WO2017141604A1 - 膜型ムチン様タンパク質の認識とその医療応用 - Google Patents

膜型ムチン様タンパク質の認識とその医療応用 Download PDF

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光代 吉原
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Definitions

  • the present invention relates to recognition of membrane-type mucin-like protein and its medical application. More specifically, the present invention relates to antibodies that detect mesothelioma and antibodies that have high specificity and high sensitivity to mesothelioma. The present invention also relates to a method for diagnosing mesothelioma using the antibody, a mesothelioma diagnostic reagent containing the antibody, and a mesothelioma diagnostic kit. The invention further relates to a diagnostic marker for mesothelioma. The present invention further relates to a pharmaceutical composition for use in treating mesothelioma comprising the antibody of the present invention or an antigen-binding fragment thereof.
  • Malignant mesothelioma is a serious social problem as a malignant tumor caused mainly by asbestos exposure. Early detection is difficult, and it is positioned as one of malignant tumors with poor prognosis. Malignant mesothelioma may be pathologically similar to metastatic adenocarcinoma, sarcoma, or benign proliferative reactive mesothelial cells, and is often associated with pathological differentiation. In addition, it is not uncommon to have a variety of tissue types such as epithelial type and sarcoma type and have difficulty in diagnosis.
  • markers for pathological diagnosis of malignant mesothelioma calretinin, cytokeratin 5/6 (CK5 / 6), mesothelin, podoplanin, Wilms tumor gene product-1 (WT-1), etc. are frequently used. These markers are generally capable of detecting epithelial malignant mesothelioma with high sensitivity (about 80-90%). However, its specificity is not necessarily excellent, and it may not be used for differentiation between lung cancer and epithelial malignant mesothelioma, or for detection of sarcoma-type malignant mesothelioma.
  • the nuclear translocation of calretinin and WT-1 in malignant mesothelioma is an important element in the differentiation of malignant mesothelioma, but these molecules are expressed in the cytoplasm in various healthy tissues and cancer cells. Therefore, it is necessary to determine whether the expression is in the nucleus or the cytoplasm, and it has a problem in visibility as a pathological diagnosis marker.
  • Non-Patent Document 1 analysis of genes expressed as mRNA in malignant mesothelioma has been made, but it is concluded that an increase in the analyzed mRNA level is not a statistically significant phenomenon and can be used for diagnosis The specific factors have not been identified.
  • the present invention provides an antibody for detecting mesothelioma and an antibody having high specificity and high sensitivity to mesothelioma.
  • the present invention also provides a method for diagnosing mesothelioma using the antibody, a mesothelioma diagnostic reagent containing the antibody, and a mesothelioma diagnostic kit.
  • the present invention further provides a diagnostic marker for mesothelioma.
  • the present invention further provides a pharmaceutical composition for use in treating mesothelioma comprising the antibody of the present invention or an antigen-binding fragment thereof.
  • the present inventors have found that the SKM9-2 antibody obtained by immunizing mice with human mesothelioma cells can recognize mesothelioma with high sensitivity and high specificity.
  • the inventors have also found that the antigen of the SKM9-2 antibody is HEG1 protein. Based on this result, the present inventors have found that the HEG1 protein can be used as a marker for mesothelioma.
  • the present inventors have further found that the SKM9-2 antibody binds to the HEG1 protein in a sugar chain modification-dependent manner.
  • the present inventors have found that HEG1 protein glycosylated in mesothelioma can also be used as a marker for mesothelioma. The present invention has been made based on such findings.
  • an antibody that binds to the HEG1 protein on the cell membrane of mesothelioma [4] The antibody according to claim 3, (1) an antibody comprising a heavy chain variable region comprising CDR1 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6, CDR2 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8, and CDR3 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10, (2) an antibody comprising CDR1 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12, CDR2 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14, and a light chain variable region comprising CDR3 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16, (3) having a heavy chain variable region comprising CDR1 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6, CDR2 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8, CDR3 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10, and the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12 An antibody comprising CDR1, CDR2 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14, and a light chain variable region comprising C
  • An antibody that binds to HEG1 protein, the antibody according to any one of [1] to [6] above or an antigen-binding fragment thereof, or the protein complex according to [7] above, and an imaging probe A kit for in-vivo diagnosis of mesothelioma, including a conjugate.
  • a mesothelioma comprising an antibody that binds to the HEG1 protein, the antibody according to any one of [1] to [6] or an antigen-binding fragment thereof, or the protein complex according to [7] above
  • a pharmaceutical composition for use in treating [13]
  • a method for detecting mesothelioma comprising detecting HEG1 protein in a sample separated from a living body.
  • a method for detecting mesothelioma comprising detecting HEG1 protein in a sample.
  • [16 ′] A HEG1 protein having an O-type sugar chain modification obtained from mesothelioma, or a fragment thereof comprising the amino acid sequence from 799th to 809th in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 35.
  • a diagnostic marker for mesothelioma comprising the HEG1 protein or the fragment thereof according to [16] above.
  • a diagnostic marker for mesothelioma comprising the HEG1 protein according to [16 ′] or the fragment thereof.
  • FIG. 1 shows immunohistochemically stained images using the SKM9-2 antibody against a representative mesothelioma subtype.
  • FIG. 1A shows an immunohistological staining image of epithelial mesothelioma
  • FIG. 1B shows an immunohistological staining image of sarcoma mesothelioma. The arrowheads in the figure indicate stained portions.
  • FIG. 2 shows the results of Western blot and SDS-PAGE of purified SKM9-2 antigen.
  • FIG. 3 shows the results of Western blotting of a cell extract obtained by knocking down the HEG1 protein and a recombinant soluble HEG1 protein expressed in a mesothelioma cell line using the SKM9-2 antibody.
  • FIG. 4 is a graph showing that antigen recognition of the SKM9-2 antibody is weakened by treatment with desialylase.
  • FIG. 5 shows that the antigen of the SKM9-2 antibody is expressed on the cell surface of mesothelioma.
  • FIG. 6 shows the base sequence and amino acid sequence of the heavy chain and light chain of the antibody gene of the hybridoma producing the SKM9-2 antibody, respectively.
  • the V H region and the VL region are shown as regions sandwiched by arrows.
  • FIG. 7 is a view showing that the SKM10-2 antibody can also detect HEG1 protein in a sugar chain modification-dependent manner.
  • FIG. 8 is a Intelectin (ITLN) and V H region and CH1 region of the fused SKM9-2 antibody, V L region and a C L region (i.e., the light chain of SKM9-2 antibody) protein complex with, It is a figure which shows that HEG1 protein can be detected similarly to SKM9-2 antibody.
  • FIG. 9 is a diagram showing that inectin binds strongly to beads having a diol bond.
  • FIG. 10 is a diagram showing the time-dependent effect of knockdown of the HEG1 gene on cell proliferation of a mesothelioma cell line.
  • FIG. 11 is a diagram showing the effect of knockdown of the HEG1 gene on cell proliferation of a mesothelioma cell line.
  • FIG. 12 shows the effect of knockdown of the HEG1 gene on the cell proliferation of other mesothelioma cell lines.
  • FIG. 13 is a graph showing the positive (+) and negative ( ⁇ ) binding between the SKM9-2 antibody and each human HEG1 fragment. In FIG. 13, the position of each human HEG1 fragment in HEG1 is shown. The result of alanine scanning is shown at the bottom of FIG. In FIG. 13, unmodified amino acids are indicated by the symbol “-”.
  • FIG. 14A shows the results of Western blotting confirming the reactivity of HEG1 full-length, 3 kb fragment, 2 kb fragment and 1 kb fragment with the SKM9-2 antibody.
  • FIG. 14A shows the results of Western blotting confirming the reactivity of HEG1 full-length, 3 kb fragment, 2 kb fragment and 1 kb fragment with the SKM9-2 antibody.
  • FIG. 14B shows the results of Western blotting confirming the reactivity between each HEG1 fragment and the SKM9-2 antibody. In FIG. 14B, positive signals are confirmed in the 7.6 and 7.62 fragments.
  • FIG. 14C shows the results of Western blot confirming the reactivity between each HEG1 fragment and the SKM9-2 antibody. In FIG. 14C, positive signals are confirmed in the 7.623 fragment and the 7.6231 fragment.
  • FIG. 14D shows the results of alanine scanning. S799A in the figure indicates a fragment in which the 799th serine in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 35 is substituted with alanine.
  • FIG. 14E shows that the neuraminidase-treated 7.6231 fragment does not react with the SKM9-2 antibody.
  • the “subject” may be a mammal, preferably a human.
  • a subject can be a subject suffering from or at risk for mesothelioma or other tumor or cancer.
  • antibody means an immunoglobulin and includes a polyclonal antibody and a monoclonal antibody.
  • a preferred antibody is a monoclonal antibody.
  • the origin of the antibody is not particularly limited, and examples thereof include a non-human animal antibody, a non-human mammal antibody, and a human antibody.
  • the antibody may also be a chimeric antibody, a humanized antibody, or a human antibody.
  • the antibody may also be a bispecific antibody.
  • the term “antigen-binding fragment” means a part of an antibody that maintains the binding to an antigen.
  • the antigen-binding fragment can comprise the heavy chain variable region or the light chain variable region of the antibody of the present invention, or both.
  • the antigen-binding fragment may be chimerized or humanized.
  • Examples of the antigen-binding fragment include Fab, Fab ′, F (ab ′) 2 , Fv, scFv (single chain Fv), diabody, and sc (Fv) 2 (single chain (Fv) 2 ).
  • Such antibody fragments are not particularly limited, and can be obtained, for example, by treating an antibody with an enzyme.
  • Fab can be obtained by digesting an antibody with papain.
  • F (ab ′) 2 can be obtained by digesting the antibody with pepsin
  • Fab ′ can be obtained by further reducing this.
  • such an antigen-binding fragment of an antibody can be used.
  • mesothelioma means a mesothelial cell-derived tumor.
  • mesothelioma pleural mesothelioma, peritoneal mesothelioma, pericardial mesothelioma, and testicular sheath mesothelioma are known from the site of their occurrence.
  • mesothelioma means benign mesothelioma and / or malignant mesothelioma.
  • Mesothelioma is broadly divided into histological types, epithelial mesothelioma, sarcoma mesothelioma, biphasic mesothelioma, and other mesothelioma (such as fibrosis).
  • the HEG1 protein is a protein whose expression and function are hardly understood, and is estimated to be a membrane protein from gene ontology analysis.
  • the human HEG1 protein is a protein (SEQ ID NO: 30) encoded by a gene having the sequence of SEQ ID NO: 29 registered as NM_020733.1 in the National Center for Biotechnology Information (NCBI), and has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 31 Protein, a protein encoded by the gene having the sequence of SEQ ID NO: 36 registered as XM — 005247666 (SEQ ID NO: 37), a gene encoded protein having the sequence of SEQ ID NO: 32 (SEQ ID NO: 33), and the sequence of SEQ ID NO: 34 And a protein (SEQ ID NO: 35) encoded by a gene having Natural variants of HEG1 protein are not particularly limited.
  • variants of HEG1 protein having amino acid mutations corresponding to mutations such as Q145R, S305P, F602S, V980L, and M1039T in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 30 are known. Yes.
  • natural variants of HEG1 protein are also included in HEG1 protein.
  • the 1359th serine in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 30 may be phosphoserine.
  • a HEG1 protein in which the serine corresponding to the 1359th serine in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 30 is phosphoserine is also included in the HEG1 protein.
  • the signal peptide portion is a domain corresponding to positions 1 to 29 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 30, and the extracellular domain is positions 30 to 1248 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 30.
  • a transmembrane domain is a domain corresponding to positions 1249 to 1269 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 30, and an intracellular domain is a domain corresponding to positions 1270 to 1381 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 30 Is expected.
  • the HEG1 protein has a DNA sequence represented by SEQ ID NO: 29, 32, 34 or 36 or a complementary strand of DNA having a DNA sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 30, 31, 33, 35 or 37.
  • Proteins encoded by DNA sequences that can hybridize under stringent conditions can also be included. Examples of stringent conditions include, for example, washing conditions after hybridization at 65 ° C. with 1 ⁇ SSC (an aqueous solution containing 0.15 M NaCl and 15 mM trisodium citrate).
  • the HEG1 protein can also include a protein having an amino acid sequence that is 90% or more, 95% or more, 98% or more, or 99% or more homologous to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 30.
  • the HEG1 protein may contain one or more amino acid substitutions, insertions, additions and / or deletions in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 30.
  • HEG1 protein is mainly expressed in mesothelioma. Further, according to the present inventors, mesothelioma can be diagnosed based on the expression level of HEG1 protein. Therefore, according to the present invention, mesothelioma can be detected using an antibody that binds to the HEG1 protein. Also according to the present invention, HEG1 protein is expressed on the cell membrane surface of mesothelioma and has an extracellular domain. Accordingly, the antibodies of the present invention bind to mesothelioma cell membranes, membrane proteins on mesothelioma cell membranes, or HEG1 protein on mesothelioma cell membranes.
  • the antibody of the present invention can be an antibody against the extracellular domain of HEG1 protein or an antigen-binding fragment thereof.
  • HEG1 protein is also expressed in well-differentiated papillary mesothelioma (WDPM) and may be used to detect these mesothelioma.
  • WDPM papillary mesothelioma
  • the extracellular domain of HEG1 protein is subjected to sialylated sugar chain modification in mesothelioma. Therefore, in one aspect, the antibody of the present invention or an antigen-binding fragment thereof binds to a HEG1 protein that has undergone glycosylation.
  • the apparent molecular weight can be detected as a broad band in the range of 300 kDa to 500 kDa. More specifically, the apparent molecular weight by SDS-PAGE can be about 400 kDa.
  • the sugar chain modification is a sugar chain modification received by the HEG1 protein expressed on the cell membrane of mesothelioma.
  • the antibody or antigen-binding fragment thereof of the present invention binds to a HEG1 protein having a sugar chain modification found in mesothelioma cells, but the binding is dependent on the sugar chain modification. That is, in this aspect, the antibody of the present invention or the antigen-binding fragment thereof does not bind to a HEG1 protein that does not have a sugar chain modification (for example, a HEG1 protein obtained by decomposing a sugar chain by glycolysis), Binding is weaker (less affinity) than for HEG1 protein with glycosylation.
  • the antibody of the present invention or an antigen-binding fragment thereof binds to a sugar chain portion of HEG1 protein having a sugar chain modification found in mesothelioma cells.
  • the antibody of the present invention can bind to a HEG1 protein that has been subjected to sugar chain modification in a sugar chain modification-dependent manner.
  • the sugar chain modification is caused by HEG1 protein present on the cell membrane of mesothelioma. It may have.
  • the antibodies of the invention bind to a HEG1 protein having a glycosylation found in denatured mesothelioma cells.
  • the antibody of the present invention is a denatured fragment of HEG1 protein having a sugar chain modification found in mesothelioma cells, and comprises the amino acid sequence from 799th to 809th in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 35 It binds to fragments having the amino acid sequence.
  • the antibody of the invention or antigen-binding fragment thereof binds to an epitope of the extracellular domain of human HEG1 protein expressed in human mesothelioma cells, but is ⁇ 2-3 neuraminidase or ⁇ 2-3, 6, 8.
  • the extracellular domain of human HEG1 protein expressed in human mesothelioma cells has undergone sialylated glycosylation.
  • HEG1 protein having a sugar chain modification obtained from mesothelioma may be a HEG1 protein having a sugar chain modification characteristic of mesothelioma, for example, a sialylated O-type sugar chain It can be a modification.
  • an antibody that binds to a mesothelioma cell membrane, a membrane protein on a mesothelioma cell membrane, or a HEG1 protein on a mesothelioma cell membrane comprising: Heavy chain CDR1 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6, heavy chain CDR2 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8, heavy chain CDR3 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10, light chain CDR1 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: Provided is an antibody comprising any one, two, three, four, five or six of a light chain CDR2 having 14 amino acid sequences and a light chain CDR3 having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 16 .
  • An antibody comprising a light chain variable region comprising any one, two, or three is provided.
  • an antibody that binds to a mesothelioma cell membrane, a membrane protein on a mesothelioma cell membrane, or a HEG1 protein on a mesothelioma cell membrane comprising: (1) an antibody comprising a heavy chain variable region comprising CDR1 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6, CDR2 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8, and CDR3 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10, (2) an antibody comprising CDR1 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12, CDR2 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14, and a light chain variable region comprising CDR3 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16, (3) having a heavy chain variable region comprising CDR1 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6, CDR2 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8, CDR3 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10, and the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12
  • the antibody of the present invention is an antibody that binds to a peptide having the sequence of SEQ ID NO: 53. In certain embodiments, an antibody of the invention is an antibody that binds to a peptide having the sequence of SEQ ID NO: 53 expressed in a mesothelioma cell line. In one embodiment, the antibody of the present invention is an antibody that binds to a peptide having the sequence of SEQ ID NO: 53 expressed in a mesothelioma cell line in a glycosylation-dependent manner.
  • an antibody of the invention is an antibody that binds to a mesothelioma cell membrane, a membrane protein on a mesothelioma cell membrane, or a HEG1 protein on a mesothelioma cell membrane, wherein the sequence of SEQ ID NO: 53 is It is an antibody that binds to the peptide it has.
  • an antibody of the invention is an antibody that binds to a mesothelioma cell membrane, a membrane protein on a mesothelioma cell membrane, or a HEG1 protein on a mesothelioma cell membrane, wherein the antibody is a mesothelioma cell line.
  • an antibody that binds to the expressed peptide having the sequence of SEQ ID NO: 53 is an antibody that binds to a mesothelioma cell membrane, a membrane protein on a mesothelioma cell membrane, or a HEG1 protein on a mesothelioma cell membrane, wherein the antibody is a mesothelioma cell line.
  • Sequence homology can be determined with default parameters by, for example, the FASTA program of Pearson and Lipman, PNAS, 85: 2444-2448, 1988.
  • the antibodies of the invention have a heavy chain having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
  • an antibody of the invention has a light chain having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4.
  • the antibody of the present invention has a heavy chain having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and a light chain having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4.
  • the antibody of the present invention has the amino acid sequence of No. 20 to No. 132 of SEQ ID NO: 2 as the heavy chain variable region (V H region).
  • the antibody of the present invention has the amino acid sequence of No. 20 to No. 132 of SEQ ID NO: 4 as the light chain variable region ( VL region).
  • the antibody of the present invention has a heavy chain variable region having amino acid sequences 20 to 132 of SEQ ID NO: 2 and a light chain variable region having amino acid sequences 20 to 132 of SEQ ID NO: 4. .
  • the antibody of the present invention competes with the above-mentioned antibody for binding to a glycosylated HEG1 protein.
  • the present invention also provides a chimeric antigen receptor comprising a heavy chain variable region such as scFv and a light chain variable region.
  • a chimeric antigen receptor comprising a heavy chain variable region such as scFv and a light chain variable region.
  • the chimeric antigen receptor for example, the first generation in which scFv and the T cell receptor ⁇ chain are linked via a spacer, the second generation in which CD28 or 4-1BB is linked, CD28 and 4-1BB or OX40
  • Various chimeric antigen receptors such as third generation linked via can be used.
  • a conjugate (conjugate) of the antibody of the present invention or an antigen-binding fragment thereof and a cytotoxic agent is provided.
  • a pharmaceutical composition for use in treating mesothelioma comprising a conjugate (conjugate) of the antibody of the present invention or an antigen-binding fragment thereof and an imaging probe.
  • the cytotoxic agent used in the present invention include radioisotopes for cancer treatment (for example, P 32 , Y 90 , I 131 , I 125 , Sm 153 , Re 186 , Re 188 , At 211 , Bi 212 , Pb 212 and Lu).
  • the cytotoxic agent used in the present invention include an anticancer agent.
  • a pharmaceutical composition for use in treating mesothelioma comprising siRNA, shRNA, or antisense oligo for the HEG1 gene.
  • the siRNA, shRNA or antisense oligo may be a modified nucleic acid.
  • the modified nucleic acid include a fluorescent dye-modified nucleic acid, a biotinylated nucleic acid, and a nucleic acid into which a cholesteryl group has been introduced.
  • RNA may be 2′-O-methyl modified, 2′-fluoro modified, or 2′-methoxyethyl (MOE) modified to the base to enhance stability, thereby phosphodiester bonds in the nucleic acid backbone.
  • MOE 2′-methoxyethyl
  • Artificial nucleic acids include 2'-position oxygen atom and 4'-position carbon atom via a methylene bridged DNA (locked nucleic acid (LNA), N- (2-aminoethyl) instead of deoxyribose or ribose Peptide nucleic acid (PNA) in which a polymer in which a glycine amide bond is a main chain is used.
  • LNA locked nucleic acid
  • PNA ribose Peptide nucleic acid
  • siRNA, shRNA, or antisense oligo may be encapsulated in vesicles such as micelles and liposomes. Vesicles such as micelles and liposomes can have a particle size of 20 to 100 nm, for example.
  • vesicles such as micelles and liposomes can be efficiently accumulated in tumor tissue by the EPR effect (Enhanced permeability and retention effect), and the contents can be delivered to the tumor tissue.
  • Such vesicles may be modified with a surface modifier such as polyethylene glycol.
  • Certain aspects of the invention also provide the use of siRNA, shRNA, or antisense oligos against the HEG1 gene in the manufacture of a pharmaceutical composition for use in treating mesothelioma.
  • Certain embodiments of the invention further provide a method of treating mesothelioma, comprising reducing HEG1 protein expression in a subject in need thereof.
