WO2017090762A1 - デングウイルス弱毒株をバンク化した生ウイルス、及びそれらを抗原とするデングワクチン - Google Patents

デングウイルス弱毒株をバンク化した生ウイルス、及びそれらを抗原とするデングワクチン Download PDF

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靖彦 新村
晋 山折
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真一 丸野
翔太 ▲高▼木
靖久 林
和久 亀山
英恵 小村
福田　亜紀
奈緒美 内田
昌也 吉村
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Definitions

  • the present invention relates to a dengue vaccine containing an attenuated dengue virus.
  • Dengue virus infection is the most common infectious disease after the world's three major infectious diseases (AIDS, malaria, tuberculosis), and is spreading worldwide.
  • Dengue virus is a single-stranded RNA virus belonging to the Flaviviridae family, and there are four serotypes that are distinguished by antigenicity. Infection with certain serotypes of dengue virus does not reinfect dengue viruses of the same serotype for a lifetime due to acquired immunity, while cross protection against viruses of different serotypes is at most 12 Dengue virus infection can occur more than once because it lasts only about a week. In particular, it is known that “Dengue hemorrhagic fever” and “Dengue shock syndrome”, which are serious pathological conditions that can lead to death, are likely to occur during the second and subsequent infections.
  • the dengue virus genome encodes structural proteins such as C protein, M protein, and E protein, and seven non-structural (NS) proteins that do not constitute virus particles and work during replication. Therefore, genetically modified chimeric live vaccines with other viruses and specific serotypes of dengue viruses as backbones, inactivated whole particle vaccines, subunit vaccines, DNA vaccines, etc. lack dengue-derived components. It only presents some of the various immune antigens that occur in the body due to natural infection.
  • live attenuated vaccines that have been subcultured in cells different from the natural host and acquired host cell range mutations are similar to those in natural infections, as shown in measles, rubella, mumps, polio, etc. Since it can induce an immune response, it can be expected to be highly effective in dengue virus infection.
  • Dengue vaccines that are currently being developed or marketed can induce neutralizing antibodies against dengue viruses of all four serotypes by multiple administrations, but all four It takes a period of time to acquire neutralizing antibodies against serotypes, and in endemic areas there is a risk of natural infection during that period, and a vaccine that can confer protective immunity against all four serotypes by a single administration Can be said to be more useful.
  • Sanofi ChimeriVax-DEN Dengvaxia (TM)
  • Takeda's DENVax TM
  • Butantan's TetraVax TM
  • Sanofi's Dengvaxia is a live genetically modified chimera vaccine with the yellow fever vaccine strain YF-17D as the backbone. It is used in 3 countries in Mexico, Brazil and the Philippines for 3 to 6 years between 9 and 45 years. It has been approved by.
  • the Phase 3 study of Dengvaxia was conducted in 5 countries in Southeast Asia with approximately 10,000 people aged 2 to 15 years old and approximately 20,000 people aged 9 to 16 years in 5 South American countries. As a result, the effectiveness was limited to about 60%, and especially the effectiveness against serotype 2 was as low as about 40%, which was not sufficient. In addition, the effectiveness for subjects without dengue existing immunity was about 40%. Furthermore, in the results of the long-term follow-up of Phase 3 and Phase 2b in Thailand, the risk of hospitalization in those younger than 9 years was 1.6 times higher than that of the non-inoculated group at the third year. In particular, it was about 5 times higher for those under 5 years old. This point is considered to be Vaccine Enhancement.
  • a live-passaged live vaccine that includes all dengue-derived components and that does not undergo active cloning and that includes quasispecies can be expected to be more effective.
  • the present inventors have found an attenuated tetravalent live dengue virus vaccine that is excellent in both medicinal efficacy and safety results.
  • the present inventors have found an attenuated tetravalent live dengue virus vaccine that is excellent in medicinal and safety results, whether it is a single dose or multiple doses.
  • Known attenuated strains obtained by subcultured wild-type dengue virus (serotypes 1 to 4) with canine primary kidney (PDK; Primary Dog Kidney) cells or primary monkey primary kidney (PGMMK; Primary Green Monkey Kidney) cells Yes.
  • the present invention further provides an attenuated dengue virus obtained by subculture in African green monkey kidney (Vero) cells, and an attenuated dengue virus vaccine comprising a live virus banked as an antigen.
  • the present invention includes the following.
  • [1] There is 95% or more homology with the serotype 1 dengue virus parent strain 03135 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 analyzed using a next-generation sequencer, and any of the parent strains at positions 483, 568, and 1663
  • An attenuated serotype 1 dengue virus having a completely mutated amino acid and further having one or more of the following mutations (1) to (4): (1) K482E or K482E / K (2) K484R or K484R / K (3) I / T2353T (4) A2364T or A2364T / A
  • the attenuated serotype 1 dengue virus according to [1] which has a homology of 97% or more with the amino acid sequence of the parent strain 03135 represented by SEQ ID NO: 1.
  • [31] There is 95% or more homology with the serotype 4 dengue virus parent strain 1036 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 analyzed using a next-generation sequencer, and the amino acid at position 2187 or 2354 of the parent strain is completely mutated And an attenuated serotype 4 dengue virus that has no mutation at position 624, 742, 1628, 2286, 2482, or 2508.
  • the attenuated serotype 4 dengue virus according to [31] which has a homology of 97% or more with the amino acid sequence of the parent strain 1036 represented by SEQ ID NO: 4.
  • An attenuated tetravalent dengue virus vaccine comprising the attenuated serotype 3 dengue virus according to any of the above and the attenuated serotype 4 dengue virus according to any of [31] to [38] as an antigen.
  • the mixing ratio of dengue virus antigens of serotypes 1, 2, 3 and 4 is 1: 1: 1: 1: 1, 5: 3: 5: 3, or 5: 3: 3: 3. [39] Or the attenuated dengue virus vaccine according to [40].
  • a serotype 1 dengue virus parent strain 03135 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 analyzed using a next-generation sequencer is passaged 15 to 25 in canine primary kidney (PDK) cells to make an attenuated strain,
  • PDK canine primary kidney
  • a serotype 1 dengue virus parental strain 03135 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 analyzed using a next-generation sequencer is subcultured into 15 attenuated strains with PDK cells, and the attenuated strain is further subcultured with Vero cells.
  • a method for producing an attenuated serotype 2 dengue virus according to [10] to [20].
  • a serotype 2 dengue virus parent strain 99345 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 analyzed using a next-generation sequencer is subcultured into PDK cells for 25 passages to be attenuated strains, and the attenuated strains are further subcultured in Vero cells.
  • the serotype 3 dengue virus parent strain 16562 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 analyzed using a next-generation sequencer was passaged 20-30 in green monkey primary kidney (PGMMK) cells and 2-5 in PDK cells.
  • the serotype 3 dengue virus parent strain 16562 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 analyzed using a next-generation sequencer is passed through 30 passages with PGMK cells and 4 passages with PDK cells to form attenuated strains.
  • Serotype 4 dengue virus parent strain 1036 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 analyzed using a next-generation sequencer is subcultured from PDK cells 35-45 to attenuated strains, and the attenuated strains are further subcultured in Vero cells.
  • a serotype 4 dengue virus parent strain 1036 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 analyzed using a next-generation sequencer is subcultured into 40 attenuated strains with PDK cells, and the attenuated strain is further passaged with Vero cells.
  • the present invention can induce neutralizing antibody responses against all four dengue virus serotypes even with a single dose, and has the same level of safety (tolerability) as other live attenuated virus vaccines on the market.
  • a dengue vaccine is provided.
  • FIG. 1 shows the long-term transition of the neutralizing antibody titer (serotype 1).
  • FIG. 2 shows the long-term transition of the neutralizing antibody titer (serotype 2).
  • FIG. 3 shows the long-term transition of the neutralizing antibody titer (serotype 3).
  • FIG. 4 shows the long-term transition of the neutralizing antibody titer (serotype 4).
  • FIG. 5 shows the long-term transition of the neutralizing antibody titer and the inoculation frequency independence (serotype 1).
  • FIG. 6 shows the long-term transition of the neutralizing antibody titer and the inoculation frequency independence (serotype 2).
  • FIG. 7 shows the long-term transition of the neutralizing antibody titer and the inoculation frequency independence (serotype 3).
  • FIG. 8 shows the long-term transition of the neutralizing antibody titer and the inoculation frequency independence (serotype 4).
  • FIG. 9 shows the antigen amount-independence (serotype 1) of the neutralizing antibody response.
  • FIG. 10 shows the antigen amount-independence (serotype 2) of the neutralizing antibody response.
  • FIG. 11 shows the antigen amount-independent (serotype 3) of the neutralizing antibody response.
  • FIG. 12 shows the antigen amount-independence (serotype 4) of the neutralizing antibody response.
  • FIG. 13 shows a production flow of a tetravalent dengue vaccine.
  • the present invention relates to an attenuated dengue virus obtained by further subculturing an attenuated strain obtained by subculturing clinically isolated wild-type dengue virus (parent strain) with PDK cells or PGMK cells and PDK cells with Vero cells. Seed strains used for dengue vaccines (VMS (Virus Master Seed), VWS (Virus Working Seed), etc.) and product equivalent passages (GLP test bulk (Pre-CTM: Pre-Clinical Trial Material) ) Etc.), and dengue vaccines made using them.
  • VMS Virus Master Seed
  • VWS Virus Working Seed
  • GLP test bulk Pre-CTM: Pre-Clinical Trial Material
  • the site is specified.
  • the attenuated serotype 1 dengue virus of the present invention further comprises attenuated strain 1 produced by subculturing parental strain 03135 (SEQ ID NO: 1), which is a clinical isolate, in passage 15-25 in canine primary kidney (PDK) cells, Obtained by passage on Vero cells.
  • SEQ ID NO: 1 which is a clinical isolate, in passage 15-25 in canine primary kidney (PDK) cells, Obtained by passage on Vero cells.
  • Attenuated strain 1 has been completely mutated to any other amino acid with respect to parental strain 03135, either or all of glutamic acid at position 483, lysine at position 568, and asparagine at position 1663 with respect to parent strain 03135,
  • the attenuated serotype 1 dengue virus of the present invention having a mutation of E483K, K568R, or N1663K can be further passaged in Vero cells, and in addition to the mutation, any of positions 482, 484, 2353, and 2364
  • One or more mutations are present and genetically distinguishable from attenuated strain 1.
  • the attenuated serotype 2 dengue virus of the present invention was obtained by substituting the attenuated strain 2 produced by subculturing the parent strain 99345 (SEQ ID NO: 2), which is a clinical isolate, with PDK cells 20 to 35, and further subcultured with Vero cells. Can be obtained. Attenuated strain 2 was completely replaced with the parent strain 99345 with any or all of aspartic acid at position 143, threonine at position 400, aspartic acid at position 1102, leucine at position 1308, and glutamic acid at position 1654. It is mutated to other amino acids, and preferably has mutations of D143N, T400K, D1102N, L1308F, E1654K.
  • the attenuated serotype 2 dengue virus of the present invention has a mutation at position 2347 or 2828 by further passage in Vero cells, and can be genetically distinguished from attenuated strain 2.
  • the attenuated serotype 3 dengue virus of the present invention was produced by subculturing the parent strain 16562 (SEQ ID NO: 3), which is a clinical isolate, for 20 to 30 passages with PGMK cells and further for 2 to 5 passages with PDK cells. Attenuated strain 3 is obtained by further passage with Vero cells. Attenuated strain 3 is completely mutated to another amino acid in any one or all of isoleucine at position 209, serine at position 582, phenylalanine at position 1211, glutamine at position 1563 with respect to parent strain 16562, I209L, S582G, F1211L, Q1563K mutations.
  • the attenuated serotype 3 dengue virus of the present invention has a mutation at any one or more of positions 671, 687, 764 and 1237 by further passage in Vero cells. And genetically distinguishable.
  • the attenuated serotype 4 dengue virus of the present invention is obtained by substituting the attenuated strain 4 produced by subculturing the parent strain 1036 (SEQ ID NO: 4), which is a clinical isolate, with PDK cells 35-45, and further subcultured with Vero cells. Can be obtained.
  • Attenuated strain 4 has leucine at position 2187, phenylalanine / leucine (mixed amino acid) at position 2354, or both completely mutated to other amino acids relative to parent strain 1036, preferably L2187F, F / It has a mutation of L2354S.
  • the attenuated serotype 4 dengue virus of the present invention has no mutation at positions 624, 742, 1628, 2286, 2482, or 2508, and is genetically distinguishable from attenuated strain 4.
  • the present invention also includes a vaccine containing each of the above serotypes of dengue virus as an antigen.
  • a unit price vaccine for each of serotypes 1 to 4 may be used, a combination of any serotypes may be used, and a 4-valent vaccine may be used.
  • the antigen mixing ratio of serotypes 1, 2, 3, and 4 may be arbitrary, but is particularly 1: 1: 1: 1, 5: 3: 5: 3, 5: 3: 3. : 3 is preferred.
  • ⁇ Vaccine dosage form can be selected in a timely manner. It may be a liquid preparation, a powder preparation, or a lyophilized preparation.
  • the parent strain 16562 and the parent strain 1036 are disclosed in Patent Document 1, and are deposited as I-2482 and I-2483 in the French CNCM (Collection Nationale de Cultures de Micro-organismes), respectively.
  • the parent strain 03135 has a partial sequence registered as ADJ18295.1 in GenBank
  • the parent strain 99345 has a partial sequence registered as ADJ18294.1 in GenBank.
  • the attenuated dengue virus of the present invention (serotypes 1 to 4) is deposited in the US ATCC (American Type Culture Collection; 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110 ⁇ USA), deposit numbers PTA-123506, PTA-123505, PTA-123507, Deposited as PTA-123508.
  • the base sequence of dengue virus is analyzed using a next-generation sequencer.
  • the next-generation sequencer is also called a second-generation sequencer.
  • the principle is basically similar to the conventional Sanger method using capillary electrophoresis, and the base sequence is determined by detecting the fluorescence intensity when re-synthesizing one base at a time using a DNA fragment as a template.
  • the Sanger method simultaneously processes 1 to 96 DNA fragments, while the next-generation sequencer forms “clusters” that correspond to capillaries in the Sanger method, so that millions of DNA fragments can be processed.
  • Subsequences of viruses can be studied by base sequence analysis using next-generation sequencers.
  • the main feature is that when there is a mixed base, the mixing ratio can be obtained and the subpopulation can be confirmed.
  • the base sequence is converted into an amino acid sequence, and for example, the 484th site of the attenuated strain is indicated as 30% lysine, 70% arginine, and the like.
  • K482E a site having a mutation in comparison with a parent strain or an attenuated strain
  • K482E means that lysine at position 482 is mutated to glutamic acid.
  • K482E / K means that both mutated glutamic acid and lysine mutated as a result of mutation at position 482 which was lysine.
  • the dengue virus genome encodes structural proteins such as C protein, M protein, and E protein, and seven nonstructural (NS) proteins that do not constitute a virus particle and work during replication. From the dengue virus genome, a single polyprotein is translated and then processed into its respective structural and nonstructural proteins. In the present specification, the starting codon of a polyprotein is used as a starting point for counting positions in an amino acid sequence.
