL standard xV standard ⁇ Standard dilution factor 100%.
  • the results showed that the DOX-loaded HA-Lys-LA cross-linked nanoparticles had good stability and could achieve long-circulation in mice, while free DOX could hardly be detected in mouse blood after 2 h.
  • the blood sample is weighed and dissolved at 100 1%.
  • 1 mL of 0.75 mol L of isopropanol hydrochloride solution was added, and the mixture was allowed to stand overnight at -20 ° C in the dark. After centrifugation, the supernatant was taken for fluorescence test.
  • %ID/g (FL sample x(V Triton +V hydrochloric acid))/(M blood xFL standard xV standard ⁇ Standard dilution factor 100%.
  • Example 56 In vivo imaging of HA-Lys-LA cross-linked nanoparticles in drug-resistant breast cancer-bearing nude mice
  • the tumor-bearing nude mice were injected with 0.2 mL of HA-Lys-LA cross-linked nanoparticle solution carrying the fluorescent molecule Cy7 through the tail vein, and then the nude mice were anesthetized at a certain time point and fixed in black plastic.
  • the intensity of Cy7 distribution in the body was measured at an emission wavelength of 720 nm.
  • Example 57 In vitro imaging of HA-Lys-LA cross-linked nanoparticles containing DOX in various organs of drug-resistant breast cancer-bearing nude mice
  • %ID/g FL Organ ⁇ (V treatment solution + V organ) / (V drug ⁇ dilution factor xFL drug ⁇ organ) ⁇ 100%
  • the existing surface-modified polyethylene glycol (PEG) doxorubicin (DOX)-loaded hollow gold nanospheres were less than 5% ID at the tumor site after 6 hours and 24 hours of tail vein injection. /g;
  • the pharmaceutical carrier based on the hyaluronic acid amphiphilic polymer of the present invention can effectively enter the tumor cells without modifying the targeting molecule, and the enrichment rate at the tumor site is high.
  • Relative tumor volume (%) tumor volume / day 0 tumor volume 100%.
  • Relative body weight change (%) nude mouse weight / day 0 nude mouse weight ⁇ 100%.
  • the effect of drug-loaded micelle preparation on tumor growth in nude mice was measured periodically using a caliper. The weight changes of nude mice were weighed regularly with a balance.
  • Relative tumor volume (%) tumor volume / day 0 tumor volume ⁇ 100%.
  • Relative body weight change (%) nude mouse weight / day 0 nude mouse weight ⁇ ⁇ %.
  • Figure 13A is a graph showing changes in relative tumor volume; from Figure 13A, 2/5 of the tumors disappeared within 25 days of mice treated with DOX-loaded HA-ornithine-LA cross-linked nanoparticles; As can be seen from 13B, the tumor volume of mice treated with DOX-loaded HA-ornithine-LA cross-linked nanoparticles was significantly reduced compared to that treated with phosphate buffer solution; Figure 13C shows that mice were relatively Body weight changes, as can be seen from the figure, free drug can cause severe weight loss in mice, while mice treated with DOX-loaded HA-ornithine-LA cross-linked nanoparticles have relatively small changes in body weight. 13A, Fig.
  • Fig. 13D is a result of mouse survival.
  • the results of Figures 13A-D show that: DOX-loaded HA-ornithine-LA cross-linked nanoparticles can effectively inhibit tumor volume growth and have high anti-tumor activity; while free DOX can not inhibit tumor growth.
  • Example 61 Circulation of HA-ornithine methyl ester-LA cross-linked nanoparticles loaded with DOX in mice
  • the blood sample is weighed and dissolved in 100 ⁇ % After the solution was pulled, 1 mL of 0.75 mol/L isopropyl alcohol hydrochloride solution was added, and the mixture was allowed to stand overnight at -20 ° C in the dark, and the supernatant was centrifuged for fluorescence test.
  • %ID/g (FL sample x (V Triton + V hydrochloric acid)) I (M blood xFL standard xV standard standard dilution factor) ⁇ 100%.
  • %ID/g FL organ (V treatment solution +V organ) I (V drug dilution factor xFL drug ⁇ organ) ⁇ 100%
  • Existing surface modified poly(ethylene glycol) (PEG) doxorubicin (DOX)-containing hollow gold nanospheres were enriched for less than 5% of DOX at the tumor site after 6 hours and 24 hours of injection via the tail vein. /g;
  • the pharmaceutical carrier based on the hyaluronic acid amphiphilic polymer of the present invention can effectively enter the tumor cells without modifying the targeting molecule, and the enrichment rate at the tumor site is high.

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Abstract

本发明公开了一种基于透明质酸的两亲聚合物、其制备方法与应用。所述两亲聚合物的主链为亲水性透明质酸，具有主动靶向能力；侧链为疏水性的如下式(1)表示的基团；可负载小分子抗癌药物，通过化学交联，得到聚合物纳米粒子，使得纳米粒子在细胞外和血液中不易解离，从而保证纳米粒子包封的药物稳定；一旦到达肿瘤组织，纳米粒子表面的透明质酸可以与肿瘤细胞表面的CD44受体紧密结合并通过受体介导的内吞作用有效进入肿瘤细胞内，然后快速解交联而解离，药物快速释放，在肿瘤部位的富集率高，远高于现有技术的水平，从而产生高效治疗作用；克服了药物在体内易被泄漏、运载效率低、细胞内吞少、细胞内释放慢等不足。

Description

基于透明质酸的两亲聚合物、 其制备方法与应用 技术领域
[0001] 本发明涉及一种生物可降解聚合物材料及其应用， 具体涉及一种基于透明质酸的两亲聚合物、 由其制备的纳米粒子与应用， 属于医药材料领域。
背景技术
[0002] 双亲性天然聚合物利用分子间的相互作用在水中可以自组装形成包括外部亲水层、 内部疏水 层的聚合物纳米粒子 （Nanoparticles ) 。 纳米粒子作为药物载体进入体内， 可以有效地减少人体网状内皮 系统 （RES ) 巨噬细胞的吞噬， 能穿越细胞间隙， 可通过人体最小的毛细血管及血脑屏障 （BBB ) 并被细 胞组织吸收。 纳米粒子药物载体可以控制药物在靶向部位控制释放、 减少药物用量、 增强药物疗效并降低 药物毒性。 理想的两亲聚合物纳米粒子必须具有在血液循环中良好的稳定性避免药物过早释放， 同时在肿 瘤细胞中快速释放药物的能力。
[0003] Jian You发现表面修饰了聚乙二醇（PEG) 的载有阿霉素（DOX) 的空心金纳米球经尾静脉 注射 6 小时及 24 小时之后在肿瘤部位 DOX 的富集都低于 5%ID/g( 参见： Jian You 等， Photothermal-chemotherapy with doxorubicin-loaded hollow gold nanospheres:A platform for near-infrared light-trigged drug release, Journal of Controlled Release 158 (2012) 319-328)。现有聚合物纳米载药粒子在肿瘤 中的分布一般为 l-5%ID/g， 使得药物的生物利用率差， 造成毒副作用。在聚合物纳米载药粒子表面修饰一 些靶向分子诸如多肽， 糖类， 抗体以及适配体等可以通过受体介导的内吞作用有效进入肿瘤细胞内， 大大 提高纳米粒子在肿瘤部位的富集。 但是此举增加了制备成本， 并可能对纳米粒子的结构尺寸等造成影响。
[0004] 同时， 药物载体还需具有良好的生物相容性， 代谢产物对人体无害， 并且来源广泛， 重复单 元中有多种官能团， 易于改性的性质， 使其在药物的控制释放上具有巨大应用潜力。
发明内容
[0005] 本发明的目的是， 提供一种基于透明质酸的两亲聚合物。
[0006] 为达到上述目的， 本发明具体的技术方案为：
一种基于透明质酸的两亲聚合物， 其由主链和侧链组成， 其主链为透明质酸， 所述主链透明质酸 的羧基与侧链形成酰胺键， 所述侧链为如下式 (1)表示的基团
Figure imgf000003_0001
式 (1)，
其中， A部分为二价基 ¾#-NH-CH(R)-(CH2)n-NH-*， 其中 #表示与主链透明质酸的连接点， *表示与 式 （1 ) 的基团中的硫辛酰基的连接点；
其中， 基团 R表示 H或 -C00R , 其中！^为11或 C do脂肪族垸基， n表示整数 2-10 ; 以及 所述透明质酸的分子量为 7 - 500 kDa; 侧链的取代度为 5 - 40% 。
[0007] 在本发明的一实施方式中， n为 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9或 10。
[0008] 在一优选实施方式中， 所述 n为 3。
[0009] 在另一优选实施方式中， 所述 n为 4。
[0010] 在本发明的一实施方式中， 所述透明质酸（HA) 的分子量优选为 10-100kDa。 在本发明的另 一实施方式中， 所述透明质酸的分子量优选为 9-37kDa。
[001 1] 在本发明的一实施方式中， 所述侧链的取代度为 5- 40%。在本发明的另一实施方式中， 所述 侧链的取代度优选为 10- 28%。
[0012] 在本发明的一实施方式中， 所述基团 R为- COORi, 为 C C8脂肪族垸基。 在本发明的一实 施方式中，所述基团 R为- COOR 为 H。优选地，所述基团 R为- COOR 为 C2-C8脂肪族垸基。优选地， 所述基团 R为- COOR!, 为 C2-C6脂肪族烧基。 优选地， 基团 R为- COOR!, 选自 H、 甲基、 乙基、 丙基、 异丙基、 正丁基、 异丁基、 叔丁基、 仲丁基、 正戊基、 异戊基、 新戊基、 叔戊基、 己基、 庚基、 辛基、 壬 基和癸基。 优选地， 基团 R为- COOfc , 为甲基。
[0013] 在本发明的一实施方式中， 所述基团 1 为11。
[0014] 在本发明的一实施方式中，所述侧链的 A部分可以是 L-氨基酸、其衍生物或其类似物部分， D-氨基酸、其衍生物或其类似物部分，优选为 L-赖氨酸、 L-赖氨酸酯、 L-鸟氨酸、 L-鸟氨酸酯、 D-赖氨酸、 D-赖氨酸酯、 D-鸟氨酸、 或 D-鸟氨酸； 更优选为 L-赖氨酸、 L-赖氨酸酯、 L-鸟氨酸、 L-鸟氨酸酯。
[0015] 在本发明的一实施方式中， 所述侧链可优选选自赖氨酸 -硫辛酰基， 赖氨酸酯 -硫辛酰基， 鸟 氨酸-硫辛酰基， 和鸟氨酸酯-硫辛酰基。
[0016] 在本发明的一实施方式中， 所述侧链为赖氨酸-硫辛酰基或赖氨酸酯 -硫辛酰基。 所述赖氨酸 酯-硫辛酰基包括但不限于例如赖氨酸甲酯-硫辛酰基， 赖氨酸乙酯 -硫辛酰基， 赖氨酸丙酯-硫辛酰基， 赖氨 酸异丙酯 -硫辛酰基， 赖氨酸正丁酯-硫辛酰基， 赖氨酸异丁酯-硫辛酰基， 赖氨酸叔丁酯-硫辛酰基， 赖氨酸 仲丁酯 -硫辛酰基， 赖氨酸正戊酯 -硫辛酰基， 赖氨酸异戊酯-硫辛酰基， 赖氨酸己酯 -硫辛酰基， 赖氨酸庚酯 -硫辛酰基， 赖氨酸辛酯-硫辛酰基， 赖氨酸壬酯-硫辛酰基， 和赖氨酸癸酯 -硫辛酰基。
[0017] 在本发明的一实施方式中， 所述侧链为赖氨酸甲酯-硫辛酰基， 其结构式为如下所示：
Figure imgf000005_0001
[0018] 在本发明的一实施方式中， 所述侧链为鸟氨酸-硫辛酰基或鸟氨酸酯 -硫辛酰基。 所述鸟氨酸 酯硫辛酰基包括但不限于例如所述鸟氨酸甲酯 -硫辛酰基， 鸟氨酸乙酯 -硫辛酰基， 鸟氨酸丙酯 -硫辛酰基， 鸟氨酸异丙酯-硫辛酰基， 鸟氨酸正丁酯 -硫辛酰基， 鸟氨酸异丁酯 -硫辛酰基， 鸟氨酸叔丁酯 -硫辛酰基， 鸟 氨酸仲丁酯-硫辛酰基， 鸟氨酸正戊酯-硫辛酰基， 鸟氨酸异戊酯 -硫辛酰基， 鸟氨酸己酯-硫辛酰基， 鸟氨酸 庚酯-硫辛酰基， 鸟氨酸辛酯 -硫辛酰基， 鸟氨酸壬酯 -硫辛酰基， 和鸟氨酸癸酯-硫辛酰基。
[0019] 在本发明的一实施方式中， 所述侧链为：
Figure imgf000005_0002
其中 11为2~10的整数， 优选 n 为 2、 3、 4、 或 5 ; 更优选 η为 2、 3或 4。
