WO2016199674A1 - 融合タンパク質又は複合タンパク質、細胞内送達用担体、部分ペプチド、細胞膜透過促進剤、ｄｎａ、及びベクター - Google Patents

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    • C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids

Definitions

  • the present invention relates to a fusion protein or complex protein, a carrier for intracellular delivery, a partial peptide, a cell membrane permeation enhancer, DNA, and a vector.
  • DDS drug delivery systems
  • TAT peptide that is a transcription factor of HIV is known (see Patent Document 1).
  • a ligand recognizes a receptor present on the cell surface, binds to the cell surface, is taken into the cell membrane, and binds to the endosome. Then, after binding to the endosome, the ligand is released from the endosome, and the ligand is released into the cell, whereby the ligand is taken into the cell.
  • the TAT peptide Since the TAT peptide has a low ability to detach from endosomes (hereinafter sometimes referred to as “endosome detachment” in the present specification), the target active ingredient cannot be sufficiently released into the cell, and the cell membrane permeability is low. There is a problem that it is low.
  • membrane fusion peptides such as HA2 (derived from a virus), B18 (derived from a sea urchin), and B55 (derived from a sea urchin), which are factors related to membrane fusion during virus infection and fertilization, are known. Since these peptides are excellent in endosome releasability, it is considered that they can be used as peptides for intracellular delivery with high cell membrane permeability.
  • HA2, B18, and B55 are not human-derived peptides, there is a concern that immunogenicity may occur when applied to DDS.
  • human-derived peptides that are not only excellent in cell membrane permeability but also less likely to produce immunogenicity are required as peptides for intracellular delivery.
  • the present invention has been made in view of the above circumstances, and an object of the present invention is to provide a fusion protein or a complex protein that is excellent in cell membrane permeability and includes a partial peptide derived from humans and suitable for intracellular delivery. And Furthermore, the present invention includes a carrier for intracellular delivery comprising such a fusion protein or a complex protein, a partial peptide and a cell membrane permeation enhancer comprising the partial peptide, a DNA encoding the partial peptide, and the DNA incorporated therein. The purpose is to provide vectors.
  • the present inventors have found that a partial peptide consisting of a part of amino acid residues of IZUMO1, CD9, and syncytin1, which are membrane fusion-related proteins derived from humans, has excellent endosome detachment properties, and thus complete the present invention. It came. More specifically, the present invention provides the following.
  • a partial peptide consisting of at least 7 consecutive amino acid residues in the amino acid sequence encoded by the DNA according to any one of (a) to (d) below:
  • A DNA having a base sequence encoding the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1, 2, or 3
  • B DNA having a base sequence capable of hybridizing under stringent conditions with a base sequence complementary to the base sequence encoding the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1, 2, or 3
  • C DNA having a nucleotide sequence encoding an amino acid sequence in which one or more amino acids are substituted, deleted and / or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, 2, or 3
  • D DNA comprising a base sequence encoding an amino acid sequence having 90% or more homology with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, 2, or 3
  • a carrier for intracellular delivery comprising the fusion protein or complex protein according to (1) or (2).
  • B DNA having a base sequence capable of hybridizing under stringent conditions with a base sequence complementary to the base sequence encoding the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1, 2, or 3
  • C DNA having a nucleotide sequence encoding an amino acid sequence in which one or more amino acids are substituted, deleted and / or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, 2, or 3
  • a cell membrane permeation enhancer comprising the partial peptide according to (5).
  • a fusion protein or a complex protein that is excellent in cell membrane permeability and includes a partial peptide derived from humans and suitable for intracellular delivery.
  • a carrier for intracellular delivery comprising such a fusion protein or a complex protein, a partial peptide and a cell membrane permeation enhancer comprising the partial peptide, a DNA encoding the partial peptide, and the DNA are incorporated.
  • Provided vectors can be provided.
  • the graph of the fluorescence intensity about an eGFP-TAT fusion protein, an eGFP-HA2-TAT fusion protein, and an eGFP-Syncytin1 (FP) -TAT fusion protein is shown.
  • eGFP-TAT fusion protein (final concentration 10 ⁇ M)
  • eGFP-IZUMO1 57-113 -TAT fusion protein final concentration 1 ⁇ M
  • eGFP-IZUMO1 81-113 -TAT fusion protein final concentration 1 ⁇ M
  • eGFP-IZUMO1 81-113 -TAT fusion protein final concentration 1 ⁇ M
  • eGFP-IZUMO1 81-113 -TAT fusion protein (final concentration 1 ⁇ M)
  • eGFP-IZUMO1 81-113 ⁇ A graph of fluorescence intensity is shown for the TAT fusion protein (final concentration 10 ⁇ M).
  • eGFP-TAT fusion protein (final concentration 10 ⁇ M), eGFP-IZUMO1 57-113 -TAT fusion protein (final concentration 1 ⁇ M), eGFP-IZUMO1 57-75 -TAT fusion protein (final concentration 1 ⁇ M), eGFP-IZUMO1 57-75 ⁇ TAT fusion protein (final concentration 10 ⁇ M), eGFP-IZUMO1 76-94 -TAT fusion protein (final concentration 1 ⁇ M), eGFP-IZUMO1 76-94 -TAT fusion protein (final concentration 10 ⁇ M), eGFP-IZUMO1 95-113 -TAT fusion
  • the graph of the fluorescence intensity about protein (final concentration 1 micromol) is shown.
  • HeLa human cervical cancer cell
  • HA431 human epithelial cell cancer cell
  • HepG2 human hepatoma cell
  • SH human neuroblastoma cell
  • the fluorescence intensity graphs for SNAP-Syncytin1 322-340 -TAT fusion protein, SNAP-TAT fusion protein, ⁇ -Gal-Syncytin1 322-340 -TAT fusion protein and ⁇ -Gal-TAT fusion protein are shown.
  • the fusion protein or complex protein of the present invention comprises a partial peptide consisting of at least 7 consecutive amino acid residues in the amino acid sequence encoded by the DNA described in any of (a) to (d) below, It has a ligand that is bound directly or indirectly to the peptide and has the ability to bind to the cell surface.
  • A DNA having a base sequence encoding the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1, 2, or 3
  • B DNA having a base sequence capable of hybridizing under stringent conditions with a base sequence complementary to the base sequence encoding the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1, 2, or 3
  • C DNA having a nucleotide sequence encoding an amino acid sequence in which one or more amino acids are substituted, deleted and / or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, 2, or 3
  • D DNA comprising a base sequence encoding an amino acid sequence having 90% or more homology with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, 2, or 3
  • the fusion protein or complex protein of the present invention has a high endosome detachability due to the partial peptide having the above-described configuration, and thus can exhibit excellent cell membrane permeability.
  • the “fusion protein” of the present invention refers to a protein in which the partial peptide is bound to one or more other proteins.
  • the “complex protein” of the present invention refers to a complex in which the partial peptide and a component other than a protein (for example, a low molecular compound, a nucleic acid, a sugar chain, a nanoparticle, etc.) are bound.
  • the partial peptide in the fusion protein or composite protein of the present invention is a peptide consisting of at least 7 consecutive amino acid residues in the amino acid sequence encoded by the DNA described in any of (a) to (d) above.
  • amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1 is a part of the fusion core helix peptide near the N-terminus of human-derived membrane fusion-related protein IZUMO1, and corresponds to positions 76 to 113 when counted from the N-terminal side of IZUMO1 It is an amino acid sequence represented by the amino acid residue.
  • the partial peptide has high endosome detachment properties and excellent cell membrane permeability, and therefore corresponds to positions 76-94 when counted from the N-terminal side of IZUMO1.
  • the amino acid sequence represented by the amino acid residue (SEQ ID NO: 4), the amino acid sequence represented by the amino acid residue corresponding to positions 81 to 113 when counted from the N-terminal side of IZUMO1 (SEQ ID NO: 5), or the N-terminal of IZUMO1 The amino acid sequence (SEQ ID NO: 6) represented by the amino acid residue corresponding to positions 95 to 113 when counted from the side is particularly preferred.
  • amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 is a part of the second extracellular loop peptide near the C-terminus of human-derived membrane fusion-related protein CD9, and is located at positions 113 to 194 when counted from the N-terminal side of CD9. Is an amino acid sequence represented by the amino acid residue corresponding to
  • the partial peptide has high endosome detachability and excellent cell membrane permeability, and therefore corresponds to positions 115 to 133 when counted from the N-terminal side of CD9.
  • the amino acid sequence represented by the amino acid residue (SEQ ID NO: 7), the amino acid sequence represented by the amino acid residue corresponding to positions 138 to 151 when counted from the N-terminal side of CD9 (SEQ ID NO: 8), or the N-terminus of CD9 The amino acid sequence (SEQ ID NO: 9) represented by amino acid residues corresponding to positions 182-190 when counted from the side is particularly preferred.
  • the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 3 is the amino acid sequence of the FP peptide involved in membrane fusion in the TM domain on the C-terminal side that constitutes human-derived membrane fusion-related protein Syncytin1, and is counted from the N-terminal side of Syncytin1 Is the amino acid sequence represented by the amino acid residues corresponding to positions 320-340.
  • the partial peptide has high endosome detachment properties and excellent cell membrane permeability, and therefore corresponds to positions 322 to 340 when counted from the N-terminal side of Syncytin1.
  • the amino acid sequence represented by the amino acid residue (SEQ ID NO: 44) is preferable, and the amino acid sequence (SEQ ID NO: 10) represented by the amino acid residue corresponding to positions 321 to 334 when counted from the N-terminal side of Syncytin1 is particularly preferable.
  • the number of amino acid residues constituting the partial peptide of the present invention is at least 7 consecutive amino acid residues in the amino acid sequence encoded by the DNA according to any one of (a) to (d) above, It is not particularly limited, and can be appropriately selected according to the number of amino acid residues encoded by SEQ ID NOs: 1-3. For example, at least 10, 12, 15, 18 amino acid residues constituting the partial peptide of the present invention are encoded by the amino acid sequence encoded by the DNA described in any one of (a) to (d) above. 20 amino acids, 30 amino acids, 40 amino acids, 50 amino acids, 60 amino acids, 60 amino acids, 70 amino acids, etc.
  • the upper limit thereof is not particularly limited, and for example, 75 amino acid residues constituting the partial peptide of the present invention are encoded by the DNA encoded by the DNA according to any one of (a) to (d) above. Below, 65 or less, 55 or less, 45 or less, 35 or less, 25 or less, 22 or less, 17 or less, 16 or less, 14 or less, 13 or less, etc. May be.
  • a DNA variant or homolog having a base sequence encoding the amino acid sequence described in any one of SEQ ID NOs: 1 to 10 is complementary to the base sequence encoding the amino acid sequence described in any of SEQ ID NOs: 1 to 10 90% or more (preferably 92% or more, preferably) of DNA having a base sequence that can hybridize with a stringent base sequence under stringent conditions, or a base sequence encoding the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 1 to 10 More preferably, it includes DNA having a base sequence having a homology of 95% or more, more preferably 99% or more.
  • Examples of the “stringent conditions” capable of hybridizing with a base sequence complementary to the base sequence described in any of SEQ ID NOs: 1 to 10 include, for example, 40 to 70 ° C. (preferably, in a normal hybridization buffer) The reaction is carried out at 50 to 67 ° C., more preferably 60 to 65 ° C., in a washing solution having a salt concentration of 15 to 300 mM (preferably 15 to 150 mM, more preferably 15 to 60 mM, still more preferably 30 to 50 mM). The conditions for performing the cleaning are listed.
  • the DNA encoding the amino acid sequence of the partial peptide of the present invention encodes an amino acid sequence in which one or more amino acids are substituted, deleted, and / or added in the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 1 to 10.
  • DNA having a base sequence is also included.
  • “one or more” usually refers to within 3 amino acids, preferably within 2 amino acids.
  • the partial peptide when the number of amino acid residues of the partial peptide is small (for example, when the number of amino acid residues of the partial peptide is 7 to 10) and the number of amino acids to be mutated is large (for example, within 3 amino acids) In some cases, the partial peptide can easily maintain the cell membrane permeability by being mutated to another amino acid so that the nature of the mutated amino acid side chain is preserved.
  • hydrophobic amino acids A, I, L, M, F, P, W, Y, V
  • hydrophilic amino acids R, D, N, C, E, Q, G, H, K, S, T
  • amino acids having aliphatic side chains G, A, V, L, I, P
  • amino acids having hydroxyl group-containing side chains S, T, Y
  • sulfur atom-containing side chains An amino acid (C, M) having a carboxylic acid and an amide-containing side chain (D, N, E, Q), an amino acid having a base-containing side chain (R, K, H), an aromatic-containing side chain
  • the amino acid (H, F, Y, W) which can be mentioned can be mentioned (In addition, all the alphabets in the said parenthesis represent the single letter mark of an amino acid).
  • the amino acid sequence of the partial peptide of the present invention is preferably highly homologous to the amino acid sequence described in any one of SEQ ID NOs: 1 to 10.
  • the amino acid sequence of the partial peptide of the present invention is preferably 90% or more, more preferably 92% or more, and 95% or more (96%) with the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 1 to 10. More preferably, 97% or more, 98% or more, 99% or more).
  • a protein having an amino acid sequence modified by deletion, addition and / or substitution by another amino acid residue to one amino acid sequence maintains its biological activity. (Mark, DF et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
  • amino acid sequence in which one or more amino acids are substituted, deleted, and / or added in the amino acid sequence described in any of SEQ ID NOs: 1 to 10 is also homologous to the amino acid sequence described in any of SEQ ID NOs: 1 to 10 Higher is preferable.
  • an amino acid sequence in which one or more amino acids are substituted, deleted and / or added in the amino acid sequence described in any of SEQ ID NOs: 1 to 10, and the amino acid sequence described in any of SEQ ID NOs: 1 to 10, Is preferably 85% or more, more preferably 90% or more, and even more preferably 95% or more (96% or more, 97% or more, 98% or more, 99% or more).
  • the “DNA” in the present invention may be either a sense strand or an antisense strand (for example, can be used as a probe), and the shape thereof may be either single-stranded or double-stranded. Further, it may be genomic DNA, cDNA, or synthesized DNA.
  • the method for obtaining DNA is not particularly limited, but a method for obtaining cDNA by reverse transcription from mRNA (for example, RT-PCR method), a method for preparing from genomic DNA, and a method for synthesis by chemical synthesis. And publicly known methods such as a method of isolating from a genomic DNA library or a cDNA library (see, for example, JP-A-11-29599).
  • the partial peptide of the present invention can be prepared, for example, by chemical synthesis by a known solid phase peptide synthesis method such as Fmoc synthesis method. It can also be produced by using a transformant into which an expression vector containing DNA encoding the amino acid sequence of the partial peptide has been introduced. That is, first, the transformant is cultured under appropriate conditions to synthesize a protein (partial peptide) encoded by the DNA.
  • a host for obtaining a transformant may be any host that is compatible with a vector and can be transformed.
  • a known natural cell such as a bacterium, yeast, animal cell, or insect cell, or an artificially established host. Examples thereof include cells (see JP-A-11-29599).
  • An expression vector for obtaining a transformant can be prepared by inserting the above DNA into an appropriate vector.
  • the “appropriate vector” is not particularly limited as long as it can be replicated and maintained in various prokaryotic and / or eukaryotic hosts, and can be appropriately selected depending on the purpose of use.
  • the method for introducing the vector can be appropriately selected depending on the type of the vector and the host.
  • the DNA may be configured so as to be included in a protein synthesized by a tag (6 ⁇ His, FLAG, etc.), a thrombin recognition sequence (TCS), or the like, if necessary.
  • a tag (6 ⁇ His, FLAG, etc.
  • TCS thrombin recognition sequence
  • the culture of the transformant is appropriately selected from known nutrient media according to the type of transformant so that the partial peptide can be easily obtained in large quantities, and the temperature, pH of the nutrient medium, culture time, etc. It can be carried out with appropriate adjustment (for example, see JP-A-11-29599).
  • the partial peptide of this invention can be obtained by collect
  • the method for isolating and purifying the partial peptide is not particularly limited, and is a known method such as a method using solubility, a method using a difference in molecular weight, a method using charge, etc. No. 29599).
  • Ligand The ligand in the fusion protein or complex protein of the present invention has the ability to bind to the cell surface.
  • ligands capable of binding to the cell surface include molecular recognition showing specific interaction with specific target substances (receptors, etc.) on the cell surface, such as sugar chains, proteins, and antigens as cell-selective markers. More specifically, examples include antibodies, lectins, cytokines, hormones, neurotransmitters, peptides (TAT, polyarginine, etc.), sugar chains (chitin, chitosan, hyaluronic acid, etc.). In particular, it is preferable to use an antibody because of its high cell selectivity.
  • a low-molecular antibody for example, an antibody having a molecular weight of 10 to 100 kDa
  • a single-chain antibody (scFv), Fab, domain antibody, or diabody can be preferably used.
  • the ligand binds directly or indirectly to the partial peptide.
  • the binding method can be appropriately selected depending on the type of ligand.
  • the ligand is an antibody
  • a fusion protein of the partial peptide and the antibody can be prepared by genetic engineering in the same manner as the partial peptide described above.
