WO2017048097A1 - Sod3를 과발현하는 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

Sod3를 과발현하는 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 조성물 Download PDF

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Definitions

  • a composition for the prevention or treatment of inflammatory diseases comprising stem cells overexpressing S0D3 as an active ingredient
  • the present invention relates to a composition for preventing or treating inflammatory diseases comprising stem cells overexpressing S0D3 as an active ingredient, and more particularly, to inflammatory including stem cells overexpressing S0D3 (extracel lular superoxide dismutase) as an active ingredient. It relates to a pharmaceutical composition for preventing or treating a disease.
  • Inflammatory disease refers to a condition in which inflammatory immune cells are infiltrated in human organs or tissues, edema, redness and pain, and histological changes due to various external stimuli or internal factors. These inflammations are triggered by various chemical mediators produced from damaged tissues and migrated cells, and these chemical mediators are known to vary according to the type of inflammatory process. In normal cases, the living body restores normal structure and function by neutralizing or eliminating the onset factors and regenerating the damaged tissues through inflammatory reactions. Otherwise, the living body may progress to a disease state such as chronic inflammation.
  • MSCs Mesenchymal stem cells
  • the inventors of the present invention while the side effects are significantly low, while studying the therapeutic agent for inflammatory diseases including stem cells suitable for the prevention and treatment of inflammatory diseases, overexpressing S0D3 in mesenchymal stem cells (MSC), such as immunomodulation and antioxidant effects
  • MSC mesenchymal stem cells
  • compositions for the prevention or treatment of inflammatory diseases comprising stem cells overexpressing S0D3 (extracel lular superoxide di smutase) as an active ingredient.
  • S0D3 extracel lular superoxide di smutase
  • Another object of the present invention is to provide the use of stem cells overexpressing SOD3 for the preparation of an agent for treating inflammatory diseases.
  • the present invention provides a method for treating inflammatory disease, comprising administering to a subject in need thereof an effective amount of a pharmaceutical composition comprising stem cells overexpressing S0D3 as an active ingredient.
  • Inflammatory that contains stem cells overexpressing S0D3 (extracel lular superoxide di smutase) as an active ingredient . It provides a pharmaceutical composition for preventing or treating a disease.
  • S0D3 extracel lular superoxide di smutase
  • stem cells overexpressing SOD3 for the preparation of an agent for treating an inflammatory disease.
  • the present invention provides a method for treating inflammatory disease, comprising administering to a subject in need thereof an effective amount of a pharmaceutical composition comprising stem cells overexpressing S0D3 as an active ingredient.
  • a pharmaceutical composition comprising stem cells overexpressing S0D3 as an active ingredient.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating inflammatory diseases comprising stem cells overexpressing S0D3 as an active ingredient.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention may be a composition containing S0D3 as an active ingredient, may be a composition consisting of S0D3 as an active ingredient, or may be a composition consisting essentially of S0D3 as an active ingredient.
  • the term “compri sing” is used in the same sense as “including” or “characterized by”, and in the composition or method according to the present invention, It does not exclude steps of additional components or methods not specifically mentioned. It also consists of the term “ ⁇ (consi st ing of) "means excluding additional elements, steps or components, etc., unless otherwise noted.
  • protein is compatible with the polypeptide (polypept ide) or peptide (pept ide)
  • superoxide dismutase 3 extracel hilar (S0D3) refers to an extracellular secreted superoxide dismutase (extracel lular).
  • EC-SOD superoxide dismutase
  • T human S0D3 protein
  • the amino acid sequence of a human (wi ld-type, T) S0D3 protein is known as an accession number such as NP_003093.2 of the NCBI Genbank database and encodes a human S0D3 protein.
  • the base sequence of mRNA is known as an accession number such as ⁇ _003102.2.
  • S0D3 protein catalyzes the reaction of dismutat ions of anions, is secreted extracellularly and is present in the extracel hilar matrix, and has anti-angiogenic, anti-inflammatory, anti-chemotactic, and anticancer activity. Indicates. Specifically, it has an effective effect in treating diseases such as skin cancer, pigmentary disease, photoaging, dermatitis, epidermal proliferative disease, psoriasis, atopy, urticaria and allergies (Korea Patent No. 100676502), diseases caused by angiogenesis It is also known to be effective in the prevention and treatment of cancer (Korean Patent No. 101019470).
  • colon cancer lung cancer, liver cancer, stomach cancer, esophageal cancer, pancreatic cancer, gallbladder cancer, kidney cancer, bladder cancer, prostate cancer, testicular cancer, cervical cancer, endometrial cancer, chorionic cancer, ovarian cancer, breast cancer, thyroid cancer, brain cancer, head and neck cancer, malignant It is known to have an effective effect on cancer diseases such as melanoma and lymphoma (Korean Patent Publication No. 10-2008-108876).
  • S0D3 means a protein derived from a mammal, preferably human, including humans and mice, most preferably represented by SEQ ID NO: 1
  • the amino acid sequence of the human normal S0D3 protein, or the amino acid sequence of the recombinant S0D3 protein (209E-S0D3) represented by SEQ ID NO: 3 may be included.
  • the normal human S0D3 is a signal peptide up to the 18th alanine, including the starting methionine amino acid at the N-terminal site, and activated S0D3 is composed of 222 amino acids from which the signal peptide has been removed.
  • the C-terminal region (amino acid residues 210-215) of S0D3 has a heparin binding domain.
  • S0D3 is a 209 amino acid in which 13 amino acids (amino acid residues 210 to 222) including the N-terminal signal peptide and the C-terminal heparin binding domain of the full-length human S0D3 are removed. It may be made of.
  • S0D3 protein from which the signal peptide and the heparin binding domain has been removed may be referred to as 209E-S0D3 or 209E in the present invention, and preferably may have an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3.
  • the 209E-S0D3 can also bind to anti-S0D3 antibodies, and has been confirmed to have the same enzymatic activity and R0S elimination activity as normal S0D3 (Korean Patent No. 10-2008-0108876).
  • S0D3 in the present invention includes both a functional equivalent (funct ional der), a functional derivative (funct ional der ivat ive) and fragments of the S0D3 protein having a physiological activity substantially equivalent to a normal S0D3 or 209E-S0D3 protein .
  • Substantially equivalent physiological activity means having the same level of enzymatic activity and / or extracellular secretion and intracellular permeability as normal S0D3, and due to the enzymatic activity equivalent to S0D3 in stem cells, preferably mesenchymal stem cells When overexpressed, stem cells improve immunity and inflammation.
  • the immune and inflammation control ability of the stem cells specifically refers to inhibition of immune cell infiltration due to inflammation, proliferation and differentiation of proinflammatory T cells, inhibition of proinflammatory mediator / cytokine expression, and Treg cells having inflammation control ability.
  • the functional equivalent of S0D3 preferably has at least 70%, preferably at least 80%, more preferably at least 90% homology with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3. It may be a polypeptide having. In addition, the functional equivalent may be generated as a result of addition, substitution or deletion of a part of the amino acid sequence of SOD3 of the present invention. Substitution of amino acids in the above is preferably conservative substitution.
  • amino acids examples include aliphatic amino acids (Gly, Ala, Pro), hydrophobic amino acids (lie, Leu, Val), aromatic amino acids (Phe, Tyr, Trp), acidic amino acids ( Asp, Glu), basic amino acids (His, Lys, Arg, Gin, Asn) and sulfur containing amino acids (Cys, Met).
  • the functional equivalents also include variants in which some of the amino acids are deleted on the amino acid sequence of S0D3 of the present invention. Deletion or substitution of the amino acid is preferably located in a region not directly related to the physiological activity of the S0D3 protein. Also included are variants in which some amino acids are added to both ends or the sequence of the amino acid sequence of S0D3.
  • polymorphism may be a protein.
  • the range of functional equivalents of the present invention also includes polypeptide derivatives in which some chemical structures of the protein are modified while maintaining the basic backbone of the SOD3 protein of the present invention and its physiological activity.
  • Stem cells overexpressing S0D3 included as an active ingredient in the pharmaceutical composition of the present invention may be preferably mesenchymal enjoyment cells.
  • MSC Mesenchymal stem cell
  • the mesenchymal stem cells are included in the supernovae in an undifferentiated state, that is, in a stem cell state.
  • the present invention Mesenchymal stem cells of the may be derived from a mammal, preferably may be derived from a human.
  • the mesenchymal stem cells of the present invention may be derived from a tissue selected from the group consisting of umbilical cord, cord blood, placenta, bone marrow, adipose tissue, muscle, amniotic fluid and amniotic membrane.
  • the mesenchymal stem cells of the present invention may be cord blood or placental-derived mesenchymal stem cells, and most preferably, cord blood-derived mesenchymal stem cells.
  • Umbilical cord blood or placental-derived mesenchymal stem cells are characterized by superior differentiation and proliferation ability than bone marrow-derived mesenchymal stem cells.
  • umbilical cord blood refers to blood collected from a umbilical vein connecting the placenta and fetus of a mammal.
  • the cord blood can be easily collected from the umbilical vein of the donor at birth. More specifically, in the case of normal vaginal delivery, it can be taken from the umbilical vein that has been left out after the placenta remains in the uterus after childbirth. Alternatively, in the case of cesarean section, the placenta is also extracted from the umbilical vein after being delivered out of the uterus.
  • placental stem cells refers to stem cells or progenitor cells derived from the mammalian placenta regardless of their shape, cell surface markers or number of passages after primary culture, such as tissue culture substrates, eg For example, it means attaching to tissue culture plastic or fibronectin coated tissue culture plate.
  • tissue culture substrates eg
  • tissue culture substrates eg
  • tissue culture plastic or fibronectin coated tissue culture plate eg
  • tissue culture substrates eg
  • fibronectin coated tissue culture plate eg
  • the term “placental stem cells” herein does not refer to trophoblast cells.
  • a cell is a stem cell if it has at least one of its characteristics, for example its ability to differentiate into at least one or more cell types.
  • Mesenchymal stem cells can be isolated from the placenta or umbilical cord blood according to methods known in the art. Separation of the mesenchymal stem cells can be separated by any known separation method.
  • density difference separation method densi ty gradient fract ionat ion
  • immunoselect ion dif ferent i al adhes ion separat ion
  • separation and culture of mesenchymal stem cells from umbilical cord blood or placenta can be used in any of the conventional methods.
  • Cultivation of the isolated mesenchymal stem cells can be carried out in a cell culture medium known in the art, for example, but not limited to, DMEM medium, McCoys 5A medium, Eagle's basal medium, CMRL badge, Glasgow minimum required badge, Ham's F-12 badge, Iscove's modi f ied Dulbecco's badge, Liebovi tz 'L-15 badge, RPMI 1640 badge SB-3 basal media.
  • auxiliary components may be added to the cell culture medium as needed. Serum such as fetal calf serum, horse or human serum, and antibiotics and antifungal agents for preventing microbial contamination may be used.
  • the isolated or cultured pleasant cells can be stored by methods known in the art until use.
  • stem cells can be stored after cryoprotection treatment.
  • the cryoprotective treatment includes DMS0, glycerol, polyvinylpyridone, polyethylene glycol, albumin, dextran, sucrose, ethylene glycol, i-erythri, D-libi, D-mannie, D-Solby, i-Inosine can be performed using cryoprotectants such as D-lactose or choline chloride.
  • Stem cells overexpressing S0D3 according to the present invention may be obtained by transducing a recombinant expression vector comprising a polynucleotide encoding S0D3 to the stem cells.
  • the term “expression” refers to the production of a protein or nucleic acid in a cell, and “overexpression” refers to an excessive increase in the level of expression of a particular gene over a normal or general state.
  • Stem cells overexpressing S0D3 in the present invention are specifically stem cells in which the S0D3 protein activity is increased by increasing the expression level of S0D3 protein.
  • polynucleotide or nucleic acid refers to deoxyribonucleotides (DNA) or ribonucleotides (RNA) in the form of single- or double-strands.
  • known analogues of natural nucleotides which are localized to nucleic acids in a manner similar to naturally occurring nucleotides are also included.
  • the most common way to overexpress S0D3 in pleasant cells is to include the S0D3 gene.
  • the polynucleotide containing is artificially or experimentally introduced into stem cells to increase the number of copies of the S0D3 gene ( CO py nLim ber).
  • the injection of exogenous polynucleotides into cells that are not inherent to the original cells is called transfection, and the transformation of the cell's genetic traits is called transformat ion.
  • transduct ion The process in which the exogenous polynucleotide is injected into the cell through a virus or virus-derived vector is called transduct ion.
  • transduct ion The process in which the exogenous polynucleotide is injected into the cell through a virus or virus-derived vector.
  • the terms 'transformation', 'transfection' and 'transduction' are used in a similar sense as referring to an exogenous polynucleotide introduced into a cell and having a genetic trait different from the normal form or such a process.
  • the polynucleotide encoding S0D3 may be a S0D3 gene derived from a mammal, and preferably, the nucleotide sequence encoding human normal S0D3 represented by SEQ ID NO: 2 or 209E-S0D3 represented by SEQ ID NO: 4 It may be to include a sequence sequence to.
  • the polynucleotide encoding S0D3 also includes a sequence showing substantial identity with the nucleotide sequence of human S0D3, preferably the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4.
  • Substantial identity aligns the nucleotide sequence encoding human S0D3 with any other nucleotide sequence to be compared as closely as possible, and sequence the sequence using analytical methods and algorithms commonly used in the art. In the case of comparative analysis, a sequence which exhibits at least 70% or more homology.
  • the protein encoded by the base sequence substantially the same as the nucleotide sequence of the polynucleotide encoding the S0D3 is a functional equivalent of the S0D3 protein, preferably a protein comprising an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3 Can be. Functional equivalents of the S0D3 protein are as previously described herein.
  • a “recombinant expression vector” is a vector capable of expressing a target protein or target nucleic acid (RNA) in a suitable host cell, wherein the gene comprises an essential regulatory element operably linked to express the polynucleotide (gene) insert.
  • RNA target nucleic acid
  • the gene comprises an essential regulatory element operably linked to express the polynucleotide (gene) insert.
  • Operationally l inked '' is a nucleus for performing common functions
  • the acid expression control sequence and the nucleic acid sequence encoding the desired protein or RNA is functionally linked (funct ion ink).
  • nucleic acid sequence encoding the protein or RNA is linked in such a way that gene expression is enabled by expression control sequences, for example, the promoter and the nucleic acid sequence encoding the protein or RNA must be operably linked. May affect the expression of the nucleic acid sequence.
  • Operative linkage with recombinant vectors can be prepared using genetic recombination techniques well known in the art, and site-specific DNA cleavage and ligation employs enzymes commonly known in the art.
  • the recombinant expression vector of the present invention is not particularly limited as long as it is a vector commonly used in the cloning field, and examples thereof include, but are not limited to, plasmid vector, cosmid vector, bacteriophage vector, and viral vector. .
  • plasmid vector a vector derived from a virus can be used.
  • the plasmid includes E.
  • viruses include animal viruses such as retroviruses, adenoviruses or vaccinia viruses, such as bacloviruses.
  • a toroidal virus or the like may be used, but is not limited thereto.
  • Expression vectors comprising nucleic acids according to the present invention are methods known in the art, such as, but not limited to, transient transfect ion, microinjection, transduction ion, cell fusion, Calcium phosphate precipitation, liposome-mediated transfect ion, DEAE Dextran-mediated transfect ion, polybrene-mediated transfect ion Can be introduced into stem cells by known methods for introducing nucleic acids into cells, electroporat ions, gene guns and cells.
  • Stem cells overexpressing S0D3 is injected into the mesenchymal stem cells using a recombinant expression vector comprising a polynucleotide encoding S0D3, preferably by electroporation or virus-mediated transduction method. May be transformed.
  • Stem cells of the present invention can also be prepared using recombinant viral vectors through the following steps: (a) a DNA construct that is operably linked to a sherbet vector, a nucleic acid encoding S0D3 and / or a protein transduction domain.
  • a recombinant viral vector comprising a virus; (b) transfecting said recombinant viral vector into a virus producing cell line to produce a SOD3 expressing recombinant virus; And (c) infecting mesenchymal stem cells with the S0D3 expressing recombinant virus.
  • the sherbet vector includes PUB110, PGX1416, PGX1417, PUL61, PSA77, and PGX1418.
  • ColEl pCA14 Invitrogen was used.
  • the viral vector of the present invention is selected from the group consisting of a retrovirus vector, an adenovirus vector, an adeno-associated virus (AAV) vector, a vaccinia virus vector, a herpesvirus vector, a lentiviral vector and an abipoxvirus vector. do.
  • it may be an adenovirus vector.
  • Mesenchymal stem cells (MSCs) transformed with S0D3 according to the present invention overexpress S0D3 have increased expression of genes with immunosuppressive function, and are potent by regulating the function and infiltration of neutrophils and dendritic cells in inflammatory responses Demonstrate the ability of immune regulation.
  • MSC overexpressing S0D3 significantly reduced the expression level of proinflammatory mediators / cytokines and was found to inhibit the activation of TLR-7 and NFkB. Examples of the present inventors suggest that MSCs overexpressing SOD3 may be effective therapeutic agents for inflammatory diseases.
  • Stem cells overexpressing S0D3 of the present invention is characterized by having at least one of the following characteristics.
  • (a) inhibits one or more infiltrations selected from the group consisting of CD4 + T cells, CD8 + T cells, neutrophils, and dendritic cells;
  • (c) a group consisting of IL-1 ⁇ , IL- ⁇ , IL-4, IL-6, IL-17, IL-20, IL-22, IL-23, TNF- ⁇ , IFN- ⁇ , CXCL1 and CCL20 Inhibits the expression of one or more inflammatory cytokines selected from, whereas the expression of Treg-related cytokines, IL-10 and TGF- ⁇ , increases; (d) exhibits a property of inhibiting any one or more phosphorylation selected from the group consisting of NFkB, p38, JNK, STAT1 and STAT3;
  • (e) exhibits properties that increase cAMP levels in the body.
  • icIL-IRa, TGF- ⁇ , IL-10, H0-1, and MSC untransformed in S0D3-MSC or MSC transformed with LacZ in the control group (LacZ—MSC).
  • MSCs overexpressing S0D3 have a significant improvement in immunomodulatory capacity that inhibits excessive immune responses compared to MSCs that do not.
  • H0-1 and ID0_1 have immunomodulatory activity such as inhibiting the reaction by inflammatory cytokines and Thl7 and inducing apoptosis of immune cells.
  • MSC overexpressing S0D3 can effectively control inflammation and rejection of transplantation in autoimmune diseases such as asthma and psoriasis atopy and organ transplant patients through increased expression of H0-1 or ID0-1.
  • autoimmune diseases such as asthma and psoriasis atopy and organ transplant patients
  • CD4 + T cells and CD8 + when co-cultured with S0D3-MSC compared to MSCs without transformation in a mixed lymphocyte culture experiment co-cultured with MSC.
  • the mouse experiment was performed as a model of acute rash dermatitis such as psoriasis among inflammatory diseases, skin symptoms such as hemorrhage, keratinization, etc. in the skin of mice administered S0D3-MSC than the mice administered MSC, Lesions of chronic radical dermatitis, measured by skin thickness, infiltration of immune cells into the skin, were more effectively improved.
  • the expression of proinflammatory mediators was more effectively suppressed in the mice treated with S0D3-MSC and the expression of IL-10 associated with Treg cells was increased.
  • experiments on signaling pathways have been shown to specifically inhibit the NFkB signaling system.
  • MSC overexpressing S0D3 is more effective than the conventional MSC in the prevention or treatment of inflammatory diseases. It can be used as a more effective stem cell therapy.
  • treatment refers to a clinical procedure intended to alter the natural course of the individual or cell being treated, and may also be performed for the prevention of clinical pathology.
  • Desirable effects of treatment include: suppressing the occurrence or recurrence of the disease, alleviating symptoms, reducing any direct or indirect pathological consequences of the disease, decreasing the rate of disease progression, improving the disease state, improving, alleviating or improving the prognosis, etc. It includes.
  • prevention means any action that inhibits the onset or delays the progression of a disease.
  • Inflammatory diseases targeted for the prophylaxis or treatment in the present invention may preferably be Th2 or Thl7 mediated diseases.
  • Th2 or Thl7 mediated disease refers to Th2 cells Or disease mediated by Thl7 cells.
  • Th2 or Thl7-mediated disease in the present invention may be more preferably selected from the group consisting of organ transplant rejection, autoimmune disease, inflammatory bowel disease, inflammatory eye disease, inflammatory skin disease including atopy and allergic disease.
  • the Th2-mediated disease refers to a disease mediated by Th2 cells, particularly a disease caused by the generation and activity of allergen-specific Th2 cells.
  • Th2 cells are immune cells expressing CD4 and T cell receptors (TCRs), and humoral immunity by secreting cytokines such as IL-4, IL-5, IL-6, and IL-13 by the action of GATA3 transcription factors. To get involved.
  • Th2 mediated diseases including atopic dermatitis, other skin diseases related to atopic dermatitis, allergic rhinitis, allergic asthma, etc.
  • Th2 mediated diseases can be treated by agenda or inhibiting the differentiation of Th2.
  • the Thl7 mediated disease refers to a disease caused by an imbalance between Thl7 / Treg cells due to excessive differentiation of Thl7 cells or due to excessive activity of Thl7 cells or worsening of disease.
  • Thl7 cells are representative proinf lammatpry cells, and when na ⁇ ve CD4 + T cells are subjected to antigenic stimulation in the presence of TGFP and IL-6, they differentiate through the action of transcription factors such as ROR Y t and STAT-3. do. Mature Thl7 cells secrete inflammatory cytokines IL-17, IL-21, IL-22, and invade peripheral tissues that have started inflammation and interact with macrophages, dendritic cells, fibroblasts, vascular endothelial cells, and osteoclasts. It acts to amplify the secretion of inflammatory cytokines and other inflammatory factors and cause tissue damage.
  • Thl7 cells have been found to be the major pathogens in various autoimmune diseases, allergic diseases, inflammatory diseases, and organ transplant rejection.
  • Treg cells play a role in regulating inflammation.
  • CD4 + T cells receive appropriate antigenic stimulation from antigens containing TGFP, they express and differentiate full-signatures such as Foxp3.