[0020] 在本发明中使用的术语 "透明质酸 （ΗΑ) "是一种酸性粘多糖， 又称糖醛酸、 玻尿酸， 基 本结构是由两个双糖单位 D-葡萄糖醛酸及 Ν-乙酰葡糖胺组成的大型多糖类。 透明质酸可能由几百、 几千 甚至数万个双糖单位组成，其中 D-葡萄糖醛酸和 Ν-乙酰葡糖胺之间由 β-1,3-糖苷键相连，双糖单位之间由 β-1,4-糖苷键相连。 一个双糖单位的分子量为： 379.3， 根据组成透明质酸的双糖单位数量不同， 透明质酸 的分 HA的结构式如下：
Figure imgf000005_0003
， 在该结构式中的每个重复单元的分子量为： 379.3， 每个重复单元含 1个羧基。
[0021] 在本发明中使用的术语 "CrC1()脂肪族烧基"是指含有 1至 10个碳原子的直链或支链脂肪族垸 基。 d-Cu)脂肪族烧基"的代表性实例包括甲基、 乙基、丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、仲丁基、 正戊基、 异戊基、 新戊基、 叔戊基、 己基、 庚基、 辛基、 壬基和癸基。 [0022] 在本发明中使用的术语"取代度 "是指 HA分子中 -COOH的羟基被侧链取代的程度。 取代度 (DS ) 的计算方法如下：
以如图 10中所示的 HA-Lys及其1 H NMR (400 MHz, D20) 谱图为例， 取代度根据峰 f和 a的面积 积分可以计算得出。 例如 DS20%的 HA-Lys， 其积分面积 f/a 20%。
[0023] 本发明的另一目的是提供制备本发明所述的基于透明质酸的两亲聚合物的方法， 所述方法包 括以下步骤： 首先透明质酸与 N-保护的氨基酸、 其衍生物或其类似物或 C3-Cu垸基二胺发生酰胺化反应， 转化成通过酰胺键连接至所述 N-保护的氨基酸、其衍生物或其类似物或 (^-^^完基二胺的透明质酸；然后 脱保护， 并使脱保护的产物与硫辛酸酐发生酰胺化反应， 得到上述的基于透明质酸的两亲聚合物。
[0024] 在本发明的一实施方式中，所述 N-保护的氨基酸、其衍生物或其类似物的保护基包括但不限 于例如 Boc、 Fmoc、 Bpoc、 Ddz、 Cbz、 Bn或 Tos。
[0025] 在本发明的一实施方式中， 所述透明质酸与 N-保护的氨基酸、其衍生物或其类似物或 C3-Cu 垸基二胺的酰胺化反应是在偶联剂催化下进行的。 适合的所述偶联剂包括但不限于例如 1-(3-二甲基氨丙 基) -3-乙基碳二亚胺盐酸盐 /N- 羟基琥珀酰亚胺 （EDC/NHS ) 、 碳二亚胺 /1-羟基苯并三唑 (EDCI HOBT)、 碳二亚胺 /1-羟基 -7-偶氮苯并三氮唑 (EDCI HOAT)、 2-(7-偶氮苯并三氮唑) -Ν,Ν,Ν',Ν'-四甲基脲六氟磷酸酯 (HATU)、 4-(4,6-二甲氧基三嗪 -2-基) -4-甲基吗啉盐酸盐 （DMTMM)、 六氟磷酸苯并三唑 -1-基 -氧基三吡咯 垸基 （PyBOP)、 0-苯并三氮唑 -Ν,Ν,Ν',Ν'-四甲基脲四氟硼酸 (TBTU)、 N-羟基硫代丁二酰磺酸钠盐。
[0026] 在本发明的一实施方式中， 所述脱保护的产物与硫辛酸酐的酰胺化反应是在偶联剂催化下进 行的。 适合的所述偶联剂包括但不限于例如 4- (二甲氨基） 吡啶 （DMAP) ， 二异丙基乙基胺 （DIPEA) ， N-甲基吗啉， Ν,Ν-二甲基苯胺， 吡啶和取代的吡啶衍生物， 如 2,6-二甲基吡啶、 2,4,6-三甲吡啶或 4-二甲基 氨基吡啶。
[0027] 在本发明的一实施方式中，其中侧链为赖氨酸甲酯-硫辛酰基的所述基于透明质酸的两亲聚合 物可以通过两步酰胺化反应得到： 首先透明质酸 （ΗΑ) 与 Ν-叔丁氧羰基赖氨酸甲酯 （H-Lys(BOC)-OMe) 在 1-(3-二甲基氨丙基 )-3-乙基碳二亚胺盐酸盐 /N- 羟基琥珀酰亚胺 （EDC/NHS) 催化下通过酰胺化反应转 化成透明质酸 -N-叔丁氧羰基赖氨酸甲酯 （HA-Lys(BOC)-OMe ) ， 脱保护之后得到透明质酸 -赖氨酸甲酯 (HA-Lys-OMe) ； HA-Lys-OMe 再与硫辛酸酐 （LAA) 在 4- (二甲氨基） 吡啶 （DMAP) 催化下通过酰胺 化反应得到基于透明质酸的两亲聚合物 HA-Lys-LA。
[0028] 与硫辛酰基共价连接的氨基酸基团、其衍生物或其类似物或 C3-Cu垸基二胺基团作为疏水链 段引入亲水聚合物透明质酸的侧链， 得到两亲聚合物； 该两亲聚合物可以在水溶液中自组装形成纳米粒， 然后可以通过还原剂如二硫代苏糖醇 （DTT) 来交联硫辛酰基得到交联纳米粒子， 这样可增加纳米粒子的 稳定性。 其中， 水溶液可选自： 纯水， 磷酸盐缓冲溶液 （PBS) ， 和 4-羟乙基哌嗪乙磺酸 （Hepes) 缓冲 溶液等。
[0029] 因此， 本发明的另一目的是提供一种交联纳米粒子， 所述交联纳米粒子由上述两亲聚合物构 成， 所述纳米粒子的外层亲水层由透明质酸构成， 内层疏水层由所述侧链的五元环交联构成。
[0030] 在本发明的一实施方式中， 本发明的所述交联纳米粒子由上述两亲聚合物构成， 所述纳米粒 子的外层亲水层由透明质酸构成， 内层疏水层由赖氨酸甲酯-硫辛酰基的五元环交联构成。
[0031] 本发明的另一目的是提供制备所述交联纳米粒子的方法， 其包括以下步骤：
(1) 将所述两亲聚合物通过自组装形成纳米粒子，所述纳米粒子的亲水外层由具有主动靶向的透明 质酸构成， 内层疏水层由侧链基团 （例如赖氨酸甲酯-硫辛酰基） 构成；
(2) 将步骤 (1) 中纳米粒子的内层疏水层交联，通过硫辛酰基的五元环的交联来稳定纳米粒子结构， 得到交联纳米粒子。
[0032] 在本发明的一实施方式中， 上述步骤 （1 ) 中所述两亲聚合物在水溶液中自组装形成以侧链 基团 （例如赖氨酸甲酯-硫辛酰基） 为疏水部分的纳米粒子， 所述纳米粒子的粒径为 50 - 300 nm。 尺寸稳 定， 分布均一。
[0033] 在本发明的一实施方式中， 上述步骤 （2) 中所述的交联可采用下列方法：
利用巯基 -二硫键交换反应， 通过 1,4-二硫代 -D, L-苏丁醇 （DTT) 或谷胱甘肽（GSH) 和步骤（1 )所 得纳米粒子中的含二硫键的五元环发生交换反应， 得到还原敏感的化学交联产物； 其中， 1,4-二硫代 -D, L- 苏丁醇（DTT)或谷胱甘肽 (GSH)的用量为两亲聚合物中硫辛酰基的摩尔数的 5 - 30%,纳米粒能够交联， 稳定性相对于没有交联的纳米粒子大大提高， 即使稀释 1000 倍（模拟 1V注射）也不发生解离； 对 2 M 的 氯化钠盐的水溶液稳定， 粒径不变。
[0034] 上述两亲聚合物的疏水层可以负载小分子药物， 并通过交联形成对药物的负载， 增加载药纳 米粒子的稳定性， 所以本发明的另一目的是进一步提供上述两亲聚合物在制备药物载体中的应用。
[0035] 本发明的另一目的是提供一种载药纳米粒子， 其包括载体与负载在载体上的小分子抗癌药物， 所述载体由本发明所述的两亲聚合物构成， 所述载体的外层亲水层由透明质酸构成， 内层疏水层由所述侧 链 （例如赖氨酸甲酯-硫辛酰基） 构成。
[0036] 特别地， 为了增加载药纳米粒子在体内运行的稳定性， 可以对所述载体中的硫辛酰基五元环 进行交联， 即得到一种载药纳米粒子。 因此， 在本发明的一特别实施方式中提供了一种载药纳米粒子， 其 包括载体与负载在载体上的小分子抗癌药物， 所述载体由上述的两亲聚合物构成， 所述载体的外层亲水层 由透明质酸构成， 内层疏水层由所述侧链的五元环 （例如赖氨酸甲酯-硫辛酰基的五元环） 交联构成。
[0037] 在本发明的一实施方式中， 所述小分子抗癌药物可选自但不局限于： 阿霉素、 紫杉醇、 姜黄 素、 多西紫杉醇、 喜树碱、 丝裂霉素、 道诺霉素、 博来霉素、 卡里奇霉素 （Calicheanncm) 、 美登素类"、 多柔比星、 表柔比星或者柔红霉素等。
[0038] 在本发明的优选的实施方式中， 所述载体对小分子抗癌药物的包封率为 40% - 91% ； 所述载 药纳米粒子的载药量 （"DLC", Drug loading content) 为 11% - 22%。
[0039] 在本发明的优选的实施方式中，载药纳米粒子的粒径为 50 - 300纳米，粒径分布为 0.02 -0.30。
[0040] 本发明还提供了上述载药纳米粒子的制备方法， 包括以下步骤：
( 1 ) 小分子药物先溶在有机溶液中， 再与所述两亲聚合物的有机溶液共同搅拌， 然后再滴加磷酸 盐缓冲溶液， 将得到的溶液搅拌 0.5 小时后透析， 得到包裹药物的纳米粒子；
(2)利用巯基 -二硫键交换反应， 通过 1,4-二硫代 -D, L-苏丁醇对步骤（1 )所得纳米粒子中的含二 硫键的五元环进行化学交联；其中， 1,4-二硫代 -D, L-苏丁醇的用量为两亲聚合物中硫辛酰基的摩尔数的 5 - 30%。
[0041] 上述方法得到的载药纳米粒子为交联的载药纳米粒子， 可提高药物在体内血液中循环的稳定 性。
[0042] 上述两亲聚合物构成的小分子药物载体同时具有主动靶向性和还原敏感性， 可提高药物在体 内血液中循环的稳定性， 提高药物被肿瘤细胞内吞的量； 同时两亲性聚合物交联纳米粒子在细胞内还原剂 存在下， 快速解交联、 快速释放药物， 从而提高药物的生物利用度； 并且两亲聚合物交联纳米粒子可方便 排出体外。用以解交联的还原剂可选自：含巯基的分子，如 1,4-二硫代 -D, L-苏丁醇 (DTT)，谷胱甘肽 (GSH) 或含三价磷的化合物， 如三 （2-氯乙基） 磷酸酯 （tris(2-carboxyethyl)-phosphine， TCEP) ； 例如当谷胱甘 肽的浓度为 10 mM 的时候， 上述两亲聚合物构成的交联纳米粒子会被解交联， 释放药物， 治疗疾病。
[0043] 本发明中， 由两亲聚合物构成的纳米粒子的疏水性内核负载小分子抗癌药物； 亲水外壳透明 质酸具有肿瘤主动靶向能力， 能与多种癌细胞表面的 CD44 受体结合， 通过受体介导的内吞作用有效内吞 进入肿瘤细胞内， 同时交联可以增加载药纳米粒子在体内输送时的稳定性， 交联载药纳米粒子进入肿瘤细 胞后， 对肿瘤细胞内的还原环境敏感， 能快速解除交联， 释放药物， 高效杀死癌细胞。
[0044] 所以本发明的另一目的在于提供上述包括载体与负载在载体上的小分子抗癌药物的载药纳 米粒子在制备抗肿瘤药物中的应用。 在一优选实施方式中， 所述肿瘤优选为细胞表面 CD44受体过量表达 的肿瘤。
[0045] 由于上述方案的实施， 本发明与现有技术相比， 具有以下优点：
1. 本发明首次公开了基于透明质酸两亲聚合物的药物载体， 药物包覆率高、 体内循环稳定， 药物利用 率高， 并且生物相容性好， 副作用小， 可方便排出体外。
2. 本发明公开的基于透明质酸两亲聚合物的疏水部分为硫辛酰基，通过自组装以及交联作用可以得到 稳定的交联纳米粒子， 该纳米粒子在细胞外和血液中不易解离， 从而保证纳米粒子包封的药物稳定， 增加 药物体内循环时间； 克服了现有技术中药物在体内易被泄漏、 运载效率低的缺陷； 并且该纳米粒子具有还 原敏感性， 在还原性环境中发生解交联， 释放药物， 有效将药物传递至目标组织。
3. 本发明公开的基于透明质酸两亲聚合物的药物载体亲水部分为透明质酸，可以主动靶向到肿瘤细胞 表面， 并通过受体介导的内吞作用进入到肿瘤细胞内， 有效增加细胞内吞能力， 克服了普通纳米载体细胞 摄取能力低的问题。
4. 本发明公开的基于透明质酸两亲聚合物的药物载体无需修饰靶向分子即可有效进入肿瘤细胞内，在 肿瘤部位的富集率高， 其中 HA-Lys-LA达到 12.71%ID/g， 而当侧链为 -NH-(CH2)n-NH-硫辛酰基时， 其在 肿瘤部位的富集率显著高于 HA-Lys-LA (即 HA-赖氨酸甲酯 -LA ) ， 尤其是 HA- (氨己基氨基） -LA达到 15.3%ID/g, 远高于现有技术的水平； 对肿瘤细胞、 耐药性肿瘤细胞和肿瘤干细胞都具有高细胞毒性。
5. 本发明公开的药物载体制备简单， 具有良好的生物相容性， 代谢产物对人体无害， 并且来源广泛， 重复单元中有多种官能团， 易于改性； 并且在肿瘤部分能快速解交联而解离， 药物快速释放出来， 从而产 生高效治疗作用， 在药物的控制释放上具有巨大应用潜力。
6、 本发明公开的基于透明质酸两亲聚合物的药物载体， 特别是当基于透明质酸两亲聚合物的侧链为 鸟氨酸硫辛酰基时， HA-DOX对 LP1肿瘤的治疗效果非常显著，如图 13A所示，与磷酸盐缓冲溶液（PBS ) 组相比， 经过 HA-DOX治疗 25天时， 有 2/5的肿瘤体积消失； 虽然自由药组也能达到类似效果， 但小鼠 对自由药不能耐受， 在大概 12天左右， 给自由药组的小鼠体重显著下降， 而 HA-DOX组与 PBS组对小鼠 体重影响接近， 给药 24天时体重变化仍然不显著 （如图 13C ) ； 结合图 13A和图 13D可进一步发现， 自 由药物给药 12 15天左右， 小鼠全部死亡， 而 HA-DOX组小鼠存活时间大于 50天， 说明 HA-DOX对小 鼠 LP1肿瘤具有高效治疗效果的同时， 小鼠耐受性好。
7、 本发明公开的基于透明质酸两亲聚合物的药物载体， 特别是载药的 HA-鸟氨酸甲酯 -LA交联纳米 粒子在肿瘤部位富集率高， 在小鼠体内循环时间长。
8、 本发明提供的基于透明质酸两亲聚合物的纳米粒子， 特别是当侧链为鸟氨酸、 鸟氨酸酯或其衍生 物硫辛酰基， -NH-(CH2)n-NH-硫辛酰基时， 所得到的纳米粒子粒径小， 平均粒径分布在 0.15以下。 并且， 由此制备的载药交联纳米粒子的药物包封率和载药量均比 HA-赖氨酸甲酯 -LA有显著的提高。 当理论载药 量为 20%， HA-赖氨酸甲酯 -LA (Mn/M = 35kDa， DS = 10%), 交联纳米粒子对阿霉素的包封率为 54.5%， 实 际载药量为 12%。 而相同载药量的情况下， HA-鸟氨酸甲酯 -LA (Mn/M = 35kDa， DS = 10%), 交联纳米粒 子对阿霉素的包封率可达 79.57%， 实际载药量高达 15.56%， HA-鸟氨酸 -LA (MnHA = 35kDa， DS = 10%), 交联纳米粒子对阿霉素的包封率可达 81.5%， 实际载药量高达 16.38%。
附图说明
[0046] 图 1 为实施例中聚合物 HA-Lys-LA 的合成路线图； 图 2 为实施例 15中 HA-Lys-LA交联纳米粒子在高倍稀释及高盐度条件下尺寸变化结果图； 图 3 为实施例 21中载有 DOX 的 HA-Lys-LA交联纳米粒子在谷胱甘肽触发下体外释放结果图； 图 4 为实施例 49 中载药 HA-Lys-LA 交联纳米粒子、 DOX 以及 HA 封闭的交联纳米粒子在
MCF-7/ADR细胞 （人乳腺癌细胞） 内的药物释放结果图；
图 5 为实施例 50中不同 HA-Lys-LA纳米粒子对 MCF-7/ADR细胞的细胞毒性结果图；
图 6 为实施例 54中载有 DOX 的 HA-Lys-LA交联纳米粒子在小鼠体内血液循环结果图； 图 7 为实施例 56中载有 Cy7 的 HA-Lys-LA交联纳米粒子在荷 MCF-7/ADR肿瘤裸鼠体内的活体成 像结果图；
图 8 为实施例 58中载有 DOX 的 HA-Lys-LA交联纳米粒子在荷 MCF-7/ADR肿瘤裸鼠各脏器的生 物分布结果图；
图 9 为实施例 59中载有 DOX 的 HA-Lys-LA交联纳米粒子在荷 MCF-7/ADR瘤的裸鼠体内的肿瘤 生长变化结果图；
图 10为 HA-Lys偶联物结构式及其1 H NMR (400 MHz, D20 ) 谱图；
图 11为实施例 24-27的制备通用路线；
图 12为实施例 28-34的制备通用路线；
图 13A-D为实施例 60中载有 DOX的 HA-Om-LA (HA-鸟氨酸 -LA)交联纳米粒子在荷 LP1肿瘤（多 发性骨髓瘤） 的裸鼠体内的肿瘤生长变化结果， 其中图 13A和图 13B为相对肿瘤体积变化图， 图 13C为 裸鼠相对体重变化图， 图 13D显示小鼠存活率；
图 14为实施例 61载 DOX 的 HA-鸟氨酸甲酯 -LA交联纳米粒子在小鼠体内循环结果图；
图 15为实施例 62载有 DOX的 HA- (氨己基氨基） -LA交联纳米粒子在荷 MCF-7/ADR肿瘤裸鼠各 脏器的生物分布结构图。 具体实施方式
[0047] 下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述：
[0048] 实施例 1合成聚合物透明质酸-赖氨酸甲酯-硫辛酸 （命名为 HA-Lys-LA) (M„aA=35 kDa, DS = 10%)
[0049] 图 1 为实施例中聚合物 HA-Lys-LA 的合成路线图。 首先， 于室温在 N- 叔丁氧羰基赖氨酸 甲酯盐酸盐（H-Lys(Boc)-OMexHCl ) (240 mg, 0.80 mmol)/无水甲醇溶液（2mL )中加入三乙胺 (85 mg, 0.84 mmol) 并搅拌 1 小时， 接着在透明质酸（HA) (300 mg, 0.79 mmol羧基）水溶液（6mL ) 中依次加入 1-(3- 二甲基氨丙基 )-3- 乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC) (460 mg, 2.40 mmol), N-羟基琥珀酰亚胺（NHS ) (140 mg, 1.22 mmol) 以及脱完盐酸盐的 N- 叔丁氧羰基赖氨酸甲酯盐酸盐（H-Lys(BOC)-OMe ) I 甲醇溶液并将整个 溶液的 pH调节至 8.5， 室温搅拌反应 24 小时后， 透析， 冻干得到透明质酸 -N- 叔丁氧羰基赖氨酸甲酯 ( HA-Lys(OMe)-Boc ) 。 在得到的 HA-Lys(OMe)-Boc 固体中依次加入三氟乙酸 /2M 盐酸 （v/v 1 ： 1 ) 共 6mL， 搅拌反应 6h, 脱保护结束后将溶液 pH调节至 7.0， 透析， 冻干， 产率 92%。 核磁结果表明其结构 为透明质酸-赖氨酸甲酯 （HA-Lys(OMe) ) ， 其中赖氨酸甲酯 （Lys(OMe) ) 的取代度 (DS) 为 10%。
