WO2017039311A1 - 아데노바이러스 단백질 vi 유래 펩티드를 포함하는 세포 내 전달용 조성물 및 이를 포함하는 항암용 약제학적 조성물 - Google Patents

아데노바이러스 단백질 vi 유래 펩티드를 포함하는 세포 내 전달용 조성물 및 이를 포함하는 항암용 약제학적 조성물 Download PDF

Info

Publication number
WO2017039311A1
WO2017039311A1 PCT/KR2016/009714 KR2016009714W WO2017039311A1 WO 2017039311 A1 WO2017039311 A1 WO 2017039311A1 KR 2016009714 W KR2016009714 W KR 2016009714W WO 2017039311 A1 WO2017039311 A1 WO 2017039311A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
cancer
peptide
pdna
composition
intracellular delivery
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/KR2016/009714
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
윤채옥
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Industry University Cooperation Foundation IUCF HYU
Original Assignee
Industry University Cooperation Foundation IUCF HYU
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Industry University Cooperation Foundation IUCF HYU filed Critical Industry University Cooperation Foundation IUCF HYU
Priority to EP16842277.2A priority Critical patent/EP3335722B1/en
Priority to CN201680057299.1A priority patent/CN108135966B/zh
Priority to US15/756,058 priority patent/US10722587B2/en
Publication of WO2017039311A1 publication Critical patent/WO2017039311A1/ko
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/10—Peptides having 12 to 20 amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/76—Viruses; Subviral particles; Bacteriophages
    • A61K35/761—Adenovirus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10033—Use of viral protein as therapeutic agent other than vaccine, e.g. apoptosis inducing or anti-inflammatory

