WO2017122635A1

WO2017122635A1 - 固定化ウイルス粒子を含むワクチン

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Publication number: WO2017122635A1
Application number: PCT/JP2017/000485
Authority: WO
Inventors: 浩人小沼; ゆかり鶴留; 千将池田; 亮山上; 和彦来海; 阿部　元治; 彰大渡邉; 有樹大原
Original assignee: Chemo Sero Therapeutic Research Institute Kaketsuken
Current assignee: Chemo Sero Therapeutic Research Institute Kaketsuken
Priority date: 2016-01-15
Filing date: 2017-01-10
Publication date: 2017-07-20
Anticipated expiration: 2018-07-15
Also published as: US10881723B2; JPWO2017122635A1; JP6941566B2; EP3403671B1; EP3403671C0; CN108697786A; AU2017207076B2; TWI781088B; US20190000960A1; TW201733616A; EP3403671A4; CA3010049C; TWI781700B; TW202144003A; KR102405736B1; CA3010049A1; EP3403671A1; KR20180101354A; CN108697786B; AU2017207076A1

Abstract

本発明は、固定化ウイルス粒子を含むワクチンであって、固定化ウイルス粒子の発熱試験におけるウサギ３羽での発熱反応の和が、固定化ウイルス粒子の元となるウイルス粒子又は対応する不活化ウイルス粒子におけるウサギ３羽での発熱反応の和を基準として、８０％未満である、ワクチンに関する。

Description

固定化ウイルス粒子を含むワクチン

　本発明は、固定化ウイルス粒子を含むワクチンに関する。より詳細には、本発明はウイルスの粒子構造を固定化剤で固定化することによって、副反応を抑えた固定化ウイルス粒子を含むワクチンに関する。

　インフルエンザウイルス及び日本脳炎ウイルス等のウイルスによる感染症は、ウイルスの種類、感染した対象によって、重症化する場合がある。このようなウイルスによる感染症に対する防御、予防の方法として、ワクチンの接種等が知られている。

国際公開第２０１６／０１００８１号

Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．２００９　２００（６）８４１－８４８Ｖａｃｃｉｎｅ　２００９　２７（５）７８６－７９１

　インフルエンザウイルス及び日本脳炎ウイルス等のウイルスに対するワクチンは、不活化ワクチンと生ワクチンとの二種類が製造、市販されている。このうち、不活化ワクチンは、精製したウイルス粒子をホルマリン等の不活化剤で処理して調製する全粒子ワクチンと、精製したウイルス粒子を有機溶媒又は界面活性剤で破壊（スプリット化）して調製するスプリットワクチンとに大別される。全粒子ワクチンは免疫原性が高く、感染予防の効果の面では優れている。しかし、全粒子ワクチンは、局所反応及び発熱反応等の副反応が強く出る傾向がある。一方スプリットワクチンは、局所反応が低減され、発熱反応もほとんどないため安全性に優れている。しかし、基礎免疫が成立していない小児又は免疫反応が衰えた高齢者において、スプリットワクチンの免疫原性は低い傾向がある。したがって、スプリットワクチンより優れた有効性（免疫原性）が示され、かつ安全性の高いワクチンの開発が望まれている。

　本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、免疫原性が高く、かつ副反応が抑えられたワクチンの提供を目的とする。

　本発明者らは上記課題を解決するために鋭意研究した結果、驚くべきことにウイルス粒子の粒子構造を破壊（スプリット化）せずに、固定化剤で固定化することによって、本来のウイルス粒子と同等の成分及び構造を保ったウイルス粒子（以下、「固定化ウイルス粒子」という場合がある。）を含むワクチンが、免疫原性試験において同等で、発熱試験等の副反応の成績において優れることを見出し、本発明を完成させるに到った。

　すなわち、本発明は以下の［１］～［１５］を提供する。
［１］固定化ウイルス粒子を含むワクチンであって、
　上記固定化ウイルス粒子の発熱試験におけるウサギ３羽での発熱反応の和が、上記固定化ウイルス粒子の元となるウイルス粒子又は対応する不活化ウイルス粒子におけるウサギ３羽での発熱反応の和を基準として、８０％未満である、ワクチン。
［２］上記固定化ウイルス粒子の発熱試験におけるウサギ３羽での発熱反応の和が、１．３℃以下である、［１］に記載のワクチン。
［３］固定化ウイルス粒子を含むワクチンであって、
　上記固定化ウイルス粒子によって刺激を受けたヒト末梢血単核球から産生される炎症性サイトカインの量が、上記固定化ウイルス粒子の元となるウイルス粒子又は対応する不活化ウイルス粒子によって刺激を受けたヒト末梢血単核球から産生される炎症性サイトカインの量を基準として、８０％未満である、ワクチン。
［４］上記固定化ウイルス粒子の元となるウイルス粒子が、オルソミクソウイルス粒子、フラビウイルス粒子、又はピコルナウイルス粒子を含む、［１］～［３］のいずれかに記載のワクチン。
［５］上記ウイルス粒子が、インフルエンザウイルス粒子、日本脳炎ウイルス粒子、又はＡ型肝炎ウイルス粒子を含む、［４］に記載のワクチン。
［６］上記ウイルス粒子が、インフルエンザウイルス粒子を含む、［５］に記載のワクチン。
［７］上記インフルエンザウイルス粒子が、Ａ型インフルエンザウイルス粒子、又はＢ型インフルエンザウイルス粒子を含む、［６］に記載のワクチン。
［８］上記インフルエンザウイルス粒子が、Ｈ１Ｎ１亜型株、Ｈ２Ｎ２亜型株、Ｈ３Ｎ２亜型株、Ｈ３Ｎ８亜型株、Ｈ５Ｎ１亜型株、Ｈ５Ｎ２亜型株、Ｈ５Ｎ６亜型株、Ｈ６Ｎ１亜型株、Ｈ７Ｎ３亜型株、Ｈ７Ｎ７亜型株、Ｈ７Ｎ９亜型株、Ｈ９Ｎ２亜型株、又はＨ１０Ｎ８亜型株に分類されるインフルエンザウイルス粒子を含む、［６］又は［７］に記載のワクチン。
［９］上記ウイルス粒子が、日本脳炎ウイルス粒子を含む、［５］に記載のワクチン。
［１０］上記日本脳炎ウイルス粒子が、北京－１株、中山株、ＳＡ１４－１４－２株、又はＰ３株を含む、［９］に記載のワクチン。
［１１］上記固定化ウイルス粒子の表面のタンパク質の０％～９０％が、固定化されていない、［１］～［１０］のいずれかに記載のワクチン。
［１２］上記固定化ウイルス粒子の元となるウイルス粒子の比活性（抗原含量／タンパク質含量）に対する、上記固定化ウイルス粒子の比活性の相対値が、０％～９５％である、［１］～［１１］のいずれかに記載のワクチン。
［１３］上記固定化ウイルス粒子が、上記固定化ウイルス粒子の元となるウイルス粒子又は対応する不活化ウイルス粒子の粒子径の８０％～１５０％の平均粒子径を有する、［１］～［１２］のいずれかに記載のワクチン。
［１４］上記固定化ウイルス粒子をショ糖密度勾配遠心で測定した場合に、ショ糖濃度３５％以上にピークが検出される、［１］～［１３］のいずれかに記載のワクチン。
［１５］上記固定化ウイルス粒子を高速液体クロマトグラフィーで測定した場合に、単峰性のピークが認められる、［１］～［１４］のいずれかに記載のワクチン。
［１６］マウスに免疫した場合、上記固定化ウイルス粒子に特異的なＩｇＧ１よりも、上記固定化ウイルス粒子に特異的なＩｇＧ２ａを誘導する、［１］～［１５］のいずれかに記載のワクチン。

　さらに本発明は以下の［１７］～［３１］を提供する。
［１７］元となるウイルス粒子又は対応する不活化ウイルス粒子を含む懸濁液に固定化剤を加える工程を含む、固定化ウイルス粒子の製造方法。
［１８］上記固定化剤が、アルデヒド類を含む、［１７］に記載の製造方法。
［１９］上記アルデヒド類が、ホルムアルデヒド、パラホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、及びそれらの組合せからなる群から選択される、［１８］に記載の製造方法。
［２０］上記アルデヒド類が、ホルムアルデヒドを含む、［１９］に記載の製造方法。
［２１］上記ホルムアルデヒドの濃度が、上記懸濁液及び上記固定化剤の全量を基準として、０．００５～０．５ｗ／ｖ％である、［２０］に記載の製造方法。
［２２］上記アルデヒド類が、グルタルアルデヒドを含む、［１９］に記載の製造方法。
［２３］上記グルタルアルデヒドの濃度が、上記懸濁液及び上記固定化剤の全量を基準として、０．００１～０．０６ｗ／ｖ％である、［２２］に記載の製造方法。
［２４］上記固定化剤が、カルボジイミド類を含む、［１７］に記載の製造方法。
［２５］上記カルボジイミド類が、ジシクロヘキシルカルボジイミド、ジイソプロピルカルボジイミド、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩、それらの類縁体及び、それらの組合せからなる群から選択される、［２４］に記載の製造方法。
［２６］上記カルボジイミド類が、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩を含む、［２５］に記載の製造方法。
［２７］上記１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩の濃度が、上記懸濁液及び上記固定化剤の全量を基準として、０．０５～１５００ｍＭである、［２６］に記載の製造方法。
［２８］元となる上記ウイルス粒子が、培養細胞、鶏卵又はマウス脳に感染させて、回収されたウイルス粒子である、［１７］～［２７］のいずれかに記載の製造方法。
［２９］上記培養細胞が、初代細胞、又は株化細胞を含む、［２８］に記載の製造方法。
［３０］上記培養細胞が、Ｖｅｒｏ細胞、又はＭＤＣＫ細胞を含む、［２９］に記載の製造方法。
［３１］［１７］～［３０］のいずれかに記載の製造方法によって得られた固定化ウイルス粒子を加える工程を含む、ワクチンの製造方法。

　本発明によれば、免疫原性が高く、かつ副反応が抑えられたワクチンの提供が可能になる。

固定化インフルエンザウイルス粒子を電子顕微鏡で撮影した写真である（ホルマリン処理）。固定化インフルエンザウイルス粒子を電子顕微鏡で撮影した写真である（グルタルアルデヒド処理）。固定化インフルエンザウイルス粒子を電子顕微鏡で撮影した写真である（ＥＤＣ処理）。固定化日本脳炎ウイルス粒子を電子顕微鏡で撮影した写真である（グルタルアルデヒド処理）。固定化日本脳炎ウイルス粒子を電子顕微鏡で撮影した写真である（ホルマリン処理）。固定化日本脳炎ウイルス粒子を電子顕微鏡で撮影した写真である（ＥＤＣ処理）。

　以下、本発明の好適な実施形態について詳細に説明する。ただし、本発明は以下の実施形態に限定されるものではない。

　（固定化ウイルス粒子を含むワクチン）
　本実施形態に係るワクチンは、固定化ウイルス粒子を含むワクチンであって、上記固定化ウイルス粒子の発熱試験におけるウサギ３羽での発熱反応の和（℃）が、上記固定化ウイルス粒子の元となるウイルス粒子又は対応する不活化ウイルス粒子におけるウサギ３羽での発熱反応の和を基準として、低下している。また、上記ワクチンは、固定化ウイルス粒子によって刺激を受けたヒト末梢血単核球から産生される炎症性サイトカインの量が、上記固定化ウイルス粒子の元となるウイルス粒子又は対応する不活化ウイルス粒子によって刺激を受けたヒト末梢血単核球から産生される炎症性サイトカインの量を基準として、低減している。すなわち、固定化ウイルス粒子を含むワクチンの免疫原性は、スプリットワクチンの免疫原性以上であり、局所反応及び発熱反応等の副反応がスプリットワクチンと同等に抑えられている。他の側面において、固定化ウイルス粒子は、従来の不活化ウイルス粒子を含む全粒子ワクチンと比較して安定性に優れている。

　「固定化ウイルス粒子」とは、宿主への感染能力がなく、ウイルス粒子の表面のタンパク質同士が架橋されることによって粒子構造が固定化されているウイルス粒子を意味する。固定化ウイルス粒子は、元のウイルス粒子又は対応する不活化ウイルス粒子と同等の粒子性を維持するため、免疫原性が高い。固定化ウイルス粒子は、元となるウイルス粒子又は対応する不活化ウイルス粒子を固定化剤で処理することによって得られる。ここで「固定化剤」とは、共有結合によってウイルス粒子のタンパク質同士を架橋する薬剤のことを意味する。例えば、固定化剤は、表面抗原同士、表面抗原とマトリックスタンパク質若しくは膜タンパク質、又は、マトリックスタンパク質同士若しくは膜タンパク質同士を架橋させ、ウイルス粒子の粒子構造を保持する薬剤である。

　「不活化ウイルス粒子」とは、宿主への感染能力がなく、粒子構造が固定化されていないウイルス粒子を意味する。不活化ウイルス粒子は、元となるウイルス粒子を不活化剤で処理することによって得られる。インフルエンザウイルス粒子の場合、不活化ウイルス粒子は、例えば、インフルエンザウイルス粒子を含む懸濁液に、最終濃度が０．０２ｖ／ｖ％（ホルムアルデヒド換算で、０．００７２～０．００７６ｗ／ｖ％）となるようにホルマリン（３６～３８ｗ／ｖ％ホルムアルデヒド水溶液）を添加し、４℃で６週間反応させることによって得られたものであってもよい。日本脳炎ウイルス粒子の場合、不活化ウイルス粒子は、例えば、市販されているＶｅｒｏ細胞培養日本脳炎ワクチン原薬（化学及血清療法研究所製、商品名「エンセバック」、０．０８ｖ／ｖ％ホルマリンで不活化済の日本脳炎ウイルス粒子を含む）であってもよい。

　発熱試験は、生物学的製剤基準（日本国、厚生労働省告示　第１９２号）にて示されている発熱試験法に準じた方法で行われる。「発熱反応」とは、検体を耳静脈内に注射した後に測定したウサギの体温（「測定値」という場合がある。）と、注射する前に測定したウサギの体温（「対照体温」という場合がある。）との差（「差体温」という場合がある。）の最大値を意味する。ここで、差体温が負の値のときは、発熱反応は０と解釈される。

　具体的には、以下の手順で発熱試験が行われる。まず、固定化ウイルス粒子を生理食塩水で希釈し、１ｍＬ中のタンパク質含量を７０μｇ（日本脳炎ウイルス粒子の場合）又は２４０μｇ（インフルエンザウイルス粒子の場合）としたものを試料とする。上記試料を、体重１ｋｇ当たりにつき１～３ｍＬをウサギに接種して、６時間後まで発熱の上昇を観察する。試料を接種する前のウサギの体温（対照体温）と接種した後のウサギの体温との差を求め、その差の最大値をそのウサギの発熱反応とする。同様の試験を３羽のウサギに対して行い、ウサギ３羽の発熱反応の和（℃）を求める。

