WO2017039361A1 - 전통 메주에서 분리한 신균주와 이를 이용한 콩곡자 제조방법 및 그 제조방법에 의해 제조된 콩곡자 - Google Patents

전통 메주에서 분리한 신균주와 이를 이용한 콩곡자 제조방법 및 그 제조방법에 의해 제조된 콩곡자 Download PDF

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Definitions

  • the present invention is a novel strain Bacillus amyloliquefaciens CJ 14-6 strain and soybean Koji using the same protease isolated from traditional meju and excellent anti-obesity activity It relates to a manufacturing method and soybean grain produced by the production method.
  • Meju is a fermented food that is used as a raw material for soy sauce, red pepper paste and miso, which are traditional Korean fermented soybeans.
  • Meju which is made from soybeans as a main ingredient, is also an important starter for the manufacture of conventional soy sauce, namely soy sauce, red pepper paste and miso.
  • Meju is divided into conventional meju, improved meju and industrial koji (grain) according to the manufacturing method.
  • Conventional meju was formed by using only soybeans, and then wrapped with straw and fermented for a certain period.
  • Improved meju was fermented with Aspergillus sp.
  • the wheat flour was fermented with Aspergillus rhubarb.
  • Kochujang is divided into traditional (traditional) kochujang and factory (improved) kochujang according to the manufacturing method.
  • Traditional gochujang is made by fermenting and mixing starch raw materials such as meju, rice and malt, malt, salt and red pepper powder.
  • Factory gochujang is a matured, saccharified gochujang.
  • Koji is used as a pure culture of Aspergillus oryza.
  • soybeans are used as protein raw materials
  • rice and flour are used as starch raw materials.
  • Korean Patent No. 10-0668056 discloses a soybean meju prepared by inoculating and fermenting microorganisms pre-cultivated in a grain of soybean and a method of manufacturing the same. More specifically, the prior art is a soybean characterized in that it comprises a fermentation step of fermenting for a period of time after inoculating microorganisms separated from the traditional meju cultured in the bean and the steaming step of drying the bean after increasing the soybean Disclosed are a method of preparing meju and soybean meju prepared by the method.
  • Patent Document 1 KR 10-0668056 B1 (Notice date 2007.01.11)
  • the present inventors screened strains with excellent protease activity in traditional Korean soy sauce as a part of research for mass production of factory kochujang, and selected Bacillus amyloliquefaciens CJ 14-6 strains.
  • the present invention was completed by confirming that soybean grains suitable for mass production of factory type Kochujang could be prepared.
  • Bacillus amylolytics CJ 14-6 strain which is a strain isolated from traditional meju.
  • Another object of the present invention to provide a method for producing soybean grains using the strain.
  • Another object of the present invention to provide a soybean grain produced by the above production method.
  • the present invention provides a strain of Bacillus amyloliquidosis CJ 14-6 which is excellent in protease activity isolated from traditional meju and has anti-obesity activity. .
  • the present invention also comprises a steaming step of dipping or soaking the beans to increase the steam; And inoculating and fermenting Bacillus amyloriquifasion CJ 14-6 strain to the increased soybean.
  • the present invention also provides a soybean grain produced by the method of producing soybean grain.
  • FIG. 1 is stained using the Anillin Wue staining solution in Experimental Example 1 A picture of control fat cells.
  • FIG. 2 is stained using an anilin blue dye solution in Experimental Example 2.
  • FIG. Example 2 The adipocyte photograph of the group.
  • the present invention provides a strain of Bacillus amyloliquefaction CJ 14-6, which is a strain having excellent protease activity isolated from traditional meju.
  • the present invention isolates the various strains in the traditional meju of Korea, and among them, Bacillus spp. Strains excellent in protease activity are firstly selected from the active medium, and secondly, soybeans are used as a raw material for solid culture. Strains with strong protein degradation were selected secondarily. 16s rDNA sequencing was performed to identify the strains of the genus Bacillus.
  • Bacillus amyloliquefaciens SEQ ID NO: 1. This strain with excellent protease activity was named Bacillus amyloliquefaciens CJ 14-6, and was deposited with the Korea Microbiological Conservation Center on 1 July 2015 (Accession No. KCCM11718P).
  • the present invention comprises a cooking step of soaking or soaking soybeans and soaking the beans; And inoculating and fermenting Bacillus amyloriquifasion CJ 14-6 strain to the increased soybean.
  • the present invention comprises the steps of selecting and washing the beans, soaking or soaking the beans in the beans; Cooling the beans after cooking them; Preparing a culture solution by culturing Bacillus amylolytics CJ 14-6; And inoculating the cultured culture of the Bacillus amylolytics CJ 14-6 strain on the cooled soybeans, and fermenting the soybean grains.
  • the soybean cooking step further comprising the step of immersing the screened and washed soybeans at a temperature of 10 °C to 50 °C of immersion water for 1 to 15 hours, put saturated steam (1.0 ⁇ 2.0 kgf / cm 2 ) to 100 °C
  • the steam may be increased at 150 ° C. for 1 to 60 minutes, but is not limited thereto.
  • the cooked beans may be cooled to about 30 °C to 50 °C, more specifically about 30 to 35 °C.
  • the soybeans may be cooked for 5 to 15 minutes at 100 ° C. to 150 ° C. with autoclave, and more specifically, for 10 minutes at 110 ° C.
  • the Bacillus amyloliquasions CJ 14-6 strain can be used as a culture medium cultured by switching to a spore state, the culture medium can be inoculated uniformly 0.1 to 3.0% by weight relative to the total amount of the raw soybeans.
  • the culture medium for culturing the strain may be a liver medium.