  • Mature Treg cells are known to reduce the proliferation and activity of T cells through cytokines such as TGFp and IL-10. In particular, it plays an important role in sel f-tolerance in the immune system, and it has been suggested that it is possible to treat autoimmune diseases and organ transplant rejection by controlling Treg activity in animal models such as mouse models.
  • Treg cells and Thl7 cells have opposite functions of inhibiting or amplifying inflammation, respectively, but they differentiate from the same progenitor cells and are balanced between the two cells in a healthy steady state.
  • the direction of differentiation of Treg or Thl7 cells depends on the type of inflammatory cytokine present when na ⁇ ve CD4 + T cells are differentiated by TGF] 3 and antigenic stimuli.
  • Pathogenic Thl7 cells are hyperdifferentiated or overactive. If the balance between Treg cells and Thl7 cells, which must be released to properly check each other's roles, is broken, Thl7-mediated diseases are induced.
  • the Thl7-mediated disease can be treated by restoring the balance and constant between immune cells by inhibiting the proliferation and differentiation of Thl7 cells and inducing the differentiation of Treg.
  • the present inventors confirmed that MSCXS0D3-MSC) transformed to overexpress SO0D3 through cell experiments and animal experiments inhibited the differentiation of Th2 or Thl7 cells and increased the differentiation of Treg cells.
  • unsensitized CD4 + T cells co-cultured with S0D3-MSCs were compared to control cells not co-cultured with MSCs or T cells co-cultured with MSCs not overexpressing S0D3.
  • TM7 markers such as ROR yt and IL-17 were significantly decreased, whereas expression levels of Treg markers such as Foxp3, TGF ⁇ and IL-10 were significantly increased, so that S0D3-MSC differentiated Th2 and Thl7. It was confirmed to inhibit and enhance the differentiation of Tregs (Examples ⁇ 1-7>).
  • the skins of mice injected with S0D3-MSC were compared to those of Th2- and Thl7-related proinflammatory cytokines such as IL-6, IL-17 and IL-22 compared to MSCs that did not overexpress S0D3.
  • the inflammatory disease is more specifically acute or chronic organ transplant rejection, graft-versus-host disease, inflammatory bowel disease, Crohn's disease, ulcerative colitis, inflammatory skin disease, multiple sclerosis, pancreatitis, trauma-induced shock, bronchial Asthma, allergic rhinitis, allergic conjunctivitis, cystic fibrosis, acute bronchitis, chronic bronchitis, acute bronchiole Inflammation, chronic bronchiolitis, osteoarthritis, gout, spondyloarthropathies, ankylosing spondylitis, lighter syndrome, psoriatic arthrosis, enteropathic spondylitis, juvenile arthrosis, juvenile ankylosing spondylitis, reactive arthrosis, infectious arthritis, post-infectious Arthritis, Lou Gehrig's Disease, Nodular Polyarteritis, Irritable Vasculitis, Lou Gehrig's Granulomatosis, Rheuma
  • transplant rejection is a patient transplanted after a transplantation of a solid organ such as a heart, lung, heart and lung complex, liver, kidney, pancreas, skin, bowel or cornea.
  • a solid organ such as a heart, lung, heart and lung complex, liver, kidney, pancreas, skin, bowel or cornea.
  • GVHD graft-versus-host disease
  • inflammatory skin diseases include psoriasis, atopic dermatitis, eczema dermatitis, contact dermatitis, seborrheic dermatitis, rosaceous nasal rash, squamous tachycardia, vasculitis, pore subcutaneous nasal sinus, cellulitis, folliculitis, carbuncle, pemphigus, bullous ( bul lous) is characterized by at least one disease selected from the group consisting of swelling, epidermal vesicles, gallbladder, angioedema, vasculitis, hemorrhoids and skin eosinophilia.
  • the pharmaceutical composition of the present invention comprising a stem cell overexpressing S0D3 as an active ingredient may further include a pharmaceutically acceptable carrier and diluent.
  • the pharmaceutically acceptable carrier and diluent may be biologically and physiologically friendly to stem cells and recipients to be transplanted thereof.
  • examples of pharmaceutically acceptable diluents include, but are not limited to, saline, water soluble complete solutions, solvents and / or dispersion media.
  • the present invention also provides a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of autoimmune diseases or organ transplant rejection comprising stem cells overexpressing S0D3 as an active ingredient. As described above, pro-inflammatory Thl7 cells are commonly involved in autoimmune disease or organ transplant rejection.
  • MSC overexpressing S0D3 suppresses Thl7 proliferation and differentiation and inhibits inflammation. Differentiation of regulating Treg cells promotes.
  • MSC overexpressing S0D3 significantly increases the level of expression of genes with various immunosuppressive functions such as icIL-IRa, TGF- ⁇ , IL-10, H0-1 and ID0-1, which suppresses excessive immune response. It was confirmed that the immunomodulatory ability is greatly improved. Accordingly, a person skilled in the art can suppress the excessive immune response through a pharmaceutical composition comprising a stem cell overexpressing S0D3 according to the present invention as an active ingredient, thereby preventing or treating autoimmune diseases and organ transplant rejection. You can see that you can expect it.
  • the "organ transplant rejection reaction” refers to acute or chronic transplant rejection occurring in a patient transplanted after transplantation of a solid organ such as the heart, lung, heart and lung complex, liver, kidney, etc. And grafts in transplant patients after bone marrow transplantation May be graft-versus-host disease (GVHD).
  • GVHD graft-versus-host disease
  • the "autoimmune disease” is a disease caused by the body's immune system attacks the normal cells or proteins inside, not the antigen derived from the outside, specific examples of systemic lupus erythematosus, lupus, rheumatoid arthritis, autoimmune hepatitis , Autoimmune hemolytic disease, drug-induced autoimmune hemolytic anemia, autoimmune inner ear disease, Meniere's disease, type 1 diabetes, lupus, Behcet's disease, Crohn's disease, Guillain-Barré syndrome, autoimmune thyroiditis, Hashimoto thyroiditis, ulcer Colitis, Sjogren's syndrome, scleroderma, multiple sclerosis, nodular polyarteritis, psoriasis, atopic dermatitis, vitiligo, Pemphigus vulgar is, dermatitis, myasthenia gravi s, Addison son's disease (Addi son ') s disease).
  • the pharmaceutical compositions of the present invention may be formulated using methods known in the art to provide rapid, sustained or delayed release of the active ingredient after administration to a mammal.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is preferably formulated in the form of an injection, the route of administration may include intradermal, intramuscular, intraperitoneal, intravenous, subcutaneous, intranasal, intrathecal, intraoral routes. May be, but is not limited thereto.
  • the mouse was administered with a topical subcutaneous injection of MSC transformed with S0D3 and confirmed the therapeutic effect.
  • the pharmaceutical compositions of the present invention may be applied using a catheterization method.
  • cells may be injected through the catheter in a single mass or in several smaller aliquots.
  • Administration of cells using a catheter may include, for example, intravenous delivery through a standard peripheral venous catheter, a central venous catheter, or a pulmonary artery catheter.
  • the dosage of the pharmaceutical composition of the present invention is determined by the route of administration, time of administration, number of treatments, duration of treatment, age, weight, health condition, sex, severity of disease, sensitivity to medicine, diet and excretion of the subject in need of treatment. Considering various factors such as rate, etc., those skilled in the art can determine an appropriate effective amount for the specific use described above.
  • the "effective amount” refers to an amount sufficient to exhibit an effect of treating, treating, preventing, detecting or diagnosing an inflammatory disease, an autoimmune disease, or organ transplant rejection when administered to an individual.
  • it may be a mammal, most preferably an animal including a human, and may be a cell, tissue, organ or the like derived from the animal.
  • the subject may be a patient in need of treatment.
  • the method of the present invention can utilize as many stem cells as necessary to suppress the inflammatory response.
  • the stem cells may include two lx io, five lx io, seven lx io, eight lx io, nine lx io or more stem cells.
  • a transgenic MSC was injected subcutaneously into a mouse model with 2 ⁇ 10 6 S0D3.
  • the administration may be administered once or several times a day.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be administered alone or in combination with other therapeutic agents known to be effective in the prevention or treatment of inflammatory diseases, autoimmune diseases, organ transplant rejection, and the like, when administered in combination It may be administered sequentially or simultaneously with the therapeutic agent.
  • Dosage of the pharmaceutical composition of the present invention, when administered alone or in combination is preferably administered in an amount that can achieve the maximum effect in a minimum amount without side effects, which can be easily determined by those skilled in the art.
  • the present invention also provides the use of stem cells overexpressing S0D3 for the preparation of an agent for treating inflammatory diseases.
  • the present invention provides a method for the treatment of inflammatory diseases, characterized in that to administer to the individual in need thereof an effective amount of a pharmaceutical composition comprising a stem cell overexpressing S0D3 as an active ingredient.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention may be a composition containing S0D3 as an active ingredient, a composition consisting of S0D3 as an active ingredient, or may be a composition consisting essentially of S0D3 as an active ingredient.
  • the inflammatory control activity of overexpressing S0D3 according to the present invention in particular mesenchymal stem cells (MSC) overexpressing S0D3, and the therapeutic effect of inflammatory diseases based thereon, betting Effective amounts and methods for administration may be referred to herein as described above.
  • MSC mesenchymal stem cells
  • the present invention provides a composition for the prevention or treatment of inflammatory diseases comprising stem cells overexpressing S0D3 as an active ingredient.
  • Mesenchymal stem cells (MSCs) that are transfected with S0D3 and overexpress S0D3 have stronger antioxidant and immunoregulatory functions than regular MSCs.
  • S0D3-transduced MSCs are used for inflammatory diseases, autoimmune diseases, or organs. It can be an effective treatment for transplant rejection.
  • FIG. 1 shows RT-PCR (A in FIG. 1), Western Blot (B in FIG. 1), S0D3 enzymatic activity (FIG. 1) confirming the S0D3 expression pattern of MSCXS0D3-MSC) or control MSC (MSC) transformed with S0D3.
  • FIG. 1 shows RT-PCR (A in FIG. 1), Western Blot (B in FIG. 1), S0D3 enzymatic activity (FIG. 1) confirming the S0D3 expression pattern of MSCXS0D3-MSC) or control MSC (MSC) transformed with S0D3.
  • C shows the experimental results.
  • Figure 2 is a graph showing the results of fluorescence staining and fluorophotometer for observing reactive oxygen species generated by stimulation with TNF- ⁇ in S0D3-MSC or MSC.
  • FIG. 3 is a graph showing the results of ⁇ assay (A in FIG. 3) and the number of cells measured ( ⁇ in FIG. 3) over time to confirm the effect of SOD3 transformation on cell proliferation of MSCs.
  • Figure 4 shows the results of RT-PCR experiments to confirm the effect of SOD3-MSC or MSC on the expression of inflammation-related cytokines in HaCaT cells.
  • FIG. 5 MSC, LacZ transformed with MSC (LACZ-MSC), S0D3 transformed Expression level of intracel lular IL-lRa (i cIL-lRa), soluble IL-lRa (sIL-lRa), unspl iced IL-lRa as measured by RT-PCR results in MSC (S0D3-MSC) (FIG. 5A) And quantitative analysis of icIL-IRa mRNA levels (FIG. 5B), H0-1, DI0-1, TGF- ⁇ , Galect in-1, IL-10 (FIG. 5C), corresponding cells The levels of PGE2 (FIG. 5D) measured by immunoassay in culture medium are shown.
  • Figure 6 shows the negative control group (ControK-), positive control group (ControK +)), and no treatment MSC (MSC), LacZ transformed MSC (LACZ-MSC), S0D3 transformed MSC (S0D3) -MSC), flow cytometry (FACS) results to measure CD4 + T and CD8 + T cell proliferation in CFSE-based combined lymphocyte reflex experiments co-cultured with DETCA-treated S0D3 transformed MSC S0D3-MSC + DETCA) Indicates.
  • DETCA is a S0D3 enzyme inhibitor.
  • FIG. 7 shows a graph quantifying the FACS results of FIG. 6.
  • the St imulat ion index (%) on the vertical axis represents the number of cells when stimulation was applied / the number of cells when no stimulation was applied.
  • FIG. 8 is a graph showing RT-PCR results measuring the expression levels of lineage-specific key transcription factors and cytokines of T cells.
  • FIG. 9 shows RT-PCR results (top) and flow cytometry results (bottom) showing MSC effects on Treg cell differentiation, measuring the expression levels of Treg lineage-specific key transcription factors and cytokines.
  • FIG. 10 is a schematic of a mouse experiment overview of chronic radical skin inflammation induced by IMQ.
  • FIG. 11 is a back skin photograph of a mouse showing lesion progression of each group of mice in an IMQ-induced chronic radical skin inflammation biomodel experiment.
  • FIG. 12 is a micrograph of skin sections of mice and the like of each experimental group stained with H & E in a mouse experiment of chronic radical skin inflammation induced by IMQ.
  • Figure 13 is a bar graph comparing the epidermal thickness measurement results of the back skin of the mice of each experimental group in the mouse experiment of chronic radical skin inflammation induced by IMQ.
  • FIG 14 is a graph showing the ratio of T cells, neutrophils (Grl +) and dendritic cells (CD11C +) infiltrated into the spleen of mice of each experimental group in the mouse experiment of IMQ-induced chronic radical skin inflammation.
  • Figure 15 shows immunization of T cells, neutrophils (Grl +) and dendritic cells (CD11C +) infiltrated into the skin of mice in each experimental group in a mouse experiment of IMQ induced chronic radical skin inflammation. It is a microscope photograph analyzed by staining by histochemical method. Arrows point to the stained cells.
  • Figure 16 is a graph showing the number of T cells, neutrophils (Grl + ) and dendritic cells (CDllc + ) infiltrated into the skin of mice in each experimental group in chronic radical skin inflammation biological model experiment induced by IMQ.
  • FIG. 17 is a graph showing RT-PCR results of measuring mRNA levels of proinflammatory mediators expressed in the skin of mice in each experimental group in a mouse experiment of IMQ-induced chronic radical skin inflammation.
  • Figure 18 shows the expression levels and phosphorylation levels of TLR-7, NF-kB, JNK, p38, STAT1, STAT3, JAK1, JAK2 present in the skin of mice in the chronic radical skin inflammation biomodel experiment induced by IMQ. Shown Western blot experimental results are shown.
  • 19 is a bar graph showing the cAMP concentration measured in the plasma of mice in each experimental group in the IMQ-induced chronic radical skin inflammation biomodel experiment.
  • OVA egg white protein
  • Figure 21 is a photograph of the back of the mouse showing the progression of the mice in each experimental group of atopic dermatitis inflammation induced by egg white protein (OVA).
  • OVA egg white protein
  • hUCB-MSCs Mesenchymal stem cells derived from human umbilical cord blood were collected from blood samples of the human umbilical cord with the consent of the donor. Umbilical cord blood samples were collected and stored in blood collection packs containing citric acid phosphate glucose, which acts as an anticoagulant. Treatments for the experiments were performed within 24 hours. Mononuclear cell fractions were isolated by centrifugation under a Fi col—Paque PLUS concentration gradient (Amersham Biosciences).
  • HBSS hypoglycemic Dulbecco's modified Eagle culture (DMEM, Invi trogen Corp), 20% fetal calf serum (Gibco-BRL), 2 mM L-glutamine, ImM sodium pyruvate and 1% Resuspended with antibiotics / antifungal (Li fe Technologies).
  • Antibiotic / antifungal agents include lOOU / ml penicillin, 100 ug / ml streptomycin, and 25 y g / ml amphotericin B. After 7 days, the unattached cells were removed, and the attached cells were cultured with two cultures changed weekly. Cells were incubated at 5% CO 2 , 37 ° C. wet conditions. About 60% of confluent cells were separated with 0.1% trypsin-EDTA and transferred to culture plates.
  • the immunophenotype of WJCB-MSC was analyzed by flow cytometry (Epics XL, Beckman Coulter) for the presence of antigen-positive markers associated with MSC and the absence of hematopoietic markers.
  • Positive markers include CD90 (Thy-l), CD105 (endogl in) and SH3 (CD73).
  • Hematopoietic lineage markers include endothelial cell markers such as CD34, CD45 and CD31. Cells were positive for HLA class I but negative for HLA-DR. Each fluorescently labeled monoclonal antibody was purchased from Becton Dickinson. Identification of S0D3 Transformation and S0D3 Overexpression Using Electroporation
  • FIGS. 1 to 4 used S0D3 transformed MSCs by electroporation. Electroporation was performed by applying electrical stimulation (1000 voltage, 1 pulse) to MSC according to the Neon TM protocol (Invitrogen) to increase the permeability of the cell membrane and injecting DNA into the cell. Western blots were obtained, or genes of human S0D3 (Genbank accession number ⁇ _003102.2) were amplified by PCR and confirmed on 1.5% agarose gel. Amplification program 94 ° C 5min; 94 "C 40s, 57 ° C 30s, 72 ° C 60s (35 cycles); 72 ° C lOmin; 4 ° C 0- ⁇ ( ⁇ is infinity, meaning no time specified).
  • FIGS. 5 to 21 used MSC transduced with S0D3 with adenovirus.
  • the pRC / CMV hS0D3 vector containing human S0D3 was inserted into the El Scheer vector pCA14 by homologous recombinat ion.
  • the merged Scheer vector and vector dEl-k35 / lacZ were recombined by homologous recombination to finally produce the dEl-k35 / S0D3 constructor.
  • Supernatants containing recombinant adenovirus were grown from 293 cells isolated from plaques.
  • Adenoviruses comprising the prepared human S0D3 gene or LacZ gene were transduced into mesenchymal stem cells (MSCs) at 10 mutipl icity of infect ion (M0I). All.
  • Enzymatic activity of S0D3 was confirmed by measuring superoxide radicals. 200 ⁇ M xanthine (Sigma) and 50M WST-l (Doj indo) on PBS were mixed in a 20 ⁇ 1 sample, and after treatment with 0.0005 unit XOD (Sigma), formazan dye signal development was optically measured.
  • a ⁇ assay was performed to measure cell proliferation of MSCs (Man et al., 2006; Wei chert et al., 1991). After culturing 6xl0 3 cell MSC for 24 hours, transforming the cultured MSC with human S0D3 gene using electroporation, MTT (5mg / ml) was added to the well at 24 hours, 48 hours and 72 hours. 20 ⁇ 1 was treated and further incubated for 4 hours. The medium was removed, cells were lysed with ⁇ dimethyl sulfoxide per well, and the absorbance was measured at an absorption wavelength of 595 nm (Bio-Tek Instruments, Winooski, VT, USA).
  • MSCs were distributed on 6-well plates for 24 hours, and then stimulated with lOng / ml TNF- ⁇ and 100 U / ml IFN- ⁇ for 1 hour.
  • the cells were stabilized with Hanks balanced salt solution (HBSS) for 30 minutes and then stained with 10 ⁇ 2,7-dichlorofluorescin diacetate (H2DCF-DA) for 30 minutes at 37 ° C.
  • HBSS Hanks balanced salt solution
  • H2DCF-DA 10 ⁇ 2,7-dichlorofluorescin diacetate
  • R0S was observed through DCF—fluorescence under confocal microscopy at an emission wavelength of 513 nm and an excitation wavelength of 488 nm, and fluorescence was measured using a fluorophotometer (Synergy, BIO TEK, US).
  • MSCs were cultured in the following manner and analyzed for gene expression with or without stimulation with TNF- ⁇ and IFN- ⁇ :
  • Day 1 The cultured MSCs were infected with adenovirus or control virus (AdLacZ) containing wild-type S0D3 for 24 hours to be transduced with S0D3.
  • AdLacZ adenovirus or control virus
  • cDNA was synthesized from ⁇ total RNA using QuantiTect Reverse Transcription Kit (QIAGEN). Briefly, genomic DNA was removed from the template RNA using gDNA wipeout Buffer, incubated at 42 ° C. for 2 minutes, and immediately stored on ice. After reverse transcriptase, RT buffer and RT primer mix were mixed with template RNA, reaction was performed at 42 ° C for 15 minutes and 95 ° C for 3 minutes. Synthesized cDNA was stored at -20 ° C until use. Subsequently, RT-PCR was performed at a final volume of 20 ⁇ 1 by mixing 0.25 template, the corresponding primer of ⁇ , 10 ⁇ 1 TOP polymerase mixture and 8.75 ⁇ 1 of distilled water.
  • QIAGEN QuantiTect Reverse Transcription Kit
  • PCR results were confirmed by electrophoresis with 13 ⁇ 4 agarose gel.
  • the primer sequences used for RT-PCR and real-time PCR were as follows and were customized by Bioneer (Korea): i c IL-lRa forward 5'-TTAT (; AGCAGCTCAGTT-3 '(SEQ ID NO: 15), reverse 5'— TTGACACAGGACAGGCACAT —3 '(SEQ ID NO: 16); sIL-IRa forward 5'- TCCGCAGTCACCTMTCACTC-3' (SEQ ID NO: 17), reverse 5'- TTGACACAGGACAGGCACAT-3 '(SEQ ID NO: 18); unspliced IL-lRa forward 5 '-GGCCTCCGCAGTCACCTAATCACTCT -3' (SEQ ID NO: 19), reverse 5 '-GGTCGCACTATCC ACATCTGGG-3' (SEQ ID NO: 20); HO—1 forward 5'_ CCTGGTGTCCCTTCAATCAT-3
  • AGCTATCCCAGAGCCCCAGATCCGAri TGG-3 ' (SEQ ID NO: 30); GAPDH forward 5'- MGGTCGGAGTCMCGGAn GGT-3' (SEQ ID NO: 31), reverse 5'-
  • PGE2 prostaglandin E2
  • Carbohydrate luorescein diacetate succinimidly ester (CFSE) -MLR analysis was performed to confirm the proliferation of CD4 + and CD8 + T cells co-cultured with MSC and S0D3.
  • CFSE Carbohydrate luorescein diacetate succinimidly ester
  • CFSE Molecular Probes, Inc.
  • GIBC0 Cold RPMI1640 culture medium
  • Responsive cells labeled with CFSE and irradiated stimulating cells were adjusted to a density of 2 ⁇ 10 6 cells / ml on culture medium, and MSC or T cells transformed with MSC or S0D3 at a total volume of 1 ml in a 24-well plate were subjected to 10: Mixed at a rate of 1 37 ° C, 5% C0 2 , humidity
  • Naive CD4 + T cells were isolated from the lymph nodes and spleen of C57BL / 6 mice by negative selection using a MACS column (Miltenyi Biotech). The isolated cells were activated using CD28 antibody (2 ⁇ g / ml) antibody added to RPMI1640 medium containing 10% FBS, 2 mM glutamine, 1% penicillin-straptomycin and CD3 antibody attached to the plate.
