WO2017114191A1 - 索玛鲁肽的制备方法 - Google Patents

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WO2017114191A1
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    • C07K14/001—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof by chemical synthesis

Definitions

  • the invention relates to the field of polypeptides, in particular to a method for preparing somatoglutide.
  • Semaglutide is a long-acting GLP-1 analogue developed by Nove Nordisk. The drug requires only a weekly subcutaneous injection and is currently in clinical phase III. Structurally, Semaglutide needs to attach 26 Lys to PEG, glutamic acid and octadecanoic acid fat chains. Eight of them used the non-natural amino acid aminoisobutyric acid. Compared with Liraglutide, Semaglutide has a longer aliphatic chain and increased hydrophobicity, but Semaglutide is modified by short-chain PEG and its hydrophilicity is greatly enhanced.
  • the peptide sequence structure is as follows:
  • the patent protects a synthetic method using Fmoc solid phase sequential coupling one by one; in which the Mmt, Mtt, Dde or ivDde protecting groups are selected for temporary orthogonal protection when the amino acid of the lysine is coupled to the side chain, and then a certain method is selected.
  • the protecting group was removed, and side chain coupling was carried out in sequence; the resin was cleaved by a cleavage reagent, and diethyl ether was precipitated to obtain a crude peptide; and a crude peptide was obtained by RP-HPLC.
  • the present invention provides a method for preparing somaglutide.
  • the invention adopts Fmoc-Lys(Alloc)-OH-protected amino acid as a raw material, and selects Pd(PPh 3 ) 4 for deprotection.
  • the operation process is simple, and only a simple one to two times of de-reaction operation is required, and each 10 to 30 minutes, no side reaction occurs, the operation process is safe, and it is easy to enlarge the production.
  • Boc-His(Boc)-OH.DCHA and Boc-His(Trt)-OH are used as raw materials to minimize His racemization. Risk; coupling with special fragments increases the efficiency of the synthesis.
  • the present invention provides the following technical solutions:
  • the invention provides a preparation method of somaglutide, comprising the following steps:
  • Step 1 Gly is coupled to the resin by a solid phase synthesis method; Gly-resin is obtained;
  • Step 2 taking the Gly-resin obtained in the step 1, sequentially coupling the amino acids according to the sequence of the somaglutide by sequential coupling, and cleavage and purification;
  • Lys 26 uses Fmoc-Lys(Alloc)-OH as a raw material
  • H-His 7 is synthesized by using Boc-His(Trt)-OH or Boc-His(Boc)-OH.DCHA as raw materials;
  • the Lys 26 side chain is prepared by sequential coupling or fragment synthesis.
  • the method for preparing a full-protection fragment of Fmoc-PEG-PEG- ⁇ -Glu-Octadecanedioic Acid for the fragment synthesis of the Lys 26 side chain is prepared by sequentially coupling Fmoc with a chlorine resin.
  • the resin in the first step of the preparation method is selected from the group consisting of wang resin or 2-CTC resin;
  • the degree of substitution of the wang resin is 0.1 to 0.5 mmol / g, preferably 0.25 to 0.35 mmol / g;
  • the degree of substitution of the 2-CTC resin is 0.2-0.6 mmol/g, preferably 0.25-0.45 mmol/g;
  • the coupling of the wang resin uses DIC+A+DMAP, wherein A is HOBt or HOAt;
  • the coupling of the 2-CTC resin was carried out by the DiPEA method.
  • the coupling in the second step of the preparation method is condensed by a method of DIC+A or B+A+C, and the reaction is transparent to the ninhydrin detecting resin; wherein A is selected from HOBt or HOAt, B is selected from HBTU, HATU, TBTU, PyAOP or PyBOP, C is selected from DIPEA or TMP; the solvent is selected from a mixture of one or more of DMF, CH 2 Cl 2 , NMP or DMSO.
  • the method for preparing a fragment of the Lys 26 side chain of the preparation method is condensed by a method of DIC+A or B+A+C, and the reaction is carried out until the ninhydrin detecting resin is transparent;
  • A is selected from HOBt or HOAt,
  • B is selected from HBTU, HATU, TBTU, PyAOP or PyBOP,
  • C is selected from DIPEA or TMP; and the solvent is selected from one or a mixture of two or more of DMF, CH 2 Cl 2 , NMP or DMSO .
  • the fragmentation of the Lys 26 side chain of the preparation method is carried out by cleavage using 1-2% (V/V) of TFA/CH 2 Cl 2 or 20% (V/V). TFE/CH 2 Cl 2 .
  • the preparation method comprises recrystallization of the fragment of the Lys 26 side chain by using Et 2 O, CH 2 Cl 2 , CHCl 3 , MeOH, CH 3 CN, THF, EtOAc, EtOH.
  • Et 2 O Et 2 O
  • CH 2 Cl 2 CHCl 3
  • MeOH MeOH
  • CH 3 CN THF
  • EtOAc EtOH
  • EtOH EtOH
  • the method of the preparation of the Fmoc-Lys(Alloc)-OH removes 5 to 10 equivalents of morpholine (or 5 to 10 equivalents of phenylsilane to replace morpholine). And 0.1 to 0.3 equivalent of Pd(PPh 3 ) 4 is removed twice for 10 to 30 minutes each time, and CH 2 Cl 2 is used as a solvent in the removal reaction.
  • Boc-His(Trt)-OH coupling uses B+A+C system
  • Boc-His(Boc)-OH.DCHA coupling uses HOAT+HATU+TMP system
  • A is selected from HOBt or HOAt
  • B is selected from HBTU, HATU, TBTU, PyAOP or PyBOP
  • C is selected from DIPEA or TMP
  • the solvent is selected from one or more of DMF, CH 2 Cl 2 , NMP or DMSO mixture.
  • the reagent for cleavage in the step 2 of the preparation method comprises a mixture of one or more of TFA, PhSMe, PhOMe, EDT, H 2 O, TIS or PhOH;
  • the invention adopts Fmoc-Lys(Alloc)-OH-protected amino acid as a raw material, and selects Pd(PPh 3 ) 4 for deprotection.
  • the operation process is simple, and only a simple one to two times of de-reaction operation is required, and each 10 to 30 minutes, no side reaction occurs, the operation process is safe, and it is easy to enlarge the production.
  • Boc-His(Boc)-OH.DCHA and Boc-His(Trt)-OH are used as raw materials to minimize His racemization. Risk; coupling with special fragments increases the efficiency of the synthesis.
  • the invention selects Fmoc-Lys(Alloc)-OH raw material, simplifies the deprotection step, eliminates the side reaction brought about by the process of removing Mmt and Mtt, and the operational safety risk of the Dde or ivDde protecting group in the amplification process. ;
  • the invention adopts a coupling system of Boc-His(Trt)-OH raw material and Boc-His(Boc)-OH.DCHA to reduce His racemic impurities;
  • Mmt and Mtt protecting groups of the invention requires the use of an acidic TFA solution, and the removal reaction needs to be repeated 6-12 times, which increases the complexity of the operation; the use of the acidic solution corrodes the equipment and increases the production cost; the use of the acidic solution It may lead to easy removal of protective groups under weakly acidic conditions such as tBu and Boc, and increase the possibility of side reactions. Selecting Mmt and Mtt protecting groups to synthesize somaglutide can only use acid-resistant Wang resin, and can not use acid resistance. Poor chlorine resin limits the range of use of the resin;
  • the removal of the Dde or ivDde protecting group of the present invention requires the use of a hydrazine solution, and the large-scale use of hydrazine in the production process has a great safety hazard.
