WO2017150516A1 - 生体試料中の測定対象物質を定量するためのキット及び生体試料中の測定対象物質を定量する方法 - Google Patents

生体試料中の測定対象物質を定量するためのキット及び生体試料中の測定対象物質を定量する方法 Download PDF

Info

Publication number
WO2017150516A1
WO2017150516A1 PCT/JP2017/007744 JP2017007744W WO2017150516A1 WO 2017150516 A1 WO2017150516 A1 WO 2017150516A1 JP 2017007744 W JP2017007744 W JP 2017007744W WO 2017150516 A1 WO2017150516 A1 WO 2017150516A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
substance
blocking agent
antibody
binding
particles
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP2017/007744
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
典之 笠置
浩之 知久
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Fujifilm Corp
Original Assignee
Fujifilm Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Fujifilm Corp filed Critical Fujifilm Corp
Priority to JP2018503322A priority Critical patent/JP6532594B2/ja
Priority to EP17759982.6A priority patent/EP3425397B1/en
Priority to CN201780014062.XA priority patent/CN108700581A/zh
Publication of WO2017150516A1 publication Critical patent/WO2017150516A1/ja
Priority to US16/115,593 priority patent/US10816469B2/en
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54393—Improving reaction conditions or stability, e.g. by coating or irradiation of surface, by reduction of non-specific binding, by promotion of specific binding
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6486—Measuring fluorescence of biological material, e.g. DNA, RNA, cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/551—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being inorganic
    • G01N33/553—Metal or metal coated
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
    • G01N2021/6439—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes" with indicators, stains, dyes, tags, labels, marks