  • Thl polarizing conditions 10 ⁇ g / ml anti-IL4 Ab, lOng / ml IL-12), Th2 polarizing conditions; 10 ⁇ g / ml anti-IFN- ⁇ Ab, lOng / ml IL -4), Thl7 polarizing condition (20 ng / ml IL-6, 5 ng / ml TGF- ⁇ , 10 ⁇ g / ml IFN- ⁇ antibody, 10 ⁇ g / ml IL-4 antibody) or Treg differentiation.
  • Cells were polarized in Treg polarizing conditions (5ng / ml TGF- ⁇ and lOng / ml IL-2) and then co-cultured with MSC or SOD3-transduced MSCs at a ratio of 10: 1 for 4 days.
  • Cytokines and antibodies for differentiation of CD4 + T cells were purchased from BD Bioscience. After 4 days of culture, cells were obtained and analyzed for mRNA expression using molecules or cytokines specific for Thl, Th2, Thl7 or Treg cell differentiation.
  • mice used in the experiment were C57BL / 6 mice at week 8 and were bred with standard mouse feed and water in the absence of specific pathogens, and were treated according to the regulations of the Garlic University Garlic Ethics Committee according to the Ministry of Health and Welfare. .
  • IMQ imiquimod
  • mice raised under SPF conditions were mixed with 10 ⁇ g of 0VA protein and 4 mg of aluminum hydroxide, an adjuvant, and injected intraperitoneally at the beginning of the experiment (D0), 7 (D7) and 14 (D14).
  • D0 the beginning of the experiment
  • D7 the beginning of the experiment
  • D14 14
  • 0VA 100 was dissolved in 100 ⁇ l PBS, soaked in lxlcm 2 gauze to make a patch, and attached to the back of the depilated mouse to induce immune reaction for 7 days.
  • Immune reaction was induced with the 0VA patch in the same way again for 35 days.
  • MSC, LacZ-MSC, and S0D3-MSC were injected into the lesion site, and at day 49, the skin was visually observed.
  • Dorsal skin cells were obtained from mice on days 6 and 12 of IMQ application and fixed in 4% para formaldehyde (PFA) and then embedded in paraffin. Skin samples were prepared using 4 micron thick tissue sections using a rotary microtome (Leica). After degreasing using xylene (xylene), it was dehydrated with concentration gradient alcohol. The pretreated tissue sections were stained with hemaroxylin and eosin (H & E staining). Fluorescent tissue staining experiment was performed by reacting tissue sections with primary antibodies against CD4, CD8, CDllc, Gr-1, etc., and then reacting with fluorescently labeled secondary antibodies such as Alexa f luor 488 and Alexa f luor 647. All. Mouse low splenocyte flow cytometry analysis
  • mice were obtained from mice in each experimental group and resuspended in MACS buffer (PBS with 0.5% BSA), FITC-binding anti mouse CD4 antibody, PE-binding anti mouse CD8 antibody, APC-binding anti mouse Grl antibody And PE—binding anti mouse CDllc antibody. After 30 minutes of antibody reaction, the cells were washed with MACS buffer, centrifuged, and resuspended with 500 ⁇ g of MACS buffer to perform FACS analysis. Reverse-dyne polymerase chain reaction (RT-PCR) and real-time quantitative polymerase chain reaction (RT-PCR) for mouse skin gene expression analysis
  • RT-PCR Reverse-dyne polymerase chain reaction
  • RT-PCR real-time quantitative polymerase chain reaction
  • RNA was obtained from the dorsal skin of mice using TRIzol reagent (Invitrogen).
  • cDNA was synthesized from the total RNA of lyg using reverse transcription system (Qiagen).
  • IL-1 a QT00113505), IL-1 ⁇ (QT00021385), IL-4 (QT00160678), IL-6 (QT00182896), IL-10 (QT00106169), IL-17 (QT00103278), IL-20 (QT00126735), IL-22 (QT00128324), IL-23 (QT01663613), IFNy (QT00000525), TNF-a (QT01079561), TGF- ⁇ Primer sets of (QT00025718), CXCL-KQT00199752), CCL20 (QT00261898) and GAPDH (QT02448075) were purchased from Qiagen (serial numbers in parentheses above are Qiagen catalog numbers
  • Primer sequences for confirming the expression level of Foxp3, T-bet, GATA3, RORyt, S0D3 are as follows: Foxp3 forward GCAACAGCACTGGMCCTTC (SEQ ID NO: 5), Foxp3 reverse GCATTGCTTGAGGCTGCGTA (SEQ ID NO: 6); T-bet forward AGCCAGCCAAACAGAGAAGA (SEQ ID NO: 7), T-bet reverse MTGTGCACCC TCAAACCC (SEQ ID NO: 8); GATA3 forward ACATGTCATCCCTGAGCCAC (SEQ ID NO: 9), GATA3 reverse A (MCTCTTCGCACACTTG (SEQ ID NO: 10); RORyt forward GCCTACAAT GCCACCACC (SEQ ID NO: 11), RORyt reverse ATT GAT GAG AAC CAG GGC (SEQ ID NO: 12); S0D3GA TGAGAGGA 13); S0D3 reverse AAGCTCTCTTGGAGCAGCTGGAAA (SEQ ID NO: 14)
  • Protein samples were obtained from the back skin of mice. The same amount of protein was loaded into each lane and electrophoresed and the protein blotted onto the membrane, the target protein was reacted with a target protein specific primary antibody and detected by a chemiluminescence system (GE health care Life Science). Statistical analysis
  • S0f 3 protein and S0D3 enzyme activity in mesenchymal stem cells (MSC) transformed with human S0D3 gene were investigated.
  • MSC was transformed into human S0D3 gene using electroporation, obtained 24 hours later, and subjected to RT-PCR and Western blot to confirm protein expression.
  • S0D3 enzyme activity was confirmed by measuring the amount of superoxide radicals present in the cell culture cultured for 24 hours.
  • FIG. 1 in MSCXS0D3-MSC transformed with S0D3, overexpression of S0D3 mRNA (A in FIG. 1) and S0D3 protein (B in FIG. 1) was compared with MSC (MSC) not transformed.
  • MSC MSC
  • S0D3-MSC showed significantly higher S0D3 activity than MSC (FIG. 1C).
  • R0S reactive oxygen species
  • MSC was transformed into human S0D3 gene using electroporation method, stimulated with TNF-a (10ng / ml) and IFN- ⁇ (100U / ml) for 1 hour, and the resulting R0S was fluorescently stained with H2DCF-DA. Measurement was made using a fluorophotometer. As shown in Figure 2, in the non-transformed MSC showed a strong fluorescence due to the generation of R0S due to TNF- a / IFN- ⁇ stimulation, but in S0D3-MSC PN after stimulation with TNF- a / IFN- ⁇ It was not significantly different from the control treated (control), rather fluorescence tended to decrease. That is, it was confirmed that S0D3-MSCs were significantly inhibited in the generation of reactive oxygen species compared to MSCs without transformation.
  • S0D3 transformation on cell proliferation of MSCs was examined using a ⁇ assay.
  • S0D3-MSCs showed improved cell proliferation up to 72 hours after transfection (72A) compared to non-transformed MSCs (FIG. 3A), and the number of cells was significantly increased (FIG. 3).
  • 72A 72 hours after transfection
  • FIG. 3A the number of cells was significantly increased
  • B The above results show that transformation due to SOD3 promotes cell proliferation of MSCs.
  • the increased cell proliferation activity of MSC transformed with S0D3 shows that the therapeutic efficiency can be further enhanced when developed as a cellular therapeutic agent for inflammatory diseases.
  • HaCaT cells After stimulation with TNF- ⁇ and IFN- ⁇ for 12 hours while co-culture with HaCaT cell line (kerat inocyte), HaCaT cells were obtained and the levels of various inflammatory cytokines expressed by HaCaT cells were measured by qRT-PCT.
  • MSCs HaCs
  • MSCs were cultured and transduced with AdLacZ or AdS0D3 adenovirus and stimulated with TNF-a (10ng / ml) and IFN- ⁇ (100U / ml) or intracellular IL- using RT-PCR without stimulation.
  • Intracellular mRNA expression levels of lRa intracellular IL-lRa, icIL-IRa
  • soluble IL_lRa soluble IL_lRa
  • unspliced IL-lRa HO-1, IDO-1, TGF- ⁇ , galectin-1 and IL-10 was measured (A to C of FIG. 5).
  • Relative expression levels of icIL-IRa were analyzed by real-time PCR (B of FIG.
  • MSCXS0D3-MSC transformed to overexpress S0D3, compared to MSC untransformed (MSC) or MSC transformed with LacZ as a control (LacZ-MSC), icIL— Expression levels of genes with various immunosuppressive functions such as IRa, TGF- ⁇ , IL-10, HO-1, and ID 1 were found to increase significantly.
  • ID0-1 and IL-10 were increased in TNF- ⁇ and IFN-Y-stimulated MSCs, whereas the expression of these genes was further increased in S0D3-MSCs.
  • overexpression of S0D3 did not significantly affect the amount of PGE2 secretion (D in FIG. 5) or galactin-1 expression in MSC.
  • H0-1 inhibits the reactivity of Thl7 by inhibiting the p-STAT3-R0RYt pathway, which regulates the kinetics of RORyt and F0XP3 expression, and has been shown to exhibit anti-inflammatory effects.
  • new therapeutics such as asthma, psoriasis and atopic dermatitis Become the target of have.
  • human MSC is known to induce the expression of indol eamine-2, 3-di oxygenase-1 (ID0-l).
  • ID0-1 inhibits T cell proliferation and apoptosis in immune cells. Induces immune suppression and has been accepted as a key regulator of autoimmune diseases such as acute graft-versus-host disease (GVHD). Therefore, as confirmed in the above embodiment, inducing activation of tryptophan catabolism pathways such as H0-1 or ID0-1 by overexpressing S0D3 in MSC can be a powerful therapeutic target for many autoimmune diseases. To present.
  • T cells isolated from mice of different species were treated with MSC with no MSCs, without treatment, LacZ-transduced MSCs, S0D3-type MSCs, depending on the experimental conditions.
  • CFSE based-mixed lymphocyte react ion (MLR) experiments were performed with co-culture, flow cytometry was performed on CD4 + or CD8 + cells (FIG. 6), and the flow cytometry results were quantitatively analyzed (FIG. 7).
  • MLR lymphocyte react ion
  • T cell proliferation inhibitory effect was similar to that of no treated MSC (MSC), ie, the T cell proliferation inhibitory effect of S0D3-type transduced MSCs was induced by overexpressed S0D3 enzyme activity. It can be seen that it is enhanced over MSC not introduced.
  • Na ⁇ ve T cells were co-cultured with no treatment MSC (MSC), LacZ-MSC or S0D3-MSC, depending on the experimental conditions, in the differentiation conditions of each Thl, Th2, Thl7 or Treg cell,
  • MSC MSC
  • LacZ-MSC LacZ-MSC
  • S0D3-MSC S0D3-MSC
  • Treg-related gene expression by -MSCs is due to the enzymatic activity of S0D3.
  • S0D3 transduction significantly increases the T cell differentiation effect of the original MSC.
  • Thl7 cells which act as pathogenic cells in inflammatory diseases, lower the differentiation of Treg cells, and have the effect of regulating inflammation. It suggests the possibility to induce inflammation more effectively.
  • IMQ imiquitnod
  • IMQ IMQ was continuously applied to the back of the shaved mouse for 12 days, and the reaction of inflammation on the skin was compared.
  • tissues were collected from the back skin tissue of the mouse, and the tissue samples were H & E stained and the thickness of the skin epidermis was measured.
  • IMQ IMQ without subcutaneous injection of MSC
  • erythema, peeling which can be visually confirmed after 2-3 days, is compared with the control group without IMQ. Symptoms such as scaling and thickening of the skin were accompanied by inflammatory symptoms.
  • mice injected with no treated MSC (MSC) or LacZ-transduced MSCs (LACZ-MSCs) tended to alleviate the symptoms of skin induced by IMQ.
  • mice injected with S0D3-transduced MSCXS0D3-MSC) were observed to have a markedly reduced visual symptoms such as erythema and hair loss compared to mice injected with MSC or LACZ-MSC. As shown in FIG. 12 and FIG.
  • the thickness of the skin epidermis measured from the back skin tissue sections of the control group and the mice of each experimental group was confirmed to be similar to the skin inflammation state observed by the naked eye.
  • IMQ was applied without MSC injection
  • the thickness of the skin epidermis was significantly increased compared with the control group.
  • the increase of skin epidermal thickness due to IMQ was decreased.
  • mice injected with S0D3-MSC The thickness of the epidermis did not increase after IMQ application, which was similar to that of the control group without IMQ application.
  • the epidermal thickness was significantly thinner compared to the mice injected with MSC or LACZ-S0D3.
  • composition and recruitment of immune cells in the spleen and skin of mice induced by skin inflammation with IMQ were investigated.
  • CD4 + T cells, CD8 + T cells, neutrophils, Grl + cells, and dendritic cells (dendritic cells, CDllc + cells) constituting the spleen of each MSC-injected mouse were examined by flow cytometry (Fig. 14), tissue sections of the skin, such as the application of IMQ, were stained for markers of different kinds of immune cells and the number of cells was measured (Figs. 15-16).
  • FIG. 14 CD4 + T cells and CD8 + T cells were decreased in the spleen of IMQ treated mice compared to control mice not treated with IMQ.
  • CD4 + T cells and CD8 + T cells were decreased in mice injected with MSC. It appeared to increase somewhat.
  • CD8 + T cells (data not shown), neutrophils (Grl +) and dendritic cells (CDllc +) all increased significantly, and MSC- or LacZ-MSC-treated mice reduced the immune cell infiltration induced by IMQ.
  • MSC- or LacZ-MSC-treated mice reduced the immune cell infiltration induced by IMQ.
  • infiltration was more suppressed than that of other MSCs, and it was observed that all T cells, neutrophils, and dendritic cells in skin tissues were markedly reduced.
  • IL-17, IL-22, and the major inflammatory mediators, IL-23, IL- ⁇ ⁇ , IL-6, and TNF- ⁇ , expressed by Thl7 cells were determined by S0D3-MSC. It was confirmed that the decrease significantly.
  • IL-10 which is an anti-inflammatory cytokine (ant i -inf l ammatory cytokine) and involved in regulating inflammation of Tregs, increased the amount of expression by MSC treatment, unlike other inflammatory cytokines, and IL- in S0D3-MSC. 10 The increase effect was observed to be much better.
  • the above results show that the inflammatory control action of MSC is more effectively increased by the introduction of SOD3, suggesting that it is possible to alleviate the symptoms of inflammatory diseases by controlling the expression and action of various cytokines in combination.
  • IMQ activates TLR-7 and / or TLR-8 and exhibits biological effects through the underlying NFkB signaling system. Therefore, the effects of MSC treatment, including MSC overexpressing or not S0D3, on TLR-7 / TRL-8 signaling were examined by Western blot experiment using IMQ coated skin. As shown in FIG. 18, it was confirmed that TLR-7 and phosphorylated NFkB (p-NFkB) were activated and expression levels also increased in skin such as IMQ-coated mice (FIG. 18A). Signaling of TLR-7 activated with IMQ showed a tendency to decrease by treatment with MSC or LacZ-MSC, and more markedly by S0D3-MSC. Similar results were observed for STAT1 / 3 and JAK1, but S0D3-MSC showed a significant inhibitory effect, especially on the signaling system of NF-kB. ⁇ 2-5> Increased cAMP Concentration in Plasma and Cells
  • Inflammation is caused by antigens introduced into the body stimulating T-helper cells to proliferate T-helper cells and secrete inflammation-causing substances.
  • Proliferation of T helper cells occurs by changing the ratio of cAMP and cGMP, two substances that govern cell division. As cGMP increases, cell division accelerates, and when cAMP increases, cell division slows down. When these ratios are out of balance, the risk of inflammatory disease increases. For example, in patients with psoriasis, the concentration of cGMP in cells or plasma is often high. Accordingly, the concentration of cAMP in the plasma of each MSC-treated mouse was measured using ELISA according to experimental conditions.
  • the plasma cAMP level of the mice injected with MSC or LacZ-MSC increased the cAMP level compared to the control, in particular, the cAMP level of the mouse plasma injected with S0D3-MSC was measured to be the highest . On day 6 of IMQ application this tendency became even more apparent.
  • Immune reaction was induced for 7 days.
  • the immune response was induced with OVA patch again in the same way from day 35 to week one.
  • MSC, LacZ-MSC, or MSC-S0D3 were injected into the lesion site according to the experimental conditions (5 mice per group), and at 49 days, skin changes were visually observed.
  • OVA-treated mouse OVA
  • the back skin of an OVA-treated mouse (OVA) without MSC injection was rougher, keratinized, and reddish-swollen, inflamed, and inflamed. I could confirm it.
  • mice injected with no-treated MSC (OVA + MSC) or mice injected with LacZ-MSC (OVA + LACZ-MSC) showed some improvement in skin inflammation compared to mice treated with OVA alone.
  • OVA + MSC no-treated MSC
  • LacZ-MSC OVA + LACZ-MSC
  • S0D3-MSC S0D3-MSC
  • the skin condition improved to a similar state to the control group, with almost no dead skin keratin and inflammation reactions, especially pronounced inflammation compared to mice injected with other MSCs.
  • the improvement effect was confirmed.
  • the results show that MSCs overexpressing S0D3 have superior effects in relieving skin inflammation compared to normal MSCs.
  • Mesenchymal stem cells overexpressing S0D3 have stronger antioxidant activity, immunomodulatory function, and cellular immunomodulatory function than normal mesenchymal stem cells. Mesenchymal stem cells overexpressing S0D3 may be useful for developing more effective stem cell therapeutics for inflammatory diseases, autoimmune diseases, and organ transplant rejection.

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Abstract

본 발명은 SOD3를 과발현하는 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다. 본 발명자는 SOD3를 과발현하는 중간엽 줄기세포 (MSC)가 일반 MSC에 비해 더욱 강한 항산화 활성, 면역조절기능을 가진다는 것을 확인하였으며, 따라서, SOD3를 과발현하는 MSC는 염증성 질환이나 자가면역질환, 장기이식 거부반응 등에 대하여 효과적인 치료제가 될 수 있다.

Description

【명세서】
【발명의 명칭】
S0D3를 과발현하는 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 조성물
【기술분야】
본 출원은 2015년 9월 15일에 출원된 대한민국 특허출원 제 10-2015-0130377 호를 우선권으로 주장하고， 상기 명세서 전체는 본 출원의 참고문헌이다.
본 발명은 S0D3를 과발현하는 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 염증성 질 환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로， 더욱 상세하게는 S0D3(extracel lular superoxide dismutase)를 과발현하는 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 대한 것이다.
【배경기술】
염증성 질환이란 여러 외부 자극 흑은 내부 요인으로 인해 인체 여라장기나 조직에 염증성 면역세포의 침윤과 더불어 부종， 발적 및 동통이 나타나고 조직학적 변화를 보이는 상태를 말한다. 이러한 염증은 손상조직과 이동하는 세포 (migrat ing cel l )로부터 생산되는 다양한 화학매개인자에 의하여 촉발되며, 이들 화학매개인자 들은 염증 과정의 형태에 따라 다양한 것으로 알려져 있다. 정상적인 경우에 생체 는 염증 반웅을 통하여 발병 요인을 중화시키거나 제거하고 상한 조직을 재생시켜 서 정상적인 구조와 기능을 회복시키지만， 그렇지 못한 경우에는 만성 염증과 같은 질병 상태로 진행되기도 한다. 이러한 염증 질환을 치료하기 위한 가장 일반적인 염증성 질환 예방 또는 치 료제는 크게 스테로이드성 및 비스테로이드성 염증성 질환 예방 또는 치료용제로 구분되며, 이중 대부분의 합성 염증성 질환 예방 또는 치료용제는 주작용 이외에 여러 가지 부작용을 수반하는 경우가 많으므로 효과가 탁월하며 부작용이 적은 염 증성 질환 예방 또는 치료제의 개발이 절실히 요구되고 있는 실정이다. 한편, 중간엽 줄기세포 (mesenchymal stem cel l , MSC)는 중간엽 조직 계통으 로 분화하는 능력을 가진 다분화능 전구세포이다. 이 세포는 다양한 세포에서 적웅 및 선천성 면역 반응올 조절하여 잠재적인 면역 조절 효과를 매개할 수 있어， 자가 면역 질환을 치료하기 위한 새로운 대안으로 떠오르고 있다. 또한 면역억제 및 항 염증 효과 (유럽등록특허 제 EP02298861호, 미국공개특허 계 US20120269774호)를 가질 뿐만 아니라 T 세포의 활성화 및 증식을 억제하는 것으로 알려져 있다 (Li ZJ et al . , PloS ( 8( 10)： 77159 , 2013) . 하지만 MSC의 일반적인 항염증 효과에 대해서만 공지되어 있을 뿐, 염증 관 련 질환에 대하여 더욱 강력한 효과를 갖도록 최적화된 MSC줄기세포 치료제는 아 직까지 개발이 미진한 실정이다. 따라서 염증성 질환의 예방 또는 치료에 적합한 MSC 치료제 개발이 절실히 요구된다.
【발명의 상세한 설명】
【기술적 과제】
이에， 본 발명자들은 부작용은 현저히 낮으면서 염증성 질환의 예방 및 치료 에 적합한 줄기세포를 포함하는 염증성 질환의 치료제에 대하여 연구하던 중 중간 엽 줄기세포 (MSC)에서 S0D3를 과발현하면 면역조절과 항산화 효과 등의 기능이 현 저하게 향상되는 것을 발견하여 본 발명을 완성하였다. 따라서 , 본 발명의 목적은
S0D3(extracel lular superoxide di smutase)를 과발현하는 줄기세포를 유효성 분으로 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이 다. 본 발명의 다른 목적은
염증성 질환 치료용 제제를 제조하기 위한 S0D3를 과발현하는 줄기세포의 용 도를 제공하는 것이다. 본 발명의 또 다른 목적은
상기 S0D3를 과발현하는 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물의 유효량을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 것을 특징으로 하는 염증성 질환의 치 료 방법을 제공하는 것이다.