Definitions

  • the present invention relates to a composition for intracellular delivery comprising adenovirus protein VI-derived peptide and an anticancer pharmaceutical composition comprising the same.
  • adenovirus In the case of adenovirus, the use of cancer gene therapy has steadily increased due to various advantages as a gene transfer vector, and is used most frequently in clinical trials conducted on patients.
  • tumor killing adenovirus which can selectively proliferate only in cancer cells and kill only cancer cells, has a therapeutic effect on primary infected cells, and the proliferated virus infects the surrounding tumor cells in a secondary and tertiary chain and prevents cancer cells. By killing, the therapeutic effect can continue to spread like the domino phenomenon, and the cancer therapeutic effect can be significantly increased.
  • the expression of the therapeutic gene is limited to high efficiency only in cancer cells, and thus, there is an advantage of synergistically improving the therapeutic effect.
  • the proliferation of tumor killing adenovirus is suppressed in the surrounding normal cells, cell killing does not occur, and thus the safety is high.
  • the virus-based gene therapy has a small amount of virus removed by the immune cells in the blood so that it can be delivered to the target tumor tissue, and the amount of liver can accumulate and cause hepatotoxicity. have.
  • repeated administration to form a high concentration of neutralizing antibody has the disadvantage that the therapeutic effect by repeated administration is significantly reduced.
  • all currently oncogenic adenoviruses currently being developed are treated with cancer by topical administration. Therefore, there is a need for the development of new innovative methods that can be administered systemically and efficiently deliver adenovirus to target tumor cells.
  • the present inventors have tried to develop a composition or method that can deliver the DNA or virus of the virus into tumor cells more efficiently to exhibit a tumor killing effect.
  • the present inventors improved viral DNA or viral transduction efficiency when delivering viral DNA or virus into tumor cells using adenovirus protein VI-derived peptide or complex of the peptide-polymer, and excellent anti-cancer treatment.
  • This invention was completed by confirming that an effect is shown.
  • composition comprising a peptide of SEQ ID NO: 1, a modified peptide of SEQ ID NO: 1, or a dimer thereof for efficiently delivering a bioactive modulator into a cell.
  • Another object of the present invention is to provide the use of a peptide of SEQ ID NO: 1, a modified peptide of SEQ ID NO: 1, or a dimer thereof for intracellular delivery of a bioactive modulator.
  • Still another object of the present invention is to provide a delivery method using a peptide of SEQ ID NO: 1, a modified peptide of SEQ ID NO: 1, or a dimer thereof for efficiently delivering a bioactive modulator into a cell.
  • Still another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for anticancer comprising the composition and viral DNA or virus, its use for treating cancer, and a method for treating cancer comprising administering the composition to a subject.
  • composition for intracellular delivery of a biologically active substance comprising a peptide of SEQ ID NO: 1, wherein the biologically active substance is a nucleic acid, a peptide, a polypeptide, an antibody, a chemical, and It may be any one selected from the group consisting of viruses:
  • composition for intracellular delivery comprising a peptide further linked to a positively charged amino acid at the N-terminus or C-terminus of the peptide of SEQ ID NO: 1.
  • the positively charged amino acid is arginine (Arg) or lysine (Lys).
  • composition for intracellular delivery comprising a peptide further linked to a hydrophobic amino acid at the N-terminus or C-terminus of the peptide of SEQ ID NO: 1.
  • the hydrophobic amino acid is alanine (Ala) or phenylalanine (Phe), more specifically alanine-phenylalanine is linked to the N-terminus of the peptide of SEQ ID NO: 1.
  • composition for intracellular delivery of a physiologically-modulating substance comprising a dimer of a peptide of SEQ ID NO: 1 or a modified peptide of SEQ ID NO: 1 as described above.
  • intracellular delivery of a bioactive modulator comprising a peptide of SEQ ID NO: 1, a modified peptide of SEQ ID NO: 1 as described above, or a dimer and biocompatible polymer thereof It provides a composition for.
  • the biocompatible polymer comprises (i) escapable portions from immune reactions, (ii) chargable portions and (iii) disulfide bonds. It is characterized in that the polymer comprising a bioreducible portion (bioreducible portion) comprising.
  • the escapable portion from immune reactions is polyethylene glycol (PEG), polyalkylene oxide [eg, polyoxyethylene, polyoxypropylene or copolymers thereof (eg, , Polyethylene oxide-polypropylene oxide-polyethylene oxide copolymer)], polyphenylene oxide, copolymer of PEG and polyalkylene oxide, poly (methoxyethyl methacrylate), poly (methacryloyl phosphatidylcholine), perfluoro It is characterized in that it is any one selected from a polyether, dextran or polyvinylpyrrolidone.
  • PEG polyethylene glycol
  • polyalkylene oxide eg, polyoxyethylene, polyoxypropylene or copolymers thereof (eg, , Polyethylene oxide-polypropylene oxide-polyethylene oxide copolymer)]
  • polyphenylene oxide copolymer of PEG and polyalkylene oxide
  • a process for the preparation of (a) (i) a peptide of SEQ ID NO: 1 or a modified peptide thereof, the peptide or a dimer thereof, and a biocompatible polymer, liposome, naosome, and nano Any one or more substances selected from the group consisting of substances, (ii) a therapeutically effective amount of a viral DNA or a complex comprising a virus; And (b) provides a pharmaceutical composition for anticancer comprising a pharmaceutically acceptable carrier.
  • Biocompatible polymers and the like used in the present invention include, but are not limited to:
  • Polymeric carriers widely used as non-viral gene carriers include gelatin, chitosan (Carreno GB, Duncan R. Evaluation of the biological properties of soluble chitosan and chitosan microspheres.Int J Pharm 148: 231-240 (1997)) PLL ( poly-LLysine) (Maruyama A, Ishihara T, Kim JS, Kim SW, Akaike T.
  • Advantages of the polymer-based gene carriers include low immune response and acute toxicity, simple manufacturing and mass production.
  • Liposomes are automatically formed by phospholipids dispersed in the aqueous phase. Examples of successfully delivering foreign DNA molecules into liposomes into cells include Nicolau and Sene, Biochim. Biophys. Acta, 721: 185-190 (1982) and Nicolau et al., Methods Enzymol., 149: 157-176 (1987). On the other hand, Lipofectamine (Gibco BRL) is the most used reagent for the transformation of animal cells using liposomes.
  • Liposomes containing the target nucleotide sequence to be transported carry the target nucleotide sequence to be transported into the cell by interacting with the cell through mechanisms such as endocytosis, adsorption to the cell surface, or fusion with a plasma cell membrane.
  • niosomes are bilayer transporters consisting of a mixture of nonionic surfactants and cholesterol and can contain polar and nonpolar materials. It has an advantage of being osmotically active and stable compared to liposomes, which are carriers of lipid fine particles by phospholipids and the like.
  • the surfactants used in the manufacture have the advantage that no special conditions are required for storage and handling.
  • nanomaterial refers to a biocompatible polymer material having a size of several hundreds to several hundred nanometers, for example, polyethylene glycol (polyetheleneglycol, PEG), polylactide (PLA), polyglycol Lead (polyglycolide, PGA), polylactide-co-glycolide (PLGA), polycaprolactone (PCL), hyaluronic acid (HA), chitosan (chitosan) Or serum albumin.
  • polyethylene glycol polyetheleneglycol, PEG
  • PLA polylactide
  • PGA polyglycol Lead
  • PLGA polyglycolide-co-glycolide
  • PCL polycaprolactone
  • HA hyaluronic acid
  • chitosan chitosan
  • serum albumin for example, serum albumin.
  • composition of the present invention uses the above-described peptide or peptide-polymer complex as an active ingredient, common content is omitted in order to avoid excessive complexity of the present specification.
  • viral DNA includes whole viral genome DNA, deletion of a portion of viral genome DNA, or modification of a portion of viral genome DNA.
  • the weight ratio of the Ad pDNA: polymer may be 1: 1 to 1: 1000
  • the weight ratio of Ad pDNA and dimer peptide may be 1: 0.001 to 1: 1000, but is not limited thereto.
  • the virus used in the present invention includes any virus and specifically includes a virus used as a gene therapy agent.
  • a virus used as a gene therapy agent for example, but not limited to:
  • Adenoviruses are widely used as gene transfer vectors because of their medium genome size, ease of manipulation, high titers, wide range of target cells and excellent infectivity. Both ends of the genome contain 100-200 bp inverted terminal repeats (ITRs), which are cis-elements essential for DNA replication and packaging.
  • ITRs inverted terminal repeats
  • the genome El region (E1A and E1B) encodes proteins that regulate transcription and transcription of host cell genes.
  • the E2 regions (E2A and E2B) encode proteins that are involved in viral DNA replication.
  • the E3 region is removed from conventional adenovirus vectors to provide a site for insertion of foreign genes (Thimmappaya, B. et al., Cell , 31: 543-551 (1982); and Riordan, JR et al., Science , 245: 1066-1073 (1989).
  • the target nucleotide sequence to be transported into the cell is specifically inserted into the deleted E1 region (E1A region and / or E1B region, preferably E1B region) or E3 region, and more specifically inserted into the deleted E1 region.
  • the term "deletion" as used in connection with a viral genome sequence has the meaning including not only that sequence in its entirety, but also partially deleted.
  • adenovirus can pack up to about 105% of the wild-type genome, about 2 kb can be additionally packaged (Ghosh-Choudhury et al., EMBO J. , 6: 1733-1739 (1987)).
  • the above-described foreign sequence inserted into the adenovirus may additionally bind to the genome of the adenovirus.
  • Adenoviruses have 42 different serotypes and subgroups of A-F. Among these, adenovirus type 5 belonging to subgroup C is the most suitable starting material for obtaining the adenovirus vector of the present invention. Biochemical and genetic information for adenovirus type 5 is well known.
  • Retroviruses are widely used as gene transfer vectors because they insert their genes into the host genome, carry large amounts of foreign genetic material, and have a broad spectrum of cells that can infect them.
  • the target nucleotide sequence to be delivered is inserted into the retroviral genome instead of the sequence of the retrovirus to produce a nonreplicating virus.
  • a packaging cell line comprising the gag, pol and env genes but no LTR (long terminal repeat) and ⁇ sequences is constructed (Mann et al., Cell , 33: 153-159 (1983)).
  • RNA transcripts of the recombinant plasmids When a recombinant plasmid comprising the target nucleotide sequence, LTR, and ⁇ sequences to be transported is introduced into the cell line, the ⁇ sequences enable the production of RNA transcripts of the recombinant plasmids, which are packaged into a virus and the virus is Discharged to the medium (Nicolas and Rubinstein "Retroviral vectors," In: Vectors: A survey of molecular cloning vectors and their uses , Rodriguez and Denhardt (eds.), Stoneham: Butterworth, 494-513 (1988)). The medium containing the recombinant retrovirus is collected, concentrated and used as a gene delivery system.
  • MMLV Moloney murine rheumatoid virus
  • EPO erythropoietin
  • the gene delivery system of the present invention can also be prepared according to this second generation retroviral vector construction strategy.
  • Adeno-associated virus can be used in the gene delivery system of the present invention because it can infect non-dividing cells and has the ability to infect various kinds of cells. Details of the preparation and use of AAV vectors are disclosed in detail in US Pat. Nos. 5,139,941 and 4,797,368.
  • AAV viruses are plasmids containing the gene sequence of interest with two AAV terminal repeats flanked (McLaughlin et al., J. Virol . , 62: 1963-1973 (1988); and Samulski et al. , J. Virol . , 63: 3822-3828 (1989)) and expression plasmids containing wild type AAV coding sequences without terminal repeats (McCarty et al., J. Virol. , 65: 2936-2945 (1991)). Prepared by transformation at the same time.
  • the nucleotide sequence may be used as a delivery system capable of carrying intracellularly.
  • the foreign gene sequence of the virus used in the present invention is a cancer therapeutic gene that induces death of cancer cells and ultimately degrades tumors, and includes tumor suppressor genes, immune regulatory genes such as cytokine genes, chemokine genes and co-stimulatory factors. (costimulatory factor: auxiliary molecules required for T cell activity, such as B7.1 and B7.2)], antigenic genes, suicide genes, cytotoxic genes, cytostatic genes, pro-apoptotic genes and anti-angiogenesis Genes are included, but are not limited to these.
  • Suicide genes are nucleic acid sequences that express substances that cause cells to be killed by external factors or cause toxic conditions to cells.
  • suicide genes are the thymidine kinase (TK) genes (US Pat. Nos. 5,631,236 and 5,601,818).
  • TK thymidine kinase
  • Tumor suppressor genes refer to genes encoding polypeptides that inhibit tumor formation. Tumor suppressor genes are naturally occurring genes in mammals, and it is believed that deletion or inactivation of these genes is an essential prerequisite for tumor development.
  • tumor suppressor genes include APC, DPC4, NF-1, NF-2, MTS1, WT1, BRCA1, BRCA2, VHL, p53, Rb, MMAC-1, MMSC-2, retinoblastoma genes (Lee et al. Nature, 329: 642 (1987)), adenomatous polyposis coli protein (US Pat. No. 5,783,666), and a throat disease suppressor gene located on chromosome 3p21.3 (Cheng et al. Proc. Nat. Acad.
  • INK4 family of tumor suppressor genes including the missing colon tumor (DCC) gene, MTS1, CDK4, VHL, p110Rb, p16 and p21, and therapeutically effective fragments thereof (Eg, p56Rb, p94Rb, etc.).
  • DCC missing colon tumor
  • CDK4 CDK4
  • VHL p110Rb
  • p16 and p21 members of the INK4 family of tumor suppressor genes
  • therapeutically effective fragments thereof Eg, p56Rb, p94Rb, etc.
  • antigenic gene refers to a nucleotide sequence that is expressed in a target cell to produce cell surface antigenic proteins that can be recognized by the immune system.
  • antigenic genes include carcinoembryonic antigen (CEA) and prostate specific antigen (PSA), ⁇ -feto protein (AFP), p53 (WO 94/02167).
  • CEA carcinoembryonic antigen
  • PSA prostate specific antigen
  • AFP ⁇ -feto protein
  • p53 WO 94/02167
  • cytotoxic gene refers to a nucleotide sequence that is expressed in a cell and exhibits a toxic effect.
  • examples of such cytotoxic genes include nucleotide sequences encoding Pseudomonas exotoxin, lysine toxin, diphtheria toxin, and the like.
  • cytostatic gene refers to a nucleotide sequence that is expressed in a cell and stops the cell cycle during the cell cycle.
  • cell proliferation inhibitory genes include p21, retinoblastoma gene, E2F-Rb fusion protein gene, genes encoding cyclin-dependent kinase inhibitors (eg, p16, p15, p18 and p19), growth stop specific homeo Growth arrest specific homeobox (GAX) genes (WO 97/16459 and WO 96/30385), and the like.
  • cytokines eg interferon-alpha, -beta, -delta and -gamma
  • interleukins eg IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-10 , IL-12, IL-19 and IL-20
  • genes encoding colony stimulating factors eg, GM-CSF and G-CSF
  • chemokine groups monocyte chemotactic protein 1 (MCP-1), monocyte chemotaxis) Protein 2 (MCP-2), monocyte chemotactic protein 3 (MCP-3), monocyte chemotactic protein 4 (MCP-4), macrophage inflammatory protein 1 ⁇ (MIP-1 ⁇ ), macrophage inflammatory protein 1 ⁇ (MIP-1 ⁇ ), Macrophage inflammatory protein 1 ⁇ (MIP-1 ⁇ ), macrophage
  • tissue plasminogen activator tPA
  • urokinase urokinase
  • LAL lipid-like lipid-like lipid-like lipid-like lipid-like lipid-like lipid-like lipid-like lipid-like lipid-like lipid-like lipid-like lipid-like lipid-like lipid-like lipid-like lipid-like lipid-like lipid-like lipid-like lipid-containing lipid-derived lipid lipid-derived lipid lipid-derived lipid lipid-phosphate, and adenosine deaminase deficiency, and AIDS.
  • tPA tissue plasminogen activator
  • urokinase urokinase
  • LAL LAL generating genes that provide sustained thrombotic effects to prevent cholesterol hyperemia.
  • polynucleotides are known for treating viral, malignant and inflammatory diseases and conditions such as cystic fibrosis, adenosine deaminas
  • pro-apoptotic gene refers to a nucleotide sequence that is expressed and induces programmed cell death.
  • pro-apoptotic genes include p53, adenovirus E3-11.6K (derived from Ad2 and Ad5) or adenovirus E3-10.5K (derived from Ad), adenovirus E4 gene, Fas ligand, TNF-, TRAIL, p53 pathway gene and gene encoding caspase are included.
  • anti-angiogenic gene refers to a nucleotide sequence that is expressed and releases an anti-angiogenic factor extracellularly.
  • Anti-angiogenic factors include angiostatin, inhibitors of vascular endothelial growth factor (VEGF) such as Tie 2 (PNAS, 1998, 95,8795-800), endostatin and the like.
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • the relaxin gene or decorin gene which has been found to be suitable for the treatment of adenovirus genes by the present inventors, is also a gene that can be carried intracellularly by a gene carrier.
  • Nucleotide sequences of the purpose described above can be obtained from DNA sequence databanks such as GenBank or EMBL.
  • peptide-viral DNA (or virus) complexes or peptide-polymer-viral DNA (or virus) complexes of the present invention described above may be used for the treatment of various diseases, but may be particularly useful for anticancer therapies.
  • cancer refers to breast cancer, non-small cell lung cancer, lung cancer, gastric cancer, liver cancer, hematologic cancer, bone cancer, pancreatic cancer, skin cancer, head and neck cancer, skin or eye melanoma, uterine sarcoma, ovarian cancer, rectal cancer, anal cancer, colon Cancer, fallopian tube cancer, endometrial cancer, cervical cancer, small intestine cancer, endocrine cancer, bladder cancer, laryngeal cancer, osteosarcoma, thyroid cancer, brain cancer, colon cancer, vaginal cancer, vulva cancer, Hodgkin's disease, esophageal cancer, adrenal cancer, penile cancer , Acute leukemia, lymphocytic lymphoma, ureter cancer, renal pelvic carcinoma, central nervous system (CNS) tumor, primary central nervous system lymphoma, spinal cord tumor, nasopharyngeal cancer, brain stem glioma or pituitary adenoma, parathyroid cancer
  • CNS central nervous system
  • treatment refers to (i) prevention of cancer cell formation; (ii) inhibiting a disease or condition associated with cancer following removal of cancer cells; And (iii) alleviation of a disease or disorder associated with cancer following removal of cancer cells.
  • therapeutically effective amount means an amount sufficient to achieve said pharmacological effect.
  • compositions of the present invention are those commonly used in the formulation, lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, starch, acacia rubber, calcium phosphate, alginate, gelatin, calcium silicate , Microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, cellulose, water, syrup, methyl cellulose, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate, mineral oil, and the like, but are not limited thereto. no.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may further include a lubricant, a humectant, a sweetener, a flavoring agent, an emulsifier, a suspending agent, a preservative, and the like.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is preferably parenteral, and may be administered using, for example, intravenous administration, intraperitoneal administration, intramuscular administration, subcutaneous administration or topical administration.
  • Intraperitoneal administration in ovarian cancer and in the portal vein in liver cancer can be administered by infusion method, in the case of breast cancer can be directly injected into the tumor mass, in the case of colon cancer by direct injection into the enema can do.
  • Suitable dosages of the pharmaceutical compositions of the invention vary depending on factors such as the formulation method, mode of administration, age, weight, sex of the patient, degree of disease symptom, food, time of administration, route of administration, rate of excretion and response to reaction. In general, the skilled practitioner can readily determine and prescribe a dosage effective for the desired treatment.
  • the pharmaceutical compositions of the present invention comprise a polymer-virus complex of 1 ⁇ 10 5 -1 ⁇ 10 15 pfu / ml, and typically 1 ⁇ 10 10 pfu is injected for two weeks, once every two days.
  • compositions of the present invention are prepared in unit dosage form by being formulated with pharmaceutically acceptable carriers and / or excipients, according to methods which may be readily practiced by those skilled in the art. Or may be prepared by incorporation into a multi-dose container.
  • the formulation may be in the form of a solution, suspension or emulsion in an oil or an aqueous medium, or may be in the form of extracts, powders, granules, tablets or capsules, and may further include a dispersant or stabilizer.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be used as a single therapy, but may also be used in combination with other conventional chemotherapy or radiation therapy, and when the combination therapy is performed, cancer treatment may be more effectively performed.
  • Chemotherapeutic agents that can be used with the compositions of the present invention are cisplatin, carboplatin, procarbazine, mechlorethamine, cyclophosphamide, phospho Ifosfamide, melphalan, chlorambucil, bisulfan, nitrosourea, diactinomycin, daunorubicin, doxorubicin , Bleomycin, plicomycin, mitomycin, etoposide, tamoxifen, taxol, transplatinum, 5-fluoro 5-urauracil, vincristin, vinblastin, methotrexate and the like.
  • Radiation therapy that can be used with the composition of the present invention is X-ray irradiation, ⁇ -ray irradiation, and the
  • a method of increasing intracellular delivery efficiency of a physiologically-modulating substance using a composition comprising a peptide of SEQ ID NO: 1 or a modified peptide thereof.
  • a method for increasing the intracellular delivery efficiency of a bioactive modulator by using a composition comprising a peptide of SEQ ID NO: 1 or a modified peptide thereof and a biocompatible polymer. .
  • physiologically active substance means a physiological function modulator having biological activity, and for the purposes of the present invention, as a substance that can be applied to the treatment of all diseases caused by imbalance or abnormalities of physiological function.
  • Nucleic acids, peptides, polypeptides, antibodies, chemical compounds (Chemicalapeutics) or viruses but are not limited thereto.
  • the present invention provides a composition for efficiently delivering a bioactivity modulator into a cell.
  • the present invention also provides a pharmaceutical composition for anticancer comprising the composition and viral DNA or virus.
  • the present invention also provides a method for efficiently delivering a bioactive modulator into a cell.
  • the peptide or peptide-polymer complex of the present invention exhibits high intracellular delivery efficiency compared to the conventional methods, it can be usefully used as a carrier for intracellular delivery of various therapeutic agents.
  • 1 is a schematic diagram showing the cancer cell specific killing effect of tumor selective killing adenovirus.
  • FIG. 2 is a schematic diagram comparing systemic administration with adenovirus plasmid DNA-polymer compared with administration with adenovirus itself.
  • Ad pDNA-polymer-VI-9R shows the results of confirming DNA condensation conditions of the Ad DNA-polymer-peptide complex (Ad pDNA-polymer-VI-9R).
  • Figure 4 is a photograph comparing the gene transfer efficiency of the Ad DNA-polymer-peptide complex (Ad pDNA-PPCBA-VI-9R).
  • Ad DNA-polymer-VI-9R Ad DNA-polymer-VI-9R
  • Ad pDNA-polymer-VI-9R Ad DNA-polymer-peptide complex
  • Ad pDNA-PAM-ABP-VI-9R Ad DNA-polymer-peptide complex
  • 9 is a table comparing surface charges of peptides according to pH change.
  • Figure 10 is a photograph comparing the gene transfer efficiency of the Ad DNA-polymer-peptide complex (Ad pDNA-PPCBA-R-peptide).
  • Ad pDNA-PAM-ABP-peptide shows the results of comparing and comparing the gene transfer efficiency of cells of the Ad DNA-polymer-peptide complex (Ad pDNA-PAM-ABP-peptide).
  • Figure 13 is a chart comparing the DNA enrichment efficiency of various types of modified peptides and Ad pDNA complex.
  • FIG. 15 is a chart comparing the in-nuclear localization efficiency of various Ad DNA-polymer-peptide complexes.
  • FIG. 16 shows the effects of the Ad DNA-polymer-peptide complex (Ad pDNA- (PAM-ABP) -peptide).
  • FIG. 16A shows the results of virus proliferation; 16B is a result of confirming cancer cell killing ability.
  • Ad pDNA- (PAM-ABP) -peptide shows the results of confirming the viral proliferation ability of the Ad DNA-polymer-peptide complex (Ad pDNA- (PAM-ABP) -peptide) by measuring the number of viral paticles by Q-PCR.
  • Ad pDNA- (PAM-ABP) -peptide shows the results of confirming the intracellular gene transfer efficiency of the Ad DNA-polymer-dimer peptide complex (Ad pDNA- (PAM-ABP) -peptide).
  • Figure 19 shows the results of confirming the gene transfer efficiency of the Ad DNA-polymer-dimer peptide complex (Ad pDNA- (PPCBA-PEI-Arg) -peptide).
  • Figure 20 shows the effect of the Ad pDNA-polymer-dimer peptide complex in the PC-3 cell line, a in Figure 20 a confirming the virus proliferation capacity;
  • Figure 20b is the result of confirming the cancer cell killing ability.
  • Figure 21 shows the effect of the Ad pDNA-polymer-dimeric peptide complex in the HapT1 cell line, a in Figure 21 a confirms the virus proliferation capacity; Figure 21b is the result of confirming the cancer cell killing ability.
  • Figure 23 shows the results of confirming the gene transfer efficiency of the adenovirus / peptide complex (Ad / peptide complex) in the MCF-7 cell line.
  • 25 shows the results of confirming the intracellular gene transfer efficiency of the adenovirus / peptide complex (Ad / peptide complex) in the U343 cell line.
  • Fig. 26 shows the results of comparative analysis of cell uptake efficiency of chemicals / peptide complexes.
  • FIG. 27 shows the results of confirming the cancer cell killing ability of the chemical / peptide complex (MG123 / peptide complex).
  • FIG. 29 shows the cell absorption efficiency of the protein (Human serum albumin) / Peptide complex, where a in FIG. 29 uses 50 nM of protein, and b in FIG. 29 uses 0.5 M of protein.
  • Figure 30 shows the results confirmed the intracellular delivery efficiency of the antibody / peptide complex (Antibody (Rabbit polyclonal to TGF beta 1) / peptide complex).
  • adenovirus DNA was first put in a PBS buffer, the weight ratio was calculated, and the peptide was added thereto, followed by reaction at room temperature for 10 minutes. Then, the polymer was added again at various weight ratios, and the reaction was performed at room temperature for 15 minutes.
  • pDNA-polymer-VI-9R complex was prepared.
  • PAM-ABP in which an arginine-grafted bio-reducible poly (CBA-DAH) polymer (ABP) and a polyamidoamine (PAMAM) dendrimer, was used, and its structure was as shown below (Journal of Controlled Release, Vol 160 592). -600 2012).
  • CBA-DAH arginine-grafted bio-reducible poly
  • PAMAM polyamidoamine
  • Ad pDNA adenovirus plasmid DNA
  • VI-9R adenovirus plasmid DNA
  • the degree of binding of the Ad pDNA-polymer-VI-9R complex was confirmed by adjusting to 20.
  • Gel retardation assay was performed to determine the optimal conditions for the formation of Ad pDNA-polymer-VI-9R complex and to analyze the physical properties.
  • Example 2 PPCBA (mPEG-b-Pip-CBA) was used as a polymer having a biodegradability and pH sensitivity, and the structure is as shown below (Biomaterials, Vol 41 53-68 2015).
  • Ad pDNA-PPCBA-VI-9R complex In order to confirm the intracellular gene transfer efficiency of the Ad pDNA-PPCBA-VI-9R complex, first, adenovirus DNA was put into PBS buffer using plasmid DNA (pdE1 / GFP) of non-replicating adenovirus expressing GFP, After calculating the weight ratio to put the peptide in the same tube, and reacted for 10 minutes at room temperature. Thereafter, the polymer was added thereto, followed by reaction at room temperature for 15 minutes, to prepare an Ad pDNA-polymer-VI-9R complex.
  • plasmid DNA pdE1 / GFP
  • pdE1 / GFP-PPCBA and pdE1 / GFP-PPCBA-VI-9R complexes were treated with 293A cell lines dispensed at 60-70% in 24 well plates and 72 hours later expression of GFP was observed using fluorescence microscopy.
  • Ad pDNA (RdB / GFP), a viral DNA of RdB / GFP, a tumor selective killing adenovirus expressing PPCBA as a polymer and GFP with adenovirus DNA, was used.
  • Ad pDNA RdB / GFP
  • A549 cell lines were dispensed into 12 well plates, and after 24 hours naked Ad pDNA, Ad pDNA-PEI 25K complex and Ad pDNA-PPCBA- Each VI-9R complex was treated with cells. After 72 hours, the culture was collected and the number of particles of adenovirus was confirmed using Q-PCR.
  • virus production showed only basal level (9.2 X 10 3 VP) when only naked Ad pDNA was treated, whereas when treated with Ad pDNA-PPCBA-VI-9R complex, it was 596 than naked Ad pDNA.
  • the virus production was increased by 5.5 times (5.5 ⁇ 10 6 VP) (FIG. 5). This was a 4.6-fold increase even when treated with the positive control Ad pDNA-PEI 25K complex (1.2 ⁇ 10 6 VP).
  • Example 4 Ad pDNA - Polymer Ad by -VI-9R complex pDNA Confirmation of cellular uptake efficiency
  • Example 4 PAM-ABP was used as the polymer.
  • Ad pDNA (dE1 / GFP) -PAM-ABP-VI-9R complex 293A cell lines were dispensed in 60-70% in 12 well plates and labeled with FITC after 24 hours. The cells were treated with Ad pDNA-PEI, Ad pDNA-PAM-ABP and Ad pDNA-PAM-ABP-VI-9R complexes using the Ad plasmid DNA (FITC-pDNA). After 2 hours FACS was used to compare the amount of FITC labeled-pDNA uptake into cells.
  • Example 5 PAM-ABP was used as the polymer and pdE1-GFP was used as the adenovirus DNA. Endosomal sequestration of biological agents delivered into cells is an important obstacle to improving gene transfer efficiency. On the other hand, high molecular materials with amines, sulfonamides or carboxylic acids have the function of destroying the endosome membrane to escape the endogenous biological agent from the endosomes, resulting in non-viral gene transfer efficiency And it is known that the efficiency of delivery of chemical drugs into the nucleus can be increased. In Example 5, in order to verify the endosomal escape effect of viral DNA by VI-9R, cells were subjected to fluorescent staining.
  • Ad pDNA-PAM-ABP, or Ad pDNA-PAM-ABP-VI-9R which is a combination of DNA (pdE1-GFP) of adenovirus expressing GFP with PAM-ABP or PAM-ABP-VI-9R complex
  • pdE1-GFP DNA of adenovirus expressing GFP
  • PAM-ABP or PAM-ABP-VI-9R complex Each was treated at a concentration of 2 ⁇ g / ml mL, after 4 hours fixed with 4% formaldehyde solution was observed by the confocal microscope endo escape effect.
  • adenovirus protein VI-derived peptide (SEQ ID NO: 1) was modified in various forms (FIG. 8). That is, a hydrophobic amino acid was added to the N-terminus of the peptide or TAT, which is a known cell permeation peptide (CPP), was further linked.
  • CPP cell permeation peptide
  • each peptide was put in a total volume of 1 ml of cuvette at 10 ⁇ g / ml and the surface charge values of peptides dissolved in pH 7.4 PBS and pH 6.4 PBS were measured using Zeta-sizer. .
  • VI-9R had a negative charge of 16.6 ⁇ 0.41 mV at pH 7.4, and a positive charge of 4.87 ⁇ 0.42 mV for the VI-9R peptide.
  • mVI modified VI
  • the surface charge changed to a positive charge compared to the VI peptide.
  • E bipolar amino acid glutamic acid
  • Example 7 PPCBA and PAM-ABP were used as polymers.
  • Ad pDNA (dE1 / GFP) -PPCBA-peptide complex a 293A cell line was dispensed at 60-70% in 24 well plates, and six modified peptides and the Ad pDNA-PPCBA-peptide complex were used. Were treated to cells, respectively.
  • VI-9R, NLS, TAT, and protamine were used. After 24 hours of treatment with the complex, expression of GFP was observed using a fluorescence microscope.
  • the treatment of the Ad pDNA-PPCBA-VI-9R complex significantly increased the expression of GFP compared to the treatment of Ad pDNA or Ad pDNA-PPCTBA.
  • six modified peptides mVI, mVI-TAT, mVI-TAT-A, mVI-G-TAT-A, mVI-A-TAT or mVI-GA-TAT, were formed in complex with Ad pDNA-PPCTBA.
  • the expression of GFP was increased compared to the case without modification of VI-9R (FIG. 10).
  • Ad pDNA (dE1 / GFP) -PAM-ABP-peptide complex using PAM-ABP another polymer, 293A cell line was dispensed in a 24-well plate at 60-70% for 24 hours.
  • Ad pDNA-PAM-ABP / TAT and Ad pDNA / PEI25K were used as controls, and 4 days after the complex was treated, expression of GFP was observed using a fluorescence microscope.
  • Ad pDNA-PAM-ABP-peptide complex increased gene transfer efficiency than that of Ad pDNA-PAM-ABP (FIG. 11).
  • the six modified peptides mVI, mVI-TAT, mVI-TAT-A, mVI-G-TAT-A, mVI-A-TAT were also compared with the positive control Ad pDNA-PAM-ABP / TAT.
  • gene delivery efficiency was significantly increased when Ad pDNA-PAM-ABP-peptide complex in the form of mVI-GA-TAT conjugated with PAM-ABP was treated.
  • Example 8 Ad pDNA - Polymer Ad by -peptide complex pDNA Increased cell uptake efficiency
  • Example 7 PAM-ABP was used as the polymer.
  • Ad pDNA-PAM-ABP-NLS and Ad pDNA-PAM-ABP-TAT were used as controls and the amount of FITC-pDNA absorbed into cells using FACS after 30 minutes after the complex treatment was compared and analyzed.
  • Ad pDNA-PAM- formed of VI-9R and six types of modified peptides (mVI, mVI-TAT, mVI-TAT-A, mVI-G-TAT-A, mVI-A-TAT and mVI-GA-TAT)
  • the cellular uptake rate of the ABP-peptide complex was increased 2.4, 2.6, 2.5, 2.0, 2.1, 1.6 and 2.1 times, respectively, compared to the control Ad pDNA-PAM-ABP (Fig. 12).
  • Ad pDNA-PAM-ABP Fig. 12
  • it showed significantly increased cell uptake compared to the other positive controls Ad pDNA-PAM-ABP / NLS and Ad pDNA-PAM-ABP / TAT.
  • Ad pDNA-VI showed little DNA enrichment, and among the modified peptides, mVI-TAT, mVI-TAT-A and mVI-A-TAT induced DNA enrichment, but mVI, mVI- In the case of G-TAT-A and mVI-GA-TAT, it was confirmed that DNA enrichment was not induced (FIG. 13).
  • Endosomal escape is a phenomenon in which DNA escapes by dissolving a membrane in an endosome.
  • PI staining was performed to confirm the degree of dissolution of the membrane by the Ad-polymer-peptide complex.
  • Peptides used were reacted in a 37 ° C. incubator at 50 nM for the same 30 minutes. Thereafter, 100 ⁇ g of PI was reacted at 37 ° C. for 10 minutes and after medium replacement, the results were confirmed by fluorescence microscopy. The higher the solubility of the film, the higher the degree of fluorescence.
  • Example 11 PAM-ABP was used as the polymer.
  • Ad pDNA-PAM-ABP complex an A549 cell line was dispensed into 24 wells. After labeling FITC on Ad DNA, the Ad pDNA-PAM-ABP complex and Ad pDNA-PAM-ABP-peptide (mVI, mVI-TAT, mVI-TAT-A, mVI-G-TAT-A, mVI) were used.
  • -A-TAT, mVI-GA-TAT, VI, VI-9R, TAT and NLS) complexes were made and treated respectively after 24 hours of cell division.
  • Example 12 Ad pDNA - Polymer -Peptide complex virus Proliferative capacity And cancer cells Killing power Confirm
  • Ad pDNA-polymer-peptide complex H, a tumor selective killing adenovirus expressing Decorin (DCN) and shcMet with polymer PAM-ABP and adenovirus DNA
  • DCN tumor selective killing adenovirus expressing Decorin
  • shcMet with polymer PAM-ABP and adenovirus DNA
  • Hela cell line a human uterine cancer cell line
  • PAM-ABP or peptide was treated with cells alone.
  • Example 13 Ad pDNA - Polymer -Peptide complex virus Proliferative capacity And cancer cells Killing power Verification
  • the viral DNA of RdB / GFP a tumor-selective adenovirus expressing Green Fluorescent Protein (GFP) with polymer PAM-ABP and adenovirus DNA
  • GFP Green Fluorescent Protein
  • the complex was prepared using Ad pDNA.
  • Human lung cancer cell line A549 was dispensed into 12 well plates, and after 24 hours naked Ad pDNA, Ad pDNA / PAM-ABP, 6 peptide mVI, mVI-TAT, mVI-TAT-A, mVI-G-TAT- A, mVI-A-TAT and mVI-GA-TAT with Ad pDNA- (PAM-ABP), respectively, were combined with Ad pDNA / PAM-ABP / peptide complex and control group VI-9R and TAT peptide, respectively. Treated. After 4 days of treatment, the culture was collected and the number of particles of adenovirus (Particle) was confirmed using Q-PCR.
  • Particle adenovirus
  • the virus yield was 1.2 X 10 3 VP at the baseline level
  • the virus production of the Ad pDNA- (PAM-ABP) -peptide complex formed from six peptides was Except for the complexes using mVI, mVI-G-TAT-A, they increased by 1.95, 2.01, 1.03, and 10.7 times, respectively, compared to the other Ad pDNA / PAM-ABP, especially compared to other controls, VI-9R or TAT. Increased virus production could be confirmed (FIG. 17).
  • Example 14 Ad pDNA - Polymer - Dimer By peptide complex Increased Intracellular Check gene transfer efficiency
  • 293A cell line was divided into 60-70% in a 24 well plate and modified monomer.
  • Peptide, dimeric peptide and Ad pDNA- (PAM-ABP) -dimeric peptide complexes were treated with the cells, and 48 hours after the treatment, the expression of GFP was observed through fluorescence microscopy.
  • Dimeric peptides were prepared using air oxidation. Specifically, 2 mg of the monomer peptide was dissolved in 2 mL of 0.1 M deaerated ammonium bicarbonate, and then the mixture was stirred under an open condition at room temperature for 24 hours to prepare a dimeric peptide. After that, monomer peptides were separated using dialysis castte, and the remaining reactants were used to obtain power through freeze-dry. As a control group, a complex made using TAT, a pre-modified peptide (mVI-G-A-TAT), and a PEI25k, PAM-ABP polymer and Ad pDNA were combined.
  • TAT a pre-modified peptide
  • PEI25k PEI25k
  • PAM-ABP polymer and Ad pDNA Ad pDNA
  • the treatment of Ad pDNA-Polymer-dimeric peptide complex significantly increased the expression of GFP compared to the treatment of Ad pDNA-PEI 25k and Ad pDNA-PAM-ABP.
  • the expression of GFP was similar to that of the unmodified, but when the modified monomer peptide was made into a dimeric peptide and treated with the Ad pDNA-Polymer-peptide complex, It was confirmed that the expression is significantly increased (Fig. 18)
  • the treated Ad pDNA- (PPCBA-PEI-Arg) -dimeric peptide complex was composed of a 1: 30: 1 Ad pDNA: Polymer: peptide weight ratio
  • the treated Ad pDNA-PEI 25K and Ad pDNA-Lipofectamine were treated.
  • the expression of GFP was significantly increased, and in general, when the weight ratio of Ad pDNA: Polymer is 30: 1, the effect was superior to that when the weight ratio was 20: 1, and the binding dimeric peptide
  • the amount of increased it was confirmed that the expression of GFP increased in a concentration-dependent manner (Fig. 19). That is, from the above results, it was found that the intracellular delivery efficiency can be further improved by modifying the peptide of the present invention into a dimeric form.
  • Example 15 Ad pDNA - Polymer - Dimer Virus of peptide complex Proliferative capacity And cancer cell killing ability
  • Ad pDNA-polymer-dimeric peptide complex in order to confirm the adenovirus proliferative capacity of the Ad pDNA-polymer-dimeric peptide complex, it is a tumor selective killing adenovirus expressing IL-12 and GMCSF with polymer PPCBA-PEI-Arg (PPR) and adenovirus DNA.
  • the complex was prepared using Ad pDNA containing viral DNA of RdB / IL-12 / GMCSF.
  • PC-3 cell line a human prostate cancer cell line
  • PPR PPCBA-PEI-Arg
  • dimeric peptide Ad pDNA-Lipofectamine
  • Ad pDNA-PPR Ad pDNA- Complexes
  • PPR-dimeric peptides 1: 30: 0.01, 1: 30: 0.05 [Ad pDNA: Polymer: peptide weight ratio]
  • the culture was collected and the number of particles of adenovirus (Particle) was confirmed using Q-PCR.
  • HapT1 cell line a hamster species pancreatic cancer cell line
  • the complex was prepared with dimeric peptides (1: 30: 0.01, 1: 30: 0.05 [Ad pDNA: Polymer: peptide weight ratio]) and treated with cells. After 4 days of treatment, the culture was collected and the number of particles of adenovirus (Particle) was confirmed using Q-PCR.
  • MTT assay was performed to verify the killing ability of cancer cells.
  • PC-3 cell line when the weight ratio of peptide and Ad pDNA was 1: 0.01 among the groups treated with Ad pDNA-PPR-dimeric peptide complex, 57.6% It showed the best cancer cell killing ability of the cancer cell killing effect was increased by 17.1% and 16.2%, respectively, compared to the control group Ad pDNA-Lipofectamine complex treatment group or Ad pDNA-PPR group (Fig. 20b).
  • the HapT-1 cell line when the weight ratio of peptide and Ad pDNA was 1: 0.01 among the groups treated with the Ad pDNA-PPR-dimeric peptide complex, it showed the highest cancer cell killing ability of 57.3%.
  • the effects of cancer cell death were increased by 4% and 10.5%, respectively (Fig. 21B).
  • the weight ratio of the peptide and Ad pDNA in the treatment group of Ad pDN- / PPR-dimeric peptide was 1: 0.01, indicating the highest adenovirus proliferation and the greatest cancer cell killing ability.
  • Ad pDNA-PPR-dimeric peptide complex is very successful in the proliferation of cancer cells in cancer cells, and adenoviruses proliferated in tumor cells lead to cancer cell specific killing, which leads to a significant increase in virus proliferation and cancer cell killing ability. It suggests that
  • various cell lines (A549, MCF, H460, U434) were dispensed at 60-70% in 24 well plates and after 24 hours.
  • peptides VI, VI-9R, mVI, mVI-TAT, mVI-TAT-A, mVI-G-TAT-A, mVI-A-TAT and mVI-GA-TAT are adenoviruses (dE1 / GFP) And peptide 1: 1 ⁇ 10 5 , 1: 1 ⁇ 10 6 , 1: 1 ⁇ 10 7 molar ratio, and the cells were treated with 20 MOI, respectively, 48 hours after treatment, the expression of GFP through fluorescence microscopy was observed.
  • Adenovirus only which does not bind NLS, TAT and peptide, was used as a control of the experiment using the A549 cell line. As a control for other cell lines, it did not bind VI, VI-9R, NLS, TAT, or peptide.
  • Adenovirus only group was used.
  • the gene transfer efficiency of the Ad / peptide complex was found to be high when compared to the Adenovirus only group (FIGS. 22 to 25).
  • Gene transfer efficiency was found to be significantly increased compared to the Ad / VI, Ad / VI-9R group.
  • the peptide of the present invention can not only increase the intracellular delivery efficiency of nucleic acids such as adenovirus DNA, but also improve the intracellular delivery efficiency of the virus itself, and this trend can be further enhanced through peptide modification.
  • nucleic acids such as adenovirus DNA
  • Example 17 Chemical By / peptide complex Increased Confirmation of cellular uptake efficiency
  • DOX 820 ⁇ g
  • BMPH N- ⁇ -maleimidopropionic acid hydrazide
  • the reaction was carried out under conditions of blocking light for 24 hours at room temperature, after which the peptide (4 mg) was added so that the ratio of DOX: mVI-GA-Tat peptide was 1: 1 equivalent and reacted for 3 hours at room temperature.
  • the unreacted chemicals were removed using a 3.5 kDa dialysis cassette and lyophilized to form a powder, which was then dissolved in PBS and treated with 5 ⁇ M complexes to the cells. After 5 minutes, 10 minutes, 30 minutes, and 120 minutes of treatment, Doxorubicin uptake into cells was quantified by FACS, and a group treated with Chemotherapeutics alone was used as a control.
  • H460, A549 or U343 cell line was dispensed 60-70% in a 96 well plate and after 24 hours, MG132 or Doxorubicin and mVI of Chemotherapuetics -GA-TAT peptide was treated with 0.1-5 ⁇ M by binding physically (mVI-GA-Tat + MG132, DOX + mVI-GA-Tat) or chemically (mVI-GA-Tat conjugated MG123 / DOX). After 48 hours of treatment, cell viability was confirmed by MTT assay, and the control group was treated with mVI-G-A-TAT peptide and MG132 or Doxorubicin alone.
  • the cancer cell killing effect of the Chemotherapeutics / peptide complex was increased when compared with the control group treated with Chemotherapeutics alone.
  • the chemotherapeutics and peptide were physically combined, it was confirmed that the effect was superior to the chemically bound form (Figs. 27 and 28).
  • the lung cancer cell line A549 was dispensed in a 96 well plate at 70-80% and after 24 hours, FITC labeled Human serum albumin ( HSA) and mVI-GA-TAT peptide were physically bound and treated by 0.5 or 5 ⁇ M (see physical binding procedure of Example 17). After 0.16 hours, 0.5 hours, 2 hours, and 6 hours of treatment, FITC labeled HSA uptake into cells was confirmed using a microplate reader, and a group treated with protein alone was used as a control.
  • HSA Human serum albumin
  • TGF- ⁇ transforming growth factor beta
  • TGF- ⁇ transforming growth factor beta
  • high permeability to cell membranes is required.
  • Antibody (Rabbit polyclonal to TGF beta 1) / Peptide complex is treated to the cell without permeabilization, and then intracellular delivery. It was confirmed.
  • lung cancer cell line A549 was dispensed in a chamber slide at 70-80%, and after 24 hours, antibody and mVI-GA-TAT peptide were physically combined in a weight ratio of 1: 1 (physical binding process of Example 17). Reference), 4 ⁇ g was processed. After treatment, the antibody uptake into cells for 2 hours was confirmed by fluorescence microscopy using Alexa Fluor 488 conjugated antibody (Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG (H + L)), and the antibody-treated group was used as a control. It was.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