Definitions

  • the present invention relates to a kit for quantifying a measurement target substance in a biological sample and a method for quantifying the measurement target substance in a biological sample.
  • a fluorescence detection method is widely used as a highly sensitive and easy measurement method for quantifying a measurement target substance such as a protein, enzyme, or inorganic compound contained in a biological sample.
  • the presence of a measurement target substance is detected by detecting the fluorescence emitted when the sample that is considered to contain the measurement target substance that is excited by light of a specific wavelength and emits fluorescence is irradiated with the excitation light of the specific wavelength. It is a method to confirm.
  • the measurement target substance is not a phosphor
  • a substance labeled with a fluorescent dye that specifically binds to the measurement target substance is brought into contact with the sample, and then the fluorescence emitted when the excitation light is irradiated in the same manner as described above. By detecting, the presence of the measurement target substance can be confirmed.
  • the fluorescence detection method by surface plasmon excitation is approximately 10 times the signal enhancement as compared with the fluorescence detection method by epi-illumination excitation (hereinafter referred to as “epifluorescence method”). Degree can be obtained and can be measured with high sensitivity.
  • Patent Document 1 discloses an immunostaining method for detecting an antigen in a pathological tissue fixed on the surface of a substrate glass treated with an amino group-containing silane coupling agent by immunostaining using fluorescent nanoparticles.
  • a step of adding a blocking agent to a pathological tissue fixed on the surface of a base glass treated with an amino group silane coupling agent, a step of adding an antibody that reacts with an antigen to the pathological tissue, and an amino group-containing silane A step of adding a compound (1) having a functional group capable of reacting with an amino group in a coupling agent and allowing to stand at room temperature for a predetermined time; and a fluorescent nanoparticle having a functional group capable of binding by reacting with an antibody
  • an immunostaining method characterized by comprising the step of adding bovine serum albumin as an example of a blocking agent.
  • Patent Document 2 describes a specific conjugate comprising a water-dispersed polymer particle as a carrier, and a specific binding substance for a test substance and a non-specific adsorption blocking agent on the surface of the carrier.
  • a non-specific adsorption blocking agent bovine serum albumin is described.
  • a fluorescence detection method based on surface plasmon excitation is known as a method capable of performing high-sensitivity measurement with a simple measurement method, but the measurement accuracy is not sufficiently satisfactory. That is, in order to always quantify the measurement target substance with high accuracy, a simple measurement method with higher reproducibility is desired.
  • the present invention should solve the problem of providing a kit and a method capable of quantifying a measurement target substance in a biological sample with high accuracy while avoiding the influence of an antibody such as an antiserum albumin antibody present in blood. It was an issue.
  • the present inventors have found that the labeled particles having the first binding substance and the first blocking agent having binding properties with the measurement target substance, and the measurement target substance or the first A substance to be measured in a biological sample using a substrate comprising a detection region having a second binding substance having binding properties with any one of the binding substances and a second blocking agent different from the first blocking agent It has been found that the above-mentioned problems can be solved by quantitatively determining.
  • the present invention has been completed based on these findings. That is, according to the present invention, the following inventions are provided.
  • a labeled particle having a first binding substance having a binding property to a measurement target substance and a first blocking agent; and a second binding substance having a binding property to either the measurement target substance or the first binding substance A substrate comprising a detection region having a binding substance and a second blocking agent; A kit for quantifying a substance to be measured in a biological sample containing the kit, wherein the first blocking agent and the second blocking agent are different from each other.
  • the first blocking agent is one of albumin and globulin
  • the second blocking agent is the other of albumin and globulin.
  • the labeled particles are fluorescent particles, and the detection region is on a gold film.
  • a method for quantifying a substance to be measured in a biological sample A reaction step of reacting a biological sample with a labeled particle having a first binding substance having a binding property to the measurement target substance and a first blocking agent; and binding to either the measurement target substance or the first binding substance
  • a reaction product obtained in the reaction step is contacted with a substrate including a detection region having a second binding substance having a property and a second blocking agent, and the labeled particles are captured on the substrate, and the measurement target A labeling information acquisition process related to a substance to be measured, which acquires labeling information related to the amount of the substance;
  • the first blocking agent and the second blocking agent are different from each other.
  • the substance to be measured in the biological sample can be quantified with high accuracy.
  • FIG. 1 shows a schematic view of a sensor chip included in the kit of the present invention.
  • FIG. 2 shows an exploded view of the sensor chip included in the kit of the present invention.
  • a kit for quantifying a measurement target substance in a biological sample comprises a labeled particle having a first binding substance and a first blocking agent having binding properties with the measurement target substance; and the measurement target substance or the above
  • a substrate including a detection region having a second binding substance having a binding property with any of the first binding substances and a second blocking agent, wherein the first blocking agent and the second blocking agent are Each is a different kit.
  • first blocking agent on the labeled particles
  • second blocking agent on the detection region of the substrate
  • the biological sample is not particularly limited as long as it is a sample that may contain a substance to be measured.
  • a biological sample particularly a body fluid of an animal (for example, human, dog, cat, etc.)
  • blood, serum, plasma, cerebrospinal fluid, tears, sweat, urine, pus, runny nose, or sputum) or excrement (for example, feces), organ, tissue, mucous membrane, skin, and the like can be mentioned.
  • a measuring object substance for example, a bile acid, cortisol, cholesterol, protein etc. are mentioned.
  • Bile acid is a generic name for compounds having a colanic acid skeleton that are steroid derivatives present in mammalian bile, and representative examples thereof include cholic acid, deoxycholic acid, and chenodeoxycholic acid.
  • the main role of bile acids is to promote micelle formation in the gastrointestinal tract and make it easier to absorb dietary fat. What is biosynthesized in the liver is called primary bile acid. Some of them are transformed by microorganisms in the intestine, and their metabolites are called secondary bile acids. Bile acids are usually associated with glycine and taurine, which are called conjugated bile acids (bile salts).
  • a rapid and simple method for measuring serum bile acid concentration in dogs and cats has been recognized as a highly sensitive and specific test that reflects hepatocyte function and intestinal hepatic portal circulation.
  • Studies on serum bile acids detect hepatobiliary diseases that require clinically definitive diagnosis, especially in dogs and cats that have high liver enzyme activity with unclear clinical signs and uninterpretable interpretation but without jaundice Therefore, the usefulness of serum bile acids has been shown.
  • fasting and postprandial bile acid quantification is recommended to increase the diagnosis rate in the diagnosis of congenital portal venous circulation shunts.
  • bile acid concentration When the bile acid concentration is high, acute hepatitis, chronic liver disease, cholestasis, intestinal bacterial overgrowth, portal vein shunt (PSS) epilepsy and the like are suspected. On the other hand, if the bile acid concentration is low, intestinal malabsorption is suspected.
  • PSS portal vein shunt
  • Such bile acids exist as aggregates of compounds having slightly different structures, and specifically, there are 10 kinds of compounds. In the case of dogs and cats, almost 100% of bile acids are occupied by three types of cholic acid, deoxycholic acid and chenodeoxycholic acid.
  • the structures of cholic acid, deoxycholic acid and chenodeoxycholic acid are shown below.
  • the first binding substance used in the present invention is a substance having binding properties with the measurement target substance.
  • an antigen, an antibody, or a complex thereof can be used, but is not limited thereto.
  • the first binding substance is an antibody.
  • the first binding substance is an antibody
  • an antiserum prepared from the serum of an animal immunized with the measurement target substance or an immunity purified from the antiserum as an antibody having a binding property to the measurement target substance globulin fraction monoclonal antibody obtained by cell fusion using spleen cells of an animal immunized with the analyte or, fragments thereof [e.g., F (ab ') 2, Fab, Fab', or Fv], etc.
  • F (ab ') 2, Fab, Fab', or Fv] fragments thereof [e.g., F (ab ') 2, Fab, Fab', or Fv], etc.
  • These antibodies can be prepared by a conventional method.
  • the antibody may be modified as in the case of a chimeric antibody, or may be a commercially available antibody or an antibody prepared from animal serum or culture supernatant by a known method.
  • an anti-bile acid antibody that binds to bile acid is used as the first binding substance.
  • bile acids include cholic acid, deoxycholic acid and chenodeoxycholic acid
  • anti-cholic acid antibody, anti-deoxycholic acid antibody and anti-chenodeoxycholic acid antibody are prepared as the first binding substance.
  • the above three types of antibodies can be used.
  • a cholic acid / BSA conjugate can be prepared by mixing cholic acid, bovine serum albumin (hereinafter abbreviated as BSA), and a condensing agent.
  • BSA bovine serum albumin
  • the conjugate is used as a mouse immunization antigen and immunized subcutaneously on the back of the mouse several times.
  • complete adjuvant Complete Fres' Adjuvant: CFA
  • / or incomplete adjuvant Incomplete Freund's Adjuvant: IFA
  • the diluted cells can be cultured (cloned).
  • injecting the fusion cell line thus obtained into the peritoneal cavity of a mouse and proliferating ascites-type antibody-producing cells it becomes possible to produce monoclonal antibodies in ascites, and recover these antibodies.
  • the target antibody can be obtained.
  • an anti-cortisol antibody that binds to cortisol preferably specifically recognizes cortisol
  • the anti-cortisol antibody can be produced according to the above-described method for producing an anti-cholic acid antibody.
  • Label particles As the labeled particles used in the present invention, particles having a label that can be usually used for immune reactions can be used. As the labeled particles, fluorescent particles colored with fluorescence that can be usually used for immune reactions can be used, or particles labeled with an enzyme can also be used.
  • fluorescent polymer particles such as fluorescent polystyrene beads and fluorescent glass particles such as fluorescent glass beads
  • fluorescent particle materials include polymers using monomers such as styrene, methacrylic acid, glycidyl (meth) acrylate, butadiene, vinyl chloride, vinyl acetate acrylate, methyl methacrylate, ethyl methacrylate, phenyl methacrylate, or butyl methacrylate.
  • a synthetic polymer powder such as a copolymer using two or more monomers, and a latex in which these are uniformly suspended is preferable.
  • Other organic polymer powders, inorganic substance powders, microorganisms, blood cells, cell membrane fragments, liposomes, and the like can be given.
  • latex materials include polystyrene, styrene-acrylic acid copolymer, styrene-methacrylic acid copolymer, styrene-glycidyl (meth) acrylate copolymer, styrene- Examples thereof include styrene sulfonate copolymers, methacrylic acid polymers, acrylic acid polymers, acrylonitrile-butadiene-styrene copolymers, vinyl chloride-acrylic acid ester copolymers, and polyvinyl acetate acrylate.
  • the latex a copolymer containing at least styrene as a monomer is preferable, and a copolymer of styrene and acrylic acid or methacrylic acid is particularly preferable.
  • the method for producing the latex is not particularly limited, and the latex can be produced by any polymerization method. However, since the antibody immobilization becomes difficult when a surfactant is present at the time of antibody labeling, the latex is preferably prepared by non-emulsifier emulsion polymerization, that is, emulsion polymerization without using an emulsifier such as a surfactant.
  • fluorescent latex particles When the latex itself obtained by polymerization is fluorescent, it can be used as fluorescent latex particles as it is.
  • fluorescent latex particles can be produced by adding a fluorescent substance (fluorescent dye or the like) to the latex. That is, fluorescent latex particles can be produced by adding a fluorescent dye to a latex particle solution containing water and a water-soluble organic solvent and stirring the solution.
  • Liposomes and microcapsules containing fluorescent dyes can also be used as fluorescent particles. Fluorescent color development is not particularly limited as long as it is excited by absorbing ultraviolet light or the like and emitted upon returning to the ground state. For example, yellow-green (excitation wavelength 505 nm / emission wavelength 515 nm, the same applies hereinafter) ), Blue (350-356 nm / 415-440 nm), red (535-580 nm / 575-605 nm), orange (540 nm / 560 nm), red orange (565 nm / 580 nm), crimson (625 nm / 645 nm), dark red ( Fluorescence development such as 660 nm / 680 nm) can be used. These fluorescent particles that emit fluorescence are available, for example, from Thermo Fisher Ltd., and are commercially available under the trade name FluoSpheres (registered trademark).
  • the average particle diameter of the labeled particles varies depending on the material of the particles, the concentration range for quantifying the substance to be measured, the measuring instrument, etc., but is preferably in the range of 0.001 to 10 ⁇ m (more preferably 0.001 to 1 ⁇ m).
  • the average particle diameter of the labeled particles can be measured with a commercially available particle size distribution meter or the like.
  • Measurement methods for particle size distribution include optical microscopy, confocal laser scanning, electron microscopy, atomic force microscopy, static light scattering, laser diffraction, dynamic light scattering, centrifugal sedimentation, and electrical pulse. Measurement methods, chromatography methods, ultrasonic attenuation methods, and the like are known, and devices corresponding to the respective principles are commercially available.
  • a dynamic light scattering method it is preferable to use a dynamic light scattering method because of the particle size range and ease of measurement.
  • Commercially available measuring devices using dynamic light scattering include Nanotrac UPA (Nikkiso Co., Ltd.), dynamic light scattering type particle size distribution measuring device LB-550 (Horiba, Ltd.), and a concentrated particle size analyzer.
  • FPAR-1000 Oletsuka Electronics Co., Ltd.
  • ZETA SIZER Nano's series Malvern Co., Ltd.
  • the method for immobilizing the first binding substance on the labeled particles is described in, for example, the protocol attached to JP-A-2000-206115 or Thermo Fisher's FluoSpheres (registered trademark) polystyrene microsphere F8813, and the like. Any known method for preparing a reaction reagent can be used. In addition, as a principle for immobilizing an antibody as a binding substance on a particle, any of physical adsorption and chemical bond by covalent bond can be adopted.
  • the blocking agent ie, the first blocking agent
  • the blocking agent that covers the surface of the particle that is not coated with the antibody after the antibody is immobilized on the particle
  • examples of the blocking agent include, for example, albumin (such as BSA), skim milk, casein, soy-derived component, and fish-derived component
  • albumin such as BSA
  • blocking agents for immune reactions including components, polyethylene glycol, and the like, as well as the above substances or substances having the same properties as the above substances can be used.
  • These blocking agents can be subjected to pretreatment such as partial modification with heat, acid, alkali, or the like, if necessary.
  • an antibody that does not bind to the substance to be measured, or a protein (Protein A, Protein G) that is not used in the test area can also be used.
  • a specific method for immobilizing the antibody on the particles is exemplified below.
  • An antibody solution adjusted to a concentration of 0.01 to 20 mg / mL is added to and mixed with a solution in which the solid content concentration of the particles is 0.1 to 10% by mass. Stirring is continued at a temperature of 4 to 50 ° C. for 5 minutes to 48 hours. Subsequently, the particles and the solution are separated by centrifugation or other methods to sufficiently remove the antibody that is not bound to the particles contained in the solution. Thereafter, the operation of washing the particles with a buffer solution is repeated 0 to 10 times.
  • Components that do not participate in antigen-antibody reaction preferably protein, more preferably globulin, albumin, Block Ace (registered trademark), skim milk, and casein after the operation of mixing particles and antibodies and binding the antibodies to the particles It is desirable to use a blocking agent such as to protect the part of the particle surface where the antibody is not bound.
  • Stabilizers are not particularly limited as long as they stabilize antigens and antibodies, such as synthetic or natural polymers such as sucrose and polysaccharides, such as Immunoassay Stabilizer (Advanced Biotechnologies Inc (ABI)) Commercially available stabilizers can also be used.
  • the labeled particles having the first binding substance are included in the kit of the present invention, and it is preferable that the labeled particles are included in a container, for example, a cup, which is a part of the kit.
  • the measurement target substance in the biological sample and the first binding substance can be bound by injecting the biological sample into a container containing the labeled particles, mixing, and stirring.
  • the present invention in order to achieve highly sensitive measurement, it is preferable to employ a measurement method that performs surface plasmon fluorescence (SPF) detection described later.
  • SPF surface plasmon fluorescence
  • a substrate having a metal film on the surface is not particularly limited as long as surface plasmon resonance can occur.
  • a free electron metal such as gold, silver, copper, aluminum, or platinum is used, and gold is particularly preferable.
  • gold is particularly preferable.
  • the detection area described later is on the gold film.
  • the above metals can be used alone or in combination.
  • an intervening layer made of chromium or the like may be provided between the substrate and the layer made of metal.
  • the thickness of the metal film is arbitrary, but is preferably, for example, 1 nm to 500 nm, and particularly preferably 10 nm to 200 nm. If it exceeds 500 nm, the surface plasmon phenomenon of the medium cannot be sufficiently detected. Moreover, when providing the intervening layer which consists of chromium etc., it is preferable that the thickness of the intervening layer is 0.1 nm or more and 10 nm or less.
  • the metal film may be formed by a conventional method, for example, sputtering, vapor deposition, ion plating, electroplating, or electroless plating.
  • a sputtering method it is preferable to form the metal film by a sputtering method.
  • the thickness of the mixed layer of the substrate material and the metal film is not particularly limited as long as sufficient adhesion can be secured, but is preferably 10 nm or less.
  • the metal film is preferably disposed on the substrate.
  • “arranged on the substrate” means that the metal film is arranged so as to be in direct contact with the substrate, and that the metal film is not directly in contact with the substrate, but through other layers. Including the case where it is arranged.
  • optical glass such as BK7 (borosilicate glass) which is a kind of general optical glass, or synthetic resin, specifically polymethyl methacrylate, polyethylene terephthalate, What consists of a transparent material with respect to laser beams, such as a polycarbonate or a cycloolefin polymer, can be used.
  • Such a substrate is preferably made of a material that does not exhibit anisotropy with respect to polarized light and has excellent processability.
  • a preferred embodiment of the substrate for SPF detection includes a substrate obtained by depositing a gold film on polymethyl methacrylate (PMMA).
  • the substrate includes a detection region having a second binding substance having binding properties with either the measurement target substance or the first binding substance.
  • the second binding substance is a substance having a binding property with the measurement target substance or a substance having a binding property with the first binding substance.
  • a substance having binding properties with the substance to be measured can be used as the second binding substance.
  • quantification is performed by a competitive method, a substance having binding properties with the first binding substance can be used as the second binding substance.
  • quantification is preferably performed by a competitive method, and a substance having binding properties with the first binding substance is preferably used as the second binding substance.
  • the second binding substance is not particularly limited, and preferred examples include an antigen, an antibody, or a complex thereof.
  • the second binding substance is an antigen
  • the second binding substance is a substance to be measured ( It is particularly preferable to use a substance having a binding property with the first binding substance.
  • the second binding substance is preferably a conjugate of the measurement target substance and the carrier.
  • a carrier means a substance to which a plurality of molecules of a substance to be measured can bind.
  • An example of a preferred carrier is protein and the like, and specific examples include bovine serum albumin.
  • the second binding substance is cholic acid and / or albumin conjugate of cholic acid, deoxycholic acid and / or deoxycholic acid / albumin conjugate, and chenodeoxycholic acid and / or chenodeoxycholic acid.
  • -It is particularly preferred to include an albumin conjugate.
  • the second binding substance is preferably a cortisol / albumin conjugate.
  • a method for immobilizing the second binding substance on the substrate is described in, for example, Tech Notes Vol. 2-12 and the like, and any known method for preparing a general ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) reagent can be used.
  • surface modification may be performed by arranging a self-assembled monolayer (SAM) on the substrate.
  • SAM self-assembled monolayer
  • a blocking agent that covers the substrate surface not coated with the second binding substance after the second binding substance is fixed to the substrate
  • a known substance such as bovine serum albumin (BSA) is used.
  • BSA bovine serum albumin
  • Globulin skim milk, casein, soybean-derived components, fish-derived components, polyethylene glycol, and the like, as well as commercially available blocking agents for immune reactions containing the same substances as those substances.
  • These blocking agents can be subjected to pretreatment such as partial modification with heat, acid, alkali, or the like, if necessary.
  • a test area for detecting the presence or absence of a substance to be measured in a biological sample can be provided on a substrate.
  • an antigen as a measurement target substance is captured, and the amount of the label bound to the antigen is detected and quantified, whereby the antigen can be quantified.
  • the antigen can be quantified by a method in which only the label bound to the antigen cannot be bound, only the label not bound to the antigen is captured, and the amount of the label bound to the antigen is calculated.
  • This detection method is called a competition method.
  • a substrate related to the competition method will be described.
  • the test area of the substrate has a site that reacts with a binding substance (for example, an antibody) present on the labeled particle.
  • a binding substance for example, an antibody
  • an embodiment having an antigen present in a biological sample on a test area of a substrate is preferable.
  • the antigen and BSA are reacted in the presence of a condensing agent to produce an antigen / BSA conjugate, and the conjugate can be adsorbed onto the test area to produce a test area.
  • the antigen-BSA conjugate which is the substance to be measured, is dissolved in a buffer solution, spotted on the substrate, allowed to stand for a certain period of time, and then the supernatant is aspirated and dried by a method such as drying. Can be combined.
  • control area In the present invention, in order to suppress the influence of the measurement environment, particularly the measurement temperature as much as possible, a control area is provided on the substrate, and the information on the test area is normalized with the information on the control area, thereby greatly reducing the environmental dependency. It can be kept low.
  • the control area is preferably designed so that it can bind to all the labels without depending on the amount of the substance to be measured present in the biological sample to be used. It is preferred to have an antibody that interacts with all antibodies present on the labeled particles.
  • the information in the test area is normalized with the information in the control area.For example, even when the flow of the biological sample and the reaction rate are affected in a low temperature environment, It is possible to cancel the influence and obtain a result that is always accurate and unaffected by the measurement environment.
  • a preferable antibody to be present in the control area is preferably an anti-mouse antibody if it has a function of recognizing a binding substance (for example, antibody) present on the labeled particle and the antibody is derived from a mouse. If the above antibody is derived from a goat, it is preferably an anti-goat antibody.
  • These antibodies on the control area can be dissolved in a buffer solution, spotted on a substrate, allowed to stand for a certain period of time, and then the supernatant is sucked and dried to be bound to the substrate. .
  • binding to both of the substances on the surface of the labeled particles it may be detected as negative even when a positive biological sample containing the measurement target substance is measured.
  • blocking with BSA is used to suppress nonspecific adsorption to solid phase surfaces (eg, labeled particle surfaces, gold film surfaces of substrates), but it reacts with BSA in a specific biological sample.
  • the anti-BSA antibody to be present is present, the BSA on the labeled particle and the BSA on the substrate react to crosslink and may cause a high value divergence.
  • the first blocking agent and the second blocking agent are different from each other to solve the above problem.
  • the first blocking agent and the second blocking agent are proteins different from each other. Specific examples of the first blocking agent and the second blocking agent are as described above in the present specification.
  • the first blocking agent is one of albumin and globulin
  • the second blocking agent is the other of albumin and globulin. More preferably, the first blocking agent is a globulin (more preferably, an immunoglobulin other than an immunoglobulin having a binding property to the substance to be measured), and the second blocking agent is albumin (more preferably bovine serum albumin). is there.
  • immunoglobulins other than immunoglobulins that have binding properties with the analyte include antisera prepared from the serum of animals immunized with an antigen different from the analyte, and immunoglobulin fraction purified from the antiserum.
  • antisera prepared from the serum of animals immunized with an antigen different from the analyte
  • immunoglobulin fraction purified from the antiserum Use monoclonal antibodies obtained by cell fusion using spleen cells of animals immunized with the substance to be measured, or fragments thereof (for example, F (ab ′) 2 , Fab, Fab ′, or Fv), etc. Is possible.
  • These antibodies can be prepared by a conventional method.
  • the antibody may be modified as in the case of a chimeric antibody or the like, or a commercially available antibody prepared from an animal serum or culture supernatant by a known method can be used.
  • an embodiment using an anti-CRP (C-reactive protein) antibody as the first blocking agent is particularly preferable.
  • antibodies can be used regardless of their animal species, subclasses, and the like.
  • antibodies that can be used in the present invention are antibodies derived from organisms that can cause an immune reaction such as mice, rats, hamsters, goats, rabbits, sheep, cows, chickens, specifically mouse IgG, mouse IgM.
  • Antibody fragments has at least one antigen binding site are molecules derived from intact antibodies, specifically Fab, F (ab ') is 2 and the like. These fragmented antibodies are molecules obtained by enzyme or chemical treatment or using genetic engineering techniques.
  • the kit of the present invention is used in a method for measuring a measurement target substance.
  • the measurement target substance is bile acid
  • the kit for bile acid measurement diagnosis is used, and the measurement target substance is cortisol.
  • the measurement of the measurement target substance includes a sensor chip including a substrate on which a second binding substance is fixed and a member holding a label particle such as a fluorescent particle, and a surface plasmon excitation device, and You may include the various equipment or apparatus used for the measurement of a measuring object substance, such as a fluorescence measuring device.
  • a sample including a known amount of a substance to be measured, an instruction manual, and the like may be included as elements of the kit.
  • a method for quantifying a substance to be measured in a biological sample comprises: A reaction step of reacting a biological sample with a labeled particle having a first binding substance having a binding property to the measurement target substance and a first blocking agent; and binding to either the measurement target substance or the first binding substance
  • a reaction product obtained in the reaction step is contacted with a substrate including a detection region having a second binding substance having a property and a second blocking agent, and the labeled particles are captured on the substrate, and the measurement target A labeling information acquisition process related to a substance to be measured, which acquires labeling information related to the amount of the substance;
  • the first blocking agent and the second blocking agent are different from each other.
  • the measurement target substance is quantified by the measurement target substance related label information acquisition step of acquiring the label information related to the amount of the measurement target substance.
  • the quantification in the present invention is interpreted as the broadest concept as long as it is the measurement of the amount of the substance to be measured.
  • Specific embodiments of the measurement method include a competitive method and a sandwich method, but the competitive method is preferred.
  • a bile acid immunoassay substrate on which a bile acid / albumin conjugate having a bile acid / albumin ratio of 7 to 14 is immobilized is labeled with a biological sample containing bile acid and an anti-bile acid antibody label.
  • a biological sample containing bile acid and an anti-bile acid antibody label is labeled with a biological sample containing bile acid and an anti-bile acid antibody label.
  • the fluorescent particles When the bile acid is not present in the biological sample, the anti-bile acid antibody-labeled fluorescent particles and the bile acid on the substrate (that is, the bile acid in the bile acid / albumin conjugate) cause the antigen antibody on the substrate.
  • a reaction takes place.
  • an antigen-antibody reaction occurs between the bile acid in the biological sample and the anti-bile acid antibody-labeled fluorescent particles, and the anti-bile acid antibody-labeled fluorescent particles and the substrate
  • Antigen-antibody reaction with bile acids ie, bile acids in bile acids / albumin conjugates
  • anti-bile acid antibody-labeled fluorescent particles that have not bound to albumin on the substrate are removed.
  • an immune complex on the substrate that is, a complex of antibile acid antibody-labeled fluorescent particles and bile acid in the bile acid / albumin conjugate on the substrate
  • the concentration of bile acid in a biological sample can be measured.
  • the measurement method of fluorescence in the competitive method can employ either plate reader measurement or flow measurement. For example, it can be measured by the following method.
  • a plurality of samples of known bile acid amounts with different bile acid concentrations are prepared in advance, and the sample and anti-bile acid antibody-labeled fluorescent particles are mixed in advance. This mixed solution is brought into contact with the region where the bile acid / albumin conjugate is immobilized.
  • the fluorescence signal from the region where the bile acid / albumin conjugate is immobilized is measured as a plurality of fluorescence signals while the mixture is in contact with the conjugate at specific time intervals. From the plurality of fluorescence signals, the temporal change (slope) of the fluorescence amount is obtained at each bile acid concentration.
  • This time change is plotted on the Y axis and the bile acid concentration is plotted on the X axis, and a relational expression of the bile acid concentration with respect to the time change of the fluorescence amount is obtained by using an appropriate fitting method such as a least square method. Based on the relational expression thus obtained, the amount of bile acid contained in the biological sample can be quantified using the result of temporal change of the fluorescence amount using the biological sample to be examined.
  • Quantification of the bile acid amount is preferably performed in a short time. Specifically, it is preferably performed within 10 minutes, more preferably within 8 minutes, and further preferably within 6 minutes.
  • the sample and the anti-bile acid antibody-labeled fluorescent particles are obtained by using the relational expression between the temporal change of the fluorescence amount and the bile acid concentration obtained in advance using an appropriate fitting method such as the least square method.
  • the amount of bile acid contained in the biological sample is converted based on the result of temporal change in the amount of fluorescence using the biological sample to be examined. It is preferable that time is included.
  • the measurement target substance can be measured by the following procedure.
  • a biological sample that may contain a measurement target substance is brought into contact with a fluorescent particle having a first binding substance having binding properties with the measurement target substance on the substrate.
  • a binding reaction antigen-antibody reaction or the like
  • an immune complex composed of the second binding substance bound to the substrate, the measurement target substance, and fluorescent particles having the first binding substance is formed. Is done.
  • the first binding substance that does not form the immune complex is included. Remove fluorescent particles and wash. Next, the concentration of the substance to be measured can be measured by detecting the degree of formation of the immune complex as the fluorescence intensity. The fluorescence intensity and the concentration of the measurement target substance have a positive correlation.
  • a mixed liquid obtained by mixing a biological sample that may contain a substance to be measured and labeled particles having a first binding substance is applied on a substrate and developed in a flow path.
  • the flow path is not particularly limited as long as it is a passage through which the biological sample and the labeled particles having the first binding substance flow down to the detection region.
  • the sample has a structure that can pass over the metal film.
  • a suction port can be provided on the side opposite to the spotting port with respect to the metal film.
  • the method for detecting a label such as fluorescence in the present invention is not particularly limited.
  • an apparatus capable of detecting fluorescence intensity specifically, a microplate reader or fluorescence detection (SPF) by surface plasmon excitation is used. It is preferable to detect the fluorescence intensity using a biosensor or the like.
  • label information related to the amount of the substance to be measured can be acquired by fluorescence detection using surface plasmon resonance.
  • fluorescence measurement may be plate reader measurement or flow measurement.
  • the fluorescence detection method (SPF method) based on surface plasmon excitation can be measured with higher sensitivity than the fluorescence detection method (epifluorescence method) based on epi-illumination.
  • the surface plasmon fluorescence (SPF) biosensor for example, an optical waveguide formed of a material that transmits excitation light of a predetermined wavelength, as described in Japanese Patent Application Laid-Open No. 2008-249361, and one of the optical waveguides are used.
  • a fluorescence detection means for detecting fluorescence generated by excitation by the evanescent wave enhanced by the surface plasmon can be used.
  • the fluorescence detection (SPF) system by surface plasmon excitation using the fluorescent particles of the present invention preferably detects fluorescence from a fluorescent substance depending on the amount of the measurement target substance immobilized on the metal film on the substrate.
  • It is an assay method, for example, a method different from the so-called latex agglutination method in which a change in optical transparency is detected as turbidity by the progress of a reaction in a solution.
  • the latex agglutination method an antibody-sensitized latex in a latex reagent and an antigen in a biological sample are combined and aggregated by an antibody reaction.
  • This aggregate increases with time, and the antigen concentration is quantified from the change in absorbance per unit time obtained by irradiating the aggregate with near infrared light.
  • the method of the present invention comprises: The label information acquired in the labeled particle-related label information acquisition step for acquiring the label information related to the amount of the labeled particle; and the label information related to the measurement target substance-related label information acquisition step for acquiring the label information related to the amount of the target substance It may be a method including a normalization step in which normalization is performed based on the label information acquired in the label particle-related label information acquisition step.
  • the mixed liquid containing the biological sample and the labeled particles having the first binding substance having binding properties with the measurement target substance is brought into contact with the substrate having the detection area (test area) and the reference area (control area).
  • the step of measuring the intensity of the fluorescence due to the surface plasmons generated on the detection region is It is a measurement target substance-related label information acquisition step for acquiring label information related to the quantity, and a step of measuring the intensity of fluorescence due to surface plasmons generated on the reference region is a label particle-related label information acquisition step.
  • the step of obtaining the rate of increase of the fluorescence intensity obtained in these two steps per unit time as the rate of change of the fluorescence signal value and dividing the rate of change of the signal value of the detection region by the rate of change of the signal value of the reference region is a standardization step It is.
  • Example 1 (1) Preparation of Bile Acid / Bovine Serum Albumin Conjugate (1-1) Preparation of Cholic Acid / Bovine Serum Albumin Conjugate Ultra-dehydrated dimethylformamide (hereinafter referred to as DMF; manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 1 .2 mL of cholic acid (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 50 mg, N-hydroxysuccinimide (hereinafter referred to as NHS; Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 67 mg, and 1-ethyl-3- (3 -Dimethylaminopropyl) carbodiimide (hereinafter referred to as EDC; 110 mg, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was added and mixed to make cholic acid an active ester.
  • DMF Preparation of Bile Acid / Bovine Serum Albumin Conjugate Ultra-dehydrated dimethylformamide
  • NHS N-hydroxysuccinimide
  • EDC 1-ethyl-3- (3 -D
  • the activated esterified cholic acid is a phosphate buffer solution (hereinafter referred to as PBS) in which 322 mg of bovine serum albumin (hereinafter referred to as BSA, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), which is a kind of albumin, is dissolved. Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was dropped into a 65 mL aqueous solution and reacted. After completion of the reaction, the reaction solution was purified by dialysis using 1 L of a solution of acetonitrile (hereinafter referred to as ACN; manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) / Water ratio of 1/3. Finally, it was lyophilized to obtain a white solid.
  • PBS phosphate buffer solution
  • BSA bovine serum albumin
  • ACN acetonitrile
  • Spleen cells extracted from mice and mutant myeloma cells (myeloma: P3-X63-Ag8-U1) were mixed at a cell ratio of 7: 1, and then polyethylene glycol (PEG) was added and centrifuged.
  • the suspension was suspended in a medium (RPMI-1640 (Roswell Park Memorial Institute Medium) + 10% by mass fetal bovine serum (FBS)).
  • the suspended spleen cells were seeded on a 96-well plate so that the number of cells was 1.0 ⁇ 10 5 (cell / well).
  • HAT medium hyperxanthine / aminopterin / thymidine medium
  • HAT medium hyperxanthine / aminopterin / thymidine medium
  • the cholic acid / BSA conjugate which is the antigen for measurement, is diluted with PBS to 500 ng / mL, added to the ELISA cup and allowed to stand to immobilize the antigen for measurement on the bottom of the cup, and the supernatant is removed.
  • An anti-mouse IgG HRP-labeled antibody was used as a secondary antibody against the antibody produced by the spleen cells to be measured.
  • IgG immunoglobulin G
  • HRP horseradish peroxidase
  • a dilution was prepared by limiting dilution of cells in each vial using basal medium RPMI1640 containing 10% by mass of FBS. One drop of dilution was pipetted into each well of six 96-well plates. Each well was observed with a microscope to confirm that the cells in each well were single cells. After culturing for 3 weeks, the culture supernatant of the grown hybridoma was screened by ELISA of an antibody measurement system in the same manner as described above. The top 10 wells with a high ELISA signal were selected to finish the preparation of the hybridoma. Isotyping kit (manufactured by Roche) was used to determine the subclass of the obtained antibody.
  • fluorescent particles blocked with anti-CRP antibody-1 were prepared as follows. To 357 ⁇ L of a 2% by mass (solid content concentration) fluorescent latex particle aqueous solution (Invitrogen, average particle size: 200 nm), 282 ⁇ L of a 50 mmol / L MES (2-Morpholine etheric acid) buffer solution (pH 6.0) was added, and 5 mg / L mL anti-cholic acid antibody-1 (prepared above) 5.3 ⁇ L, 5 mg / mL anti-deoxycholic acid antibody-1 (prepared above) 5.3 ⁇ L and 5 mg / mL anti-chenodeoxycholic acid antibody -1 (prepared above) 6.9 ⁇ L and 5 mg / mL anti-CRP antibody-1 (prepared above) 75.5 ⁇ L were added and stirred at room temperature for 15 minutes.
  • a solution (concentration: 50 ⁇ g / mL in 50 mmol) containing Conjugate-1, Conjugate-2 and Conjugate-3 in a content ratio (mass ratio 1: 1: 1) on the gold film surface of the detection region of this chip / L MES buffer (pH 6,150 mmol / L NaCl) and a solution containing BSA (150 mg) as a blocking agent were spotted and dried to prepare a plurality of substrates 1 on which three kinds of conjugates were immobilized.
  • a liquid containing the anti-mouse antibody prepared in (4) (concentration: 50 ⁇ g / mL in 50 mmol / L MES buffer pH 6,150 mmol / L NaCl) is spotted on the reference region of each substrate and dried. I let you. Similarly, a substrate using anti-CRP antibody-1 (150 mg) as a blocking agent was also prepared.
  • a preliminarily prepared cleaning solution (0.05 mass% Tween 20 (polyoxyethylene (20) sorbitan monolaurate, Jun Wako) Washing was repeated three times using 300 ⁇ L of PBS (pH 7.4)) containing Yakuhin).
  • FIG. 1 is a schematic view of the sensor chip 1
  • FIG. 2 is an exploded view of the sensor chip 1.
  • the sensor chip 1 includes an upper member 2, an intermediate member 3 and a substrate 4.
  • the upper member 2 is provided with a first container 5 and a second container 6.
  • the first container 5 and the second container 6 are collectively referred to as a container group 7.
  • a flow path 10 is formed on the substrate 4, and a detection area 8 and a reference area 9 are formed on the flow path 10.
  • Normalization was performed by calculating the rate of increase of the fluorescence intensity of each detection region and reference region obtained in each substrate per unit time as a fluorescence signal value and dividing the signal value of the detection region by the signal value of the reference region. .
  • a sample having a bile acid concentration of 0 was prepared and the fluorescence signal value was normalized in the same manner, and the signal value from a sample not containing bile acid was normalized.
  • Example 2 (1) Synthesis of Cortisol Oxime Derivative According to the literature (STEROIDS, 1974, Jan. 49-64), cortisol was enamined and reacted with a hydroxylamine derivative to synthesize cortisol oxime derivative-1.
  • pyrrolidine was added dropwise to a methanol suspension of cortisol (1 g), and the mixture was stirred at room temperature for 5 minutes. Enamine was formed in the reaction system, and the solution turned red. Then, another equivalent of pyrrolidine, and decolorized with addition of hydroxylamine derivative (NH 2 -O-CH 2 -COOH ) (0.35g), was carried out stirring, the oximation reaction temperature at 55 ° C.. The reaction proceeded smoothly and oxime derivative-1 of cortisol-1 (1.1 g: 84%) was obtained.
  • Cortisol-BSA conjugate-1 was prepared by the following method using the oxime derivative-1 of cortisol synthesized above.
  • Cortisol-BSA conjugate-1 was used as an antigen for immunization.
  • Cortisol-BSA conjugate-1 was subcutaneously administered to the back of the mouse with the initial immunization in an amount of 100 ⁇ g / mouse, and the second and subsequent immunizations in an amount of 50 ⁇ g / mouse. Went.
  • an emulsion mixed with complete adjuvant (CFA) was first administered, and for the second to fourth immunizations, an emulsion mixed with incomplete adjuvant (IFA) was administered.
  • CFA complete adjuvant
  • IFA incomplete adjuvant
  • Immunization was performed 4 times at 2-week intervals. Separately, blood was collected in the week following the third and fourth immunizations, and the antibody titer of 100 ⁇ L of the collected serum was measured by ELISA. The antibody titer was confirmed to be the target value, and the immunization 2 weeks after the fourth immunization was used as the final immunization, and the conjugate as the antigen was phosphate buffer (PBS, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) PH 7.1 to 7.3) The solution was diluted and dissolved in 1 mL and administered into the abdominal cavity of mice. Three days after administration, the spleen of the mouse was removed.
  • PBS phosphate buffer
  • Spleen cells extracted from mice and mutant myeloma cells (myeloma: P3-X63-Ag8-U1) were mixed at a ratio of 7: 1, polyethylene glycol (PEG) was added, and the medium (RPMI) was centrifuged. (-1640 + 10 mass% FBS).
  • the suspended spleen cells were seeded on a 96-well plate so that the number of cells was 1.0 ⁇ 10 5 (cell / well).
  • a HAT medium was added, and the culture supernatant of the grown hybridoma was screened by an ELISA using an antibody measurement system.
  • the antigen for a measurement was diluted with PBS solution so that the antigen for a measurement might be set to 500 ng / mL, it added to the cup of ELISA, and left still, the antigen for a measurement was fixed to the bottom of the cup, and the supernatant liquid was removed.
  • an anti-mouse IgG HRP (horserishing peroxidase) labeled antibody was used as a secondary antibody against the antibody produced by the spleen cells to be measured.
  • Wells that were positive from the ELISA results were cultured using a 24-well plate, and 1 mL each of the culture supernatant was collected. Again, secondary screening was performed by ELISA using the same antibody measurement system. In the same well at the time of cell fusion, the top 6 wells with high ELISA signal were selected and placed in a vial.
  • the selected 15-well cells were further subjected to ELISA screening in the same manner, and antibodies were produced by the mouse ascites method (using 2 mice) for the cells in the top 1 well with the highest signal.
  • the antibody subclasses prepared above and the amount of antibody produced are shown in Table 5.
  • fluorescent particles blocked with anti-CRP antibody-1 were prepared as follows. To 357 ⁇ L of 2% by mass (solid content concentration) fluorescent latex particle aqueous solution (Invitrogen, average particle size 200 nm), 282 ⁇ L of 50 mM MES buffer (pH 6.0) solution was added, and 5 mg / mL prepared in (4) above. Of Cortisol Monoclonal Antibody-1 (15 ⁇ L) and 5 mg / mL CRP Antibody-1 Solution (75.5 ⁇ L) were added and stirred at room temperature for 15 minutes.
  • BSA-blocked fluorescent particles used as a comparative example were prepared as follows. To 357 ⁇ L of 2% by mass (solid content concentration) fluorescent latex particle aqueous solution (Invitrogen, average particle size 200 nm), 282 ⁇ L of 50 mM MES buffer (pH 6.0) solution was added, and 5 mg / mL prepared in (4) above. Of Cortisol Monoclonal Antibody-1 (15 ⁇ L) and 5 mg / mL BSA (150 ⁇ L) were added, and the mixture was stirred at room temperature for 15 minutes.
  • Cortisol Monoclonal Antibody-1 15 ⁇ L
  • 5 mg / mL BSA 150 ⁇ L
  • a plurality of substrates 1 were produced by spotting and drying a liquid containing slag.
  • a liquid containing the anti-mouse antibody-1 prepared in (5) (concentration: 50 ⁇ g / mL in 50 mM MES buffer pH 6, 150 mM NaCl) was spotted on the reference region of each substrate and dried.
  • a substrate using anti-CRP antibody-1 (2 mg) as a blocking agent was also produced. Thereafter, in the same manner as in Example 1, the substrate was washed and sealed in a flow path to produce a flow path type sensor chip. The schematic is shown in FIGS.
  • Normalization was performed by calculating the rate of increase of the fluorescence intensity of each detection region and reference region obtained in each substrate per unit time as a fluorescence signal value and dividing the signal value of the detection region by the signal value of the reference region. .
  • a sample with a cortisol concentration of 0 was prepared and the fluorescence signal value was normalized in the same manner, and the signal value from a sample not containing cortisol was normalized.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
  • Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)