【기술적 해결방법】 상기의 목적을 달성하기 위해， 본 발명은
S0D3(extracel lular superoxide di smutase)를 과발현하는 줄기세포를 유효성 분으로 포함하는 염증성 .질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다. 본 발명의 다른 목적을 달성하기 위해, 본 발명은
염증성 질환 치료용 제제를 제조하기 위한 S0D3를 과발현하는 줄기세포의 용 도를 제공한다. 본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위해， 본 발명은
상기 S0D3를 과발현하는 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물의 유효량을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 것을 특징으로 하는 염증성 질환의 치 료 방법을 제공한다. 이하 본 발명을 상세히 설명한다. 달리 규정되지 않는 한, 본 발명에 사용된 기술적 및 과학 용어들은 본 발명 이 속하는 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 이해하는 바와 동일한 의미를 갖고， 다웁 문헌에 기재된 바와 부합된다 (Singleton et al , Dict ionary of Microbiology and Molecular Biology, 2nd Ed. , 1994； Janeway, C. , Tr avers , P. , alport , M. , Shlomchik, Immunobiology, 5th Ed. , 2001) . 본 발명은 S0D3를 과발현하는 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 염증성 질 환 예방또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다. 본 발명에 따른 상기 약학적 조성물은 S0D3를 유효성분으로 포함하는 조성물 일 수도 있고， 유효성분으로서 S0D3로 이루어진 조성물일 수도 있으며 , 또는 유효 성분으로서 S0D3로 필수적으로 구성되는 조성물일 수도 있다. 본 명세서에서 용어 "〜을 포함하는 (compri sing)" 이란 "함유하는 ( including)" 또는 "특징으로 하는 (characterized by) "과 동일한 의미로 사용되 며, 본 발명에 따른 조성물 또는 방법에 있어서， 구체적으로 언급되지 않은 추가적 인 구성 성분 또는 방법의 단계 등을 배제하지 않는다. 또한 용어 "~로 구성되는 (consi st ing of )" 이란 별도로 기재되지 않은 추가적인 요소, 단계 또는 성분 등을 제외하는 것을 의미한다. 용어 "필수적으로 구성되는 (essent ial ly consist ing of ) " 이란 조성물 또는 방법의 범위에 있어서， 기재된 물질 또는 단계와 더불어 이의 기본적인 특성에 실질적으로 영향을 미치지 않는 물질 또는 단계 등을 포함할 수 있는 것을 의미한다. 본 발명에서 "단백질"은 폴리펩타이드 (polypept ide) 또는 펩타이드 (pept ide) 와 호환성있게 사용되며， 예컨대， 자연 상태의 단백질에서 일반적으로 발견되는 바 와 같은 아미노산 잔기의 중합체를 말한다. 상기 "S0D3( superoxide dismutase 3， extracel hilar) "란 세포외 분비 슈퍼옥 사이드 디스뮤테이즈 (extracel lular superoxide dismutase , EC-SOD) 단백질로서， 슈퍼옥사이드 디스뮤테이즈 (superoxide di smutase) 단백질의 세 가지 종류 중 세포 외부로 분비되는 단백질을 일컫는다. 인간의 정상형 (wi ld-type, T) S0D3 단백질의 아미노산 서열은 NCBI Genbank database의 NP_003093.2 등의 accession number로 공지되어 있으며， 인간의 S0D3 단백질을 암호화하는 mRNA의 염기서열은 匪 _003102.2 등의 accession number로 공지되어 있다.
S0D3 단백질은 음이온의 부동 변화 (dismutat ion) 반옹을 촉매하고， 세포 외 부로 분비되어 세포외 기질 (extracel hilar matrix)에 존재하며， 항혈관신생， 항염 증， 항화학주성， 항암활성 등의 효과를 나타낸다. 구체적으로는 피부암， 색소 침착 성 질환, 광노화， 피부염， 표피증식질환， 건선， 아토피, 두드러기 및 알레르기 등 의 질환을 치료하는데 유효한 효과를 가지고 있으며 (대한민국 등록특허 제 100676502호)， 혈관 신생에 의한 질병의 예방 및 치료에도 효과가 있는 것으로 알 려져 있다 (대한민국 등록특허 제 101019470호) . 또한, 대장암， 폐암， 간암， 위암， 식도암， 췌장암, 담낭암， 신장암， 방광암, 전립선암, 고환암, 자궁경부암, 자궁내 막암， 융모암， 난소암， 유방암， 갑상선암， 뇌암， 두경부암， 악성혹색종， 림프종 등 의 암 질환에도 유효한 효과를 가지는 것으로 알려져 있다 (대한민국 공개특허 제 10-2008-108876호) . 본 발명에서 S0D3는 인간 및 마우스를 포함하는 포유동물， 바람직하게는 인 간으로부터 유래한 단백질을 의미하며， 가장 바람직하게는 서열번호 1로 표시되는 인간의 정상형 S0D3 단백질의 아미노산 서열， 또는 서열번호 3으로 표시되는 재조 합 S0D3 단백질 (209E-S0D3)의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 상기 인간의 정상형 S0D3는 N-말단 부위의 개시 메치오닌 아미노산을 포함하 여 18번째의 알라닌까지는 시그날 펩타이드로 되어 있으며， 활성화된 S0D3는 상기 시그날 펩타이드가 제거된 222개의 아미노산으로 구성된다. S0D3의 C-말단 영역 (아 미노산 잔기 210번 -215번)에는 헤파린 결합 도메인 (heparin binding domain)을 가 지고 있다. 시그널 펩타이드를 포함하는 240개의 아미노산으로 이루어진 전체 길이 의 인간 S0D3의 아미노산 서열은 서열번호 1에 표시된 바와 같다. 또한 본 발명에서의 S0D3는 전체 길이의 인간 S0D3 중 N-말단 부위의 시그날 펩티드 및 C-말단 부위의 헤파린 결합 도메인이 포함된 13개의 아미노산 (아미노산 잔기 210번〜 222번)이 제거된 209개의 아미노산으로 이루어진 것일 수도 있다. 상기 시그널 펩타이드와 헤파린 결합 도메인이 제거된 S0D3 단백질은 본 발명에서 209E- S0D3 또는 209E로 지칭할 수 있으며 , 바람직하게는 서열번호 3으로 표시되는 아미 노산 서열을 가질 수 있다. 상기 209E-S0D3는 항 -S0D3 항체와도 결합할 수 있으며， 정상형 S0D3와 동일한 효소 활성 및 R0S 제거 활성을 갖는 것으로 확인된 바 있다 ( 대한민국 공개특허 제 10-2008-0108876호) . 본 발명에서의 S0D3는 정상형 S0D3 또는 209E-S0D3 단백질과 실질적으로 동 등한 생리 활성을 갖는 기능적 동등물 (funct ional equivalent ) , 기능적 유도체 (funct ional der ivat ive) 및 상기 S0D3 단백질의 단편이 모두 포함된다. 실질적으 로 동등한 생리 활성이란 정상형 S0D3와 동등한 수준의 효소 활성 및 /또는 세포외 분비 특성과 세포내 투과성을 갖는 것을 의미하며， S0D3와 동등한 효소 활성으로 인하여 줄기세포, 바람직하게는 중간엽 줄기세포에서 과발현되었을 때 줄기세포의 면역 및 염증 조절능력을 향상시키게 된다. 상기 줄기세포의 면역 및 염증 조절능 력이란 구체적으로는 염증으로 인한 면역 세포의 침윤 억제, 전염증성 T 세포의 증 식과 분화 및 전염증성 매개체 /사이토카인의 발현의 억제， 염증조절능을 갖는 Treg 세포의 증식과 분화 및 Treg 관련 사이토카인의 발현 증가， NFkB 신호전달계의 인 산화 억제 등을 의미하며, 본 명세서에서 서술한 본 발명의 S0D3를 과발현하는 줄 기세포가 갖는 특성에서 기재한 바와 같다. 상기 S0D3의 기능적 동등물은 바람직하게는 서열번호 1 또는 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상， 보다 바람직 하게는 90% 이상의 서열 상동성 (homo logy)을 갖는 폴리펩티드일 수 있다. 또한 상 기 기능적 동등물은 본 발명의 S0D3의 아미노산 서열 중 일부가 부가, 치환 또는 결실의 결과 생성될 것일 수 있다. 상기에서 아미노산의 치환은 바람직하게는 보존 적 치환이다. 천연에 존재하는 아미노산의 보존적 치환의 예는 다음과 같다: 지방 족 아미노산 (Gly, Ala, Pro), 소수성 아미노산 (lie, Leu, Val), 방향족 아미노산 (Phe, Tyr, Trp), 산성 아미노산 (Asp, Glu), 염기성 아미노산 (His, Lys, Arg, Gin, Asn) 및 황 함유 아미노산 (Cys, Met). 또한 상기 기능적 동등물에는 본 발명의 S0D3의 아미노산 서열상에서 아미노산의 일부가 결실된 변형체도 포함된다. 상기 아미노산의 결실 또는 치환은 바람직하게는 S0D3 단백질의 생리활성에 직접적으로 관련되지 않은 영역에 위치해 있다. 아울러 상기 S0D3의 아미노산 서열의 양 말단 또는 서열 내에 몇몇의 아미노산이 부가된 변형체도 포함된다. 예를 들어 209E- S0D3과 같이 S0D3의 효소 활성에는 영향을 주지 않으면서 S0D3 전체 길이의 일부분 이 제거된 펩티드일 수 있으며， S0D3 단백질과 실질적으로 동등한 생리 활성을 갖 는 SNKsmall nucleotide polymorphism) 등 S0D3의 다형성 (polymorphism) 단백질일 수도 있다. 본 발명의 기능작 동등물의 범위에는 본 발명의 S0D3 단백질의 기본 골격 및 이의 생리 활성을 유지하면서 단빡질의 일부 화학 구조가 변형된 폴리펩티드 유도 체도 포함된다. 예를 들어， 여기 한정되는 것은 아니지만， 본 발명의 S0D3 단백질 의 안정성， 세포내 투과성, 저장성， 휘발성 또는 용해도 등을 변경시키기 위한 구 조 변경이 이에 포함된다. 본 발명의 약학적 조성물에 유효성분으로 포함되는 S0D3를 과발현하는 줄기 세포는 바람직하게는 중간엽 즐기세포일 수 있다. 본 발명의 "중간엽 줄기세포 (mesenchymal stem cell, MSC)"는 뼈 (bone)， 연 골 (cartilage), 지방조직 (fat tissue), 힘줄 (건)， 신경조직 (nerve tissue), 섬유아 세포 (fibroblast) 및 근육세포 (muscle cell) 등 구체적인 장기의 세포로 분화되기 전의 다분화 전구 세포 (multipotent progenitor)를 말한다. 본 발명에서 중간엽 줄 기세포는 분화되지 않은 상태， 즉 줄기세포 상태로 초성물 중에 포함된다. 본 발명 의 중간엽 줄기세포는 포유류에서 유래한 것일 수 있으며 바람직하게는 인간에서 유래한 것일 수 있다. 본 발명의 증간엽 줄기세포는 제대， 제대혈， 태반， 골수， 지방조직, 근육， 양수 및 양막으로 이루어진 군으로부터 선택된 조직에서 유래한 것일 수 있다. 바 람직하게는 본 발명의 중간엽 줄기세포는 제대혈 또는 태반 유래 중간엽 줄기세포 일 수 있으며, 가장 바람직하게는 제대혈 유래 중간엽 줄기세포일 수 있다. 제대혈 또는 태반 유래 중간엽 줄기세포는 골수 유래 중간엽 줄기세포보다 분화 능력 및 증식 능력이 뛰어난 특징을 지닌다. 본 발명에서 사용된 용어 제대혈은 포유동물의 태반과 태아를 연결하는 제대 정맥으로부터 채취된 혈액을 말한다. 상기 제대혈은 출산시 공여자의 제대정맥으로 부터 용이하게 채취할 수 있다. 보다 구체적으로， 정상질식분만의 경우에는 출산 후 자궁 내에 아직 태반이 남아있는 상태에서 밖으로 만출된 제대정맥으로부터 채 취할 수 있다. 또는 제왕절개의 경우에는 출산 후 태반 역시 자궁 밖으로 만출된 상태에서 제대정맥으로부터 채취한다. 본 명세서에서， "태반 줄기세포"라는 용어는 형상， 세포 표면 표지 또는 1차 배양 후 계대 수에 무관하게 포유류 태반에서 유래한 줄기세포 또는 전구세포로서 조직 배양 기질 (t i ssue cul ture substrate) , 예를 들어 조직 배양 플라스틱 또는 피브로넥틴 피복 조직 배양판에 부착하는 것을 말한다. 그러나 본 명세서에서 "태 반 줄기세포"라는 용어는 영양막 세포 (trophoblast )를 가리키는 것은 아니다. 세포 는 줄기세포의 특징 중 적어도 하나， 예를 들어 적어도 하나 이상의 세포 유형으로 분화할 수 있는 능력 등올 갖추고 있으면 줄기세포이다. 태반 또는 제대혈로부터 당업계에 공지된 방법에 따라 중간엽 줄기세포를 분 리할 수 있다. 상기 중간엽 줄기세포의 분리는 종래 알려진 어떤 분리방법에 의해 서도 분리될 수 있다. 예를 들면 , 밀도차를 이용한 분리법 (densi ty gradient fract ionat ion) , 면역선택 ( immunoselect ion) 및 감별 부착 분리법 (di f ferent i al adhes ion separat ion) 등이 있다. 제대혈 또는 태반으로부터 중간엽 줄기세포를 분 리， 배양하는 방법은 기존에 사용되어 온 방법은 모두 사용할 수 있다. 상기에서 분리된 중간엽 줄기세포의 배양은 당업계에 공지된 세포 배양용 배 지에서 수행할 수 있으며， 예를 들면， 이에 한정되지는 않으나， DMEM 배지, McCoys 5A 배지, Eagle ' s basal 배지， CMRL 배지, Glasgow 최소 필수 배지， Ham' s F-12 배 지， Iscove ' s modi f ied Dulbecco' s 배지， Liebovi tz ' L-15 배지, RPMI 1640 배지 SB-3 basal media둥이 있다. 또한， 본 발명에서 세포 배양 배지에는 필요에 따라 한 가지 이상의 보조 성분을 첨가할 수 있는데， 우태아혈청， 말 또는 인간 등의 혈 청을 비롯하여， 미생물의 오염을 막기 위한 항생제 및 항진균제 등을 사용할 수 있 다- 분리 또는 배양된 즐기세포는 사용 전까지 당업계에 공지된 방법에 의해 보 관될 수 있다. 일반적으로 줄기세포는 동결보호 (cyoprotect ion) 처리한 후 넁동 보 관할 수 있다. 상기 동결보호 처리는 당업계에 공지된 DMS0, 글리세롤， 폴리비닐피 를리돈， 폴리에틸렌 글리콜， 알부민, 덱스트란， 수크로스， 에틸렌 글리콜， i-에리 스리를， D-리비를， D-만니를 ， D-솔비를， i-이노시를, D-락토스 또는 콜린 클로라 이드와 같은 동결보호제를 이용하여 수행할 수 있다. 본 발명에 따른 S0D3를 과발현하는 줄기세포는 S0D3를 암호화하는 폴리뉴클 레오티드를 포함하는 재조합 발현 백터를 줄기세포에 형질도입시켜 수득한 것일 수 있다. 본 명세서에서 용어 "발현 (expression) "은 세포에서 단백질 또는 핵산의 생 성올 의미하며， "과발현 (overexpression) "은 정상적인 상태 또는 일반적인 상태보 다 특정 유전자의 발현의 수준이 과도하게 증가한 것을 의미한다. 본 발명에서 S0D3를 과발현하는 줄기세포는 구체적으로는 S0D3 단백질의 발현 수준이 증가하여 S0D3 단백질의 활성이 증가되어 있는 줄기세포이다. 본 명세서에서 "폴리뉴클레오티드 (polynucleot ide) " 또는 핵산은 단일 -또는 이중-가닥의 형태로 된 데옥시리보뉴클레오티드 (DNA) 또는 리보뉴클레오티드 (RNA) 를 말한다. 다른 제한이 없는 한, 자연적으로 생성되는 뉴클레오티드와 비슷한 방 법으로 핵산에 흔성화되는 자연적 뉴클레오티드의 공지된 아날로그도 포함된다. 즐기세포에서 S0D3를 과발현시키는 가장 일반적인 방법은 S0D3 유전자를 포 함하는 폴리뉴클레오티드를 줄기세포에 인위적으로 또는 실험적으로 도입하여 S0D3 유전자의 복제개수 (COpy nLimber )를 증가시키는 것이다. 원래의 세포가 가지고 있던 것이 아닌 외인성 (exogenous) 폴리뉴클레오티드를 세포 내부로 주입하는 것을 형질 감염 (transfect ion) , 그리고 이로 인하여 세포의 유전적 형질이 변화되는 현상을 형질전환 (transformat ion)이라고 한다. 상기 외인성 폴리뉴클레오티드가 바이러스 또는 바이러스 유래 백터를 통하여 세포 내부로 주입되는 과정을 형질도입 (transduct ion)이라고 부른다. 본 명세서에서는 용어 '형질전환' ， '형질감염' 그리고 '형질도입' 이 외인성 폴리뉴클레오티드를 세포에 도입되어 정상형과 다른 유전적 형질을 갖게 된 것 또는 그러한 과정을 일컫는 것으로서 유사한 의미로 사 용된다. 본 발명에서 S0D3를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 포유류에서 유래한 S0D3 유전자일 수 있으며， 바람직하게는 서열번호 2로 표시되는 인간의 정상형 S0D3를 암호화하는 염기서열 또는 서열번호 4로 표시되는 209E-S0D3를 암호화하는 염기서 열을 포함하는 것일 수 있다. 또한 상기 S0D3를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 인간의 S0D3의 염기서열， 바람직하게는 서열번호 2 또는 서열번호 4로 표시되는 염기서열과 실질적인 동일성 을 나타내는 서열도 포함한다. 실질적인 동일성은 인간 S0D3를 암호화하는 폴리뉴 클레오티드의 염기서열과 비교 대상이 되는 임의의 다른 염기서열을 최대한 대응되 도록 정렬하고， 당해 기술분야에서 통상적으로 이용되는 분석 방법과 알고리즘을 이용하여 서열을 비교 분석하는 경우， 최소 70% 이상의 상동성올 나타내는 서열을 의미한다. 상기 S0D3를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 염기서열과 실질적으로 동 일한 염기서열에 의해 암호화되는 단백질은 S0D3 단백질， 바람직하게는 서열번호 1 또는 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 단백질의 기능적 동등물 일 수 있다. S0D3 단백질의 기능적 동등물에 대하여서는 본 명세서에서 앞서 서술 한 바와 같다. 본 명세서에서 "재조합 발현 백터"란 적합한 숙주세포에서 목적 단백질 또는 목적 핵산 (RNA)을 발현할 수 있는 백터로서, 폴리뉴클레오티드 (유전자) 삽입물이 발현되도톡 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 작제물을 말한다. 작동가능하게 연결된 (operably l inked) ' '이란 일반적 기능을 수행하도록 핵 산 발현 조절 서열과 목적하는 단백질 또는 RNA를 코딩하는 핵산 서열이 기능적으 로 연결 (funct ional l inkage)되어 있는 것을 말한다. 즉， 단백질 또는 RNA를 코딩 하는 핵산 서열이 발현 조절 서열에 의해 유전자 발현이 가능하게 되는 방식으로 연결된 것을 의미하는 것으로， 예를 들어 프로모터와 단백질 또는 RNA를 코딩하는 핵산 서열이 작동가능하게 연결되어야 코딩하는 핵산 서열의 발현에 영향을 미칠 수 있다. 재조합 백터와의 작동적 연결은 당해 기술분야에서 잘 알려진 유전자 재 조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며， 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기 술 분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용한다. 본 발명의 재조합 발현 백터는 클로닝 분야에서 통상적으로 사용되는 백터라 면 그 종류가 특별히 제한되지 않으며, 그 예로는 플라스미드 백터， 코즈미드 백 터， 박테리오파아지 백터 및 바이러스 백터 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는 바이러스에서 유래한 백터를 사용할 수 있다. 상기 플라스미드에는 대장균 유래 플라스미드 (pBR322, pBR325, pUC118 및 pUC119, pET-22b(+) ) ; 바실러 스 서브틸리스 유래 플라스미드 (pUBllO 및 pTP5) 및 효모 유래 플라스미드 (ΥΕρ13, ΥΕρ24 및 YCp50) 등이 있으며， 상기 바이러스는 레트로바이러스, 아데노바이러스 또는 백시니아 바이러스와 같은 동물 바이러스， 배클로 바이러스와 같은 곤층 바이 러스 등이 사용될 수 있으며, 이에 제한되지 않는다. 본 발명에 따른 핵산을 포함하는 발현 백터는 당업계에 공지된 방법, 예를 들어 이에 한정되지는 않으나， 일시적 형질감염 (transient transfect ion) , 미세주 사， 형질도입 (transduct ion) , 세포융합， 칼슘 포스페이트 침전법， 리포좀 매개된 형질감염 ( l iposome-mediated transfect ion) , DEAE 덱스트란-매개된 형질감염 (DEAE Dextran- mediated transfect ion) , 폴리브렌一매개된 형질감염 (polybrene— mediated transfect ion) , 전기천공법 (electroporat ion)， 유전자 총 (gene gun) 및 세포 내로 핵산을 유입시키기 위한 공지의 방법에 의해 줄기세포 내로 도입할 수 있다. 본 발명에 따른 S0D3를 과발현하는 줄기세포는 S0D3를 암호화하는 폴리뉴클 레오티드를 포함하는 재조합 발현 백터를 바람직하게는 전기천공법 또는 바이러스 로 매개되는 형질도입 방법을 이용하여 중간엽 줄기세포에 주입하여 형질전환한 것 일 수 있다. 또한 본 발명의 줄기세포는 재조합 바이러스 백터를 이용하여 다음의 단계를 거쳐 제조될 수 있다: (a) 셔를백터， S0D3를 암호화하는 핵산 및 /또는 단백질 형질 도입 도메인이 작동가능하게 연결된 DNA 컨스트럭트를 포함하는 재조합 바이러스 백터를 제조하는 단계; (b) 상기 재조합 바이러스 백터를 바이러스 생산 세포주에 형질감염시켜 S0D3 발현 재조합 바이러스를 제조하는 단계; 및 (c) 상기 S0D3 발현 재조합 바이러스로 중간엽 줄기세포를 감염시키는 단계. 상기 셔를백터는 PUB110 , PGX1416, PGX1417, PUL61, PSA77 및 PGX1418 등이 있으며, 본 발명의 일실시예에서는 ColEl의 pCA14( Invitrogen)를 사용하였다. 본 발명의 바이러스 백터는 레트로바이러스 백터， 아데노바이러스 백터， 아데노연관바 이러스 (AAV) 백터， 백시니아바이러스 백터， 허피스바이러스 백터, 렌티바이러스 백 터 및 아비폭스바이러스 백터로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 한다. 바 람직하게는 아데노바이러스 백터일 수 있다. 본 발명에 따른 S0D3로 형질전환되어 S0D3를 과발현하는 중간엽 줄기세포 (MSC)는 면역억제기능을 갖는 유전자의 발현이 증가되어 있으며， 염증 반응에서 호 중구 및 수지상세포의 기능과 침윤을 조절함으로써 강력한 면역 조절 능력을 발휘 한다. 뿐만 아니라 S0D3를 과발현하는 MSC는 전염증성 매개체 /사이토카인의 발현량 을 현저하게 감소시켰으며， 특히 TLR-7와 NFkB의 활성화를 억제하는 것으로 확인되 었다. 본 발명자의 실시예는 S0D3를 과발현하는 MSC가 염증성 질환에 대하여 효과 적인 치료제가 될 수 있음을 시사한다. 본 발명의 S0D3를 과발현하는 줄기세포는 하기 특성 중 적어도 한 가지 특성 을 가지는 것을 특징으로 한다.