  • the use of the side chain fragment of the invention improves the synthesis efficiency, effectively reduces the coupling synthesis step, and reduces the risk of increased impurities due to the increased number of coupling times.
  • the use of side chain fragments improves the synthesis efficiency.
  • the yield of the crude peptide was 83%, the purity of the crude peptide was 65.3%, the purification yield was 23.6%, the purity of the phlegm peptide was 99.02%, the yield of the crude peptide was 93%, and the purity of the crude peptide was 72.4%.
  • the rate was 34.4%, and the purity of the sperm peptide was 99.60%. (See Examples 17 and 18).
  • Figure 3 is a graph showing the HPLC detection spectrum of His racemic impurities when coupled with His in the preparation of somadutide in Example 10;
  • Figure 5 shows the HPLC chromatogram of the somaglutide prepared in Example 18
  • Figure 6 shows a MALDI-TOF mass spectrum of somaduride prepared in Example 15;
  • Figure 7 is a MALDI-TOF mass spectrum of the somatoglutide prepared in Example 17;
  • Figure 8 shows the MALDI-TOF mass spectrum of the somaglutide prepared in Example 18.
  • the invention discloses a preparation method of somaglutide, and those skilled in the art can learn from the contents of the paper and appropriately improve the process parameters. It is to be understood that all such alternatives and modifications are obvious to those skilled in the art and are considered to be included in the present invention.
  • the method and the application of the present invention have been described by the preferred embodiments, and it is obvious that the method and application described herein may be modified or appropriately modified and combined without departing from the scope of the present invention.
  • the technique of the present invention is applied.
  • the present invention describes two methods for synthesizing somaglutide:
  • the sequential coupling route map is as follows:
  • the synthetic route of the present invention includes the following steps:
  • Lys 26 uses Fmoc-Lys(Alloc)-OH as a raw material, and removes the protecting group under the conditions of Pd(PPh 3 ) 4 and morpholine;
  • H-His 7 is synthesized by using Boc-His(Trt)-OH or Boc-His(Boc)-OH.DCHA as raw materials;
  • the step 1) Fmoc-Gly-OH resin may be selected from wang resin or 2-CTC resin;
  • the substitution range of the step 1) using Fmoc-Gly-wang resin is 0.1-0.5 mmol/g, preferably 0.25-0.35 mmol/g; when the Fmoc-Gly-2-CTC resin is synthesized, the degree of substitution is 0.2- 0.6 mmol/g is preferably 0.25-0.45 mmol/g; the connection of Wang resin is DIC+A+DMAP, wherein A is HOBt or HOAt; and the 2-CTC chlorine resin is connected by DiPEA method;
  • amino acid or amino acid analog used in the sequential coupling process is an Fmoc protected amino acid, wherein H-His 7 is Boc-His(Trt)-OH or Boc-His(Boc)-OH.DCHA, Lys 26 Coupling using Fmoc-Lys(Alloc)-OH, Octadecanedioic Acid using mono-tert-butyl octadecanoic acid;
  • the step 2) is condensed by DIC+A or B+A+C in the coupling process, and the reaction is transparent to the ninhydrin detecting resin;
  • A is HOBt or HOAt
  • B is HBTU, HATU, TBTU, PyAOP or PyBOP
  • C is DIPEA or TMP
  • the solvent is selected from DMF, CH2Cl2, NMP, DMSO or any mixed solvent
  • step 3 preparation of the PEG-PEG- ⁇ -Glu-Octadecanedioic Acid full-protection fragment using 2-CTC chlorine resin, cleavage using 1-2% TFA / CH2Cl2 or 20% TFE / CH2Cl2; used in the coupling process DIC+A or B+A+C method condensation, reaction to ninhydrin detection resin transparency;
  • A is HOBt or HOAt
  • B is HBTU, HATU, TBTU, PyAOP or PyBOP
  • C is DIPEA or TMP
  • solvent is selected from DMF, CH2Cl2, NMP, DMSO or any mixed solvent;
  • the step 3) is recrystallized using Et 2 O, CH 2 Cl 2 , CHCl 3 , MeOH, CH 3 CN, THF, EtOAc, EtOH, Toluene, Hexane, Actone or any mixed solvent, preferably MeOH and CH 2 Cl 2 Mixed solvent;
  • step 4) removal of Alloc in Fmoc-Lys(Alloc)-OH is carried out by using 0.1-0.3 equivalent of Pd(PPh 3 ) 4 , 5-10 equivalents of morphin or phenylsilane twice, each time 10- For 30 minutes, CH2Cl2 was used as the solvent in the removal reaction;
  • Step 5 using Boc-His(Trt)-OH coupling, preferably B+A+C system; Boc-His(Boc)-OH.DCHA coupling is preferred to HOAT+HATU+TMP system;
  • the materials and reagents used in the preparation of the somaglutide provided by the present invention are commercially available.
  • Example 7 Pyrolysis of peptide resin fragment PEG-PEG- ⁇ -Glu-Octadecanedioic Acid mon-tert-butyl ester
  • Example 8 Coupling of peptide resin fragment PEG-PEG- ⁇ -Glu-Octadecanedioic Acid mon-tert-butyl ester
  • Fmoc-Gly-Wang resin synthesized in Example 1 was used for the synthesis of the somaglutide peptide resin.
  • Fmoc-Gly-Wang Resin 202g (100mmol) with a substitution degree of 0.496mmol/g was weighed, and DMF was swollen for 30 minutes, and then coupled according to the amino acid sequence of somaglutide. The amino acid was dosed 2-5 times equivalent during the coupling process.
  • A is HOBt or HOAt
  • B is HBTU, HATU, TBTU, PyAOP or PyBOP
  • C is DIPEA or TMP
  • solvent is DMF, CH2Cl2, NMP, DMSO or any mixed solvent
  • Boc-His(Trt)-OH coupling is coupled by HOBt/HBTU/DiPEA system .
  • the Boc-His(Trt)-OH/HOBt/HBTU/DiPEA coupling system was used to obtain the Hist racemic impurity peak in the crude peptide, which was significantly smaller than the Boc-His(Boc)-OH coupling system (HOBt/HBTU/). DiPEA). as shown in picture 2.
  • Fmoc-Gly-Wang resin synthesized in Example 2 was used for the synthesis of the somaglutide peptide resin.
  • Fmoc-Gly-Wang Resin 200g (21.6mmol) with a substitution degree of 0.108mmol/g was weighed, and DMF was swollen for 30 minutes, and then coupled according to the amino acid sequence of somaglutide. The amino acid was charged 2-5 times in the coupling process.
  • Fmoc-Gly-Wang resin synthesized in Example 3 was used for the synthesis of the somaglutide peptide resin.
  • Fmoc-Gly-Wang Resin 102g (32mmol) with a substitution degree of 0.314mmol/g was weighed, and DMF was swollen for 30 minutes, and then coupled according to the amino acid sequence of somaglutide. The amino acid was charged 2-5 times equivalent during the coupling process.
  • A is HOBt or HOAt
  • B is HBTU, HATU, TBTU, PyAOP or PyBOP
  • C is DIPEA or TMP
  • solvent selection DMF, CH2Cl2, NMP, DMSO or any mixed solvent
  • Boc-His(Trt)-OH coupling is coupled using HOBt/HBTU/DiPEA or HOBt/PYBOP/DiPEA systems.