Abstract

本発明の課題は、血中に存在する抗血清アルブミン抗体などの抗体の影響を回避して、生体試料中の測定対象物質を高い精度で定量することができるキット及び方法を提供することである。本発明によれば、測定対象物質と結合性を有する第一の結合物質と第一のブロッキング剤とを有する標識粒子；及び上記測定対象物質又は上記第一の結合物質の何れかと結合性を有する第二の結合物質と第二のブロッキング剤とを有する検出領域を含む基板；を含む生体試料中の測定対象物質を定量するためのキットであって、上記第一のブロッキング剤と上記第二のブロッキング剤とがそれぞれ互いに異なる、キットが提供される。

Description

生体試料中の測定対象物質を定量するためのキット及び生体試料中の測定対象物質を定量する方法
　本発明は、生体試料中の測定対象物質を定量するためのキット及び生体試料中の測定対象物質を定量する方法に関する。
　生体試料に含まれるタンパク質、酵素又は無機化合物などの測定対象物質を定量するための高感度かつ容易な測定法として蛍光検出法が広く用いられている。蛍光検出法は、特定波長の光により励起されて蛍光を発する測定対象物質を含むと考えられる試料に上記特定波長の励起光を照射した際に発する蛍光を検出することによって測定対象物質の存在を確認する方法である。測定対象物質が蛍光体でない場合、測定対象物質と特異的に結合する物質を蛍光色素で標識した物質を、試料に接触させ、その後上記と同様にして、励起光を照射した際に発する蛍光を検出することにより、測定対象物質の存在を確認することができる。
　上記の蛍光検出法において、検出の感度を向上させるため、プラズモン共鳴による電場増強の効果を利用する方法が知られている。この方法では、プラズモン共鳴を生じさせるため、透明な支持体上の所定領域に金属膜を設けたセンサチップを用意する。そして、支持体と金属膜との界面に対して支持体における金属膜形成面の反対面側から全反射角以上の角度で励起光を入射させる。この励起光の照射により金属膜に表面プラズモンが発生し、この表面プラズモンの発生による電場増強作用によって蛍光が増強され、シグナル／ノイズ比（Ｓ／Ｎ比）が向上することとなる。表面プラズモン励起による蛍光検出法（Ｓｕｒｆａｃｅ　Ｐｌａｓｍｏｎ　Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ、以下、「ＳＰＦ法」とする）は、落射励起による蛍光検出法（以下、「落射蛍光法」とする）と比較して約１０倍のシグナル増強度が得られ、高感度に測定することができる。
　上記したような測定対象物質の定量においては、ブロッキング剤としてアルブミンを使用することが知られている。特許文献１には、 蛍光ナノ粒子を用いた免疫染色により、含アミノ基シランカップリング剤で処理した基材ガラスの表面に固定した病理組織中の抗原を検出する免疫染色方法であって、含アミノ基シランカップリング剤で処理した基材ガラスの表面に固定した病理組織に対して、ブロッキング剤を添加する工程と、抗原に反応する抗体を上記病理組織に添加する工程と、含アミノ基シランカップリング剤中のアミノ基と反応可能な官能基を有する化合物（１）を添加し、室温下に所定時間静置する工程と、抗体と反応して結合可能な官能基を有する蛍光ナノ粒子を添加する工程とからなることを特徴とする免疫染色方法が記載され、ブロッキング剤の一例としてウシ血清アルブミンが記載されている。特許文献２には、水分散型高分子粒子を担体とし、担体の表面に被検物質に対する特異的結合物質と、非特異的吸着のブロッキング剤とを有してなる特異的結合体が記載されており、非特異的吸着のブロッキング剤の一例として、ウシ血清アルブミンが記載されている。
特開２０１４－２３５０８１号公報 特開２００１－２１５６３号公報
　上記のとおり、簡易的な測定方法で高感度に測定が可能な方法としては、表面プラズモン励起による蛍光検出法が知られているが、測定精度は十分に満足のいくものではなかった。即ち、常に精度よく測定対象物質を定量するためには、更に再現性の高い簡易的な測定方法が望まれている。
　本発明は、血中に存在する抗血清アルブミン抗体などの抗体の影響を回避して、生体試料中の測定対象物質を高い精度で定量することができるキット及び方法を提供することを解決すべき課題とした。
　本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、測定対象物質と結合性を有する第一の結合物質と第一のブロッキング剤とを有する標識粒子、及び上記測定対象物質又は上記第一の結合物質の何れかと結合性を有する第二の結合物質と、第一のブロッキング剤とは異なる第二のブロッキング剤とを有する検出領域を含む基板を用いて、生体試料中の測定対象物質を定量することによって、上記課題を解決できることを見出した。本発明はこれらの知見に基づいて完成したものである。即ち、本発明によれば、以下の発明が提供される。
（１）　測定対象物質と結合性を有する第一の結合物質と第一のブロッキング剤とを有する標識粒子；及び
　上記測定対象物質又は上記第一の結合物質の何れかと結合性を有する第二の結合物質と第二のブロッキング剤とを有する検出領域を含む基板；
を含む生体試料中の測定対象物質を定量するためのキットであって、上記第一のブロッキング剤と上記第二のブロッキング剤とがそれぞれ互いに異なる、キット。
（２）　上記第一のブロッキング剤と上記第二のブロッキング剤とがそれぞれ互いに異なるタンパク質である、（１）に記載のキット。
（３）　上記第一のブロッキング剤が、アルブミン及びグロブリンの一方であり、上記第二のブロッキング剤が、アルブミン及びグロブリンの他方である、（１）又は（２）に記載のキット。
（４）　上記第一のブロッキング剤がグロブリンであり、上記第二のブロッキング剤がアルブミンである、（３）に記載のキット。
（５）　上記アルブミンが、ウシ血清アルブミンである、（３）又は（４）に記載のキット。
（６）　上記グロブリンが、上記測定対象物質と結合性を有する免疫グロブリン以外の免疫グロブリンである、（３）から（５）の何れか一に記載のキット。
（７）　上記標識粒子が蛍光粒子であり、上記検出領域が金膜上にある、（１）から（６）の何れか一に記載のキット。
（８）　生体試料中の測定対象物質を定量する方法であって、
　生体試料を、測定対象物質と結合性を有する第一の結合物質と第一のブロッキング剤とを有する標識粒子と反応させる反応工程；及び
　上記測定対象物質又は上記第一の結合物質の何れかと結合性を有する第二の結合物質と第二のブロッキング剤とを有する検出領域を含む基板に、上記反応工程で得られた反応産物を接触させて、標識粒子を基板上に捕捉させ、上記測定対象物質の量に関連した標識情報を取得する、測定対象物質関連標識情報取得工程；
を含み、上記第一のブロッキング剤と上記第二のブロッキング剤とがそれぞれ互いに異なる、方法。
（９）　上記第一のブロッキング剤と上記第二のブロッキング剤とがそれぞれ互いに異なるタンパク質である、（８）に記載の方法。
（１０）　上記第一のブロッキング剤が、アルブミン及びグロブリンの一方であり、上記第二のブロッキング剤が、アルブミン及びグロブリンの他方である、（８）又は（９）に記載の方法。
（１１）　上記第一のブロッキング剤がグロブリンであり、上記第二のブロッキング剤がアルブミンである、（１０）に記載の方法。
（１２）　上記アルブミンが、ウシ血清アルブミンである、（１０）又は（１１）に記載の方法。
（１３）　上記グロブリンが、上記測定対象物質と結合性を有する免疫グロブリン以外の免疫グロブリンである、（１０）から（１２）の何れか一に記載の方法。
（１４）　上記標識粒子が蛍光粒子であり、上記検出領域が金膜上にある、（８）から（１３）の何れか一に記載の方法。
（１５）　表面プラズモン励起による蛍光検出により、測定対象物質の量に関連した標識情報を取得する、（１４）に記載の方法。
　本発明のキット及び方法によれば、生体試料中の測定対象物質を高い精度で定量することができる。
図１は、本発明のキットに含まれるセンサチップの概略図を示す。 図２は、本発明のキットに含まれるセンサチップの分解図を示す。
　以下、本発明についてさらに詳細に説明する。
［生体試料中の測定対象物質を定量するためのキット］
　本発明による生体試料中の測定対象物質を定量するためのキットは、測定対象物質と結合性を有する第一の結合物質と第一のブロッキング剤とを有する標識粒子；及び上記測定対象物質又は上記第一の結合物質の何れかと結合性を有する第二の結合物質と第二のブロッキング剤とを有する検出領域を含む基板；を含み、上記第一のブロッキング剤と上記第二のブロッキング剤とがそれぞれ互いに異なる、キットである。
　測定精度をさらに改善するという課題に鑑みて、本発明においては、標識粒子上のブロッキング剤（第一のブロッキング剤）及び基板の検出領域上のブロッキング剤（第二のブロッキング剤）として、それぞれ互いに異なるブロッキング剤を使用することによって、測定精度が高い定量キット及び定量方法を提供することが可能になった。即ち、本発明においては、第一のブロッキング剤及び第二のブロッキング剤がそれぞれ互いに異なることにより、生体試料中に存在する可能性がある抗体成分の影響を回避することができ、これにより測定精度の向上を達成している。例えば、第一のブロッキング剤及び第二のブロッキング剤としてウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を使用した場合には、生体試料中に抗ＢＳＡ抗体が存在すると、基板の検出領域と標識粒子とが抗ＢＳＡ抗体を介して結合してしまい、正確な定量を行なえなくなるが、本発明の構成を採用することにより、上記したような抗ＢＳＡ抗体を介した結合は回避することができる。
（生体試料）
　生体試料としては、測定対象物質を含む可能性のある試料である限り、特に限定されるものではなく、例えば、生物学的試料、特には動物（例えば、ヒト、イヌ、ネコなど）の体液（例えば、血液、血清、血漿、髄液、涙液、汗、尿、膿、鼻水、又は喀痰）若しくは排泄物（例えば、糞便）、臓器、組織、粘膜や皮膚などを挙げることができる。
（測定対象物質）
　測定対象物質としては、特に限定されないが、例えば、胆汁酸、コルチゾール、コレステロール、タンパク質などが挙げられる。
　胆汁酸は、哺乳類の胆汁に存在するステロイド誘導体でコラン酸骨格を有する化合物の総称であり、代表的なものとして、コール酸、デオキシコール酸、及びケノデオキシコール酸が挙げられる。
　胆汁酸の主な役割は、消化管内でミセルの形成を促進し、食物脂肪をより吸収しやすくするものである。肝臓で生合成されたものを一次胆汁酸という。また一部は腸管で微生物による変換を受け、その代謝物は二次胆汁酸と呼ばれる。胆汁酸は、通常グリシンやタウリンと結び付いており、これらは抱合胆汁酸（胆汁酸塩）と呼ばれる。
　イヌ及びネコにおける血清胆汁酸濃度を測定する迅速で簡便な方法は、肝細胞機能及び腸肝門脈循環を反映する高感度で特異的な検査として認識されるようになった。血清胆汁酸に関する研究では、特に、臨床兆候が不明瞭で解釈できない高い肝酵素活性を示しているが黄疸を伴わないイヌとネコにおいて、臨床的に確定診断が必要な肝胆道系疾患を検出するために血清胆汁酸の有用性が示されている。また、先天性門脈体循環シャントの診断において診断率を高めるために空腹時及び食後の胆汁酸定量が勧められている。胆汁酸濃度が、高値の場合は、急性肝炎、慢性肝疾患、胆汁うっ帯、腸内細菌過剰増殖、門脈シャント(ｐｏｒｔｏｓｙｓｔｅｍｉｃ　ｓｈｕｎｔ；ＰＳＳ) 等が疑われる。一方、胆汁酸濃度が、低値の場合は、腸管吸収不良が疑われる。
　このような胆汁酸は、わずかに構造が異なる化合物の集合体として存在し、具体的には１０種類の化合物が存在する。イヌ及びネコの場合には、胆汁酸としては、 コール酸、デオキシコール酸及びケノデオキシコール酸の３種類でほぼ１００％が占められている。例えば、イヌの血液中の３種類の構造違いの胆汁酸の比率は、平均値で表すと、コール酸：デオキシコール酸：ケノデオキシコール酸＝７４％：２０％：６％の割合となる（日本獣医学雑誌、52（2）1990）。コール酸、デオキシコール酸及びケノデオキシコール酸の構造を以下に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
（第一の結合物質）
　本発明で用いる第一の結合物質は、測定対象物質と結合性を有する物質である。第一の結合物質としては、抗原、抗体、又はこれらの複合体を使用できるが、これらに限定されるものではない。好ましくは、第一の結合物質は抗体である。第一の結合物質が抗体である場合は、測定対象物質と結合性を有する抗体として、例えば、その測定対象物質によって免疫された動物の血清から調製する抗血清や、抗血清から精製された免疫グロブリン画分、その測定対象物質によって免疫された動物の脾臓細胞を用いる細胞融合によって得られるモノクローナル抗体、あるいは、それらの断片［例えば、Ｆ（ａｂ’）2、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、又はＦｖ］などを用いることができる。これらの抗体の調製は、常法により行なうことができる。さらに、その抗体がキメラ抗体などの場合のように、修飾を加えられたものでもよいし、また市販の抗体でも、動物血清又は培養上清から公知の方法により調製した抗体でも使用可能である。
　例えば、測定対象物質が胆汁酸である場合、第一の結合物質としては、胆汁酸に結合性を有する（好ましくは、胆汁酸を特異的に認識する）抗胆汁酸抗体を使用する。胆汁酸には、コール酸、デオキシコール酸及びケノデオキシコール酸が含まれることから、本発明においては、第一の結合物質として、抗コール酸抗体、抗デオキシコール酸抗体及び抗ケノデオキシコール酸抗体を作製し、上記３種類の抗体を使用することができる。
　抗コール酸抗体、抗デオキシコール酸抗体及び抗ケノデオキシコール酸抗体の具体的な作製方法として、例えば抗コール酸抗体の作製方法を例に挙げて以下に説明する。
　コール酸と、牛血清アルブミン（Ｂｏｖｉｎｅ　Ｓｅｒｕｍ　Ａｌｂｕｍｉｎ、以下ＢＳＡと略す）と、縮合剤を混合してコール酸・ＢＳＡ結合体を作製することができる。結合体をマウス免疫感作抗原として用いて、数回、マウス背部皮下に免疫する。この場合、完全アジュバント（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ　Ｆｒｅｕｎｄ‘ｓ　Ａｄｊｕｖａｎｔ：ＣＦＡ）、及び／又は不完全アジュバント（Ｉｎｃｏｍｐｌｅｔｅ　Ｆｒｅｕｎｄ‘ｓ　Ａｄｊｕｖａｎｔ：ＩＦＡ）を適宜選択して免疫感作抗原と混合して使用することができる。完全アジュバントとは、免疫を刺激する物質であって、パラフィンとアラセルの混合物である。不完全アジュバントとは、完全アジュバントに死滅したミコバクテリア又は結核菌の死菌を加え、抗原性をさらに増強させたものである。数週間で数回、適宜免疫感作を行った後にマウスから採血し抗体価の測定を実施する。抗体価の十分な上昇が認められた場合に腹腔内に抗原を投与し、数日後に脾臓を摘出する。こうして免疫マウスより摘出した脾臓細胞を、変異株骨髄腫細胞（ミエローマ）と融合させることで、抗体産生能力を備えた融合細胞を作製することができる。この融合細胞の中から目的とする抗原に対する抗体産生細胞のみを選択し、さらにその細胞株だけを増殖するために限界希釈を行う。希釈後の細胞の培養（クローニング）を行うことができる。このようにして得られる融合細胞株を、マウスの腹腔内に注射して、腹水型の抗体産生細胞を増殖させることによってモノクローナル抗体を腹水中に産生することが可能となり、これらの抗体を回収することで、目的の抗体を入手することができる。
　測定対象物質がコルチゾールである場合、第一の結合物質としては、コルチゾールに結合性を有する（好ましくは、コルチゾールを特異的に認識する）抗コルチゾール抗体を使用することができる。抗コルチゾール抗体の製造は、上記した抗コール酸抗体の作製方法に準じて行うことができる。
（標識粒子）
　本発明で用いる標識粒子としては、免疫反応に通常用いられ得る標識を有する粒子を使用することができる。標識粒子としては、免疫反応に通常用いられ得る蛍光で着色された蛍光粒子を使用することができ、あるいは酵素で標識された粒子、などを使用することもできる。
　蛍光粒子としては、例えば、蛍光ポリスチレンビーズなどの蛍光高分子粒子、蛍光ガラスビーズ等の蛍光ガラス粒子を用いることができる。蛍光粒子の材質の具体例としては、スチレン、メタクリル酸、グリシジル（メタ）アクリレート、ブタジエン、塩化ビニル、酢酸ビニルアクリレート、メチルメタクリレート、エチルメタクリレート、フェニルメタクリレート、又はブチルメタクリレートなどのモノマーを用いた高分子、又は２種以上のモノマーを用いた共重合体などの合成高分子粉末があり、これらを均一に懸濁させたラテックスが好ましい。また、その他の有機高分子粉末、無機物質粉末、微生物、血球、細胞膜片、又はリポソームなどが挙げられる。
　標識粒子としてラテックス粒子を使用する場合、ラテックスの材質の具体例としては、ポリスチレン、スチレン－アクリル酸共重合体、スチレン－メタクリル酸共重合体、スチレン－グリシジル（メタ）アクリレート共重合体、スチレン－スチレンスルホン酸塩共重合体、メタクリル酸重合体、アクリル酸重合体、アクリロニトリル－ブタジエン－スチレン共重合体、塩化ビニル－アクリル酸エステル共重合体、及びポリ酢酸ビニルアクリレートなどが挙げられる。ラテックスとしては、単量体としてスチレンを少なくとも含む共重合体が好ましく、スチレンと、アクリル酸又はメタクリル酸との共重合体が特に好ましい。ラテックスの作製方法は特に限定されず、任意の重合方法により作製することができる。但し、抗体標識の際に界面活性剤が存在すると抗体固定化が困難となるため、ラテックスの作製は、無乳化剤乳化重合、即ち界面活性剤などの乳化剤を用いない乳化重合により行うことが好ましい。
　重合により得られたラテックス自体が蛍光性である場合には、そのまま蛍光ラテックス粒子として使用することができる。重合により得られたラテックスが非蛍光性の場合には、ラテックスに蛍光物質（蛍光色素など）を添加することによって、蛍光ラテックス粒子を作製することができる。即ち、蛍光ラテックス粒子は、水及び水溶性有機溶剤を含むラテックス粒子の溶液に蛍光色素を添加して攪拌することなどにより製造できる。
　蛍光色素を含有したリポゾ－ムやマイクロカプセル等も蛍光粒子として使用することができる。蛍光発色は、紫外光等を吸収して励起し、基底状態に戻る際に放出されるものであれば特に制限されるものではなく、例えば、黄緑（励起波長５０５ｎｍ／放出波長５１５ｎｍ、以下同じ）、青（３５０～３５６ｎｍ／４１５～４４０ｎｍ）、赤（５３５～５８０ｎｍ／５７５～６０５ｎｍ）、オレンジ（５４０ｎｍ／５６０ｎｍ）、レッド・オレンジ（５６５ｎｍ／５８０ｎｍ）、クリムゾン（６２５ｎｍ／６４５ｎｍ）、ダークレッド（６６０ｎｍ／６８０ｎｍ）などの蛍光発色が用いられ得る。これらの蛍光を発する蛍光粒子は、例えば、Thermo Fisher 社から入手可能であり、同社においてFluoSpheres（登録商標）の商品名で市販されている。
　標識粒子の平均粒径は、粒子の材質や測定対象物質を定量する濃度範囲、測定機器などによって異なるが、０．００１～１０μｍ（より好ましくは０．００１～１μｍ）の範囲が好ましい。
（平均粒径の測定方法）
　標識粒子の平均粒径は、市販の粒度分布計等で計測することが可能である。粒度分布の測定法としては、光学顕微鏡法、共焦点レーザー顕微鏡法、電子顕微鏡法、原子間力顕微鏡法、静的光散乱法、レーザー回折法、動的光散乱法、遠心沈降法、電気パルス計測法、クロマトグラフィー法、超音波減衰法等が知られており、それぞれの原理に対応した装置が市販されている。
　粒径範囲及び測定の容易さから、本発明においては動的光散乱法を用いることが好ましい。動的光散乱を用いた市販の測定装置としては、ナノトラックＵＰＡ（日機装（株））、動的光散乱式粒径分布測定装置ＬＢ－５５０（（株）堀場製作所）、濃厚系粒径アナライザーＦＰＡＲ－１０００（大塚電子（株））、ＺＥＴＡ　ＳＩＺＥＲ　Ｎａｎｏ ｓｅｒｉｅｓ（マルバーン社）等が挙げられ、本発明においては、２５℃の測定温度で測定したメジアン径（ｄ＝５０）の値として求める。