[0050] 将硫辛酸 （12 mg, 58 μιηοΐ ) 溶解在 2.0 mL 二氯甲垸中， 加入到 25mL 的 Schlenk真空密封 瓶中， 通氮气条件下， 溶解在 l .O mL 的二氯甲垸中的 Ν,Ν'- 二环己基碳二亚胺（DCC ) ( 6 mg， 29μιηο1 ) 加入密封瓶中， 把瓶子放在 30°C的油浴中， 搅拌反应 22 小时后， 冷却， 过滤除去反应中生成的脲， 滤液 旋蒸， 除去溶剂后得到硫辛酸酐。
[0051] 将上面得到的硫辛酸酐溶解在 0.5mL 经过无水处理的 Ν,Ν'- 二甲基甲酰胺中。 氮气保护下， 于 50mL 的三口烧瓶中依次加入溶解在 5mL 甲酰胺中的 HA-Lys(OMe) ( 60mg, 27μιηο1氨基） ， 硫辛酸 酐及溶解在 0.5mLN,N'- 二甲基甲酰胺中的 4- 二甲氨基吡啶 （DMAP ) ( 4mg, 33μιηο1 ) ， 反应器放置在 30°C的油浴中， 搅拌反应 48 小时后， 依次在水 / 乙醇 （1/1 ) 及水中透析， 冻干， 产率 95%。 核磁结果表 明其结构为透明质酸-赖氨酸甲酯-硫辛酸 （HA-Lys-LA) ， 其中赖氨酸甲酯-硫辛酰基的取代度 (DS) 为 10%。
[0052] 实施例 2合成聚合物 HA-Lys-LA(M„/M =35kDa, DS = 5%)
[0053] 首先， 于室温在 H-Lys(Boc)-OMexHCl (120mg, 0.40mmol)/无水甲醇溶液 （2mL ) 中加入三 乙胺 (42mg, 0.42mmol) 并搅拌 1 小时， 接着在 HA (300mg, 0.79mmol羧基）水溶液 （6mL ) 中依次加入 EDC (460mg, 2.40mmol), NHS (140mg, 1.22mmol) 以及脱完盐酸盐的 H-Lys(Boc)-OMe/ 甲醇溶液并将整个 溶液的 pH 调节至 8.5， 室温搅拌反应 24 小时后， 透析， 冻干得到 HA-Lys(OMe)-BOC。 在得到的 HA-Lys(OMe)-Boc 固体中依次加入三氟乙酸 /2M盐酸 （v/v 1 ： 1 ) 共 6mL， 搅拌反应 6h, 脱保护结束后 将溶液 pH调节至 7.0，透析， 冻干， 产率 89%。核磁结果表明其结构为 HA-Lys(OMe)， 其中 Lys(OMe) 的 取代度 5%。
[0054] 将硫辛酸（12mg, 58μιηο1 )溶解在 2.0mL 二氯甲垸中， 加入到 25mL 的 Schlenk真空密封瓶 中， 通氮气条件下， 溶解在 l .OmL 的二氯甲垸中的 DCC ( 6mg， 29μιη01 )加入密封瓶中， 把瓶子放在 30°C 的油浴中， 搅拌反应 22 小时后， 冷却， 过滤除去反应中生成的脲， 滤液旋蒸， 除去溶剂后得到硫辛酸酐。
[0055] 将上面得到的硫辛酸酐溶解在 0.5mL 经过无水处理的 Ν,Ν'- 二甲基甲酰胺中。 氮气保护下， 于 50mL 的三口烧瓶中依次加入溶解在 5mL 甲酰胺中的 HA-Lys(OMe) ( 60mg, 14μιηο1氨基） ， 硫辛酸 酐及溶解在 0.5mL N,N'- 二甲基甲酰胺中的 4- 二甲氨基吡啶（4η¾, 33μιη01 ) ， 反应器放置在 30°C的油浴 中， 搅拌反应 48 小时后， 依次在水 / 乙醇 （1/1 ) 及水中透析， 冻干， 产率 93%。 核磁结果表明其结构为 HA-Lys-LA, 其中赖氨酸甲酯-硫辛酰基的取代度 5%。
[0056] 实施例 3合成聚合物 HA-Lys-LA( n//A =35kDa, DS = 28%)
[0057] 首先， 于室温在 H-Lys(Boc)-OMexHCl (480mg, 1.58mmol)/无水甲醇溶液 （2mL ) 中加入三 乙胺 (42mg, 0.42mmol) 并搅拌 1 小时， 接着在 HA (300mg, 0.79mmol羧基）水溶液 （6mL ) 中依次加入 EDC (460mg, 2.40mmol), NHS (140mg, 1.22mmol) 以及脱完盐酸盐的 H-Lys(Boc)-OMe/ 甲醇溶液并将整个 溶液的 pH 调节至 8.5， 室温搅拌反应 24 小时后， 透析， 冻干得到 HA-Lys(OMe)-BOC。 在得到的 HA-Lys(OMe)-Boc 固体中依次加入三氟乙酸 /2M盐酸 （v/v 1 ： 1 ) 共 6mL， 搅拌反应 6h, 脱保护结束后 将溶液 pH调节至 7.0，透析， 冻干， 产率 90%。核磁结果表明其结构为 HA-Lys(OMe)， 其中 Lys(OMe) 的 取代度 28%。
[0058] 将硫辛酸 （32mg, 152μιηο1) 溶解在 2.0mL 二氯甲垸中， 加入到 25mL 的 Schlenk真空密封 瓶中， 通氮气条件下， 溶解在 l.OmL 的二氯甲垸中的 DCC ( 16mg， 76μιηο1) 加入密封瓶中， 把瓶子放在 30°C的油浴中， 搅拌反应 22 小时后， 冷却， 过滤除去反应中生成的脲， 滤液旋蒸， 除去溶剂后得到硫辛 酸酐。
[0059] 将上面得到的硫辛酸酐溶解在 0.5mL 经过无水处理的 Ν,Ν'- 二甲基甲酰胺中。 氮气保护下， 于 50mL 的三口烧瓶中依次加入溶解在 5mL 甲酰胺中的 HA-Lys(OMe) ( 60mg, 76μιηο1氨基） ， 硫辛酸 酐及溶解在 0.5mL Ν,Ν'- 二甲基甲酰胺中的 4- 二甲氨基吡啶 （10mg, 83μιηο1) ， 反应器放置在 30°C的油 浴中， 搅拌反应 48 小时后， 依次在水 / 乙醇 （1/1 ) 及水中透析， 冻干， 产率 91%。 核磁结果表明其结构 为 HA-Lys-LA, 其中赖氨酸甲酯-硫辛酰基的取代度 28%。
[0060] 实施例 4合成聚合物 HA-Lys-LA( n//A = 8.9kDa， DS = 12%)
[0061] 首先， 于室温在 H-Lys(Boc)-OMexHCl (240mg, 0.80mmol)/无水甲醇溶液 （2mL ) 中加入三 乙胺 (85mg, 0.84mmol) 并搅拌 1 小时， 接着在 HA (300mg, 0.79mmol羧基）水溶液 （6mL ) 中依次加入 EDC (460mg, 2.40mmol), NHS (140mg, 1.22mmol) 以及脱完盐酸盐的 H-Lys(Boc)-OMe/ 甲醇溶液并将整个 溶液的 pH 调节至 8.5， 室温搅拌反应 24 小时后， 透析， 冻干得到 HA-Lys(OMe)-BOC。 在得到的 HA-Lys(OMe)-Boc 固体中依次加入三氟乙酸 /2M盐酸 （v/v 1 ： 1 ) 共 6mL， 搅拌反应 6h, 脱保护结束后 将溶液 pH调节至 7.0，透析， 冻干， 产率 92%。核磁结果表明其结构为 HA-Lys(OMe)， 其中 Lys(OMe) 的 取代度 12%。
[0062] 将硫辛酸（15mg, 70μιηο1)溶解在 2.0mL 二氯甲垸中， 加入到 25mL 的 Schlenk真空密封瓶 中， 通氮气条件下， 溶解在 l.OmL 的二氯甲垸中的 DCC ( 7mg， 35μιη01 )加入密封瓶中， 把瓶子放在 30°C 的油浴中， 搅拌反应 22 小时后， 冷却， 过滤除去反应中生成的脲， 滤液旋蒸， 除去溶剂后得到硫辛酸酐。
[0063] 将上面得到的硫辛酸酐溶解在 0.5mL 经过无水处理的 Ν,Ν'- 二甲基甲酰胺中。 氮气保护下， 于 50mL 的三口烧瓶中依次加入溶解在 5mL 甲酰胺中的 HA-Lys(OMe) ( 60mg, 32μιηο1氨基） ， 硫辛酸 酐及溶解在 0.5mLN,N'- 二甲基甲酰胺中的 4- 二甲氨基吡啶 （5mg, 40μιηΟ1) ， 反应器放置在 30°C的油浴 中， 搅拌反应 48 小时后， 依次在水 / 乙醇 （1/1 ) 及水中透析， 冻干， 产率 94%。 核磁结果表明其结构为 HA-Lys-LA, 其中赖氨酸甲酯-硫辛酰基的取代度 12%。
[0064] 实施例 5合成聚合物 HA-Lys-LA( n//A = 8.9kDa， DS = 10%)
[0065] 首先， 于室温在 H-Lys(Boc)-OMexHCl (240mg, 0.80mmol)/无水甲醇溶液 （2mL ) 中加入三 乙胺 (85mg, 0.84mmol) 并搅拌 1 小时， 接着在 HA (300mg, 0.79mmol羧基）水溶液 （6mL ) 中依次加入 EDC (460mg, 2.40mmol), NHS (140mg, 1.22mmol) 以及脱完盐酸盐的 H-Lys(Boc)-OMe/ 甲醇溶液并将整个 溶液的 pH 调节至 8.5， 室温搅拌反应 24 小时后， 透析， 冻干得到 HA-Lys(OMe)-BOC。 在得到的 HA-Lys(OMe)-Boc 固体中依次加入三氟乙酸 /2M盐酸 （v/v 1 : 1 ) 共 6mL， 搅拌反应 6h, 脱保护结束后 将溶液 pH调节至 7.0， 透析， 冻干得到 HA-Lys(OMe；)。
[0066] 将硫辛酸（12mg, 58μιηο1)溶解在 2.0mL 二氯甲垸中， 加入到 25mL 的 Schlenk真空密封瓶 中， 通氮气条件下， 溶解在 l.OmL 的二氯甲垸中的 DCC ( 0.384g, 1.86mmol) 加入密封瓶中， 把瓶子放 在 30°C的油浴中， 搅拌反应 22 小时后， 冷却， 过滤除去反应中生成的脲， 滤液旋蒸， 除去溶剂后得到硫 辛酸酐。
[0067] 将上面得到的硫辛酸酐溶解在 0.5mL 经过无水处理的 Ν,Ν'- 二甲基甲酰胺中。 氮气保护下， 于 50mL 的三口烧瓶中依次加入溶解在 5mL 甲酰胺中的 HA-Lys(OMe) ( 60mg, 27μιηο1氨基） ， 硫辛酸 酐及溶解在 0.5mL N,N'- 二甲基甲酰胺中的 4- 二甲氨基吡啶（4η¾, 33μιη01 ) ， 反应器放置在 30°C的油浴 中， 搅拌反应 48 小时后， 依次在水 / 乙醇 （1/1 ) 及水中透析， 冻干， 产率 95%。 核磁结果表明其结构为 HA-Lys-LA, 其中赖氨酸甲酯-硫辛酰基的取代度 10%。
[0068] 实施例 6合成聚合物 HA-Lys-LA(M„/M = 100kDa， DS = 10%)
[0069] 首先， 于室温在 H-Lys(Boc)-OMexHCl (240mg, 0.80mmol)/无水甲醇溶液 （2mL ) 中加入三 乙胺 (85mg, 0.84mmol) 并搅拌 1 小时， 接着在 HA (300mg, 0.79mmol羧基）水溶液 （6mL ) 中依次加入 EDC (460mg, 2.40mmol), NHS (140mg, 1.22mmol) 以及脱完盐酸盐的 H-Lys(Boc)-OMe/ 甲醇溶液并将整个 溶液的 pH 调节至 8.5， 室温搅拌反应 24 小时后， 透析， 冻干得到 HA-Lys(OMe)-BOC。 在得到的 HA-Lys(OMe)-Boc 固体中依次加入三氟乙酸 /2M盐酸 （v/v 1 ： 1 ) 共 6mL， 搅拌反应 6h, 脱保护结束后 将溶液 pH调节至 7.0，透析， 冻干， 产率 92%。核磁结果表明其结构为 HA-Lys(OMe)， 其中 Lys(OMe) 的 取代度 10%。
[0070] 将硫辛酸（12mg, 58μιηο1)溶解在 2.0mL 二氯甲垸中， 加入到 25mL 的 Schlenk真空密封瓶 中， 通氮气条件下， 溶解在 l.OmL 的二氯甲垸中的 DCC ( 6mg， 29μιη01 )加入密封瓶中， 把瓶子放在 30°C 的油浴中， 搅拌反应 22 小时后， 冷却， 过滤除去反应中生成的脲， 滤液旋蒸， 除去溶剂后得到硫辛酸酐。
[0071] 将上面得到的硫辛酸酐溶解在 0.5mL 经过无水处理的 Ν,Ν'- 二甲基甲酰胺中。 氮气保护下， 于 50mL 的三口烧瓶中依次加入溶解在 5mL 甲酰胺中的 HA-Lys(OMe) ( 60mg, 27μιηο1氨基） ， 硫辛酸 酐及溶解在 0.5mL N,N'- 二甲基甲酰胺中的 4- 二甲氨基吡啶（4η¾, 33μιη01 ) ， 反应器放置在 30°C的油浴 中， 搅拌反应 48 小时后， 依次在水 / 乙醇（1/1 )及水中透析， 冻干。核磁结果表明其结构为 HA-LyS-LA， 其中赖氨酸甲酯-硫辛酰基的取代度 10%。
[0072] 实施例 7合成聚合物 HA-Lys-LA(M„ M = 300kDa, DS = 10%)
[0073] 首先， 于室温在 H-Lys(Boc)-OMexHCl (240mg, 0.80mmol)/无水甲醇溶液 （2mL ) 中加入三 乙胺 (85mg, 0.84mmol) 并搅拌 1 小时， 接着在 HA (300mg, 0.79mmol羧基）水溶液 （6mL ) 中依次加入 EDC (460mg, 2.40mmol), NHS (140mg, 1.22mmol) 以及脱完盐酸盐的 H-Lys(Boc)-OMe/ 甲醇溶液并将整个 溶液的 pH 调节至 8.5， 室温搅拌反应 24 小时后， 透析， 冻干得到 HA-Lys(OMe)-BOC。 在得到的 HA-Lys(OMe)-Boc 固体中依次加入三氟乙酸 /2M盐酸 （v/v 1 ： 1 ) 共 6mL， 搅拌反应 6h, 脱保护结束后 将溶液 pH调节至 7.0，透析， 冻干， 产率 92%。核磁结果表明其结构为 HA-Lys(OMe)， 其中 Lys(OMe) 的 取代度 10%。
[0074] 将硫辛酸（12mg, 58μιηο1)溶解在 2.0mL 二氯甲垸中， 加入到 25mL 的 Schlenk真空密封瓶 中， 通氮气条件下， 溶解在 l.OmL 的二氯甲垸中的 DCC ( 6mg， 29μιη01 )加入密封瓶中， 把瓶子放在 30°C 的油浴中， 搅拌反应 22 小时后， 冷却， 过滤除去反应中生成的脲， 滤液旋蒸， 除去溶剂后得到硫辛酸酐。
[0075] 将上面得到的硫辛酸酐溶解在 0.5mL 经过无水处理的 Ν,Ν'- 二甲基甲酰胺中。 氮气保护下， 于 50mL 的三口烧瓶中依次加入溶解在 5mL 甲酰胺中的 HA-Lys(OMe) ( 60mg, 27μιηο1氨基） ， 硫辛酸 酐及溶解在 0.5mL N,N'- 二甲基甲酰胺中的 4- 二甲氨基吡啶（4η¾, 33μιη01 ) ， 反应器放置在 30°C的油浴 中， 搅拌反应 48 小时后， 依次在水 / 乙醇 （1/1 ) 及水中透析， 冻干， 产率 95%。 核磁结果表明其结构为 HA-Lys-LA, 其中赖氨酸甲酯-硫辛酰基的取代度 10%。
[0076] 实施例 8 HA-Lys-LA( n//A= 35kDa, DS = 10%) 纳米粒子制备
[0077] 聚合物 HA-Lys-LA纳米粒子通过透析方法制备。具体过程是：将 5mg 聚合物 HA-Lys-LA(DS = 10%) 溶在 lmL 甲酰胺中， 在 25 °C搅拌条件下， 向其中滴加 4.0mL 磷酸盐缓冲溶液（ 10mM, pH 7.4 ) 。 得到的溶液搅拌 lh后， 装入预先准备好的透析袋中 （SPECTRA POR, MWCO:3500 ) ， 用磷酸盐缓冲溶液 ( lOmM, pH 7.4 ) 透析 24h。 纳米粒子平均粒径为 198 纳米， 粒径分布为 0.11。
[0078] 实施例 9
Figure imgf000014_0001
35kDa, DS = 5%)纳米粒子制备
[0079] 聚合物 HA-Lys-LA纳米粒子通过透析方法制备。具体过程是：将 5mg 聚合物 HA-Lys-LA(DS = 5%)溶在 lmL 甲酰胺中， 在 25 °C搅拌条件下， 向其中滴加 4.0mL 磷酸盐缓冲溶液 （10mM, pH 7.4 ) 。 得到的溶液搅拌 lh后， 装入预先准备好的透析袋中（SPECTRAPOR,MWCO: 3500)， 用磷酸盐缓冲溶液 (lOmM, pH 7.4) 透析 24h。 纳米粒子平均粒径为 237纳米， 粒径分布为 0.23。
[0080] 实施例 10
Figure imgf000015_0001
35kDa, DS = 28%)纳米粒子制备
[0081] 聚合物 HA-Lys-LA纳米粒子通过透析方法制备。具体过程是：将 5mg 聚合物 HA-Lys-LA(DS = 28%) 溶在 lmL 甲酰胺中， 在 25°C搅拌条件下， 向其中滴加 4.0mL 磷酸盐缓冲溶液（ 10mM, pH 7.4) 。 得到的溶液搅拌 lh后， 装入预先准备好的透析袋中（SPECTRAPOR,MWCO: 3500)， 用磷酸盐缓冲溶液 (lOmM, pH 7.4) 透析 24h。 纳米粒子平均粒径为 178 纳米， 粒径分布为 0.13。
[0082] 实施例 11 HA-Lys-LA (Mn/M=8.9kDa， DS = 5%) 纳米粒子制备
[0083] 聚合物 HA-Lys-LA纳米粒子通过透析方法制备。具体过程是：将 5mg 聚合物 HA-Lys-LA(DS = 5%)溶在 lmL 甲酰胺中， 在 25°C搅拌条件下， 向其中滴加 4.0mL 磷酸盐缓冲溶液 （lOmM, pH 7.4) 。 得到的溶液搅拌 lh后， 装入预先准备好的透析袋中（SPECTRAPOR,MWCO: 3500)， 用磷酸盐缓冲溶液 (lOmM, pH 7.4) 透析 24h。 纳米粒子平均粒径为 203 纳米， 粒径分布为 0.25。
[0084] 实施例 12 HA-Lys-LA (MnHA =8.9kDa， DS = 13%)纳米粒子制备
[0085] 聚合物 HA-Lys-LA纳米粒子通过透析方法制备。具体过程是：将 5mg 聚合物 HA-Lys-LA(DS = 13%) 溶在 lmL 甲酰胺中， 在 25°C搅拌条件下， 向其中滴加 4.0mL 磷酸盐缓冲溶液（ lOmM, pH 7.4) 。 得到的溶液搅拌 lh后， 装入预先准备好的透析袋中（SPECTRAPOR,MWCO: 3500)， 用磷酸盐缓冲溶液 (lOmM, pH 7.4) 透析 24h。 纳米粒子平均粒径为 185 纳米， 粒径分布为 0.09。
