WO2017069254A1 - アフィニティクロマトグラフィ担体および生体物質の精製方法 - Google Patents

アフィニティクロマトグラフィ担体および生体物質の精製方法 Download PDF

Info

Publication number
WO2017069254A1
WO2017069254A1 PCT/JP2016/081312 JP2016081312W WO2017069254A1 WO 2017069254 A1 WO2017069254 A1 WO 2017069254A1 JP 2016081312 W JP2016081312 W JP 2016081312W WO 2017069254 A1 WO2017069254 A1 WO 2017069254A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
gel
amount
affinity chromatography
antibody
carrier
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP2016/081312
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
史織 木原
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Fujifilm Corp
Original Assignee
Fujifilm Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority to EP16857567.8A priority Critical patent/EP3367093B1/en
Priority to RU2018114693A priority patent/RU2694637C1/ru
Priority to CN201680060014.XA priority patent/CN108139371A/zh
Priority to AU2016340518A priority patent/AU2016340518B2/en
Priority to BR112018008113-2A priority patent/BR112018008113A2/ja
Priority to SG11201802997WA priority patent/SG11201802997WA/en
Priority to KR1020187009519A priority patent/KR20180049026A/ko
Priority to JP2017545816A priority patent/JP6600002B2/ja
Priority to CA3000965A priority patent/CA3000965A1/en
Application filed by Fujifilm Corp filed Critical Fujifilm Corp
Publication of WO2017069254A1 publication Critical patent/WO2017069254A1/ja
Priority to US15/952,627 priority patent/US10888841B2/en
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/88—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/281—Sorbents specially adapted for preparative, analytical or investigative chromatography
    • B01J20/286—Phases chemically bonded to a substrate, e.g. to silica or to polymers
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
    • B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
    • B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
    • B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
    • B01D15/38—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism involving specific interaction not covered by one or more of groups B01D15/265 and B01D15/30 - B01D15/36, e.g. affinity, ligand exchange or chiral chromatography
    • B01D15/3804—Affinity chromatography
    • B01D15/3809—Affinity chromatography of the antigen-antibody type, e.g. protein A, G or L chromatography
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/22—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof comprising organic material
    • B01J20/24—Naturally occurring macromolecular compounds, e.g. humic acids or their derivatives
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/28—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof characterised by their form or physical properties
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/28—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof characterised by their form or physical properties
    • B01J20/28002—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof characterised by their form or physical properties characterised by their physical properties
    • B01J20/28011—Other properties, e.g. density, crush strength
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/281—Sorbents specially adapted for preparative, analytical or investigative chromatography
    • B01J20/282—Porous sorbents
    • B01J20/285—Porous sorbents based on polymers
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/281—Sorbents specially adapted for preparative, analytical or investigative chromatography
    • B01J20/291—Gel sorbents
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/30—Processes for preparing, regenerating, or reactivating
    • B01J20/32—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating
    • B01J20/3202—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating characterised by the carrier, support or substrate used for impregnation or coating
    • B01J20/3206—Organic carriers, supports or substrates
    • B01J20/3208—Polymeric carriers, supports or substrates
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/30—Processes for preparing, regenerating, or reactivating
    • B01J20/32—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating
    • B01J20/3214—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating characterised by the method for obtaining this coating or impregnating
    • B01J20/3217—Resulting in a chemical bond between the coating or impregnating layer and the carrier, support or substrate, e.g. a covalent bond
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/30—Processes for preparing, regenerating, or reactivating
    • B01J20/32—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating
    • B01J20/3231—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating characterised by the coating or impregnating layer
    • B01J20/3242—Layers with a functional group, e.g. an affinity material, a ligand, a reactant or a complexing group
    • B01J20/3268—Macromolecular compounds
    • B01J20/3272—Polymers obtained by reactions otherwise than involving only carbon to carbon unsaturated bonds
    • B01J20/3274—Proteins, nucleic acids, polysaccharides, antibodies or antigens
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/30—Processes for preparing, regenerating, or reactivating
    • B01J20/32—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating
    • B01J20/3291—Characterised by the shape of the carrier, the coating or the obtained coated product
    • B01J20/3293—Coatings on a core, the core being particle or fiber shaped, e.g. encapsulated particles, coated fibers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
    • C07K1/22—Affinity chromatography or related techniques based upon selective absorption processes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/88—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86
    • G01N2030/8809—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample
    • G01N2030/8813—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample biological materials
    • G01N2030/8831—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample biological materials involving peptides or proteins