　上記ワクチンは、固定化ウイルス粒子の発熱試験におけるウサギ３羽での発熱反応の和が、固定化ウイルス粒子の元となるウイルス粒子又は対応する不活化ウイルス粒子におけるウサギ３羽での発熱反応の和を基準として、８０％未満であってもよく、６０％未満であってもよく、４０％未満であってもよく、２０％未満であってもよく、１０％未満であってもよい。下限は特に制限はないが、固定化ウイルス粒子の元となるウイルス粒子又は対応する不活化ウイルス粒子におけるウサギ３羽での発熱反応の和を基準として、０％以上であってもよく、２０％以上であってもよい。発熱反応の和を上記範囲とすることによって、従来の不活化ウイルス粒子を含む全粒子ワクチンと比べて副反応が抑えられたワクチンの提供が可能になる。

　上記ワクチンは、固定化ウイルス粒子の発熱試験におけるウサギ３羽での発熱反応の和が、１．３℃以下であってもよいし、０．９℃以下であってもよいし、０．５℃以下であってもよい。下限は特に制限はないが、０℃以上であってもよいし、０．６℃以上であってもよい。発熱反応の和を上記範囲とすることによって、従来の不活化ウイルス粒子を含む全粒子ワクチンと比べて副反応が抑えられたワクチンの提供が可能になる。

　「炎症性サイトカイン」とは、炎症に伴い産生されるサイトカインの総称であり、例えば、ＩＬ－１β、ＩＬ－６、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－γ等が挙げられる。

　「ヒト末梢血単核球」（ＰＢＭＣ）とは、ヒトの末梢血から得られたリンパ球（Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞等を含む。）及び単球を意味する。

　炎症性サイトカインの量は、欧州薬局方ＭＯＮＯＣＹＴＥ－ＡＣＴＩＶＡＴＩＯＮ　ＴＥＳＴに準じた方法で、ウイルス粒子によってヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を刺激した場合の炎症性サイトカインの産生量を定量することで求められる。上記方法としては、欧州薬局方ＭＯＮＯＣＹＴＥ－ＡＣＴＩＶＡＴＩＯＮ　ＴＥＳＴにおいて、後述する実施例に示される測定条件の変更を行った方法であってもよい。

　上記ワクチンは、固定化ウイルス粒子によって刺激を受けたヒト末梢血単核球から産生される炎症性サイトカインの量が、固定化ウイルス粒子の元となるウイルス粒子又は対応する不活化ウイルス粒子によって刺激を受けたヒト末梢血単核球から産生される炎症性サイトカインの量を基準として、８０％未満であってもよく、６０％未満であってもよく、４０％未満であってもよく、２０％未満であってもよく、１０％未満であってもよい。下限は特に制限はないが、固定化ウイルス粒子の元となるウイルス粒子又は対応する不活化ウイルス粒子によって刺激を受けたヒト末梢血単核球から産生される炎症性サイトカインの量を基準として、０％以上であってもよく、４０％以上であってもよい。固定化ウイルス粒子によって刺激を受けたヒト末梢血単核球から産生される炎症性サイトカインの量を上記範囲とすることによって、従来の不活化ウイルス粒子を含む全粒子ワクチンと比べて副反応が抑えられたワクチンの提供が可能になる。

　炎症性サイトカインがＩＬ－１βである場合、固定化ウイルス粒子によって刺激を受けたヒト末梢血単核球から産生される炎症性サイトカインの濃度は、上記ヒト末梢血単核球を含む培養液を基準として、３０ｐｇ／ｍｌ以下であってもよいし、２０ｐｇ／ｍｌ以下であってもよい。下限は特に制限はないが、０ｐｇ／ｍｌ以上であってもよいし、５ｐｇ／ｍｌ以上であってもよい。固定化ウイルス粒子によって刺激を受けたヒト末梢血単核球から産生される炎症性サイトカインの濃度を上記範囲とすることによって、従来の不活化ウイルス粒子を含む全粒子ワクチンと比べて副反応が抑えられたワクチンの提供が可能になる。

　炎症性サイトカインがＩＬ－６である場合、固定化ウイルス粒子によって刺激を受けたヒト末梢血単核球から産生される炎症性サイトカインの濃度は、上記ヒト末梢血単核球を含む培養液を基準として、５０ｐｇ／ｍｌ以下であってもよいし、４０ｐｇ／ｍｌ以下であってもよい。下限は特に制限はないが、０ｐｇ／ｍｌ以上であってもよいし、５ｐｇ／ｍｌ以上であってもよい。固定化ウイルス粒子によって刺激を受けたヒト末梢血単核球から産生される炎症性サイトカインの濃度を上記範囲とすることによって、従来の不活化ウイルス粒子を含む全粒子ワクチンと比べて副反応が抑えられたワクチンの提供が可能になる。

　固定化ウイルス粒子の元となるウイルス粒子としては、例えば、ポックスウイルス粒子、ヘルペスウイルス粒子、オルソミクソウイルス粒子、パラミクソウイルス粒子、ラブドウイルス粒子、コロナウイルス粒子、アレナウイルス粒子、トガウイルス粒子、フラビウイルス粒子、ブニヤウイルス粒子、レトロウイルス粒子、ヘパドナウイルス粒子、アデノウイルス粒子、パピローマウイルス粒子、パポバウイルス粒子、フィロウイルス粒子、レオウイルス粒子、ピコルナウイルス粒子及びカリシウイルス粒子が挙げられる。上記オルソミクソウイルス粒子は、例えば、インフルエンザウイルス粒子が挙げられる。上記フラビウイルス粒子は、例えば、日本脳炎ウイルス粒子が挙げられる。上記ピコルナウイルス粒子は、例えば、Ａ型肝炎ウイルス粒子が挙げられる。

　インフルエンザウイルス粒子としては、例えば、Ａ型インフルエンザウイルス粒子及びＢ型インフルエンザウイルス粒子が挙げられる。Ａ型インフルエンザウイルス粒子の場合には、例えば、Ｈ１Ｎ１亜型株、Ｈ２Ｎ２亜型株、Ｈ３Ｎ２亜型株、Ｈ３Ｎ８亜型株、Ｈ５Ｎ１亜型株、Ｈ５Ｎ２亜型株、Ｈ５Ｎ６亜型株、Ｈ６Ｎ１亜型株、Ｈ７Ｎ３亜型株、Ｈ７Ｎ７亜型株、Ｈ７Ｎ９亜型株、Ｈ９Ｎ２亜型株、又はＨ１０Ｎ８亜型株に分類されるインフルエンザ粒子が挙げられる。

　日本脳炎ウイルス粒子としては、例えば、日本脳炎ウイルス粒子の北京－１株、中山株（中山－予研株）、又はＳＡ１４－１４－２株及びＰ３株が挙げられる。

　固定化ウイルス粒子は、スプリットワクチンのように粒子構造が破壊されていないため、ウイルス粒子に由来するゲノム核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ等）を含む。ウイルス粒子由来のゲノム核酸はアジュバントとして作用し得る。例えば、不活化ポリオウイルスワクチンにはウイルスゲノムＲＮＡを含むＤ抗原と、ウイルスゲノムＲＮＡを含まないＣ抗原がある。Ｃ抗原は免疫原性が弱くワクチン抗原としての効果を示さない。ワクチン抗原として効果を有する分子種はＤ抗原のみである。このことはワクチンに内包されたウイルスゲノムＲＮＡがその効果の発現に重要であることを示唆している。そのため、本実施形態に係るワクチンは、Ｔｈ１型応答を誘導し得る。スプリットインフルエンザワクチンがＴｈ２型応答を誘導することとは対照的である。マウスにおいてＴｈ１型応答によって誘導されるＩｇＧ２ａサブクラスの抗体は、Ｔｈ２型応答によって誘導されるＩｇＧ１サブクラスの抗体よりもインフルエンザウイルスに対する感染防御能が優れている。このことから、上記ワクチンによる有効性のさらなる向上が期待できる。すなわち、上記ワクチンは、マウスに免疫した場合、固定化ウイルス粒子に特異的なＩｇＧ１よりも、固定化ウイルス粒子に特異的なＩｇＧ２ａを誘導してもよい。

　固定化ウイルス粒子は、ショ糖密度勾配遠心、高速液体クロマトグラフィー、及び／又は動的光散乱法によって測定した場合、元のウイルス粒子又は対応する不活化ウイルス粒子と実質的に同一のパラメーター（例えば、分子量、平均粒子径、密度、ヘマグルチニン（ＨＡ）含量等）であってもよい。

　例えば、固定化ウイルス粒子が、元のウイルス粒子又は対応する不活化ウイルス粒子の粒子径の８０％～１５０％の平均粒子径を有する固定化ウイルス粒子であってもよく、９０％～１４０％の平均粒子径を有する固定化ウイルス粒子であってもよい。日本脳炎ウイルス粒子の場合、固定化ウイルス粒子が、元のウイルス粒子又は対応する不活化ウイルス粒子の粒子径の９０％～１３０％の平均粒子径を有する固定化ウイルス粒子であってもよく、１００％～１２０％の平均粒子径を有する固定化ウイルス粒子であってもよい。

　固定化ウイルス粒子が、インフルエンザウイルス粒子を元とする場合、固定化ウイルス粒子の平均粒子径は、動的光散乱法で測定した場合に１５０ｎｍ前後であってもよく、１２０ｎｍ～１８０ｎｍであってもよく、１３０ｎｍ～１７０ｎｍであってもよい。他の側面において、固定化ウイルス粒子が、インフルエンザウイルス粒子を元とする場合、固定化ウイルス粒子の平均粒子径は、動的光散乱法で測定した場合に１００ｎｍ以上であってもよく、１２０ｎｍ以上であってもよく、１３０ｎｍ以上であってもよく、１５０ｎｍ以上であってもよく、１７０ｎｍ以上であってもよい。上記平均粒子径は、１８０ｎｍ以下であってもよく、１７５ｎｍ以下であってもよく、１７０ｎｍ以下であってもよい。固定化ウイルス粒子が、日本脳炎ウイルス粒子を元とする場合、固定化ウイルス粒子の平均粒子径は、動的光散乱法で測定した場合に９０ｎｍ前後であってもよく、８０ｎｍ～１１０ｎｍであってもよい。他の側面において、固定化ウイルス粒子が、日本脳炎ウイルス粒子を元とする場合、固定化ウイルス粒子の平均粒子径は、動的光散乱法で測定した場合に７０ｎｍ以上であってもよく、８０ｎｍ以上であってもよく、９０ｎｍ以上であってもよい。上記平均粒子径は、１１０ｎｍ以下であってもよく、１００ｎｍ以下であってもよい。

　固定化ウイルス粒子が、エンベロープを有するウイルス粒子を元とする場合、上記固定化ウイルス粒子の脂質成分の含有量は、上記ウイルス粒子の脂質成分の含有量に対して、同等であってもよい。

　固定化ウイルス粒子は、ショ糖密度勾配遠心で測定した場合に、ショ糖濃度３５％以上にピークが検出される固定化ウイルス粒子であってもよく、ショ糖濃度４５％以上５５％以下にピークが検出される固定化ウイルス粒子であってもよい。上記ショ糖濃度は、公知の方法によって求めることが可能である。例えば、固定化ウイルス粒子を含む検体を１５～６０％のショ糖密度勾配に重層し、４℃、１８０００ｒｐｍ（ＲＣＦ＝５７５００（×ｇ））で１６時間、遠心分離を行うことで上記ショ糖濃度を求めることができる。

　固定化ウイルス粒子は、高速液体クロマトグラフィー（サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ））で測定した場合に、単峰性のピークが認められる固定化ウイルス粒子であってもよい。例えば、サイズ排除クロマトグラフィー（商品名：ＴＳＫｇｅｌ　Ｇ６０００ＰＷＸＬ（ＴＯＳＯＨ社製）又はＳｕｐｅｒｏｓｅ　６　１０／３００　ＧＥ（ＧＥヘルスケア社製））を用いて分子量測定を行う場合（溶離液：ＰＢＳ、流速：０．５ｍｌ／ｍｉｎ）、溶出時間１４～１５分付近に単峰性のピークが認められる、日本脳炎ウイルス粒子の固定化ウイルス粒子であってもよく、溶出時間１６～１７分付近に単峰性のピークが認められる、インフルエンザウイルス粒子の固定化ウイルス粒子であってもよい。

　上記ワクチンは、固定化ウイルス粒子の表面のタンパク質の０％～９０％が、固定化されていなくてもよいし、固定化ウイルス粒子の表面のタンパク質の５％～８０％が、固定化されていなくてもよい。

　固定化ウイルス粒子の表面のタンパク質としては、表面抗原、マトリックスタンパク質、膜タンパク質、及びそれらの組合せが挙げられる。

　ウイルス粒子がインフルエンザウイルス粒子である場合、上記表面抗原としては、例えば、ヘマグルチニン（ＨＡ）、ノイラミニダーゼ（ＮＡ）が挙げられる。上記マトリックスタンパク質としては、例えば、Ｍ１タンパク質が挙げられる。上記膜タンパク質としては、例えば、Ｍ２タンパク質が挙げられる。

　ウイルス粒子が日本脳炎ウイルス粒子である場合、上記表面抗原としては、例えば、Ｅタンパク質、Ｍタンパク質が挙げられる。

　固定化されていないタンパク質の割合を算出する方法としては、例えば、対象となるタンパク質の本来の分子量における、固定化前と固定化後のタンパク質の量の変化率（残存率）を求める方法が挙げられる。例えば、固定化ウイルス粒子がインフルエンザウイルス粒子を元とする場合、還元条件下におけるＳＤＳ－ＰＡＧＥ（ポリアクリルアミドゲル電気泳動）を行った後に、ウイルスの構成タンパク質の一つであるＭ１タンパク質のバンドの濃さをデンシトメトリーによって求め、Ｍ１タンパク質の残存率（％）を算出する方法が挙げられる。この場合、固定化剤の濃度が高まるにつれて、Ｍ１タンパク質の残存率が低下する傾向がある。この方法を応用することにより、固定化剤による架橋度分析を行うことができる。

　本実施形態において、固定化ウイルス粒子がインフルエンザウイルス粒子を元とする場合、Ｍ１タンパク質の残存率が５％～９０％である固定化ウイルス粒子であってもよいし、Ｍ１タンパク質の残存率が１０％～８０％である固定化ウイルス粒子であってもよい。言い換えると、Ｍ１タンパク質の５％～９０％が固定化されていなくてもよいし、１０％～８０％が固定化されていなくてもよい。

　架橋度分析は、固定化ウイルス粒子の比活性（抗原含量／タンパク質含量）を求めることより行うこともできる。ウイルス粒子の抗原含量測定に使用されるモノクローナル抗体は、中和エピトープを認識しており、中和エピトープの構造変化が起きると比活性が低下する。この性質を利用して、固定化を行っていないウイルス粒子に対する、固定化ウイルス粒子の比活性の相対値（％）を算出し、架橋度を評価する。本実施形態において、比活性の相対値は０～９５％の範囲である。固定化ウイルス粒子が日本脳炎ウイルスを元とする場合、固定化日本脳炎ウイルス粒子の比活性の相対値は、９０～９５％であってもよく、７０～９０％であってもよく、５０～７０％であってもよい。