[0086] 实施例 13 HA-Lys-LA (MnHA =8.9kDa, DS = 25%)纳米粒子制备
[0087] 聚合物 HA-Lys-LA纳米粒子通过透析方法制备。具体过程是：将 5mg 聚合物 HA-Lys-LA(DS = 25%) 溶在 lmL 甲酰胺中， 在 25°C搅拌条件下， 向其中滴加 4.0mL 磷酸盐缓冲溶液（ lOmM, pH 7.4) 。 得到的溶液搅拌 lh后， 装入预先准备好的透析袋中（SPECTRAPOR,MWCO: 3500)， 用磷酸盐缓冲溶液 (lOmM, pH 7.4) 透析 24h。 纳米粒子平均粒径为 169 纳米， 粒径分布为 0.10。
[0088] 实施例 14 HA-Lys-LA ( n//A=35kDa, DS = 5%)纳米粒子交联
[0089] 为了得到交联的聚合物纳米粒子，将上述形成的聚合物纳米粒子（0.5 毫克 /毫升， 2 毫升） 溶液调节 pH 至 8.5， 并通氮气 10 分钟， 加入 lmg/mL l,4- 二硫代 -D, L- 苏丁醇 (DTT)4mL， 将混合液在 室温氮气保护条件下搅拌反应 24 小时。得到的交联的纳米粒子用磷酸盐缓冲溶液透析，除去没反应的 DTT。 交联的纳米粒子尺寸为 219 纳米， 粒径分布为 0.27。
[0090] 实施例 15 HA-Lys-LA (MnHA =35kDa, DS = 10%) 纳米粒子交联
[0091] 为了得到交联的聚合物纳米粒子，将上述形成的聚合物纳米粒子（0.5 毫克 /毫升， 2 毫升） 溶液调节 pH 至 8.5， 并通氮气 10 分钟， 加入 lmg/mL l,4- 二硫代 -D, L- 苏丁醇 (DTT)7mL， 将混合液在 室温氮气保护条件下搅拌反应 24 小时。得到的交联的纳米粒子用磷酸盐缓冲溶液透析，除去没反应的 DTT。 附图 2 为 HA-Lys-LA交联纳米粒子在高倍稀释（A )及高盐度（B )条件下尺寸变化结果， 可以看出交联 的纳米粒子尺寸为 175 纳米， 粒径分布为 0.12， 对高度稀释 （模拟静脉注射） ， 高盐度 （2 M ) ， 有显著 的稳定性。
[0092] 实施例 16 HA-Lys-LA (MnHA =35kDa, DS = 28%) 纳米粒子交联
[0093] 为了得到交联的聚合物纳米粒子，将上述形成的聚合物纳米粒子（0.5 毫克 /毫升， 2 毫升） 溶液调节 pH 至 8.5， 并通氮气 10 分钟， 加入 lmg/mL l,4- 二硫代 -D, L- 苏丁醇 (DTT)20mL， 将混合液在 室温氮气保护条件下搅拌反应 24 小时。得到的交联的纳米粒子用磷酸盐缓冲溶液透析，除去没反应的 DTT。 交联的纳米粒子尺寸为 152 纳米， 粒径分布为 0.16。
[0094] 实施例 17 HA-Lys-LA (MnHA =8.9kDa, DS = 5%) 纳米粒子交联
[0095] 为了得到交联的聚合物纳米粒子，将上述形成的聚合物纳米粒子（0.5 毫克 /毫升， 2 毫升） 溶液调节 pH 至 8.5， 并通氮气 10 分钟， 加入 lmg/mL l,4- 二硫代 -D, L- 苏丁醇 (DTT)4mL， 将混合液在 室温氮气保护条件下搅拌反应 24 小时。得到的交联的纳米粒子用磷酸盐缓冲溶液透析，除去没反应的 DTT。 交联的纳米粒子尺寸为 199 纳米， 粒径分布为 0.23。
[0096] 实施例 18 HA-Lys-LA (MnHA =8.9kDa, DS = 13%)纳米粒子交联
[0097] 为了得到交联的聚合物纳米粒子，将上述形成的聚合物纳米粒子（0.5 毫克 /毫升， 2 毫升） 溶液调节 pH 至 8.5， 并通氮气 10 分钟， 加入 lmg/mL l,4- 二硫代 -D, L- 苏丁醇 (DTT)7mL， 将混合液在 室温氮气保护条件下搅拌反应 24 小时。得到的交联的纳米粒子用磷酸盐缓冲溶液透析，除去没反应的 DTT。 交联的纳米粒子尺寸为 164 纳米， 粒径分布为 0.11。
[0098] 实施例 19 HA-Lys-LA (MnHA =8.9kDa, DS = 25%)纳米粒子交联
[0099] 为了得到交联的聚合物纳米粒子，将上述形成的聚合物纳米粒子（0.5 毫克 /毫升， 2 毫升） 溶液调节 pH 至 8.5， 并通氮气 10 分钟， 加入 lmg/mL l,4- 二硫代 -D, L- 苏丁醇 (DTT)20mL， 将混合液在 室温氮气保护条件下搅拌反应 24 小时。得到的交联的纳米粒子用磷酸盐缓冲溶液透析，除去没反应的 DTT。 交联的纳米粒子尺寸为 148 纳米， 粒径分布为 0.23。
[00100] 实施例 20过量谷胱甘肽使交联的聚合物纳米粒子解交联 HA-Lys-LA (MnHA=35kOa, DS = 10%)
[00101] 氮气保护下， 将称好的谷胱甘肽（GSH )加到 2.0ml HA-Lys-LA聚合物交联纳米粒子（0.001 毫克 /毫升）的玻璃样品池中，使最终谷胱甘肽的浓度是 10mM， 同时设立的平行对照样品不含谷胱甘肽， 然后玻璃样品池用橡胶塞封住， 摇晃均匀， 置于 37°C恒温摇床（200rpm ) 中， 在选定时间、 37°C下， 通过 动态激光光散射 （DLS ) 来跟踪测定颗粒的粒径变化。 结果表明， 10mM谷胱甘肽作用 12 小时后交联纳 米粒子粒径从原来的 175 纳米增加到几千纳米， 稀释 1000 倍后粒径降至几纳米， 说明交联纳米粒子发生 解交联。
[00102] 实施例 21包裹小分子抗癌药物阿霉素及其谷胱甘肽触发释放
[00103] 将 HA-Lys-LA (M„a4 = 35kDa， DS = 5%, 10%, 28%)/ 甲酰胺溶液 (5mg/mL， lmL) 与阿霉 素 (DOX)/二甲亚砜 (5mg/mL， 0.25mL)混合搅拌 1 小时， 在 25 °C搅拌条件下， 向其中滴加 4mL 磷酸盐 缓冲溶液。 得到的溶液搅拌 lh后， 装入预先准备好的透析袋中 （SPECTRA/POR, MWCO: 3500) ， 用磷 酸盐缓冲溶液透析， 形成载药聚合物纳米粒子溶液。
[00104] 将形成的载药聚合物纳米粒子溶液取一半体积， 调节 pH至 8.5， 并通氮气 10 分钟， 加入 lmg/mL 1,4- 二硫代 -D, L- 苏丁醇 (DTT) 17.5mL， 将混合液在室温氮气保护条件下搅拌 24 小时。 交联的 载药纳米粒子溶液用磷酸盐缓冲溶液透析， 除去没反应的 DTT。
[00105] 把载有 DOX 的交联纳米粒子用 PBS ( 10mM, pH 7.4 )稀释 100 倍， 分成两份： 一个加入等 体积 GSH 的 PBS溶液 （10mM) ， 另一个只加入等体积的 PBS 溶液， 温度为 37°C， 这些溶液被马上分 别转移到透析袋中， 置于 37°C恒温摇床 （200rpm) 中。 前者被浸入 25mL 相同 GSH浓度， 相同温度的 PBS 中， 后者被浸入 25mL 相同温度的 PBS (20mM) 中， 到一定时间取 6mL 的透析袋外的透析液用来 测定其荧光强度， 并把 6mL 的相应的新鲜液体加入透析袋外。
[00106] DOX在聚合物纳米粒子中的包封率的确定：取一定量的交联和未交联的载药纳米粒子溶液， 先通过冷冻干燥法将溶液中的水除去， 然后加入 0.5mL 甲酰胺超声 lh 充分溶解冷冻干燥后的固体， 取该 溶液 20mL， 加入 3mL 甲酰胺， 通过荧光测试， 结合阿霉素的标准曲线计算包封率及载药量。
[00107] 包封率 = (纳米粒子中阿霉素的质量 /投入的阿霉素的质量） 100 %
载药量 = (纳米粒子中阿霉素的质量 /纳米粒子的质量与投入的阿霉素的质量总和） χ ΐοο % 当理论载药量为 20% 时， HA-Lys-LA1()交联纳米粒子对阿霉素的包封率为 54.5%，实际载药量为 12%。
[00108] 图 3 为载有 DOX 的 HA-Lys-LA交联纳米粒子在谷胱甘肽 ( GSH)触发下体外释放结果图。 结果表明： 载有 DOX 的交联纳米粒子在 10 mM GSH, 37°C下， 很快解交联， DOX在 22小时内释放出 约 86% ； 而载有 DOX 的交联纳米粒子在无 GSH条件下很稳定， 释放很少， 仅有 24%。
[00109] 实施例 22包裹小分子抗癌药物阿霉素及其谷胱甘肽触发释放
[00110] 将 HA-Lys-LA (M„a4 = 35kDa， DS = 40%)/ 甲酰胺溶液 (5mg/mL， lmL) 与阿霉素 (DOX)/二 甲亚砜 (5mg/mL， 0.25mL) 混合搅拌 1 小时， 在 25 °C搅拌条件下， 向其中滴加 4mL 磷酸盐缓冲溶液。 得 到的溶液搅拌 lh后， 装入预先准备好的透析袋中 （SPECTRA POR, MWCO: 3500 ) ， 用磷酸盐缓冲溶液 透析， 形成载药聚合物纳米粒子溶液。
[00111] 将形成的载药聚合物纳米粒子溶液取一半体积， 调节 pH至 8.5， 并通氮气 10 分钟， 加入 lmg/mL 1,4- 二硫代 -D, L- 苏丁醇 (DTT) 17.5mL， 将混合液在室温氮气保护条件下搅拌 24 小时。 交联的 载药纳米粒子溶液用磷酸盐缓冲溶液透析， 除去没反应的 DTT。
[00112] 把载有 DOX 的交联纳米粒子用 PBS ( 10mM, pH 7.4 )稀释 100 倍， 分成两份： 一个加入等 体积 GSH 的 PBS 溶液 （10mM) ， 另一个只加入等体积的 PBS 溶液， 温度为 37°C， 这些溶液被马上分 别转移到透析袋中， 置于 37°C恒温摇床 （200rpm) 中。 前者被浸入 25mL 相同 GSH浓度， 相同温度的 PBS 中， 后者被浸入 25mL 相同温度的 PBS (20mM) 中， 到一定时间取 6mL 的透析袋外的透析液用来 测定其荧光强度， 并把 6mL 的相应的新鲜液体加入透析袋外。
[00113] DOX在聚合物纳米粒子中的包封率的确定：取一定量的交联和未交联的载药纳米粒子溶液， 先通过冷冻干燥法将溶液中的水除去， 然后加入 0.5mL 甲酰胺超声 lh 充分溶解冷冻干燥后的固体， 取该 溶液 20mL， 加入 3mL 甲酰胺， 通过荧光测试， 结合阿霉素的标准曲线计算包封率及载药量。
[00114] 包封率 = (纳米粒子中阿霉素的质量 /投入的阿霉素的质量） 100 %
载药量 = (纳米粒子中阿霉素的质量 /纳米粒子的质量与投入的阿霉素的质量总和） χ ΐοο % 当理论载药量为 25% 时， HA-Lys-LA4。交联纳米粒子对阿霉素的包封率为 74.5%，实际载药量为 20%。
[00115] 载有 DOX 的交联纳米粒子在 10 mM GSH、 37°C下， 很快解交联， DOX在 22 小时内释放 出约 78% ； 而载有 DOX 的交联纳米粒子在无 GSH条件下很稳定， 释放很少， 仅有 19%。
[00116] 实施例 23: 包裹小分子抗癌药物紫杉醇 （PTX ) 及其 DTT触发释放
[00117] 将 HA-Lys-LA (M„a4 = 35kDa， DS = 10%)/ 甲酰胺溶液 (5mg/mL， lmL) 与 ΡΤΧ/Ν,Ν'- 二甲 基甲酰胺 (5mg/mL， 0.25mL) 混合搅拌 1 小时， 在 25 °C搅拌条件下， 向其中滴加 4mL磷酸盐缓冲溶液。 得到的溶液搅拌 lh后， 装入预先准备好的透析袋中 （SPECTRA POR, MWCO: 3500 ) ， 用磷酸盐缓冲溶 液透析。
[00118] 将形成的载药聚合物纳米粒子溶液取一半体积， 调节 pH至 8.5， 并通氮气 10 分钟， 加入 lmg/mL 1,4- 二硫代 -D, L- 苏丁醇 (DTT) 17.5mL， 将混合液在室温氮气保护条件下搅拌 24 小时。 交联的 载药纳米粒子溶液用磷酸盐缓冲溶液透析， 除去没反应的 DTT。
[00119] 把载有 PTX 的交联 NPs (纳米粒子， nanoparticles) 用 PBS ( 10mM, pH 7.4 )稀释 100 倍， 分成两份：一个加入等体积 DTT 的 PBS 溶液（10mM)，另一个只加入等体积的 PBS 溶液，温度为 37°C， 这些溶液被马上分别转移到透析袋中， 置于 37°C恒温摇床（200rpm) 中。 前者被浸入 25mL 相同 DTT 浓 度， 相同温度的 PBS 中， 后者被浸入 25mL相同温度的 PBS ( 10mM) 中， 到一定时间点取 6mL 的透析 袋外的透析液用来测定其释放药物浓度， 并把 6mL 的相应的新鲜液体加入透析袋外。
[00120] PTX在聚合物纳米粒子中的包封率的确定： 取一定量的交联和未交联的载药纳米粒子溶液， 先通过冷冻干燥法将溶液中的水除去， 然后加入 0.5mL 乙腈超声 lh， 过滤， 通过高效液相色谱检测， 以 乙腈和水混合物 （1/1, v/v) 作为流动相， 测试在 227nm 处的吸收强度并结合紫杉醇的标准曲线计算包封 率。
[00121] 包封率 = (纳米粒子中紫杉醇的质量 /投入的紫杉醇的质量） 100 %
载药量 = (纳米粒子中紫杉醇的质量 /纳米粒子的质量与投入的紫杉醇的质量总和） χ ΐοο % 结果表明： PTX不影响纳米粒子的形成且尺寸基本不变， 且当理论载药量为 30% 时， HA-Lys-LA10 交联纳米粒子对紫杉醇的包封率为 67.2%，实际载药量为 22%。载有 PTX 的交联纳米粒子在 10mM DTT、 37°C下， 很快解交联， PTX在 22 小时内释放出约 82%。
[00122] 实施例 24合成聚合物 HA- (氨乙基氨基） -LA (Μη/Μ =8.9kDa， DS = 5%) 的方法
[00123] 首先， 于室温在 NH2-CH2CH2NH(Boc)'HCl (64.08mg, 0.40mmol)/无水甲醇溶液 （2mL ) 中加 入三乙胺 (42.5mg, 0.42mmol) 并搅拌 1小时， 接着在 HA (300mg, 0.79mmol羧基） 水溶液 （6mL ) 中依次 加入 EDC (460mg, 2.40mmol)， NHS (140mg, 1.22mmol) 以及脱完盐酸盐的 NH2-CH2CH2NH(Boc)/甲醇溶液 并将整个溶液的 pH调节至 8.5， 室温搅拌反应 24小时后， 透析， 冻干得到 HA- NHCH2CH2NH-Boc。在得 到的 HA- NHCH2CH2NH-Boc固体中依次加入三氟乙酸 /2M盐酸 （v/v 1 : 1 ) 共 6mL， 搅拌反应 6h, 脱保护 结束后将溶液 pH调节至 7.0， 透析， 冻干得到 HA- NHCH2CH2NH2。
[00124] 将硫辛酸 （6η¾, 29μιηο1) 溶解在 l.OmL 二氯甲垸中， 加入到 13mL 的 Schlenk真空密封瓶 中， 通氮气条件下， 溶解在 0.5mL 的二氯甲垸中的 DCC ( 0.192g, 0.93mmol) 加入密封瓶中， 把瓶子放 在 30°C的油浴中， 搅拌反应 22 小时后， 冷却， 过滤除去反应中生成的脲， 滤液旋蒸， 除去溶剂后得到硫 辛酸酐。
[00125] 将上面得到的硫辛酸酐溶解在 0.5mL 经过无水处理的 Ν,Ν'-二甲基甲酰胺中。 氮气保护下， 于 50mL的三口烧瓶中依次加入溶解在 5mL 甲酰胺中的 HA-NHCH2CH2NH2 ( 114.4mg,15^ol氨基）， 硫 辛酸酐及溶解在 0.5mL Ν,Ν'-二甲基甲酰胺中的 4-二甲氨基吡啶 （2η¾,16.5μιηο1) ， 反应器放置在 30°C的 油浴中， 搅拌反应 48小时后， 依次在水 /乙醇 （1/1 ) 及水中透析， 冻干， 产率 97%。 核磁结果表明其结构 为 HA- (氨乙基氨基） -LA， 其中氨基乙基氨 -硫辛酰基的取代度 5%。
[00126] 实施例 25 合成聚合物 HA- (氨乙基氨基） -LA (Μη/Μ =100kDa, DS = 10%) 的方法
[00127] 首先， 于室温在 NH2-CH2CH2NH(Boc)'HCl (128.2mg, 0.80mmol) /无水甲醇溶液 （2mL ) 中加 入三乙胺 (85mg, 0.84mmol) 并搅拌 1小时， 接着在 HA (300mg, 0.79mmol羧基)水溶液（6mL ) 中依次加入 EDC (460mg, 2.40mmol), NHS (140mg, 1.22mmol) 以及脱完盐酸盐的 NH2-CH2CH2NH(Boc)/甲醇溶液并将 整个溶液的 pH调节至 8.5， 室温搅拌反应 24小时后， 透析， 冻干得到 HA-NHCH2CH2NH-Boc。 在得到的 HA-NHCH2CH2NH-Boc固体中依次加入三氟乙酸 /2M 盐酸 （v/v 1 : 1 ) 共 6mL， 搅拌反应 6h, 脱保护结束 后将溶液 pH调节至 7.0， 透析， 冻干， 产率 92%。 核磁结果表明其结构为 HA-NHCH2CH2NH2， 其中氨基 乙基氨的取代度 ιο%。
[00128] 将硫辛酸 （12mg, 58μιηο1 ) 溶解在 2.0mL二氯甲垸中， 加入到 25mL的 Schlenk真空密封瓶 中， 通氮气条件下， 溶解在 l.OmL的二氯甲垸中的 DCC ( 6mg， 29μιη01)加入密封瓶中， 把瓶子放在 30°C 的油浴中， 搅拌反应 22小时后， 冷却， 过滤除去反应中生成的脲， 滤液旋蒸， 除去溶剂后得到硫辛酸酐。
[00129] 将上面得到的硫辛酸酐溶解在 0.5mL 经过无水处理的 Ν,Ν'-二甲基甲酰胺中。 氮气保护下， 于 50mL的三口烧瓶中依次加入溶解在 5mL甲酰胺中的 HA-NHCH2CH2NH2 ( 103.6mg,27^ol氨基）， 硫 辛酸酐及溶解在 0.5mL N,N'-二甲基甲酰胺中的 4-二甲氨基吡啶 （4η¾,33μηι01) ， 反应器放置在 30°C的油 浴中， 搅拌反应 48小时后， 依次在水 /乙醇（1/1 )及水中透析， 冻干。 核磁结果表明其结构为 HA-氨乙基 氨基 -LA， 其中氨基乙基氨 -硫辛酰基的取代度 10%。