  • the partial peptide and the antibody may be bound indirectly via the linker by inserting an amino acid sequence to be a linker between the partial peptide and the antibody, and directly without using the linker. You may couple
  • the number of amino acid residues serving as a linker is not particularly limited, and may be, for example, 1 to 100 amino acid residues in consideration of the number of amino acid residues in the entire protein.
  • amino acid sequence to be a linker examples include a flexible linker (SEQ ID NO: 11) that repeats GGGGS three times.
  • the peptide itself encoded by the amino acid sequence serving as a linker may be designed so as to have high cell membrane permeability, and the cell membrane permeability of the fusion protein may be further enhanced.
  • the peptide itself is designed to have high homology with the amino acid sequence described in any one of SEQ ID NOs: 1 to 10. For example, it may be designed to be 70% or more, 80% or more, 90% or more, 95% or more, and the like.
  • the ligand is not a protein such as an antibody (for example, when the ligand is a low molecular weight compound or a sugar chain)
  • the functional group present at the terminal or inside of the partial peptide in order to bind the ligand directly to the partial peptide can be used for chemical bonding.
  • Examples of the chemical bonding mode at that time include an amide bond, a thioether bond, and an ester bond.
  • the indirect binding between the partial peptide and the ligand is mainly performed when it is difficult to bind directly or when it is preferable to bind indirectly. Indirect coupling can be performed via a linker.
  • the linker in this case (that is, the linker when the ligand is not a protein) is not particularly limited as long as it is a molecule having a reactive group at both ends and a structure capable of linking two molecules.
  • the sex group include a maleimide group, an aldehyde group, and an NHS ester.
  • Specific examples of the linker when the ligand is not a protein include polyethylene glycol.
  • the combination of the partial peptide and the ligand of the present invention takes into account the properties of the partial peptide and the ligand, the structure correlation, etc. It is possible to select a coupling method suitable for the combination.
  • the fusion protein or complex protein of the present invention may contain an active ingredient having physiological activity (hereinafter, sometimes referred to as “active ingredient”) in the molecule.
  • the fusion protein or complex protein of the present invention may not contain an active ingredient in the molecule.
  • the fusion protein or complex protein of the present invention and the active ingredient For example, a complex with a nucleic acid or the like may be formed.
  • the active ingredient is a protein
  • a fusion protein of the partial peptide, the active ingredient, and a protein (such as an antibody) that further acts as a ligand is genetically engineered in the same manner as the partial peptide described above.
  • the amino acid sequence to be a linker may be inserted between each peptide in the same manner as the above-described ligand, so that each peptide may be indirectly bound via the linker, Each peptide may be bound directly.
  • the same linker as that inserted between the ligand and the partial peptide can be used.
  • the region where each peptide is located is not particularly limited.
  • the fusion protein may be designed so that the partial peptide, the active ingredient, and the ligand are in this order from the N-terminal side.
  • the fusion protein may be designed so that the active ingredient, ligand, and partial peptide are ordered from the N-terminal side, and the fusion protein is designed so that the active ingredient, partial peptide, and ligand are ordered from the N-terminal side.
  • the active ingredient may act as a ligand.
  • the fusion protein of the present invention may be composed of only the ligand and the partial peptide.
  • the active ingredient is a protein
  • an antibody scFv, Fab, domain antibody, Diabody, etc.
  • a cytotoxic toxin protein Pseudomonas exotoxin, ribonuclease, etc.
  • a reporter enzyme fluorescent protein, luciferase, ⁇ -galactosidase, Horseradish peroxidase, etc.
  • bioactive peptides for example, an antibody (scFv, Fab, domain antibody, Diabody, etc.), a cytotoxic toxin protein (Pseudomonas exotoxin, ribonuclease, etc.), a reporter enzyme (fluorescent protein, luciferase, ⁇ -galactosidase, Horseradish peroxidase, etc.) and bioactive peptides.
  • the molecular weight of the active ingredient is not particularly limited and can be appropriately selected according to the type, molecular weight, etc. of other
  • the active ingredient When the active ingredient is not a protein, the active ingredient can bind directly or indirectly to the partial peptide or ligand.
  • the active ingredient In order for the active ingredient to bind directly to the partial peptide or ligand, the active ingredient can be chemically bound using a functional group present at the terminal or inside the partial peptide or within the ligand. The chemical bonding mode at that time is determined according to the type of functional group that reacts with the active ingredient.
  • a biotin-labeled active ingredient can be bound to a fusion protein of a partial peptide and avidin using a non-covalent bond such as avidin and biotin.
  • the indirect binding between the active ingredient and the partial peptide or ligand is mainly performed when it is difficult to bind directly or when it is preferable to bind indirectly. Indirect coupling can be performed via a linker.
  • a linker in this case (that is, a linker when the active ingredient is not a protein), the same linker as the above-mentioned partial peptide and ligand can be used.
  • Non-protein active ingredients include, for example, low molecular weight compounds (anticancer drugs and antibiotics used in antibody-drug conjugate ADCs, fluorescent dyes such as FITC and TAMRA, reporter units for MRI and PET, etc. ), Nucleic acids (DNA and mRNA encoding suicide genes and reporter genes, siRNA, shRNA, antisense oligonucleotides, aptamers, etc.), sugar chains, radioisotopes and the like.
  • low molecular weight compounds anticancer drugs and antibiotics used in antibody-drug conjugate ADCs, fluorescent dyes such as FITC and TAMRA, reporter units for MRI and PET, etc.
  • Nucleic acids DNA and mRNA encoding suicide genes and reporter genes, siRNA, shRNA, antisense oligonucleotides, aptamers, etc.
  • sugar chains for example, low molecular weight compounds (anticancer drugs and antibiotics used in antibody-drug conjugate ADCs, fluorescent dyes such as FIT
  • the complex protein of the present invention refers to a complex in which a partial peptide is bound to a component other than a protein.
  • the fusion protein described above is chemically bound to a component other than a protein.
  • a partial peptide and a ligand and / or active ingredient other than a protein itself may be bound, and the partial peptide and a component other than a protein and a component other than a linker and an active ingredient may be combined. It may be what you did.
  • examples of the component include, for example, a lipid (phospholipid, etc.) in addition to the above-described ligand other than a protein, an active ingredient, and a linker thereof.
  • natural polysaccharides chitin, chitosan, hyaluronic acid, chondroitin sulfate, etc.
  • nanoparticles such as liposomes and natural polysaccharide complexes are used as carriers in DDS.
  • the complex protein of the present invention is used.
  • lipids and natural polysaccharides having the ability to form nanoparticles can be used, and can be appropriately selected according to the types of active ingredients and ligands.
  • components other than these proteins may be directly bound to the partial peptide, ligand, or active ingredient, or indirectly bound via a linker.
  • Biopolymers such as fusion proteins have particularly low cell membrane permeability, but the present invention has high endosome detachment properties even when the fusion protein is a fusion protein with the above partial peptide, Excellent cell membrane permeability. For this reason, the fusion protein is particularly suitable for the present invention.
  • the molecular weight or size of the fusion protein or composite protein of the present invention is not particularly limited.
  • the molecular weight of the fusion protein or composite protein may be 100 to 1000 kDa, or the size (particle size of the fusion protein or composite protein) ) May be 1 to 200 nm.
  • the fusion protein or complex protein of the present invention may contain a cationic peptide (for example, TAT peptide, polyarginine, polylysine, polyhistidine) in the molecule in order to improve cell membrane permeability.
  • a cationic peptide for example, TAT peptide, polyarginine, polylysine, polyhistidine
  • the cationic peptide electrostatically interacts with the cell membrane that is anionic, the permeability of the cell membrane is increased, while it interacts non-selectively with the cell and is taken into the cell. Therefore, a cationic peptide is not preferable from the viewpoint of delivering into a specific cell.
  • an antibody when used as a ligand, the antibody has low cell membrane permeability.
  • the antibody has to be fused with a cationic peptide such as a TAT peptide.
  • a cationic peptide such as a TAT peptide.
  • the fusion protein or composite protein of the present invention is excellent in cell membrane permeability, it has high cell membrane permeability even if it does not contain a cationic peptide in the molecule. Rather, since the cell selectivity is lowered by including a cationic peptide, when using a ligand having a high cell selectivity such as an antibody, the cell selectivity is not lowered, and thus these cationic peptides are not included. Is preferred.
  • the carrier for intracellular delivery of the present invention comprises the above fusion protein or complex protein.
  • the target cells are not particularly limited, and for example, lung cells, colon cells, rectal cells, anal cells, bile duct cells, small intestine cells, gastric cells, esophageal cells, gallbladder cells, hepatocytes, pancreatic cells, appendix cells, milk Cells, ovarian cells, cervical cells, prostate cells, kidney cells, glioblastoma cells, skin cells, lymphocytes, choriocarcinoma cells, head and neck cells, osteogenic sarcoma cells, blood cells, etc.
  • Cancer cells (cervical cancer cells, lung cancer cells, colon cancer cells, rectal cancer cells, anal cancer cells, bile duct cancer cells, small intestine cancer cells, gastric cancer cells, esophageal cancer cells, gallbladder cancer cells, liver cancer cells, pancreatic cancer cells, appendix Cancer cells, breast cancer cells, ovarian cancer cells, prostate cancer cells, kidney cancer cells, central nervous system cancer cells, glioblastoma cells, neuroblastoma cells, skin cancer cells, lymphoma cells, choriocarcinoma tumor cells, head and neck Cancer cells, osteogenic sarcoma cells, blood cancer cells, epithelium It can be delivered to the carcinoma cells, etc.).
  • the carrier for intracellular delivery of the present invention can be delivered into cells by a conventionally known method.
  • the carrier for intracellular delivery of the present invention when the carrier for intracellular delivery of the present invention is delivered to an isolated cell, the carrier for intracellular delivery and the cell can be mixed and cultured in vitro.
  • the carrier for intracellular delivery of the present invention when the carrier for intracellular delivery of the present invention is administered to animals (including animals other than humans), it is administered in vivo by oral administration, injection (intravenous injection, subcutaneous injection, intramuscular injection, etc.). Can be delivered.
  • the present invention includes a cell membrane permeation enhancer comprising the above partial peptide. “Promotion of cell membrane permeation” in the present invention includes promotion of endosome withdrawal.
  • the present invention relates to a partial peptide consisting of at least 7 consecutive amino acid residues in the amino acid sequence encoded by the DNA described in any of (a) to (d) above, and the partial peptide directly or indirectly. And a fusion protein having a ligand capable of binding to the cell surface and a DNA encoding the partial peptide.
  • the DNA encoding the fusion protein can be prepared in the same manner as the DNA used for the synthesis of the partial peptide.
  • the present invention relates to a partial peptide consisting of at least 7 consecutive amino acid residues in the amino acid sequence encoded by the DNA described in any of (a) to (d) above, and the partial peptide directly or indirectly. Or a fusion protein having a ligand capable of binding to the cell surface, or a vector in which a DNA encoding the partial peptide is incorporated.
  • the vector of the present invention can be a vector similar to an appropriate vector that can be used in the synthesis of the partial peptide described above.
  • sperm-side factors related to gamete recognition and fusion at the time of fertilization “IZUMO1 57-113 ” (SEQ ID NO: 12) which is a fusion core helix peptide near the N-terminus of the protein IZUMO1; a 3-amino acid sequence (CCG) characteristic of the tetraspanin family near the C-terminus of the protein CD9 of the egg-side factor
  • IZUMO1 57-113 SEQ ID NO: 12
  • CCG 3-amino acid sequence characteristic of the tetraspanin family near the C-terminus of the protein CD9 of the egg-side factor
  • a portion of a coiled-coil structure comprising “ CD9 113-194 ” (SEQ ID NO: 2), which is a second extracellular loop peptide, and a heptad repeat structure of the protein Syncytin1 involved in the formation of placental syncytial trophoblast cells is a
  • sea urchin-derived partial peptide B55 (SEQ ID NO: 19) was selected as a positive control for cell membrane-permeable peptides.
  • the domain structure of the protein containing each peptide is shown in FIG. 1, and the amino acid sequence of each peptide is shown in Table 1.
  • SP in “IZUMO1” indicates an N-terminal signal sequence (SP)
  • TMD in “IZUMO1” indicates a transmembrane domain on the C-terminal side
  • IZUMO1” “Ig-like” refers to an Ig-like domain that is one of the extracellular domains.
  • TMD in “CD9” indicates four respective transmembrane domains.
  • CHR (407-440a.a.)
  • CHR which is a C-terminal heptad repeat sequence
  • the numbers described in each domain in FIG. 1 are the numbers of amino acid residues when the amino acid residues constituting each peptide are counted from the N-terminal side in the protein that is derived from each peptide.
  • regions selected as candidates for a partial peptide having human cell membrane permeability are indicated by hatching with respect to “IZUMO1” and “CD9”, and “Syncytin1 (FP)” and “Syncytin1 (NHR)”.
  • “Syncytin 1 (CHR)” is indicated by the letter name of each name
  • “Syncytin 1 345-422 ” is indicated by a numerical value attached to the lower side.
  • eGFP fusion protein a fusion protein of each of the above partial peptides and eGFP (highly sensitive green fluorescent protein) (hereinafter referred to as the present specification)
  • the fusion protein containing eGFP is sometimes referred to as “eGFP fusion protein.”
  • eGFP fusion protein. was expressed and purified in E. coli and added to the cultured cells, and the localization of eGFP was observed with a fluorescence microscope.
  • FIG. 2 shows a schematic diagram of a DNA construct of an eGFP fusion protein that is a human-derived membrane-acting peptide candidate (eGFP fusion protein of “Syncytin1 345-422 ” for the partial peptide of Syncytin1 ).
  • FIG. 2 shows a schematic diagram of a DNA construct of an eGFP fusion protein of a partial peptide of each Syncytin1 domain.
  • “6xHis” and “FLAG” indicate a base sequence encoding Tag used for purification of eGFP fusion protein
  • TCS indicates a thrombin recognition sequence.
  • “(G 4 S) 3 ” indicates a flexible linker in which a base sequence encoding GGGGS inserted between eGFP and Syncytin 1 (FP) is repeated three times.
  • "IZUMO1 57-113” indicates a nucleotide sequence encoding the SEQ ID NO: 20 shows the nucleotide sequence encoding a "the CD 9 113-194" in SEQ ID NO: 21, a nucleotide sequence encoding a "Syncytin1 345-422"
  • the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 22, the nucleotide sequence encoding “Syncytin1 (FP)” is shown in SEQ ID NO: 23, the nucleotide sequence encoding “Syncytin1 (NHR)” is shown in SEQ ID NO: 24, and “Syncytin1 (CHR)” is encoded.
  • the base sequence encoding “Syncytin1 (FP-NHR)” is shown in SEQ ID NO: 26
  • the base sequence encoding “Syncytin1 (NHR-CHR)” is shown in SEQ ID NO: 27
  • a salt encoding "Syncytin 1 (FP-NHR-CHR)" Sequence is shown in SEQ ID NO: 28.
  • Each plasmid in which each of these DNAs is incorporated into pET20b is introduced into E. coli BL21-CodonPlus (DE3) -RIPL (manufactured by Agilent Technologies), cultured in 2 ⁇ YT medium at 20 ° C. for 3 days, collected. Fungus.
  • the collected bacteria were suspended in 500 ⁇ L of TBS (Tris-buffered saline) (1 mM PMSF), and subjected to ultrasonic crushing using Sonifier 250 (manufactured by Branson) to collect the soluble fraction.
  • TBS Tris-buffered saline
  • Sonifier 250 manufactured by Branson
  • the insoluble fraction was purified, and then refolded by dialysis using Slide-A-Lyser Dialysis cassette (manufactured by Thermo Scientific).
  • each obtained eGFP fusion protein is added to HeLa cells, fixed with 4% paraformaldehyde after 24 hours, and eGFP using a confocal microscope FV-1000 (manufactured by Olympus). The localization of was observed. As a result, strong binding to the cell membrane was observed in the eGFP-B55 fusion protein and the eGFP-Syncintin 1 345-422 fusion protein.
  • an eGFP fusion protein to which a cationic TAT peptide (SEQ ID NO: 29, YGRKKRRQRRR) that interacts with the cell membrane is added to the C terminus (hereinafter referred to as “eGFP” in this specification, and TAT at the C terminus)
  • the added fusion protein is sometimes referred to as “eGFP-TAT-containing fusion protein”.
  • HA2 peptide derived from influenza virus (SEQ ID NO: 30, GLFEAIEGFIENGWEGMIDGWYG) was prepared as a positive control for a cell membrane-permeable peptide.
  • a schematic diagram of the DNA construct of the prepared eGFP-TAT-containing fusion protein is shown in FIG. In FIG. 3, (a) shows a schematic diagram of a DNA construct of an eGFP-TAT fusion protein and an eGFP-TAT-containing fusion protein containing HA2 or a human-derived cell membrane-permeable peptide candidate (other than Syncytin1).
  • FIG. 3 shows a schematic diagram of a DNA construct of an eGFP-TAT-containing fusion protein of a partial peptide of each Syncytin1 domain.
  • “6xHis” and “FLAG” indicate a base sequence encoding Tag used for purification of the eGFP fusion protein
  • “TCS” indicates a thrombin recognition sequence.
  • “(G 4 S) 3 ” indicates a flexible linker in which a base sequence encoding GGGGS inserted between eGFP and Syncytin 1 (FP) is repeated three times.