  • the soy medium is 1-10% soy sauce selected from Korean soy sauce, brewed soy sauce or mixed soy sauce, and 0.1-10% sugar source selected from the group consisting of glucose, sucrose, galactose or maltose. It can be prepared by mixing.
  • the present invention is inoculated with Bacillus amyloliquidition CJ 14-6 strain stored purely in soy sauce medium (brewed soy sauce + glucose), spores in the temperature range of 30 to 42 °C Incubated for 20 to 42 hours until it was produced to prepare a culture medium of Bacillus amyloliquation CJ 14-6 strain.
  • Bacillus amyloliquidition CJ 14-6 strain stored purely in soy sauce medium (brewed soy sauce + glucose), spores in the temperature range of 30 to 42 °C Incubated for 20 to 42 hours until it was produced to prepare a culture medium of Bacillus amyloliquation CJ 14-6 strain.
  • soybean grains may be prepared by fermentation at 30 ° C. to 45 ° C., more specifically at 34 ° C. to 44 ° C. for 1 to 3 days.
  • a drying step may be performed after the fermentation step.
  • the present invention also provides soybean curd produced by the method of producing soybean curd.
  • Bean grains produced by the production method of the present invention can be used for mass production of factory type kochujang.
  • strain used as a starter in the present invention was isolated and selected from traditional meju collected from traditional food manufacturers in Gyeonggi, Gangwon, Chungbuk, Jeonnam.
  • the traditional meju was diluted in sterile water, and then plated in agar medium (Nutrient agar, Difco) and incubated at 37 ° C.
  • the isolated strains were named CJ 3-27, CJ 4-4, CJ 5-10, CJ 14-6 and CJ 16-57, respectively.
  • the isolated strains were shaken in nutrient broth (Nutrient Broth, Difco) at 37 ° C., 24 hours, 200 rpm, and the titers of proteases were compared. Identification results and titer results of the protease are shown in Table 1 below.
  • strains CJ 3-27, CJ 4-4, CJ 14-6, and CJ 16-57 were selected as primary except CJ 5-10, which showed the lowest protease titer among the isolated and identified strains.
  • Soybean grains were prepared using the four primary screened strains, and the respective protease titers were measured. The results are shown in Table 2 below, and excellent strains were secondarily selected by comparison.
  • soybean grains 1 kg were immersed in purified water for 12 hours, and then steamed at 110 ° C. for 10 minutes with an autoclave, and then cooled to 35 ° C. after cooking.
  • the isolated strains were mixed with 2.0 wt% of the total amount of the cooled bean, and then cultured at 37 to 3 days, respectively, to prepare soybean grains.
  • Protease titer measurement was carried out using the soybean grains, respectively, extracted and filtered for 1 hour at 30 ° C. in distilled water as crude enzyme solutions.
  • the enzyme reaction solution was reacted at 38 ° C. for 1 hour by adding 0.5 ml of crude enzyme solution, 1.5 ml of 2% milk casein, and 1 ml of Mcllivine buffer (pH 6.0) as a substrate. Thereafter, 3 ml of 0.4M TCA solution was added to stop the reaction, and the mixture was filtered. Then, 5 ml of 0.4 M Na 2 CO 3 and 1 ml of a phenolic reagent were mixed well, followed by color development at 38 ° C. for 30 minutes, using a spectrophotometer.
  • Absorbance was measured at 660 nm. At this time, the enzyme activity was defined as 1 unit of the amount of the enzyme that produces tyrosine corresponding to 1 ⁇ g for 1 minute, and a calibration curve was prepared using tyrosine as a standard substance.
  • Adipose-differentiated cells were used as 3T3-L1 cells, which are mouse embryonic fibroblast cell lines, from Korea Cell Line Bank (KCLB).
  • 3T3-L1 cells Culture of 3T3-L1 cells was performed using DMEM medium containing 10% BCS, 1% Penicillin-streptomycin. Cells were recovered by centrifugation at 1,000 rpm for 5 minutes when grown to 70% of the culture dish and used at a passage of 1: 5.
  • MTT assay was performed according to Carmichael et al. Based on the principle that mitochondria dehydrogenase in living cells reacts with MTT to form a dark blue MTT formazan crystal. 3T3-L1 cells were incubated in 48 wells at a concentration of 1.5 x 10 4 / ml and incubated for 24 hours in a 37 ° C, 5% CO 2 incubator to allow cells to adhere to the plate bottom. The next day, samples were injected into each well to achieve final concentrations of 1000, 250 and 0 ⁇ g / ml.
  • the medium containing the sample was adjusted to 5 mg / ml, and the final concentration was adjusted to 500 ⁇ g / ml by dispensing 50 ⁇ l of Thiazolyl Blue Tetrazolium bromide solution at 37 ° C, 5
  • the reaction was carried out in a% CO 2 incubator for 4 hours.
  • remove the medium containing the MTT reagent add 300 ⁇ l of DMSO (dimethyl sulfoxide) to dissolve the MTT-formazan crystal, induce color development for 5 minutes, and then use 540nm using an ELISA microplate reader. Absorbance was measured at.
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • differentiation-inducing medium 10% FBS, 1% penicillin-streptomycin, 5 ⁇ g / ml insulin, 1 ⁇ M DMS (dexamethasone), 0.5 mM IBMX (3-isobutyl-1- The medium containing 1methylxanthine) was treated for 72 hours and DMEM differentiation medium containing only 10% FBS, 1% penicillin-streptomycin, and 10 ⁇ g / ml INS was treated on Days 3 and 5. At the same time, every time the medium was changed, all samples were treated with a final concentration of 10, 50, 0 ⁇ g / ml and treated with a positive control of 20 ⁇ g / ml.