[00130] 实施例 26合成聚合物 HA- (氨乙基氨基） -!^ (^^^! =371^ 3， DS = 28%) 的方法
[00131] 首先， 于室温在]\[¾-( ¾( ¾ «1(80。)'11( 1 (310.711¾, 1.5811111101) /无水甲醇溶液 （211^) 中加 入三乙胺 (167.9mg, 1.66mmol) 并搅拌 1小时， 接着在 HA (300mg, 0.79mmol羧基)水溶液（6mL )中依次加 入 EDC (460mg, 2.40mmol)， NHS (140mg, 1.22mmol) 以及脱完盐酸盐的 NH2-CH2CH2NH(Boc)/甲醇溶液并 将整个溶液的 pH调节至 8.5， 室温搅拌反应 24小时后， 透析， 冻干得到 HA-NHCH2CH2NH-Boc。 在得到 的 HA-NHCH2CH2NH-Boc固体中依次加入三氟乙酸 /2M盐酸 （v/v 1 : 1 ) 共 6mL， 搅拌反应 6h, 脱保护结 束后将溶液 pH调节至 7.0， 透析， 冻干， 产率 92%。 核磁结果表明其结构为 HA- NHCH2CH2NH2， 其中 氨基乙基氨的取代度 28%。
[00132] 将硫辛酸（32mg, 152μιηο1 )溶解在 2.0mL二氯甲垸中， 加入到 25mL的 Schlenk真空密封瓶 中，通氮气条件下，溶解在 l.OmL的二氯甲垸中的 DCC ( 16mg， 76μιηο1)加入密封瓶中，把瓶子放在 30°C 的油浴中， 搅拌反应 22小时后， 冷却， 过滤除去反应中生成的脲， 滤液旋蒸， 除去溶剂后得到硫辛酸酐。
[00133] 将上面得到的硫辛酸酐溶解在 0.5mL 经过无水处理的 Ν,Ν'-二甲基甲酰胺中。 氮气保护下， 于 50mL的三口烧瓶中依次加入溶解在 5mL甲酰胺中的 HA- NHCH2CH2NH2 ( 106mg, 76μιηο1氨基） ， 硫 辛酸酐及溶解在 0.5mL N,N'- 二甲基甲酰胺中的 4-二甲氨基吡啶（ 10mg, 83μιηο1) ， 反应器放置在 30°C的 油浴中， 搅拌反应 48小时后， 依次在水 /乙醇 （1/1 )及水中透析， 冻干。 核磁结果表明其结构为 HA-氨乙 基氨基 -LA， 其中氨基乙基氨 -硫辛酰基的取代度 28%。
[00134] 实施例 27合成聚合物 HA- (氨己基氨基） -LA (Μη/Μ =400kDa， DS = 40%) 的方法
[00135] 首先， 于室温在^¾-(( ¾( ¾)3^1(80(^11( 1 (310.711¾, 1.5811111101) /无水甲醇溶液 （211^) 中 加入三乙胺 (167.9mg, 1.66mmol) 并搅拌 1小时， 接着在 HA (300mg, 0.79mmol羧基)水溶液（6mL)中依次 加入 EDC (460mg, 2.40mmol)， NHS (140mg, 1.22mmol) 以及脱完盐酸盐的 NH2-(CH2CH2)3NH(Boc)/甲醇溶 液并将整个溶液的 pH调节至 8.5， 室温搅拌反应 96小时后， 透析， 冻干得到 HA-NH(CH2CH2)3NH-Boc。 在得到的 HA-NH(CH2CH2)3NH-Boc固体中依次加入三氟乙酸 /2M 盐酸（v/v 1 : 1 )共 6mL，搅拌反应 6h, 脱 保护结束后将溶液 pH调节至 7.0，透析，冻干，产率 89%。核磁结果表明其结构为 HA-NH(CH2CH2)3NH2， 其中氨己基氨的取代度 40%。
[00136] 将硫辛酸（32mg, 152μιηο1 )溶解在 2.0mL二氯甲垸中， 加入到 25mL的 Schlenk真空密封瓶 中，通氮气条件下，溶解在 l.OmL的二氯甲垸中的 DCC ( 16mg， 76μιηο1)加入密封瓶中，把瓶子放在 30°C 的油浴中， 搅拌反应 22小时后， 冷却， 过滤除去反应中生成的脲， 滤液旋蒸， 除去溶剂后得到硫辛酸酐。
[00137] 将上面得到的硫辛酸酐溶解在 0.5mL 经过无水处理的 Ν,Ν'-二甲基甲酰胺中。 氮气保护下， 于 50mL的三口烧瓶中依次加入溶解在 5mL甲酰胺中的 HA-NH(CH2CH2)3NH2 ( 79mg, 76μιηο1氨基）， 硫 辛酸酐及溶解在 0.5mL N,N'- 二甲基甲酰胺中的 4-二甲氨基吡啶（ 10mg, 83μιηο1) ， 反应器放置在 30°C的 油浴中， 搅拌反应 48小时后， 依次在水 /乙醇 （1/1 )及水中透析， 冻干。 核磁结果表明其结构为 HA-氨己 基氨基 -LA， 其中氨己基氨-硫辛酰基的取代度 40%。
[00138] 实施例 28合成聚合物 HA-鸟氨酸 -LA (MnHA =8.9kDa, DS = 10% ) 的方法
[00139] 首先，于室温在 Om(Boc)'HCl (215mg, 0.80mmol) /无水甲醇溶液（2mL)中加入三乙胺 (85mg, 0.84mmol) 并搅拌 1小时， 接着在 HA (300mg, 0.79mmol羧基)水溶液 （6mL ) 中依次加入 EDC (460mg, 2.40mmol), NHS (140mg, 1.22mmol) 以及脱完盐酸盐的 Om(Boc)/甲醇溶液并将整个溶液的 pH调节至 8.5， 室温搅拌反应 24小时后， 透析， 冻干得到 HA-Om(Boc；)。在得到的 HA-Om(Boc)固体中依次加入三氟乙酸 /2M 盐酸（v/v 1: 1 )共 6mL， 搅拌反应 6h,脱保护结束后将溶液 pH调节至 7.0， 透析， 冻干， 产率 92%。 核磁结果表明其结构为 HA- Om， 其中鸟氨酸 （Om) 的取代度 10%。
[00140] 将硫辛酸 （12mg, 58μιηο1 ) 溶解在 2.0mL二氯甲垸中， 加入到 25mL的 Schlenk真空密封瓶 中， 通氮气条件下， 溶解在 l.OmL的二氯甲垸中的 DCC ( 6mg， 29μιη01)加入密封瓶中， 把瓶子放在 30°C 的油浴中， 搅拌反应 22小时后， 冷却， 过滤除去反应中生成的脲， 滤液旋蒸， 除去溶剂后得到硫辛酸酐。
[00141] 将上面得到的硫辛酸酐溶解在 0.5mL 经过无水处理的 Ν,Ν'-二甲基甲酰胺中。 氮气保护下， 于 50mL的三口烧瓶中依次加入溶解在 5mL甲酰胺中的 HA-Om ( 105.2η¾,27μιηο1 氨基）， 硫辛酸酐及溶 解在 0.5mL N,N'- 二甲基甲酰胺中的 4-二甲氨基吡啶（4η¾,33μηι01)， 反应器放置在 30°C的油浴中， 搅拌 反应 48小时后， 依次在水 /乙醇（1/1 )及水中透析， 冻干。 核磁结果表明其结构为 HA-0m-LA， 其中鸟氨 酸-硫辛酰基的取代度 10%。
[00142] 实施例 29合成聚合物 HA-鸟氨酸 -LA {MnHA =8.9kDa, DS = 28% ) 的方法
[00143] 首先， 于室温在 Om(Boc)'HCl (424.6mg, 1.58mmol) /无水甲醇溶液 （2mL ) 中加入三乙胺 (167.9mg, 1.66mmol) 并搅拌 1小时， 接着在 HA (300mg, 0.79mmol羧基)水溶液 （6mL ) 中依次加入 EDC (460mg, 2.40mmol), NHS (140mg, 1.22mmol) 以及脱完盐酸盐的 Orn(Boc)/甲醇溶液并将整个溶液的 pH调 节至 8.5， 室温搅拌反应 24小时后， 透析， 冻干得到 HA-Om(Boc；)。 在得到的 HA-Om(Boc)固体中依次加 入三氟乙酸 /2M 盐酸（v/v l : l )共 6mL， 搅拌反应 6h, 脱保护结束后将溶液 pH调节至 7.0， 透析， 冻干， 产率 92%。 核磁结果表明其结构为 HA-Om， 其中鸟氨酸的取代度 28%。
[00144] 将硫辛酸（32mg, 152μιηο1 )溶解在 2.0mL二氯甲垸中， 加入到 25mL的 Schlenk真空密封瓶 中，通氮气条件下， 溶解在 l.OmL的二氯甲垸中的 DCC ( 16mg， 76μιη01)加入密封瓶中，把瓶子放在 30°C 的油浴中， 搅拌反应 22小时后， 冷却， 过滤除去反应中生成的脲， 滤液旋蒸， 除去溶剂后得到硫辛酸酐。
[00145] 将上面得到的硫辛酸酐溶解在 0.5mL 经过无水处理的 Ν,Ν'-二甲基甲酰胺中。 氮气保护下， 于 50mL的三口烧瓶中依次加入溶解在 5mL甲酰胺中的 HA-Om ( 110.7mg, 76μιηο1氨基） ， 硫辛酸酐及 溶解在 0.5mL Ν,Ν'- 二甲基甲酰胺中的 4-二甲氨基吡啶 （ 10mg, 83μιηο1) ， 反应器放置在 30°C的油浴中， 搅拌反应 48小时后， 依次在水 /乙醇（1/1 )及水中透析， 冻干。 核磁结果表明其结构为 HA-Om-LA， 其中 鸟氨酸-硫辛酰基的取代度 28%。
[00146] 实施例 30合成聚合物 HA-鸟氨酸 -LA MnHA =100kDa, DS = 28% ) 的方法
[00147] 首先， 于室温在 Om(Boc)'HCl (424.6mg, 1.58mmol) /无水甲醇溶液 （2mL ) 中加入三乙胺 (167.9mg, 1.66mmol) 并搅拌 1小时， 接着在 HA (300mg, 0.79mmol羧基)水溶液 （6mL ) 中依次加入 EDC (460mg, 2.40mmol), NHS (140mg, 1.22mmol) 以及脱完盐酸盐的 Orn(Boc)/甲醇溶液并将整个溶液的 pH调 节至 8.5， 室温搅拌反应 24小时后， 透析， 冻干得到 HA-Om(Boc；)。 在得到的 HA-Om(Boc)固体中依次加 入三氟乙酸 /2M 盐酸（v/v l : l )共 6mL， 搅拌反应 6h, 脱保护结束后将溶液 pH调节至 7.0， 透析， 冻干， 产率 92%。 核磁结果表明其结构为 HA-Om， 其中鸟氨酸的取代度 28%。
[00148] 将硫辛酸（32mg, 152μιηο1 )溶解在 2.0mL二氯甲垸中， 加入到 25mL的 Schlenk真空密封瓶 中，通氮气条件下， 溶解在 l.OmL的二氯甲垸中的 DCC ( 16mg， 76μιη01)加入密封瓶中，把瓶子放在 30°C 的油浴中， 搅拌反应 22小时后， 冷却， 过滤除去反应中生成的脲， 滤液旋蒸， 除去溶剂后得到硫辛酸酐。
[00149] 将上面得到的硫辛酸酐溶解在 0.5mL 经过无水处理的 Ν,Ν'-二甲基甲酰胺中。 氮气保护下， 于 50mL的三口烧瓶中依次加入溶解在 5mL甲酰胺中的 HA-Om ( 110.7mg, 76μιηο1氨基） ， 硫辛酸酐及 溶解在 0.5mL Ν,Ν'- 二甲基甲酰胺中的 4-二甲氨基吡啶 （ 10mg, 83μιηο1) ， 反应器放置在 30°C的油浴中， 搅拌反应 48小时后， 依次在水 /乙醇（1/1 )及水中透析， 冻干。 核磁结果表明其结构为 HA-Om-LA， 其中 鸟氨酸-硫辛酰基的取代度 28%。
[00150] 实施例 31 合成聚合物 HA-鸟氨酸 -LA iMnHA =300kDa, DS = 40% ) 的方法 [00151] 首先， 于室温在 Om(Boc)'HCl (424.6mg, 1.58mmol) /无水甲醇溶液 （2mL ) 中加入三乙胺 (167.9mg, 1.66mmol) 并搅拌 1小时， 接着在 HA (300mg, 0.79mmol羧基)水溶液 （6mL ) 中依次加入 EDC (460mg, 2.40mmol), NHS (140mg, 1.22mmol) 以及脱完盐酸盐的 Orn(Boc)/甲醇溶液并将整个溶液的 pH调 节至 8.5， 室温搅拌反应 96小时后， 透析， 冻干得到 HA-Om(Boc；)。 在得到的 HA-Om(Boc)固体中依次加 入三氟乙酸 /2M 盐酸（v/v l : l )共 6mL， 搅拌反应 6h, 脱保护结束后将溶液 pH调节至 7.0， 透析， 冻干， 产率 89%。 核磁结果表明其结构为 HA-Om， 其中鸟氨酸的取代度 40%。
[00152] 将硫辛酸（32mg, 152μιηο1 )溶解在 2.0mL二氯甲垸中， 加入到 25mL的 Schlenk真空密封瓶 中，通氮气条件下， 溶解在 l .OmL的二氯甲垸中的 DCC ( 16mg， 76μιη01 )加入密封瓶中，把瓶子放在 30°C 的油浴中， 搅拌反应 22小时后， 冷却， 过滤除去反应中生成的脲， 滤液旋蒸， 除去溶剂后得到硫辛酸酐。
[00153] 将上面得到的硫辛酸酐溶解在 0.5mL 经过无水处理的 Ν,Ν'-二甲基甲酰胺中。 氮气保护下， 于 50mL的三口烧瓶中依次加入溶解在 5mL甲酰胺中的 HA-Om ( 79.8mg, 76μιηο1氨基） ， 硫辛酸酐及溶 解在 0.5mL N,N'- 二甲基甲酰胺中的 4-二甲氨基吡啶 （ 10mg, 83μιη01 ) ， 反应器放置在 30°C的油浴中， 搅 拌反应 48小时后， 依次在水 /乙醇（1/1 )及水中透析， 冻干。 核磁结果表明其结构为 HA-Om-LA， 其中鸟 氨酸-硫辛酰基的取代度 40%。
[00154] 实施例 32合成聚合物 HA-鸟氨酸乙酯 -LA MnHA =8.9kDa, DS = 5% ) 的方法
[00155] 首先， 于室温在 Om(Boc)-OEt'HCl (107.5mg, 0.40mmol)/无水甲醇溶液（2mL ) 中加入三乙胺 (42.5mg, 0.42mmol) 并搅拌 1小时， 接着在 HA (300mg, 0.79mmol羧基） 水溶液 （6mL ) 中依次加入 EDC (460mg, 2.40mmol), NHS (140mg, 1.22mmol) 以及脱完盐酸盐的 Om(Boc)-OEt/甲醇溶液并将整个溶液的 pH 调节至 8.5， 室温搅拌反应 24小时后， 透析， 冻干得到 HA- Om(Boc)-OEt。 在得到的 HA- Orn(Boc)-OEt 固体中依次加入三氟乙酸 /2M盐酸 （v/v l : l ) 共 6mL， 搅拌反应 6h, 脱保护结束后将溶液 pH调节至 7.0， 透析， 冻干得到 HA-OmCOEt；)。
[00156] 将硫辛酸 （6η¾, 29μιηο1 ) 溶解在 l .OmL 二氯甲垸中， 加入到 13mL 的 Schlenk真空密封瓶 中， 通氮气条件下， 溶解在 0.5mL 的二氯甲垸中的 DCC ( 0.192g, 0.93mmol ) 加入密封瓶中， 把瓶子放 在 30°C的油浴中， 搅拌反应 22 小时后， 冷却， 过滤除去反应中生成的脲， 滤液旋蒸， 除去溶剂后得到硫 辛酸酐。
[00157] 将上面得到的硫辛酸酐溶解在 0.5mL 经过无水处理的 Ν,Ν'-二甲基甲酰胺中。 氮气保护下， 于 50mL的三口烧瓶中依次加入溶解在 5mL 甲酰胺中的 HA-Om(OEt) ( 115.5η¾,15μιηο1氨基） ， 硫辛酸 酐及溶解在 0.5mL Ν,Ν'-二甲基甲酰胺中的 4-二甲氨基吡啶 （2η¾,16.5μηι01 ) ， 反应器放置在 30°C的油浴 中， 搅拌反应 48 小时后， 依次在水 /乙醇 （1/1 ) 及水中透析， 冻干， 产率 97%。 核磁结果表明其结构为 HA-Orn(OEt)-LA, 其中鸟氨酸乙酯-硫辛酰基的取代度 5%。
[00158] 实施例 33合成聚合物 HA-鸟氨酸甲酯 -LA iMnHA =35kDa, DS = 28% ) 的方法
[00159] 首先， 于室温在 Orn(Boc)-OMe X HCl (402.5mg, 1.58mmol) /无水甲醇溶液 （2mL) 中加入三 乙胺 (167.9mg, 1.66mmol) 并搅拌 1小时， 接着在 HA (300mg, 0.79mmol羧基)水溶液 （6mL ) 中依次加入 EDC (460mg, 2.40mmol), NHS (140mg, 1.22mmol) 以及脱完盐酸盐的 Om(Boc)-OMe/甲醇溶液并将整个溶 液的 pH 调节至 8.5， 室温搅拌反应 24 小时后， 透析， 冻干得到 HA-Om(Boc)-OMe。 在得到的 HA-Om(Boc)-OMe固体中依次加入三氟乙酸 /2M 盐酸（v/v 1 : 1 )共 6mL， 搅拌反应 6h, 脱保护结束后将溶 液 pH调节至 7.0， 透析， 冻干， 产率 92%。核磁结果表明其结构为 HA-Om(OMe)， 其中 Om(OMe)的取代 度 28%。
[00160] 将硫辛酸（32mg, 152μιηο1 )溶解在 2.0mL二氯甲垸中， 加入到 25mL的 Schlenk真空密封瓶 中，通氮气条件下，溶解在 l.OmL的二氯甲垸中的 DCC ( 16mg， 76μιηο1)加入密封瓶中，把瓶子放在 30°C 的油浴中， 搅拌反应 22小时后， 冷却， 过滤除去反应中生成的脲， 滤液旋蒸， 除去溶剂后得到硫辛酸酐。
[00161] 将上面得到的硫辛酸酐溶解在 0.5mL 经过无水处理的 Ν,Ν'-二甲基甲酰胺中。 氮气保护下， 于 50mL的三口烧瓶中依次加入溶解在 5mL甲酰胺中的 HA-Om(OMe) ( 110.6mg, 76μιηο1氨基） ， 硫辛酸 酐及溶解在 0.5mL N,N'- 二甲基甲酰胺中的 4-二甲氨基吡啶（ 10mg, 83μιη01) ， 反应器放置在 30°C的油浴 中，搅拌反应 48小时后，依次在水 /乙醇（ 1/1 )及水中透析，冻干。核磁结果表明其结构为 HA-Om(OMe)-LA， 其中鸟氨酸甲酯-硫辛酰基的取代度 28%。
[00162] 实施例 34合成聚合物 HA-鸟氨酸丁酯 -LA MnHA =500kDa, DS = 28% ) 的方法