  • RNA is first extracted from dengue virus, and after reverse transcription with a Random primer, double-stranding, adapter sequence addition, and amplification, short-chain sequence aggregate data is obtained with an SBS sequencer.
  • a contig is created from the data of the parent strain by the assembler Velvet to obtain the longest contig homologous to the dengue virus.
  • the sequences on the gene bank having high homology with the contig are aligned, and the sequences at the 5 'end and / or the 3' end are supplemented and used as a reference sequence for resequencing analysis.
  • mapper BWA is used to map sequence data to a reference sequence, and the virus genome sequence is determined taking into account the mixed bases.
  • An amino acid sequence is obtained by adding mixed amino acids from the obtained viral genome sequence. It should be noted that the mixed amino acids include only those amino acids that are present at a mixing ratio of 10% or more.
  • Next-generation sequencer models are known as MiSeq and HiSeq (both manufactured by Illumina), but other models may also be used.
  • the attenuated properties of dengue virus can be confirmed by plaque size assay, growth temperature sensitivity test, animal experiment, etc., but are not limited thereto.
  • plaque size assay for example, rhesus monkey-derived LLC-MK2 cells are used, the diameter of the plaque is measured, and if the diameter is smaller than that of the parent strain, the attenuated characteristics are confirmed.
  • dengue virus growth temperature sensitivity test for example, using Vero cells, the culture temperature is changed, and if the high-temperature growth ability is reduced as compared with the parent strain, the attenuated characteristics are confirmed.
  • NHP Non-Human Primate
  • a typical example of NHP is cynomolgus monkey.
  • Neutralizing antibody titer measurement uses PRNT (PlaqueqReduction Neutralizing Test) method using plaque as an index, or Immunospot PRNT or FRNT (Focus Reduction Neutralization Titer) method for labeling a virus-derived protein with an antibody.
  • PRNT PaqueqReduction Neutralizing Test
  • FRNT Immunospot PRNT or FRNT (Focus Reduction Neutralization Titer) method for labeling a virus-derived protein with an antibody.
  • the measurement of the amount of virus in the blood mainly uses a plaque size assay or an RT-qPCR (Real-Time-Quantitative-Polymerase-Chain Reaction) method that indirectly detects a viral genome fragment, but is not limited thereto.
  • RT-qPCR Real-Time-Quantitative-Polymerase-Chain Reaction
  • Attenuated Dengue virus (serotype 1, serotype 2, serotype 3 and serotype 4) as a new vaccine candidate was created at the Mahidol University in Thailand by the following procedure.
  • a serotype 1 attenuated dengue virus was created by passage 15 in canine primary kidney (PDK) cells using 03135, a clinical isolate, as a parent strain.
  • a serotype 2 attenuated dengue virus was created by subcultured 25 passages in PDK cells using the clinical isolate 99345 as a parent strain.
  • the serotype 3 attenuated dengue virus was produced by using passage 16 in primary green monkey kidney (PGMK) cells and 4 passages in PDK cells, using 16562, a clinical isolate, as a parent strain.
  • a serotype 4 attenuated dengue virus was produced by passage 40 of PDK cells using 1036, a clinical isolate, as a parent strain.
  • Serotype 1 attenuated dengue virus was further passaged 3 times in Vero cells. These attenuated dengue viruses are referred to as attenuated strains 1 to 4, respectively.
  • Preparation of PreVMS In preparation of VMS (Virus Master Seed), first, a preVMS seed was prepared. The preVMS seeds were obtained by passing the attenuated strains 1 to 4 through Vero cells for 2 passages, 3 passages, 3 passages and 2 passages, respectively. A specific method for preparing PreVMS seeds for each serotype will be described below.
  • PreVMS1 Serotype 1 PreVMS seed
  • MOI Multiplicity of Infection
  • FBS Fetal Bovine Serum
  • fetal bovine serum fetal bovine serum
  • the virus obtained by passage 1 of the attenuated strain 1 was inoculated at an MOI of 0.001, and the virus was adsorbed to Vero cells at 37 ° C. and 5% CO 2 for 90 minutes. Thereafter, a serum-free medium was added and cultured at 37 ° C. and 5% CO 2 , and the culture supernatant was recovered after 9 days of culture. After adding FBS as a stabilizer to the culture supernatant to a final concentration of 20%, the pH was adjusted with sodium bicarbonate and temporarily stored frozen. After thawing, 0.2 ⁇ m sterile filtration was performed, and the solution was stored at ⁇ 60 ° C. or lower. As a result of measurement by plaque assay, the infectivity titer of PreVMS1 was 5.1 ⁇ 10 6 PFU / mL.
  • FBS was added as a stabilizer to a final concentration of 20%, pH was adjusted with sodium bicarbonate, 0.2 ⁇ m sterile filtered, and stored at ⁇ 60 ° C. or lower. Result of measurement by plaque assay, infectivity was 2.7 ⁇ 10 5 PFU / mL.
  • the virus obtained by passage 1 of the attenuated strain 2 was inoculated at an MOI of 0.001, and the virus was adsorbed to Vero cells at 37 ° C. and 5% CO 2 for 90 minutes. Thereafter, MEM + 2% medium was added, and the cells were cultured at 37 ° C. and 5% CO 2. After 11 days of culturing, the whole culture vessel was freeze-thawed twice. Then, the cells and cell debris were precipitated by centrifugation (1500 rpm, 5 minutes), and the supernatant was collected.
  • the virus obtained by subculturing the attenuated strain 2 was inoculated at an MOI of 0.001, and the virus was adsorbed to Vero cells at 37 ° C. for 90 minutes. Thereafter, MEM + 2% medium was added, and sealed culture was performed at 37 ° C., and the culture supernatant was recovered after 6 days of culture. Then, the cells and cell debris were precipitated by centrifugation (1500 rpm, 5 minutes), and the supernatant was collected. After 0.2 ⁇ m aseptic filtration, 20% of the supernatant FBS was added as a stabilizer, the pH was adjusted with sodium bicarbonate, and the mixture was stored at ⁇ 60 ° C. or lower. As a result of measurement by plaque assay, the infectivity titer of PreVMS2 was 7.1 ⁇ 10 4 PFU / mL.
  • the virus obtained by subculturing the attenuated strain 3 was inoculated at an MOI of 0.001, and the virus was adsorbed to Vero cells at 37 ° C. and 5% CO 2 for 90 minutes. Thereafter, a serum-free medium was added and cultured at 37 ° C. and 5% CO 2 , and the culture supernatant was recovered after 7 days of culture. Then, the cells and cell debris were precipitated by centrifugation (1500 rpm, 5 minutes), and the supernatant was collected. After 0.2 ⁇ m aseptic filtration, 20% of the supernatant FBS was added as a stabilizer, the pH was adjusted with sodium bicarbonate, and the mixture was stored at ⁇ 60 ° C. or lower. As a result of measurement by plaque assay, the infectious titer was 1.3 ⁇ 10 5 PFU / mL.
  • the virus obtained by subculturing the attenuated strain 3 was inoculated at an MOI of 0.001, and the virus was adsorbed to Vero cells at 37 ° C. and 5% CO 2 for 90 minutes. Thereafter, a serum-free medium was added, the cells were cultured at 37 ° C. and 5% CO 2 , and the culture supernatant was recovered after 7 days of culture. Then, the cells and cell debris were precipitated by centrifugation (1500 rpm, 5 minutes), and the supernatant was collected. After 0.2 ⁇ m sterile filtration, 20% amount of FBS as a stabilizer was added as a stabilizer, the pH was adjusted with sodium bicarbonate, and the mixture was stored at ⁇ 60 ° C. or lower. As a result of measurement by plaque assay, the infectivity titer of PreVMS3 was 3.7 ⁇ 10 5 PFU / mL.
  • the virus obtained by subculturing one attenuated strain 4 was inoculated at an MOI of 0.001, and the virus was adsorbed to Vero cells at 37 ° C. and 5% CO 2 for 90 minutes. Thereafter, a serum-free medium was added and cultured at 37 ° C. and 5% CO 2 , and the culture supernatant was recovered after 5 days of culture. Then, the cells and cell debris were precipitated by centrifugation (2000 rpm, 5 minutes), and the supernatant was collected. After 0.2 ⁇ m sterile filtration, FBS was added as a stabilizer to a final concentration of 20%, the pH was adjusted with sodium bicarbonate, and stored at ⁇ 60 ° C. or lower. As a result of measurement by plaque assay, the infectivity titer of PreVMS4 was 5.5 ⁇ 10 7 PFU / mL.
  • VMS1 PreVMS1 was inoculated at MOI of 0.01, and the virus was adsorbed to Vero cells at 37 ° C. and 5% CO 2 for 90 minutes. Thereafter, a serum-free medium was added, and the cells were cultured at 37 ° C. and 5% CO 2. After 7 days of culture, the whole culture vessel was freeze-thawed twice. Then, the cells and cell debris were precipitated by centrifugation (3000 rpm, 10 minutes), and the supernatant was collected. As a stabilizer, FBS was added to a final concentration of 20%, and sodium bicarbonate was added to a final concentration of 0.2%. After 0.2 ⁇ m aseptic filtration, the solution was stored at ⁇ 60 ° C. or lower. As a result of measurement by plaque assay, the infectious titer of VMS1 was 1.49 ⁇ 10 6 PFU / mL.
  • VMS2 PreVMS2 was inoculated at MOI of 0.001, and the virus was adsorbed to Vero cells at 37 ° C. and 5% CO 2 for 90 minutes. Thereafter, a serum-free medium was added, and the cells were cultured at 37 ° C. and 5% CO 2 , and the culture supernatant was recovered after 8 days of culture. Then, the cells and cell debris were precipitated by centrifugation (1800 rpm, 10 minutes), and the supernatant was collected and 0.2 ⁇ m sterile filtered. As stabilizers, 0.258 times the amount of FBS and 0.0345 times the amount of sodium bicarbonate were added and stored at -60 ° C. or lower. As a result of measurement by plaque assay, the infectious titer of VMS2 was 2.07 ⁇ 10 5 PFU / mL.
  • VMS3 VMS3 PreVMS3 was inoculated at MOI of 0.01, and the virus was adsorbed to Vero cells at 37 ° C. and 5% CO 2 for 90 minutes. Thereafter, a serum-free medium was added and cultured at 37 ° C. and 5% CO 2 , and the culture supernatant was recovered after 6 days of culture. Then, the cells and cell debris were precipitated by centrifugation (3000 rpm, 10 minutes), and the supernatant was collected. As a stabilizer, FBS was added to a final concentration of 20%, and sodium bicarbonate was added to a final concentration of 0.2%. After 0.2 ⁇ m aseptic filtration, the solution was stored at ⁇ 60 ° C. or lower. As a result of measurement by plaque assay, the infectious titer of VMS3 was 6.49 ⁇ 10 4 PFU / mL.
  • VMS4 VMS4 PreVMS4 was inoculated at MOI of 0.01, and the virus was adsorbed to Vero cells at 37 ° C. and 5% CO 2 for 90 minutes. Thereafter, a serum-free medium was added and cultured at 37 ° C. and 5% CO 2 , and the culture supernatant was recovered after 6 days of culture. Then, the cells and cell debris were precipitated by centrifugation (3000 rpm, 10 minutes), and the supernatant was collected. As a stabilizer, FBS was added to a final concentration of 20%, and sodium bicarbonate was added to a final concentration of 0.2%. After 0.2 ⁇ m sterile filtration, the solution was stored at ⁇ 60 ° C. or lower. As a result of measurement by plaque assay, the infectious titer of VMS4 was 9.39 ⁇ 10 6 PFU / mL.
  • Pre-CTM Pre-Clinical Trial Material
  • Pre-CTM1 was produced without producing VWS1. However, after VMS1 was produced by subcultured two times with Vero cells and VWS1 was produced, two subcultures were performed with Vero cells, and Pre-CTM1 was produced. It is also good.
  • RNA is extracted from each serotype of parent strain, attenuated strain, VMS, and Pre-CTM, reverse transcription with Random primer, double-stranding, adapter sequence addition, amplification, and short-chain sequence with Illumina SBS sequencer
  • the set data was obtained. Contigs were created from the data of the parent strain by assembler Velvet, and the longest contig homologous to dengue virus was obtained. The sequences on the gene bank having high homology with the contig were aligned, and the sequences at the 5 ′ end and / or the 3 ′ end were supplemented to serve as a reference sequence for resequencing analysis.
  • mapper BWA was used to map the sequence data to the reference sequence, and the viral genome sequence was determined by taking into account the mixed bases (SEQ ID NOs: 17-20 to parent strains 1 to 4, SEQ ID NOs: 21 to 24 were attenuated) Strains 1 to 4, SEQ ID NOs: 25 to 28 are VMS1 to 4 and SEQ ID NOs: 29 to 32 are the base sequences of Pre-CTM1 to 4). Amino acid sequences were obtained by adding mixed amino acids from the obtained viral genome sequences (SEQ ID NOs: 1 to 4 were parent strains 1 to 4, SEQ ID NOs: 5 to 8 were attenuated strains 1 to 4, and SEQ ID NOs: 9 to 12 were VMS 1 to 4).
  • amino acid sequences of Pre-CTM1 to 4 are shown in SEQ ID NOs: 13 to 16, respectively).
  • the presence or absence of a difference was determined by setting each amino acid ratio at each site as a threshold when the mixing ratios differed by 10% or more.
  • the amino acid notation of the parent strain is A (Alanine only)
  • the amino acid notation of the attenuated strain is A / G (mixed amino acid of alanine and glycine).
  • the mixing ratio of alanine between the parent strain and the attenuated strain is compared, there is a divergence of 10% or more (10%), so the parent strain and the attenuated strain are judged as “difference”.
  • serotype 1 VMS and Pre-CTM are completely mutated from glutamic acid at position 483 to lysine, lysine at position 568 to arginine, and asparagine at position 1663 to lysine.
  • the site was confirmed to have the same mutation as the attenuated strain.
  • lysine at position 482 is a mixed amino acid of glutamic acid / lysine
  • lysine at position 484 is a mixed amino acid of arginine / lysine
  • a mixed amino acid of isoleucine / threonine at position 2353 is threonine
  • alanine at position 2364 is threonine / alanine. It was mutated to a mixed amino acid, and the difference from the attenuated strain was confirmed at these sites.
  • aspartic acid at position 143 is asparagine
  • threonine at position 400 is lysine
  • aspartic acid at position 1102 is asparagine
  • leucine at position 1308 is phenylalanine relative to the parent strain 99345.
  • the glutamic acid at position 1654 was completely mutated to lysine, and it was confirmed that these sites had the same mutation as the attenuated strain.
  • the proline at position 2347 was mutated to a mixed amino acid of proline / leucine
  • the threonine at position 2828 was mutated to a mixed amino acid of threonine / methionine. Differences from the attenuated strain were confirmed at these sites.
  • Serotype 3 VMS and Pre-CTM are completely mutated to isoleucine at position 209 to leucine, serine at position 582 to glycine, phenylalanine at position 1211 to leucine, and glutamine at position 1563 to lysine relative to the parent strain 16562. It was confirmed that these sites had the same mutation as the attenuated strain. Furthermore, the mixed amino acid lysine / arginine at position 671 is mutated to lysine, alanine at position 687 is valine, threonine at position 764 is mutated to isoleucine / threonine, and alanine at position 1237 is mutated to threonine. The difference from the attenuated strain was confirmed in the site.