  • a method of treating mesothelioma comprising administering an expression inhibitor (eg, siRNA, shRNA, or antisense oligo) to the HEG1 gene in a subject in need thereof.
  • an expression inhibitor eg, siRNA, shRNA, or antisense oligo
  • the antibody of the present invention may have cytotoxic activity such as antibody-dependent cytotoxic activity (ADCC activity) or complement-dependent cytotoxic activity (CDC activity).
  • ADCC activity antibody-dependent cytotoxic activity
  • CDC activity complement-dependent cytotoxic activity
  • the antibody of the present invention binds to the HEG1 protein expressed on the surface of the mesothelioma membrane and can exhibit cytotoxic activity against mesothelioma cells.
  • a pharmaceutical composition or a mesothelioma therapeutic agent for use in treating mesothelioma comprising the antibody of the present invention or an antigen-binding fragment thereof as an active ingredient is provided.
  • “treatment” is used in the meaning including therapy.
  • the pharmaceutical composition or drug containing the antibody of the present invention as an active ingredient can be formulated by a known pharmaceutical method.
  • the pharmaceutical composition or medicament of the present invention may contain a pharmaceutically acceptable excipient.
  • the excipient can be an excipient that can be appropriately administered to give an effective amount of the antibody of the present invention, which is an active ingredient, to the subject.
  • the pharmaceutical composition or medicament of the present invention can be an injection, and the injectable excipient is a sterile aqueous solution, such as a pharmaceutical such as Ringer's solution, Hanks' solution or saline. And an isotonic solution containing glucose, glucose and other adjuvants.
  • the adjuvant examples include alcohols such as ethanol, polyalcohols such as polyethylene glycol, and nonionic surfactants such as polysorbate 80, which can be added during formulation. Sesame oil, coconut oil and soybean oil can be used as an oily liquid for injection, and benzyl benzoate or benzyl alcohol can be used as an auxiliary agent.
  • the pharmaceutical composition or medicament of the present invention can be administered parenterally (for example, intravenously or intrathoracically) in the form of an injection.
  • ADCC activity is achieved, for example, by incubating mesothelioma cells and effector cells expressing Fc receptors (eg, NK cells and monocytes) under physiological conditions in the presence of the antibody of the present invention. It can be determined by counting the number of live and / or dead cells.
  • CDC activity can be determined by, for example, incubating mesothelioma cells with a solution containing complement (eg, human serum) in the presence of antibodies under physiological conditions to determine the number of live and / or dead mesothelioma cells. It can be determined by counting.
  • Cytotoxic activity can be enhanced by various methods well known to those skilled in the art.
  • antibodies lacking fucose in the Fc region sugar chain, bisecting N-acetylglucosamine (GlcNAc) bound to the sugar chain, amino acid substitution in the Fc region enhances the binding between the Fc receptor of the effector cell and the antibody
  • GlcNAc N-acetylglucosamine
  • the antibody can be a genetically modified antibody such as a chimeric antibody, a humanized antibody or a human antibody by a method well known to those skilled in the art for the purpose of reducing the antigenicity of the antibody itself in humans.
  • the antibody of the present invention may be a chimeric antibody, a humanized antibody or a human antibody.
  • the antibody may also be a bispecific antibody.
  • a conjugate (conjugate) of the antibody of the present invention or an antigen-binding fragment thereof and an imaging probe is provided.
  • the conjugate (conjugate) of the antibody or antigen-binding fragment thereof of the present invention and an imaging probe can be used for in vitro diagnosis or in vivo diagnosis of mesothelioma. Therefore, according to the present invention, there is provided a diagnostic agent or diagnostic kit for mesothelioma comprising a conjugate (conjugate) of the antibody of the present invention or an antigen-binding fragment thereof and an imaging probe.
  • the present invention also provides an in-vivo diagnostic agent or in-vivo diagnostic kit for mesothelioma comprising a conjugate (conjugate) of the antibody of the present invention or an antigen-binding fragment thereof and an imaging probe.
  • Imaging probes that can be used for in-vivo diagnosis of mesothelioma include, for example, fluorescent imaging probes, enhancement agents such as contrast agents for nuclear magnetic resonance imaging (MRI) (eg paramagnetic ions), and PET molecular imaging probes Examples include radionuclides for imaging.
  • MRI nuclear magnetic resonance imaging
  • PET molecular imaging probes examples include radionuclides for imaging.
  • a HEG1 protein having a sugar chain modification (eg, O-type sugar chain modification) obtained from mesothelioma or a fragment thereof (particularly the amino acid sequence from 799th to 809th in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 35) And fragments thereof) are provided.
  • HEG1 protein having a sugar chain modification (for example, O-type sugar chain modification) obtained from mesothelioma or a fragment thereof is used as a marker for detecting mesothelioma with high sensitivity and high specificity. Can be used.
  • a diagnostic marker for mesothelioma comprising a HEG1 protein having a sugar chain modification (eg, O-type sugar chain modification) obtained from mesothelioma or a fragment thereof.
  • the O-type sugar chain modification of the HEG1 protein obtained from mesothelioma or the fragment thereof may be a sialylated O-type sugar chain modification.
  • Such HEG1 protein has, for example, 80% or more, 90% or more, 95% or more, or 98% or more of sequence homology with any one amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 30, 31, 33, 35 and 37 It may be a HEG1 protein obtained from mesothelioma having a sex amino acid sequence, or a variant obtained from these mesothelioma.
  • the HEG1 protein having a sugar chain modification (for example, O-type sugar chain modification) obtained from mesothelioma or the fragment thereof is obtained from the antibody of the present invention (glycan modification obtained from the mesothelioma of the present invention) from mesothelioma cells.
  • HEG1 protein having an O-type sugar chain modification For example, an antibody that binds to a HEG1 protein having an O-type sugar chain modification.
  • HEG1 protein or fragment thereof has sialic acid and GlcNAc, HEG1 against a lectin that specifically binds to them (eg, WGA that is sialic acid specific or DSA that is GlcNAc specific or a combination thereof). It is also conceivable to purify the HEG1 protein using the protein affinity.
  • HEG1 protein having a sugar chain modification for example, O-type sugar chain modification obtained from mesothelioma or the fragment thereof (particularly, the fragment containing the amino acid sequence of 799 to 809 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 35), It may be detained.
  • the fragment (particularly the denatured fragment) is an amino acid sequence of the 799th to 809th amino acids in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 35 in the HEG1 protein having a sugar chain modification (eg, O-type sugar chain modification) obtained from mesothelioma.
  • the peripheral area may be included.
  • the present invention provides fusion proteins of intelctin and Fab or scFv fragments of the antibodies of the present invention.
  • a heavy chain of an Fab fragment or an scFv fragment and inlectin exist as a fusion form.
  • a complex of a fusion protein of inlectin with the VH region and linker (eg, CH1 region) of the antibody of the present invention and the L chain of the antibody of the present invention is provided.
  • Such a fusion protein or protein complex binds to a mesothelioma cell membrane, a membrane protein on the cell membrane, or a HEG1 protein on the cell membrane.
  • the present invention also provides a fusion protein of the scFv fragment of the antibody of the present invention and inlectin.
  • a fusion protein or protein complex contains inlectin, which binds specifically and strongly to the diol structure, so it is treated with a column (eg, treated with an epoxide crosslinking agent) that uses a resin that displays the diol structure. It can be easily purified with a gel containing polysaccharide (dextran or agarose) or a gel filtration column such as silica gel hydrophilized by diol modification.
  • the fusion protein or protein complex can be purified using a column using diol sepharose beads shown in Table 5. After purifying the complex, a fusion protein may be further generated on an affinity column to which an antigen is linked.
  • a fusion protein of a heavy chain variable region comprising CDR1 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6, CDR2 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8, and CDR3 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10; 2) including the fusion protein of (1) above, CDR1 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12, CDR2 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14, and the light chain variable region comprising CDR3 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16
  • a protein complex is provided.
  • the protein complex binds to a mesothelioma cell membrane, a membrane protein on a mesothelioma cell membrane, or a HEG1 protein on a mesothelioma cell membrane.
  • the heavy chain variable region can form a fusion protein with intelectin via or without the CH1 region, preferably the heavy chain variable region is intelectin and fusion protein via the CH1 region. Can be formed.
  • This fusion protein can bind to each other through physiological intactin moieties under physiological conditions to form multimers (mainly trimers). In the present specification, monomers and multimers are included in the fusion protein.
  • the above-mentioned inlectin fusion protein and complex of the present invention can bind to a HEG1 protein having a sugar chain modification obtained from mesothelioma. Therefore, the above-mentioned inlectin fusion protein or complex of the present invention can be used for detection of mesothelioma. Therefore, according to the present invention, there is provided a diagnostic agent for mesothelioma comprising the above-mentioned inlectin fusion protein or complex of the present invention.
  • the conjugate of the above-mentioned interectin fusion protein or complex of the present invention and an imaging probe can be used for in-vivo imaging of mesothelioma.
  • an in-vivo diagnostic agent for mesothelioma comprising the conjugate of the above-mentioned intellctin fusion protein or complex of the present invention and an imaging probe.
  • the conjugate of the above-described inlectin fusion protein and complex of the present invention and the cytotoxic agent as defined above can be used for treating mesothelioma.
  • a pharmaceutical composition for use in treating mesothelioma comprising a conjugate of the above-mentioned intellctin fusion protein and complex of the present invention and a cytotoxic agent as defined above. Is done.
  • Antibodies can be produced by methods well known to those skilled in the art. That is, a polyclonal antibody can be obtained by immunizing an animal with an antigen and an adjuvant and obtaining plasma of the immunized animal. Alternatively, an animal may be immunized with an antigen and an adjuvant, B lymphocytes may be obtained from the immunized animal, cell hybridized with myeloma to form a hybridoma, and a hybridoma that produces a desired antibody may be cloned. In the immunization step, HEG1 protein may be forcibly expressed in a mesothelioma cell line (eg, ACC-MESO4 cells), and the cells may be immunized.
  • a mesothelioma cell line eg, ACC-MESO4 cells
  • the immunized animal can produce antibodies against the HEG1 protein.
  • the HEG1 protein may be purified from a cell that expresses the HEG1 protein, preferably from a mesothelioma cell line, to immunize the animal.
  • a solubilized form of HEG1 protein eg, extracellular domain
  • a mesothelioma cell line eg, ACC-MESO4 cells
  • a solubilized form of HEG1 protein obtained from the culture supernatant is used. May immunize animals.
  • such solubilized HEG1 protein is also subjected to sugar chain modification, and this sugar chain modification is similar to the modification of HEG1 protein on the mesothelioma cell membrane.
  • Chimeric antibodies can be prepared by methods well known in the art. For example, it can be prepared by replacing the constant region of an antibody with the constant region of a human antibody.
  • Humanized antibodies include, for example, complementarity determining regions (CDRs) derived from animals other than humans, framework regions derived from human antibodies, and constant regions derived from human antibodies.
  • CDRs complementarity determining regions
  • a humanized antibody can be obtained, for example, by transplanting the above CDR into a human antibody.
  • Human antibodies can be obtained, for example, by immunizing genetically modified mice that produce human antibodies with antigens.
  • Bispecific antibodies are antibodies that can bind to two different epitopes or antigens and can be prepared by methods well known to those skilled in the art.
  • Bispecific antibodies are, for example, a method of further hybridizing cells that produce two different antibodies to produce a hybrid hybridoma, or a pair of V H region and VL region cannot be formed between the two regions.
  • An antibody that competes in the binding between an antibody and an antigen can be obtained by a competitive assay well known to those skilled in the art.
  • An antibody that competes for binding to the same antigen if it can block the binding of the desired antibody in a competition assay, for example, at least 20%, preferably at least 20-50%, more preferably at least 50%. Can do.
  • Competing antibodies can be confirmed by cross-blocking assays, preferably by competitive ELISA assays.
  • the antigen is coated on, for example, a microtiter plate, where the presence of a candidate competitive antibody is added and incubated to form a bond between the antigen and the candidate antibody. Then, after labeling the desired antibody, it is further added to the well, incubated, washed, and the binding amount of the desired antibody is quantified to determine whether or not the antibody has competed. If competing, there should be less label remaining in the well.
  • a method for diagnosing mesothelioma in a patient suffering from or at risk of suffering from mesothelioma using an antibody or antigen-binding fragment thereof that binds to the HEG1 protein is provided. Is done.
  • the present invention also provides a preliminary method for diagnosing mesothelioma in a patient suffering from or at risk of suffering from mesothelioma using an antibody or antigen-binding fragment thereof that binds to the HEG1 protein (E.g., industrial methods).
  • the present invention further provides a method of detecting mesothelioma cells in a patient suffering from or at risk of suffering from mesothelioma using an antibody or antigen-binding fragment thereof that binds to the HEG1 protein.
  • the diagnosis of mesothelioma is performed by a doctor, and the present invention provides the doctor with basic information of diagnosis as a method for diagnosis by the doctor.
  • a diagnostic agent for diagnosing mesothelioma in a patient suffering from or at risk of suffering from mesothelioma comprising an antibody or antigen-binding fragment thereof that binds to the HEG1 protein
  • a diagnostic kit may comprise instructions for detecting mesothelioma using an antibody or antigen-binding fragment thereof that binds to the HEG1 protein.
  • the diagnostic agent or kit may contain any of the antibodies of the present invention or an antigen-binding fragment thereof.
  • the diagnostic agent and diagnostic kit of the present invention can be used to detect mesothelioma as described below.
  • a method for diagnosing mesothelioma comprising contacting a sample with the antibody of the present invention or an antigen-binding fragment thereof. And a method for detecting mesothelioma to assist a doctor in diagnosing mesothelioma.
  • the detection of mesothelioma according to the present invention can be performed by bringing the antibody of the present invention or an antigen-binding fragment thereof into contact with a sample.
  • a sample separated from a living body such as a cell, tissue, or tissue section
  • the antibody reaction can be detected by a method well known to those skilled in the art (for example, immunohistological staining method).
  • an antibody reaction is observed (for example, when it is positive), it is highly likely that the subject from which the sample is derived suffers from mesothelioma. Whether or not the antibody reaction is positive can be determined based on the Allred Score method (see Allred DC et al., Mod Pathol, 11: 155-168, 1998).
  • Total score (TS) staining rate score (PS) + staining intensity score (IS)
  • PS and IS staining intensity score
  • the detection of mesothelioma is Contacting the antibody of the invention or antigen-binding fragment thereof with a sample obtained from a subject suspected of being mesothelioma; Detecting the presence of the HEG1 protein (preferably the extracellular domain of the HEG1 protein) present in the sample using the antibody of the present invention.
  • the HEG1 protein to be detected is HEG1 that has undergone glycosylation, more preferably HEG1 protein having O-type glycosylation, and even more preferably mesothelioma. Is a HEG1 protein having a sugar chain modification.
  • the detection of mesothelioma may further include determining whether or not mesothelioma has been detected using the staining rate and / or staining intensity as an index.
  • the method may include determining whether mesothelioma has been detected based on the Allred Score method. In one embodiment, it may include determining that mesothelioma has been detected when the total score (TS) is 2 or more, preferably 3 or more, based on the Allred Score method.
  • HEG1 having a sugar chain modification obtained from mesothelioma using an antibody that binds to the HEG1 protein having a sugar chain modification obtained from mesothelioma in a sugar chain modification-dependent manner.
  • the presence of the protein can be detected in the sample.
  • the presence of HEG1 protein having sugar chain modification obtained from mesothelioma is detected in the sample using an antibody that binds to HEG1 protein having sugar chain modification obtained from mesothelioma. It is good also as what detects by.
  • the antigen protein or a part thereof can be detected by immunohistological staining using the antibody of the present invention.
  • the mesothelioma diagnosis method, mesothelioma detection method, mesothelioma detection method of the present invention, or mesothelioma detection method for assisting doctors in diagnosing mesothelioma Can be determined that mesothelioma has been detected from the subject.
  • the mesothelioma to be detected in the present invention is at least one mesothelioma selected from the group consisting of epithelial type, biphasic type, sarcoma type, and fibrogenic type.
  • the mesothelioma to be detected in the present invention may be a sarcoma type mesothelioma.
  • mesothelioma in a subject suspected of having mesothelioma (especially epithelial mesothelioma) or lung adenocarcinoma, It is possible to identify whether or not the patient has adenocarcinoma. Accordingly, detection of mesothelioma according to the present invention can be performed on a subject suspected of having mesothelioma (particularly epithelial mesothelioma) or lung adenocarcinoma. Further, according to the present invention, mesothelioma can be differentiated from other cancers. Thus, the detection of mesothelioma according to the present invention can be performed on a subject suspected of having mesothelioma or other cancer.
  • the detection of mesothelioma is performed by using a conjugate of an imaging probe and the antibody of the present invention or an antigen-binding fragment thereof instead of the antibody of the present invention or an antigen-binding fragment thereof, or the present invention as defined above.
  • a fusion protein or complex of the antibody fragment and inlectin may be used.
  • the fusion protein or complex of the antibody fragment of the present invention and inlectin defined above may be in the form of a conjugate with an imaging probe.
  • the cell precipitate that had been stored frozen was suspended in 100 ⁇ L of PBS and mixed with 100 ⁇ L of AddaVax (INVIVOGEN). The whole amount was administered intraperitoneally to a 6-week-old Balb / c mouse (female), and the cell precipitate that had been stored frozen every two weeks was repeatedly administered in the same manner. After a total of three immunizations, a drop of blood was collected from the tail vein to obtain serum. Immunostaining was performed using thin slices prepared from ACC-MESO1 and ACC-MESO4 cell pellets fixed with AMeX (Sato Y et al. Am J Pathol 125: 431-435 (1986)), and mesothelioma cells It was confirmed whether the antibody against was produced. Mice with high antibody titers were immunized again using cell precipitation as described above, and the spleen was aseptically removed one week later.
  • the spleen was ground on a stainless mesh, and lymphocytes were dispersed in 10 mL of RPMI 1640. After loosening a large cell mass by pipetting, it was transferred to a 15 mL centrifuge tube and allowed to stand for 3 minutes. The cell suspension was transferred to a new centrifuge tube so as not to suck a large aggregate, and the cells were washed twice with RPMI 1640, and the number of cells was counted.
  • Lymphocytes (6.75 ⁇ 10 7 cells) and myeloma cells (PAI) (5.25 ⁇ 10 6 cells) that had been cultured in advance were mixed, washed twice with RPMI 1640, and then cell fusion was performed.
  • Cell fusion was performed using PEG1500 (Roche Diagnostics Inc.) according to the protocol attached to the product. After the fusion, the cells were suspended in RPMI 1640 (76 mL) containing 15% FCS, 10% BM Condimed H1 (Roche Diagnostics), 1 ⁇ HAT (Thermo Fisher Scientific), and 200 ⁇ L per well (about 1.9 ⁇ 10 5 cells / well) were placed in four 96-well plates. After culturing at 37 ° C.
  • Screening was performed by immunostaining using sliced sections prepared from cell precipitates of ACC-MESO1 and ACC-MESO4 fixed with AMeX. The sliced sections were blocked with 0.5% casein for 10 minutes, and 100 ⁇ L of the hybridoma culture supernatant was reacted as a primary antibody for 2 hours. After washing with PBS, the EnVision + kits (Dako Japan Godo Kaisha) was reacted for 30 minutes as a secondary antibody, and coloring was performed using DAB. 384 wells were screened and 93 clones were obtained as immunostaining positive clones.
  • Example 2 Detection of mesothelioma by the obtained monoclonal antibody Various types of mesothelioma were stained using the monoclonal antibody produced from SKM9-2 obtained in the above screening.
  • a cell pellet fixed with AMeX or a tissue fixed with formalin was embedded in paraffin to prepare a sliced slice.
  • the sections were fixed on a slide glass, deparaffinized and dehydrated with xylene and ethanol, and antigens were activated under various conditions.
  • the sections were treated with 3% hydrogen peroxide for 5 minutes to inactivate endogenous peroxidase, washed with PBS, and blocked with 0.5% casein for 10 minutes.
  • cytokeratin 5/6 CK5 / 6
  • podoplanin cytokeratin 5/6
  • WT-1 Wilms tumor gene product 1
  • the activation solution was calretinin, CK5 / 6, podoplanin 1 mM ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) 10 mM Tris buffer (pH 9.0), WT-1, mesothelin, SKM9-2 antigen 0.1% Tween-20. It was a 10 mM citrate buffer solution (pH 6.0).
  • the primary antibodies used were as follows: calretinin, rabbit anti-calretinin polyclonal antibody (PAD: DC8) (Life Technologies Japan Ltd., Tokyo, Japan); CK5 / 6, mouse anti-cytokeratin 5,6 monoclonal antibody (D5) / 16B4) (Nichirei Biosciences); mesothelin, mouse anti-human mesothelin monoclonal antibody (5B2) (Leica Micro- systems, Inc., Bannockburn, IL); podoplanin, mouse anti-podoplanin monoclonal antibody (D2-40) (Roche Diagnostics Inc.); WT-1, mouse anti-human WT-1 monoclonal antibody (6F-H2) (Roche Diagnostics Inc.).
  • FIGS. 1A and B Representative staining images of mesothelioma were as shown in FIGS. 1A and B.
  • the SKM9-2 antibody was able to satisfactorily stain each of the epithelial type (FIG. 1A) and sarcoma type (FIG. 1B). Further, as shown in Table 1, the SKM9-2 antibody was able to detect mesothelioma with higher sensitivity than any of the other antibodies.
  • the positive determination was made positive when the ratio of cells that were 1 or more in the determination based on Allred score to the cells was 10% or more.
  • the SKM9-2 antibody can detect each type of mesothelioma with high sensitivity.