본 발명은 아데노바이러스 단백질 VI 유래 펩티드를 포함하는 세포 내 전달용 조성물 및 이를 포함하는 항암용 약제학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 본 발명의 펩티드 또는 펩티드-폴리머 복합체를 이용하는 경우, 핵산, 펩티드, 폴리펩티드, 항체, 화학물질 또는 바이러스의 세포 내 전달효율이 향상된다. 따라서 본 발명의 펩티드 또는 펩티드-폴리머 복합체는 다양한 치료제의 세포 내 전달체로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

아데노바이러스 단백질 VI 유래 펩티드를 포함하는 세포 내 전달용 조성물 및 이를 포함하는 항암용 약제학적 조성물
본 발명은 아데노바이러스 단백질 VI 유래 펩티드를 포함하는 세포 내 전달용 조성물 및 이를 포함하는 항암용 약제학적 조성물에 관한 것이다.
기존의 암 유전자 치료제는 대부분 국소투여(local administration)를 통해 체내에 주입하기 때문에 온몸에 퍼져있는 전이암에 대한 접근성이 떨어지는 한계가 있었다. 이로 인해 전이암과 같이 온몸에 미세하게 퍼져있는 질환의 경우에는 현재까지 유전자 치료 대상에서 거의 제외되어 왔지만, 유전자 치료제 시장을 확장하기 위해서는 전신 투여가 가능한 제품의 개발이 필요하다.
아데노바이러스의 경우, 유전자 전달 벡터로서 여러 가지 장점들이 부각되면서 암 유전자 치료에서 사용빈도가 꾸준히 증가하고 있으며, 환자를 대상으로 진행하는 임상시험에서 가장 높은 빈도로 이용되고 있다. 특히, 암세포에서만 선택적으로 증식하여 암세포만을 살상할 수 있는 종양 살상 아데노바이러스는 일차 감염세포에서 치료효과를 나타낼 뿐만 아니라 증식된 바이러스가 주변의 종양세포들을 2차, 3차 연쇄적으로 감염하고 암세포들을 살상함으로써, 그 치료효과가 도미노 현상과 같이 계속 퍼져 나갈 수 있기 때문에 암 치료효과를 현저하게 증대시킬 수 있다. 한편, 종양 살상 아데노바이러스에 치료 유전자를 탑재하면, 치료 유전자의 발현이 암세포에서만 제한적으로 고효율로 발현됨으로서, 치료효과를 상승적으로 향상시킬 수 있는 장점이 있다. 또한, 주변의 정상세포에서는 종양 살상 아데노바이러스의 증식이 억제되므로 세포살상이 일어나지 않으므로 안전성이 높다는 장점이 있어 차세대 항암 치료제로서 주목을 받고 있다.
하지만, 바이러스 기반 유전자 치료제는 전신투여의 경우 혈액 내에 있는 면역 세포들에 의해 바이러스가 빠르게 제거되어 타겟 종양조직으로 전달되는 양이 매우 적으며, 간에 많은 양이 축적되어 간독성을 야기할 수 있다는 한계가 있다. 또한, 반복 투여의 경우 고농도의 중화항체를 형성하기 때문에 반복 투여에 의한 치료 효과가 상당히 감소되는 단점이 있다. 이러한 이유들로 인하여 현재 개발되고 있는 종양 살상 아데노바이러스는 모두 국소투여에 의한 암치료가 이루어지고 있다. 따라서 전신투여가 가능하며 효율적으로 아데노바이러스를 목표인 종양세포에 전달할 수 있는 새로운 혁신적인 방법의 개발이 필요한 상황이다.
새로운 방법 중의 하나로서 종양살상용 아데노바이러스 자체를 치료제로 사용하는 것이 아니라, 종양살상용 아데노바이러스의 DNA를 타겟 종양세포에 전달하여 암을 치료하는 방법이 시도되고 있다. 이를 위해서는 인체에 안전하면서도 보다 효율적으로 아데노바이러스 DNA를 종양세포에 전달할 수 있는 방법의 개발이 필요하다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용은 괄호 내에 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준과 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명자들은 바이러스의 DNA 또는 바이러스를 보다 효율적으로 종양세포 내에 전달하여 종양 살상 효과를 나타낼 수 있는 조성물 또는 방법을 개발하고자 연구 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 아데노바이러스 단백질 VI 유래 펩티드 또는 상기 펩티드-폴리머의 복합체를 이용하여 바이러스 DNA 또는 바이러스를 종양세포 내로 전달하는 경우, 바이러스 DNA 또는 바이러스의 세포 내 도입효율이 향상되고, 우수한 항암치료 효과를 나타낸다는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 생리활성 조절 물질을 세포 내로 효율적으로 전달하기 위한, 서열번호 1의 펩티드, 서열번호 1의 변형된 펩티드, 또는 이들의 이량체를 포함하는 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 생리활성 조절물질의 세포 내 전달을 위한, 서열번호 1의 펩티드, 서열번호 1의 변형된 펩티드, 또는 이들의 이량체의 용도를 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 생리활성 조절 물질을 세포 내로 효율적으로 전달하기 위한 서열번호 1의 펩티드, 서열번호 1의 변형된 펩티드, 또는 이들의 이량체를 이용한 전달방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 조성물 및 바이러스 DNA 또는 바이러스를 포함하는 항암용 약제학적 조성물, 이의 암 치료 용도, 및 상기 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암의 치료방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 다음과 같은 서열번호 1의 펩티드를 포함하는 생리활성 조절 물질의 세포 내 전달용 조성물을 제공하며, 상기 생리활성 조절 물질은 핵산, 펩티드, 폴리펩티드, 항체, 화학물질 및 바이러스로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다:
서열번호 1: SWGSLWSGIKNFG
본 발명의 다른 양태에 따르면, 서열번호 1의 펩티드의 N-말단 또는 C-말단에 양전하 아미노산이 추가로 연결된 펩티드를 포함하는, 세포 내 전달용 조성물을 제공한다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 양전하 아미노산은 아르기닌(Arg) 또는 라이신(Lys)이다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 서열번호 1의 펩티드의 N-말단 또는 C-말단에 소수성 아미노산이 추가로 연결된 펩티드를 포함하는, 세포 내 전달용 조성물을 제공한다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 소수성 아미노산은 알라닌(Ala) 또는 페닐알라닌(Phe)이며, 보다 구체적으로 알라닌-페닐알라닌이 상기 서열번호 1의 펩티드의 N-말단에 연결되어 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 서열번호 1의 펩티드 또는 상기와 같이 서열번호 1의 변형된 펩티드의 이량체를 포함하는, 생리활성 조절 물질의 세포 내 전달용 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 서열번호 1의 펩티드, 상기와 같이 서열번호 1의 변형된 펩티드, 또는 이들의 이량체 및 생체적합성 폴리머(biocompatible polymer)를 포함하는 생리활성 조절 물질의 세포 내 전달용 조성물을 제공한다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 생체적합성 폴리머(biocompatible polymer)는 (i) 면역반응 회피성 부위(escapable portion from immune reactions), (ii) 전하성 부위(chargable portion) 및 (iii) 이황화결합을 포함하는 생환원성 부위(bioreducible portion)를 포함하는 폴리머인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 면역반응 회피성 부위(escapable portion from immune reactions)는 PEG(polyethylene glycol), 폴리알킬렌 옥사이드[예컨대, 폴리옥시에틸렌, 폴리옥시프로필렌 또는 이들의 공중합체(예컨대, 폴리에틸렌옥사이드-폴리프로필렌옥사이드-폴리에틸렌 옥사이드 공중합체)], 폴리페닐렌 옥사이드, PEG와 폴리알킬렌 옥사이드의 공중합체, 폴리(메톡시에틸 메타크릴에이트), 폴리(메타크릴로일 포스파티딜콜린), 과불화된 폴리에테르, 덱스트란 또는 폴리비닐피롤리돈으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, (a) (i) 서열번호 1의 펩티드 또는 이의 변형된 펩티드, 상기 펩티드 또는 이들의 이량체, 및 생체적합성 폴리머(biocompatible polymer), 리포솜, 나오좀, 및 나노물질로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 물질, (ii) 바이러스 DNA 또는 바이러스를 포함하는 복합체의 치료학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 항암용 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명에서 이용되는 생체적합성 폴리머 등은 예를 들어 다음과 같으나, 이에 한정되는 것은 아니다:
i. 폴리머
비바이러스성 유전자 전달체로서 폭넓게 사용되는 폴리머계 전달체로는 젤라틴, 키토산 (Carreno GB, Duncan R. Evaluation of the biological properties of soluble chitosan and chitosan microspheres. Int J Pharm 148:231-240(1997)) PLL(poly-LLysine)(Maruyama A, Ishihara T, Kim JS, Kim SW, Akaike T. Nanoparticle DNA carrier with poly (L-lysine) grafted polysaccharide copolymer and poly (D,Llactide). Bioconjugate Chem 8:735-742(1997)) 및 PEI(polyethyleneamine)(Abdallah B, Hassan A, Benoist C, Goula D, Behr JP, Demeneix BA. A powerful nonviral vector for in vivo gene transfer into the adult mammalian brain: Polyethyleneimine. Human Gene Ther 7:1947-1954(1996)) 등이 이용되고 있다. 폴리머계 유전자 전달체들의 장점은 면역반응과 급성독성의 발현율이 낮고 제조법이 간단하며 대량생산이 가능하다는 점이다.
ii. 리포좀 및 니오좀
리포좀은 수상에 분산된 인지질에 의해 자동적으로 형성된다. 외래 DNA 분자를 리포좀으로 성공적으로 세포 내로 운반한 예는 Nicolau 및 Sene, Biochim. Biophys. Acta, 721:185-190(1982) 및 Nicolau et al., Methods Enzymol., 149:157-176 (1987)에 개시되어 있다. 한편, 리포좀을 이용한 동물세포의 형질전환에 가장 많이 이용되는 시약으로는 Lipofectamine(Gibco BRL)이 있다. 운반하고자 하는 목적 뉴클레오타이드 서열을 내포한 리포좀은 엔도사이토시스, 세포 표면에로의 흡착 또는 플라즈마 세포막과의 융합 등의 기전을 통해 세포와 상호 작용하여 세포내로 운반하고자 하는 목적 뉴클레오타이드 서열을 운반한다.
한편, 리포좀이 인지질을 이용하여 만들어 지는 반면, 니오좀(niosome)은 비-이온성 계면활성제(nonionic surfactant) 및 콜레스테롤(cholesterol)의 혼합으로 구성된 이중막 수송체로 극성 및 비극성 물질을 봉입할 수 있고, 삼투압적으로 활성이 있어, 인지질 등에 의한 지질 미립자의 운반체인 리포좀에 비하여 안정하다는 이점이 있다. 또한 제조시 사용되는 계면활성제가 보관 및 취급 시에 특별한 조건이 필요하지 않다는 장점을 가진다.
iii. 나노물질
본 명세서 상의 용어 나노물질은 수 내지 수백 나노미터의 크기를 갖는 생체 적합성 고분자 물질을 의미하는 것으로서, 예를 들면, 폴리에틸렌글리콜(polyetheleneglycol, PEG), 폴리락타이드(poly-lactide, PLA), 폴리글리콜리드(polyglycolide, PGA), 폴리락티드코글리콜 리드(poly-lactide-co-glycolide, PLGA), 폴리카프로락톤(poly-ε-carprolactone, PCL), 히알루론산(hyaluronic acid, HA), 키토산(chitosan), 또는 혈청 알부민이 이에 해당할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 상술한 펩티드 또는 펩티드-폴리머 복합체를 유효성분으로 이용하기 때문에, 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.
본 명세서에서 “바이러스의 DNA"는 바이러스 지놈 DNA 전체인 것, 바이러스 지놈 DNA의 일부가 결실된 것 또는 바이러스 지놈 DNA의 일부가 변형된 것을 포함한다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따른면, 상기 바이러스 DNA가 아데노바이러스 DNA인 경우 (Ad pDNA-폴리머-dimeric peptide 복합체), 상기 Ad pDNA: 폴리머의 중량비는 1:1 ~ 1: 1000일 수 있고, 상기 Ad pDNA와 dimer peptide의 중량비는 1: 0.001 ~ 1:1000일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 이용되는 바이러스는 어떠한 바이러스도 포함하며, 구체적으로 유전자 치료제로 이용되는 바이러스를 포함한다. 예를 들어 다음과 같으나, 이에 한정되는 것은 아니다:
i. 아데노바이러스
아데노바이러스는 중간 정도의 지놈 크기, 조작의 편의성, 높은 타이터, 광범위한 타깃세포 및 우수한 감염성 때문에 유전자 전달 벡터로서 많이 이용되고 있다. 지놈의 양 말단은 100-200 bp의 ITR (inverted terminal repeat)를 포함하며, 이는 DNA 복제 및 패키징에 필수적인 cis-엘리먼트이다. 지놈의 E1 영역 (E1A 및 E1B)은 전사 및 숙주 세포 유전자의 전사를 조절하는 단백질을 코딩한다. E2 영역 (E2A 및 E2B)은 바이러스 DNA 복제에 관여하는 단백질을 코딩한다.
현재 개발된 아데노바이러스 벡터 중에서, E1 영역이 결여된 복제 불능 아데노바이러스가 많이 이용되고 있다. 한편, E3 영역은 통상적인 아데노바이러스 벡터에서 제거되어 외래 유전자가 삽입되는 자리를 제공한다 (Thimmappaya, B. et al., Cell, 31:543-551(1982); 및 Riordan, J. R. et al., Science, 245:1066-1073(1989)). 한편, 세포내로 운반하고자 하는 목적 뉴클레오타이드 서열은 구체적으로 결실된 E1 영역(E1A 영역 및/또는 E1B 영역, 바람직하게는 E1B 영역) 또는 E3 영역에 삽입되며, 보다 구체적으로 결실된 E1 영역에 삽입된다. 본 명세서에서 바이러스 지놈 서열과 관련하여 사용되는 용어, "결실"은 해당 서열이 완전히 결실된 것뿐만 아니라, 부분적으로 결실된 것도 포함하는 의미를 가진다.
또한, 아데노바이러스는 야생형 지놈의 약 105%까지 패킹할 수 있기 때문에, 약 2 kb를 추가적으로 패키징할 수 있다(Ghosh-Choudhury et al., EMBO J., 6:1733-1739(1987)). 따라서, 아데노바이러스에 삽입되는 상술한 외래 서열은 아데노바이러스의 지놈에 추가적으로 결합시킬 수도 있다.
아데노바이러스는 42개의 상이한 혈청형 및 A-F의 서브그룹을 갖는다. 이 중에서, 서브그룹 C에 속하는 아데노바이러스 타입 5가 본 발명의 아데노바이러스 벡터를 얻기 위한 가장 적합한 출발물질이다. 아데노바이러스 타입 5에 대한 생화학적 및 유전적 정보는 잘 알려져 있다.
아데노바이러스에 의해 운반되는 외래 유전자는 에피좀과 동일한 방식으로 복제되며, 이에 숙주세포에 대해 유전적 독성이 매우 낮다.
ii. 레트로바이러스
레트로바이러스는 자신의 유전자를 숙주의 지놈으로 삽입시키고, 대량의 외래 유전 물질을 운반할 수 있으며, 감염시킬 수 있는 세포의 스펙트럼이 넓기 때문에 유전자 전달 벡터로서 많이 이용되고 있다.
레트로바이러스 벡터를 구축하기 위하여, 운반하고자 하는 목적 뉴클레오타이드 서열을 레트로바이러스의 서열 대신에 레트로바이러스 지놈에 삽입되어 복제 불능의 바이러스를 생산한다. 바이리온을 생산하기 위하여, gag, pol 및 env 유전자를 포함하지만 LTR(long terminal repeat)와 Ψ서열이 없는 패키징 세포주를 구축한다 (Mann et al., Cell, 33:153-159(1983)). 운반하고자 하는 목적 뉴클레오타이드 서열, LTR 및 Ψ서열을 포함하는 재조합 플라스미드를 상기 세포주에 이입하면, Ψ서열은 재조합 플라스미드의 RNA 전사체의 생산을 가능하게 하며, 이 전사체는 바이러스로 패키징되고, 바이러스는 배지로 배출된다 (Nicolas and Rubinstein "Retroviral vectors," In: Vectors: A survey of molecular cloning vectors and their uses, Rodriguez and Denhardt (eds.), Stoneham: Butterworth, 494-513(1988)). 재조합 레트로바이러스를 함유하는 배지를 수집하고 농축하여 유전자 전달 시스템으로 이용한다.
2세대 레트로바이러스 벡터를 이용한 유전자 전달이 발표된 바 있다. Kasahara et al. Science, 266:1373-1376(1994))는 몰로니 뮤라인 류케미아 바이러스(MMLV)의 변이체를 제조하였고, 여기에서 EPO(erythropoietin) 서열을 엔벨로프 부위에 삽입하여 새로운 결합 특성을 갖는 키메릭 단백질을 생산하였다. 본 발명의 유전자 전달 시스템도 이와 같은 2세대 레트로바이러스 벡터의 구축 전략에 따라 제조할 수 있다.
iii. AAV 벡터
아데노-관련 바이러스(AAV)는 비분열 세포를 감염시킬 수 있고, 다양한 종류의 세포에 감염할 수 있는 능력을 갖고 있기 때문에 본 발명의 유전자 전달 시스템에 사용될 수 있다. AAV 벡터의 제조 및 용도에 대한 상세한 설명은 미국 특허 제 5,139,941호 및 제 4,797,368호에 상세하게 개시되어 있다.
전형적으로, AAV 바이러스는 두 개의 AAV 말단 리피트가 옆에 위치되어 있는 목적의 유전자 서열을 포함하는 플라스미드(McLaughlin et al., J. Virol ., 62:1963-1973(1988); 및 Samulski et al., J. Virol ., 63:3822-3828(1989)) 및 말단 리피트가 없는 야생형 AAV 코딩 서열을 포함하는 발현 플라스미드 (McCarty et al., J. Virol., 65:2936-2945( 1991))를 동시에 형질전환시켜 제조된다.
iv. 기타 바이러스 벡터
다른 바이러스 벡터들도 본 발명의 유전자 전달 시스템으로 이용할 수 있다. 배시니아 바이러스(Puhlmann M. et al., Human Gene Therapy 10:649-657(1999); Ridgeway, "Mammalian expression vectors," In: Vectors: A survey of molecular cloning vectors and their uses. Rodriguez and Denhardt, eds. Stoneham: Butterworth, 467-492(1988); Baichwal and Sugden, "Vectors for gene transfer derived from animal DNA viruses: Transient and stable expression of transferred genes," In: Kucherlapati R, ed. Gene transfer. New York: Plenum Press, 117-148( 1986) 및 Coupar et al., Gene, 68:1-10(1988)), 렌티바이러스(Wang G. et al., J. Clin. Invest. 104(11):R55-62(1999)) 또는 헤르페스 심플렉스 바이러스(Chamber R., et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 92:1411-1415(1995)), 리오바이러스, 폭스바이러스(GCE, NJL, Krupa M, Esteban M., The poxvirus vectors MVA and NYVAC as gene delivery systems for vaccination against infectious diseases and cancer Curr Gene Ther 8(2):97-120(2008)), 셈리키 포리스터 바이러스로부터 유래된 벡터들도, 목적 뉴클레오타이드 서열을 세포내로 운반할 수 있는 운반 시스템으로 이용할 수 있다.