  • Serotype 4 VMS and Pre-CTM are completely mutated with leucine at position 2187 to phenylalanine and phenylalanine / leucine mixed amino acid at position 2354 relative to parent strain 1036, and the same as the attenuated strain at these sites. It was confirmed to be a mutation. Furthermore, positions 624, 742, 1628, 2286, 2482 and 2508 were not mutated, and the difference from the attenuated strain was confirmed at these sites.
  • VMS growth temperature sensitivity test VMS cells were cultured at 35 ° C and 39 ° C for VMS1, VMS2 and VMS4, and at 35 ° C and 38 ° C for VMS3, respectively, for a certain number of days. The difference in the amount of growth was confirmed. As a result, it was confirmed that all of VMS1, VMS2, VMS3, and VMS4 had higher growth temperature sensitivity and exhibited attenuated characteristics as compared with the parent strains (Table 11).
  • Dengue virus-susceptible experimental animals are limited to NHP (Non-Human Primate) and some genetically engineered immune deficient mice. Therefore, using cynomolgus monkeys, which are NHPs, the efficacy (neutralizing antibody response) and safety (viremia) ) was evaluated.
  • Neutralizing antibody response is one of the main endpoints in vaccine development, and viremia is one of the factors resulting from the pathogenicity and the severity of symptoms in humans.
  • tetravalent dengue virus preparation (5555 preparation) After observing 4 passages of VMS1, VMS2, VMS3 and VMS4 with Vero cells in order to observe a reaction close to that during actual vaccine administration (VMSVP1, VMSVP2, VMSVP3, VMSVP4) A tetravalent dengue virus formulation was prepared. At that time, the dosage of each VMSVP was adjusted to 5 log 10 PFU / mL and 1.0 mL / dose (5555 formulation). This 5555 preparation was administered under anesthesia subcutaneously in the forearm of three cynomolgus monkeys (Group 5555). The time of administration was Day 0, and blood was collected under anesthesia at Day 0, 1, 2, 3, 4, 6, 8, 10, 14, 30, 60.
  • VMSVP1, VMSVP2, VMSVP3, and VMSVP4 were 5 log 10 PFU / dose, 3 log 10 PFU / dose, 5 log 10 PFU / dose, 3 log 10 PFU / 53 preparation ) And a VMSVP1 content of 5log10PFU / dose, VMSVP2, VMSVP3 and VMSVP4 content of 3log10PFU / dose (5333 formulation), and neutralizing antibody response and viremia using 3 cynomolgus monkeys. Evaluation was made (Groups 5353 and 5333, respectively).
  • both the 5353 group and the 5333 group were in the middle after Day 14 except that one of the 5353 group was not seroconverted only on type 4 with Day14.
  • the Japanese antibody was seroconverted, and seroconversion was maintained until Day 60 (Tables 6 to 9).
  • one of the 5353 groups in which no type 4 seroconversion was observed in Day 14 was sympathetic after Day 30 and was maintained until Day 60 (Tables 14 to 17).
  • the 5353 and 5333 formulations show the same efficacy and safety as the 5555 formulation, and there may be no significant effect on the efficacy and safety depending on the difference in the amount of virus mixed by serotype in the formulation. confirmed.
  • the following experiment was conducted for the purpose of evaluating a preparation containing a dengue virus derived from an attenuated dengue virus different from the 5555 preparation, the 5353 preparation and the 5333 preparation.
  • Example 1 Production of attenuated strain 2B and attenuated strain 4B
  • Dengue virus is referred to as attenuated strain 2B.
  • an attenuated dengue virus produced by subculturing 45 passages in PDK cells with the serotype 4 clinical isolate 1036 as a parent strain is referred to as attenuated strain 4B.
  • Attenuated strain 2B and attenuated strain 4B were subcultured with Vero cells to obtain LAVVP2B (Live Attenuated Virous Passed 2B) and LAVVP4B, respectively.
  • VMSVP123LAVVP4 and VMSVP13LAVVP24 Quadrivalent dengue virus preparations (referred to as 5log10PFU / dose each of 5MS10123FVV, and VMSVP1 and LAVV4B).
  • VMSVP13LAVVP24 was prepared, and neutralizing antibody responses and viremia were evaluated using 3 cynomolgus monkeys each (VMSVP123LAVVP4 group, VMSVP13LAVVP24 group, respectively).
  • FRNT 50 Cross neutralizing antibody titers
  • the tetravalent dengue virus preparation (5555 preparation) is expected to maintain the neutralizing antibody titer over a longer period since the drug effect is recognized for at least 2 years and no downward trend is observed. .
  • Example 1 The tetravalent Pre-CTM prepared in Example 1 was mixed to prepare tetravalent dengue vaccine formulations of 5555 Log 10 FFU / dose, 4444 Log 10 FFU / dose, and 3333 Log 10 FFU / dose.
  • the prepared tetravalent dengue vaccine preparation or vehicle was inoculated subcutaneously once in cynomolgus monkeys, and neutralizing antibody induction ability and protection ability against challenge virus (parent strain) were evaluated.
  • each group was further divided equally into 6 groups, and Day 60 was challenged subcutaneously with the unit price parent strain of each serotype.
  • the challenge amount was 5 Log 10 PFU / dose, 5 Log 10 PFU / dose, 6 Log 10 PFU / dose, and 5 Log 10 PFU / dose for each serotype.
  • Monkey neurotoxicity test A monkey neurotoxicity test according to WHO protocol (Technical Report Series No. 978, 2013) was conducted using VMS as a test substance. Twelve cynomolgus monkeys were assigned per group, and each VMS serotype was 5 Log 10 FFU / dose, 5 Log 10 PFU / dose, 5 Log 10 FFU / dose, 5 Log 10 FFU / dose, and Yellow Fever 17D 5 Log 10 PFU / dose as a reference virus. After administration, clinical scoring for 30 days and autopsy was performed only on brain tissue and spinal cord at 30 days. As a result, no problematic clinical and histopathological findings regarding neurotoxicity were observed.
  • Example 1 The 4-valent Pre-CTM prepared in Example 1 was mixed to prepare a 4-valent dengue vaccine formulation of 7777 Log 10 FFU / dose (5 mL) and 5555 Log 10 FFU / dose (0.5 mL).
  • a repeated dose toxicity test was conducted in which a 4-valent dengue vaccine formulation or vehicle was administered subcutaneously three times at 4-week intervals in 6 male and female cynomolgus monkeys. In order to evaluate the toxicity and reversibility of the test substance, half of the cynomolgus monkeys were necropsied 3 days after the final dose and the other half were 28 days after the final dose.
  • Evaluation items include general condition (Clinical signs), behavior / nerve function (general behavior and neurobehavioral function), local reaction (skin reaction), body weight (body weight), food consumption (food consumption), body temperature (body temperature), Ophthalmology, electrocardiography, respiratory rate, urinalysis, hematology, blood biochemistry, necropsy, organ weight (Organ weights), histopathology, and testicular cell count evaluation (quantitative examination of testes).