  • Differentiated cells were fixed by injecting 4% para-formaldehyde (para-formaldehyde (in PBS)) into each well for 1 hour at room temperature. Cells were stained with 0.5% Oil Red O staining for 1 hour, and washed twice with running water to remove the remaining staining so that no staining reagent remained on the plate. The stained drops were dissolved in isopropanol. Absorbance was measured at 510 nm.
  • In vitro anti-obesity activity was measured by comparing the inhibitory ability of adipocyte differentiation of two Bacillus amyloliquefaciens CJ 3-27 and CJ 14-6, which were found to have high protease activity.
  • the inhibition of the adipocyte differentiation rate of the CJ14-6 strain culture medium showed a significant level of inhibition compared to the CJ 3-27 strain culture medium without significant change in the adipocyte differentiation inhibition rate.
  • soybean grains were prepared according to the method for preparing soybean grain in Example 1- (1). It was.
  • the protease titer of each soybean grain was measured, and the results are shown in Table 4 below.
  • the protease enzyme titer of soybean grains to which the new Bacillus amyloliquefaciens CJ 14-6 strain was applied was 120.6% higher than that of the conventional soybean grains to which Aspergillus oryzae was applied. Is enhanced to promote the decomposition of protein components when used in red pepper paste or doenjang may contribute to improve the taste quality.
  • the rats were divided into two groups of seven rats, and the control group was fed a high fat diet by adding 20% of pig oil (lard) to the rat powder feed, and in Example 2 group, the new strain of the present invention in the high fat diet.
  • Application soybean powder was fed 0.91%. Body weight and adipose tissue weight for these are shown in Tables 5 and 6.
  • Body weight and dietary intake were measured every week, and adipose tissue weight and lipid content were measured after fasting 12 hours before the end of the test.
  • the collected blood was centrifuged at 1,900xG for 20 minutes and then serum was separated and used as a serum lipid content sample.
  • 0.1 g of liver and adipose tissue were added to chloroform-methanol (2: 1, v / v) for 3 days in refrigerated state. After standing, distilled water was added, centrifuged at 1,150 ⁇ G for 20 minutes, and the total lipid content of the lower layer, which was the lipid layer, was measured. This total lipid was diluted and used for total cholesterol and triglyceride content analysis. Serum and tissue lipid content results are shown in Table 7, 8, 9 and 10.
  • paraffin blocks were prepared by fixing with a Bouin solution to the extracted adipose tissue, and then a slice slide was made and stained using an aniline blue stain. After that, a photograph of the adipocytes was taken through an electron microscope, and the adipocytes of the treatment sections were compared.
  • Treatment group Lipid content in serum (mg / dl) Triglyceride Total cholesterol LDL-cholesterol Control 225.57 ⁇ 25.64 128.43 ⁇ 12.92 125.40 ⁇ 15.43
  • Example 2 152.57 ⁇ 10.21 *** 95.86 ⁇ 8.28 *** 63.66 ⁇ 8.75 ***
  • Treatment group Lipid content in liver tissue (mg / g) Total fat Triglyceride Total cholesterol Control 247.02 ⁇ 21.87 94.91 ⁇ 18.43 360.45 ⁇ 57.55 Example 2 220.99 ⁇ 16.77 * 64.57 ⁇ 3.00 ** 292.48 ⁇ 76.68
  • Treatment group Lipid content in epididymal adipose tissue (mg / g) Total fat Triglyceride Total cholesterol Control 501.55 ⁇ 57.14 166.15 ⁇ 16.18 294.90 ⁇ 15.00
  • Example 2 459.50 ⁇ 35.17 118.44 ⁇ 18.44 *** 250.48 ⁇ 26.74 **
  • Treatment group Lipid content in mesenteric adipose tissue (mg / g) Total fat Triglyceride Total cholesterol Control 412.22 ⁇ 37.59 122.01 ⁇ 6.02 178.23 ⁇ 24.41
  • Example 2 368.37 ⁇ 23.66 * 108.81 ⁇ 9.02 ** 147.77 ⁇ 12.72 *
  • Treatment group Fatty acid synthesis enzymes (nmol / min / mg protein) in adipose tissue FAS ME G6PDH Control 7.29 ⁇ 0.59 8.00 ⁇ 0.31 24.62 ⁇ 1.26
  • Example 2 5.35 ⁇ 0.35 * 5.51 ⁇ 0.62 ** 20.21 ⁇ 1.30 *
  • the weight gain rate of the Example 2 group was confirmed to be 91.5% compared to the control group.
  • the results of Table 6 also showed that the weight gain was reduced to 83.3% compared to the control in the weight of peri-adhesive adipose tissue.

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Abstract

본 발명은 전통 메주에서 분리한 균주인 바실러스 아밀로리쿼페이션스 CJ14-6 균주와 이를 이용한 콩곡자 제조방법 및 그 제조방법에 의해 제조된 콩곡자에 관한 것으로, 상기 콩곡자 제조방법은 콩을 침지 또는 콩에 가수하여 증자시키는 증자 단계; 및 상기 증자된 콩에 바실러스 아밀로리쿼페이션스 CJ 14-6 균주를 접종, 발효시킨 후 건조하여 콩곡자를 만드는 제국 단계를 포함한다.

Description

전통 메주에서 분리한 신균주와 이를 이용한 콩곡자 제조방법 및 그 제조방법에 의해 제조된 콩곡자
본 발명은 전통 메주에서 분리한 단백질 분해효소(protease) 활성이 우수하고 항비만 활성을 가지는 신규한 균주인 바실러스 아밀로리쿼페이션스 (Bacillus amyloliquefaciens) CJ 14-6 균주와 이를 이용한 콩곡자(soybean Koji) 제조방법 및 그 제조방법에 의해 제조된 콩곡자에 대한 것이다.