Definitions

  • the present invention relates to an affinity chromatography carrier and a method for purifying biological material.
  • antibody pharmaceuticals using the functions of antibodies.
  • antibody drugs work more specifically for target molecules, and are expected to reduce side effects and achieve high therapeutic effects. It contributes to the improvement.
  • antibody pharmaceuticals are administered in large quantities to living bodies, their purity has a large effect on quality when compared to other recombinant protein pharmaceuticals.
  • antibody drugs are produced by purifying antibodies expressed in host cells by genetic recombination, contamination of host cells and impurities derived from the production process becomes a problem.
  • host cell-derived protein (HCP) that remains as an impurity in antibody drugs is suspected to be associated with the development of anaphylaxis during administration of antibody drugs, thus improving purification purity and reducing impurities Is required.
  • Patent Document 1 discloses a porous medium in which a polysaccharide having an intrinsic viscosity of 0.21 dL / g to 0.90 dL / g is added to porous cellulose particles as a chromatography carrier suitable for separation and purification of protein preparations and the like.
  • the cellulosic gel is characterized in that the dry weight per unit volume of the porous cellulose gel is 1.06 to 1.40 times the dry weight per unit volume of the porous cellulose particles.
  • a chromatographic carrier obtained by adding a sulfoxy group as a ligand to a porous cellulose gel is disclosed.
  • an affinity chromatography carrier formed by immobilizing an affinity ligand having a function of specifically binding to a specific molecule on a water-insoluble carrier is a microorganism or mammalian cell containing a biological component or a recombinant. It is described that it is used for the efficient separation and purification of useful substances from cultured cells, and has an affinity ligand and a cation exchange group on the same carrier as an affinity chromatography carrier designed to achieve high-purity antibody purification.
  • An affinity chromatography carrier is disclosed.
  • the present inventor examined the affinity chromatography carrier described in Patent Document 2, and an affinity chromatography carrier having an affinity ligand and a cation exchange group on the same carrier seems to be advantageous. As shown in Comparative Examples 4 and 5, the antibody adsorption capacity was excellent, but it was found that there was room for improvement in purification purity.
  • an object of the present invention is to provide an affinity chromatography carrier excellent in antibody adsorption capacity and purification purity.
  • the substrate is a polysaccharide, an acrylate polymer, a methacrylate polymer, and an affinity chromatography carrier having a hydrophilic polymer and an affinity ligand. It is composed of at least one selected from the group consisting of styrenic polymers, the hydrophilic polymer is at least one selected from the group consisting of hydrophilic polysaccharides, and the affinity ligand is an antibody-binding protein and an antibody-binding polymer.
  • a carboxy group is introduced into the affinity chromatography carrier, and the amount of carboxy group introduced is 15 mmol / L-gel to 60 mmol / L-gel in terms of ion exchange capacity. Excellent antibody adsorption capacity and purification purity Become known, it has led to the completion of the present invention.
  • An affinity chromatography carrier having a substrate, a hydrophilic polymer and an affinity ligand,
  • the substrate comprises at least one selected from the group consisting of polysaccharides, acrylate polymers, methacrylate polymers, and styrene polymers
  • the hydrophilic polymer is at least one selected from the group consisting of hydrophilic polysaccharides
  • the affinity ligand is at least one selected from the group consisting of an antibody binding protein and an antibody binding polypeptide
  • a carboxy group is introduced into the affinity chromatography carrier,
  • An affinity chromatography carrier in which the introduction amount of the carboxy group is 15 mmol / L-gel to 60 mmol / L-gel in terms of ion exchange capacity.
  • the base material comprises at least one selected from the group consisting of polysaccharides, acrylate polymers, and methacrylate polymers. Carrier.
  • the substrate comprises at least one selected from the group consisting of cellulose, agarose, dextran, chitosan, glucomannan and a crosslinked polysaccharide having a crosslinked structure introduced thereto.
  • the hydrophilic polymer is at least one hydrophilic polysaccharide selected from the group consisting of dextran, carboxymethyldextran and pullulan;
  • the intrinsic viscosity of the hydrophilic polysaccharide is 0.12 dL / g to 0.30 dL / g
  • the coating amount of the hydrophilic polymer is 10 mg / g-dry gel to 240 mg / g-dry gel,
  • the introduction amount of the carboxy group is 15 mmol / L-gel to 55 mmol / L-gel in terms of ion exchange capacity,
  • the affinity ligand is protein A or a variant thereof, and The affinity chromatography carrier according to any one of [1] to [8] above, wherein the introduced amount of the affinity
  • the substrate comprises at least one selected from the group consisting of an acrylate polymer and a methacrylate polymer
  • the hydrophilic polymer is at least one hydrophilic polysaccharide selected from the group consisting of dextran, carboxymethyldextran and pullulan;
  • the intrinsic viscosity of the hydrophilic polysaccharide is 0.12 dL / g to 0.30 dL / g
  • the coating amount of the hydrophilic polymer is 10 mg / g-dry gel to 250 mg / g-dry gel,
  • the introduction amount of the carboxy group is 15 mmol / L-gel to 55 mmol / L-gel in terms of ion exchange capacity
  • the affinity ligand is protein A or a variant thereof, and
  • the affinity chromatography carrier according to any one of [1] to [8] above, wherein the introduced amount of the affinity ligand is 0.10 mmol / L-gel to 1.0 mmol / L-gel.
  • [11] A method for purifying a biological material using the affinity chromatography carrier according to any one of [1] to [10] above.
  • [12] The purification method according to [11] above, wherein the pH when the biological material is added is 5.0 to 9.0.
  • an affinity chromatography carrier excellent in antibody adsorption capacity and purification purity is provided.
  • the affinity chromatography carrier of the present invention has both an affinity ligand that is at least one selected from the group consisting of an antibody-binding protein and an antibody-binding polypeptide and a carboxy group that is a cation exchange group, and a carboxy group.
  • the affinity chromatography carrier of the present invention is an affinity chromatography carrier having a substrate, a hydrophilic polymer and an affinity ligand, wherein the substrate is a group consisting of a polysaccharide, an acrylate polymer, a methacrylate polymer and a styrene polymer.
  • the hydrophilic polymer is at least one selected from the group consisting of polysaccharides, and the affinity ligand is selected from the group consisting of antibody-binding proteins and antibody-binding polypeptides.
  • An affinity chromatography carrier in which a carboxy group is introduced into the affinity chromatography carrier, and an introduction amount of the carboxy group is 15 mmol / L-gel to 60 mmol / L-gel in terms of ion exchange capacity.
  • the substrate is at least one selected from the group consisting of polysaccharides, acrylate polymers, methacrylate polymers, and styrene polymers, preferably selected from polysaccharides, acrylate polymers, and methacrylate polymers. At least one, more preferably at least one selected from polysaccharides.
  • a base material may be used individually by 1 type, and may be used in combination of 2 or more type.
  • the polysaccharide is not particularly limited, and examples thereof include natural polysaccharides such as cellulose, agarose, dextran, chitosan, glucomannan, and cross-linked polysaccharides in which a cross-linked structure is introduced into these natural polysaccharides.
  • the crosslinked polysaccharide can be produced, for example, by introducing a crosslinked structure into the hydroxyl group of the natural polysaccharide using a crosslinking agent such as epichlorohydrin, (poly) alkylene glycol diglycidyl ether, or alkylene diisocyanate.
  • the polysaccharide is preferably at least one selected from cellulose, crosslinked cellulose, agarose and crosslinked agarose, more preferably at least one selected from agarose and crosslinked agarose.
  • the acrylate polymer is not particularly limited.
  • vinyl group-containing compounds other than acrylic acid esters for example, monovinyl compounds such as ethylene and propylene, aromatic polyvinyl compounds such as divinylbenzene and trivinylbenzene, polyvinyl such as butadiene, methylenebisacrylamide, and triallyl isocyanurate.
  • monovinyl compounds such as ethylene and propylene
  • aromatic polyvinyl compounds such as divinylbenzene and trivinylbenzene
  • polyvinyl such as butadiene
  • methylenebisacrylamide methylenebisacrylamide
  • triallyl isocyanurate triallyl isocyanurate.
  • a cross-linked structure may be introduced into these polymers or copolymers using a cross-linking agent such as epichlorohydrin, (poly) alkylene glycol diglycidyl ether, alkylene diisocyanate.
  • the methacrylate polymer is not particularly limited.
  • a polymer obtained by polymerizing one kind of methacrylic acid ester such as methacrylate, glycerin monomethacrylate, glycidyl methacrylate, 4,5-epoxybutyl methacrylate, 9,10-epoxystearyl methacrylate, and a copolymer obtained by copolymerizing two or more kinds.
  • Examples thereof include a polymer, a copolymer obtained by copolymerizing one or more kinds of methacrylic acid esters and one or more kinds of vinyl group-containing compounds other than the methacrylic acid esters.
  • vinyl group-containing compounds other than methacrylic acid esters include monovinyl compounds such as ethylene and propylene, aromatic polyvinyl compounds such as divinylbenzene and trivinylbenzene, and polyvinyl compounds such as butadiene, methylenebisacrylamide and triallyl isocyanurate. It is done.
  • a cross-linked structure may be introduced into these polymers or copolymers using a cross-linking agent such as epichlorohydrin, (poly) alkylene glycol diglycidyl ether, alkylene diisocyanate.
  • the styrene polymer is not particularly limited.
  • a polymer obtained by polymerizing one kind of styrene compound such as styrene, methyl styrene, ethyl styrene, hydroxy styrene, chlorostyrene, or the like is used.
  • examples thereof include a copolymer obtained by polymerization, and a copolymer obtained by copolymerizing one or more styrene compounds and one or more vinyl group-containing compounds other than styrene compounds.
  • vinyl group-containing compounds other than styrenic compounds include monovinyl compounds such as ethylene and propylene, aromatic polyvinyl compounds such as divinylbenzene and trivinylbenzene, and polyvinyl compounds such as butadiene, methylenebisacrylamide and triallyl isocyanurate. It is done.
  • a cross-linked structure may be introduced into these polymers or copolymers using a cross-linking agent such as epichlorohydrin, (poly) alkylene glycol diglycidyl ether, alkylene diisocyanate.
  • the substrate is preferably a porous particle or a porous membrane.
  • the substrate is a porous particle or a porous film, the surface area is increased, and the processing capacity per unit time can be increased.
  • the pore volume when the substrate is a porous particle or a porous membrane is not particularly limited, but the pore volume measured by a mercury porosimeter is preferably 0.2 mL / g to 10 mL / g, more preferably Is in the range of 0.2 mL / g to 5.0 mL / g.
  • the pore volume is within this range, the antibody adsorption capacity and purification purity are improved. Further, the mechanical strength does not decrease.
  • the specific surface area when the substrate is a porous particle or a porous film is not particularly limited, but the specific surface area (BET specific surface area) measured by the BET (Brunauer, Emmett, Teller) method is preferably 2 m 2. / G to 1500 m 2 / g, more preferably within the range of 5 m 2 / g to 1000 m 2 / g. When the specific surface area is within this range, the antibody adsorption capacity and purification purity are improved.
  • the average particle diameter when the substrate is porous particles is not particularly limited, but is preferably in the range of 0.5 ⁇ m to 1000 ⁇ m, more preferably 1 ⁇ m to 250 ⁇ m, and still more preferably 2 ⁇ m to 150 ⁇ m.
  • the average particle diameter of the porous particles can be measured by a known method. For example, an average particle diameter can be obtained by measuring 100 or more particle diameters with an optical microscope and calculating a volume median diameter from the distribution.
  • Examples of commercially available substrates include Sepharose series (manufactured by GE Healthcare) (“SEPHAROSE” is a registered trademark), Cellufine series (manufactured by JNC), which is a cellulosic crosslinking carrier. (“CELLUFINE” is a registered trademark), Sephacryl series (manufactured by GE Healthcare), which is a cross-linked polymer of allyldextran and N, N'-methylenebisacrylamide (“SEPHACRYL” is a registered trademark), an acrylate carrier Toyopearl HW series (manufactured by Tosoh Corporation) (“Toyopearl” and “TOYOPEARL” are registered trademarks) are included, but are not limited thereto.
  • the hydrophilic polymer is at least one selected from the group consisting of hydrophilic polysaccharides. Moreover, a hydrophilic polymer may be used individually by 1 type, and may be used in combination of 2 or more type.
  • the hydrophilicity of the polymer or polysaccharide means that it contains at least one kind of hydrophilic group.
  • the hydrophilic group is preferably a carboxy group, an alkali metal salt of a carboxy group, a sulfoxy group, an alkali metal salt of a sulfoxy group, a hydroxy group, an amide group, a carbamoyl group, a sulfonamide group, a sulfamoyl group, a phosphoric acid group, or phosphoric acid
  • functional groups such as alkali metal salts of groups, oxyphosphate groups, and alkali metal salts of oxyphosphate groups.
  • hydrophilic groups may be present at any position in the polymer, for example, may be bonded to the polymer side chain directly or via a linking group, or may be bonded to the polymer side chain or the graft side chain. It may be.
  • a plurality of hydrophilic groups are preferably present in one molecule.
  • the hydrophilic polysaccharide is not particularly limited, but is preferably at least one selected from dextran, carboxymethyl dextran, and pullulan, and more preferably dextran, because of its high effect of improving purification purity.
  • ⁇ Coating the base material with a hydrophilic polymer increases the hydrophilicity of the surface of the affinity chromatography carrier of the present invention and suppresses the adsorption of non-specific adsorbents, thereby improving the purification purity.
  • the molecular weight of the hydrophilic polymer is not particularly limited, but is an intrinsic viscosity, preferably 0.10 dL / g or more, more preferably 0.10 dL / g to 0.90 dL / g, and still more preferably 0.12 dL / g to 0. Within the range of .90 dL / g, more preferably 0.12 dL / g to 0.30 dL / g, even more preferably 0.17 dL / g to 0.25 dL / g. When the intrinsic viscosity is within this range, the purification purity is further improved.
  • the intrinsic viscosity is determined by determining the viscosity of several polymer solutions having different concentrations according to the viscosity measurement method in the general measurement method listed in the 16th revised Japanese Pharmacopoeia, the first method “capillary viscometer method”. Can be obtained by measuring the concentration dependence of the curve and extrapolating the obtained straight line concentration to zero.
  • K and ⁇ are constants determined by the type of polymer, the type of solvent, and the temperature.
  • ⁇ Dextran intrinsic viscosity
  • Mw Dextran weight average molecular weight
  • the coating amount of the hydrophilic polymer (hereinafter sometimes simply referred to as “hydrophilic polymer coating amount”) is not particularly limited, but is preferably 3 mg / g-dry gel to 500 mg / g-dry gel, and more preferably. Is 3 mg / g-dry gel to 350 mg / g-dry gel, more preferably 10 mg / g-dry gel to 300 mg / g-dry gel, more preferably 20 mg / g-dry gel to 240 mg / g-dry gel. It is.
  • the hydrophilic polymer coating amount is within this range, the hydrophilicity of the surface of the affinity chromatography carrier of the present invention is moderately increased to suppress the adsorption of nonspecific adsorbents, and there is room for the antibody to diffuse and penetrate into the substrate.
  • the purification purity is further improved because a large amount remains and the antibody adsorption capacity increases.
  • the hydrophilic polymer does not need to cover the entire surface of the base material, and may cover at least a part of the base material.
  • the hydrophilic polymer coating amount [unit: mg / g-dry gel] is the dry weight (W P ) [unit: mg] of the coated hydrophilic polymer, and the dry weight (W 0) of the substrate before coating. ) [Unit: g-dry gel].
  • the dry weight (W P ) of the hydrophilic polymer is the difference (W 1 ⁇ W 0 ) [unit: mg] between the dry weight (W 1 ) of the whole carrier and the dry weight (W 0 ) of the base material before coating. is there. Therefore, the hydrophilic polymer coating amount can be obtained by the following equation.
  • the dry weight (W 1 ) of the whole carrier can be calculated in the same manner.
  • the affinity ligand is at least one selected from the group consisting of an antibody binding protein and an antibody binding polypeptide, preferably at least one selected from antibody binding proteins.
  • a polypeptide is a molecule containing a peptide chain composed of 2 to 50 amino acid residues, and generally means a molecule having a molecular weight of less than 5000.
  • a protein is a molecule containing a peptide chain consisting of 51 or more amino acid residues, and generally means a molecule having a molecular weight of 5000 or more.
  • the antibody-binding protein is not particularly limited as long as it is a protein that binds to an antibody by an antigen-antibody reaction, and examples thereof include protein A, protein G, protein L, protein D, and a modified protein A.
  • protein A protein A or a variant thereof is preferable.
  • protein A variant alkali resistant protein A is preferred.
  • the antibody-binding polypeptide is not particularly limited as long as it is a polypeptide that binds to an antibody by an antigen-antibody reaction.
  • a polypeptide having the same amino acid sequence as part of the amino acid sequence of the antibody-binding domain of protein A and its polypeptide Modifications and the like can be mentioned.
  • the antibody-binding polypeptide variant is preferably an alkali-resistant variant.
  • affinity ligand introduced amount is not particularly limited, but is preferably 0.01 mmol / L-gel to 100 mmol / L-gel.
  • the amount of carboxy group introduced into the affinity chromatography carrier of the present invention (hereinafter sometimes simply referred to as “carboxy group introduced amount”) is 15 mmol / L-gel to 60 mmol / L-gel, preferably 15 mmol / L in terms of ion exchange capacity. L-gel to 55 mmol / L-gel, more preferably 15 mmol / L-gel to 40 mmol / L-gel.
  • the carboxy group introduction amount is within this range, the affinity ligand introduction amount can be within an appropriate range, and the antibody adsorption capacity is improved. Moreover, adsorption
  • the affinity chromatography carrier of the present invention can be produced by coating a substrate with a hydrophilic polymer, introducing a carboxy group, and further introducing an affinity ligand.
  • the base material, hydrophilic polymer and affinity ligand are as already described in “Affinity Chromatography Carrier”.
  • the substrate is coated with a hydrophilic polymer.
  • the method for coating the base material with the hydrophilic polymer is not particularly limited as long as the hydrophilic polymer can be covalently bonded to the base material.
  • chloromethyloxirane epichlorohydrin is applied to the base material.
  • a crosslinking agent such as chloromethyloxirane (epichlorohydrin).
  • a method of reacting a reaction product with a hydrophilic polymer a method of introducing a halogen group such as a chloro group into a substrate using a halogenating agent, and immobilizing the hydrophilic polymer using a Williamson ether synthesis method, etc. Can be mentioned.
  • the hydrophilic polymer coating amount is preferably 3 mg / g-dry gel to 500 mg / g-dry gel, more preferably 3 mg / g-dry gel to 350 mg / 350 mg / g-dry gel.
  • g-dry gel more preferably 10 mg / g-dry gel to 300 mg / g-dry gel, and even more preferably 20 mg / g-dry gel to 240 mg / g-dry gel.
  • a substrate immediately before coating with a hydrophilic polymer is referred to as a “pre-coating substrate”, and a substrate coated with a hydrophilic polymer may be referred to as a “carrier”.
  • a carboxy group is introduced into the carrier.
  • the method for introducing a carboxy group into the carrier is not particularly limited as long as the compound having a carboxy group can be covalently bonded to the carrier.
  • chloroacetic acid is added to the carrier under alkaline conditions.
  • a method of introducing a carboxymethyl group into a part of the hydroxyl group on the surface of the carrier by reaction, an aldehyde group being introduced into the carrier, and a reductive amination via the amino group of a compound having a carboxy group such as an amino acid and an amino group The method of introduce
  • the amount of carboxy group introduced is 15 mmol / L-gel to 60 mmol / L-gel, preferably 15 mmol / L-gel to 55 mmol / L-gel, more preferably 15 mmol in terms of ion exchange capacity. / L-gel to 40 mmol / L-gel.
  • a carrier in which a carboxy group is introduced may be referred to as a “carboxylated carrier”.
  • An affinity ligand is introduced (immobilized) onto the carboxylated carrier.
  • the method for introducing (immobilizing) the affinity ligand into the carboxylated carrier is not particularly limited as long as the affinity ligand can be covalently bound to the carboxylated carrier.
  • the portion is converted into EDC (N- (3-dimethylaminopropyl) -N'-ethylcarbodiimide); N- (3-dimethylaminopropyl) -N'-ethylcarbodiimide) / NHS (N-hydroxysuccinimide; N-hydroxysuccinimide)
  • EDC N- (3-dimethylaminopropyl) -N'-ethylcarbodiimide
  • NHS N-hydroxysuccinimide
  • Gand introducing Gand.
  • the amount of the affinity ligand introduced is preferably 0.01 mmol / L-gel to 100 mmol / L-gel, more preferably 0.05 mmol / L-gel to 50 mmol / L. -Gel, more preferably 0.10 mmol / L-gel to 10 mmol / L-gel, more preferably 0.10 mmol / L-gel to 2.0 mmol / L-gel, and even more preferably 0.10 mmol / L-gel ⁇ 1.0 mmol / L-gel, more preferably 0.10 mmol / L-gel to 0.50 mmol / L-gel.
  • the amount of carboxy group introduced into the affinity chromatography carrier when the affinity ligand is bound to a part of the carboxy group of the carboxylated carrier is represented by “the amount of carboxy group introduced into the carboxylated carrier ⁇ the amount of affinity ligand introduced into the affinity chromatography carrier”.
  • the biological material purified by the affinity chromatography carrier of the present invention is not particularly limited, but is preferably an antibody or antibody derivative, more preferably immunoglobulin G or a derivative thereof.
  • Antibody refers to immunoglobulins or analogs, fragments or fusions thereof.
  • an analog refers to a natural or artificially produced protein or protein conjugate in which the structure or function of an immunoglobulin is at least partially retained.
  • a fragment refers to a protein having a partial structure of an immunoglobulin produced by enzymatic treatment or genetic engineering design.
  • the fusion includes an Fc fusion protein (Fc-containing molecule) formed by fusing an Fc (Fragment crystallizable) region, which is a constant region of an immunoglobulin molecule, with another functional protein or peptide. .
  • immunoglobulins include IgG (Immunoglobulin G; immunoglobulin G), IgM (Immunoglobulin M; immunoglobulin M), IgA (Immunoglobulin ⁇ A; immunoglobulin A), IgD (Immunoglobulin D; immunoglobulin D) and Any of the five classes (isotypes) of IgE (Immunoglobulin E; immunoglobulin E) may be used, but IgG or IgM is preferred, and IgG is more preferred.
  • Antibody derivatives include chimeric antibodies in which the Fc region of human immunoglobulin and the Fab region of non-human mammal immunoglobulin are fused, some Fc regions of human immunoglobulin and some non-human mammalian immunoglobulins Antibody fused to the Fv region of human, humanized form of human immunoglobulin fused with the remaining portion excluding CDR (Complementarity Determining Region) portion and non-human mammalian immunoglobulin CDR portion Antibody, chimeric antibody in which Fc region of non-human mammal immunoglobulin and Fab (Fragment, antigen binding) region of human immunoglobulin are fused, some Fc region of non-human mammal immunoglobulin and human Chimeric antibody fused with several Fv regions of immunoglobulin, CDR portion of human immunoglobulin A non-human mammalized antibody obtained by fusing the removed remaining portion with the CDR portion of a non-human mammal immunoglobulin, a Fc region of
  • the purification of biological material (especially antibodies) using an affinity chromatography carrier is roughly composed of four steps of an adsorption step, a washing step, an ionic strength adjustment step, and an elution step, and a subsequent regeneration step and / or CIP (A cleaning-in-place process, a re-equilibration process, and the like may be included.
  • a general affinity chromatography purification method can be used. That is, in one example, after adjusting the pH of a protein solution containing immunoglobulin G to be near neutral, the solution is passed through a column packed with the affinity chromatography carrier of the present invention, and immunized via an affinity ligand. Globulin G is specifically adsorbed on an affinity chromatography carrier.
  • its loading pH that is, the pH at the time of addition of a biological substance is preferably 5.0 to 9.0, more preferably 5.3 to 9.0, Preferably it is 5.5 to 9.0, and more preferably 6.0 to 8.5.
  • ionic strength is not particularly required to be adjusted, and nonspecific adsorption can be further suppressed by increasing the ionic strength in advance.
  • the washing step an appropriate amount of a buffer solution in a condition range in which the affinity ligand functions is passed through to wash the column interior. That is, the preferable range of the pH may be the same as that at the time of loading, for example, preferably 5.0 to 9.0.
  • immunoglobulin G is adsorbed on the affinity chromatography carrier of the present invention.
  • impurities may be effectively removed by ionic strength or composition optimization at a pH near neutral.
  • a condition in which the carboxy group does not function is preferable, that is, it is preferable to use a washing liquid having a certain ionic strength and a neutral pH, and in this process, via an affinity chromatography carrier and / or immunoglobulin G. Impurities remaining on the column non-specifically can be washed.
  • the ionic strength is, for example, preferably 0.2M or more, and more preferably 0.5M or more.
  • the column is replaced with a buffer solution having a low ionic strength near neutrality, in preparation for the expression of an ionic strength-dependent elution function by carboxy groups during elution.
  • a combination of acidic pH and ionic strength allows the cation exchange separation mode to function during elution from affinity ligands, and the high monomer content fraction is eluted at a low ionic strength through the concerted action of both ligands. Can be collected in fractions.
  • the pH of the eluate the pH at the time of elution of immunoglobulin G from the affinity ligand can be applied. Since this pH is determined mainly by the separation conditions determined by the affinity chromatography carrier and the type of immunoglobulin G, no special condition setting is required.
  • the pH during elution is preferably set to 2.0 to 5.0.
  • the pH is more preferably 2.8 or more, further preferably pH 3.0 or more, and still more preferably pH 3.2 or more.
  • the pH is preferably 5.0 or less, more preferably 4.8 or less.
  • the pH during elution is generally preferably set to 3.5 to 4.0, but is not limited thereto.
  • the elution ionic strength depends not only on the ratio of affinity ligand and carboxy group introduction, but also on the amount of immunoglobulin G loaded per unit volume, but it can be optimized by gradient or stepwise elution experiments. Can be set easily.
  • Antibody elution from an affinity chromatography carrier prepared according to the present invention can be applied by salt concentration gradient elution or stepwise elution, but stepwise elution by ionic strength is preferred for the purpose of reducing the amount of eluate. . Furthermore, in order to simplify the operation, it is preferable to set conditions that can achieve antibody recovery and high purification purity by one-step elution.
  • the ionic strength adjustment step can be omitted if aggregates remain in the column and are not mixed into the elution fraction even with a combination of ionic strength and acidic pH in the washing step.
  • a biological material purified by the purification method of the present invention does not change its structure and properties before and after purification, but has a high purity. However, how high it is depends on the solution before purification, etc., so it cannot be generally stated.
  • Immunoglobulin G purified using an affinity chromatography carrier prepared according to the present invention exhibits higher monomer selectivity than an affinity chromatography carrier based on a single separation mode, and has a high monomer content in its eluate.
  • affinity chromatography carrier based on the single separation mode
  • affinity chromatography carrier of the present invention highly specific affinity purification and the improvement of the monomer content that can be achieved mainly by cation exchange chromatography can be achieved with a single chromatographic operation while maintaining a high recovery rate. Therefore, it is possible to reduce the load on the subsequent process and contribute to the improvement of the yield of the whole process and the improvement of the monomer content. That is, the use of the novel affinity chromatography carrier of the present invention can contribute to improvement in productivity and purification of antibody drug manufacturing processes.
  • Measurement method and evaluation method 1. Measuring method of hydrophilic polymer coating amount Wet gel weight of base material before coating used in hydrophilic polymer coating reaction by measuring 5 g of wet gel of base material before coating under reduced pressure at 50 ° C. until there is no change in weight. From this product, the dry weight of the base material before coating was determined. Next, 5 g of the wet gel of the carrier obtained by coating the substrate before coating with the hydrophilic polymer was dried under reduced pressure at 50 ° C. until there was no weight change, and the weight was measured. From the product of the wet gel weight, the dry weight of the carrier was determined.
  • the difference between the dry weight of the carrier and the dry weight of the substrate before coating was defined as the dry weight of the hydrophilic polymer coating the substrate before coating.
  • the hydrophilic polymer coating amount was calculated as the dry weight of the hydrophilic polymer per dry weight of the substrate before coating.
  • the carboxylated carrier is taken out, transferred to a 100 mL beaker, suspended in 40 mL of 0.1 mol / L saline solution, and 0.1 mol / L of water using an automatic titrator “COM-1600” (manufactured by Hiranuma Sangyo Co., Ltd.). Titrated with aqueous sodium oxide.
  • Chromatography system AKTA york 25 (manufactured by GE Healthcare) (“AKTAAVANT” is a registered trademark)
  • Buffer 20 mM phosphate buffer, 150 mM NaCl, pH 7.4 Flow rate: 3mL / min
  • a cleaning solution (0.1 M sodium hydroxide aqueous solution) was flowed at the same flow rate, and then re-equilibrated solution (20 mM phosphate buffer, 150 mM NaCl, pH 7.4). At a flow rate of 5 mL.
  • the antibody elution amount of the eluate in each fraction was calculated from the IgG elution peak obtained by monitoring the absorbance at 280 nm. The amount of antibody eluted from the pre-elution washing solution to the CIP solution was calculated as the antibody adsorption capacity.
  • Example 2 Evaluation of antibody adsorption capacity
  • the antibody adsorption capacity was evaluated based on the antibody adsorption capacity when only carboxy group and protein A were introduced. That is, for Examples 1 to 7, Comparative Examples 1 to 6, Comparative Example 8 and Reference Example 1 (Examples in which the base material is a polysaccharide, Comparative Example and Reference Example), Comparative Example 4 was compared with Example 8 and Comparative Example 1.
  • Example 7 Example and Comparative Example in which the substrate is a methacrylate polymer
  • the antibody adsorption capacity was evaluated using Comparative Example 7 as a reference.
  • Antibody adsorption capacity is 40% or more of the standard ... Evaluation of antibody adsorption capacity "A"
  • Antibody adsorption capacity is less than 40% of standard ... Evaluation of antibody adsorption capacity "C"
  • IgG and CHO-S (Chinese Hamster Ovary S) cell-derived HCPs were 1.6 mg / mL, 0.
  • the IgG / HCP mixture prepared using a standard buffer (20 mM phosphate buffer, 150 mM NaCl, pH 7.4) so as to be 32 mg / mL was 80% of the antibody adsorption capacity obtained in (1) above.
  • the amount of the solution that would load the amount of antibody was added at a flow rate of 0.21 mL / min.
  • the purification purity was calculated by the following equation as the HCP contamination amount in the eluate, that is, the HCP amount per IgG amount in the eluate.
  • Example 1 Manufacture of affinity chromatography carrier (1) Preparation of wet gel Cross-linked agarose base material “Sepharose 6 Fast Flow” (manufactured by GE Healthcare) (“SEPHAROSE” is a registered trademark), glass filter Above, it wash
  • “Sepharose 6FF” means “Sepharose 6 Fast Flow”.
  • the dextran coating amount of the obtained carrier was measured according to the above-mentioned “Method for measuring hydrophilic polymer coating amount”.
  • the obtained hydrophilic polymer coating amount is shown in the column “Hydrophilic polymer coating amount” in Table 1.
  • the amount of carboxy group introduced into the obtained carboxylated carrier was measured according to the above-described “Method for measuring the amount of carboxy group introduced”.
  • the obtained introduction amount of carboxy group is shown in the column of introduction amount of carboxy group in Table 1.
  • the amount of carboxy group introduced into the affinity chromatography carrier was expressed as “carboxy group introduced amount of carboxylated carrier ⁇ affinity ligand introduced amount”.
  • the EDC solution was prepared by dissolving 0.2 g of EDC in 2 mL of DMSO (dimethyl sulfoxide), and the NHS solution was prepared by dissolving 0.2 g of NHS in 2 mL of DMSO. is there.
  • the reaction gel solution was transferred to a disposable column and washed with 6 mL of ice-cold 1 mM hydrochloric acid to obtain an EDC / NHS activated carboxylated carrier.
  • the amount of protein A immobilized (the amount of introduced affinity ligand) of the obtained protein A-immobilized carboxylated carrier was measured according to the above-described “Method for measuring the amount of introduced affinity ligand (protein A immobilized amount)”.
  • the obtained protein A immobilization amount is shown in the column “Affinity ligand introduction amount” in Table 1.
  • Example 2 Production of Affinity Chromatography Carrier Protein A was prepared in the same manner as in Example 1 except that the amount of sodium chloroacetate used in the preparation of carboxylated carrier (introduction of carboxy group) was changed from 6.2 g to 3.6 g. A fixed carboxylated support was prepared. Further, in the same manner as in Example 1, the hydrophilic polymer coating amount, the carboxy group introduction amount, and the affinity ligand introduction amount were measured. The measurement results are shown in the columns of “hydrophilic polymer coating amount”, “carboxy group introduction amount” and “affinity ligand introduction amount” in Table 1, respectively.
  • Example 3 Production of Affinity Chromatography Carrier Protein A was prepared in the same manner as in Example 1 except that the amount of sodium chloroacetate used in the preparation of carboxylated carrier (introduction of carboxy group) was changed from 6.2 g to 11.7 g. A fixed carboxylated support was prepared. Further, in the same manner as in Example 1, the hydrophilic polymer coating amount, the carboxy group introduction amount, and the affinity ligand introduction amount were measured. The measurement results are shown in the columns of “hydrophilic polymer coating amount”, “carboxy group introduction amount” and “affinity ligand introduction amount” in Table 1, respectively.
  • Example 4 Manufacture of affinity chromatography carrier
  • the amount of dextran 70 (intrinsic viscosity 0.23 dL / g, weight average molecular weight about 70,000) used for carrier preparation (coating with hydrophilic polymer) was changed from 13 g to 66 g, and In the same manner as in Example 1, except that the amount of sodium chloroacetate used in preparation of the carboxylated carrier (introduction of carboxy group) was changed from 6.2 g to 2.0 g, Manufactured. Further, in the same manner as in Example 1, the hydrophilic polymer coating amount, the carboxy group introduction amount, and the affinity ligand introduction amount were measured. The measurement results are shown in the columns of “hydrophilic polymer coating amount”, “carboxy group introduction amount” and “affinity ligand introduction amount” in Table 1, respectively.
  • Example 5 Production of Affinity Chromatographic Carrier
  • the cross-linked agarose base material used in the preparation of the wet gel was changed to “Sepharose 4 Fast Flow” (manufactured by GE Healthcare) (“SEPHAROSE” is a registered trademark)
  • SEPHAROSE is a registered trademark
  • the amount of sodium chloroacetate used in the preparation of the carboxylated carrier was changed from 2.0 g to 3.9 g.
  • a carboxylated carrier was produced.
  • “Sepharose 4FF” means “Sepharose 4 Fast Flow”.
  • the hydrophilic polymer coating amount, the carboxy group introduction amount, and the affinity ligand introduction amount were measured. The measurement results are shown in the columns of “hydrophilic polymer coating amount”, “carboxy group introduction amount” and “affinity ligand introduction amount” in Table 1, respectively.
  • Example 6 Production of affinity chromatography carrier Dextran 40 (intrinsic viscosity 0.17 dL / g) instead of dextran 70 (intrinsic viscosity 0.23 dL / g, weight average molecular weight of about 70,000) during carrier preparation (coating with hydrophilic polymer) , Weight average molecular weight of about 40,000) and the amount of sodium chloroacetate used in the preparation of the carboxylated carrier (introduction of carboxy group) was changed from 3.9 g to 4.5 g. In the same manner as in Example 5, a protein A-immobilized carboxylated carrier was produced.
  • hydrophilic polymer coating amount the carboxy group introduction amount, and the affinity ligand introduction amount were measured.
  • the measurement results are shown in the columns of “hydrophilic polymer coating amount”, “carboxy group introduction amount” and “affinity ligand introduction amount” in Table 1, respectively.
  • Example 7 Production of affinity chromatography carrier
  • dextran 70 Intrinsic viscosity 0.23 dL / g, weight average molecular weight of about 70,000
  • dextran 19 Intrinsic viscosity 0.12 dL / g
  • the amount of sodium chloroacetate used in the preparation of the carboxylated carrier was changed from 3.9 g to 5.7 g.
  • a protein A-immobilized carboxylated carrier was produced.
  • hydrophilic polymer coating amount the carboxy group introduction amount, and the affinity ligand introduction amount were measured.
  • the measurement results are shown in the columns of “hydrophilic polymer coating amount”, “carboxy group introduction amount” and “affinity ligand introduction amount” in Table 1, respectively.
  • Example 8 Manufacture of Affinity Chromatography Carrier (1) Preparation of Wet Gel Methacrylate porous substrate “TOYOPEARL HW-65F” (manufactured by Tosoh Corporation) (“Toyopearl” and “TOYOPEARL” are registered trademarks), glass On the filter, it was washed by repeating suspension and filtration using pure water to obtain a base slurry. Pure water was removed from the substrate slurry by suction filtration to obtain a wet gel.
  • TOYOPEARL HW-65F manufactured by Tosoh Corporation
  • Example 1 Production of Affinity Chromatography Carrier Protein A was prepared in the same manner as in Example 1 except that the amount of sodium chloroacetate used in the preparation of carboxylated carrier (introduction of carboxy group) was changed from 6.2 g to 1.8 g. A fixed carboxylated support was prepared. Further, in the same manner as in Example 1, the hydrophilic polymer coating amount, the carboxy group introduction amount, and the affinity ligand introduction amount were measured. The measurement results are shown in the columns of “hydrophilic polymer coating amount”, “carboxy group introduction amount” and “affinity ligand introduction amount” in Table 1, respectively.
  • Example 2 Production of Affinity Chromatography Carrier Protein A was prepared in the same manner as in Example 1 except that the amount of sodium chloroacetate used in the preparation of carboxylated carrier (introduction of carboxy group) was changed from 6.2 g to 22.7 g. A fixed carboxylated support was prepared. Further, in the same manner as in Example 1, the hydrophilic polymer coating amount, the carboxy group introduction amount, and the affinity ligand introduction amount were measured. The measurement results are shown in the columns of “hydrophilic polymer coating amount”, “carboxy group introduction amount” and “affinity ligand introduction amount” in Table 1, respectively.
  • [Comparative Example 3] Manufacture of affinity chromatography carrier (1) Preparation of carrier-coating with hydrophilic polymer A wet gel of carrier was obtained in the same manner as in Example 1. Further, the dextran coating amount of the obtained carrier was measured in the same manner as in Example 1 according to the above-mentioned “Method for measuring hydrophilic polymer coating amount”. The obtained hydrophilic polymer coating amount is shown in the column “Hydrophilic polymer coating amount” in Table 1. (2) Preparation of protein A-immobilized carrier-introduction of affinity ligand The obtained carrier is placed in a disposable column for 4 mL as a wet volume, washed by repeating suspension and filtration with pure water, A slurry was obtained.
  • the 20 mg / mL protein A solution comprises a genetically modified natural protein A “rSPA” (manufactured by Repligen) in a 200 mM MES (2- (N-morpholino) ethanesulfonic acid; 2- (N-morpholino) ethanesulfonic acid) buffer. It was prepared by dissolving in (pH 7.4).
  • the amount of protein A immobilized (affinity ligand introduction amount) of the obtained protein A immobilization carrier was measured according to the above-mentioned “Method for measuring affinity ligand introduction amount (protein A immobilization amount)”.
  • the obtained protein A immobilization amount is shown in the column “Affinity ligand introduction amount” in Table 1.
  • Example 1 After the total amount of the aqueous sodium hydroxide solution was added dropwise, the reaction was further continued for 3 hours, and washing was carried out by repeatedly suspending and filtering using pure water on a glass filter to obtain a wet gel of a carboxylated carrier. Using the obtained carboxylated carrier, a protein A-fixed carboxylated carrier was obtained in the same manner as in Example 1.
  • hydrophilic polymer coating amount and the carboxy group introduction amount were measured.
  • the measurement results are shown in the columns of “hydrophilic polymer coating amount” and “carboxy group introduction amount” in Table 1, respectively.
  • the antibody adsorption capacity was evaluated according to the following evaluation criteria, based on the antibody adsorption capacity when only carboxy group and protein A were introduced.
  • the antibody adsorption capacity was evaluated based on Comparative Example 4.
  • Antibody adsorption capacity is 40% or more of the standard ... Evaluation of antibody adsorption capacity "A”
  • Antibody adsorption capacity is less than 40% of standard ... Evaluation of antibody adsorption capacity "C”
  • IgG and CHO-S (Chinese Hamster Ovary S) cell-derived HCPs were adjusted to 1.6 mg / mL and 0.64 mg / mL, respectively.
  • An IgG / HCP mixture prepared using a standard buffer (10 mM acetate buffer, pH 4.7) was loaded with 80% of the antibody adsorption capacity obtained in (1) above. The amount of solution was added at a flow rate of 0.21 mL / min.
  • the IgG elution amount of the eluate in each fraction was calculated from the IgG elution peak obtained by monitoring the absorbance at 280 nm.
  • the eluate of each fraction was collected, and the HCP amount of the eluate in each fraction was calculated by an ELISA method using a host cell-derived protein detection kit “CHO HCP 3rd Generation ELISA kit” (manufactured by Cygnus Technologies). did.
  • the purification purity was calculated by the following equation as the HCP contamination amount in the eluate, that is, the HCP amount per IgG amount in the eluate.
  • HCP contamination amount (ppm) HCP amount of eluate / IgG amount of eluate
  • Ppm carboxy group and protein A were introduced
  • Example 6 and Example 8 the purification purity of Example 6 in which the base material is a cross-linked agarose system was “A” evaluation, whereas the base material is a methacrylate system. Since the purification purity of No. 8 was “B” evaluation, it was suggested that the cross-linked agarose base material is superior in purity to the methacrylate base material. In Examples 1 and 4 in which the coating amount of the hydrophilic polymer is significantly different, the evaluation of the purification purity is “A” evaluation. Therefore, the evaluation of the purification purity between Example 6 and Example 8 is as follows. Is considered to be due to whether the substrate is a crosslinked agarose (Example 6) or a methacrylate (Example 8).