  • test substance administration showed an increase in the number of leukocytes, neutrophils, lymphocytes, monocytes, basophils, and large non-stained cells in some individuals. It was thought to be a secondary change due to non-toxicological significance. Histopathologically, inflammatory cell infiltration around the blood vessel was observed only at the inoculation site only, but they showed a recovery or recovery tendency within 4 weeks from the third administration.
  • the present invention can be used as a vaccine using dengue virus.

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Abstract

４種すべてのデングウイルス血清型に対する中和抗体応答を単回投与にて誘導し、一定量以上のウイルス血症を生じない安全性の高いデングワクチンを見出した。薬効（中和抗体応答）と安全性（ウイルス血症）の成績が共に優れる４価デングウイルス製剤を提供する。

Description

デングウイルス弱毒株をバンク化した生ウイルス、及びそれらを抗原とするデングワクチン
　本発明は弱毒化デングウイルスを含むデングワクチンに関する。
　デングウイルス感染症は、特定の感染症としては世界三大感染症（エイズ、マラリア、結核）に次いで発症者が多く、世界規模で蔓延している。
　デングウイルスは、フラビウイルス科に属する１本鎖ＲＮＡウイルスであり、抗原性で区別される４種の血清型が存在する。ある種の血清型のデングウイルスに感染すると、獲得免疫により同じ血清型のデングウイルスにはおよそ生涯にわたって再感染することはないとされるものの、一方で異なる血清型のウイルスに対する交差保護は長くても１２週間程度しか続かないため、２回以上のデングウイルス感染が生じうる。特に、死に至ることがある重篤な病態である「デング出血熱」や「デングショック症候群」は、２回目以降の感染時に起こりやすいことが知られている。
　デングウイルス感染症には確立された治療法はなく、予防法も限定的である。その他、感染対策としてはデングウイルスの宿主である蚊の駆除や環境整備、個人レベルの対策として忌避剤の使用や適切な服装についての指導に頼っているのが現状である。しかし、これらは費用面や効果面で十分とはいえず、幅広い年齢層への接種が可能で、且つ優れた有効性を示すワクチンによる感染防止又は発症予防が望まれている。
欧州特許第1159968号 特許第5197362号 特許第5075120号 国際公開特許WO2007/141259 国際公開特許WO2000/057910
Safety and immunogenicity of tetravalent live-attenuated dengue vaccines in Thai adult volunteers: role of serotype concentration, ratio, and multiple doses, Am. J. Trop MedImmune Hyg., 2002; 66(3):264-72. Dengue vaccines: recent developments, ongoing challenges and current candidates, Expert Rev Vaccines., 2013; 12(8):933-53. Efficacy of a tetravalent chimeric dengue vaccine (DENVax) in Cynomolgus macaques., Am J Trop Med Hyg., 2011; 84(6):978-87. Recombinant, live-attenuated tetravalent dengue virus vaccine formulations induce a balanced, broad, and protective neutralizing antibody response against each of the four serotypes in rhesus monkeys., J Virol, 2005; 79(9):5516-28. Evaluation of Interferences between Dengue Vaccine Serotypes in a Monkey Model, Am J Trop Med Hyg., 2009; 80(2):302-11. Protection of Rhesus monkeys against dengue virus challenge after tetravalent live attenuated dengue virus vaccination., J Infect Dis., 2006; 193(12):1658-65.
　上述の通り、初感染とは異なる血清型による２回目以降の感染により症状が重篤化するリスクが高いと考えられていることから、同時に４種すべての血清型のデングウイルスへの防御能を賦与しうる４価ワクチンが望まれている。しかしながら数十年に渡るワクチン開発への取り組みがなされたにもかかわらず、４種すべての血清型に対して優れた有効性を示すワクチンは存在しない。
　デングウイルスゲノムは、Ｃタンパク質、Ｍタンパク質、Ｅタンパク質などの構造タンパク質と、ウイルス粒子を構成せず複製時に働く７つの非構造（ＮＳ）タンパク質をコードしている。よって、他のウイルスや特定の血清型のデングウイルスをバックボーンとする遺伝子組換えキメラ生ワクチン、又は、不活化全粒子ワクチンやサブユニットワクチン、DNAワクチンなどは、デング由来コンポーネントを欠いており、デングウイルスの自然感染により生体内に生じる様々な免疫抗原の内の一部を提示するにすぎない。
　一方で、自然宿主とは異なる細胞にて継代馴化して宿主細胞域変異を獲得した弱毒化生ワクチンは、麻疹、風疹、おたふくかぜ、ポリオ等で実績があるように、自然感染時と同様の免疫応答を誘導しうることから、デングウイルス感染症においても高い有効性を期待しうる。
　現在開発中であることが報告されている又は上市されたデングワクチンは、複数回投与することで４種全ての血清型のデングウイルスに対する中和抗体を誘導させることが可能であるが、４種すべての血清型に対する中和抗体が獲得されるまでに期間を要し、流行地域ではその期間中に自然感染するリスクがあり、単回投与により４種すべての血清型に対する防御免疫を賦与しうるワクチンがより有用性が高いと言える。
　デングウイルスワクチンの調製にあたって、各血清型の株及び用量の混合組成の選定は容易ではない。単価で投与した場合に高い中和抗体を誘導可能であっても、４価混合し投与すると各血清型のデングウイルスに対する中和抗体レベルが均一とならない（干渉作用）問題がある。また、不十分な中和活性（交差反応、結合）抗体による抗体依存性感染増強（ADE；Antibody-Dependent Enhancement）の問題もある。
　既承認薬又は臨床段階にある主要な開発品は、SanofiのChimeriVax-DEN（Dengvaxia（商標名））、TakedaのDENVax（商標名）及びButantanのTetraVax（商標名）の３つであり、いずれも遺伝子組み換えキメラ生ワクチンである。SanofiのDengvaxiaは、黄熱ワクチン株YF-17Dをバックボーンとする遺伝子組換えキメラ生ワクチンであり、メキシコ、ブラジル及びフィリピンの３ヶ国で９歳から４５歳を対象に６箇月間隔３回接種の用法で承認されている。
　DengvaxiaのPhase３試験は、東南アジア５ヶ国において、２歳から１５歳の年齢層の約１万人、及び南米５ヶ国にて９～１６歳の年齢層の約２万人を被験者とし実施された。その結果、有効性は６割程度に留まり、特に血清型２に対する有効性は約４割と低く十分ではなかった。また、デング既存免疫がない被験者に対する有効性は約４割であった。さらに、Phase３試験の長期フォローアップ及びタイにおけるPhase2b試験の長期フォローアップでの結果では、３年目の時点で９歳未満の年齢層での入院リスクが非接種群に対して1.6倍と高くなっており、特に５歳以下では約５倍と高くなっていた。この点がVaccine Enhancementではないかと問題視されている。有効性が低い原因としては、デング由来コンポーネントの不足や流行株の変異などが考察されている。よって、デング由来コンポーネントをすべて含み、かつ、積極的なクローニングを行っておらずウイルスの亜集団（quasispecies）を含む、継代馴化生ワクチンであればより高い効果が期待できる。
　本発明者らは上記課題を解決するために鋭意研究した結果、薬効と安全性の成績が共に優れる弱毒化４価デング生ウイルスワクチンを見出した。また、単回投与であっても、複数回投与であっても、薬効と安全性の成績が優れる弱毒化４価デング生ウイルスワクチンを見出した。
　野生型のデングウイルス（血清型１～４）を、イヌ初代腎（ＰＤＫ；Ｐｒｉｍａｒｙ Ｄｏｇ Ｋｉｄｎｅｙ）細胞やミドリザル初代腎（ＰＧＭＫ；Ｐｒｉｍａｒｙ Ｇｒｅｅｎ Ｍｏｎｋｅｙ Ｋｉｄｎｅｙ）細胞で継代して得た弱毒株が知られている。本発明は、さらに、アフリカミドリザル腎（Ｖｅｒｏ）細胞で継代することによって得られる弱毒化デングウイルス、及び、それらをバンク化した生ウイルスを抗原として含む弱毒化デングウイルスワクチンを提供する。
　したがって、本発明は以下を含む。
[１] 次世代シーケンサーを用いて解析した配列番号１のアミノ酸配列を有する血清型１デングウイルス親株０３１３５との相同性が９５％以上あり、該親株の４８３位、５６８位、１６６３位のいずれかのアミノ酸が完全に変異しており、さらに以下の（１）～（４）のいずれか一つ以上の変異を有する弱毒化血清型１デングウイルス；
　（１）Ｋ４８２Ｅ又はＫ４８２Ｅ／Ｋ
　（２）Ｋ４８４Ｒ又はＫ４８４Ｒ／Ｋ
　（３）Ｉ／Ｔ２３５３Ｔ
　（４）Ａ２３６４Ｔ、又はＡ２３６４Ｔ／Ａ
[２] 配列番号１で示される親株０３１３５のアミノ酸配列との相同性が９７％以上ある、[１]に記載の弱毒化血清型１デングウイルス。
[３] 配列番号１で示される親株０３１３５のアミノ酸配列との相同性が９９％以上ある、[１]に記載の弱毒化血清型１デングウイルス。
[４] ４８３位、５６８位、及び１６６３位のアミノ酸が完全に変異している[１]～[３]に記載の弱毒化血清型１デングウイルス。
[５] ４８３位の変異がＥ４８３Ｋである、[４]に記載の弱毒化血清型１デングウイルス。
[６] ５６８位の変異がＫ５６８Ｒである、[４]に記載の弱毒化血清型１デングウイルス。
[７] １６６３位の変異がＮ１６６３Ｋである、[４]に記載の弱毒化血清型１デングウイルス。
[８] ４８３位の変異がＥ４８３Ｋであり、５６８位の変異がＫ５６８Ｒであり、１６６３位の変異がＮ１６６３Ｋである、[４]に記載の弱毒化血清型１デングウイルス。
[９] 前記（１）～（４）のすべての変異を有する、[１]～[８]のいずれかに記載の弱毒化血清型１デングウイルス。
[１０] 次世代シーケンサーを用いて解析した配列番号２のアミノ酸配列を有する血清型２デングウイルス親株９９３４５との相同性が９５％以上あり、該親株の１４３位、４００位、１１０２位、１３０８位、１６５４位のいずれかのアミノ酸が完全に変異しており、さらに以下の（５）又は（６）の変異を有する弱毒化血清型２デングウイルス；
　（５）Ｐ２３４７Ｌ又はＰ２３４７Ｐ／Ｌ
　（６）Ｔ２８２８Ｍ又はＴ２８２８Ｔ／Ｍ
[１１] 配列番号２で示される親株９９３４５のアミノ酸配列との相同性が９７％以上ある、[１０]に記載の弱毒化血清型２デングウイルス。
[１２] 配列番号３で示される親株９９３４５のアミノ酸配列との相同性が９９％以上ある、[１０]に記載の弱毒化血清型２デングウイルス。
[１３] １４３位、４００位、１１０２位、１３０８位、及び１６５４位のアミノ酸が完全に変異している[１０]～[１２]に記載の弱毒化血清型２デングウイルス。
[１４] １４３位の変異がＤ１４３Ｎである、[１３]に記載の弱毒化血清型２デングウイルス。
[１５] ４００位の変異がＴ４００Ｋである、[１３]に記載の弱毒化血清型２デングウイルス。
[１６] １１０２位の変異がＤ１１０２Ｎである、[１３]に記載の弱毒化血清型２デングウイルス。
[１７] １３０８位の変異がＬ１３０８Ｆである、[１３]に記載の弱毒化血清型２デングウイルス。
[１８] １６５４位の変異がＥ１６５４Ｋである、[１３]に記載の弱毒化血清型２デングウイルス。
[１９] １４３位の変異がＤ１４３Ｎであり、４００位の変異がＴ４００Ｋであり、１１０２位の変異がＤ１１０２Ｎであり、１３０８位の変異がＬ１３０８Ｆであり、１６５４位の変異がＥ１６５４Ｋである、[１３]に記載の弱毒化血清型２デングウイルス。
[２０] 前記（５）及び（６）の変異を有する、[１０]～[１９]のいずれかに記載の弱毒化血清型２デングウイルス。
[２１] 次世代シーケンサーを用いて解析した配列番号３のアミノ酸配列を有する血清型３デングウイルス親株１６５６２との相同性が９５％以上あり、該親株の２０９位、５８２位、１２１１位、１５６３位のいずれかのアミノ酸が完全に変異しており、さらに以下の（７）～（１０）のいずれか一つ以上の変異を有する弱毒化血清型３デングウイルス；
　（７）Ｋ／Ｒ６７１Ｋ
　（８）Ａ６８７Ｖ
　（９）Ｔ７６４Ｉ／Ｔ
　（１０）Ａ１２３７Ｔ
[２２] 配列番号３で示される親株１６５６２のアミノ酸配列との相同性が９７％以上ある、[２１]に記載の弱毒化血清型３デングウイルス。
[２３] 配列番号３で示される親株１６５６２のアミノ酸配列との相同性が９９％以上ある、[２１]に記載の弱毒化血清型３デングウイルス。
[２４] ２０９位、５８２位、１２１１位、１５６３位、及び１６５４位のアミノ酸が完全に変異している[２１]～[２３]に記載の弱毒化血清型３デングウイルス。
[２５] ２０９位の変異がＩ２０９Ｌである、[２４]に記載の弱毒化血清型３デングウイルス。
[２６] ５８２位の変異がＳ５８２Ｇである、[２４]に記載の弱毒化血清型３デングウイルス。
[２７] １２１１位の変異がＦ１２１１Ｌである、[２４]に記載の弱毒化血清型３デングウイルス。
[２８] １５６３位の変異がＱ１５６３Ｋである、[２４]に記載の弱毒化血清型３デングウイルス。
[２９] ２０９位の変異がＩ２０９Ｌであり、５８２位の変異がＳ５８２Ｇであり、１２１１位の変異がＦ１２１１Ｌであり、１５６３位の変異がＱ１５６３Ｋである、[２４]に記載の弱毒化血清型３デングウイルス。
[３０] 前記（７）～（１０）のすべての変異を有する、[２１]～[２９]のいずれかに記載の弱毒化血清型３デングウイルス。
[３１] 次世代シーケンサーを用いて解析した配列番号４のアミノ酸配列を有する血清型４デングウイルス親株１０３６との相同性が９５％以上あり、該親株の２１８７位又は２３５４位のアミノ酸が完全に変異しており、さらに、６２４位、７４２位、１６２８位、２２８６位、２４８２位、又は２５０８位に変異を有さない弱毒化血清型４デングウイルス。