[00163] 首先， 于室温在 Orn(Boc)-OBu X HCl (469.0mg, 1.58mmol) /无水甲醇溶液 （2mL ) 中加入三 乙胺 (167.9mg, 1.66mmol) 并搅拌 1小时， 接着在 HA (300mg, 0.79mmol羧基)水溶液 （6mL ) 中依次加入 EDC (460mg, 2.40mmol), NHS (140mg, 1.22mmol) 以及脱完盐酸盐的 Om(Boc)-OBu/甲醇溶液并将整个溶 液的 pH 调节至 8.5， 室温搅拌反应 24 小时后， 透析， 冻干得到 HA-Om(Boc)-OBu。 在得到的 HA-Om(Boc)-OBu固体中依次加入三氟乙酸 /2M 盐酸（v/v 1 : 1 )共 6mL， 搅拌反应 6h, 脱保护结束后将溶 液 pH调节至 7.0， 透析， 冻干， 产率 92%。 核磁结果表明其结构为 HA-Om(OBu)， 其中 Om(OBu)的取代 度 28%。
[00164] 将硫辛酸（32mg, 152μιηο1 )溶解在 2.0mL二氯甲垸中， 加入到 25mL的 Schlenk真空密封瓶 中，通氮气条件下，溶解在 l.OmL的二氯甲垸中的 DCC ( 16mg， 76μιηο1)加入密封瓶中，把瓶子放在 30°C 的油浴中， 搅拌反应 22小时后， 冷却， 过滤除去反应中生成的脲， 滤液旋蒸， 除去溶剂后得到硫辛酸酐。 [00165] 将上面得到的硫辛酸酐溶解在 0.5mL 经过无水处理的 Ν,Ν'-二甲基甲酰胺中。 氮气保护下， 于 50mL的三口烧瓶中依次加入溶解在 5mL甲酰胺中的 HA-Om(OBu) ( 113.8mg, 76μιηο1氨基） ， 硫辛酸 酐及溶解在 0.5mL N,N'- 二甲基甲酰胺中的 4-二甲氨基吡啶（ 10mg, 83μιη01 ) ， 反应器放置在 30°C的油浴 中，搅拌反应 48小时后，依次在水 /乙醇（1/1 )及水中透析，冻干。核磁结果表明其结构为 HA-Om(OBu)-LA， 其中鸟氨酸丁酯-硫辛酰基的取代度 28%。
[00166] 实施例 35: HA- (氨乙基氨基） -LA (Mn/M =37kDa， DS = 28%)纳米粒子的制备
[00167] 参考实施例 9的方法制备 HA- (氨乙基氨基） -LA (MnHA =37kDa， DS = 28%)纳米粒子， 纳米 粒子平均粒径为 132纳米， 粒径分布为 0.08。
[00168] 实施例 36: HA- (氨己基氨基） -LA (Mn/M =400kDa， DS = 40%)纳米粒子的制备
[00169] 参考实施例 9的方法制备 HA- (氨己基氨基） -LA (MniM =400kDa， DS = 40%)纳米粒子， 纳 米粒子平均粒径为 145纳米， 粒径分布为 0.11。
[00170] 实施例 37: HA-鸟氨酸 -LA iMnHA =100kDa, DS = 28% ) 纳米粒子的制备
[00171] 参考实施例 9的方法制备 HA-鸟氨酸 -LA (Mn/M =100kDa， DS = 28%) 纳米粒子， 纳米粒子 平均粒径为 140纳米， 粒径分布为 0.07。
[00172] 实施例 38: HA-鸟氨酸甲酯 -LA {MnHA =35kDa, DS = 28% ) 纳米粒子的制备
[00173] 参考实施例 9的方法制备 HA-鸟氨酸甲酯 -LA (M„H4 =35kDa， DS = 28% ) 纳米粒子， 纳米 粒子平均粒径为 148纳米， 粒径分布为 0.06。
[00174] 实施例 39: HA-鸟氨酸丁酯 -LA CMnHA =500kDa, DS = 28% ) 纳米粒子的制备
[00175] 参考实施例 9的方法制备 HA-鸟氨酸丁酯 -LA (M„H4 =500kDa， DS = 28% ) 纳米粒子， 纳米 粒子平均粒径为 151纳米， 粒径分布为 0.12。
[00176] 实施例 40: HA- (氨乙基氨基） -LA (Mn/M =37kDa， DS = 28%)纳米粒子交联
[00177] 为了得到交联的聚合物纳米粒子，将上述形成的聚合物纳米粒子（0.5 毫克 /毫升， 2 毫升） 溶液调节 pH 至 8.5， 并通氮气 10 分钟， 加入 lmg/mL l,4- 二硫代 -D, L- 苏丁醇 (DTT)20mL， 将混合液在 室温氮气保护条件下搅拌反应 24 小时。得到的交联的纳米粒子用磷酸盐缓冲溶液透析，除去没反应的 DTT。 交联的纳米粒子尺寸为 150 纳米， 粒径分布为 0.13， 对高度稀释 （模拟静脉注射） ， 高盐度 （2 M ) ， 有 显著的稳定性。
[00178] 实施例 41 : HA- (氨己基氨基） -LA (Mn/M =400kDa， DS = 40%)纳米粒子交联
[00179] 为了得到交联的聚合物纳米粒子，将上述形成的聚合物纳米粒子（0.5 毫克 /毫升， 2 毫升） 溶液调节 pH 至 8.5， 并通氮气 10 分钟， 加入 lmg/mL l,4- 二硫代 -D, L- 苏丁醇 (DTT)20mL， 将混合液在 室温氮气保护条件下搅拌反应 24 小时。得到的交联的纳米粒子用磷酸盐缓冲溶液透析，除去没反应的 DTT。 交联的纳米粒子尺寸为 149 纳米， 粒径分布为 0.13， 对高度稀释 （模拟静脉注射） ， 高盐度 （2 M) ， 有 显著的稳定性。
[00180] 实施例 42: HA-鸟氨酸 -LA {MnHA =100kDa, DS = 28% ) 纳米粒子交联
[00181] 为了得到交联的聚合物纳米粒子，将上述形成的聚合物纳米粒子（0.5 毫克 /毫升， 2 毫升） 溶液调节 pH 至 8.5， 并通氮气 10 分钟， 加入 lmg/mL l,4- 二硫代 -D, L- 苏丁醇 (DTT)20mL， 将混合液在 室温氮气保护条件下搅拌反应 24 小时。得到的交联的纳米粒子用磷酸盐缓冲溶液透析，除去没反应的 DTT。 交联的纳米粒子尺寸为 137纳米， 粒径分布为 0.08， 对高度稀释 （模拟静脉注射） ， 高盐度 （2 M) ， 有 显著的稳定性。
[00182] 实施例 43: HA-鸟氨酸甲酯 -LA (MnHA =35kDa, DS = 28% ) 纳米粒子交联
[00183] 为了得到交联的聚合物纳米粒子，将上述形成的聚合物纳米粒子（0.5 毫克 /毫升， 2 毫升） 溶液调节 pH 至 8.5， 并通氮气 10 分钟， 加入 lmg/mL l,4- 二硫代 -D, L- 苏丁醇 (DTT)20mL， 将混合液在 室温氮气保护条件下搅拌反应 24 小时。得到的交联的纳米粒子用磷酸盐缓冲溶液透析，除去没反应的 DTT。 交联的纳米粒子尺寸为 132 纳米， 粒径分布为 0.09， 对高度稀释 （模拟静脉注射） ， 高盐度 （2 M) ， 有 显著的稳定性。
[00184] 实施例 44: HA-鸟氨酸丁酯 -LA {MnHA =500kDa, DS = 28% ) 纳米粒子交联
[00185] 为了得到交联的聚合物纳米粒子，将上述形成的聚合物纳米粒子（0.5 毫克 /毫升， 2 毫升） 溶液调节 pH 至 8.5， 并通氮气 10 分钟， 加入 lmg/mL l,4- 二硫代 -D, L- 苏丁醇 (DTT)20mL， 将混合液在 室温氮气保护条件下搅拌反应 24 小时。得到的交联的纳米粒子用磷酸盐缓冲溶液透析，除去没反应的 DTT。 交联的纳米粒子尺寸为 141 纳米， 粒径分布为 0.14， 对高度稀释 （模拟静脉注射） ， 高盐度 （2 M) ， 有 显著的稳定性。
[00186] 实施例 45: 包裹小分子抗癌药物阿霉素 （DOX) 及其谷胱甘肽触发释放
[00187] 将 HA-鸟氨酸甲酯 -LA {MnHA =35kDa, DS = 28% , 10% ) /甲酰胺溶液 (5mg/mL， lmL) 与 阿霉素 (DOX)/二甲亚砜 (5mg/mL， 0.25mL) 混合搅拌 1 小时， 在 25 °C搅拌条件下， 向其中滴加 4mL 磷酸 盐缓冲溶液。 得到的溶液搅拌 lh后， 装入预先准备好的透析袋中 （SPECTRA POR, MWCO: 3500 ) ， 用 磷酸盐缓冲溶液透析， 形成载药聚合物纳米粒子溶液。
[00188] 将形成的载药聚合物纳米粒子溶液取一半体积， 调节 pH至 8.5， 并通氮气 10 分钟， 加入 lmg/mL 1,4-二硫代 -D, L-苏丁醇 (DTT) 17.5mL， 将混合液在室温氮气保护条件下搅拌 24 小时。 交联的载 药纳米粒子溶液用磷酸盐缓冲溶液透析， 除去没反应的 DTT。
[00189] 把载有 DOX的交联纳米粒子用 PBS ( 10mM, pH 7.4 ) 稀释 100倍， 分成两份： 一个加入等 体积 GSH的 PBS 溶液 （10mM) ， 另一个只加入等体积的 PBS 溶液， 温度为 37°C， 这些溶液被马上分 别转移到透析袋中， 置于 37°C恒温摇床（200rpm )中。前者被浸入 25mL相同 GSH浓度， 相同温度的 PBS 中， 后者被浸入 25mL相同温度的 PBS ( 20mM ) 中， 到一定时间取 6mL的透析袋外的透析液用来测定其 荧光强度， 并把 6mL 的相应的新鲜液体加入透析袋外。
[00190] DOX在聚合物纳米粒子中的包封率的确定：取一定量的交联和未交联的载药纳米粒子溶液， 先通过冷冻干燥法将溶液中的水除去， 然后加入 0.5mL甲酰胺超声 lh充分溶解冷冻干燥后的固体， 取该 溶液 20mL， 加入 3mL甲酰胺， 通过荧光测试， 结合阿霉素的标准曲线计算包封率及载药量。
包封率 = (纳米粒子中阿霉素的质量 /投入的阿霉素的质量） 100 %
载药量 = (纳米粒子中阿霉素的质量 /纳米粒子的质量与投入的阿霉素的质量总和） χ ΐοο %
[00191] 当理论载药量为 20% 时， HA-鸟氨酸甲酯 -LA (MnHA =35kDa, DS = 10% ) 交联纳米粒子对 阿霉素的包封率为 79.57%， 实际载药量为 15.56%。
[00192] 当理论载药量为 20% 时， HA-鸟氨酸甲酯 -LA (MnHA =35kDa, DS = 28% ) 交联纳米粒子对 阿霉素的包封率为 81.2%， 实际载药量为 16.24%。
[00193] 载有 DOX 的交联纳米粒子在 10 mM GSH、 37°C下， 很快解交联， DOX在 22小时内释放出 约 81% ； 而载有 DOX 的交联纳米粒子在无 GSH条件下很稳定， 释放很少， 仅有 16%。
[00194] 实施例 46: 包裹小分子抗癌药物阿霉素 （DOX) 及其谷胱甘肽触发释放
[00195] 将 HA-鸟氨酸 -LA (M„/M =35kDa， DS = 10% ) /甲酰胺溶液 (5mg/mL， lmL) 与阿霉素 (DOX)/ 二甲亚砜 (5mg/mL， 0.25mL) 混合搅拌 1 小时， 在 25 °C搅拌条件下， 向其中滴加 4mL磷酸盐缓冲溶液。 得到的溶液搅拌 lh后， 装入预先准备好的透析袋中 （SPECTRA POR, MWCO: 3500 ) ， 用磷酸盐缓冲溶 液透析， 形成载药聚合物纳米粒子溶液。
[00196] 将形成的载药聚合物纳米粒子溶液取一半体积， 调节 pH至 8.5， 并通氮气 10 分钟， 加入 lmg/mL 1,4-二硫代 -D, L-苏丁醇 (DTT) 17.5mL， 将混合液在室温氮气保护条件下搅拌 24 小时。 交联的载 药纳米粒子溶液用磷酸盐缓冲溶液透析， 除去没反应的 DTT。
[00197] 把载有 DOX的交联纳米粒子用 PBS ( 10mM, pH 7.4 ) 稀释 100倍， 分成两份： 一个加入等 体积 GSH的 PBS溶液 （10mM ) ， 另一个只加入等体积的 PBS溶液， 温度为 37°C， 这些溶液被马上分别 转移到透析袋中， 置于 37°C恒温摇床 QOOrpm ) 中。 前者被浸入 25mL相同 GSH浓度， 相同温度的 PBS 中， 后者被浸入 25mL相同温度的 PBS ( 20mM ) 中， 到一定时间取 6mL的透析袋外的透析液用来测定其 荧光强度， 并把 6mL 的相应的新鲜液体加入透析袋外。
[00198] DOX在聚合物纳米粒子中的包封率的确定：取一定量的交联和未交联的载药纳米粒子溶液， 先通过冷冻干燥法将溶液中的水除去， 然后加入 0.5mL甲酰胺超声 lh充分溶解冷冻干燥后的固体， 取该 溶液 20mL， 加入 3mL甲酰胺， 通过荧光测试， 结合阿霉素的标准曲线计算包封率及载药量。 包封率 = (纳米粒子中阿霉素的质量 /投入的阿霉素的质量） 100 %
载药量 = (纳米粒子中阿霉素的质量 /纳米粒子的质量与投入的阿霉素的质量总和） χ ΐοο %
[00199] 当理论载药量为 20% 时， HA-鸟氨酸 -LA (MnHA =35kDa， DS = 10%) 交联纳米粒子对阿霉 素的包封率为 81.5%， 实际载药量为 16.38%。
[00200] 载有 DOX 的交联纳米粒子在 10 mM GSH、 37°C下， 很快解交联， DOX在 22小时内释放出 约 82% ； 而载有 DOX 的交联纳米粒子在无 GSH条件下很稳定， 释放很少， 仅有 15%。
[00201] 实施例 47: 包裹小分子抗癌药物阿霉素及其谷胱甘肽触发释放
[00202] 将 HA- (氨己基氨基） -LA (Mn/M =400kDa， DS = 40%)/甲酰胺溶液 (5mg/mL， lmL) 与阿霉 素 (DOX)/二甲亚砜 (5mg/mL， 0.25mL) 混合搅拌 1 小时， 在 25 °C搅拌条件下， 向其中滴加 4mL 磷酸盐缓 冲溶液。 得到的溶液搅拌 lh后， 装入预先准备好的透析袋中 （SPECTRA POR, MWCO: 3500 ) ， 用磷酸 盐缓冲溶液透析， 形成载药聚合物纳米粒子溶液。
[00203] 将形成的载药聚合物纳米粒子溶液取一半体积， 调节 pH至 8.5， 并通氮气 10 分钟， 加入 lmg/mL 1,4-二硫代 -D, L-苏丁醇 (DTT) 17.5mL， 将混合液在室温氮气保护条件下搅拌 24 小时。 交联的载 药纳米粒子溶液用磷酸盐缓冲溶液透析， 除去没反应的 DTT。
[00204] 把载有 DOX的交联纳米粒子用 PBS ( 10mM, pH 7.4 ) 稀释 100倍， 分成两份： 一个加入等 体积 GSH的 PBS 溶液 （10mM ) ， 另一个只加入等体积的 PBS 溶液， 温度为 37°C， 这些溶液被马上分 别转移到透析袋中， 置于 37°C恒温摇床（200rpm )中。前者被浸入 25mL相同 GSH浓度， 相同温度的 PBS 中， 后者被浸入 25mL相同温度的 PBS ( 20mM ) 中， 到一定时间取 6mL的透析袋外的透析液用来测定其 荧光强度， 并把 6mL 的相应的新鲜液体加入透析袋外。
[00205] DOX在聚合物纳米粒子中的包封率的确定：取一定量的交联和未交联的载药纳米粒子溶液， 先通过冷冻干燥法将溶液中的水除去， 然后加入 0.5mL甲酰胺超声 lh充分溶解冷冻干燥后的固体， 取该 溶液 20mL， 加入 3mL甲酰胺， 通过荧光测试， 结合阿霉素的标准曲线计算包封率及载药量。
包封率 = (纳米粒子中阿霉素的质量 /投入的阿霉素的质量） 100 %
载药量 = (纳米粒子中阿霉素的质量 /纳米粒子的质量与投入的阿霉素的质量总和） χ ΐοο %
[00206] 当理论载药量为 20% 时， HA- (氨己基氨基） -LA (Mn/M =400kDa， DS = 40%)交联纳米粒子 对阿霉素的包封率为 79.8%， 实际载药量为 15.96%。
[00207] 载有 DOX 的交联纳米粒子在 10 mM GSH、 37°C下， 很快解交联， DOX在 22小时内释放出 约 83% ； 而载有 DOX 的交联纳米粒子在无 GSH条件下很稳定， 释放很少， 仅有 15%。
[00208] 实施例 48: 载 DOX 的 HA- (氨乙基氨基） -LA (Mn/M =37kDa， DS = 28%)交联纳米粒子
[00209] 将 HA- (氨乙基氨基） -LA (M„/M =37kDa， DS = 28%)/甲酰胺溶液 (5mg/mL， lmL) 与阿霉 素 (DOX)/二甲亚砜 (5mg/mL， 0.25mL) 混合搅拌 1 小时， 在 25 °C搅拌条件下， 向其中滴加 4mL 磷酸盐缓 冲溶液。 得到的溶液搅拌 lh后， 装入预先准备好的透析袋中 （SPECTRA POR, MWCO: 3500 ) ， 用磷酸 盐缓冲溶液透析， 形成载药聚合物纳米粒子溶液。
[00210] 将形成的载药聚合物纳米粒子溶液取一半体积， 调节 pH至 8.5， 并通氮气 10 分钟， 加入 lmg/mL 1,4-二硫代 -D, L-苏丁醇 (DTT) 17.5mL， 将混合液在室温氮气保护条件下搅拌 24 小时。 交联的载 药纳米粒子溶液用磷酸盐缓冲溶液透析， 除去没反应的 DTT。
[00211] 把载有 DOX的交联纳米粒子用 PBS ( 10mM, pH 7.4 ) 稀释 100倍， 分成两份： 一个加入等 体积 GSH的 PBS 溶液 （10mM ) ， 另一个只加入等体积的 PBS 溶液， 温度为 37°C， 这些溶液被马上分 别转移到透析袋中， 置于 37°C恒温摇床（200rpm )中。前者被浸入 25mL相同 GSH浓度， 相同温度的 PBS 中， 后者被浸入 25mL相同温度的 PBS ( 20mM ) 中， 到一定时间取 6mL的透析袋外的透析液用来测定其 荧光强度， 并把 6mL 的相应的新鲜液体加入透析袋外。
[00212] DOX在聚合物纳米粒子中的包封率的确定：取一定量的交联和未交联的载药纳米粒子溶液， 先通过冷冻干燥法将溶液中的水除去， 然后加入 0.5mL甲酰胺超声 lh充分溶解冷冻干燥后的固体， 取该 溶液 20mL， 加入 3mL甲酰胺， 通过荧光测试， 结合阿霉素的标准曲线计算包封率及载药量。
包封率 = (纳米粒子中阿霉素的质量 /投入的阿霉素的质量） 100 %
载药量 = (纳米粒子中阿霉素的质量 /纳米粒子的质量与投入的阿霉素的质量总和） χ ΐοο %