  • Fmoc-Gly-2-CTC resin synthesized in Example 4 was used for the synthesis of the somaglutide peptide resin.
  • Fmoc-Gly-2-CTC Resin 94g (50mmol) with a substitution degree of 0.535mmol/g was weighed, and DMF was swollen for 30 minutes, and then coupled according to the amino acid sequence of somaglutide. The amino acid was dosed 2-5 times during the coupling process.
  • Fmoc-Gly-2-CTC resin synthesized in Example 5 was used for the synthesis of the somaglutide peptide resin.
  • Fmoc-Gly-2-CTC Resin 114g (42mmol) with a substitution degree of 0.368mmol/g was weighed, and DMF was swollen for 30 minutes, and then coupled according to the amino acid sequence of somaglutide. The amino acid was dosed 2-5 times during the coupling process.
  • Fmoc-Gly-2-CTC resin synthesized in Example 6 was used for the synthesis of the somaglutide peptide resin.
  • Fmoc-Gly-2-CTC Resin 95g (20mmol) with a substitution degree of 0.211mmol/g was weighed, and DMF was swollen for 30 minutes, and then coupled according to the amino acid sequence of somaglutide. The amino acid was dosed 2-5 times during the coupling process.
  • the lysis reagent was first pre-frozen for 2 hours, and then the lysis reagent was poured into a 5 L reaction vessel and allowed to react at room temperature for 2 hours. After the reaction was completed, the resin was filtered off and the filtrate was collected. The resin was washed with a small amount of TFA, and the filtrate was combined.
  • somaglutide crude peptide was weighed and dissolved in 1500 mL of 25% acetonitrile + 75% water mixed solvent, using Waters 2545 RP-HPLC system, wavelength 218 nm, column 50 ⁇ 250 mm reverse phase C18 column, column temperature 45 °C, conventional 0.1% TFA/acetonitrile mobile phase purification, collection of the peak component of the target, to obtain a purity of more than 98.5% phage.
  • the spermatic peptide solution was a Waters 2545 RP-HPLC system, the column was a 50 ⁇ 250 mm reverse phase C18 column, and the 0.1% hydrochloric acid/acetonitrile mobile phase was transferred to a salt.
  • the peak component was collected, concentrated under reduced pressure, and lyophilized to obtain the somaglutide hydrochloride.
  • the salt sperm peptide was 11.12 g, and the HPLC purity was 98.86%.
  • somaglutide crude peptide was weighed and dissolved in 1500 mL of 25% acetonitrile + 75% water mixed solvent, using Waters 2545 RP-HPLC system, wavelength 218 nm, column 50 ⁇ 250 mm reverse phase C18 column, column temperature 45 °C, NaClO4 salt and acetonitrile mobile phase system were purified, and the peak component was collected to obtain a phage with a purity greater than 98.5%.
  • the spermatic peptide solution was a Waters 2545 RP-HPLC system, the column was a 50 ⁇ 250 mm reverse phase C18 column, and the mobile phase of 0.1% trifluoroacetic acid/acetonitrile was transferred to a salt.
  • the peak component was collected, concentrated under reduced pressure, and lyophilized to give somaglutide.
  • the salt trifluoroacetate salt was 11.98 g, and the HPLC purity was 99.60%, as shown in FIG.

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Abstract

一种索玛鲁肽的制备方法，采用Fmoc-Lys(Alloc)-OH保护的氨基酸为原料，选择Pd(PPh3)4进行去保护，一方面操作过程简单，只需要简单的1～2遍脱去反应操作即可，每次10～30min，无副反应发生，操作过程安全，便于放大生产；过程中采用Boc-His(Boc)-OH.DCHA和Boc-His(Trt)-OH为原料可以最大程度降低His消旋的风险；采用特殊的片段进行偶联提高了合成效率。