한편, 본 발명에서 이용되는 바이러스의 외래 유전자 서열은 암세포의 사멸을 유도하고 궁극적으로 종양을 퇴화시키는 암 치료 유전자로서, 종양 억제 유전자, 면역 조절 유전자[예: 사이토카인 유전자, 케모카인 유전자 및 조자극 인자(costimulatory factor: B7.1과 B7.2와 같은 T 세포 활성에 필요한 보조 분자)], 항원성 유전자, 자살 유전자, 세포독성 유전자, 세포증식 억제 유전자, 친-세포사멸 유전자 및 항-신생 혈관 생성 유전자가 포함되며, 이에 한정되는 것은 아니다.
자살 유전자는 세포가 외부 인자에 의해 살상되기 쉽도록 유도하는 물질을 발현하거나 세포에 독성 조건을 유발하는 핵산 서열이다. 이러한 자살 유전자로 잘 알려진 것은 티미딘 키나제(TK) 유전자이다(미국특허 제5,631,236호 및 제5,601,818호). TK 유전자 산물을 발현하는 세포는 간사이클로비르(gancyclovir)의 투여에 의해 선택적인 사멸에 민감하다. 종양 억제 유전자는 종양의 형성을 억제하는 폴리펩타이드를 암호화하는 유전자를 가리킨다. 종양 억제 유전자는 포유동물에서 자연발생 유전자이며, 이 유전자의 결실 또는 불활성화는 종양 발생에 필수 전제인 것으로 믿어지고 있다. 종양 억제 유전자의 예로는 APC, DPC4, NF-1, NF-2, MTS1, WT1, BRCA1, BRCA2, VHL, p53, Rb, MMAC-1, MMSC-2, 망막아세포종 유전자(Lee et al. Nature, 329:642(1987)), 선종양 폴립증 장 단백질(adenomatous polyposis coli protein; 미국특허 제 5,783,666 호), 염색체 3p21.3에 위치한 비인후 종양 억제인자 유전자(Cheng et al. Proc. Nat .Acad. Sci., 95:3042-3047(1998)), 결손된 결장 종양(DCC) 유전자, MTS1, CDK4, VHL, p110Rb, p16 및 p21을 포함한 종양 억제 유전자의 INK4 계열의 일원 및 이의 치료학적으로 유효한 단편(예, p56Rb, p94Rb 등)이 포함된다. 당업자는 상기 예시된 유전자 외에 기타 알려진 항종양 유전자 모두가 본 발명에 사용될 수 있다는 것을 이해할 것이다.
본 명세서에서 용어, "항원성 유전자 (antigenic gene)"는 표적 세포내에서 발현되어 면역 시스템에서 인식할 수 있는 세포표면 항원성 단백질을 생산하는 뉴클레오타이드 서열을 의미한다. 이러한 항원성 유전자의 예에는 암태아성 항원(carcinoembryonic antigen, CEA) 및 PSA(prostate specific antigen), AFP(α-feto protein), p53(WO 94/02167)이 포함된다. 면역 시스템이 용이하게 인식하도록 하기 위해, 상기 항원성 유전자를 MHC 제 I 형 항원에 결합시킬 수 있다.
본 명세서에서 용어, "세포독성 유전자(cytotoxic gene)"는 세포내에서 발현되어 독성 효과를 나타내는 뉴클레오타이드 서열을 의미한다. 이러한 세포독성 유전자의 예에는 슈도모나스 외독소(exotoxin), 리신 독소, 디프테리아 독소 등을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열이 포함된다.
본 명세서에서 용어 "세포증식 억제 유전자 (cytostatic gene)"는 세포 내에서 발현되어 세포 주기 도중에 세포 주기를 정지시키는 뉴클레오타이드 서열을 의미한다. 이러한 세포증식 억제 유전자의 예에는 p21, 망막아세포종 유전자, E2F-Rb 융합 단백질 유전자, 사이클린-종속성 키나아제 억제인자를 코딩하는 유전자(예를 들면, p16, p15, p18 및 p19), 성장 중지 특이성 호메오박스(growth arrest specific homeobox, GAX) 유전자(WO 97/16459 및 WO 96/30385) 등이 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 각종 질환을 치료하는데 유용하게 사용될 수 있는 많은 치료 유전자도 항종양 효과를 돕기위한 수단으로서, 본 발명의 아데노바이러스에 의해 운반될 수 있다. 예를 들면, 사이토카인(예, 인터페론-알파, -베타, -델타 및 -감마), 인터루킨(예, IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-10, IL-12, IL-19 및 IL-20) 및 콜로니 자극 인자(예, GM-CSF 및 G-CSF)를 암호화하는 유전자, 케모카인 그룹(단핵구 화학 주성단백질 1(MCP-1), 단핵구 화학 주성 단백질 2(MCP-2), 단핵구 화학 주성단백질 3(MCP-3), 단핵구 화학 주성 단백질 4(MCP-4), 대식구 염증성 단백질 1α(MIP-1α), 대식구 염증성 단백질 1β(MIP-1β), 대식구 염증성 단백질 1γ(MIP-1γ), 대식구 염증성 단백질 3α(MIP-3α), 대식구 염증성 단백질 3β(MIP-3β), 케모카인(ELC), 대식구 염증성 단백질 4(MIP-4), 대식구 염증성 단백질 5(MIP-5), LD78β, RANTES, SIS-엡실론(p500), 흉선 활성화-조절되는 케모카인(TARC), 에오탁신, I-309, 인간 단백질 HCC-1/NCC-2, 인간 단백질 HCC-3, 마우스 단백질 C10 등)이 포함된다. 또한, 조직 플라스미노겐 활성화제(tPA) 또는 우로키나제를 발현하는 유전자 및 지속적인 혈전 효과를 제공하여 콜레스테롤 과다혈증을 예방하는 LAL 생성 유전자가 포함된다. 또한, 낭성 섬유증, 아데노신 데아미나제 결핍증 및 AIDS와 같은 바이러스, 악성 및 염증 질환 및 상태를 치료하기 위한 많은 폴리뉴클레오타이드가 알려져 있다.
본 명세서에서 용어, "친-세포사멸 유전자 (pro-apoptotic gene)"는 발현되어 프로그램된 세포 소멸을 유도하는 뉴클레오타이드 서열을 의미한다. 이러한 친-세포사멸 유전자의 예에는 p53, 아데노바이러스 E3-11.6K (Ad2 및 Ad5에서 유래) 또는 아데노바이러스 E3-10.5K (Ad에서 유래), 아데노바이러스 E4 유전자, Fas 리간드, TNF-, TRAIL, p53 경로 유전자 및 카스파아제를 코딩하는 유전자가 포함된다.
본 발명의 명세서에서 용어, "항-신생혈관생성 유전자(anti-angiogenic gene)"는 발현되어 항-신생혈관 생성 인자를 세포밖으로 방출하는 뉴클레오타이드 서열을 의미한다. 항-신생혈관 생성 인자에는, 안지오스타틴, Tie 2 (PNAS, 1998, 95,8795-800)와 같은 혈관 내피 성장 인자 (VEGF)의 억제 인자, 엔도스타틴 등이 포함된다.
또한, 본 발명자들에 의해 아데노바이러스 유전자 치료에 적합한 것으로 규명된 릴랙신 유전자 또는 데코린 유전자도 유전자 전달체에 의해 세포내로 운반될 수 있는 유전자이다.
상술한 목적의 뉴클레오타이드 서열은 GenBank 또는 EMBL과 같은 DNA 서열 데이터뱅크로부터 입수할 수 있다.
상술한 본 발명의 펩티드-바이러스 DNA(또는 바이러스) 복합체 또는 펩티드-폴리머-바이러스 DNA(또는 바이러스) 복합체는 다양한 질환의 치료에 이용될 수 있지만, 특히 항암 치료에 유용할 수 있다.
본 명세서에서 "암"은 유방암, 비소세포성 폐암, 폐암, 위암, 간암, 혈액암, 뼈암, 췌장암, 피부암, 두경부암, 피부 또는 안구 흑색종, 자궁육종, 난소암, 직장암, 항문암, 대장암, 난관암, 자궁내막암, 자궁경부암, 소장암, 내분비암, 방광암, 후두암, 골육종, 갑상선암, 뇌암, 결장암, 질암, 음문암, 호지킨병(Hodgkin's disease), 식도암, 부신암, 음경암, 급성 백혈병, 림프구 림프종, 수뇨관암, 신장골반암종, 중추신경계(central nervous system, CNS) 종양, 1차 중추신경계 림프종, 척수 종양, 비인두암, 뇌간 신경교종 또는 뇌하수체 선종, 부갑상선암, 신장암, 연조직종양, 요도암, 전립선암, 기관지암, 또는 골수암을 포함한다.
본 명세서에서 용어 "치료"는 (i) 암 세포 형성의 예방; (ii) 암 세포의 제거에 따른 암과 관련된 질병 또는 질환의 억제; 및 (iii) 암 세포의 제거에 따른 암과 관련된 질병 또는 질환의 경감을 의미한다. 따라서, 본 명세서에서 용어 "치료학적 유효량"은 상기 약리학적 효과를 달성하는 데 충분한 양을 의미한다.
본 발명의 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 비경구 투여가 바람직하고, 예컨대 정맥내 투여, 복강 내 투여, 근육 내 투여, 피하 투여 또는 국부 투여를 이용하여 투여할 수 있다. 난소암에서 복강 내로 투여하는 경우 및 간암에서 문맥으로 투여하는 경우에는 주입 방법으로 투여할 수 있고, 유방암의 경우에는 종양 매스에 직접 주사하여 투여할 수 있으며, 결장암의 경우에는 관장으로 직접 주사하여 투여할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 질병 증상의 정도, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 목적하는 치료에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 약제학적 조성물은 1 × 105-1 × 1015 pfu/㎖의 폴리머-바이러스 복합체를 포함하며, 통상적으로 1 × 1010 pfu를 이틀에 한번씩 2주 동안 주사한다.
본 발명의 약제학적 조성물은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 됨으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 단독의 요법으로 이용될 수 있으나, 다른 통상적인 화학 요법 또는 방사 요법과 함께 이용될 수도 있으며, 이러한 병행 요법을 실시하는 경우에는 보다 효과적으로 암 치료를 할 수 있다. 본 발명의 조성물과 함께 이용될 수 있는 화학 요법제는 시스플라틴 (cisplatin), 카르보플라틴 (carboplatin), 프로카르바진 (procarbazine), 메클로레타민 (mechlorethamine), 시클로포스파미드 (cyclophosphamide), 이포스파미드 (ifosfamide), 멜팔란(melphalan), 클로라부실 (chlorambucil), 비술판 (bisulfan), 니트로소우레아 (nitrosourea), 디악티노마이신 (dactinomycin), 다우노루비신 (daunorubicin), 독소루비신 (doxorubicin), 블레오마이신 (bleomycin), 플리코마이신 (plicomycin), 미토마이신 (mitomycin), 에토포시드 (etoposide), 탁목시펜 (tamoxifen), 택솔 (taxol), 트랜스플라티눔 (transplatinum), 5-플루오로우라실 (5-fluorouracil), 빈크리스틴 (vincristin), 빈블라스틴 (vinblastin) 및 메토트렉세이트 (methotrexate) 등을 포함한다. 본 발명의 조성물과 함께 이용될 수 있는 방사 요법은 X-선 조사 및 γ-선 조사 등이다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면 서열번호 1의 펩티드 또는 이의 변형된 펩티드를 포함하는 조성물을 이용하여 생리활성 조절 물질의 세포 내 전달효율을 증가시키는 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 서열번호 1의 펩티드 또는 이의 변형된 펩티드 및 생체적합성 폴리머(biocompatible polymer)를 포함하는 조성물을 이용하여 생리활성 조절 물질의 세포 내 전달효율을 증가시키는 방법을 제공한다.
본 명세서에서 용어, "생리활성 조절 물질"은 생물학적 활성을 갖는 생리기능 조절물질을 의미하며, 본 발명의 목적 상, 생리기능의 불균형 또는 이상에 의해 야기되는 모든 질환의 치료에 적용될 수 있는 물질로서, 핵산, 펩티드, 폴리펩티드, 항체, 화학물질 (Chemical compound, Chemotherapeutics) 또는 바이러스일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 방법은 상술한 펩티드 또는 펩티드-폴리머 복합체를 이용하기 때문에, 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(a) 본 발명은 생리활성 조절 물질을 세포 내로 효율적으로 전달하기 위한 조성물을 제공한다.
(b) 또한, 본 발명은 상기 조성물 및 바이러스 DNA 또는 바이러스를 포함하는 항암용 약제학적 조성물을 제공한다.
(c) 또한, 본 발명은 생리활성 조절 물질을 세포 내로 효율적으로 전달하기 위한 방법을 제공한다.
(d) 본 발명의 펩티드 또는 펩티드-폴리머 복합체는 기존의 방법에 비해 높은 세포 내 전달효율을 나타내므로 다양한 치료제의 세포 내 전달을 위한 전달체로서 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 종양 선택적 살상 아데노바이러스의 암세포 특이적 살상효능을 보여주는 개요도이다.
도 2는 아데노바이러스 플라스미드 DNA-폴리머를 이용한 전신 투여법을 아데노바이러스 자체를 이용한 투여법과 비교한 개요도이다.
도 3은 Ad DNA-폴리머-펩티드 복합체(Ad pDNA-폴리머-VI-9R)의 DNA 농축(condensation) 조건을 확인한 결과이다.
도 4는 Ad DNA-폴리머-펩티드 복합체(Ad pDNA-PPCBA-VI-9R)의 세포 내 유전자 전달효율 비교한 사진이다.
도 5는 Ad DNA-폴리머-펩티드 복합체(Ad DNA-폴리머-VI-9R)의 바이러스 증식능을 분석한 도표이다.
도 6은 Ad DNA-폴리머-펩티드 복합체(Ad pDNA-폴리머-VI-9R)의 세포흡수 효율을 분석한 도표이다.
도 7은 Ad DNA-폴리머-펩티드 복합체(Ad pDNA-PAM-ABP-VI-9R)의 엔도좀 탈출을 형광현미경으로 관찰한 사진이다.
도 8은 변형된 펩티드들의 서열을 정리한 도표이다.
도 9는 pH 변화에 따른 펩티드의 표면전하 비교한 도표이다.
도 10은 Ad DNA-폴리머-펩티드 복합체(Ad pDNA-PPCBA-R-펩티드)의 세포 내 유전자 전달효율 비교한 사진이다.
도 11은 Ad DNA-폴리머-펩티드 복합체(Ad pDNA-PAM-ABP-펩티드)의 세포 내 유전자 전달효율 비교 검증한 결과이다.
도 12는 다양한 Ad DNA-폴리머-펩티드 복합체의 세포흡수 효율을 비교분석한 도표이다.
도 13은 다양한 종류의 변형된 펩티드와 Ad pDNA 복합체의 DNA 농축효율을 비교한 도표이다.
도 14는 다양한 종류의 변형된 펩티드에 의한 막 용해활성(membrane lytic activity)을 비교한 사진이다.
도 15는 다양한 Ad DNA-폴리머-펩티드 복합체의 핵내 위치화 효율 비교한 도표이다.
도 16은 Ad DNA-폴리머-펩티드 복합체(Ad pDNA-(PAM-ABP)-펩티드)의 효과를 검증한 것으로서, 도 16의 a는 바이러스 증식능을 확인한 결과; 도 16의 b는 암세포 살상능을 확인한 결과이다.
도 17은 Ad DNA-폴리머-펩티드 복합체(Ad pDNA-(PAM-ABP)-펩티드)의 바이러스 증식능을 Q-PCR로 viral Paticle의 수를 측정하여 확인한 결과이다.
도 18은 Ad DNA-폴리머-이량체 펩티드 복합체(Ad pDNA-(PAM-ABP)-펩티드)의 세포 내 유전자 전달효율을 확인한 결과이다.
도 19는 Ad DNA-폴리머-이량체 펩티드 복합체(Ad pDNA-(PPCBA-PEI-Arg)-펩티드)의 세포 내 유전자 전달효율을 확인한 결과이다.
도 20은 PC-3 세포주에서, Ad pDNA-폴리머-이량체 펩티드 복합체의 효과를 확인한 것으로서, 도 20의 a는 바이러스 증식능을 확인한 결과; 도 20의 b는 암세포 살상능을 확인한 결과이다.
도 21은 HapT1 세포주에서, Ad pDNA-폴리머-이량체 펩티드 복합체의 효과를 확인한 것으로서, 도 21의 a는 바이러스 증식능을 확인한 결과; 도 21의 b는 암세포 살상능을 확인한 결과이다.
도 22는 A549 세포주에서, 아데노바이러스/펩티드 복합체(Ad/펩티드 복합체)의 세포 내 유전자 전달효율을 확인한 결과이다.
도 23은 MCF-7 세포주에서, 아데노바이러스/펩티드 복합체(Ad/펩티드 복합체)의 세포 내 유전자 전달효율을 확인한 결과이다.
도 24는 H460 세포주에서, 아데노바이러스/펩티드 복합체(Ad/펩티드 복합체)의 세포 내 유전자 전달효율을 확인한 결과이다.
도 25는 U343 세포주에서, 아데노바이러스/펩티드 복합체(Ad/펩티드 복합체)의 세포 내 유전자 전달효율을 확인한 결과이다.
도 26은 화학물질/펩티드 복합체의 세포흡수 효율을 비교 분석한 결과이다.
도 27은 화학물질/펩티드 복합체 (MG123/펩티드 복합체)의 암세포 살상능을 확인한 결과이다.
도 28은 화학물질/펩티드 복합체 (DOX/펩티드 복합체)의 암세포 살상능을 확인한 결과이다.
도 29는 단백질 (Human serum albumin)/Peptide 복합체의 세포흡수 효율을 확인한 것으로서, 도 29의 a는 50nM의 단백질을 이용한 경우, 도 29의 b는 0.5M의 단백질을 이용한 경우이다.
도 30은 항체/펩티드 복합체 (Antibody(Rabbit polyclonal to TGF beta 1)/ 펩티드 복합체)의 세포 내 전달효율을 확인한 결과이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 통상의 기술자에 있어 자명할 것이다.
[실시예]
실시예 1: 펩티드 및 폴리머 복합체의 물리적 특성 분성
아데노바이러스 단백질 VI에서 유래한 13개의 아미노산으로 구성된 펩티드(서열번호 1)의 C-말단에 9개의 아르기닌 아미노산을 연결시킨 펩티드(VI-9R) 및 폴리머를 이용하여 아데노바이러스 DNA의 세포 내로의 전달효율을 향상시키고자 하였다. 이를 위해, 우선 아데노바이러스 DNA를 PBS 버퍼에 넣고, 여기에 중량 비율을 계산하여 펩타이드를 넣은 뒤, 상온에서 10분간 반응시켰으며, 이후 다양한 중량 비율로 폴리머를 다시 첨가하고 상온에서 15분간 반응시켜 Ad pDNA-폴리머-VI-9R 복합체를 제조하였다. 폴리머로서 arginine-grafted bio-reducible poly(CBA-DAH) polymer (ABP)와 polyamidoamine (PAMAM) dendrimer가 결합된, PAM-ABP를 사용하였으며, 구조는 하기 나타낸 바와 같다 (Journal of Controlled Release, Vol 160 592-600 2012).
Figure PCTKR2016009714-appb-C000001
이후, DNA가 펩티드-폴리머 복합체가 Ad pDNA와 결합하여 복합체를 형성하는 조건을 찾고자 하였다. 아데노바이러스 플라스미드 DNA(Ad pDNA)와 VI-9R의 중량비율을 1:10으로 고정하여 반응시킨 다음, 폴리머와의 중량비율을 1:1, 1:5, 1:10, 1:15 및 1:20으로 조절하여 Ad pDNA-폴리머-VI-9R 복합체의 결합정도를 확인하였다. Ad pDNA-폴리머-VI-9R 복합체 형성의 최적 조건을 결정하고 물리적 특성을 분석하기 위하여 gel retardation assay를 실시하였다.
분석결과, DNA:폴리머의 중량비가 1:1 일 때부터 아데노바이러스 DNA가 폴리머-펩티드 복합체로 탑재되어 DNA 농축이 충분히 일어난 것을 확인할 수 있었다(도 4). 따라서 VI-9R을 폴리머와 함께 사용하는 경우, 적은양의 폴리머로도 아데노바이러스 DNA가 폴리머-펩티드 복합체 내로 충분히 탑재될 수 있다는 것을 확인하였다.
실시예 2: Ad pDNA-폴리머-VI-9R 복합체의 세포 내 유전자 전달효율 확인
실시예 2에서는 폴리머로서, 생분해성과 pH 민감성을 갖는 폴리머로 PPCBA (mPEG-b-Pip-CBA)를 사용하였으며, 구조는 하기 나타낸 바와 같다 (Biomaterials, Vol41 53-68 2015).