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Solid-Sorbent Or Filter-Aiding Compositions (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Treatment Of Liquids With Adsorbents In General (AREA)
  • Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)

Abstract

基材、親水性ポリマーおよびアフィニティリガンドを有するアフィニティクロマトグラフィ担体であって、上記基材は多糖類、アクリレート系重合体、メタクリレート系重合体およびスチレン系重合体からなる群から選択される少なくとも１種からなり、上記親水性ポリマーは親水性多糖類からなる群から選択される少なくとも１種であり、上記アフィニティリガンドは抗体結合性タンパク質および抗体結合性ポリペプチドからなる群から選択される少なくとも１種であり、上記アフィニティクロマトグラフィ担体にはカルボキシ基が導入され、上記カルボキシ基の導入量がイオン交換容量で１５ｍｍｏｌ／Ｌ－ｇｅｌ～６０ｍｍｏｌ／Ｌ－ｇｅｌである、精製純度に優れたアフィニティクロマトグラフィ担体が提供される。

Description

アフィニティクロマトグラフィ担体および生体物質の精製方法
　本発明は、アフィニティクロマトグラフィ担体および生体物質の精製方法に関する。
　近年、遺伝子工学、タンパク質工学および細胞工学の発展に伴い、抗体医薬品と呼ばれる、抗体の有する機能を利用した医薬品の開発が盛んに行われている。抗体医薬品は、従来の医薬品と比べて、標的分子に対してより特異的に働くために、副作用をより軽減させ、かつ、高い治療効果が得られることが期待されており、実際に様々な病態の改善に寄与している。
　一方、抗体医薬品は、生体に大量に投与されることから、他の組み換えタンパク質医薬品と比べた場合に、その純度が品質に与える影響は大きい。抗体医薬品は、遺伝子組換えにより宿主細胞に発現させた抗体を精製して製造されるため、宿主細胞および製造工程に由来する不純物の混入が問題となる。例えば、抗体医薬品に不純物として残留した宿主細胞由来タンパク質（ＨＣＰ；Host Cell Protein）は、抗体医薬品投与時のアナフィラキシー発症との関連が疑われているため、精製純度を改善し、不純物を減少させることが求められている。
　例えば、特許文献１には、タンパク質製剤などの分離精製に適したクロマトグラフィ担体として、多孔性セルロース粒子に、極限粘度０．２１ｄＬ／ｇ～０．９０ｄＬ／ｇを有する多糖類が付加してなる多孔性セルロース系ゲルであって、多孔性セルロース系ゲルの単位体積あたりの乾燥重量が、多孔性セルロース粒子の単位体積あたりの乾燥重量の１．０６倍～１．４０倍であることを特徴とする多孔性セルロース系ゲルに、リガンドとしてスルホキシ基を付加してなるクロマトグラフィ担体が開示されている。
　また、例えば、特許文献２には、特定の分子に特異的に結合する機能を有するアフィニティリガンドを水不溶性担体に固定化してなるアフィニティクロマトグラフィ担体が、生体成分や組換え体を含む微生物および哺乳類細胞培養細胞からの、有用物質の効率的な分離精製に利用されていることが記載され、抗体精製の高純度化を図ったアフィニティクロマトグラフィ担体として、アフィニティリガンドと陽イオン交換基を同一の担体に有するアフィニティクロマトグラフィ担体が開示されている。
国際公開第２０１０／０９５６７３号 国際公開第２０１４／０３４４５７号
　しかしながら、本発明者は、特許文献１に記載された陽イオン交換クロマトグラフィ担体を検討したところ、本明細書に記載した参考例１に示されるように、抗体吸着容量は優れるが、精製純度に改善の余地があることを知得した。
　また、本発明者は、特許文献２に記載されたアフィニティクロマトグラフィ担体を検討したところ、アフィニティリガンドと陽イオン交換基を同一担体に有するアフィニティクロマトグラフィ担体が有利と思われるが、本明細書に記載した比較例４および比較例５に示されるように、抗体吸着容量は優れるが、精製純度に改善の余地があることを知得した。
　そこで、本発明は、抗体吸着容量および精製純度に優れたアフィニティクロマトグラフィ担体を提供することを目的とする。
　本発明者は、上記目的を達成すべく鋭意検討を重ねた結果、基材、親水性ポリマーおよびアフィニティリガンドを有するアフィニティクロマトグラフィ担体において、基材が多糖類、アクリレート系重合体、メタクリレート系重合体およびスチレン系重合体からなる群から選択される少なくとも１種からなり、親水性ポリマーが親水性多糖類からなる群から選択される少なくとも１種であり、アフィニティリガンドが抗体結合性タンパク質および抗体結合性ポリペプチドからなる群から選択される少なくとも１種であり、アフィニティクロマトグラフィ担体にはカルボキシ基が導入され、カルボキシ基の導入量がイオン交換容量で１５ｍｍｏｌ／Ｌ－ｇｅｌ～６０ｍｍｏｌ／Ｌ－ｇｅｌであると、抗体吸着容量および精製純度に優れることを知得し、本発明を完成させた。
　すなわち、本発明は以下の［１］～［１４］を提供する。
　［１］　基材、親水性ポリマーおよびアフィニティリガンドを有するアフィニティクロマトグラフィ担体であって、
　上記基材は多糖類、アクリレート系重合体、メタクリレート系重合体およびスチレン系重合体からなる群から選択される少なくとも１種からなり、
　上記親水性ポリマーは親水性多糖類からなる群から選択される少なくとも１種であり、
　上記アフィニティリガンドは抗体結合性タンパク質および抗体結合性ポリペプチドからなる群から選択される少なくとも１種であり、
　上記アフィニティクロマトグラフィ担体にはカルボキシ基が導入され、
　上記カルボキシ基の導入量がイオン交換容量で１５ｍｍｏｌ／Ｌ－ｇｅｌ～６０ｍｍｏｌ／Ｌ－ｇｅｌである、アフィニティクロマトグラフィ担体。
　［２］　上記親水性ポリマーの極限粘度が０．１０ｄＬ／ｇ以上である、上記［１］に記載のアフィニティクロマトグラフィ担体。
　［３］　上記親水性ポリマーの被覆量が３ｍｇ／ｇ－ｄｒｙ　ｇｅｌ～５００ｍｇ／ｇ－ｄｒｙ　ｇｅｌである、上記［１］または［２］に記載のアフィニティクロマトグラフィ担体。
　［４］　上記基材が多糖類、アクリレート系重合体およびメタクリレート系重合体からなる群から選択される少なくとも１種からなる、上記［１］～［３］のいずれか１つに記載のアフィニティクロマトグラフィ担体。
　［５］　上記親水性ポリマーがデキストラン、カルボキシメチルデキストランおよびプルランからなる群から選択される少なくとも１種である、上記［１］～［４］のいずれか１つに記載のアフィニティクロマトグラフィ担体。
　［６］　上記基材が多孔質粒子である、上記［１］～［５］のいずれか１つに記載のアフィニティクロマトグラフィ担体。
　［７］　上記アフィニティリガンドが抗体と抗原抗体反応をする、上記［１］～［６］のいずれか１つに記載のアフィニティクロマトグラフィ担体。
　［８］　上記アフィニティリガンドがプロテインＡまたはその改変体である、上記［１］～［７］のいずれか１つに記載のアフィニティクロマトグラフィ担体。
　［９］　上記基材がセルロース、アガロース、デキストラン、キトサン、グルコマンナンおよびこれらに架橋構造を導入した架橋多糖類からなる群から選択される少なくとも１種からなり、
　上記親水性ポリマーがデキストラン、カルボキシメチルデキストランおよびプルランからなる群から選択される少なくとも１種の親水性多糖類であり、
　上記親水性多糖類の極限粘度が０．１２ｄＬ／ｇ～０．３０ｄＬ／ｇであり、
　上記親水性ポリマーの被覆量が１０ｍｇ／ｇ－ｄｒｙ　ｇｅｌ～２４０ｍｇ／ｇ－ｄｒｙ　ｇｅｌであり、
　上記カルボキシ基の導入量がイオン交換容量で１５ｍｍｏｌ／Ｌ－ｇｅｌ～５５ｍｍｏｌ／Ｌ－ｇｅｌであり、
　上記アフィニティリガンドがプロテインＡまたはその改変体であり、かつ、
　上記アフィニティリガンドの導入量が０．１０ｍｍｏｌ／Ｌ－ｇｅｌ～１．０ｍｍｏｌ／Ｌ－ｇｅｌである、上記［１］～［８］のいずれか１つに記載のアフィニティクロマトグラフィ担体。
　［１０］　上記基材がアクリレート系重合体およびメタクリレート系重合体からなる群から選択される少なくとも１種からなり、
　上記親水性ポリマーがデキストラン、カルボキシメチルデキストランおよびプルランからなる群から選択される少なくとも１種の親水性多糖類であり、
　上記親水性多糖類の極限粘度が０．１２ｄＬ／ｇ～０．３０ｄＬ／ｇであり、
　上記親水性ポリマーの被覆量が１０ｍｇ／ｇ－ｄｒｙ　ｇｅｌ～２５０ｍｇ／ｇ－ｄｒｙ　ｇｅｌであり、
　上記カルボキシ基の導入量がイオン交換容量で１５ｍｍｏｌ／Ｌ－ｇｅｌ～５５ｍｍｏｌ／Ｌ－ｇｅｌであり、
　上記アフィニティリガンドがプロテインＡまたはその改変体であり、かつ、
　上記アフィニティリガンドの導入量が０．１０ｍｍｏｌ／Ｌ－ｇｅｌ～１．０ｍｍｏｌ／Ｌ－ｇｅｌである、上記［１］～［８］のいずれか１つに記載のアフィニティクロマトグラフィ担体。
　［１１］　上記［１］～［１０］のいずれか１つに記載のアフィニティクロマトグラフィ担体を用いた生体物質の精製方法。
　［１２］　上記生体物質の添加時ｐＨが５．０～９．０である、上記［１１］に記載の精製方法。
　［１３］　上記生体物質の溶出時ｐＨが２．０～５．０である、上記［１１］または［１２］に記載の精製方法。
　［１４］　上記生体物質が抗体または抗体誘導体である、上記［１１］～［１３］のいずれか１つに記載の精製方法。
　本発明によれば、抗体吸着容量および精製純度に優れたアフィニティクロマトグラフィ担体が提供される。
　本発明のアフィニティクロマトグラフィ担体は、抗体結合性タンパク質および抗体結合性ポリペプチドからなる群から選択される少なくとも１種であるアフィニティリガンドと陽イオン交換基であるカルボキシ基との両方を持ち、かつ、カルボキシ基の導入量をイオン交換容量で１５ｍｍｏｌ／Ｌ－ｇｅｌ～６０ｍｍｏｌ／Ｌ－ｇｅｌの範囲内としたことにより、非特異的吸着量を小さくすることができ、精製純度を改善することができた。また、カルボキシ基はスルホキシ基よりもイオン強度が低く、非特異的吸着を抑制することができるため、有利である。
　以下に、本発明のアフィニティクロマトグラフィ担体およびその製造方法について詳細に説明する。
　なお、数値範囲について「～」の左右の数値は、その数値範囲に含まれるものとする。
［アフィニティクロマトグラフィ担体］
　本発明のアフィニティクロマトグラフィ担体は、基材、親水性ポリマーおよびアフィニティリガンドを有するアフィニティクロマトグラフィ担体であって、上記基材は多糖類、アクリレート系重合体、メタクリレート系重合体およびスチレン系重合体からなる群から選択される少なくとも１種からなり、上記親水性ポリマーは多糖類からなる群から選択される少なくとも１種であり、上記アフィニティリガンドは抗体結合性タンパク質および抗体結合性ポリペプチドからなる群から選択される少なくとも１種であり、上記アフィニティクロマトグラフィ担体にはカルボキシ基が導入され、上記カルボキシ基の導入量がイオン交換容量で１５ｍｍｏｌ／Ｌ－ｇｅｌ～６０ｍｍｏｌ／Ｌ－ｇｅｌである、アフィニティクロマトグラフィ担体である。
〈基材〉
　基材は、多糖類、アクリレート系重合体、メタクリレート系重合体およびスチレン系重合体からなる群から選択される少なくとも１種、好ましくは多糖類、アクリレート系重合体およびメタクリレート系重合体から選択される少なくとも１種、より好ましくは多糖類から選択される少なくとも１種である。また、基材は１種を単独で用いてもよいし、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
　多糖類は、特に限定されないが、例えば、セルロース、アガロース、デキストラン、キトサン、グルコマンナン等の天然多糖類およびこれら天然多糖類に架橋構造を導入した架橋多糖類などが挙げられる。架橋多糖類は、例えば、天然多糖類が有する水酸基に対して、エピクロルヒドリン、（ポリ）アルキレングリコールジグリシジルエーテル、アルキレンジイソシアネート等の架橋剤を用いて架橋構造を導入することにより製造することができる。
　多糖類は、好ましくはセルロース、架橋セルロース、アガロースおよび架橋アガロースから選択される少なくとも１種、より好ましくはアガロースおよび架橋アガロースから選択される少なくとも１種である。
　アクリレート系重合体は、特に限定されないが、例えば、アクリル酸メチル、アクリル酸エチル、アクリル酸ヒドロキシエチル、アクリル酸ヒドロキシプロピル、アクリル酸ブチル、アクリル酸ステアリル、アクリル酸２－エチルヘキシル、シクロヘキシルアクリレート、グリセリンモノアクリレート、グリシジルアクリレート、４，５－エポキシブチルアクリレート、９，１０－エポキシステアリルアクリレート等のアクリル酸エステルの１種を重合してなる重合体、２種以上を共重合してなる共重合体、アクリル酸エステルの１種以上とアクリル酸エステル以外のビニル基含有化合物の１種以上とを共重合してなる共重合体などが挙げられる。ここで、アクリル酸エステル以外のビニル基含有化合物としては、例えば、エチレン、プロピレン等のモノビニル化合物、ジビニルベンゼン、トリビニルベンゼン等の芳香族ポリビニル化合物、ブタジエン、メチレンビスアクリルアミド、イソシアヌル酸トリアリル等のポリビニル化合物が挙げられる。これらの重合体または共重合体に対して、エピクロルヒドリン、（ポリ）アルキレングリコールジグリシジルエーテル、アルキレンジイソシアネート等の架橋剤を用いて架橋構造を導入してもよい。
　メタクリレート系重合体は、特に限定されるものではないが、例えば、メタクリル酸メチル、メタクリル酸エチル、メタクリル酸ヒドロキシエチル、メタクリル酸ヒドロキシプロピル、メタクリル酸ブチル、メタクリル酸ステアリル、メタクリル酸２－エチルヘキシル、シクロヘキシルメタクリレート、グリセリンモノメタクリレート、グリシジルメタクリレート、４，５－エポキシブチルメタクリレート、９，１０－エポキシステアリルメタクリレート等のメタクリル酸エステルの１種を重合してなる重合体、２種以上を共重合してなる共重合体、メタクリル酸エステルの１種以上とメタクリル酸エステル以外のビニル基含有化合物の１種以上とを共重合してなる共重合体などが挙げられる。メタクリル酸エステル以外のビニル基含有化合物としては、例えば、エチレン、プロピレン等のモノビニル化合物、ジビニルベンゼン、トリビニルベンゼン等の芳香族ポリビニル化合物、ブタジエン、メチレンビスアクリルアミド、イソシアヌル酸トリアリル等のポリビニル化合物が挙げられる。これらの重合体または共重合体に対して、エピクロルヒドリン、（ポリ）アルキレングリコールジグリシジルエーテル、アルキレンジイソシアネート等の架橋剤を用いて架橋構造を導入してもよい。
　スチレン系重合体は、特に限定されるものではないが、例えば、スチレン、メチルスチレン、エチルスチレン、ヒドロキシスチレン、クロロスチレン等のスチレン系化合物の１種を重合してなる重合体、２種以上を重合してなる共重合体、スチレン系化合物の１種以上とスチレン系化合物以外のビニル基含有化合物の１種以上とを共重合してなる共重合体などが挙げられる。スチレン系化合物以外のビニル基含有化合物としては、例えば、エチレン、プロピレン等のモノビニル化合物、ジビニルベンゼン、トリビニルベンゼン等の芳香族ポリビニル化合物、ブタジエン、メチレンビスアクリルアミド、イソシアヌル酸トリアリル等のポリビニル化合物が挙げられる。これらの重合体または共重合体に対して、エピクロルヒドリン、（ポリ）アルキレングリコールジグリシジルエーテル、アルキレンジイソシアネート等の架橋剤を用いて架橋構造を導入してもよい。
　基材は多孔質粒子または多孔質膜であることが好ましい。基材が多孔質粒子または多孔質膜であることにより、表面積が大きくなり、単位時間あたりの処理容量を大きくすることができる。
　また、基材が多孔質粒子または多孔質膜である場合の細孔容積は、特に限定されないが、水銀ポロシメーターにより測定した細孔容積が、好ましくは０．２ｍＬ／ｇ～１０ｍＬ／ｇ、より好ましくは０．２ｍＬ／ｇ～５．０ｍＬ／ｇの範囲内である。細孔容積がこの範囲内であると、抗体吸着容量および精製純度を改善する。また、機械的強度が低下しない。
　また、基材が多孔質粒子または多孔質膜である場合の比表面積は、特に限定されないが、ＢＥＴ（Brunauer、Emmett、Teller）法により測定した比表面積（ＢＥＴ比表面積）が、好ましくは２ｍ２／ｇ～１５００ｍ２／ｇ、より好ましくは５ｍ２／ｇ～１０００ｍ２／ｇの範囲内である。比表面積がこの範囲内であると、抗体吸着容量および精製純度を改善する。
　また、基材が多孔質粒子である場合の平均粒子径は、特に限定されないが、好ましくは０．５μｍ～１０００μｍ、より好ましくは１μｍ～２５０μｍ、さらに好ましくは２μｍ～１５０μｍの範囲内である。平均粒子径がこの範囲内であると、カラムに充填して通液した時の圧力損失が小さく、通液速度を高くでき、処理効率が向上するとともに、抗体吸着容量および精製純度を改善する。なお、多孔質粒子の平均粒子径は、既知の方法で測定することができる。例えば、光学顕微鏡にて、１００個以上の粒子径を測定し、その分布から体積メジアン径を算出することで平均粒子径が得られる。
　基材の市販品としては、例えば、アガロース系の担体であるセファローズシリーズ（ＧＥヘルスケア社製）（“ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ”は登録商標）、セルロース系の架橋担体であるセルファインシリーズ（ＪＮＣ社製）（“ＣＥＬＬＵＦＩＮＥ”は登録商標）、アリルデキストランとＮ，Ｎ’－メチレンビスアクリルアミドの架橋ポリマーであるセファクリルシリーズ（ＧＥヘルスケア社製）（“ＳＥＰＨＡＣＲＹＬ”は登録商標）、アクリレート系の担体であるトヨパールＨＷシリーズ（東ソー社製）（“トヨパール”および“ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ”は登録商標）などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
〈親水性ポリマー〉
　親水性ポリマーは親水性多糖類からなる群から選択される少なくとも１種である。また、親水性ポリマーは１種を単独で用いてもよいし、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
　なお、本発明では、ポリマーまたは多糖類について親水性とは、少なくとも１種類の親水性基を含むことをいう。親水性基とは、好ましくはカルボキシ基、カルボキシ基のアルカリ金属塩、スルホキシ基、スルホキシ基のアルカリ金属塩、ヒドロキシ基、アミド基、カルバモイル基、スルホンアミド基、スルファモイル基、リン酸基、リン酸基のアルカリ金属塩、オキシリン酸基、オキシリン酸基のアルカリ金属塩等の官能基が挙げられる。これらの親水性基は、ポリマー中のどの位置に存在してもよく、例えば、ポリマー側鎖に直接または連結基を介して結合していてもよいし、ポリマー側鎖またはグラフト側鎖に結合していてもよい。また、親水性基は１分子中に、好ましくは複数個が存在する。
　親水性多糖類は、特に限定されないが、精製純度を改善する効果が高いことから、好ましくはデキストラン、カルボキシメチルデキストランおよびプルランから選択される少なくとも１種であり、より好ましくはデキストランである。
　基材を親水性ポリマーで被覆することで、本発明のアフィニティクロマトグラフィ担体表面の親水性を増し、非特異的吸着物の吸着を抑制するため、精製純度を改善する効果がある。
　親水性ポリマーの分子量は、特に限定されないが、極限粘度で、好ましくは０．１０ｄＬ／ｇ以上、より好ましくは０．１０ｄＬ／ｇ～０．９０ｄＬ／ｇ、さらに好ましくは０．１２ｄＬ／ｇ～０．９０ｄＬ／ｇ、いっそう好ましくは０．１２ｄＬ／ｇ～０．３０ｄＬ／ｇ、よりいっそう好ましくは０．１７ｄＬ／ｇ～０．２５ｄＬ／ｇの範囲内である。極限粘度がこの範囲内であると、精製純度がさらに向上する。なお、極限粘度は、第１６改正日本薬局方に収載された一般測定法における粘度測定法、第１法「毛細管粘度計法」に従って、数個の異なる濃度の高分子溶液の粘度を求めて粘度の濃度依存性を測定し、得られた直線の濃度を０に外挿することにより求めることができる。
　ところで、高分子の極限粘度ηと分子量Ｍとの間には、下記マーク－ホウィンク－桜田の式（Mark-Houwink-Sakurada equation）が成立することから、直接的な測定方法でいくつかの試料の分子量を求め、分子量とそれぞれの極限粘度の値とからＫとαを決めておけば、同じ種類の高分子については、極限粘度ηを測定することによって分子量Ｍが、分子量Ｍを測定することによって極限粘度ηが、それぞれ、求められる。
