WO2016181956A1 - 結合型アミノ酸のキラル分析方法及びキラル分析システム - Google Patents

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Definitions

  • the present invention relates to a bonded amino acid chiral analysis method and a bonded amino acid chiral analysis system.
  • Bonded amino acids are compounds formed by binding amino acids in a chain by amide bonds (peptide bonds), and exist in vivo as proteins and peptides, and are important components along with sugars and lipids.
  • An ⁇ -amino acid in which an amino group is bonded to a carbon to which a carboxyl group is bonded ( ⁇ carbon) is a chiral molecule in which D-form and L-form of optical isomers having an optical center of ⁇ -carbon exist except for glycine.
  • Most of the conjugated amino acids present in the living body are composed of L-amino acids, and the optical isomer D-amino acids are extremely limited biomolecules such as peptidoglycan constituents present on the cell walls of bacteria. Has been considered.
  • Identification and quantification of amino acid residues of conjugated amino acids such as proteins are generally performed using separation techniques such as chromatography on amino acids generated by hydrolysis using heat or acid. Artifacts caused by isomerization in which L and L forms convert to each other may occur, which hinders accurate analysis of endogenous chiral molecules.
  • Non-Patent Document 1 after hydrolyzing a protein with deuterated hydrochloric acid, the ratio of amino acid residue D-form to L-form (% D:% D: LC / ESI-MS / MS equipped with a chiral column).
  • a chiral analysis method for calculating D / (D + L)) is disclosed.
  • the amino acid isomerized during the hydrolysis process has a hydrogen atom bonded to the ⁇ carbon substituted with a deuterium atom.
  • the distinction is made by utilizing the fact that the mass to charge ratio is different.
  • a hydrogen atom contained in the side chain may also be replaced with a deuterium atom, and the hydrogen atom contained in the side chain is heavy.
  • Artifacts substituted with hydrogen atoms cannot be distinguished from those in which the hydrogen atom bonded to the ⁇ -carbon is replaced with deuterium atoms in mass spectrometry. Therefore, it includes a problem that the accuracy is remarkably lowered in chiral analysis of amino acid residues contained in a very small amount in bound amino acids.
  • an aspect of the present invention is to provide artifacts generated during the process of analyzing bound amino acids, and D-amino acid residues and / or L-amino acid residues inherent in the bound amino acids. It is an object of the present invention to provide a chiral analysis method and chiral analysis system for linked amino acids that can be distinguished with high accuracy.
  • a step of hydrolyzing a conjugated amino acid using a heavy aqueous solution of dehydrochloric acid and / or heavy water a step of optically resolving D-form and L-form of an amino acid generated by the hydrolysis, A step of generating a fragment from the optically resolved amino acid, and a step of selecting and analyzing a predetermined fragment containing an ⁇ -carbon and not containing a side chain from the generated fragments by mass spectrometry.
  • a method for chiral analysis of conjugated amino acids is provided.
  • an optical resolution unit that optically resolves a D-form and an L-form of an amino acid generated by hydrolyzing a conjugated amino acid using deuterated aqueous hydrochloric acid and / or heavy water;
  • a fragment generation unit that generates a fragment from optically resolved amino acids, and a mass analysis unit that selects and analyzes a predetermined fragment that includes ⁇ -carbon and does not include a side chain from the generated fragments.
  • a chiral analysis system for conjugated amino acids is provided.
  • the present invention is a binding type capable of discriminating between artifacts generated during the process of analysis of bound amino acids and D-amino acid residues and / or L-amino acid residues inherent in the bound amino acids with high accuracy.
  • An amino acid chiral analysis method and a chiral analysis system can be provided.
  • the chiral analysis method for conjugated amino acids in this embodiment includes a step of hydrolyzing conjugated amino acids using deuterated aqueous hydrochloric acid and / or heavy water, and optical resolution of D and L isomers of amino acids generated by the hydrolysis.
  • artifacts generated during the process of analyzing bound amino acids and D-amino acid residues and / or L-amino acid residues present in the bound amino acids are highly accurate. Can be identified.
  • Bonded amino acids are compounds formed by binding amino acids in a chain by amide bonds (peptide bonds) and exist, for example, as proteins and peptides in vivo.
  • the hydrolysis of a bonded amino acid is generally a reaction in which water reacts with a bonded amino acid to obtain a free amino acid as a decomposition product.
  • a known hydrolysis method can be applied using deuterated hydrochloric acid heavy water, heavy water, etc., for example, using the hydrolysis method described in Non-Patent Document 1. Can do.
  • the hydrolysis conditions such as temperature, concentration of deuterated hydrochloric acid and heavy water, and time can be arbitrarily set.
  • free amino acids obtained by such hydrolysis may include those that maintain the configuration of linked amino acid residues and those that are isomerized during the process.
  • aspartic acid obtained by hydrolyzing a conjugated amino acid and not isomerized during the process is represented by chemical formulas (2) to (4).
  • aspartic acid obtained by hydrolyzing a conjugated amino acid and isomerized during the process is represented by chemical formulas (5) to (7).
  • D-form and L-form of amino acid obtained by hydrolyzing the conjugated amino acid are optically resolved.
  • the method for optically resolving amino acid D-form and L-form is not particularly limited, but there are methods that utilize differences in properties in crystallization, optical rotation, and enzymatic reaction, diastereomeric methods, and phase distribution with different asymmetric elements.
