WO2017069158A1 - イムノグロブリン結合ポリペプチド - Google Patents

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immunoglobulin
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英司 真島
厚志 島
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PROTENOVA CO Ltd
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    • C07K2319/705—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a protein-A fusion

Definitions

  • the present invention relates to a polypeptide that binds to an immunoglobulin or a fragment thereof. More specifically, the present invention relates to a polypeptide having high binding ability to immunoglobulin chains or kappa chains and excellent stability under alkaline conditions (alkali stability). Furthermore, the present invention relates to a method for producing the polypeptide, an immobilized product of the polypeptide, a method for separating an immunoglobulin or a fragment thereof using the polypeptide, and the like.
  • immunoglobulins also referred to as antibodies
  • immunoglobulins have been put to practical use in the medical fields such as rheumatism and cancer as antibody drugs.
  • Immunoglobulins are mainly produced by animal cell culture, and affinity chromatography using a ligand having immunoglobulin binding ability is widely used for purification.
  • affinity chromatography used for immunoglobulin purification polypeptides such as protein A, protein L, and protein G, or their immunoglobulin binding domains are used as ligands that specifically bind to immunoglobulins.
  • Patent Document 1 can be provided with excellent immunoglobulin binding ability and alkali stability by substituting a specific amino acid residue in the C domain of protein A or a specific amino acid residue in the Z domain of protein A. It has been reported.
  • Patent Document 2 reports that alkali stability can be provided by substituting the asparagine residue of protein A with another amino acid.
  • Protein L is localized on the cell surface of Peptostreptococcus magnus (also known as Finegoldia magna), and is known to be able to specifically bind to the immunoglobulin kappa chain. Protein L has been reported from Peptostreptococcus magnus 312 strain (Non-patent document 1) and from Peptostreptococcus magnus 3316 strain (Non-patent document 2 and Patent document 3). Protein L derived from Peptostreptococcus magnus 3316 has four domains that bind to the kappa chain of immunoglobulin (Non-patent Document 2 and Patent Document 3), and these domains have high amino acid sequence similarity to each other.
  • Peptostreptococcus magnus also known as Finegoldia magna
  • An object of the present invention is to provide a polypeptide having a high ability to bind an immunoglobulin kappa chain and excellent in alkali stability by modifying the amino acid sequence of an immunoglobulin binding domain in protein L derived from Peptostreptococcus magnus. is there.
  • the present inventor has substituted a specific lysine residue with a basic amino acid or an amino acid having a hydroxyl group in each immunoglobulin binding domain of protein L derived from Peptostreptococcus ccmagnus 3316 strain. By doing so, it was found that a polypeptide having high binding ability to immunoglobulin kappa chain and excellent in alkali stability can be obtained.
  • the present invention has been completed by further studies based on such knowledge.
  • this invention provides the invention of the aspect hung up below.
  • Item 1 At least one immunoglobulin binding domain shown in any of the following (1-1) to (1-4), (2-1) to (2-4), and (3-1) to (3-4) A polypeptide comprising.
  • (1-1) In the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, at least two of the sites selected from the group consisting of positions 7, 13, 22, and 29 are basic other than lysine
  • An immunoglobulin binding domain comprising an amino acid sequence substituted with an amino acid or an amino acid having a hydroxyl group.
  • At least two amino acids selected from the group consisting of positions 7, 13, 22, and 29 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 are basic amino acids or hydroxyl groups other than lysine In which one or several amino acids other than the amino acid substitution site are substituted, added, inserted or deleted, and have an ability to bind to an immunoglobulin, An immunoglobulin binding domain having improved alkali stability compared to a polypeptide comprising the amino acid sequence shown in No. 1.
  • At least two amino acids selected from the group consisting of positions 7, 13, 22, and 29 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 are basic amino acids or hydroxyl groups other than lysine
  • one or several amino acids other than the amino acid substitution site are substituted, added, inserted or deleted, and have an ability to bind to an immunoglobulin
  • An immunoglobulin binding domain having improved alkali stability compared to a polypeptide comprising the amino acid sequence shown in No. 1.
  • At least two amino acids selected from the group consisting of positions 6, 12, 21, and 28 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 are basic amino acids or hydroxyl groups other than lysine In which one or several amino acids other than the amino acid substitution site are substituted, added, inserted or deleted, and have an ability to bind to an immunoglobulin, An immunoglobulin binding domain having improved alkali stability compared to a polypeptide comprising the amino acid sequence shown in No. 1.
  • amino acids selected from the group consisting of positions 7, 13, 22, and 29 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 are basic amino acids or hydroxyl groups other than lysine
  • An immunoglobulin binding domain having improved alkali stability compared to a polypeptide comprising the amino acid sequence shown in 1.
  • At least two amino acids selected from the group consisting of positions 7, 13, 22, and 29 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 are basic amino acids or hydroxyl groups other than lysine
  • At least two amino acids selected from the group consisting of positions 7, 13, 22, and 29 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 are basic amino acids or hydroxyl groups other than lysine
  • At least two amino acids selected from the group consisting of positions 6, 12, 21, and 28 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 are basic amino acids or hydroxyl groups other than lysine
  • the polypeptide according to Item 1 which is a single-domain peptide containing a single immunoglobulin binding domain.
  • Item 3. Two selected from the immunoglobulin binding domains shown in the following (1-1) to (1-4), (2-1) to (2-4), and (3-1) to (3-4) Item 2.
  • Item 4. Including at least one of the immunoglobulin binding domains of (1-1), (2-1), and (3-1), Item 7.
  • Item 10 Including at least one of the immunoglobulin binding domains of (1-3), (2-3), and (3-3), In the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3, at least two or more sites selected from the group consisting of positions 7, 13, 22, and 29 are substituted with arginine or threonine The polypeptide according to any one of 1 to 3 and 8.
  • Item 10 Including at least one of the immunoglobulin binding domains of (1-4), (2-4), and (3-4), Item 6 is any one of Items 1 to 3, wherein all of positions 6, 12, 21, and 28 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 are substituted with a basic amino acid or an amino acid having a hydroxyl group. The described polypeptide. Item 11.
  • the method for producing a polypeptide according to any one of Items 1 to 11, comprising a step of culturing the transformant according to Item 14.
  • Item 16. Item 12.
  • Item 17. Item 17.
  • the ability to bind to a fragment containing an immunoglobulin or a kappa chain thereof is high, and the ability to bind to a fragment containing an immunoglobulin or a kappa chain thereof can be maintained even when exposed to alkaline conditions. Even if elution and washing with an alkaline solution are repeated, it is possible to suppress a decrease in binding ability to a fragment containing an immunoglobulin or its kappa chain, and to reduce the production cost and increase the efficiency of the fragment containing the immunoglobulin or its kappa chain. it can.
  • FIG. 3 is a diagram schematically showing the three-dimensional structure of immunoglobulin binding domains 1 to 4 of protein L derived from Peptostreptococcus magunus 3316 strain.
  • glycine (Gly) is G
  • alanine (Ala) is A
  • valine (Val) is V
  • leucine (Leu) is L
  • isoleucine (Ile) is I
  • phenylalanine (Phe) is F
  • tyrosine (Tyr) is Y
  • Tryptophan (Trp) is W
  • serine (Ser) is S
  • threonine (Thr) is T
  • cysteine (Cys) is C
  • methionine (Met) is M
  • aspartic acid (Asp) is D
  • glutamic acid (Glu) is E
  • Asparagine (Asn) is N
  • glutamine (Gln) is Q
  • lysine (Lys) is K
  • arginine (Arg) is R
  • histidine (His) is H
  • nonpolar amino acids include alanine, valine, leucine, isoleucine, proline, methionine, phenylalanine, and tryptophan.
  • uncharged amino acid includes glycine, serine, threonine, cysteine, tyrosine, asparagine, and glutamine.
  • acidic amino acid includes aspartic acid and glutamic acid.
  • basic amino acid includes lysine, arginine, and histidine.
  • polypeptide of the present invention includes a polypeptide comprising at least one immunoglobulin binding domain shown in any of (1-1) to (1-4) below.
  • (1-1) In the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, at least two of the sites selected from the group consisting of positions 7, 13, 22, and 29 are basic other than lysine
  • An immunoglobulin binding domain comprising an amino acid sequence substituted with an amino acid or an amino acid having a hydroxyl group.
  • amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 1 to 4 are amino acid sequences of four immunoglobulin binding domains contained in protein L (amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5, DDBJ database ID number Q51918) derived from Peptostreptococcus magunus 3316 strain, respectively. .
  • amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 may be expressed as an immunoglobulin binding domain (hereinafter referred to as “immunoglobulin binding domain 4”) present in the region from position 468 to 537 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5.
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 is expressed as an immunoglobulin binding domain (hereinafter referred to as “immunoglobulin binding domain 3”) in the region of positions 394 to 463 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5.
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 is an immunoglobulin binding domain (hereinafter referred to as “immunoglobulin binding domain 2”) present in the region of positions 320 to 389 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5.
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 is SEQ ID NO: 5.
  • Immunoglobulin binding domain that is present in the region of 249 to 317 in the amino acid sequence shown corresponding to hereinafter also. Be referred to as "immunoglobulin-binding domain 1").
  • Immunoglobulin binding domains 1 to 4 have amino acid sequences that are highly conserved and highly homologous, as shown in FIG.
  • the immunoglobulin binding domains 1 to 4 have a ⁇ sheet structure (positions 9 to 17 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 1 to 3; the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4) from the N-terminal side.
  • FIG. 2 shows a three-dimensional structure formed by immunoglobulin binding domain 4 (SEQ ID NO: 1) for convenience.
  • the amino acid at the 7th position in the amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 1 to 3 and the 6th position in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 is present on the N-terminal side of ⁇ sheet 1, and the amino acid is three-dimensional Structurally, a specific amino acid present in ⁇ -helix 1 (the amino acid at position 33 in the case of the amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 1 to 3, and the amino acid at position 32 in the case of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4); Located in a place where interaction is easy.
  • amino acid at position 13 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 1 to 3 and the 12th position in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 is present in ⁇ -sheet 1, and the amino acid has a three-dimensional structure.
  • Interacts with specific amino acids present in ⁇ -sheet 2 the 27th amino acid in the case of the amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 1 to 3 and the 26th amino acid in the case of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4). Located in an easy place.
  • the amino acid at position 22 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 1 to 3 and position 21 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 is present in the loop region between ⁇ sheet 1 and ⁇ sheet 2,
  • the amino acid is a specific amino acid existing in the same loop region on the three-dimensional structure (the 20th amino acid in the case of the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 1 to 3 and the 19th position in the case of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4). Of amino acids) are easily located.
  • the amino acid at the 29th position in the amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 1 to 3 and the 28th position in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 is present in ⁇ -sheet 2, and the amino acid has a three-dimensional structure.
  • Specific amino acids present in ⁇ -sheet 1 (the 8th and / or 11th amino acids in the case of the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 1 to 3; the 7th and / or Or an amino acid at the 10th position).
  • the interaction here may be a hydrogen bond or an electrostatic interaction.
  • the specific four sites in the case of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 1 to 3, positions 7, 13, 22, and Position 29; in the case of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, it interacts with a specific amino acid by substituting two or more sites among positions 6, 12, 12, and 28) It is considered that the structural stability is improved by the action with other amino acids located at a place where it is easy to perform, and it is possible to provide excellent alkali stability.
  • amino acids among positions 7, 13, 22, and 29 in each amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 1 to 3 The number of sites for introducing substitution may be 2 or more, but preferably 3 or more, more preferably 4 (that is, all) from the viewpoint of further improving alkali stability.
  • the sites where amino acid substitutions are introduced may be arbitrarily selected from these four sites, but from the viewpoint of further improving alkali stability, preferably Three sites at positions 13, 22 and 29; three sites at positions 7, 22 and 29; or three sites at positions 7, 13 and 22; Preferably, there are three sites at the 13th, 22nd and 29th positions, or 3 sites at the 7th, 22nd and 29th positions.
  • the amino acid substitution introduced at one or more sites may be any substitution with a basic amino acid other than lysine or an amino acid having a hydroxyl group.
  • Specific examples of the basic amino acid to be substituted include arginine and histidine, preferably arginine.
  • Specific examples of the amino acid having a hydroxyl group to be substituted include threonine, serine and tyrosine, preferably threonine. From the viewpoint of further improving alkali stability, substitution to arginine or threonine as an amino acid substitution introduced into two or more sites among positions 7, 13, 22, and 29 More preferably, substitution to arginine is mentioned.
  • both amino acid substitutions are preferably substitutions with basic amino acids other than lysine, and more preferably both are substitutions with arginine.
  • immunoglobulin binding domains (1-1) to (1-3) among the 7th, 13th, 22nd, and 29th positions in the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 1 to 3,
  • at least two are preferably substitutions with basic amino acids other than lysine (especially arginine), and all three are basic amino acids other than lysine (especially arginine). More preferably, the substitution is.
  • immunoglobulin binding domains (1-1) to (1-3) among the 7th, 13th, 22nd, and 29th positions in each amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 1 to 3
  • amino acid substitutions are introduced at four sites, at least two are preferably substitutions with basic amino acids other than lysine (particularly arginine), and at least three are basic amino acids other than lysine (particularly arginine).
  • Preferred examples of the amino acid sequence of the immunoglobulin binding domain of (1-1) to (1-3) above include 4 at 7th, 13th, 22nd and 29th positions in SEQ ID NOs: 1 to 3.
  • An amino acid sequence in which one site is substituted with a basic amino acid other than lysine (particularly arginine); the third, 22nd and 29th positions in SEQ ID NOs: 1 to 3 are basic other than lysine
  • An amino acid sequence substituted with an amino acid (especially arginine); two sites at positions 7 and 13 in each amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 1 to 3 are substituted with basic amino acids other than lysine (especially arginine)
  • amino acid sequences are particularly preferred because of their excellent alkali stability.
  • the number of sites for introducing amino acid substitutions among the 6th, 12th, 21st and 28th positions in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 is 2 From the viewpoint of further improving the alkali stability, it is preferably 3 or more, and more preferably 4 (that is, all).
  • amino acid substitutions were introduced at three positions among the 6th, 12th, 21st and 28th positions in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4.
  • the site where the amino acid substitution is introduced may be arbitrarily selected from these four sites, but from the viewpoint of further improving the alkali stability, preferably the 12th, 21st and 3 sites at position 28, 3 sites at position 6, 21 and 28, or 3 sites at positions 6, 12 and 21; more preferably positions 12 and 21 And three sites at the 28th position, or three sites at the 6th, 21st and 28th positions.
  • amino acids introduced into two or more sites among the 6th, 12th, 21st and 28th positions in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 The substitution may be any substitution with a basic amino acid other than lysine or an amino acid having a hydroxyl group. Specific examples of the substituted basic amino acid or amino acid having a hydroxyl group, preferred ones, etc. The same as in the case of the immunoglobulin binding domain of (1-3).
  • amino acid substitutions are preferably substitutions with basic amino acids other than lysine, more preferably both are substitutions with arginine.
  • amino acid substitutions were introduced into three of the 6th, 12th, 21st and 28th positions in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4.
  • At least two are preferably substituted with basic amino acids other than lysine (particularly arginine), and more preferably all three are substituted with basic amino acids other than lysine (particularly arginine).
  • amino acid substitutions are made at four sites out of the 6th, 12th, 21st and 28th positions in each amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4.
  • at least two are preferably substituted with basic amino acids other than lysine (particularly arginine), and at least three are substituted with basic amino acids other than lysine (particularly arginine). More preferably, all four are particularly preferably substituted with basic amino acids other than lysine (particularly arginine).
  • amino acid sequence contained in the immunoglobulin binding domain of (1-4) above there are four amino acid sequences of the 6th, 12th, 21st and 28th positions in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4.
  • the 21st position is substituted with a basic amino acid other than lysine (particularly arginine or histidine) or an amino acid having a hydroxyl group (particularly threonine).
  • Acid sequence and the like.
  • amino acids in which the 4th, 12th, 21st and 28th positions in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 are substituted with basic amino acids other than lysine (particularly arginine)
  • the arrangement is particularly suitable because of its excellent alkali stability.
  • (2-1) at least two amino acids selected from the group consisting of positions 7, 13, 22, and 29 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 are basic amino acids or hydroxyl groups other than lysine In which one or several amino acids other than the amino acid substitution site are substituted, added, inserted or deleted, and have an ability to bind to an immunoglobulin,
  • At least two amino acids selected from the group consisting of positions 7, 13, 22, and 29 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 are basic amino acids or hydroxyl groups other than lysine In which one or several amino acids other than the amino acid substitution site are substituted, added, inserted or deleted, and have an ability to bind to an immunoglobulin, An immunoglobulin binding domain having improved alkali stability compared to a polypeptide comprising the amino acid sequence shown in No. 1.
  • At least two amino acids selected from the group consisting of positions 7, 13, 22, and 29 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 are basic amino acids or hydroxyl groups other than lysine
  • one or several amino acids other than the amino acid substitution site are substituted, added, inserted or deleted, and have an ability to bind to an immunoglobulin
  • An immunoglobulin binding domain having improved alkali stability compared to a polypeptide comprising the amino acid sequence shown in No. 1.
  • At least two amino acids selected from the group consisting of positions 6, 12, 21, and 28 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 are basic amino acids or hydroxyl groups other than lysine In which one or several amino acids other than the amino acid substitution site are substituted, added, inserted or deleted, and have an ability to bind to an immunoglobulin, An immunoglobulin binding domain having improved alkali stability compared to a polypeptide comprising the amino acid sequence shown in No. 1.
  • amino acids selected from the group consisting of positions 7, 13, 22, and 29 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 are basic amino acids or hydroxyl groups other than lysine
  • An immunoglobulin binding domain having improved alkali stability compared to a polypeptide comprising the amino acid sequence shown in 1.
  • At least two amino acids selected from the group consisting of positions 7, 13, 22, and 29 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 are basic amino acids or hydroxyl groups other than lysine
  • At least two amino acids selected from the group consisting of positions 7, 13, 22, and 29 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 are basic amino acids or hydroxyl groups other than lysine
  • At least two amino acids selected from the group consisting of positions 6, 12, 21, and 28 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 are basic amino acids or hydroxyl groups other than lysine
  • An immunoglobulin binding domain having improved alkali stability compared to a polypeptide comprising the amino acid sequence shown in 4.
  • the immunoglobulin binding domains of (2-1) and (3-1) are variants of the immunoglobulin binding domain of (1-1), and are located at positions 7 and 13 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1. Of amino acid substitution introduced into at least two amino acids out of position 22, position 22 and position 29, preferred amino acid substitution sites, etc. are the same as in the case of the immunoglobulin binding domain of (1-1) above. .
  • the immunoglobulin binding domains of (2-2) and (3-2) are variants of the immunoglobulin binding domain of (1-2), and are located at positions 7 and 13 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2.
  • amino acid substitution introduced into at least two amino acids among the position, position 22 and position 29, the preferred amino acid substitution site, etc. are the same as in the case of the immunoglobulin binding domain of (1-2) above. .
  • the immunoglobulin binding domains of (2-3) and (3-3) are variants of the immunoglobulin binding domain of (1-3), and are located at positions 7 and 13 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3.
  • amino acid substitution introduced into at least two amino acids out of position No. 22, position 22 and position 29, preferred amino acid substitution sites, etc. are the same as in the case of the immunoglobulin binding domain of (1-3) above. .
  • the immunoglobulin binding domains of (2-4) and (3-4) are variants of the immunoglobulin binding domain of (1-4), and are located at positions 6 and 12 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4. Of amino acid substitution introduced into at least two amino acids among positions, 21 and 28, preferred amino acid substitution sites, etc. are the same as in the case of the immunoglobulin binding domain of (1-4) above. .
  • the amino acid modification introduced at the arbitrary modification site of the immunoglobulin binding domain of (2-1) to (2-4) is one kind of modification (for example, substitution) from substitution, addition, insertion, and deletion May be included, or two or more kinds of modifications (for example, substitution and insertion) may be included.
  • the number of amino acids substituted, added, inserted or deleted at an arbitrary modification site may be one, plural or several, for example 1 to 13, preferably 1 to 6, 1 to 5, or 1 to 4, more preferably 1 to 3, particularly preferably 1 or 2 or 1.
  • the sequence identity excluding the amino acid substitution site for each amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 1 to 4 is 80% or more. However, it is preferably 90% or more, more preferably 95% or more, and particularly preferably 99% or more.
  • sequence identity excluding the amino acid substitution site for each of the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 1 to 4 is SEQ ID NO: 1 to The sequence identity is calculated by extracting only the arbitrary modified site from each amino acid sequence shown in 4 and comparing only the arbitrary modified site.
  • sequence identity refers to BLAST PACKAGE [sgi32 bit edition, Version 2.0.12; available from National Center for Biotechnology Information (NCBI), Bl2seqpromTam. Microbiol.Lett., Vol.174, p247-250, 1999) shows the identity value of amino acid sequences.
  • the parameters may be set to Gap insertion Cost value: 11 and Gap extension Cost value: 1.
  • positions 8 and 11 in each amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 1 to 3 The amino acids at positions 20, 27, and 33 contribute to the improvement of alkali stability by interaction with basic amino acids other than lysine arranged at the amino acid substitution site or amino acids having a hydroxyl group. Therefore, it is desirable not to introduce substitutions or deletions at these sites.
  • SEQ ID NOs: 1 to 3 In the amino acid sequences shown in Fig. 2, the second amino acid is substituted with lysine, the 48th amino acid is substituted with arginine, the 67th amino acid is substituted with arginine, and the like.
  • the second in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 is used as a specific embodiment of amino acid substitution introduced at an arbitrary modification site. The amino acid at position is substituted with lysine, the amino acid at position 47 is substituted with arginine, the amino acid at position 66 is substituted with arginine, and the like.
  • conservative substitution Is mentioned. That is, as the substitution at the arbitrary modification site, for example, if the amino acid before substitution is a nonpolar amino acid, substitution to another nonpolar amino acid, and if the amino acid before substitution is an uncharged amino acid, other uncharged amino acids are used. Examples include substitution with an amino acid, substitution with another acidic amino acid if the amino acid before substitution is an acidic amino acid, and substitution with another basic amino acid if the amino acid before substitution is a basic amino acid.