Description

索玛鲁肽的制备方法
本申请要求于2015年12月30日提交中国专利局、申请号为201511027176.7、发明名称为“索玛鲁肽的制备方法”的中国专利申请的优先权，其全部内容通过引用结合在本申请中。
技术领域
本发明涉及多肽领域，特别涉及索玛鲁肽的制备方法。
背景技术
索玛鲁肽的化学结构如式Ⅰ所示：
Figure PCTCN2016110373-appb-000001
Semaglutide由Nove Nordisk公司研发的长效GLP-1类似物，该药物只需要进行每周一次的皮下注射给药，目前还处于临床三期阶段。从结构上看，Semaglutide需要将26位Lys接上PEG、谷氨酸和十八烷酸脂肪链， 其中8位采用非天然氨基酸氨基异丁酸。与Liraglutide相比，Semaglutide的脂肪链更长，疏水性增加，但是Semaglutide经过短链的PEG修饰，亲水性大大增强。PEG修饰后不但可以与白蛋白紧密结合，掩盖DPP-4酶水解位点，还能降低肾排泄，可延长生物半衰期，达到长循环的效果。肽序结构如下：
H-His7-Aib8-Glu9-Gly10-Thr11-Phe12-Thr13-Ser14-Asp15-Val16-Ser17-Ser18-Tyr19-Leu20-Glu21-Gly22-Gln23-Ala24-Ala25-Lys26(PEG-PEG-γ-Glu-Octadeca-nedioic Acid)-Glu27-Phe28-Ile29-Ala30-Trp31-Leu32-Val33-Arg34-Gly35-Arg36-Gly37-OH
现有技术中提供了合成Semaglutide采用Fmoc固相合成的方法顺利偶联得到目标多肽分子，专利中指出在26位Lys采用Dde、ivDde、Mmt、Mtt保护基进行正交保护，然后进行侧链的顺序偶联。专利中提到针对Ser、Thr可以选择假脯氨酸二肽方法进行替换。
专利保护了采用Fmoc固相顺序逐一偶联的合成方法；其中在赖氨酸的侧链偶联氨基酸时选择Mmt、Mtt、Dde或ivDde保护基进行临时性的正交保护，然后选择一定的方法脱除保护基，按照顺序进行侧链偶联；采用裂解试剂对树脂进行切割、乙醚沉淀得到粗肽；RP-HPLC制备得到粗肽。
目前报道的方法中当Lys采用Mmt、Mtt、Dde或ivDde进行保护时均具有一定的不足。采用Mmt、Mtt保护基保护的Lys脱除时需要使用弱酸性的TFA溶液，且需要加入一定的捕捉剂，需要经过多次的重复处理。专利中提到脱除Mmt、Mtt的实验中需要重复6-12次，每次5-10min，反复多次操作可能会导致其它易受酸影响的保护剂如Trt、tBu、Boc等，可能会导致副反应的产生；Mmt、Mtt保护基较难脱除，在放大生产过程中胶难保证去保护基的完全；6-12次的重复操作使得实验过程繁琐；当采用2-CTC(2-三苯基氯树脂)作为反应载体时，使用弱酸极易使linker脱落，多肽片段被切除，最终收率大大降低，导致生产成本增加，经济效益下降；采用Dde或ivDde保护基保护的Lys脱除时需要使用肼溶液进行脱除，肼具有较强的还原性，易与具有氧化性的基团发生副反应；肼的性 质活泼在存储、运输方面存在一定的风险，放大生产过程中具有安全隐患。
发明内容
有鉴于此，本发明提供一种索玛鲁肽的制备方法。本发明采用Fmoc-Lys(Alloc)-OH保护的氨基酸为原料，选择Pd(PPh3)4进行去保护，一方面操作过程简单，只需要简单的1～2遍脱去反应操作即可，每次10～30min，无副反应发生，操作过程安全，便于放大生产；过程中采用Boc-His(Boc)-OH.DCHA和Boc-His(Trt)-OH为原料可以最大程度降低His消旋的风险；采用特殊的片段进行偶联提高了合成效率。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种索玛鲁肽的制备方法，包括如下步骤：
步骤1：取Gly采用固相合成方法与树脂偶联；获得Gly-树脂；
步骤2：取步骤1制得的Gly-树脂，采用顺序偶联的方法按照索玛鲁肽的序列依次偶联氨基酸，裂解、纯化；
其中，Lys26采用Fmoc-Lys(Alloc)-OH为原料；
H-His7采用Boc-His(Trt)-OH或Boc-His(Boc)-OH.DCHA为原料进行合成；
Lys26侧链采用顺序偶联或片段合成的方法制备获得。
在本发明的一些具体实施方案中，所述制备方法Lys26侧链的片段合成采用的Fmoc-PEG-PEG-γ-Glu-Octadecanedioic Acid的全保护片段的制备方法为取氯树脂依次偶联Fmoc-PEG-OH、Fmoc-PEG-OH、Fmoc-Glu(OH)-OtBu和十八烷二酸单叔丁酯，裂解、重结晶获得PEG-PEG-γ-Glu-Octadecanedioic Acid mon-tert-butyl ester。
在本发明的一些具体实施方案中，所述制备方法步骤1中所述树脂选自wang树脂或2-CTC树脂；
所述wang树脂的替代度为0.1～0.5mmol/g，优选0.25～0.35mmol/g；
所述2-CTC树脂的替代度为0.2～0.6mmol/g，优选0.25～0.45mmol/g；
所述wang树脂的偶联采用DIC+A+DMAP，其中A为HOBt或HOAt；
所述2-CTC树脂的偶联采用DiPEA法。
在本发明的一些具体实施方案中，所述制备方法步骤2中所述偶联采用DIC+A或B+A+C的方法缩合，反应至茚三酮检测树脂透明；其中A选自HOBt或HOAt，B选自HBTU、HATU、TBTU、PyAOP或PyBOP，C选自DIPEA或TMP；溶剂选自DMF、CH2Cl2、NMP或DMSO中的一种或两者以上的混合物。
在本发明的一些具体实施方案中，所述制备方法所述Lys26侧链的片段合成中偶联采用DIC+A或B+A+C的方法缩合，反应至茚三酮检测树脂透明；其中A选自HOBt或HOAt，B选自HBTU、HATU、TBTU、PyAOP或PyBOP，C选自DIPEA或TMP；溶剂选自DMF、CH2Cl2、NMP或DMSO中的一种或两者以上的混合物。
在本发明的一些具体实施方案中，所述制备方法所述Lys26侧链的片段合成中裂解采用1～2％(V/V)的TFA/CH2Cl2或20％(V/V)的TFE/CH2Cl2。
在本发明的一些具体实施方案中，所述制备方法所述Lys26侧链的片段合成中重结晶选用Et2O、CH2Cl2、CHCl3、MeOH、CH3CN、THF、EtOAc、EtOH、Toluene、Hexane或Actone中的一种或两者以上的混合物，优选MeOH和CH2Cl2的混合溶剂。
在本发明的一些具体实施方案中，所述制备方法所述Fmoc-Lys(Alloc)-OH中Alloc的脱除选用5～10当量的吗啡啉(或用5～10当量的苯硅烷替代吗啡啉)与0.1～0.3当量的Pd(PPh3)4脱除两次，每次10～30min，脱除反应中选用CH2Cl2为溶剂。
在本发明的一些具体实施方案中，所述制备方法Boc-His(Trt)-OH偶联选用B+A+C体系；Boc-His(Boc)-OH.DCHA偶联选用HOAT+HATU+TMP体系；
其中A选自HOBt或HOAt，B选自HBTU、HATU、TBTU、PyAOP或PyBOP，C选自DIPEA或TMP；溶剂选自DMF、CH2Cl2、NMP或DMSO中的一种或两者以上的混合物。
在本发明的一些具体实施方案中，所述制备方法步骤2中所述裂解采 用的试剂包括TFA、PhSMe、PhOMe、EDT、H2O、TIS或PhOH中的一种或两者以上的混合物；