  • the method to use etc. are mentioned.
  • a chromatography method using a stationary phase (column) having chiral recognition ability is preferable.
  • fragments are further generated by fragmentation for each of the optically resolved amino acids or amino acid derivatives.
  • fragmentation by fragmentation, one or more fragments having a smaller mass than the amino acid or amino acid derivative before fragmentation can be generated.
  • Such a fragment can be generated by heat, pressure, molecular collision, etc. for each of the optically resolved D-form and L-form, for example, using a molecular collision mechanism provided in a mass spectrometer. Can be made.
  • aspartic acid generates, for example, a fragment containing an ⁇ carbon and no side chain, as shown in chemical formula (8). At this time, a fragment containing an ⁇ carbon and / or a side chain may also be generated.
  • the generated fragments are separated and detected based on mass by mass spectrometry, and a predetermined fragment containing ⁇ -carbon and not containing a side chain is selected and analyzed. Specifically, it is possible to distinguish between a predetermined fragment containing an ⁇ carbon and no side chain, in which a hydrogen atom bonded to the ⁇ carbon is not substituted with a deuterium atom.
  • a predetermined fragment containing an ⁇ carbon and no side chain in which a hydrogen atom bonded to the ⁇ carbon is not substituted with a deuterium atom.
  • the structure of the fragment can be estimated by, for example, analyzing a mass spectrometry spectrum of a standard product in which the amino acid to be analyzed is substituted with an isotope.
  • Amino acids may be derivatized.
  • the derivatizing reagent used for derivatizing the amino acid is not particularly limited, but 4-fluoro-7-nitrobenzofurazane, 4-fluoro-7-nitro-2,1,3-benzoxadiazole, o-phthalaldehyde, phenyl isothiocyanate, fluorescamine, dansyl chloride and the like.
  • the chiral analysis method for a conjugated amino acid includes a D-form and an L-form of an amino acid residue having a side chain containing a hydrogen atom that is included in the conjugated amino acid and can be substituted with a deuterium atom in the hydrolysis step. Suitable for identifying analysis.
  • the D-form and L-form of all amino acid residues contained in the conjugated amino acid may be analyzed using the coupled amino acid chiral analysis method in this embodiment, or may be substituted with a deuterium atom. Only D-form and L-form of amino acid residues having a side chain containing a hydrogen atom may be analyzed.
  • the group containing a hydrogen atom that can be substituted with a deuterium atom is not particularly limited, and examples thereof include a methylene group, such as a methylene group bonded to an electron-withdrawing group such as a carboxyl group.
  • the amino acid having a methylene group bonded to a carboxyl group is not particularly limited, and examples thereof include aspartic acid (Asp) and glutamic acid (Glu).
  • chiral analysis method for linked amino acids in this embodiment can be applied not only to naturally occurring linked amino acids but also to artificially synthesized linked amino acids.
  • FIG. 1 is a diagram showing an example of the configuration of a coupled amino acid chiral analysis system 100 according to the present embodiment.
  • the coupled amino acid chiral analysis system 100 according to the present embodiment is an optical resolution unit that optically resolves D-form and L-form of amino acids generated by hydrolyzing conjugated amino acids using deuterated aqueous hydrochloric acid and / or heavy water.
  • 104 a fragment generation unit 106 that generates an ⁇ -carbon-containing fragment that does not include a side chain for the optically resolved amino acid, and a mass analysis unit 108 that detects the generated fragment by mass spectrometry.
  • the coupled amino acid chiral analysis system 100 may further include a hydrolysis unit 102 that hydrolyzes the coupled amino acid by reacting with heavy water.
  • the combined amino acid chiral analysis system 100 may further include an amino acid separation unit 103 that separates each amino acid hydrolyzed by the hydrolysis unit 102 when the combined amino acid includes a plurality of types of amino acids. Good.
  • the coupled amino acid chiral analysis system 100 may include an information analysis data processing unit that analyzes detected information in the mass analysis unit 108, or is not limited to the mass analysis unit 108, and may be separately provided.
  • the information analysis data processing unit 110 that analyzes the detected information may be included.
  • the hydrolysis unit 102 includes, for example, a mechanism that hydrolyzes the bound amino acid in a reaction thermostat that can dry a sample containing the bound amino acid and maintain the sample in a vacuum state.
  • the hydrolysis unit 102 may be configured to perform the hydrolysis process off-line instead of being incorporated into the chiral analysis system 100 as a specific device.
  • the amino acid separation unit 103 includes, for example, a reverse phase microcolumn and the like, and separates the target amino acid from other components.
  • the amino acid separation unit 103 may be integrated with the optical resolution unit 104.
  • the optical resolution unit 104 includes a separation mechanism by chromatography using a stationary phase that recognizes the optical activity of the sample after hydrolysis, for example.
  • the fragment generation unit 106 has, for example, a mechanism for fragmentation by applying energy such as molecular collision to the sample after optical division.
  • the mass analyzer 108 is, for example, a mechanism that ionizes a sample, separates and detects fragment ions according to the mass-to-charge ratio by an electric / magnetic action, etc., and obtains a mass spectrum related to the mass-to-charge ratio and the detection intensity. Is provided.
  • the information analysis unit 108 includes, for example, a mechanism that selects a target fragment ion from the mass spectrum, performs qualitative and quantitative analysis, and outputs calibration, ratio data, and the like.