  • the residual activity measured under the following conditions is the polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 measured under the same conditions. Means higher than residual activity. More specifically, the residual activity of the polypeptide measured under the following conditions is 1.8% or more, preferably 8%, compared to the residual activity of the polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 measured under the same conditions.
  • the polypeptide immobilized on the agarose gel carrier is washed 3 times with 0.1 M NaOH aqueous solution and replaced with the same alkaline solution, and then kept at 25 ° C. for 17 hours (alkali treatment). Next, after washing with PBS three times, the binding amount of human IgG (mg / ml gel) is measured. Even in the case where the alkali treatment was not performed, the binding amount (mg / ml gel) of the human IgG of the polypeptide immobilized on the agarose gel carrier is measured. The ratio of the binding amount of human IgG to the polypeptide after alkali treatment is calculated as the residual activity (%), assuming that the binding amount of human IgG in the polypeptide without alkali treatment is 100%.
  • the immunoglobulin binding domains of (2-1) and (3-1) are remarkably excellent in binding ability to immunoglobulin and alkali stability, and are particularly suitable as the immunoglobulin binding domain contained in the polypeptide of the present invention. Is preferred.
  • the polypeptide of the present invention may be a single domain polypeptide having one immunoglobulin binding domain, or a multidomain polypeptide in which two or more immunoglobulin binding domains are linked.
  • the polypeptide of the present invention is a multi-domain polypeptide, there is an advantage that the binding ability of an immunoglobulin kappa chain-containing fragment is increased.
  • polypeptide of the present invention is a single domain polypeptide, the above (1-1) to (1-4), (2-1) to (2-4) and (3-1) to (3 It is sufficient that one of the immunoglobulin binding domains in (4) is included.
  • the polypeptide of the present invention is a multidomain polypeptide
  • the above (1-1) to (1-4), (2-1) to (2-4) and (3-1) to It is sufficient that at least one of the immunoglobulin binding domains of (3-4) is included, and the above (1-1) to (1-4), (2-1) to (2-4)
  • the immunoglobulin binding domains of (3-1) to (3-4) may comprise two or more domains, and the above (1-1) to (1-4), ( One or more domains among immunoglobulin binding domains of (2-1) to (2-4) and (3-1) to (3-4), and each wild-type immunoglobulin constituting protein L It may contain one or more binding domains (amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 1 to 4) and each immunoglobulin binding domain constituting protein A.
  • the polypeptide of the present invention is a multi-domain polypeptide
  • all of the immunoglobulin-binding domains constituting it are the above-mentioned (1-1) to (1-4) from the viewpoint of providing further excellent alkaline stability. ), (2-1) to (2-4) and any of the immunoglobulin binding domains (3-1) to (3-4) are preferred.
  • the total number of linked immunoglobulin binding domains may be 2 or more, preferably 2 to 10, more preferably 2 to 6. Individual.
  • each of the constituting immunoglobulin binding domains may be directly linked at the C-terminus and the N-terminus, and each immunoglobulin-binding domain has 1 between each immunoglobulin-binding domain. It may be linked through ⁇ 40, preferably 1 ⁇ 10 amino acid residues.
  • the polypeptide of the present invention has a polypeptide having a different function, a peptide tag, etc. on the N-terminal side in order to impart binding to a carrier, improve expression of the polypeptide, impart ease of purification, etc.
  • it may be added to the C-terminal side.
  • the number of amino acids added to the N-terminal side and / or C-terminal side of the polypeptide of the present invention is not particularly limited, but for example, 1 to 400, preferably 1 to 100, Preferably 1 to 30 are mentioned.
  • the DNA encoding the polypeptide of the present invention (hereinafter sometimes referred to as “the DNA of the present invention”) is, for example, a DNA encoding wild-type protein L (SEQ ID NO: 5) as a template. It can be obtained by obtaining a DNA encoding the target immunoglobulin binding domain by PCR or the like and introducing a mutation so that the amino acid substitution is introduced into the DNA.
  • the DNA of the present invention can also be artificially synthesized by a gene synthesis method.
  • DNA encoding the wild type protein L (SEQ ID NO: 5) derived from Peptostreptococcus magunus 3316 strain is known as, for example, the base sequence shown in SEQ ID NO: 6, and PCR was used from the Peptostreptococcus magunus 3316 strain. It can be isolated by conventional methods. DNA encoding wild type protein L derived from Peptostreptococcusccmagunus 3316 can also be artificially synthesized by a gene synthesis method.
  • a method for introducing a specific mutation into a specific site in a base sequence is known, and for example, a site-specific mutagenesis method for DNA can be used.
  • a site-specific mutagenesis method for DNA can be used as a specific method for converting a base in DNA.
  • a commercially available kit can be used as a specific method for converting a base in DNA.
  • the base sequence of DNA having a mutation introduced into the base sequence can be confirmed using a DNA sequencer. Once the base sequence is determined, DNA encoding the polypeptide is obtained by chemical synthesis, PCR using the cloned probe as a template, or hybridization using a DNA fragment having the base sequence as a probe. be able to.
  • a mutant form of DNA encoding the peptide having a function equivalent to that before mutation can be synthesized by site-directed mutagenesis or the like.
  • a known method such as Kunkel method, Gapped duplex method, or megaprimer PCR method can be used.
  • DNA of the present invention is the base sequence shown in SEQ ID NO: 7.
  • the DNA consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 7 encodes a polypeptide consisting of an amino acid sequence in which the 7th, 13th, 22nd and 29th positions in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 are substituted with arginine. DNA.
  • the DNA of the present invention encodes an immunoglobulin binding domain that has an ability to bind to immunoglobulin and has improved alkali stability compared to the polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • a DNA comprising a base sequence complementary to the DNA consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 7 and a DNA that hybridizes under stringent conditions are included.
  • stringent conditions means 0.5% SDS, 5 ⁇ Denhartz [Denhartz's, 0.1% bovine serum albumin (BSA), 0.1% polyvinylpyrrolidone, 0.1% Ficoll. 400] and 100 ⁇ g / ml salmon sperm DNA (1 ⁇ SSC is 0.15 M NaCl, 0.015 M sodium citrate, pH 7.0) at 50 ° C. to 65 ° C. for 4 hours to overnight This refers to the conditions for keeping warm.
  • BSA bovine serum albumin
  • polyvinylpyrrolidone 0.1% Ficoll. 400
  • hybridization under stringent conditions is performed by the following method. That is, a nylon membrane on which a DNA library or cDNA library is immobilized is prepared, and a prehybridization solution containing 6 ⁇ SSC, 0.5% SDS, 5 ⁇ Denharz, 100 ⁇ g / ml salmon sperm DNA at 65 ° C. Block nylon membrane. Then add each probe labeled with 32 P and incubate at 65 ° C. overnight. This nylon membrane was placed in 6 ⁇ SSC for 10 minutes at room temperature, in 2 ⁇ SSC containing 0.1% SDS, for 10 minutes at room temperature, in 0.2 ⁇ SSC containing 0.1% SDS for 30 minutes at 45 ° C. After washing, autoradiography can be taken to detect DNA specifically hybridized with the probe.
  • the DNA of the present invention encodes an immunoglobulin binding domain that has an ability to bind to an immunoglobulin and has improved alkali stability compared to the polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1. Also included is DNA having 80% or more homology to DNA comprising the base sequence shown in SEQ ID NO: 7. The homology is preferably 90% or more, more preferably 95% or more, and particularly preferably 98% or more.
  • the DNA of the present invention preferably has a codon usage frequency optimized for the host. For example, if E. coli is used as the host, DNA in which the codon usage frequency is optimized for E. coli is preferable.
  • Recombinant vector A recombinant vector containing the DNA encoding the polypeptide of the present invention (hereinafter sometimes referred to as "the recombinant vector of the present invention") is obtained by inserting the DNA of the present invention into an expression vector. be able to.
  • the recombinant vector of the present invention includes a control factor such as a promoter operably linked to the DNA of the present invention.
  • a control factor such as a promoter operably linked to the DNA of the present invention.
  • a typical example of a control factor is a promoter, but a transcription element such as an enhancer, a CCAAT box, a TATA box, or an SPI site may be further included as necessary.
  • operably linked means that various regulatory factors such as promoters and enhancers that regulate the DNA of the present invention and the DNA of the present invention are linked in a state in which they can operate in a host cell.
  • a vector constructed for gene recombination from a phage, plasmid, or virus capable of autonomously growing in a host is suitable.
  • Such expression vectors are known.
  • commercially available expression vectors include pQE vectors (Qiagen), pDR540, pRIT2T (GE Healthcare Biosciences), pET vectors (Merck). Etc.).
  • an appropriate combination with a host cell may be selected and used. For example, when E. coli is used as a host cell, a combination of a pET vector and a BL21 (DE3) E. coli strain, or a pDR540 vector and a JM109 E. coli strain. A combination of strains is preferred.
  • Transformant A transformant (hereinafter sometimes referred to as “transformant of the present invention”) is obtained by transforming a host using the recombinant vector of the present invention.
  • the host used for the production of the transformant is not particularly limited as long as the recombinant vector is stable, can autonomously proliferate, and can express a trait of a foreign gene.
  • Escherichia coli etc. Bacteria belonging to the genus Escherichia, Bacillus subtilis, such as Bacillus subtilis, Pseudomonas putida, etc .; Pseudomonas genus, etc .; It may be a plant or the like. Among these, Escherichia coli is particularly preferable.
  • the transformant of the present invention can be obtained by introducing the recombinant vector of the present invention into a host, and the conditions for introducing the recombinant vector into the host may be appropriately set according to the type of the host.
  • the host is a bacterium, for example, a method using competent cells by calcium ion treatment, an electroporation method and the like can be mentioned.
  • the host is yeast, for example, electroporation method (electroporation method), spheroplast method, lithium acetate method and the like can be mentioned.
  • the host is an animal cell, examples thereof include an electroporation method, a calcium phosphate method, and a lipofection method.
  • examples include calcium phosphate method, lipofection method, electroporation method and the like.
  • examples thereof include an electroporation method, an Agrobacterium method, a particle gun method, and a PEG method.
  • polypeptide of the present invention can be produced by culturing the transformant.
  • the culture conditions for the transformant may be appropriately set in consideration of the nutritional physiological properties of the host, and liquid culture is preferable. In addition, when industrial production is performed, aeration stirring culture is preferable.
  • the transformant of the present invention is cultured, and the culture supernatant or cells are collected by a method such as centrifugation of the culture solution. If the polypeptide of the present invention is accumulated in the microbial cells, the microbial cells are treated with a mechanical method such as ultrasonic wave or French press or a lytic enzyme such as lysozyme, and an enzyme such as a protease as necessary. And a water-soluble fraction containing the polypeptide of the present invention can be obtained by using a surfactant such as sodium dodecyl sulfate (SDS).
  • SDS sodium dodecyl sulfate
  • the expressed polypeptide of the present invention can also be secreted into the culture medium by selecting an appropriate expression vector and host.
  • the culture solution or water-soluble fraction containing the polypeptide of the present invention obtained as described above may be subjected to purification treatment as it is, but the polypeptide of the present invention in the culture solution or water-soluble fraction is used as it is. You may use for a refinement
  • Concentration can be performed by, for example, vacuum concentration, membrane concentration, salting-out treatment, fractional precipitation with a hydrophilic organic solvent (for example, methanol, ethanol and acetone).
  • a hydrophilic organic solvent for example, methanol, ethanol and acetone.
  • the purification treatment of the polypeptide of the present invention can be performed by appropriately combining methods such as gel filtration, hydrophobic chromatography, ion exchange chromatography, affinity chromatography and the like.
  • polypeptide of the present invention thus purified may be pulverized by freeze drying, vacuum drying, spray drying or the like, if necessary.
  • Immunoglobulin binding carrier The polypeptide of the present invention is immobilized on an insoluble carrier and used as an immunoglobulin binding carrier in order to easily recover and purify the immunoglobulin.
  • the insoluble carrier used for immobilization of the polypeptide of the present invention is not particularly limited.
  • naturally-derived polymer materials such as chitosan, dextran, cellulose, and agarose
  • synthetic organic materials such as vinyl alcohol, polyimide, and methacrylate Materials: Examples include inorganic materials such as glass and silica.
  • the shape of the insoluble carrier is not particularly limited, and may be any shape such as a hollow fiber membrane shape, a monolith shape, or a bead shape.
  • the bead shape is preferable because it generally has a relatively large surface area per volume and is suitable for production of an affinity carrier having a high immunoglobulin binding ability.
  • an amino group, a carboxyl group, or a thiol group in the polypeptide of the present invention may be coupled to the insoluble carrier.
  • an insoluble carrier can be activated by reacting with a coupling agent such as cyanogen bromide, epichlorohydrin, N-hydroxysuccinimide, tosyl chloride, tresyl chloride, carbodiimide, glutaraldehyde, hydrazine, etc.
  • an immobilization method in which a reactive functional group such as a carboxyl group or a thiol group is introduced into a carrier and then a coupling reaction is carried out with the polypeptide of the present invention.
  • a reactive functional group such as a carboxyl group or a thiol group
  • Such coupling reactions are well known in the art (see, for example, Janson,-J.-C., editing, third edition, pages 221-258, ISBN 978-0-471-74661-). 4) It can be performed according to a commonly used method.
  • a reactive functional group capable of reacting with an amino group to form a covalent bond (tresyl group, epoxy group, carboxyl group, It is desirable to use a carrier having a formyl group or the like.
  • insoluble carriers examples include Toyopearl AF-Tresyl-650, Toyopearl AF-Epoxy-650, Toyopearl AF-carboxy-650, Toyopearl AF-Formyl-650 (above, Tosoh Corporation), NHS activated Sepharose, bromide Cyan-activated Sepharose, Epoxy-activated Sepharose (GE Healthcare Bioscience Co., Ltd.), Profinity Epoxide (Bio-Rad Co., Ltd.), Glyoxal-Agarose (Agarose Bead Technologies Co., Ltd.), Cellufine Formyl (JNC Corporation) Etc., and these commercially available products can be used.
  • polypeptide of the present invention can also be immobilized on the insoluble carrier by adding a condensation or crosslinking reagent such as carbodiimide or glutaraldehyde to the system in which the polypeptide of the present invention coexists with the insoluble carrier.
  • a condensation or crosslinking reagent such as carbodiimide or glutaraldehyde
  • an insoluble carrier on which the polypeptide of the present invention is immobilized may be used.
  • immunoglobulin separation using an insoluble carrier on which the polypeptide of the present invention is immobilized can be performed by affinity column chromatography.
  • a solution containing an immunoglobulin or a fragment thereof is passed through a column packed with an insoluble carrier on which the polypeptide of the present invention is immobilized.
  • the immunoglobulin may be eluted by washing and then passing the eluate adjusted to an appropriate pH through the column.
  • Reference example 1 Production of immunoglobulin-binding domain protein of protein L derived from Peptostreptococcus magnus and evaluation of binding activity and alkali stability [Production of each immunoglobulin-binding domain] [Design and construction of modifications]
  • the chimeric protein containing immunoglobulin binding domain 1 contains PL-021, the chimeric protein containing immunoglobulin binding domain 2 contains PL-022, the chimeric protein containing immunoglobulin binding domain 3 contains PL-023, and the immunoglobulin binding domain 4
  • the chimeric protein was named PL-014.
  • DNA fragment A1 immunoglobulin
  • SEQ ID NO: 8 synthetic oligo DNA oligo-166
  • oligo-167 synthetic oligo-167
  • First part of kappa light chain binding domain 4 was prepared.
  • DNA fragment A2 second half of immunoglobulin kappa light chain binding domain 4 was prepared by PCR using synthetic oligo DNA oligo-168 (SEQ ID NO: 10) and oligo-169 (SEQ ID NO: 11).
  • a synthetic oligo DNA oligo-189 (SEQ ID NO: 15) containing an EcoO109I recognition sequence in a sequence encoding an artificial sequence “FAGALPSKS” is used as a forward primer, followed by a sequence encoding an artificial C-terminal sequence “AQAPKKKK”.
  • Synthetic oligo DNA oligo-191 (SEQ ID NO: 16) containing a translation stop codon and a BamHI recognition sequence was used as a reverse primer, and the 3 ⁇ -helix of the modified protein A-derived immunoglobulin Fc-binding C domain disclosed in Patent Document 1
  • the DNA fragment A4 was cleaved with NdeI and EcoO109I, the DNA fragment 5 was cleaved with EcoO109I and BamHI, and incorporated into the NdeI-BamHI part on the pET-9a plasmid (Novagen, Merck) at one time.
  • DNA fragment B3 was obtained by PCR using DNA fragment B1 and DNA fragment B2 as templates and synthetic oligo DNA oligo-178 (SEQ ID NO: 13) and oligo-196 (SEQ ID NO: 21) as primers.
  • the DNA fragment B3 was cleaved with NdeI and EcoO109I and incorporated into the NdeI-BamHI part on the pET-9a plasmid at the same time with the DNA fragment 5 cleaved with EcoO109I and BamHI.
  • DNA fragment A1 prepared above was used as it was.
  • DNA fragment C2 was prepared by PCR using synthetic oligo DNA oligo-199 (SEQ ID NO: 23) and oligo-201 (SEQ ID NO: 24) complementary to each other at about 3 bases on the 3 ′ end side as templates. .
  • DNA fragment A1 and fragment C2 were cleaved with restriction enzyme EcoRI and ligated to each other to obtain DNA fragment C3.
  • a DNA fragment C4 was prepared by PCR using the expression plasmid of PL-014 as a template and synthetic oligo DNA oligo-200 (SEQ ID NO: 25) and oligo-191 (SEQ ID NO: 16) as primers.
  • the DNA fragment C3 and the DNA fragment C4 are designed to have partially overlapping sequences.
  • synthetic oligo DNA oligo-178 SEQ ID NO: 13
  • oligo-191 SEQ ID NO: 16
  • This cDNA was cleaved with NdeI and BamHI and incorporated into the NdeI-BamHI part on the pET-9a plasmid, so that from the N-terminal side, an artificial N-terminal sequence of 11 residues (SEQ ID NO: 12), protein L immunoglobulin kappa 70 residues of light chain binding domain 2 (SEQ ID NO: 3), 2 residues of linking sequence consisting of alanine-leucine, 21 residues of modified C-terminal sequence of protein A-derived immunoglobulin Fc binding C domain 3 ⁇ helix (SEQ ID NO: SEQ ID NO: 17), and an expression plasmid for the chimeric protein PL-022 in which 3 residues of the artificial C-terminal sequence (SEQ ID NO: 18) were ligated in this order.
  • SEQ ID NO: 12 protein L immunoglobulin kappa 70 residues of light chain binding domain 2
  • 2 residues of linking sequence consisting of alanine-leucine 21 residue
  • DNA fragment D1 was prepared by PCR using PL-014 expression plasmid as a template and synthetic oligo DNA oligo-197 (SEQ ID NO: 26) and oligo-198 (SEQ ID NO: 27) as primers.
  • DNA fragment D2 was prepared by PCR using synthetic oligo DNA oligo-199 (SEQ ID NO: 23) and oligo-202 (SEQ ID NO: 28) complementary to each other at about 15 bases on the 3 ′ end side of each other as a template. .
  • DNA fragment D3 was prepared by PCR using DNA fragment D1 and DNA fragment D2 as templates and synthetic oligo DNA oligo-197 (SEQ ID NO: 26) and oligo-202 (SEQ ID NO: 28) as primers.
  • Protein L immunoglobulin kappa light chain binding domain 3 has 26 residues from the C-terminal side and the same sequence as domain 2. Therefore, DNA fragment C4 prepared above is used as it is, and DNA fragment D3 and DNA fragment C4 are used as templates.
  • cDNA encoding PL-023 was obtained by PCR using synthetic oligo DNA oligo-178 (SEQ ID NO: 13) and oligo-191 (SEQ ID NO: 16) as primers.
  • This cDNA was cleaved with NdeI and BamHI and incorporated into the NdeI-BamHI part on the pET-9a plasmid, so that from the N-terminal side, an artificial N-terminal sequence of 11 residues (SEQ ID NO: 12), protein L immunoglobulin kappa 70 residues of light chain binding domain 3 (SEQ ID NO: 2), 2 residues of linking sequence consisting of alanine-leucine, 21 residues of modified C-terminal sequence of protein A-derived immunoglobulin Fc binding C domain 3 ⁇ helix (SEQ ID NO: SEQ ID NO: 17), and an expression plasmid for chimeric protein PL-023 in which 3 residues of the artificial C-terminal sequence (SEQ ID NO: 18) were ligated in this order.
  • SEQ ID NO: 12 protein L immunoglobulin kappa 70 residues of light chain binding domain 3
  • 2 residues of linking sequence consisting of alanine-leucine 21 residues
  • each immunoglobulin-binding domain expression plasmid obtained as described above was analyzed using a CEQ8000 type DNA sequencer (Beckman Coulter, Inc.), and the sequence was confirmed as designed. Next, BL21 (DE3) competent cells (Merck Co., Ltd.) were transformed with each expression plasmid to obtain an expression strain for each protein.
  • Each immunoglobulin-binding domain-expressing E. coli strain was seed-cultured for 12 hours in an LB medium containing 25 mg / L kanamycin and 2.0% glucose. After inoculating the obtained seed culture solution into 2 ⁇ TY medium containing 25 mg / L kanamycin and 0.8% glucose and culturing at 37 ° C. for 16 hours to express the desired immunoglobulin binding domain E. coli was recovered by centrifugation. Next, the recovered E. coli was suspended in 50 mM sodium phosphate buffer (pH 6.5), sonicated to disrupt the E. coli, and the desired immunoglobulin-binding domain was recovered in the supernatant by centrifugation.
  • each immunoglobulin binding domain was purified as a single band at the position of the theoretical molecular weight.
  • Each purified immunoglobulin-binding domain was immobilized on a formyl-activated agarose gel carrier at a concentration of 10 mg / mL gel according to a conventional method.
  • the immobilization efficiency was 90% or more in all the immunoglobulin binding domains.
