WO2017014513A1 - Nt세포의 보관방법 및 뱅킹 시스템 - Google Patents

Nt세포의 보관방법 및 뱅킹 시스템 Download PDF

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WO2017014513A1
WO2017014513A1 PCT/KR2016/007795 KR2016007795W WO2017014513A1 WO 2017014513 A1 WO2017014513 A1 WO 2017014513A1 KR 2016007795 W KR2016007795 W KR 2016007795W WO 2017014513 A1 WO2017014513 A1 WO 2017014513A1
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cell
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oocytes
hla
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차광렬
이동율
정영기
송지환
엄진희
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Cha Biotech Co Ltd
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Cha Biotech Co Ltd
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation

Definitions

  • the present invention is a cell prepared by using somatic cell nuclear transfer (NT) technology of somatic cells having a homozygous genotype in genes such as HLA (human leukocyte antigen) -A, HLA-B and HLA-DR It relates to the storage method and banking system.
  • NT somatic cell nuclear transfer
  • Cell therapy is a field that is emerging as a new paradigm of the pharmaceutical industry by enabling 'fundamental treatment' through cells, especially stem cells, which were considered to be limitedly treated through drugs or surgical procedures.
  • regenerative medicine is a new technology field that fights diseases by restoring or replacing tissues and organs damaged or degraded by aging, disease, accident, etc. It is a field that is emerging as a.
  • HLA-A HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DP, HLA-DQ, HLA-DR
  • MHC Major Histocompatibility Antigen Complex
  • HLA surface antigens The role of HLA surface antigens is to display fragments of the proteins present in the cell on the surface of the cell so that infections or mutations that may have occurred in vivo are detected by the immune cells, which is why antigen-providing proteins ( Also known as antigen presenting protein.
  • the Somatic Cell Nuclear Transfer (SCNT) technology refers to a technique of removing a nucleus of a somatic cell and transplanting the nucleus of an egg to replicate.
  • somatic cells By using somatic cells to separate the nucleus of the somatic cells and injecting the isolated nucleus into the nucleus from which the nucleus is removed to prepare a stem cell line that maintains the genetic characteristics of the somatic cells.
  • This method has the advantage of eliminating the immune rejection reaction in that it uses the patient's own somatic cells, and enables the patient-specific treatment.
  • NT's technology is advancing, the rate of formation from reconstructed oocytes to blastocysts is still very low. Therefore, various attempts have been made and demanded to increase this formation rate.
  • the largest disorder of NT embryos is zygotic gene activation (ZGA), which occurs in 4- to 8-cell phases in large mammals, including humans.
  • ZGA zygotic gene activation
  • the present inventors have led to the present invention by developing a cell therapeutic agent or a cell for transplantation that does not cause immunorejection from homozygous cells.
  • an object of the present invention is to provide a method for storing NT cell-derived stem cells applicable to various diseases of the same kind or different kinds.
  • the present invention comprises the steps of: a) screening for homozygous (Homozygous) from a plurality of donation tissue (donation);
  • d) provides a method for storing stem cells derived from an immunocompatible NT cell comprising cryopreserving a plurality of stem cells.
  • the present invention comprises the steps of a) screening homozygous (Homozygous) from a plurality of donation tissue (donation) tissue;
  • the present invention comprises the steps of a) screening homozygous (Homozygous) from a plurality of donation tissue (donation) tissue;
  • It provides a method for producing a cell differentiated from the stem cells, which are derived from an immunocompatible NT comprising: d) preparing the differentiated cells for cell transplantation from the prepared stem cells.
  • the present invention also includes a) means for collecting a plurality of donor tissues, b) means for screening collected tissues, c) means for preparing stem cells from tissues, and d) means for cryopreserving stem cells, It provides a banking system of immunocompatible NT-derived stem cells.
  • Implantable cell and tissue materials can be provided for the treatment of various diseases such as diabetes, osteoarthritis and Parkinson's disease, and in particular offer the possibility of fundamental treatment of cell type specific defects.
  • the homozygous cells can provide a therapeutic approach that can reduce the risk of immune rejection and immune tolerance.
  • 1 is a diagram showing that when the number of cells less than 700 million according to the law on cord blood management and research is classified for disposal.
  • Figure 2 shows the chromosome test results of the donor cells of Example 1.
  • Figure 3 shows the chromosome test results of NT cells prepared in Example 3.
  • Figure 4 shows (a) genomic DNA test results and (b) mitochondrial DNA test results of NT cells prepared in Example 3 compared with donor somatic cells and donor oocytes.
  • Figure 5 shows the results of immunochemistry analysis of stem cell markers of NT cells prepared in Example 3.
  • Figure 6 shows the results of RT-PCR analysis of stem cell markers of NT cells prepared in Example 3.
  • Figure 8 shows that there is no difference as a result of comparing the markers of (a) morphology of embryonic stem cell-derived RPE cells and NT-derived RPE cells prepared in Example 3 and (b) RPE cells.
  • immunocompatibility homozygous means that each of the HLA-A, HLA-B, and HLA-DR genes inherited from the donor's paternal and maternal genomes is completely identical and has three HLA genotypes instead of six. Means that.
  • tissue cell refers to any tissue cell in the body except sex cells or precursors thereof.
  • stem cells are capable of self-renewal (having the ability to pass multiple cell division cycles while maintaining an undifferentiated state) and exhibit at least one multidifferentiation capacity (the ability to differentiate into one or more specialized cells). It means a cell that can.
  • long term culture means proliferation of cells under controlled conditions for at least two months or longer than at least 10 passages.
  • the long term culture is cultured for at least 4 months, at least 6 months or at least 1 year.
  • the long term culture is passaged for at least 15 passages, at least 18 passages or at least 20 passages.
  • the duration of long term culture depends mainly on individual cells and can vary from cell line to cell line.
  • mature refers to a process consisting of coordinated biochemical steps leading towards finally differentiated cell types.
  • differentiation refers to the adaptation of the cell to a particular form or function.
  • differentiated cell includes any somatic cell that is not pluripotent in its original form, as the term is defined herein.
  • differentiated cells also refers to partially differentiated cells, such as multipotent cells, or cells that are stable, non-potentially partially reprogrammed or partially differentiated cells produced using any of the compositions and methods described herein. It includes.
  • the differentiated cells are cells that are stable intermediate cells, such as non-pluripotent, partially reprogrammed cells. It should be noted that placing a large number of primary cells in the culture may result in some loss of fully differentiated properties.
  • telomeres are also extended passaged without loss of growth potential as compared to parent cells with lower likelihood of having generally only a limited number of divisions in culture. Has the ability to suffer.
  • the term “differentiated cells” also refers to cells of less specialized cell types (ie, increased likelihood) (eg, from undifferentiated cells or reprogrammed cells), where the cells are an intracellular differentiation process. Refers to cells of more specialized cell types (ie, reduced likelihood of occurrence) derived from).
  • hematopoietic stem cells muscle cells, cardiomyocytes, liver cells, chondrocytes, epithelial cells, urinary organ cells, adipocytes, kidney cells, vascular cells, retinal cells, mesenchymal stem cells (MSC) and neuronal cells It is selected from the group consisting of but not limited to.
  • the "immunocompetent cell” refers to a cell in which the HLA-A, HLA-B and HLA-DR genes are homozygous-like, without being particularly limited thereto, and all HLA genotypes in which only three of the six pairs are identical. It may have the advantage of being transplantable to the beneficiaries of the combination.
  • bank means a storage location of stem cells, and may be used as it is or may be differentiated from the stored cells to the individual or another individual for therapeutic, clinical or research purposes as needed.
  • administration means introducing a certain substance into a patient in any suitable way and the route of administration of the substance can be administered via any general route as long as it can reach the target tissue.
  • administration can be performed by any device capable of moving to a target cell.
  • the present invention comprises the steps of: a) screening for homozygous (Homozygous) from a plurality of donation tissue (donation); b) isolating nuclei from Homozygous cells to produce NT cells; c) generating stem cells from the prepared NT cells; And d) cryopreserving a plurality of stem cells; provides a method for storage of stem cells derived from immunocompatible NT cells.
  • Cells made via NT may carry the genetic material of the patient's nucleus and are in this respect individual patient specific. Thus, cell transplantation into patients with a significantly reduced risk for autologous transplantation, i.e. allogeneic rejection, is possible.
  • the homozygous cells of the present invention are cells that match the HLA antigen type, and can be transplanted to a heterogeneous person without anti-HLA antibodies. That is, the NT-derived stem cells have a homozygous type and can be transplanted into immunocompatible cells.
  • the screening in step a) is preferably selected that the genes of human leukocyte antigen (HLA) -A, HLA-B and HLA-DR is homozygous (homozygous).
  • HLA genotyping screens find 140 donors with different immunocompatible homozygotes, it has been announced that it is possible to secure immune-compatible cell lines that can be transplanted to over 90% of Japan's population. (A more efficient method to generate integration-free human iPS cells, Nature Methods 8, 409-412 (2011))
  • homozygous (homozygous) cells were screened based on data from a primary hospital donor umbilical cord blood bank. According to the current umbilical cord blood management and research law, if the number of cells is less than 700 million cells, the Ministry of Health and Welfare Umbilical Cord Blood Committee is authorized to discard them so that they can be used for research (see FIG. 1).
  • the cells to be used in this study can be used primarily for cryopreservation blood (with less than 700 million cells), and in addition to all donor blood for research, registered with the Center for Organ Transplantation Management (KONOS). It may include. In addition, samples obtained by the hematopoietic stem cell donor network and medical institutions affiliated with the Cha Hospital can be used.
  • KONOS Center for Organ Transplantation Management
  • the NT cell production method in step b) is the step of denuclearizing oocytes; Fusing the nucleus of the somatic cell to denucleated oocytes; And culturing the fused oocytes in post activation medium.
  • the method for producing stem cells derived from NT comprises the steps of removing the nuclei of oocytes, adding one or more nuclei of one or more donor cells to generate nuclear transplanted (NT) oocytes, and incubating the NT eggs by incubation in an activation medium. Activating blast cells, and generating blastocysts from the activated NT oocytes.
  • removing the nucleus of the oocyte includes removing the mid-phase II (MII) stage egg spindle.
  • the first pole body 1PBE is removed.
  • the method includes the step of stripping the cumulus cells before completion of maturation.
  • oocytes are observed by non-UV light based observation on 1PBE in real time.
  • the observation takes place in the absence of a staining or labeling agent such as Hoechst staining. In one embodiment, this involves the use of a polscope, eg, Research Instruments (CRi) Oosight TM image system.
  • a polscope eg, Research Instruments (CRi) Oosight TM image system.
  • removing the nuclei of oocytes comprises the use of contoured micropipettes that allow the removal of 1 PBE from the oocytes and the pores of the oocyte membranes.
  • removing the nuclei of oocytes comprises the use of a piezoelectric drill.
  • the step of removing nuclei of oocytes is carried out in a denucleation medium containing cytocalin B and optionally, a protein phosphatase inhibitor such as caffeine.
  • Caffeine is a protein phosphatase inhibitor that inhibits premature activation and improves the growth of cloned embryos, thereby increasing the rate of blastocyst formation. Therefore, preferably, the denucleation of the oocytes is made in a medium containing a protein phosphatase inhibitor, and the protein phosphatase inhibitor may be caffeine.
  • generating the nuclearly transplanted (NT) oocytes by adding one or more nuclei of one or more donor cells may comprise implanting the donor nuclei.
  • Implanting the donor nucleus involves the use of agents that modify the oocyte membrane structure.
  • removing the nucleus of the oocyte through the use of an agent to modify the oocyte membrane structure comprises fusion with somatic cells.
  • implanting a donor nucleus may comprise providing 3 to 4 donor cells with an injection pipette (eg, 12 ⁇ m diameter), paramyxovirus or paramyxovirus proteins such as Sendai virus, Releasing the donor cells in a predetermined amount of a solution containing the envelope protein or extract thereof.
  • the recovery of the pipette does not interfere with the contact between the yolk sac and the donor cell.
  • the cells are fused after 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 or more minutes of donor cell insertion. In various embodiments, the cells are fused 10 minutes after donor cell insertion. Optionally, the process is repeated for cells that have not been successfully fused.
  • polyscopes such as the Oosight TM image system, are used throughout the process.
  • the method of implanting a donor nucleus may be performed by a direct injection method.
  • the step of implanting a donor nucleus may comprise electrical cell manipulation, eg, electrofusion.
  • the method may comprise separating the nucleus of the somatic cell nuclear donor, the stem cell nuclear donor, and the sperm cell nuclear donor.
  • the method comprises inserting one or more donor nuclei via a pipette or piezoelectric injection after the step of separating the somatic nuclei for NT.
  • the donor nucleus is derived from a cell, such as dermal fibroblasts, white blood cells, hair follicles, or other somatic cell nuclear donors.
  • the present invention discloses a method comprising isolation and preparation of a nucleus from sperm cell donation.
  • the separation of the nucleus may be tissue biopsy, transfusion, or other method for obtaining a tissue sample, mechanical separation, collagenase digestion, washing, centrifugation based density gradient separation, and / or standard culture medium. Processing of tissues through culture.
  • the step of fusing the nucleus of the somatic cells is made in a medium containing Sendai virus or Sendai virus extract.
  • the fused oocytes After fusing the nucleus of the somatic cell to the denucleated oocytes, the fused oocytes are transferred to a post activation medium and undergo an activation process.
  • NT-hPSC cell lines C) generating stem cells from the prepared NT cells, specifically, activating NT oocytes by incubating nuclear transplanted (NT) oocytes in an activation medium, and generating blastocysts from the activated NT oocytes. And isolating endothelial cell (ICM) cells from the blastocyst, wherein the ICM cells can be further cultured as NT-hPSC cell lines.
  • ICM endothelial cell
  • MFP Metaphase Promoting Factor
  • MII I block of cells is hampered by a cell change in calcium ions (Ca 2 +) level due to the entry of sperm. Thereafter, targeted degradation of cyclin B (MPF regulatory subunit) occurs, which releases oocytes from cell cycle blocking, pronuclear formation, and meiosis and mitosis processes.
  • Oocyte activation relies on an artificial calcium-change strategy to release cultured oocytes from cell cycle blockade. Examples include the addition of calcium ion carriers, fat soluble molecules that transfer ions through the lipid bilayer, such as ionomycin and A23817. Alternative strategies rely on electrical activity or direct implantation of ions.
  • oocyte activation using calcium alteration techniques also occurs.
  • kinase inhibitors such as 6-dimethylaminopurine (6-DMAP)
  • protein synthesis inhibitors such as ethanol and cycloheximide (CHX)
  • TSA Histone deacetylase inhibitors
  • Treatment of TSA can promote the formation of blastocysts.
  • an electrical pulse may be applied during fusion and activation of somatic cells. Electrical activation includes electrical pulses in electrical cell fusion media.
  • the electrical cell fusion the medium is from 0.1 to 0.5 M mannitol, 0.01 to 1 mM MgSO 4 .7H 2 O, 0.01 to 1 mg / ml of polyvinyl alcohol, 1 to 10 mg / ml human serum albumin, 0.005? 0.5 mM CaCl 2 .2H 2 O.
  • nuclear transplanted oocytes are treated in a post-activation medium for complete activation.
  • the activated reconstructed nuclear transplanted oocytes are then incubated in post-activation medium.
  • the post-activation medium is HEPES-removing medium, protein-removing medium, G1 or G2 medium, eggplant medium, eggplant aid medium, IVF medium, blastocyst forming medium, or global human embryo culture medium.
  • the post-activation medium is 6-DMAP, puromycin, ethanol, cycloheximide (CHX), trichostatin A (TSA), and cytochalasin B It may include any one or more selected from (CB).
  • the activated oocytes are 30 to 45, 45 to 60, 60 to 90, 90 to 120, 120 to 150, 150 to 180, 180 to 210, 210 to 240, 240 to 240 in post-activation medium. Incubate for less than 270, 300 to 330, 330 to 360, 360 to 390 minutes, or more than 390 minutes. In certain embodiments, the activated oocytes are incubated for 240, 300, or 360 minutes. In various embodiments, the activation and post-activation steps are performed under hypoxic conditions. In certain embodiments, hypoxic conditions are about 80-85%, 85-90%.
  • low oxygen conditions include about 90% N 2 , about 5% O 2 , and about 5% CO 2 .
  • the post-activation medium is 1, 2, 3, 4, 5, 5, or in a gas mixture, such as about 90% N 2 , about 5% O 2 , and about 5% CO 2 . 1, 2, 3, 4, 5, 5, or more mM 6-DMAP in eggplant media, incubated at 37 ° C. for longer time.
  • post-activated oocytes are incubated in wash medium.
  • the wash medium is HEPES-removing medium, protein-removing medium, G1 or G2 medium, eggplant medium, eggplant aid medium, IVF medium, blastocyst forming medium.
  • the culture medium does not require continuous medium exchange as global human embryo culture medium.
  • the wash medium comprises TSA.
  • post-activated oocytes are incubated for 240, 300, or 360 minutes in wash media comprising TSA.
  • the post-activated reconstructed nuclear transplanted oocytes are washed and further cultured.
  • the post-activated reconstituted nuclear transplanted oocytes are washed in 6-DMAP removal medium.
  • various disclosed media such as HEPES-removing media, protein-removing media, G1 or G2 media, eggplant media, eggplant aid media, IVF media, blastocyst forming media, or global human embryo culture media,
  • growth factors such as GM-CSF or IGF1.