TFA、PhSMe、PhOMe、EDT、H2O、TIS与PhOH的体积比为80～90:0～5:0～3:0～5:0～5：0～2：0～5；优选比例为TFA：PhSMe：PhOH：EDT：H2O＝85:5:3:5:2。
本发明采用Fmoc-Lys(Alloc)-OH保护的氨基酸为原料，选择Pd(PPh3)4进行去保护，一方面操作过程简单，只需要简单的1～2遍脱去反应操作即可，每次10～30min，无副反应发生，操作过程安全，便于放大生产；过程中采用Boc-His(Boc)-OH.DCHA和Boc-His(Trt)-OH为原料可以最大程度降低His消旋的风险；采用特殊的片段进行偶联提高了合成效率。
本发明选用Fmoc-Lys(Alloc)-OH原料，简化了去保护步骤，排除了在去Mmt、Mtt保护过程中带来的副反应，以及去Dde或ivDde保护基在放大过程中的操作安全风险；
本发明选用Boc-His(Trt)-OH原料和Boc-His(Boc)-OH.DCHA的偶联体系降低了His消旋杂质；
本发明Mmt、Mtt保护基脱除需要使用酸性的TFA溶液，脱除反应需重复进行6-12次，增加了操作的复杂性；酸性溶液的使用会腐蚀设备，增加生产成本；酸性溶液的使用可能导致tBu、Boc等弱酸性条件下易脱去保护基的离去，增加副反应的可能性；选用Mmt、Mtt保护基合成索玛鲁肽只能选用耐酸性的Wang树脂，不能选用耐酸性较差的氯树脂，限制了树脂的使用范围；
本发明Dde或ivDde保护基脱除需要使用肼溶液，放大生产中大量使用肼具有较大的安全隐患。
本发明采用侧链片段提高了合成效率，有效的减少偶联合成步骤，降低了由于偶联次数增加导致杂质增加的风险。
本发明的有益效果包括：
1.选用Fmoc-Lys(Alloc)-OH、Boc-His(Trt)-OH和Boc-His(Boc)-OH.DCHA原料进行对应氨基酸偶联；
2.采用特定的偶联方法Boc-His(Boc)-OH.DCHA或Boc-His(Trt)-OH，HOAt/HATU/TMP、HOBt/HBTU/DiPEA或HOBt/PYBOP/DiPEA降低组氨酸消旋风险；
3.采用侧链片段提高了合成效率。采用顺序偶联粗肽合成收率83％，粗肽纯度65.3％，纯化收率23.6％，精肽纯度99.02％；采用片段偶联粗肽合成收率93％，粗肽纯度72.4％，纯化收率34.4％，精肽纯度99.60％。(见实施例17和18)。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1索玛鲁肽的结构及制备工艺；
图2示实施例9制备索玛鲁肽与现有技术(方法1)制备索玛鲁肽过程中偶联His时产生His消旋杂质的检测结果；
图3示实施例10制备索玛鲁肽过程中偶联His时产生His消旋杂质的HPLC检测谱图；
图4示实施例16制备的索玛鲁肽的MALDI-TOF质谱图；
图5示实施例18制备的索玛鲁肽的HPLC谱图；
图6示实施例15制备的索玛鲁肽的MALDI-TOF质谱图；
图7示实施例17制备的索玛鲁肽的MALDI-TOF质谱图；
图8示实施例18制备的索玛鲁肽的MALDI-TOF质谱图。
具体实施方式
本发明公开了一种索玛鲁肽的制备方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明阐述了两种合成索玛鲁肽的方法：
方法1：顺序偶联选择
顺序偶联路线图如下：
Figure PCTCN2016110373-appb-000002
方法2：顺序偶联+片段合成
顺序偶联+片段合成分析示意图
Figure PCTCN2016110373-appb-000003
本发明的合成路线包括以下几个步骤：
1)选择合适的载体，采用固相合成的方法将Fmoc-Gly-OH连接至树脂上；
2)采用顺序偶联的方法依次偶联每个氨基酸；
3)选择氯树脂制备Fmoc-PEG-PEG-γ-Glu-Octadecanedioic Acid的全保护片段，采用重结晶的方法进行纯化
4)Lys26采用Fmoc-Lys(Alloc)-OH为原料，在Pd(PPh3)4和吗啡啉的条件下脱去保护基；
5)H-His7采用Boc-His(Trt)-OH或Boc-His(Boc)-OH.DCHA为原料进行合成；
6)Octadecanedioic Acid的偶联采用十八烷二酸单叔丁酯为原料；
7)肽树脂的裂解
8)粗肽的纯化
所述步骤1)Fmoc-Gly-OH接树脂可以选用wang树脂或2-CTC树脂；
所述步骤1)采用Fmoc-Gly-wang树脂合成时替代度范围为0.1～0.5mmol/g，优选0.25～0.35mmol/g；采用Fmoc-Gly-2-CTC树脂合成时替代度范围为0.2～0.6mmol/g优选0.25～0.45mmol/g；连接Wang树脂采用DIC+A+DMAP，其中A为HOBt或HOAt；连接2-CTC氯树脂采用DiPEA法；
所述步骤2)顺序偶联过程中使用的氨基酸或氨基酸类似物为Fmoc保护氨基酸，其中H-His7采用Boc-His(Trt)-OH或Boc-His(Boc)-OH.DCHA、Lys26采用Fmoc-Lys(Alloc)-OH、Octadecanedioic Acid的偶联采用十八烷二酸单叔丁酯；
所述步骤2)偶联过程中采用DIC+A或B+A+C的方法缩合，反应至茚三酮检测树脂透明；其中A为HOBt或HOAt，B为HBTU、HATU、TBTU、PyAOP或PyBOP，C为DIPEA或TMP；溶剂选用DMF、CH2Cl2、NMP、DMSO或任意的混合溶剂；
所述步骤3)制备PEG-PEG-γ-Glu-Octadecanedioic Acid的全保护片段采用2-CTC氯树脂，裂解采用1-2％的TFA/CH2Cl2或20％的TFE/CH2Cl2；偶联过程中采用DIC+A或B+A+C的方法缩合，反应至茚三酮检测树脂透明；其中A为HOBt或HOAt，B为HBTU、 HATU、TBTU、PyAOP或PyBOP，C为DIPEA或TMP；溶剂选用DMF、CH2Cl2、NMP、DMSO或任意的混合溶剂；
所述步骤3)重结晶选用Et2O、CH2Cl2、CHCl3、MeOH、CH3CN、THF、EtOAc、EtOH、Toluene、Hexane、Actone或任意的混合溶剂，优选MeOH和CH2Cl2的混合溶剂；
所述步骤4)Fmoc-Lys(Alloc)-OH中Alloc的脱除选用0.1-0.3当量的Pd(PPh3)4，5-10当量的吗啡啉或苯硅烷脱除两次，每次10-30分钟，脱除反应中选用CH2Cl2做溶剂；
所述步骤5)选用Boc-His(Trt)-OH偶联优选B+A+C体系；选用Boc-His(Boc)-OH.DCHA偶联优选HOAT+HATU+TMP体系；
所述步骤7)裂解试剂为TFA：PhSMe：PhOMe：EDT：H2O：TIS：PhOH＝80～90:0～5:0～3:0～5:0～5：0～2：0～5(V:V)，优选比例为TFA：PhSMe：PhOH：EDT：H2O＝85:5:3:5:2。
缩写及英文对应的含义见表1。
表1缩写及英文对应的含义
Figure PCTCN2016110373-appb-000004
Figure PCTCN2016110373-appb-000005
本发明提供的索玛鲁肽的制备方法中所用原料及试剂均可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1：Fmoc-Gly-Wang Resin的制备
称取干燥Wang Resin 210g(替代度为0.845mmol/g)加入到固相反应柱中，首先DMF洗涤树脂2遍，再用2～3倍树脂床层体积DMF溶胀树脂30分钟，DMF洗涤3次，DCM洗涤2次，等待投料。