메주는 우리나라의 전통 콩 발효식품인 간장, 고추장 및 된장 등의 원료로 사용되는 발효식품이다. 콩을 주원료로 제조한 메주는 재래식 장류, 즉 간장, 고추장 및 된장 등의 제조를 위한 중요한 스타터(starter)이기도 하다.
메주는 제조방법에 따라 재래식 메주, 개량식 메주 및 산업용 코오지(곡자)로 구분하고 있다. 재래식 메주는 콩만을 이용하여 성형한 후 짚으로 싸서 일정기간 발효시킨 것이고, 개량식 메주는 증자한 콩에 미리 아스퍼질러스속(Aspergillus sp.) 균주로 발효시킨 것이고, 산업적으로 생산되고 있는 코오지는 밀쌀 또는 밀가루를 아스퍼질러스속의 황국균으로 발효시킨 것이다.
고추장은 제조방법에 따라 크게 전통식(재래식) 고추장과 공장식(개량식) 고추장으로 나눠진다. 전통식 고추장은 콩과 곡류를 일정한 비율로 섞어 만든 고추장용 메주, 쌀 등의 전분질 원료, 엿기름, 식염 그리고 고춧가루를 섞어 발효 숙성하여 제조된다. 공장식 고추장은 숙성식, 당화식 고추장으로, 고추장용 메주 대신에 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae)를 순수 배양한 코오지를 사용한다. 코오지 제조에는 단백질 원료로서는 콩, 전분질 원료로서는 쌀이나 밀가루가 사용된다.
여성의 사회진출이 증가하게 되면서 공장에서 제조한 고추장을 구입하는 가정이 증가하고 있어 이러한 공장식 고추장의 생산량이 계속 증가 추세를 보이고 있으며, 고추장의 수출량 또한 지속적인 증가세를 보이고 있다.
상기 종래의 공장식 고추장의 대량생산을 위한 방안으로, 대한민국 등록특허 제10-0668056호는 낱알콩에 미리 배양한 미생물을 접종하여 발효시켜 제조하는 콩메주 및 그 제조방법에 관한 것을 개시하고 있다. 보다 상세하게는, 상기 선행기술은 콩을 증자한 후 건조하는 증자단계와 상기 콩에 전통메주로부터 분리하여 배양한 미생물을 접종한 후 일정기간 동안 발효시키는 발효단계를 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 콩메주의 제조방법 및 그 방법에 의해 제조된 콩메주를 개시하고 있다.
그러나 상기한 종래 방법에 의하더라도 공장식 고추장의 대량생산을 위한 콩곡자의 개발은 여전히 요구되고 있다.
[선행기술문헌]
(특허문헌 1) KR 10-0668056 B1 (공고일 2007.01.11)
이에 본 발명자들은 공장식 고추장의 대량생산을 위한 연구의 일환으로서 전통 장류에서 단백질 분해효소 활성이 우수한 균주들을 스크리닝하여 바실러스 아밀로리쿼페이션스 (Bacillus amyloliquefaciens) CJ 14-6 균주를 선별하였고, 이를 이용하여 공장식 고추장의 대량생산에 적합한 콩곡자를 제조할 수 있다는 사실을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 전통 메주에서 분리한 균주인 바실러스 아밀로리쿼페이션스 CJ 14-6 균주를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 균주를 이용한 콩곡자의 제조방법을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 상기 제조방법에 의해 제조된 콩곡자를 제공하는 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 전통 메주에서 분리한 단백질 분해효소(protease) 활성이 우수하고 항비만 활성을 가지는 균주인 바실러스 아밀로리쿼페이션스 CJ 14-6 균주를 제공한다.
본 발명은 또한 콩을 침지 또는 콩에 가수하여 증자시키는 증자 단계; 및 상기 증자된 콩에 바실러스 아밀로리쿼페이션스 CJ 14-6 균주를 접종, 발효시키는 제국 단계를 포함하는 콩곡자의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 또한 상기 콩곡자의 제조방법에 의해 제조된 콩곡자를 제공한다.
[규칙 제91조에 의한 정정 10.11.2016]　
도면의간단한설명
도1은 실험예1에서아닐린 블루 (Anillin Wue) 염색액을 사용하여 염색한
대조군지방세포의 사진이다.
도 2는실험예 2에서의아닐린 블루 (Anillin blue)염색액을 사용하여 염색한
실시예 2군의 지방세포 사진이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명의 첫 번째 양태로서, 본 발명은 전통 메주에서 분리한 단백질 분해효소(protease) 활성이 우수한 균주인 바실러스 아밀로리쿼페이션스 CJ 14-6 균주를 제공한다.
구체적으로, 본 발명은 우리나라의 전통메주에서 다양한 균주들을 분리한 다음 그 중에서 단백질 분해효소 활성이 탁월한 바실러스 속(Bacillus spp.) 균주를 활성배지에서 1차 선별하고, 2차로 콩을 원료로 고체 배양하여 단백질 분해능력이 강한 균주를 2차 선별하였다. 16s rDNA 염기 서열분석(16s rDNA sequencing)을 통하여 최종 선별된 바실러스 속 균주의 동정을 진행하였다.
분리된 바실러스 속 균주는 바실러스 아밀로리쿼페이션스(Bacillus amyloliquefaciens)로 동정되었다(서열번호 1). 단백질 분해효소 활성이 우수한 이 균주를 바실러스 아밀로리쿼페이션스(Bacillus amyloliquefaciens) CJ 14-6으로 명명하고, 이를 2015년 7월 1일에 한국미생물보존센터에 기탁하였다(수탁번호 KCCM11718P).