[３２] 配列番号４で示される親株１０３６のアミノ酸配列との相同性が９７％以上ある、[３１]に記載の弱毒化血清型４デングウイルス。
[３３] 配列番号４で示される親株１０３６のアミノ酸配列との相同性が９９％以上ある、[３１]に記載の弱毒化血清型４デングウイルス。
[３４] ２１８７位、及び２３５４位のアミノ酸が完全に変異している[３１]～[３３]に記載の弱毒化血清型４デングウイルス。
[３５] ２１８７位の変異がＬ２１８７Ｆである、[３４]に記載の弱毒化血清型４デングウイルス。
[３６] ２３５４位の変異がＦ／Ｌ２３５４Ｓである、[３４]に記載の弱毒化血清型４デングウイルス。
[３７] ２１８７位の変異がＬ２１８７Ｆであり、２３５４位の変異がＦ／Ｌ２３５４Ｓである、[３４]に記載の弱毒化血清型４デングウイルス。
[３８] ６２４位、７４２位、１６２８位、２２８６位、２４８２位、及び２５０８位に変異を有さない、［３１]～[３７]のいずれかに記載の弱毒化血清型４デングウイルス。
[３９] [１]～[９]のいずれかに記載の弱毒化血清型１デングウイルス、[１０]～[２０] のいずれかに記載の弱毒化血清型２デングウイルス、[２１]～[３０]のいずれかに記載の弱毒化血清型３デングウイルス、及び[３１]～[３８]のいずれかに記載の弱毒化血清型４デングウイルスよりなる群から選ばれる１つ以上の弱毒化デングウイルスを抗原として含む、弱毒化デングウイルスワクチン。
[４０] [１]～[９] のいずれかに記載の弱毒化血清型１デングウイルス、[１０]～[２０]のいずれかに記載の弱毒化血清型２デングウイルス、[２１]～[３０]のいずれかに記載の弱毒化血清型３デングウイルス、及び[３１]～[３８]のいずれかに記載の弱毒化血清型４デングウイルスを抗原として含む、弱毒化４価デングウイルスワクチン。
[４１] 血清型１、２、３及び４のデングウイルス抗原の混合比率が、１：１：１：１、５：３：５：３、又は５：３：３：３である、[３９]又は［４０］に記載の弱毒化デングウイルスワクチン。
[４２] 血清型１、２、３及び４のデングウイルスの各抗原量が、１～７ｌｏｇ１０ＦＦＵ／ｄｏｓｅである、[３９]～［４１］のいずれかに記載の弱毒化デングウイルスワクチン。
[４３]次世代シーケンサーを用いて解析した配列番号１のアミノ酸配列を有する血清型１デングウイルス親株０３１３５をイヌ初代腎（ＰＤＫ）細胞で１５～２５継代して弱毒株とし、前記弱毒株をさらにアフリカミドリザル腎（Ｖｅｒｏ）細胞で継代することを含む、[１]～[９]に記載の弱毒化血清型１デングウイルスの製造方法。
[４４] 次世代シーケンサーを用いて解析した配列番号１のアミノ酸配列を有する血清型１デングウイルス親株０３１３５をＰＤＫ細胞で１５継代して弱毒株とし、前記弱毒株をさらにＶｅｒｏ細胞で継代することを含む、[１]～[９]に記載の弱毒化血清型１デングウイルスの製造方法。
[４５] 次世代シーケンサーを用いて解析した配列番号２のアミノ酸配列を有する血清型２デングウイルス親株９９３４５をＰＤＫ細胞で２０～３５継代して弱毒株とし、前記弱毒株をさらにＶｅｒｏ細胞で継代することを含む、[１０]～[２０]に記載の弱毒化血清型２デングウイルスの製造方法。
[４６] 次世代シーケンサーを用いて解析した配列番号２のアミノ酸配列を有する血清型２デングウイルス親株９９３４５をＰＤＫ細胞で２５継代して弱毒株とし、前記弱毒株をさらにＶｅｒｏ細胞で継代することを含む、[１０]～[２０]に記載の弱毒化血清型２デングウイルスの製造方法。
[４７] 次世代シーケンサーを用いて解析した配列番号３のアミノ酸配列を有する血清型３デングウイルス親株１６５６２をミドリザル初代腎（ＰＧＭＫ）細胞で２０～３０継代、ＰＤＫ細胞で２～５継代して弱毒株とし、前記弱毒株をさらにＶｅｒｏ細胞で継代することを含む、[２１]～[３０]に記載の弱毒化血清型３デングウイルスの製造方法。
[４８] 次世代シーケンサーを用いて解析した配列番号３のアミノ酸配列を有する血清型３デングウイルス親株１６５６２をＰＧＭＫ細胞で３０継代、ＰＤＫ細胞で４継代して弱毒株とし、前記弱毒株をさらにＶｅｒｏ細胞で継代することを含む、[２１]～[３０]に記載の弱毒化血清型３デングウイルスの製造方法。
[４９] 次世代シーケンサーを用いて解析した配列番号４のアミノ酸配列を有する血清型４デングウイルス親株１０３６をＰＤＫ細胞で３５～４５継代して弱毒株とし、前記弱毒株をさらにＶｅｒｏ細胞で継代することを含む、[３１]～[３８]に記載の弱毒化血清型４デングウイルスの製造方法。
[５０] 次世代シーケンサーを用いて解析した配列番号４のアミノ酸配列を有する血清型４デングウイルス親株１０３６をＰＤＫ細胞で４０継代して弱毒株とし、前記弱毒株をさらにＶｅｒｏ細胞で継代することを含む、[３１]～[３８]に記載の弱毒化血清型４デングウイルスの製造方法。
　本発明は、４種すべてのデングウイルス血清型に対する中和抗体応答を単回投与であっても誘導でき、上市されている他の弱毒生ウイルスワクチンと同等レベルの安全性（忍容性）を有するデングワクチンを提供するものである。
図１は、中和抗体価の長期推移（血清型１）を示す。 図２は、中和抗体価の長期推移（血清型２）を示す。 図３は、中和抗体価の長期推移（血清型３）を示す。 図４は、中和抗体価の長期推移（血清型４）を示す。 図５は、中和抗体価の長期推移と接種回数非依存性（血清型１）を示す。 図６は、中和抗体価の長期推移と接種回数非依存性（血清型２）を示す。 図７は、中和抗体価の長期推移と接種回数非依存性（血清型３）を示す。 図８は、中和抗体価の長期推移と接種回数非依存性（血清型４）を示す。 図９は、中和抗体応答の抗原量非依存性（血清型１）を示す。 図１０は、中和抗体応答の抗原量非依存性（血清型２）を示す。 図１１は、中和抗体応答の抗原量非依存性（血清型３）を示す。 図１２は、中和抗体応答の抗原量非依存性（血清型４）を示す。 図１３は、４価デングワクチンの作製フローを示す。
　本発明によれば、４種すべてのデングウイルス血清型に対する中和抗体応答を単回投与であっても誘導することが可能であり、上市されている他の弱毒生ウイルスワクチンと同等レベルの安全性（忍容性）を有するデングワクチンが提供される。
　以下、本発明の好適な実施形態について詳細に説明する。ただし、本発明は以下の実施形態に限定されるものではない。
　本発明は、臨床分離された野生型デングウイルス（親株）をＰＤＫ細胞、又はＰＧＭＫ細胞とＰＤＫ細胞で継代することによって得られた弱毒株を、さらにVero細胞で継代して得られる弱毒化デングウイルスに関するものであり、デングワクチン用として用いられるシード株（VMS（Virus Master Seed）、VWS（Virus Working Seed）等）や製品相当継代株（GLP試験用バルク（Pre-CTM：Pre-Clinical Trial Material）等）、及びそれらを用いて作製されるデングワクチンが含まれる。本発明では、親株、弱毒株、シード株、製品相当継代株のアミノ酸配列を比較検討することにより、親株と弱毒株が識別できる部位及び弱毒株とシード株、製品相当継代株が識別できる部位を特定している。
　本発明の弱毒化血清型１デングウイルスは、臨床分離株である親株０３１３５（配列番号１）を、イヌ初代腎（ＰＤＫ）細胞にて１５～２５継代して作出された弱毒株１を、さらにVero細胞で継代することにより得られる。弱毒株１は継代に伴って、親株０３１３５に対して、４８３位のグルタミン酸、５６８位のリジン、１６６３位のアスパラギンのいずれか又はすべてが完全に他のアミノ酸に変異しており、好ましくは、Ｅ４８３Ｋ、Ｋ５６８Ｒ、Ｎ１６６３Ｋの変異を有する本発明の弱毒化血清型１デングウイルスは、さらにVero細胞で継代することにより、上記変異に加えて、４８２位、４８４位、２３５３位、２３６４位のいずれか一つ以上にも変異を有しており、弱毒株１と遺伝的に識別可能である。
　本発明の弱毒化血清型２デングウイルスは、臨床分離株である親株９９３４５（配列番号２）を、ＰＤＫ細胞にて２０～３５継代して作出された弱毒株２を、さらにVero細胞で継代することにより得られる。弱毒株２は継代に伴って、親株９９３４５に対して、１４３位のアスパラギン酸、４００位のトレオニン、１１０２位のアスパラギン酸、１３０８位のロイシン、１６５４位のグルタミン酸のいずれか又はすべてが完全に他のアミノ酸に変異しており、好ましくは、Ｄ１４３Ｎ、Ｔ４００Ｋ、Ｄ１１０２Ｎ、Ｌ１３０８Ｆ、Ｅ１６５４Ｋの変異を有する。本発明の弱毒化血清型２デングウイルスは、さらにVero細胞で継代することにより、２３４７位又は２８２８位にも変異を有しており、弱毒株２と遺伝的に識別可能である。
　本発明の弱毒化血清型３デングウイルスは、臨床分離株である親株１６５６２（配列番号３）を、ＰＧＭＫ細胞で２０～３０継代し、さらにＰＤＫ細胞にて２～５継代して作出された弱毒株３を、さらにVero細胞で継代することにより得られる。弱毒株３は、親株１６５６２に対して、２０９位のイソロイシン、５８２位のセリン、１２１１位のフェニルアラニン、１５６３位のグルタミンのいずれか又はすべてが完全に他のアミノ酸に変異しており、好ましくは、Ｉ２０９Ｌ、Ｓ５８２Ｇ、Ｆ１２１１Ｌ、Ｑ１５６３Ｋの変異を有する。本発明の弱毒化血清型３デングウイルスは、さらにVero細胞で継代することにより、６７１位、６８７位、７６４位、１２３７位のいずれか一つ以上にも変異を有しており、弱毒株３と遺伝的に識別可能である。
　本発明の弱毒化血清型４デングウイルスは、臨床分離株である親株１０３６（配列番号４）を、ＰＤＫ細胞にて３５～４５継代して作出された弱毒株４を、さらにVero細胞で継代することにより得られる。弱毒株４は、親株１０３６に対して、２１８７位のロイシン、２３５４位のフェニルアラニン／ロイシン（混合アミノ酸）のどちらか又は両方が完全に他のアミノ酸に変異しており、好ましくは、Ｌ２１８７Ｆ、Ｆ／Ｌ２３５４Ｓの変異を有する。本発明の弱毒化血清型４デングウイルスは、６２４位、７４２位、１６２８位、２２８６位、２４８２位、又は２５０８位に変異を有さず、弱毒株４と遺伝的に識別可能である。
　本発明には、上記の各血清型のデングウイルスを抗原として含むワクチンも含まれる。血清型１～４それぞれの単価ワクチンであっても良く、いずれかの血清型の組合せでも良く、４価ワクチンであっても良い。４価ワクチンの場合、血清型１、２、３、及び４の抗原混合比率は任意であってよいが、特に１：１：１：１、５：３：５：３、５：３：３：３が好ましい。本発明のデングウイルスワクチンをプライミングワクチンとし、他のワクチンをブースターとして組み合わせてもよい。また、他のフラビウイルスワクチンと混合しても良く、他の感染症などのワクチンと混合して用いても良い。
　ワクチンの剤型は適時選択し得る。液状製剤であっても良く、粉末製剤であってもよく、凍結乾燥製剤であっても良い。
　親株１６５６２と親株１０３６は、特許文献１に開示されており、また、フランスのCNCM（Collection Nationale de Cultures de Micro-organismes）に、それぞれI-2482、I-2483として寄託されている。また、親株０３１３５はＧｅｎＢａｎｋにＡＤＪ１８２９５.１として部分配列が登録されており、親株９９３４５はＧｅｎＢａｎｋにＡＤＪ１８２９４.１として部分配列が登録されている。本発明の弱毒化デングウイルス（血清型１～４）は、米国のATCC（American Type Culture Collection; 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110 USA）にそれぞれ寄託番号PTA-123506、PTA-123505、PTA-123507、PTA-123508として寄託されている。
　本発明では、デングウイルスの塩基配列を次世代シーケンサーを用いて解析している。次世代シーケンサーとは、第２世代シーケンサーとも呼ばれ、例えばIllumina社のSBSシーケンサーの場合、数百万本以上のDNA断片の塩基配列を同時並行的に決定することができる。原理は、基本的にはキャピラリー電気泳動を用いた従来のサンガー法と類似しており、DNA断片をテンプレートとし１塩基ずつ再合成する時の蛍光強度を検出し塩基配列を決定するものである。サンガー法では１～９６本のDNA断片を同時処理するのに対し、次世代シーケンサーではサンガー法でのキャピラリーに相当する「クラスター」を形成させることで、数百万本以上のDNA断片に対して大量並列処理を行うところに違いがある。これによりシーケンス解析のスピードは飛躍的に向上し、大きなゲノム領域を対象とする研究や高いリード数が要求される低頻度変異の研究や亜集団（quasispecies）の研究ができるようになった。
　次世代シーケンサーを用いた塩基配列解析により、ウイルスの亜集団の研究が可能である。混合塩基がある場合にその混合比を得られ、亜集団を確認できることが大きな特徴である。本明細書では、その塩基配列をアミノ酸配列に変換して表記しており、例えば、弱毒株の第４８４部位はリジンが３０%、アルギニンが７０%などのように示される。
　本明細書では、親株や弱毒株などとの比較において変異がある部位は、Ｋ４８２Ｅ、Ｋ４８２Ｅ／Ｋなどのように記載する。ここで、「Ｋ４８２Ｅ」とは４８２位のリジンがグルタミン酸に変異していることを意味する。「Ｋ４８２Ｅ／Ｋ」とは、リジンであった４８２位に、変異の結果、グルタミン酸に変異したものとリジンに変異したものの両方が混在していることを意味する。
　デングウイルスゲノムはＣタンパク質、Ｍタンパク質、Ｅタンパク質といった構造タンパク質、そしてウイルス粒子を構成せず複製時に働く７つの非構造（ＮＳ）タンパク質をコードしている。デングウイルスゲノムからは、１本のポリタンパク質が翻訳された後、それぞれの構造タンパク質及び非構造タンパク質にプロセシングを受ける。本明細書では、アミノ酸配列中の位置を数える上で、ポリタンパク質の開始コドンを起点としている。
　次世代シーケンサーで測定する際には、まずデングウイルスからＲＮＡを抽出し、Ｒａｎｄｏｍプライマーによる逆転写、二本鎖化、アダプター配列付加、増幅を経て、ＳＢＳシーケンサーで短鎖配列の集合データを得る。親株のデータからアセンブラーＶｅｌｖｅｔによりコンティグを作成し、デングウイルスに相同で最も長いコンティグを得る。当該コンティグと相同性の高い遺伝子バンク上の配列をアライメントし、５’末端及び／又は３’末端の配列を補いリシーケンス解析の参照配列とする。リシーケンス解析では、マッパーＢＷＡを用いてシーケンスデータを参照配列にマッピングし、ウイルスゲノム配列を混合塩基も加味して決定する。得られたウイルスゲノム配列から混合アミノ酸を加味してアミノ酸配列を得る。なお、混合アミノ酸には、混合比として全体の１０%以上存在するアミノ酸のみを含めるものとする。
　次世代シーケンサーの機種は、MiSeqやHiSeq（共にIllumina社製）などが知られているが、その他の機種であっても構わない。
　デングウイルスの弱毒特性は、プラークサイズアッセイや増殖温度感受性試験、動物実験などにより確認することができるが、これに限定されない。プラークサイズアッセイでは、例えばアカゲザル由来のＬＬＣ－ＭＫ２細胞を用い、プラークの直径を測定し、親株と比較して直径が小さければ弱毒特性が確認される。デングウイルスの増殖温度感受性試験では、例えばVero細胞を用い、培養温度を変化させ、親株と比較して高温増殖能が減じていれば弱毒特性が確認される。
　デングウイルスの薬効・安全性試験は、ＮＨＰ（Ｎｏｎ－Ｈｕｍａｎ Ｐｒｉｍａｔｅ）や一部の遺伝子組換え免疫欠損マウスを用いて行われる。ＮＨＰの代表例はカニクイザルである。