  • the gel carrier after the immobilization reaction was washed with a PBS solution, and then a PBS solution containing 40 mg / mL human IgG (obtained from the Institute of Chemistry and Serum Therapy) was added and shaken for 1 hour, followed by washing with PBS.
  • Human IgG bound to the gel carrier was eluted from the carrier with 0.1 M glycine hydrochloride buffer (pH 2.5). The eluate was measured for absorption at 280 nm with a spectrophotometer, and the amount of bound immunoglobulin (IgG binding activity) was determined based on the specific extinction coefficient of 13.8 (1 g ⁇ 1 cm ⁇ 1 ).
  • Table 1 shows the amount of each immunoglobulin-binding domain immobilized on the gel and IgG binding activity. From this result, it was found that domain 4 has the highest IgG binding activity among the four domains of protein L.
  • Fab prepared by papain treatment of human IgG was biotinylated by the same method, then immobilized on a streptavidin sensor chip, and the amount of binding of each immunoglobulin binding domain was measured. Domain 4 PL-014 showed the highest binding activity.
  • immunoglobulin binding domain 4 showed the highest binding ability to IgG kappa light chain even in solution.
  • Example 1 Production of variant of immunoglobulin binding domain 4 and evaluation of binding activity and alkali stability [Production of variant] With the immunoglobulin binding domain 4 having high immunoglobulin binding activity and alkali stability as a basic sequence, the threonine residue at position 2 in the immunoglobulin binding domain 4 and the 7th and 13th positions are aimed at further improving the alkali stability. , 22, 28, 29, 48, and 67, a total of 8 amino acid residues of 7 lysine residues were noted, and amino acid-substituted variants were prepared.
  • the DNA fragment E1 was prepared by PCR using the expression plasmid of PL-023 as a template and the synthetic oligo DNA oligo-178 (SEQ ID NO: 13) and oligo-203 (SEQ ID NO: 29) as primers. Further, a DNA fragment E2 was prepared by PCR using the expression plasmid of PL-014 as a template and the synthetic oligo DNAs oligo-204 (SEQ ID NO: 30) and oligo-205 (SEQ ID NO: 31) as primers.
  • DNA fragment E3 was prepared by PCR using PL-014 expression plasmid as a template and synthetic oligo DNAs oligo-206 (SEQ ID NO: 32) and oligo-207 (SEQ ID NO: 33) as primers.
  • DNA fragment E1 and DNA fragment E2 as templates and PCR using oligo-178 (SEQ ID NO: 13) and oligo-205 (SEQ ID NO: 31) as primers
  • DNA fragment E4 in the first half of PL-024 was obtained as fragment E3
  • DNA fragment E5 of the latter half of PL-024 was prepared by PCR using synthetic oligo DNAs oligo-206 and oligo-191 as primers using fragment 5 as a template.
  • the entire PL-024 cDNA fragment was prepared by PCR using the DNA fragment E4 and the DNA fragment E5 as templates and the synthetic oligo DNA oligo-178 (SEQ ID NO: 13) and oligo-191 (SEQ ID NO: 16) as primers.
  • the cDNA was digested with NdeI and BamHI and incorporated into the NdeI-BamHI part on the pET-9a plasmid to obtain an expression plasmid for the chimeric protein PL-024.
  • the extension extension method two-step PCR method
  • the 2nd, 7th, 13th CDNA fragments encoding single amino acid substitutions at positions 22, 22, 29, 48 and 67 were prepared.
  • a mutation at another position was introduced by the same overlap extension method (two-step PCR method) using the cDNA of one amino acid substitution product as a template.
  • mutant cDNA fragments containing amino acid substitutions at a plurality of sites in various combinations were prepared by PCR using primers that cause mutation at different positions.
  • Each modified cDNA obtained as described above was inserted into the E. coli expression vector pET9a in the same manner as in Example 1 to construct an expression plasmid.
  • Table 3 shows the substitution pattern of each modified product obtained.
  • the nucleic acid sequence of the expression plasmid thus obtained was analyzed using a CEQ8000 type DNA sequencer (Beckman Coulter, Inc.), and it was confirmed that the sequence was as designed. Next, by transforming BL21 (DE3) competent cells (Merck Co., Ltd.) with each expression plasmid, an expression strain of each immunoglobulin binding domain 4 variant was obtained.
  • E. coli strains expressing the respective variants of immunoglobulin binding domain 4 were cultured at 37 ° C. for 16 hours in the same manner as in Reference Example 1 to express the desired immunoglobulin binding domain 4 variant. Thereafter, E. coli was recovered by centrifugation. Next, the recovered E. coli was suspended in 50 mM sodium phosphate buffer (pH 6.5), sonicated to disrupt the E. coli, and the desired immunoglobulin-binding domain 4 variant was recovered in the supernatant by centrifugation. . When each supernatant obtained was subjected to SDS-PAGE as a bacterial cell extract, it was confirmed that the target immunoglobulin-binding domain 4 variant was produced at each molecular weight position.
  • Table 4 shows the obtained results. From this result, in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, PL-024 and PL-038, in which all seven lysine residues at positions 7, 13, 22, 29, 48, and 67 were substituted, The activity was 11% higher than that of PL-014. When the 29th, 48th, and 67th positions in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 were substituted with arginine, the activity increased by 5%. In addition, a tendency that the activity increases as the number of substitutions of lysine residues at positions 7, 13, 22, 29, 48, and 67 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 with arginine increases. It was.
  • the lysine residue at position 7 is a glutamic acid residue at position 33 in ⁇ -helix structure 1. It is arranged at a position where interaction is easy. Therefore, when the lysine residue at the 7th position is replaced with an amino acid that ionically bonds or hydrogen bonds with glutamic acid (that is, a basic amino acid or an amino acid having a hydroxyl group), an alkaline stability is achieved by the interaction with the 33rd position glutamic acid residue. It is estimated that the improvement of the property is achieved.
  • the lysine residue at the 13th position in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is present in ⁇ sheet 1, which is in a position where it is likely to interact with glutamic acid at the 27th position present in ⁇ sheet 2.
  • the lysine residue at position 22 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is present in the loop part between ⁇ sheet 1 and ⁇ sheet 2, which is mutually associated with aspartic acid at position 20 present in the loop part. It is arranged at a position where it is easy to act.
  • the lysine residue at position 29 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is arranged at a position where it can easily interact with glutamic acid at position 8 and / or threonine at position 11 present in ⁇ -sheet 1. Therefore, the lysine residues at positions 13, 22, and 29 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 are amino acids that are ion-bonded or hydrogen-bonded to glutamic acid, aspartic acid and / or threonine at position 11 (ie, basic). By substituting with an amino acid or an amino acid having a hydroxyl group, it is presumed that the alkali stability is improved by the interaction between these amino acids. This is consistent with the above experimental results where PL-050 and PL-052 showed improved alkali stability, but PL-051 and PL-053 to PL-056 did not show improved alkali stability. is doing.
  • Example 2 Production and binding activity and alkaline stability evaluation of a multidomain polypeptide of immunoglobulin binding domain 4 variant [construction of a multidomain polypeptide expression plasmid and protein expression]
  • the DNA sequence of the modified PL-024 chimeric protein encodes an immunoglobulin kappa light chain binding domain modification domain of protein L in a sequence encoding a translation initiation codon (CATATG) having an NdeI recognition sequence and an artificial N-terminal sequence “MAQHDEAGLAL”
  • a sequence that has an EcoO109I recognition sequence (GGGGCCCT) in the sequence encoding the artificial sequence “NIKFAGAL” at the C-terminal portion, and further, the modified C-terminus of the protein F immunoglobulin F-binding C domain 3 alpha helix The sequence is followed by 21 residues, and finally contains the sequence encoding the artificial C-terminal sequence “KKK”, a translation stop codon and a BamHI recognition sequence.
  • the plasmid obtained by inserting this PL-024 chimeric protein cDNA into the cloning site of the pUC19 plasmid from which the EcoO109I cleavage site on the plasmid had been previously deleted was used for the construction of the multidomain polypeptide cDNA.
  • Protein L immunoglobulin kappa with EcoO109I recognition sequences at both N and C ends by PCR using the modified PL-024 cDNA as a template and synthetic oligo DNA oligo210 (SEQ ID NO: 34) and oligo211 (SEQ ID NO: 35) as primers.
  • a cDNA fragment containing only the light chain binding domain modified domain portion was prepared, and both ends of this fragment were cleaved with EcoO109I.
  • the pUC19 plasmid into which the cDNA of the PL-024 chimeric protein was subcloned was cleaved with EcoO109I, the cleavage site was dephosphorylated with alkaline phosphatase, and the PCR fragment was inserted into this site by ligation reaction.
  • two protein L immunoglobulin kappa light chain binding domain-modified domains are linked from the N-terminal side to protein A immunoglobulin Fc-binding C domain 3 ⁇ .
  • Lix's modified C-terminal sequence of 21 residues (SEQ ID NO: 17) and an artificial C-terminal sequence (SEQ ID NO: 18) were obtained as a dimeric chimeric protein cDNA in this order, and similarly 3 fragments
  • the inserted clone was obtained as a tetrameric chimeric protein cDNA, and the clone into which 5 fragments were inserted was obtained as a hexameric chimeric protein cDNA.
  • the modified C-terminal sequence of protein A immunoglobulin Fc binding C domain 3 ⁇ helix may be a shorter sequence such as 2 residues of “PK” or 6 residues of “PKKKKKK”. It has been confirmed that the C-terminal sequence does not affect the alkaline stability of the modified multidomain polypeptide.
  • the C-terminal sequence added in this way is not limited to the modified sequence of the protein A immunoglobulin Fc-binding C domain 3 ⁇ helix, but a sequence containing many amino acid residues that are likely to react in immobilizing the gel carrier. By doing so, it is possible to fix the modified body to the gel by controlling the orientation.
  • Each cDNA was excised from the pUC19 plasmid obtained by subcloning the tetramer PL-424 and hexamer PL-624 cDNAs obtained as described above with restriction enzymes NdeI and BamHI, and the resulting cDNAs were isolated from NdeI on pET9a, an E. coli expression vector.
  • -An expression plasmid was constructed by inserting into a BamHI site, and the nucleic acid sequence of each expression plasmid was analyzed using a CEQ8000 type DNA sequencer (Beckman Coulter, Inc.) to confirm that the sequence was as designed.
  • BL21 (DE3) competent cells (Merck Co., Ltd.) were transformed with each expression plasmid to obtain an expression strain of each multidomain polypeptide.