[00213] 当理论载药量为 20%时， HA- (氨乙基氨基） -LA (Mn/M =37kDa， DS = 28%)交联纳米粒子 对阿霉素的包封率为 63.5%， 实际载药量 12.7%。
[00214] 载有 DOX 的交联纳米粒子在 10 mM GSH、 37°C下， 很快解交联， DOX在 22小时内释放出 约 82% ； 而载有 DOX 的交联纳米粒子在无 GSH条件下很稳定， 释放很少， 仅有 16%。 生物学测定
[00215] 实施例 49载 DOX 的交联纳米粒子在细胞内的药物释放
[00216] 采用共聚焦激光扫描显微镜观察了载有 DOX 的 HA-Lys-LA (MnHA = 35kDa， DS = 10%, DLC = 12%) 交联纳米粒子在 CD44 受体表达多且对 DOX 具有耐药性的耐 DOX 的人乳腺癌细胞 (MCF-7/ADR) 中的细胞内吞和细胞内释放行为。 首先将 MCF-7/ADR细胞以 Ι χ ΙΟ5个 /孔的密度铺于细胞培养板中， 并 于 37°C，5%二氧化碳条件下，在含有 10%血清、 100 IU/mL 抗生素青霉素和 10(^g/mL 链霉素的 lmL1640 培养基中培养 24h，使细胞的单层覆盖率达到 70%。然后向每个孔中加入 200 载有 DOX 的 HA-Lys-LA 交联纳米粒子或自由 DOX溶液， 其中 DOX在孔中的最终浓度为 5.(^g/mL。 在 37°C， 5% 二氧化碳条件 下培养 10h后，移去培养基并用 PBS 溶液洗涤 3 次。接着用 4% 的多聚甲醛溶液固定 15 mm后用 PBS 溶 液清洗 3次。 接着用 FITC标记的鬼笔环肽对细胞骨架进行染色 lh， 并用 PBS 溶液清洗 3 次。 最后用 DAPI (4',6-二脒基 -2-苯基吲哚二盐酸盐）对细胞核进行染色 15mm， 并用 PBS 溶液清洗 3 次。封闭受体 实验时在加入载有 DOX的 HA-Lys-LA交联纳米粒子之前将自由的 HA溶液（5mg/mL )与细胞一起孵育 4h， 接下来的步骤如前所述。 制备好的样品采用共聚焦激光扫描显微镜进行观察和拍照。
[00217] 图 4 为载药 HA-Lys-LA交联纳米粒子、 DOX 以及 HA封闭的交联纳米粒子在 MCF-7/ADR 细胞内的药物释放结果图 （ I是载药纳米粒子， II是自由药， III是用自由 HA封闭的载药纳米粒子） 。 结 果表明： 载有 DOX 的 HA-Lys-LA交联纳米粒子可以很快被细胞内吞， 并在细胞内将 DOX释放出来， 培养 10h后，其细胞内 DOX 荧光几乎全部进入细胞核， 且强度要明显强于自由 DOX和自由 HA封闭的 对照组， 说明该纳米粒子有显著的靶向性和逆转肿瘤细胞耐药性的能力。
[00218] 实施例 50 HA-Lys-LA纳米粒子对 MCF-7/ADR细胞毒性测试
[00219] HA-Lys-LA 空纳米粒子 (Mn/M = 35kDa; DS =5%, 10%, 28%)在 MCF-7/ADR细胞中的毒性 通过 MTT 法测定。首先将 ΙΟΟμΙ^ 细胞的 1640悬浮液 (1640培养基中含 10%胎牛血清、 100IU/mL 青霉 素和 lOO /mL 链霉素）铺于 96 孔培养板中， 使细胞的最终密度为 1 >< 104个 /孔， 并置于 37°C， 5%二氧 化碳条件下培养 24h使单层细胞的覆盖率达到 70~80%。 然后向每孔中加入 20 不同浓度的 HA-Lys-LA 交联或未交联纳米粒子的 PBS 溶液， 使空纳米粒子在细胞孔中的最终浓度为 0.5 l.Omg/mLo 待继续培 养 24h后，向每孔中加入 20 3-(4,5- 二甲基噻唑 -2)-2,5- 二苯基四氮唑溴盐 (MTT) 的 PBS 溶液 (5mg/mL)， 并放入培养箱继续培养 4h 以使 MTT 与活细胞作用。随后移除含有 MTT 的培养液， 向每孔中加入 15(^L DMSO 以溶解活细胞与 MTT 产生的紫色甲瓒结晶， 并使用酶标仪 (BioTek) 测定每个孔在 570nm 处的吸 收。 细胞相对存活率通过与只有空白细胞的对照孔在 570nm 处的吸收相比得到。 实验数据均是平行四组 进行的。
细胞存活率(％)=(00570 样品 /OD570 对照) χ 100%
[00220] 载有 DOX 的 HA-Lys-LA
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= 35kDa; DS = 5%, 10%, 28%; DLC=11%, 12%, 15%) 的抗癌活性通过与上述空纳米粒子细胞毒性类似的方法进行测定。 将 100 MCF-7/ADR细胞的 1640 悬浮液铺于 96 孔培养板中， 使细胞的最终密度为 lxlO4个 /孔， 并置于 37°C， 5%二氧化碳条件下 培养 24h 使单层细胞的覆盖率达到 70~80%。 然后向每孔中加入 2(^L 载有 DOX 的取代度不同的 HA-Lys-LA 交联或未交联纳米粒子或自由 DOX 的 PBS 溶液， 使 DOX 在细胞孔中的最终浓度为 0.0023~150 /11^。 待继续培养 4h后， 去掉原有培养基补充等量新鲜培养基， 培养 44h后， 向每孔中加 入 2(^L MTT 溶液 (5mg/mL)， 并置于培养箱中培养 4h。 随后的实验处理及毒性的测定与上述一致。 封闭 受体实验时在加入载有 DOX 的 HA-Lys-LA交联纳米粒子之前将自由的 HA溶液（5mg/mL )与细胞一起 孵育 4h， 即完成 HA对肿瘤细胞的封闭， 接下来的步骤同上， 作为对照组。 [00221] 图 5 为不同 HA-Lys-LA 纳米粒子对 MCF-7/ADR 细胞的细胞毒性结果图。 结果表明： HA-Lys-LA交联纳米粒子具有良好的生物相容性，而载有 DOX 的交联纳米粒子具有抗肿瘤活性，且当取 代度为 10 %时其抗肿瘤活性达到最高， 因为当取代度太低时所形成的交联纳米粒子不太稳定，而过量修饰 透明质酸会影响其靶向能力。
[00222] 实施例 51 HA-Lys-LA纳米粒子对 MCF-7/ADR细胞毒性测试
[00223] HA-Lys-LA 空纳米粒子 (Mn/M = 35kDa, DS = 40%)在 MCF-7/ADR细胞中的毒性通过 MTT 法测定。 首先将 ΙΟΟμΙ^ 细胞的 1640 悬浮液 (1640 培养基中含 10% 胎牛血清、 100 IU/mL 青霉素和 100Mg/mL 链霉素） 铺于 96 孔培养板中， 使细胞的最终密度为 1 >< 104个 /孔， 并置于 37°C， 5%二氧化碳 条件下培养 24h使单层细胞的覆盖率达到 70~80%。 然后向每孔中加入 20 不同浓度的 HA-Lys-LA交 联或未交联纳米粒子的 PBS 溶液， 使空纳米粒子在细胞孔中的最终浓度为 0.5 l.Omg/mLo 待继续培养 24h后， 向每孔中加入 20μΙ^ 3-(4,5- 二甲基噻唑 -2)-2,5- 二苯基四氮唑溴盐 (ΜΤΤ) 的 PBS 溶液 (5mg/mL)， 并放入培养箱继续培养 4h 以使 MTT 与活细胞作用。随后移除含有 MTT 的培养液， 向每孔中加入 15(^L DMSO 以溶解活细胞与 MTT 产生的紫色甲瓒结晶， 并使用酶标仪 (BioTek) 测定每个孔在 570nm 处的吸 收。 细胞相对存活率通过与只有空白细胞的对照孔在 570nm 处的吸收相比得到。 实验数据均是平行四组 进行的。
细胞存活率(％)=(00570 样品 /OD570对照) χ 100%
[00224] 载有 DOX 的 HA-Lys-LA纳米粒子 (Mn/M = 35kDa, DS = 40%, DLC = 20%) 的抗癌活性通过 与上述空纳米粒子细胞毒性类似的方法进行测定。 将 ΙΟΟμΙ^ MCF-7/ADR细胞的 1640 悬浮液铺于 96 孔 培养板中， 使细胞的最终密度为 lxlO4个 /孔， 并置于 37°C， 5% 二氧化碳条件下培养 24h使单层细胞的 覆盖率达到 70~80%。然后向每孔中加入 20 载有 DOX 的取代度不同的 HA-Lys-LA交联或未交联纳米 粒子或自由 DOX 的 PBS 溶液，使 DOX在细胞孔中的最终浓度为 0.0023~150μ§/ηΛ。待继续培养 4h后， 去掉原有培养基补充等量新鲜培养基， 培养 44h后， 向每孔中加入 2(^L MTT 溶液 (5mg/mL)， 并置于培 养箱中培养 4h。 随后的实验处理及毒性的测定与上述一致。 封闭受体实验时在加入载有 DOX 的 HA-Lys-LA40交联纳米粒子之前将自由的 HA溶液 （5mg/mL ) 与细胞一起孵育 4h， 接下来的步骤同上。
[00225] 结果表明： 空的 HA-Lys-LA交联纳米粒子具有良好的生物相容性， 而载有 DOX 的交联纳 米粒子具有一定的抗肿瘤活性。
[00226] 实施例 52 对人脑胶质瘤 (U87MG) 细胞毒性测试
[00227] HA-Lys-LA 空纳米粒子 (Mn/M = 35kDa; DS = 5%, 10%, 28%)在 U87MG细胞中的毒性通过 MTT 法测定。 首先将 100 细胞的 DMEM 低糖培养基 (DMEM低糖培养基中含 10%胎牛血清、 100 IU/mL 青霉素和 lOO^!g/mL 链霉素）铺于 96 孔培养板中，使细胞的最终密度为 lx lO4个 /孔，并置于 37°C， 5% 二氧化碳条件下培养 24h使单层细胞的覆盖率达到 70~80%。 然后向每孔中加入 2(^L 不同浓度的 HA-Lys-LA交联或未交联纳米粒子的 PBS 溶液，使空纳米粒子在细胞孔中的最终浓度为 0.5 或 1.0mg/mL。 待继续培养 24h后，向每孔中加入 20 3-(4,5- 二甲基噻唑 -2)-2,5- 二苯基四氮唑溴盐 (MTT) 的 PBS 溶 液 (5mg/mL)， 并放入培养箱继续培养 4h 以使 MTT 与活细胞作用。 随后移除含有 MTT 的培养液， 向每 孔中加入 150^iL DMSO 以溶解活细胞与 MTT产生的紫色甲瓒结晶，并使用酶标仪 (BioTek) 测定每个孔 在 570nm 处的吸收。 细胞相对存活率通过与只有空白细胞的对照孔在 570nm 处的吸收相比得到。 实验数 据均是平行四组进行的。
细胞存活率(％)=(00570 样品 /OD570 对照) χ 100%
[00228] 载有 DOX 的 HA-Lys-LA纳米粒子 (M„a4 = 35kDa; DS = 5%, 10%, 28%; DLC = 12%, 15%, 18%) 的抗癌活性通过与上述空纳米粒子细胞毒性类似的方法进行测定。 将 100 U87MG 细胞的 DMEM低糖培养基铺于 96 孔培养板中， 使细胞的最终密度为 Ι χ ΙΟ4个 /孔， 并置于 37°C， 5%二氧化碳 条件下培养 24h使单层细胞的覆盖率达到 70~80%。 然后向每孔中加入 20^iL 载有 DOX 的取代度不同的 HA-Lys-LA 交联或未交联纳米粒子或自由 DOX 的 PBS 溶液， 使 DOX 在细胞孔中的最终浓度为 0.0023~100 /11^。 待继续培养 4h后， 去掉原有培养基补充等量新鲜培养基， 培养 44h后， 向每孔中加 入 2(^L MTT 溶液 (5mg/mL)， 并置于培养箱中培养 4h。 随后的实验处理及毒性的测定与上述一致。 封闭 受体实验时在加入载有 DOX的 HA-Lys-LA交联纳米粒子之前将自由的 HA溶液（5mg/mL ) 与细胞一起 孵育 4h， 接下来的步骤同上。
[00229] 结果显示， 空白的纳米粒子在 U87MG细胞中经 48 小时后其细胞存活率均大于 90%， 说明 空白的纳米粒子的生物相容性很好； 载有 DOX 的 HA-Lys-LA 交联纳米粒子对 CD44 受体表达低的 U87MG细胞具有抗肿瘤活性，但取代度不同的载药交联纳米粒子的抗肿瘤活性接近，且远低于自由药物。
[00230] 实施例 53对人脑胶质瘤 (U87MG) 细胞毒性测试
[00231] HA-Lys-LA 空纳米粒子 (Mn/M = 35kDa, DS = 40%) 在 U87MG细胞中的毒性通过 MTT 法测 定。 首先将 100 细胞的 DMEM低糖培养基 (DMEM低糖培养基中含 10%胎牛血清、 100 IU/mL 青霉 素和 10(^g/mL链霉素）铺于 96 孔培养板中， 使细胞的最终密度为 Ι χ ΙΟ4个 /孔， 并置于 37°C， 5%二氧 化碳条件下培养 24h使单层细胞的覆盖率达到 70~80%。 然后向每孔中加入 20 不同浓度的 HA-Lys-LA 交联或未交联纳米粒子的 PBS 溶液， 使空纳米粒子在细胞孔中的最终浓度为 0.5 l.Omg/mLo 待继续培 养 24h后，向每孔中加入 20 3-(4,5- 二甲基噻唑 -2)-2,5- 二苯基四氮唑溴盐 (MTT) 的 PBS 溶液 (5mg/mL)， 并放入培养箱继续培养 4h 以使 MTT 与活细胞作用。随后移除含有 MTT 的培养液， 向每孔中加入 15(^L DMSO 以溶解活细胞与 MTT 产生的紫色甲瓒结晶， 并使用酶标仪 (BioTek) 测定每个孔在 570nm 处的吸 收。 细胞相对存活率通过与只有空白细胞的对照孔在 570nm 处的吸收相比得到。 实验数据均是平行四组 进行的。
细胞存活率(％)=(00570 样品 /OD570 对照) χ 100%
[00232] 载有 DOX 的 HA-Lys-LA纳米粒子 (Mn/M = 35kDa, DS = 40%, DLC = 20%) 的抗癌活性通过 与上述空纳米粒子细胞毒性类似的方法进行测定。将 10(^L U87MG细胞的 DMEM低糖培养基铺于 96 孔 培养板中， 使细胞的最终密度为 l x lO4个 /孔， 并置于 37°C， 5% 二氧化碳条件下培养 24h使单层细胞的 覆盖率达到 70~80%。然后向每孔中加入 20 载有 DOX 的取代度不同的 HA-Lys-LA交联或未交联纳米 粒子或自由 DOX 的 PBS 溶液，使 DOX在细胞孔中的最终浓度为 0.0023~100μ§/ηΛ。待继续培养 4h后， 去掉原有培养基补充等量新鲜培养基， 培养 44h后， 向每孔中加入 2(^L MTT 溶液 (5mg/mL)， 并置于培 养箱中培养 4h。 随后的实验处理及毒性的测定与上述一致。 封闭受体实验时在加入载有 DOX 的 HA-Lys-LA交联纳米粒子之前将自由的 HA溶液 （5mg/mL ) 与细胞一起孵育 4h， 接下来的步骤同上。
[00233] 结果显示， 空白的纳米粒子在 U87MG细胞中经 48 小时后其细胞存活率均大于 88%， 说明 空白的纳米粒子的生物相容性很好； 载有 DOX 的 HA-Lys-LA 交联纳米粒子对 CD44 受体表达低的 U87MG细胞具有一定的抗肿瘤活性， 与其他取代度的载药纳米粒子的抗肿瘤活性接近， 且远低于自由药 物。
[00234] 实施例 54载 DOX 的 HA-Lys-LA交联纳米粒子在小鼠体内循环研究
[00235] 以下动物实验操作均符合苏州大学实验动物中心的批准协议。将 6 只体重为 18-22g约 5-8 周 龄的裸鼠随机分为两组， 每组分别尾静脉给药载有 DOX 的 HA-Lys-LA交联纳米粒子 (Mn/M= 35kDa, DS = 10%, DLC = 12%) 或自由 DOX (DOX用量为 15mg/kg ) 。 在给药后 2min、 15min、 30min、 lh、 2h、 4h、 6h、 8h、 12h、 24h各时间点尾部取血， 每次取血量约为 10μΙ^。取血结束后将血样称重，并溶解在 100 1% 曲拉通溶液中， 后再加入 lmL 0.75mol L 的盐酸异丙醇溶液， 于 -20°C避光条件下静置过夜， 离心后取上 清液进行荧光测试。
[00236] %ID/g=(FL 样品 x(V 曲拉通 +V盐酸)）/(M血 xFL 标样 xV标样 χ 标样稀释倍数 100%。
[00237] 附图 6 为载 DOX 的 HA-Lys-LA交联纳米粒子 (Mn/M = 35kDa, DS = 10%, DLC =12%) 与 DOX在小鼠体内血液循环结果图。 结果表明： 载 DOX 的 HA-Lys-LA交联纳米粒子具有良好的稳定性， 可以在小鼠体内实现长循环， 而自由 DOX在 2h之后几乎无法在小鼠血液中检测到。
[00238] 实施例 55载 DOX 的 HA-Lys-LA交联纳米粒子在小鼠体内循环研究
[00239] 以下动物实验操作均符合苏州大学实验动物中心的批准协议。将 6 只体重为 18-22g约 5-8 周 龄的裸鼠随机分为两组，每组分别尾静脉给药载有 DOX 的 HA-Lys-LA交联纳米粒子 (Mn/M = 35kDa, DS = 40%, DLC = 20%) 或自由 DOX (DOX用量为 15mg/kg ) 。 在给药后 2min、 15min、 30min、 lh、 2h、 4h、 6h、 8h、 12h、 24h各时间点尾部取血， 每次取血量约为 10μΙ^。取血结束后将血样称重，并溶解在 100 1% 曲拉通溶液中， 后再加入 lmL 0.75mol L 的盐酸异丙醇溶液， 于 -20°C避光条件下静置过夜， 离心后取上 清液进行荧光测试。
[00240] %ID/g=(FL 样品 x(V 曲拉通 +V盐酸)）/(M血 xFL 标样 xV标样 χ 标样稀释倍数 100%。
[00241] 结果表明：载 DOX 的 HA-Lys-LA交联纳米粒子 (Mn/M = 35kDa, DS = 40%, DLC =20%) 具有 良好的稳定性， 可以在小鼠体内实现长循环， 而自由 DOX在 2h之后几乎无法在小鼠血液中检测到。
[00242] 实施例 56 HA-Lys-LA交联纳米粒子在耐药性乳腺癌荷瘤裸鼠体内的活体成像研究