  • eGFP-TAT fusion protein eGFP-HA2-TAT fusion protein, eGFP- CD9 113-194 -TAT fusion protein, eGFP-Syncytin1 (NHR) -TAT fusion protein, and eGFP-Syncytin1 (CHR) -TAT fusion protein
  • NHR eGFP-Syncytin1
  • CHR eGFP-Syncytin1
  • the insoluble fraction was purified under the same conditions as “eGFP-B55” in “Preparation of eGFP fusion protein” above. did.
  • the eGFP-TAT fusion protein is a control example
  • the eGFP-HA2-TAT fusion protein is a reference example
  • the eGFP-IZUMO1 57-113 -TAT fusion protein is Example 1, eGFP- CD9 113-194.
  • eGFP-TAT fusion protein in Example 2 eGFP-Syncytin1 (FP) -TAT fusion protein in Example 3, eGFP-Syncytin1 (NHR) -TAT fusion protein in Comparative Example 1, eGFP-Syncytin1 (CHR) -TAT fusion protein Sometimes referred to as Comparative Example 2.
  • the amino acid sequence of the eGFP-TAT fusion protein (control example) is SEQ ID NO: 31
  • the amino acid sequence of the eGFP-HA2-TAT fusion protein (reference example) is SEQ ID NO: 32
  • the amino acid sequence of (Example 1) is SEQ ID NO: 33
  • the amino acid sequence of eGFP- CD9 113-194-TAT fusion protein (Example 2) is SEQ ID NO: 34
  • the eGFP-Syncytin1 (FP) -TAT fusion protein (implemented) is SEQ ID NO: 34
  • the amino acid sequence of Example 3) is SEQ ID NO: 35
  • the amino acid sequence of eGFP-Syncytin 1 (NHR) -TAT fusion protein (Comparative Example 1) is SEQ ID NO: 36
  • the final concentration of eGFP-TAT fusion protein is 10 ⁇ M
  • the final concentration of eGFP-HA2-TAT fusion protein is 10 ⁇ M
  • the final concentration of eGFP-IZUMO1 57-113 -TAT fusion protein is 0.
  • EGFP- CD9 113-194 -TAT fusion protein to a final concentration of 5 ⁇ M
  • eGFP-Syncytin1 (FP) -TAT fusion protein to a final concentration of 10 ⁇ M
  • eGFP-Syncytin1 The (NHR) -TAT fusion protein was added to HeLa cells so that the final concentration was 10 ⁇ M
  • the eGFP-Syncytin1 (CHR) -TAT fusion protein was added to a final concentration of 10 ⁇ M.
  • eGFP-IZUMO1 57-113 -TAT fusion protein (Example 1)
  • eGFP- CD9 113-194 -TAT fusion protein (Example 2)
  • eGFP Regarding the -Syncytin1 (FP) -TAT fusion protein (Example 3)
  • eGFP fluorescence was observed in the whole cytoplasm, similar to the eGFP-HA2-TAT fusion protein (reference example) which is a positive control.
  • eGFP-Syncytin1 (FP-NHR) -TAT fusion protein and eGFP-Syncytin1 (FP-NHR-CHR) -TAT fusion protein showed the same localization as eGFP-Syncytin1 (FP). It is considered that this is a cell membrane permeation promoting effect of Syncytin 1 (FP).
  • the eGFP-Syncytin1 (NHR-CHR) -TAT fusion protein was promoted to be incorporated into endosomes, but it was determined that endosomal detachment did not occur because eGFP was not localized throughout the cytoplasm.
  • FIGS. 4 shows a graph of fluorescence intensities for eGFP-TAT fusion protein, eGFP-HA2-TAT fusion protein, eGFP-IZUMO1 57-113 -TAT fusion protein, eGFP- CD9 113-194 -TAT fusion protein.
  • FIG. 5 shows a graph of fluorescence intensity for eGFP-TAT fusion protein, eGFP-HA2-TAT fusion protein, eGFP-Syncytin1 (FP) -TAT fusion protein.
  • fluorescence intensities in FIGS. 4 and 5 are relative fluorescence intensities of the respective fusion proteins with respect to the fluorescence intensities of “eGFP-TAT”.
  • eGFP-IZUMO1 57-113 -TAT fusion protein, eGFP- CD9 113-194 -TAT fusion protein and eGFP-Syncytin1 (FP) -TAT fusion protein are significantly different from those in eGFP-TAT fusion protein. The abundance was increasing.
  • eGFP-IZUMO1 57-113 -TAT fusion protein eGFP- CD9 113-194 -TAT fusion protein
  • eGFP-Syncytin1 (FP) -TAT fusion protein are all more cells than eGFP-HA2-TAT fusion protein.
  • the amount of internal localization increased. Therefore, IZUMO1 57-113, CD9 113-194, cell membrane permeability of the effect of Syncytin1 (FP) is higher than HA2 peptides are cell membrane permeable peptide derived from virus was confirmed.
  • eGFP-IZUMO1 57-113 -TAT fusion protein has a higher intracellular fluorescence than 10 ⁇ M eGFP-HA2-TAT fusion protein even at a low concentration of 0.2 ⁇ M. It was found that the use of 57-113 can be expected to realize a more efficient drug delivery system.
  • the whole cell when quenching with trypan blue, the whole cell emits red fluorescence and endosome labeling with LysoTracker cannot be performed. Therefore, the eGFP-TAT-containing fusion protein on the cell membrane surface was removed by washing with heparin / PBS. Specific operations will be described below.
  • the eGFP-TAT fusion protein after purification "eGFP-TAT Preparation of containing fusion protein", eGFP-HA2-TAT fusion protein, eGFP-IZUMO1 57-113 -TAT fusion protein, eGFP-CD9 113-194 -TAT
  • the fusion protein and eGFP-Syncytin1 (FP) -TAT fusion protein were added to HeLa cells, washed with heparin / PBS after 1 hour, fixed, and then observed with a confocal microscope.
  • the final concentration of eGFP-TAT fusion protein is 10 ⁇ M
  • the final concentration of eGFP-HA2-TAT fusion protein is 10 ⁇ M
  • the final concentration of eGFP-IZUMO1 57-113 -TAT fusion protein is 1 ⁇ M.
  • EGFP- CD9 113-194 -TAT fusion protein to HeLa cells so that the final concentration is 5 ⁇ M
  • eGFP-Syncytin1 (FP) -TAT fusion protein is 5 ⁇ M.
  • the nucleus was labeled with Hoechst, and the endosome was labeled with LysoTracker.
  • an area of interest is taken for each cell, and the area where the fluorescence of eGFP in the cell is colocalized with the fluorescence of LysoTracker relative to the fluorescence of eGFP
  • the ratio ie, the ratio of the area where each fusion protein is localized to the area colocalized with the endosome
  • the fluorescence intensity of LysoTracker were quantified. The result is shown in FIG. As shown in FIG.
  • eGFP-TAT-containing fusion proteins The peptide used as the human-derived cell membrane permeation promoting peptide is preferably shorter from the viewpoint of operability. Therefore , IZUMO1 57-75 (SEQ ID NO: 38), IZUMO1 76-94 (SEQ ID NO: 4), IZUMO1 95-113 (SEQ ID NO: 6) and IZUMO1 81-113 (SEQ ID NO: 5), the respective eGFP-TAT-containing fusion proteins are referred to as “eGFP-TAT-containing fusion proteins”.
  • each fusion protein was delivered into HeLa cells, and the fluorescence intensity of eGFP incorporated into the cells was quantified.
  • eGFP-TAT fusion protein to a final concentration of 10 ⁇ M eGFP-IZUMO1 57-113 -TAT fusion protein to a final concentration of 1 ⁇ M
  • eGFP-IZUMO1 95-113 -TAT fusion EGFP-IZUMO1 57-75 -TAT fusion protein has a final concentration of 1 ⁇ M
  • eGFP-IZUMO1 76-94 -TAT fusion protein has a final concentration of 1 ⁇ M, so that the final concentration is 1 ⁇ M, or 10 ⁇ M.
  • the eGFP-IZUMO1 81-113 -TAT fusion protein was added to Hela cells so that the final concentration was 1 ⁇ M or 10 ⁇ M so that the concentration was 10 ⁇ M.
  • the cells were fixed 1 hour later, and the fluorescence on the cell membrane surface was quenched with trypan blue, and then observed with a confocal microscope.
  • a region of interest (ROI) was taken for each cell and the fluorescence intensity of eGFP was quantified. The results are shown in FIGS.
  • the eGFP-IZUMO1 81-113- TAT fusion protein is shown in Example 4
  • the eGFP-IZUMO1 76-94- TAT fusion protein is shown in Example 5
  • the eGFP-IZUMO1 95-113- TAT fusion protein is used.
  • Example 6 The eGFP-IZUMO1 57-75 -TAT fusion protein is sometimes referred to as Comparative Example 3.
  • the eGFP-IZUMO1 81-113- TAT fusion protein (Example 4) is SEQ ID NO: 39
  • the eGFP-IZUMO1 76-94- TAT fusion protein (Example 5) is SEQ ID NO: 40
  • eGFP-IZUMO1 95-113 is SEQ ID NO: 40
  • the -TAT fusion protein (Example 6) is shown in SEQ ID NO: 41
  • the eGFP-IZUMO1 57-75 -TAT fusion protein (Comparative Example 3) is shown in SEQ ID NO: 42, respectively.
  • the eGFP-IZUMO1 57-75 -TAT fusion protein (Comparative Example 3) showed lower fluorescence intensity than the eGFP-TAT fusion protein (Control Example), whereas eGFP-IZUMO1 81 -113-TAT fusion protein (example 4), eGFP-IZUMO1 76-94 -TAT fusion protein (example 5), eGFP-IZUMO1 95-113 -TAT fusion protein (example 6), eGFP-TAT fusion protein (Control example) Higher fluorescence intensity was shown.
  • the eGFP-IZUMO1 81-113- TAT fusion protein (Example 4) showed the highest value of about 20 times that of the eGFP-TAT fusion protein to which no peptide of IZUMO1 was added (control example). From these results, it is shown that IZUMO1 is a partial peptide consisting of amino acid residues 76-113 (SEQ ID NO: 1) having a high endosome detachment property and excellent cell membrane permeation promoting effect. It was done.
  • the fragment containing a helix of 115-133 (SEQ ID NO: 7), 138-151 (SEQ ID NO: 8) or 182-190 (SEQ ID NO: 9) is also important for CD9.
  • SEQ ID NO: 7 the fragment containing a helix of 115-133
  • 138-151 SEQ ID NO: 8
  • 182-190 SEQ ID NO: 9
  • an eGFP-TAT-containing fusion protein having a nuclear localization signal sequence (NLS) added to the C-terminus hereinafter referred to as a fusion protein containing eGFP and having TAT and NLS added to the C-terminus in the present specification.
  • eGFP-TAT-NLS-containing fusion protein A schematic diagram of the DNA construct of the prepared eGFP-TAT-NLS-containing fusion protein is shown in FIG.
  • the meanings of “6xHis”, “FLAG”, “TCS”, and “(G 4 S) 3 ” in FIG. 10 are the same as those in FIG. "FP '" in FIG.
  • eGFP-NLS fusion protein eGFP-TAT-NLS fusion protein, eGFP-HA2-TAT-NLS fusion protein, and eGFP-Syncytin1 322-340 (FP ′) -TAT -NLS fusion protein
  • the product was purified under the same conditions as “eGFP” in “Preparation of eGFP fusion protein”.
  • eGFP-IZUMO1 57-113- TAT-NLS fusion protein and eGFP-Syncytin1 320-340 (FP) -TAT-NLS fusion protein the insoluble fraction was added to the “eGFP- It refine
  • the collected cells were solubilized using NE-PER nuclear and cytoplasmic extraction reagents (Thermo Fisher Scientific) and fractionated into a nuclear fraction and a non-nuclear fraction. Since the fusion protein remaining inside the endosome is contained in the non-nuclear fraction, the fusion protein contained in the nuclear fraction is considered to be a protein that has left the endosome. Therefore, the fusion protein contained in the nuclear fraction was quantified by Western blotting using an anti-FLAG antibody and divided by the number of cells to calculate the average number of molecules of the protein contained in the nuclear fraction per cell. The results are shown in Table 2.
  • eGFP-IZUMO1 57-113 -TAT-NLS fusion protein is shown in Example 7
  • eGFP-Syncytin1 320-340 (FP) -TAT-NLS fusion protein is shown in Example 8
  • the ⁇ 340 (FP ′) -TAT -NLS fusion protein is sometimes referred to as Example 9.
  • fusion proteins containing the partial peptides of the present invention have a high number of molecules contained in the nuclear fraction per cell and high endosome withdrawal efficiency. It was.
  • the fusion protein containing FP ′ has a remarkably high number of molecules and can deliver about 20 times more molecules to the cytoplasm than “eGFP-HA2-TAT-NLS” containing HA2, which is a conventional cell membrane-permeable peptide. It was found that about 100 times as many molecules as “eGFP-TAT-NLS” can be delivered to the cytoplasm.
  • eGFP-TAT-containing fusion protein ⁇ Delivery of eGFP-Syncytin1 322-340 -TAT into various human cultured cells> It was confirmed that the eGFP-TAT-containing fusion protein was taken up by human cultured cells other than HeLa cells.
  • eGFP-TAT-containing fusion protein eGFP-Syncytin1 322-340 -TAT (SEQ ID NO: 45, Table 3) was used, and “eGFP-IZUMO1 57-113 -TAT fusion” in “Preparation of eGFP-TAT-containing fusion protein” above. It was prepared in the same manner as “Protein”.
  • the obtained fusion protein was mixed with HeLa (human cervical cancer cell), HA431 (human epithelial cell carcinoma cell), HepG2 (human hepatoma cell), and SK-N-SH (final concentration of 5 ⁇ M). Human neuroblastoma cells).
  • HeLa human cervical cancer cell
  • HA431 human epithelial cell carcinoma cell
  • HepG2 human hepatoma cell
  • SK-N-SH final concentration of 5 ⁇ M.
  • Human neuroblastoma cells Human neuroblastoma cells.
  • the cells were fixed, the fluorescence on the cell membrane surface was quenched with trypan blue, and then observed with a confocal microscope. After delivery into each cell, a region of interest (ROI) was taken for each cell and the fluorescence intensity of eGFP was quantified. The result is shown in FIG.
  • the eGFP-Syncytin1 322-340- TAT fusion protein is sometimes referred to as Example 10.
  • the eGFP-Syncytin1 322-340 -TAT fusion protein (Example 10) showed higher fluorescence intensity than the eGFP-TAT fusion protein (control example). From this, it was shown that Syncytin1 322-340 (SEQ ID NO: 44) has a high endosome detachment property against various types of human cells and has an excellent effect of promoting cell membrane permeation.
  • Syncytin1 322-340 SEQ ID NO: 44
  • a SNAP tag molecular weight 19.4 kDa [Nat. Biotechnol. 21 (2003) 86-89] or ⁇ -galactosidase (molecular weight 116 kDa)
  • the TAT fusion protein is the same as “eGFP-IZUMO 157-113 -TAT fusion protein” in “Preparation of eGFP-TAT-containing fusion protein” above. It was prepared by the method. Each of the obtained fusion proteins was added to HeLa cells so that the final concentration was 5 ⁇ M, and the SNAP tag and ⁇ -galactosidase ( ⁇ -Gal) incorporated into the cells were quantified according to the following method.
  • a fusion protein using a SNAP tag instead of eGFP (SNAP-Syncytin1 322-340- TAT fusion protein, SEQ ID NO: 46, Table 3) is covalently bound to benzylguanine (BG-DY505) that has been previously fluorescently labeled.
  • BG-DY505 benzylguanine
  • ROI region of interest
  • Example 11 A fluorescent substrate (C12-FDG) was added and the fluorescence intensity was quantified. The result is shown in FIG.
  • the SNAP-Syncytin1 322-340- TAT fusion protein may be referred to as Example 11, and the ⁇ -Gal-Syncytin1 322-340- TAT fusion protein may be referred to as Example 12.
  • the SNAP-Syncytin1 322-340- TAT fusion protein (Example 11) and the ⁇ -Gal-Syncytin1 322-340- TAT fusion protein (Example 12) are each added with a Syncytin1 322-340 peptide.
  • the fluorescence intensity was higher than that of the SNAP-TAT fusion protein (SEQ ID NO: 48, Table 4) and ⁇ -Gal-TAT fusion protein (SEQ ID NO: 49, Table 4), which were not controlled. From these results, it was shown that Syncytin1 322-340 has a high endosome detachment property for proteins other than eGFP and has an excellent effect of promoting permeation of cell membrane.