  • Each expression strain was seed-cultured for 12 hours in an LB medium containing 25 mg / L kanamycin and 2.0% glucose, and this seed culture was used as a 2 ⁇ TY medium containing 25 mg / L kanamycin and 0.8% glucose. Inoculated and cultured at 37 ° C. for 16 hours to express the desired multidomain polypeptide, and then E. coli was collected by centrifugation. Next, the collected E. coli was suspended in 50 mM MES buffer (pH 6.0), sonicated to disrupt the E. coli, and the desired multidomain polypeptide was recovered in the supernatant by centrifugation.
  • the amino acid sequence of the obtained tetramer PL-424 is shown in SEQ ID NO: 36
  • the amino acid sequence of the obtained hexamer PL-624 is shown in SEQ ID NO: 37.
  • each multidomain polypeptide was eluted with a 0.35 M NaCl linear concentration gradient. Each eluate was subjected to SDS-PAGE to confirm the purity. As a result, it was confirmed that each multidomain polypeptide was purified as a single band at the position of the theoretical molecular weight.
  • Human IgG binding activity is 144% for multidomain polypeptide PL-424 (4 domains) and 151% for multidomain polypeptide PL-624 (6 domains) compared to single domain polypeptide PL-024 And each showed higher activity than single domain polypeptides. It should be noted that the 47 kDa Fab fragment is close to IgG in the molecular weight of 145 kDa IgG. When the number of moles is calculated based on the respective molecular weights, 632 nmol of IgG is bound at 10 mg of PL-424 (4 domains), and 661 nmol of IgG is bound at 10 mg of PL-624 (6 domains).
  • the multimer of the present invention when compared with CaptoL (GE Healthcare) in which a multi-domain polypeptide (domain number 4) (protein L) of a natural sequence is immobilized on a 10 mg / mL gel, the multimer of the present invention has a Fab fragment.
  • the binding amount was about 2.4 times that of IgG and 2.2 times that of IgG.
  • Example 3 Production of variant of immunoglobulin binding domain 3 and evaluation of binding activity and alkali stability [Production of variant]
  • the immunoglobulin binding domain 3 as a basic sequence, four lysines at positions 7, 13, 22, and 29 in the immunoglobulin binding domain 3 (SEQ ID NO: 2) are aimed at improving alkali stability.
  • SEQ ID NO: 2 four lysines at positions 7, 13, 22, and 29 in the immunoglobulin binding domain 3 (SEQ ID NO: 2) are aimed at improving alkali stability.
  • a variant in which the residue was substituted with arginine was prepared.
  • lysine residue at position 29 was replaced with arginine by PCR using PL-024 expression plasmid as a template and oligo-335 (SEQ ID NO: 39) and oligo-191 (SEQ ID NO: 16) as primers.
  • a cDNA fragment encoding the sequence of immunoglobulin binding domain 3 was generated.
  • a cDNA encoding PL-061 was obtained by PCR using these two DNA fragments as templates and using synthetic oligo DNA oligo-178 (SEQ ID NO: 13) and oligo-191 (SEQ ID NO: 16) as primers.
  • This cDNA was cleaved with NdeI and BamHI and incorporated into the NdeI-BamHI part on the pET-9a plasmid, so that the artificial N-terminal sequence 11 residues (SEQ ID NO: 12), position 7 in SEQ ID NO: 2 from the N-terminal side.
  • the purified variant PL-061 was immobilized on a formyl-activated agarose gel carrier at a concentration of 10 mg / mL gel according to a conventional method. When the reaction solution after immobilization was collected and the immobilization rate was measured, it was confirmed that the immobilization efficiency was 95% or more. Next, the human IgG binding activity of each immobilized gel carrier was measured by the same method as in Reference Example 1.
  • Table 8 shows the obtained results. From this result, even when the four lysine residues at positions 7, 13, 22, and 29 in SEQ ID NO: 2 were substituted with arginine, as in the case of the immunoglobulin binding domain 4, Improvement in human IgG binding activity was observed.
  • the amino acid sequence of the immunoglobulin binding domain in protein L from Peptostreptococcus magnus 3316 strain is highly homologous to that from Peptostreptococcus magnus 312 strain. It has been confirmed that even when the globulin binding domain is subjected to the same mutation as described above, the alkali stability cannot be improved. That is, it can be said that the mutation that can improve the alkali stability demonstrated in Examples 1 to 3 is unique to the immunoglobulin binding domain in protein L derived from Peptostreptococcus magnus 3316 strain.

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Abstract

本発明の目的は、Peptostreptococcus magnus由来のプロテインＬにおけるイムノグロブリン結合ドメインのアミノ酸配列を改変することにより、イムノグロブリンのカッパ鎖に対する結合能が高く、アルカリ安定性に優れたポリペプチドを提供することである。　Peptostreptococcus magnus 3316株由来のプロテインＬの各イムノグロブリン結合ドメインにおいて、特定のリジン残基を塩基性アミノ酸又は水酸基を有するアミノ酸に置換することによって、イムノグロブリンのカッパ鎖に対する結合能が高く、しかもアルカリ安定性に優れたポリペプチドが得られる。

Description

イムノグロブリン結合ポリペプチド
　本発明は、イムノグロブリン又はその断片に結合するポリペプチドに関する。より具体的には、本発明は、イムノグロブリン又はその断片のカッパ鎖に対する結合性が高く、アルカリ条件下での安定性（アルカリ安定性）に優れたポリペプチドに関する。更に、本発明は、当該ポリペプチドの製造方法、当該ポリペプチドの固定化物、及び当該ポリペプチドを利用したイムノグロブリン又はその断片の分離方法等に関する。
　従来、イムノグロブリン（抗体とも称される）は、標的物質に対する結合特異性が高く、研究用試薬や臨床検査試薬として広く利用されている。また、近年では、遺伝子組換え技術の進歩によって、ヒト抗体やヒト化抗体の作製技術が確立され、イムノグロブリンは、抗体医薬としてリウマチや癌等の医療分野で実用化されるに至っている。
　イムノグロブリンは、主に動物細胞培養により製造されており、その精製にはイムノグロブリン結合能を有するリガンドを使用したアフィニティークロマトグラフィーが広く利用されている。イムノグロブリンの精製に利用されるアフィニティークロマトグラフィーでは、イムノグロブリンに特異的に結合するリガンドとして、プロテインＡ、プロテインＬ、プロテインＧ等のポリペプチド、又はこれらのイムノグロブリン結合ドメインが用いられている。
　一方、近年、イムノグロブリンの精製に使用されるリガンドの安定性の向上が求められるようになっている。特に、イムノグロブリンの精製では、ウイルス等の失活、リガンドを固定化した担体の洗浄等のためにアルカリ溶液が使用されており、イムノグロブリンの精製に使用されるリガンドには、アルカリに対して高い安定性を備えていることが１つの重要な要素になっている。
　従来、プロテインＡのアルカリ安定性を向上させる技術については精力的に検討されている。例えば、特許文献１には、プロテインＡのＣドメインの特定のアミノ酸、又はプロテインＡのＺドメインの特定のアミノ酸残基を置換することにより、優れたイムノグロブリン結合能及びアルカリ安定性を備えさせ得ることが報告されている。また、特許文献２には、プロテインＡのアスパラギン残基を別のアミノ酸に置換することによってアルカリ安定性を備えさせ得ることが報告されている。
　このように、プロテインＡについては、アルカリ安定性を付与する技術が種々報告されているものの、プロテインＬのアルカリ安定性を付与する技術については十分な検討がなされていないのが現状である。
　プロテインＬは、Peptostreptococcus magnus（別名 Finegoldia magna）の細胞表面に局在しており、イムノグロブリンのカッパ鎖に特異的に結合できることが知られている。プロテインＬには、Peptostreptococcus magnus 312株由来のもの（非特許文献１）とPeptostreptococcus magnus 3316株由来のもの（非特許文献２及び特許文献３）が報告されている。Peptostreptococcus magnus 3316株由来のプロテインＬには、イムノグロブリンのカッパ鎖に結合する４つのドメインがあり（非特許文献２及び特許文献３）、これらのドメインは相互にアミノ酸配列の類似性が高く、しかもこれらの４つのドメインは単独でもイムノグロブリンに対する結合能を示すことが知られている。312株の５つのカッパ鎖結合ドメインのアミノ酸配列も3316株の各ドメインのアミノ酸配列に対して類似性が高い。しかしながら、Peptostreptococcus magnus 由来のプロテインＬの各ドメインのアミノ酸配列において、どのような改変が、アルカリ安定性に寄与するかについては一切明らかにされていない。
国際公開番号第２００７／０９７３６１号 国際公開第２０００／０２３５８０号 US patent No. 6,162,903 (2000)
W. Kastern et al., J.Biol. Chem. (1992) 267, 12820-12825 J.P. Murphy et al., Mol. Microbiol. (1994)12, 911-920
　本発明の目的は、Peptostreptococcus magnus由来のプロテインＬにおけるイムノグロブリン結合ドメインのアミノ酸配列を改変することにより、イムノグロブリンのカッパ鎖に対する結合能が高く、アルカリ安定性に優れたポリペプチドを提供することである。
　本発明者は、前記課題を解決すべく鋭意検討を行ったところ、Peptostreptococcus magnus 3316株由来のプロテインＬの各イムノグロブリン結合ドメインにおいて、特定のリジン残基を塩基性アミノ酸又は水酸基を有するアミノ酸に置換することによって、イムノグロブリンのカッパ鎖に対する結合能が高く、しかもアルカリ安定性に優れたポリペプチドが得られることを見出した。本発明は、かかる知見に基づいて更に検討を重ねることにより完成したものである。
　即ち、本発明は、下記に掲げる態様の発明を提供する。
項１．　下記(1-1)～(1-4)、(2-1)～(2-4)、及び(3-1)～(3-4)のいずれかに示すイムノグロブリン結合ドメインを少なくとも１つ含むポリペプチド。
(1-1)配列番号１に示すアミノ酸配列において、第７位、第１３位、第２２位、及び第２９位よりなる群から選択される部位の少なくとも２個以上が、リジン以外の塩基性アミノ酸又は水酸基を有するアミノ酸に置換されているアミノ酸配列を含むイムノグロブリン結合ドメイン。
(1-2)配列番号２に示すアミノ酸配列において、第７位、第１３位、第２２位、及び第２９位よりなる群から選択される部位の少なくとも２個以上が、リジン以外の塩基性アミノ酸又は水酸基を有するアミノ酸に置換されているアミノ酸配列を含むイムノグロブリン結合ドメイン。
(1-3)配列番号３に示すアミノ酸配列において、第７位、第１３位、第２２位、及び第２９位よりなる群から選択される部位の少なくとも２個以上が、リジン以外の塩基性アミノ酸又は水酸基を有するアミノ酸に置換されているアミノ酸配列を含むイムノグロブリン結合ドメイン。
(1-4)配列番号４に示すアミノ酸配列において、第６位、第１２位、第２１位、及び第２８位よりなる群から選択される部位の少なくとも２個以上が、リジン以外の塩基性アミノ酸又は水酸基を有するアミノ酸に置換されているアミノ酸配列を含むイムノグロブリン結合ドメイン。
(2-1)配列番号１に示すアミノ酸配列における第７位、第１３位、第２２位、及び第２９位よりなる群から選択される少なくとも２つのアミノ酸が、リジン以外の塩基性アミノ酸又は水酸基を有するアミノ酸に置換されているアミノ酸配列において、前記アミノ酸置換部位以外のアミノ酸の１個又は数個が置換、付加、挿入又は欠失されてなり、且つ、イムノグロブリンに対する結合能を有し、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドと比較してアルカリ安定性が向上しているイムノグロブリン結合ドメイン。
(2-2)配列番号２に示すアミノ酸配列における第７位、第１３位、第２２位、及び第２９位よりなる群から選択される少なくとも２つのアミノ酸が、リジン以外の塩基性アミノ酸又は水酸基を有するアミノ酸に置換されているアミノ酸配列において、前記アミノ酸置換部位以外のアミノ酸の１個又は数個が置換、付加、挿入又は欠失されてなり、且つ、イムノグロブリンに対する結合能を有し、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドと比較してアルカリ安定性が向上しているイムノグロブリン結合ドメイン。
(2-3)配列番号３に示すアミノ酸配列における第７位、第１３位、第２２位、及び第２９位よりなる群から選択される少なくとも２つのアミノ酸が、リジン以外の塩基性アミノ酸又は水酸基を有するアミノ酸に置換されているアミノ酸配列において、前記アミノ酸置換部位以外のアミノ酸の１個又は数個が置換、付加、挿入又は欠失されてなり、且つ、イムノグロブリンに対する結合能を有し、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドと比較してアルカリ安定性が向上しているイムノグロブリン結合ドメイン。
(2-4)配列番号４に示すアミノ酸配列における第６位、第１２位、第２１位、及び第２８位よりなる群から選択される少なくとも２つのアミノ酸が、リジン以外の塩基性アミノ酸又は水酸基を有するアミノ酸に置換されているアミノ酸配列において、前記アミノ酸置換部位以外のアミノ酸の１個又は数個が置換、付加、挿入又は欠失されてなり、且つ、イムノグロブリンに対する結合能を有し、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドと比較してアルカリ安定性が向上しているイムノグロブリン結合ドメイン。
(3-1)配列番号１に示すアミノ酸配列における第７位、第１３位、第２２位、及び第２９位よりなる群から選択される少なくとも２つのアミノ酸が、リジン以外の塩基性アミノ酸又は水酸基を有するアミノ酸に置換されているアミノ酸配列において、配列番号１に示すアミノ酸配列に対する前記アミノ酸置換部位を除いた配列同一性が８０％以上であり、且つ、イムノグロブリンに対する結合能を有し、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドと比較してアルカリ安定性が向上しているイムノグロブリン結合ドメイン。
(3-2)配列番号２に示すアミノ酸配列における第７位、第１３位、第２２位、及び第２９位よりなる群から選択される少なくとも２つのアミノ酸が、リジン以外の塩基性アミノ酸又は水酸基を有するアミノ酸に置換されているアミノ酸配列において、配列番号２に示すアミノ酸配列に対する前記アミノ酸置換部位を除いた配列同一性が８０％以上であり、且つ、イムノグロブリンに対する結合能を有し、配列番号２に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドと比較してアルカリ安定性が向上しているイムノグロブリン結合ドメイン。
(3-3)配列番号３に示すアミノ酸配列における第７位、第１３位、第２２位、及び第２９位よりなる群から選択される少なくとも２つのアミノ酸が、リジン以外の塩基性アミノ酸又は水酸基を有するアミノ酸に置換されているアミノ酸配列において、配列番号３に示すアミノ酸配列に対する前記アミノ酸置換部位を除いた配列同一性が８０％以上であり、且つ、イムノグロブリンに対する結合能を有し、配列番号３に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドと比較してアルカリ安定性が向上しているイムノグロブリン結合ドメイン。
(3-4)配列番号４に示すアミノ酸配列における第６位、第１２位、第２１位、及び第２８位よりなる群から選択される少なくとも２つのアミノ酸が、リジン以外の塩基性アミノ酸又は水酸基を有するアミノ酸に置換されているアミノ酸配列において、配列番号４に示すアミノ酸配列に対する前記アミノ酸置換部位を除いた配列同一性が８０％以上であり、且つ、イムノグロブリンに対する結合能を有し、配列番号４に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドと比較してアルカリ安定性が向上しているイムノグロブリン結合ドメイン。
項２．　前記(1-1)～(1-4)、(2-1)～(2-4)、及び(3-1)～(3-4)に示すイムノグロブリン結合ドメインの中から選択される１個のイムノグロブリン結合ドメインが含まれる単ドメイン型ペプチドである、項１に記載のポリペプチド。
項３．　前記　下記(1-1)～(1-4)、(2-1)～(2-4)、及び(3-1)～(3-4)に示すイムノグロブリン結合ドメインから選択される２個以上のイムノグロブリン結合ドメインが連結されてなる複ドメイン型ペプチドである、項１に記載のポリペプチド。
項４．　前記(1-1)、(2-1)、及び(3-1)のイムノグロブリン結合ドメインのいずれか少なくとも１つを含み、
　配列番号１に示すアミノ酸配列における第７位、第１３位、第２２位、及び第２９位の全てが、塩基性アミノ酸又は水酸基を有するアミノ酸に置換されている、項１～３のいずれかに記載のポリペプチド。
項５．　前記(1-1)、(2-1)、及び(3-1)のイムノグロブリン結合ドメインのいずれか少なくとも１つを含み、
　配列番号１に示すアミノ酸配列において、第７位、第１３位、第２２位、及び第２９位よりなる群から選択される部位の少なくとも２個以上が、アルギニン又はトレオニンに置換されている、項１～４のいずれかに記載のポリペプチド。
項６．　前記(1-2)、(2-2)、及び(3-2)のイムノグロブリン結合ドメインのいずれか少なくとも１つを含み、
　配列番号２に示すアミノ酸配列における第７位、第１３位、第２２位、及び第２９位の全てが、塩基性アミノ酸又は水酸基を有するアミノ酸に置換されている、項１～３のいずれかに記載のポリペプチド。
項７．　前記(1-2)、(2-2)、及び(3-2)のイムノグロブリン結合ドメインのいずれか少なくとも１つを含み、
　配列番号２に示すアミノ酸配列において、第７位、第１３位、第２２位、及び第２９位よりなる群から選択される部位の少なくとも２個以上が、アルギニン又はトレオニンに置換されている、項１～３及び６のいずれかに記載のポリペプチド。
項８．　前記(1-3)、(2-3)、及び(3-3)のイムノグロブリン結合ドメインのいずれか少なくとも１つを含み、
　配列番号３に示すアミノ酸配列における第７位、第１３位、第２２位、及び第２９位の全てが、塩基性アミノ酸又は水酸基を有するアミノ酸に置換されている、項１～３のいずれかに記載のポリペプチド。
項９．　前記(1-3)、(2-3)、及び(3-3)のイムノグロブリン結合ドメインのいずれか少なくとも１つを含み、
　配列番号３に示すアミノ酸配列において、第７位、第１３位、第２２位、及び第２９位よりなる群から選択される部位の少なくとも２個以上が、アルギニン又はトレオニンに置換されている、項１～３及び８のいずれかに記載のポリペプチド。
項１０．　前記(1-4)、(2-4)、及び(3-4)のイムノグロブリン結合ドメインのいずれか少なくとも１つを含み、
　配列番号４に示すアミノ酸配列における第６位、第１２位、第２１位、及び第２８位の全てが、塩基性アミノ酸又は水酸基を有するアミノ酸に置換されている、項１～３のいずれかに記載のポリペプチド。
項１１．　前記(1-4)、(2-4)、及び(3-4)のイムノグロブリン結合ドメインのいずれか少なくとも１つを含み、
　配列番号４に示すアミノ酸配列において、第６位、第１２位、第２１位、及び第２８位よりなる群から選択される部位の少なくとも２個以上が、アルギニン又はトレオニンに置換されている、項１～３及び１０のいずれかに記載のポリペプチド。
項１２．　項１～１１のいずれかに記載のポリペプチドをコードしているＤＮＡ。