  • well-differentiated papillary mesothelioma which is a benign or low-grade mesothelioma, could be stained well with the SKM9-2 antibody (1 case in 1 case).
  • other cancers are gastric cancers, colon cancers, breast cancers, ovarian cancers, renal cell cancers, urothelial cancers, which tend to be a problem in differential diagnosis from mesothelioma, and “soft tissue sarcomas” are cancers.
  • the SKM9-2 antibody has high specificity for mesothelioma and can be differentiated from other types of tumors or cancers with high accuracy. In addition, the SKM9-2 antibody hardly recognized any healthy tissue. Only three cases of SKM9-2 antibody were positive: urothelial carcinoma (1/10), leiomyosarcoma (1/10), and epithelioid vascular endothelial species (1/6). .
  • Calretinin antibody, cytokeratin 5/6 antibody, mesothelin antibody and WT-1 antibody known as conventional mesothelioma diagnostic antibodies can each detect epithelial mesothelioma with high sensitivity.
  • these antibodies do not necessarily have excellent specificity, and it is difficult to distinguish lung adenocarcinoma from epithelial mesothelioma, or to detect sarcoma mesothelioma. It was known that there was.
  • calretinin and WT-1 are expressed in the cytoplasm in various healthy and cancerous tissues, and there is a risk of misidentifying as a nuclear translocation image characteristic of mesothelioma. It was not an easy marker.
  • the SKM9-2 antibody can easily distinguish mesothelioma depending on whether it is positive or negative, and can detect both epithelial mesothelioma and sarcoma mesothelioma. It was better than the antibody. It was also possible to differentiate between mesothelioma and other cancers.
  • the antigen recognized by the SKM9-2 antibody can be a very useful marker in mesothelioma diagnosis.
  • Example 3 Analysis of the obtained hybridoma In Examples 1 and 2, it was revealed that a monoclonal antibody having high specificity for mesothelioma cells was obtained. Thus, identification of the antigen of SKM9-2 antibody and antibody Further analysis of the antigen recognition properties of SKM9-2 antibody.
  • the precipitate was extracted with 20% Tris buffer (ph 7.2) containing 0.1% Tween 20, 150 mM NaCl, and the supernatant after centrifugation was concentrated using Amicon Ultra-15,100 kDa (Merck Millipore) and 6M
  • the solution was exchanged with 20 mM Tris buffer (pH 8.0) containing guanidine hydrochloride.
  • Tris (2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride having a final concentration of 10 mM was added to the concentrated solution and heated at 60 ° C. for 30 minutes, and then 40 mM of iodoacetamide having a final concentration was added and reacted at room temperature for 3 hours.
  • the reaction solution was subjected to gel filtration chromatography (Superose 6 Increase 10 / 300GL (GE Healthcare)) in 20 mM Tris buffer (pH 8.0) containing 6 M guanidine hydrochloride and 0.05% Tween 20, and positive by dot blot. The fractions to be collected were collected. The sample was dialyzed overnight at room temperature against 25 mM phosphate buffer (pH 7.0) containing 4 M urea and 0.05% Tween 20, and applied to Mono Q 5 / 50GL (GE Healthcare).
  • the dot blot was performed as follows. A PVDF membrane (Immobilon-P Merck Millipore) was immersed in methanol, and then washed and immersed in pure water. A hydrophilic PVDF membrane was placed on a filter paper soaked with water so as not to sandwich air, and after removing excess water, the sample was impregnated into dots with a micropipette of 1 to 5 ⁇ L. After the membrane was dried overnight at room temperature, it was hydrophilized again with methanol and pure water, and with 20 mM Tris buffer (pH 7.4) (blocking buffer) containing 5% skim milk, 0.1% Tween 20, 150 mM NaCl at room temperature. Blocking was performed for 1 hour.
  • Tris buffer pH 7.4
  • the mouse ascites of SKM9-2 hybridoma diluted 1,000 times with blocking buffer was reacted as a primary antibody for 1 hour at room temperature, and then 20 mM Tris buffer (pH 7.4) containing 0.1% Tween 20, 150 mM NaCl (pH 7.4) ( The membrane was washed by TBST).
  • Horseradish peroxidase-labeled goat anti-mouse IgG (Jackson ImmunoResearch) diluted 30,000 times in blocking buffer was allowed to react at room temperature for 1 hour, washed with TBST, then developed and detected with ECL prime (GE Healthcare). Went.
  • the purified antigen was confirmed by Western blotting. Samples were separated with 6% SDS-PAGE or 4-15% Mini-PROTEAN TGX precast gel (Bio-Rad), and submarine type using 10 mM CAPS buffer (pH 10.5) containing 0.01% SDS. The sample was transferred to the PVDF membrane by a transfer device. The transferred membrane was subjected to blocking and antibody reaction in the same manner as the dot blot, and color development and detection were performed with ECL prime (GE Healthcare).
  • the membrane was washed with 20 mM Tris buffer (pH 8.0) containing 6M guanidine hydrochloride, 0.1% Tween 20, 1% 2-mercaptoethanol for 15 minutes at room temperature, washed thoroughly purely, and then blocked again. went. Detection was performed in the same manner using a mouse anti- ⁇ -actin monoclonal antibody (Sigma-Aldrich) diluted 5,000 times as a control antibody.
  • the molecular weight of the antigen of the SKM9-2 antibody by SDS-PAGE was estimated to be about 400 kDa, which was inconsistent with the estimated molecular weight of the HEG1 protein (about 150 kDa).
  • the SKM9-2 antibody could recognize the HEG1 protein.
  • H1097 sense strand GAUCUUUGACGGUCAGUCUGG (SEQ ID NO: 23)
  • H1097 antisense strand AGACUGACCGUCAAAGAUCGC (SEQ ID NO: 24)
  • H2674 sense strand CCUAUAGCCGUACAGACUACA (SEQ ID NO: 25)
  • H2674 antisense strand UAGUCUGUACGGCUAUAGGGC (SEQ ID NO: 26)
  • H3671 antisense strand UGAAAGUAUCCCGACUUGCAC (SEQ ID NO: 28)
  • As a negative control Mission Negative control SIC-001, confidential sequences (manufactured by Sigma) was used.
  • siRNAs were each transfected into ACC-MESO4 using Lipofectamine 2000 (Thermo Fisher Scientific). After culturing for 72 hours, the cells were washed with PBS, 25 mM / cm 2 of 20 mM Tris buffer (pH 8.0) containing 1% SDS, 125 mU / mL Benzonase nuclease (Merck Millipore) was added, and the mixture was allowed to stand on ice for 5 minutes. And the lysate was collected. The supernatant after centrifugation was used as a sample, separated by 6% SDS-PAGE, and then Western blotted.
  • expression suppression was also performed using a lentivirus that expresses shRNA against human HEG1.
  • Lentiviral particles sc-78365-V
  • ACC-MESO4 ACC-MESO4 according to the product protocol.
  • drug selection was started using 10 ⁇ g / mL puromycin, and cells that survived and proliferated until 10 days were used as shRNA stably expressing cells.
  • the operation after solubilization was performed in the same manner as in the siRNA treatment.
  • cop GFP control lentiviral particles sc-108084, manufactured by Santa Cruz
  • HEG1 cDNA (SEQ ID NOs: 32 and 34) cloned from ACC-MESO4, a FLAG tag and His are added to the base sequence (# 1 to 4059 of SEQ ID NO: 32) corresponding to the extracellular region of the base sequence shown in SEQ ID NO: 32.
  • the gene to which the tag was connected (SEQ ID NO: 17) was inserted between the XhoI site and NotI site of pcDNA3.1 (-) (Thermo Fisher Fisher Scientific) to prepare a recombinant soluble HEG1 expression plasmid.
  • This plasmid was transfected into ACC-MESO4 using Lipofectamine LTX Reagent with PLUS Reagent (Thermo Fisher Scientific), and drug selection was performed with 750 ⁇ g / mL geneticin (Thermo Fisher Scientific). Two weeks later, the surviving and proliferating cells were collected and used as recombinant soluble HEG1 stably expressing cells. 40 mL of the cell culture supernatant was added to HisTrap excel (1 mL) (GE Healthcare), and the column was washed with 25 mM phosphate buffer (pH 7.2) containing 10 mM imidazole and 0.5 M NaCl. Elution was performed in solution with a 10-500 mM imidazole gradient.
  • the SKM9-2 antibody expresses post-translational modification HEG1 expressed in mesothelioma. It was suggested that they were aware.
  • the post-translational modification of HEG1 contained in the epitope The apparent molecular weight of SDS-PAGE of HEG1 protein was about 400 kDa, which was considerably larger than the expected molecular weight of 148 kDa.
  • the primary amino acid sequence of the HEG1 protein was analyzed, and it was predicted that HEG1 was subjected to many O-type and N-type sugar chain modifications. Therefore, the purified antigen was treated with a sugar chain cleaving enzyme, and the reactivity of the SKM9-2 antibody was analyzed.
  • the reactivity of the SKM9-2 antibody was confirmed after the HEG1 protein purified from the ACC-MESO4 cells was untreated or treated with various enzymes. The reactivity was confirmed by the dot blot method as described above.
  • Example 1 a polyclonal antibody was obtained from the serum of a mouse immunized with a human malignant pleural mesothelioma-derived cell line, and the HEG1 protein was treated with neuraminidase, followed by dot plot. As a result, recognition of the HEG1 antibody was recognized by neuraminidase treatment. Weakened. From this, it is considered that the obtained antibody contains many antibodies that recognize the HEG1 protein in a sugar chain modification-dependent manner.
  • N-glycanase F N-glycanase F treatment did not eliminate the reactivity of the antibody, so the sugar chain contained in the epitope was considered to be an O-type sugar chain. . Furthermore, since the reactivity of the antibody disappeared by the proteinase K treatment, it was predicted that the peptide region was also included in the epitope. From these results, it was suggested that the SKM9-2 antibody is an antibody that recognizes the sugar chain portion and the peptide portion of the HEG1 protein.
  • anti-HEG1 antibodies are antibodies against peptide antigens, such as anti-HEG1 antibodies (HEG1 (N-13): sc-102592), which are goat polyclonal antibodies from Santa Cruz Biotechnology, and rabbits from Bioss Inc.
  • Anti-HEG1 antibody which is a polyclonal antibody, did not react with HEG1 protein purified from mesothelioma.
  • ACC-MESO4 was cultured, and the cells adhered to the dish were detached from the culture dish with a scraper. The detached cells were reacted with the SKM9-2 antibody, then treated with FITC-labeled anti-mouse IgG, and analyzed with a flow cytometer. As a negative control, 2D2 antibody that does not bind to cells was used. If the SKM9-2 antibody binds to the extracellular region of the HEG1 protein, the cells will be FITC labeled and fluorescence should be observed by flow cytometry. The result was as shown in FIG.
  • Example 4 SKM9-2 antibody sequencing
  • the DNA and amino acid sequences of the SKM9-2 antibody were determined.
  • Example 5 Reactivity of SKM10-2 antibody to HEG1 protein The reaction specificity of the SKM10-2 antibody obtained as an antibody specifically recognizing mesothelioma in Example 1 was confirmed.
  • Recombinant soluble HEG1 (see Example 3 (2)) and ACC-MESO4 cell lysate were separated by 6% SDS-PAGE, and Western blotting was performed using the culture supernatant of SKM10-2. .
  • the result was as shown in FIG.
  • the SKM10-2 antibody recognized the HEG1 protein.
  • the SKM10-2 antibody is an antibody that binds to the HEG1 protein in a sugar chain-dependent manner like the SKM9-2 antibody. It became clear.
  • the SKM10-2 antibody can also compete for binding between the SKM9-2 antibody and the HEG1 protein.
  • Example 6 Preparation of intactin fusion Fab A fusion protein of Fab fragment of SKM9-2 antibody and intellactin was prepared, and it was confirmed whether this intactin fusion antibody could recognize HEG1 protein.
  • a protein (SEQ ID NO: 21) in which the V H region and CH1 region of the H chain of the SKM9-2 antibody and the 19th to 313th amino acids of human intellectin (SEQ ID NO: 20) are fused is added to the L of the SKM9-2 antibody.
  • the intactin fusion antibody was obtained by co-expressing in chains and cells.
  • the inventors have shown that inlectin has a diol structure and very high specificity and high affinity and can be highly purified by a column packed with a diol-modified gel. Therefore, the culture supernatant containing the intellactin fusion antibody was added to a column packed with diol sepharose and eluted with 1,2-propanediol to obtain a purified intellectin fusion antibody.
  • Diol Sepharose was prepared by alkaline hydrolysis of the epoxy group of Sepharose beads (epoxy-activated Sepharose 6B (GE Healthcare Bioscience)) into which 1,4-bis (2,3-epoxypropyl) butane was introduced. It was confirmed by Western blotting whether the lectin fusion antibody can recognize the HEG1 protein by using an anti-intellectin antibody labeled with horseradish peroxidase as the secondary antibody. The results were as shown in Fig. 8, and the intellactin fusion antibody recognized the sugar chain-modified HEG1 protein in the same manner as the SKM9-2 antibody.
  • the present inventors have clarified that inlectin binds to a diol structure. That is, as shown in Table 4, the diol structure was added to 500 ⁇ L of the culture supernatant of RK-13 cells forcibly expressing human inlectin-1 (MEM medium containing recombinant human inlectin-1 and 5% FCS). With or without beads were added and stirred at 25 ° C. for 18 hours. Thereafter, the beads were collected by centrifugation, and the collected beads were washed once with 20 mM Tris buffer (pH 7.2) containing 0.1% Tween 20 and 150 mM NaCl, and eluted with a buffer containing 15% glycerol. .
  • MEM medium containing recombinant human inlectin-1 and 5% FCS
  • the eluted sample was separated by SDS-PAGE and stained with CBB.
  • diol beads beads obtained by binding 3-amino-1-propanediol via amino groups to the surface of polystyrene beads are used, and as diol sepharose beads, 1,4-bis (2,3- Epoxy-activated Sepharose B 6B (GE Healthcare Biosciences), which had an epoxy hydrolyzed epoxy group, was used.
  • the inlectin binds to the diol structure of the compound, it can be purified using the diol sepharose beads or the like.
  • the fusion protein of the antibody Fab fragment and inlectin could be purified with diol sepharose beads.
  • an intectin fusion protein can be purified by using a column or bead on which a compound shown in Table 5 is immobilized. Since a column having a diol structure can be procured at a low cost, the intectin fusion protein is useful in the detection of mesothelioma from the viewpoint of production cost.
  • Example 7A Suppressive effect of mesothelioma proliferation by knockdown of HEG1
  • HEG1 was knocked down in a mesothelioma cell line using siRNA against HEG1, and the effect on mesothelioma cell proliferation was examined. It was.
  • the ACC-MESO-4 cell line was used as the mesothelioma cell.
  • Cells were seeded in 96-well plates at 5 ⁇ 10 3 cells / well and cultured in 100 ⁇ L of medium for 24 hours. The cells were washed with PBS and 15 ⁇ Lopti-MEM (Thermo Fisher Scientific Inc.) containing 7.5 pmol siRNA, 0.15 ⁇ L Lipofectamine 2000 or Lipofectamine RNAiMAX (Thermo Fisher Scientific Inc.) was added to each well. The cells were cultured for 24 hours, 48 hours, or 72 hours, and the number of viable cells was measured using CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Reagent (Promega KK, Tokyo, Japan).
  • siRNA a 1: 1 mixture of the above H1097 and H2674 was used as siRNA1, and commercially available sc-78365 (Santa Cruz Biothechnology, Inc.) was used as siRNA2.
  • H3059 sense strand 5'-GCGAAUGCGUCGCAGACAACA-3 '(SEQ ID NO: 38)
  • H3059 antisense strand 5'-UUGUCUGCGACGCAUUCGCCA-3 '(SEQ ID NO: 39)
  • H9106 sense strand 5'-CUGGCGUUCUAGUCAGUAAAA-3 '(SEQ ID NO: 40)
  • H9106 antisense strand 5'-UUACUGACUAGAACGCCAGAC-3 '(SEQ ID NO: 41) was used.
  • MISSION siRNA Universal Negative Control SIC-001
  • HEG1 knockdown was as shown in FIG. As shown in FIG. 10, it was revealed that the cell proliferation ability was lowered in both cases where HEG1 was knocked down (HEG1, siRNA1, and siRNA2) as compared to the control and untreated mesothelioma cell lines. In addition, in HEG1 siRNA1, the number of cells was decreased compared with that before the start of culture (FIG. 10). Some of the mesothelioma cells treated with HEG1 siRNA1 induced cell death at 48 hours.
  • siRNA was introduced into cells as described above. The result was as shown in FIG. As shown in FIG. 11, even when HEG1 was knocked down using any siRNA, mesothelioma cells had reduced cell proliferation ability.
  • HEG1 is strongly involved in cell proliferation of mesothelioma. It was also revealed that cell growth of mesothelioma can be suppressed by suppressing the expression of HEG1. This suggests that treatment of cancers (eg, mesothelioma) expressing HEG1 becomes possible by inhibiting the expression of HEG1 and the cell growth promoting function of HEG1.
  • cancers eg, mesothelioma
  • the HEG1 protein has three EGF domains in the extracellular region.
  • a protein called MUC4 has an EGF domain outside the cell, and is known to be involved in carcinogenesis by binding to ErbB2 (or HER2 / neu). This suggests that the EGF domain of HEG1 protein may also be involved in carcinogenesis.
  • HEG1 knockdown suppressed the growth of tumor cells. That is, in this example, the results showed that HEG1 protein is required for tumor cell growth. From this, it was considered that the EGF domain may be involved in the cell growth promoting function of the HEG1 protein.
  • HEG1 when the intracellular expression site of HEG1 is confirmed, the conventional non-glycan chain-modified HEG1 is expressed at a site of tight junction between epithelial cells, whereas it has a sugar chain modification characteristic of mesothelioma. HEG1 is hydrophilic due to sugar chain modification and is expressed on the apical surface of epithelial cells. This also suggests that HEG1 may be involved in intercellular signals or signal transduction involved in cell proliferation.
  • Example 8A Determination of Epitope Region
  • endogenous HEG1 of mesothelioma cell line ACC-MESO-1 was knocked down, human HEG1 fragment was expressed, and the reactivity with SKM9-2 antibody was determined. confirmed.
  • the epitope region was then tested for reactivity with the antibody by alanine scanning to determine the amino acids important for antibody binding.
  • HEG1 siRNA H9106
  • human HEG1 were introduced into mesothelioma cell line ACC-MESO-1, and the reactivity of SKM9-2 was determined by Western blotting. confirmed.
  • Human HEG1 used was a full length (HEG1 full length) or a fragment (HEG1 3 kb, HEG1 2 kb, or HEG1 1 kb).
  • the full length of human HEG1 is a protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 35, and a plasmid obtained by inserting the base sequence of SEQ ID NO: 34 into pFLAG-CMV1 (Sigma) was transformed into the above mesothelioma.
  • HEG1 3 kb fragment was expressed in the above mesothelioma cell line by inserting the 285th leucine to 1387th phenylalanine fragment of SEQ ID NO: 35 into pFLAG-CMV1 (Sigma) so as to be in-frame.
  • HEG1 2 kb and HEG1 1 kb were respectively expressed in the above mesothelioma cell line in the same manner as the 677th leucine to 1387th phenylalanine fragment and 992nd valine to 1387th phenylalanine fragment of SEQ ID NO: 35. It was.
  • Cell lysates were analyzed by Western blot using SKM9-2 antibody. The results were as shown in FIGS.
  • HEG1 full length including HEG1 exon 7, HEG1 3 kb, and HEG1 2 kb were positive (+).
  • HEG1 1 kb was negative ( ⁇ ) for binding to the antibody (FIGS. 13 and 14A). This revealed that the SKM9-2 antibody binds to the exon 7 region of HEG1.
  • the fusion protein of the partial sequence of exon 7 of HEG1 and SLURPgpi used was as follows.
  • a fragment (7.6) obtained by binding a fragment from aspartic acid at amino acid number 783 to serine at position 991 to SLURPgpi;
  • a fragment (7.7) obtained by binding a fragment from glutamine of amino acid number 832 to serine at position 991 to SLURPgpi;
  • a fragment (7.8) obtained by binding a fragment from glutamine of amino acid number 886 to serine at position 991 to SLURPgpi;
  • a fragment (7.9) obtained by binding a fragment of amino acid number 941 from alanine to serine at position 991 to SLURPgpi;
  • FIGS. 13 and 14B The results were as shown in FIGS. 13 and 14B. As shown in FIGS. 13 and 14B, the fusion proteins (7.6 and 7.62) were positive. From this, it was revealed that the SKM9-2 antibody binds to a region containing E793 to T812 of HEG1. Moreover, as shown in FIG. 13 and FIG. 14C, the fusion proteins (7.623 and 7.6231) became positive. From this, it was revealed that the SKM9-2 antibody binds to a region containing S799 to E810 of HEG1.
  • SEQ ID NO: 1 SKM9-2 antibody heavy chain nucleic acid sequence
  • SEQ ID NO: 2 SKM9-2 antibody heavy chain amino acid sequence
  • SEQ ID NO: 3 SKM9-2 antibody light chain nucleic acid sequence
  • SEQ ID NO: 4 SKM9-2 antibody Light chain amino acid sequence
  • SEQ ID NO: 5 nucleic acid sequence of heavy chain CDR1 of SKM9-2 antibody
  • SEQ ID NO: 6 amino acid sequence of heavy chain CDR1 of SKM9-2 antibody
  • SEQ ID NO: 7 nucleic acid sequence sequence sequence of heavy chain CDR2 of SKM9-2 antibody No.