Figure PCTKR2016009714-appb-C000002
Ad pDNA-PPCBA-VI-9R 복합체의 세포 내 유전자 전달효율을 확인하기 위하여, 우선, GFP를 발현하는 복제 불능 아데노바이러스의 플라스미드 DNA(pdE1/GFP)를 이용하여 아데노바이러스 DNA를 PBS 버퍼에 넣고, 중량 비율을 계산하여 동일한 튜브에 펩타이드를 넣은 후, 상온에서 10분간 반응시켰다. 이후, 상기 폴리머를 첨가시킨 뒤, 상온에서 15분간 반응시켜 Ad pDNA-폴리머-VI-9R 복합체를 제조하였다. pdE1/GFP-PPCBA 및 pdE1/GFP-PPCBA-VI-9R 복합체를 24 well 플레이트에 60-70%로 분주된 293A 세포주에 처리하고 72시간 후에 형광 현미경을 이용하여 GFP의 발현을 관찰하였다.
관찰결과, pdE1/GFP-PPCBA의 경우, GFP의 발현이 전혀 관찰되지 않았지만, pdE1/GFP-PPCBA-VI-9R 복합체를 세포에 처리한 경우, 현저하게 증가한 GFP의 발현을 관찰할 수 있었다(도 4). 상기 결과를 통하여 폴리머와 VI-9R을 결합한 형태의 pdE1/GFP-PPCBA-VI-9R 복합체는 바이러스 DNA와 폴리머만이 결합된 복합체(pdE1/GFP-PPPCBA)의 한계인 낮은 유전자 전달효율을 극복하고 세포 내로의 유전자 전달효율을 현저하게 증가시킬 수 있다는 것을 확인하였다.
실시예 3: Ad pDNA-폴리머-VI-9R 복합체의 바이러스 증식능 확인
실시예 3에서는 폴리머로 PPCBA를, 아데노바이러스 DNA로 GFP를 발현하는 종양 선택적 살상 아데노바이러스인 RdB/GFP의 viral DNA인 Ad pDNA (RdB/GFP)를 사용하였다. Ad pDNA(RdB/GFP)-PPCBA-VI-9R 복합체의 바이러스 증식능을 확인하기 위하여 A549 세포주를 12 well 플레이트에 분주하고, 24시간 후에 naked Ad pDNA, Ad pDNA-PEI 25K 복합체 및 Ad pDNA-PPCBA-VI-9R 복합체를 각각 세포에 처리하였다. 72시간 후에 배양액을 수집하여 아데노바이러스의 입자(particle)수를 Q-PCR을 이용하여 확인하였다.
분석결과, naked Ad pDNA만을 처리한 경우 바이러스 생산량은 기초 수준(9.2 X 103 VP)을 나타낸 반면, Ad pDNA-PPCBA-VI-9R 복합체를 처리한 경우에는, naked Ad pDNA를 처리한 경우보다 596배 더 증가된 바이러스 생산량(5.5 X 106 VP)을 확인하였다(도 5). 이는 양성 대조군인 Ad pDNA-PEI 25K 복합체를 처리한 경우(1.2 X 106 VP)에 비해서도 4.6배 증가된 것이었다. 이러한 결과는 Ad pDNA-PPCBA-VI-9R 복합체의 경우 암세포 내에서 바이러스 증식이 매우 성공적으로 이루어지며, 이후 증식된 아데노바이러스가 연쇄적으로 종양세포에서 증식되는 특성으로 인해 바이러스의 생산량이 매우 크게 증가할 가능성을 보여주는 결과이다.
실시예 4: Ad pDNA - 폴리머 -VI-9R 복합체에 의한 Ad pDNA의 cellular Uptake 효율 확인
실시예 4에서는 폴리머로 PAM-ABP를 사용하였다. Ad pDNA(dE1/GFP)-PAM-ABP-VI-9R 복합체에 의해 증가된 Ad pDNA의 세포 흡수효율을 확인하기 위하여 293A 세포주를 12 well 플레이트에 60-70%로 분주하고 24시간 후에 FITC로 표지된 Ad 플라스미드 DNA(FITC-pDNA)를 이용한 Ad pDNA-PEI, Ad pDNA-PAM-ABP 및 Ad pDNA-PAM-ABP-VI-9R 복합체를 세포에 처리하였다. 2시간 후 FACS를 이용하여 세포내로 흡수된 FITC 표지-pDNA의 양을 비교하였다.
분석결과, FITC로 표지된 Ad pDNA를 PEI, PAM-ABP 및 PAM-ABP/VI-9R (pDNA:VI-9R 1:5 또는 1:10 중량비)와 반응시켜 형성된 복합체를 세포에 트랜스펙션하고 2시간 후에 FACS를 실시하였다. 분석결과, PAM-ABP를 사용한 경우, 양성 대조군으로 사용한 Ad pDNA-PEI에 비해서 현저하게 증가되었다. 특히, Ad pDNA-PAM-ABP-VI-9R 복합체의 경우, 폴리머만을 이용한 PAM-ABP보다 각각 1.2 내지 1.4배 향상된 세포흡수율을 나타내었다(도 6). 이러한 결과는 VI-9R이 pDNA 및 PAM-ABP와 결함하여 세포투과성을 높여주었기 때문에 Ad pDNA-PAM-ABP/VI-9R 복합체의 세포흡수효율이 향상된 것으로 보인다.
실시예 5: Ad pDNA - 폴리머 -VI-9R 복합체의 암세포 내 엔도좀 탈출( endosome escape) 효과
실시예 5에서는 폴리머로 PAM-ABP를, 아데노바이러스 DNA로 pdE1-GFP 사용하였다. 세포 내로 전달된 생물학적 제제의 엔도좀 격리현상(endosomal sequestration)은 유전자 전달효율 향상의 중요한 장애물로 작용한다. 한편, 아민, 술폰아마이드 또는 카르복실산 등을 지닌 고분자 물질은 엔도좀 막(endosome membrane)을 파괴하여 세포 내로 전달된 생물학적 제제를 엔도좀에서 탈출시키는 기능을 나타내며, 결과적으로 비바이러스성 유전자 전달효율 및 화학 약물의 핵 내로의 전달효율을 증가시킬 수 있다는 것이 알려져 있다. 실시예 5에서는 VI-9R에 의한 viral DNA의 엔도좀 탈출(endosome escape) 효과를 검증하기 위하여, 세포의 형광 염색을 실시하였다. HEK293(1 × 105 cells) 세포주를 커버슬라이드가 들어 있는 6 well에 분주하고 24시간 후에 핵과 엔도좀을 각각 DAPI와 lysotracker로 염색하였다. 이후 GFP를 발현하는 아데노바이러스의 DNA(pdE1-GFP)와 PAM-ABP 또는 PAM-ABP-VI-9R 복합체와의 결합물인 Ad pDNA-PAM-ABP, 또는 Ad pDNA-PAM-ABP-VI-9R을 각각 2 ㎍/㎖mL의 농도로 처리하고, 4시간 후에 4% 포름알데히드 용액으로 고정하여 공초점현미경으로 엔도좀 탈출효과를 관찰하였다.
관찰결과(도 7), Ad pDNA-PAM-ABP를 처리한 세포의 경우 lysotracker와 GFP가 중첩되어 있었는데, 이는 Ad pDNA-PAM-ABP를 단독으로 viral DNA와 결합하여 처리하였을 때 viral DNA의 엔도좀으로부터 탈출효율이 낮다는 것을 의미한다. 반면, Ad pDNA-PAM-ABP-VI-9R 복합체를 처리한 경우 GFP와 lysotracker의 형광이 겹쳐지지 않았을 뿐만 아니라 바이러스(GFP)가 핵 내로 이동한 것이 관찰되었는데, 이는 Ad pDNA-PAM-ABP-VI-9R 복합체가 viral DNA의 엔도좀 탈출효율을 향상시켰다는 것을 의미한다. 이러한 결과는 Ad pDNA-PAM-ABP를 단독으로 사용한 경우 낮은 엔도좀 탈출효과 및 이에 따른 유전자 전달효율의 저하라는 한계가 폴리머-VI-9R 복합체의 사용에 의해 극복될 수 있다는 것을 보여주는 것이다.
실시예 6: Ad Protein VI 유래 펩티드의 변형 및 이들의 물리적 특성
상기 실시예에서 확인된 VI-9R의 유전자 전달효율을 보다 개선하기 위하여, 아데노바이러스 단백질 VI 유래 펩티드(서열번호 1)를 다양한 형태로 변형시켰다(도 8). 즉, 펩티드의 N-말단에 소수성 아미노산을 추가하거나 기존에 알려져 있는 세포투과 펩티드(CPP)인 TAT을 추가로 연결시켰다. 변형된 펩티드들의 물리적 특성을 분석하고자 각각의 펩티드를 10 ㎍/㎖ 씩 총 1 ㎖ 부피의 큐벳에 넣고 Zeta-sizer를 이용하여 pH 7.4 PBS 및 pH 6.4 PBS에 용해된 펩티드들의 표면전하 값을 측정하였다.
Zeta potential 분석 결과(도 9), VI-9R의 경우 pH 7.4의 환경에서 16.6 ± 0.41 mV 의 음전하를 띠고 있었으며, VI-9R 펩티드의 경우 R 서열의 추가로 4.87 ± 0.42 mV의 양전하를 띠고 있었다. 변형된 VI(mVI)의 경우 VI 펩티드와 비교했을 때 표면전하가 양전하로 바뀌었다. 또한, 양극성 아미노산인 글루탐산(E, Glutamic acid)을 추가한 mVI-TAT-A 또는 mVI-A-TAT의 경우 pH가 낮아짐에 따라 표면전하가 증가하였다.
실시예 7: Ad pDNA-폴리머-펩티드 복합체의 세포 내 유전자 전달효율
실시예 7에서는 폴리머로 PPCBA 및 PAM-ABP를 사용하였다. Ad pDNA(dE1/GFP)-PPCBA-펩티드 복합체의 세포 내 유전자 전달효율을 확인하기 위하여 293A 세포주를 24 well 플레이트에 60-70%로 분주하고 변형된 6종류의 펩티드와 Ad pDNA-PPCBA-펩티드 복합체를 각각 세포에 처리하였다. 대조군으로는 VI-9R, NLS, TAT 및 protamine을 사용하였으며 복합체를 처리하고 24시간 후, 형광 현미경을 이용하여 GFP의 발현을 관찰하였다.
분석결과, Ad pDNA-PPCBA-VI-9R 복합체를 처리한 경우, Ad pDNA 또는 Ad pDNA-PPCTBA를 처리한 경우에 비하여 GFP의 발현이 현저하게 증가하였다. 또한, 변형된 6종류의 펩티드 mVI, mVI-TAT, mVI-TAT-A, mVI-G-TAT-A, mVI-A-TAT 또는 mVI-G-A-TAT를 Ad pDNA-PPCTBA과 복합체를 형성하여 처리한 경우, VI-9R을 변형하지 않은 경우에 비해 GFP의 발현이 증가하였다(도 10).
또 다른 폴리머인 PAM-ABP를 이용한 Ad pDNA(dE1/GFP)-PAM-ABP-펩티드 복합체의 세포 내 유전자 전달효율을 확인하기 위하여 293A 세포주를 24 well 플레이트에 60-70%로 분주하고 24시간 후에 변형된 6종류의 펩티드 mVI, mVI-TAT, mVI-TAT-A, mVI-G-TAT-A, mVI-A-TAT, mVI-G-A-TAT를 이용한 Ad pDNA-PAM-ABP-펩티드 복합체를 각각 세포에 처리하였다. 대조군으로 Ad pDNA-PAM-ABP/TAT와 Ad pDNA/PEI25K를 사용하였으며 복합체를 처리하고 4일 후, 형광 현미경을 이용하여 GFP의 발현을 관찰하였다.
분석결과, Ad pDNA-PAM-ABP-펩티드 복합체를 처리한 경우 Ad pDNA-PAM-ABP를 처리한 경우보다 유전자 전달효율 증가하였다(도 11). 특히, 양성대조군인 Ad pDNA-PAM-ABP/TAT를 처리한 경우에 비해서도 변형된 6종류의 펩티드 mVI, mVI-TAT, mVI-TAT-A, mVI-G-TAT-A, mVI-A-TAT 및 mVI-G-A-TAT를 PAM-ABP와 결합시킨 형태의 Ad pDNA-PAM-ABP-펩티드 복합체를 처리한 경우에 유전자 전달효율이 현저하게 증가하였다. 이와 같은 결과는 변형된 펩티드가 Ad pDNA-PPCBA-펩티드 복합체의 유전자 전달효율을 증가시킬 수 있다는 것을 보여주는 것이다.
실시예 8: Ad pDNA - 폴리머 -펩티드 복합체에 의한 Ad pDNA의 세포흡수 효율증가
실시예 7에서는 폴리머로 PAM-ABP를 사용하였다. Ad pDNA-PAM-ABP-펩티드 복합체의 세포 흡수효율을 확인하기 위하여 A549 폐암 세포주를 12 well 플레이트에 60-70%로 분주하고 24시간 후에 FITC가 표지된 Ad pDNA(dEl/GFP)와 PAM-ABP-VI-9R 또는 다양한 종류의 PAM-ABP-변형된 펩티드 복합체(mVI, mVI-TAT, mVI-TAT-A, mVI-G-TAT-A, mVI-A-TAT 및 mVI-G-A-TAT)를 처리하였다. 대조군으로 Ad pDNA-PAM-ABP-NLS 및 Ad pDNA-PAM-ABP-TAT을 사용하였으며 복합체를 처리하고 30분 후에 FACS를 이용하여 세포 내로 흡수되 FITC-pDNA의 양을 비교, 분석하였다.
VI-9R 및 6종류의 변형된 펩티드(mVI, mVI-TAT, mVI-TAT-A, mVI-G-TAT-A, mVI-A-TAT 및 mVI-G-A-TAT)로 형성된 Ad pDNA-PAM-ABP-펩티드 복합체의 세포 흡수율은 대조군인 Ad pDNA-PAM-ABP에 비해 각각 2.4, 2.6, 2.5, 2.0, 2.1, 1.6 및 2.1배 증가하였다(도 12). 특히, 또 다른 양성 대조군인 Ad pDNA-PAM-ABP/NLS 및 Ad pDNA-PAM-ABP/TAT에 비해서도 현저히 증가된 세포흡수율을 나타내었다.
실시예 9: Ad pDNA-펩티드 복합체에 의한 DNA 농축효율 분석
Ad pDNA-펩티드 복합체의 DNA 농축효율 확인하기 위하여, 피코그린 염색(picogreen staining)을 통한 DNA 농축효율을 확인하였다. DNA에 특이적으로 결합하는 것으로 알려져 있는 피코그린 시약(100 ㎕)을 다양한 형태의 Ad pDNA-펩티드 복합체(1 ㎍)와 반응시킨 다음, 마이크로플레이트 리더기를 이용하여 형광발현 정도를 확인하고 농축되는 효율을 확인하였다. DNA 농축이 잘 되었을 수록 형광발현 정도가 약하게 나타난다.
분석결과, Ad pDNA-VI의 경우, DNA 농축이 거의 되지 않았으며, 변형된 펩티드 중, mVI-TAT, mVI-TAT-A 및 mVI-A-TAT의 경우 DNA 농축이 유도되었지만, mVI, mVI-G-TAT-A 및 mVI-G-A-TAT의 경우 DNA 농축이 유도되지 않는 것을 확인하였다 (도 13).
실시예 10: 펩티드에 의해 향상된 막 용해 활성
엔도좀 탈출(endosomal escape)는 엔도좀 내에서 막(membrane)을 용해하여 DNA가 탈출하는 현상이므로, Ad-폴리머-펩티드 복합체에 의해 막을 용해시키는 정도를 확인하고자 PI 염색을 실시하였다. 사용한 펩티드들은 50nM로 동일하게 30분간 37℃ 인큐베이터에서 반응시켰다. 이후 100 ㎍의 PI를 10분간 37℃에서 반응시킨 다음 배지교체 후, 형광 현미경으로 결과를 확인하였다. 막의 용해 정도가 높을수록 형광발현 정도가 증가하게 된다.
분석결과, 양성 대조군으로 사용한 펩티드인 TAT을 처리한 경우, 막의 용해가 거의 일어나지 않은 반면, 펩티드(VI-9R, mVI-TAT-A, mVI-A-TAT 및 mVI-G-A-TAT)을 처리한 경우, 막 용해효율이 현저하게 향상된 것을 확인하였다(도 14). 이를 통하여 변형된 펩티드는 향상된 엔도좀 탈출효과를 나타낼 것이라고 기대할 수 있었다.
실시예 11: Ad pDNA - 폴리머 -펩티드 복합체에 의해 증가된 핵 내 위치화 (nuclear localization)
실시예 11에서는 폴리머로 PAM-ABP를 사용하였다. Ad pDNA-폴리머-펩티드 복합체에 의해 향상된 핵 내 위치화를 비교하기 위하여, A549 세포주를 24 well에 분주하였다. Ad DNA에 FITC를 표지한 후, 이를 이용하여 Ad pDNA-PAM-ABP 복합체 및 Ad pDNA-PAM-ABP-펩티드(mVI, mVI-TAT, mVI-TAT-A, mVI-G-TAT-A, mVI-A-TAT, mVI-G-A-TAT, VI, VI-9R, TAT 및 NLS) 복합체를 만든 후, 이를 세포 분주 24시간 후에 각각 처리하였다. Ad pDNA-PAM-ABP-펩티드 복합체를 처리하고 4시간 후에 세포질과 핵을 Nuclear/Cytosolic Fractionation Kit(Cell Biolabs, San Diego, CA)를 제조사의 설명서에 따라 사용하여 Ex/Em = 495/519 nm에서 측정하였다. 각 그룹의 세포질과 핵의 평균값의 합을 100%로 환산하여 상대 비교하였다.
분석결과, Ad pDNA-PAM-ABP를 처리한 경우와 비교하여 Ad pDNA-PAM-ABP-펩티드 복합체를 이용한 모든 경우, Ad pDNA의 핵 내 위치화가 현저히 증가한 것을 확인하였다. 또한, 이는 양성대조군(Ad pDNA-PAM-ABP-NLS 또는 Ad pDNA-PAM-ABP-TAT 복합체)과 비교한 경우에도 핵 내 위치화 비율이 증가한 것이었다(도 15). 이러한 결과를 통해, Ad pDNA-PAM-ABP-펩티드 복합체의 경우 펩티드의 변형을 통해 Ad DNA의 핵 내 위치화를 증가시킬 수 있으며 결과적으로 아데노 바이러스의 복제를 향상시킬 수 있다는 것을 확인하였다.
실시예 12: Ad pDNA - 폴리머 -펩티드 복합체의 바이러스 증식능 및 암세포 살상능 확인
본 실시예에서는, Ad pDNA-폴리머-펩티드 복합체의 아데노바이러스 증식능 및 암세포 살상능을 확인하기 위하여, 폴리머 PAM-ABP와 아데노바이러스 DNA로 Decorin(DCN)과 shcMet을 발현하는 종양선택적 살상 아데노바이러스인 H-Rd19-k35/DCN/shcMet의 viral DNA를 포함하는 Ad pDNA를 사용하여 복합체를 제작하였다. 인체 자궁암 세포주인 Hela 세포주를 12 well plate에 분주하고, 24시간 후, naked Ad pDNA, Ad pDNA/PAM-ABP, 6종류의 peptide mVI, mVI-TAT, mVI-TAT-A, mVI-G-TAT-A, mVI-A-TAT 및 mVI-G-A-TAT를 각각 Ad pDNA/PAM-ABP와 결합시킨 Ad pDNA/PAM-ABP/peptide 복합체 및 대조군인 VI-9R, TAT peptide와의 복합체를 각각 상기 세포에 처리하였다. 또한 세포 독성여부를 검증하기 위하여, PAM-ABP 혹은 peptide 만을 단독으로 세포에 처리하였다. 처리 4일 후, 상기 배양액을 수집하여 아데노바이러스의 입자 (Particle) 수를 Q-PCR을 이용하여 확인하였으며. 암세포 살상능을 검증하기 위하여 상층액을 제거한 plate에 PBS 내의 2 mg/ml의 3-(4,5-디메틸싸이아졸-2-일)-2,5-디페닐-테트라졸륨 브로마이드(MTT; Sigma Aldrich) 200 μL를 각 웰에 첨가시켰고, 37℃에서 4시간동안 배양시켰다. 그 후, 상청액을 제거하였고, 침전물을 1.0 ml 디메틸설폭사이드에 용해시킨 뒤, 플레이트를 마이크로플레이트 리더 상에서 540 nm의 흡광도에서에서 판독하였으며. 처리하지 않은 세포군을 음성 대조군으로 분류하였다.
분석 결과, Hela 세포주에서 naked Ad pDNA만을 처리한 경우, 바이러스 생산량은 기초 수준으로 1.5 X 103 VP 나타내었고, 6 종류의 peptide로 형성된 Ad pDNA/PAM-ABP/peptide 복합체의 바이러스 생산량은 대조군인 Ad pDNA/PAM-ABP에 비해 mVI-G-TAT-A를 사용한 복합체를 제외하고, 각각 8.0, 11.6, 34.1, 29.5 및 25.6배 가량 증가하였으며, 특히, 다른 대조군인 VI-9R 혹은 TAT에 비해서도 현저히 증가된 바이러스 생산능을 확인할 수 있었다 (도 16a). 또한, 암세포 살상능과 세포 독성을 확인하기 위해 상층액을 제거한 각 plate에 MTT 용액을 처리한 결과, VI-9R peptide에서 높은 세포독성이 보였으나, mVI, mVI-G-TAT-A, mVI-A-TAT, mVI- G-A-TAT 에서는 상대적으로 높은 세포독성을 보이지 않았으며, 암세포 살상능을 확인한 결과, 6종류의 peptide로 형성된 Ad pDNA-(PAM-ABP)-peptide 복합체의 바이러스 생산량은 대조군인 Ad pDNA/PAM-ABP에 비해 각각 22.5, 18.7, 29.5, 7.1, 21.7, 26.5% 증가된 암세포 살상능을 확인하였다 (도 16b). 특히, 상기 결과에서 VI-9R을 이용한 Ad pDNA/PAM-ABP/peptide 복합체에서 가장 높은 암세포 살상능을 보인 점은, VI-9R 자체의 독성에 의한 암세포 사멸 유도 효과인 것으로 유추해 볼 수 있다.
상기 결과로부터, Ad pDNA-(PAM-ABP)-peptide 복합체의 경우, 암세포 내에서 바이러스 증식이 매우 성공적으로 이루어지며, 종양세포에서 증식된 아데노바이러스는 연쇄적으로 암세포 특이적 살상능으로 이어져서 바이러스 증식능과 암세포 살상능이 크게 증가됨을 알 수 있었다.
실시예 13: Ad pDNA - 폴리머 -펩티드 복합체의 바이러스 증식능 및 암세포 살상능 검증
본 실시예에서는, Ad pDNA-폴리머-펩티드 복합체의 아데노바이러스 증식능을 검증하고자 폴리머 PAM-ABP와 아데노바이러스 DNA로 Green Fluorescent Protein (GFP)을 발현하는 종양선택적 아데노바이러스인 RdB/GFP의 viral DNA를 포함하는 Ad pDNA를 사용하여 복합체를 제작하였다. 인체 폐암 세포주인 A549 세포주를 12 well plate에 분주하고, 24시간 후에 naked Ad pDNA, Ad pDNA/PAM-ABP, 6종류의 peptide mVI, mVI-TAT, mVI-TAT-A, mVI-G-TAT-A, mVI-A-TAT 및 mVI-G-A-TAT를 각각 Ad pDNA-(PAM-ABP)와 결합시킨 Ad pDNA/PAM-ABP/peptide 복합체 및 대조군인 VI-9R, TAT peptide와의 복합체를 각각 세포에 처리하였다. 처리 4일 후, 상기 배양액을 수집하여 아데노바이러스의 입자 (Particle) 수를 Q-PCR을 이용하여 확인하였다.