項１３．　項１２に記載のＤＮＡを含む組換えベクター。
項１４．　項１３に記載の組換えベクターを用いて宿主を形質転換して得られる形質転換体。
項１５．　項１４に記載の形質転換体を培養する工程を含む、項１～１１のいずれかに記載のポリペプチドの製造方法。
項１６．　項１～１１のいずれかに記載のポリペプチドが不溶性担体に固定化されてなる、イムノグロブリン結合用担体。
項１７．　項１６に記載のイムノグロブリン結合用担体を用いて、イムノグロブリン又はそのカッパ鎖を含む断片の分離を行う、イムノグロブリン又はその断片の分離方法。
　本発明のポリペプチドによれば、イムノグロブリン又はそのカッパ鎖を含む断片に対する結合能が高く、アルカリ条件下に晒されても、イムノグロブリン又はそのカッパ鎖を含む断片に対する結合能を維持できるので、アルカリ性溶液による溶出や洗浄を繰り返しても、イムノグロブリン又はそのカッパ鎖を含む断片に対する結合能の低下を抑制でき、イムノグロブリン又はそのカッパ鎖を含む断片の製造コストの低減と効率化を図ることができる。
Peptostreptococcus magunus 3316株由来のプロテインＬのイムノグロブリン結合ドメイン１～４のアミノ酸配列を比較した図である。 Peptostreptococcus magunus 3316株由来のプロテインＬのイムノグロブリン結合ドメイン１～４の三次元構造を模式的に示した図である。
　以下、本発明を詳細に説明する。なお、配列表以外では、アミノ酸配列における２０種類のアミノ酸残基は、一文字略記で表現することがある。即ち、グリシン（Ｇｌｙ）はＧ、アラニン（Ａｌａ）はＡ、バリン（Ｖａｌ）はＶ、ロイシン（Ｌｅｕ）はＬ、イソロイシン（Ｉｌｅ）はＩ、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）はＦ、チロシン（Ｔｙｒ）はＹ、トリプトファン（Ｔｒｐ）はＷ、セリン（Ｓｅｒ）はＳ、トレオニン（Ｔｈｒ）はＴ、システイン（Ｃｙｓ）はＣ、メチオニン（Ｍｅｔ）はＭ、アスパラギン酸（Ａｓｐ）はＤ、グルタミン酸（Ｇｌｕ）はＥ、アスパラギン（Ａｓｎ）はＮ、グルタミン（Ｇｌｎ）はＱ、リジン（Ｌｙｓ）はＫ、アルギニン（Ａｒｇ）はＲ、ヒスチジン（Ｈｉｓ）はＨ、プロリン（Ｐｒｏ）はＰである。
　本明細書において、「非極性アミノ酸」には、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、メチオニン、フェニルアラニン、及びトリプトファンが含まれる。また、「非電荷アミノ酸」には、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、及びグルタミンが含まれる。また、「酸性アミノ酸」には、アスパラギン酸及びグルタミン酸が含まれる。また、「塩基性アミノ酸」には、リジン、アルギニン、及びヒスチジンが含まれる。
１．ポリペプチド
　本発明のポリペプチドの一態様として、下記(1-1)～(1-4)のいずれかに示すイムノグロブリン結合ドメインを少なくとも１つ含むポリペプチドが挙げられる。
(1-1)配列番号１に示すアミノ酸配列において、第７位、第１３位、第２２位、及び第２９位よりなる群から選択される部位の少なくとも２個以上が、リジン以外の塩基性アミノ酸又は水酸基を有するアミノ酸に置換されているアミノ酸配列を含むイムノグロブリン結合ドメイン。
(1-2)配列番号２に示すアミノ酸配列において、第７位、第１３位、第２２位、及び第２９位よりなる群から選択される部位の少なくとも２個以上が、リジン以外の塩基性アミノ酸又は水酸基を有するアミノ酸に置換されているアミノ酸配列を含むイムノグロブリン結合ドメイン。
(1-3)配列番号３に示すアミノ酸配列において、第７位、第１３位、第２２位、及び第２９位よりなる群から選択される部位の少なくとも２個以上が、リジン以外の塩基性アミノ酸又は水酸基を有するアミノ酸に置換されているアミノ酸配列を含むイムノグロブリン結合ドメイン。
(1-4)配列番号４に示すアミノ酸配列において、第６位、第１２位、第２１位、及び第２８位よりなる群から選択される部位の少なくとも２個以上が、リジン以外の塩基性アミノ酸又は水酸基を有するアミノ酸に置換されているアミノ酸配列を含むイムノグロブリン結合ドメイン。
　配列番号１～４に示すアミノ酸配列は、それぞれPeptostreptococcus magunus 3316株由来のプロテインＬ（配列番号５に示すアミノ酸配列、ＤＤＢＪデータベースＩＤ番号Ｑ５１９１８）に含まれる４つのイムノグロブリン結合ドメインの各アミノ酸配列である。具体的には、配列番号１に示すアミノ酸配列は、配列番号５に示すアミノ酸配列における４６８～５３７位の領域に存在するイムノグロブリン結合ドメイン（以下、「イムノグロブリン結合ドメイン４」と表記することもある。）に該当し、配列番号２に示すアミノ酸配列は、配列番号５に示すアミノ酸配列における３９４～４６３位の領域に存在するイムノグロブリン結合ドメイン（以下、「イムノグロブリン結合ドメイン３」と表記することもある。）に該当し、配列番号３に示すアミノ酸配列は、配列番号５に示すアミノ酸配列における３２０～３８９位の領域に存在するイムノグロブリン結合ドメイン（以下、「イムノグロブリン結合ドメイン２」と表記することもある。）に該当し、配列番号４に示すアミノ酸配列は、配列番号５に示すアミノ酸配列における２４９～３１７位の領域に存在するイムノグロブリン結合ドメイン（以下、「イムノグロブリン結合ドメイン１」と表記することもある。）に該当する。
　イムノグロブリン結合ドメイン１～４は、図１に示すように、保存性が高く、相同性が高いアミノ酸配列を有している。
　また、イムノグロブリン結合ドメイン１～４は、図２に示すように、Ｎ末端側から、βシート構造（配列番号１～３に示すアミノ酸配列における第９～１７位；配列番号４に示すアミノ酸配列における第８～１６位）（以下、βシート１又はβ１と表記することもある）、βシート構造（配列番号１～３に示すアミノ酸配列における第２３～３０位；配列番号４に示すアミノ酸配列における第２２～２９位）（以下、βシート２又はβ２と表記することもある）、αへリックス構造（配列番号１～３に示すアミノ酸配列における第３２～５０位；配列番号４に示すアミノ酸配列における第３１～４９位）（以下、αへリックス１又はα１と表記することもある）、βシート構造（配列番号１～３に示すアミノ酸配列における第５３～５８位；配列番号４に示すアミノ酸配列における第５２～５７位）（以下、βシート３又はβ３と表記することもある）、及びβシート構造（配列番号１～３に示すアミノ酸配列における第６３～６８位；配列番号４に示すアミノ酸配列における第６２～６７位）（以下、βシート４又はβ４と表記することもある）が連結した状態になっている。なお、図２は、便宜上、イムノグロブリン結合ドメイン４（配列番号１）が形成する三次元構造を示している。
　配列番号１～３に示すアミノ酸配列における第７位及び配列番号４に示すアミノ酸配列における第６位にあるアミノ酸は、βシート１よりもＮ末端側に存在しており、当該アミノ酸は、三次元構造上、αへリックス１中に存在する特定のアミノ酸（配列番号１～３に示すアミノ酸配列の場合は第３３位のアミノ酸、配列番号４に示すアミノ酸配列の場合は第３２位のアミノ酸）と相互作用し易い場所に位置している。また、配列番号１～３に示すアミノ酸配列における第１３位及び配列番号４に示すアミノ酸配列における第１２位にあるアミノ酸は、βシート１中に存在しており、当該アミノ酸は、三次元構造上、βシート２中に存在する特定のアミノ酸（配列番号１～３に示すアミノ酸配列の場合は第２７位のアミノ酸、配列番号４に示すアミノ酸配列の場合は第２６位のアミノ酸）と相互作用し易い場所に位置している。また、配列番号１～３に示すアミノ酸配列における第２２位及び配列番号４に示すアミノ酸配列における第２１位にあるアミノ酸は、βシート１とβシート２の間のループ領域に存在しており、当該アミノ酸は、三次元構造上、同ループ領域に存在する特定のアミノ酸（配列番号１～３に示すアミノ酸配列の場合は第２０位のアミノ酸、配列番号４に示すアミノ酸配列の場合は第１９位のアミノ酸）と相互作用し易い位置に配されている。更に、配列番号１～３に示すアミノ酸配列における第２９位及び配列番号４に示すアミノ酸配列における第２８位にあるアミノ酸は、βシート２中に存在しており、当該アミノ酸は、三次元構造上、βシート１中に存在する特定のアミノ酸（配列番号１～３に示すアミノ酸配列の場合は第８位及び／又は１１位のアミノ酸、配列番号４に示すアミノ酸配列の場合は第７位及び／又は１０位のアミノ酸）と相互作用し易い位置に配されている。ここでの相互作用は、水素結合や静電的相互作用が考えられる。
　本発明のポリペプチドでは、これらのイムノグロブリン結合ドメインのアミノ酸配列において、特定の４つの部位（配列番号１～３のアミノ酸配列の場合は、第７位、第１３位、第２２位、及び第２９位；配列番号４のアミノ酸配列の場合は、第６位、第１２位、第２１位、及び第２８位）の内２つ以上の部位を特定のアミノ酸に置換することによって、それと相互作用し易い場所に位置している他のアミノ酸との作用によって構造上の安定性が向上し、優れたアルカリ安定性を備えることが可能になっていると考えられる。
　前記(1-1)～(1-3)のイムノグロブリン結合ドメインにおいて、配列番号１～３に示す各アミノ酸配列における第７位、第１３位、第２２位、及び第２９位の内、アミノ酸置換を導入する部位数は２以上であればよいが、アルカリ安定性をより一層向上させるという観点から、好ましくは３以上、更に好ましくは４（即ち、全て）が挙げられる。
　また、前記(1-1)～(1-3)のイムノグロブリン結合ドメインにおいて、配列番号１～３に示す各アミノ酸配列における第７位、第１３位、第２２位、及び第２９位の内、３か所についてアミノ酸置換を導入する場合、アミノ酸置換が導入される部位については、これらの４つの部位から任意に選択すればよいが、アルカリ安定性をより一層向上させるという観点から、好ましくは第１３位、第２２位及び第２９位の３つの部位、第７位、第２２位及び第２９位の３つの部位、又は第７位、第１３位及び第２２位の３つの部位；更に好ましくは第１３位、第２２位及び第２９位の３つの部位、又は第7位、第２２位及び第２９位の３つの部位が挙げられる。
　前記(1-1)～(1-3)のイムノグロブリン結合ドメインでは、配列番号１～３に示す各アミノ酸配列における第７位、第１３位、第２２位、及び第２９位の内、２つ以上の部位に導入されるアミノ酸置換については、リジン以外の塩基性アミノ酸又は水酸基を有するアミノ酸への置換であればよい。置換される塩基性アミノ酸としては、具体的には、アルギニン、ヒスチジン、好ましくはアルギニンが挙げられる。また、置換される水酸基を有するアミノ酸としては、具体的には、トレオニン、セリン、チロシン、好ましくはトレオニンが挙げられる。アルカリ安定性をより一層向上させるという観点から、第７位、第１３位、第２２位、及び第２９位の内、２つ以上の部位に導入されるアミノ酸置換として、アルギニン又はトレオニンへの置換、更に好ましくは、アルギニンへの置換が挙げられる。
　前記(1-1)～(1-3)のイムノグロブリン結合ドメインにおいて、配列番号１～３に示す各アミノ酸配列における第７位、第１３位、第２２位、及び第２９位の内、２つの部位にアミノ酸置換を導入する場合、アミノ酸置換は、２つともリジン以外の塩基性アミノ酸への置換であることが好ましく、２つともアルギニンへの置換であることが更に好ましい。また、前記(1-1)～(1-3)のイムノグロブリン結合ドメインにおいて、配列番号１～３に示す各アミノ酸配列における第７位、第１３位、第２２位、及び第２９位の内、３つの部位にアミノ酸置換を導入する場合、少なくとも２つはリジン以外の塩基性アミノ酸（特に、アルギニン）への置換であることが好ましく、３つともリジン以外の塩基性アミノ酸（特に、アルギニン）への置換であることが更に好ましい。更に、前記(1-1)～(1-3)のイムノグロブリン結合ドメインにおいて、配列番号１～３に示す各アミノ酸配列における第７位、第１３位、第２２位、及び第２９位の内、４つの部位にアミノ酸置換を導入する場合、少なくとも２つはリジン以外の塩基性アミノ酸（特に、アルギニン）への置換であることが好ましく、少なくとも３つはリジン以外の塩基性アミノ酸（特に、アルギニン）への置換であることが更に好ましく、４つともリジン以外の塩基性アミノ酸（特に、アルギニン）への置換であることが特に好ましい。
　前記(1-1)～(1-3)のイムノグロブリン結合ドメインのアミノ酸配列の好適な例として、配列番号１～３における第７位、第１３位、第２２位、及び第２９位の４つの部位がリジン以外の塩基性アミノ酸（特に、アルギニン）に置換されているアミノ酸配列；配列番号１～３における第７位、第２２位、及び第２９位の３つの部位がリジン以外の塩基性アミノ酸（特に、アルギニン）に置換されているアミノ酸配列；配列番号１～３に示す各アミノ酸配列における第７位及び第１３位の２つの部位がリジン以外の塩基性アミノ酸（特に、アルギニン）に置換され、且つ第２２位がリジン以外の塩基性アミノ酸（特に、アルギニン又はヒスチジン）又は水酸基を有するアミノ酸（特に、トレオニン）に置換されているアミノ酸配列が挙げられる。これらの中でも、配列番号１～３に示す各アミノ酸配列における第７位、第１３位、第２２位、及び第２９位の４つの部位がリジン以外の塩基性アミノ酸（特に、アルギニン）に置換されているアミノ酸配列は、卓越したアルカリ安定性を備えており、特に好適である。
　前記(1-4)のイムノグロブリン結合ドメインにおいて、配列番号４に示すアミノ酸配列における、第６位、第１２位、第２１位、及び第２８位の内、アミノ酸置換を導入する部位数は２以上であればよいが、アルカリ安定性をより一層向上させるという観点から、好ましくは３以上、更に好ましくは４（即ち、全て）が挙げられる。
　また、前記(1-4)のイムノグロブリン結合ドメインにおいて、配列番号４に示すアミノ酸配列における第６位、第１２位、第２１位、及び第２８位の内、３か所についてアミノ酸置換を導入する場合、アミノ酸置換が導入される部位については、これらの４つの部位から任意に選択すればよいが、アルカリ安定性をより一層向上させるという観点から、好ましくは第１２位、第２１位及び第２８位の３つの部位、第６位、第２１位及び第２８位の３つの部位、又は第６位、第１２位及び第２１位の３つの部位；更に好ましくは第１２位、第２１位及び第２８位の３つの部位、又は第６位、第２１位及び第２８位の３つの部位が挙げられる。
　前記(1-4)のイムノグロブリン結合ドメインでは、配列番号４に示すアミノ酸配列における第６位、第１２位、第２１位、及び第２８位の内、２つ以上の部位に導入されるアミノ酸置換については、リジン以外の塩基性アミノ酸又は水酸基を有するアミノ酸への置換であればよく、置換される塩基性アミノ酸又は水酸基を有するアミノ酸の具体例、好ましいもの等については、前記(1-1)～(1-3)のイムノグロブリン結合ドメインの場合と同様である。
　前記(1-4)のイムノグロブリン結合ドメインにおいて、配列番号４に示すアミノ酸配列における第６位、第１２位、第２１位、及び第２８位の内、２つの部位にアミノ酸置換を導入する場合、アミノ酸置換は、２つともリジン以外の塩基性アミノ酸への置換であることが好ましく、２つともアルギニンへの置換であることが更に好ましい。また、前記(1-4)のイムノグロブリン結合ドメインにおいて、配列番号４に示すアミノ酸配列における第６位、第１２位、第２１位、及び第２８位の内、３つの部位にアミノ酸置換を導入する場合、少なくとも２つはリジン以外の塩基性アミノ酸（特に、アルギニン）への置換であることが好ましく、３つともリジン以外の塩基性アミノ酸（特に、アルギニン）への置換であることが更に好ましい。更に、前記(1-4)のイムノグロブリン結合ドメインにおいて、配列番号４に示す各アミノ酸配列における第６位、第１２位、第２１位、及び第２８位の内、４つの部位にアミノ酸置換を導入する場合、少なくとも２つはリジン以外の塩基性アミノ酸（特に、アルギニン）への置換であることが好ましく、少なくとも３つはリジン以外の塩基性アミノ酸（特に、アルギニン）への置換であることが更に好ましく、４つともリジン以外の塩基性アミノ酸（特に、アルギニン）への置換であることが特に好ましい。
　前記記(1-4)のイムノグロブリン結合ドメインに含まれるアミノ酸配列の好適な例として、配列番号４に示すアミノ酸配列おける第６位、第１２位、第２１位、及び第２８位の４つの部位がリジン以外の塩基性アミノ酸（特に、アルギニン）に置換されているアミノ酸配列；配列番号４に示すアミノ酸配列における第６位、第１２位、及び第２１位の３つの部位がリジン以外の塩基性アミノ酸（特に、アルギニン）に置換されているアミノ酸配列；配列番号４に示すアミノ酸配列における第６位及び第１２位の２つの部位がリジン以外の塩基性アミノ酸（特に、アルギニン）に置換され、且つ第２１位がリジン以外の塩基性アミノ酸（特に、アルギニン又はヒスチジン）又は水酸基を有するアミノ酸（特に、トレオニン）に置換されているアミノ酸配列が挙げられる。これらの中でも、配列番号４に示すアミノ酸配列における第６位、第１２位、第２１位、及び第２８位の４つの部位がリジン以外の塩基性アミノ酸（特に、アルギニン）に置換されているアミノ酸配列は、卓越したアルカリ安定性を備えており、特に好適である。
　また、本発明のポリペプチドの他の態様として、下記(2-1)～(2-4)及び(3-1)～(3-4)のいずれかに示すイムノグロブリン結合ドメインを少なくとも１つ含むポリペプチドが挙げられる。
(2-1)配列番号１に示すアミノ酸配列における第７位、第１３位、第２２位、及び第２９位よりなる群から選択される少なくとも２つのアミノ酸が、リジン以外の塩基性アミノ酸又は水酸基を有するアミノ酸に置換されているアミノ酸配列において、前記アミノ酸置換部位以外のアミノ酸の１個又は数個が置換、付加、挿入又は欠失されてなり、且つ、イムノグロブリンに対する結合能を有し、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドと比較してアルカリ安定性が向上しているイムノグロブリン結合ドメイン。
(2-2)配列番号２に示すアミノ酸配列における第７位、第１３位、第２２位、及び第２９位よりなる群から選択される少なくとも２つのアミノ酸が、リジン以外の塩基性アミノ酸又は水酸基を有するアミノ酸に置換されているアミノ酸配列において、前記アミノ酸置換部位以外のアミノ酸の１個又は数個が置換、付加、挿入又は欠失されてなり、且つ、イムノグロブリンに対する結合能を有し、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドと比較してアルカリ安定性が向上しているイムノグロブリン結合ドメイン。
(2-3)配列番号３に示すアミノ酸配列における第７位、第１３位、第２２位、及び第２９位よりなる群から選択される少なくとも２つのアミノ酸が、リジン以外の塩基性アミノ酸又は水酸基を有するアミノ酸に置換されているアミノ酸配列において、前記アミノ酸置換部位以外のアミノ酸の１個又は数個が置換、付加、挿入又は欠失されてなり、且つ、イムノグロブリンに対する結合能を有し、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドと比較してアルカリ安定性が向上しているイムノグロブリン結合ドメイン。
(2-4)配列番号４に示すアミノ酸配列における第６位、第１２位、第２１位、及び第２８位よりなる群から選択される少なくとも２つのアミノ酸が、リジン以外の塩基性アミノ酸又は水酸基を有するアミノ酸に置換されているアミノ酸配列において、前記アミノ酸置換部位以外のアミノ酸の１個又は数個が置換、付加、挿入又は欠失されてなり、且つ、イムノグロブリンに対する結合能を有し、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドと比較してアルカリ安定性が向上しているイムノグロブリン結合ドメイン。
(3-1)配列番号１に示すアミノ酸配列における第７位、第１３位、第２２位、及び第２９位よりなる群から選択される少なくとも２つのアミノ酸が、リジン以外の塩基性アミノ酸又は水酸基を有するアミノ酸に置換されているアミノ酸配列において、配列番号１に示すアミノ酸配列に対する前記アミノ酸置換部位を除いた配列同一性が８０％以上であり、且つ、イムノグロブリンに対する結合能を有し、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドと比較してアルカリ安定性が向上しているイムノグロブリン結合ドメイン。
(3-2)配列番号２に示すアミノ酸配列における第７位、第１３位、第２２位、及び第２９位よりなる群から選択される少なくとも２つのアミノ酸が、リジン以外の塩基性アミノ酸又は水酸基を有するアミノ酸に置換されているアミノ酸配列において、配列番号２に示すアミノ酸配列に対する前記アミノ酸置換部位を除いた配列同一性が８０％以上であり、且つ、イムノグロブリンに対する結合能を有し、配列番号２に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドと比較してアルカリ安定性が向上しているイムノグロブリン結合ドメイン。
(3-3)配列番号３に示すアミノ酸配列における第７位、第１３位、第２２位、及び第２９位よりなる群から選択される少なくとも２つのアミノ酸が、リジン以外の塩基性アミノ酸又は水酸基を有するアミノ酸に置換されているアミノ酸配列において、配列番号３に示すアミノ酸配列に対する前記アミノ酸置換部位を除いた配列同一性が８０％以上であり、且つ、イムノグロブリンに対する結合能を有し、配列番号３に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドと比較してアルカリ安定性が向上しているイムノグロブリン結合ドメイン。
(3-4)配列番号４に示すアミノ酸配列における第６位、第１２位、第２１位、及び第２８位よりなる群から選択される少なくとも２つのアミノ酸が、リジン以外の塩基性アミノ酸又は水酸基を有するアミノ酸に置換されているアミノ酸配列において、配列番号４に示すアミノ酸配列に対する前記アミノ酸置換部位を除いた配列同一性が８０％以上であり、且つ、イムノグロブリンに対する結合能を有し、配列番号４に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドと比較してアルカリ安定性が向上しているイムノグロブリン結合ドメイン。
　以下、前記(2-1)～(2-4)及び(3-1)～(3-4)のイムノグロブリン結合ドメインにおいて、配列番号１～３に示す各アミノ酸配列における第７位、第１３位、第２２位、及び第２９位以外のアミノ酸部位、配列番号４に示す各アミノ酸配列における第６位、第１２位、第２１位、及び第２８位以外のアミノ酸部位を、「任意改変部位」と表記することもある。
　前記(2-1)及び(3-1)のイムノグロブリン結合ドメインは、前記(1-1)のイムノグロブリン結合ドメインの改変体であり、配列番号１に示すアミノ酸配列における第７位、第１３位、第２２位、及び第２９位の内、少なくとも２つのアミノ酸に導入されるアミノ酸置換の態様、好ましいアミノ酸置換部位等は、前記(1-1)のイムノグロブリン結合ドメインの場合と同様である。
　前記(2-2)及び(3-2)のイムノグロブリン結合ドメインは、前記(1-2)のイムノグロブリン結合ドメインの改変体であり、配列番号２に示すアミノ酸配列における第７位、第１３位、第２２位、及び第２９位の内、少なくとも２つのアミノ酸に導入されるアミノ酸置換の態様、好ましいアミノ酸置換部位等は、前記(1-2)のイムノグロブリン結合ドメインの場合と同様である。
　前記(2-3)及び(3-3)のイムノグロブリン結合ドメインは、前記(1-3)のイムノグロブリン結合ドメインの改変体であり、配列番号３に示すアミノ酸配列における第７位、第１３位、第２２位、及び第２９位の内、少なくとも２つのアミノ酸に導入されるアミノ酸置換の態様、好ましいアミノ酸置換部位等は、前記(1-3)のイムノグロブリン結合ドメインの場合と同様である。
　前記(2-4)及び(3-4)のイムノグロブリン結合ドメインは、前記(1-4)のイムノグロブリン結合ドメインの改変体であり、配列番号４に示すアミノ酸配列における第６位、第１２位、第２１位、及び第２８位の内、少なくとも２つのアミノ酸に導入されるアミノ酸置換の態様、好ましいアミノ酸置換部位等は、前記(1-4)のイムノグロブリン結合ドメインの場合と同様である。
　前記(2-1)～(2-4)のイムノグロブリン結合ドメインの任意改変部位に導入されるアミノ酸の改変は、置換、付加、挿入、および欠失の中から１種類の改変（例えば置換）のみを含むものであってもよく、２種以上の改変（例えば、置換と挿入）を含んでいても良い。前記(2-1)～(2-4)のイムノグロブリン結合ドメインにおいて、任意改変部位に置換、付加、挿入又は欠失されるアミノ酸は、１個又は複数個若しくは数個であればよく、例えば１～１３個、好ましくは１～６個、１～５個、又は１～４個、更に好ましくは１～３個、特に好ましくは１又は２個或いは１個が挙げられる。
　また、前記(3-1)～(3-4)のイムノグロブリン結合ドメインにおいて、配列番号１～４に示す各アミノ酸配列に対する前記アミノ酸置換部位を除いた配列同一性は、８０％以上であればよいが、好ましくは９０％以上、更に好ましくは９５％以上、特に好ましくは９９％以上が挙げられる。