  • the configuration of the information analysis unit 108 includes an arbitrary computer CPU, memory, a program loaded in the memory, a storage unit such as a hard disk for storing the program, and an arbitrary combination of hardware and software centering on a network connection interface. It is realized by.
  • the coupled amino acid chiral analysis system 100 having such a configuration has high artifacts generated during the coupled amino acid analysis process and D-amino acid residues and / or L-amino acid residues inherent in the coupled amino acids. Can be identified by accuracy.
  • the NBD derivatives of amino acids were analyzed using a two-dimensional HPLC-FL-MS / MS system.
  • the apparatus configuration and analysis conditions of the two-dimensional HPLC-FL-MS / MS system are as follows.
  • the NBD derivative of each amino acid was separated using the first-dimensional column in the amino acid separation unit 103.
  • the D-form and L-form of each amino acid were separated using the second dimension column in the optical resolution unit 104.
  • an ion (m / z: 192) containing an ⁇ carbon and a side chain (Asp, having a side chain) derived from an NBD derivative of aspartic acid; (2) an ion derived from an NBD derivative of aspartic acid and containing an ⁇ carbon and no side chain (m / z: 237) (Asp, no side chain); (3) an ion (m / z: 247) (Glu, with side chain) derived from an NBD derivative of glutamic acid and containing an ⁇ carbon and a side chain; (4) An ion (m / z: 149) (Glu, no side chain) containing ⁇ -carbon and no side chain, derived from an NBD derivative of glutamic acid, was selected.
  • (1) and (3) are intended for fragments in which the hydrogen atom bonded to the ⁇ -carbon is not replaced by a deuterium atom.
  • FIG. 2 shows the result of chiral analysis of aspartic acid and glutamic acid contained in the hydrolysis product of the peptide.
  • the fluorescence detection results are also shown. From the chromatograms of fluorescence and MS, the formula (D-chromatographic peak height) / (Standard D-chromatographic peak height) / ⁇ (L-chromatographic peak height) Height) / (peak height of chromatographic peak of standard product L) + (height of chromatographic peak of standard D product) / (height of chromatographic peak of standard product D) ⁇ ⁇ 100 From this,% D was calculated.
  • FIG. 2 shows that D-form was detected despite the peptide synthesized with all L-form amino acids. This occurred because the hydrogen atom bonded to the ⁇ -carbon was not replaced by the deuterium atom during the isomerization reaction due to the purity of the reagent, protein binding water, deuterated hydrochloric acid used in the reaction, and protons in the sample. Presumed to be an artifact. However, as can be seen from FIG.
  • the side chain derived from the NBD derivative of aspartic acid in the fragment ion (Asp, no side chain) derived from the NBD derivative of aspartic acid and containing the ⁇ carbon, the side chain derived from the NBD derivative of aspartic acid The amount of detected D-form is reduced compared to the fragment detection (including Asp, with side chain) and fluorescence detection results.
  • the detection limit is calculated by the signal / noise ratio (S / N) and the detection sensitivity is compared
  • S / N signal / noise ratio
  • the detection sensitivity is improved by 18.5 times compared to the fluorescence detection having no discrimination / selection ability and 1.6 times compared with the fragment ion containing the side chain.
  • the fragment ion (Glu, side chain) derived from the NBD derivative of glutamic acid is derived from the NBD derivative of glutamic acid, and the fragment ion (Glu, no side chain) containing ⁇ -carbon and containing no side chain is also included. Yes) and the detection amount of D body is reduced compared with the fluorescence detection result.
  • the detection limit is calculated by the signal / noise ratio (S / N) and the detection sensitivity is compared, in the case of a fragment ion derived from an NBD derivative of glutamic acid and containing an ⁇ carbon and not containing a side chain, fluorescence detection and In comparison, the detection sensitivity is improved 48.3 times and 8.3 times compared to the fragment ion containing the side chain.

