WO2016195439A1 - O-아세틸-호모세린을 생산하는 미생물 및 이를 이용하여 o-아세틸-호모세린을 생산하는 방법 - Google Patents

O-아세틸-호모세린을 생산하는 미생물 및 이를 이용하여 o-아세틸-호모세린을 생산하는 방법 Download PDF

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    • C12Y106/01—Oxidoreductases acting on NADH or NADPH (1.6) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.6.1)
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    • C12Y203/01—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
    • C12Y203/01031—Homoserine O-acetyltransferase (2.3.1.31)
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
    • C12Y207/01—Phosphotransferases with an alcohol group as acceptor (2.7.1)
    • C12Y207/01039—Homoserine kinase (2.7.1.39)

Definitions

  • the present application relates to a protein capable of releasing O-acetyl homoserine and a novel variant thereof, a microorganism having an enhanced expression of O-acetyl homoserine, and a method of producing O-acetyl homoserine using the same. will be.
  • Methionine which can be produced through chemical and biological synthesis, is used as a synthetic raw material for fluids and pharmaceuticals, as well as feed and food additives. Recently, a two-step process for producing L-methionine by enzymatic conversion reaction from L-methionine precursor produced through fermentation has been known (International Patent Publication No. WO2008 / 013432). In the two-step method described above, O-succinyl homoserine and O-acetyl homoserine may be used as methionine precursors, and methionine precursors may be used for economic mass production of methionine. It is very important to produce in high yield.
  • LeuE also known as leucine export protein, is a member of the Homoserine / homoserine lactone efflux protein (RhtB) family that is present in the lining of the inner membrane and is a putative uncharacterized transport protein. It is known to emit analogues.
  • RhtB Homoserine / homoserine lactone efflux protein
  • leuE leuE
  • amino acid sequence of the leuE (yeaS) gene or a variant thereof can be produced to produce purine nucleosides or purine nucleotides, and that amino acid production can be improved.
  • leuE variants with a cysteine excretion function are known.
  • the inventors of the present application have made intensive efforts to increase the production of O-acetyl-homoserine, and have completed the present application by discovering proteins and variants thereof having the activity of releasing O-acetyl-homoserine.
  • One object of the present application is to provide a polypeptide having O-acetyl homoserine releasing ability.
  • Another object of the present application is to provide a polynucleotide encoding the polypeptide.
  • Another object of the present invention is to culture the Escherichia genus microorganism producing the O-acetyl homoserine in a medium;
  • It provides a method for producing O-acetyl homoserine comprising the step of recovering O-acetyl homoserine from the microorganism or medium cultured in the culture step.
  • Another object of the present invention is to culture the Escherichia genus microorganism producing the O-acetyl homoserine in a medium;
  • O-acetyl homoserine was treated with O-acetyl homoserine recovered from the microorganism or medium cultured in the culture step or from the microorganism or medium cultured in the culture step to convert O-acetyl homoserine to L-methionine. It provides a method for producing L-methionine, including the step of converting.
  • the microorganism having the inner membrane protein LeuE or LeuE variant of the present invention is enhanced O-acetyl homoserine releasing ability to improve the production efficiency of O-acetyl homoserine bar, the microorganism of the present invention can be efficiently used to produce O-acetyl homoserine have.
  • high-efficiency O-acetyl homoserine can be used to economically mass-produce L-methionine.
  • One aspect of the present application to achieve the above object is one or more amino acids selected from the group consisting of 1 amino acid valine, 30 amino acid leucine, 95 amino acid phenylalanine or 165 amino acid phenylalanine in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 It relates to a polypeptide having O-acetyl homoserine releasing capacity, substituted by.
  • O-acetyl homoserine is a specific intermediate substance on the methionine biosynthetic pathway of a microorganism, which means an acetyl derivative of L-homoserine. It is known that the reaction of homoserine and acetyl-CoA is produced by the reaction of homoserine acetyl transferase, and has a chemical formula of C 6 H 11 NO 4 .
  • polypeptide having O-acetyl homoserine releasing ability refers to a polypeptide having a function of extracellularly releasing O-acetyl homoserine in a microbial cell. Specifically, it may mean a LeuE protein and a variant thereof having O-acetyl homoserine releasing ability, and are not particularly limited as long as it has O-acetyl homoserine releasing ability.
  • LeuE is known as a protein present in the inner membrane as one of the homoserine / homoserine lactone efflux protein (RhtB) family for amino acid transporters, but the exact The function is unknown. The inventors of the present application first confirmed that LeuE specifically releases O-acetyl homoserine.
  • the LeuE may be derived from an Escherichia spp. Microorganism, and may be, for example, E. coli-derived LeuE, but may be included herein without limitation in microorganisms as long as it has a function of releasing O-acetyl homoserine.
  • the polypeptide having O-acetyl homoserine releasing ability may be a protein having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 70% or more, specifically 80% or more, more specifically 90% or more homology, and substantially identical or corresponding to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 O-acetyl homoserine It may be a protein having an amino acid sequence having a releasing activity.
  • the term “variant” of a polypeptide having O-acetyl homoserine excretion ability refers to a polypeptide having an enhanced ability to excrete O-acetyl homoserine relative to the excretion capacity of the polypeptide in its natural or non-mutant state. Refer. Specifically, it is a polypeptide having improved O-acetyl homoserine releasing ability than the polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 due to one or more amino acid mutations in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • At least one amino acid selected from the group consisting of the first amino acid valine, the 30th amino acid leucine, the 95th amino acid phenylalanine, or the 165th amino acid phenylalanine in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 may be a polypeptide substituted with another amino acid.
  • the first amino acid valine is substituted with methionine;
  • 30th amino acid phenylalanine is selected from the group consisting of alanine, tryptophan, leucine, valine, glycine, serine, asparagine, aspartic acid, histidine, isoleucine, proline, tyrosine, glutamine, lysine, glutamic acid, cysteine, threonine and alginine Substituted;
  • 95th amino acid leucine is substituted or selected from the group consisting of valine, phenylalanine, alanine, glycine, threonine, asparagine, aspartic acid, histidine, isoleucine, serine, proline, tyrosine, glutamine, lysine, glutamic acid, cysteine, tryptophan and alginine ;
  • Or the 165th amino acid phenylalanine is selected from the group consisting of alan
  • the first amino acid valine in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is substituted with methionine;
  • the 30th amino acid phenylalanine is substituted with one selected from the group consisting of alanine, tryptophan, leucine, valine, glycine, serine, asparagine, aspartic acid and histidine;
  • the 95th amino acid leucine is substituted with one selected from the group consisting of valine, phenylalanine, alanine, glycine, threonine, asparagine, aspartic acid and histidine;
  • the 165th amino acid phenylalanine may be substituted with one selected from the group consisting of alanine, tryptophan, leucine, valine, glycine, serine, asparagine, aspartic acid and histidine.
  • the first amino acid valine may be substituted with methionine, and the 30th amino acid phenylalanine, 95th amino acid leucine, or 165th amino acid phenylalanine may be substituted with another amino acid.
  • it may be a polypeptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, 133, 134, 137, 138, 141, or 142.
  • It may be a protein having a sequence.
  • polypeptide is an example of a variant of the polypeptide having improved ability to release O-acetyl homoserine compared to the polypeptide in its natural or non-mutated state, without being limited thereto.
  • naturally or non-mutated state means a state that does not introduce a change in the introduction or activity of the polypeptide of interest herein.
  • the term “homology” refers to the amino acid sequence or nucleic acid sequence of a gene encoding a protein, wherein the same sequence of bases or amino acid residues between the sequences is aligned after aligning both sequences as closely as possible in a specific comparison region. It means degree. If the homology is sufficiently high, the expression products of the gene of interest may have the same or similar activity.
  • the percent sequence identity can be determined using known sequence comparison programs, and examples include BLAST (NCBI), CLC Main Workbench (CLC bio), MegAlign TM (DNASTAR Inc), and the like.
  • One aspect of the present application relates to a polynucleotide encoding a polypeptide having the O-acetyl homoserine releasing ability.
  • the polypeptide having the O-acetyl homoserine releasing capacity herein is as described above.
  • the polynucleotide may be a start codon substituted with ATG, and may be a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4, 135, 136, 139, 140 143, or 144, but is not limited thereto.
  • the polynucleotides also include nucleotide sequences encoding the same amino acid sequences and variants thereof due to genetic code degeneracy. For example, it may be modified to have an optimal codon depending on the microorganism used.
  • At least 70%, specifically at least 80%, more specifically at least 90% homology with the base sequence, and substantially the same or corresponding to the base sequence to release the activity of O-acetyl homoserine It may be a base sequence encoding an amino acid sequence having. Or a probe capable of being prepared from a known gene sequence, for example, hydriding under stringent conditions with complementary sequences for all or part of the nucleotide sequence to encode O-acetyl homoserine for proteins with excretion activity. The sequence may be sufficient. "Strict conditions" refer to conditions under which so-called specific hybrids are formed and nonspecific hybrids are not formed.
  • genes with high homology are, for example, 80% or more, specifically 90% or more, more specifically 95% or more, more specifically 97% or more, particularly specifically 99% or more Genes having homologous hybridization and hybridization with less homologous genes, or 60 ° C, 1 ⁇ SSC, 0.1% SDS, specifically 60 ° C, 0.1 At a salt concentration and temperature corresponding to x SSC, 0.1% SDS, more specifically 68 ° C., 0.1 ⁇ SSC, and 0.1% SDS, the conditions for washing once, specifically, two to three times can be enumerated ( Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (2001)).
  • the probe used for the hybridization may be part of the complementary sequence of the nucleotide sequence.
  • a probe can be constructed by PCR using an oligonucleotide constructed based on a known sequence as a primer as a template of a gene fragment containing such a nucleotide sequence.
  • a gene fragment of about 300 bp in length can be used as the probe. More specifically, when a gene fragment of about 300 bp in length is used as the probe, 50 ° C, 2 x SSC and 0.1% SDS are listed as washing conditions for hybridization.
  • Genes, protein sequences and promoter sequences used herein can be obtained from known databases, for example, but not limited to GenBank of NCBI, and the like.
  • One aspect of the present application relates to a microorganism that produces O-acetyl homoserine, wherein the polypeptide having O-acetyl homoserine releasing ability or a variant polypeptide thereof is included or overexpressed.
  • the microorganism may be a microorganism that produces O-acetyl homoserine, which includes or overexpresses a polypeptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or a variant polypeptide thereof.
  • polypeptide having the O-acetyl homoserine releasing capacity and the variant polypeptide are as described above.
  • microorganism that produces O-acetyl homoserine refers to a microorganism having the ability to produce O-acetyl homoserine and secrete it in the medium when the microorganism is cultured in the medium.
  • O-acetyl homoserine production capacity may be imparted or enhanced by natural or artificial mutations or species amelioration.
  • all of the microorganisms producing O-acetyl homoserine may be included regardless of the origin of the microorganism as long as it has the ability to produce O-acetyl homoserine. For example, it may be of the genus Escherichia , more specifically Escherichia coli ).
  • the microorganism producing O-acetyl homoserine herein is related to the mechanism related to homoserine biosynthesis pathway or O-acetyl homoserine releasing capacity to enhance O-acetyl homoserine production ability separately from the LeuE
  • the known microorganism may be a mutant microorganism additionally introduced.
  • Another specific aspect of the present application may be an inactivated activity of cystathionine synthase in addition to the O-acetyl homoserine-producing microorganism.
  • the gene encoding the cystathionine synthase (metB) may be deleted or the expression may be attenuated in comparison with the non-mutant microorganism, but is not limited thereto.
  • the amino acid sequence of metB may be obtained from a known database, and an amino acid sequence having cystathionine synthase activity may be included without limitation, and for example, may be a protein having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 5.
  • the protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 may be a protein encoded by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 6, but is not limited thereto.
  • another specific aspect of the present application may be an inactivated activity of homoserine kinase (homoserine kinase) in addition to the microorganism producing the O-acetyl homoserine.
  • the activity of the homoserine kinase may be reduced or eliminated than the intrinsic activity of the non-mutant microorganism.
  • the gene encoding homoserine kinase (thrB) may be mutated or deleted so as to be linked to a weak promoter or have weak activity compared to a natural promoter, but is not limited thereto.
  • the amino acid sequence of thrB can be obtained from a known database, and the amino acid sequence having homoserine kinase activity may be included without limitation, and for example, may be a protein having an amino acid sequence of SEQ ID NO.
  • the protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7 may be a protein encoded by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 8, but is not limited thereto.
  • the term "inactivation" of the protein refers to the case where the activity is decreased, when the activity is reduced, and when the expression is reduced, as compared with the activity of the enzyme that the original microorganism has in nature or in the non-mutated state of the protein. Even if the activity does not mean.
  • the inactivation is a case where the activity of the enzyme itself is reduced or eliminated compared to the activity of the enzyme originally possessed by a microorganism, such as a mutation of the gene encoding the enzyme, and the inhibition of expression or translation of the gene encoding the enzyme.
  • the gene is partially or completely deleted, and a combination thereof, but is not limited thereto.
  • Inactivation of such enzyme activity can be accomplished by the application of various methods well known in the art.
  • Examples of the method include a method of replacing a gene encoding the enzyme on a chromosome with a mutated gene such that the activity of the enzyme is reduced, including when the activity of the enzyme is removed; Introducing a mutation into an expression control sequence of a gene on a chromosome encoding said enzyme; Replacing the expression control sequence of the gene encoding the enzyme with a sequence having weak or no activity; Deleting all or part of a gene on a chromosome that encodes the enzyme; Introducing an antisense oligonucleotide (eg, antisense RNA) that complementarily binds to a transcript of a gene on the chromosome to inhibit translation from the mRNA to an enzyme; The method of artificially adding a sequence complementary to the SD sequence in front of the SD sequence of the gene encoding the enzyme to form a secondary structure to make the attachment of ribosomes impossible and
  • the method for modifying the expression control sequence is carried out by inducing a mutation on the expression control sequence by deletion, insertion, non-conservative or conservative substitution, or a combination thereof, to further weaken the activity of the expression control sequence, or weaker. By replacement with a nucleic acid sequence having activity.
  • the expression control sequence includes, but is not limited to, a promoter, an operator sequence, a sequence encoding a ribosomal binding site, and a sequence that controls the termination of transcription and translation.
  • a method of modifying a gene sequence on a chromosome may be performed by inducing a mutation on the sequence by deletion, insertion, non-conservative or conservative substitution, or a combination thereof, to further weaken the activity of the enzyme, or to perform weaker activity. It may be carried out by replacing with a gene sequence that is improved to have or a gene sequence that has been modified to have no activity, but is not limited thereto.
  • a method of deleting part or all of a gene encoding an enzyme is performed by replacing a polynucleotide encoding an endogenous target protein in a chromosome with a polynucleotide or a marker gene in which some nucleic acid sequences are deleted through a bacterial chromosome insertion vector.
  • a method for deleting part or all of the gene a method of deleting a gene by homologous recombination may be used, but is not limited thereto.
  • the term "some” may vary depending on the type of polynucleotide, but may be specifically 1 to 300, more specifically 1 to 100, and even more specifically 1 to 50, but is not particularly limited thereto. no.
  • homologous recombination refers to genetic recombination occurring through linkage exchange at the locus of gene chains having homology with each other.
  • another specific aspect of the present application may be an enhanced activity of homoserine acetyl transferase (homoserine acetyltransferase) in addition to the microorganism producing the O-acetyl homoserine compared to the non-mutated microorganism.
  • the activity of the homoserine acetyl transferase may be increased than that of the non-mutant microorganism, and in particular, the variant metA gene encoding the enhanced activity homoserine acetyl transferase may be introduced.
  • the variant metA gene may be a gene encoding the substitution of amino acid No. 111 of glutathic acid and the amino acid No.
  • the variant metA may include an amino acid sequence whose activity of the homoserine acetyl transferase is stronger than that of the wild type without limitation, and for example, may be a protein having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 10.
  • An example of the production of such a mutant metA gene and its utilization, the homoserine acetyl transferase-enhanced strain, etc. are disclosed in Korean Patent No. 10-1335841, the entire specification of which is incorporated herein by reference. May be included.