　ここで、前記(3-1)～(3-4)のイムノグロブリン結合ドメインにおいて、配列番号１～４に示す各アミノ酸配列に対する前記アミノ酸置換部位を除いた配列同一性とは、配列番号１～４に示す各アミノ酸配列から前記任意改変部位のみを抜き出して、当該任意改変部位のみを比較して算出される配列同一性である。また、「配列同一性」とは、ＢＬＡＳＴ　ＰＡＣＫＡＧＥ［ｓｇｉ３２　ｂｉｔ　ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｖｅｒｓｉｏｎ　２．０．１２；ａｖａｉｌａｂｌｅ　ｆｒｏｍ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）］のｂｌ２ｓｅｑ　ｐｒｏｇｒａｍ（Ｔａｔｉａｎａ　Ａ．Ｔａｔｓｕｓｏｖａ，Ｔｈｏｍａｓ　Ｌ．Ｍａｄｄｅｎ，ＦＥＭＳ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．，Ｖｏｌ．１７４，ｐ２４７－２５０，１９９９）により得られるアミノ酸配列の同一性の値を示す。パラメーターは、Ｇａｐ　ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ　Ｃｏｓｔ　ｖａｌｕｅ：１１、Ｇａｐ　ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ　Ｃｏｓｔ　ｖａｌｕｅ：１に設定すればよい。
　前記(2-1)～(2-3)及び(3-1)～(3-3)のイムノグロブリン結合ドメインにおいて、配列番号１～３に示す各アミノ酸配列における第８位、第１１位、第２０位、第２７位、及び第３３位のアミノ酸は、前記アミノ酸置換部位に配されるリジン以外の塩基性アミノ酸又は水酸基を有するアミノ酸との相互作用によって、アルカリ安定性の向上に寄与していると考えられることから、これらの部位には置換又は欠失を導入しないことが望ましい。また、前記(2-4)及び(3-4)のイムノグロブリン結合ドメインについても、同様に、配列番号４に示す各アミノ酸配列における第７位、第１０位、第１９位、第２６位、及び第３２位のアミノ酸は、前記アミノ酸置換部位に配されるリジン以外の塩基性アミノ酸又は水酸基を有するアミノ酸との相互作用によって、アルカリ安定性の向上に寄与していると考えられることから、これらの部位には置換又は欠失を導入しないことが望ましい。
　前記(2-1)～(2-3)及び(3-1)～(3-3)のイムノグロブリン結合ドメインの任意改変部位に導入されるアミノ酸置換の具体的態様として、配列番号１～３に示す各アミノ酸配列における第２位のアミノ酸がリジンに置換、第４８位のアミノ酸がアルギニンに置換、第６７位のアミノ酸がアルギニンに置換等が挙げられる。また、前記(2-4)及び(3-4)のイムノグロブリン結合ドメインについても、同様に、任意改変部位に導入されるアミノ酸置換の具体的態様として、配列番号４に示すアミノ酸配列における第２位のアミノ酸がリジンに置換、第４７位のアミノ酸がアルギニンに置換、第６６位のアミノ酸がアルギニンに置換等が挙げられる。
　また、前記(2-1)～(2-4)及び(3-1)～(3-4)のイムノグロブリン結合ドメインの任意改変部位に導入されるアミノ酸置換の他の態様として、保存的置換が挙げられる。即ち、前記任意改変部位における置換としては、例えば、置換前のアミノ酸が非極性アミノ酸であれば他の非極性アミノ酸への置換、置換前のアミノ酸が非荷電性アミノ酸であれば他の非荷電性アミノ酸への置換、置換前のアミノ酸が酸性アミノ酸であれば他の酸性アミノ酸への置換、及び置換前のアミノ酸が塩基性アミノ酸であれば他の塩基性アミノ酸への置換が挙げられる。
　前記(2-1)のイムノグロブリン結合ドメインにおいて、「イムノグロブリンに対する結合能を有し、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドと比較してアルカリ安定性が向上している」とは、イムノグロブリンのカッパ鎖に対する結合能があり、且つポリペプチドをアガロースゲル担体に固定した状態で、下記条件で測定した残存活性が、同条件で測定した配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドの残存活性よりも高いことを意味する。より具体的には、下記条件で測定したポリペプチドの残存活性が、同条件で測定した配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドの残存活性に比べて１．８％以上、好ましくは８％以上、更に好ましくは１８％以上高いことを意味する。なお、前記(2-2)～(2-4)及び(3-1)～(3-4)のイムノグロブリン結合ドメインでも、同様である。
（測定条件）
　アガロースゲル担体に固定化したポリペプチドに対して、０．１Ｍ ＮａＯＨ水溶液で３回洗浄して同アルカリ溶液に置換した後に２５℃にて１７時間保温する（アルカリ処理）。次いで、ＰＢＳで３回洗浄した後に、ヒトＩｇＧの結合量（ｍｇ/ｍｌゲル）を測定する。アルカリ処理しなかった場合についても、アガロースゲル担体に固定化したポリペプチドのヒトＩｇＧの結合量（ｍｇ/ｍｌゲル）を測定する。アルカリ処理しなかった場合のポリペプチドのヒトＩｇＧの結合量を１００％として、アルカリ処理後のポリペプチドのヒトＩｇＧの結合量の割合を残存活性（％）として算出する。
　前記(1-1)～(1-4)、(2-1)～(2-4)及び(3-1)～(3-4)のイムノグロブリン結合ドメインの中でも、前記(1-1)、(2-1)及び(3-1)のイムノグロブリン結合ドメインは、イムノグロブリンに対する結合能、及びアルカリ安定性が格段に優れており、本発明のポリペプチドに含まれるイムノグロブリン結合ドメインとして特に好適である。
　本発明のポリペプチドは、イムノグロブリン結合ドメインを１個有する単ドメイン型ポリペプチドであってもよく、またイムノグロブリン結合ドメインを２個以上連結した複ドメイン型ポリペプチドであってもよい。本発明のポリペプチドが複ドメイン型ポリペプチドである場合には、イムノグロブリンのカッパ鎖含有断片の結合能が高くなるという利点がある。
　本発明のポリペプチドが単ドメイン型ポリペプチドである場合には、前記(1-1)～(1-4)、(2-1)～(2-4)及び(3-1)～(3-4)のイムノグロブリン結合ドメインの内の１個のドメインが含まれていればよい。
　また、本発明のポリペプチドが複ドメイン型ポリペプチドである場合には、前記(1-1)～(1-4)、(2-1)～(2-4)及び(3-1)～(3-4)のイムノグロブリン結合ドメインの内、少なくとも１個のドメインが含まれていればよく、前記(1-1)～(1-4)、(2-1)～(2-4)及び(3-1)～(3-4)のイムノグロブリン結合ドメインの内、２個以上のドメインからなるものであってもよく、また、前記(1-1)～(1-4)、(2-1)～(2-4)及び(3-1)～(3-4)のイムノグロブリン結合ドメインの内、１個以上のドメインと、プロテインＬを構成している野生型の各イムノグロブリン結合ドメイン（配列番号１～４に示すアミノ酸配列）やプロテインＡを構成している各イムノグロブリン結合ドメインが１個以上含まれているものであってもよい。本発明のポリペプチドが複ドメイン型ポリペプチドである場合、より一層優れたアルカリ安定性を備えさせるという観点から、構成するイムノグロブリン結合ドメインの全てが、前記(1-1)～(1-4)、(2-1)～(2-4)及び(3-1)～(3-4)のイムノグロブリン結合ドメインのいずれかであるものが好ましい。
　本発明のポリペプチドを複ドメイン型ポリペプチドにする場合、連結されているイムノグロブリン結合ドメインの総数については、２個以上であればよいが、好ましくは２～１０個、更に好ましくは２～６個が挙げられる。
　本発明のポリペプチドを複ドメイン型ポリペプチドにする場合、構成する各イムノグロブリン結合ドメインは、それぞれのＣ末端とＮ末端が直接連結されていてもよく、また各各イムノグロブリン結合ドメイン間が１～４０個、好ましくは１～１０個のアミノ酸残基を介して連結されていてもよい。
　また、本発明のポリペプチドは、担体への結合性の付与、ポリペプチドの発現の向上、精製の容易性の付与等のために、他の機能を有するポリペプチド、ペプチドタグ等がＮ末端側又はＣ末端側に付加されていてもよい。このような目的で、本発明のポリペプチドのＮ末端側及び／又はＣ末端側に付加されるアミノ酸の数については、特に制限されないが、例えば１～４００個、好ましくは１～１００個、更に好ましくは１～３０個が挙げられる。
２．ＤＮＡ
　本発明のポリペプチドをコードしているＤＮＡ（以下、「本発明のＤＮＡ」と表記することもある）は、例えば、野生型のプロテインＬ（配列番号５）をコードしているＤＮＡを鋳型として、目的のイムノグロブリン結合ドメインをコードしているＤＮＡをＰＣＲ等によって取得し、当該ＤＮＡに前記アミノ酸置換が導入されるように変異を導入することにより得ることができる。また、本発明のＤＮＡは、遺伝子の合成法によって人工合成することもできる。
　ここで、Peptostreptococcus magunus 3316株由来の野生型のプロテインＬ（配列番号５）をコードしているＤＮＡは、例えば、配列番号６に示す塩基配列として知られており、Peptostreptococcus magunus3316株からＰＣＲを用いた定法により単離することができる。また、Peptostreptococcus magunus 3316株由来の野生型のプロテインＬをコードしているＤＮＡは、遺伝子の合成法によって人工合成することもできる。
　塩基配列の特定の部位に特定の変異を導入する方法は公知であり、例えばＤＮＡの部位特異的変異導入法等が利用できる。ＤＮＡ中の塩基を変換する具体的な方法としては、例えば、市販のキットを用いて行うこともできる。
　塩基配列に変異を導入したＤＮＡは、ＤＮＡシーケンサーを用いて塩基配列を確認することができる。一旦、塩基配列が確定されると、その後は化学合成、クローニングされたプローブを鋳型としたＰＣＲ、又は当該塩基配列を有するＤＮＡ断片をプローブとするハイブリダイゼーションによって、前記ポリペプチドをコードするＤＮＡを得ることができる。
　また、部位特異的突然変異誘発法等によって前記ペプチドをコードするＤＮＡの変異型であって変異前と同等の機能を有するものを合成することができる。なお、前記ペプチドをコードするＤＮＡに変異を導入するには、Ｋｕｎｋｅｌ法、Ｇａｐｐｅｄ　ｄｕｐｌｅｘ法、メガプライマーＰＣＲ法等の公知の手法によって行うことができる。
　本発明のＤＮＡの一例として、配列番号７に示す塩基配列が挙げられる。配列番号７に示す塩基配列からなるＤＮＡは、配列番号１に示すアミノ酸配列における第７位、第１３位、第２２位及び第２９位がアルギニンに置換されたアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードしているＤＮＡである。
　また、本発明のＤＮＡには、イムノグロブリンに対する結合能を有し、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドと比較してアルカリ安定性が向上しているイムノグロブリン結合ドメインをコードし、且つ、配列番号７に示す塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列を含むＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡが包含される。
　ここで、「ストリンジェントな条件下」とは、０．５％ＳＤＳ、５×デンハルツ〔Ｄｅｎｈａｒｔｚ’ｓ、０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、０．１％ポリビニルピロリドン、０．１％フィコール４００〕および１００μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡを含む６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣは、０．１５Ｍ　ＮａＣｌ、０．０１５Ｍ　クエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）中で、５０℃～６５℃で４時間～一晩保温する条件をいう。
　ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーションは、具体的には、以下の手法によって行われる。即ち、ＤＮＡライブラリー又はｃＤＮＡライブラリーを固定化したナイロン膜を作成し、６×ＳＳＣ、０．５％ ＳＤＳ、５×デンハルツ、１００μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡを含むプレハイブリダイゼーション溶液中、６５℃でナイロン膜をブロッキングする。その後、32Ｐでラベルした各プローブを加えて、６５℃で一晩保温する。このナイロン膜を６×ＳＳＣ中、室温で１０分間、０．１％ＳＤＳを含む２×ＳＳＣ中、室温で１０分間、０．１％ＳＤＳを含む０．２×ＳＳＣ中、４５℃で３０分間洗浄した後、オートラジオグラフィーをとり、プローブと特異的にハイブリダイズしているＤＮＡを検出することができる。
　更に、本発明のＤＮＡには、イムノグロブリンに対する結合能を有し、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドと比較してアルカリ安定性が向上しているイムノグロブリン結合ドメインをコードし、且つ配列番号７に示す塩基配列からなるＤＮＡに８０％以上の相同性を有するＤＮＡも包含される。当該相同性として、好ましくは９０％以上、更に好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上が挙げられる。
　ここで、ＤＮＡの「相同性」とは、ＢＬＡＳＴ　ＰＡＣＫＡＧＥ［ｓｇｉ３２　ｂｉｔ　ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｖｅｒｓｉｏｎ　２．０．１２；ａｖａｉｌａｂｌｅ　ｆｒｏｍ　ｔｈｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）］のｂｌ２ｓｅｑ　ｐｒｏｇｒａｍ（Ｔａｔｉａｎａ　Ａ．　Ｔａｔｓｕｓｏｖａ，Ｔｈｏｍａｓ　Ｌ．Ｍａｄｄｅｎ，ＦＥＭＳ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．，Ｖｏｌ．１７４，２４７－２５０，１９９９）により得られる同一性の値を示す。パラメーターは、Ｇａｐ　ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ　Ｃｏｓｔ　ｖａｌｕｅ：１１、Ｇａｐ　ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ　Ｃｏｓｔ　ｖａｌｕｅ：１に設定すればよい。
　本発明のＤＮＡは、コドン利用頻度を宿主に最適化したものが好ましい。例えば、宿主として大腸菌を使用する場合であれば、コドン利用頻度を大腸菌に最適化させたＤＮＡが好適である。
３．組換えベクター
　本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡを含む組換えベクター（以下、「本発明の組換えベクター」と表記することもある）は、発現ベクターに本発明のＤＮＡを挿入することにより得ることができる。
　本発明の組換えベクターには、本発明のＤＮＡに作動可能に連結されたプロモーター等の制御因子が含まれる。制御因子としては、代表的にはプロモーターが挙げられるが、更に必要に応じてエンハンサー、ＣＣＡＡＴボックス、ＴＡＴＡボックス、ＳＰＩ部位等の転写要素が含まれていてもよい。また、作動可能に連結とは、本発明のＤＮＡを調節するプロモーター、エンハンサー等の種々の制御因子と本発明のＤＮＡが、宿主細胞中で作動し得る状態で連結されることをいう。
　発現ベクターとしては、宿主内で自律的に増殖し得るファージ、プラスミド、又はウイルスから遺伝子組換え用として構築されたものが好適である。このような発現ベクターは公知であり、例えば、商業的に入手可能な発現ベクターとしては、ｐＱＥ系ベクター（株式会社キアゲン）、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ２Ｔ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社）、ｐＥＴ系ベクター（メルク株式会社）等が挙げられる。発現ベクターは、宿主細胞との適切な組み合わせを選んで使用すればよく、例えば、大腸菌を宿主細胞とする場合には、ｐＥＴ系ベクターとＢＬ２１（ＤＥ３）大腸菌株の組み合わせ、又はｐＤＲ５４０ベクターとＪＭ１０９大腸菌株の組み合わせなどが好ましく挙げられる。
４．形質転換体
　本発明の組換えベクターを用いて宿主を形質転換することによって形質転換体（以下、「本発明の形質転換体」と表記することもある）が得られる。
　形質転換体の製造に使用される宿主としては、組換えベクターが安定であり、且つ自律増殖可能で外来性遺伝子の形質を発現できるのであれば特に制限されないが、例えば、大腸菌（Escherichia coli）等のエッシェリヒア属、バチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）等のバチルス属、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）等のシュードモナス属等に属する細菌；酵母等が好適な例として挙げられるが、その他、動物細胞、昆虫細胞、植物等であってもよい。これらの中でも大腸菌が特に好ましい。
　本発明の形質転換体は、宿主に本発明の組換えベクターを導入することによって得ることができ、宿主に組換えベクターを導入する条件は、宿主の種類等に応じて適宜設定すればよい。宿主が細菌の場合であれば、例えば、カルシウムイオン処理によるコンピテントセルを用いる方法及びエレクトロポレーション法等が挙げられる。宿主が酵母の場合であれば、例えば、電気穿孔法（エレクトロポレーション法）、スフェロプラスト法及び酢酸リチウム法等が挙げられる。宿主が動物細胞の場合であれば、例えば、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法及びリポフェクション法等が挙げられる。宿主が昆虫細胞の場合であれば、例えば、リン酸カルシウム法、リポフェクション法及びエレクトロポレーション法等が挙げられる。宿主が植物の場合であれば、例えば、エレクトロポレーション法、アグロバクテリウム法、パーティクルガン法及びＰＥＧ法等が挙げられる。
５．ポリペプチドの製造
　本発明のポリペプチドは、前記形質転換体を培養することによって製造することができる。
　形質転換体の培養条件は、宿主の栄養生理的性質を考慮して適宜設定すればよいが、好ましくは液体培養が挙げられる。また、工業的製造を行う場合であれば、通気攪拌培養が好ましい。
　本発明の形質転換体を培養し、培養液を遠心分離等の方法により培養上清又は菌体を回収する。本発明のポリペプチドが菌体内に蓄積されている場合であれば、菌体を超音波、フレンチプレス等の機械的方法又はリゾチーム等の溶菌酵素により処理を施し、必要に応じてプロテアーゼ等の酵素やドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）等の界面活性剤を使用することにより可溶化し、本発明のポリペプチドを含む水溶性画分を得ることができる。
　また、適当な発現ベクターと宿主を選択することにより、発現した本発明のポリペプチドを培養液中に分泌させることもできる。
　上記のようにして得られた本発明のポリペプチドを含む培養液又は水溶性画分は、そのまま精製処理に供してもよいが、当該培養液又は水溶性画分中の本発明のポリペプチドを濃縮した後に精製処理に供してもよい。
　濃縮は、例えば、減圧濃縮、膜濃縮、塩析処理、親水性有機溶媒（例えば、メタノール、エタノールおよびアセトン）による分別沈殿法等により行うことができる。
　本発明のポリペプチドの精製処理は、例えば、ゲルろ過、疎水性クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等の方法を適宜組み合わせることによって行うことができる。
　このようにして精製された本発明のポリペプチは、必要に応じて、凍結乾燥、真空乾燥、スプレードライ等により粉末化してもよい。
６．イムノグロブリン結合担体
　本発明のポリペプチドは、イムノグロブリンの回収や精製を簡便に行うために、不溶性担体に固定化され、イムノグロブリン結合担体として使用される。本発明のポリペプチドの固定化に使用される不溶性担体としては、特に制限されないが、例えば、キトサン、デキストラン、セルロース、アガロースなどの天然由来の高分子材料；ビニルアルコール、ポリイミド、メタクリレートなどの合成有機材料；ガラス、シリカ等の無機材料等が挙げられる。
　不溶性担体の形状については、特に制限されず、中空糸膜状、モノリス状、ビーズ状等のいずれの形状のものであってもよい。これらの形状の中でも、ビーズ状は、一般的に、体積当たりの表面積が比較的大きく、イムノグロブリン結合能の高いアフィニティー担体の製造に適しているので、好適である。
　本発明のポリペプチドを不溶性担体に固定化するには、例えば、本発明のポリペプチド中のアミノ基、カルボキシル基、又はチオール基を不溶性担体とカップリング反応させればよい。具体的には、不溶性担体に対して、シアノゲンブロミド、エピクロロヒドリン、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド、トシルクロリド、トレシルクロリド、カルボジイミド、グルタルアルデヒド、ヒドラジン等のカップリング剤と反応させて活性化したり、或は担体にカルボキシル基やチオール基等の反応性官能基を導入したりした後に、本発明のポリペプチドとカップリング反応を行う固定化方法が挙げられる。このようなカップリング反応は、当該技術分野において周知であり（例えば、Ｊａｎｓｏｎ, Ｊ.-Ｃ., 編集［Ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ］、第３版、２２１－２５８頁、ＩＳＢＮ ９７８－０－４７１－７４６６１－４）、慣用されている方法に従って行うことができる。
　また、本発明のポリペプチド中のアミノ基を介して不溶性担体に固定化する場合であれば、アミノ基と反応して共有結合を形成できる反応性官能基（トレシル基、エポキシ基、カルボキシル基、ホルミル基等）を有する担体を用いることが望ましい。このような不溶性担体としては、トヨパールＡＦ－トレシル－６５０、トヨパールＡＦ－エポキシ－６５０、トヨパールＡＦ－カルボキシ－６５０、トヨパールＡＦ－ホルミル－６５０（以上、東ソー株式会社）、ＮＨＳ活性化セファロース、臭化シアン活性化セファロース、エポキシ活性化セファロース（以上、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社）、プロフィニティエポキシド（バイオラッド株式会社）、グリオキサール－アガロース（アガロースビーズテクノロジーズ株式会社）、セルファインホルミル（ＪＮＣ株式会社）等として市販されており、これらの市販品を使用することができる。
　更に、本発明のポリペプチドと不溶性担体が共存する系に、カルボジイミドやグルタルアルデヒド等の縮合又は架橋試薬を加えることによって、本発明のポリペプチドを不溶性担体に固定化することもできる。
７．イムノグロブリン又はその断片の分離方法
　本発明のポリペプチドは、イムノグロブリンのカッパ鎖に結合するので、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ等のイムノグロブリン、及びこれらのカッパ鎖含有断片（Ｆａｂ断片等）等の分離に使用できる。
　本発明のポリペプチドを用いてイムノグロブリン又はその断片を分離するには、本発明のポリペプチドを固定化した不溶性担体を使用すればよい。具体的には、本発明のポリペプチドを固定化した不溶性担体を用いたイムノグロブリンの分離は、アフィニティーカラム・クロマトグラフィー法によって行うことができる。
　アフィニティーカラム・クロマトグラフィー法によってイムノグロブリンを分離するには、本発明のポリペプチドを固定化した不溶性担体を充填したカラムに、イムノグロブリン又はその断片を含む溶液を通液させた後に、カラム内部を洗浄し、次いで、適切なｐＨに調整した溶出液をカラムに通液することによって、イムノグロブリンを溶出させればよい。
　以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定して解釈されるものではない。
参考例１：ペプトストレプトコッカスマグナス由来プロテインＬのイムノグロブリン結合ドメインタンパク質の製造と結合活性及びアルカリ安定性の評価
［各イムノグロブリン結合ドメインの製造］
［設計と改変体の構築］
　イムノグロブリン結合ドメイン１を含むキメラタンパク質をＰＬ－０２１、イムノグロブリン結合ドメイン２を含むキメラタンパク質をＰＬ－０２２、イムノグロブリン結合ドメイン３を含むキメラタンパク質をＰＬ－０２３、及びイムノグロブリン結合ドメイン４を含むキメラタンパク質をＰＬ－０１４と命名した。
［ＰＬ－０１４の発現プラスミド作成］