  • the growth factor may be added at 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, or later days after nuclear transfer.
  • the activating and / or post-activating step comprises adding a factor, derivatives and extracts isolated from sperm.
  • the human sperm factor is injected into the reconstructed ovum activated using any of the described infusion methods.
  • the human sperm factor is injected into the post-activated reconstructed egg using any of the described infusion methods.
  • post-activated reconstituted nuclear transplanted oocytes are transferred to eggplant medium.
  • the post-activated reconstructed nuclear transplanted oocytes are transferred to eggplant medium.
  • the sperm factor includes a factor that is isolated from, for example, a cellular protein present inside or outside the sperm cell.
  • the total sperm extract is obtained using mechanical mixing of the surfactant and ejaculated sperm.
  • the whole cell extract is treated with DNAase I and RNAase.
  • the crude extract is washed with buffer and centrifuged (20,000 g for 2 hours).
  • fresh ejaculated human sperm is imported and centrifuged at 900 g for 10 minutes to remove semen plasma, followed by Sperm-TALP containing 5 mg / mL bovine serum albumin.
  • the post-activated reconstructed nuclear transplanted oocytes are further cultured into blastocysts.
  • the post-activated reconstituted nuclear transplanted oocytes are further cultured in SAGE eggplant medium, eg, Quinn's medium.
  • medium for example 3i medium (Neuro basal medium 50%, DMEM / F-12 50%, N2 additive 1/200 v / v, B27 additive 1/100 v / v, 100 mM L-glutamine 1/100 v / v, 0.1M ⁇ -ME 1/1000 v / v, SU5402 (FGFR inhibitor) 2 ⁇ M, PD184352 (ERK cascade inhibitor) 0.8 ⁇ M, CHIR99021 (GSK3 inhibitor) 3 ⁇ M) or modified 3i medium (including 0.4 ⁇ M PD0325901 (MAPK inhibitor)) promotes pluripotency.
  • the additional culture is for at least 1, 2, 3, 4, 5, or 5 days.
  • additional cultures are provided in a culture medium having a reprogramming factor and / or methylation-modifying agent.
  • the additional culture is for 3 days in G2 medium to which any of CARM1 CARM1, Esrrb, Kdm4a, Kdm4b and Kdm4d Esrrb is added.
  • CARM1 and / or Esrrb may be provided at concentrations in medium of 0.5, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5 or more ⁇ g / ml, respectively.
  • CARM1 and / or Esrrb are each provided at a concentration in medium of 2 ⁇ g / ml.
  • further incubation into blastocysts and induction of pluripotent stem cells (pSCs) from blastocysts comprises treating the cultured blastocysts with acidic Tyrode's solution to remove the zona pellucida (ZP). Include. In various embodiments, the treatment is for a few seconds (eg, 1 to 5). In various embodiments the removal of ZP is followed by a wash in HEPES-HTF medium. In various embodiments, isolation of the internal cell mass (ICM) comprises discarding the trophoblast of the blastocyst. In various embodiments, ICM cells are plated in a mouse embryonic feeder (MEF) prepared one day prior to plating.
  • MEF mouse embryonic feeder
  • the whole blastocyst is plated on MEFs.
  • the method includes stripping the zona pellucida of the blastocyst.
  • the method removes the zona pellucida of the blastocyst with 0.05, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, or 1% pronase in Hepes-HTF medium. Steps.
  • the method comprises removing the zona pellucida of the blastocyst with 0.5% pronase in Hepes-HTF medium.
  • the method comprises pronase in TH3 medium (SAGE blastocyst medium) for 1-10, 10-20, 20-30, 30-60, 60-120, 120-180, or> 180 seconds. It includes the step of applying. In yet another embodiment, applying 0.5% pronase in HTF medium for 30-60 seconds.
  • the blastocyst is derived from reconstructed nuclear transplanted oocytes obtained from somatic cell nuclear transfer (NT) of donor cell nuclei into recipient oocytes.
  • the stem cell line is a somatic cell nuclear transfer human pluripotent stem cell (NT-hPSC) cell line.
  • the invention includes a method for immunosurgery comprising mechanical dispersion of an internal cell mass (ICM) from trophectodermal cells.
  • ICM internal cell mass
  • the exfoliated blastocysts are treated with rabbit anti-human spleen serum at 37 ° C. for about 10, 20, 25, 30, 35, 40, 45, or 60 minutes.
  • the method comprises washing the exfoliated blastocyst with TH3 (SAGE blastocyst medium) and incubating in guinea pig complement reconstituted with HECM-9 (SAGE blastocyst medium) at 37 ° C. for 30 minutes. do.
  • the zona pellucida of the expanded blastocyst is removed with slight exposure (45-60 seconds) to 0.5% pronase or acidic tirod solution in TH3 (hepes-HTF) medium.
  • the method is laser assisted incubation using small bore pipetting, Ehsms zilos-tk unit (Hamilton Thorne) to selectively separate endocytosis from trophectoderm cells. mechanically spreading the cells using a hatching method.
  • the post activation medium is made from a medium containing TSA, and the post activation medium is 6-DMAP. More preferably, the cells are cultured in a medium containing 6-DMAP at the time of post activation, and then further cultured in a medium containing TSA.
  • the nuclei of at least one donor cell can be altered by focusing epigenetic modifying agents to increase successful NT production.
  • Epigenetic regulators specifically alter the state of methylation or acetylation of specific proteins or DNA to increase transcriptional efficiency and consequently to increase NT efficiency.
  • Targets of these epigenetic regulators include histone acetyl transferase (HAT) proteins, histone deacetylase (HDAC) proteins, lysine dimethylase (KDM) domain proteins, and protein methyl transfer.
  • RNA small interfering RNA
  • NT oocytes are cultured in the presence of agents that alter epigenetic status. Specific examples of these formulations are described in Tables 2-5 below.
  • Histone acetyl transferase (HAT) protein, histone deacetylase (HDAC) protein, lysine dimethylase (KDM) domain protein, protein methyl transferase (PMT) protein It is not limited to the examples below.
  • Histone acetyl transferase (HAT) protein Target_ID (
  • Histone deacetylase protein Target_ID (
  • Lysine Dimethylase (KDM) Domain Protein Target_ID (
  • methyl transferases can be inhibited by co-substrate analogues.
  • co-substrate analogues Three kinds of co-substrate analogues that inhibit various kinds of methyltransferases are known.
  • Sinefugin a structurally similar antibiotic compound to S-adenosylmethionone (SAM), dimethylated co-substrate SAH and methylthioadenosine as feedback inhibitors.
  • Lysine methyl group inhibitors include the first identified chaetocin and G9a (KMT1C) inhibitor Bix-01294. These are optional for SUV39H1 and PRM1.
  • Bix-01338 is a rather nonselective inhibitor with no selectivity between lysine and arginine methyltransferase, showing an IC50 of 5 mM for G9a and an IC50 of 6 mM for PRMT1.
  • UNC0224 has been proposed as a new inhibitor with IC50 15 mM against lysine methyltransferase G9a.
  • Inhibitors of histone methyltransferases such as EPZ5676, EPZ005687 and GSK126 also show anticancer activity in various cancer animal models.
  • Protein arginine methylation is accomplished by PRMTs and is divided into two groups. Type I methyl transferases form asymmetrically substituted arginine residues, and type II methyl transferases form symmetrically substituted arginine residues.
  • CARM1 shows affinity with proline-glycine-methionine-arginine (the so-called PGM motif).
  • PRMT5 is also known to methylate the PGM motif.
  • Cosubstrate analogs such as sinefungin can also be used as inhibitors of arginine methyltransferases (also known as AMIs as arginine methyltransferase inhibitors).
  • AMI-1 is the most active inhibitor of PRMT1 with IC50 9 mM. Inhibitors of allatodapsone and stilbamidine induce hypomethylation in H4R3.
  • DNA methyltransferases preferentially methylate the CpGnucleotide sequence of DNA.
  • methylation of these promoter sites inhibits the expression of genes by preventing transcription factors from binding to DNA.
  • methylated DNA is bound by a methyl-CpG binding domain protein, which attracts histone modeling enzymes, consequently condensing chromatin structure to express genes. May induce a mechanism to suppress DNMT inhibitors can increase the efficiency of NT by preventing gene expression from being inhibited.
  • Some examples include chlorogenic acid, mithramycin, azacytide, bisdemethoxycurcumim, decitabine, lomegutatrib, benzylguanine, sorafenib and sorafenib tosylate.
  • HDAC histone deacetylase
  • Type IV HDACs (11 subtypes) are found in both the nucleus and cytoplasm and are primarily located in the brain, heart, and muscle cells. HDACs inhibitors have anticancer activity when administered in combination with other chemotherapy drugs. HDAC inhibitors can promote DN transcription, resulting in increased NT efficiency.
  • Epigenetic modifying agents such as epigenetic chromatin and ⁇ histone modification agents, and / or DNA modifiers may be included in the post activation medium.
  • it is a protein arginine methyl-transferase (PRMT1) and a coactivator-associated arginine methyltransferase 1 (CARM1 / PRMT4), a nuclear orphan receptor estrogen.
  • receptor estrogen may be selected from related receptor ⁇ (Esrrb) proteins and may also be selected from Lysine (K) -Specific Demethylase 4A (Kdm4a), Lysine-specific dimethylase 4B (Lysine (K)).
  • CARM1 and Esrrb may be a 7X arginine (7R) -cell-penetrating peptides (CPPs), or one of skill in the art, to enhance the penetration of proteins and peptides through cell and nuclear membranes, and to bind and / or transactivate DNA. May be modified with other proteins known to increase.
  • the method uses transcript talent-based reprogramming to allow octamer binding transcription factor-4 (Oct-4), sex determination site Y-box-2 (sex determining). region Y-box-2) (Sox-2), nanog, Kruppel-like factor-4 (Klk-4), MyoD, c-Myc, zinc finder protein-42 protein-42) (Rex-1 / Zfp-42), lefty A, teratocarcinoma-derived growth factor (Tdgf), and / or telomeric repeating binding epigenetic reprogramming of nuclear donor cells with factor) (Terf-1).
  • the method comprises direct piezoelectric injection, viral injection, liposome injection, or other intracellular injection.
  • the transcription factor can be delivered in the form of mRNA, protein, and / or cell extracts that can be applied prior to nuclear transfer into nucleated oocytes.
  • the method may comprise the use of HDAC inhibitors (Class I, II, and III), or DNMT3a and DNMT3b inhibitors.
  • the present invention preferably post activation medium comprises epigenetic modifying agents. More preferably, epigenetic modifying agents are histone acetyl transferase (HAT) proteins, histone deacetylase (HDAC) proteins, lysine dimethylase (KDM) domain proteins, Protein methyl transferase (PMT) domain proteins and DNA methyl transferases (DNA) are involved in any one or more selected from the group comprising DNA transferases (DNMTs).
  • HAT histone acetyl transferase
  • HDAC histone deacetylase
  • KDM lysine dimethylase
  • PMT Protein methyl transferase domain proteins
  • DNA DNA methyl transferases
  • the method for producing NT cell-derived stem cells is the step of activating NT cells to generate blastocysts; Isolating endocytosis (ICM) cells from the resulting blastocysts; And further culturing the isolated inner cell population cells with stem cells.
  • ICM Isolating endocytosis
  • Stem cells of the present invention can be cryopreserved for future use.
  • the cryopreservative comprises one or more cryoprotectants including but not limited to dimethyl sulfoxide (DMSO), ethylene glycol, glycerol and propanediol;
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • One or more culture media including but not limited to DMEM, MEM and the patented media disclosed above;
  • the stem cells are cryopreserved in a solution comprising one or more additional substances, including but not limited to sucrose, dextran, serum substitutes and HEPES buffer.
  • the solution comprises CryoStor TM CS-10 media (BioLife Solutions Inc., Botel, Washington).
  • the serum replacement is Knockout serum replacement (Invitrogen 10828-028).
  • Cryopreservation of the prepared stem cells freezes the cells at a controlled rate or in a "manual" process.
  • the controlled rate freezing procedure begins by turning on a controlled rate freezer and setting up a freezing program for tissue or cell freezing.
  • the controlled rate freezer will use liquid nitrogen to reduce the temperature in the inner chamber (which will reduce the temperature of any contents of the chamber).
  • the freezing program for cells begins by cooling the inner chamber to 4 ° C. and maintaining the temperature until it is stimulated to continue the procedure. While the controlled rate freezer cools, the cells are suspended in cryopreservation medium cooled to 4 ° C.
  • the cell suspension is aliquoted into frozen vials in an amount of 1 ml per cryovial.
  • the frozen vials are then labeled and placed in a controlled rate freezer chamber to stimulate the program to continue.
  • the temperature of the chamber is maintained at 4 ° C. for an additional 10 minutes.
  • the chamber is cooled at a rate of -1 ° C / min until the temperature reaches -80 ° C.
  • the chamber is then cooled at a rate of -50 ° C / min until the chamber reaches a temperature of -120 ° C.
  • the temperature of the frozen cells will equilibrate to -120 ° C.
  • the frozen vials of the frozen cells are then transferred to liquid nitrogen Dewar for long term storage.
  • the present invention comprises the steps of a) screening homozygous (Homozygous) from a plurality of donation tissue (donation) tissue;
  • the screening in step a) is that the genes of human leukocyte antigen (HLA) -A, HLA-B, and HLA-DR are homozygous, and in step b), NT production may include denuclearizing oocytes; Fusing the nucleus of the somatic cell to denucleated oocytes; Comprising a step of culturing the fused oocytes in a post activation medium, more preferably, the denucleation of the oocytes is made in a medium containing a protein phosphatase inhibitor (protein phosphatase inhibitor).
  • HLA human leukocyte antigen
  • the step of fusing the nucleus of the somatic cells is made in a medium containing Sendai virus or Sendai virus extract
  • the post-activation medium preferably comprises a histone deacetylase inhibitor (distone deacetylase inhibitor), It is more desirable to include TSA.
  • the post activation medium preferably contains epigenetic modifying agents, more preferably the epigenetic modifying agents include histone acetyl transferase (HAT, histone acetyl). at least one selected from the group consisting of transferase (HDC) protein, histone deacetylase (HDAC) protein, lysine dimethylase (KDM) domain protein, and protein methyl transferase (PMT) domain protein.
  • HDC transferase
  • HDAC histone deacetylase
  • KDM protein methyl transferase
  • the present invention comprises the steps of a) screening homozygous (Homozygous) from a plurality of donation tissue (donation) tissue;
  • It provides a method for producing cells differentiated from stem cells derived from immunocompatible NT cells, comprising the steps of: preparing the differentiated cells for cell transplantation from the prepared stem cells.
  • the stem cells may be optionally added to cryopreservation, in which case, the step of thawing the cryopreserved cells prior to step d) may be selectively added.
  • Differentiated cells are derived from stem cells, hematopoietic stem cells, muscle cells, cardiomyocytes, liver cells, chondrocytes, epithelial cells, urinary organ cells, adipocytes, kidney cells, vascular cells, retinal cells, mesenchymal stem cells (MSCs) and neurons.
  • stem cells hematopoietic stem cells
  • muscle cells cardiomyocytes
  • liver cells chondrocytes
  • epithelial cells urinary organ cells
  • adipocytes adipocytes
  • kidney cells vascular cells
  • retinal cells mesenchymal stem cells (MSCs) and neurons.
  • MSCs mesenchymal stem cells
  • Such a banking system can reduce the continuous supply of new oocytes by replacing NT production with autologous cells and enable a wide range of autologous or heterologous cell transplants.
  • the screening step for xenotransplantation from these banking systems and the preparation of specific differentiated cells from the selected stem cells expand the range of use as more and more various cell therapies. It is possible to apply variously to the field of cell transplantation treatment that is used in the past.
  • the differentiation into vascular endothelial cells can lead to vascular related diseases, retinal pigment epithelial cells, and retinal related diseases through differentiation into neurons.
  • the field of treatment such as neurodegenerative diseases through differentiation will not be limited.
  • the present invention is to provide a cell population comprising an immune-compatible stem cells prepared by the method for producing an immunocompatible NT cell-derived stem cells.
  • the present invention also provides a composition comprising a cell population of NT cell-derived stem cells for the treatment of various diseases.
  • Cell composition of the present invention with respect to the total weight of the composition of the present invention contains 0.1 to 99.9% by weight as an active ingredient, may comprise a pharmaceutically acceptable carrier, excipient or diluent.
  • compositions of the present invention may be in various oral or parenteral formulations.
  • diluents or excipients such as fillers, extenders, binders, wetting agents, disintegrating agents, and surfactants are usually used.
  • Solid form preparations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules, and the like, which form at least one excipient such as starch, calcium carbonate, sucrose or lactose (at least one compound). lactose) and gelatin.
  • lubricants such as magnesium stearate, talc and the like are also used.
  • Liquid preparations for oral administration include suspensions, liquid solutions, emulsions, and syrups, and various excipients such as wetting agents, sweeteners, fragrances, and preservatives, in addition to commonly used simple diluents such as water and liquid paraffin, may be included.
  • Formulations for parenteral administration include sterile aqueous solutions, non-aqueous solvents, suspensions, emulsions, lyophilized preparations, suppositories.
  • non-aqueous solvent and the suspension solvent propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oil such as olive oil, injectable ester such as ethyl oleate, and the like can be used.
  • As the base of the suppository witepsol, macrogol, tween 61, cacao butter, laurin butter, glycerogelatin and the like can be used.
  • the pharmaceutically effective amount is 0.0001 to 100 mg / kg, 0.001 to 10 mg / kg, but is not limited thereto.
  • the dosage may vary depending on the weight, age, sex, health condition, diet, duration of administration, method of administration, elimination rate, severity of disease, and the like of the particular patient.
  • composition can be administered orally or parenterally during clinical administration and intraperitoneal injection, rectal injection, subcutaneous injection, intravenous injection, intramuscular injection, intrauterine dural injection, cerebrovascular injection or intrathoracic injection during parenteral administration. And can be used in the form of general pharmaceutical formulations.
  • composition of the present invention may be used alone or in combination with methods using surgery, radiation therapy, hormone therapy, chemotherapy and biological response modifiers.
  • the present invention provides a means for collecting a plurality of donor tissue
  • Means for cryopreserving stem cells provides an immunocompatible NT cell-derived stem cell banking system comprising a.
  • the present invention provides a stem cell bank for storing NT cell derived stem cells obtained from multiple donors of an individual.
  • Stored stem cells can be used as a source of cells for restoring a particular cell population of an individual's body for health reasons or for the treatment or clinical use of another individual.
  • Stored stem cells can also be used for research applications.
  • Stored stem cells may be thawed and used as stem cells after long-term preservation, or may be used or administered to a patient after differentiation into specific cells.
  • Genomic DNA was extracted using Gentra Puregene TM Blood Kits (QIAGEN, Hilden, Germany) for HLA-A, B and DRB1 genotyping, and then SeCore A, B and DRB1 Locus Sequencing Kit (Invitrogen, Brown Deer, WI, USA) Sequence-based typing was used.
  • exon 2-4 for HLA-A and B and exon 2 for HLA-DRB1 were amplified using a locus specific primer included in the kit, and ABI3130XL Genetic Analyzer (Applied Biosystems, Foster City, CA) , USA) was used to sequence the PCR product formed, and the data using HLA SBT u-type software v3.0 (Invitrogen) and Sequencher (Gene Codes Corp., Ann Arbor, MI, USA) The analysis was carried out. In the end, HLA homozygous donor cells (A * 33: 03-B * 44: 03-DRB1 * 13: 02) (haplotype frequency: 4.6%) were most frequently used in donor blood If found, NT-cells could cover about 9% of the total population.
  • hematopoietic cells of HLA AB-DRB1 haplotype were selected as donor cells and cultured in a cell culture flask under 5% CO 2 at 37 ° C.
  • DMEM culture medium containing 10% DMSO and 30% FBS is used as a freezing solution, frozen in cryo vials and stored in a liquid nitrogen tank until use.
  • FBS chromosome test
  • Ovarian stimulation was performed according to established clinical IVF guidelines (Tachibana et al., 2013). The women were sedated with Midazolam 5-7.5 mg (Versed, Roche, and Nutley. NJ, USA) and Fentanyl 50-75 ug (Abbott Pharmaceutical, Abbott Park, Ill. USA) 36 hours after Lupron or hCG injection. And oocytes were then recovered using the previously described ultrasound map.
  • COCs cumulus-oocyte cell complexes
  • IVF medium Quinn's IVF medium, SAGE Biopharma, Bedminster, NJ
  • SSS serum substitutes
  • HTF-Hepes medium Global Medium
  • COCs were treated with hyaluroniase (100 IU / ml, Sigma, St. Louis, Mo. USA), and then the oocytes were sorted according to maturity, and oocytes in the middle II (MII) phase were used for NT.
  • MII middle II
  • the denuclearization of oocytes can be carried out by a previously known method (Tachibana et al., 2013), the denuclearization of oocytes and nuclear replacement of somatic cells can be performed by stage warmers, narishige micromanipulators. ), An Oosight TM imaging system (poloscopic microscopy), and an inverted microscope equipped with a laser. An inverted microscope with piezo may optionally be used instead of an inverted microscope with a laser.
  • HTF-Hepes medium Global Medium
  • cytocarcin B 5 ⁇ g / ml
  • caffeine 1.25 mM
  • Caffeine is a protein phosphatase inhibitor that inhibits premature activation and improves the growth of cloned embryos, thereby increasing the rate of blastocyst formation.
  • the zona pellucida next to the spindle was drilled with a laser pulse, and the injection pipette was inserted through the drilled portion.
  • the injection pipette was aspirated with spindles in contact with a small amount of cytoplasm surrounded by a plasma membrane.
  • the transparent band may optionally use piezo pulses instead of laser pulses.
  • the donor cells were then aspirated into micropipettes and transferred to small drops containing Sendai virus envelope protein (HJV-E extract, Isihara Sangyo Kaisha). Then, the nuclear donor cells of Example 1 were inserted into a perivitelline space located opposite the first polar body.
  • Sendai virus envelope protein Sendai virus envelope protein
  • the prepared eggs were further incubated for 30 minutes or 2 hours in Global 10% SPS medium.
  • Activation was performed under 0.25 mM d-sorbitol buffer containing 0.1 mM potassium acetate, 0.5 mM magnesium acetate, 0.5 mM HEPES, 1 mg / ml fatty acid-free BSA (fatty-acid-free BSA). Electrical pulses (2 ⁇ 50 ⁇ s DC pulses, 2.7 kV / cm) were added to the test. Activated cells were incubated for 4 hours in Global Medium (excluding serum) containing 2 mM DMAP under 5% CO 2 , 37 ° C., and under 5% CO 2 , 5% O 2 , 90% N 2 , 37 ° C.
  • Example 2 The blastocyst cultured in Example 2 was treated with acidic Tyrode solution (pH 2.0) for several seconds to remove the zona pellucida (ZP). After removal of ZP, embryos were vigorously washed in Hepes-HTF medium to remove even trace amounts of Tyrode solution. Intracellular cell mass (ICM) was isolated using a laser-assisted blastocyst ablation system (Hamilton-Thorne Inc.) and the remaining portion of the blastocyst (nutrient membrane) was discarded to confirm that the blastocyst was no longer intact.
  • ICM Intracellular cell mass
  • ICMs were plated on MEFs prepared one day prior to plating, but whole embryos were plated if replicated blastocysts had indistinguishable ICMs.
  • hPSC induction medium was serum replacement (5% SR, Invitrogen), FBS (10%, Hyclone), plasmamate (5%), bFGF (32 ng / ml), and human LIF (2000 units / mI, Sigma) Knockout-DMEM supplemented with -Aldrich) was included. After incubation of ICM for 3 days in the same medium without change, on day 4 about 1/3 of the medium was replaced. 1 ⁇ 2 of the medium was changed every other day from day 6. Initial outgrowth was observed within 7 days after plating.
  • EBs embryonic bodies
  • FIG. 7 (a) and (b) In order to confirm the pluripotency in the body, stem cells were injected into the testis or subcutaneously of the immunodeficient mice to induce teratoma formation and histologically, the differentiation was confirmed through H-E and special staining. The results are shown in Figure 7 (c).
  • the cells prepared in Example 3 are sorted according to homozygous cells and stored and recorded in a document or program.
  • the information of the cell donor is stored together. It can be used directly for future autologous or allogenic recipients (patients) or stored for use as differentiated cells.
  • NT-derived stem cells were mechanically clump-form of NT-ES cells using a sterilized tip under an anatomical microscope (a fragment of approximately 300-600 undifferentiated embryos). Stem cell line). Clump-type NT-derived stem cells were supplemented with 15% (v / v) knockout TM DMEM (Thermo Scientific, CA, USA) supplemented in low attachment 6-well plates (Corning, CA, USA).
  • TM serum replacement (Thermo), 1% (v / v) glutamax (Thermo), 1% (v / v) NEAA (Thermo), 1% (v / v) penicillin-streptomycin (Thermo) and 0.1 mM ⁇ -mercaptoethanol (Thermo)) incubated for 4 days in a suspended state.
  • the cultured embryoid body is transferred to the culture dish and induces RPE differentiation while attached.
  • Embryos were transferred to a 6-well culture dish coated with 0.1% gelatin coating and allowed to stand in the incubator for 3 days for attachment. Then, EBDM culture medium was replaced every 2-3 days, and retinal pigment epithelial cells were grown. Incubated for about 50-55 days until it appears. To separate the color-coded RPE cells by pigmentation, the cells were washed twice with physiological saline (DPBS containing Ca 2 + Mg 2 + (Thermo)) and physiological saline containing collagenase type 4 (Type IV collagenase). (Thermo) in DPBS with Ca 2+ Mg 2+ (Thermo)) and incubated in an incubator maintained at 37 ° C., 5% CO 2 for 2 hours.
  • physiological saline DPBS containing Ca 2 + Mg 2 + (Thermo)
  • Type IV collagenase Type IV collagenase
  • detached cell clusters separated from the culture dish were collected in a 50 ml tube and washed twice with DMEM-FBS culture using a centrifuge (1500 rpm, 5 minutes). The cell masses were transferred to a 60 mm Petri dish, and the pigmented cell clusters were collected from other non-pigmented cell masses using a glass pipette drawn under a dissecting microscope.
  • Pigmented cell clusters are washed twice with physiological saline (DPBS without Ca 2 + Mg 2 + (Thermo)) without calcium and magnesium to isolate and culture single cells. : 1 mixture of 0.25% Trypsin-EDTA (Thermo) and Cell Dissociation Buffer (Thermo)) were isolated. Retinal pigment epithelial cells separated into single cells were washed with DMEM-FBS medium using a centrifuge (1500 rpm, 5 min), and then 200,000 cells / 4 well plate was prepared by releasing the cells with EGM2 medium (Lonza, PA, USA). In a well of 0.1% gelatin-coated 4well culture plate at a concentration of one well was incubated in EGM-2 culture until it is full.
  • the cells are filled with a culture plate with RPE differentiation medium (RGMM: 1: 1 mixture of EBDM and DMEM-FBS media) to show the shape and characteristics of retinal pigment epithelial cells.
  • RPE differentiation medium RGMM: 1: 1 mixture of EBDM and DMEM-FBS media
  • Retinal pigment epithelial cells differentiated from NT-derived stem cells were subcultured using the same separation enzyme solution as above, and functional retinal pigment epithelial cells were obtained through the proliferation process using EGM2 culture and the aging process using RGMM culture.
  • Some retinal pigment epithelial cells from passages 2 and 3 were obtained using 2 million cells / mL / cryo using freezing solution (90% (v / v) FBS (Thermo) and 10% (v / v) DMSO (Sigma)). Freezing at the concentration of vial was stored until use, and some of the retinal pigment epithelial cells were characterized.
  • Figure 8 shows that there is no difference in the morphology and differentiation markers of RPE cells of embryonic stem cell-derived RPE cells and NT-derived stem cells prepared in Example 3 (Fig. 8 (a), (b)).

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Abstract

본 발명은 HLA (human leukocyte antigen)-A, HLA-B 및 HLA-DR 등의 유전자에서 동형접합(Homozygous) 유전형을 가진 체세포의 핵이식(somatic cell nuclear transfer, NT)기술을 이용하여 제조된 세포의 보관 방법 및 뱅킹 시스템에 관한 것이다. 본 발명에 따른 NT 세포 유래 줄기세포의 뱅킹은 동종 또는 이종의 환자에게 적용이 가능하며, 당뇨, 골관절염 및 파킨슨병 등 다양한 질환에 치료를 위하여 이식가능한 세포 및 조직 재료를 제공할 수 있다.

Description

NT세포의 보관방법 및 뱅킹 시스템
본 발명은 HLA (human leukocyte antigen)-A, HLA-B 및 HLA-DR 등의 유전자에서 동형접합(Homozygous) 유전형을 가진 체세포의 핵이식(somatic cell nuclear transfer, NT)기술을 이용하여 제조된 세포의 보관 방법 및 뱅킹 시스템에 관한 것이다.
세포 치료제는 질병 치료에 있어 약물이나 외과적 수술 등을 통하여 제한적으로 치료가 가능하다고 생각되었던 부분을 세포 특히 줄기세포를 통하여 ‘근본적인 치료’를 가능하도록 하여 의약계의 새로운 패러다임으로 급부상하고 있는 분야이다. 특히 재생의학(regenerative medicine) 분야에서 고령화, 질병, 사고 등으로 손상받거나 기능이 저하된 조직과 장기를 재생시키거나 대체하여 기능을 회복하도록 함으로써 질병에 대항하는 새로운 기술분야이며, 난치성 질환의 치료대안으로 부각되고 있는 분야이다.
세포치료제가 보다 폭넓게 이용되기 위하여는 면역거부반응이라는 난제를 해결하여야 한다. 면역거부반응을 일으키는 원인은 주요 (Major Histocompatibility Antigen Complex, MHC)이라고도 불리는 6종의 HLA (HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DP, HLA-DQ, HLA-DR) 세포 표면 단백질이며, 사람은 부계 유전자에서 유래한 6종과 모계 유전자에서 유래한 6종, 즉 총 6쌍이 발현 되고 있다. 일반 체세포는 MHC 클래스 I에 속하는 HLA-A, HLA-B, HLA-C, 총 3쌍 만을 발현하며, 면역세포들은 MHC 클래스 I과 MHC 클래스 II, 모두 합하여 총 6쌍을 발현한다. HLA 표면항원의 역할은 세포 내에 존재하는 단백질들의 조각들을 세포의 표면에 전시 (display)하여, 혹시 생체 내에서 발생했을지 모를 감염이나 돌연변이가 면역세포에 의해 감지되도록 하는 것이며, 이런 이유로 항원제공 단백질 (antigen presenting protein) 이라고도 한다.
한편, 체세포 핵이식(Somatic Cell Nuclear Transfer, SCNT)기술은 체세포의 핵을 제거한 후 난자의 핵을 이식하여 복제하는 기술을 의미한다. 체세포를 이용하여 체세포의 핵을 분리하고 분리된 핵을 핵이 제거된 난자에 주입하여 체세포의 유전적 특성을 그대로 유지한 줄기세포주를 제조하는 것이다. 이 방법은 환자 자신의 체세포를 이용한다는 점에서 면역거부반응을 없앨 수 있다는 장점이 있으며, 환자 맞춤형 치료가 가능하도록 한다. NT의 기술이 발전하고 있지만, 아직까지도 융합된 난모세포(reconstructed oocytes)로부터 배반포(blastocyst)까지의 형성율을 매우 낮은 상태이다. 따라서, 이 형성율을 높이기 위한 다양한 시도가 이루어지고 요구되고 있다. 특히, NT 배아의 가장 큰 장애는 배아 유전자의 활성화(ZGA, zygotic gene activation)이며, 인간을 포함한 대형 포유동물에서 4-에서 8- 세포기에 나타난다. 특히 공여자의 다양성(variability)과 관계없이 성공률을 높이기 위하여 기존에 존재하는 후생성 장애인자(epigenetic barriers)를 제거하는 것이 필요하다. 구체적으로 2-, 4-, 8- 세포기로부터 배반포까지의 성공적인 제조를 위하여 제조상의 결함이나 손실없이도 공여자 핵의 후생성 상태를 바꿈으로써 배반포 성공률을 획기적으로 높이는 것이 필요하다.
상기와 같이 재생의료 및 난치성 질환의 치료를 위한 세포치료제로서 면역거부반응을 해소할 수 있으며 되도록 환자 맞춤형 세포를 제공할 수 있는 세포의 제조방법 및 뱅킹 시스템이 요구되고 있다.
본 발명자들은 동형접합형 세포로부터 면역거부반응을 일으키지 않은 세포 치료제 또는 이식용 세포를 개발하여 본 발명을 이르게 되었다.
따라서, 본 발명은 동종 또는 이종의 다양한 질환에 적용이 가능한 NT 세포유래 줄기세포의 보관방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 NT 세포 유래 줄기세포의 제조방법 및 제조된 세포의 뱅킹 시스템을 제공하는 목적으로 한다.
본 발명은 a) 복수의 기증자(donation) 조직으로부터 동형접합(Homozygous) 여부를 스크리닝하는 단계;
b) 동형접합(Homozygous) 세포로부터 핵을 분리하여 NT 세포로 제조하는 단계;
c) 제조된 NT 세포로부터 줄기세포를 생성하는 단계; 및
d) 복수개의 줄기세포들을 냉동보존하는 단계를 포함하는 면역적합형 NT 세포 유래 줄기세포의 보관 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 a) 복수의 기증자(donation) 조직으로부터 동형접합(Homozygous) 여부를 스크리닝하는 단계;
b) 동형접합(Homozygous) 세포로부터 핵을 분리하여 NT 세포로 제조하는 단계; 및
c) 제조된 NT 세포로부터 줄기세포를 생성하는 단계;를 포함하는 면역적합형 NT 세포 유래 줄기세포의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 a) 복수의 기증자(donation) 조직으로부터 동형접합(Homozygous) 여부를 스크리닝하는 단계;
b) 동형접합(Homozygous) 세포로부터 핵을 분리하여 NT 세포로 제조하는 단계;
c) 제조된 NT 세포로부터 줄기세포를 생성하는 단계; 및
d) 상기 제조된 줄기세포로부터 세포 이식을 위한 분화된 세포로 제조하는 단계;를 포함하는 면역 적합형 NT 세포 유래 줄기세포로부터 분화된 세포의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 a)복수의 기증자 조직을 수집하는 수단, b) 수집된 조직을 스크리닝 하는 수단, c) 조직으로부터 줄기세포를 제조하는 수단, 및 d) 줄기세포를 냉동보존하는 수단,을 포함하는 면역적합형 NT 유래 줄기세포의 뱅킹 시스템을 제공한다.
본 발명에 따른 NT 세포 유래 줄기세포의 뱅킹은 다양한 질환 또는 장애의 치료를 가능하도록 한다. 당뇨, 골관절염 및 파킨슨병 등 다양한 질환에 치료를 위하여 이식가능한 세포 및 조직 재료를 제공할 수 있으며 특히 세포 종류 특이적 결함을 근본적으로 치료할 수 있는 가능성을 제시한다. 특히, 본 동형접합형 세포는 면역거부반응 및 면역관용의 위험을 감소시킬 수 있는 치료적 접근방법을 제공할 수 있다.
도 1은 현 제대혈 관리 및 연구에 관한 법률에 따라 세포수 7억개 미만일 경우 폐기용으로 분류됨을 나타낸 그림이다.
도 2는 실시예 1의 공여세포의 염색체 검사결과를 나타낸 것이다.
도 3은 실시예 3에서 제조된 NT 세포의 염색체 검사결과를 나타낸 것이다.
도 4는 실시예 3에서 제조된 NT 세포의 (a) genomic DNA 검사결과와 (b) mitochondrial DNA 검사결과로 공여 체세포 및 공여 난모세포와 비교하여 보여주는 것이다.
도5는 실시예 3에서 제조된 NT 세포의 줄기세포 마커의 immunochemistry 분석 결과를 보여주는 것이다.
도6은 실시예 3에서 제조된 NT 세포의 줄기세포 마커의 RT-PCR 분석결과를 보여주는 것이다.
도7은 실시예 3에서 제조된 NT 세포의 삼배엽성 유래 세포로 분화할 수 있는 전분화능을 확인하기 위한 실험 결과로, 배아체를 형성하여 14일간 배양 후 확인한 (a) 삼배엽성 분화 마커의 immunohistochemistry 분석결과 및 (b) 마커의 RT-PCR 결과와 (c) 면역결핍생쥐에 주입하여 형성된 테라토마의 조직분석결과를 보여준다.
도8은 (a) 배아줄기세포 유래 RPE세포와 실시예 3에서 제조된 NT 유래 RPE세포의 형태와 (b) RPE 세포의 마커를 비교한 결과로 차이가 없음을 보여주는 것이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명에서, "면역적합항원 동형접합"이란, 공여자의 부계와 모계에서 물려받은 각각의 HLA-A, HLA-B, HLA-DR 유전자들의 유전형이 완전히 동일하여 6개가 아닌 3개의 HLA 유전형을 가진 것을 의미한다.
본 발명에서 “체세포”는 성세포 또는 이의 전구체를 제외한 체내의 임의의 조직세포를 의미한다.
본 발명에서 “줄기세포”는 자가재생할 수 있고 (미분화된 상태를 유지하면서 다수의 세포 분열 주기를 통과하는 능력을 갖고) 1종 이상의 다중분화능 (1종 이상의 전문화된 세포로 분화하는 성능)을 나타낼 수 있는 세포를 의미한다.
본 발명에서 사용된 "장기간 배양"은 2개월 이상 또는 10회 계대배양 이상보다 더 오랫동안 조절된 조건 하에서 세포를 증식시키는 것을 의미한다. 바람직하게는, 장기간 배양은 4개월 이상, 6개월 이상 또는 1년 이상 동안 배양된다. 바람직하게는, 장기간 배양은 15회 이상의 계대배양, 18회 이상의 계대배양 또는 20회 이상의 계대배양 동안 계대배양된다. 장기간 배양의 지속기간은 개별 세포에 주로 의존하고 세포주마다 다를 수 있다.
본 발명에서 사용된 "성숙"은 최종적으로 분화된 세포 종류를 향하여 인도하는 조화된 생화학적 단계들로 구성된 과정을 의미한다.
본 발명에서 “분화”는 특정 형태 또는 기능에 대한 세포의 적응을 의미한다.
본 발명에서 "분화된 세포"는 본 명세서에 그 용어가 정의된 것처럼 이의 원래 형태에서 다능성이 아닌 임의의 체세포를 포함한다. 따라서, 용어 "분화된 세포"는 또한 부분 분화된 세포, 예컨대 다분화능 세포, 또는 본 명세서에 기재된 임의의 조성물 및 방법을 이용하여 생성된 안정한, 비다능성 부분 재프로그래밍된 또는 부분 분화된 세포인 세포를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 분화된 세포는 안정한 중간 세포, 예컨대 비다능성, 부분 재프로그래밍된 세포인 세포이다. 배양물 중에 많은 1차 세포를 위치시키면 완전 분화된 특성을 약간 소실할 수 있는 것에 유의해야 한다. 따라서, 이러한 분화된 또는 체세포를 단순히 배양하는 것은 이 세포가 비분화된 세포(예를 들면 미분화 세포) 또는 다능성 세포가 되게 하지 않는다. 분화된 세포(안정한, 비다능성 부분 재프로그래밍된 세포 중간체를 포함)의 전분화능으로의 전이는 배양물 중에 위치시킬 때 분화된 특성을 부분 소실시키는 자극을 넘는 재프로그래밍 자극을 필요로 한다. 재프로그래밍된, 몇몇 실시양태에서, 부분 재프로그래밍된 세포는 또한 일반적으로 배양물 중에 오직 제한된 수의 분열에 대한 능력을 갖는 더 낮은 발생 가능성을 갖는 모 세포에 비해 성장 가능성의 소실 없이 연장된 계대배양을 겪는 능력을 갖는 특성을 갖는다. 몇몇 실시양태에서, 용어 "분화된 세포"는 또한 (예를 들면, 미분화 세포 또는 재프로그래밍된 세포로부터) 덜 특수화된 세포 유형(즉, 발생 가능성 증가)의 세포(여기서, 세포는 세포내 분화 공정을 겪음)로부터 유래한 더 특수화된 세포 유형(즉, 발생 가능성 감소)의 세포를 의미한다.
바람직하게는 본 발명에서 조혈모세포, 근육 세포, 심근 세포, 간 세포, 연골 세포, 상피 세포, 비뇨기관 세포, 지방세포, 신장세포, 혈관세포, 망막세포, 중간엽 줄기세포(MSC) 및 뉴런 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이나 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 "면역적합형 세포"는 특별히 이에 제한되지 않으나, HLA-A, HLA-B 및 HLA-DR 유전자가 동형적합 유사로 존재하는 세포를 말하며, 6쌍 중에 단 3개가 동일한 모든 HLA 유전형 조합의 수혜자에게 이식이 가능한 이점을 가질 수 있다.
본 발명에서 “뱅크”는 줄기세포의 저장장소를 의미하며, 필요에 따라 저장된 세포로부터 치료, 임상 또는 연구목적으로 개인 자신이나 다른 개인에게 그대로 또는 분화되어 사용될 수 있다.
본 발명에서, "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하며 물질의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경구 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여 될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 또한, 투여는 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 수행될 수 있다.
본 발명은 a) 복수의 기증자(donation) 조직으로부터 동형접합(Homozygous) 여부를 스크리닝하는 단계; b) 동형접합(Homozygous) 세포로부터 핵을 분리하여 NT 세포로 제조하는 단계; c) 제조된 NT 세포로부터 줄기세포를 생성하는 단계; 및 d) 복수개의 줄기세포들을 냉동보존하는 단계;를 포함하는 면역적합형 NT 세포 유래 줄기세포의 보관 방법을 제공한다.
NT를 통하여 제조된 세포는 환자의 핵의 유전 물질을 지닐 수 있으며, 이러한 점에서 개별적인 환자 특이적이다. 따라서, 자가 이식 즉, 동종에서의 면역거부에 대하여 유의적으로 감소된 위험을 갖는 환자에의 세포이식을 가능하게 하는 것이다. 나아가 본 발명에서의 동형접합(homozygous)세포는 HLA 항원 타입(type)이 매칭되는 세포로 항 HLA 항체가 없는 이종의 사람에게 이식이 가능한 것이다. 즉, 상기 NT 유래 줄기세포는 동형접합형 타입을 가지고 있어 면역적합형 세포로 이식이 가능한 것이다.
따라서, 상기 a)단계에서 스크리닝은 HLA(human leukocyte antigen)-A, HLA-B 및 HLA-DR의 유전자가 동형접합(homozygous)인 것을 선별하는 것이 바람직하다. HLA 유전형 스크리닝을 통해 서로 다른 면역적합 동형접합을 가진 공여자 140명을 찾게 되면 이들로부터 일본 전체 인구의 90% 이상 사람들에게 이식할 수 있는 면역적합 세포주를 미리 확보가 하는 것이 가능하다고 발표된 바 있다. (A more efficient method to generate integration-free human iPS cells, Nature Methods 8, 409-412 (2011))
본 발명에서는 일차로 차병원 기증 제대혈은행을 데이터를 바탕으로 동형접합(homozygous) 세포를 스크리닝하였다. 현 제대혈 관리 및 연구에 관한 법률에 따르면, 세포수 7억개 미만일 경우 폐기용으로 보건복지부 제대혈위원회의 승인을 받아 필요시 연구에 사용할 수 있도록 되어져 있다 (도 1 참조).
아래의 표 1(International Journal of Immunogenetics (2013) 40: 515-523)은 총 4,128개의 제대혈을 대상으로 HLA A-B-DRB1 haplotype 빈도를 조사한 것이다 (0.1% 이상만 나타냄).
Figure PCTKR2016007795-appb-T000001
따라서 본 연구에 이용될 세포로는 연구용으로 적합한 (7억개 미만의 세포수를 갖는) 냉동제대혈을 일차적으로 사용할 수 있으며, 이외에도 질병관리본부 장기이식관리센터 (KONOS)에 등록된 연구용 기증제대혈 전부를 포함할 수 있다. 이외에도 조혈모세포 기증자 네트워크 및 차병원 산하 의료기관에서 자체적으로 확보한 검체를 사용할 수 있다.
또한, 상기 b) 단계에서 NT 세포 제조방법은 난모세포를 탈핵하는 단계; 탈핵된 난모세포에 체세포의 핵을 융합시키는 단계; 및 융합된 난모세포를 포스트 활성화(post activation) 배지에 배양하는 단계를 포함하는 것이 바람직하다.
NT 유래의 줄기세포 제조방법은 난모세포의 핵을 제거하는 단계, 하나 이상의 공여체 세포의 하나 이상의 핵을 첨가함으로써 핵 이식된 (NT) 난모세포를 생성하는 단계, 활성화 배지에서 인큐베이션에 의해 상기 NT 난모세포를 활성화하는 단계, 및 상기 활성화된 NT 난모세포로부터 배반포를 생성하는 단계를 포함할 수 있다.
일예에서, 난모세포의 핵을 제거하는 단계는 중기 II(MII) 단계 난자 방추사를 제거하는 단계를 포함한다. 다양한 구체예에 있어서, 제1 극체(1PBE)는 제거된다. 또 다른 구체예에 있어서, 상기 방법은 난구 세포를 성숙의 완료 전에 벗기는 단계를 포함한다. 일 구체예에 있어서, 난모세포는 실시간으로 1PBE에 대한 비-UV 빛 기반 관찰로 관찰된다. 또 다른 구체예에 있어서, 관찰은 염색 또는 라벨링 제제, 예를 들면 훽스트 염색(Hoechst staining)의 부재하에서 일어난다. 일 구체예에 있어서, 이것은 폴리스코프(polscope), 예를 들면, Research Instruments (CRi) OosightTM 이미지 시스템의 사용을 포함한다. 예를 들면, 이것은 545 nm 평광으로 수집된 MII 난모세포에서의 투명대(zona pellucid) 및 방추사 복합체를 시각화하는 단계를 포함한다. 또 다른 구체예에 있어서, 난모세포의 핵을 제거하는 단계는 난모세포 막의 구멍 및 난모세포로부터의 1PBE의 제거를 가능하게 하는 윤곽을 갖는 마이크로피펫(contoured micropipette)의 사용을 포함한다. 또 다른 구체예에 있어서, 난모세포의 핵을 제거하는 단계는 압전기 드릴(piezoelectric drill)의 사용을 포함한다. 다른 구체예에 있어서, 난모세포의 핵을 제거하는 단계는 사이토칼라신 B 및 선택적으로, 단백질 포스파타아제 억제제, 예를 들면, 카페인을 함유하는 탈핵 배지에서 수행된다. 카페인은 단백질 인산가수분해효소 저해제로서 이른 활성화(premature activation)를 억제하여 복제배아의 성장을 개선시킴으로써 결과적으로 배반포의 형성율을 증가시킨다. 따라서, 바람직하게는 상기 난모세포의 탈핵은 단백질 인산가수분해효소 저해제(protein phosphatase inhibitor)를 포함하는 배지에서 이루어지는 것이며, 상기 단백질 인산가수분해효소 저해제는 카페인일 수 있다.
또 다른 구체예에 있어서, 하나 이상의 공여체 세포의 하나 이상의 핵을 첨가함으로써 핵 이식된 (NT) 난모세포를 생성하는 단계는 공여 핵을 이식하는 단계를 포함할 수 있다.
공여 핵을 이식하는 단계는 난모세포 막 구조를 변형시키는 제제의 사용을 포함한다. 일 구체예에 있어서, 난모세포 막 구조를 변형시키는 제제의 사용을 통한 난모세포의 핵을 제거하는 단계는 체세포와의 융합을 포함한다. 예를 들면, 공여 핵을 이식 하는 단계는 주입 피펫(예를 들면, 12 ㎛ 직경)으로 3 내지 4 공여 세포를 제공하는 단계, 파라믹소바이러스 또는 파라믹소 바이러스 단백질, 예를 들면 센다이 바이러스, 이들의 외피 단백질 또는 이들의 추출물을 함유하는 용액의 일정 양 중의 공여 세포를 배출하는 단계를 포함할 수 있다. 이후에, 선형으로 배열된 공여 세포로부터 일정 거리 떨어져서(4 내지 5 세포 길이) 주입 피펫을 사용하여 세포를 회수하는 단계, 홀딩 피펫으로 난모세포를 홀딩하는 단계, 공여 세포를 갖는 주입 피펫을 난모세포로 진전시키는 단계가 뒤따른다. 주입 피펫을 진전시키는 단계는 난황 원형질 막의 비파괴를 포함하고, 및 핵 공여 세포를 투명대 아래에 위치하는 난황 원형질 막과 접촉시키기 위하여 난모세포의 투명대 및 세포막 사이의 공간인 위란강(perivitelline space)에 하나의 핵 공여 세포의 삽입을 포함한다. 다양한 구체예에 있어서, 피펫의 회수는 난황막과 공여 세포 사이의 접촉을 방해하지 않는다. 다양한 구체예에 있어서, 세포는 공여 세포 삽입 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 또는 그 이상의 분 후에 융합된다. 다양한 구체예에 있어서, 세포는 공여 세포 삽입 10분 후에 융합된다. 선택적으로 상기 과정은 성공적으로 융합되지 않은 세포에 대하여 반복된다. 다양한 구체예에 있어서, 폴리스코프, 예를 들면, OosightTM 이미지 시스템이 전 과정에서 사용된다.
일 예로, 공여 핵을 이식하는 방법은 직접 주입(direct injection)방법에 의할 수 있다. 일 구체예에 있어서, 공여 핵을 이식하는 단계는 전기적 세포 조작, 예를 들면, 전기세포융합(electrofusion)을 포함할 수 있다. 다른 구체예에 있어서, 상기 방법은 체세포 핵 공여체, 줄기 세포 핵 공여체, 및 정자 세포 핵 공여체의 핵을 분리하는 단계를 포함할 수 있다. 다른 구체예에 있어서, 상기 방법은 NT를 위한 체세포 핵을 분리하는 단계 후에 피펫 또는 압전기 주입(piezoelectric injection)을 통하여 하나 또는 그 이상의 공여 핵을 삽입하는 단계를 포함한다. 다양한 구체예에 있어서, 공여 핵은 세포, 예를 들면, 피부 섬유아세포, 백혈구, 모낭, 또는 다른 체세포 핵 공여체로부터 유래된다. 또 다른 구체예에 있어서, 본 발명은 정자 세포 공여로부터 핵의 분리 및 제조를 포함하는 방법을 개시한다. 상이한 구체예에 있어서, 핵의 분리는 조직 생검, 수혈, 또는 조직 시료를 수득하기 위한 다른 방법, 기계적 분리, 콜라게나아제 소화, 세척, 원심분리 기반 밀도 구배 분리, 및/또는 표준 배양 배지로의 배양을 통한 조직의 가공을 포함한다.
바람직하게는, 상기 체세포의 핵을 융합키는 단계는 센다이바이러스 또는 센다이 바이러스 추출물을 포함하는 배지에서 이루어지는 것이다.
탈핵된 난모세포에 체세포의 핵을 융합시킨 후에 융합된 난모세포는 포스트 활성화(post activation) 배지에 옮겨져 활성화과정을 거친다.
상기 c) 제조된 NT 세포로부터 줄기세포를 생성시키는 단계는 구체적으로 핵 이식된 (NT) 난모세포를 활성화 배지에서 인큐베이션에 의해 NT 난모세포를 활성화시키는 단계, 상기 활성화된 NT 난모세포로부터 배반포를 생성하는 단계, 및 상기 배반포로부터 내세포집단 (ICM) 세포를 단리하는 단계를 포함하는 것이며, 상기 ICM 세포는 NT-hPSC 세포주로서 추가적으로 배양할 수 있는 것이다.
난모세포 활성화(artificial oocyte activation)는 자연발생적인 정자 수정 동안 일어나는 칼슘 신호 변화의 모방에 의존한다. 정상적인 난모세포 발달은 난모세포를 중기 II(MII) 단계에서 차단(arrest)하기 위한 고 수준의 중기 촉진 인자(Metaphase Promoting Factor)(MFP) 활성에 의존한다. MII 난모세포의 차단은 정자 진입에 기인한 세포내 칼슘 이온(Ca2 +) 수준 변화에 의해 방해된다. 이후에, 사이클린 B(cyclin B)(MPF 조절 서브유닛)의 표적 분해가 일어나고, 이것은 세포주기 차단, 전핵 형성, 및 감수 분열 및 유사 분열 과정으로부터 난모세포를 풀어준다.
난모세포 활성화는 세포주기 차단으로부터 배양된 난모세포를 풀어주기 위한 인위적인 칼슘-변화 전략에 의존한다. 예시는 칼슘 이온운반체, 지질 이중층을 통과하여 이온을 전달하는 지용성 분자, 예를 들면 이오노마이신(ionomycin) 및 A23817의 첨가를 포함한다. 대안적인 전략은 전기적 활성 또는 이온의 직접적인 주입에 의존한다.
NT와 관련된 바와 같이, 핵 이식된(즉, 재구축된) 난모세포의 재구축 이후에 또한, 칼슘 변화 기법을 사용한 난모세포 활성화가 일어난다.
그러나, 이러한 칼슘 이온주입 외에 NT 제조시 예를 들면, 단백질 포스파타아제 억제제 카페인의 양(sheep) 난모세포에의 첨가는 성숙-촉진 인자(Matruation Promoting Factor)(MPF) 및 미토겐-활성화된 단백질 키나아제(MAPKs)의 활성을 증가시킨다는 것이 보고되었고, 유사한 이점이 원숭이 난모세포에서 보고된 반면, 배반포 형성의 빈도는 증가하지 않았다. 또한, 칼슘 이온운반체, 전기적 활성화, 또는 직접적인 주입을 통한 칼슘 활성화는 자연발생적인 수정으로서 동일한 타이밍, 공간 조절, 또는 칼슘 진동을 일으키지 않는다. 추가적인 복잡성을 더하면 칼슘에 대한 영향은 또한, 종 특이적인 것으로 나타났다는 점이다. 일부 예에 있어서, 6-디메틸아미노퓨린(6-DMAP)과 같은 키나아제 억제제, 에탄올 및 사이클로헥시이미드(CHX)와 같은 단백질 합성 억제제로의 부가적인 처리의 사용은, MPF 불활성화를 증가시키기 위해 사용된다. TSA와 같은 히스톤 탈아세틸화효소 저해제는 개선된 NT 리프로그밍과 관계가 있다. TSA의 처리는 배반포의 형성을 촉진시킬 수 있다.
일 예에서 체세포의 핵융합과정 및 활성화 과정에서 전기적 자극(electrical pulse)를 가할 수 있다. 전기적 활성화는 전기적 세포융합 배지에서의 전기적 펄스를 포함한다. 다양한 구체예에 있어서, 전기적 세포융합 배지는 0.1 내지 0.5 M 만니톨, 0.01 내지 1 mM MgSO4.7H2O, 0.01 내지 1 mg/ml 폴리비닐 알코올, 1 내지 10 mg/ml 인간 혈청 알부민, 0.005 내지 0.5 mM CaCl2.2H2O를 포함한다. 일 구체예에 있어서, 전기적세포융합 배지는 0.3 M 만니톨, 0.1 mM MgSO4.7H2O, 0.1 mg/ml 폴리비닐 알코올, 3 mg/ml 인간 혈청 알부민, 0.05 mM CaCl2.2H2O를 포함한다.
다양한 구체예에 있어서, 핵 이식 난모세포는 완전한 활성화를 위해 포스트-활성화 배지(post-activation medium)에서 처리된다. 상이한 구체예에 있어서, 활성화된 재구축된 핵 이식된 난모세포는 이후에 포스트-활성화 배지에서 인큐베이션된다. 상이한 구체예에 있어서, 포스트-활성화 배지는 HEPES-제거 배지, 단백질-제거 배지, G1 또는 G2 배지, 난할 배지, 난할 보조 배지, IVF 배지, 배반포 형성 배지, 또는 글로벌 인간 배아 배양 배지이다. 상이한 구체예에 있어서, 포스트-활성화 배지는 6-DMAP, 퓨로마이신(puromycin), 에탄올, 사이클로헥시이미드(CHX), 트리코스타틴 A(trichostatin A)(TSA), 및 사이토칼라신 B(cytochalasin B)(CB)로부터 선택된 어느 하나이상을 포함할 수 있다. 상이한 구체예에 있어서, 활성화된 난모세포는 포스트-활성화 배지에서 30 내지 45, 45 내지 60, 60 내지 90, 90 내지 120, 120 내지 150, 150 내지 180, 180 내지 210, 210 내지 240, 240 내지 270, 300 내지 330, 330 내지 360, 360 내지 390분 미만, 또는 390분 초과 동안 인큐베이션된다. 특정 구체예에 있어서, 활성화된 난모세포는 240, 300, 또는 360분 동안 인큐베이션된다. 다양한 구체예에 있어서, 활성화 및 포스트-활성화 단계는 저산소 조건하에서 수행된다. 특정 구체예에 있어서, 저산소 조건은 약 80 내지 85%, 85 내지 90%. 90 내지 95%, 95% 또는 그 이상의 N2, 약 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10% 또는 그 이상의 O2, 및 약 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 또는 10% 또는 그 이상의 CO2를 포함한다. 특정 구체예에 있어서, 저산소 조건은 약 90% N2, 약 5% O2, 및 약 5% CO2를 포함한다. 다양한 구체예에 있어서, 포스트-활성화 배지는 기체 혼합물, 예를 들면, 약 90% N2, 약 5% O2, 및 약 5% CO2 중 1, 2, 3, 4, 5, 5, 또는 그 이상의 시간 동안, 예를 들면, 37 ℃에서 인큐베이션된, 난할 배지 중 1, 2, 3, 4, 5, 5, 또는 그 이상의 mM의 6-DMAP를 포함한다.
포스트-활성화 배지에서 인큐베이션 후에, 포스트-활성화된 난모세포는 세척 배지에서 인큐베이션된다. 상이한 구체예에 있어서, 세척 배지는 HEPES-제거 배지, 단백질-제거 배지, G1 또는 G2 배지, 난할 배지, 난할 보조 배지, IVF 배지, 배반포 형성 배지이다. 또 다른 구체예에 있어서, 배양 배지는 글로벌 인간 배아 배양 배지와 같이 연속의 배지 교환을 요구하지 않는다. 특정 구체예에 있어서, 세척 배지는 TSA를 포함한다. 특정 구체예에 있어서, 포스트-활성화된 난모세포는 TSA를 포함하는 세척 배지에서 240, 300, 또는 360분 동안 인큐베이션된다. 일 구체예에 있어서, 포스트-활성화된 재구축된 핵 이식된 난모세포는 세척되고, 추가적으로 배양된다. 일 구체예에 있어서, 포스트-활성화된 재구축된 핵 이식된 난모세포는 6-DMAP 제거 배지에서 세척된다. 다른 구체예에 있어서, 다양한 개시된 배지, 예를 들면, HEPES-제거 배지, 단백질-제거 배지, G1 또는 G2 배지, 난할 배지, 난할 보조 배지, IVF 배지, 배반포 형성 배지, 또는 글로벌 인간 배아 배양 배지는 선택적으로 성장인자, 예를 들면, GM-CSF 또는 IGF1을 포함한다. 다양한 구체예에 있어서, 성장 인자는 핵 이식 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 그 이후의 일에 첨가될 수 있다.
또 다른 구체예에 있어서, 활성화 및/또는 포스트-활성화 단계는 정자로부터 분리된 인자, 그의 파생물 및 추출물을 첨가하는 단계를 포함한다. 일 구체예에 있어서, 인간 정자 인자는 기재된 주입 방법의 어느 것을 사용하여 활성화된 재구축된 난자에 주입된다. 일 구체예에 있어서, 인간 정자 인자는 기재된 주입 방법의 어느 것을 사용하여 포스트-활성화된 재구축된 난자에 주입된다. 다양한 구체예에 있어서, 약 1, 2, 3, 또는 4일 후에, 포스트-활성화된 재구축된 핵 이식된 난모세포는 난할 배지로 옮겨진다. 특정 구체예에 있어서, 약 1일 후에, 포스트-활성화된 재구축된 핵 이식된 난모세포는 난할 배지로 옮겨진다. 다양한 구체예에 있어서, 정자 인자는 예를 들면, 정자 세포의 내부 또는 외부에 존재하는 세포 단백질로부터 분리된 인자를 포함한다. 일 구체예에 있어서, 전체 정자 추출물은 계면 활성제 및 사정된 정자의 기계적 혼합을 사용하여 수득된다. 또 다른 구체예에 있어서, 전체 세포 추출물은 DNAase I 및 RNAase로 처리된다. 또 다른 구체예에 있어서, 조추출물(crude extract)은 버퍼로 세척되고 원심분리(2시간 동안 20,000 g)된다. 다른 구체예에 있어서, 신선한 사정된 인간 정자는 수입되고, 정액 혈장을 제거하기 위해 10분 동안 900 g에서 원심 분리 된 이후, 5 mg/mL 소 혈청 알부민을 함유하는 스펌-TALP(Sperm-TALP)에서 펠렛의 재현탁 및 설정과 동시에 원심 분리된 이후, 상등액의 제거 및 핵 분리 배지(NIM: 125 mM KCl, 2.6 mM NaCl, 7.8 mM Na2HPO4, 1.4 mM KH2PO4, 3.0 mM EDTA 디소듐 염; pH 7.45)에서 최종 농도 20 X 108 sperm/mL로 펠렛의 재현탁, 및 스펌-TALP를 제거하기 위해 원심 분리된다. 스펌-TALP가 제거된 이후, 1 mM 디티오쓰레이톨(dithiothreitol), 100 mM 루펩틴(leupeptin), 100 mM 안티패인(antipain), 및 100 mg=mL 소이빈 트립신 억제제(soybean trypsin inhibitor)를 함유하는 NIM에 동일한 부피로 펠렛의 재현탁 이후에 2 ℃에서 50분 동안 20,000X에서 밀집한 정자 펠렛 형성과 함께 4 주기의 동결(액체 N2에서 각 주기당 5분), 및 해동(15℃에서 각 주기당 5분)이 뒤따른다. 최종적으로 결과 상등액은 조심스럽게 제거되고, 적정되고, 사용될 때까지 -80℃에서 유지된다.
다양한 구체예에 있어서, 포스트-활성화된 재구축된 핵 이식된 난모세포는 배반포로 더 배양된다. 일 구체예에 있어서, 포스트-활성화된 재구축된 핵 이식된 난모세포는 SAGE 난할 배지, 예를 들면, 퀸 배지(Quinn’s medium)에서 더 배양된다. 또 다른 구체예에 있어서, 배지, 예를 들면, 3i 배지 (뉴로 기본 배지(Neuro basal medium) 50%, DMEM/F-12 50%, N2 첨가물 1/200 v/v, B27 첨가물 1/100 v/v, 100 mM L-글루타민 1/100 v/v, 0.1M β-ME 1/1000 v/v, SU5402 (FGFR 억제제) 2 μM, PD184352 (ERK 캐스케이드 억제제) 0.8 μM, CHIR99021 (GSK3 억제제) 3 μM) 또는 변형된 3i 배지(PD0325901 (MAPK 억제제) 0.4 μM 포함)는 다능성을 촉진한다. 일 구체예에 있어서, 추가적인 배양은 1, 2, 3, 4, 5, 또는 5일 이상 동안이다. 일 구체예에 있어서, 부가적인 배양은 리프로그래밍 인자 및/또는 메틸화-변경제를 갖는 배양 배지에서 제공된다. 다양한 구체예에 있어서, 부가적인 배양은 CARM1 CARM1, Esrrb, Kdm4a, Kdm4b 및 Kdm4d Esrrb 중 어느 하나가 첨가된 G2 배지에서 3일 동안이다. 예를 들면, CARM1 및/또는 Esrrb는 각각 0.5, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5 또는 그 이상의 μg/ml의 배지 중 농도로 제공될 수 있다. 일부 구체예에 있어서, CARM1 및/또는 Esrrb는 각각 2 μg/ml의 배지 중 농도로 제공된다.
다양한 구체예에 있어서, 배반포로의 추가적인 배양 및 배반포로부터 다능성 줄기 세포(pSCs)의 유도는 투명대(ZP)를 제거하기 위해 배양된 배반포를 산성 티로드 용액(acidic Tyrode’s solution)으로 처리하는 단계를 포함한다. 다양한 구체예에 있어서, 처리는 몇 초(예를 들면, 1 내지 5) 동안이다. 다양한 구체예에 있어서 ZP의 제거 이후에 HEPES-HTF 배지에서의 세척이 뒤따른다. 다양한 구체예에 있어서, 내세포괴(ICM)의 분리는 배반포의 영양포(trophoblast)를 폐기하는 단계를 포함한다. 다양한 구체예에 있어서, ICM 세포는 플레이팅 하루 전에 제조된 마우스 배아 피더층(mouse embryonic feeder)(MEF)에 플레이팅된다. 일부 구체예에 있어서, 전체 배반포는 MEFs에 플레이팅된다. 예를 들면, 이 방법은 배반포의 투명대를 벗기는 단계를 포함한다. 다양한 구체예에 있어서, 상기 방법은 Hepes-HTF 배지 중 0.05, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 또는 1% 프로나아제(pronase)로 배반포의 투명대를 제거하는 단계를 포함한다. 일 구체예에 있어서, 상기 방법은 Hepes-HTF 배지 중 0.5% 프로나아제(pronase)로 배반포의 투명대를 제거하는 단계를 포함한다. 또 다른 구체예에 있어서, 상기 방법은 1 내지 10, 10 내지 20, 20 내지 30, 30 내지 60, 60 내지 120, 120 내지 180, 또는 >180 초 동안 TH3 배지(SAGE 배반포 배지) 중 프로나아제를 적용하는 단계를 포함한다. 또 다른 구체예에 있어서, 30 내지 60초 동안 HTF 배지 중 0.5% 프로나아제를 적용하는 단계를 포함한다. 일 구체예에 있어서, 배반포는 수여 난모세포로의 공여 세포 핵의 체세포 핵 이식(NT)으로부터 수득된 재구축된 핵 이식된 난모세포로부터 유래된다. 일 구체예에 있어서, 줄기 세포주는 체세포 핵 이식 인간 다능성 hPSC(human Pluripotent Stem Cell, NT-hPSC) 세포주이다.
또 다른 구체예에 있어서, 본 발명은 영양외배엽성 세포(trophectodermal cell)로부터의 내세포괴(ICM)이 기계적 확산(mechanical dispersion)하는 단계를 포함하는 면역절제술(immunosurgery)을 위한 방법을 포함한다. 다양한 구체예에 있어서, 벗겨진 배반포는 37℃에서 약 10, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 또는 60분 동안 래빗 항-인간 비장 혈청으로 처리된다. 일 구체예에 있어서, 상기 방법은 벗겨진 배반포를 TH3(SAGE 배반포 배지)로 세척하는 단계, 37℃에서 30분 동안 HECM-9(SAGE 배반포 배지)로 재구축된 기니 피그 보체에서 인큐베이션하는 단계를 포함한다. 상이한 구체예에 있어서, 확장된 배반포의 투명대는 TH3(hepes-HTF) 배지 중 0.5% 프로나아제 또는 산성 티로드 용액에의 약간의 노출(45 내지 60 초)로 제거된다. 일 구체예에 있어서, 상기 방법은 선택적으로 영양외배엽성 세포로부터 내세포괴를 분리하기 위해 작은 구경 피펫팅(small bore pipetting), Ehsms zilos-tk unit(Hamilton Thorne)을 사용한 레이저 보조 부화 방법(laser assisted hatching method)을 사용하여 세포를 기계적으로 확산하는 단계를 포함한다.
본 발명에서 바람직하게는 상기 포스트 활성화 배지는 TSA를 포함하는 배지에서 이루어지는 것이며 또한, 포스트 활성화 배지는 6-DMAP를 포함하는 것이다. 더 바람직하게는 포스트 활성화 시 6-DMAP를 포함한 배지에서 배양한 후 추가로 TSA가 포함된 배지에서 배양하는 것이다.
다양한 구체예에 있어서, 성공적인 NT 제조율을 높이기 위하여 적어도 하나의 공여세포의 핵을 후생학적 조절인자(epigenetic modifying agents)와 집촉시킴으로써 변경될 수 있다. 후생학적 조절인자는 구체적으로 특정 단백질 또는 DNA의 메틸레이션 또는 아세틸레이션의 상태를 바꿈으로써 전사의 효율을 증가시키고 결과적으로 NT 효율을 높이도록 하는 것이다. 이러한 후생학적 조절인자의 표적(target)은 히스톤 아세틸기전달효소(HAT, histone acetyl transferase) 단백질, 히스톤 탈아세틸효소(HDAC, histone deacetylase) 단백질, 라이신 디메틸라아제(KDM) 도메인 단백질, 단백질 메틸 전달효소(PMT, protein methyl transferase) 도메인 단백질 등을 포함하며, 적어도 하나 이상을 포함한다. 이들 제제는 small interfering RNA(siRNA), 저분자(small molecule), 단백질, 펩티드, 항체등을 포함하는 것이다. 이들 제제들은 리프로그래밍 저항부위(reprogramming resistant region)와 연관된 후생성 타겟에 작용하는 것이다. NT난모세포는 후생성 상태를 변경하는 제제의 존재하에 배양된다. 이들 제제들의 구체적인 예시는 아래 표 2 내지 5에 기술된다. 히스톤 아세틸기전달효소(HAT, histone acetyl transferase) 단백질, 히스톤 탈아세틸효소(HDAC, histone deacetylase) 단백질, 라이신 디메틸라아제(KDM) 도메인 단백질, 단백질 메틸 전달효소(PMT, protein methyl transferase) 도메인 단백질은 아래 예시에 제한되는 것은 아니다.
히스톤 아세틸기전달효소(HAT, histone acetyl transferase) 단백질
Target_ID (|domain #) Full name Uniprot _ID NCBI geneid
ATAT1 alpha tubulin acetyltransferase 1 Q5SQI0-1 79969
CLOCK clock homolog (mouse) O15516-1 9575
CREBBP CREB binding protein Q92793-1 1387
ELP3 elongation protein 3 homolog (S. cerevisiae) Q9H9T3-1 55140
EP300 E1A binding protein p300 Q09472-1 2033
GTF3C4 general transcription factor IIIC, polypeptide 4, 90kDa Q9UKN8-1 9329
HAT1 histone acetyltransferase 1 O14929-1 8520
KAT2A/GCN5L2 K(lysine) acetyltransferase 2A Q92830-1 2648
KAT2B/PCAF K(lysine) acetyltransferase 2B Q92831-1 8850
KAT5/TIP60 K(lysine) acetyltransferase 5 Q92993-1 10524
MYST1 K(lysine) acetyltransferase 8 Q9H7Z6-1 84148
MYST2 K(lysine) acetyltransferase 7 O95251-1 11143
MYST3 K(lysine) acetyltransferase 6A Q92794-1 7994
MYST4 K(lysine) acetyltransferase 6B Q8WYB5-1 23522
NCOA1 nuclear receptor coactivator 1 Q15788-1 8648
NCOA3 nuclear receptor coactivator 3 Q9Y6Q9-1 8202
TAF1 TAF1 RNA polymerase II, TATA box binding protein (TBP)-associated factor, 250kDa P21675-1 6872
TAF1L TAF1 RNA polymerase II, TATA box binding protein (TBP)-associated factor, 210kDa-like Q8IZX4-1 138474
히스톤 탈아세틸효소(HDAC, histone deacetylase) 단백질
Target_ID (|domain #) Full name Uniprot_ID NCBI geneid
HDAC1 histone deacetylase 1 Q13547_1 3065
HDAC10|1 histone deacetylase 10 Q969S8_1 83933
HDAC10|2 histone deacetylase 10 Q969S8_1 83933
HDAC10|1 histone deacetylase 10 Q969S8_2 83933
HDAC10 histone deacetylase 10 Q969S8_5 83933
HDAC11 histone deacetylase 11 Q96DB2_1 79885
HDAC2 histone deacetylase 2 Q92769_1 3066
HDAC3 histone deacetylase 3 O15379_1 8841
HDAC4 histone deacetylase 4 P56524_1 9759
HDAC5 histone deacetylase 5 Q9UQL6_1 10014
HDAC6|1 histone deacetylase 6 Q9UBN7_1 10013
HDAC6|2 histone deacetylase 6 Q9UBN7_1 10013
HDAC7 histone deacetylase 7 Q8WUI4_1 51564
HDAC8 histone deacetylase 8 Q9BY41_1 55869
HDAC9 histone deacetylase 9 Q9UKV0_1 9734
SIRT1 sirtuin 1 Q96EB6_1 23411
SIRT2 sirtuin 2 Q8IXJ6_1 22933
SIRT3 sirtuin 3 Q9NTG7_1 23410
SIRT4 sirtuin 4 Q9Y6E7_1 23409
SIRT5 sirtuin 5 Q9NXA8_1 23408
SIRT6 sirtuin 6 Q8N6T7_1 51548
SIRT6 sirtuin 6 Q8N6T7_2 51548
SIRT6 sirtuin 6 Q8N6T7_4 51548
SIRT7 sirtuin 7 Q9NRC8_1 51547
라이신 디메틸라아제(KDM) 도메인 단백질
Target_ID (|domain #) Full name Uniprot_ID NCBI geneid
JARID2 jumonji, AT rich interactive domain 2 Q92833_1 3720
JHDM1D jumonji C domain containing histone demethylase 1 homolog D (S. cerevisiae) Q6ZMT4_1 80853
JMJD1C jumonji domain containing 1C Q15652_1 221037
JMJD5 jumonji domain containing 5 Q8N371_1 79831
KDM1A lysine (K)-specific demethylase 1A O60341_1 23028
KDM1B lysine (K)-specific demethylase 1B Q8NB78_1 221656
KDM1B lysine (K)-specific demethylase 1B Q8NB78_2 221656
KDM2A lysine (K)-specific demethylase 2A Q9Y2K7_1 22992
KDM2B lysine (K)-specific demethylase 2B Q8NHM5_1 84678
KDM3A lysine (K)-specific demethylase 3A Q9Y4C1_1 55818
KDM3B lysine (K)-specific demethylase 3B Q7LBC6_1 51780
KDM4A lysine (K)-specific demethylase 4A O75164_1 9682
KDM4B lysine (K)-specific demethylase 4B O94953_1 23030
KDM4C lysine (K)-specific demethylase 4C Q9H3R0_1 23081
KDM4D lysine (K)-specific demethylase 4D Q6B0I6_1 55693
KDM4DL lysine (K)-specific demethylase 4D-like B2RXH2_1 390245
KDM5A lysine (K)-specific demethylase 5A P29375_1 5927
KDM5B lysine (K)-specific demethylase 5B Q9UGL1_1 10765
KDM5C lysine (K)-specific demethylase 5C P41229_1 8242
KDM5D lysine (K)-specific demethylase 5D Q9BY66_1 8284
KDM6A lysine (K)-specific demethylase 6A O15550_1 7403
KDM6B lysine (K)-specific demethylase 6B O15054_1 23135
MINA MYC induced nuclear antigen Q8IUF8_1 84864
NO66 chromosome 14 open reading frame 169 Q9H6W3_1 79697
단백질 메틸 전달효소(PMT, protein methyl transferase) 도메인 단백질
Target_ID (|domain #) Full name Uniprot_ID NCBI geneid
ASH1L ash1 (absent, small, or homeotic)-like (Drosophila) Q9NR48_1 55870
CARM1 coactivator-associated arginine methyltransferase 1 Q86X55_1 10498
DOT1L DOT1-like, histone H3 methyltransferase (S. cerevisiae) Q8TEK3_1 84444
EHMT1 euchromatic histone-lysine N-methyltransferase 1 Q9H9B1_1 79813
EHMT2 euchromatic histone-lysine N-methyltransferase 2 Q96KQ7_1 10919
EZH1 enhancer of zeste homolog 1 (Drosophila) Q92800_1 2145
EZH2 enhancer of zeste homolog 2 (Drosophila) Q15910_1 2146
EZH2 enhancer of zeste homolog 2 (Drosophila) Q15910_5 2146
MDS1 MDS1 and EVI1 complex locus Q03112_3 2122
MLL myeloid/lymphoid or mixed-lineage leukemia (trithorax homolog, Drosophila) Q03164_1 4297
MLL2 myeloid/lymphoid or mixed-lineage leukemia 2 O14686_1 8085
MLL3 myeloid/lymphoid or mixed-lineage leukemia 3 Q8NEZ4_1 58508
MLL4 - Q9UMN6_1 9757
MLL5 myeloid/lymphoid or mixed-lineage leukemia 5 (trithorax homolog, Drosophila) Q8IZD2_1 55904
NSD1 nuclear receptor binding SET domain protein 1 Q96L73_1 64324
PRDM1 PR domain containing 1, with ZNF domain O75626_1 639
PRDM10 PR domain containing 10 Q9NQV6_1 56980
PRDM11 PR domain containing 11 Q9NQV5_1 56981
PRDM12 PR domain containing 12 Q9H4Q4_1 59335
PRDM13 PR domain containing 13 Q9H4Q3_1 59336
PRDM14 PR domain containing 14 Q9GZV8_1 63978
PRDM15 PR domain containing 15 P57071_1 63977
PRDM16 PR domain containing 16 Q9HAZ2_1 63976
PRDM2 PR domain containing 2, with ZNF domain Q13029_1 7799
PRDM4 PR domain containing 4 Q9UKN5_1 11108
PRDM5 PR domain containing 5 Q9NQX1_1 11107
PRDM6 PR domain containing 6 Q9NQX0_1 93166
PRDM7 PR domain containing 7 Q9NQW5_1 11105
PRDM8 PR domain containing 8 Q9NQV8_1 56978
PRDM9 PR domain containing 9 Q9NQV7_1 56979
PRMT1 protein arginine methyltransferase 1 Q99873_1 3276
PRMT2 protein arginine methyltransferase 2 P55345_1 3275
PRMT3 protein arginine methyltransferase 3 O60678_1 10196
PRMT5 protein arginine methyltransferase 5 O14744_1 10419
PRMT6 protein arginine methyltransferase 6 Q96LA8_1 55170
PRMT7|1 protein arginine methyltransferase 7 Q9NVM4_1 54496
PRMT7|2 protein arginine methyltransferase 7 Q9NVM4_1 54496
PRMT8 protein arginine methyltransferase 8 Q9NR22_1 56341
SETD1A SET domain containing 1A O15047_1 9739
SETD1B SET domain containing 1B Q9UPS6_1 23067
SETD2 SET domain containing 2 Q9BYW2_1 29072
SETD3 SET domain containing 3 Q86TU7_1 84193
SETD4 SET domain containing 4 Q9NVD3_1 54093
SETD5 SET domain containing 5 Q9C0A6_1 55209
SETD6 SET domain containing 6 Q8TBK2_1 79918
SETD6 SET domain containing 6 Q8TBK2_2 79918
SETD7 SET domain containing (lysine methyltransferase) 7 Q8WTS6_1 80854
SETD8 SET domain containing (lysine methyltransferase) 8 Q9NQR1_1 387893
SETDB1 SET domain, bifurcated 1 Q15047_1 9869
SETDB2 SET domain, bifurcated 2 Q96T68_1 83852
SETMAR SET domain and mariner transposase fusion gene Q53H47_1 6419
SMYD1 SET and MYND domain containing 1 Q8NB12_1 150572
SMYD2 SET and MYND domain containing 2 Q9NRG4_1 56950
SMYD3 SET and MYND domain containing 3 Q9H7B4_1 64754
SMYD4 SET and MYND domain containing 4 Q8IYR2_1 114826
SMYD5 SMYD family member 5 Q6GMV2_1 10322
SUV39H1 suppressor of variegation 3-9 homolog 1 (Drosophila) O43463_1 6839
SUV39H2 suppressor of variegation 3-9 homolog 2 (Drosophila) Q9H5I1_1 79723
SUV420H1 suppressor of variegation 4-20 homolog 1 (Drosophila) Q4FZB7_1 51111
SUV420H2 suppressor of variegation 4-20 homolog 2 (Drosophila) Q86Y97_1 84787
WHSC1 Wolf-Hirschhorn syndrome candidate 1 O96028_1 7468
WHSC1L1 Wolf-Hirschhorn syndrome candidate 1-like 1 Q9BZ95_1 54904
일반적으로 메틸기 전달효소는 공동기질 유사체(co-substrate analogues)에 의해 억제될 수 있다. 다양한 종류의 메틸기 전달효소를 억제하는 공동기질 유사체로는 세가지 종류가 알려져 있다. S-adenosylmethionone(SAM)에 구조적으로 유사한 항생제 화합물인 sinefugin, 피드백 저해제로서 디메틸화된 공동기질 SAH 및 메틸티오아데노신(methylthioadenosine)이다. 라이신 메틸기 저해제로는 가장 먼저 확인된 chaetocin와 G9a(KMT1C) 저해제인 Bix-01294를 포함한다. 이들은 SUV39H1 및 PRM1에 선택적이다. Bix-01338화합물은 라이신과 아르기닌 메틸기 전달효소사이에 선택성 없이 다소 비선택적인 억제제이며, G9a에 대하여 IC50 5mM을 보이는 반면, PRMT1에 대하여는 IC50 6mM을 보였다. UNC0224는 라이신 메틸기 전달효소 G9a에 대하여 IC50 15mM을 보이는 새로운 저해제로 제시되고 있다. EPZ5676, EPZ005687 및 GSK126과 같은 히스톤 메틸기 전달효소의 억제제는 또한 다양한 암 동물모델에서 항암활성을 보여주고 있다.
단백질 아르기닌 메틸화는 PRMTs에 의하여 이루어지며, 두개의 그룹으로 분류된다. Type Ⅰ메틸기 전달효소는 비대칭적으로 치환된 아르기닌 잔기를 형성시키도록 하며, type Ⅱ 메틸기 전달효소는 대칭적으로 치환된 아르기닌 잔기를 형성시킨다. CARM1은 포롤린(proline)-글라이신(glycine)-메티오닌(methionine)-아르기닌(arginine)(소위 PGM 모티프)와 친화도(affinity)를 보여준다. PRMT5는 또한 PGM 모티프를 메틸레이트시킨다고 알려져 있다. Sinefungin과 같은 공동기질 유사체는 아르기닌 메틸기 전달효소의 억제제(또한, 아르기닌 메틸기 전달효소 억제제로서 AMIs로 알려진)로도 사용될 수 있다. AMI-1은 PRMT1에 대하여 IC50 9mM으로 가장 활성이 높은 억제제이다. Allatodapsone과 stilbamidine의 억제제들은 H4R3에서 하이포메틸화(hypomethylation)을 유도한다.
후생성 타겟(epigenetic target)의 다른 유형으로 NT효율을 높이는 방법이 있을 수 있다. DNA 메틸기 전달효소(DNA mehtyltransferases, DNMTs)는 우선적으로 DNA의 CpG뉴클레오티드 서열을 메틸레이트시킨다. 포유류에서는 DNMT1, DNMT3A 및 DNMT3 세개의 DNA 메틸기 전달효소가 확인된 바 있다. 일반적으로 이들 프로모터 부위의 메틸화는 전사인자가 DNA에 결합하는 것을 방해함으로써 유전자의 발현을 저지한다. 추가적으로 메틸화된 DNA는 메틸-CpG결합 도메인 단백질(methyl-CpG binding domain protein)에 의하여 묶여 있으며, 이들 단백질은 히스톤 모델링 효소(histone modeling enzymes)을 끌어들이게 되며, 결과적으로 크로마틴 구조를 응축시켜 유전자 발현을 억제하는 메커니즘을 유도할 수 있다. DNMT inhibitors는 유전자 발현이 억제되는 것을 저지함으로써 결과적으로 NT 효율을 증가시킬 수 있다. 예시적으로 몇 개의 화합물이 있으며, chlorogenic acid, mithramycin, azacytide, bisdemethoxycurcumim, decitabine, lomegutatrib, benzylguanine, sorafenib 및sorafenib tosylate 등이 있다.
추가로, 히스톤 탈아세틸효소(HDAC, histone deacetylase)는 히스톤의 N-아세틸 라이신 아미노산으로부터 아세틸기를 제거하는 기능을 하며, 결과적으로 더 많은 양전하를 띄게 되며 음전하를 띄는 DNA에 강하게 결합하게 된다. DNA 구조의 응축과 유전적 전사는 더 억제되게 된다. HDACs는 위치와 기능에 따라 4개의 세부그룹으로 분리될 수 있으며, Class Ⅰ HDACs(1, 2, 3, 8 아형)은 주로 핵에서 발견되며, class Ⅱ HDACs(4, 5, 6, 7, 9, 10)은 핵막을 통과하여 이동할 수 있으며 핵과 세포질 모두에서 발견된다. Type Ⅲ HDACs는 silent information regulator 2 (Sir2)로 불리며, type Ⅳ HDACs(11 아형)는 핵과 세포질 모두에서 발견되며 주로 뇌, 심장, 근세포 등에 위치한다. HDACs 억제제는 다른 화학합성약물과 병용투여되었을 때 항암활성을 가진다. HDAC inhibitors는 DN의 전사를 촉진함으로써 결과적으로 NT 효율을 증가시킬 수 있다.
포스트 활성화 배지에 후생학적 조절인자(epigenetic modifying agents), 예를 들면 후생적 크로마틴(epigenetic chromatin) 및 β 히스톤 변형제(histone modification agents), 및/또는 DNA 변경제를 포함할 수 있다. 특정 구체예에 있어서, 이것은 단백질 아르기닌 메틸-트랜스퍼라아제(PRMT1) 및 공활성화 인자-연관된 아르기닌 메틸트랜스퍼라아제 1(coactivator-associated arginine methyltransferase 1) (CARM1/PRMT4), 핵 고아 수용체 에스트로겐(orphan nuclear receptor estrogen) 관련된 수용체 β (Esrrb) 단백질 중에서 선택될 수 있으며, 또한, 라이신 특이적 디메틸라아제 4A(Lysine (K)-Specific Demethylase 4A, Kdm4a), 라이신 특이적 디메틸라아제 4B(Lysine (K)-Specific Demethylase 4B, Kdm4b) 또는 라이신 특이적 디메틸라아제 4D(Lysine (K)-Specific Demethylase 4D, Kdm4d)의 각각 RNA 또는 단백질 중에서 선택될 수 있다. 특정 구체예에 있어서, 메틸화-변경제 및/또는 DNA 변형제는 변형된 재조합 단백질로 발현된다. 예를 들면, CARM1 및 Esrrb는 7X아르기닌(7R)-세포-투과 펩티드(CPPs), 또는 통상의 기술자에게 세포막 및 핵막을 통과하여 단백질 및 펩티드의 투과를 증진시키고, DNA와의 결합 및/또는 전사활성화를 증가시키는 것으로 알려진 다른 단백질로 변형될 수 있다. 다른 구체예에 있어서, 상기 방법은 전사 인재-기반 재프로그래밍을 사용하여 옥타머 결합 전사 인자-4(octamer binding transcription factor-4)(Oct-4), 성 결정 부위 Y-박스-2(sex determining region Y-box-2)(Sox-2), nanog, 크루펠-유사 인자-4(Kruppel-like factor-4)(Klk-4), MyoD, c-Myc, 징크 파인더 단백질-42(zinc finder protein-42)(Rex-1/Zfp-42), 레프티 A(lefty A), 기형암종-유래 성장인자(teratocarcinoma-derived growth factor) (Tdgf), 및/또는 텔로머 반복 결합 인자(telomeric repeating binding factor)(Terf-1)로 핵 공여 세포를 후생적으로 재프로그래밍하는 단계를 포함한다. 다양한 구체예에 있어서, 상기 방법은 직접적인 압전기 주입, 바이러스성 주입, 리포좀성 주입, 또는 다른 방법의 세포질 내 주입을 포함한다. 다양한 구체예에 있어서, 전사 인자는 핵이 제거된 난모세포로의 핵 이식 전에 적용될 수 있는 mRNA, 단백질, 및/또는 세포 추출물의 형태로 전달될 수 있다. 다른 구체예에 있어서, 상기 방법은 HDAC 억제제(클래스 I, II, 및 III), 또는 DNMT3a 및 DNMT3b 억제제의 사용을 포함할 수 있다.
따라서, 본 발명은 바람직하게는 포스트 활성화(post activation) 배지는 후생학적 조절인자(epigenetic modifying agents)를 포함한 것이다. 더 바람직하게는 후생학적 조절인자(epigenetic modifying agents)는 히스톤 아세틸기전달효소(HAT, histone acetyl transferase) 단백질, 히스톤 탈아세틸효소(HDAC, histone deacetylase) 단백질, 라이신 디메틸라아제(KDM) 도메인 단백질, 단백질 메틸 전달효소(PMT, protein methyl transferase) 도메인 단백질 및 DNA 메틸기 전달효소(DNA mehtyltransferases, DNMTs)를 포함하는 군에서 선택되는 어느 하나 이상에 관여하는 것이다. 본 발명에서 바람직하게는 NT세포 유래 줄기세포의 제조방법은, 상기 c)단계에서 줄기세포의 제조는 NT 세포를 활성화시킨 후 배반포를 생성하는 단계; 생성된 배반포로부터 내세포집단 (ICM) 세포를 단리하는 단계; 및 분리된 내세포집단 세포를 줄기세포로 추가로 배양하는 단계를 포함하는 것이다.
본 발명의 줄기세포는 장래 사용을 위하여 냉동보존 될 수 있다. 한 실시양태에서 냉동보존제는 디메틸 설폭사이드(DMSO), 에틸렌 글리콜, 글리세롤 및 프로판디올을 포함하나 이들로 한정되지 않는 하나 이상의 냉동보호제; DMEM, MEM 및 상기 개시된 특허 배지를 포함하나 이들로 한정되지 않는 하나 이상의 배양 배지; 수크로스, 덱스트란, 혈청 대체물 및 HEPES 완충제를 포함하나 이들로 한정되지 않는 하나 이상의 추가 물질을 포함하는 용액에 줄기세포를 냉동보존한다. 한 실시양태에서, 상기 용액은 크리오스토어(CryoStor)(상표명) CS-10 배지(바이오라이프 솔루션스 인코포레이티드(BioLife Solutions Inc.), 미국 워싱톤주 보텔 소재)를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 혈청 대체물은 넉아웃(Knockout) 혈청 대체물(인비트로겐(Invitrogen) 10828-028)이다.
제조된 줄기세포의 동결보존은 세포를 조절된 속도에서 동결하거나 "수동" 과정으로 동결한다. 조절된 속도 동결 절차는 조절된 속도 동결기를 켜고 조직 또는 세포 동결을 위한 동결 프로그램을 설정함으로써 시작된다. 조절된 속도 동결기는 액체 질소를 사용하여 내부 챔버 내의 온도를 감소시킬 것이다(이로써 상기 챔버의 임의의 내용물의 온도를 감소시킬 것임). 세포에 대한 동결 프로그램은 내부 챔버를 4℃로 냉각시키고 상기 절차를 계속하도록 자극될 때까지 상기 온도를 유지함으로써 시작된다. 조절된 속도 동결기가 냉각시키는 동안, 세포는 4℃로 냉각된 냉동보존 배지에 현탁된다. 상기 세포 현탁액을 냉동바이알(cryovial) 당 1 ㎖의 양으로 냉동바이알 내로 분취한다. 그 다음, 상기 냉동바이알을 표지하고 조절된 속도 동결기 챔버 내에 넣고 프로그램이 계속되도록 자극한다. 먼저, 상기 챔버의 온도를 4℃에서 추가 10분 동안 유지한다. 다음으로, 온도가 -80℃에 도달할 때까지 상기 챔버를 -1℃/분의 속도로 냉각시킨다. 그 다음, 상기 챔버가 -120℃의 온도에 도달할 때까지 상기 챔버를 -50℃/분의 속도로 냉각시킨다. -120℃에서 5분이 경과된 후, 동결된 세포의 온도는 -120℃로 평형화될 것이다. 그 다음, 상기 동결된 세포의 냉동바이알을 장기간 저장을 위해 액체 질소 드와(Dewar)로 옮긴다.
또한, 본 발명은 a) 복수의 기증자(donation) 조직으로부터 동형접합(Homozygous) 여부를 스크리닝하는 단계;
b) 동형접합(Homozygous) 세포로부터 핵을 분리하여 NT 세포로 제조하는 단계; 및
c) 제조된 NT 세포로부터 줄기세포를 생성하는 단계;를 포함하는 면역적합형 NT 세포 유래 줄기세포의 제조방법을 제공한다.
바람직하게는 a)단계에서 스크리닝은 HLA(human leukocyte antigen)-A, HLA-B 및 HLA-DR의 유전자가 동형접합(homozygous)인 것이며, b) 단계에서 NT 제조는 난모세포를 탈핵하는 단계; 탈핵된 난모세포에 체세포의 핵을 융합시키는 단계; 융합된 난모세포를 포스트 활성화(post activation) 배지에 배양하는 단계로 이루어지는 것이며, 더 바람직하게는 상기 난모세포의 탈핵은 단백질 인산가수분해효소 저해제(protein phosphatase inhibitor)을 포함하는 배지에서 이루어지는 것이다. 또한, 상기 체세포의 핵을 융합키는 단계는 센다이바이러스 또는 센다이 바이러스 추출물을 포함하는 배지에서 이루어지는 것이며, 상기 포스트 활성화 배지는 히스톤 탈아세틸효소 억제제(distone deacetylase inhibitor)를 포함하는 것이 바람직하며, 그 중 TSA를 포함하는 것이 더 바림직하다. 상기 포스트 활성화(post activation) 배지는 후생학적 조절인자(epigenetic modifying agents)를 포함하는 것이 바람직하며, 더 바람직하게는 상기 후생학적 조절인자(epigenetic modifying agents)는 히스톤 아세틸기전달효소(HAT, histone acetyl transferase) 단백질, 히스톤 탈아세틸효소(HDAC, histone deacetylase) 단백질, 라이신 디메틸라아제(KDM) 도메인 단백질, 단백질 메틸 전달효소(PMT, protein methyl transferase) 도메인 단백질 를 포함하는 군에서 선택되는 어느 하나 이상에 관여하는 것이다.
또한, 본 발명은 a) 복수의 기증자(donation) 조직으로부터 동형접합(Homozygous) 여부를 스크리닝하는 단계;
b) 동형접합(Homozygous) 세포로부터 핵을 분리하여 NT 세포로 제조하는 단계;
c) 제조된 NT 세포로부터 줄기세포를 생성하는 단계; 및
d) 상기 제조된 줄기세포로부터 세포 이식을 위한 분화된 세포로 제조하는 단계;를 포함하는 면역적합형 NT 세포 유래 줄기세포로부터 분화된 세포의 제조방법을 제공한다.
상기 c)단계 이후 선택적으로 줄기세포는 동결보존 되는 단계가 추가될 수 있으며, 이 경우 d)단계 이전에 동결보존 된 세포를 해동하는 단계가 선택적으로 추가될 수 있다.
분화된 세포는 줄기세포로부터 조혈모세포, 근육 세포, 심근 세포, 간 세포, 연골 세포, 상피 세포, 비뇨기관 세포, 지방세포, 신장세포, 혈관세포, 망막세포, 중간엽 줄기세포(MSC) 및 뉴런 세포 등 제한 없으며, 이들로 이루어진 군으로부터 어느 하나 이상의 세포로 분화된 것이며 제한없이 세포 이식을 통한 치료제로 사용될 수 있는 모든 세포를 의미한다. 동결보존된 세포 뱅킹으로부터 이종 환자의 HLA 스크리닝을 통한 면역접합한 세포를 선별하는 단계가 추가될 수 있다. 면역접합성은 이식재료로서 재생 치료의 최적의 공급가능성을 높임으로써 뱅킹이 가능하도록 하는 것이다. 이러한 뱅킹시스템은 자가(autologous) 세포를 이용한 NT 제조를 대체함으로써 신규 난모세포의 지속적 공급을 감소시킬 수 있으며, 폭넓은 자가 또는 이종간의 세포이식을 가능하도록 하는 것이다. 특히, 이들 뱅킹시스템으로부터 이종간의 세포이식을 위한 선별단계 및 선별된 줄기세포로부터 특정 분화된 세포로 제조하는 단계는 더욱 더 다양한 세포치료제로서의 사용범위를 확대하는 것이다. 기존에 사용되고 있는 세포이식 치료분야에 다양하게 접목이 가능하며, 구체적으로 혈관 내피세포로 분화를 통환 혈관관련 질환, 망막색소상피세포(retinal pigment epithelial cell)로 분화를 통한 망막관련 질환, 및 신경세포로 분화를 통한 퇴행성 신경 질환 등 치료분야는 한정되지 않을 것이다.
또한, 본 발명은 상기 면역적합형 NT 세포 유래 줄기세포의 제조방법으로 제조된 면역 적합형 줄기세포를 포함하는 세포집단을 제공하는 것이다. 본 발명은 또한, 여러 종류의 질환의 치료를 위한 NT 세포 유래 줄기세포의 세포집단을 포함하는 조성물을 제공한다.
본 발명의 조성물 총 중량에 대하여 본 발명의 세포 조성물은 0.1 내지 99.9 중량%를 유효성분으로 함유하고, 약제학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물은 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한, 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용된다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제 및 현탁용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
상기 약학적으로 유효한 양이란 0.0001 내지 100 mg/kg이고, 0.001 내지 10 mg/kg이며, 이에 한정되는 것은 아니다. 투여량은 특정 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여기간, 투여방법, 제거율, 질환의 중증도 등에 따라 변화될 수 있다.
상기 조성물은 임상 투여 시에 경구 또는 비경구로 투여가 가능하며 비경구 투여시 복강내주사, 직장내주사, 피하주사, 정맥주사, 근육내주사, 자궁내 경막주사, 뇌혈관내 주사 또는 흉부내 주사에 의해 투여될 수 있고, 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물은 단독으로, 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.
또한, 본 발명은 복수의 기증자 조직을 수집하는 수단,
상기 수집된 조직으로부터 면역적합형 여부를 스크리닝 하는 수단,
면역 적합형 조직으로부터 줄기세포를 제조하는 수단, 및
줄기세포를 냉동보존하는 수단;을 포함하는 면역적합형 NT 세포 유래 줄기세포 뱅킹 시스템을 제공한다.
본 발명은 개인의 다수 기증자로부터 얻어지는 NT 세포 유래 줄기세포를 저장하는 줄기세포 뱅크를 제공한다. 저장된 줄기세포는 건강상의 이유로 개인의 생체의 특정 세포집단을 회복하거나 다른 개인의 치료 또는 임상적으로 사용하기 위한 세포의 공급원으로 사용될 수 있다. 저장된 줄기세포는 연구응용에도 사용될 수 있다. 저장된 줄기세포는 장기 보존된 후 해동되어 줄기세포로 사용되거나 특정 세포로 분화된 후 이용 또는 환자에 투여될 수 있다.
이하, 발명의 구체적인 실시예를 통해, 발명의 작용 및 효과를 보다 상세하게 설명하기로 한다. 다만, 이러한 실시예는 발명의 예시로 제시된 것에 불과하며, 이에 의해 발명의 권리범위가 정해지는 것은 아니다.
[실시예 1]
기증자 세포로부터 동형접합(Homozygous) 세포의 스크리닝 및 공여세포의 선별
차병원 기증 제대혈은행에서 7억개 미만의 폐기용 제대혈에 대하여 동형접합(homozygous) 세포를 스크리닝 했다. HLA-A, B, DRB1 genotyping을 위해 Gentra PuregeneTM Blood Kits (QIAGEN, Hilden, Germany)을 사용하여 genomic DNA를 추출한 뒤 SeCore A, B and DRB1 Locus Sequencing Kit (Invitrogen, Brown Deer, WI, USA)를 사용하여 Sequence-based typing을 실시했다. 특히 HLA-A와 B의 경우 exon 2-4, HLA-DRB1의 경우 exon 2를 키트(kit)에 포함되어져 있는 locus specific primer를 사용하여 증폭시켰으며, ABI3130XL Genetic Analyzer (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)를 이용하여 형성된 PCR product에 대한 시퀀싱(sequencing)을 수행했고, HLA SBT u-type software v3.0 (Invitrogen) 및 Sequencher (Gene Codes Corp., Ann Arbor, MI, USA)을 사용하여 데이터분석을 실시했다. 결국 이와 같은 방법을 통해 기증제대혈로부터 한국인에게 가장 빈도수가 높은 HLA 동형접합(homozygous) 공여세포 (A*33:03-B*44:03-DRB1*13:02) (haplotype frequency: 4.6%)를 발견했으며, 만일 이로부터 NT-세포를 제작할 경우 전체 인구의 약 9%를 포괄할 수 있다.
상기 스크리닝한 결과로부터 HLA A-B-DRB1 haplotype의 조혈세포(hemapoietic cell)를 공여세포로 선별하여 세포 배양 플라스크에 5% CO2, 37℃ 조건하에 배양하였다. 10% DMSO, 30% FBS가 포함된 DMEM 배양액을 동결액으로 사용하여 cryo vial에 담아 동결하여 사용 시까지 액체질소 탱크에 보관한다. 이들 세포는 염색체 검사를 시행한다(도 2). 세포들은 NT 전에 해동시키고 4 웰 디쉬들에 confluency하게 배양하고 이들 세포는 0.5% FBS DMEM/F12 배지에 2일간 배양하면서 G0/G1단계로 동기화하였다.
[실시예 2]
2. 1 난모세포의 회수 및 제조
CHARMI(CHA Regenerative Medicine Institute)의 SCRO(Stem cell Research Oversight) 위원회 및 EIRB(Essex Institutional Review Board) 승인 하에 진행되었다.
웹(web) 기반의 광고를 통하여 20-32세 여성들을 모집하였으며, ASRM(American Society for Reproductive Medicine) 가이드라인에 따라 상기 여성들의 생식학적, 의학적 및 정신학적인 건강상태를 검사하였다. 상기 검사에 따라 의학 및 정신학적인 검사를 모두 통과한 BMI <28 Kg/m2의 여성들을 대상으로 진행하였다.
난소 자극(Ovarian stimulation)은 정립된 임상 IVF 가이드라인에 따라 수행하였다 (Tachibana et al., 2013). 상기 여성들에게 루프론(Lupron) 또는 hCG 주입 후 36시간 Midazolam 5-7.5 mg (Versed, Roche, 및 Nutley. N.J., USA) 및 Fentanyl 50-75 ug (Abbott Pharmaceutical, Abbott Park, Ill. USA)로 진정시키고 난모세포를 그 후 이전에 기재된 초음파 지도를 사용해 회수하였다. IVF 배지 (Quinn's IVF 배지, SAGE Biopharma, Bedminster, N.J.) 중 신선하게-단리된 난구-난모세포 복합체 (cumulus-oocyte cell complexs: COCs)를 모아 10% 혈청대용물(SSS; Quinns Advantage Serum, Cooper Surgical)이 보충된 HTF-Hepes 배지(Global Medium)에 37℃ 조건하에 두었다. COCs를 히알루로니아제 (100 IU/ml, Sigma, St. Louis, Mo. USA)로 처리한 후 성숙정도에 따라 난모세포를 분류 한후 중기 II (MII) 시기의 난모세포를 NT를 위해 사용하였다.
2.2 난모세포의 탈핵, 체세포의 핵치환 및 활성화
난모세포의 탈핵은 이전에 공지된 방법으로 수행될 수 있으며 (Tachibana et al., 2013), 난모세포의 탈핵 및 체세포의 핵치환은 스테이지 워머(stage warmer), 나리시게 마이크로마니퓰레이터(narishige micromanipulator), OosightTM 이미징 시스템 (poloscopic microscopy), 및 레이저를 갖춘 도립현미경(inverted microscope)을 사용하여 수행하였다. 레이저를 갖춘 도립현미경 대신에 피에조를 갖춘 도립현미경이 선택적으로 사용될 수 있다.
상기 난모세포를 사이토카라신 B(5 ㎍/ml) 및 카페인(1.25mM)를 포함한 HTF-Hepes 배지(Global Medium)의 드로플렛(droplet)에 위치시킨 후 상기 드로플렛을 조직배양(tissue culture) 오일로 덮어 37 ℃ 조건 하에 10 내지 15분 정도 두었다. 카페인은 단백질 인산가수분해효소 저해제로서 이른 활성화(premature activation)를 억제하여 복제배아의 성장을 개선시킴으로써 결과적으로 배반포의 형성율을 증가시킨다. 이후 방추사(spindle)가 2 내지 4시 방향에 가깝게 위치하도록 홀딩 피펫으로 난모세포를 고정시킨 후, 방추사 옆에 있는 투명대(zona pellucida)를 레이저 펄스로 뚫었으며, 뚫린 부분을 통해 주입 피펫을 넣었다. 상기 주입 피펫으로 원형질막(plasma membrane)로 둘러싸인 적은 양의 세포질과 접촉된 방추사를 흡입시켰다. 상기 투명대는 레이저 펄스 대신에 피에조 펄스가 선택적으로 이용될 수 있다.
이후, 공여세포를 마이크로 피펫에 흡입시켜 센다이 바이러스 외피 단백질(HJV-E extract, Isihara Sangyo Kaisha)를 포함하는 작은 드랍(drop)으로 옮겨 놓았다. 그리고는 상기 실시예 1의 핵 공여세포를 제1극체 반대편에 위치한 난황주위 공간(perivitelline space)에 삽입하였다.
이렇게 융합이 확인되면, 제조된 난자는 추가로 Global 10% SPS 배지에 30분 또는 2시간 동안 배양하였다.
활성화(activation)는 0.1 mM 아세트산칼륨, 0.5 mM 아세트산마그네슘, 0.5 mM HEPES, 1mg/ml 지방산이 없는 BSA(fatty-acid-free BSA)를 포함하는 0.25mM 디-소르비톨(d-sorbitol) 버퍼 하에서 전기자극(electrical pulse)(2X 50μs DC pulses, 2.7 kV/cm)을 가하여 수행하였다. 활성화된 세포는 5% CO2, 37℃ 조건 하에 2 mM DMAP를 포함하는 Global Medium(혈청 제외)에서 4시간 배양하였고, 5% CO2, 5% O2, 90% N2, 37℃ 조건 하에 10% FBS, 12 μM BME(β-mercaptoethanol), CARM(2 μg/ml) 및 10 nM TSA(Trichostatin A)가 보충된 Global Medium에서 12시간 배양하였다. 이후 전핵 형성(pronuclear formation)을 확인하였고, 5% CO2, 5% O2, 90% N2, 37℃ 조건 하에, TSA가 없고 10% FBS 및 12 μM BME이 보충된 Global Medium에서 최대 7일간 배양하였다. 이후 4세포기 시기에 마이크로 인젝션 시스템(micro injection system)을 사용하여 CARM mRNA를 할구에 주입한다. CARM 대신에 선택적으로 HDAC1, SIRT2 또는 KDM4D가 첨가될 수 있다.
[실시예 3]
NT세포로부터 stem cell line의 제조 및 특성 분석
상기 실시예 2에서 배양된 배반포를 산성 Tyrode 용액 (pH 2.0)으로 수 초간 처리하여 투명대(ZP)를 제거하였다. ZP의 제거 후, 배아를 Hepes-HTF 배지에서 힘차게(vigorously) 세척하여 미량의 Tyrode 용액까지도 제거하였다. 레이저-보조 배반포 절제 시스템(Hamilton-Thorne Inc.)을 이용하여 내세포괴(ICM)을 분리하고 배반포의 잔여 부분(영양막)을 폐기하여 배반포가 더 이상 온전하지 않다는 것을 확인하였다. 플레이팅 1일 전 준비된 MEF 위에 ICM을 플레이팅하고, 그러나, 복제된 배반포가 구별할 수 없는 ICM을 가질 경우 전체 배아를 플레이팅하였다. hPSC 유도 배지는 혈청 대체물(serum replacement) (5% SR, Invitrogen), FBS (10%, Hyclone), plasmamate (5%), bFGF (32 ng/ml), 및 human LIF (2000 units/mI, Sigma-Aldrich)가 보충된 넉아웃- DMEM를 포함하였다. 동일 배지에서 3일 동안 변화 없이 ICM을 배양한 후, 4일차에 배지의 약 1/3을 교체하였다. 6일차부터 격일로 배지의 ½을 교체하였다. 플레이팅 후 7일 이내에 최초 성장(outgrowth)이 확인되었다.
ESC형 형상을 갖는 콜로니들을 추가적인 증식을 위해 선택, 특성화 및 세포유전학적 분석을 수행하였다. 그리고, 12일차 이전에 콜로니를 확장하고 동결보존하였다. 세포의 특성분석은 염색체 검사(karyotype, G-banding), DNA 지문검사 및 mitochondrial DNA 유전자형 검사를 시행하였다. 그 결과는 각각 도 3 및 도4에서 보여준다. 세포의 전분화능 줄기세포 마커의 발현을 확인하기 위하여 AP staining 으로 알카라인 포스파타제(alkaline phosphatase)활성을 확인하고 immunocytochemistry 로 Oct4, SSEA-4, TRA 1-60, TRA 1-81을 분석하였으며, RT-PCR로 Oct4, Nanog, Sox-2 마커의 발현을 분석하였다. 그 결과는 도 5 및 6에서 보여준다. 이들 결과로부터 도출된 세포가 줄기세포임을 확인하였다. 추가로 삼배엽성 (3 germ layers) 유래 세포로 분화할 수 잇는 전분화능을 확인하기위하여, 체외에서 배아체 (EB)를 형성하여 배양 후 Immunochemistry 및 RT-PCR를 통하여 삼배엽 유래 분화 마커의 발현을 확인하였다(도 7(a) 및 (b)). 체내에서 전분화능 확인을 위하여 면역결핍생쥐의 정소 도는 피하에 줄기세포를 주입하여 테라토마(teratoma) 형성을 유도한 후 조직학적으로 H-E 및 special staining을 통하여 분화능을 확인하였다. 결과는 도7 (c)에 나타내었다.
[실시예 4]
NT 세포 동결보존 및 뱅킹
실시예 3에서 제조된 세포를 동형접합성 세포에 따라 분류되어 보관되고 문서 또는 프로그램에 기록되도록 하는 것이다. 특히 세포 공여체의 정보가 같이 저장되도록 한다. 추후 동종(autologous) 또는 이종(allogenic) 수여자(환자)에 직접적으로 이용될 수 있거나 또는 분화된 세포로 이용될 수 있도록 저장된다.
[ 실시예 5]
NT 유래 줄기세포로부터 기능성 망막색소상피세포 (RPE)로의 분화
RPE로의 분화를 유도하기 위하여 미분화상태의 NT 유래 줄기세포를 해부현미경 하에서 멸균된 팁을 사용하여 기계적으로 여러 조각(clump-form of NT-ES cells; 한 조각은 약 300~600개의 미분화상태의 배아줄기세포주)으로 자른다. Clump 형태의 NT 유래 줄기세포는 low attachment 6-well plates (Corning, CA, USA)에 담아 배아체 배양액 (EBDM; knockoutTM DMEM (Thermo Scientific, CA, USA) supplemented with 15% (v/v) knockoutTM serum replacement (Thermo), 1% (v/v) glutamax (Thermo), 1% (v/v) NEAA (Thermo), 1% (v/v) penicillin-streptomycin (Thermo) and 0.1mM β-mercaptoethanol (Thermo)) 에서 부유상태로 4일간 배양한다. 배양된 배아체는 배양접시에 옮겨져 부착된 상태로 RPE 분화를 유도한다.
NT 유래 줄기세포로부터 분화된 망막색소상피세포의 분리
배아체는 0.1% 젤라틴 코팅이 된 6-well 배양접시에 옮겨 부착이 되도록 3일간 배양기안에 정치시킨 후 2~3일 간격으로 EBDM 배양액을 교체해주면서 배아체에서 뻗어나와서 자라는 세포들 중에서 망막색소상피세포가 나타날 때까지 약 50~55일간 배양하였다. 색소침착으로 색깔이 구분되는 RPE cell 들을 분리하기 위하여, 세포들은 생리식염수 (DPBS containing Ca2 +Mg2 + (Thermo))로 2회 세척 후 콜라게나아제 타입4가 포함된 생리식염수 (Type IV collagenase (Thermo) in DPBS with Ca2+Mg2+ (Thermo))로 교체하여 2시간 동안 37 ℃, 5% CO2 가 유지되는 배양기에서 배양하였다. 효소를 제거하기 위하여, 배양접시에서 떨어져 나온 세포 덩어리들 (detached cell clusters)을 50ml 튜브에 모아 원심분리기(1500 rpm, 5분)를 이용하여 DMEM-FBS 배양액으로 2회 세척하였다. 세포 덩어리들은 60mm 페트리접시에 옮긴 후, 해부현미경 하에서 가늘게 뽑은 유리 피펫을 이용하여 망막색소상피세포 덩어리들(pigmented cell clusters)을 색소가 침착되지 않은 다른 세포덩어리들과 구분하여 수집하였다.
NT 유래 줄기세포로부터 분화된 망막색소상피세포의 성숙 및 증식
망막색소상피세포 덩어리들(pigmented cell clusters)은 단일세포로 분리하여 배양하기 위하여 칼슘과 마그네슘이 제거된 생리식염수 (DPBS without Ca2 +Mg2 + (Thermo))로 2회 세척 후 분리효소액 (1 : 1 mixture of 0.25% Trypsin-EDTA (Thermo) and Cell Dissociation Buffer (Thermo))을 처리하여 분리하였다. 단일세포로 분리된 망막색소상피세포는 원심분리기(1500 rpm, 5분)를 이용하여 DMEM-FBS 배양액으로 세척 한 후, EGM2 배양액(Lonza, PA, USA)으로 세포들을 풀어 200,000 세포/4well 배양접시 1개 well 의 농도로 0.1% 젤라틴 코팅된 4well 배양접시에 넣어 꽉 찰 때까지 EGM-2배양액에서 배양하였다. 약 3~4일 후 배양접시에 세포들이 차면 망막색소상피세포의 형태와 특성 (cobble stone morphology and pigmentation)을 보이도록 RPE 분화배양액 (RGMM; 1:1 mixture of EBDM and DMEM-FBS media)으로 배양액을 교체하여 7일간 배양하였다.
NT 유래 줄기세포로부터 분화된 망막색소상피세포들은 위와 동일한 분리효소액을 이용하여 계대 배양을 하고, EGM2 배양액을 이용한 증식과정과 RGMM 배양액을 이용한 숙성과정을 거쳐 기능성 망막색소상피세포들을 확보하였다. 2계대와 3계대에서 얻어진 망막색소상피세포 일부는 동결액 (90% (v/v) FBS (Thermo) and 10% (v/v) DMSO (Sigma))을 이용하여 2 million cells/mL/cryo vial 의 농도로 동결하여 사용시까지 보관하고 일부는 망막색소상피세포 특성분석을 수행하였다. 도 8은 배아줄기세포 유래 RPE세포와 상기 실시예 3에서 제조된 NT 유래 줄기세포의 RPE세포의 형태와 분화마커에 차이가 없음을 보여주는 것이다(도 8의 (a), (b)).
이하 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

Claims (22)

  1. a) 복수의 기증자(donation) 조직으로부터 동형접합(Homozygous) 여부를 스크리닝하는 단계;
    b) 동형접합(Homozygous) 세포로부터 핵을 분리하여 NT 세포로 제조하는 단계;
    c) 제조된 NT 세포로부터 줄기세포를 생성하는 단계; 및
    d) 복수개의 줄기세포들을 냉동보존하는 단계를 포함하는 면역 적합형 NT 세포 유래 줄기세포의 보관 방법.
  2. 제 1항에 있어서, a)단계에서 스크리닝은 HLA(human leukocyte antigen)-A, HLA-B 및 HLA-DR의 유전자가 동형접합(homozygous)인 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 1항에 있어서, b) 단계에서 NT 제조는 난모세포를 탈핵하는 단계; 탈핵된 난모세포에 체세포의 핵을 융합시키는 단계; 및 융합된 난모세포를 포스트 활성화(post activation) 배지에 배양하는 단계로 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 난모세포의 탈핵은 단백질 인산가수분해효소 저해제(protein phosphatase inhibitor)을 포함하는 배지에서 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제3항에 있어서, 상기 체세포의 핵을 융합키는 단계는 센다이바이러스 또는 센다이 바이러스 추출물을 포함하는 배지에서 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제3항에 있어서, 상기 포스트 활성화 배지는 히스톤 디아세틸라아제 저해제를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제3항에 있어서, 상기 포스트 활성화(post activation) 배지는 후생학적 조절인자(epigenetic modifying agents)를 포함한 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 후생학적 조절인자(epigenetic modifying agents)는 히스톤 아세틸기전달효소(HAT, histone acetyl transferase) 단백질, 히스톤 탈아세틸효소(HDAC, histone deacetylase) 단백질, 라이신 디메틸라아제(KDM) 도메인 단백질 및 단백질 메틸 전달효소(PMT, protein methyl transferase) 도메인 단백질을 포함하는 군에서 선택되는 어느 하나 이상에 관여하는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 1항에 있어서, 상기 c)단계에서 줄기세포의 제조는 NT 세포를 활성화시킨 후 배반포를 생성하는 단계; 생성된 배반포로부터 내세포집단 (ICM) 세포를 단리하는 단계; 및 분리된 내세포집단 세포를 줄기세포로 추가로 배양하는 단계로 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. a) 복수의 기증자(donation) 조직으로부터 동형접합(Homozygous) 여부를 스크리닝하는 단계;
    b) 동형접합(Homozygous) 세포로부터 핵을 분리하여 NT 세포로 제조하는 단계; 및
    c) 제조된 NT 세포로부터 줄기세포를 생성하는 단계;를 포함하는 면역 적합형 NT 세포유래 줄기세포의 제조방법.
  11. 제10항에 있어서, a)단계에서 스크리닝은 HLA(human leukocyte antigen)-A, HLA-B 및 HLA-DR의 유전자가 동형접합(homozygous)인 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제10항에 있어서, b) 단계에서 NT 제조는 난모세포를 탈핵하는 단계; 탈핵된 난모세포에 체세포의 핵을 융합시키는 단계; 및 융합된 난모세포를 포스트 활성화(post activation) 배지에 배양하는 단계로 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 난모세포의 탈핵은 단백질 인산가수분해효소 저해제(protein phosphatase inhibitor)을 포함하는 배지에서 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제12항에 있어서, 상기 체세포의 핵을 융합키는 것은 센다이바이러스 또는 센다이 바이러스 추출물을 포함하는 배지에서 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제12항에 있어서, 상기 포스트 활성화 배지는 TSA를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제12항에 있어서, 상기 포스트 활성화(post activation) 배지는 후생학적 조절인자(epigenetic modifying agents)를 포함한 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제13항에 있어서, 상기 후생학적 조절인자(epigenetic modifying agents)는 히스톤 아세틸기전달효소(HAT, histone acetyl transferase) 단백질, 히스톤 탈아세틸효소(HDAC, histone deacetylase) 단백질, 라이신 디메틸라아제(KDM) 도메인 단백질, 및 단백질 메틸 전달효소(PMT, protein methyl transferase) 도메인 단백질을 포함하는 군에서 선택되는 어느 하나 이상에 관여하는 것을 특징으로 하는 방법.
  18. a) 복수의 기증자(donation) 조직으로부터 동형접합(Homozygous) 여부를 스크리닝하는 단계;
    b) 동형접합(Homozygous) 세포로부터 핵을 분리하여 NT 세포로 제조하는 단계;
    c) 제조된 NT 세포로부터 줄기세포를 생성하는 단계; 및
    d) 상기 제조된 줄기세포로부터 세포 이식을 위한 분화된 세포로 제조하는 단계;를 포함하는 면역 적합형 NT 세포 유래 줄기세포로부터 분화된 세포의 제조방법.
  19. 제18항에 있어서, 상기 c)단계 이후 줄기세포는 동결보존되는 단계 및 동결보존된 세포를 해동하는 단계가 추가되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  20. 제18항에 있어서, d)단계의 분화된 세포는 조혈모세포, 근육 세포, 심근 세포, 간 세포, 연골 세포, 상피 세포, 비뇨기관 세포, 지방세포, 신장세포, 혈관세포, 망막세포, 중간엽 줄기세포(MSC) 및 뉴런 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 제조방법.
  21. 제1항의 방법으로 제조된 면역 적합형 줄기세포를 포함하는 세포집단.
  22. 복수의 기증자 조직을 수집하는 수단,
    상기 수집된 조직으로부터 면역적합형 여부를 스크리닝 하는 수단,
    면역 적합형 조직으로부터 줄기세포를 제조하는 수단, 및
    줄기세포를 냉동보존하는 수단;을 포함하는 면역적합형 NT 세포 유래 줄기세포 뱅킹 시스템.
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