  • another aspect of the present invention is in addition to the O-acetyl homoserine-producing microorganisms of aspartate semialdehyde dehydrogenase, pyridine nucleotide transhydrogenase or a combination thereof It may be a microorganism of the genus Escherichia that produces O-acetyl homoserine, whose activity is enhanced compared to unmutated microorganisms.
  • another specific embodiment of the present invention is in addition to the microorganisms producing the O-acetyl homoserine phosphoenolpyruvate carboxylase, aspartate aminotransferase or a combination thereof is non-mutated It may be enhanced compared to microorganisms.
  • the term "strengthening" of protein activity means improving the active state of the protein possessed by the microorganism. Enhancing the activity of the protein is not limited as long as it can enhance the activity of each protein, such as enhancing the activity of the protein of interest, than the natural state of nature or the non-mutated state of the protein.
  • an increase in the number of copies of a polynucleotide encoding each protein ii) a modification of an expression control sequence to increase expression of the polynucleotide, iii) a modification of the polynucleotide sequence on a chromosome to enhance the activity of each protein.
  • a combination thereof i) an increase in the number of copies of a polynucleotide encoding each protein, ii) a modification of an expression control sequence to increase expression of the polynucleotide, iii) a modification of the polynucleotide sequence on a chromosome to enhance the activity of each protein.
  • a method of inserting a polynucleotide containing a nucleotide sequence encoding each protein into a chromosome a method of introducing the polynucleotide into a vector system into a microorganism, an improved activity upstream of a nucleotide sequence encoding each protein
  • a method of introducing a promoter or a mutated protein to the promoter a method of modifying the nucleotide sequence of the 5'-UTR region, and a method of introducing a variant of the nucleotide sequence encoding each protein It may be performed by a method, but is not limited thereto.
  • One aspect of the present application relates to an O-acetyl homoserine production method comprising culturing the Escherichia genus microorganism producing the O-acetyl homoserine in a medium.
  • culturing the Escherichia genus microorganism producing the O-acetyl homoserine in a medium And it relates to a production method comprising the step of recovering O-acetyl homoserine in the cultured microorganism or medium in the culture step.
  • the term "culture” means growing the microorganisms in suitably controlled environmental conditions. Cultivation process of the present application can be made according to the appropriate medium and culture conditions known in the art. This culture process can be easily adjusted and used by those skilled in the art according to the strain selected. In the above method, the step of culturing the microorganism is not particularly limited thereto, and may be performed by a known batch culture method, continuous culture method, fed-batch culture method, or the like.
  • the medium and other culture conditions used for the cultivation of the microorganism of the present application may be any medium that is used for the cultivation of ordinary Escherichia microorganisms without any particular limitation, but specifically, the microorganism of the present invention may be suitable carbon source, nitrogen source, personnel In a conventional medium containing inorganic compounds, amino acids and / or vitamins, and the like, it can be cultured under aerobic conditions while controlling temperature, pH and the like.
  • the carbon source herein includes carbohydrates such as glucose, fructose, sucrose, maltose, mannitol, sorbitol and the like; Alcohols such as sugar alcohols, glycerol, pyruvic acid, lactic acid, citric acid and the like; Amino acids such as organic acids, glutamic acid, methionine, lysine, and the like, and the like, but are not limited thereto.
  • natural organic nutrients such as starch hydrolyzate, molasses, blackstrap molasses, rice winters, cassava, sugarcane residue and corn steep liquor can be used, specifically glucose and sterilized pretreated molasses (ie, reducing sugars).
  • Carbohydrates, such as molasses), and other appropriate amounts of carbon sources can be used in various ways without limitation. These carbon sources may be used alone or in combination of two or more thereof.
  • nitrogen source examples include inorganic nitrogen sources such as ammonia, ammonium sulfate, ammonium chloride, ammonium acetate, ammonium phosphate, anmonium carbonate, and ammonium nitrate; Organic nitrogen sources such as amino acids such as glutamic acid, methionine, glutamine, etc., peptones, NZ-amines, meat extracts, yeast extracts, malt extracts, corn steep liquor, casein hydrolysates, fish or their degradation products, skim soy cakes or their degradation products Can be used. These nitrogen sources may be used alone or in combination of two or more kinds, but are not limited thereto.
  • inorganic nitrogen sources such as ammonia, ammonium sulfate, ammonium chloride, ammonium acetate, ammonium phosphate, anmonium carbonate, and ammonium nitrate
  • Organic nitrogen sources such as amino acids such as glutamic acid, methionine, glutamine, etc., peptones, NZ-amines
  • the personnel may include a first potassium phosphate, a second potassium phosphate, or a sodium-containing salt corresponding thereto.
  • a first potassium phosphate sodium chloride, calcium chloride, iron chloride, magnesium sulfate, iron sulfate, manganese sulfate, calcium carbonate and the like may be used, and other amino acids, vitamins and / or suitable precursors may be used, but are not limited thereto.
  • These media or precursors may be added batchwise or continuously to the culture, but are not limited thereto.
  • compounds such as ammonium hydroxide, potassium hydroxide, ammonia, phosphoric acid, sulfuric acid and the like can be added to the culture in an appropriate manner during the culturing of the microorganisms to adjust the pH of the culture.
  • antifoaming agents such as fatty acid polyglycol esters can be used to suppress bubble generation.
  • oxygen or oxygen-containing gas may be injected into the culture, or nitrogen, hydrogen, or carbon dioxide gas may be injected without injecting gas to maintain anaerobic and unaerobic conditions.
  • the temperature of the culture may be 27 ° C to 37 ° C, more specifically 30 ° C to 35 ° C, but is not limited thereto.
  • the incubation period may continue until the desired amount of useful substance is obtained, specifically, may be 10 hours to 100 hours, but is not limited thereto.
  • the step of recovering the O-acetyl homoserine is the desired O-acetyl from the culture medium using a suitable method known in the art according to the culture method of the microorganism of the present application, for example, batch, continuous or fed-batch culture method.
  • Homoserine can be recovered.
  • centrifugation, filtration, anion exchange chromatography, crystallization and HPLC and the like can be used, and can also be used in combination with any suitable method known in the art.
  • the recovery step may include a separation process and / or a purification process.
  • One aspect of the present invention comprises the steps of culturing the Escherichia genus microorganism producing the O-acetyl homoserine of the present invention in a medium; And treating L-methionine with O-acetyl homoserine by treating methyl mercaptan and methionine converting enzyme to O-acetyl homoserine recovered from the microorganism or medium cultured in the culture step or from the microorganism or medium cultured in the culture step. It relates to a method for producing L-methionine comprising the step of converting.
  • O-acetyl homoserine recovered by culturing Escherichia microorganisms producing O-acetyl homoserine in a medium can be produced using methionine using a two-step method (Korean Patent No. 10-0905381). have.
  • L-methionine and organic acid through the enzymatic reaction using an enzyme having the activity of converting O-acetyl homoserine to methionine or a strain containing the enzyme using O-acetyl homoserine and methyl mercaptan as a substrate It includes the process of producing.
  • the methionine converting enzyme includes all enzymes for converting O-acetyl homoserine to methionine, and in particular, may be O-acetylhomoserine sulfhydrylase, but is not limited thereto.
  • the O-acetyl homoserine sulfidylase is a microorganism strain belonging to the genus Leptospira sp., Chromobacterium sp., Hyphomonas sp., More specifically leptospirame O-Acetyl Homoserine Sulfila from microbial strains belonging to Leptospira meyeri, Pseudomonas aurogenosa, Hyphomonas Neptunium, and Chromobacterium Violaceum An aze can be used.
  • the reaction is as follows.
  • E. coli which is a representative microorganism among Escherichia spp.
  • E. coli K12 W3110 ATCC27325
  • ATCC American Type Resource Collection
  • a strain lacking the gene metB SEQ ID NO: 6
  • cystathionine gamma synthase SEQ ID NO: 8
  • the O-acetyl homoserine producing strain thus produced was named W3-BT.
  • An example of such a metB and thrB gene deletion strains is disclosed in Korean Patent No. 10-0905381 or International Publication WO2008 / 013432 (in particular, Korean Patent No. 10-0905381 Example 1-1). And 1-2), the entirety of the specification may be incorporated by reference herein.
  • Strain preparation was prepared pCL_Pcj1_metA (EH) plasmid by the method disclosed in Example 1 and Example 3 of Republic of Korea Patent No. 10-1335841.
  • the pKD3 vector was amplified and obtained by PCR using primers of SEQ ID NO: 23 and SEQ ID NO: 24 to prepare a replacement cassette as a method for introducing and replacing the prepared mutant metA gene into the strain. .
  • the denaturation step using the primers of SEQ ID NOs: 23 and 24 is carried out for 30 seconds at 94 °C
  • the annealing step is carried out for 30 seconds at 55 °C
  • the extension step is carried out for 2 minutes at 72 °C
  • a PCR reaction was repeated 30 times.
  • the metA (EH) portion of the replacement cassette used pCL-Pcj1-metA (EH) as the template, using SEQ ID NO: 19 and SEQ ID NO: 20 primers, and the metA wild type portion using SEQ ID NO: 21 and SEQ ID NO: 22 primers, respectively.
  • the product was obtained.
  • the three PCR products were prepared using metA (EH) replacement cassette containing chloramphenicol marker moieties using SEQ ID NO: 19 and SEQ ID NO: 22 primers, and were previously transformed with pKD46 vector.
  • BT strain was introduced using electroporation.
  • Strain preparation was prepared by the method described in Examples 1-1 to 1-3 of the Republic of Korea Patent Registration No. 10-1117012 pSG-2ppc, pSG-2aspC, pSG-2asd plasmid, W3-BTA strain to the above plasmid Introduced by the method of Example 1-5 of the patent was prepared a 2copy amplified strain of the three genes sequentially.
  • O-acetyl homoserine is not produced at all in wild type W3110, but O-acetyl homoserine (O-AH) was produced in 0.93-g strain of W3-BTA, and the biosynthetic pathway was enhanced. 1.2 g / L was produced in the WCJM strain.
  • E. coli-derived leuE SEQ ID NO: 1
  • O-acetyl homoserine which is disclosed as a membrane protein but has not been disclosed to be associated with O-acetyl homoserine releasing ability and O-acetyl homoserine producing ability.
  • the leuE gene was cloned using the smaI restriction enzyme site of the pCL vector.
  • the denaturation step is 30 seconds at 94 ° C
  • the annealing step is 30 seconds at 55 ° C
  • the extension step is 68 ° C.
  • the reaction was carried out for 1 minute, and the PCR reaction was performed 30 times.
  • the resulting PCR product was electrophoresed on 1.0% agarose gel, and then DNA was purified from the band of 800bp size.
  • the purified DNA was treated with restriction enzyme sma I at 37 ° C. overnight, and once more purified, the leuE and pCL vectors were cloned using T4 ligase. After transforming E.
  • the transformed E. coli DH5 ⁇ was selected from LB plate medium containing 50 ⁇ g / mL of spectinomycin to obtain a plasmid.
  • the prepared plasmids were introduced into strains W-BTA and WCJM, the producers of O-acetyl homoserine, and named W3-BTA / pCL-leuE and WCJM / pCL-leuE, respectively, and the flask for the production capacity of O-acetyl homoserine Evaluation was conducted.
  • the empty vector pCL1920 was introduced into the strains in W3-BTA and WCJM in the same manner as above and named W3-BTA / pCL1920 and WCJM / pCL1920, respectively, and the flask evaluation for the production capacity of O-acetyl homoserine Proceeded.
  • each strain was plated in LB solid medium and then cultured overnight in an incubator at 33 °C.
  • Single colonies of strains cultured overnight in LB plate medium were inoculated in 3 ml LB medium, then incubated at 33 ° C. for 5 hours and again diluted 200-fold in 250 ml Erlenmeyer flasks containing 25 ml O-acetyl homoserine production medium.
  • Table 3 The results are summarized in Table 3 below.
  • Example 2 leuE Initiation codon Altered Plasmid Construction and 0-acetyl Homoserine Productivity evaluation
  • the initiation codon of wild type leuE is known as amino acid coding with gtg.
  • an experiment was performed to change the start codon based on the plasmid prepared in Example 1 to change the start codon to methionine amino acid codon with atg. Specifically, in order to enhance 0-acetyl homoserine releasing ability, the first amino acid was substituted with methionine in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • leuE (ATG) mutations were produced.
  • SEQ ID NO: 145 and SEQ ID NO: 146 primers were used to prepare leuE (ATG) mutations, and mutant leuE (ATG) genes were prepared using a site-directed mutagenesis kit (stratagene, USA).
  • the existing wild-type plasmid WT, the start codon variant plasmid was named WT_ATG and the prepared plasmid was introduced into WCJM to evaluate the production capacity of O-acetyl homoserine in the flask.
  • each strain was plated in LB plate medium and incubated overnight in a 33 ° C. incubator.
  • Strains incubated overnight in LB solid medium were inoculated in the 25 ml titer medium shown above, and then incubated for 40 hours in an incubator at 33 ° C. and 200 rpm, and the results are shown in Table 4.
  • L95V, F30A or F165A mutations were made.
  • the primers of SEQ ID NO: 13 and SEQ ID NO: 14 were used to prepare L95V mutations, F30A used SEQ ID NO: 25 and SEQ ID NO: 26 primers, and F165A used SEQ ID NO: 27 and SEQ ID NO: 28 primers.
  • Mutant leuE genes were prepared using a site-directed mutagenesis kit (stratagene, USA) with each of the above primers.
  • the variant plasmid L95V based on the existing wild-type plasmid WT was named WT_M3, F30A was WT_M4, and F165A was WT_M6.
  • the variant plasmid L95V based on the plasmid WT (ATG) with altered start codon was named WT (ATG) _M3, F30A was WT (ATG) _M4, and F165A was WT (ATG) _M6.
  • the prepared plasmid was introduced into WCJM to evaluate the production capacity of O-acetyl homoserine in the flask.
  • each strain was plated in LB plate medium and incubated overnight in a 33 ° C. incubator.
  • Strains incubated overnight in LB solid medium were inoculated in the 25 ml titer medium shown above, and then cultured in an incubator at 33 ° C. and 200 rpm for 40 hours, and the results are shown in Table 5.
  • the denaturation step using the primers of SEQ ID NO: 15 and SEQ ID NO: 16 for asd, SEQ ID NO: 17 and SEQ ID NO: 18 for pntAB, 30 seconds at 94 °C, The annealing step was performed at 55 ° C. for 30 seconds, and the extension step was performed at 68 ° C. for 3 minutes, and the PCR reaction was performed 30 times. Each resulting PCR product was electrophoresed on 1.0% agarose gel, and then DNA was purified from bands of 1.4 kb (asd) and 3 kb (pntAB) sizes.
  • the two purified genes were linked by sewing PCR (a PCR technique for amplifying using primers at both ends after linking using overlap parts of two genes in the first step without primers). Sewing PCR conditions were carried out 10 times the PCR reaction described above in the first step, and then 20 times the PCR reaction after the addition of the primers of SEQ ID NO: 15 and SEQ ID NO: 18.
  • the asd-pntAB gene combination fragment was prepared and purified by electrophoresis, the restriction enzyme samI with pCL vector was treated at 37 ° C. overnight, and then purified once more, using T4 ligase (ligase).
  • ligase T4 ligase
  • the leuE gene was cloned into the plasmid thus prepared. Specifically, the cloning was carried out using a primer of SEQ ID NO. 29 and SEQ ID NO. 30 to obtain the leuE gene.
  • the denaturation step was 30 seconds at 94 ° C.
  • the annealing step was 30 seconds at 55 ° C., extension.
  • the step was performed at 68 ° C. for 1 minute, and the PCR reaction was performed 30 times.
  • the resulting PCR product was electrophoresed on 1.0% agarose gel, and then DNA was purified from the band of 800bp size.
  • the purified DNA and the plasmid were treated with restriction enzyme kpnI at 37 ° C. overnight, and then purified once more, and leuE and pCL-asd-pntAB vectors were cloned using T4 ligase.
  • transformed E. coli DH5 ⁇ was selected from LB plate medium containing 50 ⁇ g / mL of spectinomycin to obtain a plasmid.
  • the prepared plasmid was introduced into WCJM, an O-acetyl homoserine producer, and the flask evaluation was performed for the ability to produce O-acetyl homoserine.
  • the prepared plasmids were all four, using the wild type and three variants produced in Example 2-1.
  • Four plasmids were introduced into the WCJM strain using electroporation, and flask evaluation was performed in the same manner as in Example 3-1. The results are shown in Table 6 below.
  • Example 4 saturated mutagenesis through leuE Mutation Fabrication and O-acetyl Homoserine Productivity evaluation
  • the mutant leuE gene was prepared by performing a site-directed mutagenesis kit (Stratagene, USA) using the primers shown in Table 7.
  • the prepared plasmid was introduced into the WCJM strain, and the flask was evaluated in the same manner as in Example 3-1. The results are shown in Table 8 below.
  • leuE gene and three variants were introduced by electroporation in the form of plasmid.
  • the introduced strains were named KCCM11146P / pCL1920, KCCM11146P / pCL-leuE WT, KCCM11146P-pCL-leuE M3, KCCM11146P-pCL-leuE M4 or KCCM11146P / pCL-leuE M6.
  • Flask culture evaluation was performed to measure the O-acetyl homoserine production capacity of the leuE gene and variants.
  • O-acetyl homoserine was produced 14.2 g / L in the strain introduced only pCL1920 in the KCCM11146P strain, leuE WT also increased the production of O-acetyl homoserine than the original strain.
  • all three mutants had decreased OD, and the highest production of O-acetyl homoserine was found in M4 at 19.2 g / L, and the production of O-acetyl homoserine was increased in the remaining M3 and M6 mutations. Confirmed.
  • the inventors of the present application confirmed that O-acetyl homoserine production is increased in three strains of leuE M3, M4, and M6 leuE-based leuE strains 'KCCM11146P / pCL-leuE M3, M4, M6', and the strain is 'CA05'. It was named -4009, 'CA05-4010' and 'CA05-4011', and was deposited with the Korea Microorganism Conservation Center (KCCM) on December 15, 2014 under the Treaty of Budapest and was given accession numbers KCCM11645P, KCCM11646P and KCCM11647P.
  • KCCM Korea Microorganism Conservation Center
  • the experiment was performed to produce L-methionine using O-acetyl homoserine sulfidylase, an enzyme having an activity of converting O-acetyl homoserine obtained in Example 4 and converting it into methionine.
  • the conversion enzyme O-acetyl homoserine sulfidylase was prepared by the method shown in Example 1-2 of Korean Patent No. 10-1250651, and the L- produced by performing the conversion reaction by the method described in Example 3 of the patent. Methionine was measured.
  • O-acetyl homoserine was used as a substrate in the culture of KCCM11146P-pCL-leuE M4 obtained in Example 4 of the present application (O-AH concentration 19.2 g / L), the concentration of the resulting L- methionine is shown in the following table Same as 10