　η＝ＫＭα
　ここで、Ｋおよびαは高分子の種類、溶媒の種類および温度によって定まる定数である。
　例えば、デキストランの極限粘度（ηＤｅｘｔｒａｎ）と重量平均分子量（ＭｗＤｅｘｔｒａｎ）とは、下記の関係式を満たすことが知られている。
　ηＤｅｘｔｒａｎ［ｄＬ／ｇ］＝９×１０－４×ＭｗＤｅｘｔｒａｎ ０．５［ｄＬ／ｇ］
　親水性ポリマーの被覆量（以下、単に「親水性ポリマー被覆量」という場合がある。）は、特に限定されないが、好ましくは３ｍｇ／ｇ－ｄｒｙ　ｇｅｌ～５００ｍｇ／ｇ－ｄｒｙ　ｇｅｌであり、より好ましくは３ｍｇ／ｇ－ｄｒｙ　ｇｅｌ～３５０ｍｇ／ｇ－ｄｒｙ　ｇｅｌであり、さらに好ましくは１０ｍｇ／ｇ－ｄｒｙ　ｇｅｌ～３００ｍｇ／ｇ－ｄｒｙ　ｇｅｌ、いっそう好ましくは２０ｍｇ／ｇ－ｄｒｙ　ｇｅｌ～２４０ｍｇ／ｇ－ｄｒｙ　ｇｅｌである。親水性ポリマー被覆量がこの範囲内であると、本発明のアフィニティクロマトグラフィ担体の表面の親水性を適度に増して非特異的吸着物の吸着を抑えるとともに、抗体が基材に拡散浸透する余地が多く残って抗体吸着容量が大きくなるため、精製純度がさらに改善される。なお、親水性ポリマーは基材の表面をすべて覆っている必要はなく、基材の少なくとも一部を覆っていればよい。
　なお、親水性ポリマー被覆量［単位：ｍｇ／ｇ－ｄｒｙ　ｇｅｌ］は、被覆している親水性ポリマーの乾燥重量（ＷＰ）［単位：ｍｇ］を、被覆前基材の乾燥重量（Ｗ０）［単位：ｇ－ｄｒｙ　ｇｅｌ］で除した値である。また、親水性ポリマーの乾燥重量（ＷＰ）は、担体全量の乾燥重量（Ｗ１）と被覆前基材の乾燥重量（Ｗ0）の差（Ｗ１－Ｗ０）［単位：ｍｇ］である。
　したがって、親水性ポリマー被覆量は以下の式により求めることができる。
　親水性ポリマー被覆量（ｍｇ／ｇ－ｄｒｙ　ｇｅｌ）＝ＷＰ／Ｗ０＝（Ｗ１－Ｗ０）／Ｗ０
　上記被覆前基材の乾燥重量（Ｗ0）は、次のようにして算出することができる。
　Ｗ０＝Ｗ０，ｘｇ×ｗ０／ｘ
　ここで、
　Ｗ０，ｘｇ：被覆前基材の湿ゲルｘｇの乾燥重量
　ｗ０：親水性ポリマー被覆反応に用いた被覆前基材の湿ゲル全重量
　ｘ：乾燥に用いた被覆前基材の湿ゲル重量（ｘｇ）
である。
　上記担体全量の乾燥重量（Ｗ１）も、同様にして算出することができる。
〈アフィニティリガンド〉
　アフィニティリガンドは抗体結合性タンパク質および抗体結合性ポリペプチドからなる群から選択される少なくとも１種、好ましくは抗体結合性タンパク質から選択される少なくとも１種である。
　本発明において、ポリペプチドとは、２残基～５０残基のアミノ酸残基からなるペプチド鎖を含む分子であり、概ね、分子量が５０００未満の分子をいう。また、本発明において、タンパク質とは、５１残基以上のアミノ酸残基からなるペプチド鎖を含む分子であり、概ね、分子量が５０００以上の分子をいう。
　抗体結合性タンパク質は、抗体と抗原抗体反応により結合するタンパク質であれば特に限定されず、例えば、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＬ、プロテインＤ、プロテインＡ改変体などが挙げられる。抗体結合性タンパク質としては、プロテインＡまたはその改変体が好ましい。プロテインＡ改変体としては、アルカリ耐性型プロテインＡが好ましい。
　抗体結合性ポリペプチドは、抗体と抗原抗体反応により結合するポリペプチドであれば特に限定されず、例えば、プロテインＡの抗体結合ドメインのアミノ酸配列の一部と同一のアミノ酸配列を持つポリペプチドおよびその改変体などが挙げられる。抗体結合性ポリペプチド改変体としては、アルカリ耐性型改変体が好ましい。
　本発明のアフィニティクロマトグラフィ担体のアフィニティリガンドの導入量（以下、単に「アフィニティリガンド導入量」という場合がある。）は、特に限定されないが、好ましくは０．０１ｍｍｏｌ／Ｌ－ｇｅｌ～１００ｍｍｏｌ／Ｌ－ｇｅｌ、より好ましくは０．０５ｍｍｏｌ／Ｌ－ｇｅｌ～５０ｍｍｏｌ／Ｌ－ｇｅｌ、さらに好ましくは０．１０ｍｍｏｌ／Ｌ－ｇｅｌ～１０ｍｍｏｌ／Ｌ－ｇｅｌ、いっそう好ましくは０．１０ｍｍｏｌ／Ｌ－ｇｅｌ～２．０ｍｍｏｌ／Ｌ－ｇｅｌ、よりいっそう好ましくは０．１０ｍｍｏｌ／Ｌ－ｇｅｌ～１．０ｍｍｏｌ／Ｌ－ｇｅｌ、さらにいっそう好ましくは０．１０ｍｍｏｌ／Ｌ－ｇｅｌ～０．５０ｍｍｏｌ／Ｌ－ｇｅｌである。
〈カルボキシ基〉
　本発明のアフィニティクロマトグラフィ担体のカルボキシ基の導入量（以下、単に「カルボキシ基導入量」という場合がある。）は、イオン交換容量で１５ｍｍｏｌ／Ｌ－ｇｅｌ～６０ｍｍｏｌ／Ｌ－ｇｅｌ、好ましくは１５ｍｍｏｌ／Ｌ－ｇｅｌ～５５ｍｍｏｌ／Ｌ－ｇｅｌ、より好ましくは１５ｍｍｏｌ／Ｌ－ｇｅｌ～４０ｍｍｏｌ／Ｌ－ｇｅｌである。カルボキシ基導入量がこの範囲内であると、アフィニティリガンド導入量を適度な範囲内とすることができ、抗体吸着容量を改善する。また、非特異的吸着物の吸着を抑えることができる。
［アフィニティクロマトグラフィ担体の製造方法］
　本発明のアフィニティクロマトグラフィ担体は、基材を親水性ポリマーで被覆し、カルボキシ基を導入し、さらにアフィニティリガンドを導入することにより製造することができる。
　基材、親水性ポリマーおよびアフィニティリガンドは、既に「アフィニティクロマトグラフィ担体」に記載したとおりである。
〈親水性ポリマーによる被覆〉
　基材を親水性ポリマーで被覆する。
　基材を親水性ポリマーで被覆する方法は、親水性ポリマーを基材に共有結合によって結合させることができるものであれば特に限定されるものではないが、例えば、基材にクロロメチルオキシラン（エピクロルヒドリン）を反応させてエポキシ基を導入し、これに親水性ポリマーを反応させる方法、溶媒中、アルカリの存在下、基材をクロロメチルオキシラン（エピクロルヒドリン）のような架橋剤と反応させ、得られた反応生成物を親水性ポリマーと反応させる方法、クロロ基等のハロゲン基をハロゲン化剤を用いて基材に導入し、ウィリアムソンのエーテル合成法を用いて親水性ポリマーを固定化する方法などが挙げられる。
　基材を親水性ポリマーで被覆する際には、親水性ポリマー被覆量が、好ましくは３ｍｇ／ｇ－ｄｒｙ　ｇｅｌ～５００ｍｇ／ｇ－ｄｒｙ　ｇｅｌであり、より好ましくは３ｍｇ／ｇ－ｄｒｙ　ｇｅｌ～３５０ｍｇ／ｇ－ｄｒｙ　ｇｅｌであり、さらに好ましくは１０ｍｇ／ｇ－ｄｒｙ　ｇｅｌ～３００ｍｇ／ｇ－ｄｒｙ　ｇｅｌ、いっそう好ましくは２０ｍｇ／ｇ－ｄｒｙ　ｇｅｌ～２４０ｍｇ／ｇ－ｄｒｙ　ｇｅｌとなるようにする。
　なお、本明細書において、親水性ポリマーで被覆する直前の基材を「被覆前基材」といい、この被覆前基材に親水性ポリマーを被覆したものを「担体」という場合がある。
〈カルボキシ基の導入〉
　担体にカルボキシ基を導入する。
　担体にカルボキシ基を導入する方法は、カルボキシ基を有する化合物を担体に共有結合によって結合させることができるものであれば特に限定されるものではないが、例えば、アルカリ条件下で担体にクロロ酢酸を反応させて、担体表面のヒドロキシ基の一部にカルボキシメチル基を導入する方法、担体にアルデヒド基を導入し、アミノ酸等のカルボキシ基およびアミノ基を有する化合物のアミノ基を介して還元的アミノ化法でアルデヒド基にカルボキシ基を導入する方法などが挙げられる。
　担体にカルボキシ基を導入する際には、カルボキシ基導入量がイオン交換容量で１５ｍｍｏｌ／Ｌ－ｇｅｌ～６０ｍｍｏｌ／Ｌ－ｇｅｌ、好ましくは１５ｍｍｏｌ／Ｌ－ｇｅｌ～５５ｍｍｏｌ／Ｌ－ｇｅｌ、より好ましくは１５ｍｍｏｌ／Ｌ－ｇｅｌ～４０ｍｍｏｌ／Ｌ－ｇｅｌとなるようにする。
　なお、本明細書において、担体にカルボキシ基を導入したものを「カルボキシ化担体」という場合がある。
〈アフィニティリガンドの導入〉
　カルボキシ化担体にアフィニティリガンドを導入（固定化）する。
　カルボキシ化担体にアフィニティリガンドを導入（固定化）する方法は、アフィニティリガンドをカルボキシ化担体に共有結合によって結合させることができるものであれば特に限定されるものではないが、例えば、カルボキシ基の一部をＥＤＣ（N-(3-dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimide）；Ｎ‐（３‐ジメチルアミノプロピル）－Ｎ’‐エチルカルボジイミド）／ＮＨＳ（N-hydroxysuccinimide；Ｎ‐ヒドロキススクシンイミド）化し、プロテインＡ等のアフィニティリガンドと反応させ、反応後に未反応のＥＤＣ／ＮＨＳ化されたカルボキシ基を再生する方法、プロテインＡ等のアミノ基を有するアフィニティリガンドの場合には、カルボキシ基を保護して、アルデヒド基を導入し、アミノ基を介して還元的アミノ化法でアルデヒド基にアフィニティリガンドを導入する方法などが挙げられる。
　カルボキシ化担体にアフィニティリガンドを導入する際には、アフィニティリガンドの導入量が、好ましくは０．０１ｍｍｏｌ／Ｌ－ｇｅｌ～１００ｍｍｏｌ／Ｌ－ｇｅｌ、より好ましくは０．０５ｍｍｏｌ／Ｌ－ｇｅｌ～５０ｍｍｏｌ／Ｌ－ｇｅｌ、さらに好ましくは０．１０ｍｍｏｌ／Ｌ－ｇｅｌ～１０ｍｍｏｌ／Ｌ－ｇｅｌ、いっそう好ましくは０．１０ｍｍｏｌ／Ｌ－ｇｅｌ～２．０ｍｍｏｌ／Ｌ－ｇｅｌ、よりいっそう好ましくは０．１０ｍｍｏｌ／Ｌ－ｇｅｌ～１．０ｍｍｏｌ／Ｌ－ｇｅｌ、さらにいっそう好ましくは０．１０ｍｍｏｌ／Ｌ－ｇｅｌ～０．５０ｍｍｏｌ／Ｌ－ｇｅｌとなるようにする。
　なお、アフィニティリガンドをカルボキシ化担体のカルボキシ基の一部に結合した場合のアフィニティクロマトグラフィ担体のカルボキシ基導入量は、「カルボキシ化担体のカルボキシ基導入量－アフィニティクロマトグラフィ担体のアフィニティリガンド導入量」で表す。
［生体物質の精製方法、その精製方法により精製された生体物質］
〈生体物質〉
　本発明のアフィニティクロマトグラフィ担体により精製される生体物質は、特に限定されるものではないが、好ましくは抗体または抗体誘導体、より好ましくは免疫グロブリンＧまたはその誘導体である。
　抗体とは、免疫グロブリンまたはその類縁体、フラグメントもしくは融合体をいう。ここで、類縁体とは、免疫グロブリンの構造または機能が少なくとも部分的に保持された、天然の、または人工的に作製された、タンパク質またはタンパク質コンジュゲートをいう。また、フラグメントとは、酵素的な処理または遺伝子工学的な設計によって作製された、免疫グロブリンの部分構造を有するタンパク質をいう。また、融合体とは、免疫グロブリン分子の定常領域であるＦｃ（Fragment crystallizable、結晶化可能断片）領域と他の機能性蛋白質またはペプチドを融合してなるＦｃ融合タンパク質（Ｆｃ含有分子）が含まれる。なお、本発明において、免疫グロブリンは、ＩｇＧ（Immunoglobulin G；免疫グロブリンＧ）、ＩｇＭ（Immunoglobulin M；免疫グロブリンＭ）、ＩｇＡ（Immunoglobulin A；免疫グロブリンＡ）、ＩｇＤ（Immunoglobulin D；免疫グロブリンＤ）およびＩｇＥ（Immunoglobulin E；免疫グロブリンＥ）の５種類のクラス（アイソタイプ）のいずれでもよいが、ＩｇＧまたはＩｇＭが好ましく、ＩｇＧがより好ましい。
　また、抗体誘導体とは、ヒト免疫グロブリンのＦｃ領域と非ヒト哺乳動物免疫グロブリンのＦａｂ領域とを融合させたキメラ抗体、ヒト免疫グロブリンのいくつかのＦｃ領域と非ヒト哺乳動物免疫グロブリンのいくつかのＦｖ領域とを融合させたキメラ抗体、ヒト免疫グロブリンのＣＤＲ（Complementarity Determining Region；相補性決定領域）部分を除いた残余の部分と非ヒト哺乳動物免疫グロブリンＣＤＲ部分とを融合させたヒト型化抗体、非ヒト哺乳動物免疫グロブリンのＦｃ領域とヒト免疫グロブリンのＦａｂ（Fragment, antigen binding；抗体結合断片）領域とを融合させたキメラ抗体、非ヒト哺乳動物免疫グロブリンのいくつかのＦｃ領域とヒト免疫グロブリンのいくつかのＦｖ領域とを融合させたキメラ抗体、ヒト免疫グロブリンのＣＤＲ部分を除いた残余の部分と非ヒト哺乳動物免疫グロブリンのＣＤＲ部分とを融合させた非ヒト哺乳動物化抗体、非ヒト哺乳動物免疫グロブリンのＦｃ領域と非ヒト哺乳動物免疫グロブリンのＦａｂ領域とを融合させたキメラ抗体、非ヒト哺乳動物グロブリンのいくつかのＦｃ領域と非ヒト哺乳動物免疫グロブリンのいくつかのＦｖ領域とを融合させたキメラ抗体、非ヒト哺乳動物免疫グロブリンのＣＤＲ（Complementarity Determining Region；相補性決定領域）部分を除いた残余の部分と非ヒト哺乳動物免疫グロブリンＣＤＲ部分とを融合させた非ヒト哺乳動物型抗体、およびこれらの化学的修飾を加えたタンパク質であってＦｃ領域を保持するタンパク質をいう。
　これらは抗体医薬品の原料として利用される。
〈精製方法〉
　以下に、本発明のアフィニティクロマトグラフィ担体を用いた精製方法の詳細な説明を、生体物質が免疫グロブリンＧの場合について例示するが、本発明はこれに限定されるものではない。
　アフィニティクロマトグラフィ担体を用いた生体物質（特に、抗体）の精製は、大きく、吸着工程、洗浄工程、イオン強度調節工程、溶出工程の４工程で構成されるほか、その後の再生工程および／またはＣＩＰ（cleaning-in-place；定置洗浄）工程、再平衡化工程などの再利用の為の工程を含んでもよい。
　吸着工程では、一般的なアフィニティクロマトグラフィ精製方法を用いることができる。すなわち、その一例において、免疫グロブリンＧを含むタンパク質溶液のｐＨが中性付近となるように調整した後、その溶液を本発明のアフィニティクロマトグラフィ担体を充填したカラムに通過させ、アフィニティリガンドを介して免疫グロブリンＧを特異的にアフィニティクロマトグラフィ担体に吸着させる。たとえば、プロテインＡをアフィニティリガンドとする場合、その負荷ｐＨ、すなわち生体物質の添加時ｐＨは、好ましくは５．０～９．０であり、より好ましくは５．３～９．０であり、さらに好ましくは５．５～９．０であり、いっそう好ましくは６．０～８．５である。晴乳類培養細胞により生産される免疫グロブリンＧの精製において、特にイオン強度の調製を必要としないほか、あらかじめイオン強度を上げてさらに非特異吸着を抑制することも出来る。
　洗浄工程では、アフィニティリガンドが機能する条件範囲の緩衝液を適量通過させ、カラム内部を洗浄する。すなわち、ｐＨの好ましい範囲は前記負荷時と同じ範囲であってもよく、例えば、好ましくはｐＨ５．０～９．０である。この時点で免疫グロブリンＧは本発明のアフィニティクロマトグラフィ担体に吸着されている。この時、中性付近のｐＨでイオン強度や組成物の最適化により、不純物を効果的に除去できる場合がある。洗浄時において、カルボキシ基が機能しない条件が好ましく、すなわち、中性付近のｐＨにすると共に一定以上のイオン強度の洗浄液の利用が好ましく、この過程でアフィニティクロマトグラフィ担体および／または免疫グロブリンＧを介して非特異的にカラムに残留する不純物を洗浄することが出来る。イオン強度は、例えば、好ましくは０．２Ｍ以上であり、より好ましくは０．５Ｍ以上である。
　イオン強度調節工程では、中性付近でイオン強度が低い緩衝液にカラムを置換し、溶出時のカルボキシ基によるイオン強度依存的溶出機能の発現に備える。
　溶出工程では、酸性ｐＨ、イオン強度の組み合わせにより、アフィニティリガンドからの溶出時に陽イオン交換分離モードを機能させ、両リガンドの協奏的な作用で、単量体含量の高い画分を低イオン強度溶出画分に回収することが出来る。溶出液のｐＨはアフィニティリガンドからの免疫グロブリンＧの溶出時ｐＨが適用できる。このｐＨは、アフィニティクロマトグラフィ担体と免疫グロブリンＧの種類により決定される分離条件を中心に決定されることから、特段の条件設定を必要としない。
　アフィニティリガンドにプロテインＡを用いた場合は、溶出時ｐＨは、好ましくは２．０～５．０に設定される。ただし、生体物質の酸変性を避ける目的から、より好ましくはｐＨ２．８以上、さらに好ましくはｐＨ３．０以上、いっそう好ましくはｐＨ３．２以上である。ｐＨは、好ましくは５．０以下、より好ましくは４．８以下である。
　アフィニティリガンドにアルカリ耐性型のプロテインＡを用いる場合は、一般的に、溶出時ｐＨは、好ましくは３．５～４．０に設定されるが、これに限定されるものではない。また、溶出イオン強度は、アフィニティリガンドとカルボキシ基の導入比率に依存するほか、単位体積あたりの免疫グロブリンＧの負荷量にも依存するが、グラジエン卜実験やステップワイズ溶出実験により最適化ポイン卜を容易に設定しうる。
　本発明により調製されるアフィニティクロマトグラフィ担体からの抗体溶出は、塩濃度グラジエン卜溶出でもステップワイズ溶出でも適用可能であるが、溶出液量の低減を目的にした場合はイオン強度によるステップワイズ溶出が好ましい。さらに、操作の単純化のためには、ワンステップ溶出による抗体の回収と高精製純度を達成できる条件設定が好ましい。
　なお、洗浄工程のイオン強度と酸性ｐＨの組み合わせでも凝集体がカラムに残留し溶出画分に混入しない場合は、イオン強度調節工程を省略することが出来る。
〈精製された生体物質〉
　本発明の精製方法によって精製された生体物質、特に抗体または抗体誘導体は、精製の前後でそれ自体の構造、特性は変化しないが、精製純度が高くなっている。ただし、どの程度高くなっているかは、精製前の溶液等に依存するため、一概に言うことはできない。
　本発明により調製されたアフィニティクロマトグラフィ担体を用いて精製された免疫グロブリンＧは、単一の分離モードに基づくアフィニティクロマトグラフィ担体よりも高いモノマー選択性を示し、その溶出液中のモノマー含量が高い。
　単一分離モードに基づくアフィニティクロマトグラフィ担体を用いた場合にも、溶出時ｐＨおよびイオン強度等の最適化により、モノマー含量を幾分高めることは可能であるが、その効果が低く、効果発現にはより大きな回収率の低下を伴う。本発明のアフィニティクロマトグラフィ担体を用いることにより、特異性の高いアフィニティ精製と、主に陽イオン交換クロマトグラフィにより達成しうるモノマー含量の向上を、高回収率を維持したまま単一のクロマ卜操作で効率的に達成可能であることから、後段プロセスへの負荷の低減が可能となり、プロセス全体の収率向上と単量体含量の向上に貢献できる。すなわち、本発明の新規アフィニティクロマトグラフィ担体の使用により、抗体医薬品の製造プロセスの生産性向上と高純度化に寄与できる。
　以下、実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は何らこれらに制限されるものではない。
［測定方法および評価方法］
１．親水性ポリマー被覆量の測定方法
　被覆前基材の湿ゲル５ｇを５０℃で重量変化がなくなるまで減圧乾燥して重量を測定し、親水性ポリマー被覆反応に用いた被覆前基材の湿ゲル重量との積より、被覆前基材の乾燥重量とした。次いで、被覆前基材に親水性ポリマーを被覆して得た担体の湿ゲル５ｇを５０℃で重量変化がなくなるまで減圧乾燥して重量を測定し、親水性ポリマー被覆反応後に得られた担体の湿ゲル重量との積より、担体の乾燥重量とした。担体の乾燥重量と被覆前基材の乾燥重量との差を、被覆前基材を被覆している親水性ポリマーの乾燥重量とした。親水性ポリマー被覆量は、被覆前基材の乾燥重量あたりの親水性ポリマーの乾燥重量として算出した。
２．カルボキシ基導入量の測定方法
　カルボキシ化担体１ｇを３ｍＬの純水に懸濁し、内径１５ｍｍのディスポーザブルカラムに注ぎ、吸引ろ過で溶媒を除去した。０．２ｍｏｌ／Ｌの塩酸３ｍＬで４回洗浄し、その後純水４ｍＬで洗浄を繰返した。洗浄後、ベッド（カラムに堆積した担体部分）高を測定することで、カルボキシ化担体の体積を算出した。カルボキシ化担体を取り出し、１００ｍＬ容ビーカーに移し、４０ｍＬの０．１ｍｏｌ／Ｌの食塩水に懸濁し、自動滴定装置「ＣＯＭ－１６００」（平沼産業社製）を用い、０．１ｍｏｌ／Ｌの水酸化ナトリウム水溶液で滴定した。終点までの滴定液量からカルボキシ化担体１Ｌあたりのイオン交換容量（ｍｅｑ／Ｌ－ｇｅｌ）を算出した。さらに、単位を「ｍｍｏｌ／Ｌ－ｇｅｌ」に換算した（１ｍｅｑ／Ｌ－ｇｅｌ＝１ｍｍｏｌ／Ｌ－ｇｅｌ）。カルボキシ基導入量はイオン交換容量で表した。
３．アフィニティリガンド導入量（プロテインＡ固定化量）の測定方法
　プロテインＡ固定化反応後のプロテインＡ液、反応液および洗浄液を、それぞれ、ゲルろ過クロマトグラフィ（下記）にかけ、２８０ｎｍにおける吸光度のピーク面積値より、各溶液に含まれるプロテインＡ量を算出した。
　プロテインＡ固定化反応前のプロテインＡ液、反応液および洗浄液に含まれるプロテインＡ量との差より、プロテインＡ固定化量を算出した。
（ゲルろ過クロマトグラフィの条件）
　クロマトシステム：アクタアヴァント２５（AKTA avant 25）（ＧＥヘルスケア社製）（“ＡＫＴＡＡＶＡＮＴ”は登録商標）