(a) CD4+ T세포， CD8+ T 세포， 호중구, 수지상세포로 이루어진 군에서 선택 된 하나 이상의 침윤을 억제하는 특성을 나타냄;
(b) CD4+ T 세포， CD8+ T 세포, Thl 세포， Th2 세포， Thl7 세포의 분화 및 증식은 억제하고 Treg의 분화와 증식은 촉진하는 특성을 나타냄;
(c) IL-1 α , IL-Ιβ , IL-4, IL-6, IL-17, IL-20, IL-22, IL-23 , TNF- α， IFN- γ , CXCL1 및 CCL20으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 염증성 사이토카 인의 발현을 억제하는 반면 , Treg 관련 사이토카인인 IL-10와 TGF-β의 발현은 증 가시키는 특성을 나타냄 ; (d) NFkB, p38, JNK, STAT1 및 STAT3으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 인산화를 억제하는 특성을 나타냄 ;
(e) 체내 cAMP 수준을 증가시키는 특성을 나타냄 .
(f ) icIL-IRa, TGF-β , IL-10, HO— 1， IDO-1 등 면역억제 기능이 있는 유전자 의 발현이 증가되어 있는 특성을 나타냄. 본 발명자들이 다양한 세포 실험과 동물 실험을 통해 밝힌 S0D3를 과발현하 는 줄기세포， 특히 중간엽 줄기세포 (MSC)의 면역조절능력은 구체적으로 다음과 같 다. 본 발명의 일실시예에서는 S0D3로 형질전환된 MSCXS0D3-MSC)와 공동배양한 HaCaT 세포에서는 TNF- α와 IFN- γ의 자극에 의해 유도되는 전염증성 사이토카인 (proinf lammatory cytokine)의 발현 수준이 형질전환하지 않은 MSC와 공동배양한 HaCaT에 비교하여 현저하게 감소하고， 반대로 항염증 사이토카인으로 알려진 TGF- β의 발현은 증가한 것을 관찰하였다. 또한 다른 일실시예에서는 S0D3-MSC에서는 형질전환되지 않은 MSC또는 대조 군으로 LacZ로 형질전환된 MSC(LacZ— MSC)와 비교하여， icIL-IRa, TGF-β， IL-10 , H0-1 그리고 ID0-1과 같은 다양한 면역억제 기능을 갖는 유전자의 발현 수준이 크 게 증가한 것으로 확인되었다. 이는 S0D3를 과발현하는 MSC는 그렇지 않은 MSC와 비교하여 과도한 면역 반응을 억제하는 면역 조절능력이 크게 향상된 것올 보여주 는 것이다. 특히 H0-1과 ID0_1은 염증성 사이토카인과 Thl7에 의한 반응을 억제하 고 면역세포의 세포사멸을 유도하는 등의 면역조절 활성이 있음이 보고된 바 있다. 따라서， S0D3를 과발현하는 MSC는 H0-1 또는 ID0-1의 발현 증가를 통하여 천식， 건 선 아토피 등의 자가면역질환 및 장기이식환자에서 발생할 수 있는 염증과 이식거 부반응을 효과적으로 조절할 수 있음을 이해할 수 있다. 본 발명의 다른 일실시예에서는 MSC와 공동배양한 흔합림프구배양 실험에서 형질전환하지 않은 MSC와 비교하여 S0D3-MSC과 공동배양했을 때 CD4+ T 세포와 CD8+
T 세포 분화와 증식이 억제되는 것을 확인하였다. 또한 본 발명의 다른 일실시예에 서는 미분화 T 세포들을 각각 다른 MSC(MSC, LacZ-MSC, S0D3-MSC, MSC+DETCA)와 공 동배양하면서 Thl , Th2, Thl7, Treg 세포로 분화 유도한 결과， S0D3-MSC는 S0D3를 과발현하지 않는 MSC와 비교하여 미분화 T 세포의 Treg 세포로의 분화는 증진시키 고， Thl7과 다른 T 세포로의 분화는 억제하는 것을 더욱 확인하였다. 본 발명의 다른 실시예에서는 염증성 질환 중 건선과 같은 급성 발진성 피부 염의 모델로 마우스 실험을 수행하였으며, MSC를 투여한 마우스보다 S0D3-MSC를 투 여한 마우스의 피부에서 흥반, 각질화 등의 피부 증상， 피부 두께， 면역 세포의 피 부로의 침윤 현상 등으로 측정되는 만성 급진성 피부염의 병변이 더욱 효과적으로 개선되었다. 또한 세포 실험에서 확인한 결과와 마찬가지로， S0D3-MSC를 투여한 마 우스에서 전염증성 매개체의 발현은 더 효과적으로 억제하고， Treg 세포와 관련된 IL-10의 발현은 증가시키는 것으로 확인되었다. 추가적으로 신호전달 경로에 대한 실험에서 특히 NFkB신호전달체계를 억제하는 것을 확인하였다. 또한 난백 단백질로 유발되는 아토피 유사 피부 염증의 마우스 모델에서도 MSC를 투여한 마우스보다 S0D3-MSC를 투여한 마우스에서 염증 병변이 현저하게 개 선되는 것을 확인하였다. 따라서 이상의 세포 실험과 동물 실험 결과는 S0D3의 과발현으로 인하여 MSC 의 면역조절능력이 현저하게 향상되는 것을 보여주며， S0D3를 과발현하는 MSC는 염 증성 질환의 예방 또는 치료에서 기존의 아무 처리하지 않은 MSC보다 더욱 효과적 인 줄기세포 치료제로 사용될 수 있음을 시사한다. 본 명세서에서 "치료 "란 치료되는 개체 또는 세포의 자연적 과정을 변경시키 려는 임상적 시술을 의미하며, 임상적 병리의 예방을 위해서도 수행될 수 있다. 치 료의 바람직한 효과는 질병의 발생 또는 재발 억제， 증상의 완화， 질병의 임의의 직접 또는 간접적인 병리학적 결과의 감소， 질병 진행 속도의 감소， 질병 상태의 개선， 호전， 완화 또는 개선된 예후 등을 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "예방"은 질병의 발병을 억제시키거나 진행을 지연시키는 모든 행위를 의미한다. 본 발명에서의 예방 또는 치료의 표적인 염증성 질환은 바람직하게는 Th2 또 는 Thl7 매개성 질환일 수 있다. 상기 "Th2 또는 Thl7 매개성 질환"은 Th2 세포 또는 Thl7 세포에 의해 매개되는 질환을 말한다. 본 발명에서의 Th2 또는 Thl7 매 개성 질환은 더욱 바람직하게는 장기이식 거부반응， 자가면역 질환， 염증성 장질 환, 염증성 안질환, 아토피를 포함하는 염증성 피부질환 및 알레르기성 질환으로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있다. 상기 Th2 매개성 질환은 Th2 세포에 의해 매개되는 질환으로， 특히 알레르기 를 일으키는 항원 (al lergen) 특이적인 Th2 세포의 생성 및 활성으로 유발되는 질환 올 의미한다. Th2 세포는 CD4와 T 세포 수용체 (TCR)를 발현하는 면역세포로， GATA3 전사인자 등의 작용으로 IL-4, IL-5, IL-6, IL-13 등의 사이토카인을 분비하면서 체액성 면역에 관여한다. Th2 세포가 자가항원 (autoant igen)에 대하여 과다 활성화 되면, 비만세포 (mast cel l )와 IgE가 관여하는 알레르기와 과다면역반웅이 일어나는 것으로 알려져 있다. 아토피 피부염， 아토피와 관련된 다른 피부 질환， 알레르기성 비염, 알레르기성 천식 등을 포함하는 Th2 매개 질환에서 Th2의 분화를 의제하거나 활성을 억제함으로써 Th2 매개성 질환을 치료할 수 있음을 알 수 있다. 상기 Thl7 매개성 질환은 Thl7 세포의 과다한 분화로 인한 Thl7/Treg 세포간 의 불균형 또는 Thl7 세포의 과다한 활성으로 인해 발생하거나 병세가 악화되는 질 환을 의미한다. Thl7 세포는 대표적인 전염증성 (proinf lammatpry) 세포로서， 미감 작 CD4+ T 세포가 TGFP와 IL-6가 존재하는 환경에서 항원성 자극을 받으면 ROR Y t , STAT-3 등의 전사인자의 작용을 통해 분화한다. 성숙한 Thl7 세포는 염증성 사 이토카인인 IL-17, IL-21 , IL-22 등을 분비하며， 염증이 시작된 말초조직으로 침윤 하여 대식세포, 수지상세포， 섬유모세포， 혈관내피세포， 파골세포 등과 상호작용하 여 염증성 사이토카인과 기타 염증성 인자의 분비를 증폭시키고 조직 손상을 일으 킨다. 이같은 Thl7 세포는 다양한 자가면역 질환， 알레르기성 질환， 염증성 질환 그리고 장기이식 거부반웅 등에서 주요 병인성 세포로 밝혀진 바 있다. 한편 Treg 세포는 Thl7 세포와는 반대로 염증을 조절하는 역할을 하는 세포로서， 미감작 CD4+ T 세포가 TGFP가 존재하는 항원에서 적절한 항원성 자극을 받으면 Foxp3 등의 전 사인자를 발현하며 분화하게 된다. 성숙한 Treg 세포는 TGFp와 IL-10 등의 사이토 카인을 통해 T 세포의 증식과 활성을 감소시키는 것으로 알려져 있다. 특히 면역계 에서 자가관용 (sel f-tolerance)에 중요한 역할을 하며， 마우스 모델 등의 동물 실 험에서 Treg 활성을 조절하여 자가면역질환과 장기이식 거부반응을 치료할 수 있는 가능성이 제시된 바 있다. 상기 Treg 세포와 Thl7 세포는 각각 염증을 억제하거나 염증을 증폭시키는 상반된 기능을 하지만, 이들은 동일한 전구세포로부터 분화되며， 건강한 정상 상태 에서는 두 세포 간 균형을 이루고 있다. 미감작 CD4+ T 세포가 TGF]3와 항원성 자 극에 의해 분화할 때 존재하는 염증성 사이토카인 종류에 따라 Treg 또는 Thl7 세 포로 분화의 방향이 결정되는데， 병인성 Thl7 세포가 과분화되거나 활성이 과다해 져서 서로의 역할을 적절히 견제해야 하는 Treg 세포와 Thl7 세포의 균형이 깨지면 Thl7 매개성 질환이 유발되는 것이다. 따라서 상기 Thl7 매개성 질환에서， Thl7 세 포의 증식과 분화는 억제하고 Treg의 분화를 유도함으로써 면역 세포간 균형과 항 상성을 회복하여 상기 Thl7 매개성 질환을 치료할 수 있음올 알 수 있다. 본 발명자들은 실시예에서 세포 실험과 동물 실험을 통해 S0D3를 과발현하도 록 형질전환된 MSCXS0D3-MSC)가 Th2 또는 Thl7 세포의 분화는 억제하고, Treg 세포 의 분화는 증가시키는 것을 확인하였다. 특정 T 세포 분화 조건에서， S0D3-MSC와 공동배양한 미감작 CD4+ T 세포들은 MSC와 공동배양하지 않은 대조군 또는 S0D3를 과발현하지 않는 MSC와 공동배양한 T 세포와 비교하여 IL-4, GATA3 둥 Th2 표지자 와 ROR y t와 IL-17 등 TM7 표지자의 발현량은 현저하게 감소하였으며, Foxp3, TGF β , IL-10 등 Treg 표지자의 발현량은 반대로 크게 증가하여， S0D3-MSC가 Th2 및 Thl7의 분화는 억제하고 Treg의 분화는 증진시키는 것을 확인하였다 (실시예 <1- 7>) . 또한 만성 급진성 피부 염증의 마우스 모델에서도 S0D3-MSC를 주입한 마우스 의 피부에서는 S0D3를 과발현하지 않는 MSC와 비교하여 IL-6, IL-17과 IL-22 등 Th2와 Thl7 관련 전염증성 사이토카인의 발현량은 현저하게 감소하였으며， 반대로 Treg 관련 염증 조절 사이토카인인 IL-10의 발현은 크게 증가한 것을 관찰하였다 ( 실시예 <2-3>) . 또한 상기 급진성 피부 염증 마우스 모델과 아토피 유사 피부 염증 의 마우스 모델에서 S0D3-MSC는 S0D3를 과발현하지 않는 MSC와 비교하여 증상을 개 선시키는 탁월한 효과가 있었다. 이상의 실험 결과는 S0D3를 과발현하는 MSC가 Th2 또는 Thl7 매개 질환의 효과적인 세포 치료제가 될 수 있음을 시사한다. 또한 본 발명에서 염증성 질환은 보다 구체적으로는 급성 또는 만성 장기이 식 거부반옹, 이식편대숙주병， 염증성 장 질환， 크론병， 궤양성 대장염， 염증성 피 부 질환， 다발성 경화증， 췌장염， 외상 유발 쇼크， 기관지 천식， 알러지성 비염， 알러지성 결막염, 낭포성 섬유증， 급성 기관지염， 만성 기관지염, 급성 세기관지 염， 만성 세기관지염， 골관절염， 통풍， 척추관절병증, 강직성 척추염, 라이터 증후 군, 건선성 관절병증， 장질환 척추염， 연소자성 관절병증, 연소자성 강직성 척추 염， 반응성 관절병증, 감염성 관절염， 후-감염성 관절염， 루게릭병， 결절성 다발동 맥염， 과민성 혈관염， 루게릭 육아종증， 류마티스성 다발성 근육통， 관절세포 동맥 염， 칼슘 결정침착 관절병증, 가성 통풍， 비 -관절 류마티즘， 점액낭염， 건초염， 상 과염, 신경병증성 관절질환 (neuropathic joint disease 또는 Charcot joint) , 출혈 성 관절증 (hemarthrosis), 알레르기 자반병， 비후성 골관절병증， 다중심성 세망조 직구종， 척추측만증 (scoliosis), 혈색소증， 혈색소병증， 고지단백혈증， 저감마글로 불린혈증， 가족성 지중해열 (familial Mediterranean fever), 베체트씨병， 전신성 흥반성 루푸스， 재귀열， 패혈증， 패혈성 쇼크， 급성 호흡곤란 증후군， 다발성 장기 부전， 만성 폐쇄성 폐질환 (chronic obstructive pulmonary disease) , 류마티스성 관절염 (rheumatoid arthritis), 급성 폐손상 (acute lung injury), 기관지 폐 형성 장애 (broncho— pulmonary dysplasia), 제 1형 당뇨병, 제 2형 당뇨병， 동맥경화, 알츠 하이머성 치매， 가족성 한랭자가염증 증훈군 (familial cold auto inflammatory syndrome), 머클 -웰스 증후군 (Muckle-Wel Is syndrome) , 신생아발병 다발성 염증성 '질환 (neonatal multisystem inflammatory disease) , 만성 유아 신경피부관절 증후 군 (chronic infantile neurologic cutaneous articular syndrome) , 성인발증형 스 틸병 (adult-onset Still's disease), 접촉성 피부염, 포상기태 (hydatidiform mole) , PAPA 증早군 (syndrome of pyogenic arthritis, pyoderma gangrenosum and acne), 고면역글로불린 D 증후군 (hyper immunoglobulin d syndrome) , 크리오피린 관 련 주기적 증후군 (cryopyr in— associated periodic syndrome) , 각막염， 결막염 , 망 막염， 망막혈관염， 포도막염， 안검염， 알레르기결막염， 건성 안 (dry eye), 전신성 경피증 (progressive systemic sclerosis) , 다발성 근염 (polymyosit is)， 자가면역성 뇌척수염， 중증 근무력증 (myasthenia gravis), 결절성 다발성 동맥염 (polyarteritis nodosa) 및 섬유조직염 (fibromyalgia syndrome)으로 이루어진 군에 서 선택되는 하나 이상의 질환인 것일 수 있다. 본 명세서에서 "장기이식 거부반응 (transplant rejection)"이란， 구체적으 로는 심장， 폐， 심장 및 폐 복합， 간， 신장， 췌장， 피부, 장 (bowel) 또는 각막 등 고형장기의 이식 후에 이식받은 환자의 체내 면역세포가 이식기관에 침윤하고 공격 함으로써 세포사멸과 조직 괴사 등을 유발하여 발생하는 급성 또는 만성의 이식 거 부반응， 그리고 골수이식 후 이식편대숙주병 (graft— versus-host disease, GVHD)일 수 있다. 상기 염증성 질환 중 염증성 피부 질환은 건선, 아토피성 피부염, 습진성 피 부염， 접촉성 피부염， 지루성 피부염, 장미색 비강진, 편평 태선， 혈관염， 모공성 흥색 비강진， 봉와직염， 모낭염, 옹종， 천포창， 수포성 (bul lous) 천포창， 표피 수 포증， 담마진， 혈관 부종， 맥관염， 흥반 및 피부 호산구 증가증으로 이루어진 군에 서 선택되는 하나 이상의 질환인 것을 특징으로 한다. 또한 S0D3를 과발현하는 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 본 발명의 약학 적 조성물은 약학적으로 허용되는 담체 및 회석제를 추가로 포함할 수 있다. 상기 약학적으로 허용되는 담체 및 회석제는 줄기세포 및 이를 이식받을 수혜자에 대해 생물학적 및 생리학적으로 친화적인 것일 수 있다. 약학적으로 허용되는 회석제의 예로는 이에 한정되지는 않으나， 염수， 수용성 완층액, 용매 및 /또는 분산제 (dispersion media)를 들 수 있다. 또한 본 발명은 S0D3를 과발현하는 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 자가 면역질환또는 장기이식 거부반웅의 예방또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다. 전술한 바와 같이， 자가면역질환 또는 장기이식 거부반응에는 공통적으로 전 염증성 Thl7 세포가 중요하게 관여하고 있으며， 본 발명자들이 규명한 바에 따르면 S0D3를 과발현하는 MSC는 Thl7의 증식과 분화는 억제하고 염증을 조절하는 Treg 세 포의 분화는 촉친시킨다. 또한 S0D3를 과발현하는 MSC는 icIL-IRa, TGF-β， IL-10 , H0-1 그리고 ID0-1과 같은 다양한 면역억제 기능을 갖는 유전자의 발현 수준이 크 게 증가되어， 과도한 면역 반웅을 억제하는 면역 조절능력이 크게 향상되어 있음을 확인하였다. 이에 따라 통상의 기술자는 본 발명에 따른 S0D3를 과발현하는 줄기세 포를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물을 통하여 과도한 면역 반응을 억제함으 로써 자가면역질환과 장기이식 거부반응의 예방 또는 치료의 효과를 기대할 수 있 음을 알 수 있다. 상기 "장기이식 거부반웅" 은 전술한 바와 같이， 예를 들어 심장, 폐， 심장 및 폐 복합， 간, 신장 등의 고형 장기의 이식 후에 이식받은 환자에서 발생하는 급 성 또는 만성의 이식 거부반응， 그리고 골수이식 후 이식환자에서 발생하는 이식편 대숙주병 (graft-versus-host disease, GVHD)일 수 있다. 또한 상기 "자가면역질환" 은 체내 면역 세스템이 외부에서 유래한 항원이 아닌 내부의 정상 세포 또는 단백질을 공격하여 발생하는 질환으로서， 구체적인 예 로는 전신 흥반성 낭창, 루푸스， 류마티스 관절염, 자가면역성 간염, 자가면역성 용혈성 질환， 약물 유발성 자가면역성 용혈성 빈혈, 자가면역성 내이질환， 메니에 르병， 제 1형 당뇨병， 루푸스, 베체트병, 크론병， 길랑 바레 증후군, 자가면역성 갑 상선염， 하시모토 갑상선염, 궤양성 대장염， 쇼그렌 증후군， 경피증， 다발성 경화 증, 결절성 다발 동맥염, 건선， 아토피 피부염, 백반， 심상성 천포창 (Pemphigus vulgar is) , 피부근염， 중증 근무력증 (myasthenia gravi s) , 애디슨씨 병 (Addi son' s disease) 등이 있다. 장기이식 거부반웅과 자가면역질환 모두 과다 염증 반웅을 동반하는 경우가 많기 때문에, 염증성 질환으로도 분류가 가능하여 앞서 본 명세서에서 염증성 질환 으로서 기재한 질환의 일부가 이에 해당할 수 있다. 또한, 본 발명의 약학적 조성물은 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속， 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형 화될 수 있다. 상기 본 발명의 약학적 조성물은 주사제의 형태로 제제화되는 것이 바람직하 며, 투여경로로는 경피내， 근육내， 복강내， 정맥내， 피하내， 비강내， 척수강내， 구 강내 경로를 포함할 수 있으나， 이에 제한되지는 않는다. 본 발명의 실시예에서는 마우스에 S0D3로 형질전환한 MSC를 국소 피하주사하여 투여하고 치료 효과를 확인 하였다. 또한， 본 발명의 약학적 조성물은 도관법을 사용하여 적용될 수도 있는데， 말초 정맥 접근법에 있어서， 세포는 단일 덩어리 또는 여러 개의 더 작은 분취량으 로 도관을 통해 주사될 수 있다. 도관을 이용한 세포의 투여는 예를 들면, 표준 말 초 정맥내 도관， 중앙 정맥 도관， 또는 폐동맥 도관을 통한 정맥내 전달을 포함할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물의 투여량은 투여 경로， 투여 시간， 치료 횟수， 치 료 기간， 치료가 필요한 개체의 연령， 체중， 건강 상태， 성별， 질환의 중증도， 약 물에 대한 민감도， 식이 및 배설율， 등 다양한 요인을 고려하여 당업자가 상술한 특정 용도에 따른 적절한 유효량을 결정할 수 있다. 상기 "유효량" 이란 개체에게 투여하였을 때, 염증성 질환이나 자가면역질환， 장기이식 거부반응 등의 개선, 치 료, 예방， 검출 또는 진단 효과를 나타내기에 충분한 양을 말하며， 상기 "개체 "란 동물, 바람직하게는 포유동물， 가장 바람직하게는 인간을 포함하는 동물일 수 있으 며, 동물에서 유래한 세포, 조직， 기관 등일 수도 있다. 상기 개체는 치료가 필요 한 환자일 수 있다. 본 발명의 방법은 염증 반응을 억제하기 위하여 필요한 만큼의 줄기세포를 이용할 수 있다. 예를 들어， 상기 줄기세포는 lx io2개， lx io5개， lx io7개， lx io8 개， lx io9개 또는 더 많은 수의 줄기세포를 포함할 수 있다. 본 발명의 일실시예에 서는 2X 106개의 S0D3로 형질전환 MSC를 마우스 모델에 피하주사한 바 있다. 상기 투여는 하루에 한번 또는 수회 나누어 투여할 수도 있다. 본 발명의 약 학 조성물은 단독으로 투여되거나 염증성 질환이나 자가면역질환, 장기이식 거부반 응 등의 예방 또는 치료에 효과가 있는 것으로 알려진 다른 치료제와 병용하여 투 여될 수 있고， 병용하여 투여할 경우 다른 치료제와 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 상기 단독 투여 또는 병용 투여시 본 발명의 약학 조성물의 투여량은 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양올 투여하는 것이 바람직하며， 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 또한 본 발명은 염증성 질환 치료용 제제를 제조하기 위한 S0D3를 과발현하 는줄기세포의 용도를 제공한다. 상기 용도와 관련하여， 본 발명에 따른 S0D3를 과발현 하는 줄기세포, 특히 S0D3를 과발현하는 중간엽 줄기세포 (MSC)의 염증 조절 활성과 이에 기반한 염증성 질환의 치료 효과， 그리고 S0D3를 과발현하는 줄기세포의 제작 방법에 대하여서는 본 명세서에서 전술한 바와 같다. 또한 본 발명은 S0D3를 과발현하는 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 약학 적 조성물의 유효량을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 것을 특징으로 하는 염증 성 질환의 치료 방법을 제공한다. 본 발명에 따른 상기 약학적 조성물은 S0D3를 유효성분으로 포함하는 조성물 일 수도 있고， 유효성분으로서 S0D3로 이루어진 조성물일 수도 있으며， 또는 유효 성분으로서 S0D3로 필수적으로 구성되는 조성물일 수도 있다. 상기 염증성 질환의 치료 방법과 관련하여， 본 발명에 따른 S0D3를 과발현 하는 즐기세포， 특히 S0D3를 과발현하는 증간엽 줄기세포 (MSC)의 염증 조절 활성과 이에 기반한 염증성 질환의 치료 효과， 치료 효과를 내기 위한 유효량 및 투여 방 법 등은 본 명세서에서 전술한 바를 참고로 할 수 있다.