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Abstract

본원은 O-아세틸 호모세린을 배출할 수 있는 단백질 및 이의 신규 변이체, 상기 단백질의 발현이 강화된 O-아세틸 호모세린 생산능을 가지는 미생물 및 이를 이용하여 O-아세틸 호모세린을 생산하는 방법에 관한 것이다.

Description

O-아세틸-호모세린을 생산하는 미생물 및 이를 이용하여 O-아세틸-호모세린을 생산하는 방법
본원은 O-아세틸 호모세린을 배출할 수 있는 단백질 및 이의 신규 변이체, 상기 단백질의 발현이 강화된 O-아세틸 호모세린 생산능을 가지는 미생물 및 이를 이용하여 O-아세틸 호모세린을 생산하는 방법에 관한 것이다.
화학 합성과 생물학적 합성을 통해 생산될 수 있는 메치오닌은 사료 및 식품 첨가제뿐만 아니라 수액제, 의약품의 합성 원료로 사용된다. 최근에는, 발효를 통해 생산한 L-메치오닌 전구체로부터 효소전환 반응에 의하여 L-메치오닌을 생산하는 이단계 공법이 공지된 바 있다(국제특허 공개번호 WO2008/013432). 상기의 이단계 공법에서는 메치오닌 전구체로 O-숙시닐 호모세린 (O-succinyl homoserine)과 O-아세틸 호모세린 (O-acetyl homoserine)이 사용될 수 있다고 개시하였으며, 메치오닌의 경제적인 대량 생산을 위하여 메치오닌 전구체를 고수율로 생산하는 것이 매우 중요하다.
LeuE는 류신 배출 단백질(leucine export protein)로 공지되었으며, 호모세린/호모세린 락톤 배출 단백질(Homoserine/homoserine lactone efflux protein, RhtB) 패밀리의 하나로 내막에 존재하는 단백질이며, Putative uncharacterized transport protein으로 류신과 이의 아날로그(analogue)를 배출하는 것으로 알려져 있다.
LeuE와 관련된 종래 기술에서는 leuE(yeaS) 유전자의 아미노산 서열 또는 이의 변이체 강화를 통해 퓨린 뉴클레오시드(purine nucleoside) 또는 퓨린 뉴클레오티드(purine nucleotide)를 생산할 수 있고, 아미노산 생산량이 향상될 수 있음이 공지되었다. 또한, 시스테인의 배출기능을 갖는 leuE 변이체가 알려져 있다.
본원의 발명자들은 O-아세틸-호모세린의 생산을 증가시키기 위해 예의 노력한 결과, O-아세틸-호모세린을 배출하는 활성을 가지는 단백질 및 이의 변이체를 발굴함으로써 본원을 완성하였다.
본원의 하나의 목적은 O-아세틸 호모세린 배출능을 가지는 폴리펩티드를 제공하는 것이다.
본원의 다른 목적은 상기 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것이다.
본원의 또 다른 목적은 O-아세틸 호모세린 배출능을 가지는 폴리펩티드가 포함되거나 과발현된, O-아세틸 호모세린을 생산하는 에스케리키아(Escherichia) 속 미생물을 제공하는 것이다.
본원의 또 다른 목적은 상기 O-아세틸 호모세린을 생산하는 에스케리키아 속 미생물을 배지에서 배양하는 단계; 및
상기 배양단계에서 배양된 미생물 또는 배지에서 O-아세틸 호모세린을 회수하는 단계를 포함하는, O-아세틸 호모세린 생산방법을 제공하는 것이다.
본원의 또 다른 목적은 상기 O-아세틸 호모세린을 생산하는 에스케리키아 속 미생물을 배지에서 배양하는 단계; 및
상기 배양단계에서 배양된 미생물 또는 배지에, 또는 상기 배양단계에서 배양된 미생물 또는 배지에서 회수한 O-아세틸 호모세린에 메틸머캅탄과 메치오닌 전환 효소를 처리하여 O-아세틸 호모세린을 L-메치오닌으로 전환하는 단계를 포함하는, L-메치오닌의 생산방법을 제공하는 것이다.
본원의 내막 단백질 LeuE 또는 LeuE 변이체를 가지는 미생물은 O-아세틸 호모세린 배출능이 증진되어 O-아세틸 호모세린의 생산 효율이 향상되는 바, 본원의 미생물은 O-아세틸 호모세린을 생산하는데 효율적으로 사용될 수 있다. 또한 고효율로 생산된 O-아세틸 호모세린을 이용하면 L-메치오닌을 경제적으로 대량 생산할 수 있다.
상기 목적을 달성하기 위한, 본원의 일 양태는 서열번호 1의 아미노산 서열에서 1번째 아미노산 발린, 30번째 아미노산 류신, 95번째 아미노산 페닐알라닌 또는 165번째 아미노산 페닐알라닌으로 이루어진 그룹에서 선택되는 하나 이상의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, O-아세틸 호모세린 배출능을 가지는 폴리펩티드에 관한 것이다.
본원에서 사용되는 용어, "O-아세틸 호모세린"은 미생물의 메치오닌 생합성 경로상의 특이적 중간체 물질로, L-호모세린의 아세틸 유도체를 의미한다. 이는 호모세린과 아세틸-CoA가 호모세린 아세틸 트랜스퍼라제에 의하여 반응이 촉매되어 생성되는 것으로 알려져 있으며, C6H11NO4의 화학식을 갖는다.
본원에서 사용되는 용어, "O-아세틸 호모세린 배출능을 가지는 폴리펩티드"는 미생물 세포내의 O-아세틸 호모세린을 세포외로 배출하는 기능을 가지는 폴리펩티드를 의미한다. 구체적으로 O-아세틸 호모세린 배출능을 가지는 LeuE 단백질 및 이의 변이체를 의미할 수 있으며, O-아세틸 호모세린 배출능을 가지는 한 특별히 제한되지 않는다.
본원에서 사용되는 용어, "LeuE"는 아미노산 전달체(amino acid transporter)에 대한 호모세린/호모세린 락톤 배출 단백질(Homoserine/homoserine lactone efflux protein, RhtB) 패밀리의 하나로 내막에 존재하는 단백질로 알려져 있으나, 정확한 기능은 알려져 있지 않다. 이에 본원의 발명자들은 최초로 LeuE가 O-아세틸 호모세린을 특이적으로 배출하는 것을 확인하였다.
상기 LeuE는 에스케리키아 속 미생물로부터 유래한 것일 수 있으며, 구체적인 예로 대장균 유래 LeuE일 수 있으나, O-아세틸 호모세린을 배출할 수 있는 기능을 가지는 것이면 미생물 유래에 한정 없이 본원에 포함될 수 있다.
구체적으로, O-아세틸 호모세린 배출능을 가지는 폴리펩티드는 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질일 수 있다. 또한 서열번호 1의 아미노산 서열과 70 % 이상, 구체적으로는 80 % 이상, 보다 구체적으로는 90% 이상의 상동성을 가지며, 실질적으로 서열번호 1의 아미노산 서열과 동일하거나 상응하게 O-아세틸 호모세린을 배출하는 활성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 단백질일 수 있다. 또는 이러한 상동성을 갖는 서열로서 실질적으로 서열번호 1의 아미노산 서열과 동일하거나 상응하게 O-아세틸 호모세린을 배출하는 활성을 갖는 아미노산 서열에서, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열일 수 있으며, 이의 경우도 본원의 범주에 포함됨은 자명하다.
본원에서 사용되는 용어, O-아세틸 호모세린 배출능을 가지는 폴리펩티드의 “변이체”는 천연의 자연 상태 또는 비변이 상태에서의 폴리펩티드가 가지는 배출능에 비하여 O-아세틸 호모세린을 배출하는 능력이 향상된 폴리펩티드를 지칭한다. 구체적으로, 서열번호 1의 아미노산 서열에 하나 이상의 아미노산 변이로 인하여 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 보다 향상된 O-아세틸 호모세린 배출능을 가지는 폴리펩티드이다.
그 예로, 서열번호 1의 아미노산 서열에서 첫번째 아미노산 발린, 30번째 아미노산 류신, 95번째 아미노산 페닐알라닌 또는 165번째 아미노산 페닐알라닌으로 이루어진 그룹에서 선택되는 하나 이상의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 폴리펩티드일 수 있다. 구체적으로 서열번호 1의 아미노산 서열에서 1번째 아미노산 발린이 메치오닌 으로 치환되거나; 30번째 아미노산 페닐알라닌이 알라닌, 트립토판, 류신, 발린, 글리신, 세린, 아스파라긴, 아스파르트산, 히스티딘, 이소류신, 프롤린, 타이로신, 글루타민, 라이신, 글루탐산, 시스테인, 쓰레오닌 및 알지닌으로 이루어진 군으로부터 선택된 것으로 치환되거나; 95번째 아미노산 류신이 발린, 페닐알라닌, 알라닌, 글리신, 트레오닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 히스티딘, 이소류신, 세린, 프롤린, 타이로신, 글루타민, 라이신, 글루탐산, 시스테인, 트립토판 및 알지닌으로 이루어진 군으로부터 선택된 것으로 치환되거나; 또는 165번째 아미노산 페닐알라닌이 알라닌, 트립토판, 류신, 발린, 글리신, 세린, 아스파라긴, 아스파르트산, 히스티딘, 이소류신, 프롤린, 타이로신, 글루타민, 라이신, 글루탐산, 시스테인, 쓰레오닌 및 알지닌으로 이루어진 군으로부터 선택된 것으로 치환된 것일 수 있다. 더욱 구체적으로 서열번호 1의 아미노산 서열에서 1번째 아미노산 발린이 메치오닌으로 치환되거나; 30번째 아미노산 페닐알라닌이 알라닌, 트립토판, 류신, 발린, 글리신, 세린, 아스파라긴, 아스파르트산 및 히스티딘으로 이루어진 군으로부터 선택된 것으로 치환되거나; 95번째 아미노산 류신이 발린, 페닐알라닌, 알라닌, 글리신, 트레오닌, 아스파라긴, 아스파르트산 및 히스티딘으로 이루어진 군으로부터 선택된 것으로 치환되거나; 또는 165번째 아미노산 페닐알라닌이 알라닌, 트립토판, 류신, 발린, 글리신, 세린, 아스파라긴, 아스파르트산 및 히스티딘으로 이루어진 군으로부터 선택된 것으로 치환된 것일 수 있다. 보다 구체적으로 서열번호 1의 아미노산 서열에서 1번째 아미노산 발린이 메치오닌으로 치환되고, 30번째 아미노산 페닐알라닌, 95번째 아미노산 류신 또는 165번째 아미노산 페닐알라닌이 다른 아미노산으로 치환된 것일 수 있다. 보다 더욱 구체적으로 서열번호 2, 133, 134, 137, 138, 141, 또는 142의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드일 수 있다. 구체적으로, 상기 서열과 70% 이상, 구체적으로는 80 % 이상, 보다 구체적으로는 90% 이상의 상동성을 가지며, 실질적으로 상기 변이체의 아미노산 서열과 동일하거나 상응하게 O-아세틸 호모세린 배출능이 향상된 아미노산 서열을 갖는 단백질일 수 있다. 또는 이러한 상동성을 갖는 서열로서 실질적으로 상기 변이체의 아미노산 서열과 동일하거나 상응하게 O-아세틸 호모세린 배출능이 향상된 아미노산 서열에서. 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열일 수 있다. 상기 폴리펩티드는 천연의 자연 상태 또는 비변이 상태에서의 폴리펩티드에 비하여 O-아세틸 호모세린을 배출하는 능력이 향상된 폴리펩티드의 변이체의 예이며, 이에 한정되는 것은 아니다. 본원에서 용어, "천연의 자연상태 또는 비변이 상태”는 본원에서의 해당 폴리펩티드의 도입이나 활성의 변이를 도입하지 않은 상태를 의미한다.
본원에서 사용되는 용어, "상동성"이란, 단백질을 코딩하는 유전자의 아미노산 서열 또는 핵산 서열에 있어서, 특정 비교 영역에서 양 서열을 최대한 일치되도록 정렬 (align)시킨 후 서열 간의 염기 또는 아미노산 잔기의 동일한 정도를 의미한다. 상동성이 충분히 높은 경우 해당 유전자의 발현 산물은 동일하거나 유사한 활성을 가질 수 있다. 상기 서열 동일성의 퍼센트는 공지의 서열 비교 프로그램을 사용하여 결정될 수 있으며, 일례로 BLAST(NCBI), CLC Main Workbench (CLC bio), MegAlignTM(DNASTAR Inc) 등을 들 수 있다.
본원의 일 양태는 상기 O-아세틸 호모세린 배출능을 가지는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 본원에서 상기 O-아세틸 호모세린 배출능을 가지는 폴리펩티드는 앞서 설명한 바와 같다.
예를 들어, 상기 폴리뉴클레오티드는 개시코돈이 ATG로 치환된 것일 수 있고, 서열번호 4, 135, 136, 139, 140 143, 또는 144의 염기 서열일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 유전 암호의 축퇴성(genetic code degeneracy)에 기인하여 동일 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열 및 이의 변이체 또한 본원에 포함된다. 예를 들어, 사용되는 미생물에 따라 최적인 코돈을 갖도록 개변되어 있는 것일 수 있다.
구체적으로, 상기 염기 서열과 70 % 이상, 구체적으로는 80 % 이상, 보다 구체적으로는 90% 이상의 상동성을 가지며, 실질적으로 상기 염기서열과 동일하거나 상응하게 O-아세틸 호모세린을 배출하는 활성을 갖는 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열일 수 있다. 또는 공지의 유전자 서열로부터 조제될 수 있는 프로브, 예를 들면, 상기 염기 서열의 전체 또는 일부에 대한 상보 서열과 엄격한 조건 하에 하이드리드화하여, O-아세틸 호모세린을 배출 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 서열이어도 좋다. 「엄격한 조건」이란, 소위 특이적인 하이브리드가 형성되고, 비특이적 하이브리드가 형성되지 않는 조건을 말한다. 일례를 나타내면, 상동성이 높은 유전자끼리, 예를 들면, 80% 이상, 구체적으로는 90% 이상, 보다 구체적으로는 95% 이상, 더욱 구체적으로는 97% 이상, 특히 구체적으로는 99% 이상의 상동성을 갖는 유전자끼리 하이브리드화하고, 그보다 상동성이 낮은 유전자끼리 하이브리드화하지 않는 조건, 또는 통상의 써던 하이브리드화의 세척 조건인 60℃, 1×SSC, 0.1% SDS, 구체적으로는 60℃, 0.1×SSC, 0.1% SDS, 보다 구체적으로는 68℃, 0.1×SSC, 0.1% SDS에 상당하는 염 농도 및 온도에서, 1회, 구체적으로는 2회 내지 3회 세정하는 조건을 열거할 수 있다(Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001)).
상기 하이브리드화에 사용된 프로브는, 염기서열의 상보 서열의 일부이어도 좋다. 이러한 프로브는, 공지의 서열에 근거하여 작제된 올리고뉴클레오타이드를 프라이머로 하여, 이러한 염기 서열을 포함하는 유전자 단편을 주형으로 하는 PCR에 의해 작제될 수 있다. 예를 들면, 프로브로서는, 300bp 정도 길이의 유전자 단편을 사용할 수 있다. 보다 구체적으로는, 프로브로서, 300bp 정도 길이의 유전자 단편을 사용하는 경우에는, 하이브리드화의 세척 조건으로서는, 50℃, 2×SSC 및 0.1% SDS가 열거된다.
본원에서 사용되는 유전자, 이들이 코딩하는 단백질 서열 및 프로모터 서열 등은 공지의 데이터 베이스에서 얻을 수 있으며, 그 예로 NCBI의 GenBank 등에서 얻을 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본원의 일 양태는 상기 O-아세틸 호모세린 배출능을 가지는 폴리펩티드 또는 이의 변이체 폴리펩티드가 포함되거나 과발현된, O-아세틸 호모세린을 생산하는 미생물에 관한 것이다. 구체적으로, 상기 미생물은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드 또는 이의 변이체 폴리펩티드가 포함되거나 과발현된, O-아세틸 호모세린을 생산하는 미생물일 수 있다.
상기 O-아세틸 호모세린 배출능을 가지는 폴리펩티드 및 변이체 폴리펩티드는 앞서 설명한 바와 같다.
본원에서 사용되는 용어, "O-아세틸 호모세린을 생산하는 미생물"이란 미생물이 배지에서 배양되는 경우, 생물체 내에서 O-아세틸 호모세린을 생산하고 배지내에 이를 분비하는 능력을 갖는 미생물을 의미한다. O-아세틸 호모세린 생산 능력은 천연 또는 인위적 돌연변이 또는 종 개량에 의해 부여되거나 증진될 수 있다. 구체적으로는, O-아세틸 호모세린을 생산하는 미생물은 O-아세틸 호모세린 생산능을 가지는 한 미생물 유래에 상관없이 모두 포함될 수 있다. 일 예로 에스케리키아(Escherichia) 속일 수 있으며, 더욱 구체적으로는 대장균(Escherichia coli)일 수 있다.