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Abstract

結合型アミノ酸のキラル分析方法は、重塩酸重水溶液及び／又は重水を用いて結合型アミノ酸を加水分解させる工程と、該加水分解により生成したアミノ酸のＤ体とＬ体を光学分割する工程と、該光学分割されたアミノ酸からフラグメントを生成させる工程と、該生成したフラグメントの中から、質量分析によりα炭素を含み、かつ側鎖を含まない所定のフラグメントを選択して解析する工程と、を有する。

Description

結合型アミノ酸のキラル分析方法及びキラル分析システム
　本発明は、結合型アミノ酸のキラル分析方法及び結合型アミノ酸のキラル分析システムに関する。
　結合型アミノ酸は、アミノ酸がアミド結合（ペプチド結合）により鎖状に結合してできた化合物であり、生体内では、タンパク質やペプチドとして存在し、糖、脂質等と並び、重要な成分である。カルボキシル基が結合した炭素（α炭素）にアミノ基が結合したα－アミノ酸は、グリシンを除き、α炭素を光学中心とした光学異性体のＤ体、Ｌ体が存在するキラル分子である。生体内に存在する結合型アミノ酸のほとんどは、Ｌ－アミノ酸から構成されており、その光学異性体であるＤ－アミノ酸は、細菌の細胞壁に存在するペプチドグリカンの構成成分等の極めて限られた生体分子と考えられてきた。
　しかしながら、近年、Ｄ－アミノ酸とＬ－アミノ酸を識別する能力を有するキラル分析技術の進展に伴い、微生物や植物をはじめ、哺乳動物にも様々なＤ－アミノ酸が存在し、生理現象に影響を与え得ることが明らかになりつつある。
　タンパク質をはじめとする結合型アミノ酸のアミノ酸残基の同定や定量は、一般に熱や酸を用いた加水分解により生成するアミノ酸についてクロマトグラフィー等の分離技術を用いて行われるが、この過程においてＤ体とＬ体が相互に変換する異性化を原因としたアーティファクトが生じる可能性があり、内在性キラル分子の正確な分析の障害となっている。
　非特許文献１には、重塩酸を用いてタンパク質を加水分解させた後、キラルカラムを備えたＬＣ／ＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳを用いて、アミノ酸残基のＤ体とＬ体の比率（％Ｄ：Ｄ／（Ｄ＋Ｌ））を算出するキラル分析方法が開示されている。このとき、加水分解過程中に異性化したアミノ酸は、α炭素に結合する水素原子が重水素原子で置換されているため、異性化されていないアミノ酸とは、α炭素を含むイオンの質量分析において、質量電荷比が異なることを利用して区別している。
T. Miyamoto, M. Sekine, T. Ogawa, M. Hidaka, H. Homma, H. Masaki: Generation of Enantiomeric Amino Acids during Acid Hydrolysis of Peptides Detected by the Liquid Chromatography/Tandem Mass Spectroscopy, Chem. Biodivers., 7, 1644-1649 (2010).
　しかしながら、非特許文献１に記載の方法では、側鎖を有するアミノ酸残基は、側鎖に含まれる水素原子も重水素原子で置換される可能性があり、側鎖に含まれる水素原子が重水素原子で置換されたアーティファクトは、α炭素に結合した水素原子が重水素原子で置換されたアーティファクトと、質量分析において、区別することができない。そのため、結合型アミノ酸に微量に内在するアミノ酸残基のキラル分析において、正確度を著しく低下させるという問題を包含している。
　そこで、本発明の一態様は、上記の従来技術が有する問題に鑑み、結合型アミノ酸の分析過程中に生じるアーティファクトと、結合型アミノ酸に内在するＤ－アミノ酸残基及び／又はＬ－アミノ酸残基とを、高い正確度で識別することが可能な結合型アミノ酸のキラル分析方法及びキラル分析システムを提供することを目的とする。
　本発明の一態様によれば、重塩酸重水溶液及び／又は重水を用いて結合型アミノ酸を加水分解させる工程と、該加水分解により生成したアミノ酸のＤ体とＬ体を光学分割する工程と、該光学分割されたアミノ酸からフラグメントを生成させる工程と、該生成したフラグメントの中から、質量分析によりα炭素を含み、かつ側鎖を含まない所定のフラグメントを選択して解析する工程と、を有することを特徴とする結合型アミノ酸のキラル分析方法が提供される。
　また、本発明の一態様によれば、重塩酸重水溶液及び／又は重水を用いて結合型アミノ酸を加水分解させることにより生成したアミノ酸のＤ体とＬ体を光学分割する光学分割部と、該光学分割されたアミノ酸からフラグメントを生成させるフラグメント生成部と、該生成したフラグメントの中から、質量分析によりα炭素を含み、かつ側鎖を含まない所定のフラグメントを選択して解析する質量分析部を有することを特徴とする結合型アミノ酸のキラル分析システムが提供される。
　本発明は、結合型アミノ酸の分析過程中に生じるアーティファクトと、結合型アミノ酸に内在するＤ－アミノ酸残基及び／又はＬ－アミノ酸残基とを、高い正確度で識別することが可能な結合型アミノ酸のキラル分析方法及びキラル分析システムを提供することができる。