  • SEQ ID NO: 28 Nucleic acid sequence of antisense strand of H3671
  • SEQ ID NO: 29 Nucleic acid sequence of HEG1 gene registered as NM — 0207333.1
  • SEQ ID NO: 30 Amino acid sequence of the protein encoded by SEQ ID NO: 29: Natural of HEG1 protein Soluble variant of SEQ ID NO: 32: Nucleic acid sequence of nucleic acid encoding a natural variant of HEG1 protein
  • SEQ ID NO: 33 Amino acid sequence of the protein encoded by SEQ ID NO: 32: SEQ ID NO: 34 encodes a natural variant of HEG1 protein Nucleic acid arrangement SEQ ID NO: 35: Amino acid sequence of the protein encoded by SEQ ID NO: 34
  • SEQ ID NO: 36 Nucleic acid sequence of a nucleic acid encoding a natural variant of the HEG1 protein
  • SEQ ID NO: 37 Amino acid sequence SEQ ID NO: 38 of the protein encoded by SEQ ID NO: 36 : Nu
  • Amino acid sequence of L807A mutant peptide of FIG. 13 SEQ ID NO: 63: Amino acid sequence of P808A mutant peptide of FIG. 13 SEQ ID NO: 64: Amino acid sequence of T809A mutant peptide of FIG. 13 SEQ ID NO: 65: E810A mutant peptide of FIG. Amino acid sequence

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Abstract

本発明は、中皮腫を検出する抗体および中皮腫に対する高い特異性および高い感受性を有する抗体を提供する。本発明はまた、該抗体を用いた中皮腫の診断方法、並びに、該抗体を含む中皮腫診断用試薬および中皮腫診断用キットを提供する。本発明はさらに、中皮腫の診断マーカーを提供する。本発明はさらにまた、本発明の抗体若しくはその抗原結合性断片を含む中皮腫を処置することに用いるための医薬組成物が提供される。　中皮腫から得られる糖鎖修飾を有するＨＥＧ１タンパク質に結合する抗体。

Description

膜型ムチン様タンパク質の認識とその医療応用
　本発明は、膜型ムチン様タンパク質の認識とその医療応用に関する。より具体的には、本発明は、中皮腫を検出する抗体および中皮腫に対する高い特異性および高い感受性を有する抗体に関する。本発明はまた、該抗体を用いた中皮腫の診断方法、並びに、該抗体を含む中皮腫診断用試薬および中皮腫診断用キットに関する。本発明はさらに、中皮腫の診断マーカーに関する。本発明はさらにまた、本発明の抗体若しくはその抗原結合性断片を含む中皮腫を処置することに用いるための医薬組成物に関する。
　悪性中皮腫は、アスベストの曝露が主要原因で発生する悪性腫瘍として、大きな社会問題となっている疾患である。早期発見が困難であり、予後の悪い悪性腫瘍の一つに位置づけられている。悪性中皮腫は、転移性の腺癌や肉腫、良性の増殖である反応性中皮細胞と病理学的に類似する場合があり、病理学的鑑別にしばしば困難を伴う。また、上皮型、肉腫型など多彩な組織型をとり、診断に苦慮することも稀ではない。そのため、悪性中皮腫に特異性の高い免疫組織学的な病理診断マーカーの開発が続けられているが、頻用されている抗体でも悪性中皮腫に対する特異性が高いものばかりではなく、病理診断では陽性マーカーと陰性マーカーを組み合わせて多角的に鑑別を行うのが一般的である。
　悪性中皮腫の病理診断のための陽性マーカーとして、カルレチニン、サイトケラチン５／６（ＣＫ５／６）、メソテリン、ポドプラニン、ウィルムス腫瘍遺伝子産物－１（ＷＴ－１）などが頻用されている。これらのマーカーは一般的に高い感度（８０－９０％程度）で上皮型悪性中皮腫を検出しうる。しかし、その特異性に関しては必ずしも優れているとは言えず、肺線がんと上皮型悪性中皮腫の鑑別や、肉腫型悪性中皮腫の検出に利用できない場合がある。また、悪性中皮腫におけるカルレチニンやＷＴ－１の核移行像は悪性中皮腫の鑑別において重要な要素となるが、これらの分子は種々の健常組織やがん細胞で細胞質に発現が認められ、発現が核内なのか細胞質なのかを判断する必要があり、病理診断マーカーとしては視認性に問題を有する。
　非特許文献１では、悪性中皮腫においてｍＲＮＡとして発現する遺伝子の解析がなされているが、分析されたｍＲＮＡレベルの上昇は統計学的に有意な現象ではないと結論付けられ、診断に利用可能な因子の特定には至っていない。
Melaiu O. et al., Mutation Research, 771: 6-12, 2015
　本発明は、中皮腫を検出する抗体および中皮腫に対する高い特異性および高い感受性を有する抗体を提供する。本発明はまた、該抗体を用いた中皮腫の診断方法、並びに、該抗体を含む中皮腫診断用試薬および中皮腫診断用キットを提供する。本発明はさらに、中皮腫の診断マーカーを提供する。本発明はさらにまた、本発明の抗体若しくはその抗原結合性断片を含む中皮腫を処置することに用いるための医薬組成物を提供する。
　本発明者らは、マウスにヒト中皮腫細胞を免疫して得たＳＫＭ９－２抗体が中皮腫を高感度かつ高い特異性を持って認識できることを見出した。本発明者らはまた、ＳＫＭ９－２抗体の抗原がＨＥＧ１タンパク質であることを見出した。本発明者らは、この結果に基づいてＨＥＧ１タンパク質が中皮腫のマーカーとして用い得ることを見出した。本発明者らはさらに、ＳＫＭ９－２抗体が糖鎖修飾依存的にＨＥＧ１タンパク質に結合することを見出した。本発明者らは、中皮腫において糖鎖修飾されたＨＥＧ１タンパク質もまた中皮腫のマーカーとして用い得ることを見出した。本発明はこのような知見に基づいてなされた発明である。
　すなわち、本発明によれば、以下の発明が提供される。
［１］中皮腫から得られる糖鎖修飾を有するＨＥＧ１タンパク質に結合する抗体、またはその抗原結合性断片。
［２］中皮腫から得られる糖鎖修飾を有するＨＥＧ１タンパク質に糖鎖修飾依存的に結合する、上記［１］に記載の抗体、またはその抗原結合性断片。
［２’］中皮腫から得られる糖鎖修飾を有するＨＥＧ１タンパク質の糖鎖部分およびペプチド部分の両方に結合する、上記［１］または［２］に記載の抗体、またはその抗原結合性断片。
［３］中皮腫の細胞膜上のＨＥＧ１タンパク質に結合する抗体。
［４］請求項３記載の抗体であって、
（１）配列番号６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１と、配列番号８のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２と、配列番号１０のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む重鎖可変領域を含む、抗体、
（２）配列番号１２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１と、配列番号１４のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２と、配列番号１６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域とを含む、抗体、
（３）配列番号６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１と、配列番号８のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２と、配列番号１０のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号１２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１と、配列番号１４のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２と、配列番号１６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域とを含む、抗体、
（４）上記（１）～（３）のいずれかの抗体と８０％以上（例えば９０％以上または９５％以上）のアミノ酸配列の配列相同性を有する抗体、
（５）上記（１）～（４）のいずれかの抗体と結合において競合する抗体、若しくは
（６）上記（１）～（４）のいずれかの抗体と同じエピトープに結合する抗体
またはこれらの抗原結合性断片。
［５］中皮腫細胞株で発現された配列番号５３のアミノ酸配列を有するペプチドに結合する抗体。
［６］抗原が、中皮腫から得られる糖鎖修飾を有するＨＥＧ１タンパク質である、上記［４］に記載の抗体、またはその抗原結合性断片。
［７］上記［１］～［６］のいずれか一項に記載の抗体のＶH領域またはＶH領域およびＣＨ１領域とヒトインテレクチンタンパク質との融合タンパク質と、該抗体の軽鎖とのタンパク質複合体。
［８］ＨＥＧ１タンパク質に結合する抗体、上記［１］～［６］のいずれか一項に記載の抗体若しくはこれらの抗原結合性断片、または上記［７］に記載のタンパク質複合体を含む、中皮腫診断薬。
［９］ＨＥＧ１タンパク質に結合する抗体、上記［１］～［６］のいずれかに記載の抗体若しくはこれらの抗原結合性断片、または上記［７］に記載のタンパク質複合体と、イメージングプローブとの結合体を含む、中皮腫の体内診断薬。
［１０］ＨＥＧ１タンパク質に結合する抗体、上記［１］～［６］のいずれか一項に記載の抗体若しくはこれらの抗原結合性断片、または上記［７］に記載のタンパク質複合体を含む、中皮腫診断用キット。
［１１］ＨＥＧ１タンパク質に結合する抗体、上記［１］～［６］のいずれかに記載の抗体若しくはこれらの抗原結合性断片、または上記［７］に記載のタンパク質複合体と、イメージングプローブとの結合体を含む、中皮腫の体内診断用キット。
［１２］ＨＥＧ１タンパク質に結合する抗体、上記［１］～［６］のいずれかに記載の抗体若しくはこれらの抗原結合性断片、または上記［７］に記載のタンパク質複合体を含む、中皮腫を処置することに用いるための医薬組成物。
［１３］ＨＥＧ１に対する発現抑制剤を含む、中皮腫を処置することに用いるための医薬組成物。
［１４］生体から分離された試料において、ＨＥＧ１タンパク質を検出することを含む、中皮腫の検出方法。
［１５］ＨＥＧ１タンパク質に結合する抗体、上記［１］～［６］のいずれかに記載の抗体若しくはこれらの抗原結合性断片、または上記［７］に記載のタンパク質複合体により、生体から分離された試料中のＨＥＧ１タンパク質を検出することを含む、中皮腫の検出方法。
［１６］中皮腫から得られる糖鎖修飾を有するＨＥＧ１タンパク質または配列番号３５のアミノ酸配列において７９９番目～８０９番目のアミノ酸配列を含むその断片。
［１６’］中皮腫から得られるＯ型糖鎖修飾を有するＨＥＧ１タンパク質または配列番号３５のアミノ酸配列において７９９番目～８０９番目のアミノ酸配列を含むその断片。
［１７］上記［１６］に記載のＨＥＧ１タンパク質または前記その断片を含む、中皮腫の診断マーカー。
［１７’］上記［１６’］に記載のＨＥＧ１タンパク質または前記その断片を含む、中皮腫の診断マーカー。
図１は、代表的な中皮腫のサブタイプに対するＳＫＭ９－２抗体を用いた免疫組織学染色像を示す。図１Ａは上皮型中皮腫の免疫組織学染色像を示し、図１Ｂは肉腫型中皮腫の免疫組織学染色像を示す。図中の矢じりは、染色された箇所を示す。 図２は、精製ＳＫＭ９－２抗原のウェスタンブロットとＳＤＳ－ＰＡＧＥの結果を示す。 図３は、ＨＥＧ１タンパク質をノックダウンした細胞抽出物と中皮腫細胞株で発現させた組換え可溶型ＨＥＧ１タンパク質をＳＫＭ９－２抗体を用いてウェスタンブロットした結果を示す。 図４は、ＳＫＭ９－２抗体の抗原認識が、脱シアル化酵素処理により弱まることを示す図である。 図５は、ＳＫＭ９－２抗体の抗原が中皮腫の細胞表面に発現していることを示す図である。 図６は、ＳＫＭ９－２抗体を産生するハイブリドーマの抗体遺伝子の重鎖および軽鎖それぞれの塩基配列およびアミノ酸配列を示す。図中では、ＶＨ領域およびＶＬ領域が矢印により挟まれた領域として示されている。 図７は、ＳＫＭ１０－２抗体も糖鎖修飾依存的にＨＥＧ１タンパク質を検出できることを示す図である。 図８は、インテレクチン（ＩＴＬＮ）と融合したＳＫＭ９－２抗体のＶＨ領域およびＣＨ１領域と、ＶＬ領域およびＣＬ領域（すなわち、ＳＫＭ９－２抗体の軽鎖）とのタンパク質複合体が、ＳＫＭ９－２抗体と同様にＨＥＧ１タンパク質を検出できることを示す図である。 図９は、インテレクチンがジオール結合を有するビーズに強く結合することを示す図である。 図１０は、中皮腫細胞株の細胞増殖に対するＨＥＧ１遺伝子のノックダウンの経時的影響を示す図である。 図１１は、中皮腫細胞株の細胞増殖に対するＨＥＧ１遺伝子のノックダウンの影響を示す図である。 図１２は、他の中皮腫細胞株の細胞増殖に対するＨＥＧ１遺伝子のノックダウンの影響を示す図である。 図１３は、ＳＫＭ９－２抗体と、各ヒトＨＥＧ１断片との結合の陽性（＋）および陰性（－）の別を示す図である。図１３では、各ヒトＨＥＧ１断片のＨＥＧ１中での位置が示されている。図１３の最下部ではアラニンスキャニングの結果を示す。図１３中では、改変していないアミノ酸は記号「－」で示された。 図１４Ａは、ＨＥＧ１全長、３ｋｂ断片、２ｋｂ断片および１ｋｂ断片それぞれとＳＫＭ９－２抗体との反応性を確認したウェスタンブロットの結果を示す。 図１４Ｂは、各ＨＥＧ１断片とＳＫＭ９－２抗体との反応性を確認したウェスタンブロットの結果を示す。図１４Ｂでは、７．６断片および７．６２断片において陽性のシグナルが確認されている。 図１４Ｃは、各ＨＥＧ１断片とＳＫＭ９－２抗体との反応性を確認したウェスタンブロットの結果を示す。図１４Ｃでは、７．６２３断片と７．６２３１断片において陽性シグナルが確認されている。 図１４Ｄは、アラニンスキャニングの結果を示す。図中のＳ７９９Ａは、配列番号３５のアミノ酸配列におけるアミノ酸番号で７９９番目のセリンがアラニンに置換された断片を示す。 図１４Ｅは、ノイラミニダーゼ処理された７．６２３１断片とＳＫＭ９－２抗体とが反応しないことを示す。
発明の具体的な説明
　本明細書では、「対象」とは、哺乳動物であり得、好ましくは、ヒトである。対象は、中皮腫その他の腫瘍または癌に罹患している、またはそのリスクがある対象であり得る。
　本明細書では、「抗体」は、免疫グロブリンを意味し、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を含む。好ましい抗体は、モノクローナル抗体である。抗体の由来は、特に限定されないが例えば、非ヒト動物の抗体、非ヒト哺乳動物の抗体、およびヒト抗体が挙げられる。また、抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体、またはヒト抗体であってもよい。また、抗体は、二重特異性抗体であってもよい。
　本明細書では、「抗原結合性断片」とは、抗原への結合性が維持された抗体の一部を意味する。抗原結合性断片は、本発明の抗体の重鎖可変領域若しくは軽鎖可変領域またはその両方を含みうる。抗原結合性断片は、キメラ化またはヒト化されていてもよい。抗原結合性断片としては、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ（単鎖Ｆｖ）、ダイアボディー、ｓｃ（Ｆｖ）２（単鎖（Ｆｖ）２）が挙げられる。このような抗体の断片は、特に限定されないが例えば、抗体を酵素で処理して得ることができる。例えば、抗体をパパインで消化すると、Ｆａｂを得ることができる。あるいは、抗体をペプシンで消化すると、Ｆ（ａｂ’）２を得ることができ、これをさらに還元するとＦａｂ’を得ることができる。本発明ではこのような抗体の抗原結合性断片を用いることができる。
　本明細書では、「中皮腫」とは、中皮細胞由来の腫瘍を意味する。中皮腫としては、その発生部位から、胸膜中皮腫、腹膜中皮腫、心膜中皮腫、および精巣鞘膜中皮腫などが知られている。本明細書では、中皮腫は、良性の中皮腫および／または悪性の中皮腫を意味する。中皮腫は、組織型から、上皮型中皮腫、肉腫型中皮腫、二相型中皮腫、その他の中皮腫（線維形成型など）に大別される。
　ＨＥＧ１タンパク質は、その発現や機能がほとんど分かっていないタンパク質であり、遺伝子オントロジー解析から膜タンパク質であると推定されている。ヒトＨＥＧ１タンパク質としては、米国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）にＮＭ＿０２０７３３．１として登録された配列番号２９の配列を有する遺伝子によりコードされるタンパク質（配列番号３０）、配列番号３１のアミノ酸配列を有するタンパク質、ＸＭ＿００５２４７６６６として登録された配列番号３６の配列を有する遺伝子よりコードされるタンパク質（配列番号３７）、配列番号３２の配列を有する遺伝子コードされるタンパク質（配列番号３３）、および配列番号３４の配列を有する遺伝子によりコードされるタンパク質（配列番号３５）が挙げられる。ＨＥＧ１タンパク質の天然のバリアントとしては、特に限定されないが例えば、配列番号３０のアミノ酸配列においてＱ１４５Ｒ、Ｓ３０５Ｐ、Ｆ６０２Ｓ、Ｖ９８０Ｌ、およびＭ１０３９Ｔなどの変異に対応するアミノ酸変異を有するＨＥＧ１タンパク質のバリアントが知られている。本明細書では、ＨＥＧ１タンパク質の天然のバリアントもＨＥＧ１タンパク質に含まれる。また、ヒトＨＥＧ１タンパク質では、配列番号３０のアミノ酸配列において１３５９番目のセリンがホスホセリンであり得る。本明細書では、配列番号３０のアミノ酸配列において１３５９番目のセリンに対応するセリンがホスホセリンであるＨＥＧ１タンパク質も、ＨＥＧ１タンパク質に含まれる。遺伝子オントロジー解析の結果から、ＨＥＧ１タンパク質において、シグナルペプチド部分は、配列番号３０のアミノ酸配列の１～２９番目に対応するドメインであり、細胞外ドメインは、配列番号３０のアミノ酸配列の３０～１２４８番目に対応するドメインであり、膜貫通ドメインは、配列番号３０のアミノ酸配列の１２４９～１２６９番目に対応するドメインであり、細胞内ドメインは、配列番号３０のアミノ酸配列の１２７０～１３８１番目に対応するドメインであると予想される。例えば、ＨＥＧ１タンパク質には、配列番号２９、３２、３４若しくは３６により表されるＤＮＡ配列または配列番号３０、３１、３３、３５若しくは３７のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を有するＤＮＡの相補鎖に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズできるＤＮＡ配列によりコードされるタンパク質も含まれ得る。ストリンジェントな条件とは、例えば、ハイブリダイズ後の洗浄条件において、例えば、１×ＳＳＣ（０．１５Ｍ　ＮａＣｌ、１５ｍＭクエン酸三ナトリウムを含む水溶液）で６５℃で洗浄する条件を挙げることができる。例えばまた、ＨＥＧ１タンパク質には、配列番号３０により表されるアミノ酸配列と９０％以上、９５％以上、９８％以上、または９９％以上相同なアミノ酸配列を有するタンパク質も含まれ得る。例えば、ＨＥＧ１タンパク質には、配列番号３０により表されるアミノ酸配列において、１または複数個のアミノ酸置換、挿入、付加および／または欠失を含んでいてもよい。
　本発明者らは、ＨＥＧ１タンパク質は、主に中皮腫に発現することを見出した。また、本発明者らによれば、中皮腫は、ＨＥＧ１タンパク質の発現量に基づき診断が可能である。従って、本発明によればＨＥＧ１タンパク質に結合する抗体を用いて中皮腫を検出することができる。本発明によればまた、ＨＥＧ１タンパク質は、中皮腫の細胞膜表面上に発現し、細胞外ドメインを有する。従って、本発明の抗体は、中皮腫の細胞膜、中皮腫の細胞膜上の膜タンパク質、または中皮腫の細胞膜上のＨＥＧ１タンパク質に結合する。また、本発明の抗体は、ＨＥＧ１タンパク質の細胞外ドメインに対する抗体またはその抗原結合性断片であり得る。本発明によれば、ＨＥＧ１タンパク質は、高分化型乳頭状中皮腫（ＷＤＰＭ）にも発現するので、これらの中皮腫の検出に用いてもよい。
　後述の実施例によれば、ＨＥＧ１タンパク質の細胞外ドメインは中皮腫ではシアル化された糖鎖修飾を受けている。従って、ある態様では、本発明の抗体またはその抗原結合性断片は、糖鎖修飾を受けたＨＥＧ１タンパク質に結合する。糖鎖修飾を受けたＨＥＧ１タンパク質は、精製してＳＤＳ－ＰＡＧＥで分析すると見かけ上の分子量が３００ｋＤａ～５００ｋＤａの範囲にブロードなバンドとして検出されうる。より詳細には、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによる見かけ上の分子量は約４００ｋＤａであり得る。本発明のある態様では、糖鎖修飾は、中皮腫の細胞膜上に発現するＨＥＧ１タンパク質が受けている糖鎖修飾である。