한편, 본원에서 O-아세틸 호모세린을 생산하는 미생물은 상기 LeuE와 별개로 O-아세틸 호모세린 생산능을 증진시키기 위해 호모세린 생합성 관련 경로나 O-아세틸 호모세린 배출능력 관련 기작 등 관련 기작에 대해 기존 공지의 변이가 추가적으로 도입된 변이 미생물일 수 있다.
본원의 다른 구체적 일 양태는 상기 O-아세틸 호모세린을 생산하는 미생물에 추가적으로 시스타치오닌 신타아제(cystathionine synthase)의 활성이 불활성화된 것일 수 있다. 구체적으로는, 상기 시스타치오닌 신타아제를 코딩하는 유전자(metB)가 결손되거나 비변이 미생물에 비하여 발현이 약화된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 metB의 아미노산 서열은 공지의 데이터 베이스에서 얻을 수 있으며, 시스타치오닌 신타아제 활성을 갖는 아미노산 서열은 제한 없이 포함될 수 있으나, 그 예로 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖는 단백질일 수 있다. 상기 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖는 단백질은 서열번호 6의 염기서열이 코딩하는 단백질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본원의 다른 구체적 일 양태는 상기 O-아세틸 호모세린을 생산하는 미생물에 추가적으로 호모세린 키나아제(homoserine kinase)의 활성이 불활성화된 것일 수 있다. 구체적으로는, 상기 호모세린 키나아제의 활성이 비변이 미생물의 내재적 활성보다 감소 또는 제거되는 것일 수 있다. 예시적으로, 호모세린 키나아제를 코딩하는 유전자(thrB)가 천연 프로모터에 비하여 약한 프로모터에 연결되거나 약한 활성을 가지도록 변이되거나 결손된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 thrB의 아미노산 서열은 공지의 데이터 베이스에서 얻을 수 있으며, 호모세린 키나아제 활성을 갖는 아미노산 서열은 제한 없이 포함될 수 있으나, 그 예로 서열번호 7의 아미노산 서열을 갖는 단백질일 수 있다. 상기 서열번호 7의 아미노산 서열을 갖는 단백질은 서열번호 8의 염기서열이 코딩하는 단백질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본원에서 용어, 상기 단백질의 "불활성화"는 본래 미생물이 천연 또는 상기 단백질의 비변이 상태에서 가지고 있는 효소의 활성과 비교하였을 때, 그 활성이 감소되는 경우, 전혀 발현이 되지 않는 경우 및 발현이 되더라도 그 활성이 없는 경우를 의미한다. 상기 불활성화는 상기 효소를 코딩하는 유전자의 변이 등으로 효소 자체의 활성이 본래 미생물이 가지고 있는 효소의 활성에 비해 감소하거나 제거된 경우와, 이를 코딩하는 유전자의 발현 저해 또는 번역(translation) 저해 등으로 세포 내에서 전체적인 효소 활성 정도가 천연형 균주에 비하여 낮거나 제거된 경우, 상기 유전자가 일부 또는 전체 결실된 경우, 및 이들의 조합 역시 포함하는 개념으로, 이에 한정되지는 않는다.
이러한 효소 활성의 불활성화는, 당해 분야에 잘 알려진 다양한 방법의 적용으로 달성될 수 있다. 상기 방법의 예로, 상기 효소의 활성이 제거된 경우를 포함하여 상기 효소의 활성이 감소되도록 돌연변이된 유전자로, 염색체상의 상기 효소를 코딩하는 유전자를 대체하는 방법; 상기 효소를 코딩하는 염색체상의 유전자의 발현 조절 서열에 변이를 도입하는 방법; 상기 효소를 코딩하는 유전자의 발현 조절 서열을 활성이 약하거나 없는 서열로 교체하는 방법; 상기 효소를 코딩하는 염색체상의 유전자의 전체 또는 일부를 결실시키는 방법; 상기 염색체상의 유전자의 전사체에 상보적으로 결합하여 상기 mRNA로부터 효소로의 번역을 저해하는 안티센스 올리고뉴클레오티드(예컨대, 안티센스 RNA)를 도입하는 방법; 상기 효소를 코딩하는 유전자의 SD 서열 앞단에 SD 서열과 상보적인 서열을 인위적으로 부가하여 2차 구조물을 형성시켜 리보솜(ribosome)의 부착이 불가능하게 만드는 법 및 해당 서열의 ORF(open reading frame)의 3' 말단에 역전사되도록 프로모터를 부가하는 RTE(Reverse transcription engineering) 방법 등이 있으며, 이들의 조합으로도 달성할 수 있으나, 상기 예에 의해 특별히 제한되는 것은 아니다.
상기 발현 조절 서열을 변형하는 방법은 상기 발현 조절 서열의 활성을 더욱 약화하도록 핵산 서열을 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합으로 발현 조절 서열상의 변이를 유도하여 수행하거나, 더욱 약한 활성을 갖는 핵산 서열로 교체함으로써 수행할 수 있다. 상기 발현 조절서열에는 프로모터, 오퍼레이터 서열, 리보좀 결합부위를 코딩하는 서열, 및 전사와 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
아울러, 염색체상의 유전자 서열을 변형하는 방법은 상기 효소의 활성을 더욱 약화하도록 유전자 서열을 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합으로 서열상의 변이를 유도하여 수행하거나, 더욱 약한 활성을 갖도록 개량된 유전자 서열 또는 활성이 없도록 개량된 유전자 서열로 교체함으로써 수행할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 효소를 코딩하는 유전자의 일부 또는 전체를 결실하는 방법은, 세균 내 염색체 삽입용 벡터를 통해 염색체 내 내재적 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 일부 핵산 서열이 결실된 폴리뉴클레오티드 또는 마커 유전자로 교체함으로써 수행될 수 있다. 이러한 유전자의 일부 또는 전체를 결실하는 방법의 일례로 상동 재조합에 의하여 유전자를 결실시키는 방법을 사용할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
상기에서 "일부"란, 폴리뉴클레오티드의 종류에 따라서 상이하지만, 구체적으로는 1 내지 300개, 더욱 구체적으로는 1 내지 100개, 보다 더욱 구체적으로는 1 내지 50개일 수 있으나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다.
상기에서 "상동 재조합(homologous recombination)"이란, 서로 상동성을 지닌 유전자 사슬의 좌위에서 연결 교환을 통해 일어나는 유전자 재조합을 의미한다.
아울러, 본원의 다른 구체적 일 양태는 상기 O-아세틸 호모세린을 생산하는 미생물에 추가적으로 호모세린 아세틸 트랜스퍼라제(homoserine acetyltransferase)의 활성이 비변이 미생물에 비하여 강화된 것일 수 있다. 구체적으로는, 상기 호모세린 아세틸 트랜스퍼라제의 활성이 비변이 미생물의 활성보다 증가되는 것일 수 있으며, 특히 활성이 강화된 호모세린 아세틸 트랜스퍼라제를 코딩하는 변이형 metA 유전자가 도입된 것일 수 있다. 상기 변이형 metA 유전자는 호모세린 아세틸 트랜스퍼라제의 111번 아미노산을 글루탐산으로 치환하고, 112번 아미노산을 히스티딘으로 치환한 것을 코딩하는 유전자일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 변이형 metA는 호모세린 아세틸 트랜스퍼라제의 활성이 야생형보다 활성이 강화된 아미노산 서열은 제한 없이 포함될 수 있으나, 그 예로 서열번호 10의 아미노산 서열을 갖는 단백질일 수 있다. 이와 같은 변이형 metA 유전자의 제조 및 이의 활용, 상기 호모세린 아세틸 트랜스퍼라제 강화 균주 등에 대한 내용의 일 예는 한국등록특허 제10-1335841에 개시되어 있으며, 상기 특허의 명세서 전체는 본원의 참고자료로 포함될 수 있다.
또한, 본원의 다른 일 양태는 상기 O-아세틸 호모세린을 생산하는 미생물에 추가적으로 아스파테이트 세미알데하이드 디하이드로게나아제 (aspartate semialdehyde dehydrogenase), 피리딘 뉴클레오티드 트랜스하이드로게나아제 (pyridine nucleotide transhydrogenase) 또는 이들의 조합의 활성이 비변이 미생물에 비하여 강화된, O-아세틸 호모세린을 생산하는 에스케리키아 속 미생물일 수 있다.
또한, 본원의 다른 구체적 양태는 상기 O-아세틸 호모세린을 생산하는 미생물에 추가적으로 포스포에놀파이루베이트 카복실라아제(phosphoenolpyruvate carboxylase), 아스파테이트 아미노트랜스퍼라아제 또는 이들의 조합의 활성이 비변이 미생물에 비하여 강화된 것일 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 단백질 활성의 "강화"는, 미생물이 보유하고 있는 단백질의 활성 상태를 향상시키는 것을 의미한다. 단백질의 활성의 강화는 목적 단백질의 활성의 강화와 같이 각 단백질의 활성을 천연의 자연상태 또는 당해 단백질의 비변이 상태보다 강화시킬 수 있는 한, 제한되지 않는다. 그 예로, i) 각 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 카피수 증가, ii) 상기 폴리뉴클레오티드의 발현이 증가하도록 발현 조절 서열의 변형, iii) 각 단백질의 활성이 강화되도록 염색체 상의 상기 폴리뉴클레오티드 서열의 변형 및 iv) 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법에 의하여 수행될 수 있다. 구체적으로는 각 단백질을 코딩하는 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 염색체에 삽입하는 방법, 상기 폴리뉴클레오티드를 벡터 시스템에 도입하여 미생물에 도입하는 방법, 각 단백질을 코딩하는 염기서열의 상류에 개량된 활성을 나타내는 프로모터를 도입하거나 프로모터에 변이를 준 각 단백질을 도입하는 방법, 5'-UTR 지역의 염기서열을 변형시키는 방법 및 각 단백질을 코딩하는 염기서열의 변이체를 도입하는 방법으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법에 의하여 수행되는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본원의 일 양태는 상기 O-아세틸 호모세린을 생산하는 에스케리키아 속 미생물을 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 O-아세틸 호모세린 생산방법에 관한 것이다.
구체적으로, 상기 O-아세틸 호모세린을 생산하는 에스케리키아 속 미생물을 배지에서 배양하는 단계; 및 상기 배양 단계에서 배양된 미생물 또는 배지에서 O-아세틸 호모세린을 회수하는 단계를 포함하는 생산방법에 관한 것이다.
본원에서 용어, "배양"은 상기 미생물을 적당히 조절된 환경 조건에서 생육시키는 것을 의미한다. 본원의 배양과정은 당업계에 알려진 적당한 배지와 배양조건에 따라 이루어질 수 있다. 이러한 배양 과정은 선택되는 균주에 따라 당업자가 용이하게 조정하여 사용할 수 있다. 상기 방법에 있어서, 상기 미생물을 배양하는 단계는, 특별히 이에 제한되지 않으나, 공지된 회분식 배양방법, 연속식 배양방법, 유가식 배양방법 등에 의해 수행될 수 있다. 본원의 미생물의 배양에 사용되는 배지 및 기타 배양 조건은 통상의 에스케리키아속 미생물의 배양에 사용되는 배지라면 특별한 제한 없이 어느 것이나 사용할 수 있으나, 구체적으로는 본원의 미생물을 적당한 탄소원, 질소원, 인원, 무기화합물, 아미노산 및/또는 비타민 등을 함유한 통상의 배지 내에서 호기성 조건 하에서 온도, pH 등을 조절하면서 배양할 수 있다.
본원에서 상기 탄소원으로는 글루코오스, 프룩토오스, 수크로오스, 말토오스, 만니톨, 소르비톨 등과 같은 탄수화물; 당 알코올, 글리세롤, 피루브산, 락트산, 시트르산 등과 같은 알코올; 유기산, 글루탐산, 메티오닌, 리신 등과 같은 아미노산 등이 포함될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 전분 가수분해물, 당밀, 블랙스트랩 당밀, 쌀겨울, 카사버, 사탕수수 찌꺼기 및 옥수수 침지액 같은 천연의 유기 영양원을 사용할 수 있으며, 구체적으로는 글루코오스 및 살균된 전처리 당밀(즉, 환원당으로 전환된 당밀) 등과 같은 탄수화물이 사용될 수 있으며, 그 외의 적정량의 탄소원을 제한 없이 다양하게 이용할 수 있다. 이들 탄소원은 단독으로 사용되거나 2 종 이상이 조합되어 사용될 수 있다.
상기 질소원으로는 암모니아, 황산암모늄, 염화암모늄, 초산암모늄, 인산암모늄, 탄산안모늄, 질산암모늄 등과 같은 무기질소원; 글루탐산, 메티오닌, 글루타민 등과 같은 아미노산, 펩톤, NZ-아민, 육류 추출물, 효모 추출물, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 카세인 가수분해물, 어류 또는 그의 분해생성물, 탈지 대두 케이크 또는 그의 분해 생성물 등과 같은 유기 질소원이 사용될 수 있다. 이들 질소원은 단독으로 사용되거나 2 종 이상이 조합되어 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 인원으로는 인산 제1칼륨, 인산 제2칼륨, 또는 이에 대응되는 소디움-함유 염 등이 포함될 수 있다. 무기화합물로는 염화나트륨, 염화칼슘, 염화철, 황산마그네슘, 황산철, 황산망간, 탄산칼슘 등이 사용될 수 있으며, 그 외에 아미노산, 비타민 및/또는 적절한 전구체 등이 포함될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 이들 배지 또는 전구체는 배양물에 회분식 또는 연속식으로 첨가될 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.
본원에서, 미생물의 배양 중에 수산화암모늄, 수산화칼륨, 암모니아, 인산, 황산 등과 같은 화합물을 배양물에 적절한 방식으로 첨가하여, 배양물의 pH를 조정할 수 있다. 또한, 배양 중에는 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 또한, 배양물의 호기 상태를 유지하기 위하여, 배양물 내로 산소 또는 산소 함유 기체를 주입하거나 혐기 및 미호기 상태를 유지하기 위해 기체의 주입 없이 혹은 질소, 수소 또는 이산화탄소 가스를 주입할 수 있다.
배양물의 온도는 27℃ 내지 37℃일 수 있으며, 보다 구체적으로는 30℃ 내지 35℃일 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 배양 기간은 원하는 유용 물질의 생성량이 수득될 때까지 계속될 수 있으며, 구체적으로는 10 시간 내지 100 시간일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
상기 O-아세틸 호모세린을 회수하는 단계는 본원의 미생물의 배양 방법, 예를 들어 회분식, 연속식 또는 유가식 배양 방법 등에 따라 당해 기술 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 배양액으로부터 목적하는 O-아세틸 호모세린을 회수할 수 있다. 예를 들어, 원심분리, 여과, 음이온 교환 크로마토그래피, 결정화 및 HPLC 등이 사용될 수 있으며, 또한 당해 분야에 공지된 적합한 방법을 조합하여 사용될 수 있다.
상기 회수 단계는 분리 공정 및/또는 정제 공정을 포함할 수 있다.
본원의 일 양태는 상기 본원의 O-아세틸 호모세린을 생산하는 에스케리키아 속 미생물을 배지에서 배양하는 단계; 및 상기 배양단계에서 배양된 미생물 또는 배지에, 또는 상기 배양단계에서 배양된 미생물 또는 배지에서 회수한 O-아세틸 호모세린에 메틸 머캅탄과 메치오닌 전환 효소를 처리하여 O-아세틸 호모세린을 L-메치오닌으로 전환하는 단계를 포함하는 L-메치오닌 생산방법에 관한 것이다.