본 발명의 두 번째 양태로서, 본 발명은 콩을 침지 또는 콩에 가수하여 증자시키는 증자 단계; 및 상기 증자된 콩에 바실러스 아밀로리쿼페이션스 CJ 14-6 균주를 접종, 발효시키는 제국 단계를 포함하는 콩곡자의 제조방법을 제공한다.
더욱 구체적으로, 본 발명은 콩을 선별 및 세척하고, 콩을 침지 또는 콩에 가수하는 단계; 상기 콩을 증자한 후 냉각시키는 단계; 바실러스 아밀로리쿼페이션스 CJ 14-6을 배양하여 배양액을 제조하는 단계; 및 상기 냉각된 콩에 상기 바실러스 아밀로리쿼페이션스 CJ 14-6 균주의 배양액을 접종, 발효키는 제국 단계를 포함하는 콩곡자의 제조방법을 제공한다.
상기 콩 증자 단계 전, 선별 및 세척된 콩을 침지수의 온도 10℃ 내지 50℃에서 1 내지 15 시간 침지하는 단계를 더 포함하고, 포화 스팀(1.0~2.0 kgf/cm2)을 넣어 100℃ 내지 150℃에서 1 내지 60분간 증자할 수 있으며, 이에 한정되지 않는다. 상기 증자된 콩은 30℃ 내지 50℃ 정도, 더욱 구체적으로 약 30 ~ 35℃ 정도로 냉각시킬 수 있다.
상기 콩은 고압증기멸균기(Autoclave)로 100℃ 내지 150℃에서 5 내지 15분간 증자할 수 있으며, 더욱 구체적으로, 110℃에서 10분간 증자할 수 있다.
상기 바실러스 아밀로리쿼페이션스 CJ 14-6 균주는 포자상태로 전환시켜 배양한 배양액으로 사용할 수 있으며, 상기 배양액은 증자된 콩에 원료 총량 대비 0.1 내지 3.0 중량%로 균일하게 접종할 수 있다.
상기 균주를 배양하는 배양배지는 간장배지일 수 있다. 상기 간장배지는 한식간장, 양조간장 또는 혼합간장으로부터 선택된 간장 1~10% 및 글루코스(glucose), 수크로스(sucrose), 갈락토스(glactose) 또는 말토오스(maltose) 로 이루어진 군으로부터 선택된 당원 0.1 ~ 10%를 혼합하여 제조될 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시예에 있어서, 본 발명은 순수 분리하여 보관한 바실러스 아밀로리쿼페이션스 CJ 14-6 균주를 간장배지(양조간장+글루코스)에 접종하고, 30 내지 42℃의 온도범위에서 포자가 생성될 때까지 20 내지 42시간 배양하여 바실러스 아밀로리쿼페이션스 CJ 14-6 균주의 배양액을 제조하였다.
바실러스 아밀로리쿼페이션스 CJ 14-6 균주를 접종하여 혼합한 후, 30℃ 내지 45℃, 더욱 구체적으로 34℃ 내지 44℃에서 1 내지 3일간 발효시켜 콩곡자를 제조할 수 있다.
추가적으로, 상기 발효 단계 이후 건조 단계를 진행할 수 있다.
본 발명의 세 번째 양태로서, 본 발명은 또한 상기 콩곡자의 제조방법에 의해 제조된 콩곡자를 제공한다.
본 발명의 제조방법에 의해 제조된 콩곡자는 공장식 고추장의 대량생산에 사용될 수 있다.
이하 본 발명의 내용을 실시예에 의해 보다 상세하게 설명하기로 한다. 다만, 이들 실시예는 본 발명의 내용을 이해하기 위해 제시되는 것일 뿐 본 발명의 권리범위가 이들 실시한 예로 한정되어지는 것으로 해석 되어져서는 아니된다.
[ 실시예 ]
실시예 1 : 전통메주로부터 균주의 분리 및 동정
(1) 균주의 분리 및 동정
본 발명에서 스타터로 사용된 균주는 경기, 강원, 충북, 전남 소재의 전통 식품 제조 업체에서 수거한 전통 메주에서 분리, 선별하였다.
전통 메주를 멸균수에 희석한 다음, 한천배지(Nutrient agar, Difco)에 도말하여 37℃에서 배양하고, 전통 메주에서 우점종으로 서식하는 세균 5종을 선정하여 순수 분리하여 동정하였다. 분리된 균주를 각각 CJ 3-27, CJ 4-4, CJ 5-10, CJ 14-6 및 CJ 16-57로 명명하였다.
상기 분리된 균주를 영양배지(Nutrient Broth, Difco)에서 37℃, 24시간, 200rpm으로 진탕배양 한 후 프로테아제의 역가를 비교하였다. 동정 결과 및 프로테아제의 역가 결과를 하기 표 1에 나타내었다.
전통 메주 유래 분리 균주의 동정결과
1차 선별 균주 프로테아제 역가 (U/g) 동정결과
CJ 3-27 62.58 ± 0.17 Bacillus amyloliquefaciens
CJ 4-4 91.44 ± 6.97 Bacilus licheniformis
CJ 5-10 61.72 ± 4.13 Bacillus subtilis subsp . Subtilis
CJ 14-6 140.73 ± 4.62 Bacillus amyloliquefaciens
CJ 16-57 222.42 ± 0.63 Bacilus licheniformis
(2) 1차 선별
상기 분리, 동정된 균주들 중 가장 낮은 프로테아제 역가를 나타낸 CJ 5-10를 제외한 나머지 균주 CJ 3-27, CJ 4-4, CJ 14-6, 및 CJ 16-57를 1차로 선정하였다.