　カラム：脱塩カラム「ハイトラップデソルティング（HiTrap Desalting）（ＧＥヘルスケア社製）（“ＨＩＴＲＡＰ”は登録商標）
　バッファー：２０ｍＭ　リン酸バッファー、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、ｐＨ７．４
　流速：３ｍＬ／ｍｉｎ
４．抗体吸着容量の評価方法
（１）抗体吸着容量の測定
　実施例で製造したアフィニティクロマトグラフィ担体、比較例で製造したクロマトグラフィ担体または市販のクロマトグラフィ担体１ｍＬをガラスカラム「トリコーン　１０／２０　カラム（Tricorn 10/20 column）」（ＧＥヘルスケア社製）（“ＴＲＩＣＯＲＮ”は登録商標）に充填し、クロマトシステム「アクタアヴァント２５（AKTA avant 25）」（ＧＥヘルスケア社製）（“ＡＫＴＡＡＶＡＮＴ”は登録商標）に接続し、抗体吸着容量の測定を行った。
　カラムを平衡化液（２０ｍＭリン酸バッファー、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）で平衡化した後に、ヒトＩｇＧ抗体（Immunoglobulin G：免疫グロブリンＧ）を標準バッファー（２０ｍＭリン酸バッファー、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）で５ｍｇ／ｍＬに調整した溶液１５ｍＬを流速０．４２ｍＬ／ｍｉｎにて添加した。その後、負荷後洗浄液（２０ｍＭリン酸バッファー、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）を同じ流速で５ｍＬ流して洗浄した後に、溶出前洗浄液（２０ｍＭリン酸バッファー、１Ｍ　ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）を同じ流速で５ｍＬ流した。その後、溶出液（１００ｍＭクエン酸バッファー、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、ｐＨ３．２）を同じ流速で５ｍＬ流した。さらに連続して、定置洗浄（ＣＩＰ；cleaning in place）液（０．１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液）を同じ流速で５ｍＬ流し、その後、再平衡化液（２０ｍＭリン酸バッファー、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）を、同じ流速で５ｍＬ流した。このとき、２８０ｎｍの吸光度をモニタリングして得られたＩｇＧ溶出ピークより、各分画における溶出液の抗体溶出量を算出した。溶出前洗浄液からＣＩＰ液までに溶出した抗体量を抗体吸着容量として算出した。
（２）抗体吸着容量の評価
　抗体吸着容量の評価は、以下の評価基準に従い、カルボキシ基とプロテインAのみを導入した場合の抗体吸着容量を基準として行った。すなわち、実施例１～７、比較例１～６、比較例８および参考例１（基材が多糖類である実施例、比較例および参考例）については比較例４を、実施例８および比較例７（基材がメタクリレート系重合体である実施例および比較例）については比較例７を、それぞれ基準として抗体吸着容量を評価した。
　抗体吸着容量が基準の４０％以上・・・抗体吸着容量の評価「Ａ」
　抗体吸着容量が基準の４０％未満・・・抗体吸着容量の評価「Ｃ」
５．精製純度の評価方法
（１）精製純度の算出
　実施例または比較例で製造したアフィニティクロマトグラフィ担体または市販のクロマトグラフィ担体１ｍＬをガラスカラム「トリコーン　１０／２０　カラム（Tricorn 10/20 column）」（ＧＥヘルスケア社製）（“ＴＲＩＣＯＲＮ”は登録商標）に充填し、クロマトシステム「アクタアヴァント２５（AKTA avant 25）」（ＧＥヘルスケア社製）（“ＡＫＴＡＡＶＡＮＴ”は登録商標）に接続し、各分画で溶出されるＨＣＰ（host cell protein；宿主細胞由来タンパク質）量およびＩｇＧ（Immunoglobulin G；免疫グロブリンＧ）量の測定を行った。
　カラムを平衡化液（２０ｍＭリン酸バッファー、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）で平衡化した後に、ＩｇＧ、ＣＨＯ－Ｓ（Chinese Hamster Ovary S）細胞由来ＨＣＰが、それぞれ、１．６ｍｇ／ｍＬ、０．３２ｍｇ／ｍＬになるように標準バッファー（２０ｍＭリン酸バッファー、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）を用いて調製したＩｇＧ／ＨＣＰ混合液を、上述した（１）で得られた抗体吸着容量の８割の抗体量が負荷されるような溶液量を流速０．２１ｍＬ／ｍｉｎにて添加した。その後、負荷後洗浄液（２０ｍＭリン酸バッファー、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）を０．４２ｍＬ／ｍｉｎで５ｍＬ流して洗浄した後に、溶出前洗浄液（２０ｍＭリン酸バッファー、１Ｍ　ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）を同じ流速で５ｍＬ流した。その後、溶出液（１００ｍＭクエン酸バッファー、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、ｐＨ３．２）を同じ流速で５ｍＬ流した。さらに連続して、ＣＩＰ液（０．１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液）を同じ流速で５ｍＬ流し、その後、再平衡化液（２０ｍＭリン酸バッファー、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）を同じ流速で５ｍＬ流した。このとき、２８０ｎｍの吸光度をモニタリングして得られたＩｇＧ溶出ピークより、各分画における溶出液のＩｇＧ溶出量を算出した。また、各分画の溶出液を回収し、宿主細胞由来タンパク質検出キット「ＣＨＯ　ＨＣＰ　３ｒｄ　Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ＥＬＩＳＡ　ｋｉｔ」（シグナステクノロジーズ社製）を用いたＥＬＩＳＡ法により、各分画における溶出液のＨＣＰ量を算出した。
　算出した溶出液のＩｇＧ量およびＨＣＰ量を用いて、精製純度は溶出液におけるＨＣＰ混入量、すなわち、溶出液中のＩｇＧ量あたりのＨＣＰ量として、以下の式により算出した。
　精製純度（ｐｐｍ）＝ＨＣＰ混入量（ｐｐｍ）＝溶出液のＨＣＰ量／溶出液のＩｇＧ量
（２）精製純度の評価
　精製純度の評価は、以下の評価基準に従い、カルボキシ基とプロテインＡのみを導入した場合のＨＣＰ混入量（ｐｐｍ）を基準として行った。すなわち、実施例１～７、比較例１～６、比較例８および参考例１（基材が多糖類である実施例、比較例および参考例）については比較例４を、実施例８および比較例７（基材がメタクリレート系重合体である実施例および比較例）については比較例７を、それぞれ、基準としてＨＣＰ混入量を評価した。
　ＨＣＰ混入量（ｐｐｍ）が２０％以上減少した・・・・・精製純度の評価「Ａ」
　ＨＣＰ混入量（ｐｐｍ）が０％超２０％未満減少した・・・精製純度の評価「Ｂ」
　ＨＣＰ混入量（ｐｐｍ）が減少しない・・・・・・・・・・精製純度の評価「Ｃ」
［実施例１］
１．アフィニティクロマトグラフィ担体の製造
（１）湿ゲルの調製
　架橋アガロース系基材「セファローズ６　ファスト・フロー（Sepharose 6 Fast Flow）」（ＧＥヘルスケア社製）（“ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ”は登録商標）を、グラスフィルター上で、純水を用いて懸濁およびろ過を繰り返すことによって洗浄し、基材スラリーを得た。この基材スラリーから、吸引ろ過によって純水を除去して、湿ゲルを得た。
　なお、表１の「基材」欄において「セファローズ6FF」は「セファローズ６　ファスト・フロー」を意味する。
（２）被覆前基材の調製　－　エポキシ基の導入
　得られた湿ゲル１００ｇ、純水１５２ｍＬおよびクロロメチルオキシラン５０ｇを、５００ｍＬ容の三口フラスコに入れ、４５℃の温浴中で、フラスコ内容物の撹拌を開始した。フラスコ内の温度が４５℃になるまで撹拌を行った。４５℃の温浴中で、フラスコ内の温度を約４５℃に維持しながら、５０％（ｗ／ｗ）水酸化ナトリウム水溶液４１ｇを２時間かけてフラスコ内に滴下した。水酸化ナトリウム水溶液の全量を滴下した後、さらに１時間反応し、グラスフィルター上で、純水を用いて懸濁およびろ過を繰り返すことによって洗浄し、被覆前基材の湿ゲルを得た。
（３）担体の調製　－　親水性ポリマーによる被覆
　デキストラン７０（極限粘度０．２３ｄＬ／ｇ；重量平均分子量約７０，０００）１３ｇおよび純水１５４ｍＬを、５００ｍＬ容の三口フラスコに入れ、室温で、フラスコ内容物の撹拌を開始した。デキストラン７０が完全に溶解するまで撹拌を行った。溶解後、被覆前基材の湿ゲル９０ｇをこの三口フラスコに加え、室温で、さらに撹拌した。三口フラスコ内の混合液が均一なってから、５０％（ｗ／ｗ）水酸化ナトリウム水溶液４．２ｇを加えた。水酸化ナトリウム水溶液を加えた後、室温で１６時間反応し、グラスフィルター上で、純水を用いて懸濁およびろ過を繰り返すことによって洗浄し、担体の湿ゲルを得た。
　また、得られた担体のデキストラン被覆量を、上述した「親水性ポリマー被覆量の測定方法」に従って測定した。得られた親水性ポリマー被覆量を、表１の「親水性ポリマー被覆量」の欄に示す。
（４）カルボキシ化担体の調製　－　カルボキシ基の導入
　得られた担体の湿ゲル１２ｇ、クロロ酢酸ナトリウム６．２ｇおよび純水２４ｍＬを、１００ｍＬ容の三口フラスコに入れ、５０℃の温浴中で、フラスコ内容物の撹拌を開始した。クロロ酢酸ナトリウムが完全に溶解するまで撹拌を行った。溶解後、５０℃の温浴中で、フラスコ内温度を約５０℃に維持しながら、５０％（ｗ／ｗ）水酸化ナトリウム水溶液８．８ｇを１時間かけて滴下した。水酸化ナトリウム水溶液の全量を滴下した後、さらに３時間反応し、グラスフィルター上で、純水を用いて懸濁およびろ過を繰り返すことによって洗浄し、カルボキシ化担体の湿ゲルを得た。
　また、得られたカルボキシ化担体のカルボキシ基導入量を、上述した「カルボキシ基導入量の測定方法」に従って測定した。得られたカルボキシ基導入量を、表１のカルボキシ基導入量の欄に示す。
　なお、アフィニティクロマトグラフィ担体のカルボキシ基導入量は、「カルボキシ化担体のカルボキシ基導入量－アフィニティリガンド導入量」で表した。
（５）プロテインＡ固定カルボキシ化担体の調製　－　アフィニティリガンドの導入
　得られたカルボキシ化担体を、湿潤体積として２．５ｍＬ分、ディスポーザブルカラムに入れ、純水を用いて懸濁およびろ過を繰り返すことによって洗浄し、担体スラリーを得た。この担体スラリーから、吸引ろ過によって純水を除去して、湿ゲルを得た。
　得られた湿ゲル２．０ｇを反応容器にとり、ＥＤＣ（N-(3-dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimide）；Ｎ‐（３‐ジメチルアミノプロピル）－Ｎ’‐エチルカルボジイミド）溶液２ｍＬを加え、室温で、１０分間、転倒撹拌した。その後、反応容器にＮＨＳ（N-hydroxysuccinimide；Ｎ‐ヒドロキススクシンイミド）溶液２ｍＬを加え、室温で、３０分間、転倒撹拌した。ここで、ＥＤＣ溶液は、ＤＭＳＯ（dimethyl sulfoxide；ジメチルスルホキシド）２ｍＬにＥＤＣ　０．２ｇを溶解して調製したものであり、ＮＨＳ溶液は、ＤＭＳＯ　２ｍＬにＮＨＳ　０．２ｇを溶解して調製したものである。
　反応ゲル溶液をディスポーザブルカラムに移し、氷冷した１ｍＭ塩酸６ｍＬで洗浄し、ＥＤＣ／ＮＨＳ活性化されたカルボキシ化担体を得た。
　得られたＥＤＣ／ＮＨＳ活性化カルボキシ化担体１．５ｇを反応容器に入れ、続いて、１０ｍｇ／ｍＬプロテインＡ溶液１．５ｍＬを反応容器に加え、２５℃で、２時間、振盪した。上記１０ｍｇ／ｍＬプロテインＡ容液は、遺伝子組換え天然型プロテインＡ「ｒＳＰＡ」（レプリジェン社製）を、２０ｍＭ　ＭＥＳ（2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid；２－（Ｎ－モルホリノ）エタンスルホン酸）バッファー（ｐＨ４．５）に溶解して調製したものである。
　溶媒を１Ｍ塩化ナトリウム水溶液および０．５Ｍエタノールアミン水溶液に置換し、洗浄し、プロテインＡ固定カルボキシ化担体を得た。
　また、得られたプロテインＡ固定カルボキシ化担体のプロテインＡ固定化量（アフィニティリガンド導入量）を、上述した「アフィニティリガンド導入量（プロテインＡ固定化量）の測定方法」に従って測定した。得られたプロテインＡ固定化量を、表１の「アフィニティリガンド導入量」の欄に示す。
２．抗体吸着容量および精製純度の評価
　製造したプロテインＡ固定カルボキシ化担体を用いて、上述した「抗体吸着容量の評価方法」および「精製純度の評価方法」に従って、抗体吸着容量および精製純度の評価を行った。抗体吸着容量および精製純度の評価結果を、それぞれ、表１の「抗体吸着容量（評価）」および「精製純度（評価）」の欄に示す。
［実施例２］
１．アフィニティクロマトグラフィ担体の製造
　カルボキシ化担体の調製（カルボキシ基の導入）の際のクロロ酢酸ナトリウムの使用量を６．２ｇから３．６ｇに変更した点を除き、実施例１と同様にして、プロテインＡ固定カルボキシ化担体を製造した。
　さらに、実施例１と同様にして、親水性ポリマー被覆量、カルボキシ基導入量、アフィニティリガンド導入量を測定した。測定結果を、それぞれ、表１の「親水性ポリマー被覆量」、「カルボキシ基導入量」および「アフィニティリガンド導入量」の欄に示す。
２．抗体吸着容量および精製純度の評価
　製造したプロテインＡ固定カルボキシ化担体を用いて、実施例１と同様に、上述した「抗体吸着容量の評価方法」および「精製純度の評価方法」に従って、抗体吸着容量および精製純度の評価を行った。抗体吸着容量および精製純度の評価結果を、それぞれ、表１の「抗体吸着容量（評価）」および「精製純度（評価）」の欄に示す。
［実施例３］
１．アフィニティクロマトグラフィ担体の製造
　カルボキシ化担体の調製（カルボキシ基の導入）の際のクロロ酢酸ナトリウムの使用量を６．２ｇから１１．７ｇに変更した点を除き、実施例１と同様にして、プロテインＡ固定カルボキシ化担体を製造した。
　さらに、実施例１と同様にして、親水性ポリマー被覆量、カルボキシ基導入量、アフィニティリガンド導入量を測定した。測定結果を、それぞれ、表１の「親水性ポリマー被覆量」、「カルボキシ基導入量」および「アフィニティリガンド導入量」の欄に示す。
２．抗体吸着容量および精製純度の評価
　製造したプロテインＡ固定カルボキシ化担体を用いて、実施例１と同様に、上述した「抗体吸着容量の評価方法」および「精製純度の評価方法」に従って、抗体吸着容量および精製純度の評価を行った。抗体吸着容量および精製純度の評価結果を、それぞれ、表１の「抗体吸着容量（評価）」および「精製純度（評価）」の欄に示す。
［実施例４］
１．アフィニティクロマトグラフィ担体の製造
　担体の調製（親水性ポリマーによる被覆）の際のデキストラン７０（極限粘度０．２３ｄＬ／ｇ、重量平均分子量約７０，０００）の使用量を１３ｇから６６ｇに変更した点、および、カルボキシ化担体の調製（カルボキシ基の導入）の際のクロロ酢酸ナトリウムの使用量を６．２ｇから２．０ｇに変更した点を除き、実施例１と同様にして、プロテインＡ固定カルボキシ化担体を製造した。
　さらに、実施例１と同様にして、親水性ポリマー被覆量、カルボキシ基導入量、アフィニティリガンド導入量を測定した。測定結果を、それぞれ、表１の「親水性ポリマー被覆量」、「カルボキシ基導入量」および「アフィニティリガンド導入量」の欄に示す。
２．抗体吸着容量および精製純度の評価
　製造したプロテインＡ固定カルボキシ化担体を用いて、実施例１と同様に、上述した「抗体吸着容量の評価方法」および「精製純度の評価方法」に従って、抗体吸着容量および精製純度の評価を行った。抗体吸着容量および精製純度の評価結果を、それぞれ、表１の「抗体吸着容量（評価）」および「精製純度（評価）」の欄に示す。
［実施例５］
１．アフィニティクロマトグラフィ担体の製造
　湿ゲルの調製の際の架橋アガロース系基材を「セファローズ４　ファスト・フロー（Sepharose 4 Fast Flow）」（ＧＥヘルスケア社製）（“ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ”は登録商標）に変更した点、および、カルボキシ化担体の調製（カルボキシ基の導入）の際のクロロ酢酸ナトリウムの使用量を２．０ｇから３．９ｇに変更した点を除き、実施例４と同様にして、プロテインＡ固定カルボキシ化担体を製造した。
　なお、表１の「基材」欄において「セファローズ４ＦＦ」は「セファローズ４　ファスト・フロー」を意味する。
　さらに、実施例１と同様にして、親水性ポリマー被覆量、カルボキシ基導入量、アフィニティリガンド導入量を測定した。測定結果を、それぞれ、表１の「親水性ポリマー被覆量」、「カルボキシ基導入量」および「アフィニティリガンド導入量」の欄に示す。
２．抗体吸着容量および精製純度の評価
　製造したプロテインＡ固定カルボキシ化担体を用いて、実施例１と同様に、上述した「抗体吸着容量の評価方法」および「精製純度の評価方法」に従って、抗体吸着容量および精製純度の評価を行った。抗体吸着容量および精製純度の評価結果を、それぞれ、表１の「抗体吸着容量（評価）」および「精製純度（評価）」の欄に示す。
［実施例６］
１．アフィニティクロマトグラフィ担体の製造
　担体の調製（親水性ポリマーによる被覆）の際のデキストラン７０（極限粘度０．２３ｄＬ／ｇ、重量平均分子量約７０，０００）に代えてデキストラン４０（極限粘度０．１７ｄＬ／ｇ、重量平均分子量約４０，０００）を用いた点、および、カルボキシ化担体の調製（カルボキシ基の導入）の際のクロロ酢酸ナトリウムの使用量を３．９ｇから４．５ｇに変更した点を除き、実施例５と同様にして、プロテインＡ固定カルボキシ化担体を製造した。
　さらに、実施例１と同様にして、親水性ポリマー被覆量、カルボキシ基導入量、アフィニティリガンド導入量を測定した。測定結果を、それぞれ、表１の「親水性ポリマー被覆量」、「カルボキシ基導入量」および「アフィニティリガンド導入量」の欄に示す。
２．抗体吸着容量および精製純度の評価
　製造したプロテインＡ固定カルボキシ化担体を用いて、実施例１と同様に、上述した「抗体吸着容量の評価方法」および「精製純度の評価方法」に従って、抗体吸着容量および精製純度の評価を行った。抗体吸着容量および精製純度の評価結果を、それぞれ、表１の「抗体吸着容量（評価）」および「精製純度（評価）」の欄に示す。
［実施例７］
１．アフィニティクロマトグラフィ担体の製造
　担体の調製（親水性ポリマーによる被覆）の際のデキストラン７０（極限粘度０．２３ｄＬ／ｇ、重量平均分子量約７０，０００）に代えてデキストラン１９（極限粘度０．１２ｄＬ／ｇ、重量平均分子量約１９，０００）を用いた点、および、カルボキシ化担体の調製（カルボキシ基の導入）の際のクロロ酢酸ナトリウムの使用量を３．９ｇから５．７ｇに変更した点を除き、実施例５と同様にして、プロテインＡ固定カルボキシ化担体を製造した。
　さらに、実施例１と同様にして、親水性ポリマー被覆量、カルボキシ基導入量、アフィニティリガンド導入量を測定した。測定結果を、それぞれ、表１の「親水性ポリマー被覆量」、「カルボキシ基導入量」および「アフィニティリガンド導入量」の欄に示す。
２．抗体吸着容量および精製純度の評価
　製造したプロテインＡ固定カルボキシ化担体を用いて、実施例１と同様に、上述した「抗体吸着容量の評価方法」および「精製純度の評価方法」に従って、抗体吸着容量および精製純度の評価を行った。抗体吸着容量および精製純度の評価結果を、それぞれ、表１の「抗体吸着容量（評価）」および「精製純度（評価）」の欄に示す。
［実施例８］
１．アフィニティクロマトグラフィ担体の製造
（１）湿ゲルの調製
　メタクリレート系多孔系基材「トヨパールＨＷ－６５Ｆ（TOYOPEARL HW-65F）」（東ソー社製）（“トヨパール”および“ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ”は登録商標）を、グラスフィルター上で、純水を用いて懸濁およびろ過を繰り返すことによって洗浄し、基材スラリーを得た。この基材スラリーから、吸引ろ過によって純水を除去して、湿ゲルを得た。
（２）被覆前基材の調製　－　エポキシ基の導入