　ある態様では、本発明の抗体またはその抗原結合性断片は、中皮腫細胞で見出される糖鎖修飾を有するＨＥＧ１タンパク質に結合するが、その結合は糖鎖修飾依存的である。すなわち、この態様では、本発明の抗体またはその抗原結合性断片は、糖鎖修飾を有しないＨＥＧ１タンパク質（例えば、糖鎖を糖鎖分解処理によって分解したＨＥＧ１タンパク質）に対しては結合しないか、糖鎖修飾を有するＨＥＧ１タンパク質に対するよりも結合が弱い（親和性が低い）。あるいは、ある態様では、本発明の抗体またはその抗原結合性断片は、中皮腫細胞で見出される糖鎖修飾を有するＨＥＧ１タンパク質の糖鎖部分に結合する。このように本発明の抗体は、ある態様では、糖鎖修飾がなされたＨＥＧ１タンパク質に糖鎖修飾依存的に結合し得るが、糖鎖修飾は、中皮腫の細胞膜上に存在するＨＥＧ１タンパク質が有するものであり得る。ある態様では、本発明の抗体は、ディネーチャーした中皮腫細胞で見出される糖鎖修飾を有するＨＥＧ１タンパク質に結合する。ある態様では、本発明の抗体は、中皮腫細胞で見出される糖鎖修飾を有するＨＥＧ１タンパク質のディネーチャーした断片であって、配列番号３５のアミノ酸配列において７９９番目～８０９番目のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列を有する断片に結合する。
　ある態様では、本発明の抗体またはその抗原結合性断片は、ヒト中皮腫細胞に発現するヒトＨＥＧ１タンパク質の細胞外ドメインのエピトープには結合するが、α２－３ノイラミニダーゼまたはα２－３，６，８ノイラミニダーゼ処理によりヒトＨＥＧ１タンパク質に対する結合が低減するか消失する、抗体またはその抗原結合性断片である。この態様では、ヒト中皮腫細胞に発現するヒトＨＥＧ１タンパク質の細胞外ドメインはシアル化された糖鎖修飾を受けている。本明細書では、「中皮腫から得られる糖鎖修飾を有するＨＥＧ１タンパク質」は、中皮腫に特徴的な糖鎖修飾を有するＨＥＧ１タンパク質であり得、例えば、シアル化されたＯ型糖鎖修飾であり得る。
　ある態様では、中皮腫の細胞膜、中皮腫の細胞膜上の膜タンパク質、または中皮腫の細胞膜上のＨＥＧ１タンパク質に結合する抗体であって、
　配列番号６のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号８のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、配列番号１０のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３、配列番号１２のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１４のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、および、配列番号１６のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３のいずれか１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたは６つを含む抗体が提供される。ある態様では、配列番号６のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号８のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、および、配列番号１０のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３のいずれか１つ、２つ、または３つを含む重鎖可変領域と、配列番号１２のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１４のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、および、配列番号１６のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３のいずれか１つ、２つ、または３つを含む軽鎖可変領域とを含む抗体が提供される。
　ある態様では、中皮腫の細胞膜、中皮腫の細胞膜上の膜タンパク質、または中皮腫の細胞膜上のＨＥＧ１タンパク質に結合する抗体であって、
（１）配列番号６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１と、配列番号８のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２と、配列番号１０のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む重鎖可変領域を含む、抗体、
（２）配列番号１２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１と、配列番号１４のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２と、配列番号１６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域とを含む、抗体、
（３）配列番号６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１と、配列番号８のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２と、配列番号１０のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号１２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１と、配列番号１４のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２と、配列番号１６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域とを含む、抗体、
（４）上記（１）～（３）のいずれかの抗体と８０％以上（例えば９０％以上または９５％以上）のアミノ酸配列の配列相同性を有する抗体、
（５）上記（１）～（４）のいずれかの抗体と結合において競合する抗体、若しくは
（６）上記（１）～（４）のいずれかの抗体と同じエピトープに結合する抗体
またはこれらの抗原結合性断片が提供される。
　ある態様では、本発明の抗体は、配列番号５３の配列を有するペプチドに結合する抗体である。ある態様では、本発明の抗体は、中皮腫細胞株で発現した配列番号５３の配列を有するペプチドに結合する抗体である。ある態様では、本発明の抗体は、中皮腫細胞株で発現した配列番号５３の配列を有するペプチドに糖鎖修飾依存的に結合する抗体である。ある態様では、本発明の抗体は、中皮腫の細胞膜、中皮腫の細胞膜上の膜タンパク質、または中皮腫の細胞膜上のＨＥＧ１タンパク質に結合する抗体であって、配列番号５３の配列を有するペプチドに結合する抗体である。ある態様では、本発明の抗体は、中皮腫の細胞膜、中皮腫の細胞膜上の膜タンパク質、または中皮腫の細胞膜上のＨＥＧ１タンパク質に結合する抗体であって、中皮腫細胞株で発現した配列番号５３の配列を有するペプチドに結合する抗体である。ある態様では、本発明の抗体は、中皮腫の細胞膜、中皮腫の細胞膜上の膜タンパク質、または中皮腫の細胞膜上のＨＥＧ１タンパク質に結合する抗体であって、中皮腫細胞株で発現した配列番号５３の配列を有するペプチドに糖鎖修飾依存的に結合する抗体である。
　配列相同性は、例えば、Pearson and Lipman, PNAS, 85:2444-2448, 1988のＦＡＳＴＡプログラムにより、デフォルトパラメータで決定することができる。
　ある態様では、本発明の抗体は、配列番号２のアミノ酸配列を有する重鎖を有する。ある態様では、本発明の抗体は、配列番号４のアミノ酸配列を有する軽鎖を有する。ある態様では、本発明の抗体は、配列番号２のアミノ酸配列を有する重鎖と配列番号４のアミノ酸配列を有する軽鎖とを有する。ある態様では、本発明の抗体は、重鎖可変領域（ＶＨ領域）として、配列番号２のアミノ酸配列の２０番～１３２番を有する。ある態様では、本発明の抗体は、軽鎖可変領域（ＶＬ領域）として、配列番号４のアミノ酸配列の２０番～１３２番を有する。ある態様では、本発明の抗体は、配列番号２のアミノ酸配列の２０番～１３２番を有する重鎖可変領域と配列番号４のアミノ酸配列の２０番～１３２番を有する軽鎖可変領域とを有する。ある態様では、本発明の抗体は、糖鎖修飾を受けたＨＥＧ１タンパク質との結合において上記の抗体と競合する。
　また、本発明では、ｓｃＦｖなどの重鎖可変領域と軽鎖可変領域とを含むキメラ抗原受容体も提供される。キメラ抗原受容体では、例えば、ｓｃＦｖとＴ細胞受容体ζ鎖とがスペーサーを介して連結する第１世代、ＣＤ２８または４－１ＢＢを介して連結する第２世代、ＣＤ２８と４－１ＢＢまたはＯＸ４０とを介して連結する第３世代などの様々なキメラ抗原受容体を用いることができる。
　本発明のある態様では、本発明の抗体またはその抗原結合性断片と細胞傷害剤との結合体（コンジュゲート）が提供される。本発明によれば、本発明の抗体またはその抗原結合性断片とイメージングプローブとの結合体（コンジュゲート）を含む、中皮腫を処置することに用いるための医薬組成物が提供される。本発明で用いられる細胞傷害剤としては、例えば、癌治療用の放射性同位体（例えば、Ｐ３２、Ｙ９０、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｓｍ１５３、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ａｔ２１１、Ｂｉ２１２、Ｐｂ２１２およびＬｕの放射性同位体）が挙げられる。本発明で用いられる細胞傷害剤としては、例えば、抗癌剤が挙げられる。
　本発明のある態様では、ＨＥＧ１遺伝子に対するｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、またはアンチセンスオリゴを含む、中皮腫を処置することに用いるための医薬組成物が提供される。ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡまたはアンチセンスオリゴは、修飾核酸であってもよい。修飾核酸としては、例えば、蛍光色素修飾された核酸、ビオチン化された核酸、コレステリル基を導入した核酸が挙げられる。ＲＮＡは安定性を高めるために、塩基に対して２’－Ｏ－メチル修飾または、２’－フルオロ修飾若しくは２’－メトキシエチル（ＭＯＥ）修飾をすることがあり、核酸バックボーンのホスホジエステル結合をホスホロチオエート結合に置き換えることもある。人工核酸としては、２’位の酸素原子と４’位の炭素原子がメチレンを介して架橋型ＤＮＡであるlocked nucleic acid（ＬＮＡ）、デオキシリボースまたはリボースの代わりにＮ－（２－アミノエチル）グリシンがアミド結合したポリマーが主鎖となったペプチド核酸（ＰＮＡ）などが挙げられる。ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、またはアンチセンスオリゴは、ミセルやリポソームなどの小胞に内包されていてもよい。ミセルやリポソームなどの小胞は、例えば、２０～１００ｎｍの粒径を有するものとすることができる。ミセルやリポソームなどの小胞は、ＥＰＲ効果（Enhanced permeability and retention effect）により腫瘍組織に効率よく集積し、内容物を腫瘍組織に送達できることが知られている。このような小胞は、ポリエチレングリコールのような表面改質剤により修飾されていてもよい。本発明のある態様ではまた、ＨＥＧ１遺伝子に対するｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、またはアンチセンスオリゴの、中皮腫を処置することに用いるための医薬組成物の製造における使用が提供される。本発明のある態様ではさらに、中皮腫を処置する方法であって、その必要のある対象においてＨＥＧ１タンパク質の発現を低下させることを含む、方法が提供される。本発明のある態様では、中皮腫を処置する方法であって、その必要のある対象においてＨＥＧ１遺伝子に対する発現抑制剤（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、またはアンチセンスオリゴ）を投与することを含む、方法が提供される。
　本発明のある態様では、本発明の抗体は、抗体依存性細胞傷害活性（ＡＤＣＣ活性）または補体依存性細胞傷害活性（ＣＤＣ活性）などの細胞傷害活性を有し得る。この場合、本発明の抗体は、中皮腫膜表面に発現したＨＥＧ１タンパク質に結合し、中皮腫細胞に対して細胞傷害活性を示し得る。このように、ある態様では、本発明の抗体またはその抗原結合性断片を有効成分として含む中皮腫を処置することに用いるための医薬組成物や中皮腫治療用薬剤が提供される。本明細書では、「処置」は治療を含む意味で用いられる。
　本発明の抗体を有効成分として含む医薬組成物または薬剤は、公知の製剤学的方法により製剤化することができる。例えば、本発明の医薬組成物または薬剤は、薬学上許容可能な賦形剤を含んでいてもよい。賦形剤は、有効成分である本発明の抗体の有効量を対象に与えるために適宜投与されうる賦形剤とすることができる。ある態様では、本発明の医薬組成物または薬剤は、注射剤とすることができ、注射用の賦形剤は、無菌の水性溶液、例えば、リンガー溶液、ハンクス溶液または生理食塩水などの薬学的に許容可能な緩衝液、ブドウ糖やその他の補助剤を含む等張液とすることができる。補助剤としては、エタノールなどのアルコール、ポリエチレングリコールなどのポリアルコール、ポリソルベート８０などの非イオン性界面活性剤などが挙げられ、製剤化の際に添加することができる。注射用の油性液としては、ゴマ油、ヤシ油および大豆油を用いることができ、補助剤として、安息香酸ベンジルまたはベンジルアルコールを用いることができる。本発明の医薬組成物または薬剤は、注射剤の形で非経口投与（例えば、静脈内投与または胸腔内投与）することができる。
　抗体のＡＤＣＣ活性またはＣＤＣ活性は、当業者に周知の方法により測定することができる。ＡＤＣＣ活性は、例えば、中皮腫細胞とＦｃ受容体を発現するエフェクター細胞（例えば、ＮＫ細胞や単球）を本発明の抗体の存在下で生理的条件下でインキュベートし、中皮腫細胞の生細胞数および／または死細胞数をカウントすることにより決定することができる。ＣＤＣ活性は、例えば、中皮腫細胞を補体を含む溶液（例えば、ヒト血清）と抗体存在下で生理的条件下でインキュベートし、中皮腫細胞の生細胞数および／または死細胞数をカウントすることにより決定することができる。
　細胞傷害活性は、当業者に周知の種々の方法によって増強することができる。例えば、Ｆｃ領域糖鎖のフコースが欠失した抗体、糖鎖にバイセクティングＮ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）が結合した抗体、Ｆｃ領域のアミノ酸置換によりエフェクター細胞のＦｃ受容体と抗体との結合を増強し、これにより細胞傷害活性を増強する方法が知られ、このように改変した抗体も本発明の抗体として用いることができる。
　抗体は、ヒトにおける抗体自体の抗原性を低下させること等を目的として、当業者に周知の方法により、遺伝子改変抗体、例えば、キメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体とすることができる。本発明の医薬組成物または薬剤においては、本発明の抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体であり得る。抗体はまた、二重特異性抗体であってもよい。
　本発明のある態様では、本発明の抗体またはその抗原結合性断片とイメージングプローブとの結合体（コンジュゲート）が提供される。本発明によれば、本発明の抗体またはその抗原結合性断片とイメージングプローブとの結合体（コンジュゲート）は、中皮腫の体外診断または体内診断に用いることができる。従って、本発明によれば、本発明の抗体またはその抗原結合性断片とイメージングプローブとの結合体（コンジュゲート）を含む、中皮腫の診断薬または診断キットが提供される。本発明によればまた、本発明の抗体またはその抗原結合性断片とイメージングプローブとの結合体（コンジュゲート）を含む、中皮腫の体内診断薬または体内診断キットが提供される。中皮腫の体内診断に用いることのできるイメージングプローブとしては、例えば、蛍光イメージングプローブ、核磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）用造影剤などの増強剤（例えば、常磁性イオン）およびＰＥＴ分子イメージングプローブなどのイメージング用の放射性核種が挙げられる。
　本発明の別の側面では、中皮腫から得られる糖鎖修飾（例えば、Ｏ型糖鎖修飾）を有するＨＥＧ１タンパク質またはその断片（特に配列番号３５のアミノ酸配列において７９９番目～８０９番目のアミノ酸配列を含むその断片）が提供される。本発明によれば、中皮腫から得られる糖鎖修飾（例えば、Ｏ型糖鎖修飾）を有するＨＥＧ１タンパク質または上記その断片は、中皮腫を高感度、かつ高特異的に検出するマーカーとして用いることができる。従って、本発明のある態様では、中皮腫から得られる糖鎖修飾（例えば、Ｏ型糖鎖修飾）を有するＨＥＧ１タンパク質または上記その断片からなる中皮腫の診断マーカーが提供される。中皮腫から得られるＨＥＧ１タンパク質または上記その断片のＯ型糖鎖修飾は、シアル化されたＯ型糖鎖修飾であり得る。このようなＨＥＧ１タンパク質は、例えば、配列番号３０、３１、３３、３５および３７から選択されるいずれか１のアミノ酸配列と、８０％以上、９０％以上、９５％以上または９８％以上の配列相同性を有するアミノ酸配列を有する中皮腫から得られるＨＥＧ１タンパク質、または、これらの中皮腫から得られるバリアントであり得る。中皮腫から得られる糖鎖修飾（例えば、Ｏ型糖鎖修飾）を有するＨＥＧ１タンパク質または上記その断片は、中皮腫細胞から本発明の抗体（本発明の中皮腫から得られる糖鎖修飾（例えば、Ｏ型糖鎖修飾）を有するＨＥＧ１タンパク質に結合する抗体）を用いて精製することができる。あるいは、ＨＥＧ１タンパク質または上記その断片は、シアル酸とＧｌｃＮＡｃを有するので、これらに特異的に結合するレクチン（例えば、シアル酸特異的であるＷＧＡ若しくはＧｌｃＮＡｃ特異的であるＤＳＡまたはこれらの組合せ）に対するＨＥＧ１タンパク質の親和性を利用してＨＥＧ１タンパク質を精製することも考え得る。中皮腫から得られる糖鎖修飾（例えば、Ｏ型糖鎖修飾）を有するＨＥＧ１タンパク質または上記その断片（特に配列番号３５のアミノ酸配列において７９９番目～８０９番目のアミノ酸配列を含むその断片）は、ディネーチャーされていてもよい。断片（特にディネーチャーされた断片）は、中皮腫から得られる糖鎖修飾（例えば、Ｏ型糖鎖修飾）を有するＨＥＧ１タンパク質において、配列番号３５のアミノ酸配列において７９９番目～８０９番目のアミノ酸配列の周辺領域を含んでいてもよい。
インテレクチン融合タンパク質および複合体
　本発明では、インテレクチンと本発明の抗体のＦａｂ断片またはｓｃＦｖ断片との融合タンパク質が提供される。この融合タンパク質では、例えば、Ｆａｂ断片の重鎖またはｓｃＦｖ断片とインテレクチンとが融合形態として存在する。例えば、インテレクチンと本発明の抗体のＶＨ領域およびリンカー（例えば、ＣＨ１領域）との融合タンパク質と本発明の抗体のＬ鎖との複合体が提供される。このような融合タンパク質またはタンパク質複合体は、中皮腫の細胞膜、細胞膜上の膜タンパク質、または細胞膜上のＨＥＧ１タンパク質に結合する。本発明ではまた、本発明の抗体のｓｃＦｖ断片とインテレクチンとの融合タンパク質が提供される。このような融合タンパク質またはタンパク質複合体は、インテレクチンを含み、インテレクチンはジオール構造に特異的かつ強く結合するので、ジオール構造を表出する樹脂を用いたカラム（例えば、エポキシド架橋剤で処理された多糖（デキストランやアガロース）を含むゲルやジオール修飾により親水化されたシリカゲルなどのゲル濾過カラム）で簡単に精製することができる。例えば、表５に示すジオールセファロースビーズを用いたカラムを用いて融合タンパク質またはタンパク質複合体を精製することができる。複合体を精製した後には、抗原を連結したアフィニティーカラムで融合タンパク質をさらに生成してもよい。
　本発明のある態様では、
（１）配列番号６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１と、配列番号８のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２と、配列番号１０のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む重鎖可変領域とインテレクチンとの融合タンパク質、または
（２）上記（１）の融合タンパク質と配列番号１２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１と、配列番号１４のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２と、配列番号１６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域とを含む、タンパク質複合体
が提供される。上記タンパク質複合体は、中皮腫の細胞膜、中皮腫の細胞膜上の膜タンパク質、または中皮腫の細胞膜上のＨＥＧ１タンパク質に結合する。この態様では、例えば、重鎖可変領域は、ＣＨ１領域を介して、または介さずにインテレクチンと融合タンパク質を形成し得、好ましくは、重鎖可変領域はＣＨ１領域を介してインテレクチンと融合タンパク質を形成し得る。この融合タンパク質は、生理的条件下で互いにインテレクチン部分を介して結合して多量体（主に３量体）を形成し得る。本明細書においては、単量体および多量体が、融合タンパク質に含まれる。