분석 결과, A549 세포주에서 naked Ad pDNA만을 처리한 경우, 바이러스 생산량은 기초 수준으로 1.2 X 103 VP 나타내었고, 6 종류의 peptide로 형성된 Ad pDNA-(PAM-ABP)-peptide 복합체의 바이러스 생산량은 대조군인 Ad pDNA/PAM-ABP에 비해 mVI, mVI-G-TAT-A를 사용한 복합체를 제외하고 각각 1.95, 2.01, 1.03 및 10.7 배 가량 증가하였으며, 특히, 다른 대조군인 VI-9R 혹은 TAT에 비해서도 현저히 증가된 바이러스 생산능을 확인할 수 있었다 (도 17).
실시예 14: Ad pDNA - 폴리머 - 이량체 펩티드 복합체에 의해 증가된 세포내 유전자 전달효율 확인
본 실시예에서는, Ad pDNA(dE1/GFP)-(PAM-ABP)-dimeric peptide 복합체의 세포 내 유전자 전달효율을 확인하기 위하여, 293A 세포주를 24 well plate에 60-70%로 분주하고 변형된 monomer peptide, dimeric peptide와 Ad pDNA-(PAM-ABP)-dimeric peptide 복합체를 각각 세포에 처리하고, 처리 48시간 후, 형광 현미경을 통해 GFP의 발현을 관찰하였다.
한편, Dimeric peptide는 air oxidation 기법을 이용하여 제작하였다. 구체적으로, 2 mg의 monomer peptide를 0.1 M deaerated ammonium bicarbonate 2 mL에 녹인 후, 혼합물을 24시간 동안 상온에서 뚜겅이 열린 조건으로 교반시켜 dimeric peptide를 제작하였다. 이후, dialysis castte을 이용하여 monomer peptide를 분리하고 남은 반응물은 freeze-dry를 통해서 power를 얻어서 사용하였다. 대조군으로는 TAT, 변형 전 펩타이드(mVI-G-A-TAT)를 사용하여 만든 복합체, PEI25k, PAM-ABP polymer와 Ad pDNA만을 결합시킨 복합체를 이용하였다.
또한, 다른 폴리머인 PPCBA-PEI-Arg를 이용한 Ad pDNA(RdB/GFP)-(PPCBA-PEI-Arg)-peptide 복합체의 세포 내 유전자 전달효율을 확인하였으며, 이를 위하여, 293A 세포주를 24 well plate에 60-70%로 분주하고 24 시간 후에 변형된 dimeric peptide를 이용해 Ad pDNA-(PPCBA-PEI-Arg)-dimeric peptide를 1:20, 1:30 (Ad pDNA : PPCBA-PEI-Arg weight ratio)로 결합시킨 뒤 각각 세포에 처리하고, 처리 4일 후, 형광 현미경을 통해 GFP의 발현을 관찰하였다. 대조군으로 Ad pDNA/PEI25K, Ad pDNA/Lipofectamine를 이용하였다.
분석결과, Ad pDNA-Polymer-dimeric peptide 복합체를 처리한 경우, Ad pDNA-PEI 25k, Ad pDNA-PAM-ABP를 처리한 경우에 비해, GFP의 발현이 현저하게 증가하였다. 또한, mVI-G-A-TAT peptide를 변형한 경우, 변형하지 않은 경우와 GFP 발현은 유사하였으나, 변형된 monomer peptide를 dimeric peptide로 만들어 Ad pDNA-Polymer-peptide 복합체를 처리한 경우, 대조군에 비해 GFP의 발현이 현저하게 증가됨을 확인할 수 있었다 (도 18)
또한, 처리된 Ad pDNA-(PPCBA-PEI-Arg)-dimeric peptide 복합체가 1:30:1의 Ad pDNA : Polymer : peptide 중량비로 이루어진 경우, 대조군인 Ad pDNA-PEI25K, Ad pDNA-Lipofectamine를 처리한 경우에 비해, GFP의 발현이 현저하게 증가하였고, 일반적으로 Ad pDNA : Polymer의 중량비가 30:1인 경우, 상기의 중량비가 20:1인 경우에 비해 그 효과가 우수하였으며, 결합하는 dimeric peptide의 양이 늘어날수록 농도 의존적으로 GFP의 발현이 증가됨을 확인할 수 있었다 (도 19). 즉, 상기의 결과로부터, 본 발명의 펩타이드를 dimeric 형태로 변형시킴으로써, 세포내 전달효율을 보다 향상시킬 수 있음을 알 수 있었다.
실시예 15: Ad pDNA - 폴리머 - 이량체 펩티드 복합체의 바이러스 증식능 및 암세포 살상능 확인
본 실시예에서는, Ad pDNA-폴리머-dimeric peptide 복합체의 아데노바이러스 증식능을 확인하기 위하여, 폴리머 PPCBA-PEI-Arg(PPR)와 아데노바이러스 DNA로 IL-12와 GMCSF를 발현하는 종양선택적 살상 아데노바이러스인 RdB/IL-12/GMCSF의 viral DNA를 포함하는 Ad pDNA를 사용하여 복합체를 제작하였다. 인체 전립선암 세포주인 PC-3 세포주를 12 well plate에 분주하고, 24시간 후, naked Ad pDNA, PPCBA-PEI-Arg(PPR), dimeric peptide, Ad pDNA-Lipofectamine, Ad pDNA-PPR, Ad pDNA-PPR-dimeric peptide (1:30:0.01, 1:30:0.05 [Ad pDNA:Polymer: peptide 중량비])로 복합체를 준비하고 각각 세포에 처리하였다. 처리 4일 후, 상기 배양액을 수집하여 아데노바이러스의 입자 (Particle) 수를 Q-PCR을 이용하여 확인하였다. 또한 햄스터종 췌장암 세포주인 HapT1 세포주를 12 well plate에 분주하고, 24시간 후에 naked Ad pDNA, PPCBA-PEI-Arg(PPR), dimeric peptide, Ad pDNA-Lipofectamine, Ad pDNA-PPR, Ad pDNA-PPR-dimeric peptide (1:30:0.01, 1:30:0.05 [Ad pDNA:Polymer: peptide 중량비])로 복합체를 준비하고 각각 세포에 처리하였다. 처리 4일 후, 상기 배양액을 수집하여 아데노바이러스의 입자 (Particle) 수를 Q-PCR을 이용하여 확인하였다.
아울러, 암세포 살상능을 검증하기 위하여 상층액을 제거한 plate에 PBS 내의 2 mg/ml의 3-(4,5-디메틸싸이아졸-2-일)-2,5-디페닐-테트라졸륨 브로마이드(MTT; Sigma Aldrich) 200 μL를 각 웰에 첨가시켰고, 37℃에서 4시간동안 배양시켰다. 그 후, 상청액을 제거하였고, 침전물을 1.0 ml 디메틸설폭사이드에 용해시킨 뒤, 플레이트를 마이크로플레이트 리더 상에서 540 nm의 흡광도에서에서 판독하였으며. 처리하지 않은 세포군을 음성 대조군으로 분류하였다.
분석 결과, PC-3 세포주에서 naked Ad pDNA만을 처리한 경우, 바이러스 생산량은 기초 수준으로 4.6 X 103 VP 나타내었다. Ad pDNA-PPR-dimeric peptide 복합체를 처리한 그룹 중 peptide와 Ad pDNA의 weight ratio가 1:0.01인 경우, 가장 높은 바이러스 생산량 (9.3X 107 VP)을 보였으며, 대조군인 Ad pDNA-PPR를 처리한 경우 (2.4 X 106 VP) 보다 7.3배 더 증가되었고, 양성 대조군인 Ad pDNA-Lipofectamine 복합체를 처리한 경우 (2.5X 107 VP)에 비해서도 3.7배 증가됨을 확인할 수 있었다 (도 20a). 또한, HapT1 세포주에서는 naked Ad pDNA만을 처리한 경우 바이러스 생산량은 기초 수준으로 4.6 X 103 VP 나타내었다. 상기 결과와 마찬가지로, Ad pDNA-PPR-dimeric peptide 복합체를 처리한 그룹 중 peptide와 Ad pDNA의 weight ratio가 1:0.01인 경우, 가장 높은 바이러스 생산량(6.5X 107 VP)을 보였으며, 대조군인 Ad pDNA/PPR를 처리한 경우(6.5 X 105 VP) 보다 99.4배 더 증가된 바이러스 생산량을 보였고, 양성 대조군인 Ad pDNA/Lipofectamine 복합체를 처리한 경우 (2.4 X 107 VP)에 비해서도 2.6배 증가됨을 확인할 수 있었다 (도 21a)
또한, 암세포의 살상능을 검증하기 위해서 MTT assay를 진행한 결과, PC-3 세포주에서는 Ad pDNA-PPR-dimeric peptide 복합체를 처리한 그룹 중 peptide와 Ad pDNA의 weight ratio가 1:0.01인 경우 57.6%의 가장 뛰어난 암세포 살상능을 나타내었으며, 이는 대조군인 Ad pDNA-Lipofectamine 복합체 처리 그룹 혹은 Ad pDNA-PPR 그룹에 비해 암세포 사멸 효과가 각각 17.1%, 16.2%씩 증가된 결과였다 (도 20b). 또한 HapT-1 세포주에서도, Ad pDNA-PPR-dimeric peptide 복합체를 처리한 그룹 중 peptide와 Ad pDNA의 weight ratio가 1:0.01인 경우, 57.3%의 가장 뛰어난 암세포 살상능을 나타내었으며, 이는 대조군인 Ad pDNA-Lipofectamine 복합체 처리 그룹 혹은 Ad pDNA-PPR 그룹에 비해 암세포 사멸 효과가 각각 4%, 10.5%씩 증가된 결과였다 (그림 도 21b).
상기 결과로부터, Ad pDN-/PPR-dimeric peptide를 처리 그룹 중 peptide와 Ad pDNA의 weight ratio가 1:0.01인 경우 가장 높은 아데노바이러스 증식능과 가장 큰 암세포 살상능을 나타냄을 알 수 있었으며, 이러한 결과는, Ad pDNA-PPR-dimeric peptide 복합체는 암세포 내에서 바이러스 증식이 매우 성공적으로 이루어지며, 종양세포에서 증식된 아데노바이러스는 연쇄적으로 암세포 특이적 살상능으로 이어져서 바이러스 증식능과 암세포 살상능이 크게 증가되는 것임을 시사하는 것이다.
실시예 16: 아데노바이러스/펩티드 복합체의 세포 내 유전자 전달효율 확인
본 실시예에서는, Adenovirus(dE1/GFP)-peptide 복합체의 세포 내 전달효율을 확인하기 위하여, 다양한 세포주 (A549, MCF, H460, U434)를 24 well 플레이트에 60-70%로 분주하고 24시간 후, 8종류의 펩티드 VI, VI-9R, mVI, mVI-TAT, mVI-TAT-A, mVI-G-TAT-A, mVI-A-TAT 및 mVI-G-A-TAT를 아데노바이러스(dE1/GFP)와 펩티드 1:1 × 105, 1:1 × 106, 1:1 × 107 molar ratio로 결합시킨 다음, 세포에 각각 20 MOI로 처리하였으며, 처리 48시간 후, 형광 현미경을 통해 GFP의 발현을 관찰하였다. A549 세포주를 이용한 실험의 대조군으로 NLS, TAT 및 펩티드와 결합하지 않은 아데노바이러스 (Adenovirus only)를 이용하였으며, 이 밖의 세포주에 대한 대조군으로는 VI, VI-9R, NLS, TAT, 또는 peptide와 결합하지 않은 Adenovirus only 그룹을 이용하였다.
Adenovirus(dE1/GFP)/Peptide 복합체를 세포에 transduction 시키고 유전자 전달효율을 비교한 결과, Adenovirus only 그룹과 비교하였을 때에 Ad/peptide complex의 유전자 전달효율이 대부분 높게 나타났다 (도 22 내지 도 25). 특히, modified 6종류의 펩타이드 mVI, mVI-TAT, mVI-TAT-A, mVI-G-TAT-A, mVI-A-TAT, mVI-G-A-TAT를 Ad와 결합시켰을 때, Ad/peptide complex의 유전자 전달효율은 Ad/VI, Ad/VI-9R 그룹과 비교했을 때에 비해 현저히 증가됨을 확인할 수 있었다.
이를 통하여 본 발명의 펩티드는 아데노바이러스 DNA와 같은 핵산의 세포 내 전달효율을 증가시킬 뿐만 아니라 바이러스 자체의 세포 내 전달효율도 향상시킬 수 있으며, 이러한 경향은 peptide modification을 통해 보다 증진될 수 있음을 알 수 있었다.
실시예 17: 화학물질 /펩티드 복합체에 의해 증가된 cellular Uptake 효율 확인
본 실시예에서는, Chemotherapeutics/Peptide 복합체에 의한 증가된 cellular uptake을 확인하기 위하여, U343 또는 H460 세포주를 12 well plate에 70-80%로 분주하였다. 구체적으로, 물리적 결합 (DOX+mVI-G-A-Tat)의 경우, Chemotherapuetics인 Doxorubicin과 mVI-G-A-TAT peptide를 PBS 버퍼가 들어있는 튜브에 동시에 넣고 상온에 20분 보관하여 물리적 조건으로 반응시킨 후 복합체를 5μM 세포에 처리하였다. 또한 화학적 결합 (mVI-G-A-Tat conjugated DOX)의 경우에는 DMSO 버퍼 800 μL에 DOX (820 μg)와 가교제인 BMPH(N-β-maleimidopropionic acid hydrazide)를 1.1 당량으로 넣어서 섞어주었다. 해당 반응은 상온에서 24시간 동안 빛을 차단한 조건으로 실시하였으며, 이후, DOX:mVI-G-A-Tat peptide의 비율이 1:1 당량이 되도록 펩타이드 (4 mg) 를 넣어주고 상온에서 3 시간 반응시켰다. 마지막으로 3.5 kDa dialysis cassette를 이용하여 반응하지 않은 화학물을 제거한 뒤 동결건조 시켜 powder 형태로 만든 후 PBS에 녹여서 5μM의 복합체를 세포에 처리하였다. 처리 5분, 10분, 30분, 120분 후, 세포 내로 uptake된 Doxorubicin을 FACS를 수행하여 정량하였으며, 대조군으로 Chemotherapeutics를 단독으로 처리한 그룹을 시용하였다.
Chemotherapeutics/Peptide 복합체를 세포에 처리하고 cellular uptake를 확인한 결과, Chemotherapeutics를 단독으로 처리한 대조군과 비교하였을 때, Chemotherapeutics/peptide 복합체의 cellular uptake이 증가되었으며, 특히 Chemotherapeutics와 peptide를 물리적으로 결합시켰을 때, 초기 시간에 drug이 cell 내로 uptake되는 효율이 더욱 우수함을 확인할 수 있었다 (도 26).
이를 통하여, modification한 Ad Protein VI 유래 peptide와 chemotherapeutics를 함께 세포 내로 전달함으로써, 세포 내로 uptake되는 chemotherapeutics의 양을 증가시켜, 치료 효과를 보다 증진시킬 수 있음을 알 수 있었다.
실시예 18: 화학물질/펩티드 복합체에 의해 증가된 암세포 살상 효과 확인
본 실시예에서는, Chemotherapeutics/Peptide 복합체에 의한 증가된 암세포 살상 효과를 확인하기 위하여, H460, A549 또는 U343 세포주를 96 well plate에 60-70%로 분주하고 24시간 후, Chemotherapuetics인 MG132 또는 Doxorubicin과 mVI-G-A-TAT peptide를 물리적 (mVI-G-A-Tat+MG132, DOX+mVI-G-A-Tat) 또는 화학적 (mVI-G-A-Tat conjugated MG123/DOX)으로 결합시켜 0.1-5μM 만큼 처리하였다. 처리 48시간 후, MTT assay를 수행하여 cell viability를 확인하였으며, 대조군으로는 mVI-G-A-TAT peptide, 그리고 MG132 또는 Doxorubicin을 단독으로 처리한 그룹을 이용하였다.
Chemotherapeutics/Peptide 복합체를 세포에 처리하고 암세포 살상 효과를 확인한 결과, Chemotherapeutics를 단독으로 처리한 대조군과 비교하였을 때에 Chemotherapeutics/peptide 복합체의 암세포 살상효과가 증가됨을 확인할 수 있었으며, 특히. Chemotherapeutics와 peptide를 물리적으로 결합시켰을 때, 화학적으로 결합시킨 형태에 비하여 그 효과가 더욱 우수함을 확인할 수 있었다 (도 27 및 도 28).
이를 통하여, modification한 Ad Protein VI 유래 peptide와 chemotherapeutics를 함께 세포 내로 전달함으로써, chemotherapeutics에 의한 암세포 살상능이 증가되었음을 알 수 있었다.
실시예 19: 단백질/펩티드 복합체에 의해 증가된 암세포 내 전달효율 확인
본 실시예에서는, Protein(Human serum albumin)/Peptide 복합체의 세포 내 전달효율을 확인하기 위하여, 폐암 세포주인 A549를 96 well plate에 70-80%로 분주하고 24시간 후, FITC labeled Human serum albumin (HSA)과 mVI-G-A-TAT peptide를 물리적으로 결합시켜 0.5 또는 5 μM씩 처리하였다 (실시예 17의 물리적 결합 과정 참고). 처리 0.16 시간, 0.5 시간, 2 시간, 6 시간 후, 세포 내로 uptake된 FITC labeled HSA를 microplate reader를 이용하여 확인하였으며, 대조군으로 protein을 단독으로 처리한 그룹을 이용하였다.
protein(HSA)/Peptide 복합체를 세포에 처리하고 세포 내로 uptake되는 것을 확인한 결과, protein을 단독으로 처리한 대조군과 비교하였을 때에 protein/peptide 복합체의 cellular uptake이 증가됨을 확인할 수 있었으며, 특히, Protein을 0.5, 5μM씩 처리한 실험군 모두에서 본 발명의 peptide와 함께 처리한 경우, protein을 단독으로 처리한 그룹에 비해, 통계적으로 유의한 세포내 protein 전달효율 증가를 보였다 (도 29). 이를 통하여 modification한 Ad Protein VI 유래 peptide와 protein을 함께 세포 내로 전달함으로써, protein의 세포 내 전달효율이 보다 증가됨을 알 수 있었다.
실시예 20: 항체/펩티드 복합체에 의해 증가된 세포 내 항체 전달효율 확인
본 실시예에서는, Antibody(Rabbit polyclonal to TGF beta 1)/Peptide complex의 세포 내 전달효율을 확인하고자 하였다. transforming growth factor beta (TGF-β)는 cytoplasm에 존재하는 protein으로, 암세포에서 과발현 되어있다고 알려져 있으며, 외부에서 투여되는 항체에 의한 항원-항체 반응을 위해서는, 세포막에 대한 높은 투과성을 필요로 한다. 본 실시예에서는 modification한 Ad Protein VI 유래 peptide가 Antibody를 세포 내로 전달할 수 있는지를 확인해 보기 위하여, Antibody (Rabbit polyclonal to TGF beta 1)/Peptide 복합체를 permeabilization과정 없이 세포에 처리한 후, 세포 내 전달 여부를 확인하였다. 구체적으로, 폐암 세포주인 A549를 chamber slide에 70-80%로 분주하고 24시간 후, Antibody와 mVI-G-A-TAT peptide를 1:1의 중량비로 물리적으로 결합시킨 후 (실시예 17의 물리적 결합 과정 참고), 4μg 만큼 처리하였다. 처리 후, 2시간 동안 세포 내로 uptake된 Antibody를 Alexa Fluor 488 conjugated antibody (Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG (H+L))를 이용하여 형광현미경으로 확인하였으며, 대조군으로 antibody만 처리한 그룹을 이용하였다.
분석 결과, antibody만을 처리한 대조군에서는 대부분의 antibody가 세포내로 전달되지 못한 반면, Antibody/peptide complex를 처리한 그룹에서는 다량의 antibody가 세포내 전달됨을 확인할 수 있었다 (도 30). 이를 통하여 modification한 Ad Protein VI 유래 peptide와 antibody를 함께 세포 내로 전달함으로써, antibody의 세포 내 전달효율이 보다 증가됨을 알 수 있었다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 통상의 기술자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 구체적인 구현예일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (18)