（第一の結合物質による標識粒子の修飾）
　第一の結合物質を標識粒子に固定化する方法は、例えば、特開２０００－２０６１１５号公報やThermo Fisher 社FluoSpheres（登録商標）ポリスチレンマイクロスフィアF8813に添付のプロトコールなどに記載されており、免疫凝集反応用試薬を調製する公知の方法がいずれも使用可能である。また、結合物質として抗体を粒子に固定化する原理として、物理吸着及び共有結合による化学結合のいずれの原理も採用可能である。抗体を粒子に固定させた後に抗体が被覆されていない粒子表面を覆うブロッキング剤（即ち、第一のブロッキング剤）としては、例えば、アルブミン（ＢＳＡなど）、スキムミルク、カゼイン、大豆由来成分、魚由来成分、又はポリエチレングリコールなど、並びに上記物質又は上記物質と性質が同じである物質を含む市販の免疫反応用ブロッキング剤などが使用可能である。これらのブロッキング剤は、必要に応じて熱や酸・アルカリ等により部分変性などの前処理を施すことも可能である。さらに、第一のブロッキング剤としては、測定対象物質と結合性を有しない抗体（グロブリン）、あるいはテストエリアに使用しないタンパク質（Protein A、Protein G）などを使用することもできる。
　抗体を粒子に固定化する具体的な方法を、以下に例示する。粒子の固形分濃度が０．１～１０質量％になるよう分散させた液に、０．０１～２０ｍｇ／ｍＬの濃度に調整した抗体溶液を添加して、混合する。温度４～５０℃の条件下で５分間～４８時間撹拌を継続する。次いで遠心分離その他の方法により粒子と溶液を分離して、溶液に含まれている、粒子に結合しなかった抗体を十分に除去する。その後、粒子を緩衝液にて洗浄する操作を０～１０回繰り返す。粒子と抗体とを混合して、粒子に抗体を結合させる操作を実施した後に、抗原抗体反応に関与しない成分、好ましくはタンパク質、より好ましくはグロブリン、アルブミン、ブロックエース（登録商標）、スキムミルク及びカゼインなどのブロッキング剤を使用して粒子表面の抗体が結合していない部分を保護することが望ましい。
　抗原や抗体等を粒子に固定化する際に、安定化剤を必要に応じて添加可能である。安定化剤とは、ショ糖や多糖類などの合成高分子あるいは天然高分子など、抗原や抗体を安定化するものであれば特に制限されず、Immunoassay Stabilizer（Advanced Biotechnologies Inc （ABI社））などの市販の安定化剤も使用可能である。
　第一の結合物質を有する標識粒子は本発明のキットに含まれており、キットの一部である容器、たとえばカップに含まれている態様が好ましい。この場合、生体試料を、標識粒子を含む容器に注入して混合、攪拌することにより、生体試料中の測定対象物質と第一の結合物質とを結合させることができる。
（基板）
　本発明では、高感度な測定を達成するために、後述する表面プラズモン蛍光（ＳＰＦ）検出を行う測定法を採用することが好ましい。この場合における基板としては、表面に金属膜を有する基板を使用することが好ましい。金属膜を構成する金属としては、表面プラズモン共鳴が生じ得るようなものであれば特に限定されない。好ましくは金、銀、銅、アルミニウム、又は白金等の自由電子金属が挙げられ、特に金が好ましい。金を使用する場合、後記する検出領域は、金膜上にある。上記の金属は単独又は組み合わせて使用することができる。また、上記基板への付着性を考慮して、基板と金属からなる層との間にクロム等からなる介在層を設けてもよい。金属膜の膜厚は任意であるが、例えば、１ｎｍ以上５００ｎｍ以下であるのが好ましく、特に１０ｎｍ以上２００ｎｍ以下であるのが好ましい。５００ｎｍを超えると、媒質の表面プラズモン現象を十分検出することができない。また、クロム等からなる介在層を設ける場合、その介在層の厚さは、０．１ｎｍ以上、１０ｎｍ以下であることが好ましい。
　金属膜の形成は常法によって行えばよく、例えば、スパッタ法、蒸着法、イオンプレーティング法、電気めっき法、又は無電解めっき法等によって行うことができるが、基板材質と金属膜との混合層を設けて、金属膜の密着性を良くするためには、スパッタ法により金属膜を作製することが好ましい。この場合、基板材質と金属膜との混合層の厚さは十分な密着性が確保できれば特に制限はないが、１０ｎｍ以下が好ましい。
　金属膜は好ましくは基板上に配置されている。ここで、「基板上に配置される」とは、金属膜が基板上に直接接触するように配置されている場合のほか、金属膜が基板に直接接触することなく、他の層を介して配置されている場合をも含む。本発明で使用することができる基板の材質としては例えば、一般的な光学ガラスの一種であるＢＫ７（ホウ珪酸ガラス）等の光学ガラス、あるいは合成樹脂、具体的にはポリメチルメタクリレート、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネート、又はシクロオレフィンポリマーなどのレーザー光に対して透明な材料からなるものが使用できる。このような基板は、好ましくは、偏光に対して異方性を示さずかつ加工性の優れた材料が望ましい。
　ＳＰＦ検出のための基板の好ましい態様としては、ポリメチルメタクリレート(ＰＭＭＡ)に金膜を蒸着した基板などを挙げることができる。
　基板は、測定対象物質又は第一の結合物質の何れかと結合性を有する第二の結合物質を有する検出領域を備えている。
（第二の結合物質）
　第二の結合物質は、測定対象物質と結合性を有する物質であるか、又は第一の結合物質と結合性を有する物質である。定量をサンドイッチアッセイ法で行う場合には、第二の結合物質として、測定対象物質と結合性を有する物質を使用することができる。定量を競合法で行う場合には、第二の結合物質として、第一の結合物質と結合性を有する物質を使用することができる。本発明においては、定量を競合法で行うことが好ましく、第二の結合物質として、第一の結合物質と結合性を有する物質を使用することが好ましい。
　第二の結合物質としては、特に限定されないが、好ましい例としては、抗原、抗体、又はこれらの複合体が挙げられるが、好ましくは、抗原であり、第二の結合物質として、測定対象物質（これは、第一の結合物質と結合性を有する物質である）を使用することが特に好ましい。
　第二の結合物質として、測定対象物質を使用する場合には、第二の結合物質は、測定対象物質とキャリアとの結合体であることが好ましい。キャリアとは、測定対象物質の複数の分子が結合可能な物質を意味する。好ましいキャリアの一例としては、タンパク質などが挙げられ、その中でも具体的には、ウシ血清アルブミン等を挙げることができる。
　測定対象物質が胆汁酸である場合、第二の結合物質は、コール酸及び／又はコール酸アルブミン結合体、デオキシコール酸及び／又はデオキシコール酸・アルブミン結合体、並びにケノデオキシコール酸及び／又はケノデオキシコール酸・アルブミン結合体を含むことが特に好ましい。また、測定対象物質がコルチゾールである場合は、第二の結合物質は、コルチゾール・アルブミン結合体であることが好ましい。
（第二の結合物質を基板に固定化する方法）
　第二の結合物質を基板に固定化する方法は、例えば、Ｎｕｎｃ社の提供するＴｅｃｈ　Ｎｏｔｅｓ　Ｖｏｌ．２－１２などに記載されており、一般的なＥＬＩＳＡ（Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay：酵素結合免疫吸着法）試薬を調製する公知の方法がいずれも使用可能である。また、基板上に自己組織化単分子膜（ＳＡＭ：Self-Assembled Monolayer）などを配することによる表面修飾を施しても良く、第二の結合物質を基板に固定化する方法としては、物理吸着を用いた方法、及び共有結合による化学結合を用いた方法のいずれの方法も採用可能である。第二の結合物質を基板に固定させた後に、第二の結合物質が被覆されていない基板表面を覆うブロッキング剤（第二のブロッキング剤）としては、公知の物質、例えば、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、グロブリン、スキムミルク、カゼイン、大豆由来成分、魚由来成分又はポリエチレングリコールなど、並びに上記物質又は上記物質と性質が同じである物質を含む市販の免疫反応用ブロッキング剤などが使用可能である。これらのブロッキング剤は、必要に応じて熱や酸・アルカリ等により部分変性などの前処理を施すことも可能である。
（検出領域＜テストエリア＞）
　本発明は、基板上に生体試料中の測定対象物質の有無を検出するテストエリアを設けることができる。このテストエリアでは、例えば測定対象物質である抗原を捕まえて、抗原に結合した標識の量を検出し定量することで、抗原を定量することが可能となる。あるいは、抗原に結合した標識のみを結合できないようにし、抗原に結合していない標識のみを捕獲して、抗原の結合した標識の量を算出する方法により、抗原を定量することが可能となる。この検出方法は競合法と呼ばれているが、ここでは、競合法に関する基板について説明する。
　基板のテストエリアには、標識粒子上に存在する結合物質（例えば抗体）と反応するサイトを有することが好ましい。本発明の好ましい一態様としては、生体試料中に存在する抗原を、基板のテストエリア上に有する態様が好ましい。この場合、抗原とＢＳＡを縮合剤の存在下で反応させて、抗原・ＢＳＡ結合体を作製し、この結合体をテストエリア上に吸着させることでテストエリアを作製することが可能となる。測定対象物質である抗原－ＢＳＡ結合体は、緩衝液に溶解させて、基板上に点着して、一定時間放置した後、上清を吸引し、乾燥させるなどの方法で基板上のテストエリアに結合させることが可能である。
（参照領域＜コントロールエリア＞）
　本発明では、測定環境、特に測定温度の影響を極力抑えるために、基板上にコントロールエリアを有し、テストエリアの情報を、コントロールエリアの情報で規格化することによって、環境依存性を非常に低く抑えることが可能となる。コントロールエリアとしては、使用する生体試料の中に存在する測定対象物質の量に依存せず、すべての標識と結合することが可能なように設計されていることが好ましい。標識粒子上に存在する抗体すべてに相互作用する抗体を有することが好ましい。このように設計することによって、テストエリアの情報をコントロールエリアの情報で規格化することにより、例えば、低温環境で、生体試料の流れや、反応速度が影響を受けた場合でも、規格化によってその影響をキャンセルして、常に精度よく、測定環境に影響されない結果を得ることが可能になる。
　コントロールエリアに存在させる好ましい抗体としては、標識粒子上に存在する結合物質（例えば、抗体）を認識する機能をもち、その抗体がマウス由来であれば、抗マウス抗体であることが好ましく、標識粒子上の抗体が、ヤギ由来であれば、抗ヤギ抗体であることが好ましい。これらコントロールエリア上の抗体は、緩衝液に溶解させて、基板上に点着して、一定時間放置した後、上清を吸引し、乾燥させるなどの方法で基板に結合させることが可能である。
（ブロッキング剤）
　例えば、競合法において、測定対象物質を含まない陰性となる生体試料だけでなく、測定対象物質を含む陽性となる生体試料に対しても反応して陰性となる生体試料が存在しており、高値乖離の問題の解決が課題として認識されている。このような擬陰性を示す原因は明確にはなっていないが、抗体に覆われていない標識粒子表面と、検出領域（テストエリア）との非特異的な相互作用により、本来結合してほしくない標識粒子が存在することが原因の一つではないかと考えられている。また、テストエリア上に存在する物質と同じ物質が標識粒子表面上に存在する場合にも、遊離した抗体などが生体試料中に存在する場合には、その抗体が、テストエリア上に存在する物質と、標識粒子表面上の物質のどちらにも結合することで、測定対象物質を含む陽性となる生体試料を測定した場合においても陰性として検出される場合がある。
　一般的に、固相表面（例えば標識粒子表面、基板の金膜表面）、への非特異吸着抑制のためにＢＳＡでのブロッキングが用いられているが、ある特定の生体試料中にＢＳＡに反応する抗ＢＳＡ抗体が存在する場合には、標識粒子上のＢＳＡと基板上のＢＳＡとの間で架橋するように反応し、高値乖離を起こす場合がある。
　本発明においては、第一のブロッキング剤と第二のブロッキング剤とがそれぞれ互いに異なるものとすることによって、上記問題を解決している。
　好ましくは、第一のブロッキング剤と第二のブロッキング剤とはそれぞれ互いに異なるタンパク質である。第一のブロッキング剤と第二のブロッキング剤の具体例は、本明細書中上記の通りである。好ましくは、第一のブロッキング剤は、アルブミン及びグロブリンの一方であり、第二のブロッキング剤が、アルブミン及びグロブリンの他方である。より好ましくは、第一のブロッキング剤がグロブリン（より好ましくは、測定対象物質と結合性を有する免疫グロブリン以外の免疫グロブリン）であり、第二のブロッキング剤がアルブミン（より好ましくはウシ血清アルブミン）である。
　測定対象物質と結合性を有する免疫グロブリン以外の免疫グロブリンとして具体的には、測定対象物質とは異なる抗原によって免疫された動物の血清から調製する抗血清、抗血清から精製された免疫グロブリン画分、その測定対象物質によって免疫された動物の脾臓細胞を用いる細胞融合によって得られるモノクローナル抗体、あるいは、それらの断片［例えば、Ｆ（ａｂ’）2、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、又はＦｖ］などを用いることが可能である。これらの抗体の調製は、常法により行なうことができる。さらに、その抗体がキメラ抗体などの場合のように、修飾を加えられたものでもよいし、また市販の抗体でも、動物血清や培養上清から公知の方法により調製した抗体も使用可能である。本発明では、第一のブロッキング剤として、特に抗ＣＲＰ（C反応性蛋白）抗体を使用する態様が好ましい。
（抗体）
　本発明において、抗体は、その動物種やサブクラス等によらず使用できる。例えば、本発明に用いることが可能な抗体は、マウス、ラット、ハムスター、ヤギ、ウサギ、ヒツジ、ウシ、ニワトリなど免疫反応が起こり得る生物に由来する抗体、具体的には、マウスＩｇＧ、マウスＩｇＭ、ラットＩｇＧ、ラットＩｇＭ、ハムスターＩｇＧ、ハムスターＩｇＭ、ウサギＩｇＧ、ウサギＩｇＭ、ヤギＩｇＧ、ヤギＩｇＭ、ヒツジＩｇＧ、ヒツジＩｇＭ、ウシＩｇＧ、ウシＩｇＭ、トリＩｇＹ等であり、ポリクローナル又はモノクローナルのどちらも使用可能である。断片化抗体は、少なくとも１つの抗原結合部位を持つ、完全型抗体から導かれた分子であり、具体的にはＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）2等である。これらの断片化抗体は、酵素あるいは化学的処理によって、もしくは遺伝子工学的手法を用いて得られる分子である。
（キットの他の要素）
　本発明のキットは、測定対象物質を測定する方法に用いられるものであり、測定対象物質が胆汁酸である場合には、胆汁酸測定診断用のキットであり、測定対象物質がコルチゾールである場合には、コルチゾール測定診断用のキットである。本発明において、測定対象物質の測定を実施するに当たり、第二の結合物質を固定した基板と、蛍光粒子などの標識粒子を保持した部材を含むセンサチップを含むものであるが、表面プラズモン励起装置、及び蛍光測定デバイスなどの、測定対象物質の測定に使用される各種の器材又は装置を含めてもよい。さらに、キットの要素として、既知量の測定対象物質を含む試料、取扱説明書などを含めてもよい。
［生体試料中の測定対象物質を定量する方法］
　本発明による生体試料中の測定対象物質を定量する方法は、
　生体試料を、測定対象物質と結合性を有する第一の結合物質と第一のブロッキング剤とを有する標識粒子と反応させる反応工程；及び
　上記測定対象物質又は上記第一の結合物質の何れかと結合性を有する第二の結合物質と第二のブロッキング剤とを有する検出領域を含む基板に、上記反応工程で得られた反応産物を接触させて、標識粒子を基板上に捕捉させ、上記測定対象物質の量に関連した標識情報を取得する、測定対象物質関連標識情報取得工程；
を含み、第一のブロッキング剤と第二のブロッキング剤とがそれぞれ互いに異なる、方法である。
　本発明においては、測定対象物質の量に関連した標識情報を取得する測定対象物質関連標識情報取得工程により、測定対象物質を定量する。
　本発明における定量は、測定対象物質の量の測定である限り、最も広い概念として解釈される。測定方法の具体的な実施態様としては、競合法及びサンドイッチ法が挙げられるが、競合法が好ましい。
　競合法の一例として、胆汁酸を定量する場合を以下に説明する。胆汁酸以外の物質を定量する場合も、同様に実施することができる。
　競合法では、先ず、胆汁酸／アルブミン比が７以上１４以下である胆汁酸・アルブミン結合体が固定化されている胆汁酸免疫測定用基板に、胆汁酸を含む生体試料及び抗胆汁酸抗体標識蛍光粒子を接触させる。その生体試料中に胆汁酸が存在しない場合には、抗胆汁酸抗体標識蛍光粒子と、基板上の胆汁酸（即ち、胆汁酸・アルブミン結合体中の胆汁酸）とにより、基板上で抗原抗体反応が起こる。一方、生体試料中に胆汁酸が存在する場合には、生体試料中の胆汁酸と抗胆汁酸抗体標識蛍光粒子との間で抗原抗体反応が起こり、抗胆汁酸抗体標識蛍光粒子と、基板上の胆汁酸（即ち、胆汁酸・アルブミン結合体中の胆汁酸）との間の抗原抗体反応が阻害される。上記の反応が終了した後、基板上のアルブミンに結合しなかった抗胆汁酸抗体標識蛍光粒子を除去する。次いで基板上の免疫複合体（即ち、抗胆汁酸抗体標識蛍光粒子と、基板上の胆汁酸・アルブミン結合体中の胆汁酸との複合体）の形成の度合いを蛍光強度として検出することにより、生体試料中の胆汁酸の濃度などを測定することができる。
　競合法における蛍光の測定形態は、プレートリーダー測定、あるいはフロー測定のいずれかの測定を採用することが可能であり、例えば、以下の方法により測定することができる。予め、胆汁酸濃度が異なる胆汁酸量既知の試料を複数用意し、この試料及び抗胆汁酸抗体標識蛍光粒子を予め混合する。この混合液を、胆汁酸・アルブミン結合体が固定化されている領域に接触させる。胆汁酸・アルブミン結合体が固定化されている領域からの蛍光信号を、特定の時間間隔で混合液が結合体に接触している間、複数の蛍光信号として測定する。この複数の蛍光信号から、各胆汁酸濃度において、蛍光量の時間変化（傾き）を求める。この時間変化をＹ軸、胆汁酸濃度をＸ軸としてプロットし、最小二乗法等の適宜ふさわしいフィッティング方法を用いて、蛍光量の時間変化に対する胆汁酸濃度の関係式を取得する。このように取得した関係式に基づき、検査目的とする生体試料を用いた蛍光量の時間変化の結果を用いて、生体試料に含まれる胆汁酸量を定量することができる。
　この胆汁酸量の定量は、短時間で行うことが好ましい。具体的には、１０分以内に行われることが好ましく、８分以内がより好ましく、更には６分以内で行われることが好ましい。この定量時間には、最小二乗法等の適宜ふさわしいフィッティング方法を用いて予め取得した蛍光量の時間変化と胆汁酸濃度との関係式を利用して、試料及び抗胆汁酸抗体標識蛍光粒子を、胆汁酸・アルブミン結合体が固定化されている検出領域に接触させてから、検査目的とする生体試料を用いた蛍光量の時間変化の結果を基に生体試料に含まれる胆汁酸量を換算する時間が含まれていることが好ましい。
　サンドイッチ法では、特に限定されるものではないが、例えば、以下の手順により測定対象物質を測定することができる。測定対象物質を含む可能性のある生体試料と、測定対象物質と結合性を有する第一の結合物質を有する蛍光粒子とを、基板上で接触させる。生体試料に測定対象物質が存在する場合には、測定対象物質と蛍光粒子と基板との間で結合反応（抗原抗体反応など）が生じる。その結果、生体試料中に測定対象物質が存在する場合には、基板に結合した第二の結合物質と、測定対象物質と、第一の結合物質を有する蛍光粒子とからなる免疫複合体が形成される。サンドイッチ法では、第二の結合物質と、測定対象物質と、第一の結合物質を有する蛍光粒子との反応が終了した後、上記免疫複合体を形成しなかった、第一の結合物質を有する蛍光粒子を除去し、洗浄する。次いで免疫複合体の形成の度合いを蛍光強度として検出することにより、測定対象物質の濃度などを測定することができる。なお、蛍光強度と測定対象物質の濃度は、正の相関関係がある。