　本発明の上記インテレクチン融合タンパク質および複合体は、中皮腫から得られる糖鎖修飾を有するＨＥＧ１タンパク質に結合することができる。従って、本発明の上記インテレクチン融合タンパク質または複合体は、中皮腫の検出に用いることができる。従って、本発明によれば、本発明の上記インテレクチン融合タンパク質または複合体を含む、中皮腫の診断薬が提供される。本発明の上記インテレクチン融合タンパク質または複合体とイメージングプローブとの結合体は、中皮腫の体内イメージングに用いることができる。従って、本発明によれば、本発明の上記インテレクチン融合タンパク質または複合体とイメージングプローブとの結合体を含む、中皮腫の体内診断薬が提供される。また、本発明の上記インテレクチン融合タンパク質および複合体と上記で定義した細胞傷害剤との結合体は、中皮腫を処置することに用いることができる。従って、本発明によれば、本発明の上記インテレクチン融合タンパク質および複合体と上記で定義した細胞傷害剤との結合体を含む、中皮腫を処置することに用いるための医薬組成物が提供される。
抗体の作製
　抗体は、当業者に周知の方法により作成することができる。すなわち、抗原とアジュバントとを動物に免疫することと、免疫した動物の血漿を得ることによりポリクローナル抗体を得ることができる。あるいは、抗原とアジュバントとを動物に免疫し、免疫した動物からＢリンパ球を得て、ミエローマと細胞融合させてハイブリドーマを形成させ、所望の抗体を産生するハイブリドーマをクローニングして得てもよい。免疫の工程は、ＨＥＧ１タンパク質を中皮腫細胞株（例えば、ＡＣＣ－ＭＥＳＯ４細胞）に強制発現させ、細胞を動物に免疫してもよい。この場合、ＨＥＧ１タンパク質は細胞表面に暴露するので免役された動物はＨＥＧ１タンパク質に対する抗体を産生しうる。または、ＨＥＧ１タンパク質を発現する細胞、好ましくは、中皮腫細胞株からＨＥＧ１タンパク質を精製して動物に免疫してもよい。あるいは、免疫の工程は、ＨＥＧ１タンパク質の可溶化型（例えば、細胞外ドメイン）を中皮腫細胞株（例えば、ＡＣＣ－ＭＥＳＯ４細胞）に強制発現させ、培養上清から得られる可溶化型ＨＥＧ１タンパク質を動物に免疫してもよい。本発明によれば、このような可溶化型ＨＥＧ１タンパク質も糖鎖修飾を受けており、この糖鎖修飾は中皮腫細胞膜上でのＨＥＧ１タンパク質の修飾と類似している。
　キメラ抗体は、本分野において周知の方法により作製することができる。例えば、抗体の定常領域をヒトの抗体の定常領域に置換することにより作製することができる。ヒト化抗体は、例えば、ヒト以外の動物由来の相補性決定領域（ＣＤＲ）とヒト抗体由来のフレームワーク領域およびヒト抗体由来の定常領域とを含む。ヒト化抗体は、例えば、上記のＣＤＲをヒト抗体に移植して得ることができる。ヒト抗体は、例えば、ヒト抗体を産生する遺伝子改変マウスに抗原を免疫することにより得ることができる。二重特異性抗体は、２つの異なるエピトープまたは抗原に結合することができる抗体であって、当業者に周知の方法で調製することができる。二重特異性抗体は、例えば、２つの異なる抗体を産生する細胞をさらに融合して、ハイブリッドハイブリドーマを作製する方法や、ＶH領域とＶL領域を、上記２つの領域間では対を形成できない短いリンカーを介して１本のポリペプチド鎖上で発現させ、別のポリペプチド鎖であって、前記ＶＨ領域とＶＬ領域と対形成する相補的なＶH領域とＶL領域を有するポリペプチド鎖と複合体を形成させることにより作製できる。
　ある抗体と抗原との結合において競合する抗体は、当業者に周知の競合アッセイなどにより得ることができる。競合アッセイで、例えば、少なくとも２０％、好ましくは少なくとも２０～５０％、さらに好ましくは少なくとも５０％、所望の抗体の結合をブロックすることができるならば、同じ抗原に対する結合において競合する抗体とすることができる。競合する抗体は、交差ブロッキングアッセイ、好ましくは、競合ＥＬＩＳＡアッセイにより確認することができる。交差ブロッキングアッセイでは、抗原を、例えばマイクロタイタープレート上にコーティングし、ここに候補となる競合抗体存在を添加してインキュベートし、抗原と候補抗体との結合を形成させる。その後、所望の抗体を標識した上でさらにウェルに添加してインキュベートし、洗浄して、所望の抗体の結合量を定量することにより、抗体が競合したか否かを判断することができる。競合する場合には、ウェル中に残存する標識量が少なくなるはずである。
　本発明の別の側面では、ＨＥＧ１タンパク質に結合する抗体またはその抗原結合性断片を用いて、中皮腫に罹患した患者または罹患しているリスクがある対象において中皮腫を診断する方法が提供される。
　本発明ではまた、ＨＥＧ１タンパク質に結合する抗体またはその抗原結合性断片を用いて、中皮腫に罹患した患者または罹患しているリスクがある対象において中皮腫を診断するための予備的な方法（例えば、工業的方法）を提供する。本発明ではさらに、ＨＥＧ１タンパク質に結合する抗体またはその抗原結合性断片を用いて、中皮腫に罹患した患者または罹患しているリスクがある対象において中皮腫細胞を検出する方法を提供する。これらの態様では、中皮腫の診断は医師により行われ、本発明は医師が診断するための方法として医師に診断の基礎情報を提供するものである。
　本発明の別の側面では、ＨＥＧ１タンパク質に結合する抗体またはその抗原結合性断片を含む、中皮腫に罹患した患者または罹患しているリスクがある対象において中皮腫を診断するための診断薬または診断キットが提供される。診断キットは、ＨＥＧ１タンパク質に結合する抗体またはその抗原結合性断片を用いて中皮腫を検出するための説明書を含んでいてもよい。また、ある態様では、上記診断薬またはキットは、本発明の抗体のいずれかまたはその抗原結合性断片を含むものであってもよい。本発明の診断薬や診断キットは下記のように中皮腫を検出するために用いることができる。
中皮腫の検出
　本発明では、本発明の抗体またはその抗原結合性断片と試料とを接触させることを含む、中皮腫の診断方法、中皮腫の検出方法、中皮腫の検出のための方法、および医師による中皮腫の診断を補助するための中皮腫の検出方法が提供される。
　本発明による中皮腫の検出は、本発明の抗体またはその抗原結合性断片と試料とを接触させて行うことができる。試料として、細胞、組織または組織切片などの生体から分離された試料を用いる場合には、当業者に周知の方法（例えば、免疫組織学染色法）により抗体の反応を検出することができる。そして、抗体の反応が観察された場合（例えば、陽性である場合）には、その試料が由来する対象が、中皮腫に罹患している可能性が高い。抗体の反応が陽性であるか否かは、Allred Score法に基づいて判定することができる（Allred DC et al., Mod Pathol, 11: 155-168, 1998参照）。AllRed score法では、例えば、
　合計スコア（ＴＳ）＝染色率スコア（ＰＳ）＋染色強度スコア（ＩＳ）
により合計スコアが３以上である場合に、反応が陽性であると判定することができる。ＰＳおよびＩＳは、以下のスコア表により求めることができる。
Allred Score法によるスコア表
染色率スコアＰＳ
　０：染色性なし
　１：染色率１％未満
　２：染色率１％以上１０％未満
　３：染色率１０％以上１／３未満
　４：染色率１／３以上２／３未満
　５：染色率２／３以上
染色強度スコアＩＳ
　０：陰性
　１：弱染色性
　２：中間染色性
　３：強染色性
　本発明のある態様では、中皮腫の検出は、
　本発明の抗体またはその抗原結合性断片と、中皮腫と疑われる対象から得られた試料とを接触させることと、
　試料中に存在するＨＥＧ１タンパク質（好ましくは、ＨＥＧ１タンパク質の細胞外ドメイン）の存在を、本発明の抗体を用いて検出することと
を含む。好ましい態様では、中皮腫の検出において、検出するＨＥＧ１タンパク質は、糖鎖修飾を受けたＨＥＧ１であり、より好ましくは、Ｏ型糖鎖修飾を有するＨＥＧ１タンパク質であり、さらに好ましくは、中皮腫から得られる糖鎖修飾を有するＨＥＧ１タンパク質である。中皮腫の検出はさらに、染色率および／または染色強度を指標として中皮腫が検出されたか否かを判定することを含んでいてもよい。ある態様では、Allred Score法に基づいて中皮腫が検出されたか否かを判定することを含んでいてもよい。ある態様では、Allred Score法に基づいて合計スコア（ＴＳ）が、２以上であるとき、好ましくは３以上である時に中皮腫が検出されたと判定することを含んでいてもよい。
　本発明における中皮腫の検出においては、中皮腫から得られる糖鎖修飾を有するＨＥＧ１タンパク質に糖鎖修飾依存的に結合する抗体を用いて、中皮腫から得られる糖鎖修飾を有するＨＥＧ１タンパク質の存在を試料中で検出するものとすることができる。本発明における中皮腫の検出においては、中皮腫から得られる糖鎖修飾を有するＨＥＧ１タンパク質に結合する抗体を用いて、中皮腫から得られる糖鎖修飾を有するＨＥＧ１タンパク質の存在を試料中で検出するものとしてもよい。
　本発明のある態様では、試料が組織または組織切片である場合には、抗原タンパク質またはその一部は、本発明の抗体を用いた免疫組織学染色によって検出することができる。
　本発明の中皮腫の診断方法、中皮腫の検出方法、中皮腫の検出のための方法、または医師による中皮腫の診断を補助するための中皮腫の検出方法では、本発明の抗体が認識する抗原が試料中に含まれる場合には、対象から中皮腫が検出されたと決定することができる。
　本発明において、上皮型、二相型、肉腫型および線維形成型のいずれもが本発明の抗体によって検出できる。従って、本発明において検出対象となる中皮腫は、上皮型、二相型、肉腫型および線維形成型からなる群から選択される少なくとも１つの中皮腫である。特に従来の方法では、肉腫型中皮腫の検出は困難であったが、本発明の抗体を用いれば肉腫型中皮腫の検出が可能である。従って、本発明において検出対象となる中皮腫は、肉腫型中皮腫であり得る。
　本発明によれば、中皮腫（特に上皮型中皮腫）または肺腺癌に罹患している疑いのある対象において、中皮腫（特に上皮型中皮腫）に罹患しているか、肺腺癌に罹患しているかを鑑別することができる。従って、本発明による中皮腫の検出は、中皮腫（特に上皮型中皮腫）または肺腺癌に罹患している疑いのある対象に対して行うことができる。また、本発明によれば、中皮腫とその他の癌とを鑑別することができる。従って、本発明による中皮腫の検出は、中皮腫またはその他の癌に罹患している疑いのある対象に対して行うことができる。
　本発明では、中皮腫の検出は、本発明の抗体またはその抗原結合性断片の代わりに、イメージングプローブと本発明の抗体若しくはその抗原結合性断片との結合体、または上記で定義した本発明の抗体断片とインテレクチンとの融合タンパク質若しくは複合体を用いてもよい。上記で定義した本発明の抗体断片とインテレクチンとの融合タンパク質若しくは複合体はイメージングプローブとの結合体の形態であってもよい。
実施例１：中皮腫特異的抗体の調製
　ヒト悪性胸膜中皮腫由来細胞株ＡＣＣ－ＭＥＳＯ１（RCB2292, RIKEN Cell Bank）、およびＡＣＣ－ＭＥＳＯ４（RCB2293, RIKEN Cell Bank）を１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０中で１０ｃｍディッシュにコンフルエントになるまで３７℃で培養した。それぞれの細胞ディッシュ二枚分をスクレイパーで回収し、ＰＢＳで三回洗浄した。細胞を混合し、４等分して、遠心により細胞沈殿とし、－８０℃で保存した。それぞれの細胞質量は一本あたり約１０ｍｇであった。
　冷凍保存されていた細胞沈殿を１００μＬのＰＢＳに懸濁し、１００μＬのＡｄｄａＶａｘ（ＩＮＶＩＶＯＧＥＮ社）と混合した。六週齢のＢａｌｂ／ｃマウス（雌）の腹腔内に全量投与し、二週間ごとに冷凍保存していた細胞沈殿を同様の方法で繰り返し投与した。計三回の免疫後、尾部静脈より血液を一滴採取し、血清を得た。ＡＭｅＸ固定（Sato Y et al. Am J Pathol 125:431-435 (1986)）されたＡＣＣ－ＭＥＳＯ１とＡＣＣ－ＭＥＳＯ４の細胞沈殿から作製した薄切切片を用いて免疫染色を行い、中皮腫細胞に対する抗体が産生されているかどうかを確認した。抗体価が高いマウスに対し、再度、前記と同様に細胞沈殿を用いて免疫を行い、一週間後に無菌的に脾臓を摘出した。
　脾臓をステンレスメッシュ上ですりつぶし、リンパ球を１０ｍＬのＲＰＭＩ１６４０に分散した。ピペッティングにより大きな細胞塊をほぐした後、１５ｍＬの遠心管に移し、３分静置した。大きな凝集塊を吸わないように細胞懸濁液を新しい遠心管に移し、ＲＰＭＩ１６４０で細胞を２回洗浄し、細胞数を計測した。
　リンパ球（６．７５×１０7細胞）とあらかじめ培養していたミエローマ細胞（ＰＡＩ）（５．２５×１０6細胞）を混合し、ＲＰＭＩ１６４０で２回洗浄した後、細胞融合操作をおこなった。細胞融合はＰＥＧ１５００（ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社）を用い、製品付属のプロトコールに従い行った。融合後、細胞を１５％ＦＣＳ、１０％ＢＭ　Ｃｏｎｄｉｍｅｄ　Ｈ１（ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社）、１×ＨＡＴ（Thermo Fisher Scientific社）を含むＲＰＭＩ１６４０（７６ｍＬ）に懸濁し、１ウェルあたり２００μＬ（約１．９×１０5細胞／ウェル）ずつ、９６穴プレート４枚にまきこんだ。３７℃で３日間培養後、約１００μＬの培養上清を除き、前述のＨＡＴ培養液１００μＬを加え培地交換を行った。融合後５日目に約１００μＬの培養上清を除き、１５％ＦＣＳ、１０％ＢＭ　Ｃｏｎｄｉｍｅｄ　Ｈ１、１×ＨＴ（Thermo Fisher Scientific社）を含むＲＰＭＩ１６４０を加え培地交換を行い、７日目以降、コロニーの直径が５ｍｍ以上になっているウェルについてスクリーニングを行った。
　スクリーニングはＡＭｅＸ固定されたＡＣＣ－ＭＥＳＯ１とＡＣＣ－ＭＥＳＯ４の細胞沈殿から作製した薄切切片を用いて、免疫染色により行った。薄切切片を０．５％　カゼインで１０分間ブロッキングし、一次抗体としてハイブリドーマの培養上清１００μＬを２時間反応させた。ＰＢＳで洗浄した後、二次抗体としてthe EnVision+ kits（ダコ・ジャパン合同会社）を３０分間反応させ、ＤＡＢを用いて発色を行った。３８４ウェルをスクリーニングし、９３クローンが免疫染色陽性クローンとして得られた。二次スクリーニングとして、ＡＭｅＸ固定されたＡ５４９の細胞沈殿から作製した薄切切片に反応しないクローン、三次スクリーニングとしてホルマリン固定された中皮腫の組織切片に反応するクローンを選抜し、最終的にホルマリン固定された中皮腫以外のがんの組織切片にほとんど反応しないクローンが複数（ＳＫＭ９－２およびＳＫＭ１０－２）得られた。
実施例２：得られたモノクローナル抗体による中皮腫の検出
　上述のスクリーニングで得られたＳＫＭ９－２から産生されるモノクローナル抗体を用いて、様々なタイプの中皮腫を染色した。
　ＡＭｅＸ固定された細胞沈殿、またはホルマリン固定された組織をパラフィン包埋し、薄切切片を作製した。切片をスライドグラスに固定し、キシレンとエタノールで脱パラフィンと脱水を行い、各種条件下で抗原の賦活化を行った。切片を３％　過酸化水素で５分間処理して内在性ペルオキシダーゼを失活させた後、ＰＢＳで洗浄し、０．５％カゼインで１０分間ブロッキングを行った。一次抗体を含む溶液を１００μＬ加えて室温で２時間処理した後、ＰＢＳで洗浄し、Histofine Simple Stain MAX-PO (Multi)（ニチレイバイオサイエンス社） 、ベンタナ　ｕｌｔｒａＶｉｅｗ　ＤＡＢ　ユニバーサルキット　（ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社）またはthe EnVision+ kitsを用いて発色させた。切片をヘマトキシリン染色したあと脱水し、マリノール（武藤化学株式会社）を用いて封入して、顕微鏡にて観察を行った。抗原の賦活化条件は、カルレチニン、メソテリン、およびＳＫＭ９－２抗原が９８℃　４０分間、サイトケラチン５／６（ＣＫ５／６）、ポドプラニン、ウィルムス腫瘍遺伝子産物１（ＷＴ－１）が９５℃　６４分間とした。賦活化溶液はカルレチニン、ＣＫ５／６、ポドプラニンが１ｍＭ　エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を含む１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ９．０）、ＷＴ－１、メソテリン、ＳＫＭ９－２抗原が０．１％　Ｔｗｅｅｎ－２０を含む１０ｍＭ　クエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）であった。一次抗体は以下の通りを用いた：カルレチニン，ウサギ抗カルレチニンポリクローナル抗体（ＰＡＤ：ＤＣ８）(Life Technologies Japan Ltd., Tokyo, Japan);ＣＫ５／６，マウス抗サイトケラチン５，６モノクローナル抗体（Ｄ５／１６Ｂ４） (ニチレイバイオサイエンス社); メソテリン, マウス抗ヒトメソテリンモノクローナル抗体（５Ｂ２）(Leica Micro- systems, Inc., Bannockburn, IL); ポドプラニン, マウス抗ポドプラニンモノクローナル抗体(D2-40) (ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社); ＷＴ－１，マウス抗ヒトＷＴ－１モノクローナル抗体（６Ｆ－Ｈ２） (ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社)。
　中皮腫の代表的な染色像は、図１ＡおよびＢに示される通りであった。ＳＫＭ９－２抗体は上皮型（図１Ａ）、肉腫型（図１Ｂ）それぞれを良好に染色できた。また、表１に示されるようにＳＫＭ９－２抗体は、他のいずれの抗体よりも感度高く中皮腫を検出することができた。以下、陽性の判定は、Ａｌｌｒｅｄ　ｓｃｏｒｅに基づく判定で１以上となった細胞が細胞に占める割合が１０％以上の場合に陽性とした。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　上記の通りＳＫＭ９－２抗体が各型の中皮腫を高感度に検出できることが明らかになった。また、良性または悪性度の低い中皮腫である高分化型乳頭状中皮腫（ＷＤＰＭ）についてもＳＫＭ９－２抗体により良好に染色することができた（１例中１例）。
　次に、中皮腫に対する検出の特異性を確認するため、他の癌の検出特性をそれぞれの抗体と比較した。ここでは、「その他の癌」としては中皮腫との鑑別診断上問題となりやすい、胃癌、大腸癌、乳癌、卵巣癌、腎細胞癌、尿路上皮癌を、「軟部の肉腫」としては癌肉腫、脂肪肉腫、横紋筋肉腫、平滑筋肉腫、線維肉腫、滑膜肉腫、消化管間質肉腫（ＧＩＳＴ）、ユーイング肉腫、胞巣状軟部肉腫（ＡＳＰＳ）、孤在性線維性腫瘍、悪性末梢神経鞘腫瘍（ＭＰＮＳＴ）、血管肉腫、類上皮血管内皮腫、類上皮血管肉腫、２相性滑膜肉腫を、「骨の肉腫」としては軟骨肉腫、骨肉腫をそれぞれ複数種類ずつ測定した。結果は表２に示される通りであった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　表２に示されるように、ＳＫＭ９－２抗体は、中皮腫に特異性が高く、他の種類の腫瘍または癌との鑑別が高い精度で行えることが明らかとなった。また、ＳＫＭ９－２抗体は健常組織を認識することはほとんどなかった。なお、ＳＫＭ９－２抗体において陽性となったのは、尿路上皮癌（１／１０）、平滑筋肉腫（１／１０）および類上皮血管内皮種（１／６）のわずか３例であった。
　従来の中皮腫診断抗体として知られるカルレチニン抗体、サイトケラチン５／６抗体、メソテリン抗体およびＷＴ－１抗体はそれぞれ、高い感度で上皮型中皮腫を検出することができる。しかし、これらの抗体は表２から明らかなように、必ずしも特異性は優れておらず、肺腺癌と上皮型中皮腫の鑑別が困難であったり、肉腫型中皮腫の検出が困難であることが知られていた。さらには、カルレチニンやＷＴ－１は種々の健常組織や癌組織で細胞質には発現が認められ、中皮腫で特徴的な核移行像と誤認するリスクがあり、この点で鑑別が容易な使いやすいマーカーでは無かった。対照的に、ＳＫＭ９－２抗体は、陽性か陰性かにより簡便に中皮腫を鑑別できる上に、上皮型中皮腫および肉腫型中皮腫のどちらの検出も可能であるという点で従来の抗体よりも優れていた。また、中皮腫とそれ以外の癌との鑑別も可能であった。
　また、正常組織に対するＳＫＭ９－２抗体の反応性を免疫組織学染色により確認した。明らかな病変が見られない健常組織についてＳＫＭ９－２抗体を用いて免疫染色を行った。結果は、表３に示される通りであった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　表３に示されるように、心膜中皮細胞と血管内皮細胞において陽性像が見られたが、大部分の組織において陰性となった。精巣では精細管が陽性となる例が一例あった。心膜中皮細胞以外の正常中皮細胞は陰性で、中皮腫細胞と正常組織の判別性に優れていると考えられた。また、血管内皮細胞も陰性の細胞が多くを占め、陽性細胞は一部の細胞であった。
　このことから、ＳＫＭ９－２抗体の認識する抗原は、中皮腫診断において極めて有用なマーカーたり得ると示唆された。
実施例３：得られたハイブリドーマの解析
　実施例１および２において、中皮腫細胞に特異性の高いモノクローナル抗体が得られたことが明らかとなったので、ＳＫＭ９－２抗体の抗原の同定および抗体の抗原認識特性の更なる解析を行った。
（１）ＳＫＭ９－２抗体の抗原精製