　中和抗体価測定は、プラークを指標とするＰＲＮＴ（Ｐｌａｑｕｅ Ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ Ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ Ｔｅｓｔ）法やウイルス由来タンパク質を抗体で標識するＩｍｍｕｎｏｓｐｏｔ ＰＲＮＴ又はＦＲＮＴ（Ｆｏｃｕｓ Ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ Ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ Ｔｉｔｅｒ）法が用いられる。
　血中ウイルス量の測定は、直接的にプラークサイズアッセイを用いるか、間接的にウイルスゲノム断片を検出するＲＴ－ｑＰＣＲ（Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法が主に用いるがこれに限定されない。
　以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に何ら限定されるものではない。
（１）弱毒株の作製
　タイ国マヒドン大学にて、新規のワクチン候補となる弱毒化デングウイルス（血清型１、血清型２、血清型３及び血清型４）が次の手順で作出された。血清型１の弱毒化デングウイルスは、臨床分離株である０３１３５を親株として、イヌ初代腎（ＰＤＫ）細胞にて１５継代することで作出された。血清型２の弱毒化デングウイルスは、臨床分離株である９９３４５を親株として、ＰＤＫ細胞にて２５継代することで作出された。血清型３の弱毒化デングウイルスは、臨床分離株である１６５６２を親株として、初代ミドリザル腎（ＰＧＭＫ）細胞にて３０継代し、さらにＰＤＫ細胞にて４継代することで作出された。血清型４の弱毒化デングウイルスは、臨床分離株である１０３６を親株として、ＰＤＫ細胞にて４０継代することで作出された。なお、血清型１の弱毒化デングウイルスはVero細胞でさらに３継代された。これらの弱毒化デングウイルスを、それぞれ弱毒株１～４と称する。
（２）ＰｒｅＶＭＳの作製
　ＶＭＳ（Ｖｉｒｕｓ Ｍａｓｔｅｒ Ｓｅｅｄ）の作製にあたって、まず、ｐｒｅＶＭＳシードを作製した。ｐｒｅＶＭＳシードは、弱毒株１～４をVero細胞にてそれぞれ２継代、３継代、３継代、２継代することで得た。以下に各血清型のＰｒｅＶＭＳシードの具体的な作製方法について記載する。
（i）血清型１ＰｒｅＶＭＳシード（ＰｒｅＶＭＳ１）
　１継代目は、Multiplicity of Infection（MOI）0.001にて弱毒株１を接種し、３７℃・５％ＣＯ２下で９０分間ウイルスをVero細胞に吸着させた。この後、無血清培地を添加し、３７℃・５%ＣＯ２下で培養し、培養１２日後に培養容器ごと２回凍結融解した。それから、遠心分離（１５００ｒｐｍ・５分間）にて細胞及び細胞残滓を沈殿させ、上清を回収した。安定剤として上清の２０％量のＦＢＳ（Fetal Bovine Serum；ウシ胎児血清）を添加後、重曹によりｐＨを調整し、－６０℃以下で保存した。プラークアッセイで測定した結果、感染価は１.６×１０７ＰＦＵ／ｍＬであった。
 ２継代目は、弱毒株１を１継代したウイルスをMOI0.001にて接種し、３７℃・５％ＣＯ２下で９０分間ウイルスをVero細胞に吸着させた。この後、無血清培地を添加し、３７℃・５%ＣＯ２下で培養し、培養９日後に培養上清を回収した。培養上清に安定剤として２０％終濃度となるようＦＢＳを添加後、重曹によりｐＨを調整し、一時的に凍結保存した。融解後、０.２μｍ無菌ろ過し、－６０℃以下で保存した。プラークアッセイで測定した結果、ＰｒｅＶＭＳ１の感染価は５.１×１０６ＰＦＵ／ｍＬであった。
（ii）血清型２ＰｒｅＶＭＳシード（ＰｒｅＶＭＳ２）
　１継代目は、MOI0.001にて弱毒株２を接種し、３７℃・５％ＣＯ２下で９０分間ウイルスをVero細胞に吸着させた。この後、ＭＥＭ＋２％培地を添加し、３７℃・５%ＣＯ２下で培養し、培養１０日後に培養容器ごと２回凍結融解した。それから、遠心分離（１５００ｒｐｍ・５分間）にて細胞及び細胞残滓を沈殿させ、上清を回収した。安定剤として２０％終濃度となるようＦＢＳを添加後、重曹によりｐＨを調整し、０．２μｍ無菌ろ過し、－６０℃以下で保存した。プラークアッセイで測定した結果、感染価は２．７×１０５ＰＦＵ／ｍＬであった。
　２継代目は、弱毒株２を１継代したウイルスをMOI0.001にて接種し、３７℃・５％ＣＯ２下で９０分間ウイルスをVero細胞に吸着させた。この後、ＭＥＭ＋２％培地を添加し、３７℃・５%ＣＯ２下で培養し、培養１１日後に培養容器ごと２回凍結融解した。それから、遠心分離（１５００ｒｐｍ・５分間）にて細胞及び細胞残滓を沈殿させ、上清を回収した。０.２μｍ無菌ろ過後、安定剤として上清の２０％量のＦＢＳを添加し、重曹によりｐＨを調整した後、－６０℃以下で保存した。プラークアッセイで測定した結果、感染価は１.１×１０４ＰＦＵ／ｍＬであった。
 ３継代目は、弱毒株２を２継代したウイルスをMOI0.001にて接種し、３７℃で９０分間ウイルスをVero細胞に吸着させた。この後、ＭＥＭ＋２％培地を添加し、３７℃で密栓培養し、培養６日後に培養上清を回収した。それから、遠心分離（１５００ｒｐｍ・５分間）にて細胞及び細胞残滓を沈殿させ、上清を回収した。０.２μｍ無菌ろ過後、安定剤として上清の２０％量のＦＢＳを添加し、重曹によりｐＨを調整した後、－６０℃以下で保存した。プラークアッセイで測定した結果、ＰｒｅＶＭＳ２の感染価は７.１×１０４ＰＦＵ／ｍＬであった。
（iii）血清型３ＰｒｅＶＭＳシード（ＰｒｅＶＭＳ３）
　１継代目は、MOI0.001にて弱毒株３を接種し、３７℃・５％ＣＯ２下で９０分間ウイルスをVero細胞に吸着させた。この後、無血清培地を添加し、３７℃・５%ＣＯ２下で培養し、培養１０日後に培養上清を回収した。０.２μｍ無菌ろ過後、安定剤として培養上清の２０％量のＦＢＳを添加し、重曹によりｐＨを調整した後、－６０℃以下で保存した。プラークアッセイで測定した結果、感染価は９.８×１０４ＰＦＵ／ｍＬであった。
　２継代目は、弱毒株３を1継代したウイルスをMOI0.001にて接種し、３７℃・５％ＣＯ２下で９０分間ウイルスをVero細胞に吸着させた。この後、無血清培地を添加し、３７℃・５%ＣＯ２下で培養し、培養７日後に培養上清を回収した。それから、遠心分離（１５００ｒｐｍ・５分間）にて細胞及び細胞残滓を沈殿させ、上清を回収した。０.２μｍ無菌ろ過後、安定剤として上清の２０％量のＦＢＳを添加し、重曹によりｐＨを調整した後、－６０℃以下で保存した。プラークアッセイで測定した結果、感染価は１.３×１０５ＰＦＵ／ｍＬであった。
　３継代目は、弱毒株３を２継代したウイルスをMOI0.001にて接種し、３７℃・５％ＣＯ２下で９０分間ウイルスをVero細胞に吸着させた。この後、無血清培地を添加し、３７℃・５％ＣＯ２下で培養し、培養７日後に培養上清を回収した。それから、遠心分離（１５００ｒｐｍ・５分間）にて細胞及び細胞残滓を沈殿させ、上清を回収した。０.２μｍ無菌ろ過後、安定剤として上清の２０％量のＦＢＳを添加後、重曹によりｐＨを調整し、－６０℃以下で保存した。プラークアッセイで測定した結果、ＰｒｅＶＭＳ３の感染価は３.７×１０５ＰＦＵ／ｍＬであった。
（iv）血清型４ＰｒｅＶＭＳシード（ＰｒｅＶＭＳ４）
　１継代目は、MOI0.001にて弱毒株４を接種し、３７℃・５％ＣＯ２下で９０分間ウイルスをVero細胞に吸着させた。この後、無血清培地を添加し、３７℃・５%ＣＯ２下で培養し、培養７日後に培養上清を回収した。それから、遠心分離（１５００ｒｐｍ・５分間）にて細胞及び細胞残滓を沈殿させ、上清を回収した。０.２μｍ無菌ろ過後、安定剤として２０％終濃度となるようにＦＢＳを添加し、重曹によりｐＨを調整した後、－６０℃以下で保存した。プラークアッセイで測定した結果、感染価は１.９×１０７ＰＦＵ／ｍＬであった。
 ２継代目は、弱毒株４を１継代したウイルスをMOI0.001にて接種し、３７℃・５％ＣＯ２下で９０分間ウイルスをVero細胞に吸着させた。この後、無血清培地を添加し、３７℃・５％ＣＯ２下で培養し、培養５日後に培養上清を回収した。それから、遠心分離（２０００ｒｐｍ・５分間）にて細胞及び細胞残滓を沈殿させ、上清を回収した。０.２μｍ無菌ろ過後、安定剤として２０％終濃度となるようにＦＢＳを添加後、重曹によりｐＨを調整し、－６０℃以下で保存した。プラークアッセイで測定した結果、ＰｒｅＶＭＳ４の感染価は５.５×１０７ＰＦＵ／ｍＬであった。
（３）ＶＭＳの作製
　ＰｒｅＶＭＳをさらに１継代し、ウイルスバンクの最上流となるＶＭＳ１、ＶＭＳ２、ＶＭＳ３及びＶＭＳ４を作製した。以下に各血清型のＶＭＳの具体的な作製方法について記載する。
（i）ＶＭＳ１
　MOI0.01にてＰｒｅＶＭＳ１を接種し、３７℃・５％ＣＯ２下で９０分間ウイルスをVero細胞に吸着させた。この後、無血清培地を添加し、３７℃・５%ＣＯ２下で培養し、培養７日後に培養容器ごと２回凍結融解した。それから、遠心分離（３０００ｒｐｍ・１０分間）にて細胞及び細胞残滓を沈殿させ、上清を回収した。安定剤として２０％終濃度となるようにＦＢＳを添加及び０．２％終濃度となるように重曹を添加し、０.２μｍ無菌ろ過後、－６０℃以下で保存した。プラークアッセイで測定した結果、ＶＭＳ１の感染価は１.４９×１０６ＰＦＵ／ｍＬであった。
（ii）ＶＭＳ２
　MOI0.001にてＰｒｅＶＭＳ２を接種し、３７℃・５％ＣＯ２下で９０分間ウイルスをVero細胞に吸着させた。この後、無血清培地を添加し、３７℃・５%ＣＯ２下で培養し、培養８日後に培養上清を回収した。それから、遠心分離（１８００ｒｐｍ・１０分間）にて細胞及び細胞残滓を沈殿させ、上清を回収し、０．２μｍ無菌ろ過した。安定剤として上清の０．２５８倍量のＦＢＳ及び０.０３４４５倍量の重曹を添加し、－６０℃以下で保存した。プラークアッセイで測定した結果、ＶＭＳ２の感染価は２.０７×１０５ＰＦＵ／ｍＬであった。
（iii）ＶＭＳ３
　MOI0.01にてＰｒｅＶＭＳ３を接種し、３７℃・５％ＣＯ２下で９０分間ウイルスをVero細胞に吸着させた。この後、無血清培地を添加し、３７℃・５%ＣＯ２下で培養し、培養６日後に培養上清を回収した。それから、遠心分離（３０００ｒｐｍ・１０分間）にて細胞及び細胞残滓を沈殿させ、上清を回収した。安定剤として２０％終濃度となるようにＦＢＳを添加及び０．２％終濃度となるように重曹を添加し、０.２μｍ無菌ろ過後、－６０℃以下で保存した。プラークアッセイで測定した結果、ＶＭＳ３の感染価は６.４９×１０４ＰＦＵ／ｍＬであった。
（iv）ＶＭＳ４
　MOI0.01にてＰｒｅＶＭＳ４を接種し、３７℃・５％ＣＯ２下で９０分間ウイルスをVero細胞に吸着させた。この後、無血清培地を添加し、３７℃・５%ＣＯ２下で培養し、培養６日後に培養上清を回収した。それから、遠心分離（３０００ｒｐｍ・１０分間）にて細胞及び細胞残滓を沈殿させ、上清を回収した。安定剤として２０％終濃度となるようにＦＢＳを添加及び０.２％終濃度となるように重曹を添加し、０.２μｍ無菌ろ過後、－６０℃以下で保存した。プラークアッセイで測定した結果、ＶＭＳ４の感染価は９.３９×１０６ＰＦＵ／ｍＬであった。
（４）Ｐｒｅ－ＣＴＭの作製
続いて、ＧＬＰ試験用バルク（以下、「Ｐｒｅ－ＣＴＭ」；Pre-Clinical Trial Material）を作製した。血清型１は、ＶＭＳ１をＶｅｒｏ細胞で４継代することで、Ｐｒｅ－ＣＴＭ１を得た。血清型２～４は、ＶＭＳ２～４をそれぞれＶｅｒｏ細胞で２継代し、Ｖｉｒｕｓ Ｗｏｒｋｉｎｇ Ｓｅｅｄ（ＶＷＳ）を作製した。さらにＶＷＳ２～４をそれぞれＶｅｒｏ細胞で２継代（ＶＭＳから数えて合計４継代）し、Ｐｒｅ－ＣＴＭ２～４を得た。ＶＭＳから３継代目までは、培養上清を遠心分離後、その上清に安定剤として２０％終濃度となるようにＦＢＳを添加し、０.２％終濃度となるように重曹を添加した。０.２μｍ無菌ろ過後、－６０℃以下で保存した。最終継代となる４継代時は、培養上清に０.２％終濃度となるように重曹を添加し、清澄ろ過及び０.２μｍ無菌ろ過の後、中空糸膜を用いて濃縮した。濃縮液を０.２μｍ無菌ろ過した後、－６０℃以下で保存した。なお、本実施例ではＶＷＳ１を作製せずにＰｒｅ－ＣＴＭ１を作製しているが、ＶＭＳ１をＶｅｒｏ細胞で２継代してＶＷＳ１を作製した後、さらにＶｅｒｏ細胞で２継代してＰｒｅ－ＣＴＭ１としても良い。
（５）配列決定
　ウイルスゲノム配列を下記の方法で調べた。各血清型の親株、弱毒株、ＶＭＳ、Ｐｒｅ－ＣＴＭのそれぞれからＲＮＡを抽出し、Ｒａｎｄｏｍプライマーによる逆転写、二本鎖化、アダプター配列付加、増幅を経て、Ｉｌｌｕｍｉｎａ社のＳＢＳシーケンサーで短鎖配列の集合データを得た。親株のデータからアセンブラーＶｅｌｖｅｔによりコンティグを作成し、デングウイルスに相同で最も長いコンティグを得た。当該コンティグと相同性の高い遺伝子バンク上の配列をアライメントし、５’末端及び／又は３’末端の配列を補いリシーケンス解析の参照配列とした。リシーケンス解析では、マッパーＢＷＡを用いてシーケンスデータを参照配列にマッピングし、ウイルスゲノム配列を混合塩基も加味して決定した（配列番号１７～２０に親株１～４、配列番号２１～２４に弱毒株１～４、配列番号２５～２８にＶＭＳ１～４、配列番号２９～３２にＰｒｅ－ＣＴＭ１～４の塩基配列をそれぞれ示す）。得たウイルスゲノム配列から混合アミノ酸を加味してアミノ酸配列を得た（配列番号１～４に親株１～４、配列番号５～８に弱毒株１～４、配列番号９～１２にＶＭＳ１～４、配列番号１３～１６にＰｒｅ－ＣＴＭ１～４のアミノ酸配列をそれぞれ示す）。なお、混合アミノ酸を表記する場合には、混合比として全体の１０%以上存在するアミノ酸のみを表記した。また、アミノ酸配列を比較する際は、各部位の各アミノ酸を比較する時にその各混合比が１０%以上乖離していることを閾値とし、差異の有無を判定した。例えば、親株の５０位が「アラニン９５%、グリシン５%」、弱毒株の５０位は「アラニン８５%、グリシン１４%、プロリン１%」という解析結果を得た場合、親株のアミノ酸表記はＡ（アラニンのみ）、弱毒株のアミノ酸表記はＡ／Ｇ（アラニンとグリシンの混合アミノ酸）となる。この部位において、親株と弱毒株のアラニンの混合比を比較すると１０%以上（１０%）の乖離があるため、親株と弱毒株で「差異あり」の判定となる。グリシンについては９%の差異しか認められないが、最低１種類のアミノ酸で差異が認められれば「差異あり」の判定としている。一方、親株の１００位が「アラニン９４%、グリシン６%」、弱毒株の１００位は「アラニン８５%、グリシン１５%」という場合にも、親株のアミノ酸表記はＡ、弱毒株のアミノ酸表記はＡ／Ｇとなる。しかし、この部位のアラニンとグリシンの混合比をそれぞれ比較すると、共に１０%未満（９%）であるため、「差異なし」の判定となる。
（６）アミノ酸配列比較
　親株と弱毒株の配列を比較し、アミノ酸の完全変異が生じている部位を確認した（表１～４）。なお、混合アミノ酸が存在する親株の部位については、弱毒株の同部位において当該親株の混合アミノ酸に含まれない他のアミノ酸に変異している場合に完全変異しているものとみなした。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　次に、弱毒株、ＶＭＳ、Ｐｒｅ－ＣＴＭの配列を比較し、弱毒株に対してＶＭＳ及びＰｒｅ－ＣＴＭを識別できる部位を確認した（表５～８）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