예를 들어, O-아세틸 호모세린을 생산하는 에스케리키아 속 미생물을 배지에서 배양하여 회수된 O-아세틸 호모세린을 2단계 공법(대한민국 등록특허 제10-0905381호)을 사용하여 메치오닌을 생산할 수 있다.
상기 2단계 공법은 O-아세틸 호모세린과 메칠 머캅탄을 기질로 이용하여 O-아세틸 호모세린을 메치오닌으로 전환하는 활성을 갖는 효소 또는 상기 효소를 포함한 균주를 이용한 효소반응을 통하여 L-메치오닌 및 유기산을 생산하는 공정을 포함한다.
상기 메치오닌 전환 효소는 O-아세틸 호모세린을 메치오닌으로 전환하는 모든 효소를 포함하며, 특히 O-아세틸 호모세린 설피드릴라제(Oacetylhomoserine sulfhydrylase)일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
구체적으로 상기 O-아세틸 호모세린 설피드릴라제는 렙토스피라속(Leptospira sp.), 크로모박테리움속(Chromobacterium sp.), 하이포모나스속(Hyphomonas sp.)에 속하는 미생물 균주, 보다 구체적으로는 렙토스피라 메에리(Leptospira meyeri), 슈도모나스 애루기노사 (Pseudomonas aurogenosa), 하이포모나스 넵튜니움(Hyphomonas Neptunium), 크로모박테리움 비오라슘 (Chromobacterium Violaceum)에 속하는 미생물 균주로부터 유래된 O-아세틸 호모세린 설피드릴라아제가 사용될 수 있다.
상기의 반응은 하기와 같다.
CH3SH + O-아세틸-L-호모세린 <=> 아세테이트 + 메치오닌
이와 같은 추가 메치오닌 생산 공정에 대해서는 대한민국 등록 특허 제10-0905381호에 개시되어 있으며, 상기 특허의 명세서 전체는 본원의 참고자료로서 포함될 수 있다.
이하 실시예를 통하여 본원을 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본원을 예시적으로 설명하기 위한 것으로, 본원의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
참고예 1: O-아세틸 호모세린 생산능을 가지는 균주의 제작
1-1. 야생형 대장균에서의 metB 유전자 결손
O-아세틸 호모세린 생산 균주를 제작하기 위하여 에스케리키아 속 미생물 중에서 대표적인 미생물인 대장균을 사용하였다. 이를 위해, 야생형 대장균인 E. coli K12 W3110(ATCC27325)을 미국생물자원센터(American Type Culture Collection, ATCC)로부터 입수하여 사용하였다. 상기 대장균 W3110 균주에, 시스타치오닌 감마 신타아제를 코딩하는 유전자 metB(서열번호 6) 및 호모세린 키나아제를 코딩하는 유전자 thrB(서열번호 8)가 결손된 균주를 제작하였다. 이렇게 제작된 O-아세틸 호모세린 생산균주를 W3-BT로 명명하였다. 이와 같은 metB 및 thrB 유전자 결실 균주 등에 대한 내용의 일 예는 대한민국 등록특허 제10-0905381호 또는 국제공개 WO2008/013432호에 개시되어 있으며(특히, 대한민국 등록특허 제10-0905381호 실시예 1-1 및 1-2 참고), 상기 특허의 명세서 전체는 본원의 참고자료로서 포함될 수 있다.
1-2. 호모세린 아세틸 트랜스퍼라제 활성을 가지는 변이형 metA 유전자 도입 균주 제작
상기 참고예 1-1에서 수득한 균주에 호모세린 아세틸 트랜스퍼라제(homoserine acetyltransferase) 활성을 강화하기 위하여, 균주에 강화된 활성을 가지는 호모세린 아세틸 트랜스퍼라제를 코딩하는 변이형 metA 유전자(서열번호 10)를 도입하고자 하였다.
균주 제작은 대한민국 등록특허 제10-1335841호의 실시예 1 및 실시예 3에 개시된 방법으로 pCL_Pcj1_metA(EH) 플라스미드를 제작하였다.
다음으로, 상기 제작한 변이형 metA 유전자를 균주 내로 도입하여 치환하기 위한 방법으로 교체 카세트를 제작하기 위하여 pKD3 벡터를 주형으로, 서열번호 23 및 서열번호 24의 프라이머를 이용한 PCR을 통해 증폭 및 수득하였다. 구체적으로, 서열번호 23 및 24의 프라이머를 이용하여 변성(denaturation) 단계는 94℃에서 30초, 어닐링(annealing) 단계는 55℃에서 30초, 연장(extension) 단계는 72℃에서 2분 동안 실시하고, 이를 30 회 반복 수행하는 PCR 반응을 진행하였다.
교체 카세트의 metA(EH) 부분은 pCL-Pcj1-metA(EH)를 주형으로 서열번호 19 및 서열번호 20 프라이머를 이용하였고, metA 야생형 부분은 서열번호 21 및 서열번호 22 프라이머를 이용하여 각각의 PCR 산물을 얻었다. 3개의 PCR 산물을 서열번호 19 및 서열번호 22 프라이머를 이용하여 클로람페니콜 마커 부분을 포함하는 metA(EH) 교체 카세트를 제작하여, pKD46 벡터로 미리 형질 전환시킨 상기 참고예 1-1에서 제작된 W3-BT 균주에 전기천공을 이용하여 도입하였다.
상기 과정을 통해 도입이 확인된 균주는 다시 pCP20 벡터로 형질전환시켜 LB 배지에서 배양하였으며 클로람페니콜 마커가 제거되고 metA 유전자가 metA(EH)로 교체된 균주를 W3-BTA라 명명하였다.
이와 같은 호모세린 아세틸 트랜스퍼라제 강화 균주 등에 대한 내용의 일 예는 대한민국 등록특허 제10-1335841호 또는 국제공개 WO2012/087039호에 개시되어 있으며, 상기 특허의 명세서 전체는 본원의 참고자료로서 포함될 수 있다.
1-3. ppc , aspC 및 asd 유전자를 2 copy 포함하는 균주의 제작
상기 참고예 1-2에서 제작한 W3-BTA 균주의 O-아세틴 호모세린 생산능을 증가시키기 위하여, 기존에 알려진 생합성 경로 강화 전략을 도입하였다. 포스포에놀파이루베이트로부터 옥살로아세테이트의 생합성에 관여하는 포스포에놀파이루베이트 카복실라아제(phosphoenolpyruvate carboxylase), 옥살로아세테이트로부터 아스파테이트의 생합성에 관여하는 아스파테이트 아미노트랜스퍼라아제 및 β-아스파틸 포스페이트로부터 호모세린의 생합성에 관여하는 아스파테이트 세미할데히드 디히드로게나아제(aspartate-semialdehyde dehydrogenase), 즉, ppc 유전자, aspC 유전자 및 asd 유전자를 2 copy로 증폭시킨 균주를 제작하고자 하였다.
균주 제작은 대한민국 특허 등록번호 제10-1117012호의 실시예 1-1 내지 1-3에 개시된 방법으로 pSG-2ppc, pSG-2aspC, pSG-2asd 플라스미드를 제작하고, W3-BTA 균주에 상기의 플라스미드를 도입하고 상기 특허의 실시예 1-5의 방법으로 상기의 3가지 유전자를 순차적으로 2copy 증폭된 균주를 제작하였다. 이렇게 제작된 균주를 W3-BTA2PCD(=WCJM)라 명명하였다.
이와 같은 포스포에놀파이루베이트 카복실라아제, 아스파테이트 아미노트랜스퍼라아제 및 아스파테이트 세미할데히드 디히드로게나아제 강화 균주 등에 대한 내용의 일 예는 대한민국 등록특허 제 10-0905381호 또는 국제공개 WO2008/013432호에 개시되어 있으며, 상기 특허의 명세서 전체는 본원의 참고자료로서 포함될 수 있다.
1-4. 플라스크 배양 실험
상기 참고예 1-2 및 1-3에서 제작된 균주의 O-아세틸 호모세린 생산량을 실험하기 위하여 삼각플라스트 배양을 실시하였다. LB 배지에 W3110, W3-BTA, WCJM 균주를 접종하여 33 ℃에서 하룻밤 배양한 후, 단일 콜로니를 3 mL LB 배지에 접종한 후 33 ℃에서 5시간 배양하고, 다시 25 mL O-아세틸 호모세린 생산 배지를 포함한 250 mL 삼각플라스크에 200배 희석하여 33 ℃ 200 rpm에서 30 시간 배양하여 HPLC 분석을 통하여 O-아세틸 호모세린 생산량을 확인하였다. 이에 사용한 배지조성은 하기 표 1에 정리하였다.
O-아세틸 호모세린 생산 플라스크 배지 조성
조성 농도(리터당)
포도당 40 g
황산암모늄 17 g
KH2PO4 1.0 g
MgSO4·7H2O 0.5 g
FeSO4·7H2O 5 mg
MnSO4·8H2O 5 mg
ZnSO4 5 mg
탄산칼슘 30 g
효모 엑기스 2 g
메치오닌 0.15 g
쓰레오닌 0.15 g
상기 배지를 이용하여 30 시간 배양한 HPLC 분석을 통하여 O-아세틸 호모세린 생산량을 확인한 결과는 하기 표 2에 정리하였다.
플라스크 배양을 통한 O-아세틸 호모세린 생산
OD(562 nm) 포도당 소모(g/L) O-AH(g/L)
W3110 14.2 40 0
W3-BTA 8.4 36 0.9
WCJM 9.6 35 1.2
상기 표 2에서 확인할 수 있듯이, 야생형 W3110에서는 O-아세틸 호모세린이 전혀 생성되지 않지만, W3-BTA 균주에서 O-아세틸 호모세린(O-AH)이 0.9 g/L 생성되었고, 생합성 경로가 강화된 WCJM 균주에서는 1.2 g/L가 생성되었다.
실시예 1 : O-아세틸 호모세린 생산능을 증가시키는 막 단백질의 선별
본원의 발명자들은 막단백질로 개시되었으나 O-아세틸 호모세린 배출능 및 O-아세틸 호모세린 생산능과의 연관성이 개시된 바 없는 대장균 유래 leuE(서열번호 1)를 O-아세틸 호모세린 생산에 적용해보았다.
균주에서 leuE 유전자를 강화하기 위하여 leuE 유전자를 pCL 벡터의 smaⅠ 제한효소 자리를 이용하여 클로닝을 진행하였다.
우선, leuE 유전자를 얻기 위하여 서열번호 11 및 12의 프라이머를 이용하여 변성(denaturation) 단계는 94℃에서 30초, 어닐링(annealing) 단계는 55℃에서 30초, 연장(extension) 단계는 68℃에서 1분 동안 실시하고, 이를 30회 수행하는 PCR 반응을 진행하였다. 그 결과 얻어진 PCR 산물을 1.0% 아가로즈 겔에서 전기영동한 후, 800bp 크기의 밴드로부터 DNA를 정제하였다. 정제된 DNA를 제한효소 smaⅠ로 밤새 37℃에서 처리해 준 후, 한 번 더 정제 후, T4 리가아제(ligase)를 이용하여 leuE 와 pCL 벡터를 클로닝하였다. 클로닝된 플라스미드를 이용하여 대장균 DH5α를 형질전환 한 후, 스펙티노마이신 (spectinomycin) 50 ㎍/mL를 포함하는 LB 평판 배지에서 형질전환된 대장균 DH5α를 선별하여 플라스미드를 획득하였다. 제작된 플라스미드를 O-아세틸 호모세린 생산주인 W3-BTA 및 WCJM에 균주를 도입하여, 각각 W3-BTA/pCL-leuE 및 WCJM/pCL-leuE라 명명하였고, O-아세틸 호모세린의 생산능에 대한 플라스크 평가를 진행하였다.
또한 대조군으로, W3-BTA 및 WCJM에 균주에 상기와 같은 방법으로 공벡터 pCL1920을 도입하여 각각 W3-BTA/pCL1920 및 WCJM/pCL1920로 명명하였고, 상기 O-아세틸 호모세린의 생산능에 대한 플라스크 평가를 진행하였다.
구체적으로, 각각의 균주를 LB 고체 배지에 도말 한 후 33 ℃ 배양기에서 밤새 배양하였다. LB 평판 배지에 밤새 배양한 균주의 단일 콜로니를 3 ml LB 배지에 접종한 후, 이를 33 ℃에서 5시간 배양하고, 다시 25 ml O-아세틸 호모세린 생산배지를 포함한 250 ml 삼각 플라스크에서 200배 희석하여 33 ℃, 200 rpm의 배양기에서 30시간 배양하였으며, HPLC 분석을 통하여 O-아세틸 호모세린 생산량을 확인하였다. 이의 결과를 정리하면 하기 표 3과 같다.
플라스크 배양을 통한 O-아세틸 호모세린 생산 측정
OD(562nm) 포도당 소모(g/L) O-AH(g/L)
W3-BTA/pCL1920 9.5 35 0.9
W3-BTA/pCL-leuE 8.2 36 1.0
WCJM/pCL1920 9.6 35 1.2
WCJM/pCL-leuE 8.4 36 1.5
상기 표 3에서 확인할 수 있듯이, WCJM에 leuE 플라스미드의 도입은 공벡터가 들어간 대조군 균주보다 OD가 더 낮았고, 포도당 소모도 향상하였다. 하지만 O-아세틸 호모세린은 1.5 g/L가 생산되어 leuE의 야생형 도입으로써 O-아세틸 호모세린은 생산능이 향상되었다는 결과는 얻기 힘들었으나, OD가 제어되고 당소모 속도가 향상됨으로 보아 배출능의 가능성을 확인하였고, 구조 모델링을 통해 야생형 보다 O-아세틸 호모세린의 배출능이 강화될 수 있는 변이를 선별하고자 하였다.
실시예 2 : leuE 개시코돈 변경 플라스미드 제작 및 0-아세틸 호모세린 생산능 평가
야생형의 leuE의 개시코돈은 gtg 로 발린 아미노산 코딩으로 알려져 있다. leuE 단백질의 강화효과를 확인하기 위하여 개시코돈을 atg 로 메치오닌 아미노산 코돈으로 변경하고자 실시예 1에서 제작한 플라스미드를 기본으로 하여 개시코돈을 변경하는 실험을 진행하였다. 구체적으로는, 0-아세틸 호모세린 배출능을 강화시키기 위해 서열번호 1의 아미노산 서열에서 1번째 아미노산을 메치오닌으로 치환하였다.
더욱 구체적으로는 leuE(ATG) 변이를 제작하였다. leuE(ATG) 변이를 제작하기 위해 서열번호 145 및 서열번호 146 프라이머를 이용하였고 위치-특이적 돌연변이 키트(site-directed mutagenesis kit, stratagene, 미국)을 이용하여 변이형 leuE(ATG) 유전자를 제조하였다. 기존 야생형 플라스미드를 WT, 개시코돈 변이형 플라스미드는 WT_ATG 로 명명하고 제작된 플라스미드를 WCJM에 도입하여 플라스크에서 O-아세틸 호모세린의 생산능을 평가하였다.
구체적으로, 각각의 균주를 LB 평판 배지에 도말한 후 33 ℃ 배양기에서 밤새 배양하였다. LB 고체 배지에 밤새 배양한 균주를 상기에서 나타낸 25 ㎖ 역가 배지에 접종한 다음, 이를 33 ℃, 200 rpm의 배양기에서 40 시간 배양하였으며, 이의 결과를 표 4에 나타내었다.
플라스크 배양을 통한 O-아세틸 호모세린 생산 측정
OD(562 nm) 포도당 소모(g/L) O-AH(g/L)
WCJM/pCL-leuE WT 8.4 36 1.5
WCJM/pCL-leuE WT(ATG) 7.6 39 2.6
상기 표 4에서 확인할 수 있듯이, pCL-leuE WT(ATG) 개시코돈 변이 플라스미드가 도입된 균주가 야생형보다 OD가 감소하였으나, 빠른 당 소모 속도를 보였고, O-아세틸 호모세린이 2.6 g/L 생산되어 야생형 대비 무려 173% 생산능이 증가되었다.
실시예 3 : leuE 변이 플라스미드 제작 및 O-아세틸 호모세린 생산능 평가
3-1. leuE 변이 플라스미드 제작
실시예 1과 2에서 제작한 플라스미드pCL-leuE WT 과 pCL-leuE WT(ATG) 2종을 기본으로 하여 leuE 야생형보다 배출능이 강할 것이라고 예상하는 3개의 변이를 각각 제작하는 실험을 진행하였다. 구체적으로는, O-아세틸 호모세린 배출능을 강화시키기 위해 구조 모델링을 통해 leuE 변이위치를 선별하였으며, 서열번호 1과 2의 아미노산 서열에서 30번째 아미노산, 95번째 아미노산, 165번째 아미노산을 다른 아미노산으로 치환하였다.
더욱 구체적으로는, L95V, F30A 또는 F165A 변이를 제작하였다. L95V 변이를 제작하기 위해 서열번호 13 및 서열번호 14의 프라이머를 이용하였으며, F30A는 서열번호 25 및 서열번호 26 프라이머, F165A는 서열번호 27 및 서열번호 28 프라이머를 이용하였다. 상기 각각의 프라이머와 함께 위치-특이적 돌연변이 키트(site-directed mutagenesis kit, stratagene, 미국)을 이용하여 변이형 leuE 유전자를 제조하였다. 기존 야생형 플라스미드 WT를 기반으로한 변이형 플라스미드 L95V는 WT_M3, F30A는 WT_M4, F165A는 WT_M6으로 명명하였다. 또한 개시코돈이 변경된 플라스미드 WT(ATG)를 기반으로 한 변이형 플라스미드 L95V는 WT(ATG)_M3, F30A는 WT(ATG)_M4, F165A는 WT(ATG)_M6으로 명명하였다. 제작된 변이형 플라스미드를 WCJM에 도입하여 플라스크에서 O-아세틸 호모세린의 생산능을 평가하였다.
구체적으로, 각각의 균주를 LB 평판 배지에 도말한 후 33 ℃ 배양기에서 밤새 배양하였다. LB 고체 배지에 밤새 배양한 균주를 상기에서 나타낸 25 ㎖ 역가 배지에 접종한 다음, 이를 33 ℃, 200 rpm의 배양기에서 40 시간 배양하였으며, 이의 결과를 표 5에 나타내었다.
플라스크 배양을 통한 O-아세틸 호모세린 생산 측정