　まず互いの３’末端側の約１５塩基が相補的な合成オリゴＤＮＡ oligo-166（配列番号８）及びoligo-167（配列番号９）を互いの鋳型にしたPCRにより、ＤＮＡフラグメントA1（イムノグロブリンカッパ軽鎖結合ドメイン４の前半部分）を作成した。同様にして合成オリゴＤＮＡ oligo-168（配列番号１０）及びoligo-169（配列番号１１）を用いたPCRにより、ＤＮＡフラグメントA2（イムノグロブリンカッパ軽鎖結合ドメイン４の後半部分）を作成した。次に、ＤＮＡフラグメントA1及びＤＮＡフラグメントA2を制限酵素ＥｃｏＲＩで切断し、ライゲーション反応により互いに連結してＤＮＡフラグメントA3を得た。次いで、ＤＮＡフラグメントA3を鋳型とし、ＮｄｅＩ認識配列を持つ翻訳開始コドンと人工Ｎ末端配列「ＭＡＱＨＤＥＡＧＬＡＬ」（配列番号１２）をコードする配列を含んだ合成オリゴＤＮＡ oligo-178（配列番号１３）をフォワードプライマー、人工配列「ＮＩＫＦＡＧＡＬ」をコードする配列内にＥｃｏＯ１０９Ｉ認識配列を含んだ合成オリゴＤＮＡ oligo-170（配列番号１４）をリバースプライマーとしたPCRにより、ＤＮＡフラグメントA4を作成した。また別に、人工配列「ＦＡＧＡＬＰＳＫＳ」をコードする配列内にＥｃｏＯ１０９Ｉ認識配列を含んだ合成オリゴＤＮＡ oligo-189（配列番号１５）をフォワードプライマー、人工Ｃ末端配列「ＡＱＡＰＫＫＫＫ」をコードする配列内に続いて翻訳終止コドンとＢａｍＨＩ認識配列を含んだ合成オリゴＤＮＡ oligo-191（配列番号１６）をリバースプライマーとして用い、特許文献１に示されている改変プロテインＡ由来イムノグロブリンＦｃ結合Ｃドメインの第３αへリックス部分配列（８個のリジンを含む２１残基のαへリックス部分配列；配列番号１７）とそれに続く３残基のリジンからなる配列（配列番号１８）をコードするＤＮＡフラグメント5を作成した。ＤＮＡフラグメントA4をＮｄｅＩ及びＥｃｏＯ１０９Ｉにて切断し、ＤＮＡフラグメント5をＥｃｏＯ１０９Ｉ及びＢａｍＨＩにて切断して、一度にｐＥＴ－９ａプラスミド（ノバジェン、メルク株式会社）上のＮｄｅＩ－ＢａｍＨＩ部分に組み込むことにより、Ｎ末端側から、人工Ｎ末端配列１１残基（配列番号１２）、プロテインＬのイムノグロブリンカッパ軽鎖結合ドメイン４の７０残基（配列番号１）、アラニン－ロイシンからなる連結配列２残基、プロテインＡ由来イムノグロブリンＦｃ結合Ｃドメイン第３αへリックスの改変Ｃ末端配列２１残基（配列番号１７）、及び人工Ｃ末端配列３残基（配列番号１８）がこの順で連結されたキメラタンパク質ＰＬ－０１４の発現プラスミドを得た。
［ＰＬ－０２１の発現プラスミド作成］
　ＰＬ－０１４の発現プラスミド作成と同様に、まず互いの３’末端側の約１５塩基が相補的な合成オリゴＤＮＡ oligo-193（配列番号１９）及びoligo-194（配列番号２０）を互いの鋳型にしたPCRにより、ＤＮＡフラグメントB１を作成した。同様にして合成オリゴＤＮＡ oligo-195（配列番号２１）及びoligo-196（配列番号２２）を用いたPCRにより、ＤＮＡフラグメントB2を作成した。次にＤＮＡフラグメントB１及びＤＮＡフラグメントB2を鋳型とし、合成オリゴＤＮＡ oligo-178（配列番号１３）及びoligo-196（配列番号２１）をプライマーとしたPCRによりＤＮＡフラグメントB3を得た。ＤＮＡフラグメントB3をＮｄｅＩ及びＥｃｏＯ１０９Ｉにて切断し、ＥｃｏＯ１０９Ｉ及びＢａｍＨＩにて切断したＤＮＡフラグメント5とともに一度にｐＥＴ－９ａプラスミド上のＮｄｅＩ－ＢａｍＨＩ部分に組み込むことにより、Ｎ末端側から、人工Ｎ末端配列１１残基（配列番号１２）、プロテインＬのイムノグロブリンカッパ軽鎖結合ドメイン１の６９残基（配列番号４）、アラニン－ロイシンからなる連結配列２残基、プロテインＡ由来イムノグロブリンＦｃ結合Ｃドメイン第３αへリックスの改変Ｃ末端配列２１残基（配列番号１７）、及び人工Ｃ末端配列３残基（配列番号１８）がこの順で連結されたキメラタンパク質ＰＬ－０２１の発現プラスミドを得た。
［ＰＬ－０２２の発現プラスミド作成］
　プロテインＬのイムノグロブリンカッパ軽鎖結合ドメイン２はドメイン４とＮ末端から37残基が同一配列であるので、先に作成したＤＮＡフラグメントA１をそのまま使用した。また互いの３’末端側の約１５塩基が相補的な合成オリゴＤＮＡ oligo-199（配列番号２３）及びoligo-201（配列番号２４）を互いの鋳型にしたPCRにより、ＤＮＡフラグメントC2を作成した。次にＤＮＡフラグメントA１及びフラグメントC2を制限酵素ＥｃｏＲＩで切断し、ライゲーション反応により互いに連結してＤＮＡフラグメントC3を得た。ＰＬ－０１４の発現プラスミドを鋳型として、合成オリゴＤＮＡ oligo-200（配列番号２５）及びoligo-191（配列番号１６）をプライマーとしたPCRにより、ＤＮＡフラグメントC4を作成した。ＤＮＡフラグメントC3及びＤＮＡフラグメントC4は部分的に重複する配列を持つように設計されており、これらを鋳型として合成オリゴＤＮＡ oligo-178（配列番号１３）及びoligo-191（配列番号１６）をプライマーとしたPCRにより、ＰＬ－０２２をコードするｃＤＮＡが得られた。このｃＤＮＡをＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩにて切断し、ｐＥＴ－９ａプラスミド上のＮｄｅＩ－ＢａｍＨＩ部分に組み込むことにより、Ｎ末端側から、人工Ｎ末端配列１１残基（配列番号１２）、プロテインＬのイムノグロブリンカッパ軽鎖結合ドメイン２の７０残基（配列番号３）、アラニン－ロイシンからなる連結配列２残基、プロテインＡ由来イムノグロブリンＦｃ結合Ｃドメイン第３αへリックスの改変Ｃ末端配列２１残基（配列番号１７）、及び人工Ｃ末端配列３残基（配列番号１８）がこの順で連結されたキメラタンパク質ＰＬ－０２２の発現プラスミドを得た。
［ＰＬ－０２３の発現プラスミド作成］
　ＰＬ－０１４の発現プラスミドを鋳型とし、合成オリゴＤＮＡ oligo-197（配列番号２６）及びoligo-198（配列番号２７）をプライマーとしたPCRによりＤＮＡフラグメントD1を作成した。また互いの３’末端側の約１５塩基が相補的な合成オリゴＤＮＡ oligo-199（配列番号２３）及びoligo-202（配列番号２８）を互いの鋳型にしたPCRにより、ＤＮＡフラグメントD2を作成した。次にＤＮＡフラグメントD1及びＤＮＡフラグメントD2を鋳型とし、合成オリゴＤＮＡ oligo-197（配列番号２６）及びoligo-202（配列番号２８）をプライマーとしたPCRによりＤＮＡフラグメントD3を作成した。プロテインＬのイムノグロブリンカッパ軽鎖結合ドメイン3はＣ末端側から26残基がドメイン2と同一配列であるので、先に作成したＤＮＡフラグメントC4をそのまま使用し、ＤＮＡフラグメントD3及びＤＮＡフラグメントC4を鋳型として合成オリゴＤＮＡ oligo-178（配列番号１３）及びoligo-191（配列番号１６）をプライマーとしたPCRにより、ＰＬ－０２３をコードするｃＤＮＡが得られた。このｃＤＮＡをＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩにて切断し、ｐＥＴ－９ａプラスミド上のＮｄｅＩ－ＢａｍＨＩ部分に組み込むことにより、Ｎ末端側から、人工Ｎ末端配列１１残基（配列番号１２）、プロテインＬのイムノグロブリンカッパ軽鎖結合ドメイン３の７０残基（配列番号２）、アラニン－ロイシンからなる連結配列２残基、プロテインＡ由来イムノグロブリンＦｃ結合Ｃドメイン第３αへリックスの改変Ｃ末端配列２１残基（配列番号１７）、及び人工Ｃ末端配列３残基（配列番号１８）がこの順で連結されたキメラタンパク質ＰＬ－０２３の発現プラスミドを得た。
　以上のようにして得た各イムノグロブリン結合ドメインの発現プラスミドの核酸配列を、ＣＥＱ８０００型ＤＮＡシークエンサー（ベックマンコールター株式会社）を用いて解析し、設計どおりの配列であることを確認した。次に各発現プラスミドにてＢＬ２１（ＤＥ３）コンピーテントセル（メルク株式会社）を形質転換することで、各タンパク質の発現株を得た。
　それぞれのイムノグロブリン結合ドメインの発現大腸菌株を、２５ｍｇ／Ｌのカナマイシン及び２．０％グルコースを含むＬＢ培地にて１２時間種培養した。得られた種培養液を、２５ｍｇ／Ｌのカナマイシン及び０．８％グルコースを含む２×ＴＹ培地に接種し、３７℃にて１６時間培養して目的とするイムノグロブリン結合ドメインを発現させた後、遠心分離によって大腸菌を回収した。次に、回収した大腸菌を５０ｍＭ　リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）に懸濁し、超音波処理して大腸菌を破砕し、更に遠心分離によって目的のイムノグロブリン結合ドメインを上清に回収した。得られた各上清を菌体抽出液としてドデシル硫酸ナトリウム－１５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）に供したところ、各分子量の位置に目的のイムノグロブリン結合ドメインが生産されていることが確認できた。
［各イムノグロブリン結合ドメインの精製と純度検定］
　各イムノグロブリン結合ドメインの菌体抽出液をｐＨ６．０に調整したのちに、陽イオン交換体ＳＰ－セファロースファストフロー（ＧＥヘルスケア株式会社）カラムにアプライした。２０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ６．０）にて洗浄後、０．５Ｍ ＮａＣｌの直線的濃度勾配によりカラムからタンパク質を溶出した。溶出液をＳＤＳ－ＰＡＧＥにて確認したところ、目的となるイムノグロブリン結合ドメインは０．１から０．２Ｍ ＮａＣｌ間に溶出していた。次に、イムノグロブリン結合ドメインを含む同溶出液のｐＨを９に調整した後に陰イオン交換体ギガキャップＱ（東ソー株式会社）カラムに添加した。２０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．８）にて洗浄後、０．３Ｍ ＮａＣｌ直線的濃度勾配にてイムノグロブリン結合ドメインを分離溶出した。各溶出液をＳＤＳ－ＰＡＧＥに供して純度を確認した結果、各イムノグロブリン結合ドメインは理論値の分子量の位置に単一バンドとして精製されていることを確認した。
［ゲル担体への固定化とイムノグロブリン結合活性測定による評価］
　精製した各イムノグロブリン結合ドメインを、ホルミル活性化アガロースゲル担体に１０ｍｇ／ｍＬゲルの濃度で常法に従って、それぞれ固定化した。固定化後の反応溶液を回収し、固定化率を測定したところ、すべての各イムノグロブリン結合ドメインにおいて固定化効率が９０％以上であった。更に固定化反応後のゲル担体をＰＢＳ溶液で洗浄後、４０ｍｇ／ｍＬのヒトＩｇＧ（化学及血清療法研究所より入手）を含むＰＢＳ溶液を加えて1時間振とうした後に、ＰＢＳで洗浄したゲル担体から０．１Ｍ　グリシン塩酸バッファー（ｐＨ２．５）でゲル担体に結合したヒトＩｇＧを溶出した。その溶出液を分光光度計にて２８０ｎｍの吸収を測定し、１３．８（１ｇ-1ｃｍ-1）の比吸光係数をもとに結合したイムノグロブリン量（ＩｇＧ結合活性）を求めた。
　各イムノグロブリン結合ドメインのゲルへの固定化量及びＩｇＧ結合活性を表１に示す。この結果より、プロテインLの４つのドメイン中で、ドメイン４が最も高いＩｇＧ結合活性を有することが分かった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
［各イムノグロブリン結合ドメインとヒトＩｇＧ及びヒトＦａｂとの分子間相互作用解析］
　分子間相互作用解析装置ＢＬＩｔｚ（ポール社製）を用いて溶液中の各イムノグロブリン結合ドメインとヒトＩｇＧ及びヒトＦａｂ断片との相互作用を解析した。ビオチン化ヒトＩｇＧはビオチン化キット（EZ-Link Biotinylation Kit、サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）を用いて調製した。０．１％　ＢＳＡ（牛血清アルブミン）含有２０ｍＭ ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．５）で０．１ｍｇ／ｍＬに調製したビオチン化ＩｇＧとストレプトアビジンセンサーチップを室温で６０分間インキュベートすることにより、ＩｇＧ固定化チップを作製した。その後、２０ｍＭ ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．５）で洗浄した同センサーチップを精製イムノグロブリン結合ドメインＰＬ－０２１、ＰＬ－０２２、ＰＬ－０２３、及びＰＬ－０１４の各１．６μｇ／ｍＬ濃度を含む０．１％ＢＳＡ含有２０ｍＭ　ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．５）に添加し、５０秒後の各イムノグロブリン結合ドメインの結合量をそれぞれ測定した。その結果、ＰＬ－０１４＞ＰＬ－０２３＝ＰＬ－０２２＞ＰＬ－０２１の順位で結合活性が高かった。
　次に、ヒトＩｇＧをパパイン処理して調製したＦａｂを同様の方法でビオチン化したのちにストレプトアビジンセンサーチップに固定化して、各イムノグロブリン結合ドメインの結合量を測定した結果、Ｆａｂに対してもドメイン４のＰＬ－０１４が最も高い結合活性を示した。
　以上の結果から、溶液中においてもイムノグロブリン結合ドメイン４はＩｇＧのカッパ軽鎖に対して最も高い結合能を示すことが分かった。
［固定化ゲル担体のアルカリｐＨ条件での安定性の評価］
　次に、４つのイムノグロブリン結合ドメイン固定化ゲル担体を０．１Ｍ ＮａＯＨ水溶液で３回洗浄して同アルカリ溶液に置換した後に２５℃にて１７時間保温した。その後、ＰＢＳで３回洗浄し、前記と同条件でヒトＩｇＧ結合活性を測定した。アルカリ処理前のそれぞれのＩｇＧ結合量を１００％としたときの１７時間処理後の残存ＩｇＧ結合量の割合をアルカリ処理後の残存活性（％）として求めた。得られた結果を表２に示す。
　この結果から、ＰＬ－０１４＞ＰＬ－０２３＞ＰＬ－０２２＞ＰＬ－０２１の順位で高いアルカリ安定性を示した。これより、プロテインＬの４つのドメインの中でも、ドメイン４が最もアルカリ安定性が高いことが明らかとなった。以後、このドメイン４を基本設計として更にアルカリ安定性の高い改変体の創出を試みた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
実施例１：イムノグロブリン結合ドメイン４の改変体の製造と結合活性及びアルカリ安定性評価
［改変体の製造］
　イムノグロブリン結合活性とアルカリ安定性が高いイムノグロブリン結合ドメイン４を基本配列として、更なるアルカリ安定性の向上を目指して、イムノグロブリン結合ドメイン４における２位のトレオニン残基と、７位、１３位、２２位、２９位、４８位、及び６７位の７個のリジン残基の合計８個のアミノ酸残基に注目してアミノ酸を置換した改変体を作製した。
［設計と改変体の構築］
　ドメイン４を基本配列として、表３に示す２位のトレオニン残基と、７位、１３位、２２位、２９位、４８位、及び６７位の７個のリジン残基を各々置換した改変体を作製した。
［ＰＬ－０２４の発現プラスミド作成］
　まず、ＰＬ－０１４の配列上に存在するイムノグロブリン結合ドメイン４領域（配列番号１）における７位、１３位、２２位、２９位、４８位、及び６７位の７箇所のリジン残基をアルギニン残基にそれぞれ置換した改変体ＰＬ－０２４の発現プラスミドを構築した。
　ＰＬ－０２３の発現プラスミドを鋳型とし、合成オリゴＤＮＡ oligo-178（配列番号１３）及びoligo-203（配列番号２９）をプライマーとしたPCRによりＤＮＡフラグメントE1を作成した。またＰＬ－０１４の発現プラスミドを鋳型とし、合成オリゴＤＮＡ oligo-204（配列番号３０）及びoligo-205（配列番号３１）をプライマーとしたPCRによりＤＮＡフラグメントE2を作成した。同様にＰＬ－０１４の発現プラスミドを鋳型とし、合成オリゴＤＮＡ oligo-206（配列番号３２）及びoligo-207（配列番号３３）をプライマーとしたPCRによりＤＮＡフラグメントE3を作成した。次に、ＤＮＡフラグメントE1及びＤＮＡフラグメントE2を鋳型として、oligo-178（配列番号１３）及びoligo-205（配列番号３１）をプライマーとしたPCRによりＰＬ－０２４の前半のＤＮＡフラグメントE4を、フラグメントE3及びフラグメント5を鋳型として合成オリゴＤＮＡ oligo-206及びoligo-191をプライマーとしたPCRによりＰＬ－０２４の後半のＤＮＡフラグメントE5を作成した。最後にＤＮＡフラグメントE4及びＤＮＡフラグメントE5を鋳型として合成オリゴＤＮＡ oligo-178（配列番号１３）及びoligo-191（配列番号１６）をプライマーとしたPCRによりＰＬ－０２４のｃＤＮＡフラグメント全体を作成し、このｃＤＮＡをＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩにて切断して、ｐＥＴ－９ａプラスミド上のＮｄｅＩ－ＢａｍＨＩ部分に組み込むことにより、キメラタンパク質ＰＬ－０２４の発現プラスミドを得た。
［２位、７位、１３位、２２位、２９位、４８位、及び６７位の８個のアミノ酸残基の置換の組み合わせを持つキメラタンパク質の発現プラスミド作成］
　次に、イムノグロブリン結合ドメイン４領域（配列番号１）における２位、７位、１３位、２２位、２９位、４８位、及び６７位の８箇所のアミノ酸残基の複数の置換の組み合わせを持つ変異体をコードするｃＤＮＡを調製した。具体的には、ＰＬ－０１４のｃＤＮＡを鋳型とし、それぞれの位置の塩基配列を変異させたオリゴＤＮＡを準備し、オーバーラップ伸張法（二段階ＰＣＲ法）にてまず２位、７位、１３位、２２位、２９位、４８位、６７位それぞれの位置の一アミノ酸置換体をコードするｃＤＮＡフラグメントを作成した。次に、一アミノ酸置換体のｃＤＮＡを鋳型として同様のオーバーラップ伸張法（二段階ＰＣＲ法）にて別の位置の変異を導入した。更に、得られた変異体プラスミドを鋳型とし、別の位置に変異をもたらすプライマーを用いたＰＣＲによって、種々の組み合わせの複数の部位にアミノ酸置換を含む変異体のｃＤＮＡフラグメントを調製した。
　以上のようにして得た各改変体ｃＤＮＡを実施例１と同様に大腸菌発現ベクターｐＥＴ９ａ上に挿入して発現プラスミドを構築した。得られた各改変体の置換パターンを表３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
 表中、各改変体において、アミノ酸部位において空欄になっている箇所は変異を導入していないこと（即ち、２位はＴ；７位、１３位、２２位、２９位、４８位及び６７位はＫ）を示す。
　斯くして得た発現プラスミドの核酸配列を、ＣＥＱ８０００型ＤＮＡシークエンサー（ベックマンコールター株式会社）を用いて解析し、設計通りの配列であることを確認した。次に、各発現プラスミドにてＢＬ２１（ＤＥ３）コンピーテントセル（メルク株式会社）を形質転換することにより、各イムノグロブリン結合ドメイン４改変体の発現株を得た。
　それぞれのイムノグロブリン結合ドメイン４の改変体を発現する大腸菌株を、前記参考例１と同様の手法で、３７℃にて１６時間培養して目的とするイムノグロブリン結合ドメイン４改変体を発現させた後、遠心分離によって大腸菌を回収した。次に回収した大腸菌を５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）に懸濁し、超音波処理して大腸菌を破砕し、更に遠心分離によって目的のイムノグロブリン結合ドメイン４改変体を上清に回収した。得られた各上清を菌体抽出液としてＳＤＳ－ＰＡＧＥに供したところ、各分子量の位置に目的となるイムノグロブリン結合ドメイン４の改変体が生産されていることが確認できた。
［各改変体の精製と純度検定］
　各改変体の菌体抽出液をｐＨ６．０に調整した後に、参考例１と同様の手法で陽イオン交換体ＳＰ－セファロースファストフロー（ＧＥヘルスケア株式会社）カラムにアプライし、２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）にて洗浄後、０．５Ｍ ＮａＣｌの直線的濃度勾配にてタンパク質を溶出した。目的の改変体が含まれる溶出画分を集めてｐＨを９に調整した後に陰イオン交換体ギガキャップＱ（東ソー株式会社）カラムに添加した。２０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．８）にて洗浄後、０．３Ｍ ＮａＣｌ直線的濃度勾配にて目的の改変体を溶出した。各溶出液をＳＤＳ－ＰＡＧＥに供して純度を確認した結果、各改変体は理論値の分子量の位置に単一バンドとして精製されていることを確認した。
［ゲル担体への固定化とイムノグロブリン結合活性測定による評価］
　精製した各改変体を、ホルミル活性化アガロースゲル担体に１０ｍｇ／ｍＬゲルの濃度で常法に従って、それぞれ固定化した。固定化後の反応溶液を回収し、固定化率を測定したところ、すべての改変体の固定化効率が９５％以上であることを確認した。次に、参考例１と同様の方法で各固定化ゲル担体のヒトＩｇＧ結合活性を測定した。
　得られた結果を表４に示す。この結果から、配列番号１に示すアミノ酸配列において、７位、１３位、２２位、２９位、４８位、及び６７位の７つのリジン残基全てを置換したＰＬ－０２４とＰＬ－０３８は、ＰＬ－０１４よりも１１％高い活性を示した。配列番号１に示すアミノ酸配列における２９位、４８位、及び６７位をアルギニンに置換すると、５％活性が高くなった。また、配列番号１に示すアミノ酸配列における７位、１３位、２２位、２９位、４８位、及び６７位のリジン残基のアルギニンへの置換数が多いほど、活性が高くなる傾向が認められた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
 表中、各改変体において、アミノ酸部位において空欄になっている箇所は変異を導入していないこと（即ち、２位はＴ；７位、１３位、２２位、２９位、４８位及び６７位はＫ）を示す。
［ゲル担体に固定化した各改変体のアルカリ条件での安定性の評価］
　各改変体を固定化したゲル担体を０．１Ｍ ＮａＯＨ水溶液に置換した後に、２５℃にて１７時間保温した。その後、ＰＢＳで３回洗浄し、前記と同条件でヒトＩｇＧ結合活性を測定した。アルカリ処理前のそれぞれのＩｇＧ結合量を１００％としたときの１７時間処理後の残存ＩｇＧ結合量の割合をアルカリ処理後の残存活性（％）として求めた。得られた結果を表５に示す。
　表５から分かるように、配列番号１に示すアミノ酸配列における２位のトレオニン残基をリジン又はアルギニンに置換しても、アルカリ安定性に影響は与えなかった。
　また、配列番号１に示すアミノ酸配列における７位、１３位、２２位、２９位、４８位、及び６７位のリジン残基の全てをアルギニンに置換した場合には、格段に高いアルカリ安定性が認められた（PL-024及びPL-038）。
　更に、配列番号１に示すアミノ酸配列における７位、１３位、２２位、及び２９位の４か所のリジン残基をアルギニンに置換した場合（PL-049）では、最も高いアルカリ安定性が認められ、７位、１３位、及び２２位の３か所のリジン残基をアルギニンに置換した場合（PL-027、PL-036）、並びに１３位、２２位、及び２９位の３か所のリジン残基をアルギニンに置換した場合（PL-048）、７位、１３位、及び２９位の３か所のリジン残基をアルギニンに置換した場合（PL-057）、７位、２２位、及び２９位の３か所のリジン残基をアルギニンに置換した場合（PL-058）でも、優れたアルカリ安定性を備えていた。また、配列番号１に示すアミノ酸配列における７位、１３位、２２位、及び２９位のリジン残基の内、２つをアルギニンに置換した場合（PL-026、PL-035、PL-046、PL-047、PL-059）でも、野生型（PL-014）に比して、アルカリ安定性の向上が認められた。一方、配列番号１に示すアミノ酸配列における７位、１３位、２２位、及び２９位のリジン残基の内、１つのリジン残基のみを置換した場合（PL-044）では、アルカリ安定性の向上は認められなかった。
　一方、配列番号１に示すアミノ酸配列における７位及び１３位のリジン残基をアルギニンに置換し、且つ２２位のリジン残基をトレオニンに置換した場合（PL-050）には、アルカリ安定性の向上が認められた。同じく２２位をヒスチジンに置換した場合（PL-052）は、変異を導入していない２２位がリジン残基の場合（PL-026、PL-035）と同等のアルカリ安定性を示したが、２２位のリジン残基をロイシン、グルタミン酸、グルタミン、フェニルアラニン、又はアラニンに置換した場合には、アルカリ安定性の低下が認められた。以上の結果から、２２位のリジン残基は、塩基性アミノ酸又は水酸基を有するアミノ酸の置換が望ましいことが確認された。
　イムノグロブリン結合ドメイン４（配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド）の三次元構造（図２）において、７位のリジン残基は、αへリックス構造１中の３３位のグルタミン酸残基と相互作用し易い位置に配置されている。そのため、７位のリジン残基を、グルタミン酸とイオン結合又は水素結合をするアミノ酸（即ち、塩基性アミノ酸又は水酸基を有するアミノ酸）に置換すると、３３位のグルタミン酸残基との相互作用によって、アルカリ安定性の向上が図られると推測される。
　また、同様のことが、配列番号１に示すアミノ酸配列における１３位、２２位、及び２９位のリジン残基でも当てはまる。具体的には、配列番号１に示すアミノ酸配列における１３位のリジン残基はβシート１中に存在しており、これはβシート２中に存在する２７位のグルタミン酸と相互作用し易い位置に配置されている。また、配列番号１に示すアミノ酸配列における２２位のリジン残基はβシート１とβシート２の間のループ部分に存在しており、これは同ループ部分に存在する２０位のアスパラギン酸と相互作用し易い位置に配置されている。更に、配列番号１に示すアミノ酸配列における２９位のリジン残基はβシート１中に存在する８位のグルタミン酸及び／又は１１位のトレオニンと相互作用し易い位置に配置されている。そのため、配列番号１に示すアミノ酸配列における１３位、２２位、及び２９位のリジン残基を、グルタミン酸、アスパラギン酸及び／又は１１位のトレオニンとイオン結合又は水素結合をするアミノ酸（即ち、塩基性アミノ酸又は水酸基を有するアミノ酸）に置換することにより、これらのアミノ酸間の相互作用によってアルカリ安定性の向上が図られると推測される。このことは、PL-050とPL-052ではアルカリ安定性の向上が認められたが、PL-051、PL-053～PL-056ではアルカリ安定性の向上が認められなかった前記実験結果と符合している。
　即ち、以上の結果から、配列番号１に示すアミノ酸配列における７位、１３位、２２位、及び２９位のリジン残基の内、少なくとも２個以上を塩基性アミノ酸又は水酸基を有するアミノ酸に置換することによって、アルカリ安定性の向上が図れることが明らかとなった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