　これにより、血清型１のＶＭＳ及びＰｒｅ－ＣＴＭは、親株０３１３５に対して４８３位のグルタミン酸がリジンに、５６８位のリジンがアルギニンに、１６６３位のアスパラギンがリジンに完全変異しており、これらの部位において弱毒株と同じ変異であることが確認された。さらに、４８２位のリジンがグルタミン酸／リジンの混合アミノ酸に、４８４位のリジンがアルギニン／リジンの混合アミノ酸に、２３５３位のイソロイシン／トレオニンの混合アミノ酸がトレオニンに、２３６４位のアラニンがトレオニン／アラニンの混合アミノ酸に変異しており、これらの部位において弱毒株との違いが確認された。
　血清型２のＶＭＳ及びＰｒｅ－ＣＴＭは、親株９９３４５に対して１４３位のアスパラギン酸がアスパラギンに、４００位のトレオニンがリジンに、１１０２位のアスパラギン酸がアスパラギンに、１３０８位のロイシンがフェニルアラニンに、１６５４位のグルタミン酸がリジンに完全変異しており、これらの部位において弱毒株と同じ変異であることが確認された。さらに２３４７位のプロリンがプロリン／ロイシンの混合アミノ酸に、２８２８位のトレオニンが、トレオニン／メチオニンの混合アミノ酸に変異しており、これらの部位において弱毒株との違いが確認された。
　血清型３のＶＭＳ及びＰｒｅ－ＣＴＭは、親株１６５６２に対して２０９位のイソロイシンがロイシンに、５８２位のセリンがグリシンに、１２１１位のフェニルアラニンがロイシンに、１５６３位のグルタミンがリジンに完全変異しており、これらの部位において弱毒株と同じ変異であることが確認された。さらに、６７１位のリジン／アルギニンの混合アミノ酸がリジンに、６８７位のアラニンがバリンに、７６４位のトレオニンがイソロイシン／トレオニンの混合アミノ酸に、１２３７位のアラニンがトレオニンに変異しており、これらの部位において弱毒株との違いが確認された。
　血清型４のＶＭＳ及びＰｒｅ－ＣＴＭは、親株１０３６に対して２１８７位のロイシンがフェニルアラニンに、２３５４位のフェニルアラニン／ロイシンの混合アミノ酸がセリンに完全変異しており、これらの部位において弱毒株と同じ変異であることが確認された。さらに６２４位、７４２位、１６２８位、２２８６位、２４８２位、２５０８位が変異しておらず、これらの部位において弱毒株との違いが確認された。
（７）ＶＭＳの試験管内弱毒特性
　ＶＭＳの試験管内弱毒特性を確認するために、ＬＬＣ－ＭＫ２細胞を用いたプラークサイズアッセイを行った。プラークの直径を測定し、測定結果により表９のように区分した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
　その結果、ＶＭＳ１、ＶＭＳ２、ＶＭＳ３及びＶＭＳ４のプラークサイズの分布は、それぞれの親株に対して小さく、弱毒特性を示すことを確認した（表１０）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
（８）ＶＭＳの増殖温度感受性試験
　ＶＭＳ１、ＶＭＳ２及びＶＭＳ４については３５℃及び３９℃、ＶＭＳ３については３５℃及び３８℃で、それぞれ一定日数の間Vero細胞で培養し、低温培養時と高温培養時での増殖量の差を確認した。その結果、それぞれの親株と比較して、ＶＭＳ１、ＶＭＳ２、ＶＭＳ３及びＶＭＳ４すべてにおいて増殖温度感受性が高く、弱毒特性を示すことを確認した（表１１）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
１．カニクイザルを用いた４価デングウイルス製剤の薬効・安全性評価試験１
　デングウイルス感受性実験動物は、ＮＨＰ（Ｎｏｎ－Ｈｕｍａｎ Ｐｒｉｍａｔｅ）や一部の遺伝子組換え免疫欠損マウスに限られるため、ＮＨＰであるカニクイザルを用いて、薬効（中和抗体応答）及び安全性（ウイルス血症）の評価を実施した。なお、中和抗体応答はワクチン開発上の主要評価項目の一つであり、ウイルス血症はヒトでの病原性及び症状の重篤化に起因する要素の一つである。
（１）４価デングウイルス製剤（５５５５製剤）の調製
　実際のワクチン投与時に近い反応を観察するため、ＶＭＳ１、ＶＭＳ２、ＶＭＳ３及びＶＭＳ４をVero細胞で４継代した後（ＶＭＳＶＰ１、ＶＭＳＶＰ２、ＶＭＳＶＰ３、ＶＭＳＶＰ４）、４価デングウイルス製剤を調製した。その際、各ＶＭＳＶＰの投与量が、５ｌｏｇ１０ＰＦＵ／ｍＬ、１.０ｍＬ／ｄｏｓｅとなるように調製した（５５５５製剤）。この５５５５製剤を３頭のカニクイザルの前腕部皮下に麻酔下で投与した（５５５５群）。投与時をＤａｙ０とし、Ｄａｙ０、１、２、３、４、６、８、１０、１４、３０、６０に麻酔下で採血を実施した。
（２）Ｉｍｍｕｎｏｓｐｏｔ ＰＲＮＴ法による中和抗体価測定
 　Ｉｍｍｕｎｏｓｐｏｔ ＰＲＮＴ（Ｐｌａｑｕｅ Ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ Ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ Ｔｅｓｔ）法により、Ｄａｙ０、１４、３０、６０の採血で得た血清中の中和抗体価を測定した。その結果、全３個体、４種すべての血清型についてＤａｙ１４以降で中和抗体が陽転しており、少なくともＤａｙ６０までの間は陽性を維持していた（陽転基準は１０ＰＲＮＴ５０以上；表１２及び表１３）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
（３）ＲＴ－ｑＰＣＲ法による血中ゲノム量測定
　ＲＴ－ｑＰＣＲ（Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法により、Ｄａｙ１、２、３、４、６、８、１０、１４に採取した血清中のウイルスゲノム量を測定したところ、全３個体について全て定量限界未満であった（定量限界：１型は５００、２型、３型及び４型は１０００；単位はｇｅｎｏｍｅ ｃｏｐｙ／ｍＬ ｓｅｒｕｍ）。
　上記結果より、良好な薬効及び安全性が確認された。
１．カニクイザルを用いた４価デングウイルス製剤の薬効・安全性評価試験２
　血清型別に異なる配合量（混合用量）を調製した４価デングウイルス製剤の薬効・安全性への影響を確認する目的で、以下の実験を行った。
（１）４価デングウイルス製剤（５３５３製剤、５３３３製剤）の調製
　ＶＭＳＶＰ１及びＶＭＳＶＰ２、ＶＭＳＶＰ３、ＶＭＳＶＰ４のそれぞれの含有量を５ｌｏｇ１０ＰＦＵ／ｄｏｓｅ、３ｌｏｇ１０ＰＦＵ／ｄｏｓｅ、５ｌｏｇ１０ＰＦＵ／ｄｏｓｅ、３ｌｏｇ１０ＰＦＵ／ｄｏｓｅとした製剤（５３５３製剤）と、ＶＭＳＶＰ１の含有量を５ｌｏｇ１０ＰＦＵ／ｄｏｓｅ、ＶＭＳＶＰ２、ＶＭＳＶＰ３及びＶＭＳＶＰ４の含有量を３ｌｏｇ１０ＰＦＵ／ｄｏｓｅとした製剤（５３３３製剤）を調製し、カニクイザル３頭を用いて中和抗体応答及びウイルス血症を評価した（それぞれ５３５３群、５３３３群）。
（２）Immunospot ＰＲＮＴ法による中和抗体価測定
　中和抗体応答について、５３５３群の一頭が４型に対してのみＤａｙ１４では陽転していなかったことを除き、５３５３群及び５３３３群共にＤａｙ１４以後で中和抗体が陽転しており、Ｄａｙ６０までの間、陽転が維持されていた（表６～表９）。また、Ｄａｙ１４に４型の陽転が認められなかった５３５３群の一頭についても、Ｄａｙ３０以後は陽転しており、その後Ｄａｙ６０まで陽転が維持されていた（表１４～１７）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000014
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000015
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000016
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000017
（３）ＲＴ－ｑＰＣＲ法による血中ゲノム量測定
　Ｄａｙ４にて５３３３群の一頭のみから、血清型１及び血清型４についてわずかに定量限界を上回るウイルスゲノムが検出された（それぞれ１６３２、２８０８ｇｅｎｏｍｅ／ｍＬ）が、５３３３群及び５３５３群の他の個体については定量限界未満であった。また、Ｄａｙ４にてウイルスゲノムが検出された一頭についても、血清型１の親株及び血清型４の親株をそれぞれ等量単価接種した場合の個体別ピークウイルス量の幾何平均（それぞれ７５００１（２１８６４～５９２６５０）、９８５３（３００６～３２３１５）ｇｅｎｏｍｅ／ｍＬ、Ｎ＝３）に比して、低い値であった。
　上記結果より、５３５３製剤及び５３３３製剤は、５５５５製剤と同等の薬効・安全性が示され、製剤中における血清型別のウイルス配合量の違いによっては、薬効・安全性に大きな影響はないことが確認された。
　５５５５製剤、５３５３製剤及び５３３３製剤とは異なる弱毒化デングウイルス由来のデングウイルスを含む製剤についても評価する目的で以下の実験を行った。
（１）弱毒株２Ｂ及び弱毒株４Ｂの作製
　上述の実施例１（１）弱毒株の作製において、血清型２の臨床分離株９９３４５を親株として、ＰＤＫ細胞で３５継代して作出した弱毒化デングウイルスを弱毒株２Ｂと称する。また、血清型４の臨床分離株１０３６を親株として、ＰＤＫ細胞にて４５継代して作出した弱毒化デングウイルスを弱毒株４Ｂと称する。
（２）ＬＡＶＶＰ２Ｂ及びＬＡＶＶＰ４Ｂの作製
　弱毒株２Ｂ及び弱毒株４ＢをVero細胞で継代し、それぞれＬＡＶＶＰ２Ｂ（Ｌｉｖｅ Ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ Ｖｅｒｏ Ｐａｓｓａｇｅｄ ２Ｂ）及びＬＡＶＶＰ４Ｂを得た。
（３）ＶＭＳＶＰ１２３ＬＡＶＶＰ４及びＶＭＳＶＰ１３ＬＡＶＶＰ２４の調製
　ＶＭＳＶＰ１、ＶＭＳＶＰ２、ＶＭＳＶＰ３及びＬＡＶＶＰ４Ｂによる４価デングウイルス製剤（各５ｌｏｇ１０ＰＦＵ／ｄｏｓｅ；「ＶＭＳＶＰ１２３ＬＡＶＶＰ４」と呼称）及びＶＭＳＶＰ１、ＬＡＶＶＰ２Ｂ、ＶＭＳＶＰ３及びＬＡＶＶＰ４Ｂによる４価デングウイルス製剤（各５ｌｏｇ１０ＰＦＵ／ｄｏｓｅ；「ＶＭＳＶＰ１３ＬＡＶＶＰ２４」と呼称）を調製し、カニクイザル各３頭を用いて中和抗体応答及びウイルス血症を評価した（それぞれＶＭＳＶＰ１２３ＬＡＶＶＰ４群、ＶＭＳＶＰ１３ＬＡＶＶＰ２４群）。
（４）ＰＲＮＴ法による中和抗体価測定
　ＰＲＮＴ法により、ＶＭＳＶＰ１２３ＬＡＶＶＰ４群及びＶＭＳＶＰ１３ＬＡＶＶＰ２４群の中和抗体価を測定した。その結果、両製剤とも５５５５製剤と同等の中和抗体応答を誘導した（表１８及び表１９）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000018
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000019
（５）ＲＴ－ｑＰＣＲ法による血中ゲノム量測定
　ウイルス血症については、ＶＭＳＶＰ１２３ＬＡＶＶＰ４群から比較的高い量の４型のウイルスゲノムがＤａｙ１にて検出（１００６６ｇｅｎｏｍｅ／ｍＬ、ＧＭＴ、Ｎ＝３）されており、ＶＭＳＶＰ１３ＬＡＶＶＰ２４群から比較的高い量の４型のウイルスゲノムと、定量限界をわずかながら上回る量の１型及び２型のウイルスゲノムがＤａｙ１にて検出（それぞれ１２３４０、５４７、１３３７ｇｅｎｏｍｅ／ｍＬ、ＧＭＴ、Ｎ＝３）された。これらのことから、ＶＭＳＶＰはＬＡＶＶＰに比して高度に弱毒化されていることが示唆された。
　興味深いことに、ＶＭＳＶＰ１３ＬＡＶＶＰ２４群の２頭より、Ｄａｙ１にて血清型１のウイルスゲノムがわずかながらも検出されており、ＶＭＳＶＰによる４価デングウイルス製剤の組み合わせの素性の良さを示唆していると考えられた。
（１）４価デングウイルス製剤（５５５５製剤）の中和抗体価長期観察試験
　良好な薬効・安全性を示したＶＭＳＶＰ１、ＶＭＳＶＰ２、ＶＭＳＶＰ３及びＶＭＳＶＰ４を用いて調製した４価デングウイルス製剤（５５５５製剤）について、中和抗体価の長期評価を行う目的で、全６頭のカニクイザル（ＩＤ Ｎｏ.１～６）に５５５５製剤を単回接種し、接種月をＭｏｎｔｈ０とし、Ｍｏｎｔｈ１、２、３、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２３、２５と、２年以上に渡り中和抗体価（Ｆｏｃｕｓ Ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ Ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ Ｔｉｔｅｒ５０；以下「ＦＲＮＴ５０」）を測定した。
　その結果、Ｍｏｎｔｈ１より全ての個体で中和抗体の陽転（ＦＲＮＴ５０＞１０）が認められた。また、中和抗体価の幾何平均値は１～４型いずれに対しても１００以上であった。中和抗体価はその後２年以上に渡り同程度に維持されており、下降のトレンドは認められなかった（図１～図４）。
　このことから、４価デングウイルス製剤（５５５５製剤）は、少なくとも２年以上は薬効が認められ、また下降のトレンドが認められないことから、より長期にわたって中和抗体価が維持されると期待される。
（２）接種回数及び接種間隔の検討
　４価デングウイルス製剤（５５５５製剤）の接種回数と接種間隔の評価を行う目的で、１箇月間隔２回接種、６箇月間隔２回接種のスケジュールで、カニクイザル６頭に本製剤を接種した。
　その結果、１箇月間隔２回接種、６箇月間隔２回接種のいずれの場合でも、中和抗体価は単回接種の場合とほぼ同程度に上昇し、また、２回接種以降で中和抗体価に大きな変化は認められなかった。したがって、本デングウイルス弱毒株を含むワクチンは１回の接種により中和抗体応答を十分に誘導し得ることが示唆された。（図５～図８；図５～図８は、各５ｌｏｇ１０ＰＦＵ／ｄｏｓｅの４価デングウイルス製剤を、カニクイザルに単回接種（Ｎ＝６）、１箇月間隔２回接種（Ｎ＝６）及び６箇月間隔２回接種（Ｎ＝６）したときの中和抗体価の幾何平均値を示した。垂直バーは±ＳＤを示す。）
（３）投与用量試験
　さらに異なる用量での反応性を確認する目的で、各５ｌｏｇ１０、各３ｌｏｇ１０、各２ｌｏｇ１０及び各１ｌｏｇ１０ＦＦＵ／ｄｏｓｅの４価デングウイルス製剤を調製し、カニクイザルに単回接種した。接種週をＷｅｅｋ０とし、Ｗｅｅｋ２及びＷｅｅｋ５の中和抗体価を測定した。
　その結果、Ｗｅｅｋ２において全個体の中和抗体が陽転し、またＷｅｅｋ５においても陽性が維持されていた。したがって、各１ｌｏｇ１０ＦＦＵ／ｄｏｓｅという低抗原量からの中和抗体応答が確認できた。（図９～図１２；図９～図１２は、各５ｌｏｇ１０ＦＦＵ／ｄｏｓｅ（Ｎ＝１）、各３ｌｏｇ１０ＦＦＵ／ｄｏｓｅ（Ｎ＝３）、各２ｌｏｇ１０ＦＦＵ／ｄｏｓｅ（Ｎ＝３）、各１ｌｏｇ１０ＦＦＵ／ｄｏｓｅ（Ｎ＝３）の４価デングウイルス製剤を、カニクイザルに単回接種したときのＷｅｅｋ０、Ｗｅｅｋ２及びＷｅｅｋ５の中和抗体価の幾何平均値を示した。垂直バーは±ＳＤを示す。）
（１）ＧＬＰ薬効試験
　実施例１で調製したＰｒｅ－ＣＴＭを４価混合し、５５５５Ｌｏｇ１０ＦＦＵ／ｄｏｓｅ、４４４４Ｌｏｇ１０ＦＦＵ／ｄｏｓｅ、３３３３Ｌｏｇ１０ＦＦＵ／ｄｏｓｅの４価デングワクチン製剤を調製した。調製した４価デングワクチン製剤又は媒体をカニクイザルに皮下単回接種し、中和抗体誘導能及びチャレンジウイルス（親株）に対する防御能を評価した。
　中和抗体価はＩｍｍｕｎｏｓｐｏｔ ＰＲＮＴ法で得た。５５５５Ｌｏｇ１０ＦＦＵ／ｄｏｓｅ接種群（Ｎ＝２４）、４４４４Ｌｏｇ１０ＦＦＵ／ｄｏｓｅ接種群（Ｎ＝２４）、３３３３Ｌｏｇ１０ＦＦＵ／ｄｏｓｅ接種群（Ｎ＝２４）のすべての個体でＤａｙ１４より中和抗体陽転が認められた（表２０～２８）。一方、媒体接種群では中和抗体陽転は認められなかった（表２９、３０）