　得られた湿ゲル１００ｇ、純水１５２ｍＬおよびクロロメチルオキシラン５０ｇを、５００ｍＬ容の三口フラスコに入れ、４５℃の温浴中で、フラスコ内容物の撹拌を開始した。フラスコ内の温度が４５℃になるまで撹拌を行った。４５℃の温浴中で、フラスコ内の温度を約４５℃に維持しながら、５０％（ｗ／ｗ）水酸化ナトリウム水溶液４１ｇを２時間かけてフラスコ内に滴下した。水酸化ナトリウム水溶液の全量を滴下した後、さらに１時間反応し、グラスフィルター上で、純水を用いて懸濁およびろ過を繰り返すことによって洗浄し、湿ゲルを得た。この反応を３回繰返すことで、被覆前基材の湿ゲルを得た。
（３）担体の調製　－　親水性ポリマーによる被覆
　デキストラン７０（極限粘度０．２３ｄＬ／ｇ；重量平均分子量約７０，０００）１３ｇに代えてデキストラン４０（極限粘度０．１７ｄＬ／ｇ、重量平均分子量約４０，０００）１２６ｇを用いた点を除き、実施例１と同様にして、担体の湿ゲルを得た。
　また、得られた担体のデキストラン被覆量を、実施例１と同様に、上述した「親水性ポリマー被覆量の測定方法」に従って測定した。得られた親水性ポリマー被覆量を、表１の「親水性ポリマー被覆量」の欄に示す。
（４）カルボキシ化担体の調製　－　カルボキシ基の導入
　クロロ酢酸ナトリウムの使用量を６．２ｇから３．４ｇに変更した点を除き、実施例１と同様にして、カルボキシ化担体の湿ゲルを得た。
　また、得られたカルボキシ化担体のカルボキシ基導入量を、実施例１と同様に、上述した「カルボキシ基導入量の測定方法」に従って測定した。得られたカルボキシ基導入量を、表１の「カルボキシ基導入量」の欄に示す。
（５）プロテインＡ固定カルボキシ化担体の調製　－　アフィニティリガンドの導入
　実施例１と同様にして、プロテインＡ固定カルボキシ化担体を得た。
　また、得られたプロテインＡ固定カルボキシ化担体のプロテインＡ固定化量を、実施例１と同様に、上述した「アフィニティリガンド導入量（プロテインＡ固定化量）の測定方法」に従って測定した。得られたプロテインＡ固定化量を、表１の「アフィニティリガンド導入量」の欄に示す。
２．抗体吸着容量および精製純度の評価
　製造したプロテインＡ固定カルボキシ化担体を用いて、実施例１と同様に、上述した「抗体吸着容量の評価方法」および「精製純度の評価方法」に従って、抗体吸着容量および精製純度の評価を行った。抗体吸着容量および精製純度の評価結果を、それぞれ、表１の「抗体吸着容量（評価）」および「精製純度（評価）」の欄に示す。
［比較例１］
１．アフィニティクロマトグラフィ担体の製造
　カルボキシ化担体の調製（カルボキシ基の導入）の際のクロロ酢酸ナトリウムの使用量を６．２ｇから１．８ｇに変更した点を除き、実施例１と同様にして、プロテインＡ固定カルボキシ化担体を製造した。
　さらに、実施例１と同様にして、親水性ポリマー被覆量、カルボキシ基導入量、アフィニティリガンド導入量を測定した。測定結果を、それぞれ、表１の「親水性ポリマー被覆量」、「カルボキシ基導入量」および「アフィニティリガンド導入量」の欄に示す。
２．抗体吸着容量および精製純度の評価
　製造したプロテインＡ固定カルボキシ化担体を用いて、実施例１と同様に、上述した「抗体吸着容量の評価方法」および「精製純度の評価方法」に従って、抗体吸着容量および精製純度の評価を行った。抗体吸着容量および精製純度の評価結果を、それぞれ、表１の「抗体吸着容量（評価）」および「精製純度（評価）」の欄に示す。
［比較例２］
１．アフィニティクロマトグラフィ担体の製造
　カルボキシ化担体の調製（カルボキシ基の導入）の際のクロロ酢酸ナトリウムの使用量を６．２ｇから２２．７ｇに変更した点を除き、実施例１と同様にして、プロテインＡ固定カルボキシ化担体を製造した。
　さらに、実施例１と同様にして、親水性ポリマー被覆量、カルボキシ基導入量、アフィニティリガンド導入量を測定した。測定結果を、それぞれ、表１の「親水性ポリマー被覆量」、「カルボキシ基導入量」および「アフィニティリガンド導入量」の欄に示す。
２．抗体吸着容量および精製純度の評価
　製造したプロテインＡ固定カルボキシ化担体を用いて、実施例１と同様に、上述した「抗体吸着容量の評価方法」および「精製純度の評価方法」に従って、抗体吸着容量および精製純度の評価を行った。抗体吸着容量および精製純度の評価結果を、それぞれ、表１の「抗体吸着容量（評価）」および「精製純度（評価）」の欄に示す。
［比較例３］
１．アフィニティクロマトグラフィ担体の製造
（１）担体の調製　－　親水性ポリマーによる被覆
実施例１と同様にして担体の湿ゲルを得た。また、得られた担体のデキストラン被覆量を、実施例１と同様に、上述した「親水性ポリマー被覆量の測定方法」に従って測定した。得られた親水性ポリマー被覆量を、表１の「親水性ポリマー被覆量」の欄に示す。
（２）プロテインＡ固定化担体の調製　－　アフィニティリガンドの導入
　得られた担体を、湿潤体積として４ｍＬ分、ディスポ―サブルカラムに入れ、純水を用いて懸濁およびろ過を繰り返すことによって洗浄し、担体スラリーを得た。この担体スラリーから、吸引ろ過によって純水を除去して、湿ゲルを得た。
　得られた湿ゲルを反応容器にとり、純水にてスラリー体積を５ｍＬとした後に、２５０ｍＭクエン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ３．５）１ｍＬ加えた。さらに、１６０ｍＭ過ヨウ素酸ナトリウム水溶液２ｍＬを加えた後、室温で０．５時間転倒撹拌し、フィルター上で純水およびリン酸バッファーを用いて懸濁およびろ過を繰り返すことによって洗浄し、吸引ろ過によって純水もしくはリン酸バッファーを除去して、アルデヒド基導入担体の湿ゲルを得た。
　得られたアルデヒド基導入担体の湿ゲル１．５ｇを反応容器にとり、２０ｍｇ／ｍＬプロテインＡ溶液３ｍＬを反応容器に加え、室温で、２時間、転倒撹拌した。上記２０ｍｇ／ｍＬプロテインＡ溶液は、遺伝子組み換え天然型プロテインＡ「ｒＳＰＡ」（レプリジェン社製）を、２００ｍＭ　ＭＥＳ（2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid；２－（Ｎ－モルホリノ）エタンスルホン酸）バッファー（ｐＨ７．４）に溶解して調製したものである。
　続いて、トリエチルアミノボラン１１ｍｇを反応容器に加え、２５℃で、１６時間、振盪した。溶媒を２００ｍＭ　ＭＥＳバッファー（ｐＨ７．４）に置換し、洗浄し、洗浄液を除去した後に、２０ｍＭトリス塩酸バッファー３ｍＬ、トリエチルアミノボラン１１ｍｇを反応容器に加え、室温で、２時間、転倒撹拌した。溶媒を純水、１Ｍ塩化ナトリウム水溶液に置換し、洗浄し、プロテインＡ固定化担体を得た。
　また、得られたプロテインＡ固定化担体のプロテインＡ固定化量（アフィニティリガンド導入量）を、上述した「アフィニティリガンド導入量（プロテインＡ固定化量）の測定方法」に従って測定した。得られたプロテインＡ固定化量を、表１の「アフィニティリガンド導入量」の欄に示す。
２．抗体吸着容量および精製純度の評価
　製造したプロテインＡ固定化担体を用いて、実施例１と同様に、上述した「抗体吸着容量の評価方法」および「精製純度の評価方法」に従って、抗体吸着容量および精製純度の評価を行った。抗体吸着容量および精製純度の評価結果を、それぞれ、表１の「抗体吸着容量（評価）」および「精製純度（評価）」の欄に示す。
［比較例４］
１．アフィニティクロマトグラフィ担体の製造
　架橋アガロース系基材「セファローズ６　ファスト・フロー（Sepharose 6 Fast Flow）」（ＧＥヘルスケア社製）を、グラスフィルター上で、純水を用いて懸濁およびろ過を繰り返すことによって洗浄し、基材スラリーを得た。この基材スラリーから、吸引ろ過によって純水を除去して、湿ゲルを得た。
　得られた湿ゲル１２ｇ、クロロ酢酸ナトリウム４．７ｇおよび純水２４ｍＬを１００ｍＬ容の三口フラスコに入れ、５０℃の温浴中で、フラスコ内容物の撹拌を開始した。クロロ酢酸ナトリウムが完全に溶解するまで撹拌を行った。溶解後、５０℃の温浴中で、フラスコ内温度を約５０℃に維持しながら、５０％（ｗ／ｗ）水酸化ナトリウム水溶液８．８ｇを１時間かけて滴下した。水酸化ナトリウム水溶液の全量を滴下した後、さらに３時間反応し、グラスフィルター上で、純水を用いて懸濁およびろ過を繰り返すことによって洗浄し、カルボキシ化担体の湿ゲルを得た。
　得られたカルボキシ化担体を用いて、実施例１と同様にして、プロテインＡ固定カルボキシ化担体を得た。
　さらに、実施例１と同様にして、カルボキシ化担体のカルボキシ基導入量およびプロテインＡ固定カルボキシ化担体のプロテインＡ導入量を測定した。測定結果を、それぞれ、表１の「カルボキシ基導入量」および「アフィニティリガンド導入量」の欄に示す。
２．抗体吸着容量および精製純度の評価
　製造したプロテインＡ固定カルボキシ化担体を用いて、実施例１と同様に、上述した「抗体吸着容量の評価方法」および「精製純度の評価方法」に従って、抗体吸着容量および精製純度の評価を行った。抗体吸着容量および精製純度の評価結果を、それぞれ、表１の「抗体吸着容量（評価）」および「精製純度（評価）」の欄に示す。
［比較例５］
１．アフィニティクロマトグラフィ担体の製造
　湿ゲルの調製の際の架橋アガロース系基材を「セファローズ４　ファスト・フロー（Sepharose 4 Fast Flow）」（ＧＥヘルスケア社製）に変更した点、および、カルボキシ化担体の調製の際のクロロ酢酸ナトリウムの使用量を４．７ｇから９．３ｇに変更した点を除き、比較例４と同様にして、プロテインＡ固定カルボキシ化担体を製造した。
　さらに、実施例１と同様にして、カルボキシ化担体のカルボキシ基導入量およびプロテインＡ固定カルボキシ化担体のプロテインＡ導入量を測定した。測定結果を、それぞれ、表１の「カルボキシ基導入量」および「アフィニティリガンド導入量」の欄に示す。
２．抗体吸着容量および精製純度の評価
　製造したプロテインＡ固定カルボキシ化担体を用いて、実施例１と同様に、上述した「抗体吸着容量の評価方法」および「精製純度の評価方法」に従って、抗体吸着容量および精製純度の評価を行った。抗体吸着容量および精製純度の評価結果を、それぞれ、表１の「抗体吸着容量（評価）」および「精製純度（評価）」の欄に示す。
［比較例６］
１．アフィニティクロマトグラフィ担体の準備
　アフィニティクロマトグラフィ担体として、プロテインＡ導入担体「マブセレクトＳｕＲｅ（MabSelect SuRe）」（ＧＥヘルスケア社製）（“ＭＡＢＳＥＬＥＣＴ”は登録商標）を準備した。
２．抗体吸着容量および精製純度の評価
　準備したプロテインＡ導入担体を用いて、実施例１と同様に、上述した「抗体吸着容量の評価方法」および「精製純度の評価方法」に従って、抗体吸着容量および精製純度の評価を行った。抗体吸着容量および精製純度の評価結果を、それぞれ、表１の「抗体吸着容量（評価）」および「精製純度（評価）」の欄に示す。
［比較例７］
１．アフィニティクロマトグラフィ担体の製造
　メタクリレート系多孔系基材「トヨパールＨＷ－６５Ｆ（TOYOPEARL HW-65F）」（東ソー社製）（“トヨパール”および“ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ”は登録商標）を、グラスフィルター上で、純水を用いて懸濁およびろ過を繰り返すことによって洗浄し、基材スラリーを得た。この基材スラリーから、吸引ろ過によって純水を除去して、湿ゲルを得た。
　得られた湿ゲル１２ｇ、クロロ酢酸ナトリウム３．８ｇおよび純水２４ｍＬを１００ｍＬ容の三口フラスコに入れ、５０℃の温浴中で、フラスコ内容物の撹拌を開始した。クロロ酢酸ナトリウムが完全に溶解するまで撹拌を行った。溶解後、５０℃の温浴中で、フラスコ内温度を約５０℃に維持しながら、５０％（ｗ／ｗ）水酸化ナトリウム水溶液８．８ｇを１時間かけて滴下した。水酸化ナトリウム水溶液の全量を滴下した後、さらに３時間反応し、グラスフィルター上で、純水を用いて懸濁およびろ過を繰り返すことによって洗浄し、カルボキシ化担体の湿ゲルを得た。
　得られたカルボキシ化担体を用いて、実施例１と同様にして、プロテインＡ固定カルボキシ化担体を得た。
　さらに、実施例１と同様にして、カルボキシ化担体のカルボキシ基導入量およびプロテインＡ固定カルボキシ化担体のプロテインＡ導入量を測定した。測定結果を、それぞれ、表１の「カルボキシ基導入量」および「アフィニティリガンド導入量」の欄に示す。
２．抗体吸着容量および精製純度の評価
　製造したプロテインＡ固定カルボキシ化担体を用いて、実施例１と同様に、上述した「抗体吸着容量の評価方法」および「精製純度の評価方法」に従って、抗体吸着容量および精製純度の評価を行った。抗体吸着容量および精製純度の評価結果を、それぞれ、表１の「抗体吸着容量（評価）」および「精製純度（評価）」の欄に示す。
［比較例８］
１．アフィニティクロマトグラフィ担体の製造
　実施例１と同様にして、カルボキシ化担体の湿ゲルを得た。
　得られた湿ゲルをアフィニティクロマトグラフィ担体として用いた。
　さらに、実施例１と同様にして、親水性ポリマー被覆量およびカルボキシ基導入量を測定した。測定結果を、それぞれ、表１の「親水性ポリマー被覆量」および「カルボキシ基導入量」の欄に示す。
２．抗体吸着容量および精製純度の評価
　製造したカルボキシ化担体を用いて、実施例１と同様に、上述した「抗体吸着容量の評価方法」および「精製純度の評価方法」に従って、抗体吸着容量および精製純度の評価を行った。抗体吸着容量および精製純度の評価結果を、それぞれ、表１の「抗体吸着容量（評価）」および「精製純度（評価）」の欄に示す。
［参考例１］
１．クロマトグラフィ担体の準備
　クロマトグラフィ担体として、スルホキシ基導入担体「セルファインＭＡＸ　Ｓ－ｒ（Cellufine MAX S-r）」（ＪＮＣ社製）（“ＣＥＬＬＵＦＩＮＥ”は登録商標）を準備した。
２．抗体吸着容量および精製純度の評価
　準備したスルホキシ基導入担体を用いて、後述する「抗体吸着容量の評価方法」および「精製純度の評価方法」に従って、抗体吸着容量および精製純度の評価を行った。抗体吸着容量および精製純度の評価結果を、それぞれ、表１の「抗体吸着容量（評価）」および「精製純度（評価）」の欄に示す。
３．スルホキシ基導入量の測定
　また、上述した「カルボキシ基導入量の測定方法」に準じて、スルホキシ基導入量を測定したところ、スルホキシ基導入量は、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ－ｇｅｌであった。
４．抗体吸着容量の評価方法
　市販のクロマトグラフィ担体１ｍＬをガラスカラム「トリコーン　１０／２０　カラム（Tricorn 10/20 column）」（ＧＥヘルスケア社製）（“ＴＲＩＣＯＲＮ”は登録商標）に充填し、クロマトシステム「アクタアヴァント２５（AKTA avant 25）」（ＧＥヘルスケア社製）（“ＡＫＴＡＡＶＡＮＴ”は登録商標）に接続し、抗体吸着容量の測定を行った。
　カラムを平衡化液（１０ｍＭ酢酸バッファー、ｐＨ４．７）で平衡化した後に、ヒトＩｇＧ抗体（Immunoglobulin G：免疫グロブリンＧ）を標準バッファー（１０ｍＭ酢酸バッファー、ｐＨ４．７）で５ｍｇ／ｍＬに調整した溶液３０ｍＬを流速０．４２ｍＬ／ｍｉｎにて添加した。その後、負荷後洗浄液（１０ｍＭ酢酸バッファー、ｐＨ４．７）を同じ流速で５ｍＬ流して洗浄した後に、溶出液１（２０ｍＭリン酸バッファー、ｐＨ７．４）および溶出液２（２０ｍＭリン酸バッファー、１Ｍ　ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）によって塩濃度を段階的に上げながら同じ流速で３０ｍＬ流した。その後、ＣＩＰ液（０．１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液）を同じ流速で５ｍＬ流し、続いて平衡化液（２０ｍＭリン酸バッファー、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）を同じ流速で５ｍＬ流した。このとき、２８０ｎｍの吸光度をモニタリングして得られたＩｇＧ溶出ピークより、各分画における溶出液の抗体溶出量を算出した。溶出前洗浄液からＣＩＰ液までに溶出した抗体量を抗体吸着容量として算出した。
　抗体吸着容量の評価は、以下の評価基準に従い、カルボキシ基とプロテインAのみを導入した場合の抗体吸着容量を基準として行った。すなわち、比較例４を基準として抗体吸着容量を評価した。
　抗体吸着容量が基準の４０％以上・・・抗体吸着容量の評価「Ａ」
　抗体吸着容量が基準の４０％未満・・・抗体吸着容量の評価「Ｃ」
５．精製純度の評価方法
　市販のクロマトグラフィ担体１ｍＬをガラスカラム「トリコーン　１０／２０　カラム（Tricorn 10/20 column）」（ＧＥヘルスケア社製）（“ＴＲＩＣＯＲＮ”は登録商標）に充填し、クロマトシステム「アクタアヴァント２５（AKTA avant 25）」（ＧＥヘルスケア社製）（“ＡＫＴＡＡＶＡＮＴ”は登録商標）に接続し、各分画で溶出されるＨＣＰ（host cell protein；宿主細胞由来タンパク質）量およびＩｇＧ（Immunoglobulin G；免疫グロブリンＧ）量の測定を行った。
　カラムを平衡化液（１０ｍＭ酢酸バッファー、ｐＨ４．７）で平衡化した後に、ＩｇＧ、ＣＨＯ－Ｓ（Chinese Hamster Ovary S）細胞由来ＨＣＰが、それぞれ、１．６ｍｇ／ｍＬ、０．６４ｍｇ／ｍＬになるように標準バッファー（１０ｍＭ酢酸バッファー、ｐＨ４．７）を用いて調製したＩｇＧ／ＨＣＰ混合液を、上述した（１）で得られた抗体吸着容量の８割の抗体量が負荷されるような溶液量を流速０．２１ｍＬ／ｍｉｎにて添加した。その後、溶出液１（２０ｍＭリン酸バッファー、ｐＨ７．４）および溶出液２（２０ｍＭリン酸バッファー、１Ｍ　ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）によって塩濃度を段階的に上げながら流速０．４２ｍＬ／ｍｉｎで３０ｍＬ流した。その後、ＣＩＰ液（０．１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液）を同じ流速で５ｍＬ流し、続いて平衡化液（２０ｍＭリン酸バッファー、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）を同じ流速で５ｍＬ流した。このとき、２８０ｎｍの吸光度をモニタリングして得られたＩｇＧ溶出ピークより、各分画における溶出液のＩｇＧ溶出量を算出した。また、各分画の溶出液を回収し、宿主細胞由来タンパク質検出キット「ＣＨＯ　ＨＣＰ　３ｒｄ　Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ＥＬＩＳＡ　ｋｉｔ」（シグナステクノロジーズ社製）を用いたＥＬＩＳＡ法により、各分画における溶出液のＨＣＰ量を算出した。
　算出した溶出液のＩｇＧ量およびＨＣＰ量を用いて、精製純度は溶出液におけるＨＣＰ混入量、すなわち、溶出液中のＩｇＧ量あたりのＨＣＰ量として、以下の式により算出した。
　精製純度（ｐｐｍ）＝ＨＣＰ混入量（ｐｐｍ）＝溶出液のＨＣＰ量／溶出液のＩｇＧ量
　精製純度の評価は、以下の評価基準に従い、カルボキシ基とプロテインＡのみを導入した場合のＨＣＰ混入量（ｐｐｍ）を基準として行った。すなわち、比較例４を基準としてＨＣＰ混入量を評価した。
　ＨＣＰ混入量（ｐｐｍ）が２０％以上減少した・・・・・・精製純度の評価「Ａ」
　ＨＣＰ混入量（ｐｐｍ）が０％超２０％未満減少した・・・精製純度の評価「Ｂ」
　ＨＣＰ混入量（ｐｐｍ）が減少しない・・・・・・・・・・精製純度の評価「Ｃ」
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
<結果の説明>
　実施例１～８のアフィニティクロマトグラフィ担体は、抗体吸着容量および精製純度がいずれも「Ｂ」以上の評価であり、抗体吸着容量および精製純度のいずれもが優れていた。
　一方、比較例１～８は、抗体吸着容量および精製純度のうち少なくとも一方が「Ｃ」評価であり、抗体吸着容量および精製純度の少なくとも一方が劣っていた。
　また、実施例６と実施例８とを対比すると、基材が架橋アガロース系である実施例６の精製純度が「Ａ」評価であったのに対して、基材がメタクリレート系である実施例８の精製純度は「Ｂ」評価であったことから、架橋アガロース系基材の方がメタクリレート系基材よりも、精製純度が優れることが示唆された。なお、親水性ポリマー被覆量が大きく異なる実施例１と実施例４では、精製純度の評価がいずれも「Ａ」評価であることから、実施例６と実施例８との間で精製純度の評価が異なることとなった原因は、基材が架橋アガロース系（実施例６）であるか、メタクリレート系（実施例８）であるかによるものであると考えられる。