（流路）
　本発明の好ましい態様においては、測定対象物質を含む可能性のある生体試料と、第一の結合物質を有する標識粒子とを混合した混合液を、基板上に適用し、流路に展開することができる。流路とは、生体試料と、第一の結合物質を有する標識粒子とを、検出領域まで流下する通路であれば、特に制限はない。好ましい流路の態様としては、第一の結合物質を有する標識粒子を含む生体試料液を点着する点着口、検出領域としての金属膜、及び金属膜を超えて流路が存在し、生体試料が、金属膜上を通過できる構造を有するものである。好ましくは、金属膜に対して、点着口とは反対側に、吸引口を設けることができる。
（表面プラズモン蛍光測定）
　本発明における蛍光などの標識の検出方法としては、特に限定されないが、例えば、蛍光強度を検出することができる機器、具体的には、マイクロプレートリーダー、又は表面プラズモン励起による蛍光検出（ＳＰＦ）を行うためのバイオセンサーなどを用いて蛍光強度を検出することが好ましい。好ましくは、表面プラズモン共鳴による蛍光検出により、測定対象物質の量に関連した標識情報を取得することができる。
　なお、蛍光の測定の形態は、プレートリーダー測定でもよいし、フロー測定でもよい。表面プラズモン励起による蛍光検出法（ＳＰＦ法）は、落射励起による蛍光検出法（落射蛍光法）よりも高感度に測定することができる。
　表面プラズモン蛍光（ＳＰＦ）バイオセンサーとしては、例えば、特開２００８－２４９３６１号公報に記載されているような、所定波長の励起光を透過させる材料から形成された光導波路と、この光導波路の一表面に形成された金属膜と、光ビームを発生させる光源と、上記光ビームを光導波路に通し、上記光導波路と金属膜との界面に対して表面プラズモンを発生させる入射角で入射させる光学系と、上記表面プラズモンによって増強されたエバネッセント波によって励起されることによって発生する蛍光を検出する蛍光検出手段とを備えたセンサーを用いることができる。
　本発明の蛍光粒子を用いた表面プラズモン励起による蛍光検出（ＳＰＦ）系は、好ましくは、基板上の金属膜上に固定化された測定対象物質の量に依存した蛍光物質からの蛍光を検出するアッセイ方法であり、例えば、溶液中での反応の進行により、光学的な透明度の変化を濁度として検出する、いわゆるラテックス凝集法とは異なる方法である。ラテックス凝集法は、ラテックス試薬中の抗体感作ラテックスと生体試料中の抗原が、抗体反応により結合し凝集する。この凝集塊は時間と共に増大し、この凝集塊に近赤外光を照射して得られた単位時間当たりの吸光度変化から、抗原濃度を定量化する方法である。本発明では、ラテックス凝集法に比べて、非常に簡便な測定対象物質の検出方法を提供できる。
（規格化）
　さらに本発明の方法は、
　標識粒子の量に関連した標識情報を取得する、標識粒子関連標識情報取得工程；及び
　測定対象物質の量に関連した標識情報を取得する測定対象物質関連標識情報取得工程で取得した標識情報を、標識粒子関連標識情報取得工程で取得した標識情報により規格化する、規格化工程を含む方法でもよい。
　ここで、生体試料と、測定対象物質と結合性を有する第一の結合物質を有する標識粒子とを含む混合液を、検出領域（テストエリア）と参照領域（コントロールエリア）とを有する基板に接触させて検出領域と参照領域上に表面プラズモンを発生させ、放出された蛍光の強度を測定する工程のうち、検出領域上で発生する表面プラズモンによる蛍光の強度を測定する工程が、測定対象物質の量に関連した標識情報を取得する測定対象物質関連標識情報取得工程であり、参照領域上で発生する表面プラズモンによる蛍光の強度を測定する工程が、標識粒子関連標識情報取得工程である。この２つの工程で取得した蛍光強度の単位時間における増加速度を蛍光シグナル値の変化率として求め、検出領域のシグナル値の変化率を参照領域のシグナル値の変化率で除する工程が規格化工程である。
　以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
実施例１：
（１）胆汁酸・ウシ血清アルブミン結合体の調製
（１－１）コール酸・ウシ血清アルブミン結合体の調製
　超脱水ジメチルホルムアミド（以下、ＤＭＦと記す。和光純薬工業（株）社製）１．２ｍＬにコール酸（和光純薬工業（株）社製）５０ｍｇ、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（以下、ＮＨＳと記す。和光純薬工業（株）社製）６７ｍｇ、及び１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（以下、ＥＤＣと記す。和光純薬（株）社製）１１０ｍｇを加えて混合し、コール酸を活性エステル化した。この活性エステル化したコール酸を、アルブミンの１種であるウシ血清アルブミン（以下、ＢＳＡと記す。和光純薬工業（株）社製）３２２ｍｇを溶解したリン酸緩衝液（以下、ＰＢＳと記す。和光純薬工業（株）社製）６５ｍＬの水溶液に滴下し反応させた。反応終了後、反応溶液をアセトニトリル（以下、ＡＣＮと記す。和光純薬工業（株）社製）／水の比率が１／３の溶液１Ｌを用いて透析により精製した。最後に、凍結乾燥し、白色の固体を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
（１－２）デオキシコール酸・ＢＳＡ結合体の調製
　超脱水ＤＭＦ１．２ｍＬにデオキシコール酸（和光純薬工業(株)社製）５０ｍｇ、ＮＨＳ　６７ｍｇ、及びＥＤＣ　１１０ｍｇを加えて混合し、デオキシコール酸を活性エステル化した。この活性エステル化したデオキシコール酸を、ＢＳＡ　３２２ ｍｇを溶解したＰＢＳ　６５ｍＬの水溶液に滴下し反応させた。反応終了後、反応溶液をＡＣＮ／水の比率が１／３の溶液　１Ｌを用いて透析により精製した。最後に、凍結乾燥し、白色の固体を得た。
（１－３）ケノデオキシコール酸・ＢＳＡ結合体の調製
　超脱水ＤＭＦ１．２ｍＬにケノデオキシコール酸（和光純薬工業(株)社製）５０ｍｇ、ＮＨＳ　６７ｍｇ、及びＥＤＣ　１１０ｍｇを加えて混合し、ケノデオキシコール酸を活性エステル化した。この活性エステル化したケノデオキシコール酸を、ＢＳＡ　３２２ ｍｇを溶解したＰＢＳ　６５ｍＬの水溶液に滴下し反応させた。反応終了後、反応溶液をＡＣＮ／水の比率が１／３の溶液　１Ｌを用いて透析により精製した。最後に、凍結乾燥し、白色の固体を得た。
（２）ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ（マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析計）による胆汁酸／ＢＳＡ標識モル比（結合体の胆汁酸／アルブミン比）の測定
（測定手順）
　（１－１）から（１－３）で調製した結合体を０．１質量％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）：ＡＣＮの比率が２／１の溶液に溶解し、１ｍｇ／ｍＬの濃度に調整した。この溶液１μＬと、マトリックス（ＳＡ；シナピン酸（和光純薬工業(株)社製））４μＬとを混合し、金プレート上に１μＬとして４点を点着した。自然乾燥した後に、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ装置（Applied Bio Systems社品 Voyager）に金プレートを挿入し、１スポットごとに積算９００ショットを行い質量情報となるデータを取得（Ｎ＝４）した。このデータを用いて、胆汁酸・ＢＳＡ結合体に対応するピークの、ピーク強度の最大の値の５０％強度での分子量中心値をＢＳＡ結合体のピークとして採用し、このピーク値から垂直に降ろした位置を胆汁酸・ＢＳＡ結合体の分子量と見なして、Ｎ＝４の平均値を取り、（胆汁酸・ＢＳＡ結合体の分子量－ｎａtｉｖｅ ＢＳＡの分子量）/胆汁酸の分子量（例えば、コール酸の場合４０８－１８＝３９０）でＢＳＡに対する胆汁酸の結合数を計算した。得られた結合体の胆汁酸／ＢＳＡ比を表１に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
（３）コール酸に対する抗体、デオキシコール酸に対する抗体、又はケノデオキシコール酸に対する抗体を産生するハイブリドーマの作製、並びに抗体産生
（３－１）免疫原
　上記で作製したコール酸・ＢＳＡ結合体、デオキシコール酸・ＢＳＡ結合体及びケノデオキシコール酸・ＢＳＡ結合体の各々２ｍｇずつを、マウス免疫感作の免疫原として使用した。
（３－２）ハイブリドーマの調製
　マウス免疫感作の免疫原として、コール酸・ＢＳＡ結合体を使用した。
　初回の免疫を１００μg/匹の量とし、２回目以降の免疫を５０μg/匹の量とし、コール酸・ＢＳＡ結合体を、マウス背部皮下に投与して免疫を行った。免疫においては、完全アジュバント（ＣＦＡ）と混合したエマルジョンを初回投与し、２～４回目の免疫には不完全アジュバント（ＩＦＡ）と混合したエマルジョンを投与した。２週間隔で４回免疫を行った。別途、３回目、４回目の免疫の翌週に採血を行い、採血清１００μＬを用いてＥＬＩＳＡ測定にて抗体価の測定を行った。抗体価が目的の値であることを確認し、４回目の免疫から２週間後の免疫を最終免疫として、抗原である結合体をリン酸緩衝液（ＰＢＳ、和光純薬工業（株）社製、ｐＨ７．１～７．３）１ｍＬで希釈溶解し、マウスの腹腔内に投与する形で行った。投与の３日後にマウスの脾臓を摘出した。
　マウスより摘出した脾臓細胞と変異株骨髄腫細胞（ミエローマ：Ｐ３－Ｘ６３－Ａｇ８－Ｕ１）を、７：１の細胞数の割合で混合した後に、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を添加し、遠心分離後に培地（ＲＰＭＩ－１６４０（ロズウェルパーク記念研究所培地：Ｒｏｓｗｅｌｌ Ｐａｒｋ Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｍｅｄｉｕｍ）＋１０質量％ウシ胎児血清（Ｆｅｔａｌ　Ｂｏｖｉｎｅ　Ｓｅｒｕｍ：ＦＢＳ））に浮遊させた。この浮遊した脾臓細胞を、細胞数として１．０×１０5（ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌ）となるように、９６ｗｅｌｌプレートに播種した。翌日、ＨＡＴ培地（ヒポキサンチン・アミノプテリン・チミジン培地）を添加し、増殖したハイブリドーマの培養上清を抗体測定系のＥＬＩＳＡでスクリーニングを行った。測定用抗原であるコール酸・ＢＳＡ結合体を５００ｎｇ／ｍＬとなるようＰＢＳで希釈し、ＥＬＩＳＡのカップに添加して静置して、カップの底に測定用抗原を固定化し、上澄み液を除去した。測定対象となる脾臓細胞が産生した抗体に対する二次抗体として抗マウスＩｇＧ　ＨＲＰ標識抗体を用いた。ＩｇＧはイムノグロブリンＧを示し、ＨＲＰは西洋ワサビペルオキシダーゼを示す。ＥＬＩＳＡの結果から陽性であったウェルを２４ウェルプレートを用いて培養し、培養上清を各１ｍＬ採取した。再度、同じ抗体測定系のＥＬＩＳＡで二次スクリーニングを行った。細胞融合時の同一ウェル中で、ＥＬＩＳＡシグナルの高い上位の６ウェルを選択してバイアル瓶に入れた。
　それぞれのバイアル中の細胞を、１０質量％のＦＢＳを含む基礎培地ＲＰＭＩ１６４０を用いて限界希釈して希釈物を調製した。６個の９６ウェルプレートのそれぞれのウェルに希釈物１滴ずつピペットで添加した。それぞれのウェルを顕微鏡で観察し、それぞれのウェル中の細胞がシングルセルであることを確認した。３週間培養した後、上記と同様にして、増殖したハイブリドーマの培養上清を抗体測定系のＥＬＩＳＡでスクリーニングを行った。ＥＬＩＳＡシグナルの高い上位の１０ウェルを選択し、ハイブリドーマの調製を終了した。得られた抗体のサブクラスの決定は、Isotyping kit（ロッシュ社製）を用いた。
（３－３）マウス腹水法による抗体の産生
　選択した１０ウェルの細胞を、さらに同様にＥＬＩＳＡスクリーニングを行って、シグナルの高かった上位１ウェルの細胞についてマウス腹水法（マウス２匹を使用）により抗体を作製した。得られた抗体を、抗コール酸抗体-1と称する。
（３－４）デオキシコール酸に対する抗体、及びケノデオキシコール酸に対する抗体の調製
　デオキシコール酸に対する抗体、及びケノデオキシコール酸に対する抗体の調製も、上記と同様に行った。得られた抗体をそれぞれ、抗デオキシコール酸抗体-1及び抗ケノデオキシコール酸抗体-1と称する。
（３－５）抗体のサブクラスと抗体産生量
　上記で調製した抗体のサブクラスと抗体産生量を表２に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
（４）抗マウス抗体の作製
　マウス由来のグロブリン（ＬＡＭＰＩＲＥ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製、カタログ番号７４０４３０２、Ｍｏｕｓｅ　Ｇａｍｍａ　Ｇｌｏｂｕｌｉｎ　Ｓａｌｔ　Ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ、５００ｍｇ）を準備し、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）と混合したエマルジョンを初回投与し、２～４回目の免疫には不完全アジュバント（ＩＦＡ）と混合したエマルジョンを投与する方法で、ヤギへ免疫感作（皮下免疫）を２週間隔で４回免疫を行った。その後、ＥＬＩＳＡ測定を行って抗体価の上昇を確認した後に全採血を行い、遠心分離により抗血清を得た。その後、Protein Aカラム（Ｔｈｅｒｍｏ　ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製Ｐｉｅｒｃｅ　ＰｒｏｔｅｉｎＡ　Ｃｏｌｕｍｎｓ、カタログ番号２０３５６）により精製し、目的の抗マウス抗体を取得した。
（５）抗ＣＲＰ抗体の作製
　ｒＣＲＰ抗原（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ＣＲＰ：オリエンタル酵母社製、製品番号４７１９１０００、５ｍｇ）を準備し、完全アジュバント（ＣＦＡ）と混合したエマルジョンを初回投与し、２～４回目の免疫には不完全アジュバント（ＩＦＡ）と混合したエマルジョンを投与する方法で、マウスへ免疫感作（皮下免疫）を２週間隔で４回免疫を行った。その後、ＥＬＩＳＡ測定を行って抗体価の上昇を確認した後に全採血を行い、遠心分離により抗血清を得た。その後、ＰｒｏｔｅｉｎＡカラム（Ｔｈｅｒｍｏ　ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製　Ｐｉｅｒｃｅ　ＰｒｏｔｅｉｎＡ　Ｃｏｌｕｍｎｓ、カタログ番号２０３５６）により精製し、目的の抗ＣＲＰ抗体－１を取得した。
（６）抗胆汁酸抗体で標識した蛍光粒子の調製
（６－１）抗ＣＲＰ抗体－１でブロッキングした蛍光粒子１の調製
　抗ＣＲＰ抗体－１でブロッキングした蛍光粒子を、以下の通り調製した。
　２質量％（固形分濃度）蛍光ラテックス粒子水溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、平均粒径２００ｎｍ）３５７μＬに、５０ｍｍｏｌ／ＬのＭＥＳ（２－Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ　ａｃｉｄ）緩衝液（ｐＨ６．０）溶液２８２μＬを加え、５ｍｇ／ｍＬの抗コール酸抗体-1 （上記で作製したもの）５．３μＬ、５ｍｇ／ｍＬの抗デオキシコール酸抗体-1（上記で作製したもの）５．３μＬと、５ｍｇ／ｍＬの抗ケノデオキシコール酸抗体－１（上記で作製したもの）６．９μＬ、及び、５ｍｇ／ｍＬの抗ＣＲＰ抗体－１（上記で作製したもの）７５．５μＬを添加し、室温で１５分間攪拌した。その後、１０ｍｇ／ｍＬのＥＤＣ水溶液７．５μＬを加え、室温で１．５時間撹拌した。２ｍｏｌ／ＬのＧｌｙｃｉｎｅ（和光純薬社製）水溶液３７．５μＬを添加して１５分間撹拌した後、遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、４℃、１５分）を行い、蛍光ラテックス粒子を沈降させた。ｒｐｍは回毎分(revolution per minute)を示し、１ｒｐｍ＝１min-1 である。その後、上清を取り除き、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）７５０μＬを加え、超音波洗浄機により蛍光ラテックス粒子を再分散させた。再度、遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、４℃、１５分）を行って上清を除いた後、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）７５０μＬを加えて、蛍光ラテックス粒子を再分散させることで、３種の抗胆汁酸抗体と抗ＣＲＰ抗体が結合した蛍光粒子１の１質量％溶液を調製した。
（６－２）ＢＳＡでブロッキングした蛍光粒子２の調製
　ＢＳＡでブロッキングした蛍光粒子を、以下の通り調製した。
　２質量％（固形分濃度）蛍光ラテックス粒子水溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、平均粒径２００ｎｍ）３５７μＬに、５０ｍｍｏｌ／ＬのＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．０）溶液２８２μＬを加え、５ｍｇ／ｍＬの抗コール酸抗体-1 （上記で作製したもの）５１．２μＬ、５ｍｇ／ｍＬの抗デオキシコール酸抗体-1（上記で作製したもの）６６．６μＬと、５ｍｇ／ｍＬの抗ケノデオキシコール酸抗体－１（上記で作製したもの）８３．４μＬとを添加し、室温で１５分間攪拌した。その後、１０ｍｇ／ｍＬのＥＤＣ水溶液７．５μＬを加え、室温で１．５時間撹拌した。２ｍｏｌ／ＬのＧｌｙｃｉｎｅ（和光純薬社製）水溶液３７．５μＬを添加して１５分間撹拌した後、遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、４℃、１５分）を行い、蛍光ラテックス粒子を沈降させた。ｒｐｍは回毎分(revolution per minute)を示し、１ｒｐｍ＝１min-1 である。その後、上清を取り除き、ＰＢＳ溶液（ｐＨ７．４）７５０μＬを加え、超音波洗浄機により蛍光ラテックス粒子を再分散させた。再度、遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、４℃、１５分）を行って上清を除いた後、１質量ＢＳＡを含むＰＢＳ（ｐＨ７．４）７５０μＬを加えて、蛍光ラテックス粒子を再分散させることで、ＢＳＡでブロッキングした蛍光粒子２の１質量％溶液を調製した。
（７）基板の作製
　ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）の基体（三菱レイヨン（株）社製、アクリペット（登録商標）ＶＨ）を用意した。マグネトロンスパッタ法により、検出領域と参照領域の２箇所に、それぞれ厚さ４５ｎｍの金膜を片面に幅４ｍｍ、長さ３ｍｍとなるように作製し、これを、基板を構成するためのチップとして使用した。このチップの検出領域の金膜面上に、結合体－１、結合体－２及び結合体－３を含有比率（質量比で１：１：１）で含む液（濃度：５０μｇ／ｍＬ　ｉｎ　５０ｍｍｏｌ／Ｌ　ＭＥＳ緩衝液　ｐＨ６，１５０ｍｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣｌ）と、ブロッキング剤としてＢＳＡ（１５０ｍｇ）を含む液を点着し、乾燥させ、３種の結合体を固定化した基板１を複数作製した。また、それぞれの基板の参照領域には、（４）で作製した抗マウス抗体を含む液（濃度：５０μｇ／ｍＬ　ｉｎ　５０ｍｍｏｌ／Ｌ　ＭＥＳ緩衝液　ｐＨ６，１５０ｍｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣｌ）を点着して、乾燥させた。また、同様にブロッキング剤として抗ＣＲＰ抗体－１（１５０ｍｇ）を用いた基板も作製した。