在冰浴冷却的条件下，将105.48g Fmoc-Gly-OH、47.92g HOBt溶于DMF和DCM的混合溶剂中，待氨基酸溶解后，慢慢加入DIC 55ml，活化3min后将反应液倒入反应柱中，加入DMAP2.17g，鼓气搅拌反应2小时；反应结束后，DMF洗涤3遍后，加入适量的乙酸酐和吡啶混合溶液(体积比：Ac2O/Pyridine＝7/6)封闭反应5小时或以上，反应停止后DMF洗涤6遍，甲醇收缩两遍，减压干燥得替代度为0.496mmol/g的Fmoc-Gly-Wang Resin。
实施例2：Fmoc-Gly-Wang Resin的制备
称取干燥Wang Resin 218g(替代度为0.845mmol/g)加入到固相反应柱中，首先DMF洗涤树脂2遍，再用2～3倍树脂床层体积DMF 溶胀树脂30分钟，DMF洗涤3次，DCM洗涤2次，等待投料。
在冰浴冷却的条件下，将26.88g Fmoc-Gly-OH、12.03g HOBt溶于DMF和DCM的混合溶剂中，待氨基酸溶解后，慢慢加入DIC 11ml，活化3min后将反应液倒入反应柱中，加入DMAP1.12g，鼓气搅拌反应45min；反应结束后，DMF洗涤3遍后，加入适量的乙酸酐和吡啶混合溶液(体积比：Ac2O/Pyridine＝7/6)封闭反应过夜，反应停止后DMF洗涤6遍，甲醇收缩两遍，减压干燥得替代度为0.108mmol/g的Fmoc-Gly-Wang Resin。
实施例3：Fmoc-Gly-Wang Resin的制备
称取干燥Wang Resin 220g(替代度为0.845mmol/g)加入到固相反应柱中，首先DMF洗涤树脂2遍，再用2～3倍树脂床层体积DMF溶胀树脂30分钟，DMF洗涤3次，DCM洗涤2次，等待投料。
在冰浴冷却的条件下，将55.76g Fmoc-Gly-OH、25.11g HOBt溶于DMF和DCM的混合溶剂中，待氨基酸溶解后，慢慢加入DIC 29ml，活化3min后将反应液倒入反应柱中，加入DMAP 2.17g，鼓气搅拌反应90min；反应结束后，DMF洗涤3遍后，加入适量的乙酸酐和吡啶混合溶液(体积比：Ac2O/Pyridine＝7/6)封闭反应过夜，反应停止后DMF洗涤6遍，甲醇收缩两遍，减压干燥得替代度为0.314mmol/g的Fmoc-Gly-Wang Resin。
实施例4：Fmoc-Gly-2-CTC-Resin的制备
称取干燥2-CTC-Resin 198g(替代度为0.568mmol/g)加入到固相反应柱中，首先DMF洗涤树脂2遍，再用2～3倍树脂床层体积DMF溶胀树脂30min，DMF洗涤3次，DCM洗涤2次，等待投料。
在冰浴冷却的条件下，将64.58g Fmoc-Gly-OH、75ml DIPEA溶于DMF和DCM的混合溶剂中，待氨基酸溶解后，慢慢将活化了的Fmoc-Gly-OH加入到反应柱中反应2小时，反应结束后，向反应柱中加入由50mL甲醇和36ml DIPEA组成的封闭液反应30min。DMF洗涤3遍后，甲醇收缩两遍，减压干燥得到的Fmoc-Gly-2-CTC-Resin替代度为0.535mmol/g。
实施例5：Fmoc-Gly-2-CTC-Resin的制备
称取干燥2-CTC-Resin 202g(替代度为0.388mmol/g)加入到固相反应柱中，首先DMF洗涤树脂2遍，再用2～3倍树脂床层体积DMF溶胀树脂30min，DMF洗涤3次，DCM洗涤2次，等待投料。
在冰浴冷却的条件下，将46.75g Fmoc-Gly-OH、54ml DIPEA溶于DMF和DCM的混合溶剂中，待氨基酸溶解后，慢慢将活化了的Fmoc-Gly-OH加入到反应柱中反应2小时，反应结束后，向反应柱中加入由48mL甲醇和26ml DIPEA组成的封闭液继续反应30min。DMF洗涤3遍，甲醇收缩两遍，减压干燥得到Fmoc-Gly-2-CTC-Resin的替代度为0.368mmol/g。
实施例6：Fmoc-Gly-2-CTC-Resin的制备
称取干燥2-CTC-Resin 216g(替代度为0.388mmol/g)加入到固相反应柱中，首先DMF洗涤树脂2遍，再用2～3倍树脂床层体积DMF溶胀树脂30min，DMF洗涤3次，DCM洗涤2次，等待投料。
在冰浴冷却的条件下，将25.16g Fmoc-Gly-OH、28ml DIPEA溶于DMF和DCM的混合溶剂中，待氨基酸溶解后，慢慢将活化了的Fmoc-Gly-OH加入到反应柱中反应2小时，反应结束后，向反应柱中加入由45mL甲醇和15ml DIPEA组成的封闭液继续反应30min。DMF洗涤3遍，甲醇收缩两遍，减压干燥得到Fmoc-Gly-2-CTC-Resin替代度为0.211mmol/g。
实施例7：肽树脂片段PEG-PEG-γ-Glu-Octadecanedioic Acid mon-tert-butyl ester的裂解
称取干燥2-CTC-Resin 239g(替代度为0.568mmol/g)加入到固相反应柱中，首先DMF洗涤树脂2遍，再用2～3倍树脂床层体积DMF溶胀树脂30min，DMF洗涤3次，DCM洗涤2次，等待投料。
在冰浴冷却的条件下，将104.6g Fmoc-PEG-OH、94ml DIPEA溶于DMF和DCM的混合溶剂中，待氨基酸溶解后，慢慢将活化了的Fmoc-PEG-OH加入到反应柱中反应2小时，反应结束后，向反应柱中加入由65mL甲醇和47ml DIPEA组成的封闭液继续反应30min。DMF 洗涤3遍。
采用常规的氨基酸偶联方法顺序偶联Fmoc-PEG-OH、Fmoc-Glu(OH)-OtBu和十八烷二酸单叔丁酯，偶联结束后甲醇收缩得到肽树脂345g，采用3.5L 1％TFA/CH2Cl2溶液裂解两小时，减压浓缩得到约108g全保护肽。采用甲醇和二氯甲烷的混合溶剂重结晶得到98g全保护肽。MALDI-TOF质谱分子量为[M+H+]＝846.8。
实施例8：肽树脂片段PEG-PEG-γ-Glu-Octadecanedioic Acid mon-tert-butyl ester的偶联
称取干燥2-CTC-Resin 187g(替代度为0.752mmol/g)加入到固相反应柱中，首先DMF洗涤树脂2遍，再用2～3倍树脂床层体积DMF溶胀树脂30min，DMF洗涤3次，DCM洗涤2次，等待投料。
在冰浴冷却的条件下，将108.4g Fmoc-PEG-OH、98ml DIPEA溶于DMF和DCM的混合溶剂中，待氨基酸溶解后，慢慢将活化了的Fmoc-PEG-OH加入到反应柱中反应2小时，反应结束后，向反应柱中加入由60mL甲醇和50ml DIPEA组成的封闭液继续反应30min。DMF洗涤3遍。
采用常规的氨基酸偶联方法顺序偶联Fmoc-PEG-OH、Fmoc-Glu(OH)-OtBu和十八烷二酸单叔丁酯，偶联结束后甲醇收缩得到肽树脂310g，采用3.1L 20％TFE/CH2Cl2溶液裂解两小时，减压浓缩得到约115g全保护肽。采用乙酸乙酯和三氯甲烷的混合溶剂重结晶得到108g全保护肽。MALDI-TOF质谱分子量为[M+H+]＝846.6。
实施例9：索玛鲁肽肽树脂的合成
将实施例1中合成的Fmoc-Gly-Wang树脂用于索玛鲁肽肽树脂的合成。称取替代度为0.496mmol/g的Fmoc-Gly-Wang Resin 202g(100mmol)，DMF溶胀30分钟，按照索玛鲁肽的氨基酸序列依次偶联，偶联过程中氨基酸投料2-5倍当量，采用DIC+A或B+A+C的方法缩合，反应至茚三酮检测树脂透明；其中A为HOBt或HOAt，B为 HBTU、HATU、TBTU、PyAOP或PyBOP，C为DIPEA或TMP；溶剂选用DMF、CH2Cl2、NMP、DMSO或任意的混合溶剂；Boc-His(Trt)-OH偶联采用HOBt/HBTU/DiPEA体系偶联。