Claims (14)

  1. 　基材、親水性ポリマーおよびアフィニティリガンドを有するアフィニティクロマトグラフィ担体であって、
    　前記基材は多糖類、アクリレート系重合体、メタクリレート系重合体およびスチレン系重合体からなる群から選択される少なくとも１種からなり、
    　前記親水性ポリマーは親水性多糖類からなる群から選択される少なくとも１種であり、
    　前記アフィニティリガンドは抗体結合性タンパク質および抗体結合性ポリペプチドからなる群から選択される少なくとも１種であり、
    　前記アフィニティクロマトグラフィ担体にはカルボキシ基が導入され、
    　前記カルボキシ基の導入量がイオン交換容量で１５ｍｍｏｌ／Ｌ－ｇｅｌ～６０ｍｍｏｌ／Ｌ－ｇｅｌである、アフィニティクロマトグラフィ担体。
  2. 　前記親水性ポリマーの極限粘度が０．１０ｄＬ／ｇ以上である、請求項１に記載のアフィニティクロマトグラフィ担体。
  3. 　前記親水性ポリマーの被覆量が３ｍｇ／ｇ－ｄｒｙ　ｇｅｌ～５００ｍｇ／ｇ－ｄｒｙ　ｇｅｌである、請求項１または２に記載のアフィニティクロマトグラフィ担体。
  4. 　前記基材が多糖類、アクリレート系重合体およびメタクリレート系重合体からなる群から選択される少なくとも１種からなる、請求項１～３のいずれか１項に記載のアフィニティクロマトグラフィ担体。
  5. 　前記親水性ポリマーがデキストラン、カルボキシメチルデキストランおよびプルランからなる群から選択される少なくとも１種である、請求項１～４のいずれか１項に記載のアフィニティクロマトグラフィ担体。
  6. 　前記基材が多孔質粒子である、請求項１～５のいずれか１項に記載のアフィニティクロマトグラフィ担体。
  7. 　前記アフィニティリガンドが抗体と抗原抗体反応をする、請求項１～６のいずれか１項に記載のアフィニティクロマトグラフィ担体。
  8. 　前記アフィニティリガンドがプロテインＡまたはその改変体である、請求項１～７のいずれか１項に記載のアフィニティクロマトグラフィ担体。
  9. 　前記基材がセルロース、アガロース、デキストラン、キトサン、グルコマンナンおよびこれらに架橋構造を導入した架橋多糖類からなる群から選択される少なくとも１種からなり、
    　前記親水性ポリマーがデキストラン、カルボキシメチルデキストランおよびプルランからなる群から選択される少なくとも１種の親水性多糖類であり、
    　前記親水性多糖類の極限粘度が０．１２ｄＬ／ｇ～０．３０ｄＬ／ｇであり、
    　前記親水性ポリマーの被覆量が１０ｍｇ／ｇ－ｄｒｙ　ｇｅｌ～２４０ｍｇ／ｇ－ｄｒｙ　ｇｅｌであり、
    　前記カルボキシ基の導入量がイオン交換容量で１５ｍｍｏｌ／Ｌ－ｇｅｌ～５５ｍｍｏｌ／Ｌ－ｇｅｌであり、
    　前記アフィニティリガンドがプロテインＡまたはその改変体であり、かつ、
    　前記アフィニティリガンドの導入量が０．１０ｍｍｏｌ／Ｌ－ｇｅｌ～１．０ｍｍｏｌ／Ｌ－ｇｅｌである、請求項１～８のいずれか１項に記載のアフィニティクロマトグラフィ担体。
  10. 　前記基材がアクリレート系重合体およびメタクリレート系重合体からなる群から選択される少なくとも１種からなり、
    　前記親水性ポリマーがデキストラン、カルボキシメチルデキストランおよびプルランからなる群から選択される少なくとも１種の親水性多糖類であり、
    　前記親水性多糖類の極限粘度が０．１２ｄＬ／ｇ～０．３０ｄＬ／ｇであり、
    　前記親水性ポリマーの被覆量が１０ｍｇ／ｇ－ｄｒｙ　ｇｅｌ～２４０ｍｇ／ｇ－ｄｒｙ　ｇｅｌであり、
    　前記カルボキシ基の導入量がイオン交換容量で１５ｍｍｏｌ／Ｌ－ｇｅｌ～５５ｍｍｏｌ／Ｌ－ｇｅｌであり、
    　前記アフィニティリガンドがプロテインＡまたはその改変体であり、かつ、
    　前記アフィニティリガンドの導入量が０．１０ｍｍｏｌ／Ｌ－ｇｅｌ～１．０ｍｍｏｌ／Ｌ－ｇｅｌである、請求項１～８のいずれか１項に記載のアフィニティクロマトグラフィ担体。
  11. 　請求項１～１０のいずれか１項に記載のアフィニティクロマトグラフィ担体を用いた生体物質の精製方法。
  12. 　前記生体物質の添加時ｐＨが５．０～９．０である、請求項１１に記載の精製方法。
  13. 　前記生体物質の溶出時ｐＨが２．０～５．０である、請求項１１または１２に記載の精製方法。
  14. 　前記生体物質が抗体または抗体誘導体である、請求項１１～１３のいずれか１項に記載の精製方法。
PCT/JP2016/081312 2015-10-23 2016-10-21 アフィニティクロマトグラフィ担体および生体物質の精製方法 Ceased WO2017069254A1 (ja)