　このように調製した３種類の複数の基板をセンサチップの流路として使用する前に、予め調製した洗浄用溶液（０．０５質量％Ｔｗｅｅｎ２０（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウラート、和光純薬社製）を含むＰＢＳ（ｐＨ７．４））３００μＬを用いて３回繰り返し洗浄した。
（８）流路型センサチップの作製
　特開２０１０－１９０８８０号公報の第２の実施形態の構成となるように、流路型センサチップを作製した。その概略図を図１及び図２に示した。図１は、センサチップ１の概略図であり、図２は、センサチップ１の分解図である。センサチップ１は、上部部材２、中間部材３及び基板４から構成されている。上部部材２には、第一の容器５及び第二の容器６が設けられている。なお、第一の容器５及び第二の容器６を併せて、容器群７と称する。基板４には、流路１０が形成されており、流路１０の上には、検出領域８及び参照領域９が形成されている。
（９）大型機（既存の胆汁酸測定試薬）での測定
　免疫測定で、当業者により広く使用されている大型機である日立自動分析装置7170により、取り扱い説明書に従い、胆汁酸の量が既知である試料の測定を行い、胆汁酸の測定値を得た。
（１０）蛍光粒子を用いた胆汁酸の免疫測定
　２５℃の環境下で実験準備を行った。その２時間後に、（９）で測定した胆汁酸の量が既知である試料を、（６－１）及び（６－２）で調製した蛍光粒子１又は蛍光粒子２を含むカップにおいて予め１０分間攪拌しながら混合した。次に、（７）で作製した基板１を封入した流路型センサチップにそれぞれ点着した。点着後、ポンプ吸引を行いながら混合液を１０μＬ／分の速度で流下させ、胆汁酸・ＢＳＡ結合体を固定した金膜面上に接触させてから１．５分間継続して蛍光強度を測定した。各基板において得られた検出領域と参照領域のそれぞれの蛍光強度の単位時間における増加速度を蛍光シグナル値として求め、検出領域のシグナル値を参照領域のシグナル値で除することで規格化を行った。また、胆汁酸濃度０の試料を用意して同様にして蛍光シグナル値の規格化を行い、胆汁酸を含まない試料からのシグナル値の規格化を行った。
（１１）検量線の作成
　（１０）で求めた胆汁酸の量が既知である試料の規格化した蛍光シグナル値と、（９）で求めた大型機での測定値、との対応関係を求めることで、（１－１）から（１－３）で調製した、胆汁酸・ＢＳＡ結合体－１～３を用いた基板に対して、それぞれ検量線を作成した。
（１２）胆汁酸の量が未知である試料の測定結果
　北山ラベス（株）からイヌの血清１～４を入手し、表３に示すような蛍光粒子と基板の組み合わせでそれぞれ実験を行い、（１１）で作成した検量線を使用して胆汁酸の測定値を得た。また、上記血清１～４について、大型機を用いて胆汁酸の測定値を求めた。
　大型機の測定値を基準にして、その値からどれだけ測定値が乖離したかを以下の計算式１で計算し、結果を表３にまとめた。
大型機との乖離幅％の計算式
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000005
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　表３の結果から、基板上の金膜（固相）上のブロッキング剤と、標識を有する粒子上のブロッキング剤とが異なる場合に、すべての検体において、正常な値での測定が可能であることがわかり、本発明の効果が確認された。
実施例２：
（１）コルチゾールのオキシム誘導体の合成
　文献（STEROIDS, 1974, Jan. 49-64）に従い、コルチゾールをエナミン化し、ヒドロキシルアミン誘導体と反応させることで、コルチゾールのオキシム誘導体－１の合成を行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
　コルチゾール（１ｇ）のメタノール懸濁液に対してピロリジンを１当量滴下し、室温で５分間攪拌した。反応系中でエナミンが生じ、溶液が赤変した。その後、もう１当量のピロリジン、及びヒドロキシルアミン誘導体（ＮＨ2－Ｏ－ＣＨ2－ＣＯＯＨ）（０．３５ｇ）を加えると消色し、反応温度を５５℃にて攪拌、オキシム化を行った。反応はスムーズに進行し、コルチゾールのオキシム誘導体－１（１．１ｇ：８４％）が得られた。
（２）コルチゾール-ＢＳＡ結合体の調整
　上記で合成したコルチゾールのオキシム誘導体－１を使用して、以下の方法でコルチゾール－ＢＳＡ結合体－１を調製した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
　乾燥ＤＭＦにオキシム誘導体－１（５０ｍｇ、１１５μｍｏｌ）と過剰量のＮＨＳ及びＷＳＣ（ｗａｔｅｒ　ｓｏｌｕｂｌｅ　ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ）を用いて活性エステル化した。その後、ＢＳＡ（１９３ｍｇ）のＰＢＳ溶液に滴下した。反応終了後、反応溶液をアセトニトリル／水＝１／１（０．１％ＴＦＡ含有）溶液中（５Ｌ）で透析精製を行った。最後に、凍結乾燥し、コルチゾール－ＢＳＡ結合体－１の白色の固体を得た。
（３）コルチゾールとＢＳＡのモル比の測定
　（２）で調製したコルチゾール－ＢＳＡ結合体－１を０．１質量％ＴＦＡ: アセトニトリル＝２／１の溶液に溶解し、１ｍｇ/ｍＬの濃度に調整した。この溶液１μＬと、マトリックス（ＳＡ；シナピン酸）４μＬとを混合し、金プレート上に１μl×４点着した。自然乾燥した後に、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ装置（Applied Bio Systems社品 Voyger）に金プレートを挿入し、１スポットごとに積算９００ショットを行い質量情報となるデータを取得（Ｎ＝４）した。このデータを用いて、コルチゾール－ＢＳＡ結合体－１に対応するピークの、ピーク強度の最大の値の５０％強度での分子量中心値をＢＳＡ結合体のピークとして採用し、このピーク値から垂直に降ろした位置をコルチゾール－ＢＳＡ結合体－１の分子量と見なして、Ｎ＝４の平均値を取り、（コルチゾール－ＢＳＡ結合体－１の分子量－ｎａtｉｖｅ ＢＳＡの分子量）/コルチゾールの分子量（例えば、コルチゾールの場合435－18＝417）でＢＳＡに対するコルチゾールの結合数を計算した。得られた結合体のコルチゾール／ＢＳＡ比を表４に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
（４）抗体産生ハイブリドーマ及びコルチゾールモノクローナル抗体－１の作製
　免疫感作の抗原として、コルチゾール－ＢＳＡ結合体－１を使用した。コルチゾール－ＢＳＡ結合体－１をマウス免疫感作抗原として用いて、数回、マウス背部皮下に結合体を初回の免疫を１００μｇ／匹の量、２回目以降の免疫を５０μｇ／匹の量で免疫を行った。この免疫は、完全アジュバント（ＣＦＡ）と混合したエマルジョンを初回投与し、２～４回目の免疫には不完全アジュバント（ＩＦＡ）と混合したエマルジョンを投与した。２週間隔で４回免疫を行った。別途、３回目、４回目の免疫の翌週に採血を行い、採血血清１００μＬをＥＬＩＳＡ測定にて抗体価の測定を実施した。抗体価が目的の値であることを確認し、４回目の免疫から２週間後の免疫を最終免疫として、抗原である結合体をリン酸緩衝液（ＰＢＳ、和光純薬工業（株）社製、ｐＨ７．１～７．３）１ｍＬで希釈溶解し、マウスの腹腔内に投与する形で行った。投与の３日後にマウスの脾臓を摘出した。
　マウスより摘出した脾臓細胞と変異株骨髄腫細胞（ミエローマ：Ｐ３－Ｘ６３－Ａｇ８－Ｕ１）を、７：１の割合で混合した後に、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を添加し、遠心分離後に培地（ＲＰＭＩ－１６４０＋１０質量％ＦＢＳ）に浮遊させた。この浮遊した脾臓細胞を、細胞数として１．０×１０5（ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌ）となるように、９６ｗｅｌｌプレートに播種した。翌日、ＨＡＴ倍地を添加し、増殖したハイブリドーマの培養上清を抗体測定系のＥＬＩＳＡでスクリーニングを行った。測定用抗原が５００ｎｇ／ｍＬとなるようＰＢＳ溶液で希釈し、ＥＬＩＳＡのカップに添加して静置して、カップの底に測定用抗原を固定化し、上澄み液を除去した。測定対象となる脾臓細胞が産生した抗体に対する２次抗体として抗マウスＩｇＧ　ＨＲＰ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ　ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）標識抗体を用いた。ＥＬＩＳＡの結果から陽性であったウェルを２４ウェルプレートを用いて培養し、培養上清を各１ｍＬ採取した。再度、同じ抗体測定系のＥＬＩＳＡで二次スクリーニングを行った。細胞融合時の同一ウェル中で、ＥＬＩＳＡシグナルの高い上位の６ウェルを選択してバイアル瓶に入れた。
　それぞれのバイアル中の細胞を、１０質量％のウシ胎児血清（Ｆｅｔａｌ　Ｂｏｖｉｎｅ　Ｓｅｒｕｍ：ＦＢＳ）を含む基礎培地ＲＰＭＩ１６４０（ロズウェルパーク記念研究所培地：Ｒｏｓｗｅｌｌ　Ｐａｒｋ　Ｍｅｍｏｒｉａｌ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　Ｍｅｄｉｕｍ）を用いて限界希釈し、６個の９６ウェルプレートのそれぞれのウェルに１滴ずつピペットで添加し、それぞれのウェルを顕微鏡で観察し、それぞれのウェル中の細胞がシングルセルであることを確認した。３週間培養した後、上記と同様にして、増殖したハイブリドーマの培養上清を抗体測定系のＥＬＩＳＡでスクリーニングを行った。ＥＬＩＳＡシグナルの高い上位の１０ウェルを選択し、ハイブリドーマの調製を終了した。得られた抗体のサブクラスの決定は、Isotyping kit（ロッシュ社製）を用いた。
　選択した１５ウェルの細胞を、さらに同様にＥＬＩＳＡスクリーニングを行って、シグナルの高かった上位１ウェルの細胞についてマウス腹水法（マウス２匹を使用）により抗体を作製した。
　上記で調製した抗体のサブクラスと抗体産生量を表５に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
（５）抗マウス抗体－１の作製
　マウス由来のグロブリン（ＬＡＭＰＩＲＥ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製、カタログ番号７４０４３０２、Ｍｏｕｓｅ　Ｇａｍｍａ　Ｇｌｏｂｕｌｉｎ　Ｓａｌｔ　Ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ、５００ｍｇ）を準備し、完全アジュバント（ＣＦＡ）と混合したエマルジョンを初回投与し、２～４回目の免疫には不完全アジュバント（ＩＦＡ）と混合したエマルジョンを投与する方法で、ウサギへ免疫感作（皮下免疫）を２週間隔で４回免疫を行った。その後、ＥＬＩＳＡ測定を行って抗体価の上昇を確認した後に全採血を行い、遠心分離により抗血清を得た。その後、ＰｒｏｔｅｉｎＡカラム（Ｔｈｅｒｍｏ　ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製Ｐｉｅｒｃｅ　ＰｒｏｔｅｉｎＡ　Ｃｏｌｕｍｎｓ、カタログ番号２０３５６）により精製し、目的の抗マウス抗体－１を取得した。
（６）抗ＣＲＰ抗体－１の作製
　ｒＣＲＰ抗原（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ＣＲＰ：オリエンタル酵母社製，製品番号４７１９１０００、５ｍｇ）を準備し、完全アジュバント（ＣＦＡ）と混合したエマルジョンを初回投与し、２～４回目の免疫には不完全アジュバント（ＩＦＡ）と混合したエマルジョンを投与する方法で、マウスへ免疫感作（皮下免疫）を２週間隔で４回免疫を行った。その後、ＥＬＩＳＡ測定を行って抗体価の上昇を確認した後に全採血を行い、遠心分離により抗血清を得た。その後、ＰｒｏｔｅｉｎＡカラム（Ｔｈｅｒｍｏ　ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製　Ｐｉｅｒｃｅ　ＰｒｏｔｅｉｎＡ　Ｃｏｌｕｍｎｓ、カタログ番号２０３５６）により精製し、目的の抗ＣＲＰ抗体－１を取得した。
（７）蛍光粒子の調製
（７－１）抗ＣＲＰ抗体－１でブロッキングした蛍光粒子－１の調製
　抗ＣＲＰ抗体－１でブロッキングした蛍光粒子を、以下の通り調製した。
　２質量％（固形分濃度）蛍光ラテックス粒子水溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、平均粒径２００ｎｍ）３５７μＬに、５０ｍＭのＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．０）溶液２８２μＬを加え、上記（４）で調製した５ｍｇ／ｍＬのコルチゾールモノクローナル抗体－１の溶液１５μＬ、及び５ｍｇ／ｍＬのＣＲＰ抗体－１の溶液７５．５μＬを添加し、室温で１５分間攪拌した。その後、１０ｍｇ／ｍＬの１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）水溶液を７．５μＬ加え、室温で１．５時間撹拌した。２ｍｏｌ／Ｌのグリシン（Ｇｌｙｃｉｎｅ：和光純薬工業（株）社製）水溶液を３７．５μＬ添加して１５分間撹拌した後、遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、４℃、１５分）を行い、蛍光ラテックス粒子を沈降させた。その後上清を取り除き、ＰＢＳ溶液（ｐＨ７．４）を７５０μＬ加え、超音波洗浄機により蛍光ラテックス粒子を再分散させた。再度、遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、４℃、１５分）を行って上清を除いた後、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）７５０μＬ加えて、蛍光ラテックス粒子を再分散させることで、抗ＣＲＰ抗体でブロッキングした抗コルチゾール抗体結合蛍光ラテックス粒子（蛍光粒子－１）の１質量％溶液を調製した。
（７－２）ＢＳＡでブロッキングした蛍光粒子－２の調製
　比較例として使用する、ＢＳＡでブロッキングした蛍光粒子を、以下の通り調製した。
　２質量％（固形分濃度）蛍光ラテックス粒子水溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、平均粒径２００ｎｍ）３５７μＬに、５０ｍＭのＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．０）溶液２８２μＬを加え、上記（４）で調製した５ｍｇ／ｍＬのコルチゾールモノクローナル抗体－１の溶液１５μＬ、及び５ｍｇ／ｍＬのＢＳＡの溶液１５０μＬを添加し、室温で１５分間攪拌した。その後、１０ｍｇ／ｍＬのＥＤＣ水溶液を７．５μＬ加え、室温で１．５時間撹拌した。２ｍｏｌ／Ｌのグリシン（Ｇｌｙｃｉｎｅ：和光純薬社製）水溶液を３７．５μＬ添加して１５分間撹拌した後、遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、４℃、１５分）を行い、蛍光ラテックス粒子を沈降させた。その後上清を取り除き、ＰＢＳ溶液（ｐＨ７．４）を７５０μＬ加え、超音波洗浄機により蛍光ラテックス粒子を再分散させた。再度、遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、４℃、１５分）を行って上清を除いた後、１質量％ＢＳＡを含むＰＢＳ（ｐＨ７．４）溶液７５０μＬ加えて、蛍光ラテックス粒子を再分散させることで、ＢＳＡでブロッキングした３種の抗コルチゾール抗体結合蛍光ラテックス粒子（蛍光粒子－２）の１質量％溶液を調製した。
（８）流路型センサチップの作製
　ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）の基体（三菱レイヨン（株）社製、アクリペットＶＨ）を用意し、マグネトロンスパッタ法により、検出領域と参照領域の２箇所に、それぞれ厚さ４５ｎｍの金膜を片面に幅４ｍｍ、長さ３ｍｍとなるように作製して基板を構成するためのチップを作製した。このチップの検出領域の金膜面上に、（２）で調製したコルチゾール－ＢＳＡ結合体－１（濃度：５０μｇ／ｍＬ　ｉｎ　５０ｍＭ　ＭＥＳ緩衝液　ｐＨ６、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ）と、ブロッキング剤としてＢＳＡ（２ｍｇ）を含む液を点着し、乾燥させることで、基板１を複数作製した。また、それぞれの基板の参照領域には、（５）で作製した抗マウス抗体－１を含む液（濃度：５０μｇ／ｍＬ　ｉｎ　５０ｍＭ　ＭＥＳ緩衝液ｐＨ６、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ）を点着して、乾燥させた。また、同様にブロッキング剤として抗ＣＲＰ抗体－１（２ｍｇ）を用いた基板も作製した。
　この後、実施例１と同様にして、基板の洗浄を行い、流路に封入して流路型センサチップを作製した。その概略図を図１及び図２に示した。
（９）大型機（既存のコルチゾール測定試薬）での測定
　免疫測定で、当業者により広く使用されている大型機であるシーメンス社イムライズ１０００により、取り扱い説明書に従い、コルチゾールの量が既知である試料の測定を行い、コルチゾールの測定値を得た。
（１０）蛍光粒子を用いたコルチゾールの免疫測定
　２５℃の環境下で実験準備を行った。その２時間後に、（９）で測定したコルチゾールの量が既知である試料を、（７－１）で調製したラテックス粒子－１、又は（７－２）で調製したラテックス粒子－２を含むカップにおいてそれぞれ、予め１０分間攪拌しながら混合した。次に、（８）で作製した基板１を封入した流路型センサチップにそれぞれ点着した。点着後、ポンプ吸引を行いながら混合液を１０μＬ／ｍｉｎの速度で流下させ、コルチゾール－ＢＳＡ結合体－１を固定した金膜面上に接触させてから１．５分間継続して蛍光強度を測定した。各基板において得られた検出領域と参照領域のそれぞれの蛍光強度の単位時間における増加速度を蛍光シグナル値として求め、検出領域のシグナル値を参照領域のシグナル値で除することで規格化を行った。また、コルチゾール濃度０の試料を用意して同様にして蛍光シグナル値の規格化を行い、コルチゾールを含まない試料からのシグナル値の規格化を行った。
（１１）検量線の作成
　（１０）で求めたコルチゾールの量が既知である試料の規格化した蛍光シグナル値と、（９）で求めた大型機での測定値、との対応関係を求めることで、（２）で調製したコルチゾール－ＢＳＡ結合体―１を用いた基板に対して、それぞれ検量線を作成した。
（１２）コルチゾール量が未知である試料の測定結果
　北山ラベス（株）から検体としてイヌの血清１～８を入手し、表４に示すような蛍光粒子と基板の組み合わせでそれぞれ実験を行い、（１１）で求めた検量線を使用して得られたコルチゾールの測定値と、大型機を用いてコルチゾールの測定値を求めた。
　大型機の測定値を基準にして、その値からどれだけ測定値が乖離したかを以下の計算式２で計算し、結果を表６にまとめた。
大型機との乖離幅％の計算式
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000011
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
　表６の結果から、基板上の金膜（固相）上のブロッキング剤と、標識を有する粒子上のブロッキング剤が異なる場合に、すべての検体において、正常な値での測定が可能であることがわかり、本発明の効果が確認された。
　１　センサチップ
　２　上部部材
　３　中間部材
　４　基板
　５　第一の容器
　６　第二の容器
　７　容器群
　８　検出領域
　９　参照領域
　１０　流路