  1. 서열번호 1의 펩티드를 포함하는, 생리활성 조절 물질의 세포 내 전달용 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 서열번호 1의 펩티드의 N-말단 또는 C-말단에 양전하 아미노산이 추가로 연결된 펩티드를 포함하는, 세포 내 전달용 조성물.
  3. 제2항에 있어서, 상기 양전하 아미노산은 아르기닌(Arg) 또는 라이신(Lys)인 것을 특징으로 하는, 세포 내 전달용 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 서열번호 1의 펩티드의 N-말단 또는 C-말단에 소수성 아미노산이 추가로 연결된 펩티드를 포함하는, 세포 내 전달용 조성물.
  5. 제4항에 있어서, 상기 소수성 아미노산은 알라닌(Ala) 또는 페닐알라닌(Phe)인 것을 특징으로 하는, 세포 내 전달용 조성물.
  6. 제4항에 있어서, 상기 서열번호 1의 펩티드의 N-말단에 알라닌(Ala) 및 페닐알라닌(Phe)이 추가로 연결된 펩티드를 포함하는, 세포 내 전달용 조성물.
  7. 제1항에 있어서, 상기 펩티드는 이량체 (dimer) 형태인 것을 특징으로 하는, 세포 내 전달용 조성물.
  8. 제1항에 있어서, 상기 생리활성 조절 물질은 핵산, 펩티드, 폴리펩티드, 항체, 화학물질 및 바이러스로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는, 세포 내 전달용 조성물.
  9. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 생체적합성 폴리머(biocompatible polymer)를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 세포 내 전달용 조성물.
  10. 제9항에 있어서, 상기 생체적합성 폴리머(biocompatible polymer)는 (i) 면역반응 회피성 부위(escapable portion from immune reactions), (ii) 전하성 부위(chargable portion) 및 (iii) 이황화결합을 포함하는 생환원성 부위(bioreducible portion)를 포함하는 폴리머인 것을 특징으로 하는, 세포 내 전달용 조성물.
  11. 제10항에 있어서, 상기 면역반응 회피성 부위(escapable portion from immune reactions)는 PEG(polyethylene glycol), 폴리알킬렌 옥사이드[예컨대, 폴리옥시에틸렌, 폴리옥시프로필렌 또는 이들의 공중합체(예컨대, 폴리에틸렌옥사이드-폴리프로필렌옥사이드-폴리에틸렌 옥사이드 공중합체)], 폴리페닐렌 옥사이드, PEG와 폴리알킬렌 옥사이드의 공중합체, 폴리(메톡시에틸 메타크릴에이트), 폴리(메타크릴로일 포스파티딜콜린), 과불화된 폴리에테르, 덱스트란 또는 폴리비닐피롤리돈으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는, 세포 내 전달용 조성물.
  12. (a) 제1항의 조성물, 생체적합성 폴리머(biocompatible polymer) 및 아데노바이러스 DNA를 포함하는 복합체의 치료학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 항암용 약제학적 조성물.
  13. 제12항에 있어서, 상기 생체적합성 폴리머(biocompatible polymer)는 (i) 면역반응 회피성 부위(escapable portion from immune reactions), (ii) 전하성 부위(chargable portion) 및 (iii) 이황화결합을 포함하는 생환원성 부위(bioreducible portion)를 포함하는 폴리머인 것을 특징으로 하는, 항암용 약제학적 조성물.
  14. 제13항에 있어서, 상기 면역반응 회피성 부위(escapable portion from immune reactions)는 PEG(polyethylene glycol), 폴리알킬렌 옥사이드[예컨대, 폴리옥시에틸렌, 폴리옥시프로필렌 또는 이들의 공중합체(예컨대, 폴리에틸렌옥사이드-폴리프로필렌옥사이드-폴리에틸렌 옥사이드 공중합체)], 폴리페닐렌 옥사이드, PEG와 폴리알킬렌 옥사이드의 공중합체, 폴리(메톡시에틸 메타크릴에이트), 폴리(메타크릴로일 포스파티딜콜린), 과불화된 폴리에테르, 덱스트란 또는 폴리비닐피롤리돈으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는, 항암용 약제학적 조성물.
  15. 제12항에 있어서, 상기 아데노바이러스의 DNA는 아데노바이러스 지놈 DNA 전체인 것, 아데노바이러스 지놈 DNA의 일부가 결실된 것 또는 아데노바이러스 지놈 DNA의 일부가 변형된 것을 특징으로 하는, 항암용 약제학적 조성물.
  16. 제12항에 있어서, 상기 암은 유방암, 비소세포성 폐암, 폐암, 위암, 간암, 혈액암, 뼈암, 췌장암, 피부암, 두경부암, 피부 또는 안구 흑색종, 자궁육종, 난소암, 직장암, 항문암, 대장암, 난관암, 자궁내막암, 자궁경부암, 소장암, 내분비암, 방광암, 후두암, 골육종, 갑상선암, 뇌암, 결장암, 질암, 음문암, 호지킨병(Hodgkin's disease), 식도암, 부신암, 음경암, 급성 백혈병, 림프구 림프종, 수뇨관암, 신장 골반암종, 중추신경계(central nervous system, CNS) 종양, 1차 중추신경계 림프종, 척수 종양, 비인두암, 뇌간 신경교종 또는 뇌하수체 선종, 부갑상선암, 신장암, 연조직종양, 요도암, 전립선암, 기관지암, 또는 골수암인 것을 특징으로 하는, 항암용 약제학적 조성물.
  17. 제1항의 조성물, 및 생리활성 조절 물질을 포함하는 복합체를 세포에 처리하는 단계를 포함하는, 생리활성 조절 물질의 세포 내 전달방법.
  18. (a) 제1항의 조성물, 생체적합성 폴리머(biocompatible polymer) 및 아데노바이러스 DNA를 포함하는 복합체의 치료학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 암의 치료방법.
PCT/KR2016/009714 2015-08-31 2016-08-31 아데노바이러스 단백질 vi 유래 펩티드를 포함하는 세포 내 전달용 조성물 및 이를 포함하는 항암용 약제학적 조성물 Ceased WO2017039311A1 (ko)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP16842277.2A EP3335722B1 (en) 2015-08-31 2016-08-31 Composition for intracellular delivery containing adenovirus protein vi-derived peptide and anticancer pharmaceutical composition containing same
CN201680057299.1A CN108135966B (zh) 2015-08-31 2016-08-31 包含腺病毒蛋白vi衍生肽的用于细胞内递送的组合物和包含它的抗癌药物组合物
US15/756,058 US10722587B2 (en) 2015-08-31 2016-08-31 Composition for intracellular delivery containing adenovirus protein VI-derived peptide and anticancer pharmaceutical composition containing same