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Abstract

本発明の課題は、細胞膜透過性に優れかつヒト由来である部分ペプチドを含む、細胞内送達に適した融合タンパク質又は複合タンパク質、このような融合タンパク質又は複合タンパク質からなる細胞内送達用担体、部分ペプチド並びに部分ペプチドからなる細胞膜透過促進剤、ＤＮＡ、及びベクターの提供である。　融合タンパク質又は複合タンパク質は、所定のＤＮＡがコードするアミノ酸配列のうち少なくとも７個の連続するアミノ酸残基からなる部分ペプチドと、該部分ペプチドと直接的又は間接的に結合され、かつ、細胞表面に対する結合能を有するリガンドと、を有する。リガンドが、好ましくは、抗体である。細胞内送達用担体は、上記融合タンパク質又は複合タンパク質からなる。細胞膜透過促進剤は、上記部分ペプチドからなる。

Description

融合タンパク質又は複合タンパク質、細胞内送達用担体、部分ペプチド、細胞膜透過促進剤、ＤＮＡ、及びベクター
　本発明は、融合タンパク質又は複合タンパク質、細胞内送達用担体、部分ペプチド、細胞膜透過促進剤、ＤＮＡ、及びベクターに関する。
　近年、薬物の過剰投与や副作用を抑制し、安全に、かつ、効果的に薬物投与を行うための手段である、ドラッグデリバリーシステム（Ｄｒｕｇ　ｄｅｌｉｖｅｒｙ　ｓｙｓｔｅｍ：ＤＤＳ）に関する様々な研究・開発がなされている。
　このＤＤＳを利用して、様々な薬剤を細胞に送達するための試みがなされている一方で、例えば、タンパク質等の生体高分子のように、中には細胞膜透過性の低い薬剤も存在する。
　そこで、このような細胞膜透過性の低い薬剤を、細胞内に効率よく送達させることが求められており、そのための技術として、近年、細胞膜透過性ペプチドが注目されている。
　例えば、細胞膜透過性ペプチドとしては、ＨＩＶの転写因子であるＴＡＴペプチドが知られている（特許文献１を参照）。
特開平１０－３３１８６号公報
　ところで、細胞膜透過における作用であるエンドサイトーシスにおいては、まず、リガンドが細胞表面に存在する受容体を認識し、細胞表面に結合してから、細胞膜内に取り込まれ、エンドソームと結合する。そして、エンドソームとの結合後、リガンドがエンドソームから離脱し、細胞内にリガンドが放出されることで、細胞内にリガンドが取り込まれる。
　上記ＴＡＴペプチドは、エンドソームからの離脱性（以下、本明細書において「エンドソーム離脱性」ということがある。）が低いため、細胞内に目的の活性成分を十分に放出できず、細胞膜透過性が低いという問題がある。
　他方、ウイルス感染時や受精時における膜融合に関わる因子である、ＨＡ２（ウイルス由来）、Ｂ１８（ウニ由来）、Ｂ５５（ウニ由来）という膜融合ペプチドが知られている。これらのペプチドは、エンドソーム離脱性に優れているため、細胞膜透過性の高い細胞内送達のためのペプチドとして利用可能であるとも考えられる。
　しかしながら、上記ＨＡ２、Ｂ１８、Ｂ５５は、ヒト由来のペプチドではないため、ＤＤＳに応用する際に免疫原性が生じることが懸念される。
　そのため、細胞内送達のためのペプチドとして、細胞膜透過性に優れるだけではなく、免疫原性が生じにくいヒト由来のペプチドが求められている。
　本発明は、以上の実情に鑑みてなされたものであり、細胞膜透過性に優れ、かつ、ヒト由来である部分ペプチドを含む、細胞内送達に適した融合タンパク質又は複合タンパク質を提供することを目的とする。更に、本発明は、このような融合タンパク質又は複合タンパク質からなる細胞内送達用担体、部分ペプチド及び該部分ペプチドからなる細胞膜透過促進剤、該部分ペプチドをコードするＤＮＡ、並びに該ＤＮＡが組み込まれたベクターを提供することを目的とする。
　本発明者らは、ヒト由来の膜融合関連タンパク質であるＩＺＵＭＯ１、ＣＤ９、Ｓｙｎｃｙｔｉｎ１の一部のアミノ酸残基からなる部分ペプチドが、優れたエンドソーム離脱性を有することを見出し、本発明を完成するに至った。より具体的には、本発明は以下のようなものを提供する。
　（１）　以下の（ａ）から（ｄ）のいずれかに記載のＤＮＡがコードするアミノ酸配列のうち少なくとも７個の連続するアミノ酸残基からなる部分ペプチドと、
　該部分ペプチドと直接的又は間接的に結合され、かつ、細胞表面に対する結合能を有するリガンドと、
を有する、融合タンパク質又は複合タンパク質。
　（ａ）配列番号１、２、又は３に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡ
　（ｂ）配列番号１、２、又は３に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる塩基配列を有するＤＮＡ
　（ｃ）配列番号１、２、又は３に記載のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡ
　（ｄ）配列番号１、２、又は３に記載のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＤＮＡ
　（２）　前記リガンドが、抗体である、（１）に記載の融合タンパク質又は複合タンパク質。
　（３）　（１）又は（２）に記載の融合タンパク質。
　（４）　（１）又は（２）に記載の融合タンパク質又は複合タンパク質からなる、細胞内送達用担体。
　（５）　以下の（ａ）から（ｄ）のいずれかに記載のＤＮＡがコードするアミノ酸配列のうち少なくとも７個の連続するアミノ酸残基からなる部分ペプチド。
　（ａ）配列番号１、２、又は３に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡ
　（ｂ）配列番号１、２、又は３に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる塩基配列を有するＤＮＡ
　（ｃ）配列番号１、２、又は３に記載のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡ
　（ｄ）配列番号１、２、又は３に記載のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＤＮＡ
　（６）　（５）に記載の部分ペプチドからなる細胞膜透過促進剤。
　（７）　（１）又は（２）に記載の融合タンパク質又は（５）に記載の部分ペプチドをコードするＤＮＡ。
　（８）　（７）に記載のＤＮＡが組み込まれたベクター。
　本発明によれば、細胞膜透過性に優れ、かつ、ヒト由来である部分ペプチドを含む、細胞内送達に適した融合タンパク質又は複合タンパク質を提供することができる。更に、本発明によれば、このような融合タンパク質又は複合タンパク質からなる細胞内送達用担体、部分ペプチド及び該部分ペプチドからなる細胞膜透過促進剤、該部分ペプチドをコードするＤＮＡ、並びに該ＤＮＡが組み込まれたベクターを提供することができる。
「ＩＺＵＭＯ１」、「ＣＤ９」、「Ｓｙｎｃｙｔｉｎ１」のドメイン構造を示す図である。 ｅＧＦＰ融合タンパク質のＤＮＡコンストラクトの模式図を示す図である。 ｅＧＦＰ－ＴＡＴ含有融合タンパク質のＤＮＡコンストラクトの模式図を示す図である。 ｅＧＦＰ－ＴＡＴ融合タンパク質、ｅＧＦＰ－ＨＡ２－ＴＡＴ融合タンパク質、ｅＧＦＰ－ＩＺＵＭＯ１５７－１１３－ＴＡＴ融合タンパク質、ｅＧＦＰ－ＣＤ９１１３－１９４－ＴＡＴ融合タンパク質についての蛍光強度のグラフを示す。 ｅＧＦＰ－ＴＡＴ融合タンパク質、ｅＧＦＰ－ＨＡ２－ＴＡＴ融合タンパク質、ｅＧＦＰ－Ｓｙｎｃｙｔｉｎ１（ＦＰ）－ＴＡＴ融合タンパク質についての蛍光強度のグラフを示す。 ｅＧＦＰ－ＴＡＴ融合タンパク質、ｅＧＦＰ－ＨＡ２－ＴＡＴ融合タンパク質、ｅＧＦＰ－ＩＺＵＭＯ１５７－１１３－ＴＡＴ融合タンパク質、ｅＧＦＰ－ＣＤ９１１３－１９４－ＴＡＴ融合タンパク質、ｅＧＦＰ－Ｓｙｎｃｙｔｉｎ１（ＦＰ）－ＴＡＴ融合タンパク質のＨｅｌａ細胞内に送達後における、細胞内のｅＧＦＰの蛍光がＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒの蛍光と共局在している面積のｅＧＦＰの蛍光に対する面積比（右軸）と、ＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒの蛍光強度（左軸）のグラフを示す図である。 ｅＧＦＰ－ＴＡＴ融合タンパク質（終濃度１０μＭ）、ｅＧＦＰ－ＩＺＵＭＯ１５７－１１３－ＴＡＴ融合タンパク質（終濃度１μＭ）、ｅＧＦＰ－ＩＺＵＭＯ１８１－１１３－ＴＡＴ融合タンパク質（終濃度１μＭ）、ｅＧＦＰ－ＩＺＵＭＯ１８１－１１３－ＴＡＴ融合タンパク質（終濃度１０μＭ）についての蛍光強度のグラフを示す。 ｅＧＦＰ－ＴＡＴ融合タンパク質（終濃度１０μＭ）、ｅＧＦＰ－ＩＺＵＭＯ１５７－１１３－ＴＡＴ融合タンパク質（終濃度１μＭ）、ｅＧＦＰ－ＩＺＵＭＯ１５７－７５－ＴＡＴ融合タンパク質（終濃度１μＭ）、ｅＧＦＰ－ＩＺＵＭＯ１５７－７５－ＴＡＴ融合タンパク質（終濃度１０μＭ）、ｅＧＦＰ－ＩＺＵＭＯ１７６－９４－ＴＡＴ融合タンパク質（終濃度１μＭ）、ｅＧＦＰ－ＩＺＵＭＯ１７６－９４－ＴＡＴ融合タンパク質（終濃度１０μＭ）、ｅＧＦＰ－ＩＺＵＭＯ１９５－１１３－ＴＡＴ融合タンパク質（終濃度１μＭ）についての蛍光強度のグラフを示す。 ヒト由来細胞膜透過性ペプチドの候補であるＩＺＵＭＯ１５７－１１３、ＣＤ９１１３－１９４、及びＳｙｎｃｙｔｉｎ１３２０－４４０の二次構造予測について示した図である。 ｅＧＦＰ－ＴＡＴ－ＮＬＳ含有融合タンパク質のＤＮＡコンストラクトの模式図を示す図である。 ｅＧＦＰ－Ｓｙｎｃｙｔｉｎ１３２２－３４０－ＴＡＴ融合タンパク質及びｅＧＦＰ－ＴＡＴ融合タンパク質について、ＨｅＬａ（ヒト子宮頸癌細胞）、ＨＡ４３１（ヒト上皮様細胞癌細胞）、ＨｅｐＧ２（ヒト肝癌細胞）、及び、ＳＫ－Ｎ－ＳＨ（ヒト神経芽腫細胞）に添加したときの蛍光強度のグラフを示す。 ＳＮＡＰ－Ｓｙｎｃｙｔｉｎ１３２２－３４０－ＴＡＴ融合タンパク質、ＳＮＡＰ－ＴＡＴ融合タンパク質、β－Ｇａｌ－Ｓｙｎｃｙｔｉｎ１３２２－３４０－ＴＡＴ融合タンパク質及びβ－Ｇａｌ－ＴＡＴ融合タンパク質についての蛍光強度のグラフを示す。
　以下、本発明の具体的な実施形態について詳細に説明するが、本発明は以下の実施形態に何ら限定されるものではなく、本発明の目的の範囲内において、適宜変更を加えて実施することができる。
　＜融合タンパク質又は複合タンパク質＞
　本発明の融合タンパク質又は複合タンパク質は、以下の（ａ）から（ｄ）のいずれかに記載のＤＮＡがコードするアミノ酸配列のうち少なくとも７個の連続するアミノ酸残基からなる部分ペプチドと、該部分ペプチドと直接的又は間接的に結合され、かつ、細胞表面に対する結合能を有するリガンドとを有する。
　（ａ）配列番号１、２、又は３に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡ
　（ｂ）配列番号１、２、又は３に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる塩基配列を有するＤＮＡ
　（ｃ）配列番号１、２、又は３に記載のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡ
　（ｄ）配列番号１、２、又は３に記載のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＤＮＡ
　本発明の融合タンパク質又は複合タンパク質は、部分ペプチドが上記構成を有することで、高いエンドソーム離脱性を有するため、優れた細胞膜透過性を奏することができる。なお、本発明の「融合タンパク質」とは、該部分ペプチドと、他の１種以上のタンパク質とが結合されたタンパク質のことを指す。また、本発明の「複合タンパク質」とは、該部分ペプチドと、タンパク質以外の成分（例えば、低分子化合物、核酸、糖鎖、ナノ粒子等）とが結合された複合体のことを指す。
　（部分ペプチド）
　本発明の融合タンパク質又は複合タンパク質における部分ペプチドは、上記（ａ）から（ｄ）のいずれかに記載のＤＮＡがコードするアミノ酸配列のうち少なくとも７個の連続するアミノ酸残基からなるペプチドである。
　配列番号１に記載のアミノ酸配列は、ヒト由来の膜融合関連タンパク質ＩＺＵＭＯ１のＮ末端付近の融合コアヘリックスペプチドの一部であって、ＩＺＵＭＯ１のＮ末端側から数えた場合に７６－１１３番目に相当するアミノ酸残基が表すアミノ酸配列である。
　配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち、特に、部分ペプチドが高いエンドソーム離脱性を有し、優れた細胞膜透過性を奏することから、ＩＺＵＭＯ１のＮ末端側から数えた場合に７６－９４番目に相当するアミノ酸残基が表すアミノ酸配列（配列番号４）、ＩＺＵＭＯ１のＮ末端側から数えた場合に８１－１１３番目に相当するアミノ酸残基が表すアミノ酸配列（配列番号５）、又は、ＩＺＵＭＯ１のＮ末端側から数えた場合に９５－１１３番目に相当するアミノ酸残基が表すアミノ酸配列（配列番号６）が特に好ましい。
　配列番号２に記載のアミノ酸配列は、ヒト由来の膜融合関連タンパク質ＣＤ９のＣ末端付近の第２細胞外ループペプチドの一部であって、ＣＤ９のＮ末端側から数えた場合に１１３－１９４番目に相当するアミノ酸残基が表すアミノ酸配列である。
　配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち、特に、部分ペプチドが高いエンドソーム離脱性を有し、優れた細胞膜透過性を奏することから、ＣＤ９のＮ末端側から数えた場合に１１５－１３３番目に相当するアミノ酸残基が表すアミノ酸配列（配列番号７）、ＣＤ９のＮ末端側から数えた場合に１３８－１５１番目に相当するアミノ酸残基が表すアミノ酸配列（配列番号８）、又は、ＣＤ９のＮ末端側から数えた場合に１８２－１９０番目に相当するアミノ酸残基が表すアミノ酸配列（配列番号９）が特に好ましい。
　配列番号３に記載のアミノ酸配列は、ヒト由来の膜融合関連タンパク質Ｓｙｎｃｙｔｉｎ１を構成するＣ末端側のＴＭドメインのうち、膜融合に関わるＦＰペプチドのアミノ酸配列であって、Ｓｙｎｃｙｔｉｎ１のＮ末端側から数えた場合に３２０－３４０番目に相当するアミノ酸残基が表すアミノ酸配列である。
　配列番号３に記載のアミノ酸配列のうち、特に、部分ペプチドが高いエンドソーム離脱性を有し、優れた細胞膜透過性を奏することから、Ｓｙｎｃｙｔｉｎ１のＮ末端側から数えた場合に３２２－３４０番目に相当するアミノ酸残基が表すアミノ酸配列（配列番号４４）が好ましく、Ｓｙｎｃｙｔｉｎ１のＮ末端側から数えた場合に３２１－３３４番目に相当するアミノ酸残基が表すアミノ酸配列（配列番号１０）が特に好ましい。
　本発明の部分ペプチドを構成するアミノ酸残基の数は、上記（ａ）から（ｄ）のいずれかに記載のＤＮＡがコードするアミノ酸配列のうち少なくとも７個の連続するアミノ酸残基であれば、特に限定されず、上記配列番号１～３がコードするアミノ酸残基の数等に応じて適宜選択することができる。例えば、本発明の部分ペプチドを構成するアミノ酸残基を、上記（ａ）から（ｄ）のいずれかに記載のＤＮＡがコードするアミノ酸配列のうち、少なくとも１０個、１２個、１５個、１８個、２０個、３０個、４０個、５０個、６０個、７０個等の連続するアミノ酸残基によって構成してもよい。また、その上限も特に限定されず、例えば、本発明の部分ペプチドを構成するアミノ酸残基を、上記（ａ）から（ｄ）のいずれかに記載のＤＮＡがコードするアミノ酸配列のうち、７５個以下、６５個以下、５５個以下、４５個以下、３５個以下、２５個以下、２２個以下、１７個以下、１６個以下、１４個以下、１３個以下等の連続するアミノ酸残基によって構成してもよい。