　ＡＣＣ－ＭＥＳＯ４を大量に培養し、細胞溶解液より抗原の精製を行った。１０ｃｍディッシュ２４０枚分の細胞を1% Triton X-100, 1% CHAPS, 1 mM EDTA, 50 mM NaCl, プロテアーゼ阻害剤（Complete ロシュ・ライフサイエンス社）を含む５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ８．０）で可溶化し、次いで遠心した。得られた上清を２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）に４℃で１８時間透析して酸性沈殿物を得た。沈殿を０．１％　Ｔｗｅｅｎ２０、１５０ｍＭ　ＮａＣｌを含む２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐｈ７．２）で抽出し、遠心後の上清をアミコン　ウルトラ－１５，１００ｋＤａ（メルク・ミリポア社）を用いて濃縮、および６Ｍ塩酸グアニジンを含む２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ８．０）に溶液交換した。濃縮液に終濃度１０ｍＭのＴｒｉｓ（２－カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩を加え６０℃、３０分間加熱した後、終濃度４０ｍＭのヨードアセトアミドを加え、室温で３時間反応させた。反応液を６Ｍ塩酸グアニジン、０．０５％　Ｔｗｅｅｎ２０を含む２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ８．０）中でゲル濾過クロマトグラフィ（Superose 6 Increase 10/300GL (GE ヘルスケア社)）を行い、ドットブロットにて陽性となる画分を集めた。サンプルを４Ｍ　尿素、０．０５％　Ｔｗｅｅｎ２０を含む２５ｍＭ　リン酸緩衝液（ｐＨ　７．０）に対し室温で一晩透析し、Mono Q 5/50GL（ＧＥヘルスケア社）にアプライした。４Ｍ　尿素、０．０５％　Ｔｗｅｅｎ２０を含む２５ｍＭ　リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）でカラムを洗浄後、０～１ＭのＮａＣｌ塩濃度勾配により溶出を行った。ドットブロットで強陽性となる画分を集め、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、０．０５％　Ｔｗｅｅｎ２０を含む２５ｍＭ　リン酸緩衝液（ｐＨ７．２）に対し、室温で一晩透析し、WGA-Sepharose（Ｊオイルミルズ社）１ｍＬにアプライした。緩衝液で洗浄後、０．２Ｍ　Ｎ－アセチルグルコサミン、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、０．０５％　Ｔｗｅｅｎ２０を含む２５ｍＭ　リン酸緩衝液（ｐＨ７．２）で溶出し、溶出液をＣｅｎｔｒｉｃｏｎ（ＹＭ－３０）（ミリポア社）を用いて濃縮した。３Ｍ　ＧｄｎＨＣｌ、０．５％　ＣＨＡＰＳを含む２５ｍＭ　リン酸緩衝液（ｐＨ７．２）中でゲル濾過クロマトグラフィ（Superose 6 Increase 10/300GL （ＧＥヘルスケア社））を行い、ドットブロットで強陽性となる画分を０．５％　ＣＨＡＰＳを含む２０ｍＭ　ＮＨ4ＨＣＯ3に対して室温で一晩透析し、精製抗原を得た。
　ドットブロットは以下の通りに行った。ＰＶＤＦ膜（Immobilon-P メルク・ミリポア社）をメタノールに浸した後、純水にて洗浄、浸漬した。空気を挟まないよう水を含ませた濾紙上に親水化したＰＶＤＦ膜をおき、余分な水分を除去後、サンプルを１～５μＬ、マイクロピペットでドット状にしみ込ませた。膜を室温で一晩乾燥させたのち、メタノールと純水で再度親水化し、５％スキムミルク、０．１％　Ｔｗｅｅｎ２０、１５０ｍＭ　ＮａＣｌを含む２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．４）（ブロッキングバッファー）で、室温１時間ブロッキングを行った。ブロッキングバッファーで１，０００倍希釈したＳＫＭ９－２ハイブリドーマのマウス腹水を室温で１時間、一次抗体として反応させた後、０．１％　Ｔｗｅｅｎ２０、１５０ｍＭ　ＮａＣｌを含む２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．４）（ＴＢＳＴ）によって膜を洗浄した。ブロッキングバッファーにて３０，０００倍に希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ（Jackson ImmunoResearch社）を室温で１時間反応させ、ＴＢＳＴで洗浄後、ＥＣＬ　ｐｒｉｍｅ（ＧＥヘルスケア社）にて発色、検出を行った。
　精製抗原をウェスターンブロッティングにより確認した。サンプルを６％ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、または４－１５％　ミニプロティアンＴＧＸプレキャストゲル（Ｂｉｏ－Ｒａｄ社）にて分離し、０．０１％　ＳＤＳを含む１０ｍＭ　ＣＡＰＳ緩衝液（ｐＨ１０．５）を用いてサブマリン型転写装置によりサンプルをＰＶＤＦ膜に転写した。転写された膜は、ドットブロットと同様にブロッキング、抗体反応を行い、ＥＣＬ　ｐｒｉｍｅ（ＧＥヘルスケア社）にて発色、検出を行った。発色後、６Ｍ　塩酸グアニジン、０．１％　Ｔｗｅｅｎ２０、１％　２－メルカプトエタノールを含む２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ８．０）で膜を室温１５分間洗浄し、純粋でよく洗浄した後、再度ブロッキング操作を行った。コントロール抗体として５，０００倍希釈したマウス抗β－アクチンモノクローナル抗体（Sigma-Aldrich社）を用い、同様の操作により検出を行った。
　結果は図２に示される通りであった。図２に示されるように、常法によりＣＢＢ染色すると約４００ｋＤａの位置にバンドが検出され、このバンドはウェスターンブロッティングによりＳＫＭ９－２抗体により認識された。従って、上記の操作によりＳＫＭ９－２抗体の抗原が精製できたことが明らかとなった。
（２）ＳＫＭ９－２抗原（ＨＥＧ１）の同定
　ＣＢＢ染色で約４００ｋＤａを示した上記のバンドを切りだし、ペプチダーゼ処理後に質量分析（ｎａｎｏ－ＬＣ　ＭＳ／ＭＳ）を行い、Ｍａｓｃｏｔ　ｓｅａｒｃｈにより候補蛋白質を同定した。その結果、候補タンパク質としてProtein HEG homolog 1（ＨＥＧ１）が得られた。
　一方で、上記実施例ではＳＤＳ－ＰＡＧＥによるＳＫＭ９－２抗体の抗原の分子量は約４００ｋＤａと見積もられており、推定されるＨＥＧ１タンパク質の分子量（約１５０ｋＤａ）と齟齬があった。そこで以下の実験により、ＳＫＭ９－２抗体がＨＥＧ１タンパク質を認識しうるかを確認した。
　まず、ウェスタンブロット法によりＳＫＭ９－２抗体の認識するバンドが、ＨＥＧ１に対する発現抑制で減弱するかを確認した。加えて、ＡＣＣ－ＭＥＳＯ４で産生された組換え可溶型ＨＥＧ１がウェスタンブロット法によりＳＫＭ９－２抗体により検出できるかを確認した。
　ヒトＨＥＧ１に対する以下３種類のｓｉＲＮＡ（Ｈ１０９７，Ｈ２６７４，Ｈ３６７１）を作製し、ＨＥＧ１の発現抑制を行った。
　Ｈ１０９７センス鎖：GAUCUUUGACGGUCAGUCUGG（配列番号２３）
　Ｈ１０９７アンチセンス鎖：AGACUGACCGUCAAAGAUCGC（配列番号２４）
　Ｈ２６７４センス鎖：CCUAUAGCCGUACAGACUACA（配列番号２５）
　Ｈ２６７４アンチセンス鎖：UAGUCUGUACGGCUAUAGGGC（配列番号２６）
　Ｈ３６７１センス鎖：GCAAGUCGGGAUACUUUCAGU（配列番号２７）
　Ｈ３６７１アンチセンス鎖：UGAAAGUAUCCCGACUUGCAC（配列番号２８）
陰性対照としては、Mission Negative control SIC-001, confidential sequences (Sigma社製)を用いた。
　具体的には、これらのｓｉＲＮＡをそれぞれLipofectamine 2000（Thermo Fisher Scientific 社）を用いてＡＣＣ－ＭＥＳＯ４にトランスフェクションした。７２時間培養後、細胞をＰＢＳで洗浄し、１％　ＳＤＳ、１２５ｍＵ／ｍＬ　Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ　ｎｕｃｌｅａｓｅ（メルク・ミリポア社）を含む２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ８．０）を２５μＬ／ｃｍ2加え、氷上で５分間静置し、可溶化液を回収した。遠心後の上清をサンプルとし、６％　ＳＤＳ－ＰＡＧＥで分離後、ウェスタンブロットを行った。また、ヒトＨＥＧ１に対するｓｈＲＮＡを発現するレンチウイルスを用いての発現抑制も行った。レンチウイルス粒子（sc-78365-V）はサンタクルズ社より入手したものを用い、製品プロトコールに従いＡＣＣ－ＭＥＳＯ４に感染させた。４８時間後から１０μｇ／ｍＬのピューロマイシンを用いて薬剤選択を開始し、１０日後まで生存し増殖している細胞をｓｈＲＮＡ安定発現細胞として用いた。可溶化以降の操作はｓｉＲＮＡ処理の場合と同様に行った。陰性対照としては、cop GFP対照レンチウイルス粒子（sc-108084、サンタクルズ社製）を用いた。
　結果は図３に示される通りであった。中皮腫細胞のＨＥＧ１を３種類のｓｉＲＮＡで発現抑制すると、いずれのｓｉＲＮＡでもＳＫＭ９－２抗体が認識するバンドに対するＳＫＭ９－２抗体の反応性が減少した。また、市販のレンチウイルス粒子を用いたＨＥＧ１に対するｓｈＲＮＡ発現でもＳＫＭ９－２抗体の反応性が減少した。このことから、ＳＫＭ９－２抗体は、ＨＥＧ１タンパク質を認識することが示唆された。
　ＡＣＣ－ＭＥＳＯ４よりクローニングしたＨＥＧ１　ｃＤＮＡ（配列番号３２および３４）のうち、配列番号３２に示される塩基配列の細胞外領域に対応する塩基配列（配列番号３２の１～４０５９番）にＦＬＡＧタグおよびＨｉｓタグを接続した遺伝子（配列番号１７）をｐｃＤＮＡ３．１（－）(Thermo Fisher Scientific 社)のＸｈｏＩサイトとＮｏｔＩサイト間に挿入し、組換え可溶型ＨＥＧ１発現プラスミドを作製した。このプラスミドを、ＡＣＣ－ＭＥＳＯ４に、Lipofectamine LTX Reagent with PLUS Reagent (Thermo Fisher Scientific 社)を用いてトランスフェクションし、７５０μｇ／ｍＬのジェネティシン(Thermo Fisher Scientific 社)により薬剤選択を行った。二週間後に生存、増殖している細胞を集め、組換え可溶型ＨＥＧ１安定発現細胞とした。この細胞の培養上清４０ｍＬをＨｉｓＴｒａｐ　ｅｘｃｅｌ（１ｍＬ）（ＧＥヘルスケア社）に添加し、１０ｍＭ　イミダゾール、０．５Ｍ　ＮａＣｌを含む２５ｍＭ　リン酸緩衝液（ｐＨ７．２）でカラムを洗浄後、同緩衝液中で、１０～５００ｍＭのイミダゾール濃度勾配により溶出を行った。ドットブロットによりＳＫＭ９－２抗体の結合が陽性となる画分を集め、アミコン　ウルトラ－１５，１００ｋＤａ（メルク・ミリポア社）を用いて濃縮し、１０ｍＭ　ＥＤＴＡ、６Ｍ塩酸グアニジンを含む２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ８．０）に溶液交換後、０．１％　Ｔｗｅｅｎ　２０を含む２５ｍＭ　リン酸緩衝液（ｐＨ７．２）に溶液交換し、部分精製された組換え可溶型ＨＥＧ１とした。組換え可溶型ＨＥＧ１はＳＫＭ９－２抗原と同程度の分子量を示し、ＳＫＭ９－２抗体により認識された（図３）。このことから、ＨＥＧ１タンパク質は中皮腫で産生される際、翻訳後修飾等を受け、大幅に分子量が増加すること、ＳＫＭ９－２抗体は中皮腫に発現する翻訳後修飾を受けたＨＥＧ１を認識していることが示唆された。
（３）エピトープに含まれるＨＥＧ１の翻訳後修飾
　ＨＥＧ１タンパク質のＳＤＳ－ＰＡＧＥによる見かけ上の分子量は約４００ｋＤａであり、予想されるタンパク質の分子量である１４８ｋＤａと比較してかなり大きなものであった。この原因を探るため、ＨＥＧ１タンパク質のアミノ酸一次配列を解析したところ、ＨＥＧ１は多数のＯ型、Ｎ型糖鎖修飾を受けることが予想された。そこで、精製抗原を糖鎖切断酵素により処理し、ＳＫＭ９－２抗体の反応性を解析した。
　具体的には、ＡＣＣ－ＭＥＳＯ４細胞から精製したＨＥＧ１タンパク質を、未処理で、または、各種酵素で処理した後にＳＫＭ９－２抗体の反応性を確認した。反応性は上記の通りドットブロット法により確認した。
　結果は図４に示される通りであった。図４に示されるように、抗原をノイラミニダーゼ処理すると、ＳＫＭ９－２抗体は結合しなくなった（組換え可溶型ＨＥＧ１でも同様。図省略）。α２－３ノイラミニダーゼ処理で抗原に対する抗体の反応性が消失することから、ＳＫＭ９－２抗体のエピトープにはα２－３結合されたシアル化糖鎖が含まれることが示唆された。
　このように、ＡＣＣ－ＭＥＳＯ４細胞では、ＨＥＧ１タンパク質はシアル化糖鎖修飾された状態で発現していることが明らかとなった。また、ＳＫＭ９－２抗体は、ＨＥＧ１タンパク質の糖鎖修飾依存的に認識することが明らかとなった。なお、実施例１においてヒト悪性胸膜中皮腫由来細胞株で免疫したマウスの血清からポリクローナル抗体を得て、ノイラミニダーゼによりＨＥＧ１タンパク質を処理した後にドットプロットを行ったところ、ＨＥＧ１抗体の認識がノイラミニダーゼ処理により弱まった。このことから、得られた抗体には、ＨＥＧ１タンパク質を糖鎖修飾依存的に認識する抗体が多数含まれると考えられる。
　さらに結果を詳細に解析すると、図４に示されるように、Ｎ－グリカナーゼ（ＰＮＧａｓｅ　Ｆ）処理では抗体の反応性は消失しない事から、エピトープに含まれる糖鎖はＯ型糖鎖と考えられた。さらに、Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ　Ｋ処理によって抗体の反応性が消失する事から、エピトープにはペプチド領域も含まれることが予想された。これらの結果から、ＳＫＭ９－２抗体は、ＨＥＧ１タンパク質の糖鎖部分とペプチド部分とを認識する抗体であることが示唆された。一方で、市販の抗ＨＥＧ１抗体は、ペプチド抗原に対する抗体であり、Santa Cruz Biotechnology社のヤギポリクローナル抗体である抗ＨＥＧ１抗体（HEG1 (N-13): sc-102592）や、Bioss Inc.社のウサギポリクローナル抗体である抗ＨＥＧ１抗体は、中皮腫から精製されるＨＥＧ１タンパク質には反応しなかった。
（４）ＨＥＧ１タンパク質の細胞膜上の局在
　ＨＥＧ１タンパク質が免疫組織学染色により細胞膜上に局在することから、ＳＫＭ９－２抗体がＨＥＧ１タンパク質の細胞外領域に結合するのか、細胞内領域に結合するのかを調べた。
　まず、ＡＣＣ－ＭＥＳＯ４を培養し、ディッシュに接着した細胞をスクレイパーにて培養ディッシュより剥離した。剥離した細胞とＳＫＭ９－２抗体とを反応させ、次いでＦＩＴＣ標識抗マウスＩｇＧで処理して、フローサイトメーターにて解析した。陰性対照としては細胞に結合することが無い２Ｄ２抗体を用いた。ＳＫＭ９－２抗体がＨＥＧ１タンパク質の細胞外領域に結合する場合には、細胞がＦＩＴＣ標識されることになるのでフローサイトメトリーで蛍光が観察されるはずである。この結果は、図５に示される通りであった。
　図５に示されるように、ＳＫＭ９－２抗体は、細胞膜表面上に露出するＨＥＧ１タンパク質部分に結合することが明らかとなった。
実施例４：ＳＫＭ９－２抗体の配列決定
　本実施例では、ＳＫＭ９－２抗体のＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を決定した。
　ＳＫＭ９－２ハイブリドーマの培養上清をIsoStrip Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Kit (ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社)を用いて解析したところ、ＳＫＭ９－２抗体のサブクラスはＩｇＧ１、Ｌ鎖はｋａｐｐａであることが示唆された。そこでハイブリドーマよりＴＲＩｚｏｌ（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を用いてＲＮＡを抽出し、マウスＩｇＧ１およびｋａｐｐａ鎖の遺伝子配列データベース情報をもとに設計したプライマーを用いて５’ＲＡＣＥ（タカラバイオ株式会社）を行った。これにより、ＳＫＭ９－２抗体のＨ鎖およびＬ鎖のオープンリーディングフレームの全塩基配列を決定した。結果は図６に示される通りであった。
実施例５：ＳＫＭ１０－２抗体のＨＥＧ１タンパク質への反応性
　実施例１において中皮腫を特異的に認識する抗体として得られたＳＫＭ１０－２抗体について、その反応特異性を確認した。
　組換え可溶型ＨＥＧ１（実施例３の（２）参照）およびＡＣＣ－ＭＥＳＯ４の細胞可溶化液を６％ＳＤＳ－ＰＡＧＥで分離し、ＳＫＭ１０－２の培養上清を用いてウェスタンブロットを行った。結果は、図７に示される通りであった。図７に示されるように、ＳＫＭ１０－２抗体は、ＨＥＧ１タンパク質を認識した。また、図７に示されるように、糖鎖分解処理によりその反応性が消失することから、ＳＫＭ１０－２抗体は、ＳＫＭ９－２抗体と同様にＨＥＧ１タンパク質に糖鎖依存的に結合する抗体であることが明らかになった。また、ＳＫＭ１０－２抗体は、ＳＫＭ９－２抗体とＨＥＧ１タンパク質との結合に関して競合することができる。
実施例６：インテレクチン融合Ｆａｂの作製
　ＳＫＭ９－２抗体のＦａｂ断片とインテレクチンとの融合タンパク質を作製して、このインテレクチン融合抗体がＨＥＧ１タンパク質を認識できるかどうかを確認した。
　ＳＫＭ９－２抗体のＨ鎖のＶH領域およびＣＨ１領域と、ヒトインテレクチン（配列番号２０）の１９～３１３番目のアミノ酸とを融合させたタンパク質（配列番号２１）を、ＳＫＭ９－２抗体のＬ鎖と細胞に共発現させて、インテレクチン融合抗体を得た。インテレクチンは、ジオール構造と極めて高い特異性および高い親和性を有し、ジオール修飾ゲルを充填したカラムによって、高度に精製可能であることを発明者らは明らかにしている。そこで、インテレクチン融合抗体を含む培養上清をジオールセファロースを充填したカラムに添加し、１，２－プロパンジオールを用いて溶出し、精製インテレクチン融合抗体を得た。ジオールセファロースは１，４－ビス（２，３－エポキシプロピル）ブタンが導入されたセファロースビーズ（epoxy-activated Sepharose 6B（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）のエポキシ基をアルカリ加水分解し作製した。このインテレクチン融合抗体がHEG1タンパク質を認識できるかをウェスタンブロット法により確認した。ウェスタンブロットは、インテレクチン融合抗体を１次抗体として用い、２次抗体としては西洋ワサビペルオキシダーゼで標識した抗ヒトインテレクチン抗体を用いた。結果は、図８に示される通りであり、インテレクチン融合抗体は、ＳＫＭ９－２抗体と同じく糖鎖修飾ＨＥＧ１タンパク質を認識した。
　インテレクチンは、ジオール構造と結合することを本発明者らは解明した。すなわち、ヒトインテレクチン－１を強制発現させたＲＫ－１３細胞の培養上清（リコンビナントヒトインテレクチン－１と５％ＦＣＳを含むＭＥＭ培地）５００μＬに、表４に示されるように、ジオール構造を含むビーズまたは含まないビーズを加え、２５℃で１８時間撹拌した。その後、遠心分離によりビーズを回収し、回収されたビーズを０．１％Ｔｗｅｅｎ２０、１５０ｍＭ　ＮａＣｌを含む２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．２）で一回洗浄し、１５％グリセロールを含む緩衝液で溶出した。溶出されたサンプルをSDS-PAGEにより分離してCBB染色を行った。ここで、ジオールビーズとしては、ポリスチレンビーズの表面に３－アミノ－１－プロパンジオールをアミノ基を介して結合させたビーズを用い、ジオールセファロースビーズとしては、１，４－ビス（２，３－エポキシプロピル）ブタンが導入されたセファロースビーズ（epoxy-activated Sepharose 6B（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）のエポキシ基をアルカリ加水分解したものを用いた。
　結果は図９に示される通りであった。すなわち、インテレクチンは、ジオールビーズおよびジオールセファロースビーズに強く結合し、ジオール構造を有しないビーズには結合しなかった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　また、インテレクチンとジオールセファロースビーズとの結合は、ジオール構造を有する他の化合物の存在下では阻害された。この実験は、ビアコア（GEヘルスケアバイオサイエンス社）を用いて、段階希釈された様々な種類の化合物の存在下で、３－アミノ－１－プロパンジオールをアミノ基を介して固定したセンサーチップに対するリコンビナントヒトインテレクチン－１の結合を測定することにより行った。インテレクチンは終濃度０．５μｇ／ｍＬで使用し、測定緩衝液として１ｍＭ　ＣａＣｌ2、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、０．０３％Ｔｗｅｅｎ２０を含む１０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０）を用いた。化合物を添加しなかった試料を用いて測定したインテレクチンの結合量を１００％として、各試料におけるインテレクチンの結合率を測定した。