取样检测采用Boc-His(Trt)-OH/HOBt/HBTU/DiPEA偶联体系得到粗肽中His消旋杂质峰明显小于文献中采用Boc-His(Boc)-OH偶联体系(HOBt/HBTU/DiPEA)。如图2所示。
方法1：Boc-His(Boc)-OH/HOBt/HBTU/DiPEA体系，His消旋杂质约在2％～3％；
方法2(本发明)：Boc-His(Trt)-OH/HOBt/HBTU/DiPEA体系，His消旋杂质在1％以下；
偶联Lys侧链前采用0.2当量的Pd(PPh3)4、10当量吗啡啉的二氯甲烷溶液脱去Alloc保护基，脱去反应进行两次，每次反应30min；侧链其余氨基酸按照常规方法偶联至透明，偶联完后得到肽树脂826g。
实施例10：索玛鲁肽肽树脂的合成
将实施例2中合成的Fmoc-Gly-Wang树脂用于索玛鲁肽肽树脂的合成。称取替代度为0.108mmol/g的Fmoc-Gly-Wang Resin 200g(21.6mmol)，DMF溶胀30分钟，按照索玛鲁肽的氨基酸序列依次偶联，偶联过程中氨基酸投料2-5倍当量，采用DIC+A或B+A+C的方法缩合，反应至茚三酮检测树脂透明；其中A为HOBt或HOAt，B为HBTU、HATU、TBTU、PyAOP或PyBOP，C为DIPEA或TMP；溶剂选用DMF、CH2Cl2、NMP、DMSO或任意的混合溶剂；Boc-His(Boc)-OH.DCHA偶联采用HOAt/HATU/TMP体系偶联。
偶联Lys侧链前采用0.2当量的Pd(PPh3)4、10当量苯硅烷的二氯甲烷溶液脱去Alloc保护基，脱去反应进行两次，每次反应30min；侧链其余氨基酸按照常规方法偶联至透明，偶联完后得到肽树脂335g。如图3所示。
采用Boc-His(Boc)-OH.DCHA/HOAt/HATU/TMP体系，His消旋杂质0.98％；
实施例11：索玛鲁肽肽树脂的合成
将实施例3中合成的Fmoc-Gly-Wang树脂用于索玛鲁肽肽树脂的合成。称取替代度为0.314mmol/g的Fmoc-Gly-Wang Resin 102g(32mmol)，DMF溶胀30分钟，按照索玛鲁肽的氨基酸序列依次偶联，偶联过程中氨基酸投料2-5倍当量，采用DIC+A或B+A+C的方法缩合，反应至茚三酮检测树脂透明；其中A为HOBt或HOAt，B为HBTU、HATU、TBTU、PyAOP或PyBOP，C为DIPEA或TMP；溶剂选用DMF、CH2Cl2、NMP、DMSO或任意的混合溶剂；Boc-His(Trt)-OH偶联采用HOBt/HBTU/DiPEA或HOBt/PYBOP/DiPEA体系偶联。
偶联Lys侧链前采用0.2当量的Pd(PPh3)4、10当量苯硅烷的二氯甲烷溶液脱去Alloc保护基，脱去反应进行两次，每次反应30min；侧链其余氨基酸偶联采用片段PEG-PEG-γ-Glu-Octadecanedioic Acid mon-tert-butyl ester一次偶联完成，偶联完后得到肽树脂306g。
实施例12：索玛鲁肽肽树脂的合成
将实施例4中合成的Fmoc-Gly-2-CTC树脂用于索玛鲁肽肽树脂的合成。称取替代度为0.535mmol/g的Fmoc-Gly-2-CTC Resin 94g(50mmol)，DMF溶胀30分钟，按照索玛鲁肽的氨基酸序列依次偶联，偶联过程中氨基酸投料2-5倍当量，采用DIC+A或B+A+C的方法缩合，反应至茚三酮检测树脂透明；其中A为HOBt或HOAt，B为HBTU、HATU、TBTU、PyAOP或PyBOP，C为DIPEA或TMP；溶剂选用DMF、CH2Cl2、NMP、DMSO或任意的混合溶剂；Boc-His(Trt)-OH偶联采用HOBt/HBTU/DiPEA或HOBt/PYBOP/DiPEA体系偶联。
偶联Lys侧链前采用0.2当量的Pd(PPh3)4、10当量苯硅烷的二氯甲烷溶液脱去Alloc保护基，脱去反应进行两次，每次反应30min；侧链其余氨基酸按照常规方法偶联至透明，偶联完后得到肽树脂396g。
实施例13：索玛鲁肽肽树脂的合成
将实施例5中合成的Fmoc-Gly-2-CTC树脂用于索玛鲁肽肽树脂的合成。称取替代度为0.368mmol/g的Fmoc-Gly-2-CTC Resin 114g(42mmol)，DMF溶胀30分钟，按照索玛鲁肽的氨基酸序列依次偶联，偶联过程中氨基酸投料2-5倍当量，采用DIC+A或B+A+C的方 法缩合，反应至茚三酮检测树脂透明；其中A为HOBt或HOAt，B为HBTU、HATU、TBTU、PyAOP或PyBOP，C为DIPEA或TMP；溶剂选用DMF、CH2Cl2、NMP、DMSO或任意的混合溶剂；Boc-His(Boc)-OH.DCHA偶联采用HOAt/HATU/TMP体系偶联。
偶联Lys侧链前采用0.2当量的Pd(PPh3)4、10当量吗啡啉的二氯甲烷溶液脱去Alloc保护基，脱去反应进行两次，每次反应30min；侧链其余氨基酸按照常规方法偶联至透明，偶联完后得到肽树脂362g。
实施例14：索玛鲁肽肽树脂的合成
将实施例6中合成的Fmoc-Gly-2-CTC树脂用于索玛鲁肽肽树脂的合成。称取替代度为0.211mmol/g的Fmoc-Gly-2-CTC Resin 95g(20mmol)，DMF溶胀30分钟，按照索玛鲁肽的氨基酸序列依次偶联，偶联过程中氨基酸投料2-5倍当量，采用DIC+A或B+A+C的方法缩合，反应至茚三酮检测树脂透明；其中A为HOBt或HOAt，B为HBTU、HATU、TBTU、PyAOP或PyBOP，C为DIPEA或TMP；溶剂选用DMF、CH2Cl2、NMP、DMSO或任意的混合溶剂；Boc-His(Boc)-OH.DCHA偶联采用HOAt/HATU/TMP体系偶联。
偶联Lys侧链前采用0.2当量的Pd(PPh3)4、10当量吗啡啉的二氯甲烷溶液脱去Alloc保护基，脱去反应进行两次，每次反应30min；侧链其余氨基酸采用片段PEG-PEG-γ-Glu-Octadecanedioic Acid mon-tert-butyl ester一次偶联完成，偶联完后得到肽树脂223g。
实施例15：索玛鲁肽的裂解和纯化
取实施例9中得到的索玛鲁肽Wang树脂400g加入到5L的反应釜中，按TFA：苯甲硫醚：苯甲醚：EDT＝90:5:3:2的体积比配制裂解试剂4L，先将裂解试剂预冻2小时，然后将裂解试剂倒入5L的反应釜中，室温反应2小时。反应结束后，滤除树脂，收集滤液。用少量TFA洗涤树脂，合并滤液，将滤液加入到40L冰冻的无水乙醚中沉淀，离心，无水乙醚洗涤，真空干燥，得到索玛鲁肽粗肽182g，粗肽纯度66.8％，MALDI-TOF：(M+H)+＝4113.9。如图6所示：
称取42.6g索玛鲁肽粗肽，用25％乙腈+75％水的混合溶剂1500mL 溶解，采用Waters 2545RP-HPLC系统，波长218nm，色谱柱为50×250mm反相C18柱，柱温为45℃，常规0.1％TFA/乙腈流动相纯化，收集目的峰组分，得到纯度大于98.5％精肽。精肽溶液采用Waters 2545RP-HPLC系统，色谱柱为50×250mm反相C18柱，0.1％盐酸/乙腈流动相转盐，收集目的峰组分，减压浓缩，冻干得到索玛鲁肽盐酸盐精肽10.86g，HPLC纯度98.98％。
实施例16：索玛鲁肽的裂解和纯化
取实施例11中得到的索玛鲁肽Wang树脂180g加入到3L的反应瓶中，按TFA：苯甲硫醚：水：苯酚：EDT＝82.5:5:5:5:2.5的体积比配制裂解试剂1.8L，先将裂解试剂预冻2小时，然后将裂解试剂倒入3L的反应瓶中，室温反应2小时。反应结束后，滤除树脂，收集滤液。用少量TFA洗涤树脂，合并滤液，将滤液加入到40L冰冻的无水乙醚中沉淀，离心，无水乙醚洗涤，真空干燥，得到索玛鲁肽粗肽101g，粗肽纯度62.6％MALDI-TOF：(M+H)+＝4113.5。如图4所示。