[00243] HA-Lys-LA交联纳米粒子 (Mn/M = 35kDa, DS = 10%) 在体内循环过程中在各个部位分布的 情况用 Maestro 活体成像仪进行实时观测。 耐药性乳腺癌裸鼠移植瘤模型通过皮下注射 50μΙ^、 含有 1 >< 107 个 MCF-7/ADR细胞的悬浮液接种到裸鼠 （体重 18-22g ) 的体侧。 当肿瘤体积达到 100mm3, 荷瘤裸鼠通 过尾静脉注射 0.2mL 载有荧光分子 Cy7 的 HA-Lys-LA交联纳米粒子溶液， 然后在一定的时间点将裸鼠 麻醉， 并固定在黑色塑料板上， 放入 Maestro 活体成像仪内， 在 720nm 的发射波长下测定 Cy7在体内分 布的强度。
[00244] 图 7为载有 Cy7的 HA-Lys-LA交联纳米粒子 (Mn/M = 35kDa, DS = 10%)在荷瘤裸鼠体内的活 体成像结果图； 结果表明： 随着时间延长， 裸鼠肿瘤部位 Cy7荧光逐渐增强， 且当 10h 时肿瘤部位的荧 光强度达到最强， 24h后肿瘤部位 Cy7 荧光仍然较强， 说明 HA-Lys-LA交联纳米粒子可以有效地富集在 肿瘤部位并维持较长时间。
[00245] 实施例 57载 DOX 的 HA-Lys-LA交联纳米粒子在耐药性乳腺癌荷瘤裸鼠各脏器的体外成 像研究
[00246] 将六只肿瘤体积达到 100mm3的耐药性乳腺癌荷瘤裸鼠随机分成两组， 每只裸鼠通过尾静脉 分别注射 0.2mL 的 （ 1 ) 载 DOX交联纳米粒子溶液 (Mn/M = 35kDa, DS = 10%, DLC = 12%) ； (2 ) 自由 DOX溶液 （最终 DOX浓度约为 15mg/kg ) 。 10h后， 将每只裸鼠的心， 肝， 脾， 肺， 肾， 及肿瘤取出， 洗净， 并固定在黑色塑料板上， 放入 Maestro 活体成像仪内， 在 523nm 的发射波长下测定 DOX在体内 分布的强度。
[00247] 结果表明，载 DOX 的 HA-Lys-LA交联纳米粒子 (Mn/M = 35kDa, DS = 10%, DLC =12%) 在肿 瘤部位比其他脏器富集多， 释放 DOX 的荧光强， 而自由 DOX在肿瘤部位几乎没有富集。
[00248] 实施例 58 载 DOX 的 HA-Lys-LA交联纳米粒子在耐药性乳腺癌荷瘤裸鼠各脏器的生物分 布研究
[00249] 将六只肿瘤体积达到 100mm3的荷瘤裸鼠随机分成两组，每只裸鼠通过尾静脉分别注射 0.2mL 的 （ 1 ) 载 DOX交联纳米粒子溶液 (M„H4 = 35kDa, DS = 10%, DLC = 12%) ； (2 ) 自由 DOX溶液 （最终 DOX浓度约为 15mg/kg ) 。 10h后， 将每只裸鼠的心， 肝， 脾， 肺， 肾， 及肿瘤取出， 洗净， 称重， 加 入 400μυ% 曲拉通， 用匀浆机匀浆， 再加入 0.75mol/L 的盐酸异丙醇溶液 600 ， 置于 -20°C度冰箱， 24h 后离心， 取上清液进行荧光测试分析。
[00250] %ID/g=FL 器官 χ (V处理液 +V器官） / (V药物 χ 稀释倍数 xFL 药物 χΜ器官） χ 100% [00251] 图 8 为载有 DOX 的 HA-Lys-LA交联纳米粒子 (Mn/M = 35kDa, DS = 10%, DLC = 12%) 在荷 肿瘤裸鼠各脏器的生物分布结果图。 结果表明： 载 DOX 的 HA-Lys-LA交联纳米粒子在肿瘤部位有很高 富集达到 12.71%ID/g， 而自由 DOX在肿瘤部位的富集少， 只有 0.63%ID/g。 现有的表面修饰了聚乙二醇 (PEG) 的载有阿霉素 （DOX) 的空心金纳米球经尾静脉注射 6 小时及 24 小时之后在肿瘤部位 DOX 的 富集都低于 5%ID/g ； 说明本发明基于透明质酸两亲聚合物的药物载体无需修饰靶向分子即可有效进入肿 瘤细胞内， 在肿瘤部位的富集率高。
[00252] 实施例 59 载 DOX 的 HA-Lys-LA交联纳米粒子在耐药性乳腺癌荷瘤裸鼠体内的抗肿瘤效 果研究
[00253] 将肿瘤体积达到 50mm3的荷瘤裸鼠随机分成三组 （每组六只） ， 这天被定为第 0天。 通过 尾静脉分别注射 0.2mL 的 （ 1 ) 载 DOX交联纳米粒子溶液 (Mn/M = 35kDa, DS = 10%, DLC =12%) ； (2 ) 自由 DOX溶液； （3 ) PBS 溶液 （最终 DOX浓度约为 7.5mg/kg ) 。 载药胶束制剂对裸鼠肿瘤生长的影 响定期用卡尺进行测量。裸鼠体重变化定期用天平称量。肿瘤的体积大小通过 V=0.5xLxWxH 公式计算得 到（L 是肿瘤最长点的长度； W是测量肿瘤最短点的长度； H 是测量肿瘤的高度） 。 24天后， 每组随机 取一只老鼠通过颈与脊椎骨脱臼处死， 将每只老鼠心， 肝， 肿瘤取出， 用 4% 甲醛固定， 切片， 并用苏木 精和曙红（H&E)染色用于组织学分析。 其余裸鼠继续观察。 在整个治疗过程中， 裸鼠死亡或肿瘤体积超 过 1000mm3均认为该鼠死亡。
[00254] 相对肿瘤体积 （％) =肿瘤体积 /第 0 天肿瘤体积 100%。
[00255] 相对体重变化 （％) =裸鼠体重 /第 0 天裸鼠体重 χ 100%。
[00256] 图 9 为载有 DOX 的 HA-Lys-LA交联纳米粒子 (Mn/M = 35kDa, DS = 10%, DLC =12%) 在荷 瘤裸鼠体内的肿瘤生长变化结果图。 结果表明： 载 DOX 的 HA-Lys-LA交联纳米粒子可以有效抑制肿瘤 体积增长， 具有很高的抗肿瘤活性； 而自由 DOX不能抑制肿瘤生长。 裸鼠体重变化情况及存活实验表明 载 DOX 的 HA-Lys-LA交联纳米粒子 (Mn/M = 35kDa, DS =10%, DLC = 12%)对体重没有影响， 副作用小， 存活时间最长， 而自由 DOX使裸鼠体重降低了 28%， 毒副作用大， 28 天内全部死亡。 此外， H&E染色 组织学分析结果显示载 DOX 的 HA-Lys-LA交联纳米粒子 (Mn/M = 35kDa, DS = 10%, DLC = 12%) 对应的 肿瘤组织有大面积的坏死， 但心脏和肝脏均正常； 而自由 DOX和 PBS 组对应的肿瘤组织生长旺盛， 且 自由 DOX组对应的肝脏受到很大损伤， 心肌细胞萎缩， 出现空泡并伴有炎症组织浸润。
[00257] 实施例 60:载 DOX 的 HA-鸟氨酸 -LA iMnHA =100kDa， DS = 28% )交联纳米粒子在荷 LP1 肿瘤 （多发性骨髓瘤） 的裸鼠体内的肿瘤生长效果研究
将肿瘤体积达到 50mm3的荷瘤裸鼠随机分成三组 （每组六只） ， 这天被定为第 0 天。 通过尾静脉分 别注射 0.2mL 的 （1 ) 载 DOX交联纳米粒子溶液 （Mn/M =100kDa， DS = 28% , DLC =12%) ； (2) 自 由 DOX溶液； （3 ) PBS 溶液 （最终 DOX浓度约为 7.5mg/kg ) 。 载药胶束制剂对裸鼠肿瘤生长的影响 定期用卡尺进行测量。裸鼠体重变化定期用天平称量。肿瘤的体积大小通过 V=0.5xLxWxH 公式计算得到 (L 是肿瘤最长点的长度； W是测量肿瘤最短点的长度； H是测量肿瘤的高度） 。 24 天后， 每组随机取 一只老鼠通过颈与脊椎骨脱臼处死， 将每只老鼠心， 肝， 肿瘤取出， 用 4% 甲醛固定， 切片， 并用苏木精 和曙红（H&E)染色用于组织学分析。 其余裸鼠继续观察。 在整个治疗过程中， 裸鼠死亡或肿瘤体积超过 1000mm3均认为该鼠死亡。
相对肿瘤体积 （％) =肿瘤体积 /第 0 天肿瘤体积 χ 100%。
相对体重变化 （％) =裸鼠体重 /第 0 天裸鼠体重 χ ΐοο%。
图 13A-D为载有 DOX 的 HA-鸟氨酸 -LA交联纳米粒子 (Mn/M =100kDa, DS = 28% , DLC =12%)在 荷瘤裸鼠体内的肿瘤生长变化结果图。 图 13A为相对肿瘤体积变化结果图； 从图 13A可看出， 经过载有 DOX 的 HA-鸟氨酸 -LA交联纳米粒子处理的小鼠， 2/5的肿瘤在 25天内基本消失； 图 13B可看出， 经载 有 DOX 的 HA-鸟氨酸 -LA交联纳米粒子治疗的小鼠肿瘤体积与经磷酸盐缓冲溶液治疗的相比， 肿瘤体积 显著减小； 图 13C 显示小鼠相对体重变化， 从图上可看出， 自由药会导致小鼠体重严重降低， 而经载有 DOX 的 HA-鸟氨酸 -LA交联纳米粒子处理的小鼠， 体重变化相对较小， 结合图 13A、 图 13B， 可得出， 载有 DOX 的 HA-鸟氨酸 -LA交联纳米粒子在增强抗肿瘤活性的同时， 对小鼠的毒性较小； 图 13D为小鼠 存活率结果。 图 13A-D结果表明： 载 DOX 的 HA-鸟氨酸 -LA交联纳米粒子可以有效抑制肿瘤体积增长， 具有很高的抗肿瘤活性； 而自由 DOX不能抑制肿瘤生长。 裸鼠体重变化情况及存活实验表明载 DOX 的 HA-鸟氨酸 -LA交联纳米粒子 (Mn/M =100kDa， DS = 28% , DLC = 12%)对体重没有影响， 副作用小， 存活 时间最长， 而自由 DOX使裸鼠体重降低了约 34%， 毒副作用大， 15天内全部死亡。 此外， H&E染色组 织学分析结果显示载 DOX的 HA-鸟氨酸 -LA交联纳米粒子 (M„/M =100kDa， DS = 28% , DLC = 12%) 对 应的肿瘤组织有大面积的坏死，但心脏和肝脏均正常；而自由 DOX和 PBS 组对应的肿瘤组织生长旺盛， 且自由 DOX组对应的肝脏受到很大损伤， 心肌细胞萎缩， 出现空泡并伴有炎症组织浸润。
[00258] 实施例 61 : 载 DOX的 HA-鸟氨酸甲酯 -LA交联纳米粒子在小鼠体内循环研究
[00259] 以下动物实验操作均符合苏州大学实验动物中心的批准协议。将 6 只体重为 18-22g约 5-8 周 龄的裸鼠随机分为两组，每组分别尾静脉给药载有 DOX 的
Figure imgf000036_0001
=35kDa, DS = 28%， DLC = 12%) 或自由 DOX (DOX用量为 15mg/kg) 。 在给药后 2min、 15min、 30min、 lh、 2h、 4h、 6h、 8h、 12h、 24h各时间点尾部取血， 每次取血量约为 10 。取血结束后将血样称重， 并溶解在 100μΙ^% 曲 拉通溶液中， 后再加入 lmL 0.75mol/L 的盐酸异丙醇溶液， 于 -20°C避光条件下静置过夜， 离心后取上清 液进行荧光测试。
%ID/g= ( FL样品 x(V曲拉通 +V盐酸)） I ( M血 xFL标样 xV标样 标样稀释倍数） χ 100%。
[00260] 附图 14为载 DOX 的 ΗΑ-鸟氨酸甲酯 -LA ίΜηΗΑ =35kDa, DS = 28% , DLC = 12%)与 DOX 在小鼠体内血液循环结果图。结果表明：载 DOX的 HA-鸟氨酸甲酯 -LA交联纳米粒子具有良好的稳定性， 可以在小鼠体内实现长循环， 而自由 DOX在 2h之后几乎无法在小鼠血液中检测到。
[00261] 实施例 62: 载 DOX的 HA- (氨己基氨基） -LA (MnHA =400kDa， DS = 40%)交联纳米粒子 在耐药性乳腺癌荷瘤裸鼠各脏器的生物分布研究
[00262] 将六只肿瘤体积达到 100mm3的荷瘤裸鼠随机分成两组，每只裸鼠通过尾静脉分别注射 0.2mL 的 （1 ) 载 DOX交联纳米粒子溶液 (Mn/M = (W: ¾i, DS = 40%, DLC = 12%) ； ( 2 ) 自由 DOX溶液 （最 终 DOX浓度约为 15mg/kg ) 。 10h后， 将每只裸鼠的心， 肝， 脾， 肺， 肾， 及肿瘤取出， 洗净， 称重， 加入 400^1% 曲拉通， 用匀浆机匀浆， 再加入 0.75mol L 的盐酸异丙醇溶液 600 ， 置于 -20°C度冰箱， 24h后离心， 取上清液进行荧光测试分析。
%ID/g=FL器官 (V处理液 +V器官） I (V药物 稀释倍数 xFL药物 χΜ器官） χ 100%
[00263] 图 15为载有 DOX 的 ΗΑ- (氨己基氨基） -LA交联纳米粒子 (Mn/M =35kDa, DS=10%, DLC=12%) 在荷肿瘤裸鼠各脏器的生物分布结果图。 结果表明： 载 DOX的 HA- (氨己基氨基） -LA交联纳米粒子在 肿瘤部位有很高富集达到 15.3%ID/g， 而自由 DOX在肿瘤部位的富集少， 只有 0.63%ID/g。现有的表面修 饰了聚乙二醇 （PEG) 的载有阿霉素 （DOX) 的空心金纳米球经尾静脉注射 6小时及 24 小时之后在肿瘤 部位 DOX 的富集都低于 5%ID/g ;说明本发明基于透明质酸两亲聚合物的药物载体无需修饰靶向分子即可 有效进入肿瘤细胞内， 在肿瘤部位的富集率高。

Claims

¾ ¾ ^ ^
1. 一种基于透明质酸的两亲聚合物， 其由主链和侧链组成， 所述主链为透明质酸， 所述主链透明质 酸的羧基与侧链形成酰胺键， 侧链为如下式 (1)表示的基团
Figure imgf000038_0001
式 (1)，
其中， A部分为二价基团^！^！！ ！^！^-^！！ -！^！！- 其中 #表示与主链透明质酸的连接点， 示与式 （1 ) 的基团中的硫辛酰基的连接点；
其中， 基团 R表示 H或 -COOR Ri表示！！或^^。脂肪族烧基， n表示整数 2-10; 所述透明质酸的分子量为 7 - 500 kDa 侧链的取代度为 5 - 40%。
2. 如权利要求 1所述的基于透明质酸的两亲聚合物， 其中 n为 3。
3. 如权利要求 1所述的基于透明质酸的两亲聚合物， 其中 n为 4。
4. 如权利要求 1所述的基于透明质酸的两亲聚合物， 其中所述透明质酸的分子量为 10-100kDa。
5. 如权利要求 1所述的基于透明质酸的两亲聚合物， 其中侧链的取代度为 10% - 28%„
6. 如权利要求 1-5中任一项所述的基于透明质酸的两亲聚合物， 其中基团 R为 -COOR 为 -( 8脂 肪族垸基。
7. 如权利要求 1-5中任一项所述的基于透明质酸的两亲聚合物， 其中基团 R为 -COOR 为 -( 8脂 肪族垸基。
8. 如权利要求 1-5中任一项所述的基于透明质酸的两亲聚合物， 其中基团 R为 -COOR 选自 H， 甲基、 乙基、 丙基、 异丙基、 正丁基、 异丁基、 叔丁基、 仲丁基、 正戊基、 异戊基、 新戊基、 叔戊基、 己 基、 庚基、 辛基、 壬基和癸基。
9. 制备如权利要求 1-8中任一项所述的基于透明质酸的两亲聚合物的方法， 其特征在于， 包括以下 步骤：
首先透明质酸与 N-保护的氨基酸、 其衍生物或其类似物或 C3-C„垸基二胺发生酰胺化反应， 转化成通 过酰胺键连接至所述 N-保护的氨基酸、 其衍生物或其类似物或 -(„垸基二胺的透明质酸； 然后脱保护， 并使脱保护的产物与硫辛酸酐发生酰胺化反应， 得到如权利要求 1-8中任一项所述的基 于透明质酸的两亲聚合物。
10. 如权利要求 9所述的方法， 其中所述 N-保护的氨基酸、 其衍生物或其类似物的保护基选自 Boc、 Fmoc、 Bpoc、 Ddz、 Cbz、 Bn和 Tos。
11. 如权利要求 9或 10所述的方法， 其中所述透明质酸与 N-保护的氨基酸、 其衍生物或其类似物或 c3-c„垸基二胺的酰胺化反应是在偶联剂催化下进行的。
12. 如权利要求 11所述的方法， 其中所述偶联剂为 1- (3-二甲基氨丙基 ) -3-乙基碳二亚胺盐酸盐 /N- 羟基琥珀酰亚胺 （EDC/NHS ) ， 碳二亚胺 /1-羟基苯并三唑 (EDCI/H0BT) , 碳二亚胺 /1-羟基 -7-偶氮苯并三 氮唑 (EDCI/H0AT)， 2- (7-偶氮苯并三氮唑) -N， N, N'， N' -四甲基脲六氟磷酸酯 (HATU)， 4_ (4， 6_二甲氧基三 嗪 -2-基) -4-甲基吗啉盐酸盐 （DMTMM) , 六氟磷酸苯并三唑 -1-基-氧基三吡咯垸基 （PyBOP) , 0_苯并三氮 唑 -N， N, N'， N' -四甲基脲四氟硼酸 (TBTU)， 或 N-羟基硫代丁二酰磺酸钠盐。
13. 如权利要求 9所述的方法，其中脱保护的产物与硫辛酸酐的酰胺化反应是在 4- ( 二甲氨基） 吡啶 ( DMAP) ， 二异丙基乙基胺（DIPEA)， N-甲基吗啉， N，N_二甲基苯胺， 吡啶， 取代的吡啶衍生物， 如 2， 6- 二甲基吡啶、 2， 4， 6-三甲吡啶， 或其混合物的催化下进行的。
14. 一种交联纳米粒子， 其特征在于， 所述交联纳米粒子由如权利要求 1-8中任一项所述的两亲聚合 物构成， 所述交联纳米粒子的外层亲水层由透明质酸构成， 内层疏水层由所述侧链的五元环交联构成。
15. 如权利要求 1-8中任一项所述的两亲聚合物在制备药物载体中的应用。
16. 一种载药纳米粒子， 其包括载体与负载在载体上的小分子抗癌药物， 其特征在于， 所述载体由权 利要求 1-8中任一项所述的两亲聚合物构成， 所述载体的外层亲水层由透明质酸构成， 内层疏水层由所述 侧链的五元环交联构成。
17. 如权利要求 16所述的载药纳米粒子， 其特征在于， 所述小分子抗癌药物为阿霉素、 紫杉醇、 姜 黄素、 多西紫杉醇、 喜树碱、 丝裂霉素、 道诺霉素、 博来霉素、 卡里奇霉素 （Calicheamicin ) 、 美登素 类、 多柔比星、 表柔比星或者柔红霉素。
18. 如权利要求 16所述的载药纳米粒子， 其特征在于， 载体对药物的包封率为 40% -91% ； 所述载药 纳米粒子的载药量为 11% - 22%„
19. 如权利要求 16所述的载药纳米粒子， 其特征在于， 所述载药纳米粒子的粒径为 50 -300纳米， 粒径分布为 0. 02 - 0. 30。
20. 如权利要求 16-19中任一项所述的载药纳米粒子在制备抗肿瘤药物中的应用。
21. 如权利要求 20所述的应用， 其特征在于， 所述肿瘤为 CD44 受体过量表达的肿瘤。
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