　配列番号１～１０のいずれかに記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡの変異体やホモログには、配列番号１～１０のいずれかに記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる塩基配列を有するＤＮＡや、配列番号１～１０のいずれかに記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列と９０％以上（好ましくは、９２％以上、より好ましくは、９５％以上、更に好ましくは、９９％以上）の相同性を有する塩基配列からなるＤＮＡも含まれる。配列番号１～１０のいずれかに記載の塩基配列に相補的な塩基配列とハイブリダイズできる「ストリンジェントな条件」としては、例えば、通常のハイブリダイゼーション緩衝液中、４０～７０℃（好ましくは、５０～６７℃、より好ましくは、６０～６５℃）で反応を行い、塩濃度１５～３００ｍＭ（好ましくは、１５～１５０ｍＭ、より好ましくは１５～６０ｍＭ、更に好ましくは、３０～５０ｍＭ）の洗浄液中で洗浄を行う条件が挙げられる。
　本発明の部分ペプチドのアミノ酸配列をコードするＤＮＡには、配列番号１～１０のいずれかに記載のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡも含まれる。ここで、「１もしくは複数」とは、通常、３アミノ酸以内を指し、好ましくは２アミノ酸以内である。部分ペプチドが細胞膜透過性作用を維持する場合、変異するアミノ酸残基においては、アミノ酸側鎖の性質が保存されている別のアミノ酸に変異されることが望ましい。特に、部分ペプチドのアミノ酸残基の数が少なく（例えば、部分ペプチドのアミノ酸残基の数が７～１０である場合）、かつ、変異されるアミノ酸の数が多い場合（例えば、３アミノ酸以内である場合）、変異するアミノ酸側鎖の性質が保存されるように、別のアミノ酸に変異されることで、部分ペプチドが細胞膜透過性作用を維持しやすくなる。例えばアミノ酸側鎖の性質としては、疎水性アミノ酸（Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｗ、Ｙ、Ｖ）、親水性アミノ酸（Ｒ、Ｄ、Ｎ、Ｃ、Ｅ、Ｑ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｓ、Ｔ）、脂肪族側鎖を有するアミノ酸（Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ）、水酸基含有側鎖を有するアミノ酸（Ｓ、Ｔ、Ｙ）、硫黄原子含有側鎖を有するアミノ酸（Ｃ、Ｍ）、カルボン酸及びアミド含有側鎖を有するアミノ酸（Ｄ、Ｎ、Ｅ、Ｑ）、塩基含有側鎖を有するアミノ酸（Ｒ、Ｋ、Ｈ）、芳香族含有側鎖を有するアミノ酸（Ｈ、Ｆ、Ｙ、Ｗ）を挙げることができる（なお、上記括弧内のアルファベットは、いずれもアミノ酸の一文字標記を表す）。
　本発明の部分ペプチドのアミノ酸配列は、配列番号１～１０のいずれかに記載のアミノ酸配列と相同性が高い方が好ましい。例えば、本発明の部分ペプチドのアミノ酸配列は、配列番号１～１０のいずれかに記載のアミノ酸配列との相同性は、９０％以上が好ましく、９２％以上がより好ましく、９５％以上（９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上）が更に好ましい。他方、あるアミノ酸配列に対する１又は複数個のアミノ酸残基の欠失、付加及び／又は他のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列を有するタンパク質がその生物学的活性を維持することはすでに知られている（Ｍａｒｋ，Ｄ．Ｆ．ｅｔ　ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８４）８１，５６６２－５６６６、Ｚｏｌｌｅｒ，Ｍ．Ｊ．＆　Ｓｍｉｔｈ，Ｍ．Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９８２）１０，６４８７－６５００、Ｗａｎｇ，Ａ．ｅｔ　ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ　２２４，１４３１－１４３３、Ｄａｌｂａｄｉｅ－ＭｃＦａｒｌａｎｄ，Ｇ．ｅｔ　ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８２）７９，６４０９－６４１３）。配列番号１～１０のいずれかに記載のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列も、配列番号１～１０のいずれかに記載のアミノ酸配列と相同性が高い方が好ましい。例えば、配列番号１～１０のいずれかに記載のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列と、配列番号１～１０のいずれかに記載のアミノ酸配列との相同性は、８５％以上が好ましく、９０％以上がより好ましく、９５％以上（９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上）が更に好ましい。
　アミノ酸配列や塩基配列の相同性は、Ｋａｒｌｉｎ　ａｎｄ　ＡｌｔｓｃｈｕｌによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　９０：５８７３－５８７７，１９９３）によって決定することができる。このアルゴリズムに基づいて、ＢＬＡＳＴＮやＢＬＡＳＴＸと呼ばれるプログラムが開発されている（Ａｌｔｓｃｈｕｌ　ｅｔ　ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．　２１５：４０３－４１０，１９９０）。ＢＬＡＳＴに基づいてＢＬＡＳＴＮによって塩基配列を解析する場合には、パラメータは例えばｓｃｏｒｅ＝１００、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝１２とする。また、ＢＬＡＳＴに基づいてＢＬＡＳＴＸによってアミノ酸配列を解析する場合には、パラメータは例えばｓｃｏｒｅ＝５０、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝３とする。ＢＬＡＳＴとＧａｐｐｅｄ　ＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメータを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．）。
　本発明における「ＤＮＡ」は、センス鎖又はアンチセンス鎖（例えば、プローブとして使用できる）のいずれでもよく、その形状は一本鎖と二本鎖のいずれでもよい。また、ゲノムＤＮＡであっても、ｃＤＮＡであっても、合成されたＤＮＡであってもよい。
　本発明において、ＤＮＡを取得する方法としては、特に限定されないが、ｍＲＮＡから逆転写することでｃＤＮＡを得る方法（例えば、ＲＴ－ＰＣＲ法）、ゲノムＤＮＡから調製する方法、化学合成により合成する方法、ゲノムＤＮＡライブラリーやｃＤＮＡライブラリーから単離する方法等の公知の方法（例えば、特開平１１－２９５９９号公報参照）が挙げられる。
　本発明の部分ペプチドは、例えば、Ｆｍｏｃ合成法など公知の固相ペプチド合成法により化学合成することで作製できる。また、部分ペプチドのアミノ酸配列をコードするＤＮＡを含む発現ベクターが導入された形質転換体を使用することでも作製できる。すなわち、まず、この形質転換体を適宜の条件で培養し、このＤＮＡがコードするタンパク質（部分ペプチド）を合成させる。
　形質転換体を得るための宿主としては、ベクターに適合し形質転換されうるものであればよく、例えば、細菌、酵母、動物細胞、昆虫細胞等の、公知の天然細胞又は人工的に樹立された細胞（特開平１１－２９５９９号公報参照）が挙げられる。形質転換体を得るための発現ベクターは、適当なベクターに上述のＤＮＡを挿入することにより、作製できる。「適当なベクター」とは、原核生物及び／又は真核生物の各種の宿主内で複製保持又は自己増殖できるものであればよく、使用の目的に応じて適宜選択できる。ベクターの導入方法は、ベクターや宿主の種類等に応じて適宜選択できる。その具体例としては、特に限定されないが、プロトプラスト法、コンピテント法等の公知の方法（例えば、特開平１１－２９５９９号公報参照）が挙げられる。また、ＤＮＡは、精製等を目的として、必要に応じて、タグ（６×Ｈｉｓ、ＦＬＡＧ等）や、トロンビン認識配列（ＴＣＳ）等が合成するタンパク質に含まれるように、構成してもよい。
　形質転換体の培養は、部分ペプチドが大量にかつ容易に取得できるように、形質転換体の種類等に応じて、公知の栄養培地から適宜選択し、温度、栄養培地のｐＨ、培養時間等を適宜調整して行うことができる（例えば、特開平１１－２９５９９号公報参照）。このように、形質転換体により合成されたタンパク質を形質転換体又は培養液から回収することにより、本発明の部分ペプチドを得ることができる。なお、部分ペプチドの単離方法及び精製方法としては、特に限定されず、溶解度を利用する方法、分子量の差を利用する方法、荷電を利用する方法等の公知の方法（例えば、特開平１１－２９５９９号公報参照）が挙げられる。
　（リガンド）
　本発明の融合タンパク質又は複合タンパク質におけるリガンドは、細胞表面に対する結合能を有するものである。
　細胞表面に対する結合能を有するリガンドとしては、例えば、細胞選択的マーカーとしての糖鎖、タンパク質、抗原等の細胞表面の特定の対象物質（受容体等）に対して特異的相互作用を示す分子認識素子が挙げられ、より具体的には、抗体、レクチン、サイトカイン、ホルモン、神経伝達物質、ペプチド（ＴＡＴ、ポリアルギニン等）、糖鎖（キチン、キトサン、ヒアルロン酸等）が挙げられる。特に、細胞選択性が高いことから、抗体を用いることが好ましい。抗体としては、例えば、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、Ｆａｂ、ドメイン抗体、Ｄｉａｂｏｄｙ等の低分子抗体（例えば、分子量１０～１００ｋＤａの抗体）を好適に用いることができる。
　リガンドは、上記部分ペプチドと直接的又は間接的に結合する。結合の方法は、リガンドの種類等に応じて、適宜選択することができる。例えば、リガンドが、抗体である場合、上記部分ペプチドと抗体との融合タンパク質を、上記で述べた部分ペプチドと同様に遺伝子工学的に作製することができる。この際、リンカーとなるアミノ酸配列を部分ペプチドと抗体との間に挿入することで、リンカーを介して間接的に部分ペプチドと抗体とを結合させてもよく、リンカーを介さずに、直接的に部分ペプチドと抗体とを結合させてもよい。リンカーとなるアミノ酸残基の数は、特に限定されず、タンパク質全体のアミノ酸残基の数等を考慮して例えば、１～１００アミノ酸残基であってもよい。リンカーとなるアミノ酸配列としては、ＧＧＧＧＳを３回繰り返すフレキシブルリンカー（配列番号１１）等が挙げられる。また、リンカーとなるアミノ酸配列がコードするペプチド自身が、細胞膜透過性が高くなるように設計し、融合タンパク質の細胞膜透過性をより一層高めてもよい。リンカーとなるアミノ酸配列がコードするペプチド自身が、細胞膜透過性を高くなるように設計するには、上記配列番号１～１０のいずれかに記載のアミノ酸配列との相同性が高くなるように設計してもよく、例えば、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上等となるように設計してもよい。
　リガンドが、抗体等のタンパク質でない場合（例えば、リガンドが低分子化合物や糖鎖である場合）、リガンドが部分ペプチドに直接的に結合するには、部分ペプチド内の末端又は内部に存在する官能基（例えば、カルボキシル基、アミノ基、スルフヒドリル基等）を利用して、化学的に結合することができる。その際の化学的な結合様式としては、例えば、アミド結合、チオエーテル結合、エステル結合等が挙げられる。また、部分ペプチドとリガンドとの間接的な結合は、主に、直接的に結合させることが困難である場合や、間接的に結合をさせた方が好適である場合に行う。間接的な結合は、リンカーを介して行うことができる。この場合のリンカー（つまり、リガンドがタンパク質でない場合のリンカー）としては、両端に反応性基を有し、２分子を連結させうる構造の分子であれば、特に限定されるものでないが、該反応性基としては、例えば、マレイミド基、アルデヒド基、ＮＨＳエステル等が挙げられる。また、リガンドがタンパク質でない場合のリンカーの具体例としては、ポリエチレングリコール等が挙げられる。
　上記で述べたように、本発明の部分ペプチドとリガンドとの組み合わせは、部分ペプチド及びリガンドの性質、構造相関等を考慮し、公知の結合方法の中から、本発明のペプチドとリガンドとのそれぞれの組み合わせに適した結合方法を選択することができる。
　（その他）
　本発明の融合タンパク質又は複合タンパク質は、生理活性を有する有効成分（以下、本明細書において、「有効成分」ということがある。）を、その分子中に含んでもよい。あるいは、本発明の融合タンパク質又は複合タンパク質が、有効成分を分子中に含まなくてもよく、この場合、例えば、細胞内送達に用いる場合に、本発明の融合タンパク質又は複合タンパク質と、有効成分（例えば、核酸等）との複合体を形成してもよい。
　有効成分がタンパク質である場合、上記部分ペプチドと、有効成分と、必要に応じて更にリガンドとして作用するタンパク質（抗体等）との融合タンパク質を、上記で述べた部分ペプチドと同様に遺伝子工学的に作製することができる。この際、リンカーとなるアミノ酸配列を、上記リガンドと同様に、それぞれのペプチドの間に挿入することで、リンカーを介して間接的にそれぞれのペプチドを結合させてもよく、リンカーを介さずに、直接的にそれぞれのペプチドを結合させてもよい。リンカーとなるアミノ酸配列がコードするペプチドは、上記のリガンドと部分ペプチドとの間に挿入されるリンカーと同様のものを用いることができる。また、融合タンパク質において、それぞれのペプチドが位置する領域は、特に限定されず、例えば、Ｎ末端側から、部分ペプチド、有効成分、リガンドとの順番となるように融合タンパク質を設計してもよく、Ｎ末端側から、有効成分、リガンドと、部分ペプチドの順番となるように融合タンパク質を設計してもよく、Ｎ末端側から、有効成分、部分ペプチド、リガンドの順番となるように融合タンパク質を設計してもよく、それぞれのタンパク質の性質に応じて、所望の効果を発揮するように適宜設計することができる。なお、有効成分がリガンドとして作用する場合もありえ、その場合は、リガンドと部分ペプチドのみから本発明の融合タンパク質を構成してもよい。