Claims (15)

  1. 測定対象物質と結合性を有する第一の結合物質と第一のブロッキング剤とを有する標識粒子；及び
    　前記測定対象物質又は前記第一の結合物質の何れかと結合性を有する第二の結合物質と第二のブロッキング剤とを有する検出領域を含む基板；
    を含む生体試料中の測定対象物質を定量するためのキットであって、前記第一のブロッキング剤と前記第二のブロッキング剤とがそれぞれ互いに異なる、キット。
  2. 前記第一のブロッキング剤と前記第二のブロッキング剤とがそれぞれ互いに異なるタンパク質である、請求項１に記載のキット。
  3. 前記第一のブロッキング剤が、アルブミン及びグロブリンの一方であり、前記第二のブロッキング剤が、アルブミン及びグロブリンの他方である、請求項１又は２に記載のキット。
  4. 前記第一のブロッキング剤がグロブリンであり、前記第二のブロッキング剤がアルブミンである、請求項３に記載のキット。
  5. 前記アルブミンが、ウシ血清アルブミンである、請求項３又は４に記載のキット。
  6. 前記グロブリンが、前記測定対象物質と結合性を有する免疫グロブリン以外の免疫グロブリンである、請求項３から５の何れか一項に記載のキット。
  7. 前記標識粒子が蛍光粒子であり、前記検出領域が金膜上にある、請求項１から６の何れか一項に記載のキット。
  8. 生体試料中の測定対象物質を定量する方法であって、
    　生体試料を、測定対象物質と結合性を有する第一の結合物質と第一のブロッキング剤とを有する標識粒子と反応させる反応工程；及び
    　前記測定対象物質又は前記第一の結合物質の何れかと結合性を有する第二の結合物質と第二のブロッキング剤とを有する検出領域を含む基板に、前記反応工程で得られた反応産物を接触させて、標識粒子を基板上に捕捉させ、前記測定対象物質の量に関連した標識情報を取得する、測定対象物質関連標識情報取得工程；
    を含み、前記第一のブロッキング剤と前記第二のブロッキング剤とがそれぞれ互いに異なる、方法。
  9. 前記第一のブロッキング剤と前記第二のブロッキング剤とがそれぞれ互いに異なるタンパク質である、請求項８に記載の方法。
  10. 前記第一のブロッキング剤が、アルブミン及びグロブリンの一方であり、前記第二のブロッキング剤が、アルブミン及びグロブリンの他方である、請求項８又は９に記載の方法。
  11. 前記第一のブロッキング剤がグロブリンであり、前記第二のブロッキング剤がアルブミンである、請求項１０に記載の方法。
  12. 前記アルブミンが、ウシ血清アルブミンである、請求項１０又は１１に記載の方法。
  13. 前記グロブリンが、前記測定対象物質と結合性を有する免疫グロブリン以外の免疫グロブリンである、請求項１０から１２の何れか一項に記載の方法。
  14. 前記標識粒子が蛍光粒子であり、前記検出領域が金膜上にある、請求項８から１３の何れか一項に記載の方法。
  15. 表面プラズモン励起による蛍光検出により、測定対象物質の量に関連した標識情報を取得する、請求項１４に記載の方法。
PCT/JP2017/007744 2016-02-29 2017-02-28 生体試料中の測定対象物質を定量するためのキット及び生体試料中の測定対象物質を定量する方法 Ceased WO2017150516A1 (ja)