【유리한 효과】
따라서 본 발명은 S0D3를 과발현하는 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 염 증성 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다. S0D3로 형질전환되어 S0D3를 과 발현하는 중간엽 줄기세포 (MSC)는 일반 MSC에 비해 더욱 강한 항산화 활성， 면역조 절기능을 가지고 있으며 따라서, S0D3-형질도입 MSC는 염증성 질환， 자가면역질환 또는 장기이식 거부반응 등에 대하여 효과적인 치료제가 될 수 있다.
【도면의 간단한 설명】
도 1은 S0D3로 형질전환된 MSCXS0D3-MSC) 또는 대조군 MSC(MSC)의 S0D3 발현 양상을 확인하는 RT-PCR (도 1의 A) , 웨스턴 블랏 (도 1의 B) , S0D3 효소 활성 (도 1 의 C) 실험 결과를 나타낸다.
도 2는 S0D3-MSC 또는 MSC에서 TNF- α와 자극으로 생성되는 활성산소 종을 관찰하기 위한 형광염색사진과 형광광도계 측정 결과를 나타낸 그래프이다. 도 3은 S0D3 형질전환이 MSC의 세포 증식에 미치는 영향을 확인하기 위한 시 간에 따른 ΜΤΤ 어세이 결과 (도 3의 Α)와 측정된 세포의 수 (도 3의 Β)를 나타낸 그 래프이다.
도 4는 S0D3-MSC 또는 MSC가 HaCaT 세포의 염증 관련 사이토카인의 발현에 미치는 영향을 확인하기 위한 RT-PCR실험 결과를 나타낸다.
도 5는 MSC , LacZ로 형질전환된 MSC(LACZ-MSC) , S0D3로 형질전환된 MSC(S0D3-MSC)에서 RT-PCR 결과로 측정한 intracel lular IL-lRa( i cIL-lRa) , soluble IL-lRa(sIL-lRa) , unspl iced IL-lRa의 발현 수준 (도 5의 A) 및 icIL-IRa mRNA 수준의 정량 분석 (도 5의 B) , H0— 1， DI0-1 , TGF-β， Galect in-1 , IL-10의 발 현 수준 (도 5의 C) , 해당 세포의 배양 배지에서 면역어세이로 측정한 PGE2의 수준 ( 도 5의 D)을 나타낸다.
도 6은 음성대조군 (ControK-) ) , 양성대조군 (ControK+) )， 그리고 실험조건 에 따라 아무 처리하지 않은 MSC(MSC) , LacZ 형질전환된 MSC(LACZ-MSC)， S0D3 형질 전환된 MSC(S0D3-MSC) , DETCA 처리한 S0D3 형질전환된 MSC S0D3-MSC+DETCA)와 각각 공동배양한 CFSE—기반 흔합림프구반옹 실험에서의 CD4+ T 세포와 CD8+ T 세포 증식 을 측정하기 위한 유세포분석 (FACS) 결과를 나타낸다. DETCA는 S0D3 효소 억제제이 다.
도 7은 도 6의 FACS 결과를 정량화한 그래프를 나타낸다. 세로축의 St imulat ion index(%)는 자극을 가했을 때의 세포 수 /자극을 가하지 않았을 때의 세포수의 백분율을 나타낸다.
도 8은 T 세포의 계통특이적 핵심 전사인자와 사이토카인의 발현 수준을 측 정하는 RT-PCR 결과를 보여주는 그래프이다.
도 9는 Treg 계통특이적인 핵심 전사인자 및 사이토카인의 발현 수준을 측정 하는 RT-PCR 결과 (상단)와 MSC가 Treg 세포분화의 미치는 영향을 보여주는 유세포 분석 결과 (하단)를 나타낸다.
도 10은 IMQ로 유발된 만성 급진성 피부 염증의 마우스 실험 개요의 모식도 이다.
도 11은 IMQ로 유발된 만성 급진성 피부 염증 생체 모델 실험에서 각 실험군 마우스의 병변 진행을 보여주는 마우스의 등 피부 사진이다.
도 12는 IMQ로 유발된 만성 급진성 피부 염증의 마우스 실험에서 H&E 염색한 각 실험군의 마우스 등 피부 절편의 현미경 사진이다.
도 13은 IMQ로 유발된 만성 급진성 피부 염증의 마우스 실험에서 각 실험군 의 마우스의 등 피부의 표피 두께 측정 결과를 비교하는 막대그래프이다.
도 14는 IMQ로 유발된 만성 급진성 피부 염증의 마우스 실험에서 각 실험군 의 마우스의 비장에 침윤한 T 세포， 호중구 (Grl+) 및 수지상세포 (CD11C+)의 비율을 나타낸 그래프이다.
도 15는 IMQ로 유발된 만성 급진성 피부 염증의 마우스 실험에서 각 실험군 의 마우스의 피부에 침윤한 T 세포， 호중구 (Grl+) 및 수지상 세포 (CD11C+)를 면역 조직화학법으로 염색하여 분석한 현미경 사진이다. 화살표는 염색된 세포를 가리키 는 것이다.
도 16은 IMQ로 유발된 만성 급진성 피부 염증 생체 모델 실험에서 각 실험군 의 마우스의 피부에 침윤한 T 세포， 호중구 (Grl+) 및 수지상 세포 (CDllc+)의 숫자를 나타낸 그래프이다.
도 17은 IMQ로 유발된 만성 급진성 피부 염증의 마우스 실험에서 각 실험군 의 마우스의 피부에서 발현된 전염증성 매개체의 mRNA 수준을 측정한 RT-PCR 결과 를 나타내는 그래프이다.
도 18은 IMQ로 유발된 만성 급진성 피부 염증 생체 모델 실험에서 각 실험군 의 마우스의 피부에 존재하는 TLR-7, NF-kB, JNK, p38 , STAT1 , STAT3 , JAK1 , JAK2 의 발현량과 인산화 수준을 보여주는 웨스턴 블랏 실험 결과를 나타낸다.
도 19는 IMQ로 유발된 만성 급진성 피부 염증 생체 모델 실험에서 각 실험군 의 마우스의 혈장에서 측정한 cAMP 농도를 나타내는 막대그래프이다.
도 20은 난백 단백질 (OVA)로 유발되는 아토피 유사 피부 염증의 마우스 실험 과정을 보여주는 모식도이다.
도 21은 난백 단백질 (OVA)로 유발되는 아토피 유사 피부 염증의 마우스 실험 에서 각 실험군의 마우스의 병변 진행을 보여주는 등 피부 사진이다.
【발명의 실시를 위한 형태】
이하본 발명을 상세히 설명한다.
단， 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐， 본 발명의 내용이 하기 실 시예에 한정되는 것은 아니다.
<실험 방법 >
MSC의 배양 및 동정
인간의 제대혈에서 유래한 중간엽 줄기세포 (hUCB-MSC)는 제공자의 동의하에 인간 탯줄의 혈액 샘플로부터 수집하였다. 탯줄 혈액 샘플은 채취 후 항응고제로 작용하는 구연산 인산 포도당을 포함하는 혈액수집팩에 보관하였다. 실험을 위한 처리는 24시간 이내에 실시하였다. Fi col l— Paque PLUS 농도 구배 (Amersham Biosciences)하에 원심분리하여 단핵 세포 분획을 분리하였다. HBSS(Jei l Biotech Services)로 세척하고， 저혈당 Dulbecco의 변형된 Eagle 배양액 (DMEM, Invi trogen Corp) , 20% 우태아 혈청 (Gibco-BRL) , 2mM L-글루타민， ImM 피루브산 나트륨 및 1% 의 항생제 /항진균제 (Li fe Technologies)로 재현탁하였다. 항생제 /항진균제는 lOOU/ml 페니실린， 100 u g/ml 스트렙토마이신， 25 y g/ml의 암포테리신 B를 포함한 다. 7일 후， 부착되지 않은 세포는 제거하고， 부착된 세포를 두 가지 배양액을 일 주일마다 바꿔가며 배양하였다. 세포는 5% C02, 37°C의 습윤 조건에서 배양하였다. 융합성 세포의 약 60%를 0.1% 트립신 -EDTA로 분리하였고， 배양 플레이트에 옮겨 담 았다.
WJCB-MSC의 면역표현형을 분석하여 MSC와 관련된 항원 양성 마커의 존재와 조혈 계통 마커의 부재를 유동세포 분석법 (Epics XL, Beckman Coulter)으로 조사하 였다. 양성 마커로는 CD90(Thy-l) , CD105(endogl in) 및 SH3(CD73)가 있으며, 조혈 계통 마커로는 CD34, CD45 및 CD31과 같은 내피 세포 마커가 있다. 세포는 HLA class I에는 양성이었지만， HLA-DR에는 음성이었다. 각각의 형광표지 단일클론 항 체는 Becton Dickinson에서 구입하였다. 전기천공법을 이용한 S0D3 형질전환과 S0D3 과발현의 확인
본 명세서 도 1 내지 4의 실험 결과는 전기천공법으로 S0D3 형질전환된 MSC 를 이용하였다. 전기천공법 (electroporat ion)은 MSC에 Neon™ 프로토콜 ( Invitrogen)에 따라 전기 자극 (1000 voltage , 1 pulse)을 가하여 세포막의 투과성 을 증가시킨 뒤 DNA를 세포 내에 주입하였으며, DNA의 과발현 유무는 단백질을 습 득하여 웨스턴 블랏하거나， 인간 S0D3의 유전자 (Genbank accession number 丽_003102.2)를 PCR로 증폭시켜 1.5% agarose gel에서 확인하였다. 증폭 프로그램 은 94°C 5min; 94 "C 40s , 57 °C 30s , 72 °C 60s(35 cycle) ; 72 °C lOmin; 4°C 0-∞로 구성하였다 (∞는 무한대로， 특정된 시간이 없다는 의미로 사용함) .
S0D3 형질도입을 위한 아데노바이러스 발현 백터 및 형질도입 조건
본 명세서 도 5 내지 21의 실험 결과는 아데노바이러스로 S0D3 형질도입된 MSC를 이용하였다. 인간의 S0D3를 포함하는 pRC/CMV hS0D3 백터는 상동 재조합 (homologous recombinat ion)으로 El 셔를백터인 pCA14에 삽입하였다. 병합 셔를백 터와 백터 dEl-k35/lacZ는 상동 재조합에 의해 다시 결합시켜서 최종적으로 dEl- k35/S0D3 컨스트력트를 제조하였다. 재조합 아데노바이러스를 포함하는 상층액은 플라크로부터 분리하여 293 세포에서 증식시켰다. 준비된 인간의 S0D3 유전자 또는 LacZ 유전자를 포함하는 아데노바이러스는 10 감염다중도 (mult ipl icity of infect ion, M0I )로 중간엽 줄기세포 (mesenchymal stem cel l , MSC)에 형질도입하였 다.
S0D3의 효소 활성 측정
S0D3의 효소 활성은 슈퍼옥사이드 라디칼을 측정하여 확인하였다. 20μ1의 시료에 200Μ xanthine(Sigma)와 PBS상의 50M WST-l(Doj indo)를 흔합하고， 0.0005unit XOD(Sigma)를 처리한 후, formazan 염료 신호 발색을 母광학적으로 측 정하였다.
MTT어세이
MSC의 세포 증식을 측정하기 위하여 ΜΊΤ 어세이를 실시하였다 (Man et al . , 2006； Wei chert et al . , 1991). 6xl03cell MSC를 24시간 동안 배양하고， 배양된 MSC 를 전기천공법을 이용하여 인간 S0D3 유전자로 형질전환시킨 뒤, 24시간， 48시간, 72시간째에 MTT(5mg/ml)를 해당 well에 20μ1을 처리하고， 4시간 동안 추가 배양하 였다. 배지를 제거하고, well당 ΙΟΟμΙ dimethyl sulfoxide로 세포를 용해시키고 흡수파장 595nm로 흡광도를 측정하였다 (Bio-Tek Instruments, Winooski , VT, USA).
TNF-α와 IFN-γ 자극으로 MSC에서 생성되는 활성산소종의 측정
MSC는 6-well plates에 분배하여 24시간 배양한 후， lOng/ml TNF-α와 100 U/ml IFN-γ로 1시간 동안 자극하였다. 30분 동안 Hanks balanced salt solution (HBSS)으로 세포를 안정시킨 후， 37°C에서 30분 동안 10 μΜ 2,7- dichlorofluorescin diacetate(H2DCF-DA)로 염색하였다. 방출파장 513nm과 여기파 장 488nm 조건으로 공초점 현미경 (confocal microscopy)으로 DCF— fluorescence를 통해 R0S를 관찰하고， 형광광도계 (Synergy, BIO TEK, US)로 형광도를 측정하였다. 면억억제 분자 (immunosuppressive molecule) 발현 분석
MSC에서 발현되는 면역억제기능을 갖는 유전자 발현을 분석하기 위하여 다음 과 같은 방법으로 MSC를 배양하고 TNF-α 및 IFN-γ로 자극하거나 자극이 없는 상 태에서 유전자 발현을 분석하였다:
-Day 0: 60mm 배양접시 (dish)에 MSC(lxl04cel ls/cm2)를 배양한 후 (medium volume: 3 ml), 70-80% confluency로 세포를 배양함.
-Day 1: 상기 배양된 MSC를 wild— type S0D3를 포함하는 아데노바이러스 또는 대조군 바이러스 (AdLacZ)로 24시간 동안 감염시켜 S0D3로 형질도입되도록 함. -Day 2： 바이러스 감염 24시간 후에 새로운 MSC성장배지로 교체함.
-Day 3： 24시간 동안 추가 배양하고， TNF- a (10ng/ml )와 IFN- γ (lOOUnit/ml ) 를 첨가하여 자극하거나 자극하지 않은 세포를 수득하여 mRNA 수준을 측정하여 해 당 유전자 발현 분석을 수행함.
유전자 발현 분석을 위해 QuantiTect Reverse Transcription Kit(QIAGEN)을 이용하여 Ιμΐ total RNA로부터 cDNA를 합성하였다. 간단히， gDNA wipeout Buffer 를 이용하여 Template RNA에서 유전체 DNA(genomic DNA)를 제거하고， 42°C에서 2분 간 배양 후， 즉시 얼음에 보관하였다. 이후 역전사효소 (reverse transcriptase), RT buffer 및 RT primer mix를 template RNA와 흔합한 후， 42°C에서 15분， 95°C에 서 3분 동안 반웅을 진행하였다. 합성된 cDNA는 사용할 때까지 -20°C에 보관하였 다. 그 후， 0.25 template, Ιμΐ의 해당 primer, 10 μ 1 TOP polymerase mixture 그 리고 8.75μ1의 증류수를 흔합하여 최종 부피 20μ1로 RT-PCR을 수행하였다. PCR 결과는 1¾ agarose gel로 전기영동하여 확인하였다. RT-PCR과 real-time PCR에 사 용된 프라이머 서열은 다음과 같으며 Bioneer (Korea)에서 주문제작하였다: icIL- lRa forward 5'-TTAT( ;AGCAGCTCAGTT-3' (서열번호 15)， reverse 5'— TTGACACAGGACAGGCACAT —3' (서열번호 16); sIL-IRa forward 5'- TCCGCAGTCACCTMTCACTC-3' (서열번호 17), reverse 5'- TTGACACAGGACAGGCACAT-3' (서 열번호 18); unspliced IL-lRa forward 5 ' -GGCCTCCGCAGTCACCTAATCACTCT -3' (서열번 호 19)， reverse 5 ' -GGTCGCACTATCC ACATCTGGG-3' (서열번호 20); HO—1 forward 5'_ CCTGGTGTCCCTTCAATCAT-3 '(서열번호 21), reverse 5 ' -GGCGATGAGGTGGAATACAT-3 '(서열 번호 22); IDO-1 forward 5'-TGTGMCCCAA GCArnTTC-3' (서열번호 23)， reverse 5'-A GACGCTGCTTTGGCC-3' (서열번호 24); TGF-β forward 5 ' -CCCAGCATCTGCAAAGCTC- 3' (서열번호 25), reverse 5'-GTCAATGTACAGCTGCCGCA-3' (서열번호 26); Galectin-1 forward 5'-GGTCTGOTCGCCAGCAACCTGAAT-3' (서열번호 27)， reverse 5'- TGAGGCGGTTGGGGAACTTG -3' (서열번호 28); IL-10 forward 5'- MGCTGAGAACCAAGACCCAGACATCAAGGCG— 3' (서열번호 29)， reverse 5'-
AGCTATCCCAGAGCCCCAGATCCGAri TGG-3' (서열번호 30)； GAPDH forward 5'- MGGTCGGAGTCMCGGAn GGT-3' (서열번호 31)， reverse 5'-
AGTGATGGCATGGACTGTGGTCAT-3 '(서열번호 32 ) . 프로스타글란딘 E2 면역어세이
프로스타글란딘 E2(prostaglandin E2, PGE2)의 측정은 모든 표준물질과 샘플 에 대하여 2번씩 반복하여 수행하였다 (duplicate). ΙΟΟμΙ의 표준회석물질 (standard diluent; Tissue Culture Media)은 NSB와 Bo(0pg/raL 표준물질)에 넣고， ΙΟΟμΙ의 표준물질을 적당한 well에 첨가하였다. 이와 유사하게 ΙΟΟμΙ의 샘플을 해당 well에 첨가하였다. 이후 50 μΐ assay buffer를 NSB well에 첨가하고， 50 μΐ blue conjugate를 total activity(TA)와 blank well을 제외한 나머지 각각의 well 에 첨가하였다. 이후 50μ1의 yellow antibody를 각 well에 첨가하고 plate shaker (~500rpm)에서 2시간 동안 반웅시켰다. 400μ1의 wash solution으로 각 well 을 3번 세척하였다. 마지막 세척 후， 각 well의 버퍼를 모두 제거하고， lint free paper towel을 이용하여 남아 있는 washing buffer를 모두 제거한 다음 5μ1 blue conjugate를 TA well에 첨가하였다. 다음으로 200μ1의 pNpp substrate solution을 각 well에 첨가하였다. 실온에서 진동 없이 45분간 반응을 진행하고， 각각의 well 에 50μ1의 stop solution을 첨가한 후， 405nm에서 흡광도를 측정하였다.