(3) 2차 선별
상기 1차 선별된 균주 4종을 이용하여 콩곡자를 제조하고 각각의 프로테아제 역가를 측정하였다. 그 결과를 하기 표 2에 나타내었으며, 이를 비교하여 우수 균주를 2차 선별하였다.
콩곡자의 제조를 위해, 콩 1kg을 정수에 12시간 침지한 후 고압증기멸균기 (Autoclave)로 110℃에서 10분간 증자하였으며, 증자 후 35℃로 냉각하였다. 냉각된 증자 콩에 상기 분리된 균주를 원료 총량 대비 2.0 중량%로 혼합한 후 37에서 3일간 각각 배양하였으며, 이를 이용하여 각각 콩곡자를 제조하였다.
프로테아제 역가 측정은 상기 각각 제조된 콩곡자를 증류수에 30℃에서 1시간 동안 추출, 여과한 것을 조효소액으로 사용하여 수행하였다. 효소 반응액은 조효소액 0.5㎖, 기질로 2% 밀크 카제인(Milk casein) 1.5㎖, Mcllivine 버퍼(pH 6.0) 1㎖를 첨가하여 38℃에서 1시간 반응시켰다. 이후, 0.4M TCA 용액을 3㎖ 넣어 반응을 정지시켜 여과한 후, 0.4M Na2CO3 5㎖와 페놀 시약 1㎖를 넣어 충분히 혼합한 후 38℃에서 30분간 발색시키고, 분광 광도계를 이용하여 660nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때, 효소 활성은 1분간 1㎍에 해당하는 티로신을 생성하는 효소의 양을 1 유닛으로 정의하였고, 티로신을 표준 물질로 이용하여 검량선을 작성하였다.
1차 선별된 균주 적용 콩곡자의 프로테아제 역가 비교
　1차 선별된 균주 프로테아제 역가 (U/g)
CJ 3-27 258
CJ 4-4 118
CJ 14-6 225
CJ 16-57 155
상기 표 2의 결과로부터, 프로테아제 역가가 우수한 CJ 3-27과 CJ 14-6 균주를 선정하였다.
(4) 3차 선별 - 시험관 내(In vitro) 3T3-L1 항비만 활성
가.세포주
지방분화세포는 쥐의 배아섬유아세포주(Mouse embry onic fibroblast cell line)인 3T3-L1 세포를 한국세포주은행(KCLB)에서 분양받아 사용하였다.
나.세포배양
3T3-L1 세포의 배양은 10% BCS, 1% 페니실린-스트렙토마이신(Penicillin-streptomycin)을 함유하는 DMEM배지를 사용하였다. 세포는 culture dish의 70% 수준으로 증식하였을 때 1,000rpm에서 5분간 원심분리하여 회수하고 1:5의 비율로 계대하여 사용하였다.
다.MTT assay
MTT assay는 살아있는 세포 내의 미토콘드리아 디하이드로게네이즈(mitochondria dehydrogenase)가 MTT와 반응하여 짙은 푸른색의 MTT 포르마잔 결정(MTT formazan crystal)을 형성하는 것을 기본원리로 하여 Carmichael 등의 방법에 따라 실험하였다. 3T3-L1 세포는 1.5 x 104/ml의 농도로 48웰에 500μl씩 분주 후 세포가 플레이트 바닥에 부착 될 수 있도록 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 24시간 배양했다. 다음날 최종농도 1000, 250, 0 μg/ml이 되도록 각 웰에 시료를 주입하였다. 24시간 배양 후 시료가 포함된 배지에 5 mg/ml로 조정하고 싸이아졸릴 블루 테트라졸리움 브로마이드 용액(Thiazolyl Blue Tetrazolium bromide solution)을 50μl씩 분주하여 최종농도를 500μg/ml로 조정하고 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 4시간 반응시켰다. 반응이 끝나면 MTT 시약이 포함된 배지를 제거하고, DMSO(Dimethyl sulfoxide)를 300μl 가하여 MTT 포르마잔 결정(MTT-formazan crystal)을 용해시키고, 5분 동안 발색을 유도시킨 다음 ELISA microplate reader를 이용하여 540nm에서 흡광도를 측정하였다.
라.3T3-L1 cell 분화유도
세포분화를 유도하기 위하여 6웰 플레이트에 세포를 2.5 x 104/ml로 접종하고, 10% FBS와 1% 페니실린-스트렙토마이신(penicillin-streptomycin)을 포함한 DMEM으로 post-confluent 상태가 될 때까지 4일간 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 배양하였다. 항비만 실험에 사용되는 대표적인 양성 컨트롤로는 전지방세포의 분화를 억제, 지방분해 촉진, 성숙한 지방세포의 세포자살을 유도하여 지방형성 억제에 효과가 있는 레스베라톨(resveratol)을 사용하였다.
Post-confluent상태가 되면 Day 0에 분화유도 배지인 10% FBS, 1% 페니실린-스트렙토마이신(penicillin-streptomycin), 5μg/ml 인슐린, 1μM DMS(dexamethasone), 0.5mM IBMX(3-isobutyl-1-1methylxanthine)를 함유한 배지를 72시간 동안 처리하고 Day 3과 5에는 10%이 FBS, 1% 페니실린-스트렙토마이신(penicillin-streptomycin), 10μg/ml INS만 포함하고 있는 DMEM 분화 진행배지를 처리하였다. 동시에 배지를 교체할 때마다 모든 시료는 최종농도가 10, 50, 0μg/ml이 되도록 처리하였고 양성 컨트롤인 20μg/ml 농도로 처리하였다.