　有効成分がタンパク質である場合、例えば、抗体（ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、ドメイン抗体、Ｄｉａｂｏｄｙ等）、細胞傷害性の毒素タンパク質（シュードモナス外毒素、リボヌクレアーゼ等）、レポーター酵素（蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ、β－ガラクトシダーゼ、西洋わさびペルオキシダーゼ等）、生理活性ペプチド等が挙げられる。有効成分がタンパク質である場合、その有効成分の分子量としては、特に限定されず、他のペプチドの種類、分子量等に応じて、適宜選択することができるが、例えば、１～１０００ｋＤａの範囲内から選択してもよい。
　有効成分がタンパク質でない場合、有効成分は、部分ペプチド又はリガンドに直接的又は間接的に結合することができる。有効成分が部分ペプチド又はリガンドに直接的に結合するには、部分ペプチド内又はリガンド内の末端又は内部に存在する官能基を利用して、有効成分は化学的に結合することができる。その際の化学的な結合様式は、有効成分と反応する官能基の種類に応じて決定される。また、アビジンとビオチン等の非共有結合を利用して、部分ペプチドとアビジンとの融合タンパク質に、ビオチン標識した有効成分を結合することもできる。有効成分と、部分ペプチド又はリガンドとの間接的な結合は、主に、直接的に結合させることが困難である場合や、間接的に結合をさせた方が好適である場合に行う。間接的な結合は、リンカーを介して行うことができる。この場合のリンカー（つまり、有効成分がタンパク質でない場合のリンカー）としては、上述の部分ペプチドとリガンドとのリンカーと同様のものを用いることができる。
　タンパク質でない有効成分としては、例えば、低分子化合物（抗体薬物複合体ＡＤＣで利用されている抗ガン剤や抗生物質等の薬剤、ＦＩＴＣやＴＡＭＲＡなどの蛍光色素、ＭＲＩやＰＥＴのためのレポーターユニット等）、核酸（自殺遺伝子やレポーター遺伝子をコードするＤＮＡやｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、アプタマー等）、糖鎖、放射性同位元素等が挙げられる。
　本発明の複合タンパク質は、上述のとおり、部分ペプチドがタンパク質以外の成分と結合した複合体のことを指すものであり、例えば、上記で述べた融合タンパク質と、タンパク質以外の成分を化学的に結合したものや、部分ペプチドと、タンパク質以外のリガンド及び／又は有効成分を結合したもの自体であってもよく、該部分ペプチドと、タンパク質以外の成分でありかつリンカー及び有効成分以外である成分を結合したものであってもよい。
　本発明の複合タンパク質において、タンパク質以外の成分を結合する場合、該成分としては、例えば、上述した、タンパク質以外のリガンド、有効成分、及びこれらのリンカーの他に、例えば、脂質（リン脂質等）や天然多糖（キチン、キトサン、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸等）が挙げられる。ここで、リポソームや天然多糖複合体等のナノ粒子がキャリアとしてＤＤＳに利用されていることは公知であり、例えば、ナノ粒子形成能を有する脂質や天然多糖を用いることで、本発明の複合タンパク質は、上記のタンパク質以外の有効成分を封入したキャリアとして、有効成分の細胞内送達に利用できる。ナノ粒子形成能を有する脂質や天然多糖は、従来の公知の脂質や天然多糖を用いることができ、有効成分、リガンド等の種類に応じて、適宜選択することができる。また、これらタンパク質以外の成分は、部分ペプチド、リガンド、又は有効成分と直接的に結合してもよく、リンカーを介して間接的に結合してもよい。
　融合タンパク質のような生体高分子は、特に、細胞膜透過性が低いが、本発明は、融合タンパク質であっても、上記部分ペプチドとの融合タンパク質とすることで、高いエンドソーム離脱性を有し、優れた細胞膜透過性を奏する。このことから、本発明は、融合タンパク質が特に好適である。
　本発明の融合タンパク質又は複合タンパク質の分子量やサイズは、特に限定されず、例えば、融合タンパク質又は複合タンパク質の分子量が１００～１０００ｋＤａであってもよく、又は、融合タンパク質又は複合タンパク質のサイズ（粒径）が１～２００ｎｍであってもよい。
　本発明の融合タンパク質又は複合タンパク質は、細胞膜透過性を向上させるために、カチオン性ペプチド（例えば、ＴＡＴペプチド、ポリアルギニン、ポリリシン、ポリヒスチジン）を分子中に含んでもよい。しかし、カチオン性ペプチドは、アニオン性である細胞膜と静電的に相互作用するため、細胞膜透過性が上昇する一方で、細胞非選択的に相互作用して、細胞内に取り込まれる。そのため、カチオン性ペプチドは、特定の細胞内へ送達を行うという観点では、好ましくない。他方、抗体をリガンドとして用いた場合、抗体は細胞膜透過性が低いため、この細胞膜透過性を上昇させるためには、抗体をＴＡＴペプチド等のカチオン性ペプチドと融合せざるを得なかった。しかしながら、本発明の融合タンパク質又は複合タンパク質は、細胞膜透過性に優れるため、カチオン性ペプチドを分子中に含まなくても高い細胞膜透過性を有する。むしろ、カチオン性ペプチドを含むことで、細胞選択性が低くなるため、抗体等の細胞選択性の高いリガンドを利用する場合は、細胞選択性を低くしないため、これらのカチオン性ペプチドは、含まない方が好ましい。
　＜細胞内送達用担体＞
　本発明の細胞内送達用担体は、上記の融合タンパク質又は複合タンパク質からなる。
　標的とする細胞は、特に限定されず、例えば、肺細胞、結腸細胞、直腸細胞、肛門細胞、胆管細胞、小腸細胞、胃細胞、食道細胞、胆嚢細胞、肝細胞、膵臓細胞、虫垂細胞、乳細胞、卵巣細胞、子宮頸細胞、前立腺細胞、腎細胞、神経膠芽腫細胞、皮膚細胞、リンパ細胞、絨毛腫瘍細胞、頭頸部細胞、骨原性肉腫細胞、血液細胞等の細胞あるいは、これらの癌細胞（子宮頸癌細胞、肺癌細胞、結腸癌細胞、直腸癌細胞、肛門癌細胞、胆管癌細胞、小腸癌細胞、胃癌細胞、食道癌細胞、胆嚢癌細胞、肝癌細胞、膵臓癌細胞、虫垂癌細胞、乳癌細胞、卵巣癌細胞、前立腺癌細胞、腎癌細胞、中枢神経系の癌細胞、神経膠芽腫細胞、神経芽腫細胞、皮膚癌細胞、リンパ腫細胞、絨毛癌腫瘍細胞、頭頸部癌細胞、骨原性肉腫細胞、血液癌細胞、上皮様細胞癌細胞等）に送達することができる。
　本発明の細胞内送達用担体は、従来の公知の方法によって、細胞内へ送達することができる。例えば、本発明の細胞内送達用担体を単離された細胞に送達する場合、ｉｎ　ｖｉｔｒｏで、細胞内送達用担体と細胞を混合して培養することにより、行うことができる。あるいは、本発明の細胞内送達用担体を動物（ヒトを除く動物を含む）に投与する場合、ｉｎ　ｖｉｖｏで、経口投与、注射（静脈内注射、皮下注射、筋肉内注射等）による投与方法により、送達することができる。
　＜細胞膜透過促進剤＞
　本発明は、上記部分ペプチドからなる細胞膜透過促進剤を含む。本発明における「細胞膜透過促進」は、エンドソーム離脱性の促進を含む。
　＜ＤＮＡ＞
　本発明は、上記（ａ）から（ｄ）のいずれかに記載のＤＮＡがコードするアミノ酸配列のうち少なくとも７個の連続するアミノ酸残基からなる部分ペプチドと、該部分ペプチドと直接的又は間接的に結合され、かつ、細胞表面に対する結合能を有するリガンドとを有する融合タンパク質、又は、上記部分ペプチドをコードするＤＮＡを包含する。
　上記融合タンパク質をコードするＤＮＡは、上記部分ペプチドの合成に用いられるＤＮＡと同様の方法で作製することができる。
　＜ベクター＞
　本発明は、上記（ａ）から（ｄ）のいずれかに記載のＤＮＡがコードするアミノ酸配列のうち少なくとも７個の連続するアミノ酸残基からなる部分ペプチドと、該部分ペプチドと直接的又は間接的に結合された、細胞表面に対する結合能を有するリガンドとを有する融合タンパク質、又は、上記部分ペプチドをコードするＤＮＡが組み込まれたベクターを包含する。
　本発明のベクターは、上述の部分ペプチドの合成で用いることができる適当なベクターと同様のベクターを用いることができる。
　＜ヒト由来の細胞膜透過性を有する部分ペプチド候補の選定＞
　ヒト由来の細胞膜透過性を有する部分ペプチド（以下、本明細書において「ヒト由来細胞膜透過性ペプチド」ということがある。）の候補として、受精時に配偶子の認識及び融合に関係する精子側因子のタンパク質ＩＺＵＭＯ１のＮ末端付近の融合コアヘリックスペプチドである「ＩＺＵＭＯ１５７－１１３」（配列番号１２）、卵子側因子のタンパク質ＣＤ９のＣ末端付近のテトラスパニンファミリーの特徴である３アミノ酸配列（ＣＣＧ）が含まれる第２細胞外ループペプチドである「ＣＤ９１１３－１９４」（配列番号２）、及び、胎盤の合胞体性栄養膜細胞の形成に関わるタンパク質Ｓｙｎｃｙｔｉｎ１のヘプタッドリピート構造を含むコイルドコイル構造の部分ペプチドである「Ｓｙｎｃｙｔｉｎ１３４５－４２２」（配列番号１３）、「Ｓｙｎｃｙｔｉｎ１３２０－３４０（ＦＰ）」（以下、本明細書において、「Ｓｙｎｃｙｔｉｎ１（ＦＰ）」ということがある。）（配列番号３）、「Ｓｙｎｃｙｔｉｎ１３５２－３９２（ＮＨＲ）（以下、本明細書において、「Ｓｙｎｃｙｔｉｎ１（ＮＨＲ）」ということがある。）」（配列番号１４）、及び「Ｓｙｎｃｙｔｉｎ１４０７－４４０（ＣＨＲ）（以下、本明細書において、「Ｓｙｎｃｙｔｉｎ１（ＣＨＲ）」ということがある。）」（配列番号１５）を選択した。更に、ヒト由来細胞膜透過性ペプチドの候補として、「Ｓｙｎｃｙｔｉｎ１（ＦＰ－ＮＨＲ）」（配列番号１６）、「Ｓｙｎｃｙｔｉｎ１（ＮＨＲ－ＣＨＲ）」（配列番号１７）、「Ｓｙｎｃｙｔｉｎ１（ＦＰ－ＮＨＲ－ＣＨＲ）」（配列番号１８）を選択した。なお、各ペプチド名に付された下付きの数字は、それぞれのペプチドを構成するアミノ酸残基について、それぞれの由来となるタンパク質においてＮ末端側から数えた場合のアミノ酸残基の番号である。
　また、細胞膜透過性ペプチドのポジティブコントロールとしてウニ由来の部分ペプチドＢ５５（配列番号１９）を選択した。各ペプチドが含まれるタンパク質のドメイン構造を図１に、各ペプチドのアミノ酸配列を表１に示す。図１中、「ＩＺＵＭＯ１」中の「ＳＰ」は、Ｎ末端のシグナル配列（ＳＰ）を示し、「ＩＺＵＭＯ１」中の「ＴＭＤ」は、Ｃ末端側の膜貫通ドメインを示し、「ＩＺＵＭＯ１」中の「Ｉｇ－ｌｉｋｅ」は、細胞外ドメインの１つであるＩｇ様ドメインを示す。「ＣＤ９」中の「ＴＭＤ」は、４つのそれぞれの膜貫通ドメインを示す。「Ｓｙｎｃｙｔｉｎ１」の上に付された「ＳＵ」及び「ＴＭ」は、「Ｓｙｎｃｙｔｉｎ１」を構成する２つのドメインを示し、「ＣＳ」は、これらの間にある切断サイトを示す。「Ｓｙｎｃｙｔｉｎ１」中の「ＳＰ」は、Ｎ末端のシグナル配列を示し、「ＴＭＤ」は、Ｃ末端側の膜貫通ドメイン示す。また、図１に示すとおり、「Ｓｙｎｃｙｔｉｎ１」中、膜融合に関わる融合ペプチドである「ＦＰ（３２０－３４０ａ．ａ．）」、Ｎ末端側ヘプタッドリピート配列である「ＮＨＲ」（３５２－３９２ａ．ａ．）、Ｃ末端側ヘプタッドリピート配列である「ＣＨＲ（４０７－４４０ａ．ａ．）」は、それぞれＴＭドメインに含まれる３つのモチーフ配列であることを示す。図１中の各ドメインに記載された数字は、それぞれのペプチドを構成するアミノ酸残基について、それぞれの由来となるタンパク質においてＮ末端側から数えた場合のアミノ酸残基の番号である。図１中、ヒト由来の細胞膜透過性を有する部分ペプチドの候補として選んだ領域を、「ＩＺＵＭＯ１」、「ＣＤ９」に関しては斜線で示しており、「Ｓｙｎｃｙｔｉｎ１（ＦＰ）」、「Ｓｙｎｃｙｔｉｎ１（ＮＨＲ）」、「Ｓｙｎｃｙｔｉｎ１（ＣＨＲ）」に関してはそれぞれの名前の文字標記で示しており、「Ｓｙｎｃｙｔｉｎ１３４５－４２２」に関しては下側に付した数値で示している。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　＜ｅＧＦＰ融合タンパク質の調製＞
　まず、ヒト由来細胞膜透過性ペプチドの候補が細胞膜に非選択的に結合しないことを確認するために、上記の各部分ペプチドとｅＧＦＰ（高感度緑色蛍光タンパク質）との融合タンパク質（以下、本明細書において、ｅＧＦＰを含む融合タンパク質を「ｅＧＦＰ融合タンパク質」ということがある。）を大腸菌で発現・精製し、培養細胞に添加した後のｅＧＦＰの局在を蛍光顕微鏡で観察した。作製した各種ｅＧＦＰ融合タンパク質のＤＮＡコンストラクトの模式図を図２に示す。図２中、（ａ）は、ヒト由来膜作用性ペプチド候補のｅＧＦＰ融合タンパク質（Ｓｙｎｃｙｔｉｎ１の部分ペプチドについては、「Ｓｙｎｃｙｔｉｎ１３４５－４２２」のｅＧＦＰ融合タンパク質）のＤＮＡコンストラクトの模式図を示す。（ｂ）は、各Ｓｙｎｃｙｔｉｎ１ドメインの部分ペプチドのｅＧＦＰ融合タンパク質のＤＮＡコンストラクトの模式図を示す。「６ｘＨｉｓ」、「ＦＬＡＧ」は、ｅＧＦＰ融合タンパク質の精製時に使用するＴａｇをコードする塩基配列を示し、「ＴＣＳ」は、トロンビン認識配列を示す。「（Ｇ４Ｓ）３」は、ｅＧＦＰとＳｙｎｃｙｔｉｎ１（ＦＰ）との間に挿入したＧＧＧＧＳをコードする塩基配列を３回繰り返したフレキシブルリンカーを示す。なお、「ＩＺＵＭＯ１５７－１１３」をコードする塩基配列を配列番号２０に示し、「ＣＤ９１１３－１９４」をコードする塩基配列を配列番号２１に示し、「Ｓｙｎｃｙｔｉｎ１３４５－４２２」をコードする塩基配列を配列番号２２に示し、「Ｓｙｎｃｙｔｉｎ１（ＦＰ）」をコードする塩基配列を配列番号２３に示し、「Ｓｙｎｃｙｔｉｎ１（ＮＨＲ）」をコードする塩基配列を配列番号２４に示し、「Ｓｙｎｃｙｔｉｎ１（ＣＨＲ）」をコードする塩基配列を配列番号２５に示し、「Ｓｙｎｃｙｔｉｎ１（ＦＰ－ＮＨＲ）」をコードする塩基配列を配列番号２６に示し、「Ｓｙｎｃｙｔｉｎ１（ＮＨＲ－ＣＨＲ）」をコードする塩基配列を配列番号２７に示し、「Ｓｙｎｃｙｔｉｎ１（ＦＰ－ＮＨＲ－ＣＨＲ）」をコードする塩基配列を配列番号２８に示した。
　これらの各ＤＮＡがｐＥＴ２０ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）に組み込まれた各プラスミドを大腸菌ＢＬ２１－ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ（ＤＥ３）－ＲＩＰＬ（Ａｇｉｌｅｎｔ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）に導入し、２ｘＹＴ培地中で２０℃で３日間培養後、集菌した。集菌後の菌をＴＢＳ（トリス緩衝生理食塩水）（１ｍＭ　ＰＭＳＦ）５００μＬに懸濁して、Ｓｏｎｉｆｉｅｒ２５０（Ｂｒａｎｓｏｎ社製）を用いて超音波破砕を行い、可溶性画分を回収した。残ったペレットをＵｒｅａ－ＴＢＳ（６Ｍ　Ｕｒｅａ，ｉｎ　ＴＢＳ）（１ｍＭ　ＰＭＳＦ）５００μＬに懸濁後、４℃で１時間ボルテックスをすることで不溶性画分を回収した。ｅＧＦＰ、ｅＧＦＰ－ＣＤ９１１３－１９４融合タンパク質、ｅＧＦＰ－Ｓｙｎｃｙｔｉｎ１３４５－４２２融合タンパク質、ｅＧＦＰ－Ｓｙｎｃｙｔｉｎ１（ＦＰ）融合タンパク質、ｅＧＦＰ－Ｓｙｎｃｙｔｉｎ１（ＮＨＲ）融合タンパク質、ｅＧＦＰ－Ｓｙｎｃｙｔｉｎ１（ＣＨＲ）融合タンパク質、ｅＧＦＰ－Ｓｙｎｃｙｔｉｎ１（ＦＰ－ＮＨＲ）融合タンパク質、ｅＧＦＰ－Ｓｙｎｃｙｔｉｎ１（ＮＨＲ－ＣＨＲ）融合タンパク質、及びｅＧＦＰ－Ｓｙｎｃｙｔｉｎ１（ＦＰ－ＮＨＲ－ＣＨＲ）融合タンパク質については、更に、可溶性画分をＣＯＳＭＯＧＥＬ　Ｈｉｓ－Ａｃｃｅｐｔ（Ｎａｃａｌａｉ　Ｔｅｓｑｕｅ社製）を用いて精製した。ｅＧＦＰ－Ｂ５５及びｅＧＦＰ－ＣＤ９１１３－１９４については不溶性画分を精製後、Ｓｌｉｄｅ－Ａ－Ｌｙｚｅｒ　Ｄｉａｌｙｓｉｓ　Ｃａｓｓｅｔｔｅ　（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いた透析によりリフォールディングを行った。