　チャレンジウイルス（親株）に対する防御能評価のため、各群を６頭ずつ均等にさらに群分けし、Ｄａｙ６０にそれぞれの血清型の単価親株を皮下チャレンジした。チャレンジ量は、血清型ごとにそれぞれ５Ｌｏｇ１０ＰＦＵ／ｄｏｓｅ、５Ｌｏｇ１０PＦＵ／ｄｏｓｅ、６Ｌｏｇ１０ＰＦＵ／ｄｏｓｅ、５Ｌｏｇ１０ＰＦＵ／ｄｏｓｅとした。チャレンジ１、２、３、４、６，８，１０、１４日後に血清中のウイルスゲノム量を測定したところ、媒体接種群（各Ｎ＝３）ではウイルスゲノムが多く検出されたが（表３１）、ワクチン接種群ではいずれの群においてもウイルスゲノムは検出されなかった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000020
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Figure JPOXMLDOC01-appb-T000031
（１）サル神経毒力試験
　ＶＭＳを被験物質としてＷＨＯ ｐｒｏｔｏｃｏｌ（Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｒｅｐｏｒｔ Ｓｅｒｉｅｓ Ｎｏ．９７８、２０１３）に従ったサル神経毒力試験を実施した。１群あたり１２頭のカニクイザルを割り当て、ＶＭＳの各血清型それぞれ５Ｌｏｇ１０ＦＦＵ／ｄｏｓｅ、５Ｌｏｇ１０ＰＦＵ／ｄｏｓｅ、５Ｌｏｇ１０ＦＦＵ／ｄｏｓｅ、５Ｌｏｇ１０ＦＦＵ／ｄｏｓｅと、参照ウイルスとしてＹｅｌｌｏｗ Ｆｅｖｅｒ １７Ｄ ５Ｌｏｇ１０ＰＦＵ／ｄｏｓｅを頭蓋内に投与した。投与後、３０日間の臨床スコアリング及び３０日経過時点で脳組織及び脊髄に限って剖検を実施した。その結果、神経毒性に関する問題のある臨床的及び組織病理学的所見は認められなかった。
（１）ＧＬＰ反復投与毒性試験
　実施例１で調製したＰｒｅ－ＣＴＭを４価混合し、７７７７Ｌｏｇ１０ＦＦＵ／ｄｏｓｅ（５ｍＬ）、５５５５Ｌｏｇ１０ＦＦＵ／ｄｏｓｅ（０．５ｍＬ）の４価デングワクチン製剤を調製した。４価デングワクチン製剤又は媒体をそれぞれ雌雄６頭ずつのカニクイザルの皮下に４週間隔で３回投与する反復投与毒性試験を実施した。被験物質の毒性及び可逆性を評価する目的で、カニクイザルの半数は最終投与３日後、残り半数は最終投与２８日後に剖検した。
　評価項目は、一般状態（Clinical signs）、行動・神経機能（general behavior and neurobehavioral function）、局所反応（skin reaction）、体重（body weight）、摂餌量（food consumption）、体温（body temperature）、眼科的検査（ophthalmology）、心電図（electrocardiography）、呼吸数（respiratory rate）、尿検査（urinalysis）、血液学的検査（hematology）、血液生化学的検査（blood chemistry）、剖検（necropsy）、器官重量（organ weights）、病理組織学的検査（histopathology）、精巣細胞数評価（quantitative examination of testes）とした。
　反復毒性試験の投与期間及び回復期間中に死亡した個体は、いずれの投与群においても認められなかった。また、投与期間及び回復期間中に、一般状態、行動・神経機能、局所反応、体重、摂餌量、体温、眼科的検査、心電図、呼吸数、尿検査、剖検、器官重量、精巣細胞数評価において、被験物質に関連する変化は雌雄共にいずれの投与群においても認められなかった。
　血液学的には被験物質投与により白血球、好中球、リンパ球、単球、好塩基球、大型非染色細胞の個数増加が一部個体で見受けられたものの、接種部位の炎症又は免疫応答に起因する二次的な変化であり、毒性学的に有意なものではないと考えられた。病理組織学的には接種部位のみにおいて血管周囲に炎症性細胞浸潤が極小程度から中程度見受けられたものの、それらは３回目の投与から４週のうちに回復又は回復傾向を示した。
　以上より、７７７７Ｌｏｇ１０ＦＦＵ／ｄｏｓｅが当該試験におけるｎｏ－ｏｂｓｅｒｖｅｄ－ａｄｖｅｒｓｅ－ｅｆｆｅｃｔ ｌｅｖｅｌと結論付けられた。
　本発明は、デングウイルスを用いたワクチンとして利用可能である。
[規則26に基づく補充 22.12.2016]　
Figure WO-DOC-RO134
Figure WO-DOC-RO1342

Claims (50)

  1. 　次世代シーケンサーを用いて解析した配列番号１のアミノ酸配列を有する血清型１デングウイルス親株０３１３５との相同性が９５％以上あり、該親株の４８３位、５６８位、１６６３位のいずれかのアミノ酸が完全に変異しており、さらに以下の（１）～（４）のいずれか一つ以上の変異を有する弱毒化血清型１デングウイルス；
    　（１）Ｋ４８２Ｅ又はＫ４８２Ｅ／Ｋ
    　（２）Ｋ４８４Ｒ又はＫ４８４Ｒ／Ｋ
    　（３）Ｉ／Ｔ２３５３Ｔ
    　（４）Ａ２３６４Ｔ、又はＡ２３６４Ｔ／Ａ
  2. 　配列番号１で示される親株０３１３５のアミノ配列との相同性が９７％以上ある、請求項１に記載の弱毒化血清型１デングウイルス。
  3. 　配列番号１で示される親株０３１３５のアミノ配列との相同性が９９％以上ある、請求項１に記載の弱毒化血清型１デングウイルス。
  4. 　４８３位、５６８位、及び１６６３位のアミノ酸が完全に変異している、請求項１～３のいずれか一項に記載の弱毒化血清型１ウイルス。
  5. 　４８３位の変異がＥ４８３Ｋである、請求項４に記載の弱毒化血清型１デングウイルス。
  6. 　５６８位の変異がＫ５６８Ｒである、請求項４に記載の弱毒化血清型１デングウイルス。
  7. 　１６６３位の変異がＮ１６６３Ｋである、請求項４に記載の弱毒化血清型１デングウイルス。
  8. 　４８３位の変異がＥ４８３Ｋであり、５６８位の変異がＫ５６８Ｒであり、１６６３位の変異がＮ１６６３Ｋである、請求項４に記載の弱毒化血清型１デングウイルス。
  9. 　前記（１）～（４）のすべての変異を有する、請求項１～８のいずれか一項に記載の弱毒化血清型１デングウイルス。
  10. 　次世代シーケンサーを用いて解析した配列番号２のアミノ酸配列を有する血清型２デングウイルス親株９９３４５との相同性が９５％以上あり、該親株の１４３位、４００位、１１０２位、１３０８位、１６５４位のいずれかのアミノ酸が完全に変異しており、さらに以下の（５）又は（６）の変異を有する弱毒化血清型２デングウイルス；
    　（５）Ｐ２３４７Ｌ又はＰ２３４７Ｐ／Ｌ
    　（６）Ｔ２８２８Ｍ又はＴ２８２８Ｔ／Ｍ
  11. 　配列番号２で示される親株９９３４５のアミノ配列との相同性が９７％以上ある、請求項２に記載の弱毒化血清型１デングウイルス。
  12. 　配列番号２で示される親株９９３４５のアミノ配列との相同性が９９％以上ある、請求項２に記載の弱毒化血清型１デングウイルス。
  13. 　１４３位、４００位、１１０２位、１３０８位、及び１６５４位のアミノ酸が完全に変異している、請求項１０～１３のいずれか一項に記載の弱毒化血清型２デングウイルス。
  14. 　１４３位の変異がＤ１４３Ｎである、請求項１３に記載の弱毒化血清型２デングウイルス。
  15. 　４００位の変異がＴ４００Ｋである、請求項１３に記載の弱毒化血清型２デングウイルス。
  16. 　１１０２位の変異がＤ１１０２Ｎである、請求項１３に記載の弱毒化血清型２デングウイルス。
  17. 　１３０８位の変異がＬ１３０８Ｆである、請求項１３に記載の弱毒化血清型２デングウイルス。
  18. 　１６５４位の変異がＥ１６５４Ｋである、請求項１３に記載の弱毒化血清型２デングウイルス。
  19. 　１４３位の変異がＤ１４３Ｎであり、４００位の変異がＴ４００Ｋであり、１１０２位の変異がＤ１１０２Ｎであり、１３０８位の変異がＬ１３０８Ｆであり、１６５４位の変異がＥ１６５４Ｋである、請求項１３に記載の弱毒化血清型２デングウイルス。
  20. 　前記（５）及び（６）の変異を有する、請求項１０～１９のいずれか一項に記載の弱毒化血清型２デングウイルス。
  21. 　次世代シーケンサーを用いて解析した配列番号３のアミノ酸配列を有する血清型３デングウイルス親株１６５６２との相同性が９５％以上あり、該親株の２０９位、５８２位、１２１１位、１５６３位のいずれかのアミノ酸が完全に変異しており、さらに以下の（７）～（１０）のいずれか一つ以上の変異を有する弱毒化血清型３デングウイルス；
    　（７）Ｋ／Ｒ６７１Ｋ
    　（８）Ａ６８７Ｖ
    　（９）Ｔ７６４Ｉ／Ｔ
    　（１０）Ａ１２３７Ｔ
  22. 　配列番号３で示される親株１６５６２のアミノ配列との相同性が９７％以上ある、請求項２１に記載の弱毒化血清型３デングウイルス。
  23. 　配列番号２で示される親株１６５６２のアミノ配列との相同性が９９％以上ある、請求項２１に記載の弱毒化血清型３デングウイルス。
  24. 　２０９位、５８２位、１２１１位、１５６３位、及び１６５４位のアミノ酸が完全に変異している請求項２１～２３のいずれか一項に記載の弱毒化血清型３デングウイルス。
  25. 　２０９位の変異がＩ２０９Ｌである、請求項２４に記載の弱毒化血清型３デングウイルス。
  26. 　５８２位の変異がＳ５８２Ｇである、請求項２４に記載の弱毒化血清型３デングウイルス。
  27. 　１２１１位の変異がＦ１２１１Ｌである、請求項２４に記載の弱毒化血清型３デングウイルス。
  28. 　１５６３位の変異がＱ１５６３Ｋである、請求項２４に記載の弱毒化血清型３デングウイルス。
  29. 　２０９位の変異がＩ２０９Ｌであり、５８２位の変異がＳ５８２Ｇであり、１２１１位の変異がＦ１２１１Ｌであり、１５６３位の変異がＱ１５６３Ｋである、請求項２４に記載の弱毒化血清型３デングウイルス。
  30. 　前記（７）～（１０）のすべての変異を有する、請求項２１～２９に記載の弱毒化血清型３デングウイルス。
  31. 　次世代シーケンサーを用いて解析した配列番号４のアミノ酸配列を有する血清型４デングウイルス親株１０３６との相同性が９５％以上あり、該親株の２１８７位又は２３５４位のアミノ酸が完全に変異しており、さらに、６２４位、７４２位、１６２８位、２２８６位、２４８２位、又は２５０８位に変異を有さない、弱毒化血清型４デングウイルス。
  32. 　配列番号４で示される親株１０３６のアミノ配列との相同性が９７％以上ある、請求項３１に記載の弱毒化血清型４デングウイルス。
  33. 　配列番号４で示される親株１０３６のアミノ配列との相同性が９７％以上ある、請求項３１に記載の弱毒化血清型４デングウイルス。
  34. 　２１８７位、及び２３５４位のアミノ酸が完全に変異している、請求項３１～３３のいずれか一項に記載の弱毒化血清型４デングウイルス。
  35. 　２１８７位の変異がＬ２１８７Ｆである、請求項３４に記載の弱毒化血清型４デングウイルス。
  36. 　２３５４位の変異がＦ／Ｌ２３５４Ｓである、請求項３４に記載の弱毒化血清型４デングウイルス。
  37. 　２１８７位の変異がＬ２１８７Ｆであり、２３５４位の変異がＦ／Ｌ２３５４Ｓである、請求項３４に記載の弱毒化血清型４デングウイルス。
  38. 　６２４位、７４２位、１６２８位、２２８６位、２４８２位、及び２５０８位に変異を有さない、請求項３１～３７のいずれか一項に記載の弱毒化血清型４デングウイルス。
  39. 　 請求項１～９のいずれか一項に記載の弱毒化血清型１デングウイルス、請求項１０～２０のいずれか一項に記載の弱毒化血清型２デングウイルス、請求項３１～３８のいずれか一項に記載の弱毒化血清型３デングウイルス、及び請求項３１～３８のいずれか一項に記載の弱毒化血清型４デングウイルスよりなる群から選ばれる１つ以上の弱毒赤デングウイルスを抗原として含む、弱毒化デングウイルスワクチン。
  40. 　 請求項１～９のいずれか一項に記載の弱毒化血清型１デングウイルス、請求項１０～２０のいずれか一項に記載の弱毒化血清型２デングウイルス、請求項３１～３８のいずれか一項に記載の弱毒化血清型３デングウイルス、及び請求項３１～３８のいずれか一項に記載の弱毒化血清型４デングウイルスを抗原として含む、弱毒化４価デングウイルスワクチン。
  41. 　血清型１、２、３及び４のデングウイルス抗原の混合比率が、１：１：１：１、５：３：５：３、又は５：３：３：３である、請求項３９又は４０に記載の弱毒化デングウイルスワクチン。
  42. 　血清型１、２、３及び４のデングウイルスの各抗原量が、１～７ｌｏｇ１０ＦＦＵ／ｄｏｓｅである、請求項３９～４１のいずれか一項に記載の弱毒化デングウイルスワクチン。
  43. 　次世代シーケンサーを用いて解析した配列番号１のアミノ酸配列を有する血清型１デングウイルス親株０３１３５をイヌ初代腎（ＰＤＫ）細胞で１５～２５継代して弱毒株とし、前記弱毒株をさらにアフリカミドリザル腎（Ｖｅｒｏ）細胞で継代することを含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の弱毒化血清型１デングウイルスの製造方法。
  44. 　次世代シーケンサーを用いて解析した配列番号１のアミノ酸配列を有する血清型１デングウイルス親株０３１３５をＰＤＫ細胞で１５継代して弱毒株とし、前記弱毒株をさらにＶｅｒｏ細胞で継代することを含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の弱毒化血清型１デングウイルスの製造方法。
  45. 　次世代シーケンサーを用いて解析した配列番号２のアミノ酸配列を有する血清型２デングウイルス親株９９３４５をＰＤＫ細胞で２０～３５継代して弱毒株とし、前記弱毒株をさらにＶｅｒｏ細胞で継代することを含む、請求項１０～２０のいずれか一項に記載の弱毒化血清型２デングウイルスの製造方法。
  46. 　次世代シーケンサーを用いて解析した配列番号２のアミノ酸配列を有する血清型２デングウイルス親株９９３４５をＰＤＫ細胞で２５継代して弱毒株とし、前記弱毒株をさらにＶｅｒｏ細胞で継代することを含む、請求項１０～２０のいずれか一項に記載の弱毒化血清型２デングウイルスの製造方法。
  47. 　次世代シーケンサーを用いて解析した配列番号３のアミノ酸配列を有する血清型３デングウイルス親株１６５６２をミドリザル初代腎（ＰＧＭＫ）細胞で２０～３０継代、ＰＤＫ細胞で２～５継代して弱毒株とし、前記弱毒株をさらにＶｅｒｏ細胞で継代することを含む、請求項２１～３０のいずれか一項に記載の弱毒化血清型３デングウイルスの製造方法。
  48. 　次世代シーケンサーを用いて解析した配列番号３のアミノ酸配列を有する血清型３デングウイルス親株１６５６２をＰＧＭＫ細胞で３０継代、ＰＤＫ細胞で４継代して弱毒株とし、前記弱毒株をさらにＶｅｒｏ細胞で継代することを含む、請求項２０～３０のいずれか一項に記載の弱毒化血清型３デングウイルスの製造方法。
  49. 　次世代シーケンサーを用いて解析した配列番号４のアミノ酸配列を有する血清型４デングウイルス親株１０３６をＰＤＫ細胞で３５～４５継代して弱毒株とし、前記弱毒株をさらにＶｅｒｏ細胞で継代することを含む、請求項２４～３０に記載の弱毒化血清型４デングウイルスの製造方法。
  50. 　次世代シーケンサーを用いて解析した配列番号４のアミノ酸配列を有する血清型４デングウイルス親株１０３６をＰＤＫ細胞で４０継代して弱毒株とし、前記弱毒株をさらにＶｅｒｏ細胞で継代することを含む、請求項２４～３０のいずれか一項に記載の弱毒化血清型４デングウイルスの製造方法。
PCT/JP2016/085077 2015-11-27 2016-11-25 デングウイルス弱毒株をバンク化した生ウイルス、及びそれらを抗原とするデングワクチン Ceased WO2017090762A1 (ja)

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