마.Oil Red O 염색 및 수치화
배양 중인 3T3-L1 cell의 분화정도를 확인하고자 분화 마지막 날인 7일째에 지방 방울을 염색하는 Oil Red O 시약을 사용하여 Rene 등과 Kasturi 등의 방법을 변형하여 염색하였다.
분화가 진행된 세포들은 4% 파라-포름알데히드(para-formaldehyde(in PBS))를 각 웰에 주입하여 상온에서 1시간 이상 반응시켜 고정시켰다. 고정액을 제거하고 0.5% Oil Red O staining으로 1시간 동안 세포를 염색하였고, 남은 염색을 제거하기 위해 흐르는 물에 2회 세척하여 염색시약이 플레이트에 남아있지 않도록 하였으며, 염색된 방울은 이소프로판올에 용해하여 510nm에서 흡광도를 측정하였다.
프로테아제 활성이 높은것으로 확인된 2종의 바실러스 아밀로리쿼페이션스 (Bacillus amyloliquefaciens) CJ 3-27, CJ 14-6의 지방세포분화 억제능을 비교하여 In vitro 항비만 활성을 측정하였다.
2차 선별된 균주의 지방세포 분화억제율
균주 균주배양액 농도 (μg/ml) 분화억제율 (%)
바실러스 아밀로리쿼페이션스CJ 3-27 25 10.10
50 6.98
100 3.37
바실러스 아밀로리쿼페이션스CJ 14-6 25 20.57*
50 26.41*
100 36.61*
통계학적 검정 : student-T test
* : P < 0.05
상기 표3의 결과가 나타내는 바와 같이, 지방세포 분화억제율에서 유의적 변화가 없는 CJ 3-27 균주배양액에 비해 CJ14-6 균주배양액의 지방세포 분화억제율은 유의적 수준의 저해를 나타내었다.
실시예 2 : 콩곡자의 제조
상기 실시예 1에서 최종 선별된 신규의 균주인 바실러스 아밀로리쿼페이션스(Bacillus amyloliquefaciens) CJ 14-6를 종균으로 이용하여 상기 실시예 1-(1)에 기재된 콩곡자 제조방법에 따라 콩곡자를 제조하였다.
기존의 아스퍼질러스 오리재를 이용한 콩곡자와의 비교를 위하여, 충무발효에서 시판되는 통상의 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae)를 국균(麴菌)으로 이용하여 상기 실시예 1-(1)에 기재된 콩곡자 제조방법에 따라 콩곡자를 제조하였다.
(1) 프로테아제 역가 측정
상기 각각의 콩곡자의 프로테아제 역가를 측정하였으며, 그 결과를 하기 표 4에 나타내었다.
신규의 바실러스 아밀로리쿼페이션스 (Bacillus amyloliquefaciens) CJ 14-6와 통상의 아스퍼질러스 오리재 적용 콩곡자의 효소 역가
균주 프로테아제 역가 (U/g)
바실러스 아밀로리쿼페이션스 CJ 14-6 225
통상의 아스퍼질러스 오리재 102
상기 표 4의 결과로부터, 신규의 바실러스 아밀로리쿼페이션스 (Bacillus amyloliquefaciens) CJ 14-6 균주를 적용한 콩곡자의 프로테아제 효소 역가가 통상의 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae)를 적용한 콩곡자보다 120.6%가 향상되어 고추장 또는 된장에서 사용시 단백질 성분의 분해력을 촉진하여 맛품질을 향상하는데 기여할 수 있다.
실험예 1 : 신균주(CJ14-6) 적용 콩곡자에 의한 항비만 효능 측정
신규의 아밀로리퀴페이션스 (Bacillus amyloliquefaciens) CJ 14-6 콩곡자(실시예 4)에 의한 항비만 효능 검증을 위하여 동물실험을 수행하였다. 실험에 이용한 동물은 수컷 흰쥐(S.D. rat 5주령)로 다물사이언스(대한민국)에서 구입하여 사용하였고, 사육실 온도는 18±2℃로 유지하며 조명은 12시간 주기(08:00~20:00)로 조절하였다.
실험쥐들은 7마리씩 2개의 군으로 나누어, 대조군에는 흰쥐용 분말사료에 돼지기름(lard) 20%를 첨가하여 고지방식이를 급여하였고, 실시예2군에는 상기 고지방식이에 본 발명의 신균주 적용 콩곡자 분말을 0.91% 급여하였다. 이들에 대한 체중 및 지방조직 무게는 표 5 및 6에 나타내었다.
체중과 식이섭취량은 1주일마다 측정하였고, 지방조직 무게 및 지질함량은 시험종료 전 12시간절식 시킨 후 측정하였다. 채취한 혈액은 1,900xG에서 20분간 원심분리 시킨 후 혈정을 분리하여 혈청 지질함량 시료로 사용하였다. 간과 지방조직의 총 지질, 중성지방 및 총 콜레스테롤 함량 분석을 위하여 적출한 간과 지방조직 0.1g에 클로로폼-메탄올(chloroform-methanol)(2:1, v/v)을 첨가하여 냉장상태에서 3일간 방치한 후 증류수를 첨가하고, 1,150xG에서 20분간 원심분리 시킨 후 지질층인 하층부의 총 지질 함량을 측정하였다. 이 총 지질을 희석하여 총 콜레스테롤과 중성지방 함량 분석을 위하여 사용하였다. 이를 통한 혈청 및 조직의 지질함량결과는 표 7, 8, 9 및 10에 나타내었다.