　＜ｅＧＦＰ融合タンパク質の細胞膜に対する結合性の観察試験＞
　上記「ｅＧＦＰ融合タンパク質の調製」において、得られた各ｅＧＦＰ融合タンパク質をＨｅＬａ細胞に添加し、２４時間後に４％パラホルムアルデヒドで固定し、共焦点顕微鏡　ＦＶ－１０００（Ｏｌｙｍｐｕｓ社製）を用いてｅＧＦＰの局在の観察を行った。その結果、ｅＧＦＰ－Ｂ５５融合タンパク質とｅＧＦＰ－Ｓｙｎｃｙｔｉｎ１３４５－４２２融合タンパク質においては、細胞膜への強い結合が観察された。また、ｅＧＦＰ－ＣＤ９１１３－１９４融合タンパク質、ｅＧＦＰ－Ｓｙｎｃｙｔｉｎ１（ＦＰ）融合タンパク質、ｅＧＦＰ－Ｓｙｎｃｙｔｉｎ１（ＣＨＲ）融合タンパク質、及びｅＧＦＰ－Ｓｙｎｃｙｔｉｎ１（ＮＨＲ－ＣＨＲ）融合タンパク質では細胞膜への弱い結合が観察された。それ以外の融合タンパク質（ｅＧＦＰ－ＩＺＵＭＯ１５７－１１３融合タンパク質、ｅＧＦＰ－Ｓｙｎｃｙｔｉｎ１（ＮＨＲ）融合タンパク質、ｅＧＦＰ－Ｓｙｎｃｙｔｉｎ１（ＦＰ－ＮＨＲ）融合タンパク質、及びｅＧＦＰ－Ｓｙｎｃｙｔｉｎ１（ＦＰ－ＮＨＲ－ＣＨＲ）融合タンパク質）については、細胞膜への結合は全く見られなかった。
　＜ｅＧＦＰ－ＴＡＴ含有融合タンパク質の調製＞
　上記結合性の観察試験において、ｅＧＦＰ－Ｓｙｎｃｙｔｉｎ１３４５－４２２以外のヒト由来細胞膜透過性ペプチドの融合タンパク質については、細胞膜への強い結合が見られなかった。これを踏まえて、細胞膜と相互作用するカチオン性のＴＡＴペプチド（配列番号２９、ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ）をＣ末端に付加したｅＧＦＰ融合タンパク質（以下、本明細書において、ｅＧＦＰを含み、かつ、Ｃ末端にＴＡＴが付加された融合タンパク質を「ｅＧＦＰ－ＴＡＴ含有融合タンパク質」ということがある。）を調製し、ＴＡＴを介して非選択的に細胞に取り込まれたｅＧＦＰのエンドソーム離脱をヒト由来ペプチドが促進するかどうかの検証を行った。なお、細胞膜透過性ペプチドのポジティブコントロールとしてインフルエンザウイルス由来のＨＡ２ペプチド（配列番号３０、ＧＬＦＥＡＩＥＧＦＩＥＮＧＷＥＧＭＩＤＧＷＹＧ）を、調製した。作製したｅＧＦＰ－ＴＡＴ含有融合タンパク質のＤＮＡコンストラクトの模式図を図３に示す。図３中、（ａ）は、ｅＧＦＰ－ＴＡＴ融合タンパク質、及び、ＨＡ２、又は、ヒト由来細胞膜透過性ペプチド候補（Ｓｙｎｃｙｔｉｎ１以外）を含むｅＧＦＰ－ＴＡＴ含有融合タンパク質のＤＮＡコンストラクトの模式図を示す。（ｂ）は、各Ｓｙｎｃｙｔｉｎ１ドメインの部分ペプチドのｅＧＦＰ－ＴＡＴ含有融合タンパク質のＤＮＡコンストラクトの模式図を示す。図３中、「６ｘＨｉｓ」、「ＦＬＡＧ」は、ｅＧＦＰ融合タンパク質の精製時に使用するＴａｇをコードする塩基配列を示し、「ＴＣＳ」は、トロンビン認識配列を示す。「（Ｇ４Ｓ）３」は、ｅＧＦＰとＳｙｎｃｙｔｉｎ１（ＦＰ）との間に挿入したＧＧＧＧＳをコードする塩基配列を３回繰り返したフレキシブルリンカーを示す。これらのｅＧＦＰ－ＴＡＴ含有融合タンパク質は、上記「ｅＧＦＰ融合タンパク質の調製」と同じ条件で発現を行った。その後、ｅＧＦＰ－ＴＡＴ融合タンパク質、ｅＧＦＰ－ＨＡ２－ＴＡＴ融合タンパク質、ｅＧＦＰ－ＣＤ９１１３－１９４－ＴＡＴ融合タンパク質、ｅＧＦＰ－Ｓｙｎｃｙｔｉｎ１（ＮＨＲ）－ＴＡＴ融合タンパク質、及びｅＧＦＰ－Ｓｙｎｃｙｔｉｎ１（ＣＨＲ）－ＴＡＴ融合タンパク質については、可溶性画分を、上記「ｅＧＦＰ融合タンパク質の調製」における「ｅＧＦＰ」と同じ条件で精製した。また、ｅＧＦＰ－ＩＺＵＭＯ１５７－１１３－ＴＡＴ融合タンパク質及びｅＧＦＰ－Ｓｙｎｃｙｔｉｎ１（ＦＰ）－ＴＡＴ融合タンパク質については、不溶性画分を、上記「ｅＧＦＰ融合タンパク質の調製」における「ｅＧＦＰ－Ｂ５５」と同じ条件で精製した。なお、本明細書及び図面において、ｅＧＦＰ－ＴＡＴ融合タンパク質を対照例、ｅＧＦＰ－ＨＡ２－ＴＡＴ融合タンパク質を参考例、ｅＧＦＰ－ＩＺＵＭＯ１５７－１１３－ＴＡＴ融合タンパク質を実施例１、ｅＧＦＰ－ＣＤ９１１３－１９４－ＴＡＴ融合タンパク質を実施例２、ｅＧＦＰ－Ｓｙｎｃｙｔｉｎ１（ＦＰ）－ＴＡＴ融合タンパク質を実施例３、ｅＧＦＰ－Ｓｙｎｃｙｔｉｎ１（ＮＨＲ）－ＴＡＴ融合タンパク質を比較例１、ｅＧＦＰ－Ｓｙｎｃｙｔｉｎ１（ＣＨＲ）－ＴＡＴ融合タンパク質を比較例２ということがある。また、ｅＧＦＰ－ＴＡＴ融合タンパク質（対照例）のアミノ酸配列を配列番号３１に、ｅＧＦＰ－ＨＡ２－ＴＡＴ融合タンパク質（参考例）のアミノ酸配列を配列番号３２に、ｅＧＦＰ－ＩＺＵＭＯ１５７－１１３－ＴＡＴ融合タンパク質（実施例１）のアミノ酸配列を配列番号３３に、ｅＧＦＰ－ＣＤ９１１３－１９４－ＴＡＴ融合タンパク質（実施例２）のアミノ酸配列を配列番号３４に、ｅＧＦＰ－Ｓｙｎｃｙｔｉｎ１（ＦＰ）－ＴＡＴ融合タンパク質（実施例３）のアミノ酸配列を配列番号３５に、ｅＧＦＰ－Ｓｙｎｃｙｔｉｎ１（ＮＨＲ）－ＴＡＴ融合タンパク質（比較例１）のアミノ酸配列を配列番号３６に、ｅＧＦＰ－Ｓｙｎｃｙｔｉｎ１（ＣＨＲ）－ＴＡＴ融合タンパク質（比較例２）のアミノ酸配列を配列番号３７にそれぞれ示す。
　＜ｅＧＦＰ－ＴＡＴ含有融合タンパク質の細胞内への送達後の共焦点顕微鏡による観察及び蛍光強度の測定＞
　上記「ｅＧＦＰ－ＴＡＴ含有融合タンパク質の調製」において、得られた各ｅＧＦＰ－ＴＡＴ含有融合タンパク質をＨｅＬａ細胞へ添加し、１時間後に固定し、トリパンブルーを用いて細胞膜表面の蛍光を消光後、共焦点顕微鏡で観察した。この際、ｅＧＦＰ－ＴＡＴ融合タンパク質は終濃度が１０μＭとなるように、ｅＧＦＰ－ＨＡ２－ＴＡＴ融合タンパク質は終濃度が１０μＭとなるように、ｅＧＦＰ－ＩＺＵＭＯ１５７－１１３－ＴＡＴ融合タンパク質は終濃度が０．２μＭとなるように、ｅＧＦＰ－ＣＤ９１１３－１９４－ＴＡＴ融合タンパク質は終濃度が５μＭとなるように、ｅＧＦＰ－Ｓｙｎｃｙｔｉｎ１（ＦＰ）－ＴＡＴ融合タンパク質は終濃度が１０μＭとなるように、ｅＧＦＰ－Ｓｙｎｃｙｔｉｎ１（ＮＨＲ）－ＴＡＴ融合タンパク質は終濃度が１０μＭとなるように、ｅＧＦＰ－Ｓｙｎｃｙｔｉｎ１（ＣＨＲ）－ＴＡＴ融合タンパク質は終濃度が１０μＭとなるようにＨｅＬａ細胞へ添加した。
　核をＨｏｅｃｈｓｔで標識して、共焦点顕微鏡で観察した結果、ｅＧＦＰ－ＩＺＵＭＯ１５７－１１３－ＴＡＴ融合タンパク質（実施例１）、ｅＧＦＰ－ＣＤ９１１３－１９４－ＴＡＴ融合タンパク質（実施例２）、及びｅＧＦＰ－Ｓｙｎｃｙｔｉｎ１（ＦＰ）－ＴＡＴ融合タンパク質（実施例３）に関して、ポジティブコントロールであるｅＧＦＰ－ＨＡ２－ＴＡＴ融合タンパク質（参考例）と同様に、細胞質全体でｅＧＦＰの蛍光が見られた。他方、共焦点顕微鏡による画像を観察した結果、ｅＧＦＰ－Ｓｙｎｃｙｔｉｎ１（ＮＨＲ）－ＴＡＴ融合タンパク質（比較例１）、ｅＧＦＰ－Ｓｙｎｃｙｔｉｎ１（ＣＨＲ）－ＴＡＴ融合タンパク質（比較例２）については、ｅＧＦＰ－ＴＡＴ融合タンパク質（対照例）と同程度の蛍光しか観察されなかった。これにより、ＩＺＵＭＯ１５７－１１３、ＣＤ９１１３－１９４、Ｓｙｎｃｙｔｉｎ１（ＦＰ）の部分ペプチドが、エンドソーム離脱を促進していることが示唆された。また、ｅＧＦＰ－Ｓｙｎｃｙｔｉｎ１（ＦＰ－ＮＨＲ）－ＴＡＴ融合タンパク質及びｅＧＦＰ－Ｓｙｎｃｙｔｉｎ１（ＦＰ－ＮＨＲ－ＣＨＲ）－ＴＡＴ融合タンパク質に関しても、ｅＧＦＰ－Ｓｙｎｃｙｔｉｎ１（ＦＰ）と同様な局在を示したが、これはＳｙｎｃｙｔｉｎ１（ＦＰ）の細胞膜透過促進効果であると考えられる。なお、ｅＧＦＰ－Ｓｙｎｃｙｔｉｎ１（ＮＨＲ－ＣＨＲ）－ＴＡＴ融合タンパク質については、エンドソームへの取り込みは促進されているものの、ｅＧＦＰの局在が細胞質全体でないことからエンドソーム離脱は起きていないことが判断された。
　それぞれの融合タンパク質をＨｅＬａ細胞内に送達後に、１細胞ごとに関心領域（ＲＯＩ）を取り、ｅＧＦＰの蛍光強度を定量化した。その結果を、図４、５に示す。図４は、ｅＧＦＰ－ＴＡＴ融合タンパク質、ｅＧＦＰ－ＨＡ２－ＴＡＴ融合タンパク質、ｅＧＦＰ－ＩＺＵＭＯ１５７－１１３－ＴＡＴ融合タンパク質、ｅＧＦＰ－ＣＤ９１１３－１９４－ＴＡＴ融合タンパク質についての蛍光強度のグラフを示す。図５は、ｅＧＦＰ－ＴＡＴ融合タンパク質、ｅＧＦＰ－ＨＡ２－ＴＡＴ融合タンパク質、ｅＧＦＰ－Ｓｙｎｃｙｔｉｎ１（ＦＰ）－ＴＡＴ融合タンパク質についての蛍光強度のグラフを示す。なお、図４、図５の蛍光強度は、「ｅＧＦＰ－ＴＡＴ」についての蛍光強度に対する、それぞれの融合タンパク質についての相対蛍光強度である。その結果、ｅＧＦＰ－ＩＺＵＭＯ１５７－１１３－ＴＡＴ融合タンパク質、ｅＧＦＰ－ＣＤ９１１３－１９４－ＴＡＴ融合タンパク質及びｅＧＦＰ－Ｓｙｎｃｙｔｉｎ１（ＦＰ）－ＴＡＴ融合タンパク質は、ｅＧＦＰ－ＴＡＴ融合タンパク質と比べて有意に細胞内局在量が増加していた。更に、ｅＧＦＰ－ＩＺＵＭＯ１５７－１１３－ＴＡＴ融合タンパク質、ｅＧＦＰ－ＣＤ９１１３－１９４－ＴＡＴ融合タンパク質及びｅＧＦＰ－Ｓｙｎｃｙｔｉｎ１（ＦＰ）－ＴＡＴ融合タンパク質は、いずれも、ｅＧＦＰ－ＨＡ２－ＴＡＴ融合タンパク質と比べて細胞内局在量が増加していた。したがって、ＩＺＵＭＯ１５７－１１３、ＣＤ９１１３－１９４、Ｓｙｎｃｙｔｉｎ１（ＦＰ）の細胞膜透過性の効果はウイルス由来の細胞膜透過性ペプチドであるＨＡ２ペプチドよりも高いことが確認された。特に、ｅＧＦＰ－ＩＺＵＭＯ１５７－１１３－ＴＡＴ融合タンパク質は０．２μＭという低濃度でも１０μＭのｅＧＦＰ－ＨＡ２－ＴＡＴ融合タンパク質よりも細胞内の蛍光量が高いことから、ヒト由来の細胞膜透過促進ペプチドとしてＩＺＵＭＯ１５７－１１３を用いればより効率的なドラッグデリバリーシステムの実現が期待できることがわかった。
　＜エンドソーム離脱能検証＞
　上記「ｅＧＦＰ－ＴＡＴ含有融合タンパク質の細胞内への送達後の共焦点顕微鏡による観察及び蛍光強度の測定」により、ＩＺＵＭＯ１５７－１１３、ＣＤ９１１３－１９４及びＳｙｎｃｙｔｉｎ１（ＦＰ）について細胞膜透過促進ペプチドとしての機能が示唆された。これらのｅＧＦＰ－ＴＡＴ含有融合タンパク質が、エンドソームを離脱していることを確認するために、エンドソームをＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ　Ｒｅｄ　ＤＮＤ－９９（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）により染色し、各ｅＧＦＰ－ＴＡＴ含有融合タンパク質との共局在解析を行った。なお、トリパンブルーによる消光を行うと細胞全体が赤色の蛍光を発し、ＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒによるエンドソームの標識はできないため、ｈｅｐａｒｉｎ／ＰＢＳで洗浄することで細胞膜表面のｅＧＦＰ－ＴＡＴ含有融合タンパク質の除去を行った。具体的な操作を以下に説明する。
　まず、上記「ｅＧＦＰ－ＴＡＴ含有融合タンパク質の調製」の精製後のｅＧＦＰ－ＴＡＴ融合タンパク質、ｅＧＦＰ－ＨＡ２－ＴＡＴ融合タンパク質、ｅＧＦＰ－ＩＺＵＭＯ１５７－１１３－ＴＡＴ融合タンパク質、ｅＧＦＰ－ＣＤ９１１３－１９４－ＴＡＴ融合タンパク質及びｅＧＦＰ－Ｓｙｎｃｙｔｉｎ１（ＦＰ）－ＴＡＴ融合タンパク質をＨｅＬａ細胞へ添加し、１時間後にｈｅｐａｒｉｎ／ＰＢＳで洗浄し、固定後、共焦点顕微鏡で観察した。この際、ｅＧＦＰ－ＴＡＴ融合タンパク質は終濃度が１０μＭとなるように、ｅＧＦＰ－ＨＡ２－ＴＡＴ融合タンパク質は終濃度が１０μＭとなるように、ｅＧＦＰ－ＩＺＵＭＯ１５７－１１３－ＴＡＴ融合タンパク質は終濃度が１μＭとなるように、ｅＧＦＰ－ＣＤ９１１３－１９４－ＴＡＴ融合タンパク質は終濃度が５μＭとなるように、ｅＧＦＰ－Ｓｙｎｃｙｔｉｎ１（ＦＰ）－ＴＡＴ融合タンパク質は終濃度が５μＭとなるように、それぞれをＨｅＬａ細胞へ添加した。なお、核はＨｏｅｃｈｓｔにより標識し、エンドソームはＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒで標識した。その結果、ＧＦＰ－ＴＡＴ融合タンパク質ではｅＧＦＰの蛍光がＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒの蛍光とほぼ一致しているのに対し、他のタンパク質ではＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒの蛍光と一致していないｅＧＦＰ蛍光が多く観察された。
　また、それぞれの融合タンパク質のＨｅｌａ細胞内に送達後に、１細胞ごとに関心領域（ＲＯＩ）を取り、細胞内のｅＧＦＰの蛍光がＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒの蛍光と共局在している面積のｅＧＦＰの蛍光に対する面積比（すなわち、それぞれの融合タンパク質が局在している面積のうちエンドソームと共局在している面積の割合）と、ＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒの蛍光強度の定量を行った。その結果を図６に示す。図６に示すように、細胞内のｅＧＦＰの蛍光がＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒの蛍光と共局在している面積比及びＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒの蛍光強度を定量した結果、ｅＧＦＰ－ＴＡＴ含有融合タンパク質は、ｅＧＦＰ－ＴＡＴと比べ有意にエンドソームと共局在している割合が低いこと（図６の右軸（Ａｒｅａ））、すなわち、エンドソームから離脱していることが確認された。一方、細胞ごとのＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒの蛍光強度はいずれにおいても有意差は見られなかったことから（図６の左軸（ＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ））、エンドサイトーシスには影響を与えていないことがわかった。
　＜ＩＺＵＭＯ１についてのペプチド配列の最適化＞