 表中、各改変体において、アミノ酸部位において空欄になっている箇所は変異を導入していないこと（即ち、２位はＴ；７位、１３位、２２位、２９位、４８位及び６７位はＫ）を示す。
実施例２：イムノグロブリン結合ドメイン４改変体の複ドメイン型ポリペプチドの製造と結合活性及びアルカリ安定性評価
［複ドメイン型ポリペプチド発現プラスミドの構築とタンパク質発現］
　改変体ＰＬ－０２４キメラタンパク質のＤＮＡ配列は、ＮｄｅＩ認識配列を持つ翻訳開始コドン（ＣＡＴＡＴＧ）と人工Ｎ末端配列「ＭＡＱＨＤＥＡＧＬＡＬ」をコードする配列にプロテインＬのイムノグロブリンカッパ軽鎖結合ドメイン改変ドメインをコードする配列が続き、そのＣ末端部分の人工配列「ＮＩＫＦＡＧＡＬ」をコードする配列内にＥｃｏＯ１０９Ｉ認識配列（ＧＧＧＧＣＣＴ）を有し、更にプロテインＡのイムノグロブリンＦｃ結合Ｃドメイン第３アルファへリックスの改変Ｃ末端配列２１残基が続き、最後に人工Ｃ末端配列「ＫＫＫ」をコードする配列と翻訳終止コドン及びＢａｍＨＩ認識配列を含んでいる。このＰＬ－０２４キメラタンパク質のｃＤＮＡを予めプラスミド上のＥｃｏＯ１０９I切断部位を削除したｐＵＣ１９プラスミドのクローニングサイトに挿入して得られたプラスミドを複ドメイン型ポリペプチドｃＤＮＡの構築に用いた。
　改変体ＰＬ－０２４のｃＤＮＡを鋳型とし、合成オリゴＤＮＡ oligo210（配列番号３４）及びoligo211（配列番号３５）をプライマーとしたＰＣＲによりＮ及びＣ両末端にＥｃｏＯ１０９Ｉ認識配列を持つプロテインＬのイムノグロブリンカッパ軽鎖結合ドメイン改変ドメイン部分のみのｃＤＮＡフラグメントを調製し、このフラグメントの両端をＥｃｏＯ１０９Ｉにて切断した。次に、上記ＰＬ－０２４キメラタンパク質のｃＤＮＡをサブクローニングしたｐＵＣ１９プラスミドをＥｃｏＯ１０９Ｉで切断し、切断部位をアルカリフォスファターゼにより脱リン酸化した後、この部位にライゲーション反応により上記ＰＣＲフラグメントを挿入した。この反応によってフラグメントが１個挿入されたクローンでは、Ｎ末端側から、プロテインＬのイムノグロブリンカッパ軽鎖結合ドメイン改変ドメインが２個連結された後ろにプロテインＡのイムノグロブリンＦｃ結合Ｃドメイン第３αへリックスの改変Ｃ末端配列２１残基（配列番号１７）、及び人工Ｃ末端配列（配列番号１８）がこの順で続く形の２量体のキメラタンパク質のｃＤＮＡとして得られ、同様にフラグメントが３個挿入されたクローンでは４量体のキメラタンパク質のｃＤＮＡとして、フラグメントが５個挿入されたクローンでは６量体のキメラタンパク質のｃＤＮＡとして得られた。
　なお、プロテインＡのイムノグロブリンＦｃ結合Ｃドメイン第３αへリックスの改変Ｃ末端配列２１残基が「ＰＫ」の２残基または「ＰＫＫＫＫＫ」の６残基といったより短い配列であってもよく、付加するＣ末端配列が改変体の複ドメイン型ポリペプチドのアルカリ安定性に影響を及ぼさないことを確認している。このように付加するＣ末端配列は、プロテインＡのイムノグロブリンＦｃ結合Ｃドメイン第３αへリックスの改変配列に限定されるものではなく、ゲル担体の固定化において反応しやすいアミノ酸残基を多く含む配列とすることにより、改変体を配向制御してゲルへ固定化することが可能である。
　以上の様にして得た４量体ＰＬ－４２４と６量体ＰＬ－６２４のｃＤＮＡをサブクローニングしたｐＵＣ１９プラスミドから制限酵素 ＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩにより各ｃＤＮＡを切り出し、これを大腸菌発現ベクターであるｐＥＴ９ａ上のＮｄｅＩ―ＢａｍＨＩサイトに挿入して発現プラスミドを構築し、それぞれの発現プラスミドの核酸配列を、ＣＥＱ８０００型ＤＮＡシークエンサー（ベックマンコールター株式会社）を用いて解析し、設計通りの配列であることを確認した。次に各発現プラスミドにてＢＬ２１（ＤＥ３）コンピーテントセル（メルク株式会社）を形質転換することで、各複ドメイン型ポリペプチドの発現株を得た。
　各発現株を、２５ｍｇ／Ｌのカナマイシンと２．０％グルコースを含むＬＢ培地にて１２時間種培養し、この種培養液を２５ｍｇ／Ｌのカナマイシンと０．８％グルコースを含む２×ＴＹ培地に接種し、３７℃にて１６時間培養して目的とする複ドメイン型ポリペプチドを発現させた後、遠心分離によって大腸菌を集めた。次に集めた大腸菌を５０ｍＭ ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．０）に懸濁し、超音波処理して大腸菌を破砕し、遠心分離によって目的の複ドメイン型ポリペプチドを上清に回収した。得られた各上清を菌体抽出液としてＳＤＳ－ＰＡＧＥに供したところ、それぞれの分子量の位置に目的の複ドメイン型ポリペプチドが生産されていることが確認できた。なお、得られた４量体ＰＬ－４２４のアミノ酸配列を配列番号３６に示し、得られた６量体ＰＬ－６２４のアミノ酸配列を配列番号３７に示す。
［複ドメイン型ポリペプチドの精製と純度検定］
　複ドメイン型ポリペプチドＰＬ－４２４とＰＬ－６２４の菌体抽出液をそれぞれｐＨ６．０に調整したのちに、前記参考例１と同様の方法で陽イオン交換体ＳＰ－セファロースファストフロー（ＧＥヘルスケア株式会社）カラムにアプライし、２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）にて洗浄後、０．２Ｍ ＮａＣｌの直線濃度勾配にてタンパク質を溶出した。目的の多量体が含まれる溶出画分を集めてｐＨを８に調整した後に陰イオン交換体ギガキャップＱ（東ソー株式会社）カラムに添加した。２０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．８）にて洗浄後、０．３５Ｍ　ＮａＣｌ直線濃度勾配にて目的の複ドメイン型ポリペプチドを溶出させた。各溶出液をＳＤＳ－ＰＡＧＥに供して純度を確認した結果、各複ドメイン型ポリペプチドは理論値の分子量の位置に単一バンドとして精製されていることを確認した。
［ゲル担体への固定化とイムノグロブリン結合活性測定による評価］
　精製した複ドメイン型ポリペプチドＰＬ－４２４とＰＬ－６２４を、ホルミル活性化アガロースゲル担体に１０ｍｇ／ｍＬゲルの濃度で、常法に従ってそれぞれ固定化した。固定化後の反応溶液を回収して固定化率を測定したところ、ＰＬ－４２４とＰＬ－６２４は、それぞれ９７．３％と９８．０％の固定化率であった。次に、前記参考例１と同様の方法で各固定化ゲル担体のヒトＩｇＧ結合活性を測定した。更に、比較のために、天然配列の４量体（プロテインＬ）が１０ｍｇ／ｍＬゲルで固定化されているＣａｐｔｏＬ（ＧＥヘルスケア社）を使用して、同様にヒトＩｇＧ結合活性を測定した。その結果を表６に示す。さらに、ヒトＩｇＧをパパイン処理して調製した精製Ｆａｂを２０ｍｇ／ｍＬ濃度含むＰＢＳ溶液を各固定化ゲルに加えて１時間振とうした後に、ヒトＩｇＧの場合と同様の方法で結合活性を測定した。なおＦａｂ量は１３．５（１ｇ-1ｃｍ-1）の比吸光係数を用いて求めた。
　ヒトＩｇＧ結合活性は、単ドメイン型ポリペプチドＰＬ－０２４と比べると複ドメイン型ポリペプチドＰＬ－４２４（ドメイン数４）は１４４％、複ドメイン型ポリペプチドＰＬ－６２４（ドメイン数６）は１５１％とそれぞれ単ドメイン型ポリペプチドよりも高い活性を示すことが分かった。分子量が１４５ｋＤａのＩｇＧに対して４７ｋＤａのＦａｂ断片がＩｇＧに近い結合量であることは注目すべき点である。それぞれの分子量に基づいてモル数を計算すると、ＰＬ－４２４（ドメイン数４）１０ｍｇで６３２ｎｍｏｌ、ＰＬ－６２４（ドメイン数６）１０ｍｇで６６１ｎｍｏｌのＩｇＧが結合したことになる。一方、Ｆａｂ断片は、ＰＬ－４２４（ドメイン数４）１０ｍｇで１５４０ｎｍｏｌ、６ＰＬ－６２４（ドメイン数６）１０ｍｇで１６１５ｎｍｏｌが結合した。即ち、発明の複ドメイン型ポリペプチドには、ＩｇＧに対する結合能よりも、Ｆａｂ断片に対する結合能の方が格段に高いことが明らかとなった。これは、Ｆａｂは分子サイズが小さいので結合において立体障害が起こりにくいからであると考えられる。
　一方、天然配列の複ドメイン型ポリペプチド（ドメイン数４）（プロテインＬ）が１０ｍｇ／ｍＬゲルで固定化されているＣａｐｔｏＬ（ＧＥヘルスケア社）と比較すると、本発明の多量体は、Ｆａｂ断片で約２．４倍、ＩｇＧで２．２倍の結合量であった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
［ゲル担体に固定化した複ドメイン型ポリペプチドのアルカリｐＨ条件での安定性の評価］
　各ドメイン型ポリペプチドを固定化したゲル担体を０．１Ｍ ＮａＯＨ水溶液に置換した後に、２５℃にて１７時間保温した。その後、ＰＢＳで３回洗浄し、前記と同条件でヒトＩｇＧ結合活性を測定した。アルカリ処理前のそれぞれのＩｇＧ結合量を１００％としたときの１７時間処理後の残存ＩｇＧ結合量の割合をアルカリ処理後の残存活性（％）として求めた。得られた結果を表７に示す。
　複ドメイン型ポリペプチドＰＬ－４２４（ドメイン数４）とＰＬ－６２４（ドメイン数６）は単ドメイン型ポリペプチドＰＬ－０２４とほぼ同様のアルカリ安定性を示すことが分かった。天然配列の複ドメイン型ポリペプチド（ドメイン数４）のＣａｐｔｏＬと比較すると、ＰＬ－４２４で１．４倍、ＰＬ－６２４で１．５倍の高いアルカリ安定性を備えていることがわかった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
実施例３：イムノグロブリン結合ドメイン３の改変体の製造と結合活性及びアルカリ安定性評価
［改変体の製造］
　次に、イムノグロブリン結合ドメイン３を基本配列として、アルカリ安定性の向上を目指して、イムノグロブリン結合ドメイン３（配列番号２）における７位、１３位、２２位、及び２９位の４個のリジン残基をアルギニンに置換した改変体を作製した。
［ＰＬ－０６１の発現プラスミド作成］
　ＰＬ－０２４の発現プラスミドを鋳型とし、合成オリゴＤＮＡ oligo-178（配列番号１３）及びoligo-334（配列番号３８）をプライマーとしたPCRにより７位、１３位、及び２２位のリジン残基がアルギニンに置換され、２３位がイソロイシンとなった２８位までの配列をコードするｃＤＮＡフラグメントを作成した。またＰＬ－０２４の発現プラスミドを鋳型とし、oligo-335（配列番号３９）及びoligo-191（配列番号１６）をプライマーとしたPCRにより２９位のリジン残基がアルギニンに置換された２４位以降のイムノグロブリン結合ドメイン３の配列をコードするｃＤＮＡフラグメントを作成した。これら二つのＤＮＡフラグメントを鋳型として合成オリゴＤＮＡ oligo-178（配列番号１３）及びoligo-191（配列番号１６）をプライマーとしたPCRにより、ＰＬ－０６１をコードするｃＤＮＡが得られた。このｃＤＮＡをＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩにて切断し、ｐＥＴ－９ａプラスミド上のＮｄｅＩ－ＢａｍＨＩ部分に組み込むことにより、Ｎ末端側から、人工Ｎ末端配列１１残基（配列番号１２）、配列番号２における７位、１３位、２２位、及び２９位のリジン残基がアルギニンに置換されたプロテインＬのイムノグロブリンカッパ軽鎖結合ドメイン３の７０残基、アラニン－ロイシンからなる連結配列２残基、プロテインＡ由来イムノグロブリンＦｃ結合Ｃドメイン第３αへリックスの改変Ｃ末端配列２１残基（配列番号１７）、及び人工Ｃ末端配列３残基（配列番号１８）がこの順で連結されたキメラタンパク質ＰＬ－０６１の発現プラスミドを得た。
［改変体の精製と純度検定］
　改変体ＰＬ－０６１の菌体抽出液をｐＨ６．０に調整した後に、参考例１と同様の手法で陽イオン交換体ＳＰ－セファロースファストフロー（ＧＥヘルスケア株式会社）カラムにアプライし、２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）にて洗浄後、０．５Ｍ ＮａＣｌの直線的濃度勾配にてタンパク質を溶出した。目的の改変体が含まれる溶出画分を集めてｐＨを９に調整した後に陰イオン交換体ギガキャップＱ（東ソー株式会社）カラムに添加した。２０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．８）にて洗浄後、０．３Ｍ ＮａＣｌ直線的濃度勾配にて目的の改変体を溶出した。各溶出液をＳＤＳ－ＰＡＧＥに供して純度を確認した結果、各改変体は理論値の分子量の位置に単一バンドとして精製されていることを確認した。
［ゲル担体への固定化とイムノグロブリン結合活性測定による評価］
　精製した改変体ＰＬ－０６１を、ホルミル活性化アガロースゲル担体に１０ｍｇ／ｍＬゲルの濃度で常法に従って、それぞれ固定化した。固定化後の反応溶液を回収し、固定化率を測定したところ、固定化効率が９５％以上であることを確認した。次に、参考例１と同様の方法で各固定化ゲル担体のヒトＩｇＧ結合活性を測定した。
　得られた結果を表８に示す。この結果から、配列番号２における７位、１３位、２２位、及び２９位の４個のリジン残基をアルギニンに置換した場合であっても、前記イムノグロブリン結合ドメイン４の場合と同様に、ヒトＩｇＧ結合活性の向上が認められた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
［ゲル担体に固定化した改変体のアルカリｐＨ条件での安定性の評価］
　改変体ＰＬ－０６１を固定化したゲル担体を０．１Ｍ ＮａＯＨ水溶液に置換した後に、２５℃にて１７時間保温した。その後、ＰＢＳで３回洗浄し、前記と同条件でヒトＩｇＧ結合活性を測定した。アルカリ処理前のそれぞれのＩｇＧ結合量を１００％としたときの１７時間処理後の残存ＩｇＧ結合量の割合をアルカリ処理後の残存活性（％）として求めた。得られた結果を表９に示す。
　この結果から、配列番号２における７位、１３位、２２位、及び２９位の４個のリジン残基をアルギニンに置換することによっても、アルカリ安定性が向上することが確認された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
　なお、Peptostreptococcus magnus 3316株由来のプロテインＬにおけるイムノグロブリン結合ドメインのアミノ酸配列は、Peptostreptococcus magnus 312株由来のものと配列相同性が高いが、本発明者によって、Peptostreptococcus magnus 312株由来のプロテインＬにおけるイムノグロブリン結合ドメインに対して、前記と同様の変異を施しても、アルカリ安定性の向上が図れないことが確認されている。即ち、前記実施例１～３で実証されたアルカリ安定性を向上させ得る変異は、Peptostreptococcus magnus 3316株由来のプロテインＬにおけるイムノグロブリン結合ドメインに特有のものであるといえる。

Claims (17)

  1. 　下記(1-1)～(1-4)、(2-1)～(2-4)、及び(3-1)～(3-4)のいずれかに示すイムノグロブリン結合ドメインを少なくとも１つ含むポリペプチド。
    (1-1)配列番号１に示すアミノ酸配列において、第７位、第１３位、第２２位、及び・第２９位よりなる群から選択される部位の少なくとも２個以上が、リジン以外の塩基性アミノ酸又は水酸基を有するアミノ酸に置換されているアミノ酸配列を含むイムノグロブリン結合ドメイン。
    (1-2)配列番号２に示すアミノ酸配列において、第７位、第１３位、第２２位、及び第２９位よりなる群から選択される部位の少なくとも２個以上が、リジン以外の塩基性アミノ酸又は水酸基を有するアミノ酸に置換されているアミノ酸配列を含むイムノグロブリン結合ドメイン。
    (1-3)配列番号３に示すアミノ酸配列において、第７位、第１３位、第２２位、及び第２９位よりなる群から選択される部位の少なくとも２個以上が、リジン以外の塩基性アミノ酸又は水酸基を有するアミノ酸に置換されているアミノ酸配列を含むイムノグロブリン結合ドメイン。
    (1-4)配列番号４に示すアミノ酸配列において、第６位、第１２位、第２１位、及び第２８位よりなる群から選択される部位の少なくとも２個以上が、リジン以外の塩基性アミノ酸又は水酸基を有するアミノ酸に置換されているアミノ酸配列を含むイムノグロブリン結合ドメイン。
    (2-1)配列番号１に示すアミノ酸配列における第７位、第１３位、第２２位、及び第２９位よりなる群から選択される少なくとも２つのアミノ酸が、リジン以外の塩基性アミノ酸又は水酸基を有するアミノ酸に置換されているアミノ酸配列において、前記アミノ酸置換部位以外のアミノ酸の１個又は数個が置換、付加、挿入又は欠失されてなり、且つ、イムノグロブリンに対する結合能を有し、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドと比較してアルカリ安定性が向上しているイムノグロブリン結合ドメイン。
    (2-2)配列番号２に示すアミノ酸配列における第７位、第１３位、第２２位、及び第２９位よりなる群から選択される少なくとも２つのアミノ酸が、リジン以外の塩基性アミノ酸又は水酸基を有するアミノ酸に置換されているアミノ酸配列において、前記アミノ酸置換部位以外のアミノ酸の１個又は数個が置換、付加、挿入又は欠失されてなり、且つ、イムノグロブリンに対する結合能を有し、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドと比較してアルカリ安定性が向上しているイムノグロブリン結合ドメイン。
    (2-3)配列番号３に示すアミノ酸配列における第７位、第１３位、第２２位、及び第２９位よりなる群から選択される少なくとも２つのアミノ酸が、リジン以外の塩基性アミノ酸又は水酸基を有するアミノ酸に置換されているアミノ酸配列において、前記アミノ酸置換部位以外のアミノ酸の１個又は数個が置換、付加、挿入又は欠失されてなり、且つ、イムノグロブリンに対する結合能を有し、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドと比較してアルカリ安定性が向上しているイムノグロブリン結合ドメイン。
    (2-4)配列番号４に示すアミノ酸配列における第６位、第１２位、第２１位、及び第２８位よりなる群から選択される少なくとも２つのアミノ酸が、リジン以外の塩基性アミノ酸又は水酸基を有するアミノ酸に置換されているアミノ酸配列において、前記アミノ酸置換部位以外のアミノ酸の１個又は数個が置換、付加、挿入又は欠失されてなり、且つ、イムノグロブリンに対する結合能を有し、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドと比較してアルカリ安定性が向上しているイムノグロブリン結合ドメイン。
    (3-1)配列番号１に示すアミノ酸配列における第７位、第１３位、第２２位、及び第２９位よりなる群から選択される少なくとも２つのアミノ酸が、リジン以外の塩基性アミノ酸又は水酸基を有するアミノ酸に置換されているアミノ酸配列において、配列番号１に示すアミノ酸配列に対する前記アミノ酸置換部位を除いた配列同一性が８０％以上であり、且つ、イムノグロブリンに対する結合能を有し、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドと比較してアルカリ安定性が向上しているイムノグロブリン結合ドメイン。
    (3-2)配列番号２に示すアミノ酸配列における第７位、第１３位、第２２位、及び第２９位よりなる群から選択される少なくとも２つのアミノ酸が、リジン以外の塩基性アミノ酸又は水酸基を有するアミノ酸に置換されているアミノ酸配列において、配列番号２に示すアミノ酸配列に対する前記アミノ酸置換部位を除いた配列同一性が８０％以上であり、且つ、イムノグロブリンに対する結合能を有し、配列番号２に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドと比較してアルカリ安定性が向上しているイムノグロブリン結合ドメイン。
    (3-3)配列番号３に示すアミノ酸配列における第７位、第１３位、第２２位、及び第２９位よりなる群から選択される少なくとも２つのアミノ酸が、リジン以外の塩基性アミノ酸又は水酸基を有するアミノ酸に置換されているアミノ酸配列において、配列番号３に示すアミノ酸配列に対する前記アミノ酸置換部位を除いた配列同一性が８０％以上であり、且つ、イムノグロブリンに対する結合能を有し、配列番号３に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドと比較してアルカリ安定性が向上しているイムノグロブリン結合ドメイン。
    (3-4)配列番号４に示すアミノ酸配列における第６位、第１２位、第２１位、及び第２８位よりなる群から選択される少なくとも２つのアミノ酸が、リジン以外の塩基性アミノ酸又は水酸基を有するアミノ酸に置換されているアミノ酸配列において、配列番号４に示すアミノ酸配列に対する前記アミノ酸置換部位を除いた配列同一性が８０％以上であり、且つ、イムノグロブリンに対する結合能を有し、配列番号４に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドと比較してアルカリ安定性が向上しているイムノグロブリン結合ドメイン。
  2. 　前記(1-1)～(1-4)、(2-1)～(2-4)、及び(3-1)～(3-4)に示すイムノグロブリン結合ドメインの中から選択される１個のイムノグロブリン結合ドメインが含まれる単ドメイン型ペプチドである、請求項１に記載のポリペプチド。
  3. 　前記(1-1)～(1-4)、(2-1)～(2-4)、及び(3-1)～(3-4)に示すイムノグロブリン結合ドメインから選択される２個以上のイムノグロブリン結合ドメインが連結されてなる複ドメイン型ペプチドである、請求項１に記載のポリペプチド。
  4. 　前記(1-1)、(2-1)、及び(3-1)のイムノグロブリン結合ドメインのいずれか少なくとも１つを含み、
    　配列番号１に示すアミノ酸配列における第７位、第１３位、第２２位、及び第２９位の全てが、塩基性アミノ酸又は水酸基を有するアミノ酸に置換されている、請求項１～３のいずれかに記載のポリペプチド。
  5. 　前記(1-1)、(2-1)、及び(3-1)のイムノグロブリン結合ドメインのいずれか少なくとも１つを含み、
    　配列番号１に示すアミノ酸配列において、第７位、第１３位、第２２位、及び第２９位よりなる群から選択される部位の少なくとも２個以上が、アルギニン又はトレオニンに置換されている、請求項１～４のいずれかに記載のポリペプチド。
  6. 　前記(1-2)、(2-2)、及び(3-2)のイムノグロブリン結合ドメインのいずれか少なくとも１つを含み、
    　配列番号２に示すアミノ酸配列における第７位、第１３位、第２２位、及び第２９位の全てが、塩基性アミノ酸又は水酸基を有するアミノ酸に置換されている、請求項１～３のいずれかに記載のポリペプチド。
  7. 　前記(1-2)、(2-2)、及び(3-2)のイムノグロブリン結合ドメインのいずれか少なくとも１つを含み、
    　配列番号２に示すアミノ酸配列において、第７位、第１３位、第２２位、及び第２９位よりなる群から選択される部位の少なくとも２個以上が、アルギニン又はトレオニンに置換されている、請求項１～３及び６のいずれかに記載のポリペプチド。
  8. 　前記(1-3)、(2-3)、及び(3-3)のイムノグロブリン結合ドメインのいずれか少なくとも１つを含み、
    　配列番号３に示すアミノ酸配列における第７位、第１３位、第２２位、及び第２９位の全てが、塩基性アミノ酸又は水酸基を有するアミノ酸に置換されている、請求項１～３のいずれかに記載のポリペプチド。
  9. 　前記(1-3)、(2-3)、及び(3-3)のイムノグロブリン結合ドメインのいずれか少なくとも１つを含み、
    　配列番号３に示すアミノ酸配列において、第７位、第１３位、第２２位、及び第２９位よりなる群から選択される部位の少なくとも２個以上が、アルギニン又はトレオニンに置換されている、請求項１～３及び８のいずれかに記載のポリペプチド。
  10. 　前記(1-4)、(2-4)、及び(3-4)のイムノグロブリン結合ドメインのいずれか少なくとも１つを含み、
    　配列番号４に示すアミノ酸配列における第６位、第１２位、第２１位、及び第２８位の全てが、塩基性アミノ酸又は水酸基を有するアミノ酸に置換されている、請求項１～３のいずれかに記載のポリペプチド。
  11. 　前記(1-4)、(2-4)、及び(3-4)のイムノグロブリン結合ドメインのいずれか少なくとも１つを含み、
    　配列番号４に示すアミノ酸配列において、第６位、第１２位、第２１位、及び第２８位よりなる群から選択される部位の少なくとも２個以上が、アルギニン又はトレオニンに置換されている、請求項１～３及び１０のいずれかに記載のポリペプチド。
  12. 　請求項１～１１のいずれかに記載のポリペプチドをコードしているＤＮＡ。
  13. 　請求項１２に記載のＤＮＡを含む組換えベクター。
  14. 　請求項１３に記載の組換えベクターを用いて宿主を形質転換して得られる形質転換体。
  15. 　請求項１４に記載の形質転換体を培養する工程を含む、請求項１～１１のいずれかに記載のポリペプチドの製造方法。
  16. 　請求項１～１１のいずれかに記載のポリペプチドが不溶性担体に固定化されてなる、イムノグロブリン結合用担体。
  17. 　請求項１６に記載のイムノグロブリン結合用担体を用いて、イムノグロブリン又はそのカッパ鎖を含む断片の分離を行う、イムノグロブリン又はその断片の分離方法。
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