　ワクチンに含まれる固定化ウイルス粒子の量は、ウイルスの種類又は投与対象に応じて適宜選択してもよい。例えば、インフルエンザワクチンに含まれる固定化ウイルス粒子の量（濃度）は、ヘマグルチニン濃度として、ウイルス株あたり１～４０μｇＨＡ／ｍＬであってもよい。

　ワクチンは、同じ種類のウイルス又は細菌に由来する抗原を含む、単味ワクチンであってもよい。ワクチンは、複数の種類のウイルス又は細菌に由来する抗原を含む、混合ワクチンであってもよい。ワクチンは、同じ属のウイルス又は細菌であって、複数の種類の型に由来する抗原を含む、多価ワクチンであってもよい。例えば、ワクチンがインフルエンザウイルスワクチンである場合、固定化Ａ型インフルエンザウイルス粒子又は固定化Ｂ型インフルエンザウイルス粒子のいずれかを含んでいてもよく、それらを両者とも含んでいてもよい。ワクチンが日本脳炎ウイルスワクチンである場合、細胞培養由来又はマウス脳由来ウイルスのいずれかを含んでいてもよい。上記インフルエンザウイルスワクチン又は日本脳炎ウイルスワクチンは、他のウイルス又は細菌に由来する抗原を含んでいてもよい。例えば、ジフテリア・百日せき・破傷風・不活化ポリオウイルス混合ワクチン（ＤＰＴ－ＩＰＶワクチン）に混合されていてもよい。

　ワクチンの剤形は、例えば、液状、粉末状（凍結乾燥粉末、乾燥粉末等）、カプセル状、錠剤、凍結状態であってもよい。

　ワクチンは、医薬品として許容されうる担体を含んでいてもよい。上記担体としては、ワクチン製造に通常用いられる担体を制限なく使用することができる。具体的には、上記担体は、食塩水、緩衝食塩水、デキストロース、水、グリセロール、等張水性緩衝液及びそれらの組み合わせが挙げられる。ワクチンは、乳化剤、保存剤（例えば、チメロサール）、等張化剤、ｐＨ調整剤、不活化剤（例えば、ホルマリン）等が、更に適宜配合されてもよい。

　ワクチンの投与経路は、例えば、経皮投与、舌下投与、点眼投与、皮内投与、筋肉内投与、経口投与、経腸投与、経鼻投与、静脈内投与、皮下投与、腹腔内投与、口から肺への吸入投与であってもよい。

　ワクチンの投与方法は、例えば、シリンジ、経皮的パッチ、マイクロニードル、移植可能な徐放性デバイス、マイクロニードルを付けたシリンジ、無針装置、又はスプレーによって投与する方法であってもよい。

　免疫原性をさらに高めるために、ワクチンはアジュバントを含んでもよい。アジュバントとしては、例えば、アルミニウムアジュバント又はスクアレンを含む水中油型乳濁アジュバント（ＡＳ０３、ＭＦ５９等）、ＣｐＧ及び３－Ｏ－脱アシル化－４’－モノホスホリル　ｌｉｐｉｄ　Ａ（ＭＰＬ）等のＴｏｌｌ様受容体のリガンド、サポニン系アジュバント、ポリγ－グルタミン酸等のポリマー系アジュバント、並びに、キトサン及びイヌリン等の多糖類が挙げられる。

　対象となる哺乳動物としては、例えば、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ヤギ、サル、ヒト等が挙げられる。本実施形態に係るワクチンは、ヒトに対して用いられてもよく、５歳未満の小児、６５歳以上の高齢者に対して用いられてもよい。

　ワクチンは、投与の目的、投与方法、投与対象の状態（性別、年齢、体重、病状等）によって異なるが、インフルエンザワクチンがヒトに対して投与される場合、１回当り、３．８μｇＨＡ～３０μｇＨＡの有効成分（固定化ウイルス粒子）が、投与されるように用いられてもよい。

　（固定化ウイルス粒子の製造方法）
　本実施形態に係る固定化ウイルス粒子の製造方法は、元となるウイルス粒子又は対応する不活化ウイルス粒子に対して粒子構造を固定化する工程を含む。

　ワクチンの安全性を高める技術として、従来から、界面活性剤又は有機溶媒を使ってエンベロープを有するウイルス粒子を破壊（スプリット化）する方法が知られている。しかしながら、これらの方法では粒子の崩壊に伴いワクチンの有効性（免疫原性）が低下する傾向がある。上記製造方法では、元となるウイルス粒子又は対応する不活化ウイルス粒子をウイルス粒子タンパク質との共有結合を起こす固定化剤で処理しているため、ウイルス粒子構造が維持され、結果的に、ワクチンの有効性を維持しつつ、安全性を高めることが可能になる。

　上記製造方法には、宿主を培養する工程、ウイルスを宿主へ感染させる工程、宿主内でウイルスを増殖させる工程、宿主からウイルス粒子を回収する工程、又は回収されたウイルス粒子を不活化する工程を更に含んでいてもよい。

　ウイルス粒子は、宿主にウイルス粒子を感染、増殖させた後に、宿主から回収されたウイルス粒子であってもよい。宿主はウイルス粒子の種類に応じて適宜選択してもよい。ウイルス粒子を不活化する方法は公知の方法を用いればよく、例えば、ホルマリン等の不活化剤で不活化する方法が挙げられる。ウイルス粒子がインフルエンザウイルス粒子である場合には、宿主としては例えば、培養細胞、鶏卵及びマウス脳が挙げられる。培養細胞としては、初代細胞でも株化細胞であってもよい。培養細胞としては、例えば、Ｖｅｒｏ細胞及びＭＤＣＫ細胞が挙げられる。

　インフルエンザウイルスの感染、増殖方法としては、鶏卵又はＶｅｒｏ細胞を宿主として用いる方法（Ｖａｃｃｉｎｅ．　１９９８　Ｍａｙ－Ｊｕｎ；１６（９－１０）：９６０－８．）、Ｖｅｒｏ細胞を宿主として用いる方法（Ｖａｃｃｉｎｅ．　２００７　Ａｕｇｕｓｔ　１０；　２５（３２）：　６０２８－６０３６．）、ＭＤＣＫ細胞を宿主として用いる方法（Ｊ　Ｖｉｒｏｌ．　２０１２　Ｎｏｖ；８６（２２）：１２３４１－５０）が、当業者にとって公知の方法である。

　ウイルス粒子の固定化
　上記固定化する工程は、元となるウイルス粒子又は対応する不活化ウイルス粒子を固定化剤で処理する方法が例示され、例えば、元となるウイルス粒子又は対応する不活化ウイルス粒子を含む懸濁液に固定化剤を加える工程が挙げられる。懸濁液中のウイルス粒子の濃度は、ウイルスの種類、固定化剤の種類及びその濃度等に応じて適宜変更してもよい。例えば、懸濁液中のウイルス粒子の濃度は、ウイルス粒子のタンパク質の濃度として、６０～９０μｇ／ｍＬであってもよいし、３００～３０００μｇ／ｍＬであってもよいし、５００～２５００μｇ／ｍＬであってもよい。

　固定化剤の種類は、ウイルスの種類に応じて適宜変更できる。例えば、上記固定化剤は、有機溶媒、アルデヒド類、ジイミドエステル、ビス（３，５－ジブロモサリチル）フマレート（ＤＢＢＦ）、カルボジイミド類、及びそれらの組合せが挙げられる。有機溶媒としては、例えば、メタノール、エタノール、アセトン、及びそれらの組合せが挙げられる。アルデヒド類としては、例えば、ホルムアルデヒド（ＦＡ）（例えば、ホルマリン）、パラホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド（ＧＡ）、及びそれらの組合せが挙げられる。カルボジイミド類としては、例えば、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）、それらの類縁体及びそれらの組合せが挙げられる。

　固定化剤の濃度は、ウイルスの種類、固定化剤の種類に応じて適宜変更してもよい。固定化剤が、ホルムアルデヒドを含む場合、ホルムアルデヒドの濃度は、ウイルス粒子を含む懸濁液及び固定化剤の全量を基準として、０．００５～０．５ｗ／ｖ％であってもよい。上記ホルムアルデヒドの濃度が０．００５ｗ／ｖ％未満である場合、固定化が弱くなり、粒子構造が保持されにくい傾向がある。上記ホルムアルデヒドの濃度が０．５ｗ／ｖ％を超える場合、固定化が強く、架橋による化学修飾が進み過ぎる傾向がある。ＨＡ活性を更に向上させる観点から、ホルムアルデヒドの濃度は、上記懸濁液及び固定化剤の全量を基準として、０．０１～０．５ｗ／ｖ％であってもよく、０．０１８～０．１５２ｗ／ｖ％であってもよく、０．０２９～０．１５２ｗ／ｖ％であってもよく、０．０２９～０．０７６ｗ／ｖ％であってもよい。ホルムアルデヒドを含む固定化剤を用いる方法は、ウイルス粒子がインフルエンザウイルス粒子、日本脳炎ウイルス粒子である場合に用いてもよい。

　固定化剤がホルマリン（３６～３８ｗ／ｖ％ホルムアルデヒド水溶液）である場合、ホルマリン濃度は、上記懸濁液及び固定化剤の全量を基準として、０．０１４～０．４ｖ／ｖ％であってもよく、０．０５～０．４ｖ／ｖ％であってもよく、０．０８～０．４ｖ／ｖ％であってもよく、０．０８～０．２ｖ／ｖ％であってもよい。

　固定化剤が、グルタルアルデヒドを含む場合、グルタルアルデヒドの濃度が、上記懸濁液及び固定化剤の全量を基準として、０．００１～０．０６ｗ／ｖ％であってもよく、０．００２～０．０５ｗ／ｖ％であってもよく、０．００４～０．０２ｗ／ｖ％であってもよく、０．００５～０．０１ｗ／ｖ％であってもよい。上記濃度が０．００１ｗ／ｖ％未満である場合、ウイルス粒子として日本脳炎ウイルス粒子を用いたとき、粒子が凝集する傾向がある。上記濃度が０．０６ｗ／ｖ％を超える場合、ウイルス粒子として日本脳炎ウイルス粒子を用いたとき、主要構造タンパク質であるＥタンパク質のエピトープが失活する傾向がある。固定化剤としてグルタルアルデヒドを用いる方法は、ウイルス粒子がインフルエンザウイルス粒子、日本脳炎ウイルス粒子である場合に用いてもよい。

　固定化剤が、ＥＤＣを含む場合、ＥＤＣの濃度が、上記懸濁液及び固定化剤の全量を基準として、０．０５～１５００ｍＭであってもよく、０．１５～５００ｍＭであってもよく、５～５０ｍＭであってもよい。ＥＤＣを含む固定化剤を用いる方法は、ウイルス粒子がインフルエンザウイルス粒子、日本脳炎ウイルス粒子である場合に用いてもよい。

　固定化剤で処理するときの温度は、ウイルスの種類、固定化剤の種類、固定化剤の濃度等に応じて適宜変更してもよい。上記温度は０℃（氷浴）～３７℃であってもよく、４℃～３７℃であってもよく、２５℃～３７℃であってもよい。

　固定化剤で処理するときの期間（処理時間）は、ウイルスの種類、固定化剤の種類、固定化剤の濃度、処理の温度等に応じて適宜変更してもよい。上記期間は、１日間から４週間であってもよく、３日間から４週間であってもよく、１週間から４週間であってもよい。固定化剤としてＥＤＣを用いる場合、上記期間は、５分間～２４時間であってもよく、０．５時間～２４時間であってもよく、２時間～２０時間であってもよい。

　固定化剤による架橋の進行を止めるために、グリシンなどのアミノ酸を用いてクエンチング処理を行ってもよい。なお、クエンチング処理は、ワクチンの安定性、免疫原性、及び安全性の向上を目的して行うことがある。

　必要に応じて、回収した固定化ウイルス粒子を精製する工程を更に含んでいてもよい。固定化ウイルス粒子を精製する方法としては、公知の方法によって適宜行うことが可能であるが、例えば、限外ろ過膜を用いてろ過する方法が挙げられる。

　本実施形態に係るワクチンの製造方法は、上記固定化ウイルス粒子の製造方法によって得られた固定化ウイルス粒子を加える工程を含む。ワクチンの製造方法には、医薬品として許容されうる担体、乳化剤、保存剤、等張化剤、ｐＨ調整剤、不活化剤等を加える工程をさらに含んでいてもよい。

　ワクチン接種では、実際の感染時と同様の免疫の質と量を対象に付与できることが好ましく、実際の感染によって起こる免疫に対するワクチンによって誘導される免疫の模倣性がその効果を決定する。ワクチン中には感染防御のための抗原としてのウイルスタンパク質が全て含まれていてもよい。ウイルスタンパク質の免疫原性を高めるためのウイルス由来のゲノム核酸の存在、ウイルス粒子の大きさ、形等が、それぞれで免疫応答に働いていることを踏まえれば、最良のワクチンとは実際のウイルスにより近い成分及び構造を有するものであると本発明者らは考えている。本実施形態に係る固定化ウイルス粒子は、固定化剤で固定化するのみで、それ以外は本来のウイルス粒子と同等の成分及び構造を有するため、免疫原性が高く、かつ副反応が抑えられたワクチンの提供が可能になる。

　以下、実施例によって本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に何ら限定されるものではない。

［実施例１］
１．インフルエンザウイルス粒子に由来する抗原の調製
（１）ＦＡ固定化インフルエンザウイルス粒子の調製
ホルムアルデヒド（ＦＡ）処理
　Ａ型インフルエンザウイルスＨ１Ｎ１亜型株（Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９（Ｘ－１７９Ａ）株、以下、「Ａ／ＣＡ株」と記載することがある。）を１１日齢の発育鶏卵の漿尿膜腔内に接種し、３４℃で２日間培養した。得られた漿尿液を清澄化した後、超遠心分離によってインフルエンザウイルス粒子を沈殿させた。上記インフルエンザウイルス粒子をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で再浮遊させて懸濁液を得た。得られた懸濁液をショ糖密度勾配遠心（ＲＣＦ＝５７５００（×ｇ）、１６時間）で遠心分離し、ショ糖濃度が３３％～５０％である画分を回収することによって、インフルエンザ粒子を精製した。精製したインフルエンザウイルス粒子のタンパク質の最終濃度が５００μｇ／ｍＬとなるように、得られた画分を希釈し、懸濁液を得た。その後、最終濃度が０．０５～０．２０ｖ／ｖ％（ホルムアルデヒド換算で、０．０１８～０．０７６ｗ／ｖ％）となるようにホルマリン（３６～３８ｗ／ｖ％ホルムアルデヒド水溶液）を上記懸濁液に添加し、２５℃で１週間反応させた。反応終了後、ＰＢＳで反応液を透析し、ホルムアルデヒドを除くことで、固定化インフルエンザウイルス粒子（以下、「ＦＡ固定化インフルエンザウイルス粒子」と記載することがある。）を得た。

（２）不活化インフルエンザウイルス粒子の調製
　上記懸濁液に、最終濃度が０．０２ｖ／ｖ％（ホルムアルデヒド換算で、０．００７２～０．００７６ｗ／ｖ％）となるようにホルマリン（３６～３８ｗ／ｖ％ホルムアルデヒド水溶液）を添加し、４℃で６週間～８週間反応させた。反応終了後、ＰＢＳで反応液を透析し、ホルムアルデヒドを除くことで不活化インフルエンザウイルス粒子を得た。同様の方法で、他のインフルエンザウイルス株（亜型株）についても不活化インフルエンザウイルス粒子を調製し、実施例１～６において比較対照として使用した。

（３）スプリットインフルエンザウイルス抗原の調製
　比較対照とするスプリットインフルエンザウイルス抗原（以下、「スプリットインフル抗原」と記載することがある。）は、インフルエンザＨＡワクチン（化学及血清療法研究所製、商品名「インフルエンザＨＡワクチン“化血研”」）に含まれる各株の原液を使用した。

２．発熱試験
　生物学的製剤基準（日本国、厚生労働省告示　第１９２号）に準じて、発熱試験を行った。不活化インフルエンザウイルス粒子、ＦＡ固定化インフルエンザウイルス粒子及びスプリットインフル抗原を生理食塩水で希釈し、１ｍＬ中のタンパク質含量を２４０μｇとしたものを試料とした。上記試料を、体重１ｋｇ当たりにつき１～３ｍＬをウサギに接種して、６時間後まで発熱の上昇を観察した。試料を接種する前のウサギの体温（対照体温）と接種した後のウサギの体温との差を求め、その差の最大値をそのウサギの発熱反応とした。同様の試験を３羽のウサギに対して行った。ウサギ３羽の発熱反応の和（℃）を表１に示す。

　ＦＡ固定化インフルエンザウイルス粒子は、いずれも１．３℃以上の発熱反応の和は認められず、不活化インフルエンザウイルス粒子と比較して３℃以上の発熱反応の和の低下が見られた。ＦＡ固定化インフルエンザウイルス粒子は、スプリットインフル抗原と同様、発熱反応の和が十分低いことがわかった。このことからも、ＦＡ固定化インフルエンザウイルス粒子は、スプリットインフル抗原と同様に、高い安全性を有することが示唆された。

３．炎症性サイトカインの産生量の定量
　欧州薬局方ＭＯＮＯＣＹＴＥ－ＡＣＴＩＶＡＴＩＯＮ　ＴＥＳＴに準じた方法で、ホルマリン濃度０．０５ｖ／ｖ％、０．０８ｖ／ｖ％、０．１１ｖ／ｖ％で固定したＦＡ固定化インフルエンザウイルス粒子又は不活化インフルエンザウイルス粒子でヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を刺激した場合の炎症性サイトカイン（ＩＬ－６）の産生量を定量した。具体的には、欧州薬局方ＭＯＮＯＣＹＴＥ－ＡＣＴＩＶＡＴＩＯＮ　ＴＥＳＴにおけるヒトＰＢＭＣを最低４ドナー分プールして使用するところを、１ドナー分に変更して測定した。ＦＡ固定化インフルエンザウイルス粒子及び不活化インフルエンザウイルス粒子のサイトカインの産生量の結果を表２に示す。ＦＡ固定化インフルエンザウイルス粒子におけるＩＬ－６の産生量は、不活化インフルエンザウイルス粒子と比較して十分低いことがわかった。このことから、ＦＡ固定化インフルエンザウイルス粒子は、不活化インフルエンザウイルス粒子と比較して、高い安全性を有することが示唆された。

［実施例２］
物性評価
１．ショ糖密度勾配遠心法による分析
　上記実施例１に準じた方法で、インフルエンザウイルス粒子（Ａ／ＣＡ株）のタンパク質の最終濃度が２５００μｇ／ｍＬとなるように、得られた画分を希釈し懸濁液を得た。その後、最終濃度が０．１２ｖ／ｖ％となるようにホルマリンを上記懸濁液に添加し、２５℃で１週間反応させた。反応液をＰＢＳで透析することによって、ＦＡ固定化インフルエンザウイルス粒子を得た。得られたＦＡ固定化インフルエンザウイルス粒子をショ糖密度勾配遠心法によって分析した。検体を１５～６０％のショ糖密度勾配に重層し、４℃、１８０００ｒｐｍ（５７５００（×ｇ））で１６時間、遠心分離を行った。遠心後、１フラクションあたり０．６ｍＬずつ分画し、各フラクションのショ糖濃度、ＨＡ価及びタンパク質濃度を測定した。Ａ／ＣＡ株（Ｈ１Ｎ１亜型株）の結果を表３に示す。スプリットインフル抗原では、タンパク質がショ糖濃度２５～５０％に幅広く分布し、ウイルス粒子が分解していることが示された。これに対し、ＦＡ固定化インフルエンザウイルス粒子では高いショ糖濃度（４４．３％）に単一ピーク（粒子性）として分画されていることが示された。ＨＡ活性については１０２４０倍であった。

２．電子顕微鏡による解析
　上記ＦＡ固定化インフルエンザウイルス粒子（Ａ／ＣＡ株）の形状をさらに詳細に調べるために、電子顕微鏡による観察を実施した。検体を、グルタルアルデヒドを用いて室温で２０分間固定した。その後、観察用のイオンコートしたシートメッシュ（日新ＥＭ社製）に、固定した検体を載せて約６０秒間静置し、２％リンタングステン酸水溶液でネガティブ染色した。染色した検体を、透過型電子顕微鏡（ＦＥＩカンパニー社製テクナイＧ２：加速電圧１２０ｋＶ）を用いて観察、撮影した。

　ＦＡ固定化インフルエンザウイルス粒子を電子顕微鏡で撮影した写真を図１に示す。ＦＡ固定化インフルエンザウイルス粒子は、不活化インフルエンザウイルス粒子と同様に粒子構造が保たれていた。

３．動的光散乱
　Ａ型インフルエンザウイルスＨ３Ｎ２亜型株（Ａ／Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ／３９／２０１２（Ｘ－２３３Ａ）株、以下、「Ａ／ＮＹ株」と記載することがある。）及びＢ型インフルエンザウイルスビクトリア系統株（Ｂ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／２００８株株、以下、「Ｂ／ＢＲ株」と記載することがある。）を元とするＦＡ固定化インフルエンザウイルス粒子を実施例１に準じた方法で作製し、それぞれの平均粒子径をＺｅｔａｓｉｚｅｒ　Ｎａｎｏ　ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ社製）を用いて解析した。動的光散乱法による液体中の平均粒子径を表４に示す。ＦＡ固定化インフルエンザウイルス粒子は平均粒子径が１４０～１５０ｎｍ前後で単峰性であった。このことから、ＦＡ固定化インフルエンザウイルス粒子の平均粒子径は、不活化インフルエンザウイルス粒子と同等であることがわかった。また、ＦＡ固定化インフルエンザウイルス粒子の粒子構造は保たれており、凝集体のような不純物は認められなかった。

４．分子量分布測定（ＳＥＣ）
　Ｂ型インフルエンザウイルスの山形系統株（Ｂ／Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ／０２／２０１２（ＢＸ－５１Ｂ）株（以下、「Ｂ／ＭＡ株」と記載することがある。））について、上記実施例１に準じた方法でＦＡ固定化インフルエンザウイルス粒子（Ｂ／ＭＡ株）を作製した。Ａ／ＣＡ株（Ｈ１Ｎ１亜型株）、Ａ／ＮＹ株（Ｈ３Ｎ２亜型株）、及びＢ／ＭＡ株（Ｂ型株）について、スプリットインフル抗原、及びＦＡ固定化インフルエンザウイルス粒子の分子量分布測定を、サイズ排除クロマトグラフィー（商品名：ＴＳＫｇｅｌ　Ｇ６０００ＰＷＸＬ（ＴＯＳＯＨ社製））を用いて分子量測定を行った（溶離液にはＰＢＳを用いて、流速は０．５ｍｌ／ｍｉｎで行った。）。その溶出パターンを表５に示す。ＦＡ固定化インフルエンザウイルス粒子は溶出時間１６～１７分付近に単峰性のピークが認められた。一方、同じ株由来のスプリットインフル抗原は溶出時間１９～３０分付近に三峰性のピークが認められた。

５．架橋度による分析
　実施例１で調製したＦＡ固定化インフルエンザウイルス粒子（Ａ／ＣＡ株）について、以下の手順で、固定化剤での架橋度を分析した。まず、検体にＳＤＳ－Ｂｕｆｆｅｒ（終濃度：Ｔｒｉｓ　０．７６ｗ／ｖ％、ＳＤＳ　１ｗ／ｖ％、Ｇｌｙｃｅｒｏｌ　１０ｖ／ｖ％、Ｂｒｏｍｏｐｈｅｎｏｌ　Ｂｌｕｅ（ＢＰＢ）　０．０１ｗ／ｖ％）と２－メルカプトエタノール（終濃度：０．８ｖ／ｖ％）を添加し、６分間煮沸後、ＰＡＧＥＬ　ＮＰＵ－１２．５Ｌ（ＡＴＴＯ社製、商品名）又はＰＡＧＥＬ　ＮＰＵ－Ｒ１２．５Ｌ（ＡＴＴＯ社製、商品名）を用いて、ＳＤＳ－ＰＡＧＥを行った。泳動後、ＣＢＢ（クマシーブリリアントブルー）染色を行い、ＬＡＳ３０００（富士フイルム株式会社製、商品名）にて画像を取り込んだ。固定化剤による架橋が進むと、ウイルスを構成するタンパク質の一つであるＭ１タンパク質は、本来のバンドの位置（２５～３７ｋＤａ）から高分子側へシフトする。そのため、本来の位置に検出されるＭ１タンパク質のバンド（Ｍ１バンド）は薄くなることが示唆されており、これを架橋度の指標とした。具体的には、固定化を行っていないインフルエンザウイルス粒子のＭ１バンドのデンシトメトリー値に対する、各ホルマリン濃度で処理したＦＡ固定化インフルエンザウイルス粒子の、本来の位置に検出されるＭ１バンドのデンシトメトリー値の相対値（％）（以下、この相対値を「Ｍ１タンパク質残存率」（％）と記載することがある。）を算出した。結果を表６に示す。ホルマリン濃度０．０５％、０．０８％、０．１１％、０．１４％で固定したＦＡ固定化インフルエンザウイルス粒子（Ａ／ＣＡ株）のＭ１タンパク質残存率は、それぞれ３５．７％、２３．８％、１１．０％、５．４％であり、ホルマリン濃度が高まるにつれて架橋が促進され、Ｍ１タンパク質残存率が低下することが示唆された。

６．免疫原性１（マウス筋肉内接種）
　ＦＡ固定化インフルエンザウイルス粒子（Ａ／ＣＡ株）における免疫原性を、マウスを用いて評価した。ｄｄＹマウス（雌性、８週齢）に、スプリットインフル抗原、不活化インフルエンザウイルス粒子、又はＦＡ固定化インフルエンザウイルス粒子（Ａ／ＣＡ株）を、タンパク質量として０．８μｇの接種量で筋肉内接種した（一群当たり１３匹）。免疫３週後にマウスを全採血し、安楽死させた。遠心分離によって血清を得て、「病原体検出マニュアル」（国立感染症研究所編）に従って、ＨＩ抗体価を測定した。マウスに筋肉内接種を行った際の免疫原性（ＨＩ抗体価（ＧＭＴ））の結果を表７に示す。ＦＡ固定化インフルエンザウイルス粒子（Ａ／ＣＡ株）は、スプリットインフル抗原と比較して高い免疫原性であり、不活化インフルエンザウイルス粒子と同等の免疫原性であった。

７．免疫原性２（マウス皮内接種）
　ＦＡ固定化インフルエンザウイルス粒子（Ａ／ＣＡ株）における免疫原性を、上記「６．免疫原性１（マウス筋肉内接種）」と同じ手順でマウス皮内接種によって評価した。ｄｄＹマウス（雌性、８週齢）に、スプリットインフル抗原、不活化インフルエンザウイルス粒子、又はＦＡ固定化インフルエンザウイルス粒子を、タンパク質量として０．２μｇの接種量で皮内接種した（一群当たり５匹）。免疫３週後にマウスを全採血し、安楽死させた。遠心分離によって血清を得て、ＨＩ抗体価を測定した。マウスに皮内接種を行った際の免疫原性（ＨＩ抗体価（ＧＭＴ））の結果を表８に示す。ＦＡ固定化インフルエンザウイルス粒子は、スプリットインフル抗原と比較して有意に免疫原性が高く、不活化インフルエンザウイルス粒子と同等の免疫原性であった。

８．免疫原性３（カニクイザル皮下接種）
　Ａ／ＣＡ株（Ｈ１Ｎ１亜型株）、Ａ／ＮＹ株（Ｈ３Ｎ２亜型株）、Ｂ／ＢＲ株及びＢ／ＭＡ株（Ｂ型株）について、スプリットインフル抗原、不活化インフルエンザウイルス粒子、及びＦＡ固定化インフルエンザウイルス粒子の免疫原性を、カニクイザル（雄性又は雌性、１７～２５ヶ月齢）を用いて評価した。スプリットインフル抗原、不活化インフルエンザウイルス粒子、又はＦＡ固定化インフルエンザウイルス粒子を、１群当たり８又は９匹に７．５μｇＨＡ相当（スプリットインフル抗原のＨＡ量に相当するタンパク質量）の接種量で、２１日間隔で２回皮下接種した。２次免疫前、及び２次免疫後２１日目に部分採血した。遠心分離によって血清を得て、「病原体検出マニュアル」（国立感染症研究所編）に従って、ＨＩ抗体価及び中和抗体価を測定した。免疫原性の結果を、表９（２次免疫後２１日目のＨＩ抗体価（ＧＭＴ））、表１０（２次免疫後２１日目の中和抗体価（ＧＭＴ））に示す。ＨＩ抗体価では、ＦＡ固定化インフルエンザウイルス粒子はスプリットインフル抗原と比較して高い免疫原性を有することがわかった。特に、Ｂ／ＭＡ株以外では、スプリットインフル抗原と比較して有意に免疫原性が高かった。中和抗体価においても、ＦＡ固定化インフルエンザウイルス粒子はスプリットインフル抗原と比較してＡ型株及びＢ型株全てにおいて有意に免疫原性が高かった。

９．抗体サブクラス解析
　抗体サブクラス解析として、上記「６．免疫原性１（マウス筋肉内接種）」で得られたＡ／ＣＡ株（Ｈ１Ｎ１亜型株）、及びＢ／ＭＡ株（Ｂ型株）について、マウスの血清中に含まれる、ウイルス抗原に特異的なＩｇＧ１及びＩｇＧ２ａ抗体価を酵素免疫測定（ＥＬＩＳＡ）法によって測定した。その結果、ＦＡ固定化インフルエンザウイルス粒子は、抗原特異的ＩｇＧ１よりも抗原特異的ＩｇＧ２ａを誘導することが示された（表１１、表１２）。これは、不活化インフルエンザウイルス粒子と同様の結果であり、スプリットインフル抗原との比較においても、より強いＩｇＧ２ａ誘導傾向が見られた。この結果から、ＦＡ固定化インフルエンザウイルス粒子は、液性免疫を活性化するが細胞性免疫をほとんど活性化することができないスプリットインフル抗原に比べて、ワクチンの有効性のさらなる向上が期待できる。

１０．ＲＮＡ放出量の評価
　実施例１に準じた方法で調製したＦＡ固定化インフルエンザウイルス粒子（Ａ／ＮＹ株）について、以下の手順で、プロテアーゼ処理中の経時的なＲＮＡ放出量を評価した。まず、ＦＡ固定化インフルエンザウイルス粒子をＰＢＳで希釈し、ＳＤＳとＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ　Ｋを加えて５５℃で反応させ、経時的にＲＮＡを抽出した。ＲＮＡ抽出には、ＴＲＩｚｏｌ　ＬＳ　ＲｅａｇｅｎｔとＰｕｒｅＬｉｎｋ　ＲＮＡ　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔ、ＰｕｒｅＬｉｎｋ　ＤＮａｓｅ　（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、商品名）を用いた。抽出したＲＮＡの含有量は、Ｑｕａｎｔ－ｉＴ　ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ　ＲＮＡ　Ｒｅａｇｅｎｔ　ａｎｄ　Ｋｉｔ　（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、商品名）で測定した。各ＦＡ濃度の経時的なＲＮＡ含量を表１３に示す。その結果、ＦＡ濃度依存的にＲＮＡ放出が徐放化されていることが示された。ＦＡ固定によるＲＮＡ放出の徐放化が、炎症性サイトカイン産生を徐放化させ、高い安全性を生み出していることが示唆された。

［実施例３］
（１）ＧＡ固定化インフルエンザウイルス粒子の調製
１．グルタルアルデヒド（ＧＡ）処理
　Ａ型インフルエンザウイルス（Ｈ３Ｎ２亜型株（Ａ／ＮＹ株））及びＢ型インフルエンザウイルス（Ｂ型ビクトリア系統株（Ｂ／ＢＲ株））を実施例１と同様の方法で培養、精製した。精製した各インフルエンザウイルス粒子のタンパク質の最終濃度が１０００μｇ／ｍＬとなるように、各インフルエンザウイルス粒子を希釈し、懸濁液を得た。次に、１ｗ／ｖ％ＧＡ溶液を用いて、ＧＡ濃度が０．０１６ｗ／ｖ％又は０．００８ｗ／ｖ％となるように希釈した。上記懸濁液と、希釈したＧＡ溶液（０．０１６ｗ／ｖ％又は０．００８ｗ／ｖ％）とを等量混合し、４℃で３日間反応させた。反応終了後、ＰＢＳで反応液を透析し、ＧＡを除くことで、固定化インフルエンザウイルス粒子（以下、「ＧＡ固定化インフルエンザウイルス粒子」と記載することがある。）を得た。得られたＧＡ固定化インフルエンザウイルス粒子（Ａ／ＮＹ株及びＢ／ＢＲ株）の発熱活性を、ウサギ３羽における発熱反応の和で評価する発熱試験、及びヒトＰＢＭＣを刺激した場合の炎症性サイトカインの産生量の定量によって評価した。

２．発熱試験
　実施例１と同様の方法によって、発熱試験を行った。不活化インフルエンザウイルス粒子及びＧＡ固定化インフルエンザウイルス粒子（Ａ／ＮＹ株及びＢ／ＢＲ株）を生理食塩水で希釈し、１ｍＬ中のタンパク質含量を２４０μｇとしたものを試料とした。上記試料を、体重１ｋｇ当たりにつき１ｍＬをウサギに接種して、６時間後まで発熱の上昇を観察した。Ａ／ＮＹ株のウサギ３羽の発熱反応の和（℃）を表１４、Ｂ／ＢＲ株のウサギ３羽の発熱反応の和（℃）を表１５に示す。

　ＧＡ固定化インフルエンザウイルス粒子は、いずれも１．３℃以上の発熱反応の和は認められず、不活化インフルエンザウイルス粒子を基準として２．５℃以上又は３℃以上の発熱反応の和の低下が見られた。ＧＡ固定化インフルエンザウイルス粒子は、発熱反応の和が十分低いことがわかった。このことからも、ＧＡ固定化インフルエンザウイルス粒子は、不活化インフルエンザウイルス粒子と比較して、高い安全性を有することが示唆された。

３．炎症性サイトカインの産生量の定量
　欧州薬局方ＭＯＮＯＣＹＴＥ－ＡＣＴＩＶＡＴＩＯＮ　ＴＥＳＴに準じた方法で、ＧＡ固定化インフルエンザウイルス粒子又は不活化インフルエンザウイルス粒子でヒトＰＢＭＣを刺激した場合のサイトカイン（ＩＬ－１β）の産生量を定量した。具体的には、欧州薬局方ＭＯＮＯＣＹＴＥ－ＡＣＴＩＶＡＴＩＯＮ　ＴＥＳＴにおけるヒトＰＢＭＣを最低４ドナー分プールして使用するところを、１ドナー分に変更して測定した。ＧＡ固定化インフルエンザウイルス粒子（Ａ／ＮＹ株及びＢ／ＢＲ株）のサイトカインの産生量の結果を表１６、表１７に示す。ＧＡ固定化インフルエンザウイルス粒子は、不活化インフルエンザウイルス粒子と比較して、炎症性サイトカインの産生量が十分低いことがわかった。このことから、ＧＡ固定化インフルエンザウイルス粒子は、スプリットインフル抗原と同様に、高い安全性を有することが示唆された。

［実施例４］
物性評価
　上記実施例３で得られたＧＡ固定化インフルエンザウイルス粒子の物性を以下の方法で評価した。

１．電子顕微鏡による解析
　ＧＡ固定化インフルエンザウイルス粒子（Ａ／ＮＹ株）の形状をさらに詳細に調べるために、実施例２と同様の方法で、電子顕微鏡による観察を実施した。代表として、０．００８ｗ／ｖ％のＧＡ濃度で４℃、３日間反応させたＧＡ固定化インフルエンザウイルス粒子（Ａ／ＮＹ株）を撮影した写真を図２に示す。ＧＡ固定化インフルエンザウイルス粒子は粒子構造が保たれており、粒子同士が結合しあった凝集体は認められなかった。

２．動的光散乱
　ＧＡ固定化インフルエンザウイルス粒子の平均粒子径をＺｅｔａｓｉｚｅｒ　Ｎａｎｏ　ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ社製）を用いて解析した。動的光散乱法による液体中の平均粒子径を表１８に示す。ＧＡ固定化インフルエンザウイルス粒子は、平均粒子径が１３０～１６０ｎｍ前後で単峰性であった。このことから、ＧＡ固定化インフルエンザウイルス粒子の平均粒子径は、元となるウイルス粒子と同等であることが確認された。すなわち、ＧＡ固定化インフルエンザウイルス粒子の平均粒子径は単一で変わらないことがわかった。また、ＧＡ固定化インフルエンザウイルス粒子の粒子構造は保たれており、凝集体のような不純物は認められなかった。

３．分子量分布測定（ＳＥＣ）
　ＧＡ固定化インフルエンザウイルス粒子の分子量分布を実施例２と同様の方法（ＳＥＣ）で測定した。その溶出パターンを表１９に示す。スプリットインフル抗原は、溶出時間１６～３０分付近に四峰性のピークが認められた。一方、ＧＡ固定化インフルエンザウイルス粒子は、溶出時間１６～１７分付近に単峰性のピークが認められた。

４．架橋度による分析
　ＧＡ固定化インフルエンザウイルス粒子の固定化剤での架橋度を、実施例２と同様の方法で分析した。Ｂ／ＢＲ株（Ｂ型ビクトリア系統株）の結果を表２０に示す。グルタルアルデヒド濃度０．００４ｗ／ｖ％、０．００８ｗ／ｖ％で固定したＧＡ固定化インフルエンザウイルス粒子のＭ１タンパク質残存率は、それぞれ２３．８％、１０．８％であり、グルタルアルデヒド濃度が高まるにつれて架橋が促進され、Ｍ１タンパク質残存率が低下することがわかった。

５．免疫原性（マウス筋肉内接種）
　ＧＡ固定化インフルエンザウイルス粒子（Ｂ／ＢＲ株）における免疫原性を、以下の手順で評価した。まず、ｄｄＹマウス（雌性、８週齢）に、スプリットインフル抗原、又はＧＡ固定化インフルエンザウイルス粒子をタンパク質量として０．８μｇの接種量で筋肉内接種した（一群当たり１６匹）。免疫３週後にマウスを全採血し、安楽死させた。遠心分離によって血清を得て、中和抗体価を測定した。代表としてＢ／ＢＲ株（Ｂ型ビクトリア系統株）の免疫原性（中和抗体価（ＧＭＴ））の結果を表２１に示す。Ｂ型株の場合、ＧＡ固定化インフルエンザウイルス粒子は、スプリットインフル抗原と比較して高い免疫原性であった。

６．抗体サブクラス解析
　抗体サブクラス解析として、上記「５．免疫原性（マウス筋肉内接種）」で得られたマウスの血清中に含まれる、インフルエンザウイルスの抗原に特異的なＩｇＧ１及びＩｇＧ２ａ抗体価をＥＬＩＳＡ法によって測定した。その結果、スプリットインフル抗原とは対照的に、ＧＡ固定化インフルエンザウイルス粒子は、抗原特異的ＩｇＧ１よりも抗原特異的ＩｇＧ２ａを誘導することが示された（表２２）。これは、不活化インフルエンザウイルス粒子と同様の結果である。この結果から、ＧＡ固定化インフルエンザウイルス粒子は、液性免疫を活性化するが細胞性免疫をほとんど活性化することができないスプリットインフル抗原に比べて、ワクチンの有効性のさらなる向上が期待できる。

［実施例５］
（１）ＥＤＣ固定化インフルエンザウイルス粒子の調製
１．１－エチル－３－［３－ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）処理
　Ａ型インフルエンザウイルス（Ｈ３Ｎ２亜型株（Ａ／ＮＹ株））及びＢ型インフルエンザウイルス（ビクトリア系統株Ｂ／ＢＲ株）を実施例１と同様に培養、精製した。精製した各インフルエンザウイルス粒子のタンパク質の最終濃度がＡ／ＮＹ株は２５００μｇ／ｍＬ、Ｂ／ＢＲ株は５００μｇ／ｍＬとなるように、得られた画分を希釈し、懸濁液を得た。ＥＤＣ溶液を、０．１～４ＭとなるようにＰＢＳで段階希釈し、最終濃度が５０～５００ｍＭとなるように懸濁液に添加し、氷冷（０℃）で、２～２０時間反応させた。反応終了後、ＰＢＳで反応液を透析し、ＥＤＣを除くことで、固定化インフルエンザウイルス粒子（以下、「ＥＤＣ固定化インフルエンザウイルス粒子」と記載することがある。）を得た。得られたＥＤＣ固定化インフルエンザウイルス粒子（Ａ／ＮＹ株、Ｂ／ＢＲ株）の発熱活性を、ウサギ３羽における発熱反応の和で評価する発熱試験、及びヒトＰＢＭＣを刺激した場合の炎症性サイトカインの産生量の定量によって評価した。

２．発熱試験
　実施例１と同様の方法によって、発熱試験を行った。ＥＤＣ固定化インフルエンザウイルス粒子を生理食塩水で希釈し、１ｍＬ中のタンパク質含量を２４０μｇとしたものを試料とした。ＥＤＣ固定化インフルエンザウイルス粒子は、５０ｍＭ又は５００ｍＭのＥＤＣ濃度で、氷冷で２時間反応した後、ＰＢＳで反応液を透析処理した検体を用いた（Ａ／ＮＹ株については、５ｍＭのＥＤＣ濃度も実施した。）。また、Ａ／ＮＹ株については、５ｍＭのＥＤＣ濃度で、４℃で２０時間反応した後、ＰＢＳで反応液を透析処理した検体も用いた。上記試料を、体重１ｋｇ当たりにつき１ｍＬをウサギに接種して、６時間後まで発熱の上昇を観察した。ウサギ３羽の発熱反応の和（℃）を表２３、表２４に示す。

　ＥＤＣ固定化インフルエンザウイルス粒子は、全てのＥＤＣ処理条件で１．３℃以上の発熱反応の和は認めらなかった。このことからも、ＥＤＣ固定化インフルエンザウイルス粒子は、スプリットインフル抗原と同様に、高い安全性を有することが示唆された。

３．炎症性サイトカインの産生量の定量
　欧州薬局方ＭＯＮＯＣＹＴＥ－ＡＣＴＩＶＡＴＩＯＮ　ＴＥＳＴに準じた方法で、ＥＤＣ固定化インフルエンザウイルス粒子又は不活化インフルエンザウイルス粒子でヒトＰＢＭＣを刺激した場合のサイトカイン（ＩＬ－１β及びＩＬ－６）の産生量を定量した。具体的には、欧州薬局方ＭＯＮＯＣＹＴＥ－ＡＣＴＩＶＡＴＩＯＮ　ＴＥＳＴにおけるヒトＰＢＭＣを最低４ドナー分プールして使用するところを、１ドナー分に変更して測定した。Ａ／ＮＹ株及びＢ／ＢＲ株のＥＤＣ固定化インフルエンザウイルス粒子及び不活化インフルエンザウイルス粒子のサイトカインの産生量の結果を表２５、表２６に示す。ＥＤＣ固定化インフルエンザウイルス粒子は、不活化インフルエンザウイルス粒子と比較して、炎症性サイトカイン産生量が十分低いことがわかった。このことから、ＥＤＣ固定化インフルエンザウイルス粒子は、不活化インフルエンザウイルス粒子と比較して、副反応を抑制しやすいことが示唆された。

［実施例６］
物性評価
　上記実施例５で得られたＥＤＣ固定化インフルエンザウイルス粒子の物性を以下の方法で評価した。

１．ショ糖密度勾配遠心法による分析
　実施例２と同様の方法によって、ＥＤＣ固定化インフルエンザウイルス粒子をショ糖密度勾配遠心法によって分析した。代表として、５０ｍＭのＥＤＣ濃度にて、氷冷で２時間反応した後のＥＤＣ固定化インフルエンザウイルス粒子（Ａ／ＮＹ株（Ｈ３Ｎ２亜型株））の結果を表２７に示す。スプリットインフル抗原では、タンパク質がショ糖濃度２５～５０％に幅広く分布し、ウイルス粒子が分解していることが示された。これに対し、ＥＤＣ固定化インフルエンザウイルス粒子では高いショ糖濃度（４７．２％）に単一ピーク（粒子性）として分画されていることが示された。ＨＡ活性については１０２４０倍であった。

２．電子顕微鏡による解析
　ＥＤＣ固定化インフルエンザウイルス粒子の形状を詳細に調べるために、実施例２と同様の方法で、電子顕微鏡による観察を実施した。代表として、５００ｍＭのＥＤＣ濃度にて、氷浴で２時間反応した後のＥＤＣ固定化インフルエンザウイルス粒子を撮影した写真を図３に示す。ＥＤＣ固定化インフルエンザウイルス粒子は粒子構造が保たれており、抗原同士が結合しあった凝集体は認められなかった。

３．動的光散乱
　ＥＤＣ固定化インフルエンザウイルス粒子の平均粒子径をＺｅｔａｓｉｚｅｒ　Ｎａｎｏ　ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ社製）を用いて解析した。動的光散乱法による液体中の平均粒子径を表２８に示す。ＥＤＣ固定化インフルエンザウイルス粒子（Ａ／ＮＹ株（Ｈ３Ｎ２亜型株）、Ｂ／ＢＲ株（Ｂ型株））は、平均粒子径が１３０～１６０ｎｍ前後で単峰性であった。このことから、ＥＤＣ固定化インフルエンザウイルス粒子の平均粒子径は、元となるウイルス粒子と同等であることが確認された。すなわち、ＥＤＣ処理されても固定化インフルエンザウイルス粒子の平均粒子径は単一で変わらないことがわかった。また、ＥＤＣ固定化インフルエンザウイルス粒子の粒子構造は保たれており、凝集体のような不純物は認められなかった。

４．分子量分布測定（ＳＥＣ）
　Ｈ３Ｎ２亜型株（Ａ／ＮＹ株）を元とするＥＤＣ固定化インフルエンザウイルス粒子の分子量分布を測定した。測定は、サイズ排除クロマトグラフィー（商品名：ＴＳＫｇｅｌ　Ｇ６０００ＰＷＸＬ（ＴＯＳＯＨ社製））を用いて行った（溶離液にはＰＢＳを用いて、流速は０．５ｍｌ／ｍｉｎで行った）。その溶出パターンを表２９に示す。スプリットインフル抗原は溶出時間１６～３０分付近に四峰性のピークが認められた。一方、ＥＤＣ固定化インフルエンザウイルス粒子は溶出時間１６～１７分付近に単峰性のピークが認められた。

５．架橋度による分析
　実施例５によって調製したＥＤＣ固定化インフルエンザウイルス粒子の固定化剤での架橋度を実施例２と同様の方法で分析した。Ａ／ＮＹ株（Ｈ３Ｎ２亜型株）の結果を表３０に示す。ＥＤＣ濃度５０ｍＭ、５００ｍＭで固定したＥＤＣ固定化インフルエンザウイルス粒子のＭ１タンパク質残存率（％）は、それぞれ８５．７％、５３．４％であり、ＥＤＣ濃度が高まるにつれて架橋が促進され、Ｍ１タンパク質残存率が低下することがわかった。Ｂ／ＢＲ株（Ｂ型ビクトリア系統株）の結果を表３１に示す。ＥＤＣ濃度５ｍＭ、５０ｍＭ、５００ｍＭで固定したＥＤＣ固定化インフルエンザウイルス粒子のＭ１タンパク質残存率（％）は、それぞれ８５．１％、５６．１％、２７．２％であった。Ａ／ＮＹ株（Ｈ３Ｎ２亜型株）と同様に、ＥＤＣ濃度が高まるにつれて架橋が促進され、Ｍ１タンパク質残存率が低下することがわかった。

６．免疫原性（マウス筋肉内接種）
　ＥＤＣ固定化インフルエンザウイルス粒子における免疫原性を、マウスを用いて評価した。実施例４と同様の方法によって血清を得て、ＨＩ抗体価及び中和抗体価を測定した。代表として５０ｍＭ及び５００ｍＭのＥＤＣ濃度にて、氷浴で２時間反応した後のＥＤＣ固定化インフルエンザウイルス粒子の免疫原性の結果を、表３２（Ａ／ＮＹ株のＨＩ抗体価（ＧＭＴ））、表３３（Ａ／ＮＹ株の中和抗体価（ＧＭＴ））及び表３４（Ｂ／ＢＲ株の中和抗体価（ＧＭＴ））に示す。Ａ／ＮＹ株（Ｈ３Ｎ２亜型株）、及びＢ／ＢＲ株（Ｂ型ビクトリア系統株）の場合、ＥＤＣ固定化インフルエンザウイルス粒子はスプリットインフル抗原と比較し有意に高い免疫原性であった。

７．抗体サブクラス解析
　抗体サブクラス解析として、上記「６．免疫原性（マウス筋肉内接種）」で得られたマウスの血清中に含まれる、ウイルス抗原に特異的なＩｇＧ１及びＩｇＧ２ａ抗体価をＥＬＩＳＡ法によって測定した。その結果、スプリットインフル抗原とは対照的に、ＥＤＣ固定化インフルエンザウイルス粒子は抗原特異的ＩｇＧ１よりも抗原特異的ＩｇＧ２ａを誘導することが示された（表３５、表３６）。この結果から、ＥＤＣ固定化インフルエンザウイルス粒子は、液性免疫を活性化するが細胞性免疫をほとんど活性化することができないスプリットインフル抗原に比べて、ワクチンの有効性のさらなる向上が期待できる。

８．免疫原性（カニクイザル皮下接種）
　ＥＤＣ固定化インフルエンザウイルス粒子における免疫原性を、カニクイザルを用いて以下の手順で評価した。まず、カニクイザル（雄性又は雌性、２９～３５ヶ月齢）に、スプリットインフル抗原、又はＥＤＣ固定化インフルエンザウイルス粒子をＨＡ含量として１５μｇの接種量で皮下接種した（一群当たり８匹）。３週間隔で２回皮下接種し、２次免疫後４週間目に採血した。実施例２と同様の方法によって血清を得て、ＨＩ抗体価及び中和抗体価を測定した。代表として５ｍＭのＥＤＣ濃度にて、４℃で２０時間反応した後のＥＤＣ固定化インフルエンザウイルス粒子の免疫原性のＨＩ抗体価（ＧＭＴ）の結果を表３７に示し、中和抗体価（ＧＭＴ）の結果を表３８に示す。Ａ／ＣＡ株（Ｈ１Ｎ１亜型株）、及びＡ／ＮＹ株（Ｈ３Ｎ２亜型株）、Ｂ／ＭＡ株（Ｂ型山形系統）、Ｂ／ＢＲ株（Ｂ型ビクトリア系統株）において、ＥＤＣ固定化インフルエンザウイルス粒子はスプリットインフル抗原と比較して有意に免疫原性が高かった。

９．苛酷試験前後の安定性（架橋度による分析）
　実施例５によって調製したＥＤＣ固定化インフルエンザウイルス粒子の安定性を、苛酷試験の前後における架橋度の変化を指標として評価した。まず、実施例２と同様の方法によってＭ１タンパク質残存率（％）を算出し、さらに、苛酷試験前のＭ１タンパク質残存率を１００％とした場合の、３７℃、１週間の苛酷試験後のＭ１タンパク質残存率の割合を算出した。Ａ／ＮＹ株（Ｈ３Ｎ２亜型株）の結果を表３９に示す。不活化インフルエンザウイルス粒子の苛酷試験後のＭ１タンパク質残存率は、苛酷試験前に比べて２４％上昇した。一方、ＥＤＣ濃度５０、５００ｍＭで固定したＥＤＣ固定化インフルエンザウイルス粒子の苛酷試験後のＭ１タンパク質残存率は、苛酷試験前に比べてそれぞれ１８％減少し、不活化インフルエンザウイルス粒子よりも変化率が小さく、より安定であることが示唆された。

１０．苛酷試験での安定性（一元放射免疫拡散試験による分析）
　実施例５によって調製したＥＤＣ固定化インフルエンザウイルス粒子の安定性を、苛酷試験の前後におけるＨＡ含量の変化を指標として評価した。まず、一元放射免疫拡散試験（生物学的製剤基準（日本国、厚生労働省告示　第１９２号））によってＨＡ含量を算出し、さらに、苛酷試験前のＨＡ含量を１００％とした場合の、３７℃、１週間の苛酷試験後のＨＡ含量の変化率を算出した。Ａ／ＣＡ株（Ｈ１Ｎ１亜型株）、及びＡ／ＮＹ株（Ｈ３Ｎ２亜型株）、Ｂ／ＭＡ株（Ｂ型山形系統）、Ｂ／ＢＲ株（Ｂ型ビクトリア系統株）の結果を表４０に示す。ＥＤＣ固定化インフルエンザウイルス粒子の苛酷試験後のＨＡ含量の変化率は小さく、安定であることが示唆された。

１１．５℃、１１ヶ月保存下での安定性（架橋度による分析）
　実施例５によって調製したＥＤＣ固定化インフルエンザウイルス粒子の安定性を、５℃、１１ヶ月保存の前後における架橋度の変化を指標として評価した。まず、実施例２と同様の方法によってＭ１タンパク質残存率（％）を算出し、さらに、５℃、１１ヶ月保存前のＭ１タンパク質残存率を１００％とした場合の、５℃、１１ヶ月保存下でのＭ１タンパク質残存率の割合を算出した。Ａ／ＣＡ株（Ｈ１Ｎ１亜型株）、及びＡ／ＮＹ株（Ｈ３Ｎ２亜型株）、Ｂ／ＭＡ株（Ｂ型山形系統）、Ｂ／ＢＲ株（Ｂ型ビクトリア系統株）の結果を表４１に示す。ＥＤＣ固定化インフルエンザウイルス粒子の５℃、１１ヶ月保存下でのＭ１タンパク質残存率の変化率は小さく、安定であることが示唆された。

１２．５℃、１１ヶ月保存下での安定性（一元放射免疫拡散試験による分析）
　実施例５によって調製したＥＤＣ固定化インフルエンザウイルス粒子の安定性を、５℃、１１ヶ月保存の前後におけるＨＡ含量の変化を指標として評価した。まず、一元放射免疫拡散試験（生物学的製剤基準（日本国、厚生労働省告示　第１９２号））によってＨＡ含量を算出し、さらに、５℃、１１ヶ月保存前のＨＡ含量を１００％とした場合の、５℃、１１ヶ月保存下でのＨＡ含量の変化率を算出した。Ａ／ＣＡ株（Ｈ１Ｎ１亜型株）、及びＡ／ＮＹ株（Ｈ３Ｎ２亜型株）、Ｂ／ＭＡ株（Ｂ型山形系統）、Ｂ／ＢＲ株（Ｂ型ビクトリア系統株）の結果を表４２に示す。ＥＤＣ固定化インフルエンザウイルス粒子の５℃、１１ヶ月保存下でのＨＡ含量の変化率は小さく、安定であることが示唆された。

１３．５℃、９ヶ月保存下での安定性（マウス免疫原性（筋肉内接種））
　実施例５によって調製したＥＤＣ固定化インフルエンザウイルス粒子の５℃、９ヶ月保存下での安定性を、マウス免疫原性（筋肉内接種）を用いて評価した。実施例４と同様の方法によって血清を得て、ＨＩ抗体価及び中和抗体価を測定した。代表として５ｍＭのＥＤＣ濃度にて、４℃で２０時間反応した後のＥＤＣ固定化インフルエンザウイルス粒子の免疫原性のＨＩ抗体価（ＧＭＴ）の結果を表４３に示し、中和抗体価（ＧＭＴ）の結果を表４４に示す。Ａ／ＣＡ株（Ｈ１Ｎ１亜型株）、及びＡ／ＮＹ株（Ｈ３Ｎ２亜型株）、Ｂ／ＭＡ株（Ｂ型山形系統）、Ｂ／ＢＲ株（Ｂ型ビクトリア系統株）において、ＥＤＣ固定化インフルエンザウイルス粒子はスプリットインフル抗原と比較して免疫原性が高かった。

１４．５℃、９ヶ月保存下での安定性（抗体サブクラス）
　抗体サブクラス解析として、上記「１３．５℃、９ヶ月保存下での安定性（マウス免疫原性（筋肉内接種））」で得られたマウスの血清中に含まれる、ウイルス抗原に特異的なＩｇＧ１及びＩｇＧ２ａ抗体価をＥＬＩＳＡ法によって測定した。その結果、５℃、９ヶ月保存後においても、スプリットインフル抗原とは対照的に、ＥＤＣ固定化インフルエンザウイルス粒子は抗原特異的ＩｇＧ１よりも抗原特異的ＩｇＧ２ａを誘導することが示された（表４５）。この結果から、ＥＤＣ固定化インフルエンザウイルス粒子が活性化させる細胞性免疫は５℃、９ヶ月保存後も維持されていることが期待できる。

１５．５℃、１０ヶ月保存下での安定性（カニクイザル免疫原性（皮下接種））
　実施例５によって調製したＥＤＣ固定化インフルエンザウイルス粒子の５℃、１０ヶ月保存下での安定性を、カニクイザル免疫原性（皮下接種）を用いて評価した。まず、カニクイザル（雄性又は雌性、２９～３５ヶ月齢）に、スプリットインフル抗原、ＥＤＣ固定化インフルエンザウイルス粒子、及び不活化インフルエンザウイルス粒子をＨＡ含量として１５μｇの接種量で皮下接種した（一群当たり８匹）。３週間隔で２回皮下接種し、２次免疫後４週間目に採血した。実施例２と同様の方法によって血清を得て、ＨＩ抗体価及び中和抗体価を測定した。代表として５ｍＭのＥＤＣ濃度にて、４℃で２０時間反応した後のＥＤＣ固定化インフルエンザウイルス粒子の５℃、１０ヶ月保存下でのＨＩ抗体価（ＧＭＴ）の結果を表４６に示し、中和抗体価（ＧＭＴ）の結果を表４７に示す（表４６、表４７は、それぞれ表３７、表３８の再掲）。Ａ／ＣＡ株（Ｈ１Ｎ１亜型株）、及びＡ／ＮＹ株（Ｈ３Ｎ２亜型株）、Ｂ／ＭＡ株（Ｂ型山形系統）、Ｂ／ＢＲ株（Ｂ型ビクトリア系統株）において、ＥＤＣ固定化インフルエンザウイルス粒子はスプリットインフル抗原と比較して有意に免疫原性が高かった。

１６．ＲＮＡ放出量の評価
　実施例５によって調製したＥＤＣ固定化インフルエンザウイルス粒子のプロテアーゼ処理中の経時的なＲＮＡ放出量を評価した。まず、不活化インフルエンザウイルス粒子及びＥＤＣ固定化インフルエンザウイルス粒子をＰＢＳで希釈し、ＳＤＳとＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ　Ｋを加えて５５℃で反応させ、経時的にＲＮＡを抽出した。ＲＮＡ抽出には、ＴＲＩｚｏｌ　ＬＳ　ＲｅａｇｅｎｔとＰｕｒｅＬｉｎｋ　ＲＮＡ　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔ、ＰｕｒｅＬｉｎｋ　ＤＮａｓｅ　（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、商品名）を用いた。抽出したＲＮＡの含有量は、Ｑｕａｎｔ－ｉＴ　ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ　ＲＮＡ　Ｒｅａｇｅｎｔ　ａｎｄ　Ｋｉｔ　（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、商品名）で測定した。代表として、Ａ／ＮＹ株（Ｈ３Ｎ２亜型株）の結果を表４８に示す。その結果、不活化インフルエンザウイルス粒子に比べて、ＥＤＣ固定化インフルエンザウイルス粒子のＲＮＡ放出が徐放化されていることが示された。

１７．炎症性サイトカイン産生量の評価
　実施例５によって調製したＥＤＣ固定化インフルエンザウイルス粒子の炎症性サイトカインの経時的な産生量を評価した。方法は、欧州薬局方ＭＯＮＯＣＹＴＥ－ＡＣＴＩＶＡＴＩＯＮ　ＴＥＳＴに準じた。具体的には、欧州薬局方ＭＯＮＯＣＹＴＥ－ＡＣＴＩＶＡＴＩＯＮ　ＴＥＳＴにおけるヒトＰＢＭＣを最低４ドナー分プールして使用するところを、１ドナーに変更して測定した。Ａ／ＮＹ株（Ｈ３Ｎ２亜型株）における、不活化インフルエンザウイルス粒子及びＥＤＣ固定化インフルエンザウイルス粒子のＩＬ－１β産生量の経時的変化を表４９に、ＩＬ－６産生量の経時的変化を表５０に示す。また、Ｂ／ＢＲ株（Ｂ型ビクトリア系統株）における、不活化インフルエンザウイルス粒子及びＥＤＣ固定化インフルエンザウイルス粒子のＩＬ－１β産生量の経時的変化を表５１に、ＩＬ－６産生量の経時的変化を表５２に示す。その結果、不活化インフルエンザウイルス粒子に比べて、ＥＤＣ固定化インフルエンザウイルス粒子の炎症性サイトカイン産生が徐放化されていることが示された。つまり、ＥＤＣ固定によって体内でのＲＮＡ放出が徐放化され、炎症性サイトカイン産生を遅延させることで、ＥＤＣ固定化インフルエンザウイルス粒子が高い安全性を有していることが示唆された。

［実施例７］
ＧＡ固定化日本脳炎ウイルス粒子の調製
１．グルタルアルデヒド処理（ウイルス粒子に対して粒子構造を固定化する工程）
　Ｖｅｒｏ細胞培養日本脳炎ワクチン原薬（化学及血清療法研究所製、商品名「エンセバック」、０．０８ｖ／ｖ％ホルマリンで不活化済の日本脳炎ウイルス粒子をタンパク質濃度で６０～９０μｇ／ｍｌ含む。以下、「不活化日本脳炎ウイルス粒子」と記載することがある。）に対して、最終濃度が０．００５～０．０２ｗ／ｖ％となるようにグルタルアルデヒドを添加し、４℃で３日間反応させた。反応終了後、ＰＢＳ様溶液（賦活剤である乳糖（終濃度５ｗ／ｖ％）を添加したＰＢＳ）で、得られた反応液を透析した。透析によって、グルタルアルデヒドを除くことで、固定化日本脳炎ウイルス粒子（以下、「ＧＡ固定化日本脳炎ウイルス粒子」と記載することがある。）を得た。得られたＧＡ固定化日本脳炎ウイルス粒子の発熱活性を、ウサギ３羽における発熱反応の和で評価する発熱試験、ヒトＰＢＭＣを刺激した場合の炎症性サイトカインの産生量の定量によって評価した。

２．発熱試験
　実施例１と同様の方法によって、発熱試験を行った。ＧＡ固定化日本脳炎ウイルス粒子又は不活化日本脳炎ウイルス粒子を生理食塩水で希釈し、１ｍＬ中のタンパク質含量を７０μｇとしたものを試料とした。上記試料を、体重１ｋｇ当たりにつき３ｍＬをウサギに接種して、６時間後まで発熱の上昇を観察した。ウサギ３羽の発熱反応の和（℃）を表５３に示す。代表として、０．０１ｗ／ｖ％のグルタルアルデヒド濃度で４℃、３日間反応後のＧＡ固定化日本脳炎ウイルス粒子を評価した。

　ＧＡ固定化日本脳炎ウイルス粒子は、１．３℃以上の発熱反応の和は認められず、不活化日本脳炎ウイルス粒子と比較して１．６℃以上の発熱反応の和の低下が見られた。このことからも、ＧＡ固定化日本脳炎ウイルス粒子は、高い安全性を有することが示唆された。

３．炎症性サイトカインの産生量の定量
　欧州薬局方ＭＯＮＯＣＹＴＥ－ＡＣＴＩＶＡＴＩＯＮ　ＴＥＳＴに準じた方法で、ＧＡ固定化日本脳炎ウイルス粒子又は不活化日本脳炎ウイルス粒子でヒトＰＢＭＣを刺激した場合のサイトカイン（ＩＬ－１β及びＩＬ－６）の産生量を定量した。具体的には、欧州薬局方ＭＯＮＯＣＹＴＥ－ＡＣＴＩＶＡＴＩＯＮ　ＴＥＳＴにおけるヒトＰＢＭＣを最低４ドナー分プールして使用するところを、１ドナー分に変更して測定した。その結果を表５４に示す。ＧＡ固定化日本脳炎ウイルス粒子は、不活化日本脳炎ウイルス粒子よりも炎症性サイトカインの産生量が十分低いことがわかった。このことからも、ＧＡ固定化日本脳炎ウイルス粒子は、不活化日本脳炎ウイルス粒子よりも高い安全性を有することが示唆された。

［実施例８］
物性評価
　上記実施例７で得られたＧＡ固定化日本脳炎ウイルス粒子の物性を以下の方法で評価した。

１．電子顕微鏡による解析
　ＧＡ固定化日本脳炎ウイルス粒子の形状を詳細に調べるために、実施例２と同様の方法で、電子顕微鏡による観察を実施した。代表として、０．０１ｗ／ｖ％のグルタルアルデヒド濃度で４℃、３日間反応後のＧＡ固定化日本脳炎ウイルス粒子を撮影した写真を図４示す。ＧＡ固定化日本脳炎ウイルス粒子は、グルタルアルデヒドで固定することで不活化日本脳炎ウイルス粒子と同様に粒子構造が保たれていた。

２．動的光散乱
　ＧＡ固定化日本脳炎ウイルス粒子の平均粒子径を、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ　Ｎａｎｏ　ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ社製）を用いて解析した。動的光散乱法による液体中の平均粒子径を表５５に示す。ＧＡ固定化日本脳炎ウイルス粒子は、平均粒子径が約９０ｎｍで単峰性であった。一方、不活化日本脳炎ウイルス粒子は、約８０ｎｍで単峰性であった。また、ＧＡ固定化日本脳炎ウイルス粒子の粒子構造は保たれており、凝集体のような不純物は認められなかった。

３．分子量分布測定（ＳＥＣ）
　ＧＡ固定化日本脳炎ウイルス粒子の分子量分布を測定した。測定は、サイズ排除クロマトグラフィー（商品名：Ｓｕｐｅｒｏｓｅ　６　１０／３００　ＧＥ（ＧＥヘルスケア社製））を用いて行った（溶離液にはＰＢＳを用いて、流速は０．５ｍｌ／ｍｉｎで行った）。その溶出パターンを表５６に示す。ＧＡ固定化日本脳炎ウイルス粒子は、溶出時間１４～１５分付近に単峰性の主ピークが認められた。また、不活化日本脳炎ウイルス粒子も溶出時間１４～１５分付近に単峰性の主ピークが認められた。

４．抗原の含有量
　抗日本脳炎ウイルス抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ法によって、抗原の含有量（抗原含量）を以下の手順で測定した。検体中に含まれるＥ抗原は、抗日本脳炎ウイルスウサギＩｇＧ（一次抗体；ポリクローナル抗体）が結合したマイクロプレートに捕捉される。その後、西洋わさび由来ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を結合した抗日本脳炎ウイルスＥタンパク質モノクローナル抗体（二次抗体；モノクローナル抗体）を反応させることで、プレートに結合した抗Ｅ抗原抗体／Ｅ抗原／二次抗体の複合体が形成される。反応せず残った試薬及び検体を洗浄によって除去し、酵素基質液（ｏ－フェニレンジアミン溶液：ＯＰＤ溶液）と反応させるとＥ抗原複合体上のＨＲＰが反応し、発色が起きる。ＯＰＤの発色の強度は、複合体の量（Ｅ抗原量を反映）に比例することを利用し、Ｅ抗原含量（抗原含量）を測定した。

　ＧＡ固定化日本脳炎ウイルス粒子、及び不活化日本脳炎ウイルス粒子それぞれの抗原含有量を表５７に示す。代表として、０．０１ｗ／ｖ％のグルタルアルデヒド濃度で４℃、３日間反応後のＧＡ固定化日本脳炎ウイルス粒子を評価したところ、不活化日本脳炎ウイルス粒子と同等の抗原が含まれていた。

５．比活性による分析
　実施例７で調製したＧＡ固定化日本脳炎ウイルス粒子について、比活性（抗原含量／タンパク質含量）により、固定化剤での架橋度を評価した。具体的には、抗原含量の測定に使用するモノクローナル抗体（５０３）は、中和エピトープを認識しており、中和エピトープの構造変化が起こると比活性が低下する。固定化を行っていない不活化日本脳炎ウイルス粒子の比活性に対する、各グルタルアルデヒド濃度で処理したＧＡ固定化日本脳炎ウイルス粒子の比活性の相対値（％）（以下、この相対値を「５０３抗体反応率」（％）と記載することがある。）を算出した。結果を表５８に示す。グルタルアルデヒド濃度０．００５ｗ／ｖ％、０．０１ｗ／ｖ％、０．０２ｗ／ｖ％で固定したＧＡ固定化日本脳炎ウイルス粒子の５０３抗体反応率は、それぞれ９５．１％、７４．７％、５５．２％であり、グルタルアルデヒド濃度が高まるにつれて架橋が促進され、５０３抗体エピトープの構造変化による反応率の低下が示唆された。

６．免疫原性（マウス腹腔内接種）
　ｄｄＹマウス（雌性、４週齢）に、代表として、０．００５若しくは０．０１ｗ／ｖ％のグルタルアルデヒド濃度で４℃、３日間反応後のＧＡ固定化日本脳炎ウイルス粒子又は不活化日本脳炎ウイルス粒子を１μｇ又は０．２５μｇの接種量で腹腔内接種した（一群当たり１０匹）。免疫１週間後に再度免疫し、その１週間後にマウスを全採血し、安楽死させた。遠心分離によって血清を得て、群毎に等量ずつプールし、中和抗体価を「病原体検出マニュアル」（国立感染症研究所編）に従って、測定した。５０％プラック減少率から算出した結果を表５９に示す。ＧＡ固定化日本脳炎ウイルス粒子は、不活化日本脳炎ウイルス粒子と比較して同等又はそれ以上の中和抗体価であった。

７．加速試験での安定性（抗原含量）
　最終タンパク質濃度が８μｇ／ｍＬとなるように、ＰＢＳ様溶液でＧＡ固定化日本脳炎ウイルス粒子及び不活化日本脳炎ウイルス粒子を希釈した。抗原含量を指標に、２５℃での保存安定性を評価した。代表として、０．０１ｗ／ｖ％のグルタルアルデヒド濃度で４℃、３日間反応後のＧＡ固定化日本脳炎ウイルス粒子又は不活化日本脳炎ウイルス粒子の結果を表６０に示す。ＧＡ固定化日本脳炎ウイルス粒子は、２５℃保存下では１ヶ月間維持された。一方、不活化日本脳炎ウイルス粒子は、２５℃保存下では低下を示した。ＧＡ固定化日本脳炎ウイルス粒子は、不活化日本脳炎ウイルス粒子と比較し安定性が向上することが示された。

８．加速試験での安定性（動的光散乱）
　最終タンパク質濃度が８μｇ／ｍＬとなるように、ＰＢＳ様溶液でＧＡ固定化日本脳炎ウイルス粒子及び不活化日本脳炎ウイルス粒子を希釈した。Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ　Ｎａｎｏ　ＺＳを用いた動的光散乱法による液体中の平均粒子径を指標に、２５℃での保存安定性を評価した。代表として、０．０１ｗ／ｖ％のグルタルアルデヒド濃度で４℃、３日間反応後のＧＡ固定化日本脳炎ウイルス粒子又は不活化日本脳炎ウイルス粒子の結果を表６１に示す。ＧＡ固定化日本脳炎ウイルス粒子は、２５℃保存下では１ヶ月間維持された。一方、不活化日本脳炎ウイルス粒子は、２５℃保存下では増加を示した。これにより、ＧＡ固定化日本脳炎ウイルス粒子は、不活化日本脳炎ウイルス粒子と比較し安定性が向上することが示された。

９．４℃保存下での安定性（免疫原性）
　最終タンパク質濃度が８μｇ／ｍＬとなるように、ＰＢＳ様溶液でＧＡ固定化日本脳炎ウイルス粒子及び不活化日本脳炎ウイルス粒子を希釈した。マウスでの免疫原性（中和抗体価）を指標に、４℃での保存安定性を評価した。代表として、０．０１ｗ／ｖ％のグルタルアルデヒド濃度で４℃、１５ヶ月間反応後のＧＡ固定化日本脳炎ウイルス粒子又は不活化日本脳炎ウイルス粒子の結果を表６２に示す。０ヶ月と１５ヶ月後で投与量が異なるものの、ＧＡ固定化日本脳炎ウイルス粒子は、４℃保存下では１５ヶ月間維持されることが推察された。一方、不活化日本脳炎ウイルス粒子は、４℃保存下では低下することが推察された。ＧＡ固定化日本脳炎ウイルス粒子は、不活化日本脳炎ウイルス粒子と比較して、安定性が向上することが推察された。

［実施例９］
ＦＡ固定化日本脳炎ウイルス粒子の調製
１．ホルマリン処理（ウイルス粒子に対して粒子構造を固定化する工程）
　不活化日本脳炎ウイルス粒子に対して、最終濃度が０．０１４～０．０４ｖ／ｖ％（ホルムアルデヒド換算で、０．００５～０．０１５ｗ／ｖ％）となるようにホルマリン（３６～３８ｗ／ｖ％ホルムアルデヒド水溶液）を添加し、２５℃で１週間反応させた。反応終了後、ＰＢＳ様溶液で反応液を透析し、ホルマリンを除くことで、固定化日本脳炎ウイルス粒子（以下、「ＦＡ固定化日本脳炎ウイルス粒子」と記載することがある。）を得た。得られたＦＡ固定化日本脳炎ウイルス粒子の発熱活性を、ヒトＰＢＭＣを刺激した場合の炎症性サイトカインの産生量の定量によって評価した。

２．炎症性サイトカインの産生量の定量
　欧州薬局方ＭＯＮＯＣＹＴＥ－ＡＣＴＩＶＡＴＩＯＮ　ＴＥＳＴに準じた方法で、ＦＡ固定化日本脳炎ウイルス粒子又は不活化日本脳炎ウイルス粒子でヒトＰＢＭＣを刺激した場合のサイトカイン（ＩＬ－１β及びＩＬ－６）の産生量を定量した。具体的には、欧州薬局方ＭＯＮＯＣＹＴＥ－ＡＣＴＩＶＡＴＩＯＮ　ＴＥＳＴにおけるヒトＰＢＭＣを最低４ドナー分プールして使用するところを、１ドナー分に変更して測定した。その結果を表６３に示す。ＦＡ固定化日本脳炎ウイルス粒子は、不活化日本脳炎ウイルス粒子よりも炎症性サイトカインの産生量が十分低いことがわかった。このことからも、ＦＡ固定化日本脳炎ウイルス粒子は、不活化日本脳炎ウイルス粒子よりも高い安全性を有することが示唆された。

［実施例１０］
物性評価
　上記実施例９で得られたＦＡ固定化日本脳炎ウイルス粒子の物性を以下の方法で評価した。

１．電子顕微鏡による解析
　ＦＡ固定化日本脳炎ウイルス粒子の形状を詳細に調べるために、実施例２と同様の方法で、電子顕微鏡による観察を実施した。代表として、０．０１４ｖ／ｖ％のホルマリン濃度で２５℃、１週間反応後のＦＡ固定化日本脳炎ウイルス粒子を撮影した写真を示す（図５）。ＦＡ固定化日本脳炎ウイルス粒子は、ホルマリンで固定することで不活化日本脳炎ウイルス粒子と同様に粒子構造が保たれていた。

２．動的光散乱
　ＦＡ固定化日本脳炎ウイルス粒子の平均粒子径を、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ　Ｎａｎｏ　ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ社製）を用いて解析した。動的光散乱法による液体中の平均粒子径を表６４に示す。ＦＡ固定化日本脳炎ウイルス粒子は、平均粒子径が約９０ｎｍで単峰性であった。一方、不活化日本脳炎ウイルス粒子は、約８０ｎｍで単峰性であった。また、ＦＡ固定化日本脳炎ウイルス粒子の粒子構造は保たれており、凝集体のような不純物は認められなかった。

３．分子量分布測定（ＳＥＣ）
　ＦＡ固定化日本脳炎ウイルス粒子の分子量分布を実施例８と同様の方法（ＳＥＣ）で測定した。溶出パターンを表６５に示す。ＦＡ固定化日本脳炎ウイルス粒子は、溶出時間１４～１５分付近に単峰性の主ピークが認められた。また、不活化日本脳炎ウイルス粒子も溶出時間１４～１５分付近に単峰性の主ピークが認められた。

４．抗原の含有量
　抗日本脳炎ウイルス抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ法によって、抗原の含有量（抗原含量）を実施例８と同様の方法で測定した。

　ＦＡ固定化日本脳炎ウイルス粒子、及び不活化日本脳炎ウイルス粒子それぞれの抗原含有量を表６６に示す。代表として、０．０１４ｖ／ｖ％及び０．０２ｖ／ｖ％のホルマリン濃度で２５℃、１週間反応後のＦＡ固定化日本脳炎ウイルス粒子を評価したところ、不活化日本脳炎ウイルス粒子と同等の抗原が含まれていた。

５．免疫原性（マウス腹腔内接種）
　実施例８と同様の方法で、代表として、０．０２ｖ／ｖ％のホルマリン濃度で２５℃、１週間反応後のＦＡ固定化日本脳炎ウイルス粒子の中和抗体価を測定した。５０％プラック減少率から算出した結果を表６７に示す。ＦＡ固定化日本脳炎ウイルス粒子は、不活化日本脳炎ウイルス粒子と比較して同等又はそれ以上の中和抗体価であった。

６．苛酷試験での安定性（抗原含量）
　最終タンパク質濃度が８μｇ／ｍＬとなるようにＰＢＳ様溶液で、ＦＡ固定化日本脳炎ウイルス粒子及び不活化日本脳炎ウイルス粒子を希釈した。抗原含量を指標に、３７℃での保存安定性を評価した。代表として、０．０１４ｖ／ｖ％のホルマリン濃度で２５℃、１週間反応後の結果を表６８に示す。ＦＡ固定化日本脳炎ウイルス粒子は、３７℃保存下では１週間維持された。一方、不活化日本脳炎ウイルス粒子は、３７℃保存下では低下を示した。ＦＡ固定化日本脳炎ウイルス粒子は、不活化日本脳炎ウイルス粒子と比較し安定性が向上することが示された。

［実施例１１］
ＥＤＣ固定化日本脳炎ウイルス粒子の調製
１．１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）処理
　不活化日本脳炎ウイルス粒子に対して、最終濃度が０．１５～１５ｍＭとなるようにＥＤＣを添加し、４℃で２～２０時間反応させた。クエンチング処理を行う場合には、さらにクエンチング剤としてグリシンを、ＥＤＣの８倍量（モル質量比）で反応液に添加した。反応終了後、ＰＢＳ様溶液で反応液を透析し、ＥＤＣ及びグリシンを除くことで、固定化日本脳炎ウイルス粒子（以下、「ＥＤＣ固定化日本脳炎ウイルス粒子」と記載することがある。）を得た。得られたＥＤＣ固定化日本脳炎ウイルス粒子の発熱活性を、ヒトＰＢＭＣを刺激した場合の炎症性サイトカインの産生量の定量によって評価した。

２．炎症性サイトカインの産生量の定量
　欧州薬局方ＭＯＮＯＣＹＴＥ－ＡＣＴＩＶＡＴＩＯＮ　ＴＥＳＴに準じた方法で、代表として、０．１５ｍＭ又は１．５ｍＭのＥＤＣ濃度で４℃、２０時間反応後のＥＤＣ固定化日本脳炎ウイルス粒子又は不活化日本脳炎ウイルス粒子でヒトＰＢＭＣを刺激した場合のサイトカイン（ＩＬ－１β及びＩＬ－６）の産生量を定量した。具体的には、欧州薬局方ＭＯＮＯＣＹＴＥ－ＡＣＴＩＶＡＴＩＯＮ　ＴＥＳＴにおけるヒトＰＢＭＣを最低４ドナー分プールして使用するところを、１ドナー分に変更して測定した。その結果を表６９に示す。ＥＤＣ固定化日本脳炎ウイルス粒子は、不活化日本脳炎ウイルス粒子よりも炎症性サイトカイン産生量が十分低いことがわかった。このことからも、ＥＤＣ固定化日本脳炎ウイルス粒子は、不活化日本脳炎ウイルス粒子よりも高い安全性を有することが示唆された。

［実施例１２］
物性評価
　上記実施例１１で得られたＥＤＣ固定化日本脳炎ウイルス粒子の物性を以下の方法で評価した。

１．電子顕微鏡による解析
　ＥＤＣ固定化日本脳炎ウイルス粒子の形状を詳細に調べるために、実施例２と同様の方法で、電子顕微鏡による観察を実施した。代表として、１．５ｍＭのＥＤＣ濃度で４℃、２０時間反応後のＥＤＣ固定化日本脳炎ウイルス粒子を撮影した写真を図６に示す。ＥＤＣ固定化日本脳炎ウイルス粒子は、ＥＤＣで固定することで不活化日本脳炎ウイルス粒子と同様に粒子構造が保たれていた。

２．動的光散乱
　ＥＤＣ固定化日本脳炎ウイルス粒子の平均粒子径を、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ　Ｎａｎｏ　ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ社製）を用いて解析した。動的光散乱法による液体中の平均粒子径を表７０に示す。ＥＤＣ固定化日本脳炎ウイルス粒子は、平均粒子径が約９０ｎｍで単峰性であった。一方、不活化日本脳炎ウイルス粒子は、約８０ｎｍで単峰性であった。また、ＥＤＣ固定化日本脳炎ウイルス粒子の粒子構造は保たれており、凝集体のような不純物は認められなかった。

３．分子量測定（ＳＥＣ）
　ＥＤＣ固定化日本脳炎ウイルス粒子の分子量分布を実施例８と同様の方法で測定した。溶出パターンを表７１に示す。ＥＤＣ固定化日本脳炎ウイルス粒子は、溶出時間１４～１５分付近に単峰性の主ピークが認められた。また、不活化日本脳炎ウイルス粒子も溶出時間１４～１５分付近に単峰性の主ピークが認められた。

４．抗原の含有量
　抗日本脳炎ウイルス抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ法によって、抗原の含有量（抗原含量）を実施例８と同様の方法で測定した。代表として、１．５ｍＭのＥＤＣ濃度で４℃、２０時間反応後のＥＤＣ固定化日本脳炎ウイルス粒子、及び、不活化日本脳炎ウイルス粒子それぞれの抗原含有量を表７２に示す。ＥＤＣ固定化日本脳炎ウイルス粒子は、不活化日本脳炎ウイルス粒子と同等の抗原が含まれていた。

５．免疫原性（マウス腹腔内接種）
　実施例８と同様の方法で、ＥＤＣ固定化日本脳炎ウイルス粒子の中和抗体価を測定した。５０％プラック減少率から算出した結果を表７３に示す。代表として、１．５ｍＭのＥＤＣ濃度で４℃で２時間反応後にクエンチング剤としてグリシンを、ＥＤＣの８倍量（モル質量比）で反応液に添加したＥＤＣ固定化日本脳炎ウイルス粒子を評価したところ、不活化日本脳炎ウイルス粒子と比較して同等又はそれ以上の中和抗体価であった。

６．安定性（抗原含量）
　最終タンパク質濃度が８μｇ／ｍＬとなるようにＰＢＳ様溶液で、ＥＤＣ固定化日本脳炎ウイルス粒子及び不活化日本脳炎ウイルス粒子を希釈した。抗原含量を指標に、２５℃、３７℃での保存安定性を評価した。結果を表７４、表７５に示す。ＥＤＣ固定化日本脳炎ウイルス粒子は、２５℃保存下では１ヶ月間及び３７℃保存下では１週間維持された。一方、不活化日本脳炎ウイルス粒子は、２５℃保存下、３７℃保存下のいずれにおいても、抗原含量の低下を示した。ＥＤＣ固定化日本脳炎ウイルス粒子は、不活化日本脳炎ウイルス粒子と比較して安定性が向上することが示された。

　本発明は医薬品の分野、特にワクチンの分野において有用である。

Claims

　固定化ウイルス粒子を含むワクチンであって、
　前記固定化ウイルス粒子の発熱試験におけるウサギ３羽での発熱反応の和が、前記固定化ウイルス粒子の元となるウイルス粒子又は対応する不活化ウイルス粒子におけるウサギ３羽での発熱反応の和を基準として、８０％未満である、ワクチン。
　前記固定化ウイルス粒子の発熱試験におけるウサギ３羽での発熱反応の和が、１．３℃以下である、請求項１に記載のワクチン。
　固定化ウイルス粒子を含むワクチンであって、
　前記固定化ウイルス粒子によって刺激を受けたヒト末梢血単核球から産生される炎症性サイトカインの量が、前記固定化ウイルス粒子の元となるウイルス粒子又は対応する不活化ウイルス粒子によって刺激を受けたヒト末梢血単核球から産生される炎症性サイトカインの量を基準として、８０％未満である、ワクチン。
　前記固定化ウイルス粒子の元となるウイルス粒子が、オルソミクソウイルス粒子、フラビウイルス粒子、又はピコルナウイルス粒子を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載のワクチン。
　前記ウイルス粒子が、インフルエンザウイルス粒子、日本脳炎ウイルス粒子、又はＡ型肝炎ウイルス粒子を含む、請求項４に記載のワクチン。
　前記ウイルス粒子が、インフルエンザウイルス粒子を含む、請求項５に記載のワクチン。
　前記インフルエンザウイルス粒子が、Ａ型インフルエンザウイルス粒子、又はＢ型インフルエンザウイルス粒子を含む、請求項６に記載のワクチン。
　前記インフルエンザウイルス粒子が、Ｈ１Ｎ１亜型株、Ｈ２Ｎ２亜型株、Ｈ３Ｎ２亜型株、Ｈ３Ｎ８亜型株、Ｈ５Ｎ１亜型株、Ｈ５Ｎ２亜型株、Ｈ５Ｎ６亜型株、Ｈ６Ｎ１亜型株、Ｈ７Ｎ３亜型株、Ｈ７Ｎ７亜型株、Ｈ７Ｎ９亜型株、Ｈ９Ｎ２亜型株、又はＨ１０Ｎ８亜型株に分類されるインフルエンザウイルス粒子を含む、請求項６又は７に記載のワクチン。
　前記ウイルス粒子が、日本脳炎ウイルス粒子を含む、請求項５に記載のワクチン。
　前記日本脳炎ウイルス粒子が、北京－１株、中山株、ＳＡ１４－１４－２株、又はＰ３株を含む、請求項９に記載のワクチン。
　前記固定化ウイルス粒子の表面のタンパク質の０％～９０％が、固定化されていない、請求項１～１０のいずれか一項に記載のワクチン。
　前記固定化ウイルス粒子の元となるウイルス粒子の比活性（抗原含量／タンパク質含量）に対する、前記固定化ウイルス粒子の比活性の相対値が、０～９５％である、請求項１～１１のいずれか一項に記載のワクチン。
　前記固定化ウイルス粒子が、前記固定化ウイルス粒子の元となるウイルス粒子又は対応する不活化ウイルス粒子の粒子径の８０％～１５０％の平均粒子径を有する、請求項１～１２のいずれか一項に記載のワクチン。
　前記固定化ウイルス粒子をショ糖密度勾配遠心で測定した場合に、ショ糖濃度３５％以上にピークが検出される、請求項１～１３のいずれか一項に記載のワクチン。
　前記固定化ウイルス粒子を高速液体クロマトグラフィーで測定した場合に、単峰性のピークが認められる、請求項１～１４のいずれか一項に記載のワクチン。
　マウスに免疫した場合、前記固定化ウイルス粒子に特異的なＩｇＧ１よりも、前記固定化ウイルス粒子に特異的なＩｇＧ２ａを誘導する、請求項１～１５のいずれか一項に記載のワクチン。
　元となるウイルス粒子又は対応する不活化ウイルス粒子を含む懸濁液に固定化剤を加える工程を含む、固定化ウイルス粒子の製造方法。
　前記固定化剤が、アルデヒド類を含む、請求項１７に記載の製造方法。
　前記アルデヒド類が、ホルムアルデヒド、パラホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、及びそれらの組合せからなる群から選択される、請求項１８に記載の製造方法。
　前記アルデヒド類が、ホルムアルデヒドを含む、請求項１９に記載の製造方法。
　前記ホルムアルデヒドの濃度が、前記懸濁液及び前記固定化剤の全量を基準として、０．００５～０．５ｗ／ｖ％である、請求項２０に記載の製造方法。
　前記アルデヒド類が、グルタルアルデヒドを含む、請求項１９に記載の製造方法。
　前記グルタルアルデヒドの濃度が、前記懸濁液及び前記固定化剤の全量を基準として、０．００１～０．０６ｗ／ｖ％である、請求項２２に記載の製造方法。
　前記固定化剤が、カルボジイミド類を含む、請求項１９に記載の製造方法。
　前記カルボジイミド類が、ジシクロヘキシルカルボジイミド、ジイソプロピルカルボジイミド、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩、それらの類縁体及び、それらの組合せからなる群から選択される、請求項２４に記載の製造方法。
　前記カルボジイミド類が、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩を含む、請求項２５に記載の製造方法。
　前記１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩の濃度が、前記懸濁液及び前記固定化剤の全量を基準として、０．０５～１５００ｍＭである、請求項２６に記載の製造方法。
　元となる前記ウイルス粒子が、培養細胞、鶏卵又はマウス脳に感染させて、回収されたウイルス粒子である、請求項１７～２７のいずれか一項に記載の製造方法。
　前記培養細胞が、初代細胞、又は株化細胞を含む、請求項２８に記載の製造方法。
　前記培養細胞が、Ｖｅｒｏ細胞、又はＭＤＣＫ細胞を含む、請求項２９に記載の製造方法。
　請求項１７～３０のいずれか一項に記載の製造方法によって得られた固定化ウイルス粒子を加える工程を含む、ワクチンの製造方法。