지방조직의 지방산 생합성 관련 효소 활성 측정을 위하여 지방조직 무게의 3배 부피에 해당하는 0.1M 인산칼륨 버퍼(potassium phosphate buffer)(pH 7.4, 37℃)를 첨가하여 균질화 한 후, 3,000rpm 에서 15분간 원심분리하고 상층액을 다시 15,000rpm에서 30분간 원심분리한 다음, 상층액 만을 모아 사용하였다. 이를 통한 효소활성 결과는 표11 및 12에 나타내었다.
지방세포의 크기 측정을 위하여 적출한 지방조직에 부앙용액(Bouin solution)으로 고정하여 파라핀 블록을 제작하여 절편 슬라이드를 제작한 후 아닐린 블루(Anillin blue) 염색액을 사용하여 염색하였다. 이후 전자현미경을 통해 지방세포의 사진을 찍은 후 처리구간의 지방세포를 비교하였다.
처리군 개시체중(g) 종료체중(g) 체중증가율(g/일) 식이섭취량(g/일)
대조군 171.79 544.00 6.84±0.40 17.49±0.80
실시예2군 172.57 513.29 6.26±0.40 17.33±1.78
처리군 지방조직 무게(g/100g body wt.)
부고환 지방 신장주위 지방 총 백색지방
대조군 2.43 0.78 6.80
실시예2군 2.24 0.65 6.29
처리군 혈청 중 지질 함량(mg/dl)
중성지방 총콜레스테롤 LDL-콜레스테롤
대조군 225.57±25.64 128.43±12.92 125.40±15.43
실시예2군 152.57±10.21*** 95.86±8.28*** 63.66±8.75***
처리군 간조직 중 지질 함량(mg/g)
총 지방 중성지방 총 콜레스테롤
대조군 247.02±21.87 94.91±18.43 360.45±57.55
실시예2군 220.99±16.77* 64.57±3.00** 292.48±76.68
처리군 부고환 지방조직 중 지질 함량(mg/g)
총 지방 중성지방 총 콜레스테롤
대조군 501.55±57.14 166.15±16.18 294.90±15.00
실시예2군 459.50±35.17 118.44±18.44*** 250.48±26.74**
처리군 장간막 지방조직 중 지질 함량(mg/g)
총 지방 중성지방 총 콜레스테롤
대조군 412.22±37.59 122.01±6.02 178.23±24.41
실시예2군 368.37±23.66* 108.81±9.02** 147.77±12.72*
처리군 간조직 내 지방산 합성 관련 효소(nmol/min/mg protein)
FAS ME G6PDH
대조군 12.22±1.07 31.47±1.39 24.68±1.45
실시예2군 9.77±0.54 26.96±1.74 17.31±1.19**
처리군 지방조직 내 지방산 합성 관련 효소(nmol/min/mg protein)
FAS ME G6PDH
대조군 7.29±0.59 8.00±0.31 24.62±1.26
실시예2군 5.35±0.35* 5.51±0.62** 20.21±1.30*
[규칙 제91조에 의한 정정 10.11.2016]　
Figure WO-DOC-TABLE-13
[규칙 제91조에 의한 정정 10.11.2016]　
Figure WO-DOC-TABLE-14
통계학적 검정 : student-T test
* : P < 0.05
** : P < 0.01
*** : P < 0.001
상기 표5의 결과가 나타내는 바와 같이, 실시예2군의 체중증가율은 대조군에 비해 91.5% 수준임을 확인할 수 있었다. 또한, 표6의 결과 신장주위 지방조직 무게에서도 대조군에 비해 83.3%로 그 무게 증가량이 감소하였다.
따라서 상기 실시예의 결과로부터 신균주(CJ14-6) 적용 콩곡자가 체중감량효과가 있음을 알 수 있다.
[수탁번호]
기탁기관명 : 한국미생물보존센터(국외)
수탁번호 : KCCM11718P
수탁일자 : 20150701
Figure PCTKR2016009804-appb-I000003

Claims (7)

  1. 전통 메주에서 분리 동정한 프로테아제 활성이 우수하고 항비만 활성을 가지는 바실러스 아밀로리쿼페이션스 (Bacillus amyloliquefaciens) CJ 14-6(KCCM 11718P).
  2. 콩을 침지 또는 콩에 가수하여 증자시키는 증자 단계; 및
    상기 증자된 콩에 제1항의 바실러스 아밀로리쿼페이션스 CJ 14-6 균주를 접종, 발효시키는 제국 단계
    를 포함하는 콩곡자의 제조방법.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 증자 단계 전, 선별 및 세척된 콩을 10 내지 50℃에서 1 내지 15시간 침지하는 단계를 더 포함하고,
    상기 증자 단계는, 1.0 내지 2.0 kgf/cm2의 포화 스팀을 넣어 100℃ 내지 150℃에서 1 내지 60분간 증자하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하되,
    상기 증자 단계 후, 상기 증자된 콩을 30 내지 50℃로 냉각하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 콩곡자의 제조방법.
  4. 제2항에 있어서,
    상기 증자 단계는 고압증기멸균기(Autoclave)로 100℃ 내지 150℃에서 5 내지 15분간 수행하는 것을 특징으로 하는 콩곡자의 제조방법.
  5. 제2항에 있어서,
    상기 바실러스 아밀로리쿼페이션스 CJ 14-6 균주는 상기 증자된 콩에 원료 총량 대비 0.1 내지 3.0 중량%가 되도록 접종하는 것을 특징으로 하는 콩곡자의 제조방법.
  6. 제2항 내지 제5항 중 어느 한 항에 기재된 방법으로 제조된 콩곡자.
  7. 제2항 내지 제5항 중 어느 한 항에 기재된 방법으로 제조된 항비만 활성을 가지는 콩곡자.
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