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR20150122756 2015-08-31
KR10-2015-0122756 2015-08-31

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2017039311A1 true WO2017039311A1 (ko) 2017-03-09

Family

ID=58188993

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/KR2016/009714 Ceased WO2017039311A1 (ko) 2015-08-31 2016-08-31 아데노바이러스 단백질 vi 유래 펩티드를 포함하는 세포 내 전달용 조성물 및 이를 포함하는 항암용 약제학적 조성물

Country Status (5)

Country Link
US (1) US10722587B2 (ko)
EP (1) EP3335722B1 (ko)
KR (2) KR101962927B1 (ko)
CN (1) CN108135966B (ko)
WO (1) WO2017039311A1 (ko)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20190128596A (ko) * 2018-05-08 2019-11-18 한양대학교 산학협력단 비강투여에 의한 효과적인 뇌전달 기술
JP7575013B2 (ja) * 2019-11-07 2024-10-29 インダストリー－ユニバーシティ・コーペレーション・ファウンデーション・ハンヤン・ユニバーシティ 鼻腔投与による効果的な脳伝達技術

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1994017832A1 (en) * 1993-02-09 1994-08-18 The Scripps Research Institute Targeting and delivery of genes and antiviral agents into cells by the adenovirus penton

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US210A (en) * 1837-05-30 Machine for hulling- and scouring rice
JP2001511162A (ja) * 1997-02-06 2001-08-07 ノボ ノルディスク アクティーゼルスカブ 付加され、そして／又は除去された付着基を有するポリペプチド−ポリマー結合体
US7842480B2 (en) * 2001-05-18 2010-11-30 Mayo Foundation For Medical Education And Research Chimeric antigen-specific t cell-activating polypeptides
US20060147420A1 (en) * 2004-03-10 2006-07-06 Juan Fueyo Oncolytic adenovirus armed with therapeutic genes
KR20080109751A (ko) * 2008-09-05 2008-12-17 학교법인 포항공과대학교 신규한 세포 내 물질 전달용 펩타이드
US9345787B2 (en) * 2008-12-22 2016-05-24 Targovax Oy Adenoviral vectors and methods and uses related thereto
US8551781B2 (en) * 2009-11-19 2013-10-08 The Regents Of The University Of California Vault complexes for facilitating biomolecule delivery
US10113151B2 (en) * 2012-10-29 2018-10-30 The Regents Of The University Of California Composition of viral vectors in lecithin liposomes, preparation method and treatment methods
WO2015057671A1 (en) * 2013-10-14 2015-04-23 The Broad Institute, Inc. Artificial transcription factors comprising a sliding domain and uses thereof
WO2015163622A1 (ko) * 2014-04-22 2015-10-29 한양대학교 산학협력단 항암치료용 pH 민감성 및 생환원성 폴리머-바이러스 복합체
KR101955909B1 (ko) * 2015-08-12 2019-03-11 한양대학교 산학협력단 Ppsa 및 pspa 폴리머-바이러스 복합체 및 이를 유효성분으로 포함하는 항암용 약제학적 조성물

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1994017832A1 (en) * 1993-02-09 1994-08-18 The Scripps Research Institute Targeting and delivery of genes and antiviral agents into cells by the adenovirus penton

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CARLISLE ET AL.: "Adenovirus Hexon Protein Enhances Nuclear Delivery and Increases Transgene Expression of Polyethylenimine/plasmid DNA Vectors", MOLECULAR THERAPY, vol. 4, no. 5, November 2001 (2001-11-01), pages 473 - 483, XP009118855 *
MEDINA-KAUWE: "Development of Adenovirus Capsid Proteins for Targeted Therapeutic Delivery", THERAPEUTIC DELIVERY (NIH-PA AUTHOR MANUSCRIPT ), vol. 4, no. 2, February 2013 (2013-02-01), pages 267 - 277, XP055359259 *
NICKLIN ET AL.: "The Influence of Adenovirus Fiber Structure and Function on Vector Development for Gene Therapy", MOLECULAR THERAPY, vol. 12, no. 3, September 2005 (2005-09-01), pages 384 - 393, XP005472372 *
See also references of EP3335722A4 *
VIGANT ET AL.: "Substitution of Hexon Hypervariable Region 5 of Adenovirus Serotype 5 Abrogates Blood Factor Binding and Limits Gene Transfer to Liver", MOLECULAR THERAPY, vol. 16, no. 8, August 2008 (2008-08-01), pages 1474 - 1480, XP009120092 *

Also Published As

Publication number Publication date
KR20170026308A (ko) 2017-03-08
KR101962927B1 (ko) 2019-03-28
EP3335722A4 (en) 2018-09-05
KR102474732B1 (ko) 2022-12-08
US20180243430A1 (en) 2018-08-30
EP3335722B1 (en) 2023-07-26
CN108135966B (zh) 2021-12-28
KR20190034171A (ko) 2019-04-01
CN108135966A (zh) 2018-06-08
EP3335722A1 (en) 2018-06-20
US10722587B2 (en) 2020-07-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Molinier-Frenkel et al. Immune response to recombinant adenovirus in humans: capsid components from viral input are targets for vector-specific cytotoxic T lymphocytes
Albelda et al. Gene therapy for lung disease: hype or hope?
US9017672B2 (en) Hexon Tat-PTD modified adenovirus and uses thereof
Wu et al. Cancer gene therapy by adenovirus-mediated gene transfer
US10617729B2 (en) Multitargeting onocolytic adenovirus, methods of use, and methods of making
Haddada et al. Adenoviral interleukin-2 gene transfer into P815 tumor cells abrogates tumorigenicity and induces antitumoral immunity in mice
US11850215B2 (en) Recombinant adenoviruses and stem cells comprising same
WO2002048377A2 (en) Polynucleotide encoding chimeric protein and related vectors, cells, and methods of expression thereof
US20080044386A1 (en) Protamine-Adenoviral Vector Complexes and Methods of Use
KR101967768B1 (ko) 항암치료용 pH 민감성 및 생환원성 폴리머-바이러스 복합체
WO2017039311A1 (ko) 아데노바이러스 단백질 vi 유래 펩티드를 포함하는 세포 내 전달용 조성물 및 이를 포함하는 항암용 약제학적 조성물
WO2014150179A1 (en) Pseudomonas exotoxins for cancer treatment
KR101909905B1 (ko) 암 줄기세포 및 암세포 특이적 유전자 발현 시스템
KR100993881B1 (ko) 유전자 전달체의 유전자 전달효율 개선 및 바이러스 보존용조성물
US20210128653A1 (en) Replication-enhanced oncolytic adenoviruses
KR101955909B1 (ko) Ppsa 및 pspa 폴리머-바이러스 복합체 및 이를 유효성분으로 포함하는 항암용 약제학적 조성물
Herzog et al. A guide to human gene therapy
KR20250027602A (ko) 아데노바이러스 단백질 ｖｉ 유래 펩타이드 및 이의 약제학적 용도
Tessarollo et al. Nonreplicating Adenoviral Vectors: Improving Tropism and Delivery of Cancer Gene Therapy. Cancers 2021, 13, 1863
Farace et al. Immune Response to Recombinant

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 16842277

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 15756058

Country of ref document: US

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE