WO2017131154A1 - 食物アレルギーのバイオマーカー、食物アレルギーの検査方法、尿検体検査用キット、及び尿検体検査用スティック - Google Patents

食物アレルギーのバイオマーカー、食物アレルギーの検査方法、尿検体検査用キット、及び尿検体検査用スティック Download PDF

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幸久 村田
達朗 中村
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    • G01N2800/24—Immunology or allergic disorders

Definitions

  • the present invention relates to a food allergy biomarker, a food allergy test method, a urine sample test kit, and a urine sample test stick.
  • Food allergy means various allergic reactions caused by taking allergens contained in food into the body. Symptoms include diarrhea, vomiting, dermatitis, etc., and when severe, it causes shock and death. The incidence of adults in Japan is as high as 2.6%, but it is 5.6% in newborns, which is a serious problem because of the high number of severe cases.
  • the onset mechanism of food allergy is i) T cells and B cells react with allergens that have entered the body to produce IgE, and ii) when allergens enter the body again, mast cells that bind to IgE become histamine, etc. It is known to release active substances (degranulation) and cause strong inflammation.
  • Desensitization therapy seeks to induce immune tolerance by administering to a patient allergens diluted under the supervision of a physician. While many treatment methods for allergic diseases are symptomatic treatments, desensitization therapy is attracting attention because it works on the mechanism of action of allergic diseases and aims to cure them. In desensitization therapy, start with a very low dose and gradually increase the dose.
  • Non-Patent Document 1 a diagnostic method for measuring blood IgE is used as a diagnostic method for food allergy (see, for example, Non-Patent Document 1).
  • hyposensitization therapy when the allergen dose is gradually increased, a doctor's visual diagnosis is performed so that serious symptoms will not be caused by administering an amount of allergen that exceeds the threshold, but it is arbitrary. Judgment, and cannot make a quantitative diagnosis. Therefore, a method for appropriately evaluating the severity of allergic symptoms in patients is required.
  • the diagnostic method for measuring blood IgE it is not possible to know the risk of onset or the degree of symptoms even though the presence or absence of an allergic reaction can be estimated. That is, the amount of IgE antibody in the blood often does not agree with the risk and severity of food allergy symptoms.
  • this method requires blood collection, it must be performed at a medical institution, and blood collection itself has a heavy burden on infants.
  • the present invention has been made in view of the above circumstances, and provides an inspection method that can easily and appropriately evaluate the risk of developing food allergies, the severity of symptoms, and the prognosis.
  • the present inventors have a very high dependence on mast cells for the onset and progression of food allergies. Therefore, metabolites of physiologically active substances produced by mast cells are Focusing on the fact that it is excreted in the blood and can be detected stably, a comprehensive analysis of lipid concentrations in urine samples was performed. As a result, the present inventors have found a lipid whose content in a urine sample changes with the development of symptoms of food allergy, and has completed the present invention.
  • a biomarker for testing food allergy Leukotriene E 4 (LTE 4), 14,15-LTE 4, 11-trans LTE 4, 11-dehydro Thromboxane B 2 (11-dehydro TXB 2), 2,3-dinor-8-iso Prostaglandin F 2 ⁇ , 13, 14-dihydro-15-keto- tetranor PGF 1 ⁇ , 6,15-diketo-13,14-dihydro PGF 1 ⁇ , tetranor-Prostaglandin F Metabolite (tetranor-PGFM), 20-hydroxy Prostaglandin E 2 (20-OH PGE 2) , PGE 3 , Prostaglandin D 3 (PGD 3 ), 13,14-dihydro-15-keto-te
  • a biomarker comprising at least one selected from the group consisting of a promoter PGD 2 and a 13,14-dihydro-15-keto-tetranor PGE 2 .
  • a food allergy test method comprising a step of measuring the content of a biomarker in a urine sample of a subject, wherein the biomarker is LTE 4 , 14, 15-LTE 4 , 11-trans LTE 4 , 11-dehydro TXB 2 , 2,3-dinor-8-iso Prostaglandin F 2 ⁇ , 13,14-dihydro-15-keto-tetranor PGF 1 ⁇ , 6,15-diketo-13,14-dihydro PGF 1 ⁇ , tetnor -PGFM, 20-OH PGE 2, PGE 3, PGD 3, less selected from 13,14-dihydro-15-keto- tetranor PGD 2, and 13,14-dihydro-15-keto- tetranor group consisting PGE 2 Wherein the is one.
  • the food allergy urine specimen test kit according to [10], further comprising an anti-tetranor-PGDM antibody or an anti-tetranor-PGEM antibody.
  • at least one selected from the group consisting of deuterated LTC 4 , deuterated 6-keto-PGF 1 ⁇ , deuterated tetranor-PGDM, deuterated tetranor-PGEM, and deuterated PGE 2 The kit for food allergy urine specimen test according to [10] or [11].
  • the food allergy urine sample test kit according to any one of [10] to [12], further comprising deuterated tetranor-PGDM.
  • the test method of the present invention does not require medical techniques such as blood sampling, and can be easily tested at home from children to the elderly using the urine sample test kit or urine sample test stick of the present invention. Can do.
  • FIG. 6 is a graph showing the relative value of the content of tetranor PGDM in the urine sample of a food allergy model mouse when the content of tetranor PGDM in the urine sample of an untreated mouse in Example 1 is 1.
  • FIG. 3 is a graph showing the relative value of the content of tetranor PGEM in the urine sample of a food allergy model mouse when the content of tetranor PGEM in the urine sample of the untreated mouse in Example 1 is 1.
  • FIG. 3 is a graph showing the relative value of the content of tetranor PGEM in the urine sample of a food allergy model mouse when the content of tetranor PGEM in the urine sample of the untreated mouse in Example 1 is 1.
  • the relative value of the content of 20-OH PGE 2 in the urine sample of a food allergy model mouse when the content of 20-OH PGE 2 in the urine sample of the untreated mouse in Example 1 is 1. It is a graph which shows. When the content of PGD 3 in a urine specimen in untreated mice in Example 1 and 1 is a graph showing the relative value of the amount of PGD 3 in a urine specimen in food allergy mouse model. When the content of PGE 3 in a urine specimen in untreated mice in Example 1 and 1 is a graph showing the relative value of the amount of PGE 3 in a urine specimen in food allergy mouse model.
  • the score 0 patient after the food allergy load test and the food allergy load test before and after the food allergy load test when the content of tetranor PGDM in the urine sample of the patient (human) score 0 before the food allergy load test in Example 2 It is a graph which shows the relative value of the content of tetranor PGDM in the urine sample of a score 2 patient (human).
  • the score 0 patient after the food allergy load test and the food allergy load test before and after the food allergy load test when the content of tetranor PGEM in the urine sample of the patient 0 (human) score before the food allergy load test in Example 2 is set to 1. It is a graph which shows the relative value of the content of tetranor PGEM in the urine sample of a score 2 patient (human).
  • a score 0 patient after the food allergy load test and a food allergy when the content of 11-dehydro TXB 2 in the urine sample of the patient (human) score 0 before the food allergy load test in Example 2 is 1 is a graph showing the relative value of 11-dehydro TXB 2 content in the urine sample score 2 patients before and after the load test (human).
  • Score before food allergy load test in Example 2 Score after food allergy load test when the content of 2,3-dinor-8-iso PGF 2 ⁇ in a urine sample of a patient (human) is 1 0 patients, and is a graph showing the relative value of the amount of 2,3-dinor-8-iso PGF 2 ⁇ in a urine specimen score 2 patients before and after food allergy tolerance test (human).
  • the score 0 patient after the food allergy load test and the food allergy when the content of 11-trans LTE 4 in the urine specimen of the score 0 patient (human) before the food allergy load test in Example 2 is 1 is a graph showing the relative value of the content of 11-trans LTE 4 in the urine specimen score 2 patients before and after the load test (human).
  • FIG. 6 is a graph showing the content (absolute value) of tetranor PGEM in urine specimens of patients (human) having score 0 and score 4 before and after the food allergy load test in Example 3.
  • 10 is a graph showing the content (absolute value) of 11-dehydro TXB 2 in urine samples of patients (human) with score 0 and score 4 before and after the food allergy load test in Example 3.
  • FIG. I is a graph showing the content of LTE 4 in the urinary sample score 0 and score 4 patients before and after food allergy loading test in Example 3 (human) (absolute value).
  • the present invention is a biomarker for testing food allergy, comprising Leukotriene E 4 (LTE 4 ), 14,15-LTE 4 , 11-trans LTE 4 , 11-dehydro Thrombane B 2 ( 11-dehydro TXB 2 ), 2,3-dinor-8-iso Prostaglandin F 2 ⁇ , 13,14-dihydro-15-keto-tetranor PGF 1 ⁇ , 6,15-diketo-13,14-dihydro PGF 1 ⁇ , tetranor- Prostaglandin F Metabolite (tetranor-PGFM) , 20-hydroxy Prostaglandin E 2 (20-OH PGE 2), PGE 3, Prosta landin D 3 (PGD 3), consisting of at least one selected from the group consisting of 13,14-dihydro-15-keto- tetranor PGD 2, and 13,14-dihydro-15-keto- tetranor PGE 2, biomarkers
  • biomarker of the present embodiment it is possible to appropriately evaluate not only the presence or absence of food allergy but also the onset risk and severity.
  • food allergy means various allergic reactions that occur when allergens contained in food are taken into the body.
  • food allergies include chicken eggs, milk, crustaceans, wheat, fruits, nuts, seafood, buckwheat, and the like, and allergies other than these are also included.
  • Allergic symptoms occur in the skin, mucous membranes, digestive organs, respiratory organs, etc., and diarrhea, vomiting, dermatitis and the like are typical.
  • the “food allergy biomarker” means a substance whose amount serves as an index of the risk of developing allergy, the severity of symptoms, and the prognosis.
  • the content of the above 13 kinds of lipids in the urine sample is maintained to increase or decrease for a certain period, so it can be determined to be food. Furthermore, the severity of the symptom can be evaluated from the increased value or decreased value of the content in the urine sample.
  • the certain period means, for example, 3 days or more, 5 days or more, 7 days or more, 10 days or more, or 20 days or more after ingesting a substance that causes food allergy.
  • LTE 4 11-dehydro TXB 2 , tetranor-PGFM, or 13,14-dihydro-15-keto-tetranor PGD 2 is preferable, and 11-dehydro TXB 2 , or Tetranor-PGFM is more preferred.
  • the amount of these lipids is believed to increase or decrease in a mast cell-dependent manner, and mast cells are known to be present in a large amount in the mucosa of the digestive tract where food allergy occurs.
  • urine is preferably used as a sample when measuring the above-described biomarker because it can be collected non-invasively and has a large content.
  • the present invention is a method for testing food allergy, comprising the step of measuring the content of a biomarker in a urine sample of a subject, wherein the biomarker is LTE 4 , 14, 15-LTE.
  • the inspection method of the present embodiment not only the presence or absence of food allergy, but also the onset risk and severity can be appropriately evaluated. In addition, risk can be assessed and preventive treatment given before allergic symptoms occur.
  • the test method of the present embodiment does not require medical techniques such as blood collection, and can be easily tested at home from children to the elderly using a urine sample test kit or urine sample test stick described below. .
  • “subject” means a person who has a food allergy, a person who has actually developed a food allergy, a person who has been treated for a food allergy, or is taking a food allergy remedy. It means those who are uncertain whether or not they have food allergies. Further, the “subject” is not limited to humans, and may be mammals such as mice, rats, rabbits, cats, dogs, monkeys, pigs, sheep, cows and horses.
  • urine collected from the subject is used as a sample.
  • the urine used in the inspection method of this embodiment can be collected according to a conventional method. One urine may be used, or two or more urine accumulations may be used.
  • the collected urine may be stored at room temperature until measurement, or may be stored at ⁇ 40 ° C. or lower, eg, ⁇ 80 ° C.
  • Frozen urine can be thawed rapidly and used for measurement.
  • the biomarker is contained in the blood, urine, or stool of the subject, but can be collected non-invasively and has a high content. Therefore, it is preferable to use urine as a sample.
  • the above-described method for measuring the content of a biomarker in a urine sample can be performed using any method for detecting and measuring a specific substance in a solution.
  • the term “method for measuring the content of a biomarker in a urine sample” is used, not only the amount is accurately measured, but also the presence or absence is detected, or only whether it is greater or less than a certain amount To include.
  • the content of the biomarker in the urine sample may be corrected by the amount of a reference substance such as creatinine.
  • Tetranor PGDM or tetranor PGEM is a biomarker of food allergy described in International Publication No. 2016/021704, which has been found by the present inventors.
  • lipid production and metabolism mechanism there are many kinds of lipids and details are not clarified.
  • PGD 2 and TXB 2 and metabolites thereof (for example, tetrar PGDM, 11-dehydro TXB 2 ) are obese.
  • lipids other than PGD 2 and TXB 2 metabolites are derived from mast cells or secondary inflammatory reactions caused by their activity It is considered to be a product. Therefore, in addition to the 13 types of lipids described above, by measuring the content of tetranor PGDM or tetranor PGEM, a plurality of lipids can be used as indicators, and the presence or absence of food allergies, as well as the risk and severity of onset. The determination can be made with higher accuracy.
  • Examples of the method for measuring the content of the biomarker in the urine specimen include immunoassay, aggregation method, turbidimetric method, Western blotting method, surface plasmon resonance (SPR) method, and various chromatographic techniques. Examples include, but are not limited to, the methods used (eg, gas chromatography, liquid chromatography, high performance liquid chromatography, etc.), mass spectrometry, and the like. Among these, an immunoassay for measuring the content of the biomarker in the urine specimen by using an antigen-antibody reaction between the antibody that specifically binds to the biomarker and the biomarker in the urine specimen, or Mass spectrometry is preferred.
  • An immunoassay consists of an antibody that specifically binds to a detectably labeled biomarker or an antibody that specifically binds to any one of the detectably labeled biomarkers (two Secondary antibody) may be used.
  • Examples of the antibody labeling method include an enzyme immunoassay (EIA (Enzyme immunoassay) or ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay)), a radioimmunoassay (FIA), and a fluorescence immunoassay (Fluammunoassay; FIA).
  • EIA enzyme immunoassay
  • FIA radioimmunoassay
  • FPIA fluorescence immunoassay
  • CLIA chemiluminescent immunoassay
  • enzymes such as peroxidase and alkaline phosphatase
  • radioactive materials such as 125 I, 131 I, 35 S, and 3 H
  • Fluorescent substances such as isothiocyanate and near-infrared fluorescent materials
  • the CLIA method use antibodies labeled with luminescent substances such as luciferase, luciferin and aequorin.
  • nanoparticles such as gold colloids and quantum dots may be used.
  • detection can also be performed by binding avidin or streptavidin labeled with an enzyme or the like using an antibody that specifically binds to the biomarker labeled with biotin.
  • an ELISA method using an enzyme label can measure an antigen simply and quickly.
  • the ELISA method includes a competitive method and a sandwich method.
  • a competitive method to a solid support such as a microplate, of the above mentioned biomarkers, for example, an antibody that specifically binds to LTE 4 (hereinafter, referred to as "anti-LTE 4 antibody.")
  • an enzyme-labeled antigen enzyme-labeled LTE 4 that reacts with the antibody is added to cause an antigen-antibody reaction. Once washed, it reacts with the enzyme substrate, develops color, and the absorbance is measured.
  • the content of LTE 4 in the urine sample is large, the color development becomes weak, and if the content of LTE 4 in the urine sample is small, the color development becomes strong. Therefore, using the calibration curve, the content of LTE 4 in the urine sample Can be requested. Even when a biomarker other than LTE 4 is used, the content can be determined by the same method.
  • an anti-LTE 4 antibody is immobilized on a solid phase carrier, a urine sample is added and reacted, and then an anti-LTE that recognizes another epitope of the same antigen (LTE 4 ) labeled with an enzyme. Add 4 antibodies and allow to react. After washing, reaction with the enzyme substrate, color development, and measuring the absorbance, the content of LTE 4 in the urine sample can be determined. Even when a biomarker other than LTE 4 is used, the content can be determined by the same method.
  • DAB 3,3′-diaminobenzidine
  • TMB 3,3 ′, 5,5′-tetramethylbenzidine
  • OPD o-phenylenediamine
  • NPP p-nitropheny phosphatase
  • the “solid phase carrier” is not particularly limited as long as it is a carrier capable of immobilizing an antibody.
  • the shape of the solid phase carrier include a microtiter plate, a substrate, beads, and a membrane.
  • the material of the solid phase carrier include inorganic substances such as silica, alumina, glass, and metals, thermoplastic resins (for example, nylon, polyvinylidene fluoride (PVDF), etc.), and organic polymer substances such as nitrocellulose. It is done.
  • the labeling substance or antibody can be immobilized on the above solid phase carrier according to a known method.
  • the antibody that specifically binds to any one of the biomarkers described above may be a monoclonal antibody or a polyclonal antibody, and any antibody can be prepared according to a known method.
  • Monoclonal antibodies can be produced, for example, by isolating antibody-producing cells from a non-human mammal immunized with any one of the biomarkers described above and fusing them with myeloma cells to produce hybridomas.
  • the purified antibody can be purified.
  • Polyclonal antibodies can be obtained, for example, from the serum of non-human mammals immunized with any one of the biomarkers described above.
  • a separation step for separating a metabolite contained in the urine sample may be provided before the measurement step.
  • time-resolved separation of metabolites contained in the urine sample is obtained.
  • all chromatographic separation techniques can be used, and more specifically, for example, liquid chromatography (LC), high performance liquid chromatography (HPLC), gas chromatography, and the like. Examples thereof include gas chromatography (GC), thin layer chromatography, size exclusion chromatography, affinity chromatography and the like.
  • 11-dehydro TXB 2 , tetranor-PGFMtetranor PGDM, and tetranor PGEM are preferably used in the measurement using mass spectrometry because the separation conditions from the urine specimen are close.
  • 11-dehydro TXB 2 , tetranor-PGFMtetranor PGDM, or tetranor PGEM more preferably 11-dehydro TXB 2 , tetranor-PGFMtetranor PGDM, and tetranor PGEM may be used as target biomarkers.
  • Examples of the mass spectrometry method used in the measurement process include gas chromatography mass spectrometry (GC-MS) method, liquid chromatography mass spectrometry (LC-MS) method, direct injection mass spectrometry method, and Fourier transform ion.
  • GC-MS gas chromatography mass spectrometry
  • LC-MS liquid chromatography mass spectrometry
  • Fourier transform ion examples include Fourier transform ion.
  • Cyclotron resonance mass spectrometry (Fourier transformation mass cyclotron resonance mass spectrometry; FT-ICR-MS) method, capillary electrophoresis mass spectrometry (Capillary Electrophoresis mass spectrometry-MS mass spectrometry; HPLC-MS HPLC method) Method, quadrupole mass spectrometry, tandem mass spectrometry combined with the above separation methods (eg LC-MS / MS method, HPLC-MS / MS method, etc.), inductively coupled plasma mass spectrometry (ICP-MS) method, pyrolysis mass spectrometry (Py-MS) method, Examples thereof include ion mobility mass spectrometry, time-of-flight mass spectrometry (TOF MS), and the like.
  • the mass spectrometry is preferably an LC-MS method or a tandem mass spectrometry combined with the above-described separation method.
  • a pretreatment step of adding an internal standard to the urine sample may be provided in order to quantify the content of the biomarker in the urine sample.
  • the internal standard include deuterated LTC4, deuterated 6-keto-PGF1 ⁇ , deuterated tetranor-PGDM, deuterated tetranor-PGEM, deuterated PGE2, and the like. Or may be used in combination.
  • the inspection method of the present embodiment may include an evaluation step for evaluating the risk and severity of food allergy based on the content of the biomarker in the urine sample after the above [measurement step]. Good.
  • the content of the biomarker in the urine sample may be determined by measuring the content of the biomarker in the urine sample collected a plurality of times from the same individual and comparing the results. In this case, it is possible to evaluate changes in the severity and risk of onset in the same individual. Whether or not the content of the biomarker in the urine sample is higher may be measured by measuring the content of the biomarker in the urine sample collected from a plurality of persons and comparing the results. In this case, it is possible to evaluate whether the severity and the risk of onset are higher than those of other people.
  • the predetermined value when it is lower than the predetermined value, it can be determined that the symptoms of food allergy are light or light, or the risk of developing food allergy is low or low.
  • the content of PGE 3 or PGD 3 in the urine sample when the content of PGE 3 or PGD 3 in the urine sample is less than a predetermined value, the symptoms of food allergy are serious or serious, or food allergy It can be determined that the risk of developing is increased or increased.
  • it is higher than the predetermined value it can be determined that the symptoms of food allergy are light or light, or the risk of developing food allergy is low or low.
  • Predetermined value compares the content of the biomarker in urine samples of multiple healthy subjects or non-food allergic patients with the content of the biomarker in urine samples of multiple food allergic patients Thus, it can be determined by a conventional method.
  • the determination of the content of tetranor-PGDM or tetranor-PGEM in the urine sample makes it possible to determine food allergy symptoms and risk of onset with higher accuracy. be able to. More specifically, when the amount of tetranor-PGDM in urine is higher than a predetermined value, it is judged that the symptom is serious or the risk of onset is high, and when lower than the predetermined value, the symptom is mild. Or it is judged that the onset risk is low.
  • activation of mast cells means an increase in the number of mast cells, an increase in degranulation, and an increase in the amount of active substance production.
  • the content of the above-described biomarker in the urine specimen increases or decreases as the number of mast cells increases, and decreases or increases under the suppression of degranulation. Therefore, mast cell activation can be evaluated using the content of the biomarker in the urine sample as an index.
  • the inspection method of the present embodiment can be used for evaluation of a therapeutic agent administered to a food allergy patient or a therapeutic method performed on the patient.
  • a therapeutic agent administered to a food allergy patient or a therapeutic method performed on the patient For example, when the content of the biomarker described above is measured in a urine sample collected at any time after the start of treatment from the start of treatment, and the content of the biomarker decreases or increases, the therapeutic agent or It can be determined that the treatment method is effective. On the other hand, when the content of the above-described biomarker does not decrease, increases, does not increase, or decreases, it can be determined that the therapeutic agent or method is not effective. At this time, the decrease or increase in the content of the biomarker described above may not be a significant decrease or increase, but may be such that a person skilled in the art can determine that there is a tendency to decrease or increase.
  • the administration route, dosage and administration frequency of the desensitization therapy are not particularly limited, and can be appropriately selected according to various conditions such as the patient's age, weight and symptoms.
  • Examples of the administration route include a route of administration to an individual by intradermal, subcutaneous, intramuscular, intraperitoneal, transdermal, transmucosal, oral, inhalation and the like.
  • the test method of this embodiment may be used to evaluate the effect of a drug in an animal experiment for the development of a food allergy drug.
  • the inspection method of this embodiment may be used when examining a sample collected from a subject in order to obtain information necessary for diagnosis.
  • Such an inspection method can be performed by, for example, an inspection company.
  • the present invention relates to anti-LTE 4 antibody, anti-14,15-LTE 4 antibody, anti-11-trans LTE 4 antibody, anti-11-dehydro TXB 2 antibody, anti-2,3-dinor-8-iso PGF.
  • the urine sample test kit of this embodiment is used for testing food allergies using the test method described above, and can be easily tested at home from children to the elderly.
  • the urine specimen test kit of this embodiment may further contain an anti-tetranor-PGDM antibody or an anti-tetranor-PGEM antibody.
  • an anti-tetranor-PGDM antibody or an anti-tetranor-PGEM antibody used as indicators. It is possible to determine the presence or absence of food allergy and the risk and severity of onset with higher accuracy.
  • the urine specimen test kit of this embodiment can be used in an immunoassay using an antibody that specifically binds to the above-described biomarker, and includes reagents and devices necessary for measuring the content of the above-described biomarker. May be included.
  • the urine specimen test kit of this embodiment is a microtiter plate; anti-LTE 4 for capturing antigen (LTE 4 ) when the content of LTE 4 among the biomarkers described above is measured by the sandwich method.
  • An antibody hereinafter referred to as “capture antibody 1”
  • an anti-LTE 4 antibody labeled with peroxidase or alkaline phosphatase hereinafter referred to as “labeled antibody 1”
  • a peroxidase substrate eg, DAB, TMB). , OPD, etc.
  • an alkaline phosphatase substrate eg, NPP, etc.
  • the capture antibody 1 and the labeled antibody 1 preferably recognize different epitopes of the antigen (LTE 4 ).
  • the capture antibody 1 is immobilized on a microtiter plate. Subsequently, the urine specimen is appropriately diluted and added here, and incubated. Subsequently, the urine sample is removed and washed. Subsequently, labeled antibody 1 is added and incubated. Subsequently, the substrate is added to cause color development. By measuring the color development using a microtiter plate reader or the like, the content of LTE 4 can be determined. Even when an antibody that specifically binds to a biomarker other than LTE 4 is used, the content can be determined by the same method.
  • the urine specimen test kit of the present embodiment is a microtiter plate; antigen (LTE 4 ), for example, when the content of LTE 4 among the biomarkers described above is measured by a sandwich method using a secondary antibody.
  • antigen LTE 4
  • Anti-LTE 4 antibody for capture (hereinafter referred to as “capture antibody 2”); anti-LTE 4 antibody as a primary antibody (hereinafter referred to as “primary antibody 1”); peroxidase as a secondary antibody or An antibody against anti-LTE 4 antibody labeled with alkaline phosphatase (hereinafter referred to as “secondary antibody 1”); and a peroxidase substrate (eg, DAB, TMB, OPD, etc.) or an alkaline phosphatase substrate (eg, NPP, etc.) May be included.
  • the capture antibody 2 and the primary antibody 1 preferably recognize different epitopes of the antigen (LTE 4 ).
  • the capture antibody 2 is immobilized on a microtiter plate. Subsequently, the urine specimen is appropriately diluted and added here, and incubated. Subsequently, the urine sample is removed and washed. Subsequently, primary antibody 1 is added, incubated and washed. Subsequently, a secondary antibody is added and incubated, and a substrate is added to cause color development. By measuring the color development using a microtiter plate reader or the like, the content of LTE 4 can be determined. Further, by using the secondary antibody 1, the reaction is amplified, and the detection sensitivity can be increased. Even when an antibody that specifically binds to a biomarker other than LTE 4 is used, the content can be determined by the same method.
  • the above-mentioned labeled antibody 1 and the above-mentioned secondary antibody 1 are not limited to enzyme-labeled antibodies, but are radioactive materials such as 125 I, 131 I, 35 S, 3 H, fluorescein isothiocyanate, rhodamine, dansyl chloride, phycoerythrin. It may be an antibody labeled with a fluorescent substance such as tetramethylrhodamine isothiocyanate, a near-infrared fluorescent material, a luminescent substance such as luciferase, luciferin, or aequorin, a gold colloid, a nanoparticle such as a quantum dot, or the like.
  • the labeled antibody 1 and the secondary antibody 1 described above may be biotinylated antibodies.
  • the urine sample test kit of this embodiment includes labeled avidin or streptavidin. Also good.
  • the urine specimen test kit of the present embodiment further includes deuterated LTC 4 , deuterated 6-keto-PGF 1 ⁇ , deuterium as internal standards. of tetranor-PGEM, and it may include at least one selected from the group consisting of deuterated PGE 2.
  • deuterated LTC 4 deuterated 6-keto-PGF 1 ⁇
  • deuterium deuterium as internal standards. of tetranor-PGEM, and it may include at least one selected from the group consisting of deuterated PGE 2.
  • Examples of deuterated LTC 4 include LTC 4 -d5.
  • Examples of deuterated 6-keto-PGF 1 ⁇ include 6-keto-PGF 1 ⁇ - d4.
  • Examples of deuterated tetranor-PGEM include tetranor-PGEM-d6.
  • Examples of deuterated PGE 2 include PGE 2 -d4.
  • the kit for urine specimen testing of this embodiment may further contain deuterated tetranor-PGDM.
  • deuterated tetranor-PGDM By using the urine sample test kit of this embodiment, in addition to at least one of the 13 types of lipids described above, by measuring the content of tetranor PGDM or tetranor PGEM, a plurality of lipids can be used as indices. It is possible to determine the presence or absence of food allergy and the risk and severity of onset with higher accuracy.
  • An example of deuterated tetranor-PGDM is tetranor-PGDM-d6.
  • the urine sample test kit of this embodiment may further contain necessary buffer solution, enzyme reaction stop solution, macroplate reader, and the like.
  • the urine sample test kit of this embodiment can be used for evaluation of mast cell activation in food allergy.
  • the present invention relates to anti-LTE 4 antibody, anti-14,15-LTE 4 antibody, anti-11-trans LTE 4 antibody, anti-11-dehydro TXB 2 antibody, anti-2,3-dinor-8-iso PGF.
  • anti-13,14-dihydro-15-keto-tetranor PGF 1 ⁇ antibody anti-6,15-diketo-13,14-dihydro PGF 1 ⁇ antibody, anti-tetranor-PGFM antibody, anti-20-OH PGE 2 antibody, anti-antibody
  • anti-antibody At least one selected from the group consisting of PGE 3 antibody, anti-PGD 3 antibody, anti-13,14-dihydro-15-keto-tetranor PGD 2 antibody and anti-13,14-dihydro-15-keto-tetranor PGE 2 antibody Including food allergy urine sample test To provide a click.
  • the urine specimen testing stick of this embodiment is used for testing food allergies using the testing method described above, and can be easily tested at home from children to the elderly.
  • the urine specimen test stick according to the present embodiment is a stick-shaped test drug, and may be any substance that visualizes the content of the biomarker in the urine specimen, for example, with a colored line.
  • the urine specimen testing stick of this embodiment may further contain an anti-tetranor-PGDM antibody or an anti-tetranor-PGEM antibody.
  • an anti-tetranor-PGDM antibody or an anti-tetranor-PGEM antibody used as an index. It is possible to determine the presence or absence of food allergy and the risk and severity of onset with higher accuracy.
  • the urine specimen testing stick As the urine specimen test stick, a known stick can be used, and for example, a configuration using an immunochromatography method or the like can be used.
  • the urine specimen testing stick of the present embodiment is prepared by the immunochromatography method, for example, when measuring the content of LTE 4 among the biomarkers described above, the first anti-LTE 4 antibody labeled with colloidal gold or the like is used.
  • an antibody storing portion which is stored, that the anti-LTE 4 antibodies another epitope recognizing second of LTE 4 is, the determination unit immobilized in a line shape such as a cellulose film, a structure which is connected by a thin groove Can do.
  • a urine sample is added to the urine sample test stick, and the first anti-LTE 4 antibody and LTE 4 are reacted with each other in the antibody storage unit to form an LTE 4 -first anti-LTE 4 antibody complex.
  • the complex passes through the groove by capillary action and moves to the determination unit.
  • the complex is captured by the second anti-LTE 4 antibody immobilized on the determination unit.
  • LTE 4 can be detected by the appearance of a red line in the determination unit due to the plasmon effect of the gold colloid. Even when an antibody that specifically binds to a biomarker other than LTE 4 is used, it can be detected by the same method.
  • the urine specimen test stick of this embodiment can be used for evaluation of mast cell activation in food allergy.
  • Example 1 Dynamics of lipid mediators in urine specimens in food allergy model mice (1) Preparation of ovalbumin (OVA) -induced food allergy model mice (1-1) Sensitization conditions Wild-type BALB / c mice Sensitization was performed by administering 50 ⁇ g of ovalbumin (Ovalbumin; OVA) and 1 mg of alum intraperitoneally (6-12 weeks old, female) and 50 ⁇ g of OVA intraperitoneally two weeks later.
  • OVA ovalbumin
  • tetranor-PGFM increased in score 2 pre compared to score 0 pre and score 0 post, suggesting that it could be used as a marker that reflects the predisposition to food allergies. It was done.
  • mice 6,15-diketo-13,14-dihydro PGF 1 ⁇ and 20-OH PGE 2 were significantly increased only in mice, and PGD 3 and PGE 3 were significantly decreased only in mice. Therefore, it was suggested that the above four components are useful as biomarkers in an experimental system for evaluating the allergenicity of foods using mice.
  • tetranor-PGFM, 2,3-dinor-8-iso PGF 2 ⁇ , 11-dehydro TXB 2 , 14, 15-LTE 4 , and 11-trans LTE 4 were significantly increased only in humans. Therefore, it was suggested that the above five components are useful as biomarkers for appropriately evaluating the risk and severity of food allergy in humans or for evaluating responsiveness to desensitization therapy.
  • Tetranor-PGDM-d6, tetranor-PGEM-d6, TMX-d4, and LTC 4 -d5 were added to the urine supernatant as internal standards.
  • urine specimens were prepared to pH 3-4 using hydrochloric acid.
  • the prepared urine specimen was injected into a Sep-pak C18 cartridge (manufactured by Waters) equilibrated with methanol and purified water.
  • impurities were washed with 3 mL water and 3 mL ⁇ 2 hexane.
  • the target component was eluted with methanol. Subsequently, after drying under reduced pressure for 4 hours, it was redissolved in 80% methanol and filtered.
  • the test method of the present invention does not require medical techniques such as blood sampling, and can be easily tested at home from children to the elderly using the urine sample test kit or urine sample test stick of the present invention. Can do.

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Abstract

本発明のバイオマーカーは、食物アレルギーを検査するためのバイオマーカーであって、ＬＴＥ４、１４，１５－ＬＴＥ４、１１－ｔｒａｎｓ　ＬＴＥ４、１１－ｄｅｈｙｄｒｏ　１１－ｄｅｈｙｄｒｏ　ＴＸＢ２、２，３－ｄｉｎｏｒ－８－ｉｓｏ　Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ　Ｆ２α、１３，１４－ｄｉｈｙｄｒｏ－１５－ｋｅｔｏ－ｔｅｔｒａｎｏｒ　ＰＧＦ１β、６，１５－ｄｉｋｅｔｏ－１３，１４－ｄｉｈｙｄｒｏ　ＰＧＦ１α、ｔｅｔｒａｎｏｒ－ＰＧＦＭ、２０－ＯＨ　ＰＧＥ２、ＰＧＥ３、ＰＧＤ３、１３，１４－ｄｉｈｙｄｒｏ－１５－ｋｅｔｏ－ｔｅｔｒａｎｏｒ　ＰＧＤ２、及び１３，１４－ｄｉｈｙｄｒｏ－１５－ｋｅｔｏ－ｔｅｔｒａｎｏｒ　ＰＧＥ２からなる群から選ばれる少なくとも一つからなる。

Description

食物アレルギーのバイオマーカー、食物アレルギーの検査方法、尿検体検査用キット、及び尿検体検査用スティック
　本発明は、食物アレルギーのバイオマーカー、食物アレルギーの検査方法、尿検体検査用キット、及び尿検体検査用スティックに関する。
　本願は、２０１６年１月２９日に、日本に出願された特願２０１６－０１５６８１号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
　食物アレルギーは食品中に含まれるアレルゲンを体内に取り込むことで起こる様々なアレルギー反応を意味する。その症状には下痢や嘔吐、皮膚炎等が挙げられる他、重篤になるとショックを起こして死に至る。国内における成人の罹患率は２．６％と高いが、新生児では５．６％とさらに高く重症例が多いため大きな問題となっている。
　よく知られている卵、牛乳、小麦以外にもアレルゲンとなり得る食品は多く、これらはごく少量の摂食でも強い症状を引き起こすため、危険である。食物アレルギーの予防にはアレルゲンの特定と摂食回避しか方法はないが、加工食品が世界的に流通する現在の食糧事情の下でそれは難しく、安心して食物を口にできない患者のＱＯＬは著しく損なわれる。また、原因物質を除去すると、特に小児の場合に、栄養に悪影響を及ぼすこともある。さらに近年の生活環境の変化は、体における免疫反応バランスを変化させ、食物アレルギー罹患率のさらなる増加や症状を悪化させる結果を招いており、その治療薬の開発、早期診断技術や食品のアレルギー原性を評価する実験系の確立が急務となっている。
食物アレルギーの発症機構としては、ｉ）体内に侵入したアレルゲンにＴ細胞及びＢ細胞が反応してＩｇＥを産生すること、ｉｉ）アレルゲンが再度体内に入ると、ＩｇＥと結合した肥満細胞がヒスタミンなどの活性物質を放出し（脱顆粒）、強い炎症を引き起こすこと、が知られている。
　また、食物アレルギーの治療方法の一つとして、減感作療法が挙げられる。減感作療法は、医師の管理下で希釈したアレルゲンを患者に投与し、免疫寛容を誘導しようとするものである。多くのアレルギー疾患の治療法が対症療法であるのに対し、減感作療法はアレルギー疾患の作用機序に働きかけて根治を目標とする点で注目されている。減感作療法では極めて低い投与量から開始し、徐々に投与量を増やす。
　現在、食物アレルギーの診断方法として、血中ＩｇＥを測定する診断方法が用いられている（例えば、非特許文献１参照。）。
厚生労働科学研究班による食物アレルギーの診療の手引き２０１１（http://www.allergy.go.jp/allergy/guideline/05/05_2011.pdf）
　減感作療法では、アレルゲンを徐々に投与量を増やす際に、閾値を超える量のアレルゲンを投与することで重篤な症状を引き起こすことのないよう、医師の目視による診断が行われるが、恣意的な判断であり、定量的な診断ができない。そのため、患者におけるアレルギー症状の重篤度を適切に評価する手法が必要とされる。
　また、血中ＩｇＥを測定する診断方法では、アレルギー反応の有無は推測できても、発症リスクや症状の程度を知ることはできない。つまり、血中のＩｇＥ抗体の存在量と食物アレルギー症状の発症リスクや重篤度とは一致しないことが多い。また、この方法は採血が必要とされるため、医療機関にて行わなければならず、採血自体、乳幼児には負担も大きい。
　本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、食物アレルギーの発症リスクやその症状の重篤度、予後を簡易かつ適切に評価できる検査方法を提供する。
　本発明者らは、上記課題を解決するために、食物アレルギーの発症及び進行はは、肥満細胞への依存性が非常に高いことから、肥満細胞が産生する生理活性物質の代謝物が、尿に排出されて安定的に検出できることに着目し、尿検体中の脂質の網羅的濃度解析を行った。その結果、食物アレルギーの症状発現に伴って尿検体中での含有量が変化する脂質を見出し、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は、以下の態様を含む。
［１］食物アレルギーを検査するためのバイオマーカーであって、
　Ｌｅｕｋｏｔｒｉｅｎｅ　Ｅ４（ＬＴＥ４）、１４，１５－ＬＴＥ４、１１－ｔｒａｎｓ　ＬＴＥ４、１１－ｄｅｈｙｄｒｏ　Ｔｈｒｏｍｂｏｘａｎｅ　Ｂ２（１１－ｄｅｈｙｄｒｏ　ＴＸＢ２）、２，３－ｄｉｎｏｒ－８－ｉｓｏ　Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ　Ｆ２α、１３，１４－ｄｉｈｙｄｒｏ－１５－ｋｅｔｏ－ｔｅｔｒａｎｏｒ　ＰＧＦ１β、６，１５－ｄｉｋｅｔｏ－１３，１４－ｄｉｈｙｄｒｏ　ＰＧＦ１α、ｔｅｔｒａｎｏｒ－Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ　Ｆ　Ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅ（ｔｅｔｒａｎｏｒ－ＰＧＦＭ）、２０－ｈｙｄｒｏｘｙ　Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ　Ｅ２（２０－ＯＨ　ＰＧＥ２）、ＰＧＥ３、Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ　Ｄ３（ＰＧＤ３）、１３，１４－ｄｉｈｙｄｒｏ－１５－ｋｅｔｏ－ｔｅｔｒａｎｏｒ　ＰＧＤ２、及び１３，１４－ｄｉｈｙｄｒｏ－１５－ｋｅｔｏ－ｔｅｔｒａｎｏｒ　ＰＧＥ２からなる群から選ばれる少なくとも一つからなることを特徴とするバイオマーカー。
［２］被検者の尿検体中のバイオマーカーの含有量を測定する工程を備えた食物アレルギーの検査方法であって、前記バイオマーカーがＬＴＥ４、１４，１５－ＬＴＥ４、１１－ｔｒａｎｓ　ＬＴＥ４、１１－ｄｅｈｙｄｒｏ　ＴＸＢ２、２，３－ｄｉｎｏｒ－８－ｉｓｏ　Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ　Ｆ２α、１３，１４－ｄｉｈｙｄｒｏ－１５－ｋｅｔｏ－ｔｅｔｒａｎｏｒ　ＰＧＦ１β、６，１５－ｄｉｋｅｔｏ－１３，１４－ｄｉｈｙｄｒｏ　ＰＧＦ１α、ｔｅｔｒａｎｏｒ－ＰＧＦＭ、２０－ＯＨ　ＰＧＥ２、ＰＧＥ３、ＰＧＤ３、１３，１４－ｄｉｈｙｄｒｏ－１５－ｋｅｔｏ－ｔｅｔｒａｎｏｒ　ＰＧＤ２、及び１３，１４－ｄｉｈｙｄｒｏ－１５－ｋｅｔｏ－ｔｅｔｒａｎｏｒ　ＰＧＥ２からなる群から選ばれる少なくとも一つであることを特徴とする方法。
［３］前記測定工程において、さらに、ｔｅｔｒａｎｏｒ－ＰＧＤＭ又はｔｅｔｒａｎｏｒ－ＰＧＥＭの含有量を測定する、［２］に記載の方法。
［４］さらに、尿検体中の前記バイオマーカーの含有量が多い又は少ないほど、食物アレルギーの症状が重篤である若しくは重篤になった、又は、食物アレルギーを発症するリスクが高い若しくは高くなったと評価する評価工程を備える、［２］又は［３］に記載の方法。
［５］食物アレルギーの治療法又は治療薬の評価に用いられる、［２］～［４］のいずれか一つに記載の方法。
［６］減感作療法に用いられる、［５］に記載の方法。
［７］前記測定工程を、イムノアッセイ又は質量分析法で行う、［２］～［６］のいずれか一つに記載の方法。
［８］さらに、前記尿検体中に、重水素化ＬＴＣ４、重水素化６－ｋｅｔｏ－ＰＧＦ１α、重水素化ｔｅｔｒａｎｏｒ－ＰＧＤＭ、重水素化ｔｅｔｒａｎｏｒ－ＰＧＥＭ、及び重水素化ＰＧＥ２からなる群から選ばれる少なくとも一つを内部標準として加える前処理工程を備え、前記測定工程を、質量分析法で行う、［７］に記載の方法。
［９］前記評価工程において、食物アレルギーにおける肥満細胞の活性化を評価する、［２］～［８］のいずれか一つに記載の方法。
［１０］抗ＬＴＥ４抗体、抗１４，１５－ＬＴＥ４抗体、抗１１－ｔｒａｎｓ　ＬＴＥ４抗体、抗１１－ｄｅｈｙｄｒｏ　ＴＸＢ２抗体、抗２，３－ｄｉｎｏｒ－８－ｉｓｏ　ＰＧＦ２α抗体、抗１３，１４－ｄｉｈｙｄｒｏ－１５－ｋｅｔｏ－ｔｅｔｒａｎｏｒ　ＰＧＦ１β抗体、抗６，１５－ｄｉｋｅｔｏ－１３，１４－ｄｉｈｙｄｒｏ　ＰＧＦ１α抗体、抗ｔｅｔｒａｎｏｒ－ＰＧＦＭ抗体、抗２０－ＯＨ　ＰＧＥ２抗体、抗ＰＧＥ３抗体、抗ＰＧＤ３抗体、抗１３，１４－ｄｉｈｙｄｒｏ－１５－ｋｅｔｏ－ｔｅｔｒａｎｏｒ　ＰＧＤ２抗体、及び抗１３，１４－ｄｉｈｙｄｒｏ－１５－ｋｅｔｏ－ｔｅｔｒａｎｏｒ　ＰＧＥ２抗体からなる群から選ばれる少なくとも一つを含むことを特徴とする食物アレルギーの尿検体検査用キット。
［１１］さらに、抗ｔｅｔｒａｎｏｒ－ＰＧＤＭ抗体又は抗ｔｅｔｒａｎｏｒ－ＰＧＥＭ抗体を含む、［１０］に記載の食物アレルギーの尿検体検査用キット。
［１２］さらに、重水素化ＬＴＣ４、重水素化６－ｋｅｔｏ－ＰＧＦ１α、重水素化ｔｅｔｒａｎｏｒ－ＰＧＤＭ、重水素化ｔｅｔｒａｎｏｒ－ＰＧＥＭ、及び重水素化ＰＧＥ２からなる群から選ばれる少なくとも一つを含む、［１０］又は［１１］に記載の食物アレルギーの尿検体検査用キット。
［１３］さらに、重水素化ｔｅｔｒａｎｏｒ－ＰＧＤＭを含む、［１０］～［１２］にいずれか一つに記載の食物アレルギーの尿検体検査用キット。
［１４］抗ＬＴＥ４抗体、抗１４，１５－ＬＴＥ４抗体、抗１１－ｔｒａｎｓ　ＬＴＥ４抗体、抗１１－ｄｅｈｙｄｒｏ　ＴＸＢ２抗体、抗２，３－ｄｉｎｏｒ－８－ｉｓｏ　ＰＧＦ２α抗体、抗１３，１４－ｄｉｈｙｄｒｏ－１５－ｋｅｔｏ－ｔｅｔｒａｎｏｒ　ＰＧＦ１β抗体、抗６，１５－ｄｉｋｅｔｏ－１３，１４－ｄｉｈｙｄｒｏ　ＰＧＦ１α抗体、抗ｔｅｔｒａｎｏｒ－ＰＧＦＭ抗体、抗２０－ＯＨ　ＰＧＥ２抗体、抗ＰＧＥ３抗体、抗ＰＧＤ３抗体、抗１３，１４－ｄｉｈｙｄｒｏ－１５－ｋｅｔｏ－ｔｅｔｒａｎｏｒ　ＰＧＤ２抗体、及び抗１３，１４－ｄｉｈｙｄｒｏ－１５－ｋｅｔｏ－ｔｅｔｒａｎｏｒ　ＰＧＥ２抗体からなる群から選ばれる少なくとも一つを含むことを特徴とする食物アレルギーの尿検体検査用スティック。
［１５］さらに、抗ｔｅｔｒａｎｏｒ－ＰＧＤＭ抗体又は抗ｔｅｔｒａｎｏｒ－ＰＧＥＭ抗体を含む、［１４］に記載の食物アレルギーの尿検体検査用スティック。
本発明によれば、食物アレルギーの有無のみならず、発症リスクや重篤度を適切に評価することができる。さらに、アレルギー症状が出る前にリスクを評価して予防的治療を行うことができる。また、減感作療法に対する反応性を評価して、安全な範囲でなるべく多くアレルゲンを投与することにより、効率よく治療を進めることができる。
また、本発明の検査方法は、採血等の医療技術を必要とせず、本発明の尿検体検査用キット又は尿検体検査用スティックを用いて、小児から高齢者まで簡便に家庭で検査を行うことができる。
実施例１における無処置のマウスの尿検体中でのｔｅｔｒａｎｏｒ　ＰＧＤＭの含有量を１としたときの、食物アレルギーモデルマウスの尿検体中でのｔｅｔｒａｎｏｒ　ＰＧＤＭの含有量の相対値を示すグラフである。 実施例１における無処置のマウスの尿検体中でのｔｅｔｒａｎｏｒ　ＰＧＥＭの含有量を１としたときの、食物アレルギーモデルマウスの尿検体中でのｔｅｔｒａｎｏｒ　ＰＧＥＭの含有量の相対値を示すグラフである。 実施例１における無処置のマウスの尿検体中での１３，１４－ｄｉｈｙｄｒｏ－１５－ｋｅｔｏ－ｔｅｔｒａｎｏｒ　ＰＧＦ１βの含有量を１としたときの、食物アレルギーモデルマウスの尿検体中での１３，１４－ｄｉｈｙｄｒｏ－１５－ｋｅｔｏ－ｔｅｔｒａｎｏｒ　ＰＧＦ１βの含有量の相対値を示すグラフである。 実施例１における無処置のマウスの尿検体中での１３，１４－ｄｉｈｙｄｒｏ－１５－ｋｅｔｏ－ｔｅｔｒａｎｏｒ　ＰＧＤ２の含有量を１としたときの、食物アレルギーモデルマウスの尿検体中での１３，１４－ｄｉｈｙｄｒｏ－１５－ｋｅｔｏ－ｔｅｔｒａｎｏｒ　ＰＧＤ２の含有量の相対値を示すグラフである。 実施例１における無処置のマウスの尿検体中での１３，１４－ｄｉｈｙｄｒｏ－１５－ｋｅｔｏ－ｔｅｔｒａｎｏｒ　ＰＧＥ２の含有量を１としたときの、食物アレルギーモデルマウスの尿検体中での１３，１４－ｄｉｈｙｄｒｏ－１５－ｋｅｔｏ－ｔｅｔｒａｎｏｒ　ＰＧＥ２の含有量の相対値を示すグラフである。 実施例１における無処置のマウスの尿検体中での６，１５－ｄｉｋｅｔｏ－１３，１４－ｄｉｈｙｄｒｏ　ＰＧＦ１αの含有量を１としたときの、食物アレルギーモデルマウスの尿検体中での６，１５－ｄｉｋｅｔｏ－１３，１４－ｄｉｈｙｄｒｏ　ＰＧＦ１αの含有量の相対値を示すグラフである。 実施例１における無処置のマウスの尿検体中での２０－ＯＨ　ＰＧＥ２の含有量を１としたときの、食物アレルギーモデルマウスの尿検体中での２０－ＯＨ　ＰＧＥ２の含有量の相対値を示すグラフである。 実施例１における無処置のマウスの尿検体中でのＰＧＤ３の含有量を１としたときの、食物アレルギーモデルマウスの尿検体中でのＰＧＤ３の含有量の相対値を示すグラフである。 実施例１における無処置のマウスの尿検体中でのＰＧＥ３の含有量を１としたときの、食物アレルギーモデルマウスの尿検体中でのＰＧＥ３の含有量の相対値を示すグラフである。 実施例２における食物アレルギー負荷試験前のスコア０患者（ヒト）の尿検体中でのｔｅｔｒａｎｏｒ　ＰＧＤＭの含有量を１としたときの、食物アレルギー負荷試験後のスコア０患者、及び食物アレルギー負荷試験前後のスコア２患者（ヒト）の尿検体中でのｔｅｔｒａｎｏｒ　ＰＧＤＭの含有量の相対値を示すグラフである。 実施例２における食物アレルギー負荷試験前のスコア０患者（ヒト）の尿検体中でのｔｅｔｒａｎｏｒ　ＰＧＥＭの含有量を１としたときの、食物アレルギー負荷試験後のスコア０患者、及び食物アレルギー負荷試験前後のスコア２患者（ヒト）の尿検体中でのｔｅｔｒａｎｏｒ　ＰＧＥＭの含有量の相対値を示すグラフである。 実施例２における食物アレルギー負荷試験前のスコア０患者（ヒト）の尿検体中でのｔｅｔｒａｎｏｒ　ＰＧＦＭの含有量を１としたときの、食物アレルギー負荷試験後のスコア０患者、及び食物アレルギー負荷試験前後のスコア２患者（ヒト）の尿検体中でのｔｅｔｒａｎｏｒ　ＰＧＦＭの含有量の相対値を示すグラフである。 実施例２における食物アレルギー負荷試験前のスコア０患者（ヒト）の尿検体中での１３，１４－ｄｉｈｙｄｒｏ－１５－ｋｅｔｏ－ｔｅｔｒａｎｏｒ　ＰＧＦ１βの含有量を１としたときの、食物アレルギー負荷試験後のスコア０患者、及び食物アレルギー負荷試験前後のスコア２患者（ヒト）の尿検体中での１３，１４－ｄｉｈｙｄｒｏ－１５－ｋｅｔｏ－ｔｅｔｒａｎｏｒ　ＰＧＦ１βの含有量の相対値を示すグラフである。 実施例２における食物アレルギー負荷試験前のスコア０患者（ヒト）の尿検体中での１１－ｄｅｈｙｄｒｏ　ＴＸＢ２の含有量を１としたときの、食物アレルギー負荷試験後のスコア０患者、及び食物アレルギー負荷試験前後のスコア２患者（ヒト）の尿検体中での１１－ｄｅｈｙｄｒｏ　ＴＸＢ２の含有量の相対値を示すグラフである。 実施例２における食物アレルギー負荷試験前のスコア０患者（ヒト）の尿検体中での２，３－ｄｉｎｏｒ－８－ｉｓｏ　ＰＧＦ２αの含有量を１としたときの、食物アレルギー負荷試験後のスコア０患者、及び食物アレルギー負荷試験前後のスコア２患者（ヒト）の尿検体中での２，３－ｄｉｎｏｒ－８－ｉｓｏ　ＰＧＦ２αの含有量の相対値を示すグラフである。 実施例２における食物アレルギー負荷試験前のスコア０患者（ヒト）の尿検体中での１４，１５－ＬＴＥ４の含有量を１としたときの、食物アレルギー負荷試験後のスコア０患者、及び食物アレルギー負荷試験前後のスコア２患者（ヒト）の尿検体中での１４，１５－ＬＴＥ４の含有量の相対値を示すグラフである。 実施例２における食物アレルギー負荷試験前のスコア０患者（ヒト）の尿検体中での１１－ｔｒａｎｓ　ＬＴＥ４の含有量を１としたときの、食物アレルギー負荷試験後のスコア０患者、及び食物アレルギー負荷試験前後のスコア２患者（ヒト）の尿検体中での１１－ｔｒａｎｓ　ＬＴＥ４の含有量の相対値を示すグラフである。 実施例２における食物アレルギー負荷試験前のスコア０患者（ヒト）の尿検体中での１３，１４－ｄｉｈｙｄｒｏ－１５－ｋｅｔｏ－ｔｅｔｒａｎｏｒ　ＰＧＤ２の含有量を１としたときの、食物アレルギー負荷試験後のスコア０患者、及び食物アレルギー負荷試験前後のスコア２患者（ヒト）の尿検体中での１３，１４－ｄｉｈｙｄｒｏ－１５－ｋｅｔｏ－ｔｅｔｒａｎｏｒ　ＰＧＤ２の含有量の相対値を示すグラフである。 実施例２における食物アレルギー負荷試験前のスコア０患者（ヒト）の尿検体中での１３，１４－ｄｉｈｙｄｒｏ－１５－ｋｅｔｏ－ｔｅｔｒａｎｏｒ　ＰＧＥ２の含有量を１としたときの、食物アレルギー負荷試験後のスコア０患者、及び食物アレルギー負荷試験前後のスコア２患者（ヒト）の尿検体中での１３，１４－ｄｉｈｙｄｒｏ－１５－ｋｅｔｏ－ｔｅｔｒａｎｏｒ　ＰＧＥ２の含有量の相対値を示すグラフである。 実施例３における食物アレルギー負荷試験前後のスコア０及びスコア４患者（ヒト）の尿検体中でのｔｅｔｒａｎｏｒ　ＰＧＤＭの含有量（絶対値）を示すグラフである。 実施例３における食物アレルギー負荷試験前後のスコア０及びスコア４患者（ヒト）の尿検体中でのｔｅｔｒａｎｏｒ　ＰＧＥＭの含有量（絶対値）を示すグラフである。 実施例３における食物アレルギー負荷試験前後のスコア０及びスコア４患者（ヒト）の尿検体中での１１－ｄｅｈｙｄｒｏ　ＴＸＢ２の含有量（絶対値）を示すグラフである。 実施例３における食物アレルギー負荷試験前後のスコア０及びスコア４患者（ヒト）の尿検体中でのＬＴＥ４の含有量（絶対値）を示すグラフである。
＜食物アレルギーのバイオマーカー＞
　一実施形態として、本発明は、食物アレルギーを検査するためのバイオマーカーであって、Ｌｅｕｋｏｔｒｉｅｎｅ　Ｅ４（ＬＴＥ４）、１４，１５－ＬＴＥ４、１１－ｔｒａｎｓ　ＬＴＥ４、１１－ｄｅｈｙｄｒｏ　Ｔｈｒｏｍｂｏｘａｎｅ　Ｂ２（１１－ｄｅｈｙｄｒｏ　ＴＸＢ２）、２，３－ｄｉｎｏｒ－８－ｉｓｏ　Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ　Ｆ２α、１３，１４－ｄｉｈｙｄｒｏ－１５－ｋｅｔｏ－ｔｅｔｒａｎｏｒ　ＰＧＦ１β、６，１５－ｄｉｋｅｔｏ－１３，１４－ｄｉｈｙｄｒｏ　ＰＧＦ１α、ｔｅｔｒａｎｏｒ－Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ　Ｆ　Ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅ（ｔｅｔｒａｎｏｒ－ＰＧＦＭ）、２０－ｈｙｄｒｏｘｙ　Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ　Ｅ２（２０－ＯＨ　ＰＧＥ２）、ＰＧＥ３、Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ　Ｄ３（ＰＧＤ３）、１３，１４－ｄｉｈｙｄｒｏ－１５－ｋｅｔｏ－ｔｅｔｒａｎｏｒ　ＰＧＤ２、及び１３，１４－ｄｉｈｙｄｒｏ－１５－ｋｅｔｏ－ｔｅｔｒａｎｏｒ　ＰＧＥ２からなる群から選ばれる少なくとも一つからなる、バイオマーカーを提供する。
　本実施形態のバイオマーカーによれば、食物アレルギーの有無のみならず、発症リスクや重篤度を適切に評価することができる。
　本明細書において、「食物アレルギー」とは、食品中に含まれるアレルゲンが体内に取り込まれることで起こる様々なアレルギー反応を意味する。食物アレルギーとしては、例えば、鶏卵、牛乳、甲殻類、小麦、果物、ナッツ類、魚介類、蕎麦等であってよく、これら以外のアレルゲンによるアレルギーも含まれる。アレルギー症状としては、皮膚、粘膜、消化器、呼吸器などに生じ、下痢、嘔吐、皮膚炎などが代表的である。
　本明細書において、「食物アレルギーのバイオマーカー」とは、その量が、アレルギーの発症リスクやその症状の重篤度、予後の指標となる物質を意味する。
　本実施形態のバイオマーカーについて、具体的な脂質の名称、構造式、該脂質についての簡単な説明及び食物アレルギー症状発現に伴う尿検体中の含有量の増減を以下に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
　実施例に示す通り、食物アレルギー患者において、上述の１３種の脂質の尿検体中の含有量は一定期間増加又は減少が維持されるため、食物であると判断することができる。さらに、尿検体中の含有量の増加した値又は減少した値から、症状の重篤性を評価することができる。
　本明細書において、一定期間とは、例えば、食物アレルギーの原因となる物質を摂取してから３日以上、５日以上、７日以上、１０日以上、又は２０日以上を意味する。
　また、上述の１３種の脂質のうち、中でも、ＬＴＥ４、１１－ｄｅｈｙｄｒｏ　ＴＸＢ２、ｔｅｔｒａｎｏｒ－ＰＧＦＭ、又は１３，１４－ｄｉｈｙｄｒｏ－１５－ｋｅｔｏ－ｔｅｔｒａｎｏｒ　ＰＧＤ２が好ましく、１１－ｄｅｈｙｄｒｏ　ＴＸＢ２、又はｔｅｔｒａｎｏｒ－ＰＧＦＭがより好ましい。
　これらの脂質の量は、肥満細胞依存的に上昇又は減少すると考えられており、肥満細胞は、食物アレルギーが起こる消化管の粘膜に非常に多く存在することが知られている。よって、食物を摂取し、消化される際に、上述の脂質の量が変化を、被検者から血液、尿、又は便を採取することによって、食物アレルギーの有無、及び発症リスクや重篤度を適切に評価することができる。中でも、非侵襲的に採取することができ、含有量が多いことから、上述のバイオマーカーを測定する場合には、尿を試料として用いることが好ましい。
＜食物アレルギーの検査方法＞
　一実施形態において、本発明は、被検者の尿検体中のバイオマーカーの含有量を測定する工程を備えた食物アレルギーの検査方法であって、前記バイオマーカーがＬＴＥ４、１４，１５－ＬＴＥ４、１１－ｔｒａｎｓ　ＬＴＥ４、１１－ｄｅｈｙｄｒｏ　ＴＸＢ２、２，３－ｄｉｎｏｒ－８－ｉｓｏ　Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ　Ｆ２α、１３，１４－ｄｉｈｙｄｒｏ－１５－ｋｅｔｏ－ｔｅｔｒａｎｏｒ　ＰＧＦ１β、６，１５－ｄｉｋｅｔｏ－１３，１４－ｄｉｈｙｄｒｏ　ＰＧＦ１α、ｔｅｔｒａｎｏｒ－ＰＧＦＭ、２０－ＯＨ　ＰＧＥ２、ＰＧＥ３、ＰＧＤ３、１３，１４－ｄｉｈｙｄｒｏ－１５－ｋｅｔｏ－ｔｅｔｒａｎｏｒ　ＰＧＤ２、及び１３，１４－ｄｉｈｙｄｒｏ－１５－ｋｅｔｏ－ｔｅｔｒａｎｏｒ　ＰＧＥ２からなる群から選ばれる少なくとも一つである、方法を提供する。
　本実施形態の検査方法によれば、食物アレルギーの有無のみならず、発症リスクや重篤度を適切に評価することができる。さらに、アレルギー症状が出る前にリスクを評価して予防的治療を行うことができる。
　本実施形態の検査方法は、採血等の医療技術を必要とせず、後述の尿検体検査用キット又は尿検体検査用スティックを用いて、小児から高齢者まで簡便に家庭で検査を行うことができる。
　本明細書において、「被検者」とは、食物アレルギーの可能性がある者、食物アレルギーを現に発症した者、食物アレルギーの治療を受けている者、食物アレルギーの治療薬を服用している者、食物アレルギーを有するかどうか不明な者等を意味する。また、「被検者」としては、例えば、ヒトに限らず、マウス、ラット、ウサギ、ネコ、イヌ、サル、ブタ、ヒツジ、ウシ、ウマ等の哺乳動物であってもよい。
［測定工程］
　測定工程において、被検者より採取した尿を試料として用いる。本実施形態の検査方法に用いられる尿は、常法に従って採取したものを用いることができる。一回の尿であってもよく、二回以上の蓄尿であってもよい。採取した尿は、測定まで室温で保存してもよく、－４０℃以下、例えば－８０℃で保存してもよい。凍結した尿は、急速に融解させて測定に用いることができる。
　なお、上述の＜食物アレルギーのバイオマーカー＞に記載したとおり、前記バイオマーカーは、被検者の血液、尿、又は便に含まれるが、非侵襲的に採取することができ、含有量が多いことから、尿を試料として用いることが好ましい。
　上述のバイオマーカーの尿検体中の含有量の測定方法は、溶液中の特定の物質を検出、測定するためのあらゆる方法を用いて行うことができる。本明細書において、「バイオマーカーの尿検体中の含有量の測定方法」という場合、その量を正確に測定するだけでなく、有無を検出すること、又は一定量より多いか少ないかだけを判定することも含む。上述のバイオマーカーの尿検体中の含有量は、クレアチニン等の基準物質の量により補正してもよい。
また、さらに、上述の１３種の脂質のうち少なくともいずれか一つに加えて、ｔｅｔｒａｎｏｒ　ＰＧＤＭ又はｔｅｔｒａｎｏｒ　ＰＧＥＭの含有量を測定することが好ましく、ｔｅｔｒａｎｏｒ　ＰＧＤＭ及びｔｅｔｒａｎｏｒ　ＰＧＥＭの含有量を測定することがより好ましい。
　ｔｅｔｒａｎｏｒ　ＰＧＤＭ又はｔｅｔｒａｎｏｒ　ＰＧＥＭは、国際公開第２０１６／０２１７０４号に記載の食物アレルギーのバイオマーカーであって、本発明者らによって見出されたものである。
　脂質の産生及び代謝機構については、脂質の種類が多く、詳細は明らかにされていないが、ＰＧＤ２及びＴＸＢ２、並びにこれらの代謝産物（例えば、ｔｅｔｒａｎｏｒ　ＰＧＤＭ、１１－ｄｅｈｙｄｒｏ　ＴＸＢ２）は、肥満細胞由来のものであると考えられ、また、上述の１３種の脂質のうち、ＰＧＤ２及びＴＸＢ２の代謝産物以外の脂質は、肥満細胞由来のもの又はその活性によって起こる二次的な炎症反応産物であると考えられる。
　よって、上述の１３種の脂質に加えて、ｔｅｔｒａｎｏｒ　ＰＧＤＭ又はｔｅｔｒａｎｏｒ　ＰＧＥＭの含有量を測定することにより、複数の脂質を指標とすることができ、食物アレルギーの有無、及び発症リスクや重篤度をより高い精度で判定することができる。
　上述のバイオマーカーの尿検体中の含有量の測定方法としては、例えば、イムノアッセイ、凝集法、比濁法、ウエスタンブロッティグ法、表面プラズモン共鳴（Ｓｕｒｆａｃｅ　Ｐｌａｓｍｏｎ　Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ；ＳＰＲ）法、各種クロマトグラフィー技術を用いた方法（例えば、ガスクロマトグラフィー法、液体クロマトグラフィー法、高速液体クロマトグラフィー法等）、質量分析法等が挙げられ、これらに限定されない。この中でも、上述のバイオマーカーに特異的に結合する抗体と、尿検体中の上述のバイオマーカーとの抗原抗体反応を利用して、尿検体中の上述のバイオマーカーの含有量を測定するイムノアッセイ又は質量分析法が好ましい。
（イムノアッセイ）
　イムノアッセイは、検出可能に標識された上述のバイオマーカーに特異的に結合する抗体、又は、検出可能に標識された上述のバイオマーカーのうちいずれか一つに特異的に結合する抗体に対する抗体（二次抗体）を用いればよい。抗体の標識方法としては、例えば、エンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡ（Ｅｎｚｙｍｅ　ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）又はＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ－ｌｉｎｋｅｄ　ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ　ａｓｓａｙ））、ラジオイムノアッセイ（Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ；ＲＩＡ）、蛍光イムノアッセイ（Ｆｌｕｏｒｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ；ＦＩＡ）、蛍光偏光イムノアッセイ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ　ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ；ＦＰＩＡ）、化学発光イムノアッセイ（Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ　Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ；ＣＬＩＡ）等が挙げられる。
　ＥＬＩＳＡ法では、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ等の酵素、ＲＩＡ法では、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓ、３Ｈ等の放射性物質、ＦＰＩＡ法では、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ダンシルクロリド、フィコエリトリン、テトラメチルローダミンイソチオシアネート、近赤外蛍光材料等の蛍光物質、ＣＬＩＡ法では、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、エクオリン等の発光物質で標識された抗体が用いられる。その他、金コロイド、量子ドット等のナノ粒子で標識された抗体を用いてもよい。
　また、イムノアッセイでは、ビオチンで標識された上述のバイオマーカーに特異的に結合する抗体を用いて、酵素等で標識されたアビジン又はストレプトアビジンを結合させることで検出することもできる。
イムノアッセイの中でも、酵素標識を用いるＥＬＩＳＡ法は、簡便且つ迅速に抗原を測定することができる。ＥＬＩＳＡ法には競合法とサンドイッチ法とがある。
競合法では、マイクロプレート等の固相担体に、上述のバイオマーカーのうち、例えば、ＬＴＥ４に特異的に結合する抗体（以下、「抗ＬＴＥ４抗体」と呼ぶ。）を固定し、尿検体と、酵素標識された抗原として、前記抗体と反応する酵素標識されたＬＴＥ４とを添加して、抗原抗体反応を生じさせる。いったん洗浄した後、酵素基質と反応、発色させ、吸光度を測定する。尿検体中のＬＴＥ４の含有量が多ければ発色は弱くなり、尿検体中のＬＴＥ４の含有量が少なければ発色は強くなるので、検量線を用いて、ＬＴＥ４の尿検体中の含有量を求めることができる。ＬＴＥ４以外のバイオマーカーを用いた場合においても、同様の方法により、含有量を求めることができる。
　サンドイッチ法では、固相担体に、例えば抗ＬＴＥ４抗体を固定し、尿検体を添加し、反応させた後、さらに酵素で標識された同じ抗原（ＬＴＥ４）の別のエピトープを認識する抗ＬＴＥ４抗体を添加して反応させる。洗浄後、酵素基質と反応、発色させ、吸光度を測定することにより、ＬＴＥ４の尿検体中の含有量を求めることができる。ＬＴＥ４以外のバイオマーカーを用いた場合においても、同様の方法により、含有量を求めることができる。
また、サンドイッチ法では、前記固相担体に固定した抗ＬＴＥ４抗体と、尿検体中の抗原（ＬＴＥ４）を反応させた後、まず非標識の同じ抗原（ＬＴＥ４）の別のエピトープを認識する抗ＬＴＥ４抗体を添加し、この非標識の抗ＬＴＥ４抗体に対する抗体（二次抗体）を酵素標識してさらに添加してもよい。
　酵素基質は、酵素がペルオキシダーゼの場合、３，３’－ｄｉａｍｉｎｏｂｅｎｚｉｄｉｎｅ（ＤＡＢ）、３，３’，５，５’－ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ（ＴＭＢ）、ｏ－ｐｈｅｎｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ（ＯＰＤ）等を用いることができ、アルカリホスファターゼの場合、ｐ－ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙ　ｐｈｏｓｐｈａｓｅ（ＮＰＰ）等を用いることができる。
　本明細書において、「固相担体」は、抗体を固定できる担体であれば特別な限定はなく、固相担体の形状としては、例えば、マイクロタイタープレート、基板、ビーズ、メンブレン等が挙げられる。固相担体の材質としては、シリカ、アルミナ、ガラス、金属等の無機物質、熱可塑性樹脂（例えば、ナイロン、ポリフッ化ビニリデン（ＰｏｌｙＶｉｎｙｌｉｄｅｎｅ　ＤｉＦｌｕｏｒｉｄｅ；ＰＶＤＦ）等）、ニトロセルロース等の有機高分子物質が挙げられる。標識物質又は抗体は、上述の固相担体に公知の方法に従って固定することができる。
　上述のバイオマーカーのうちいずれか一つに特異的に結合する抗体は、モノクローナル抗体であってもよく、ポリクローナル抗体であってもよく、いずれの抗体も公知の方法に従って、作製することができる。モノクローナル抗体は、例えば、上述のバイオマーカーのうちいずれか一つで免疫した非ヒト哺乳動物から抗体産生細胞を単離し、これを骨髄種細胞等と融合させてハイブリドーマを作製し、このハイブリドーマが産生した抗体を精製することによって得ることができる。また、ポリクローナル抗体は、例えば、上述のバイオマーカーのうちいずれか一つで免疫した非ヒト哺乳動物の血清から得ることができる。
（質量分析法）
　測定工程において、質量分析法を用いる場合、測定工程の前に尿検体中に含まれる代謝物質を分離するための分離工程を備えていてもよい。分離工程では、尿検体中に含まれる代謝物質の時間分解分離が得られる。分離方法としては、すべてのクロマトグラフィー分離技術を用いることができ、より具体的には、例えば、液体クロマトグラフィー（Ｌｉｑｕｉｄ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ；ＬＣ）、高速液体クロマトグラフィー（Ｈｉｇｈ　ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　ｌｉｑｕｉｄ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ；ＨＰＬＣ）、ガスクロマトグラフィー（Ｇａｓ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ；ＧＣ）、薄層クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等が挙げられる。
　また、分離工程において、上述のバイオマーカーのうち、１１－ｄｅｈｙｄｒｏ　ＴＸＢ２、ｔｅｔｒａｎｏｒ－ＰＧＦＭｔｅｔｒａｎｏｒ　ＰＧＤＭ、及びｔｅｔｒａｎｏｒ　ＰＧＥＭは尿検体中からの分離条件が近しいため、質量分析法を用いた測定においては、好ましくは１１－ｄｅｈｙｄｒｏ　ＴＸＢ２、ｔｅｔｒａｎｏｒ－ＰＧＦＭｔｅｔｒａｎｏｒ　ＰＧＤＭ、又はｔｅｔｒａｎｏｒ　ＰＧＥＭ、より好ましくは１１－ｄｅｈｙｄｒｏ　ＴＸＢ２、ｔｅｔｒａｎｏｒ－ＰＧＦＭｔｅｔｒａｎｏｒ　ＰＧＤＭ、及びｔｅｔｒａｎｏｒ　ＰＧＥＭを標的のバイオマーカーとすればよい。
　測定工程において用いられる質量分析（ｍａｓｓ　ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）法としては、例えば、ガスクロマトグラフィー質量分析（ＧＣ－ＭＳ）法、液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ－ＭＳ）法、直接注入質量分析法若しくはフーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴質量分析（Ｆｏｕｒｉｅｒ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍ　ｉｏｎ　ｃｙｃｌｏｔｒｏｎ　ｒｅｓｏｎａｎｃｅ　ｍａｓｓ　ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ；ＦＴ－ＩＣＲ－ＭＳ）法、キャピラリー電気泳動質量分析（Ｃａｐｉｌｌａｒｙ　Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ　ｍａｓｓ　ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ；ＣＥ－ＭＳ）法、高速液体クロマトグラフィー結合質量分析（ＨＰＬＣ－ＭＳ）法、四重極質量分析法、上述の分離方法と結合したタンデム質量分析法（例えば、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ法、ＨＰＬＣ－ＭＳ／ＭＳ法等）、誘導結合プラズマ質量分析（Ｉｎｄｕｃｔｉｖｅｌｙ　Ｃｏｕｐｌｅｄ　Ｐｌａｓｍａ　ｍａｓｓ　ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ；ＩＣＰ－ＭＳ）法、熱分解質量分析（Ｐｙｒｏｌｙｓｉｓ　Ｍａｓｓ　Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ；Ｐｙ－ＭＳ）法、イオン移動度質量分析法、飛行時間質量分析（Ｔｉｍｅ－ｏｆ－Ｆｌｉｇｈｔ　ｍａｓｓ　ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅ；ＴＯＦ　ＭＳ）法等が挙げられる。中でも、質量分析法としては、ＬＣ－ＭＳ法又は上述の分離方法と結合したタンデム質量分析法が好ましい。
測定工程において、質量分析法を用いる場合、尿検体中の上述のバイオマーカーの含有量を定量するために、内部標準を尿検体に加える前処理工程を備えていてもよい。内部標準としては、例えば、重水素化ＬＴＣ４、重水素化６－ｋｅｔｏ－ＰＧＦ１α、重水素化ｔｅｔｒａｎｏｒ－ＰＧＤＭ、重水素化ｔｅｔｒａｎｏｒ－ＰＧＥＭ、重水素化ＰＧＥ２等が挙げられ、これらを単独で用いてもよく、組み合わせて用いてもよい。
［評価工程］
　本実施形態の検査方法において、上述の［測定工程］の後に、尿検体中の上述のバイオマーカーの含有量に基づき、食物アレルギーの発症リスクや重篤度を評価する評価工程を備えていてもよい。
　評価工程において、上述のバイオマーカーのうち、ＬＴＥ４、１４，１５－ＬＴＥ４、１１－ｔｒａｎｓ　ＬＴＥ４、１１－ｄｅｈｙｄｒｏ　ＴＸＢ２、２，３－ｄｉｎｏｒ－８－ｉｓｏ　ＰＧＦ２α、１３，１４－ｄｉｈｙｄｒｏ－１５－ｋｅｔｏ－ｔｅｔｒａｎｏｒ　ＰＧＦ１β、６，１５－ｄｉｋｅｔｏ－１３，１４－ｄｉｈｙｄｒｏ　ＰＧＦ１α、ｔｅｔｒａｎｏｒ－ＰＧＦＭ、２０－ＯＨ　ＰＧＥ２、１３，１４－ｄｉｈｙｄｒｏ－１５－ｋｅｔｏ－ｔｅｔｒａｎｏｒ　ＰＧＤ２及び１３，１４－ｄｉｈｙｄｒｏ－１５－ｋｅｔｏ－ｔｅｔｒａｎｏｒ　ＰＧＥ２からなる群から選ばれる少なくとも一つの尿検体中の含有量がより多いときに、食物アレルギーの症状が重篤である若しくは重篤になった、又は、食物アレルギーを発症するリスクが高い若しくは高くなったと判断することができる。
また、上述のバイオマーカーのうち、ＰＧＥ３又はＰＧＤ３の尿検体中の含有量がより少ないときに、食物アレルギーの症状が重篤である若しくは重篤になった、又は、食物アレルギーを発症するリスクが高い若しくは高くなったと判断することができる。
　尿検体中の上述のバイオマーカーの含有量は、同一個体から複数回採取した尿検体中の上述のバイオマーカーの含有量を測定して結果を比較して判断してもよい。この場合、同一個体における重篤度や発症リスクの変化を評価することができる。また、尿検体中の上述のバイオマーカーの含有量がより多いか否かは、複数人から採取した尿検体中の上述のバイオマーカーの含有量を測定して結果を比較してもよい。この場合、他の人と比較して、重篤度や発症リスクが高いかどうかを評価することができる。
　また、評価工程において、上述のバイオマーカーのうち、ＬＴＥ４、１４，１５－ＬＴＥ４、１１－ｔｒａｎｓ　ＬＴＥ４、１１－ｄｅｈｙｄｒｏ　ＴＸＢ２、２，３－ｄｉｎｏｒ－８－ｉｓｏ　ＰＧＦ２α、１３，１４－ｄｉｈｙｄｒｏ－１５－ｋｅｔｏ－ｔｅｔｒａｎｏｒ　ＰＧＦ１β、６，１５－ｄｉｋｅｔｏ－１３，１４－ｄｉｈｙｄｒｏ　ＰＧＦ１α、ｔｅｔｒａｎｏｒ－ＰＧＦＭ、２０－ＯＨ　ＰＧＥ２、１３，１４－ｄｉｈｙｄｒｏ－１５－ｋｅｔｏ－ｔｅｔｒａｎｏｒ　ＰＧＤ２及び１３，１４－ｄｉｈｙｄｒｏ－１５－ｋｅｔｏ－ｔｅｔｒａｎｏｒ　ＰＧＥ２からなる群から選ばれる少なくとも一つの尿検体中の含有量が所定の値より多いときに、食物アレルギーの症状が重篤である若しくは重篤になった、又は、食物アレルギーを発症するリスクが高い若しくは高くなったと判断することができる。一方、所定の値より低いときに、食物アレルギーの症状が軽い若しくは軽くなった、又は、食物アレルギーを発症するリスクが低い若しくは低くなったと判断することができる。
また、上述のバイオマーカーのうち、ＰＧＥ３又はＰＧＤ３の尿検体中の含有量が所定の値より少ないときに、食物アレルギーの症状が重篤である若しくは重篤になった、又は、食物アレルギーを発症するリスクが高い若しくは高くなったと判断することができる。一方、所定の値より高いときに、食物アレルギーの症状が軽い若しくは軽くなった、又は、食物アレルギーを発症するリスクが低い若しくは低くなったと判断することができる。
　所定値（カットオフ値）は、複数の健常者又は非食物アレルギー患者の尿検体における上述のバイオマーカーの含有量と、複数の食物アレルギー患者の尿検体における上述のバイオマーカーの含有量とを比較して、常法により決定することができる。
　また、上述の１３種のバイオマーカーに加えて、さらに、ｔｅｔｒａｎｏｒ－ＰＧＤＭ又はｔｅｔｒａｎｏｒ－ＰＧＥＭの尿検体中の含有量による判断を行うことで、より高い精度で食物アレルギーの症状及び発症リスクを判定することができる。より具体的には、尿中のｔｅｔｒａｎｏｒ－ＰＧＤＭ量が所定の値より高い場合に、症状が重篤である、又は発症リスクが高いと判断され、所定の値より低い場合に、症状が軽い、又は発症リスクが低いと判断される。また、尿中ｔｅｔｒａｎｏｒ－ＰＧＤＭ量は一定期間上昇が維持され、尿中ｔｅｔｒａｎｏｒ－ＰＧＥＭ量は一過性に上昇してすぐに低下する場合、食物アレルギーであると判断することができる。一方で、尿中ｔｅｔｒａｎｏｒ－ＰＧＤＭ量に変化がなく、尿中ｔｅｔｒａｎｏｒ－ＰＧＥＭ量が持続的に高値である場合、食物アレルギー以外の炎症関連性疾患の罹患を示唆することができる。
　評価工程において、食物アレルギーにおける肥満細胞の活性化も評価することができる。
　本明細書において、「肥満細胞の活性化」とは、肥満細胞の数の増大、脱顆粒の増加及び活性物質産生量の増加を意味する。尿検体中の上述のバイオマーカーの含有量は、肥満細胞の増加に伴い増加又は減少し、脱顆粒抑制下では、減少または増加する。よって、尿検体中の上述のバイオマーカーの含有量を指標として、肥満細胞の活性化を評価することができる。
［用途］
　本実施形態の検査方法は、食物アレルギー患者に投与する治療薬、又は患者に対して行う治療方法の評価に用いることができる。例えば、治療開始前から治療開始後の任意の時点で採取した尿検体における上述のバイオマーカーの含有量を測定し、上述のバイオマーカーの含有量が減少又は増加する場合には、その治療薬又は治療方法は有効であると判断することができる。一方、上述のバイオマーカーの含有量が減少しない若しくは増加する又は増加しない又は減少する場合には、その治療薬又は治療方法は有効ではないと判断することができる。このとき、上述のバイオマーカーの含有量の減少または増加は、有意な減少又は増加でなくてもよく、減少または増加の傾向があると当業者が判断できる程度であってもよい。
　患者に対して行う治療方法としては、例えば減感作療法等が挙げられる。減感作療法の投与経路、投与量及び投与頻度については、特別な限定はなく、患者の年齢、体重、症状などの様々な条件に応じて、適宜選択することができる。投与経路としては、例えば、皮内、皮下、筋肉内、腹腔内、経皮、経粘膜、経口、吸入等により個体に投与する経路が挙げられる。
　本実施形態の検査方法は、食物アレルギーの治療薬の開発のための動物実験において、その薬の効果を評価するために用いてもよい。
　本実施形態の検査方法は、診断に必要な情報を得るために、被検者から採取した試料を調べる際に用いてもよい。かかる検査方法は、例えば検査会社等で実施することができる。
＜尿検体検査用キット＞
　一実施形態において、本発明は、抗ＬＴＥ４抗体、抗１４，１５－ＬＴＥ４抗体、抗１１－ｔｒａｎｓ　ＬＴＥ４抗体、抗１１－ｄｅｈｙｄｒｏ　ＴＸＢ２抗体、抗２，３－ｄｉｎｏｒ－８－ｉｓｏ　ＰＧＦ２α抗体、抗１３，１４－ｄｉｈｙｄｒｏ－１５－ｋｅｔｏ－ｔｅｔｒａｎｏｒ　ＰＧＦ１β抗体、抗６，１５－ｄｉｋｅｔｏ－１３，１４－ｄｉｈｙｄｒｏ　ＰＧＦ１α抗体、抗ｔｅｔｒａｎｏｒ－ＰＧＦＭ抗体、抗２０－ＯＨ　ＰＧＥ２抗体、抗ＰＧＥ３抗体、抗ＰＧＤ３抗体、抗１３，１４－ｄｉｈｙｄｒｏ－１５－ｋｅｔｏ－ｔｅｔｒａｎｏｒ　ＰＧＤ２抗体及び抗１３，１４－ｄｉｈｙｄｒｏ－１５－ｋｅｔｏ－ｔｅｔｒａｎｏｒ　ＰＧＥ２抗体からなる群（前記１３種の抗体をまとめて、以下、「上述のバイオマーカーに特異的に結合する抗体」と呼ぶ。）から選ばれる少なくとも一つを含む、食物アレルギーの尿検体検査用キットを提供する。
　本実施形態の尿検体検査用キットは、上述の検査方法を使用して食物アレルギーの検査を行うために使用するものであり、小児から高齢者まで簡便に家庭で検査を行うことができる。
　本実施形態の尿検体検査用キットは、さらに、抗ｔｅｔｒａｎｏｒ－ＰＧＤＭ抗体又は抗ｔｅｔｒａｎｏｒ－ＰＧＥＭ抗体を含んでいてもよい。本実施形態の尿検体検査用キットを用いて、上述の１３種の脂質のうち少なくともいずれか一つに加えて、ｔｅｔｒａｎｏｒ　ＰＧＤＭ又はｔｅｔｒａｎｏｒ　ＰＧＥＭの含有量を測定することにより、複数の脂質を指標とすることができ、食物アレルギーの有無、及び発症リスクや重篤度をより高い精度で判定することができる。
　本実施形態の尿検体検査用キットは、上述のバイオマーカーに特異的に結合する抗体を利用するイムノアッセイに用いることができ、上述のバイオマーカーの含有量を測定するために必要な試薬及び装置を含んでいてもよい。
［サンドイッチ法による測定（１）］
　本実施形態の尿検体検査用キットは、サンドイッチ法によって、例えば、上述のバイオマーカーのうちＬＴＥ４の含有量を測定する場合には、マイクロタイタープレート；抗原（ＬＴＥ４）捕捉用の抗ＬＴＥ４抗体（以下、「捕捉用抗体１」と呼ぶ。）；ペルオキシダーゼ又はアルカリホスファターゼで標識された抗ＬＴＥ４抗体（以下、「標識抗体１」と呼ぶ。）；及び、ペルオキシダーゼ基質（例えば、ＤＡＢ、ＴＭＢ、ＯＰＤ等）又はアルカリホスファターゼ基質（例えば、ＮＰＰ等）を含んでいてもよい。
捕捉用抗体１と標識抗体１は、抗原（ＬＴＥ４）の異なるエピトープを認識するものであることが好ましい。
　このような尿検体検査用キットの使用例を以下に説明する。まず、マイクロタイタープレートに捕捉用抗体１を固定する。続いて、ここに尿検体を適宜希釈して添加し、インキュベートする。続いて、尿検体を除去して洗浄する。続いて、標識抗体１を添加し、インキュベートする。続いて、基質を加えて発色させる。マイクロタイタープレートリーダー等を用いて、発色を測定することにより、ＬＴＥ４の含有量を求めることができる。
　ＬＴＥ４以外のバイオマーカーに特異的に結合する抗体を用いた場合においても、同様の方法により、含有量を求めることができる。
［サンドイッチ法による測定（２）］
　本実施形態の尿検体検査用キットは、二次抗体を使用したサンドイッチ法によって、例えば、上述のバイオマーカーのうちＬＴＥ４の含有量を測定する場合には、マイクロタイタープレート；抗原（ＬＴＥ４）捕捉用の抗ＬＴＥ４抗体（以下、「捕捉用抗体２」と呼ぶ。）；一次抗体としての抗ＬＴＥ４抗体（以下、「一次抗体１」と呼ぶ。）；二次抗体としての、ペルオキシダーゼ又はアルカリホスファターゼで標識された抗ＬＴＥ４抗体に対する抗体（以下、「二次抗体１」と呼ぶ。）；及び、ペルオキシダーゼ基質（例えば、ＤＡＢ、ＴＭＢ、ＯＰＤ等）又はアルカリホスファターゼ基質（例えば、ＮＰＰ等）を含んでいてもよい。
　捕捉用抗体２と一次抗体１は、抗原（ＬＴＥ４）の異なるエピトープを認識するものであることが好ましい。
　このような尿検体検査用キットの使用例を以下に説明する。まず、マイクロタイタープレートに捕捉用抗体２を固定する。続いて、ここに尿検体を適宜希釈して添加し、インキュベートする。続いて、尿検体を除去して洗浄する。続いて、一次抗体１を添加してインキュベートし、洗浄する。続いて、二次抗体を添加してインキュベートし、基質を加えて発色させる。マイクロタイタープレートリーダー等を用いて、発色を測定することにより、ＬＴＥ４の含有量を求めることができる。また、二次抗体１を用いることにより、反応が増幅されて、検出感度を高めることができる。
　ＬＴＥ４以外のバイオマーカーに特異的に結合する抗体を用いた場合においても、同様の方法により、含有量を求めることができる。
　上述の標識抗体１及び上述の二次抗体１は、酵素標識された抗体に限定されず、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓ、３Ｈ等の放射性物質、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ダンシルクロリド、フィコエリトリン、テトラメチルローダミンイソチオシアネート、近赤外蛍光材料等の蛍光物質、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、エクオリン等の発光物質、金コロイド、量子ドット等のナノ粒子等で標識された抗体であってもよい。
また、上述の標識抗体１及び上述の二次抗体１は、ビオチン化抗体であってもよく、この場合、本実施形態の尿検体検査用キットは、標識されたアビジン又はストレプトアビジンを含んでいてもよい。
［質量分析法による測定］
　本実施形態の尿検体検査用キットは、質量分析法により上述のバイオマーカーを測定する場合には、さらに、内部標準として、重水素化ＬＴＣ４、重水素化６－ｋｅｔｏ－ＰＧＦ１α、重水素化ｔｅｔｒａｎｏｒ－ＰＧＥＭ、及び重水素化ＰＧＥ２からなる群から選ばれる少なくとも一つを含んでいてもよい。これらを内部標準とすることにより、尿検体中の上述のバイオマーカーの含有量を測定する際に、分析毎の抽出効率及びイオン化効率を補正することができる。
　重水素化ＬＴＣ４としては、例えばＬＴＣ４－ｄ５等が挙げられる。重水素化６－ｋｅｔｏ－ＰＧＦ１αとしては、例えば、６－ｋｅｔｏ－ＰＧＦ１α－ｄ４等が挙げられる。重水素化ｔｅｔｒａｎｏｒ－ＰＧＥＭとしては、例えばｔｅｔｒａｎｏｒ－ＰＧＥＭ－ｄ６等が挙げられる。重水素化ＰＧＥ２としては、例えばＰＧＥ２－ｄ４等が挙げられる。
　本実施形態の尿検体検査用キットは、さらに、重水素化ｔｅｔｒａｎｏｒ－ＰＧＤＭを含んでいてもよい。本実施形態の尿検体検査用キットを用いて、上述の１３種の脂質のうち少なくともいずれか一つに加えて、ｔｅｔｒａｎｏｒ　ＰＧＤＭ又はｔｅｔｒａｎｏｒ　ＰＧＥＭの含有量を測定することにより、複数の脂質を指標とすることができ、食物アレルギーの有無、及び発症リスクや重篤度をより高い精度で判定することができる。
　重水素化ｔｅｔｒａｎｏｒ－ＰＧＤＭとしては、例えば、ｔｅｔｒａｎｏｒ－ＰＧＤＭ－ｄ６等が挙げられる。
　本実施形態の尿検体検査用キットは、さらに、必要な緩衝液、酵素反応停止液、マクロプレートリーダー等を含んでいてもよい。
　本実施形態の尿検体検査用キットは、食物アレルギーにおける肥満細胞の活性化の評価に用いることができる。
＜尿検体検査用スティック＞
　一実施形態として、本発明は、抗ＬＴＥ４抗体、抗１４，１５－ＬＴＥ４抗体、抗１１－ｔｒａｎｓ　ＬＴＥ４抗体、抗１１－ｄｅｈｙｄｒｏ　ＴＸＢ２抗体、抗２，３－ｄｉｎｏｒ－８－ｉｓｏ　ＰＧＦ２α抗体、抗１３，１４－ｄｉｈｙｄｒｏ－１５－ｋｅｔｏ－ｔｅｔｒａｎｏｒ　ＰＧＦ１β抗体、抗６，１５－ｄｉｋｅｔｏ－１３，１４－ｄｉｈｙｄｒｏ　ＰＧＦ１α抗体、抗ｔｅｔｒａｎｏｒ－ＰＧＦＭ抗体、抗２０－ＯＨ　ＰＧＥ２抗体、抗ＰＧＥ３抗体、抗ＰＧＤ３抗体、抗１３，１４－ｄｉｈｙｄｒｏ－１５－ｋｅｔｏ－ｔｅｔｒａｎｏｒ　ＰＧＤ２抗体及び抗１３，１４－ｄｉｈｙｄｒｏ－１５－ｋｅｔｏ－ｔｅｔｒａｎｏｒ　ＰＧＥ２抗体からなる群から選ばれる少なくとも一つを含む、食物アレルギーの尿検体検査用スティックを提供する。
　本実施形態の尿検体検査用スティックは、上述の検査方法を使用して食物アレルギーの検査を行うために使用するものであり、小児から高齢者まで簡便に家庭で検査を行うことができる。
　本実施形態の尿検体検査用スティックは、スティック状の検査薬であって、例えば、尿検体の上述のバイオマーカーの含有量が色のついたライン等で可視化されるものであればよい。
　本実施形態の尿検体検査用スティックは、さらに、抗ｔｅｔｒａｎｏｒ－ＰＧＤＭ抗体又は抗ｔｅｔｒａｎｏｒ－ＰＧＥＭ抗体を含んでいてもよい。本実施形態の尿検体検査用スティックを用いて、上述の１３種の脂質のうち少なくともいずれか一つに加えて、ｔｅｔｒａｎｏｒ　ＰＧＤＭ又はｔｅｔｒａｎｏｒ　ＰＧＥＭを検出することにより、複数の脂質を指標とすることができ、食物アレルギーの有無、及び発症リスクや重篤度をより高い精度で判定することができる。
　尿検体検査用スティックとしては、公知のものを用いることができ、例えば、イムノクロマト法等を利用した構成とすることができる。
本実施形態の尿検体検査用スティックは、イムノクロマト法により、例えば、上述のバイオマーカーのうちＬＴＥ４の含有量を測定する場合には、金コロイドなどで標識された第１の抗ＬＴＥ４抗体が格納された抗体格納部と、ＬＴＥ４の別のエピトープを認識する第２の抗ＬＴＥ４抗体とが、セルロース膜などにライン状に固定化された判定部が細い溝でつながれた構成とすることができる。
　このような尿検体検査用スティックの使用例を以下に説明する。尿検体検査用スティックに尿検体を添加し、抗体格納部で第１の抗ＬＴＥ４抗体と、ＬＴＥ４とを抗原抗体反応させ、ＬＴＥ４－第１の抗ＬＴＥ４抗体複合体を形成させる。続いて、前記複合体が毛細管現象により溝を通って、判定部に移動する。続いて、前記複合体が、判定部に固定された第２の抗ＬＴＥ４抗体に捕捉される。続いて、金コロイドのプラズモン効果により、赤色のラインが判定部に出現することで、ＬＴＥ４を検出することができる。
　ＬＴＥ４以外のバイオマーカーに特異的に結合する抗体を用いた場合においても、同様の方法により、検出することができる。
　本実施形態の尿検体検査用スティックは、食物アレルギーにおける肥満細胞の活性化の評価に用いることができる。
　以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
［実施例１］食物アレルギーモデルマウスにおける尿検体中脂質メディエーターの動態
（１）オボアルブミン（Ｏｖａｌｂｕｍｉｎ；ＯＶＡ）誘導性食物アレルギーモデルマウスの作製
（１－１）感作条件
　野生型のＢＡＬＢ／ｃマウス（６～１２週齢、雌）にオボアルブミン（Ｏｖａｌｂｕｍｉｎ；ＯＶＡ）５０μｇ及びミョウバン１ｍｇを腹腔内投与し、２週間後にＯＶＡ５０μｇを腹腔内投与することにより、感作した。
（１－２）刺激条件
続いて、２回目の投与から２週間後に、マウスにＯＶＡ１０ｍｇを２日おきに計１０回経口投与した。
（１－３）尿採取
　続いて、１０回目の刺激後、観察中に、マウス（ｎ＝５）の尿を採取した。コントロールとして、無処置のマウス（ｎ＝３）について観察中に、尿を採取した。
（２）尿検体の前処理
　尿上清に内部標準として、ＬＴＣ４－ｄ５、６－ｋｅｔｏ－ＰＧＦ１α－ｄ４、ｔｅｔｒａｎｏｒ－ＰＧＤＭ－ｄ６、ｔｅｔｒａｎｏｒ－ＰＧＥＭ－ｄ６、ＰＧＥ２－ｄ４を加えた。続いて、塩酸及びエタノールを用いて、尿検体をｐＨ３～４の５０％エタノール含有溶液となるように調製した。続いて、エタノール及び精製水で平衡化したＳｅｐ－ｐａｋ　Ｃ１８カートリッジ（Ｗａｔｅｒｓ社製）に、調製した尿検体を注入した。続いて、３ｍＬの水と３ｍＬ×２のヘキサンとで夾雑物を洗浄した。続いて、０．０５％ギ酸メタノールで目的の成分を溶出させた。続いて、５時間の減圧乾燥後、１００％メタノールに再溶解し、濾過した。
（３）脂質メディエーターの測定
　（２）の前処理済の尿検体について、エレクトロスプレーイオン化をイオン源とする３連四重極型質量分析装置（ＬＣ－ＭＳ８０３０、島津製作所製）に注入し、ソフトウエア「ＬＣ／ＭＳ／ＭＳメソッドパッケージ」（島津製作所製）を用いて脂質網羅解析を行った。結果として、無処置のマウスの尿検体中での各脂質の含有量を１としたときの、食物アレルギーモデルマウスの尿検体中での各脂質の含有量の相対値を示すグラフを図１Ａ～図１Ｉに示す。図１Ａ～図１Ｉにおいて、「ｎａｉｖｅ」とは無処置のマウスを意味し、「ＯＶＡ×１０」とは食物アレルギーモデルマウスを意味する。
（４）結果
　図１Ａ～図１Ｉから、ＯＶＡ誘導性食物アレルギーモデルマウスの尿検体中において、コントロール群と比較して、１３，１４－ｄｉｈｙｄｒｏ－１５－ｋｅｔｏ－ｔｅｔｒａｎｏｒ　ＰＧＦ１β、１３，１４－ｄｉｈｙｄｒｏ－１５－ｋｅｔｏ－ｔｅｔｒａｎｏｒ　ＰＧＤ２、１３，１４－ｄｉｈｙｄｒｏ－１５－ｋｅｔｏ－ｔｅｔｒａｎｏｒ　ＰＧＥ２、６，１５－ｄｉｋｅｔｏ－１３，１４－ｄｉｈｙｄｒｏ　ＰＧＦ１α、及び２０－ＯＨ　ＰＧＥ２の５成分が有意に増加することが明らかとなった。また、ＰＧＤ３及びＰＧＥ３の２成分が有意に減少することが明らかとなった。
［実施例２］食物アレルギー負荷試験患者（ヒト）における尿検体中脂質メディエーターの動態
（１）尿検体の入手
　３～２２歳の食物アレルギー患者（男女）に医師の監督のもと適切な負荷量及び摂取間隔で食物負荷試験を行い、症状の程度により０～２のスコアを付けた。なお、数値が高いほど、症状が重篤な患者である。スコア０及びスコア２の患者それぞれについて、負荷試験前の尿（以下、「ｓｃｏｒｅ　０　ｐｒｅ」、「ｓｃｏｒｅ　２　ｐｒｅ」と表す。）及び負荷試験後の尿（以下、「ｓｃｏｒｅ　０　ｐｏｓｔ」、「ｓｃｏｒｅ　２　ｐｏｓｔ」と表す。）を採取した。なお、「ｓｃｏｒｅ　０　ｐｒｅ」はｎ＝９、「ｓｃｏｒｅ　２　ｐｒｅ」はｎ＝１０、「ｓｃｏｒｅ　０　ｐｏｓｔ」はｎ＝１０、「ｓｃｏｒｅ　２　ｐｏｓｔ」」はｎ＝１０である。
（２）尿検体の前処理
　内部標準として、さらにＴＸＭ－ｄ４を用いた以外は、実施例１の（２）と同様の方法を用いて、尿検体を前処理した。
（３）脂質メディエーターの測定
　実施例１の（３）と同様の方法を用いて、（２）の前処理済み尿検体について、脂質網羅解析を行った。結果として、負荷試験前のスコア０患者の尿検体中での各脂質の含有量を１としたときの、負荷試験後のスコア０患者、及び負荷試験前後のスコア２患者の尿検体中での各脂質の含有量の相対値を示すグラフを図２Ａ～図２Ｊに示す。
（４）結果
　図２Ａ～図２Ｊから、ｓｃｏｒｅ　２　ｐｏｓｔにおいて、ｓｃｏｒｅ　０　ｐｏｓｔと比較して、ｔｅｔｒａｎｏｒ－ＰＧＦＭ、１３，１４－ｄｉｈｙｄｒｏ－１５－ｋｅｔｏ－ｔｅｔｒａｎｏｒ　ＰＧＦ１β、１１－ｄｅｈｙｄｒｏ　ＴＸＢ２、２，３－ｄｉｎｏｒ－８－ｉｓｏ　ＰＧＦ２α、１４，１５－ＬＴＥ４及び１１－ｔｒａｎｓ　ＬＴＥ４の６成分が有意に増加することが明らかとなった。また、ｓｃｏｒｅ　２　ｐｏｓｔにおいて、ｓｃｏｒｅ　２　ｐｒｅと比較して、１３，１４－ｄｉｈｙｄｒｏ－１５－ｋｅｔｏ－ｔｅｔｒａｎｏｒ　ＰＧＦ１β、１１－ｄｅｈｙｄｒｏ　ＴＸＢ２、２，３－ｄｉｎｏｒ－８－ｉｓｏ　ＰＧＦ２α、１３，１４－ｄｉｈｙｄｒｏ－１５－ｋｅｔｏ－ｔｅｔｒａｎｏｒ　ＰＧＤ２及び１３，１４－ｄｉｈｙｄｒｏ－１５－ｋｅｔｏ－ｔｅｔｒａｎｏｒ　ＰＧＥ２の５成分が有意に増加することが明らかとなった。
　また、図２Ｃから、ｔｅｔｒａｎｏｒ－ＰＧＦＭは、ｓｃｏｒｅ　２　ｐｒｅにおいて、ｓｃｏｒｅ　０　ｐｒｅ及びｓｃｏｒｅ　０　ｐｏｓｔと比較して、増加していることから、食物アレルギーの体質を反映するマーカーとして使用できる可能性が示唆された。
　実施例１及び２から、マウス及びヒトにおいて、１３，１４－ｄｉｈｙｄｒｏ－１５－ｋｅｔｏ－ｔｅｔｒａｎｏｒ　ＰＧＦ１β、１３，１４－ｄｉｈｙｄｒｏ－１５－ｋｅｔｏ－ｔｅｔｒａｎｏｒ　ＰＧＤ２及び１３，１４－ｄｉｈｙｄｒｏ－１５－ｋｅｔｏ－ｔｅｔｒａｎｏｒ　ＰＧＥ２は、共通して有意に増加することが明らかとなった。
　一方、６，１５－ｄｉｋｅｔｏ－１３，１４－ｄｉｈｙｄｒｏ　ＰＧＦ１α及び２０－ＯＨ　ＰＧＥ２は、マウスにおいてのみ有意に増加しており、ＰＧＤ３及びＰＧＥ３は、マウスにおいてのみ有意に減少していた。
　よって、上記４成分については、マウスを用いた食品のアレルギー原性を評価する実験系におけるバイオマーカーとして有用であることが示唆された。
　また、ｔｅｔｒａｎｏｒ－ＰＧＦＭ、２，３－ｄｉｎｏｒ－８－ｉｓｏ　ＰＧＦ２α、１１－ｄｅｈｙｄｒｏ　ＴＸＢ２、１４，１５－ＬＴＥ４、及び１１－ｔｒａｎｓ　ＬＴＥ４は、ヒトにおいてのみ有意に増加していた。
　よって、上記５成分については、ヒトにおける食物アレルギーの発症リスクや重篤度を適切に評価、又は、減感作療法に対する反応性を評価するためのバイオマーカーとして有用であることが示唆された。
［実施例３］食物アレルギー負荷試験患者（ヒト）における尿検体中脂質メディエーターの動態２
（１）尿検体の入手
　３～２２歳の食物アレルギー患者（男女）に医師の監督のもと適切な負荷量及び摂取間隔で食物負荷試験を行い、症状の程度により０～４のスコアを付けた。なお、数値が高いほど、症状が重篤な患者である。スコア０及びスコア４の患者それぞれについて、負荷試験前の尿（以下、「ｓｃｏｒｅ　０　ｐｒｅ」、「ｓｃｏｒｅ　４　ｐｒｅ」と表す。）及び負荷試験後の尿（以下、「ｓｃｏｒｅ　０　ｐｏｓｔ」、「ｓｃｏｒｅ　４　ｐｏｓｔ」と表す。）を採取した。なお、「ｓｃｏｒｅ　０　ｐｒｅ」はｎ＝８、「ｓｃｏｒｅ　４　ｐｒｅ」はｎ＝１０、「ｓｃｏｒｅ　０　ｐｏｓｔ」はｎ＝８、「ｓｃｏｒｅ　４　ｐｏｓｔ」」はｎ＝１０である。
（２）尿検体の前処理
　尿上清に内部標準として、ｔｅｔｒａｎｏｒ－ＰＧＤＭ－ｄ６、ｔｅｔｒａｎｏｒ－ＰＧＥＭ－ｄ６、ＴＭＸ－ｄ４、ＬＴＣ４－ｄ５を加えた。続いて、塩酸を用いて、尿検体をｐＨ３～４となるように調製した。続いて、メタノール及び精製水で平衡化したＳｅｐ－ｐａｋ　Ｃ１８カートリッジ（Ｗａｔｅｒｓ社製）に、調製した尿検体を注入した。続いて、３ｍＬの水と３ｍＬ×２のヘキサンとで夾雑物を洗浄した。続いて、メタノールで目的の成分を溶出させた。続いて、４時間の減圧乾燥後、８０％メタノールに再溶解し、濾過した。
（３）脂質メディエーターの測定
　（２）の前処理済の尿検体について、エレクトロスプレーイオン化をイオン源とする３連四重極型質量分析装置（ＬＣ－ＭＳ８０３０、島津製作所製）に注入し、ソフトウエア「ＬａｂＳｏｌｕｔｉｏｎｓ」（島津製作所製）を用いて脂質網羅解析を行った。結果として、負荷試験前後のスコア０及びスコア４患者の尿検体中での各脂質の含有量（絶対値）を示すグラフを図３Ａ～図３Ｄに示す。なお、図３Ａ～図３Ｄにおいて、縦軸の単位「ｎｇ／ｍｇ　Ｃｒｅ」は、尿検体中のクレアチン１ｍｇに対する各脂質の含有量（ｎｇ）を示している。
（４）結果
　図３Ａ～図３Ｄから、ｓｃｏｒｅ　４　ｐｏｓｔにおいて、ｓｃｏｒｅ　０　ｐｏｓｔと比較して、ｔｅｔｒａｎｏｒ－ＰＧＤＭ、ｔｅｔｒａｎｏｒ－ＰＧＥＭ、１１－ｄｅｈｙｄｒｏ　ＴＸＢ２、ＬＴＥ４は有意に増加することが明らかとなった。また、ｓｃｏｒｅ　４　ｐｏｓｔにおいて、ｓｃｏｒｅ　４　ｐｒｅと比較して、ｔｅｔｒａｎｏｒ－ＰＧＤＭ、ｔｅｔｒａｎｏｒ－ＰＧＥＭ、１１－ｄｅｈｙｄｒｏ　ＴＸＢ２、ＬＴＥ４は有意に増加することが明らかとなった。
　以上のことから、本発明で初めて明らかとなった１１－ｄｅｈｙｄｒｏ　ＴＸＢ２及びＬＴＥ４の２成分、並びに公知のｔｅｔｒａｎｏｒ－ＰＧＤＭ及びｔｅｔｒａｎｏｒ－ＰＧＥＭの２成分、合計４成分については、ヒトにおける食物アレルギーの発症リスクや重篤度を適切に評価、又は、減感作療法に対する反応性を評価するためのバイオマーカーとして有用であり、これら４成分を指標とすることで、食物アレルギーの有無、及び発症リスクや重篤度をより高い精度で判定できることが示唆された。
本発明によれば、食物アレルギーの有無のみならず、発症リスクや重篤度を適切に評価することができる。さらに、アレルギー症状が出る前にリスクを評価して予防的治療を行うことができる。また、減感作療法に対する反応性を評価して、安全な範囲でなるべく多くアレルゲンを投与することにより、効率よく治療を進めることができる。
また、本発明の検査方法は、採血等の医療技術を必要とせず、本発明の尿検体検査用キット又は尿検体検査用スティックを用いて、小児から高齢者まで簡便に家庭で検査を行うことができる。

Claims (15)

  1. 　食物アレルギーを検査するためのバイオマーカーであって、
    　Ｌｅｕｋｏｔｒｉｅｎｅ　Ｅ４（ＬＴＥ４）、１４，１５－ＬＴＥ４、１１－ｔｒａｎｓ　ＬＴＥ４、１１－ｄｅｈｙｄｒｏ　Ｔｈｒｏｍｂｏｘａｎｅ　Ｂ２（１１－ｄｅｈｙｄｒｏ　ＴＸＢ２）、２，３－ｄｉｎｏｒ－８－ｉｓｏ　Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ　Ｆ２α、１３，１４－ｄｉｈｙｄｒｏ－１５－ｋｅｔｏ－ｔｅｔｒａｎｏｒ　ＰＧＦ１β、６，１５－ｄｉｋｅｔｏ－１３，１４－ｄｉｈｙｄｒｏ　ＰＧＦ１α、ｔｅｔｒａｎｏｒ－Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ　Ｆ　Ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅ（ｔｅｔｒａｎｏｒ－ＰＧＦＭ）、２０－ｈｙｄｒｏｘｙ　Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ　Ｅ２（２０－ＯＨ　ＰＧＥ２）、ＰＧＥ３、Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ　Ｄ３（ＰＧＤ３）、１３，１４－ｄｉｈｙｄｒｏ－１５－ｋｅｔｏ－ｔｅｔｒａｎｏｒ　ＰＧＤ２、及び１３，１４－ｄｉｈｙｄｒｏ－１５－ｋｅｔｏ－ｔｅｔｒａｎｏｒ　ＰＧＥ２からなる群から選ばれる少なくとも一つからなることを特徴とするバイオマーカー。
  2. 　被検者の尿検体中のバイオマーカーの含有量を測定する工程を備えた食物アレルギーの検査方法であって、
    前記バイオマーカーがＬＴＥ４、１４，１５－ＬＴＥ４、１１－ｔｒａｎｓ　ＬＴＥ４、１１－ｄｅｈｙｄｒｏ　ＴＸＢ２、２，３－ｄｉｎｏｒ－８－ｉｓｏ　Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ　Ｆ２α、１３，１４－ｄｉｈｙｄｒｏ－１５－ｋｅｔｏ－ｔｅｔｒａｎｏｒ　ＰＧＦ１β、６，１５－ｄｉｋｅｔｏ－１３，１４－ｄｉｈｙｄｒｏ　ＰＧＦ１α、ｔｅｔｒａｎｏｒ－ＰＧＦＭ、２０－ＯＨ　ＰＧＥ２、ＰＧＥ３、ＰＧＤ３、１３，１４－ｄｉｈｙｄｒｏ－１５－ｋｅｔｏ－ｔｅｔｒａｎｏｒ　ＰＧＤ２、及び１３，１４－ｄｉｈｙｄｒｏ－１５－ｋｅｔｏ－ｔｅｔｒａｎｏｒ　ＰＧＥ２からなる群から選ばれる少なくとも一つであることを特徴とする方法。
  3. 　前記測定工程において、さらに、ｔｅｔｒａｎｏｒ－ＰＧＤＭ又はｔｅｔｒａｎｏｒ－ＰＧＥＭの含有量を測定する、請求項２に記載の方法。
  4. 　さらに、尿検体中の前記バイオマーカーの含有量が多い又は少ないほど、食物アレルギーの症状が重篤である若しくは重篤になった、又は、食物アレルギーを発症するリスクが高い若しくは高くなったと評価する評価工程を備える、請求項２又は３に記載の方法。
  5. 　食物アレルギーの治療法又は治療薬の評価に用いられる、請求項２～４のいずれか一項に記載の方法。
  6. 　減感作療法に用いられる、請求項５に記載の方法。
  7. 　前記測定工程を、イムノアッセイ又は質量分析法で行う、請求項２～６のいずれか一項に記載の方法。
  8. 　さらに、前記尿検体中に、重水素化ＬＴＣ４、重水素化６－ｋｅｔｏ－ＰＧＦ１α、重水素化ｔｅｔｒａｎｏｒ－ＰＧＤＭ、重水素化ｔｅｔｒａｎｏｒ－ＰＧＥＭ、及び重水素化ＰＧＥ２からなる群から選ばれる少なくとも一つを内部標準として加える前処理工程を備え、前記測定工程を、質量分析法で行う、請求項７に記載の方法。
  9. 　前記評価工程において、食物アレルギーにおける肥満細胞の活性化を評価する、請求項２～８のいずれか一項に記載の方法。
  10. 　抗ＬＴＥ４抗体、抗１４，１５－ＬＴＥ４抗体、抗１１－ｔｒａｎｓ　ＬＴＥ４抗体、抗１１－ｄｅｈｙｄｒｏ　ＴＸＢ２抗体、抗２，３－ｄｉｎｏｒ－８－ｉｓｏ　ＰＧＦ２α抗体、抗１３，１４－ｄｉｈｙｄｒｏ－１５－ｋｅｔｏ－ｔｅｔｒａｎｏｒ　ＰＧＦ１β抗体、抗６，１５－ｄｉｋｅｔｏ－１３，１４－ｄｉｈｙｄｒｏ　ＰＧＦ１α抗体、抗ｔｅｔｒａｎｏｒ－ＰＧＦＭ抗体、抗２０－ＯＨ　ＰＧＥ２抗体、抗ＰＧＥ３抗体、抗ＰＧＤ３抗体、抗１３，１４－ｄｉｈｙｄｒｏ－１５－ｋｅｔｏ－ｔｅｔｒａｎｏｒ　ＰＧＤ２抗体、及び抗１３，１４－ｄｉｈｙｄｒｏ－１５－ｋｅｔｏ－ｔｅｔｒａｎｏｒ　ＰＧＥ２抗体からなる群から選ばれる少なくとも一つを含むことを特徴とする食物アレルギーの尿検体検査用キット。
  11. 　さらに、抗ｔｅｔｒａｎｏｒ－ＰＧＤＭ抗体又は抗ｔｅｔｒａｎｏｒ－ＰＧＥＭ抗体を含む、請求項１０に記載の食物アレルギーの尿検体検査用キット。
  12. さらに、重水素化ＬＴＣ４、重水素化６－ｋｅｔｏ－ＰＧＦ１α、重水素化ｔｅｔｒａｎｏｒ－ＰＧＥＭ、及び重水素化ＰＧＥ２からなる群から選ばれる少なくとも一つを含む、請求項１０又は１１に記載の食物アレルギーの尿検体検査用キット。
  13. 　さらに、重水素化ｔｅｔｒａｎｏｒ－ＰＧＤＭを含む、請求項１０～１２にいずれか一項に記載の食物アレルギーの尿検体検査用キット。
  14. 　抗ＬＴＥ４抗体、抗１４，１５－ＬＴＥ４抗体、抗１１－ｔｒａｎｓ　ＬＴＥ４抗体、抗１１－ｄｅｈｙｄｒｏ　ＴＸＢ２抗体、抗２，３－ｄｉｎｏｒ－８－ｉｓｏ　ＰＧＦ２α抗体、抗１３，１４－ｄｉｈｙｄｒｏ－１５－ｋｅｔｏ－ｔｅｔｒａｎｏｒ　ＰＧＦ１β抗体、抗６，１５－ｄｉｋｅｔｏ－１３，１４－ｄｉｈｙｄｒｏ　ＰＧＦ１α抗体、抗ｔｅｔｒａｎｏｒ－ＰＧＦＭ抗体、抗２０－ＯＨ　ＰＧＥ２抗体、抗ＰＧＥ３抗体、抗ＰＧＤ３抗体、抗１３，１４－ｄｉｈｙｄｒｏ－１５－ｋｅｔｏ－ｔｅｔｒａｎｏｒ　ＰＧＤ２抗体、及び抗１３，１４－ｄｉｈｙｄｒｏ－１５－ｋｅｔｏ－ｔｅｔｒａｎｏｒ　ＰＧＥ２抗体からなる群から選ばれる少なくとも一つを含むことを特徴とする食物アレルギーの尿検体検査用スティック。
  15. 　さらに、抗ｔｅｔｒａｎｏｒ－ＰＧＤＭ抗体又は抗ｔｅｔｒａｎｏｒ－ＰＧＥＭ抗体を含む、請求項１４に記載の食物アレルギーの尿検体検査用スティック。
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