Priority Applications (10)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2017545816A JP6600002B2 (ja) 2015-10-23 2016-10-21 アフィニティクロマトグラフィ担体および生体物質の精製方法
RU2018114693A RU2694637C1 (ru) 2015-10-23 2016-10-21 Носитель для аффинной хроматографии и способ очистки биологического вещества
CN201680060014.XA CN108139371A (zh) 2015-10-23 2016-10-21 亲和层析载体及生物物质的纯化方法
AU2016340518A AU2016340518B2 (en) 2015-10-23 2016-10-21 Affinity chromatography carrier and biological substance purification method
BR112018008113-2A BR112018008113A2 (ja) 2015-10-23 2016-10-21 An affinity chromatography carrier and a refining method of biological material
EP16857567.8A EP3367093B1 (en) 2015-10-23 2016-10-21 Affinity chromatography carrier and its use in a biological substance purification method
KR1020187009519A KR20180049026A (ko) 2015-10-23 2016-10-21 어피니티 크로마토그래피 담체 및 생체 물질의 정제 방법
SG11201802997WA SG11201802997WA (en) 2015-10-23 2016-10-21 Affinity chromatography carrier and method for purifying biological substance
CA3000965A CA3000965A1 (en) 2015-10-23 2016-10-21 Affinity chromatography carrier and method for purifying biological substance
US15/952,627 US10888841B2 (en) 2015-10-23 2018-04-13 Affinity chromatography carrier and method for purifying biological substance

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2015-208982 2015-10-23
JP2015208982 2015-10-23

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
US15/952,627 Continuation US10888841B2 (en) 2015-10-23 2018-04-13 Affinity chromatography carrier and method for purifying biological substance

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2017069254A1 true WO2017069254A1 (ja) 2017-04-27

Family

ID=58557258

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2016/081312 Ceased WO2017069254A1 (ja) 2015-10-23 2016-10-21 アフィニティクロマトグラフィ担体および生体物質の精製方法

Country Status (11)

Country Link
US (1) US10888841B2 (ja)
EP (1) EP3367093B1 (ja)
JP (1) JP6600002B2 (ja)
KR (1) KR20180049026A (ja)
CN (1) CN108139371A (ja)
AU (1) AU2016340518B2 (ja)
BR (1) BR112018008113A2 (ja)
CA (1) CA3000965A1 (ja)
RU (1) RU2694637C1 (ja)
SG (1) SG11201802997WA (ja)
WO (1) WO2017069254A1 (ja)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2018105198A1 (ja) * 2016-12-09 2018-06-14 富士フイルム株式会社 ミックスモードアフィニティクロマトグラフィー用担体
JP2019533571A (ja) * 2016-10-03 2019-11-21 ジーイー・ヘルスケア・バイオプロセス・アールアンドディ・アクチボラグ 新規のクロマトグラフィー媒体
JP2021172606A (ja) * 2020-04-23 2021-11-01 東ソー株式会社 タンパク質を固定化可能な不溶性担体およびその製造方法
JP2022512344A (ja) * 2018-12-12 2022-02-03 ピュリロジックス，リミテッド ライアビリティー カンパニー 親和性膜及び製造方法

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP4244233A4 (en) * 2020-11-13 2024-10-09 Donaldson Company, Inc. METHODS FOR OLIGONUCLEOTIDE-BASED AFFINITY CHROMATOGRAPHY
CN113926434A (zh) * 2021-11-03 2022-01-14 上海江夏血液技术有限公司 一种蛋白吸附膜材料及其制备方法和应用

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2010133734A (ja) * 2008-12-02 2010-06-17 Tosoh Corp アフィニティークロマトグラフィー用カルボキシル化担体、及びそれを用いたアフィニティークロマトグラフィー用分離剤
WO2010095673A1 (ja) * 2009-02-20 2010-08-26 チッソ株式会社 免疫グロブリン精製用セルロース系ゲル
JP2010534336A (ja) * 2007-07-25 2010-11-04 ジーイー・ヘルスケア・バイオ−サイエンシズ・アーベー 分離マトリクス
WO2014034457A1 (ja) * 2012-09-03 2014-03-06 株式会社カネカ ミックスモード抗体アフィニティー分離マトリックスとそれを用いた精製方法および標的分子

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1984003053A1 (en) * 1983-02-14 1984-08-16 Amf Inc Modified polysaccharide supports
US4663163A (en) * 1983-02-14 1987-05-05 Hou Kenneth C Modified polysaccharide supports
GB2195344B (en) * 1986-08-19 1991-05-08 Showa Denko Kk Adsorbent composed of porous beads of chitosan and adsorption method using same
JPS6348222A (ja) * 1986-08-19 1988-02-29 Showa Denko Kk インタ−ロイキン−２活性阻害因子吸着剤
SU1700006A1 (ru) * 1989-02-06 1991-12-23 Институт биоорганической химии АН БССР Способ получени аффинных сорбентов дл иммуноферментного анализа
RU2367517C2 (ru) * 2004-09-22 2009-09-20 Джи-И Хелткер Байо-Сайенсиз АБ Способ получения хроматографической матрицы
JP6163541B2 (ja) 2013-04-16 2017-07-12 旭化成メディカル株式会社 抗体タンパク質の精製方法
JPWO2015041218A1 (ja) * 2013-09-17 2017-03-02 株式会社カネカ 新規抗体精製方法及びそれから得られる抗体（ＮｏｖｅｌＡｎｔｉｂｏｄｙＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎＭｅｔｈｏｄａｎｄＡｎｔｉｂｏｄｙｏｂｔａｉｎｅｄｔｈｅｒｅｆｒｏｍ）、並びに陽イオン交換基を用いた新規抗体精製法及びそれから得られる抗体（ＮｏｖｅｌＡｎｔｉｂｏｄｙＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｕｓｉｎｇＣａｔｉｏｎＥｘｃｈａｎｇｅｒａｎｄＡｎｔｉｂｏｄｙｏｂｔａｉｎｅｄｔｈｅｒｅｆｒｏｍ）

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2010534336A (ja) * 2007-07-25 2010-11-04 ジーイー・ヘルスケア・バイオ−サイエンシズ・アーベー 分離マトリクス
JP2010133734A (ja) * 2008-12-02 2010-06-17 Tosoh Corp アフィニティークロマトグラフィー用カルボキシル化担体、及びそれを用いたアフィニティークロマトグラフィー用分離剤
WO2010095673A1 (ja) * 2009-02-20 2010-08-26 チッソ株式会社 免疫グロブリン精製用セルロース系ゲル
WO2014034457A1 (ja) * 2012-09-03 2014-03-06 株式会社カネカ ミックスモード抗体アフィニティー分離マトリックスとそれを用いた精製方法および標的分子

Cited By (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2019533571A (ja) * 2016-10-03 2019-11-21 ジーイー・ヘルスケア・バイオプロセス・アールアンドディ・アクチボラグ 新規のクロマトグラフィー媒体
JP7114150B2 (ja) 2016-10-03 2022-08-08 サイティバ・バイオプロセス・アールアンドディ・アクチボラグ 新規のクロマトグラフィー媒体
WO2018105198A1 (ja) * 2016-12-09 2018-06-14 富士フイルム株式会社 ミックスモードアフィニティクロマトグラフィー用担体
US11565240B2 (en) 2016-12-09 2023-01-31 Fujifilm Corporation Mixed mode affinity chromatography carrier
JP2022512344A (ja) * 2018-12-12 2022-02-03 ピュリロジックス，リミテッド ライアビリティー カンパニー 親和性膜及び製造方法
US11918957B2 (en) 2018-12-12 2024-03-05 Donaldson Company, Inc. Affinity membrane and method of preparation
JP7565276B2 (ja) 2018-12-12 2024-10-10 ドナルドソン カンパニー，インコーポレイティド 親和性膜及び製造方法
JP2024150696A (ja) * 2018-12-12 2024-10-23 ドナルドソン カンパニー，インコーポレイティド 親和性膜及び製造方法
US12434201B2 (en) 2018-12-12 2025-10-07 Donaldson Company, Inc. Affinity membrane and method of preparation
JP7781219B2 (ja) 2018-12-12 2025-12-05 ドナルドソン カンパニー，インコーポレイティド 親和性膜及び製造方法
JP2021172606A (ja) * 2020-04-23 2021-11-01 東ソー株式会社 タンパク質を固定化可能な不溶性担体およびその製造方法
JP7524591B2 (ja) 2020-04-23 2024-07-30 東ソー株式会社 タンパク質を固定化可能な不溶性担体およびその製造方法

Also Published As

Publication number Publication date
EP3367093A1 (en) 2018-08-29
EP3367093B1 (en) 2021-11-03
JPWO2017069254A1 (ja) 2018-07-19
RU2694637C1 (ru) 2019-07-16
KR20180049026A (ko) 2018-05-10
US10888841B2 (en) 2021-01-12
AU2016340518A1 (en) 2018-04-26
EP3367093A4 (en) 2018-10-17
US20180229215A1 (en) 2018-08-16
SG11201802997WA (en) 2018-05-30
CN108139371A (zh) 2018-06-08
JP6600002B2 (ja) 2019-10-30
BR112018008113A2 (ja) 2018-11-06
CA3000965A1 (en) 2017-04-27
AU2016340518B2 (en) 2019-02-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6600002B2 (ja) アフィニティクロマトグラフィ担体および生体物質の精製方法
JP5064225B2 (ja) 抗体精製法
US10730908B2 (en) Separation method
US10519195B2 (en) Antibody purification method, antibody obtained therefrom, novel antibody purification method using cation exchanger, and antibody obtained therefrom
JP6340317B2 (ja) 抗体精製用陽イオン交換クロマトグラフィー担体および抗体医薬の製造過程で生産される抗体単量体とその重合体の分離方法
CN104245078A (zh) 分离方法和分离基质
JP6335785B2 (ja) ミックスモード抗体アフィニティー分離マトリックスとそれを用いた精製方法および標的分子
CN105597370A (zh) 分离基质
JP7584481B2 (ja) バイオセパレーションのための複合材料
US20210039070A1 (en) Composite materials for the depletion of contaminants from solutions
CN109964123A (zh) 抗体的纯化方法
CN1972746B (zh) 分离基质和纯化方法
JP6906547B2 (ja) ミックスモードアフィニティクロマトグラフィー用担体
JP7344232B2 (ja) バイオセパレーションのための複合材料

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 16857567

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2017545816

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 3000965

Country of ref document: CA

Ref document number: 20187009519

Country of ref document: KR

Kind code of ref document: A

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 11201802997W

Country of ref document: SG

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2016340518

Country of ref document: AU

Date of ref document: 20161021

Kind code of ref document: A

REG Reference to national code

Ref country code: BR

Ref legal event code: B01A

Ref document number: 112018008113

Country of ref document: BR

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2018114693

Country of ref document: RU

Ref document number: 2016857567

Country of ref document: EP

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 112018008113

Country of ref document: BR

Kind code of ref document: A2

Effective date: 20180420