本実施形態における結合型アミノ酸のキラル分析システムの構成の一例を示す図である。 ペプチドの加水分解生成物に含まれるアスパラギン酸及びグルタミン酸のキラル分析の結果を示す図である。
　次に、本発明を実施するための形態を図面と共に説明する。
　本実施形態における結合型アミノ酸のキラル分析方法は、重塩酸重水溶液及び／又は重水を用いて結合型アミノ酸を加水分解させる工程と、該加水分解により生成したアミノ酸のＤ体とＬ体を光学分割する工程と、該光学分割されたアミノ酸からフラグメントを生成させる工程と、該生成したフラグメントの中から、質量分析によりα炭素を含み、かつ側鎖を含まない所定のフラグメントを選択して解析する工程と、を有する。
　本実施形態における結合型アミノ酸のキラル分析方法では、結合型アミノ酸の分析過程中に生じるアーティファクトと、結合型アミノ酸に内在するＤ－アミノ酸残基及び／又はＬ－アミノ酸残基とを、高い正確度で識別することができる。
　結合型アミノ酸は、アミノ酸がアミド結合（ペプチド結合）により鎖状に結合してできた化合物であり、例えば、生体内において、タンパク質やペプチドとして存在する。
　結合型アミノ酸の加水分解とは、一般的に、結合型アミノ酸に水が反応し、分解生成物である遊離アミノ酸が得られる反応である。
　結合型アミノ酸を加水分解させる工程では、重塩酸重水溶液、重水等を用いて、公知の加水分解方法を適用することができ、例えば、非特許文献１に記載されている加水分解方法を用いることができる。
　なお、温度や重塩酸、重水の濃度、時間等の加水分解の条件は、任意で設定することができる。ところで、このような加水分解で得られる遊離アミノ酸には、結合型アミノ酸残基の立体配置を維持したものと、工程中に異性化されたものとが含まれ得る。
　一例として、結合型アミノ酸を重水素と反応させて加水分解させて得られる、遊離アスパラギン酸について説明する。
　まず、結合型アミノ酸に内在するアスパラギン酸残基を化学式（１）に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
 　次に、結合型アミノ酸を加水分解させて得られ、工程中に異性化されていないアスパラギン酸を化学式（２）～（４）に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
 　さらに、結合型アミノ酸を加水分解させて得られ、工程中に異性化されているアスパラギン酸を化学式（５）～（７）に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
 　次に、結合型アミノ酸を加水分解させて得られたアミノ酸のＤ体とＬ体を光学分割する。
　アミノ酸のＤ体とＬ体を光学分割する方法としては、特に限定されないが、結晶化、旋光度、酵素反応における性質の違いを利用する方法やジアステレオマー法、不斉要素が異なる相分配を用いる方法等が挙げられる。中でも、キラル認識能を有する固定相（カラム）を用いるクロマトグラフィー法が好ましい。
　上述したアスパラギン酸のように重水素原子で置換され得る水素原子を含む側鎖を有するアミノ酸残基の場合、例えば化学式（３）及び化学式（５）は１分子に対して１つの水素が重水素に置換されているため同じ質量を示す。同様に、化学式（４）及び化学式（６）は１分子に対して２つの水素が重水素に置換されているため同じ質量を示す。このような構造の分子においては工程中の異性化の履歴が異なるにもかかわらず、質量的に分離することができない。
　本実施形態において、さらに、光学分割されたアミノ酸又はアミノ酸誘導体それぞれについて、フラグメンテーションにより、フラグメントを生成させる。ここで、フラグメンテーションにより、フラグメンテーション前のアミノ酸又はアミノ酸誘導体よりも質量の小さい一以上のフラグメントを生成することができる。
　このようなフラグメントは、光学分割されたＤ体及びＬ体のそれぞれについて、熱、圧力、分子衝突等により生成させることができ、例えば、質量分析計に備えられている分子衝突機構を用いて生成させることができる。
　一例として、アスパラギン酸では、例えば、化学式（８）に示す、α炭素を含み、かつ側鎖を含まないフラグメントを生成させる。また、このとき、α炭素及び／又は側鎖を含むフラグメントも生成させてもよい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
 　次に、生成したフラグメントを質量分析により質量に基づき分離・検出し、α炭素を含み、かつ側鎖を含まない所定のフラグメントを選択し、解析する。具体的には、α炭素を含み、かつ側鎖を含まない所定のフラグメントであって、α炭素に結合した水素原子が重水素原子で置換されているものといないものを識別することができる。次いで、そのデータに基づいて結合型アミノ酸残基の立体配置を維持したものと工程中に異性化したものを同定し、Ｄ－アミノ酸とＬ－アミノ酸の存在比率や量を解析することができる。
　このように、重水素原子で置換され得る水素原子を含む側鎖を有するアミノ酸残基であっても、α炭素を含み、かつ側鎖を含まない所定のフラグメントを生成・分離・検出・選択・解析することにより、側鎖に重水素原子が導入されたアーティファクトを排除することができる。
　これにより、結合型アミノ酸の分析過程中に生じるアーティファクトと、結合型アミノ酸に内在するＤ－アミノ酸残基及び／又はＬ－アミノ酸残基とを、高い正確度で識別することが可能となる。
　なお、フラグメントの構造は、例えば、分析対象のアミノ酸が同位体で置換されている標準品の質量分析スペクトルを解析することにより推定することができる。
　結合型アミノ酸のキラル分析方法では、光学分割や質量分析の効率を向上させるために、アミノ酸のＤ体とＬ体を光学分割する前、又は、アミノ酸のＤ体とＬ体を光学分割した後に、アミノ酸を誘導体化してもよい。
　アミノ酸を誘導体化する際に用いられる誘導体化試薬としては、特に限定されないが、４－フルオロ－７－ニトロベンゾフラザン、４－フルオロ－７－ニトロ－２，１，３－ベンゾキサジアゾール、ｏ－フタルアルデヒド、イソチオシアン酸フェニル、フルオレサミン、ダンシルクロライド等が挙げられる。
　本実施形態における結合型アミノ酸のキラル分析方法は、結合型アミノ酸に含まれ、加水分解工程で、重水素原子で置換され得る水素原子を含む側鎖を有するアミノ酸残基のＤ体とＬ体を識別する分析に好適である。この場合、本実施形態における結合型アミノ酸のキラル分析方法を用いて、結合型アミノ酸に含まれる全てのアミノ酸残基のＤ体とＬ体を分析してもよいし、重水素原子で置換され得る水素原子を含む側鎖を有するアミノ酸残基のＤ体とＬ体のみを分析してもよい。
　重水素原子で置換され得る水素原子を含む基としては、特に限定されないが、メチレン基等が挙げられ、例えばカルボキシル基等の電子吸引性基に結合しているメチレン基等である。
　カルボキシル基に結合しているメチレン基を有するアミノ酸としては、特に限定されないが、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）等が挙げられる。
　なお、本実施形態における結合型アミノ酸のキラル分析方法は、天然に存在する結合型アミノ酸に限らず、人為的に合成された結合型アミノ酸にも適用することができる。
　図１は、本実施形態における結合型アミノ酸のキラル分析システム１００の構成の一例を示す図である。本実施形態における結合型アミノ酸のキラル分析システム１００は、重塩酸重水溶液及び／又は重水を用いて結合型アミノ酸を加水分解させることにより生成したアミノ酸のＤ体とＬ体を光学分割する光学分割部１０４と、光学分割されたアミノ酸について、α炭素を含み、かつ側鎖を含まないフラグメントを生成させるフラグメント生成部１０６と、生成したフラグメントを質量分析により検出する質量分析部１０８と、を有する。
　ここで、結合型アミノ酸のキラル分析システム１００は、結合型アミノ酸を重水と反応させて加水分解させる加水分解部１０２をさらに有していてもよい。また、結合型アミノ酸のキラル分析システム１００は、結合型アミノ酸が複数種のアミノ酸を含む場合に、加水分解部１０２で加水分解された各アミノ酸を分離するアミノ酸分離部１０３をさらに有していてもよい。また、結合型アミノ酸のキラル分析システム１００は、質量分析部１０８内に、検出された情報を解析する情報解析データ処理部を有していてもよく、又は質量分析部１０８内に限らず、別途、検出された情報を解析する情報解析データ処理部１１０を有していてもよい。
　加水分解部１０２は、例えば、結合型アミノ酸を含む試料を乾燥させ、真空状態に保持することが可能な反応恒温槽で、結合型アミノ酸を加水分解させる機構を備える。ただし、加水分解部１０２は、特定の装置としてキラル分析システム１００に組み込まれるのではなく、オフラインで加水分解処理を行う構成としてもよい。
　アミノ酸分離部１０３は、例えば、逆相ミクロカラム等を含み、目的のアミノ酸を他の成分から分離する。なお、アミノ酸分離部１０３は、光学分割部１０４と一体構成とされていてもよい。
　光学分割部１０４は、例えば、加水分解後の試料の光学活性を認識する固定相を用いたクロマトグラフィーによる分離機構を備える。
　フラグメント生成部１０６は、例えば、光学分割後の試料に分子衝突等のエネルギーを与えることにより断片化させる機構を有する。
　質量分析部１０８は、例えば、試料をイオン化し、電気的・磁気的な作用等により質量電荷比に応じて、フラグメントイオンを分離して検出し、質量電荷比、検出強度に関するマススペクトルを得る機構を備える。
　情報解析部１０８は、例えば、マススペクトルから、対象となるフラグメントイオンを選択して、定性、定量解析を行い、検量、比率データ等を出力する機構を備える。情報解析部１０８の構成は、任意のコンピュータのＣＰＵ、メモリ、メモリにロードされたプログラム、そのプログラムを格納するハードディスクなどの記憶ユニット、ネットワーク接続用インタフェースを中心にハードウエアとソフトウエアの任意の組合せによって実現される。
　このような構成の結合型アミノ酸のキラル分析システム１００は、結合型アミノ酸の分析過程中に生じるアーティファクトと、結合型アミノ酸に内在するＤ－アミノ酸残基及び／又はＬ－アミノ酸残基とを、高い正確度で識別することができる。
　結合型アミノ酸として、すべてＬ体のアミノ酸で合成したペプチド（Ｈ２Ｎ－）Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｇｌｕ－Ａｌａ－Ａｓｐ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ（－ＣＯＯＨ）（渡辺化学工業社製）１ｍｇに、重水素化率が１００％の０．１Ｍ重塩酸（ＡＣＲＯＳ ＯＲＧＡＮＩＣＳ社製）２５０μＬを加え、４℃で１晩間静置した後、水を蒸発させて乾燥させた。さらに、重水素化率が１００％の６Ｍ重塩酸（ＡＣＲＯＳ　ＯＲＧＡＮＩＣＳ社製）２００μＬを加え、ヒーター（Ｗａｔｅｒｓ社製）を用いて、１１０℃で２０時間加水分解させた後、水を蒸発させて乾燥させた。次に、水１００μＬを加え、孔径が０．４５μｍのフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）で濾過した後、８０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、遊離アミノ酸水溶液１００μＬを得た。
　得られた遊離アミノ酸水溶液１０μＬに、ｐＨが８．０の４００ｍＭホウ酸ナトリウム緩衝液１０μＬ及びＮＢＤ－Ｆ（４－フルオロ－７－ニトロベンゾフラザン）（東京化成社製）の４０ｍＭアセトニトリル溶液５μＬを加えた後、６０℃で２分間反応させた後、２体積％トリフルオロ酢酸水溶液７５μＬを加えて反応を停止させ、アミノ酸のＮＢＤ誘導体を得た。
　２次元ＨＰＬＣ－ＦＬ－ＭＳ／ＭＳシステムを用いて、アミノ酸のＮＢＤ誘導体を分析した。このとき、２次元ＨＰＬＣ－ＦＬ－ＭＳ／ＭＳシステムの装置構成と分析条件は、以下の通りである。ここで、アミノ酸分離部１０３において一次元目のカラムを用いて、各アミノ酸のＮＢＤ誘導体を分離した。また、光学分割部１０４において二次元目のカラムを用いて、各アミノ酸のＤ体とＬ体とを分離した。
　・装置構成
　＜１次元目＞
　送液ポンプ：３３０１（資生堂社製）
　カラムオーブン：３００４（資生堂社製）
　オートサンプラー：３０３３（資生堂社製）
　蛍光検出器：３２１３（資生堂社製）
　データ処理プログラム：Ｅｚｃｈｒｏｍｅ　Ｅｌｉｔｅ（資生堂社製）
　＜２次元目＞
　送液ポンプ：３２０１（資生堂社製）
　デガッサー：３２０２（資生堂社製）
　カラムオーブン：３０１４（資生堂社製）
　オートサンプラー：３０３３（資生堂社製）
　ハイプレッシャーバルブ：３０１１（資生堂社製）
　蛍光検出器：３０１３（資生堂社製）
　質量分析計：ＴＱ－５５００（ＡＢ　Ｓｃｉｅｘ社製）
　データ処理プログラム：Ａｎａｌｙｓｔ（ＡＢ　Ｓｃｉｅｘ社製）
　・分析条件
　＜１次元目＞
　カラム：モノリス型ＯＤＳカラム（０．５３ｍｍ（内径）×１０００ｍｍ）
　移動相：０～３５ｍｉｎ；Ａ１００％、３５～５５ｍｉｎ；Ａ１００％－Ｂ１００％（ｇｒａｄｉｅｎｔ）、５５～１００ｍｉｎ；Ｂ１００％、１００～１３０ｍｉｎ；Ｃ１００％、１３０～１８０ｍｉｎ；Ａ１００％
　移動相の流速：２５μＬ／ｍｉｎ
　Ａ：５質量％アセトニトリル、０．０５質量％トリフルオロ酢酸水溶液
　Ｂ：１８質量％アセトニトリル、０．０５質量％トリフルオロ酢酸水溶液
　Ｃ：８５質量％アセトニトリル水溶液
　＜２次元目＞
　カラム：ＳｕｍｉｃｈｉｒａｌＯＡ－３２００Ｓ（１．５ｍｍ（内径）×２５０ｍｍ）
　グルタミン酸用の移動相：０．８質量％ギ酸のアセトニトリル／メタノール（体積比：８０／２０）溶液
　アスパラギン酸用の移動相：１質量％ギ酸のアセトニトリル／メタノール（体積比：５０／５０）溶液
　移動相の流速：１５０μＬ／ｍｉｎ
　蛍光検出装置：励起波長４７０ｎｍ、蛍光波長５３０ｎｍにおける蛍光強度を計測
　質量分析装置：イオン化電圧５５００Ｖ、温度６００℃で生成した親イオン（ｍ／ｚ：２９９（Ａｓｐ）；３１３（Ｇｌｕ））について、衝突エネルギー３７ｅＶ（Ａｓｐ）；２１ｅＶ（Ｇｌｕ）を与えて得られたフラグメントイオンを計測
　質量分析装置は、フラグメント生成部１０６及び質量分析部１０８に対応する。
　質量分析で検出するフラグメントイオンとして、
（１）アスパラギン酸のＮＢＤ誘導体由来の、α炭素及び側鎖を含むイオン（ｍ／ｚ：１９２）（Ａｓｐ、側鎖有）と、
（２）アスパラギン酸のＮＢＤ誘導体由来の、α炭素を含み、かつ側鎖を含まないイオン（ｍ／ｚ：２３７）（Ａｓｐ、側鎖無）と、
（３）グルタミン酸のＮＢＤ誘導体由来の、α炭素及び側鎖を含むイオン（ｍ／ｚ：２４７）（Ｇｌｕ、側鎖有）と、
（４）グルタミン酸のＮＢＤ誘導体由来の、α炭素を含み、かつ側鎖を含まないイオン（ｍ／ｚ：１４９）（Ｇｌｕ、側鎖無）とを選択した。
　なお、（１）及び（３）は、α炭素に結合した水素原子が重水素原子で置換されていないフラグメントを対象としている。
　図２に、ペプチドの加水分解生成物に含まれるアスパラギン酸及びグルタミン酸のキラル分析の結果を示す。図２では、上記（１）～（４）の結果に加え、蛍光検出結果も示す。
なお、蛍光、ＭＳのそれぞれのクロマトグラムから、式
　（Ｄ体のクロマトのピークの高さ）／（標準品のＤ体のクロマトのピークの高さ）／｛（Ｌ体のクロマトのピークの高さ）／（標準品のＬ体のクロマトのピークの高さ）＋（Ｄ体のクロマトのピークの高さ）／（標準品のＤ体のクロマトのピークの高さ）｝×１００
により、％Ｄを算出した。