T세포 증식 분석
MSC 및 S0D3로 형질전환한 MSC와 공동배양한 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 증식올 확인하기 위하여 CFSE(carboxyf luorescein diacetate succinimidly ester) -MLR 분 석을 실시하였다. 24웰 플레이트 (Costar, Corning)에 lxi()6개의 CFSE-표지된 반웅 세포 (responder cell, C57BL/6 마우스의 전체 비장세포)를 넣고， 3000cGY로 방사능 처리한 1X106개의 자극 세포 (stimulator cell, Balb/c 마우스 세포)로 자극하여 실 시하였으며， 3회 반복하였다 (triplicate). CFSE 표지는 반웅 세포를 200X
106cell/ml 밀도로 PBS에 재현탁하였다. 5μΜ의 최종 농도로 CFSE( Molecular Probes, Inc.)를 첨가하고, 세포를 빛에 노출시키지 않고 실온에서 10분간 진탕배 양하였다. 차가운 RPMI1640 배양 배지 (GIBC0)를 첨가하여 세포의 CFSE 표지를 중단 시키고, 5분간 얼음에 보관하였다. 세포를 분리하여 배양 배지로 2회 세척한 후， 재현탁하였다. CFSE로 표지된 반옹 세포와 방사능 처리된 자극 세포는 배양 배지상 에서 2X106 cells/ml의 밀도로 맞추고, 24웰 플레이트에서 총 1ml 부피에서 MSC또 는 S0D3로 형질전환된 MSC와 T 세포를 10:1의 비율로 흔합하여 37°C， 5% C02, 습도
100% 조건에서 공동배양하였다. 5일 동안 배양한 후， 세포를 수득하고 2회 세척한 후 PBS에 재현탁하였다. 반응 세포의 하위인자들은 FITC-결합 항-마우스 CD4및 PE- 결합 항-마우스 CD8(BD Biosciences Pharmingen)을 사용하여 정량하였다. T세포 분화 분석
미감작 (naive) CD4+ T 세포는 MACS 컬럼 (Miltenyi Biotech)을 이용하여 C57BL/6 마우스의 림프절과 비장으로부터 음성 선^ (negative selection)에 의해 분리하였다. 분리된 세포는 플레이트에 부착한 CD3 항체와 10% FBS, 2mM 글루타민， 1% 페니실린 -스트랩토마이신을 포함하는 RPMI1640 배지에 첨가한 CD28 항체 (2μ g/ml) 항체를 이용하여 활성화하였다. Thl 분화 조건 (Thl polarizing conditions; 10 μ g/ml anti-IL4 Ab, lOng/ml IL-12), Th2 분화 조건 (Th2 polarizing conditions; 10 μ g/ml anti-IFN-γ Ab, lOng/ml IL-4) , Thl7 분화 조건 (Thl7 polarizing condition; 20ng/ml IL— 6, 5ng/ml TGF—β , 10 μ g/ml IFN- γ 항체， 10 μ g/ml IL-4 항체) 또는 Treg 분화. 조건 (Treg polarizing condition; 5ng/ml TGF-β 및 lOng/ml IL-2)에서 세포를 극성화시킨 후， MSC 또는 S0D3-형질도입 MSC와 10:1 의 비율로 4일 동안 공동배양하였다. CD4+ T 세포의 분화를 위한 사이토카인과 항 체는 BD Bioscience에서 구입하였다. 배양 4일 후 세포를 수득하여 Thl, Th2, Thl7 또는 Treg 세포 분화에 특이적인 분자 또는 사이토카인을 이용한 mRNA 발현 양상을 분석하였다. 실험 동물과 질환 모델
실험에 사용한 마우스는 8주차의 C57BL/6 마우스 (mouse)로， 특정 병원균이 없는 상태에서 표준 마우스 사료와 물로 사육하였으며， 보건복지부의 지침에 따른 가를릭 대학교 가를릭 윤리위원회의 규정에 따라 다루었다.
마우스의 피부에 만성 급진성 염증을 유발하기 위하여 마우스의 등의 털을 면도하여 제거하고， 12일 동안 1일 1회 62.5mg의 시판 이미퀴모드 (imiquimod, IMQ) 크림 (5%， Aldara 3M pharmaceuticals)을 면도한 마우스의 피부에 도포하였다.
아토피 유사 피부 염증을 유발하기 위하여 SPF 조건에서 키운 마우스에 0VA 단백질 10ug과 항원보강제인 aluminum hydroxide 4mg을 흔합하여 실험 시작 (D0), 7일 (D7), 14일 (D14)에 복강 내로 주입하여 동물을 감작시켰다. 실험 시작 21일 째 부터 0VA 100 을 100 μ ΐ의 PBS에 녹여 lxlcm2크기의 거즈에 적셔 패치를 만들고， 제모한 마우스의 등에 붙여 7일 동안 면역반웅을 유도하였다. 35일부터 일주일간 다시 동일한 방법으로 0VA 패치로 면역 반웅을 유도하였다. 실험 시작 후 42일에 MSC, LacZ-MSC, 그리고 S0D3-MSC를 병변 부위에 주사하고， 49일째에 피부의 변화를 육안으로 관찰하였다. MSC의 마우스 피하주사
IMQ와 ovalbumin을 이용한동물 실험에서 MSC의 피하주사는 각실험 조건에 맞는 MSC를 2X 106의 세포수로 마우스 피하에 주사하였으며 , MSC 피하 주사에 대한 대조군으로는 MSC대신 동일 부피의 인산염 완층 식염수 (PBS)를 피하주사하였다. 마우스 피부 cAMP농도분석
IMQ 도포 6일 및 12일째의 마우스로부터 등 피부 세포와 혈장을 수득하여 cAMP 농도를 측정하였다. cAMP 농도 분석에는 cAMP EL ISA kit (BD i隱 unocytometry) 를사용하였다. 마우스 모델의 조직학적 평가와 형광조직엮색
IMQ 도포 6일 및 12일 째의 마우스로부터 등 피부 세포를 수득하고, 4% 파라 포름알데하이드 (PFA)에 고정한 후， 파라핀에 내장하였다. 피부 샘플은 회전식 마이 크로톰 (Leica)을 이용하여 4 μ πι 두께의 조직 절편을 준비하였다. 이후 크실렌 (xylene)을 이용하여 탈지하고， 농도구배 알코을로 탈수하였다. 상기 전처리한 조 직 절편은 헤마록실린과 에오신 (H&E 염색)으로 염색하였다. 형광조직염색 실험은 조직 절편을 CD4, CD8, CDllc , Gr-1 등에 대한 1차 항체로 반웅시킨 후, 적절한 Alexa f luor 488, Alexa f luor 647 등의 형광표지된 2차 항체로 반응시켜 실시하였 다. 마우스 비장세포 유세포분석 (f low cytometry analysis)
각 실험군의 마우스로부터 전체 비장세포를 수득하여 MACS 버퍼 (0.5% BSA가 포함된 PBS)에 재현탁하고， FITC-결합 항마우스 CD4 항체， PE-결합 항마우스 CD8 항체， APC-결합 항마우스 Grl 항체 및 PE—결합 항마우스 CDllc 항체로 반응시켰다. 항체 반웅 30분 후에 MACS 버퍼로 세척하고， 원심분리를 하고, FACS 분석을 수행하 기 위해 MACS버퍼 500 μ Γ로 재현탁하였다. 마우스 피부 유전자 발현 분석을 위하 역저사 중합효소연쇄반응 (RT-PCR)과 실시간 정량중합효소연쇄반옹 (real-t ime quant i tat ive PCR)
RNA는 TRIzol 시약 ( Invitrogen)을 이용하여 마우스의 등 피부로부터 수득하 였다. cDNA는 l y g의 총 RNA로부터 역전사 시스템 (Qiagen)을 이용하여 합성하였다. IL-1 a (QT00113505)， IL-1 β (QT00021385) , IL-4(QT00160678)， IL-6(QT00182896)， IL-10(QT00106169), IL-17(QT00103278) , IL-20(QT00126735) , IL-22(QT00128324) , IL-23(QT01663613)， IFNy (QT00000525)， TNF- a (QT01079561) , TGF-β (QT00025718) , CXCL-KQT00199752), CCL20(QT00261898) 및 GAPDH(QT02448075)의 프라이머 세트는 Qiagen사에서 구입하였다 (상기 괄호 안의 일련변호는 Qiagen 카탈로그 번호). Foxp3, T-bet , GATA3, RORyt, S0D3의 발현량을 확인하기 위한 프라이머 서열은 다음과 같다: Foxp3 forward GCAACAGCACTGGMCCTTC (서열번호 5)， Foxp3 reverse GCATTGCTTGAGGCTGCGTA (서열번호 6); T-bet forward AGCCAGCCAAACAGAGAAGA (서열번호 7), T-bet reverse MTGTGCACCC TCAAACCC (서열번호 8); GATA3 forward ACATGTCATCCCTGAGCCAC (서열번호 9)， GATA3 reverse A( MCTCTTCGCACACTTG (서열번호 10)； RORyt forward GCCTACAAT GCCACCACC (서열번호 11)， RORyt reverse ATT GAT GAG AAC CAG GGC (서열번호 12); S0D3 forward TGTTGGAGCAGAGGAGAAGCTCAAC (서열번호 13)； S0D3 reverse AAGCTCTCTTGGAGCAGCTGGAAA (서열번호 14). GAPDH mRNA를 내인성 대조군 (endogenous control)으로 하였다. PCR은 Rotor— Gene 6000 ( Co r be U)과 Quant i Tec t SYBR Green PCR Kit(Qiagen)를 이용하여 실시하였다. 증폭 프로그램은 1 cycle의 95°C에서 10분, 35 cycle의 95 °C 20초, 55 °C 20초， 72 °C 20초로 구성하 였다. 마우스 피부 단백짐 발현 분석을 위하 웨스턴 불랏
단백질 샘플은 마우스의 등 피부로부터 수득하였다. 동일한 양의 단백질을 각 레인에 로딩하여 전기영동하고 멤브레인에 단백질을 블로팅하고， 표적 단백질은 표적 단백질 특이적인 1차 항체로 반웅하시키고 화학발광 시스템 (GE health care Life Science)으로 감지하였다. 통계분석
데이터는 평균士표준편차 (means士 SD)로 표시하였고, 통계적 유의성은 독립된 그룹에 대한 student i-test 또는 AN0VA로 판단하였다. 통계적으로 유의한 차이는 본 명세서 도면에서 *， $, # 등으로 표시하였다. 별도로 기재하지 않은 경우 모든 실험은 3회 반복하였다.
<실시예 1>
S0D3를 과발현하는 증간엽 줄기세포 (MSC)의 제작과 효능 검증 <1-1> S0D3로 형질전환된 MSC의 S0D3 과발현 확인
인간의 S0D3 유전자로 형질전환된 중간엽 줄기세포 (mesenchymal stem cel l , MSC)의 S0f)3 단백질 발현 양상과 S0D3 효소 활성을 알아보았다.
MSC는 전기천공법을 이용하여 인간의 S0D3 유전자로 형질전환하고， 24시간 후 수득하여 RT-PCR과 웨스턴 블랏을 실시하여 단백질 발현량을 확인하였다. S0D3 효소 활성은 24시간 배양한 세포 배양액에 존재하는 슈퍼옥사이드 라디칼의 양을 측정하여 확인하였다. 도 1에서 나타나듯이， S0D3로 형질전환한 MSCXS0D3-MSC)에서는 형질전환하지 않은 MSC(MSC)와 비교하여 S0D3의 mRNA (도 1의 A)와 S0D3 단백질 (도 1의 B)을 과발 현하는 것을 알 수 있었다. 또한 S0D3의 활성에 있어서도， S0D3-MSC는 MSC에 비하 여 현저하게 높은 S0D3 활성을 나타내었다 (도 1의 C) . S0D3로 형질전환된 MSC는 S0D3를 과발현하며， 높은 S0D3 효소 활성을 갖는 것을 확인하였다.
<1-2> S0D3로 형질전환된 MSC의 활성산소종 생성량 감소
S0D3로 형질전환된 MSC에서 TNF- a /IFN- γ 자극으로 인해 생성되는 활성산소 종 (R0S)의 양을 알아보았다.
MSC는 전기천공법올 이용하여 인간 S0D3 유전자로 형질전환하였으며， TNF- a ( 10ng/ml )와 IFN- γ ( 100U/ml )로 1시간 동안 자극하고， 생성되는 R0S는 H2DCF-DA로 형광염색하고 형광광도계를 이용하여 측정하였다. 도 2에서 나타나듯이 , 형질전환하지 않은 MSC에서는 TNF- a /IFN- γ 자극으로 인해 R0S가 다량 발생하여 강한 형광을 나타냈으나， S0D3-MSC에서는 TNF- a /IFN- γ 로 자극한 뒤에도 PBS를 처리한 대조군 (control )과 크게 달라지지 않았으며, 오히 려 형광이 감소하는 경향을 보였다. 즉， S0D3-MSC는 형질전환하지 않은 MSC에 비하 여 활성산소종 생성능이 크게 억제되어 있는 것을 확인하였다.
<1-3> S0D3의 형질전환이 MSC의 세포 증식에 미치는 영향
S0D3 형질전환이 MSC의 세포 증식에 미치는 영향을 ΜΊΤ 어세이를 이용하여 알아보았다. 도 3에서 나타나듯이, 형질전환하지 않은 MSC와 비교하여 S0D3-MSC는 형질전 환 24시간 후 72시간까지 세포 증식이 향상되었으며 (도 3의 A) , 세포의 수도 현저 하게 증가한 것으로 나타났다 (도 3의 B) . 이상의 결과는 S0D3로 인한 형질전환이 MSC의 세포 증식을 촉진하는 것을 보여준다. S0D3로 형질전환된 MSC의 세포 증식 활성이 증가한 것은 향후 염증성 질환의 세포 치료제 등으로 개발될 경우 치료 효 율이 더욱 높아질 수 있을 가능성을 보여준다.
<1-4> S0D3로 형질전환된 MSC의 염증 관련 사이토카인의 발현 억제 효과 S0D3로 형질전환된 MSC가 염증 반웅의 증요 매개체인 사이토카인의 발현량에 미치는 영향을 알아보았다.
전기천공법으로 형질전환된 S0D3— MSC 또는 MSC를 인간의 각질형성세포
(kerat inocyte)인 HaCaT 세포주와 공동배양하면서 TNF- α와 IFN- γ로 12시간 동안 자극한 후， HaCaT 세포를 수득하여 HaCaT 세포가 발현하는 다양한 염증성 사이토카 인의 수준을 qRT-PCT로 측정하였다. 도 4에서 나타나듯이, MSC와 공동배양한 HaCaT 세포 (MSC)에서는 TNF- α와 IFN- γ의 자극에 의해 IL-l a , IL-Ιβ , TNF- a 그리고 CCL— 20의 사이토카인의 mRNA 발현 수준이 크게 증가하였으나, S0D3를 과발현하는 S0D3로 형질전환된 MSC와 공동 배양한 HaCaT(S0D3-MSC)에서는 상기 사이토카인의 발현량이 효과적으로 억제되는 것을 확인하였다. CXCL-1의 경우， 형질전환하지 않은 MSC와 공동배양한 HaCaT(MSC) 에서는 TNF- α와 IFN- Y의 자극으로 인해 발현량이 거의 변하지 않았으나 S0D3-MSC 와 공동배양한 HaCaT(S0D3-MSC)에서의 발현량은 더욱 감소하였다. 한편 항염증 사 이토카인이며 Treg의 표지자인 TGF-β의 경우에는 TNF- α와 IFN- γ로 자극하지 않 은 상태에서 S0D3-MSC로 공동배양한 HaCaT(S0D3-MSC)가 MSC와 공동배양한 HaCaT(MSC) 보다 높은 발현 수준을 나타내었으며 , TNF- α와 IFN- γ 처리에 의해 그 증가폭이 더욱 커지는 것을 관찰하였다. 이상의 결과는 S0D3를 과발현하고 분비하는 MSC는 그렇지 않은 MSC와 비교하 여 공동배양한 인접 HaCaT 세포에서 TNF- α와 IFN- γ로 유발되는 염증성 사이토카 인의 발현은 더욱 효과적으로 억제하고, 항염증성 사이토카인의 발현은 크게 향상 시킴으로써 염증 반응을 다각적이고 효과적으로 조절할 수 있음을 보여준다. <l-5> S0D3로 형질전환된 MSC의 면역억제 관련 분자 발현 분석
S0D3로 형질전환된 MSC에서 발현되는 면역억제 관련 물질의 발현 양상을 분 석하였다.
MSC를 배양하여 AdLacZ 또는 AdS0D3 아데노바이러스로 형질도입하고， TNF- a(10ng/ml)와 IFN- γ (100U/ml )로 자극하거나, 자극하지 않은 상태에서 RT-PCR을 이용하여 세포내 IL-lRa( intracellular IL-lRa, icIL-IRa), 수용성 IL_lRa(sIL- lRa), unspliced IL-lRa, HO-1, IDO-1, TGF-β , galectin-1 그리고 IL-10의 세포 내 mRNA 발현 수준을 측정하였다 (도 5의 A 내지 C). icIL-IRa의 상대적인 발현 수 준은 real-time PCR로 분석하였으며 (도 5의 B), GAPDH를 대조군 (control)으로 이용 하였다. 또한 MSC를 배양한 상등액 (supernatant)을 수득하여 PGE2 ELISA kit(Enzo Life Sciences, NY, USA)를 이용하여 PGE2농도를 측정하였다. 도 5의 A 내지 C에서 나타나듯이， S0D3를 과발현하도록 형질전환된 MSCXS0D3-MSC)에서는 형질전환되지 않은 MSC(MSC) 또는 대조군으로 LacZ로 형질전 환된 MSC(LacZ-MSC)와 비교하여 , icIL— IRa, TGF-β , IL-10, HO-1 그리고 ID으 1과 같은 다양한 면역억제 기능을 갖는 유전자의 발현 수준이 크게 증가한 것으로 나타 났다. 홍미롭게도, TNF-α와 IFN- Y로 자극된 MSC에서는 ID0-1과 IL-10의 발현이 증가하였는데， S0D3-MSC에서는 이들 유전자의 발현이 더욱 증가하였다. 반면, S0D3 의 과발현이 MSC의 PGE2의 분비량 (도 5의 D)이나 galactin-1의 발현 수준에는 큰 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다.
IL-lRa를 투여받은 장기이식환자들에서 장기로 침윤한 백혈구 (graft- infiltrating leukocyte)의 수가 급격히 감소한 것으로 보고된 바 있다 (Shiraishi M et al. , J Surg Res. , 58(5)： 465—470， 1995) . 따라서 , S0D3를 과발현하는 MSC에 서는 IL-lRa의 발현이 크게 증가하므로， 이를 통하여 보다 효과적으로 장기이식환 자에서 염증 반웅과 이식 거부를 억제할 수 있음을 예상할 수 있다. 한편， TGF-β와 H0-1은 in vitro 및 in r/>o에서 IL-10의 생산과 면역억제 Treg 세포의 생성을 촉진하는 한편， 전염증성 사이토카인은 억제하는 것으로 연관 되어 왔다. H0-1은 p-STAT3-R0RYt pathway를 억제함으로써 RORyt와 F0XP3 발현의 속도 (kinetics)를 조절하여 Thl7의 반옹을 억제하고 항염증 작용을 나타내는 것이 확인되었기 때문에 천식， 건선, 아토피 피부염 등의 새로운 치료제의 타겟이 되고 있다. 또한 인간의 MSC는 indol eamine-2, 3-di oxygenase-l( ID0-l)의 발현 유도가 가 능함이 알려져 있는데、， ID0-1은 T 세포 증식을 억제하고 면역세포에서 세포사멸 (apoptosi s)을 유발함으로써 면역 억제를 유도하여 급성 이식편대숙주병 (GVHD)와 같은 자가면역질환의 핵심적인 조절자로 받아들여져 왔다. 따라서 이상의 실시예에 서 확인한 바와 같이， MSC에서 S0D3를 과발현함으로써 H0-1이나 ID0-1과 같은 tryptophan의 이화작용 경로의 활성화를 유도하는 것이 다수의 자가면역질환의 강 력한 치료제 타겟이 될 수 있음을 제시한다.
<1-6> S0D3로 형질전환된 MSC가 T세포의 증식에 미치는 영향
S0D3로 형질전환된 MSC가 T 세포의 분화 및 증식 억제에 미치는 영향을 알아 보았다.
서로 다른 종의 마우스 (C67BL/6와 BalB/C)에서 분리한 T 세포를 실험 조건에 따라 MSC를 넣지 않거나, 아무 처리하지 않은 MSC, LacZ-형질도입된 MSC, S0D3-형 질도입된 MSC와 공동배양하면서 CFSE 기반-흔합림프구반응 (CFSE based-mixed lymphocyte react ion, MLR) 실험을 실시하고, CD4+ 또는 CD8+ 세포에 대하여 유세 포분석하고 (도 6)， 유세포분석 결과를 정량 분석하였다 (도 7) . 도 7에서 나타나듯이， MSC와 공동배양하지 않은 경우 (No MSCs)와 비교하여 아무 처리하지 않은 MSC(MSC) 또는 LacZ-형질도입 MSC(LACZ-MSC)와 공동배양한 경 우에는 CD4+ T 세포와 CD8+ T 세포의 증식이 억제되었으며, S0D3-형질도입 MSC(S0D3-MSC>와 공동배양한 경우에는 T 세포 증식이 더욱 억제되었다. 한편 S0D3- MSC에 S0D3 억제제인 DETCA를 같이 처리한 경우에는 (S0D3-MSC + DETCA) , T 세포 증 식 억제 효과는 아무 처리하지 않은 MSC(MSC)와 비슷한 수준을 보였다. 즉 S0D3-형 질도입 MSC의 T 세포 증식 억제 효과는 과발현된 S0D3의 효소 활성에 의하여 형질 도입되지 않은 MSC보다 증진된 것임을 알 수 있다.
<1-7> S0D3로 형질전환된 MSC가 T 세포의 분화에 미치는 영향
S0D3-형질도입 MSC가 T세포의 분화에 미치는 영향을 알아보았다.