　ヒト由来細胞膜透過促進ペプチドとして使用するペプチドは、操作性の観点ではより短い方が好ましいため、最も細胞膜透過効率が高かったＩＺＵＭＯ１５７－１１３について、更に短く断片化したペプチドＩＺＵＭＯ１５７－７５（配列番号３８）、ＩＺＵＭＯ１７６－９４（配列番号４）、ＩＺＵＭＯ１９５－１１３（配列番号６）及びＩＺＵＭＯ１８１－１１３（配列番号５）について各ｅＧＦＰ－ＴＡＴ含有融合タンパク質を上記「ｅＧＦＰ－ＴＡＴ含有融合タンパク質の調製」における「ｅＧＦＰ－ＩＺＵＭＯ１５７－１１３－ＴＡＴ融合タンパク質」と同様の方法で調製し、ＨｅＬａ細胞内に、それぞれの融合タンパク質を送達し、細胞内に取り込まれたｅＧＦＰの蛍光強度を定量した。より具体的には、ｅＧＦＰ－ＴＡＴ融合タンパク質は終濃度が１０μＭとなるように、ｅＧＦＰ－ＩＺＵＭＯ１５７－１１３－ＴＡＴ融合タンパク質は終濃度が１μＭとなるように、ｅＧＦＰ－ＩＺＵＭＯ１９５－１１３－ＴＡＴ融合タンパク質は終濃度が１μＭとなるように、ｅＧＦＰ－ＩＺＵＭＯ１５７－７５－ＴＡＴ融合タンパク質は終濃度が１μＭ、又は１０μＭとなるように、ｅＧＦＰ－ＩＺＵＭＯ１７６－９４－ＴＡＴ融合タンパク質は終濃度が１μＭ、又は１０μＭとなるように、ｅＧＦＰ－ＩＺＵＭＯ１８１－１１３－ＴＡＴ融合タンパク質は終濃度が１μＭ又は１０μＭとなるように、Ｈｅｌａ細胞に添加した。ＨｅＬａ細胞へ添加してから１時間後に固定し、細胞膜表面の蛍光をトリパンブルーにより消光した後、共焦点顕微鏡で観察を行った。それぞれの融合タンパク質のＨｅｌａ細胞内に送達後に、１細胞ごとに関心領域（ＲＯＩ）を取り、ｅＧＦＰの蛍光強度を定量化した。その結果を図７、８に示す。なお、本明細書及び図面において、ｅＧＦＰ－ＩＺＵＭＯ１８１－１１３－ＴＡＴ融合タンパク質を実施例４、ｅＧＦＰ－ＩＺＵＭＯ１７６－９４－ＴＡＴ融合タンパク質を実施例５、ｅＧＦＰ－ＩＺＵＭＯ１９５－１１３－ＴＡＴ融合タンパク質を実施例６、ｅＧＦＰ－ＩＺＵＭＯ１５７－７５－ＴＡＴ融合タンパク質を比較例３ということがある。また、ｅＧＦＰ－ＩＺＵＭＯ１８１－１１３－ＴＡＴ融合タンパク質（実施例４）を配列番号３９に、ｅＧＦＰ－ＩＺＵＭＯ１７６－９４－ＴＡＴ融合タンパク質（実施例５）を配列番号４０に、ｅＧＦＰ－ＩＺＵＭＯ１９５－１１３－ＴＡＴ融合タンパク質（実施例６）を配列番号４１に、ｅＧＦＰ－ＩＺＵＭＯ１５７－７５－ＴＡＴ融合タンパク質（比較例３）を配列番号４２に、それぞれ示す。
　図７、８に示すように、ｅＧＦＰ－ＩＺＵＭＯ１５７－７５－ＴＡＴ融合タンパク質（比較例３）は、ｅＧＦＰ－ＴＡＴ融合タンパク質（対照例）より低い蛍光強度を示したのに対し、ｅＧＦＰ－ＩＺＵＭＯ１８１－１１３－ＴＡＴ融合タンパク質（実施例４）、ｅＧＦＰ－ＩＺＵＭＯ１７６－９４－ＴＡＴ融合タンパク質（実施例５）、ｅＧＦＰ－ＩＺＵＭＯ１９５－１１３－ＴＡＴ融合タンパク質（実施例６）は、ｅＧＦＰ－ＴＡＴ融合タンパク質（対照例）より高い蛍光強度を示した。特に、ｅＧＦＰ－ＩＺＵＭＯ１８１－１１３－ＴＡＴ融合タンパク質（実施例４）は、ＩＺＵＭＯ１のペプチドを何も付加していないｅＧＦＰ－ＴＡＴ融合タンパク質（対照例）の約２０倍という最も高い値を示した。これらのことから、ＩＺＵＭＯ１は、７６－１１３の番号のアミノ酸残基（配列番号１）からなる部分ペプチドが、高いエンドソーム離脱性を有し、優れた細胞膜透過促進効果を奏するものであることが示された。
　＜ペプチド配列の二次構造予測＞
　３種類のヒトタンパク質由来の細胞膜透過促進ペプチドを含む領域ＩＺＵＭＯ１５７－１１３、ＣＤ９１１３－１９４、及びＳｙｎｃｙｔｉｎ１３２０－４４０について、二次構造予測サーバＪＰｒｅｄ４（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｏｍｐｂｉｏ．ｄｕｎｄｅｅ．ａｃ．ｕｋ／ｊｐｒｅｄ４／）を用いて、ヘリックスやβシート、コイル等の二次構造の予測を行った。その結果を、図９に示す。図９中、Ｈはそれぞれのペプチドにおいてヘリックスを構成する部分である。図９に示すように、ＩＺＵＭＯ１は２本のヘリックス、ＣＤ９とＳｙｎｃｙｔｉｎ１は３本のヘリックスに分かれたことが確認された。上記のＩＺＵＭＯ１のペプチド配列の断片化の実験では、ＩＺＵＭＯ１については後半のアミノ酸残基である８１－１１０残基のヘリックス部分と、Ｓｙｎｃｙｔｉｎ１については前半のアミノ酸残基である３２１－３３４残基（配列番号１０）のヘリックス部分を含む断片が高い細胞膜透過効率を示したことから、これらのヘリックス構造が細胞膜との相互作用に重要であることが示唆された。更に、ＩＺＵＭＯ１とＳｙｎｃｙｔｉｎ１と同様に、ＣＤ９についても１１５－１３３（配列番号７）、１３８－１５１（配列番号８）又は１８２－１９０残基（配列番号９）のヘリックスを含む断片が重要であることが示唆された。
　＜ｅＧＦＰ－ＴＡＴ含有融合タンパク質のエンドソーム離脱効率の定量＞
　上記「エンドソーム離脱能検証」のとおり、ｅＧＦＰ－ＴＡＴ含有融合タンパク質は、エンドソームから離脱していることが確認された。更に、ｅＧＦＰ－ＴＡＴ含有融合タンパク質のエンドソーム離脱効率を定量するために、下記試験を行った。
　まず、核局在シグナル配列（ＮＬＳ）をＣ末端に付加したｅＧＦＰ－ＴＡＴ含有融合タンパク質（以下、本明細書において、ｅＧＦＰを含み、かつ、Ｃ末端にＴＡＴ及びＮＬＳが付加された融合タンパク質を「ｅＧＦＰ－ＴＡＴ－ＮＬＳ含有融合タンパク質」ということがある。）を作製した。作製したｅＧＦＰ－ＴＡＴ－ＮＬＳ含有融合タンパク質のＤＮＡコンストラクトの模式図を図１０に示す。図１０中の「６ｘＨｉｓ」、「ＦＬＡＧ」、「ＴＣＳ」、「（Ｇ４Ｓ）３」の意味は、図２におけるものと同様である。図１０の「ＦＰ’」は、「Ｓｙｎｃｙｔｉｎ１３２０－３４０（ＦＰ）」（配列番号３）よりも２アミノ酸短くしたペプチドである「Ｓｙｎｃｙｔｉｎ１３２２－３４０（ＦＰ’）」（配列番号４４、表３）を示す。核在シグナル配列（ＮＬＳ）を配列番号４３（表３）に示す。上記のｅＧＦＰ－ＴＡＴ－ＮＬＳ含有融合タンパク質は、上記「ｅＧＦＰ融合タンパク質の調製」と同じ条件で発現を行った。
　その後、ｅＧＦＰ－ＮＬＳ融合タンパク質、ｅＧＦＰ－ＴＡＴ－ＮＬＳ融合タンパク質、ｅＧＦＰ－ＨＡ２－ＴＡＴ－ＮＬＳ融合タンパク質、及びｅＧＦＰ－Ｓｙｎｃｙｔｉｎ１３２２－３４０（ＦＰ’）－ＴＡＴ－ＮＬＳ融合タンパク質については、可溶性画分を、上記「ｅＧＦＰ融合タンパク質の調製」における「ｅＧＦＰ」と同じ条件で精製した。また、ｅＧＦＰ－ＩＺＵＭＯ１５７－１１３－ＴＡＴ－ＮＬＳ融合タンパク質及びｅＧＦＰ－Ｓｙｎｃｙｔｉｎ１３２０－３４０（ＦＰ）－ＴＡＴ－ＮＬＳ融合タンパク質については、不溶性画分を、上記「ｅＧＦＰ融合タンパク質の調製」における「ｅＧＦＰ－Ｂ５５」と同じ条件で精製した。
　得られたｅＧＦＰ－ＴＡＴ－ＮＬＳ含有融合タンパク質について、エンドソームを離脱して細胞質に局在できる融合タンパク質のみがインポーチンによって核に輸送されることを利用して、下記の方法にしたがい、各融合タンパク質の核移行した分子数に基づきエンドソーム離脱効率を見積もった。まず、精製した各融合タンパク質をＨｅＬａ細胞へ添加してから１時間後に、ＰＢＳを用いて３回洗浄後、スクレイパーを用いて細胞を剥離し遠心により回収した。この一部を採取し、細胞数を血球計算盤を用いてカウントした。回収した細胞を、ＮＥ－ＰＥＲ　ｎｕｃｌｅａｒ　ａｎｄ　ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｒｅｇｅｎｔｓ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）　を用いて可溶化し、核画分と非核画分に分画した。エンドソーム内部に残ったままの融合タンパク質は非核画分に含まれるので、核画分に含まれる融合タンパク質はエンドソームを離脱したタンパク質であると考えられる。そこで、核画分に含まれる融合タンパク質を、抗ＦＬＡＧ抗体を用いたウエスタンブロッティングにより定量し、細胞数で割ることで、１細胞あたり核画分に含まれるタンパク質の平均分子数を算出した。その結果を表２に示す。なお、本明細書及び図面において、ｅＧＦＰ－ＩＺＵＭＯ１５７－１１３－ＴＡＴ－ＮＬＳ融合タンパク質を実施例７、ｅＧＦＰ－Ｓｙｎｃｙｔｉｎ１３２０－３４０（ＦＰ）－ＴＡＴ－ＮＬＳ融合タンパク質を実施例８、ｅＧＦＰ－Ｓｙｎｃｙｔｉｎ１３２２－３４０（ＦＰ’）－ＴＡＴ－ＮＬＳ融合タンパク質を実施例９ということがある。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　表２から理解されるとおり、本発明の部分ペプチド（ＩＺＵＭＯ１５７－１１３、ＦＰ、ＦＰ’）を含む融合タンパク質はいずれも１細胞あたり核画分に含まれる分子数が高く、エンドソーム離脱効率が高かった。特に、ＦＰ’を含む融合タンパク質が顕著に高い分子数を示し、従来の細胞膜透過性ペプチドであるＨＡ２を含む「ｅＧＦＰ－ＨＡ２－ＴＡＴ－ＮＬＳ」に対して約２０倍の分子を細胞質に送達でき、「ｅＧＦＰ－ＴＡＴ－ＮＬＳ」に対して約１００倍の分子を細胞質に送達できることがわかった。
　＜様々なヒト培養細胞内へのｅＧＦＰ－Ｓｙｎｃｙｔｉｎ１３２２－３４０－ＴＡＴの送達＞
　ｅＧＦＰ－ＴＡＴ含有融合タンパク質がＨｅＬａ細胞以外のヒト培養細胞にも取り込まれることを確認した。まず、ｅＧＦＰ－ＴＡＴ含有融合タンパク質として、ｅＧＦＰ－Ｓｙｎｃｙｔｉｎ１３２２－３４０－ＴＡＴ（配列番号４５、表３）を、上記「ｅＧＦＰ－ＴＡＴ含有融合タンパク質の調製」における「ｅＧＦＰ－ＩＺＵＭＯ１５７－１１３－ＴＡＴ融合タンパク質」と同様の方法で調製した。得られた融合タンパク質を、終濃度が５μＭとなるように、ＨｅＬａ（ヒト子宮頸癌細胞）、ＨＡ４３１（ヒト上皮様細胞癌細胞）、ＨｅｐＧ２（ヒト肝癌細胞）、及び、ＳＫ－Ｎ－ＳＨ（ヒト神経芽腫細胞）に添加した。添加の１時間後に細胞を固定してから、細胞膜表面の蛍光をトリパンブルーにより消光した後、共焦点顕微鏡で観察を行った。それぞれの細胞内に送達後に、１細胞ごとに関心領域（ＲＯＩ）を取り、ｅＧＦＰの蛍光強度を定量化した。その結果を図１１に示す。なお、本明細書及び図面において、ｅＧＦＰ－Ｓｙｎｃｙｔｉｎ１３２２－３４０－ＴＡＴ融合タンパク質を実施例１０ということがある。
　図１１に示すように、いずれの細胞においても、ｅＧＦＰ－Ｓｙｎｃｙｔｉｎ１３２２－３４０－ＴＡＴ融合タンパク質（実施例１０）は、ｅＧＦＰ－ＴＡＴ融合タンパク質（対照例）より高い蛍光強度を示した。このことから、Ｓｙｎｃｙｔｉｎ１３２２－３４０（配列番号４４）は、様々な種類のヒト細胞に対して、高いエンドソーム離脱性を有し、優れた細胞膜透過促進効果を奏することが示された。
　＜ｅＧＦＰ以外のタンパク質の細胞内送達＞
　Ｓｙｎｃｙｔｉｎ１３２２－３４０（配列番号４４）がｅＧＦＰ以外のタンパク質のエンドソーム離脱を促進できるかどうか検証した。具体的には、ｅＧＦＰの代わりに、ＳＮＡＰタグ（分子量１９．４ｋＤａ）［Ｎａｔ．　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．　２１（２００３）８６－８９］又はβ－ガラクトシダーゼ（分子量１１６ｋＤａ）を使用し、ＴＡＴ融合タンパク質を上記「ｅＧＦＰ－ＴＡＴ含有融合タンパク質の調製」における「ｅＧＦＰ－ＩＺＵＭＯ１５７－１１３－ＴＡＴ融合タンパク質」と同様の方法で調製した。得られた各融合タンパク質を、終濃度が５μＭとなるように、ＨｅＬａ細胞に添加し、細胞内に取り込まれたＳＮＡＰタグ及びβ－ガラクトシダーゼ（β－Ｇａｌ）を下記の方法にしたがい、定量した。
　まず、ｅＧＦＰの代わりに、ＳＮＡＰタグを使用した融合タンパク質（ＳＮＡＰ－Ｓｙｎｃｙｔｉｎ１３２２－３４０－ＴＡＴ融合タンパク質、配列番号４６、表３）については、あらかじめ蛍光標識したベンジルグアニン（ＢＧ－ＤＹ５０５）と共有結合させ、ＨｅＬａ細胞内に送達後に、１細胞ごとに関心領域（ＲＯＩ）を取り、蛍光強度を定量化した。ｅＧＦＰの代わりに、β－ガラクトシダーゼを使用した融合タンパク質（β－Ｇａｌ－Ｓｙｎｃｙｔｉｎ１３２２－３４０－ＴＡＴ融合タンパク質、配列番号４７、表３）については、ＨｅＬａ細胞に添加後に、酵素活性によって分解されると蛍光を発する基質（Ｃ１２－ＦＤＧ）を添加し、その蛍光強度を定量化した。その結果を図１２に示す。なお、本明細書及び図面において、ＳＮＡＰ－Ｓｙｎｃｙｔｉｎ１３２２－３４０－ＴＡＴ融合タンパク質を実施例１１、β－Ｇａｌ－Ｓｙｎｃｙｔｉｎ１３２２－３４０－ＴＡＴ融合タンパク質を実施例１２ということがある。
　図１２に示すように、ＳＮＡＰ－Ｓｙｎｃｙｔｉｎ１３２２－３４０－ＴＡＴ融合タンパク質（実施例１１）及びβ－Ｇａｌ－Ｓｙｎｃｙｔｉｎ１３２２－３４０－ＴＡＴ融合タンパク質（実施例１２）は、それぞれＳｙｎｃｙｔｉｎ１３２２－３４０ペプチドを付加していない対照例であるＳＮＡＰ－ＴＡＴ融合タンパク質（配列番号４８、表４）及びβ－Ｇａｌ－ＴＡＴ融合タンパク質（配列番号４９、表４）よりも高い蛍光強度を示した。これらのことから、Ｓｙｎｃｙｔｉｎ１３２２－３４０は、ｅＧＦＰ以外のタンパク質についても高いエンドソーム離脱性を有し、優れた細胞膜透過促進効果を奏するものであることが示された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004

Claims (8)

  1. 　以下の（ａ）から（ｄ）のいずれかに記載のＤＮＡがコードするアミノ酸配列のうち少なくとも７個の連続するアミノ酸残基からなる部分ペプチドと、
    　該部分ペプチドと直接的又は間接的に結合され、かつ、細胞表面に対する結合能を有するリガンドと、
    を有する、融合タンパク質又は複合タンパク質。
    　（ａ）配列番号１、２、又は３に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡ
    　（ｂ）配列番号１、２、又は３に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる塩基配列を有するＤＮＡ
    　（ｃ）配列番号１、２、又は３に記載のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡ
    　（ｄ）配列番号１、２、又は３に記載のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＤＮＡ
  2. 　前記リガンドが、抗体である、請求項１に記載の融合タンパク質又は複合タンパク質。
  3. 　請求項１又は２に記載の融合タンパク質。
  4. 　請求項１又は２に記載の融合タンパク質又は複合タンパク質からなる、細胞内送達用担体。
  5. 　以下の（ａ）から（ｄ）のいずれかに記載のＤＮＡがコードするアミノ酸配列のうち少なくとも７個の連続するアミノ酸残基からなる部分ペプチド。
    　（ａ）配列番号１、２、又は３に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡ
    　（ｂ）配列番号１、２、又は３に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる塩基配列を有するＤＮＡ
    　（ｃ）配列番号１、２、又は３に記載のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡ
    　（ｄ）配列番号１、２、又は３に記載のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＤＮＡ
  6. 　請求項５に記載の部分ペプチドからなる細胞膜透過促進剤。
  7. 　請求項１又は２に記載の融合タンパク質又は請求項５に記載の部分ペプチドをコードするＤＮＡ。
  8. 　請求項７に記載のＤＮＡが組み込まれたベクター。
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