　結果は、表５に示される通りであった。表５に示されるように、例えば、Ｌ－リボース、Ｄ－リボース、Ｌ－アスコルビン酸、モノブチリン、グリセロール、１，２－ブタンジオール、１，２－プロパンジオール、および（Ｒ）－１，２－プロパンジオールがインテレクチンとジオールセファロースビーズとの結合を阻害する際のＩＣ５０は、１ｍＭ以下であった（表５参照）。他方、エタノール、１－プロパノール、および３－アミノ－１－プロパノールなどのジオール構造を有しない化合物のＩＣ５０は、１００ｍＭを超えた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　このように、インテレクチンは化合物のジオール構造に結合するため、上記ジオールセファロースビーズなどを用いて精製することができる。さらには、抗体のＦａｂ断片とインテレクチンとの融合タンパク質は、ジオールセファロースビーズで精製することができた。例えば、表５に記載の化合物を固相化したカラムやビーズを用いれば、インテレクチン融合タンパク質を精製できることは当業者であれば当然理解できる。ジオール構造を有するカラムは安価に調達できるため、インテレクチン融合タンパク質は、製造コストの観点で中皮腫の検出において有用である。
実施例７Ａ：ＨＥＧ１のノックダウンによる中皮腫の増殖抑制効果
　本実施例では、ＨＥＧ１に対するｓｉＲＮＡを用いて中皮腫細胞株でＨＥＧ１をノックダウンし、中皮腫の細胞増殖に与える影響を調べた。
　中皮腫細胞としては、ＡＣＣ－ＭＥＳＯ－４細胞株を用いた。細胞を９６ウェルプレートに５×１０３細胞／ウェルで播種し、１００μＬの培地で２４時間培養した。細胞をＰＢＳで洗浄し、７．５ｐｍｏｌのｓｉＲＮＡ、０．１５μＬのLipofectamine 2000またはLipofectamine RNAiMAX（Thermo Fisher Scientific Inc.）を含む１５μＬＯｐｔｉ－ＭＥＭ（Thermo Fisher Scientific Inc.）を各ウェルに添加した。２４時間、４８時間または７２時間培養し、生存細胞数をCellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Reagent (Promega K.K., Tokyo, Japan)を用いて測定した。
　ｓｉＲＮＡとしては、ｓｉＲＮＡ１として上記Ｈ１０９７およびＨ２６７４の１：１混合物、ｓｉＲＮＡ２として市販のsc-78365 (Santa Cruz Biothechnology, Inc.)を用い、これらに加えて、Ｓ３８１６, SASI_Hs02_00353816; Ｓ３８１７, SASI_Hs02_00353817; Ｓ３８１８, SASI_Hs02_00353818 (Sigma-Aldrich Japan K.K.)を用いた。
　また、Ｈ３０５９として、
Ｈ３０５９センス鎖：5'-GCGAAUGCGUCGCAGACAACA-3'　（配列番号３８）
Ｈ３０５９アンチセンス鎖：5'-UUGUCUGCGACGCAUUCGCCA-3'　（配列番号３９）
を用い、Ｈ９１０６として、
Ｈ９１０６センス鎖：5'-CUGGCGUUCUAGUCAGUAAAA-3'　（配列番号４０）
Ｈ９１０６アンチセンス鎖：5'-UUACUGACUAGAACGCCAGAC-3'　（配列番号４１）
を用いた。
　また、対照として、MISSION siRNA Universal Negative Control (SIC-001) (Sigma-Aldrich Japan K.K., Tokyo, Japan)を用いた。
　経時的な細胞増殖に与えるＨＥＧ１ノックダウンの影響は、図１０に示される通りであった。図１０に示されるように、ＨＥＧ１をノックダウンした例（ＨＥＧ１　ｓｉＲＮＡ１およびｓｉＲＮＡ２）ではいずれも、対照および未処理の中皮腫細胞株よりも、細胞増殖能が低下することが明らかとなった。また、ＨＥＧ１　ｓｉＲＮＡ１では、細胞数が培養開始前よりも減少していた（図１０）。ＨＥＧ１　ｓｉＲＮＡ１で処理した中皮腫細胞の一部は、４８時間目で細胞死を誘発していた。
　ＨＥＧ１に対するｓｉＲＮＡを導入して７２時間後の細胞数を、上記のｓｉＲＮＡを用いて確認した。ｓｉＲＮＡの細胞への導入は上記の通り行った。結果は図１１に示される通りであった。図１１に示されるように、いずれのｓｉＲＮＡを用いてＨＥＧ１をノックダウンした場合でも、中皮腫細胞は細胞増殖能を低下させた。
　なお、他の中皮腫細胞株であるＮＣＩ－Ｈ２４５２細胞やＨＥＧ１を発現しないＨＥＫ－２９３Ｔ細胞に対してＨ２６７４のｓｉＲＮＡを導入した結果は、図１２に示される通りであった。
　図１２に示されるように、他の中皮腫細胞株においても、ＨＥＧ１　ｓｉＲＮＡによりＨＥＧ１をノックダウンすると細胞増殖が抑制された。一方で、ＨＥＧ１を発現しないＨＥＫ－２９３Ｔ細胞はｓｉＲＮＡの影響を受けなかった。
　このことから、中皮腫の細胞増殖には、ＨＥＧ１の発現が強く関与していることが明らかとなった。また、ＨＥＧ１の発現を抑制することで、中皮腫の細胞増殖を抑制することができることも明らかとなった。このことからＨＥＧ１の発現や、ＨＥＧ１の細胞増殖促進機能を阻害することにより、ＨＥＧ１を発現するがん（例えば、中皮腫）の処置が可能になることが示唆された。
　ＨＥＧ１分子を遺伝子オントロジー解析をすると、ＨＥＧ１タンパク質は、細胞外領域に３つのＥＧＦドメインを有することが分かる。例えば、ＭＵＣ４というタンパク質は、細胞外にＥＧＦドメインを有し、ＥｒｂＢ２（またはＨＥＲ２／ｎｅｕ）に結合して発がんに関与することが知られている。このことから、ＨＥＧ１タンパク質のＥＧＦドメインも、同様に発がんに関与する可能性が示唆される。本実施例では、ＨＥＧ１のノックダウンにより腫瘍細胞の細胞増殖が抑制された。すなわち、本実施例では、腫瘍細胞の増殖にはＨＥＧ１タンパク質が必要であるという結果が示された。このことから、ＨＥＧ１タンパク質の細胞増殖促進機能には、ＥＧＦドメインが関与している可能性が考えられた。
　また、ＨＥＧ１の細胞内発現部位を確認すると、従来の非糖鎖修飾型ＨＥＧ１は、上皮細胞間のタイトジャンクションの部位に発現するのに対して、中皮腫に特徴的な糖鎖修飾を有するＨＥＧ１は、糖鎖修飾故に親水性であり、上皮細胞の頂上部表面（apical surface）に発現する。このことも、ＨＥＧ１が細胞増殖に関わる細胞間シグナルまたはシグナル伝達に関与している可能性を示唆するものである。
実施例８Ａ：エピトープ領域の決定
　本実施例では、中皮腫細胞株ＡＣＣ－ＭＥＳＯ－１の内在性ＨＥＧ１をノックダウンした上で、ヒトＨＥＧ１断片を発現させ、ＳＫＭ９－２抗体との反応性を確認した。次いで、エピトープ領域についてアラニンスキャニングにより抗体との反応性を試験し、抗体との結合に重要なアミノ酸を決定した。
（１）結合ドメインの解析
　中皮腫細胞株ＡＣＣ－ＭＥＳＯ－１に、ＨＥＧ１　ｓｉＲＮＡ　（Ｈ９１０６）（配列番号４０、４１）　とヒトＨＥＧ１を遺伝子導入し、ＳＫＭ９－２の反応性をウェスタンブロット法で確認した。ヒトＨＥＧ１は全長（ＨＥＧ１　ｆｕｌｌ　ｌｅｎｇｔｈ）または断片（ＨＥＧ１　３ｋｂ，　ＨＥＧ１　２ｋｂ，　またはＨＥＧ１　１ｋｂ）を用いた。ここで、ヒトＨＥＧ１全長は、配列番号３５のアミノ酸配列を有するタンパク質であり、配列番号３４の塩基配列をｐＦＬＡＧ－ＣＭＶ１（シグマ社）に挿入して得たプラスミドを形質転換して上記中皮腫細胞株に発現させた。ＨＥＧ１　３ｋｂ断片は、配列番号３５の２８５番目のロイシンから１３８７番目のフェニルアラニンまでの断片をインフレームとなるようｐＦＬＡＧ－ＣＭＶ１（シグマ社）に挿入して上記中皮腫細胞株に発現させた。ＨＥＧ１　２ｋｂおよびＨＥＧ１　１ｋｂはそれぞれ、配列番号３５の６７７番目のロイシンから１３８７番目のフェニルアラニンまでの断片および９９２番目のバリンから１３８７番目のフェニルアラニンまでの断片を同様にして上記中皮腫細胞株に発現させた。細胞溶解物をＳＫＭ９－２抗体を用いたウェスタンブロットにより解析を行った。結果は、図１３および図１４Ａに示される通りであった。
　図１３および図１４Ａに示されるように、ＨＥＧ１のエクソン７を含むＨＥＧ１　ｆｕｌｌ　ｌｅｎｇｔｈ、ＨＥＧ１　３ｋｂ、ＨＥＧ１　２ｋｂが陽性（＋）となった。一方で、ＨＥＧ１　１ｋｂは抗体との結合が陰性（－）であった（図１３および図１４Ａ）。
　このことから、ＳＫＭ９－２抗体は、ＨＥＧ１のエクソン７の領域に結合することが明らかとなった。
（２）結合ドメインの解析２
　さらにＨＥＧ１のエクソン７の領域を詳細に解析した。ヒトＳＬＵＲＰ１にＧＰＩアンカーシグナルを接続したタンパク質（配列番号４２；以下、「ＳＬＵＲＰｇｐｉ」と呼ぶ）のＮ末端側にＨＥＧ１のエクソン７の一部のアミノ酸配列を接続した融合タンパク質を用いて、ＳＫＭ９－２の反応性をウェスタンブロット法で確認した。融合タンパク質には、シグナル配列（配列番号４３）をＮ末端に付加して発現させた。
　ここで、用いたＨＥＧ１のエクソン７の部分配列とＳＬＵＲＰｇｐｉとの融合タンパク質は、以下の通りとした。
　アミノ酸番号７８３のアスパラギン酸から９９１番目のセリンまでの断片をＳＬＵＲＰｇｐｉに結合した断片（７．６）；
　アミノ酸番号８３２のグルタミンから９９１番目のセリンまでの断片をＳＬＵＲＰｇｐｉに結合した断片（７．７）；
　アミノ酸番号８８６のグルタミンから９９１番目のセリンまでの断片をＳＬＵＲＰｇｐｉに結合した断片（７．８）；
　アミノ酸番号９４１のアラニンから９９１番目のセリンまでの断片をＳＬＵＲＰｇｐｉに結合した断片（７．９）；
　配列番号４４をＳＬＵＲＰｇｐｉに結合した断片（７．６１）；
　配列番号４５をＳＬＵＲＰｇｐｉに結合した断片（７．６２）；
　配列番号４６をＳＬＵＲＰｇｐｉに結合した断片（７．６３）；
　配列番号４７をＳＬＵＲＰｇｐｉに結合した断片（７．６４）；
　配列番号４８をＳＬＵＲＰｇｐｉに結合した断片（７．６２３）；
　配列番号４９をＳＬＵＲＰｇｐｉに結合した断片（７．６２３１）；
　配列番号５０をＳＬＵＲＰｇｐｉに結合した断片（７．６２３２）；
　配列番号５１をＳＬＵＲＰｇｐｉに結合した断片（７．６２４１）；
　配列番号５２をＳＬＵＲＰｇｐｉに結合した断片（７．６２４２）。
　結果は、図１３および図１４Ｂに示される通りであった。
　図１３および図１４Ｂに示されるように、融合タンパク質（７．６および７．６２）が陽性となった。このことから、ＳＫＭ９－２抗体は、ＨＥＧ１のＥ７９３～Ｔ８１２を含む領域に結合することが明らかとなった。
　また、図１３および図１４Ｃに示されるように、融合タンパク質（７．６２３および７．６２３１）が陽性となった。このことから、ＳＫＭ９－２抗体は、ＨＥＧ１のＳ７９９～Ｅ８１０を含む領域に結合することが明らかとなった。
（３）アラニンスキャニングによる結合部位の解析
　次に、Ｓ７９９～Ｅ８１０断片のアミノ酸を１アミノ酸ずつアラニンに改変した断片を作成し、上記と同様にＳＬＵＲＰｇｐｉに連結させて、ＳＫＭ９－２抗体との反応性をウェスタンブロット法で確認した。
　すると、図１３および図１４Ｄに示されるように、Ｓ７９９～Ｔ８０９（ＳＫＳＰＳＬＶＳＬＰＴ；配列番号５３）がＳＫＭ９－２抗体のエピトープ（線形エピトープ）であることが分かった。
　さらに、７．６２３１断片を発現させた細胞の可溶化液をノイラミニダーゼ処理すると、当該断片とＳＫＭ９－２抗体との反応が消失した（図１４Ｅ参照）。このことから、ＳＫＭ９－２抗体が認識するエピトープにはシアル酸修飾が含まれていることが明らかとなった。
配列表
配列番号１　：ＳＫＭ９－２抗体重鎖核酸配列
配列番号２　：ＳＫＭ９－２抗体重鎖アミノ酸配列
配列番号３　：ＳＫＭ９－２抗体軽鎖核酸配列
配列番号４　：ＳＫＭ９－２抗体軽鎖アミノ酸配列
配列番号５　：ＳＫＭ９－２抗体の重鎖ＣＤＲ１の核酸配列
配列番号６　：ＳＫＭ９－２抗体の重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列
配列番号７　：ＳＫＭ９－２抗体の重鎖ＣＤＲ２の核酸配列
配列番号８　：ＳＫＭ９－２抗体の重鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列
配列番号９　：ＳＫＭ９－２抗体の重鎖ＣＤＲ３の核酸配列
配列番号１０：ＳＫＭ９－２抗体の重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列
配列番号１１：ＳＫＭ９－２抗体の軽鎖ＣＤＲ１の核酸配列
配列番号１２：ＳＫＭ９－２抗体の軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列
配列番号１３：ＳＫＭ９－２抗体の軽鎖ＣＤＲ２の核酸配列
配列番号１４：ＳＫＭ９－２抗体の軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列
配列番号１５：ＳＫＭ９－２抗体の軽鎖ＣＤＲ３の核酸配列
配列番号１６：ＳＫＭ９－２抗体の軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列
配列番号１７：ＦＬＡＧタグおよびＨｉｓタグを有する可溶型ＨＥＧ１　ｃＤＮＡの核酸配列
配列番号１８：ＦＬＡＧタグおよびＨｉｓタグを有する可溶型ＨＥＧ１　ｃＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列
配列番号１９：ヒトインテレクチン－１遺伝子の核酸配列
配列番号２０：ヒトインテレクチン－１タンパク質のアミノ酸配列
配列番号２１：ＳＫＭ９－２抗体重鎖とインテレクチンとの融合遺伝子の核酸配列
配列番号２２：ＳＫＭ９－２抗体重鎖とインテレクチンとの融合タンパク質のアミノ酸配列
配列番号２３：Ｈ１０９７のセンス鎖の核酸配列
配列番号２４：Ｈ１０９７のアンチセンス鎖の核酸配列
配列番号２５：Ｈ２６７４のセンス鎖の核酸配列
配列番号２６：Ｈ２６７４のアンチセンス鎖の核酸配列
配列番号２７：Ｈ３６７１のセンス鎖の核酸配列
配列番号２８：Ｈ３６７１のアンチセンス鎖の核酸配列
配列番号２９：ＮＭ＿０２０７３３．１として登録されたＨＥＧ１遺伝子の核酸配列
配列番号３０：配列番号２９によりコードされるタンパク質のアミノ酸配列
配列番号３１：ＨＥＧ１タンパク質の天然の可溶型バリアント
配列番号３２：ＨＥＧ１タンパク質の天然のバリアントをコードする核酸の核酸配列
配列番号３３：配列番号３２によりコードされるタンパク質のアミノ酸配列
配列番号３４：ＨＥＧ１タンパク質の天然のバリアントをコードする核酸の核酸配列
配列番号３５：配列番号３４によりコードされるタンパク質のアミノ酸配列
配列番号３６：ＨＥＧ１タンパク質の天然のバリアントをコードする核酸の核酸配列
配列番号３７：配列番号３６によりコードされるタンパク質のアミノ酸配列
配列番号３８：Ｈ３０５９のセンス鎖の核酸配列
配列番号３９：Ｈ３０５９のアンチセンス鎖の核酸配列
配列番号４０：Ｈ９１０６のセンス鎖の核酸配列
配列番号４１：Ｈ９１０６のアンチセンス鎖の核酸配列
配列番号４２：SLURPgpi部分のアミノ酸配列
配列番号４３：SLURPgpi融合蛋白質のシグナル配列（アミノ酸配列）
配列番号４４：SLURPgpi (7.61)断片中のＨＥＧ１部分のアミノ酸配列
配列番号４５：SLURPgpi (7.62)断片中のＨＥＧ１部分のアミノ酸配列
配列番号４６：SLURPgpi (7.63)断片中のＨＥＧ１部分のアミノ酸配列
配列番号４７：SLURPgpi (7.64)断片中のＨＥＧ１部分のアミノ酸配列
配列番号４８：SLURPgpi (7.623)断片中のＨＥＧ１部分のアミノ酸配列
配列番号４９：SLURPgpi (7.6231)断片中のＨＥＧ１部分のアミノ酸配列
配列番号５０：SLURPgpi (7.6232)断片中のＨＥＧ１部分のアミノ酸配列
配列番号５１：SLURPgpi (7.6241)断片中のＨＥＧ１部分のアミノ酸配列
配列番号５２：SLURPgpi (7.6242)断片中のＨＥＧ１部分のアミノ酸配列
配列番号５３：ＨＥＧ１タンパク質のＳ７９９からＴ８０９までのアミノ酸配列
配列番号５４：図１３のＳ７９９Ａ変異体ペプチドのアミノ酸配列
配列番号５５：図１３のＫ８００Ａ変異体ペプチドのアミノ酸配列
配列番号５６：図１３のＳ８０１Ａ変異体ペプチドのアミノ酸配列
配列番号５７：図１３のＰ８０２Ａ変異体ペプチドのアミノ酸配列
配列番号５８：図１３のＳ８０３Ａ変異体ペプチドのアミノ酸配列
配列番号５９：図１３のＬ８０４Ａ変異体ペプチドのアミノ酸配列
配列番号６０：図１３のＶ８０５Ａ変異体ペプチドのアミノ酸配列
配列番号６１：図１３のＳ８０６Ａ変異体ペプチドのアミノ酸配列
配列番号６２：図１３のＬ８０７Ａ変異体ペプチドのアミノ酸配列
配列番号６３：図１３のＰ８０８Ａ変異体ペプチドのアミノ酸配列
配列番号６４：図１３のＴ８０９Ａ変異体ペプチドのアミノ酸配列
配列番号６５：図１３のＥ８１０Ａ変異体ペプチドのアミノ酸配列

Claims (17)

  1. 　中皮腫から得られる糖鎖修飾を有するＨＥＧ１タンパク質に結合する抗体、またはその抗原結合性断片。
  2. 　中皮腫から得られる糖鎖修飾を有するＨＥＧ１タンパク質に糖鎖修飾依存的に結合する、請求項１に記載の抗体、またはその抗原結合性断片。
  3. 　中皮腫の細胞膜上のＨＥＧ１タンパク質に結合する抗体。
  4. 　請求項３記載の抗体であって、
    （１）配列番号６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１と、配列番号８のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２と、配列番号１０のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む重鎖可変領域を含む、抗体、
    （２）配列番号１２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１と、配列番号１４のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２と、配列番号１６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域とを含む、抗体、
    （３）配列番号６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１と、配列番号８のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２と、配列番号１０のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号１２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１と、配列番号１４のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２と、配列番号１６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域とを含む、抗体、
    （４）上記（１）～（３）のいずれかの抗体と８０％以上のアミノ酸配列の配列相同性を有する抗体、
    （５）上記（１）～（４）のいずれかの抗体と結合において競合する抗体、若しくは
    （６）上記（１）～（４）のいずれかの抗体と同じエピトープに結合する抗体
    またはこれらの抗原結合性断片。
  5. 　中皮腫細胞株で発現された配列番号５３のアミノ酸配列を有するペプチドに結合する抗体。
  6. 　抗原が、中皮腫から得られる糖鎖修飾を有するＨＥＧ１タンパク質である、請求項４に記載の抗体、またはその抗原結合性断片。
  7. 　請求項１～６のいずれか一項に記載の抗体のＶＨ領域またはＶＨ領域およびＣＨ１領域とヒトインテレクチンタンパク質との融合タンパク質と、該抗体の軽鎖とのタンパク質複合体。
  8. 　ＨＥＧ１タンパク質に結合する抗体、請求項１～６のいずれか一項に記載の抗体若しくはこれらの抗原結合性断片、または請求項７に記載のタンパク質複合体を含む、中皮腫診断薬。
  9. 　ＨＥＧ１タンパク質に結合する抗体、請求項１～６のいずれか一項に記載の抗体若しくはこれらの抗原結合性断片、または請求項７に記載のタンパク質複合体と、イメージングプローブとの結合体を含む、中皮腫の体内診断薬。
  10. 　ＨＥＧ１タンパク質に結合する抗体、請求項１～６のいずれか一項に記載の抗体若しくはこれらの抗原結合性断片、または請求項７に記載のタンパク質複合体を含む、中皮腫診断用キット。
  11. 　ＨＥＧ１タンパク質に結合する抗体、請求項１～６のいずれか一項に記載の抗体若しくはこれらの抗原結合性断片、または請求項７に記載のタンパク質複合体と、イメージングプローブとの結合体を含む、中皮腫の体内診断用キット。
  12. 　ＨＥＧ１タンパク質に結合する抗体、請求項１～６のいずれか一項に記載の抗体若しくはこれらの抗原結合性断片、または請求項７に記載のタンパク質複合体を含む、中皮腫を処置することに用いるための医薬組成物。
  13. 　ＨＥＧ１に対する発現抑制剤を含む、中皮腫を処置することに用いるための医薬組成物。
  14. 　生体から分離された試料において、ＨＥＧ１タンパク質を検出することを含む、中皮腫の検出方法。
  15. 　ＨＥＧ１タンパク質に結合する抗体、請求項１～６のいずれか一項に記載の抗体若しくはこれらの抗原結合性断片、または請求項７に記載のタンパク質複合体により、生体から分離された試料中のＨＥＧ１タンパク質を検出することを含む、中皮腫の検出方法。
  16. 　中皮腫から得られる糖鎖修飾を有するＨＥＧ１タンパク質または配列番号３５のアミノ酸配列において７９９番目～８０９番目のアミノ酸配列を含むその断片。
  17. 　請求項１６に記載のＨＥＧ１タンパク質または前記その断片を含む、中皮腫の診断マーカー。
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