미감작 (naive) T 세포들을 Thl , Th2 , Thl7 또는 Treg 세포 각각의 분화 조건 에서 실험 조건에 따라 아무 처리하지 않은 MSC(MSC) , LacZ-MSC 또는 S0D3-MSC와 공동배양 (cocul ture)하고， 분화유도된 T 세포들이 발현하는 분화 관련 주요 전사인 자의 발현 수준을 real-t ime qRT-PCR로 측정하였다. 도 8에서 나타나듯이, Thl , Th2 , Thl7 분화 조건에서 배양한 T 세포들의 계 통특이적인 전사인자와 사이토카인인 IFN Y , T-bet , IL— 4 , GATA3 , IL-17 , ROR y t , CCL20의 발현 양상을 mRNA를 측정하여 확인한 결과， MSC와 공동배양하지 않은 대조 군 (도 7에서 (+) )과 비교하여, 아무 처리하지 않은 MSC(MSC) 또는 LacZ-MSC(LACZ- MSC)와 공동배양한 T 세포들에서는 상기 유전자들의 발현이 감소하였으며， S0D3- MSC와 공동배양한 세포에서는 상기 전사인자와 사이토카인의 발현이 더욱 현저하게 감소한 것을 확인하였다. S0D3-MSC에 의한 유전자 발현 억제 효과는 Thl7 세포 특 이적인 유전자인 IL-17 , ROR y t , CCL-20에서 더욱 강하게 나타났다. 한편 S0D3-MSC 의 공동배양에 S0D3 효소 억제제인 DETCA를 추가한 경우 (S0D3-MSC + DETCA)에는 S0D3-MSC의 상기 유전자 발현 억제 효과가 MSC 또는 LacZ-MSC와 유사한 것으로 나 타났으며 , 이는 S0D3-MSC에 의한 유전자 발현 억제 상승 효과는 S0D3의 효소 활성 에 의한 것임을 보여준다. 도 9에서 나타나듯이， Treg 분화조건에서 배양한 T 세포들의 계통특이적인 전사인자와 사이토카인인 Foxp3 , TGF-β , IL-10의 발현 양상을 mRNA를 측정하여 확 인한 결과， MSC와 공동배양하지 않은 대조군 (도 9에서 (+) )과 비교하여， 아무 처리 하지 않은 MSC 또는 LacZ-MSC와 공동배양한 T 세포들에서는 상기 유전자들의 발현 이 증가하였으며， S0D3-MSC와 공동배양한 세포에서는 상기 전사인자와 사이토카인 의 발현이 더욱 현저하게 증가한 것을 확인하였다. 특히 S0D3-MSC에 의한 F0XP3의 발현 증가 효과는 유세포분석으로 세포 수준에서 확인할 수 있었다 (도 9 하단) . 한 편 S0D3-MSC의 공동배양에 S0D3 효소 억제제인 DETCA를 추가한 경우 (S0D3-MSC + DETCA)에는 S0D3-MSC의 상기 유전자 발현 억제 효과가 MSC 또는 LacZ-MSC와 유사한 것으로 나타났으며， 이는 S0D3-MSC에 의한 Treg 관련 유전자 발현 증가의 상승 효 과는 S0D3의 효소 활성에 의한 것임을 보여준다. 이는 S0D3 형질도입으로 인해 원래 MSC의 T 세포 분화 조절 효과가 현저하게 증가함을 보여주며， 특히 염증성 질환에서 병인 세포로 작용하는 Thl7 세포의 분화 는 낮추고, 염증을 조절하는 효과를 가진 Treg 세포의 분화를 유도하여 더욱 효과 적으로 염증을 억제할 수 있는 가능성을 제시한다.
<실시예 2> 이미뒤모드로 유발된 만성 급진성 피부 염증 생체 모델
<2-1> S0D3로 형질전환된 MSC의 피부 염증 증상 억제 효과
<실시예 1>에서 관찰된， S0D3를 과발현하는 MSC의 T 세포의 증식과 분화에 대한 조절 효과를 바탕으로， S0D3로 형질전환된 MSC가 체내에서 염증을 조절하는 효과가 있는지 알아보았다.
선천면역체계 ( innate i睡 une system)의 신호전달을 활성화시켜 건선과 유사 한 급진성 피부 염증을 유발하는 것으로 알려진 이미퀴모드 ( imiquitnod, IMQ)를 면 도한마우스의 등 피부에 매일 도포하여 피부 염증 반웅을 유발하였다. 도 10의 실 험 개요에 따라 IMQ 도포 전에 각 실험군의 마우스 (군당 마우스 5마리)에 처리 조 건에 따라 아무 처리하지 않은 MSC, LacZ-형질도입된 MSC, S0D3-형질도입된 MSC를
2xl06씩 피하주사하고, 면도한 마우스의 등에 IMQ를 12일간 지속적으로 도포한 뒤 피부에 일어나는 염증 반웅을 비교 관찰하였다. 피부 염증 증상을 정량적으로 분석 하기 위하여 마우스의 등 피부 조직올 채취하여 조직 표본을 H&E 염색하고 피부 표 피 (epidermis)의 두께를 측정하였다. 도 11에서 도시된 바와 같이， MSC를 피하주사하지 않고 IMQ를 도포한 마우스 ( IMQ)에서는 IMQ를 도포하지 않은 대조군 (Control )과 비교하여 2-3일 후부터 육안 으로 확인가능한 흥반 (erhythema) , 탈피 (scal ing) 및 피부가 두꺼워지는 등의 증상 이 염증 증상과 동반하여 나타났다. 이같은 증상은 실험 시작 6일 후에 분명하게 관찰할 수 있었으며 (Day 6)， 실험 시작 후 12일 (Day 12)까지 이러한 증상이 계속 진행되었다. 아무 처리하지 않은 MSC(MSC) 또는 LacZ-형질도입 MSC(LACZ-MSC)를 주 사한 마우스들의 경우， IMQ로 유발된 피부의 증상들이 완화되는 경향을 보였다. 한 편 S0D3-형질도입된 MSCXS0D3-MSC)를 주사한 마우스들은 MSC 또는 LACZ-MSC 주사한 마우스들과 비교하여 홍반， 탈피 등의 증상이 육안으로도 식별가능한 정도로 현저 하게 감소함올 관찰하였다. 도 12와 도 13에서 나타나듯이, 대조군과 각 실험군의 마우스의 등 피부 조 직 절편에서 측정한 피부 표피의 두께도 육안으로 관찰한 피부 염증 상태와 유사한 결과를 확인할 수 있었다. MSC 주사 없이 IMQ를 도포한 경우， 피부 표피의 두께는 대조군에 비하여 현저하게 증가하였으며, MSC 또는 LacZ-MSC로 주사한 경우， IMQ로 인한 피부 표피 두께의 증가가 감소하였다. 한편 S0D3-MSC를 주사한 마우스에서는 IMQ 도포 후 표피의 두께가 거의 증가하지 않아 IMQ를 도포하지 않은 대조군과 비 슷한 수준이었으며 , MSC 또는 LACZ-S0D3 주사한 마우스와 비교하여서도 표피 두께 가 현저하게 얇은 것을 확인할 수 있었다.
이상의 결과는 S0D3를 이용한 형질전환으로 S0D3를 과발현하는 MSC가 피부 염증을 완화하는데 있어 일반 MSC에 비해 월등한 효과가 있음을 보여준다.
<2-2> S0D3로 형질전환된 MSC의 호중구 및 수지상세포의 침윤 억제 효과
IMQ로 피부 염증이 유발된 마우스의 비장과 피부의 면역 세포의 구성과 모집 현상 (recruitment)을 알아보았다.
실험 조건에 따라 각각의 MSC를 주사한 마우스의 비장을 구성하는 CD4+ T세 포， CD8+ T 세포， 호중구 (neutrophil, Grl+ cell), 수지상세포 (dendritic cell, CDllc+ cell)를 유세포분석으로 조사하고 (도 14), IMQ 도포한 등 피부의 조직 절편 을 다른 종류의 면역세포의 표지자에 대하여 염색하고 세포 수를 측정하였다 (도 15-16). 도 14에서 나타나듯이， IMQ 처리한 마우스의 비장에서는 IMQ 처리하지 않은 대조군 마우스와 비교하여 CD4+T 세포와 CD8+T 세포가 감소하였으며， MSC를 주사 한 마우스들에서는 CD4+ T 세포와 CD8+ T 세포가 다소 증가하는 것으로 나타났다. 이에 반하여 비장의 호중구 (Grl+ cell)와 수지상세포 (CDllc+ cell)는 IMQ 처리로 인해 비장에서 수가 증가하였으며， S0D3-MSC 처리로 인해 호중구와 수지상세포의 수는 감소하였다.
도 15와 도 16에서 나타나듯이， 피부에서는 IMQ 처리에 의해 CD3+T 세포 ，
CD8+T세포 (데이터 미도시)， 호중구 (Grl+) 그리고 수지상세포 (CDllc+)가모두 현저 히 증가하였으며, MSC 또는 LacZ-MSC 처리한 마우스에서는 IMQ로 유발되는 피부의 면역 세포 침윤 현상이 감소하였다. S0D3-MSC를 처리한 마우스에서는 다른 MSC 처 리한 경우보다 침윤 현상이 더욱 억제되어, 피부 조직에 존재하는 T 세포， 호중구， 수지상세포가모두 현저하게 감소한 것으로 관찰되었다.
<2-3> S0D3로 형질전환된 MSC의 염증 반웅 매개체의 발현 억제 효과 IMQ로 피부 염증이 유발된 마우스의 등 피부의 사이토카인 발현 양상을 qRT- PCR로 측정하였다. 도 17에서 나타나듯이， IMQ 도포로 인해 다양한 염증성 사이토카인의 mRNA 수준이 크게 증가하였으며， MSC 또는 LacZ— MSC 주사한 마우스에서는 이들 사이토카 인의 발현양이 다소 감소하는 경향이 있었다. S0D3-MSC를 주사한 마우스에서는 이 들 염증성 사이토카인 발현 억제 효과가 다른 MSC과 비교하여 가장 큰 것으로 나타 났다. 구체적으로는 Thl7 세포가 발현하는 IL-17 , IL-22 , 그리고 주요 염증성 매개 체 사이토카인인 IL-23 , IL-Ι β , IL-6 , TNF- α등의 발현양이 S0D3-MSC에 의해 현저 하게 감소함을 확인하였다. 한편 항염증 사이토카인 (ant i -inf l ammatory cytokine)이며 Treg의 염증 조절 과 관련된 IL-10의 경우， 다른 염증성 사이토카인들과는 달리 MSC 처리에 의해 발 현양이 다소 증가하였으며， S0D3-MSC에서는 IL-10 증가 효과가 훨씬 월등한 것으로 관찰되었다. 이상의 결과는 S0D3의 도입으로 인해 MSC의 염증 조절 작용이 더욱 효과적으 로 증가되었음을 보여주며, 다양한 사이토카인의 발현과 작용을 복합적으로 조절하 여 염증성 질환의 증상을 완화할 수 있음을 시사한다.
<2-4> S0D3로 형질전환된 MSC가 염증 관련 신호전달에 미치는 영향
IMQ는 TLR-7 및 /또는 TLR-8를 활성화시키고， 하위의 NFkB 신호전달체계를 통 해 생물학적 효과를 나타내는 것이 알려져 있다. 이에 S0D3를 과발현하거나 그렇지 않은 MSC를 비롯한 MSC의 처리가 TLR-7/TRL-8에 의한 신호전달에 미치는 영향을 IMQ도포한 피부를 이용하여 웨스턴 블랏 실험으로 알아보았다. 도 18에서 나타나듯이， IMQ 도포한 마우스 등 피부에서는 TLR-7과 인산화된 NFkB(p-NFkB)가 활성화되고 발현 수준도 증가한 것을 확인하였다 (도 18의 A) . IMQ 로 활성화된 TLR-7의 신호전달은 MSC 또는 LacZ-MSC의 처리에 의해 감소하는 경향 올 보였으며， S0D3-MSC에 의해서는 더욱 현저하게 감소하였다. STAT1/3 그리고 JAK1에 대하여서도 유사한 결과를 관찰하였으나， S0D3-MSC는 특히 NF-kB의 신호전 달계에 대하여 중점적으로 현저히 억제 효과를 보이는 것으로 나타났다. <2-5> 혈장과 세포에서의 cAMP 농도 증가
염증은 체내 유입된 항원이 T보조세포를 자극하여 T보조세포가 증식하면서 염증 유발 물질을 분비하면서 유발된다. T 보조세포의 증식은 세포 분열을 관장하 는 두 가지 물질인 cAMP와 cGMP의 비율이 변하면서 일어나는데， cGMP가 높아지면 세포분열이 빨라지고, cAMP가 높아지면 세포분열이 느려지게 된다. 이러한 비율의 균형이 깨지면 염증성 질환에 걸릴 확률이 높아지는데， 예를 들어， 건선 환자에서 는 세포 또는 혈장 내에 cGMP의 농도가 높은 경우가 많다. 이에 실험 조건에 따라 각각의 MSC를 처리한 마우스의 혈장에서의 cAMP의 농도를 엘라이자를 이용하여 측 정하였다. 도 19에서 나타나듯이， MSC 또는 LacZ-MSC를 주사한 마우스의 혈장의 cAMP의 수준은 대조군과 비교하여 cAMP 수준이 증가하였으며， 특히 S0D3-MSC 주사한 마우 스 혈장의 cAMP 수준이 가장 높은 것으로 측정되었다. IMQ 도포 6일째 이러한 경향 이 더욱 분명하게 나타났다. 이러한 결과는 S0D3-MSC가 세포적 스트레스로부터 보 호 기능을 한다는 것을 의미한다.
<실시예 3>
난백 앞부민으로 유발되는 아토피 유사 피부염 생체 모델
S0D3를 과발현하는 MSC의 생체 vivo) 내 염증 조절 효과를 다른 동물 모 델을 이용하여 확인하였다. 난백 단백질 (ovalbumin, OVA)을 항원으로 Balb/C 마우 스에서 아토피 유사 피부염을 유발하고， MSC에 의한 염증 억제 효과를 비교 관찰하 였다. 도 20의 실험 개요에 따라 SPF 조건에서 키운 마우스에 OVA 단백질과 항원보 강제인 aluminum hydroxide를 흔합하여 실험 시작 (DO) , 7일 (D7) , 14일 (D14)에 복강 내로 주입하여 동물을 감작시켰다. 실험 시작 21일 째부터 OVA lOO y g을 ΙΟΟ μ Ι의
PBS에 녹여 lxlcm2 크기의 거즈에 적셔 패치를 만들고， 제모한 마우스의 등에 붙여
7일 동안 면역반웅을 유도하였다. 35일부터 일주일간 다시 동일한 방법으로 OVA 패 치로 면역 반응을 유도하였다. 실험 시작 후 42일에 실험 조건에 따라 MSC, LacZ- MSC, 또는 MSC-S0D3를 병변 부위에 주사하고 (군당 마우스 5마리) , 49일째에 피부의 변화를 육안으로 관찰하였다. 도 21에서 나타나듯이, MSC를 주입하지 않고 OVA 처리만 한 마우스 (OVA)의 등 피부는 대조군 Control )에 비교하여 피부가 거칠고， 각질화가 진행되며， 붉게 부 풀어오르는 둥 피부 염증이 진행되고 있는 것을 확인할 수 있었다. 아무 처리하지 않은 MSC를 주입한 마우스 (OVA + MSC) 또는 LacZ-MSC를 주입한 마우스 (OVA + LACZ- MSC)에서는 OVA만 처리한 마우스에 비하여 피부 염증이 어느 정도 개선되는 효과를 나타내었다. S0D3-MSC를 주입한 마우스 (OVA + S0D3-MSC)에서는 피부의 각질과 염증 반웅이 거의 사라지는 등， 피부의 상태가 대조군과 유사한 상태로 개선되었으며， 특히 다른 MSC를 주입한 마우스와 비교하여 확연한 염증 개선 효과를 확인할 수 있 었다. 이상의 결과는 S0D3를 과발현하는 MSC가 피부 염증을 완화시키는데 일반 MSC 에 비하여 뛰어난 효과가 있음을 보여준다.
[산업상 이용가능성 ]
S0D3를 과발현하는 중간엽 줄기세포는 일반 중간엽 줄기세포에 비해 더욱 강 한 항산화 활성, 면역조절기능 및 세포성 면역조절기능을 가지고 있다. S0D3를 과 발현하는 중간엽 줄기세포는 염증성 질환이나 자가면역질환， 장기이식 거부반웅에 대하여 보다 효과적인 줄기세포 치료제를 개발하는데 유용하게 이용될 수 있다.

Claims

【청구의 범위】
【청구항 1】
S0D3(extracel lular superoxide di smutase)를 과발현하는 줄기세포를 유효성 분으로 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
【청구항 2】
계 1항에 있어서， 상기 줄기세포는 중간엽 줄기세포인 것을 특징으로 하는 조 성물.
【청구항 3】
제 2항에 있어서， 상기 중간엽 줄기세포는 제대， 제대혈, 태반， 골수, 지방조 직, 근육， 양수 및 양막으로 이루어진 군으로부터 선택된 조직에서 유래한 것을 특 징으로 하는 조성물.
【청구항 4】
제 1항에 있어서, 상기 염증성 질환은 Th2 또는 Thl7 매개성 질환인 것을 특 징으로 하는 조성물.
【청구항 5】
제 4항에 있어서， 상기 Th2 또는 Thl7 매개성 질환은 장기이식 거부반응， 자 가면역 질환， 염증성 장질환， 염증성 안질환, 염증성 피부질환 및 알레르기성 질환 으로 이루어진 군에서 선택된 것을 특징으로 하는 조성물.
【청구항 6】
제 1항에 있어서， 상기 염증성 질환은 급성 또는 만성 장기이식 거부반응， 이 식편대숙주병， 염증성 장 질환， 크론병， 궤양성 대장염, 염증성 피부 질환， 다발성 경화증， 췌장염， 외상 유발 쇼크， 기관지 천식， 알러지성 비염， 알러지성 결막염， 낭포성 섬유증， 급성 기관지염, 만성 기관지염, 급성 세기관지염， 만성 세기관지 염， 골관절염， 통풍， 척추관절병증， 강직성 척추염, 라이터 증후군, 건선성 관절병 증, 장질환 척추염， 연소자성 관절병증， 연소자성 강직성 척추염， 반웅성 관절병 증， 감염성 관절염, 후-감염성 관절염， 루게릭병, 결절성 다발동맥염， 과민성 혈관 염, 루게릭 육아종증， 류마티스성 다발성 근육통 관절세포 동맥염, 칼슘 결정침착 관절병증， 가성 통풍， 비 -관절 류마티즘， 점액낭염， 건초염 , 상과염 , 신경병증성 관절질환 (neuropathic joint disease 또는 Charcot joint) , 줄혈성 관절증 (hemarthrosis), 알레르기 자반병， 비후성 골관절병증 다중심성 세망조직구종, 척 추측만증 (scoliosis), 혈색소증， 혈색소병증， 고지단백혈증, 저감마글로불린혈증, 가족성 지중해열 (familial Mediterranean fever), 베체트씨병, 전신성 홍반성 루푸 스， 재귀열， 다발성 경화증， 패혈증, 패혈성 쇼크， 급성 호흡곤란 증후군, 다발성 장기부전, 만성 폐쇄성 폐질환 (chronic obstructive pulmonary disease), 류마티스 성 관절염 (rheumatoid arthritis) , 급성 폐손상 (acute lung injury) , 기관지 폐 형 성장애 (broncho-pulmonary dysplasia), 제 1형 당뇨병， 제 2형 당뇨병， 동맥경화, 알 츠하이머성 치매， 가족성 한탱자가염증 증훈군 (familial cold autoinf lammatory syndrome), 머클 -웰스 증후군 (Muck le— Wei Is syndrome), 신생아발병 다발성 염증성 질환 (neonatal multisystem inflammatory disease) , 만성 유아 신경피부관절증후군 (chronic infantile neurologic cutaneous articular syndrome) , 성인발증형 스틸 병 (adult— onset Still's disease), 접촉성 피부염, 포상기태 (hydatidiform mole), PAPA 증早군 (syndrome of pyogenic arthritis, pyoderma gangrenosum and acne) , 고면역글로불린 D 증후군 (hyper immunoglobulin d syndrome), 크리오피된 관련 주기 적 증후군 (cryopyr in—associated periodic syndrome) , 각막염， 결막염， 망막염, 망 막혈관염， 포도막염, 안검염, 알레르기 결막염， 건성 안 (dry eye), 전신성 경피증 (progressive systemic sclerosis) , 다발성 근염 (polymyositis), 자가면역성 뇌.척 수염, 중증 근무력증 (myasthenia gravis), 결절성 다발성 동맥염 (polyarteritis nodosa) 및 섬유조직염 (fibromyalgia syndrome)으로 이루어진 군에서 선택되는 하 나 이상의 질환인 것을 특징으로 하는 조성물.
【청구항 7】
제 6항에 있어서， 상기 염증성 피부 질환은 건선， 아토피성 피부염， 습진성 피부염， 접촉성 피부염， 지루성 피부염， 장미색 비강진， 편평 태선， 혈관염, 모공 성 홍색 비강진， 봉와직염， 모낭염, 옹종， 천포창， 수포성 (bulus) 천포창， 표피 수 포증， 담마진， 혈관 부종, 맥관염， 홍반 및 피부 호산구 증가증으로 이루어진 군에 서 선택되는 하나 이상의 질환인 것을 특징으로 하는 조성물.
【청구항 8】
제 1항에 있어서, 상기 S0D3는 서열번호 1 또는 서열번호 3으로 표시되는 아 미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
【청구항 9】
저 U항에 있어서， 상기 S0D3를 과발현하는 줄기세포는 S0D3를 암호화하는 폴 리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현 백터를 줄기세포에 형질감염시켜 수득한 것을 특징으로 하는 조성물.
【청구항 10]
제 9항에 있어서， 상기 재조합 발현 백터는 레트로바이러스 백터， 아데노바이 러스 백터， 아데노연관바이라스 (AAV) 백터， 백시니아바이러스 백터， 허피스바이러 스 백터， 렌티바이러스 백터 및 아비폭스바이러스 백터로 이루어진 군에서 선택된 것을 특징으로 하는 조성물.
【청구항 11]
계 9항에 있어서， 상기 S0D3를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2 또 는 서열번호 4로 표시되는 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
【청구항 12】
염증성 질환 치료용 제제를 제조하기 위한 S0D3를 과발현하는 줄기세포의 용
【청구항 13】
S0D3를 과발현하는 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물의 유효 량을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 것을 특징으로 하는 염증성 질환의 치료 방법 .
PCT/KR2016/010414 2015-09-15 2016-09-19 Sod3를 과발현하는 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 조성물 Ceased WO2017048097A1 (ko)

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