称取49.5g索玛鲁肽粗肽，用25％乙腈+75％水的混合溶剂1500mL溶解，采用Waters 2545RP-HPLC系统，波长218nm，色谱柱为50×250mm反相C18柱，柱温为45℃，常规0.1％TFA/乙腈流动相纯化，收集目的峰组分，得到纯度大于98.5％精肽。精肽溶液采用Waters 2545RP-HPLC系统，色谱柱为50×250mm反相C18柱，0.1％盐酸/乙腈流动相转盐，收集目的峰组分，减压浓缩，冻干得到索玛鲁肽盐酸盐精肽11.12g，HPLC纯度98.86％。
实施例17：索玛鲁肽的裂解和纯化
取实施例13中得到的索玛鲁肽2-CTC树脂203g加入到3L的反应瓶中，按TFA：苯甲硫醚：PhOMe：TIS：EDT＝82.5:5:5:5:2.5的体积比配制裂解试剂1.8L，先将裂解试剂预冻2小时，然后将裂解试剂倒入3L的反应瓶中，室温反应2小时。反应结束后，滤除树脂，收集滤液。用少量TFA洗涤树脂，合并滤液，将滤液加入到40L冰冻的无水乙醚中沉淀，离心，无水乙醚洗涤，真空干燥，得到索玛鲁肽粗肽85g，粗肽纯度65.3％，MALDI-TOF：(M+H)+＝4113.8，如图7所示。
称取40.6g索玛鲁肽粗肽，用25％乙腈+75％水的混合溶剂1500mL溶解，采用Waters 2545RP-HPLC系统，波长218nm，色谱柱为50×250mm反相C18柱，柱温为45℃，NH4Ac乙腈流动相体系纯化，收集目的峰组分，得到纯度大于98.5％精肽。精肽溶液采用Waters 2545RP-HPLC系统，色谱柱为50×250mm反相C18柱，0.1％醋酸/乙腈流动相转盐，收集目的峰组分，减压浓缩，冻干得到索玛鲁肽醋酸盐精肽8.36g，HPLC纯度99.02％。
实施例18：索玛鲁肽的裂解和纯化
取实施例14中得到的索玛鲁肽2-CTC树脂220g加入到3L的反应瓶中，按TFA：H2O：EDT＝90:5:5的体积比配制裂解试剂2.2L，先将裂解试剂预冻2小时，然后将裂解试剂倒入3L的反应瓶中，室温反应2小时。反应结束后，滤除树脂，收集滤液。用少量TFA洗涤树脂，合并滤液，将滤液加入到40L冰冻的无水乙醚中沉淀，离心，无水乙醚洗涤，真空干燥，得到索玛鲁肽粗肽79g，粗肽纯度72.4％，MALDI-TOF：(M+H)+＝4113.5，如图8所示。
称取34.8g索玛鲁肽粗肽，用25％乙腈+75％水的混合溶剂1500mL溶解，采用Waters 2545RP-HPLC系统，波长218nm，色谱柱为50×250mm反相C18柱，柱温为45℃，NaClO4盐和乙腈流动相体系纯化，收集目的峰组分，得到纯度大于98.5％精肽。精肽溶液采用Waters 2545RP-HPLC系统，色谱柱为50×250mm反相C18柱，0.1％三氟乙酸/乙腈流动相转盐，收集目的峰组分，减压浓缩，冻干得到索玛鲁肽盐三氟乙酸盐精肽11.98g，HPLC纯度99.60％，如图5所示。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

  1. 一种索玛鲁肽的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
    步骤1：取Gly采用固相合成方法与树脂偶联；获得Gly-树脂；
    步骤2：取步骤1制得的Gly-树脂，采用顺序偶联的方法按照索玛鲁肽的序列依次偶联氨基酸，裂解、纯化；
    其中，Lys26采用Fmoc-Lys(Alloc)-OH为原料；
    H-His7采用Boc-His(Trt)-OH或Boc-His(Boc)-OH.DCHA为原料进行合成；
    Lys26侧链采用顺序偶联或片段合成的方法制备获得。
  2. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述Lys26侧链的片段合成采用的Fmoc-PEG-PEG-γ-Glu-Octadecanedioic Acid的全保护片段的制备方法为取氯树脂依次偶联Fmoc-PEG-OH、Fmoc-PEG-OH、Fmoc-Glu(OH)-OtBu和十八烷二酸单叔丁酯，裂解、重结晶获得PEG-PEG-γ-Glu-Octadecanedioic Acid mon-tert-butyl ester。
  3. 根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，步骤1中所述树脂选自wang树脂或2-CTC树脂；
    所述wang树脂的替代度为0.1～0.5mmol/g；
    所述2-CTC树脂的替代度为0.2～0.6mmol/g；
    所述wang树脂的偶联采用DIC+A+DMAP，其中A为HOBt或HOAt；
    所述2-CTC树脂的偶联采用DiPEA法。
  4. 根据权利要求1至3任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤2中所述偶联采用DIC+A或B+A+C的方法缩合，反应至茚三酮检测树脂透明；其中A选自HOBt或HOAt，B选自HBTU、HATU、TBTU、PyAOP或PyBOP，C选自DIPEA或TMP；溶剂选自DMF、CH2Cl2、NMP或DMSO中的一种或两者以上的混合物。
  5. 根据权利要求2至4任一项所述的制备方法，其特征在于，所述Lys26侧链的片段合成中偶联采用DIC+A或B+A+C的方法缩合，反应 至茚三酮检测树脂透明；其中A选自HOBt或HOAt，B选自HBTU、HATU、TBTU、PyAOP或PyBOP，C选自DIPEA或TMP；溶剂选自DMF、CH2Cl2、NMP或DMSO中的一种或两者以上的混合物。
  6. 根据权利要求2至5任一项所述的制备方法，其特征在于，所述Lys26侧链的片段合成中裂解采用1～2％的TFA/CH2Cl2(V/V)或20％的TFE/CH2Cl2(V/V)。
  7. 根据权利要求2至6任一项所述的制备方法，其特征在于，所述Lys26侧链的片段合成中重结晶选用Et2O、CH2Cl2、CHCl3、MeOH、CH3CN、THF、EtOAc、EtOH、Toluene、Hexane或Actone中的一种或两者以上的混合物。
  8. 根据权利要求1至7任一项所述的制备方法，其特征在于，所述Fmoc-Lys(Alloc)-OH中Alloc的脱除选用5～10当量的吗啡啉或5～10当量的苯硅烷中的一种与0.1～0.3当量的Pd(PPh3)4脱除两次，每次10～30min，脱除反应中选用CH2Cl2为溶剂。
  9. 根据权利要求1至8任一项所述的制备方法，其特征在于，Boc-His(Trt)-OH偶联选用B+A+C体系；Boc-His(Boc)-OH.DCHA偶联选用HOAT+HATU+TMP体系；
    其中A选自HOBt或HOAt，B选自HBTU、HATU、TBTU、PyAOP或PyBOP，C选自DIPEA或TMP；溶剂选自DMF、CH2Cl2、NMP或DMSO中的一种或两者以上的混合物。
  10. 根据权利要求1至9任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤2中所述裂解采用的试剂包括TFA、PhSMe、PhOMe、EDT、H2O、TIS或PhOH中的一种或两者以上的混合物；
    TFA、PhSMe、PhOMe、EDT、H2O、TIS与PhOH的体积比为80～90:0～5:0～3:0～5:0～5：0～2：0～5。
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