　図２から、すべてＬ体のアミノ酸で合成したペプチドにもかかわらず、Ｄ体が検出されたことがわかる。これは、試薬の純度、タンパク質の結合水、反応に用いる重塩酸や試料に内在するプロトンにより、α炭素に結合する水素原子が異性化反応の際に重水素原子に置換されなかったために生じたアーティファクトではないかと推測される。しかし、図２からわかるように、アスパラギン酸のＮＢＤ誘導体由来の、α炭素を含み、かつ側鎖を含まないフラグメントイオン（Ａｓｐ、側鎖無）においては、アスパラギン酸のＮＢＤ誘導体由来の、側鎖を含むフラグメントイオン（Ａｓｐ、側鎖有）や蛍光検出結果に比べて、Ｄ体の検出量が低減している。検出限界をシグナル／ノイズ比（Ｓ／Ｎ）によって算出して、検出感度を比較した場合、アスパラギン酸のＮＢＤ誘導体由来の、α炭素を含み、かつ側鎖を含まないフラグメントイオンにおいては、アーティファクトの識別・選択能を全く有さない蛍光検出と比較して、１８．５倍、側鎖を含むフラグメントイオンと比較して、１．６倍に検出感度が向上している。
　また、グルタミン酸のＮＢＤ誘導体由来の、α炭素を含み、かつ側鎖を含まないフラグメントイオン（Ｇｌｕ、側鎖無）においても、グルタミン酸のＮＢＤ誘導体由来の、側鎖を含むフラグメントイオン（Ｇｌｕ、側鎖有）や蛍光検出結果に比べて、Ｄ体の検出量が低減している。検出限界をシグナル／ノイズ比（Ｓ／Ｎ）によって算出して、検出感度を比較した場合、グルタミン酸のＮＢＤ誘導体由来の、α炭素を含み、かつ側鎖を含まないフラグメントイオンにおいては、蛍光検出と比較して、４１．２倍、側鎖を含むフラグメントイオンと比較して、８．３倍に検出感度が向上している。
　このことは、検出するフラグメントイオンとして、α炭素を含み、かつ側鎖を含まないフラグメントイオンを選択することにより、分析過程中に生じるアーティファクトと、結合型アミノ酸に内在するＤ－アミノ酸残基及び／又はＬ－アミノ酸残基とを高い正確度で識別することが可能になったことを示している。
　以上、本発明の好ましい実施形態及び実施例について詳述したが、本発明は上記した特定の実施形態及び実施例に限定されるものではなく、特許請求の範囲に記載された本発明の要旨の範囲内において、種々の変形・変更が可能なものである。
　本国際出願は２０１５年５月１１日に出願された日本国特許出願２０１５－０９６９５９号に基づく優先権を主張するものであり、その全内容をここに援用する。

Claims (10)

  1. 　重塩酸重水溶液及び／又は重水を用いて結合型アミノ酸を加水分解させる工程と、
    　該加水分解により生成したアミノ酸のＤ体とＬ体を光学分割する工程と、
    　該光学分割されたアミノ酸からフラグメントを生成させる工程と、
    　該生成したフラグメントの中から、質量分析によりα炭素を含み、かつ側鎖を含まない所定のフラグメントを選択して解析する工程と、
    を有することを特徴とする結合型アミノ酸のキラル分析方法。
  2. 　前記加水分解により生成したアミノ酸のＤ体とＬ体をクロマトグラフィー法により光学分割することを特徴とする請求項１に記載の結合型アミノ酸のキラル分析方法。
  3. 　前記加水分解により生成したアミノ酸を誘導体化する工程をさらに有し、
    　該誘導体化されたアミノ酸のＤ体とＬ体を光学分割することを特徴とする請求項１に記載の結合型アミノ酸のキラル分析方法。
  4. 　前記フラグメントを生成させる工程において、前記光学分割されたアミノ酸のＤ体とＬ体それぞれについて前記フラグメントを生成させ、
    　前記解析する工程において、前記光学分割されたアミノ酸のＤ体とＬ体それぞれについて、α炭素を含み、かつ側鎖を含まない前記所定のフラグメントを選択し、該Ｄ体の前記所定のフラグメント及びＬ体の前記所定のフラグメントに基づき、前記結合型アミノ酸に元々含まれる前記アミノ酸のＤ体又はＬ体の存在比率を解析する請求項１に記載の結合型アミノ酸のキラル分析方法。
  5. 　前記解析する工程において、前記所定のフラグメントは、α炭素を含むとともに側鎖を含まず、前記α炭素に結合した水素原子が重水素原子で置換されていないフラグメントである請求項４に記載の結合型アミノ酸のキラル分析方法。
  6. 　前記フラグメントを生成させる工程において、熱、圧力又は分子衝突により、前記アミノ酸から前記フラグメントを生成することを特徴とする請求項１に記載の結合型アミノ酸のキラル分析方法。
  7. 　重塩酸重水溶液及び／又は重水を用いて結合型アミノ酸を加水分解させることにより生成したアミノ酸のＤ体とＬ体を光学分割する光学分割部と、
    　該光学分割されたアミノ酸からフラグメントを生成させるフラグメント生成部と、
    　該生成したフラグメントの中から、質量分析によりα炭素を含み、かつ側鎖を含まない所定のフラグメントを選択して解析する質量分析部を有することを特徴とする結合型アミノ酸のキラル分析システム。
  8. 　重塩酸重水溶液及び／又は重水を用いて前記結合型アミノ酸を加水分解させる加水分解部をさらに有することを特徴とする請求項７に記載の結合型アミノ酸のキラル分析システム。
  9. 　前記質量分析部には、前記検出された情報を解析する情報解析データ処理部を有することを特徴とする請求項７に記載の結合型アミノ酸のキラル分析システム。
  10. 　さらに、前記検出された情報を解析する情報解析データ処理部を有することを特徴とする請求項７に記載の結合型アミノ酸のキラル分析システム。
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