OD(562 nm) 포도당 소모(g/L) O-AH(g/L)
WCJM/pCL1920 9.6 35 1.3
WCJM/pCL-leuE WT 8.4 36 1.5
WCJM/pCL-leuE WT_M3 8.2 38 2.3
WCJM/pCL-leuE WT_M4 7.9 38 3.7
WCJM/pCL-leuE WT_M6 8.0 39 4.8
WCJM/pCL-leuE WT(ATG) 7.6 39 2.6
WCJM/pCL-leuE WT(ATG)_M3 7.5 40 3.1
WCJM/pCL-leuE WT(ATG)_M4 7.3 39 3.6
WCJM/pCL-leuE WT(ATG)_M6 7.5 40 4.9
상기 표 5에서 확인할 수 있듯이, leuE 변이 플라스미드가 도입된 균주의 경우 3개 변이 모두 야생형보다 OD가 감소하였으나, 빠른 당 소모 속도를 보였고, 특히 leuE WT(ATG)_M6의 경우 O-아세틸 호모세린이 4.9 g/L 생산되어 생산능이 가장 높았다. 따라서 상기 본원의 변이형 3종 모두 O-아세틸 호모세린의 생산능이 증가됨을 확인하였고, 또한 leuE 개시코돈을 변경하여 단백질 발현량을 증가시켰을 시에 0-아세틸 호모세린 생산능이 더욱 증가될 수 있음을 확인하었다.
3-2. 생합성 경로 유전자 및 변이형 플라스미드 제작
O-아세틸 호모세린의 생산능을 극대화시키기 위해 호모세린까지의 생합성 경로를 강화시키는 플라스미드를 제작하였다. 아스파테이트 세미알데하이드 디하이드로게나아제 (aspartate semialdehyde dehydrogenase)와 피리딘 뉴클레오타이드 트랜스하이드로게나아제 (pyridine nucleotide transhydrogenase)와 LeuE 야생형 및 변이체를 pCL 벡터에 클로닝하기 위해 우선 pCL벡터에 유전자 asd와 pntAB를 도입하였다.
먼저, asd와 pntAB 유전자를 수득하기 위하여, asd에 대해서는 서열번호 15 및 서열번호 16 프라이머, pntAB에 대해서는 서열번호 17 및 서열번호 18의 프라이머를 이용하여 변성(denaturation) 단계는 94℃에서 30초, 어닐링(annealing) 단계는 55℃에서 30초, 연장(extension) 단계는 68℃에서 3분 동안 실시하고, 이를 30 회 수행하는 PCR 반응을 진행하였다. 그 결과 얻어진 각각의 PCR 산물을 1.0% 아가로즈 겔에서 전기영동한 후, 1.4kb(asd)와 3kb(pntAB) 크기의 밴드로부터 DNA를 정제하였다.
상기 정제된 두 개의 유전자를 sewing PCR(첫 단계에서는 프라이머 없이 두 유전자의 overlap 부분을 이용하여 연결 후, 양 끝의 프라이머를 이용해 증폭하는 PCR 기법)을 통해 연결하였다. Sewing PCR 조건은 첫 단계에서 상기에서 설명한 PCR 반응을 10회 수행하고, 이후 서열번호 15 및 서열번호 18의 프라이머를 첨가한 후 PCR 반응 20회를 수행하였다. 이를 통해 asd-pntAB 유전자 조합 단편을 제작하였고, 이를 전기영동에서 정제 후, pCL 벡터와 함께 제한 효소 samI을 밤새 37 ℃에서 처리해 준 후, 한 번 더 정제 후, T4 리가아제(ligase)를 이용하여 pCL-asd-pntAB 플라스미드를 제작하였다.
이렇게 제작된 플라스미드에 leuE 유전자를 클로닝하였다. 상기 클로닝은 구체적으로, leuE 유전자를 얻기 위해서 서열번호 29 및 서열번호 30 프라이머를 이용하여 변성(denaturation) 단계는 94℃에서 30초, 어닐링(annealing) 단계는 55℃에서 30초, 연장(extension) 단계는 68℃에서 1분 동안 실시하고, 이를 30 회 수행하는 PCR 반응을 진행하였다.
그 결과 얻어진 PCR 산물을 1.0% 아가로즈 겔에서 전기영동한 후, 800bp 크기의 밴드로부터 DNA를 정제하였다. 정제된 DNA와 플라스미드를 제한효소 kpnI으로 밤새 37 ℃에서 처리해 준 후, 한 번 더 정제 후, T4 리가아제(ligase)를 이용하여 leuE와 pCL-asd-pntAB 벡터를 클로닝 하였다. 클로닝된 플라스미드를 이용하여 대장균 DH5α에 형질전환 한 후, 스펙티노마이신 (spectinomycin) 50㎍/mL를 포함하는 LB 평판 배지에서 형질전환 된 대장균 DH5α를 선별하여 플라스미드를 획득하였다. 제작된 플라스미드를 O-아세틸 호모세린 생산주인 WCJM 에 도입하여 O-아세틸 호모세린의 생산능에 대한 플라스크 평가를 진행하였다. 제작된 플라스미드는 모두 4종으로 실시예 2-1에서 제작된 야생형 및 변이 3종을 이용하였다. 4종 플라스미드는 WCJM 균주에 전기천공법을 이용하여 도입하였고, 실시예 3-1과 동일한 방법으로 플라스크 평가를 진행하였고, 그 결과는 다음 표 6과 같다.
플라스크 배양을 통한 O-아세틸 호모세린 생산 측정
OD(562 nm) 포도당 소모(g/L) O-AH(g/L)
WCJM/pCL-asd-pntAB 9.8 36 1.8
WCJM/pCL-asd-pntAB-leuE WT 9.5 37 2.0
WCJM/pCL-asd-pntAB-leuE WT_M3 8.2 38 3.0
WCJM/pCL-asd-pntAB-leuE WT_M4 7.5 38 4.2
WCJM/pCL-asd-pntAB-leuE WT_M6 7.8 38 5.9
상기 표 6에서 확인할 수 있듯이, 생합성 경로와 leuE 변이를 동시에 강화시켜준 결과, O-아세틸 호모세린의 생산능이 더욱 향상되었다. 특히 pCL-asd-pntAB-leuE WT_M6 플라스미드가 도입된 균주의 경우, 야생형보다 OD가 감소하였으나, 빠른 당소모 속도를 보였고, O-아세틸 호모세린이 5.9 g/L 생산되어 생산능이 가장 높았다.
실시예 4 : saturated mutagenesis를 통한 leuE 변이 제작 및 O-아세틸 호모세린 생산능 평가
4-1. saturated mutagenesis를 통한 leuE 변이 균주 제작 및 평가
O-아세틸 호모세린 생산능이 높았던 leuE 변이 3종의 다른 아미노산 치환형을 제작하기 위해 saturated mutagenesis를 통해 변이를 제작하였다. 치환되는 아미노산은 M3 변이, M4 변이, 및 M6 변이 각각 17종을 실시예 2에서 제작된 플라스미드를 주형으로 하여 제작하였다. 그 목록은 다음 표 7와 같다.
변이 플라스미드 치환 아미노산 프라이머 서열번호
M3 L95F 서열번호 31, 32
L95A 서열번호 33, 34
L95G 서열번호 35, 36
L95T 서열번호 37, 38
L95N 서열번호 39, 40
L95D 서열번호 41, 42
L95H 서열번호 43, 44
L95I 서열번호 45, 46
L95S 서열번호 47, 48
L95P 서열번호 49, 50
L95Y 서열번호 51, 52
L95Q 서열번호 53, 54
L95K 서열번호 55, 56
L95E 서열번호 57, 58
L95C 서열번호 59, 60
L95W 서열번호 61, 62
L95R 서열번호 63, 64
M4 F30W 서열번호 65, 66
F30L 서열번호 67, 68
F30V 서열번호 69, 70
F30G 서열번호 71, 72
F30S 서열번호 73, 74
F30N 서열번호 75, 76
F30D 서열번호 77, 78
F30H 서열번호 79, 80
F30I 서열번호 81, 82
F30P 서열번호 83, 84
F30Y 서열번호 85, 86
F30Q 서열번호 87, 88
F30K 서열번호 89, 90
F30E 서열번호 91, 92
F30C 서열번호 93, 94
F30T 서열번호 95, 96
F30R 서열번호 97, 98
M6 F165W 서열번호 99, 100
F165L 서열번호 101, 102
F165V 서열번호 103, 104
F165G 서열번호 105, 106
F165S 서열번호 107, 108
F165N 서열번호 109, 110
F165D 서열번호 111, 112
F165H 서열번호 113, 114
F165I 서열번호 115, 116
F165P 서열번호 117, 118
F165Y 서열번호 119, 120
F165Q 서열번호 121, 122
F165K 서열번호 123, 124
F165E 서열번호 125, 126
F165C 서열번호 127, 128
F165T 서열번호 129, 130
F165R 서열번호 131, 132
구체적으로, 상기 표 7에서 제시한 프라이머를 이용하여 위치-특이적 돌연변이 키트(site-directed mutagenesis kit, Stratagene, 미국)을 실시하여 변이형 leuE 유전자를 제조하였다. 제작된 변이를 플라스미드는 WCJM 균주에 도입하고 실시예 3-1과 동일한 방법으로 플라스크 평가를 진행하였다. 그 결과는 다음 표 8과 같다.
플라스크 배양을 통한 O-아세틸 호모세린 생산 측정
균주 플라스미드 변이위치 OD(562 nm) 포도당 소모(g/L) O-AH(g/L)
WCJM pCL1920 9.6 35 1.3
pCL-leuE WT 8.4 36 1.5
pCL-leuE WT_M3 L95V 8.2 38 2.3
pCL-leuE WT_M4 F30A 7.9 38 3.7
pCL-leuE WT_M6 F165A 8.0 39 4.8
M3 변이 L95F 8.6 38 2.3
L95A 8.3 38 2.2
L95G 9.2 37 2.1
L95T 9.4 37.5 2.3
L95N 8.8 38 2.4
L95D 8.7 36 2.2
L95H 9.5 35 2.3
L95I 9.5 37.5 2.2
L95S 9.3 37 2.5
L95P 9.2 36 2.5
L95Y 8.9 35 2.2
L95Q 9.4 38 3.1
L95K 9.2 38.5 2.2
L95E 8.6 37 2.6
L95C 8.9 37.5 2.4
L95W 9.9 38 2.1
L95R 9.3 38 2.3
M4 변이 F30W 7.5 38 3.2
F30L 7.2 36 3.1
F30V 7.3 35 2.6
F30G 8.3 36 3.4
F30S 7.9 35 3.6
F30N 8.2 37 3.5
F30D 8.6 38 3.0
F30H 8.8 34 2.9
F30I 8.3 35 3.5
F30P 8.6 35.5 3.1
F30Y 7.9 34 2.9
F30Q 8.6 34 2.8
F30K 8.8 35 3.1
F30E 7.6 35.5 2.5
F30C 7.9 35 2.4
F30T 8.9 36 3.0
F30R 8.6 38.5 2.9
M6 변이 F165W 8.2 39 4.2
F165L 8.3 38 4.5
F165V 8.4 38 4.1
F165G 8.0 39 4.6
F165S 7.9 37 4.7
F165N 8.8 39 4.7
F165D 7.8 38 4.5
F165H 7.9 38 4.5
F165I 7.8 37 4.1
F165P 7.7 37.5 4.2
F165Y 8.2 38 4.6
F165Q 8.4 38 3.9
F165K 7.6 39 4.0
F165E 7.7 36.5 4.2
F165C 7.6 36.5 4.3
F165T 8.5 34 3.7
F165R 8.3 38 3.9
상기 표 8에서 알 수 있듯이 각각 변이체들을 평가 한 결과, OD나 당소모 속도에서 미세하게 차이를 보이긴 하였으나, 상기 모든 변이체는 대조군으로 사용된 균주 WCJM/pCL1920 및 WCJM/pCL-leuE WT보다 O-아세틸 호모세린의 생산량이 향상되었음을 확인하였다.
4-2. O-아세틸 호모세린 고수율 균주에서의 leuE 변이 강화 균주 제작 및 O-아세틸 호모세린 생산능 평가
기존에 야생형 W3110 유래의 NTG mutation을 통하여 쓰레오닌을 생산하는 능력을 가지는 균주를 이용하여 O-아세틸 호모세린을 생산하는 균주를 제작하는 방법이 알려져 있다(국제특허 공개번호 WO2012/087039). 이때 제작된 고수율의 O-아세틸 호모세린을 생산하는 균주는 한국 미생물 보존센터에 수탁번호 KCCM11146P로 기탁되어 있다.
상기 균주를 바탕으로 본원의 leuE 유전자와 그 변이들을 도입하여 O-아세틸 호모세린 생산능을 더욱 증진시킬 수 있을지 확인해보았다.
구체적으로, leuE 유전자와 변이체 3종을 플라스미드 형태로 전기천공법을 이용하여 도입하였다. 도입된 균주는 KCCM11146P/pCL1920, KCCM11146P/pCL-leuE WT, KCCM11146P- pCL-leuE M3, KCCM11146P- pCL-leuE M4 또는 KCCM11146P/pCL-leuE M6라고 명명하였다. 상기 leuE 유전자와 변이체의 O-아세틸 호모세린 생산능을 측정하기 위하여 플라스크 배양 평가를 진행하였다. 구체적으로는, LB 배지에 상기 균주 4종을 접종하여 33 ℃에서 하룻밤 배양한 후, 단일 콜로니를 3 ml LB 배지에 접종한 후 33 ℃에서 5 시간 배양하고, 다시 25 ml O-아세틸 호모세린 생산 배지가 첨가된 250 ml 삼각플라스크에 200배 희석하여 33 ℃ 200 rpm에서 30시간 배양하여 HPLC 분석을 통하여 O-아세틸 호모세린 생산량을 확인하였다. 상기 실험한 결과를 정리하면 하기 표 9와 같다.
플라스크 배양을 통한 O-아세틸 호모세린 생산 측정
OD(562nm) 포도당 소모(g/L) O-AH(g/L)
KCCM11146P/pCL1920 18.3 40 14.2
KCCM11146P/pCL-leuE WT 17.9 40 16.3
KCCM11146P/pCL-leuE M3 17.5 40 16.9
KCCM11146P/pCL-leuE M4 16.8 40 19.2
KCCM11146P/pCL-leuE M6 17.2 40 18.8
상기 표 9에서 확인할 수 있듯이, KCCM11146P 균주에 pCL1920만이 도입된 균주에서 O-아세틸 호모세린이 14.2 g/L 생성되었고, leuE WT의 경우도 본래 균주보다도 O-아세틸 호모세린의 생산량이 증가하였다. 또한 변이 3종은 모두 OD가 감소하였고, M4의 경우에는 19.2 g/L로 O-아세틸 호모세린의 생산량이 가장 높았으며, 나머지 M3, M6 변이의 경우에도 O-아세틸 호모세린의 생산량이 증가한 것을 확인하였다.
본원의 발명자들은 KCCM11146P 균주 기반 leuE 3종 변이 M3, M4, M6변이 강화 균주 'KCCM11146P/pCL-leuE M3, M4, M6' 에서 O-아세틸호모세린 생산이 증가함을 확인하고, 상기 균주를 'CA05-4009, 'CA05-4010, 'CA05-4011'으로 명명한 후 부다페스트 조약 하에 2014년 12월 15일자로 한국미생물보존센터(KCCM)에 기탁하여 수탁번호 KCCM11645P, KCCM11646P, KCCM11647P를 부여받았다.
실시예 5 : 생산된 O- 아세틸호모세린 배양액과 전환효소를 이용한 L-메치오닌 생산
상기 실시예 4에서 수득한 O-아세틸 호모세린의 배양액과 이를 메치오닌으로 전환하는 활성을 가진 효소인 O-아세틸 호모세린 설피드릴라제를 이용하여 L-메치오닌 생산하는 실험을 진행하였다.
대한민국 등록특허 제10-1250651호의 실시예 1-2에 제시된 방법으로 전환효소 O-아세틸 호모세린 설피드릴라제를 제작하였으며, 상기 특허의 실시예 3에 제시된 방법으로 전환반응을 실시하여 생성된 L-메치오닌을 측정하였다. 기질로 사용한 O-아세틸 호모세린은 본원의 상기 실시예 4에서 수득한 KCCM11146P- pCL-leuE M4의 배양액(O-AH 농도 19.2 g/L)로 진행하였으며, 생성된 L-메치오닌의 농도는 하기 표 10과 같다.
시간 (min)
2 4 6 8 10
MetZ-rsp 메치오닌(g/L) 3.21 4.34 4.52 4.78 5.04
전환율(%) 50 % 68 % 71 % 75 % 79 %
상기 표 10에서 확인할 수 있듯이, 상기 실시예 4에서 수득한 KCCM11146P-pCL-leuE M4 균주의 배양액에 포함된 O-아세틸 호모세린이 10분 동안 79 %의 전환율로 메치오닌으로 전환되는 것을 확인하였다. 이를 통해, 본원의 균주를 이용하여 메치오닌을 성공적으로 생산할 수 있음을 확인하였다.
이상의 설명으로부터, 본원이 속하는 기술분야의 당업자는 본원이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본원의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본원의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
Figure PCTKR2016005951-appb-I000001
Figure PCTKR2016005951-appb-I000002
Figure PCTKR2016005951-appb-I000003

Claims (19)

  1. 서열번호 1의 아미노산 서열에서 1번째 아미노산 발린, 30번째 아미노산 페닐알라닌, 95번째 아미노산 류신 또는 165번째 아미노산 페닐알라닌으로 이루어진 그룹에서 선택되는 하나 이상의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, O-아세틸 호모세린 배출능을 가지는 폴리펩티드.
  2. 제1항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 서열번호 1의 아미노산 서열에서 1번째 아미노산 발린이 메치오닌으로 치환되거나; 30번째 아미노산 페닐알라닌이 알라닌, 트립토판, 류신, 발린, 글리신, 세린, 아스파라긴, 아스파르트산 및 히스티딘으로 이루어진 군으로부터 선택된 것으로 치환되거나; 95번째 아미노산 류신이 발린, 페닐알라닌, 알라닌, 글리신, 트레오닌, 아스파라긴, 아스파르트산 및 히스티딘으로 이루어진 군으로부터 선택된 것으로 치환되거나; 또는 165번째 아미노산 페닐알라닌이 알라닌, 트립토판, 류신, 발린, 글리신, 세린, 아스파라긴, 아스파르트산 및 히스티딘으로 이루어진 군으로부터 선택된 것으로 치환된, O-아세틸 호모세린 배출능을 가지는 폴리펩티드.
  3. 제1항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 서열번호 1의 아미노산 서열에서 1번째 아미노산 발린이 메치오닌으로 치환되고, 30번째 아미노산 페닐알라닌, 95번째 아미노산 류신 또는 165번째 아미노산 페닐알라닌이 다른 아미노산으로 치환된, O-아세틸 호모세린 배출능을 가지는 폴리펩티드.
  4. 제1항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 서열번호 2,133, 134, 137, 138, 141 및 142의 아미노산 서열로 이루어진 그룹에서 선택된, O-아세틸 호모세린 배출능을 가지는 폴리펩티드.
  5. 제1항의 O-아세틸 호모세린 배출능을 가지는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
  6. 제5항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드의 개시코돈이 ATG로 추가로 치환된, 폴리뉴클레오티드.
  7. 제5항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 4, 135, 136, 139, 140, 143 및 144의 핵산 서열로 이루어진 그룹 중에서 선택된, 폴리뉴클레오티드.
  8. 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드 또는 이의 변이체 폴리펩티드가 포함되거나 과발현된, O-아세틸 호모세린을 생산하는 에스케리키아(Escherichia) 속 미생물.
  9. 제8항에 있어서, 상기 변이체 폴리펩티드는 서열번호 1의 아미노산 서열에서 1번째 아미노산 발린, 30번째 아미노산 류신, 95번째 아미노산 페닐알라닌 또는 165번째 아미노산 페닐알라닌으로 이루어진 그룹에서 선택되는 하나 이상의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, O-아세틸 호모세린을 생산하는 에스케리키아(Escherichia) 속 미생물.
  10. 제8항에 있어서, 상기 변이체 폴리펩티드는 서열번호 1의 아미노산 서열에서 1번째 아미노산 발린이 메치오닌으로 치환되거나; 30번째 아미노산 페닐알라닌이 알라닌, 트립토판, 류신, 발린, 글리신, 세린, 아스파라긴, 아스파르트산 및 히스티딘으로 이루어진 군으로부터 선택된 것으로 치환되거나; 95번째 아미노산 류신이 발린, 페닐알라닌, 알라닌, 글리신, 트레오닌, 아스파라긴, 아스파르트산 및 히스티딘으로 이루어진 군으로부터 선택된 것으로 치환되거나; 또는 165번째 아미노산 페닐알라닌이 알라닌, 트립토판, 류신, 발린, 글리신, 세린, 아스파라긴, 아스파르트산 및 히스티딘으로 이루어진 군으로부터 선택된 것으로 치환된, O-아세틸 호모세린을 생산하는 에스케리키아 속 미생물.
  11. 제9항에 있어서, 상기 변이체 폴리펩티드는 서열번호 1의 아미노산 서열에서 1번째 아미노산 발린이 메치오닌으로 치환되고, 30번째 아미노산 페닐알라닌, 95번째 아미노산 류신 또는 165번째 아미노산 페닐알라닌이 다른 아미노산으로 치환된, O-아세틸 호모세린 배출능을 가지는 폴리펩티드.
  12. 제8항에 있어서, 상기 에스케리키아 속 미생물은 대장균(Escherichia coli)인, O-아세틸 호모세린을 생산하는 에스케리키아 속 미생물.
  13. 제8항에 있어서, 상기 에스케리키아 속 미생물은 추가적으로 시스타치오닌 신타아제(cystathionine synthase)의 활성이 불활성화된, O-아세틸 호모세린을 생산하는 에스케리키아 속 미생물.
  14. 제8항에 있어서, 상기 에스케리키아 속 미생물은 추가적으로 호모세린 키나아제(homoserine kinase)의 활성이 불활성화된, O-아세틸 호모세린을 생산하는 에스케리키아 속 미생물.
  15. 제8항에 있어서, 상기 에스케리키아 속 미생물은 추가적으로 호모세린 아세틸 트랜스퍼라제(homoserine acetyltransferase)의 활성이 비변이 미생물에 비하여 강화된, O-아세틸 호모세린을 생산하는 에스케리키아 속 미생물.
  16. 제8항에 있어서, 상기 에스케리키아 속 미생물은 추가적으로 아스파테이트 세미알데하이드 디하이드로게나아제 (aspartate semialdehyde dehydrogenase), 피리딘 뉴클레오티드 트랜스하이드로게나아제 (pyridine nucleotide transhydrogenase) 또는 이들의 조합의 활성이 비변이 미생물에 비하여 강화된, O-아세틸 호모세린을 생산하는 에스케리키아 속 미생물.
  17. 제8항 내지 제16항 중 어느 한 항의 O-아세틸 호모세린을 생산하는 에스케리키아 속 미생물을 배지에서 배양하는 단계; 및
    상기 배양단계에서 배양된 미생물 또는 배지에서 O-아세틸 호모세린을 회수하는 단계를 포함하는, O-아세틸 호모세린 생산방법.
  18. 제8항 내지 제16항 중 어느 한 항의 O-아세틸 호모세린을 생산하는 에스케리키아 속 미생물을 배지에서 배양하는 단계; 및
    상기 배양단계에서 배양된 미생물 또는 배지에, 또는 상기 배양단계에서 배양된 미생물 또는 배지에서 회수한 O-아세틸 호모세린에 메틸머캅탄과 메치오닌 전환 효소를 처리하여 O-아세틸 호모세린을 L-메치오닌으로 전환하는 단계를 포함하는, L-메치오닌 생산방법.
  19. 제18항에 있어서, 상기 메치오닌 전환 효소는 O-아세틸 호모세린 설피드릴라제인, L-메치오닌 생산방법.
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SG11201709899QA SG11201709899QA (en) 2015-06-04 2016-06-03 Microorganism producing o-acetyl-homoserine, and method for producing o-acetyl-homoserine by using same
AU2016271665A AU2016271665B2 (en) 2015-06-04 2016-06-03 Microorganism producing O-acetyl-homoserine, and method for producing O-acetyl-homoserine by using same
ES16803792T ES2906229T3 (es) 2015-06-04 2016-06-03 Microorganismo productor de O-acetil-homoserina, y método para producir O-acetil-homoserina mediante el uso de este
EP16803792.7A EP3305808B1 (en) 2015-06-04 2016-06-03 Microorganism producing o-acetyl-homoserine, and method for producing o-acetyl-homoserine by using same
US15/579,188 US10400256B2 (en) 2015-06-04 2016-06-03 Polypeptide having the activity of exporting O-acetyl-homoserine
CN201680043236.0A CN108026147B (zh) 2015-06-04 2016-06-03 生产o-乙酰-高丝氨酸的微生物和使用其生产o-乙酰-高丝氨酸的方法
JP2017562280A JP6543734B2 (ja) 2015-06-04 2016-06-03 Ｏ−アセチルホモセリンを生産する微生物及びそれを用いてｏ−アセチルホモセリンを生産する方法
BR112017026005-0A BR112017026005A2 (pt) 2015-06-04 2016-06-03 ?polipeptídeo, polinucleotídeo, micro-organismo do gênero escherichia, método de produção de o- acetil-homosserina e de l-metionina?
PL16803792T PL3305808T3 (pl) 2015-06-04 2016-06-03 Mikroorganizm wytwarzający o-acetylohomoserynę i sposób wytwarzania o-acetylohomoseryny z jego zastosowaniem
US16/514,777 US10597686B2 (en) 2015-06-04 2019-07-17 Polypeptide having the activity of exporting O-acetyl-homoserine

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Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101996769B1 (ko) * 2018-12-21 2019-10-01 씨제이제일제당 (주) 변이형 호모세린 디하이드로게나제 및 이를 이용한 호모세린 또는 호모세린 유래 l-아미노산의 생산 방법
KR102182497B1 (ko) * 2019-12-20 2020-11-24 씨제이제일제당 주식회사 내막 단백질의 변이체 및 이를 이용한 목적 산물 생산 방법
CN115728496B (zh) * 2022-11-11 2025-07-29 东南大学 碳点复合物作为探针和共反应物的免疫传感器及其应用
CN119082224B (zh) * 2024-09-26 2025-12-12 杭州精构生物科技有限责任公司 一种生产o-乙酰高丝氨酸的大肠埃希氏菌工程菌株的发酵方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20090298135A1 (en) * 2003-02-06 2009-12-03 Consortium Fur Elektrochemische Industrie Gmbh Method for fermentative production of L-methionine
KR100951766B1 (ko) * 2006-07-28 2010-04-08 씨제이제일제당 (주) Ｌ-메치오닌 전구체 생산 균주 및 상기 ｌ-메치오닌 전구체로부터의 ｌ-메치오닌 및 유기산의 생산방법
KR101117012B1 (ko) * 2009-08-28 2012-03-20 씨제이제일제당 (주) Ｏ-아세틸-ｌ-호모세린 생산 균주 및 이를 이용하여 ｏ-아세틸-ｌ-호모세린을 생산하는 방법

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2175351C2 (ru) * 1998-12-30 2001-10-27 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт "Аджиномото-Генетика" (ЗАО "АГРИ") Фрагмент днк из escherichia coli, определяющий повышенную продукцию l-аминокислот (варианты), и способ получения l-аминокислот
EP2064330A2 (en) * 2007-05-22 2009-06-03 BASF Plant Science GmbH Plants with increased tolerance and/or resistance to environmental stress and increased biomass production
CN102177246B (zh) * 2008-09-08 2015-02-11 味之素株式会社 生产l-氨基酸的微生物和l-氨基酸的生产方法
JP5521347B2 (ja) * 2009-02-16 2014-06-11 味の素株式会社 Ｌ−アミノ酸生産菌及びｌ−アミノ酸の製造法
AR083468A1 (es) * 2010-10-25 2013-02-27 Metabolic Explorer Sa Aumento de la disponibilidad de nadph para la produccion de metionina
JP5758499B2 (ja) 2010-12-21 2015-08-05 シージェイ チェイルジェダン コーポレイション ホモセリンアセチルトランスフェラーゼ活性を有する変異型ポリペプチド及びそれを発現する微生物
KR101250651B1 (ko) 2010-12-21 2013-04-03 씨제이제일제당 (주) 신규 ｏ-아세틸호모세린 설피드릴라제 또는 변이체 및 이를 이용한 메치오닌 전환 방법
WO2014145332A1 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Opx Biotechnologies, Inc. Monfunctional mcr + 3-hp dehydrogenase

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20090298135A1 (en) * 2003-02-06 2009-12-03 Consortium Fur Elektrochemische Industrie Gmbh Method for fermentative production of L-methionine
KR100951766B1 (ko) * 2006-07-28 2010-04-08 씨제이제일제당 (주) Ｌ-메치오닌 전구체 생산 균주 및 상기 ｌ-메치오닌 전구체로부터의 ｌ-메치오닌 및 유기산의 생산방법
KR101117012B1 (ko) * 2009-08-28 2012-03-20 씨제이제일제당 (주) Ｏ-아세틸-ｌ-호모세린 생산 균주 및 이를 이용하여 ｏ-아세틸-ｌ-호모세린을 생산하는 방법

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DATABASE NCBI 20 October 2014 (2014-10-20), Database accession no. WP_000457206.1 *
KUTUKOVA ET AL.: "The yeaS (leuE) Gene of Escherichia Coli Encodes An Exporter of Leucine, and the Lrp Protein Regulates its Expression", FEES LETTERS, vol. 579, no. 21, 2005, pages 4629 - 4634, XP027696668 *
See also references of EP3305808A4 *

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