Priority Applications (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2018503322A JP6532594B2 (ja) 2016-02-29 2017-02-28 生体試料中の測定対象物質を定量するためのキット及び生体試料中の測定対象物質を定量する方法
EP17759982.6A EP3425397B1 (en) 2016-02-29 2017-02-28 Kit for quantitatively determining substance to be measured in biological sample and method for quantitatively determining substance to be measured in biological sample
CN201780014062.XA CN108700581A (zh) 2016-02-29 2017-02-28 用于定量生物试样中的测定对象物质的试剂盒及定量生物试样中的测定对象物质的方法
US16/115,593 US10816469B2 (en) 2016-02-29 2018-08-29 Kit for quantitatively determining substance to be measured in biological sample and method for quantitatively determining substance to be measured in biological sample

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2016-037300 2016-02-29
JP2016037300 2016-02-29

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
US16/115,593 Continuation US10816469B2 (en) 2016-02-29 2018-08-29 Kit for quantitatively determining substance to be measured in biological sample and method for quantitatively determining substance to be measured in biological sample

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2017150516A1 true WO2017150516A1 (ja) 2017-09-08

Family

ID=59744146

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2017/007744 Ceased WO2017150516A1 (ja) 2016-02-29 2017-02-28 生体試料中の測定対象物質を定量するためのキット及び生体試料中の測定対象物質を定量する方法

Country Status (5)

Country Link
US (1) US10816469B2 (ja)
EP (1) EP3425397B1 (ja)
JP (1) JP6532594B2 (ja)
CN (1) CN108700581A (ja)
WO (1) WO2017150516A1 (ja)

Cited By (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2018181795A1 (ja) * 2017-03-30 2018-10-04 富士フイルム株式会社 生体試料中の測定対象物質を測定するためのキット及び方法
WO2018181800A1 (ja) * 2017-03-30 2018-10-04 富士フイルム株式会社 生体試料中の測定対象物質を測定するためのキット及び方法
WO2022065052A1 (ja) * 2020-09-24 2022-03-31 株式会社Ｊｖｃケンウッド 捕捉用抗体、固相担体、検出用抗体、固相担体粒子、並びに検出対象物質の測定キット及び測定方法
JP2022096817A (ja) * 2020-12-18 2022-06-30 サンスター株式会社 歯周病原菌に対する抗体価を測定する方法
US11519860B2 (en) 2017-03-30 2022-12-06 Fujifilm Corporation Kit, method and reagent for measuring measurement target substance
US11674966B2 (en) 2017-03-30 2023-06-13 Fujifilm Corporation Kit and method for measuring measurement target substance in biological sample
WO2023136043A1 (ja) * 2022-01-13 2023-07-20 株式会社島津製作所 ニューログラニン関連ペプチドの分析方法
US11733244B2 (en) 2017-03-30 2023-08-22 Fujifilm Corporation Kit, method, and reagent for measuring measurement target substance
US11821896B2 (en) 2017-03-30 2023-11-21 Fujifilm Corporation Kit and method for measuring measurement target substance in biological sample
US12195654B2 (en) 2016-08-23 2025-01-14 Fujifilm Corporation Luminescent particle and compound
US12235263B2 (en) 2018-02-22 2025-02-25 Fujifilm Corporation Progesterone measuring kit, progesterone measuring method, and progesterone measuring reagent
US12352753B2 (en) 2019-02-06 2025-07-08 Fujifilm Corporation Kit for measuring measurement target substance and method for measuring measurement target substance

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2006189317A (ja) * 2005-01-06 2006-07-20 Sysmex Corp イムノクロマトグラフ法用試験具
JP2009133740A (ja) * 2007-11-30 2009-06-18 Tanaka Kikinzoku Kogyo Kk イムノクロマトグラフィー用試験片
JP2010181155A (ja) * 2009-02-03 2010-08-19 Fujifilm Corp 物質固定基板の製造方法
JP2013083633A (ja) * 2011-09-26 2013-05-09 Fujifilm Corp 蛍光粒子を用いたサイロキシン免疫アッセイ

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2001021563A (ja) 1999-07-06 2001-01-26 Nitto Denko Corp 特異的結合体
CN1220061C (zh) * 2002-05-29 2005-09-21 中国科学院力学研究所 共价固定生物分子的蛋白质芯片及其制备方法
JP5317899B2 (ja) * 2009-09-11 2013-10-16 富士フイルム株式会社 ラテックス粒子を用いた免疫アッセイ方法
JP5363631B2 (ja) * 2011-09-28 2013-12-11 富士フイルム株式会社 蛍光粒子を用いた検出対象物質の検出方法
JP6236881B2 (ja) 2013-06-03 2017-11-29 コニカミノルタ株式会社 免疫染色方法、蛍光免疫染色用前処理液および免疫染色用キット
CN105393119A (zh) * 2013-07-30 2016-03-09 生物辐射实验室股份有限公司 用于免疫试验的多重封闭物珠
CN103792211A (zh) * 2014-01-27 2014-05-14 暨南大学 一种表面等离子体共振生物芯片及其制备方法与应用

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2006189317A (ja) * 2005-01-06 2006-07-20 Sysmex Corp イムノクロマトグラフ法用試験具
JP2009133740A (ja) * 2007-11-30 2009-06-18 Tanaka Kikinzoku Kogyo Kk イムノクロマトグラフィー用試験片
JP2010181155A (ja) * 2009-02-03 2010-08-19 Fujifilm Corp 物質固定基板の製造方法
JP2013083633A (ja) * 2011-09-26 2013-05-09 Fujifilm Corp 蛍光粒子を用いたサイロキシン免疫アッセイ

Cited By (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US12195654B2 (en) 2016-08-23 2025-01-14 Fujifilm Corporation Luminescent particle and compound
WO2018181795A1 (ja) * 2017-03-30 2018-10-04 富士フイルム株式会社 生体試料中の測定対象物質を測定するためのキット及び方法
WO2018181800A1 (ja) * 2017-03-30 2018-10-04 富士フイルム株式会社 生体試料中の測定対象物質を測定するためのキット及び方法
US11486879B2 (en) 2017-03-30 2022-11-01 Fujifilm Corporation Kit and method for measuring measurement target substance in biological sample
US11519860B2 (en) 2017-03-30 2022-12-06 Fujifilm Corporation Kit, method and reagent for measuring measurement target substance
US11674966B2 (en) 2017-03-30 2023-06-13 Fujifilm Corporation Kit and method for measuring measurement target substance in biological sample
US11674954B2 (en) 2017-03-30 2023-06-13 Fujifilm Corporation Kit and method for measuring measurement target substance in biological sample
US11733244B2 (en) 2017-03-30 2023-08-22 Fujifilm Corporation Kit, method, and reagent for measuring measurement target substance
US11821896B2 (en) 2017-03-30 2023-11-21 Fujifilm Corporation Kit and method for measuring measurement target substance in biological sample
US12235263B2 (en) 2018-02-22 2025-02-25 Fujifilm Corporation Progesterone measuring kit, progesterone measuring method, and progesterone measuring reagent
US12352753B2 (en) 2019-02-06 2025-07-08 Fujifilm Corporation Kit for measuring measurement target substance and method for measuring measurement target substance
WO2022065052A1 (ja) * 2020-09-24 2022-03-31 株式会社Ｊｖｃケンウッド 捕捉用抗体、固相担体、検出用抗体、固相担体粒子、並びに検出対象物質の測定キット及び測定方法
JP7585025B2 (ja) 2020-12-18 2024-11-18 サンスター株式会社 歯周病原菌に対する抗体価を測定する方法
JP2022096817A (ja) * 2020-12-18 2022-06-30 サンスター株式会社 歯周病原菌に対する抗体価を測定する方法
JPWO2023136043A1 (ja) * 2022-01-13 2023-07-20
WO2023136043A1 (ja) * 2022-01-13 2023-07-20 株式会社島津製作所 ニューログラニン関連ペプチドの分析方法
JP7736090B2 (ja) 2022-01-13 2025-09-09 株式会社島津製作所 ニューログラニン関連ペプチドの分析方法

Also Published As

Publication number Publication date
US10816469B2 (en) 2020-10-27
JPWO2017150516A1 (ja) 2018-12-27
JP6532594B2 (ja) 2019-06-19
EP3425397A4 (en) 2019-01-09
EP3425397A1 (en) 2019-01-09
US20180372638A1 (en) 2018-12-27
EP3425397B1 (en) 2020-05-27
CN108700581A (zh) 2018-10-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6532594B2 (ja) 生体試料中の測定対象物質を定量するためのキット及び生体試料中の測定対象物質を定量する方法
JP6602952B2 (ja) 生体試料中の胆汁酸を定量するためのキット及び生体試料中の胆汁酸を定量する方法
EP2995952B1 (en) Reagent kit, measurement kit, and method of measuring test substance
JP5363631B2 (ja) 蛍光粒子を用いた検出対象物質の検出方法
JP5416263B2 (ja) 蛍光粒子を用いたコルチゾール免疫アッセイ
WO2018181800A1 (ja) 生体試料中の測定対象物質を測定するためのキット及び方法
JPWO2020158835A1 (ja) 試薬キット、測定キットおよび測定方法
US12163962B2 (en) Reagent kit and measurement kit for serum amyloid A
JP7150891B2 (ja) 試薬キット、測定キットおよび測定方法
JP7026203B2 (ja) 試薬キット、測定キットおよび測定方法
JP6602951B2 (ja) 生体試料中の測定対象物質を定量するためのキット
JP5465758B2 (ja) 蛍光粒子を用いたサイロキシン免疫アッセイ
JP2015163865A (ja) コルチゾール・アルブミン結合体の製造方法、コルチゾール・アルブミン結合体、コルチゾール測定用基板、コルチゾール測定用キット並びにコルチゾールの測定方法

Legal Events

Date Code Title Description
DPE1 Request for preliminary examination filed after expiration of 19th month from priority date (pct application filed from 20040101)
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2018503322

Country of ref document: JP

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2017759982

Country of ref document: EP

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2017759982

Country of ref document: EP

Effective date: 20181001

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 17759982

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1