WO2017155167A1 - 세포 리프로그래밍 장치 - Google Patents

세포 리프로그래밍 장치 Download PDF

Info

Publication number
WO2017155167A1
WO2017155167A1 PCT/KR2016/008755 KR2016008755W WO2017155167A1 WO 2017155167 A1 WO2017155167 A1 WO 2017155167A1 KR 2016008755 W KR2016008755 W KR 2016008755W WO 2017155167 A1 WO2017155167 A1 WO 2017155167A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
culture
cells
cell reprogramming
cell
ultrasonic
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/KR2016/008755
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
김순학
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Catholic Kwandong University Industry Cooperation Foundation
Original Assignee
Catholic Kwandong University Industry Cooperation Foundation
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from KR1020160098754A external-priority patent/KR102050852B1/ko
Application filed by Catholic Kwandong University Industry Cooperation Foundation filed Critical Catholic Kwandong University Industry Cooperation Foundation
Priority to CN201680084455.3A priority Critical patent/CN109089424A/zh
Priority to EP16893681.3A priority patent/EP3428276A4/en
Priority to JP2018567551A priority patent/JP2019508069A/ja
Priority to US16/082,928 priority patent/US20190106669A1/en
Publication of WO2017155167A1 publication Critical patent/WO2017155167A1/ko
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M1/00—Apparatus for enzymology or microbiology
    • C12M1/36—Apparatus for enzymology or microbiology including condition or time responsive control, e.g. automatically controlled fermentors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M1/00—Apparatus for enzymology or microbiology
    • C12M1/42—Apparatus for the treatment of microorganisms or enzymes with electrical or wave energy, e.g. magnetism, sonic waves
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N13/00—Treatment of microorganisms or enzymes with electrical or wave energy, e.g. magnetism, sonic waves

Definitions

  • the present invention relates to a cell reprogramming device and method that can facilitate the influx of the environment through ultrasound, laser or heat treatment.
  • the national research and development project supporting the present invention is a high-tech medical technology development project of the Ministry of Health and Welfare, the project identification number HI14C3297, the development of stem cell distribution and neurodifferentiation monitoring method in vivo using micro RNA tracking system in ischemic brain injury model. It was supported by the clergy University of Kwandong University.
  • the national research and development project supporting the present invention is a support project for the intermediate researcher of the Ministry of Science, ICT and Future Planning, a project identification number 2013R1A2A2A01068140, a microRNA-based stem cell differentiation tracking radiation biomolecule imaging method, and the clergymanong University Industry-Academic Cooperation Group Supported.
  • the medium component contains various substances and ions, and the intracellular inflow of such an environment may be a breakthrough method for promoting cellular change.
  • the cells are not easily delivered by the cell membrane composed of phospholipids.
  • ultrasonic stimulation has a positive effect on cell development. Ultrasound also induces ATP, and it has been reported that this ATP reacts with receptors on cell membranes to cause mass transport.
  • the present inventors devised a method of delivering a variety of substances into the cell by using a physical stimulation such as ultrasound to temporarily damage the somatic cell membrane and at the same time using the cavitation effect of the medium caused by the ultrasonic wave.
  • a cell reprogramming method using a flowing environment, also known as "Physical-mediated stimulation of permeation En vironmental ransition guided t c e r llular eprogramming, ENTER cell", thereby completing the present invention.
  • the present invention is to solve the problem to provide a cell reprogramming device that can promote the influx of the environment to the differentiated cells through ultrasound, laser or heat treatment.
  • a cell reprogramming device that includes one or more instruments arranged to provide energy.
  • the apparatus may include at least one of an ultrasonic generator for irradiating ultrasonic waves, a laser irradiation apparatus for irradiating a laser, and a temperature control device.
  • the cell reprogramming device may further include one or more of a humidity control device for adjusting the humidity in the culture chamber and a gas control device for controlling the amount of carbon dioxide in the culture chamber.
  • the cell reprogramming device may further include a display unit having an input unit for adjusting one or more of the temperature, humidity, carbon dioxide amount in the culture chamber.
  • the apparatus may include an ultrasonic generator, and the display unit may be provided to set an ultrasonic frequency and time.
  • a sample tube for receiving cells is disposed in the culture chamber, and the ultrasonic wave generator may be provided to be able to lift and lower toward the sample tube.
  • the culture chamber may be provided with a sample tube holder for supporting the sample tube.
  • sample tube may have a double tube structure.
  • the ultrasonic generator may be provided to replace the ultrasonic transducer.
  • the temperature control device may include a heating wire provided around the culture chamber.
  • a cell reprogramming device comprising an autosampler provided to be equipped with a plurality of sample tubes and an ultrasonic wave generator configured to generate ultrasonic waves with any one of the sample tubes mounted on the autosampler.
  • the auto sampler may be rotatably provided, and the ultrasonic wave generator may be provided to be liftable.
  • the ultrasonic wave generator may be in an elevated state.
  • the cell reprogramming apparatus may further include a culture medium tank in which an ultrasonicated culture medium is stored, one or more culture flasks supplied with the culture medium in the culture medium tank, and an injection tube for fluidly connecting the culture flask and the sample tube. It may further comprise.
  • the cells in the sample tube to which the ultrasound is applied may be arranged to be transferred to the culture flask by the injection tube.
  • the cell reprogramming device may further comprise a transfer belt for transferring the plurality of culture flasks.
  • the cell reprogramming apparatus supplies the culture medium to the incubator in which the culture flask is accommodated, the recovery tank in which the culture medium of the culture flask in the incubator is recovered, and the culture medium in the incubator, and recovers the culture medium in the culture flask to the recovery tank. It may further include a circulator for.
  • the culture flask may be provided with flow passages on each side.
  • both flow passages of the culture flask may be located at different heights.
  • Each flow passage may also be equipped with a stopper.
  • At least one stopper may be provided so that an injector for culture medium flow is mounted.
  • the incubator may be provided with a shaker for shaking the seated culture flask.
  • the cell reprogramming apparatus has the following effects.
  • the application of energy, such as ultrasound, laser or heat treatment, to differentiated cells has the effect of inducing reprogramming to new types of pluripotent cells with pluripotent properties or any differentiated cells that differ in phenotype from the differentiated cells.
  • FIG. 1 and 2 are conceptual diagrams illustrating a cell reprogramming apparatus according to a first embodiment of the present invention.
  • FIG. 3 is a conceptual diagram illustrating various embodiments of an ultrasonic transducer constituting the cell reprogramming apparatus shown in FIG. 1.
  • FIG. 4 is a conceptual diagram illustrating a sample tube constituting the cell reprogramming apparatus shown in FIG. 1.
  • 5 to 7 are conceptual diagrams illustrating a cell reprogramming apparatus according to a second embodiment of the present invention.
  • FIG. 8 is a view showing a culture flask constituting the cell reprogramming apparatus shown in FIG.
  • FIG 9 shows an injector mounted on a culture flask.
  • FIG. 10 is a view showing a state in which the injector is mounted in the culture flask.
  • each component member may be exaggerated or reduced. Can be.
  • the present invention provides a physical stimulus capable of promoting environmental influx in a mixture of differentiated cells and culture medium, and incubating the mixture provided with the physical stimulus for a period of time to obtain reprogrammed cells. To reprogram the cells.
  • the present invention provides pluripotency by culturing differentiated cells in any medium capable of inducing the desired reprogrammed cells while providing physical stimulation to promote the influx of the environment such as ultrasound, laser or heat treatment to the differentiated cells. ) cell; Or the separation of cells into any differentiated cells that differ in phenotype from the differentiated cells, such as hepatocytes, osteoblasts, adipocytes, muscle cells, nerve cells, astrocytes, keratinocytes, hair root cells, pancreatic beta cells or cardiomyocytes. It is characterized by being able to induce programming.
  • the differentiated cells when reprogrammed cells are intended for pluripotent cells, the differentiated cells may be reprogrammed into pluripotent cells by mixing differentiated cells with stem cell culture medium and providing a physical stimulus to culture for a period of time. .
  • the differentiated cells and the differentiated induction medium of the desired differentiated cells are mixed and cultured for a period of time by providing a physical stimulus.
  • differentiated cells can be reprogrammed to any differentiated cell with a different phenotype.
  • the reprogramming method of cells of the present invention appears to induce reprogramming of differentiated cells in response to extracellular environmental influx through physical stimulation to the differentiated cells.
  • influx may include genetic material, chemicals, small molecules or exosomes released from differentiated cells that have been provided with physical stimuli; Or influx into neighboring differentiated cells, such as culture medium components.
  • environmental influx into differentiated cells is characterized by reprogramming pluripotency into pluripotent cells stably expressing pluripotency markers and trioderm markers, and to differentiated cells with different phenotypes. Seems to be able to determine.
  • the reprogramming directionality seems to be determined by the type of culture medium.
  • reprogramming from differentiated cells to pluripotent cells can be induced when physical stimulation is provided to the mixture of differentiated cells and stem cell culture media, and any differentiation with different phenotypes in differentiated cells.
  • Reprogramming into cells can be induced when a physical stimulus is provided to a mixture of differentiated cells and differentiation-inducing media of any differentiated cell.
  • the inventors considered cell membrane damage and cell secreting substances (exosomes) in particular by physical stimulation. That is, ultrasonic waves, lasers, or heat treatments induce temperature rise due to energy, vibration of microbubbles generated by ultrasonic waves, and induction of flow of liquids, that is, microstream generation along the cell membranes.
  • the Ca 2 + concentration rapidly increases immediately after sonication and gradually decreases so as not to process ultrasonic waves. By decreasing to the level of the control group it can be seen that after the damage of the cell membrane is induced.
  • the generation and increase of ATP due to ultrasound is known to induce endocytosis in response to various cellular stresses and in response to intracellular membrane ATP receptors.
  • exosomes are known to contain genetic information (DNA, mRNA, microRNA, protein) inside the exosomes through the process of exosomes that escaped out of the cell membrane through the damage to the cell membrane reenters other cells around the inside Genetic information material present in can be delivered. Therefore, the pluripotency induced or promoted the expression of pluripotent markers that were under-expressed or maintained in the suppressed state of the cell due to the stimulation by the ultrasonic treatment and damage to the cell membrane.
  • the exosomes present inside the cells containing the markers are discharged to the outside and delivered to the surrounding cells. Since the surrounding cells are also partially damaged, the cell membrane fluidity is increased and the efficiency of entering the exosomes into the cells is higher than that of the normal state.
  • the culture medium is recovered during the process of pluripotent cell induction, and the exosomes in the medium are extracted to confirm whether a pluripotent cell-related pluripotency marker is present inside the exosome. It is confirmed that the expression level is shown to support the hypothesis of the present inventors. In addition, such ultrasonic, laser, or heat treatments were found to be normal without karyotyping.
  • somatic cells including dermal fibroblasts, dermal fibroblasts and the like derived from mammals; Cancer cells including uterine cancer cells (HeLa), liver cancer cells (Hep3B), and the like; Or organ tissue cells, including lung epithelial cells (L132 cell) can be used.
  • the term "somatic cell” refers to a cell that constitutes an adult and is limited in the capacity for differentiation and self-production.
  • the somatic cells may be somatic cells constituting the skin, hair, fat of the mammal, preferably fibroblasts derived from mammals, but is not limited thereto.
  • pluripotent cells refers to cells that have acquired pluripotency after ultrasound, laser, or heat treatment in a physical stimulus, strict sense.
  • the pluripotency means a state of stably expressing a pluripotency marker expressed in stem cells. In addition, it means a state expressing three kinds of endoderm, ectoderm and mesoderm three germ layers markers.
  • the pluripotent cells are "E mbryonic s tem cell-based media En vironmental ransition t-guided c e llular r eprogramming (es / ENTER) cells can be used.
  • the pluripotent cells according to the present invention are well differentiated from the induced pluripotent stem cells in that differentiation is well induced according to the external environment, and that the properties of the progenitor cells are stronger than the properties of the stem cells.
  • a preparatory step of undergoing a differentiation process is required, which includes a risk factor that can turn into cancer, and a virus for introducing a differentiation inducer.
  • pluripotent cells of the present invention are induced without introducing a differentiation-inducing substance such as a back-differentiation inducer or a chemical for genetic variation, so co-culture with other types of cells There is no problem of cell contamination (problem of mixing with other cells) because there is no need for culturing through it.
  • the pluripotent cells of the present invention have the advantage that the induction process is simple and short, so that time can be dramatically reduced until transplantation by treating autologous cells.
  • the pluripotent cells are pluripotent markers or mesoderm of any one of OCT3 / 4, SOX2, NANOG, c-MYC, KLF4, TDGF1, SSEA4, TRA-1-60, PAX6, Nestin, Brachyury, SMA, GATA4, or AFP. And it is characterized by stably expressing the three germ seed marker gene consisting of endoderm.
  • differentiated cells may be reprogrammed into pluripotent cells or any differentiated cells of interest that differ in phenotype from differentiated cells upon receiving a physical stimulus capable of promoting environmental influx.
  • the differentiated cells are, for example, neurons expressing any one of PAX6, Nestin, MAP2, TuJ1, GFAP or O4 (referred to as " n euronal stem cell media-based ENTER, n / ENTER”); Myocytes expressing any of Desmin, Actinin, SMA, GATA4 or NKX2-5 (called “ m uscle differentiation media-based ENTER, m / ENTER”); Hepatocytes expressing any of AFP, HNF4a, CK18 or ALB (called “ h epatocyte differentiation media-based ENTER, h / ENTER”); Or adipocytes expressing any one of Pparc2, C / ebpa, aP2 or Fabp4 (referred to as “ a dipocyte differentiation media-based ENTER, a / ENTER”), but are not limited thereto.
  • culture medium is a medium used for in vitro cell culture in a comprehensive sense, and means a stem cell culture medium or differentiation induction medium in the present invention, the stem cell culture medium more specifically embryonic stem cell culture Mean badge.
  • differentiation induction medium is a medium used for induction of normal stem cells into differentiated cells, for example, hepatocyte differentiation induction medium, bone formation differentiation induction medium, adipocyte differentiation induction medium, muscle cell differentiation induction medium.
  • Stellate cell differentiation induction medium, neuronal cell differentiation induction medium, keratinocyte differentiation induction medium, pancreatic beta cell differentiation induction medium or cardiomyocyte differentiation induction medium and the like can be used, but is not limited thereto.
  • the culture medium and the differentiated cells are mixed and the mixture is provided with physical stimulation.
  • a physical stimulus Prior to providing a physical stimulus to the mixture of differentiated cells, a physical stimulus may be provided to the culture medium to increase the reprogramming efficiency of the cells.
  • the physical stimulus may be any one of ultrasonic wave, laser or heat treatment.
  • Ultrasonic treatment of the culture medium has an output intensity of 1W / cm 2 1 to 20 minutes to the ultrasound of 20W / cm 2, specifically, the output strength of 2W / cm 2 To 10 W / cm 2 of ultrasound for 5 to 15 minutes, more specifically, output intensity 3 W / cm 2 To 7 W / cm 2 may be performed for 7 to 13 minutes.
  • Laser treatment of the culture medium is performed for 1 minute to 20 minutes for the pulsed laser beam in the 300 to 900 nm wavelength band, more specifically for 3 minutes to 15 minutes for the pulsed laser beam in the wavelength band, more specifically for the wavelength.
  • the pulsed laser beam of the band may be irradiated for 5 to 10 minutes.
  • the wavelength band may use a wavelength of 400 nm, 808 nm, and 880 nm.
  • Heat treatment of the culture medium may be carried out for 5 to 20 minutes at a temperature condition of 40 to 50 °C.
  • the sonication of the mixture of culture medium and differentiated cells is performed for 1 to 5 seconds at a power intensity of 0.5 W / cm 2 to 3 W / cm 2 , more specifically, from 0.7 W / cm 2 to 2 W / cm 2.
  • the output strength may be performed for 1 to 5 seconds at 0.8W / cm 2 to 1.5W / cm 2 .
  • Laser treatment of the mixture of the culture medium and the differentiated cells can be performed from 1 second to 20 seconds for a pulsed laser beam in the 300 to 900 nm wavelength band, more specifically 3 seconds to 10 seconds for a pulsed laser beam in the wavelength band, More specifically, the pulsed laser beam of the wavelength band may be irradiated for 4 seconds to 6 seconds.
  • the wavelength band may use a wavelength of 400 nm, 808 nm, and 880 nm.
  • the heat treatment of the mixture of the culture medium and the differentiated cells may be performed by exposing for 1 minute to 10 minutes at a temperature condition of 40 to 50 ° C. and then exposing for 5 to 10 seconds at a temperature condition of 0 ° C. to 4 ° C. .
  • the mixture provided with the physical stimulus is incubated for a period of time to obtain reprogrammed cells.
  • Incubation of the mixture provided with the physical stimulus is carried out during the period of 2 to 10 days in which spheroids stably express pluripotency markers or differentiation markers are formed through a suspended culture or monolayer culture. It may be performed, but is not particularly limited thereto.
  • the floating culture exhibits higher spheroid formation efficiency than the adherent culture.
  • the floating culture has a larger number and size of spheroids than the attached culture, and shows a constant size distribution.
  • the reprogramming starts from this time by increasing or stabilizing the expression of the pluripotency marker or the differentiation marker from about 3 days in the suspension culture of the human skin fibroblasts treated with ultrasound or laser.
  • the expression of pluripotency markers increased or stabilized from about 8 days, and reprogramming started from this time.
  • pluripotency markers for example, OCT3 / 4, SOX2, NANOG, c-MYC, KLF4, TDGF1, SSEA4, TRA-1-60, it can be confirmed that spheroids have pluripotency.
  • Identification of pluripotency markers may be analyzed by RT-PCR or immunocytochemistry, but is not particularly limited thereto.
  • the pluripotent cells of the present invention are characterized by expressing high levels of trioderm markers, ie ectoderm (PAX6, Nestin), mesoderm (Brachyury, SMA), endoderm (GATA4, AFP) markers.
  • trioderm markers ie ectoderm (PAX6, Nestin), mesoderm (Brachyury, SMA), endoderm (GATA4, AFP) markers.
  • spheroids when providing physical stimulation to skin fibroblasts in differentiation-inducing media, may form between about 2 and 6 days after culture.
  • Differentiation markers may be one or more of PAX6, Nestin, MAP2, TuJ1, GFAP or O4 when reprogrammed into neurons.
  • reprogrammed into muscle cells it may be one or more of Desmin, Actinin, SMA, GATA4 or NKX2-5.
  • telomeres When reprogrammed into hepatocytes, it may be one or more of AFP, HNF4a, CK18 or ALB.
  • oil red O staining may be any one of Pparc2, C / ebpa, aP2 or Fabp4.
  • the pluripotent cells of the present invention are characterized by having proliferative capacity by expressing the proliferation marker protein Ki-67.
  • the co-culture of the reprogrammed pluripotent cells with feeder cells can increase the proliferation of pluripotent cells.
  • the reprogramming method of cells of the present invention may further comprise the step of culturing the pluripotent cells in differentiation induction medium.
  • Pluripotent cells may be differentiated into desired differentiated cells according to the type of differentiation-inducing medium.
  • differentiation induction medium hepatocyte differentiation induction medium, bone formation differentiation induction medium, adipocyte differentiation induction medium, muscle cell differentiation induction medium, astrocyte differentiation induction medium, neuronal cell differentiation induction medium, keratinocyte differentiation induction medium, pancreatic beta cell Differentiation-inducing medium or cardiomyocyte differentiation-inducing medium may be used, but is not particularly limited thereto.
  • the physical stimulus applied to the cells may be any of ultrasonic waves, lasers, or heat treatment.
  • FIG. 1 and 2 are conceptual diagrams illustrating a cell reprogramming apparatus 100 according to a first embodiment of the present invention
  • FIG. 3 is an ultrasonic transducer 220-1 constituting the cell reprogramming apparatus shown in FIG. 220-2 and 220-3 are conceptual views illustrating various embodiments of the present invention
  • FIG. 4 is a conceptual diagram illustrating a sample tube 160 constituting the cell reprogramming apparatus illustrated in FIG. 1.
  • the cell reprogramming apparatus 100 includes a culture chamber 110 provided to receive cells and culture medium, and cells and culture medium in the culture chamber 110. And one or more instruments arranged to provide energy by applying physical stimulation of at least one of ultrasonic waves, lasers, and heat.
  • the apparatus may include one or more of the ultrasonic generator 200 for irradiating ultrasonic waves, the laser irradiation apparatus for irradiating a laser, and the temperature control device 120.
  • the cell reprogramming device 100 is one or more of the humidity control device 130 for adjusting the humidity in the culture chamber 110 and the gas control device 140 for controlling the amount of carbon dioxide in the culture chamber 110. It may further comprise.
  • the cell reprogramming apparatus 100 may further include a display unit 150 having an input unit for adjusting at least one of temperature, humidity, and carbon dioxide amount in the culture chamber 110.
  • the display unit 150 may be provided to set the ultrasonic frequency, and time.
  • the present invention is disposed on one side of the culture chamber 110 and the culture chamber 110 that can accommodate the cells and culture medium, it is possible to promote environmental influx to the cells and culture medium (environmental influx) It includes a device capable of providing energy.
  • the reprogrammed cells provide a mixture of differentiated cells and culture medium with energy to promote environmental influx and incubated for a period of time to induce differentiated cells.
  • a device for inducing cell reprogrammed in a cell is provided.
  • the culture chamber 110 may mean a chamber that can be used for normal cell culture.
  • the culture chamber 110 may be a chamber in which temperature, humidity, and / or gas may be adjusted to allow cell culture.
  • the culture chamber 110 includes a temperature control unit and a carbon dioxide control unit, and the cell culture conditions in the culture chamber 110 may be appropriately adjusted at a person skilled in the art according to the purpose and the type of cells.
  • the culture chamber 110 may use a cell suspension culture or a monolayer culture method, it is preferable that such a culture is possible.
  • it may be a culture chamber equipped with a stirrer for suspension culture.
  • the device capable of providing energy to facilitate the inflow of the environment may include an ultrasonic generator 200 capable of irradiating ultrasonic waves, a laser generator capable of irradiating a laser (not shown), or a temperature controller 120. It may include. In addition, the function of the temperature control device 120 may be implemented through the sample tube holder 170 to be described later.
  • the ultrasonic generator 200 may be used without limitation as long as it is a known ultrasonic apparatus that generates ultrasonic waves having a frequency of 10 kHz to 100 MHz.
  • the ultrasonic generator may include an ultrasonic generator 210 and an ultrasonic transducer 220: 220-1, 220-2, 220-3.
  • the ultrasonic wave generator 200 may be provided to replace the ultrasonic transducer 220.
  • the ultrasonic generator 200 may be provided in the ultrasonic chamber 201.
  • the laser generator generates a pulsed laser beam having a wavelength range of 300 to 900 nm, and may use a laser device having a pulse duration of 1 ms to 900 ms and a frequency of 1 to 100 Hz with a 1 to 15 W output. It is not limiting.
  • the temperature control device 120 may use a known temperature control device capable of temperature control in the range of -40 ° C to 99.9 ° C, but is not particularly limited thereto.
  • the temperature control device 120 may be a hot wire provided around the culture chamber.
  • Induction apparatus of reprogrammed cells in the differentiated cells of the present invention is a mixture of the culture medium and the differentiated cells by ultrasonic, laser, or heat treatment using a ultrasonic generator, a laser generator, or a temperature control device for a predetermined time Culture can be induced to reprogram to pluripotent or differentiated cells.
  • the culture medium may be subjected to ultrasonic, laser, or heat treatment in advance before mixing the culture medium with the differentiated cells.
  • the cell reprogramming device 100 may include a humidity control device 130 for controlling the humidity of the culture chamber.
  • a humidity control device 130 for controlling the humidity of the culture chamber.
  • gas control device 140 carbon dioxide control unit
  • the cell reprogramming apparatus 100 may include a display unit 150 for adjusting the above-described temperature, humidity, and carbon dioxide amount.
  • the user can adjust the temperature, humidity, and carbon dioxide amount in the culture chamber 110 by manipulating the display unit.
  • the display unit 150 may include an input unit of a touch input method or a button input method.
  • a sample tube 160 for accommodating cells is disposed in the ultrasonic chamber 201, and the ultrasonic generator 200 may be provided to be lifted and raised toward the sample tube 160.
  • the ultrasonic chamber 201 may be provided with a sample tube holder 170 for supporting the sample tube 160.
  • the sample tube 160 may have a double tube structure.
  • the sample tube holder 170 may have a temperature control function, for example, may be provided as a hit block.
  • the culture chamber 110 may include a sample tube 160 for receiving cells to which ultrasound is applied.
  • the ultrasonic wave generator 200 is arranged to generate ultrasonic waves into the sample tube 160, and thus the ultrasonic chamber 201 has a sample tube holder (sample tube holder) for supporting the sample tube 160 ( 170) is provided.
  • the ultrasonic wave generator 200 in particular, the ultrasonic transducer 220 may be provided to be liftable to correspond to the entry / exit of the sample tube 160 and the sample tube 160 having various sizes.
  • the ultrasonic generator 200 in particular, the ultrasonic transducer 220 may be raised or lowered.
  • the transfer unit 230 is mounted so that the ultrasonic transducer 220 can be lowered, it may be provided to block the inlet of the sample tube 160 when lowered.
  • a lid 111 surrounding the ultrasonic generator 200 and the sample tube 160 may be provided.
  • the lid 111 may be mounted to be opened and closed, and may be formed of a transparent material such as glass or transparent resin.
  • the ultrasonic generator 200 may be interchangeably mounted with various types of ultrasonic transducers 220-1, 220-2, and 220-3 according to the size of the sample tube and the radiation characteristics of the ultrasonic waves. have.
  • the sample tube 160 may have a double tube 161 and 162 structure.
  • the sample tube 160 may be inserted into the sample tube holder 170.
  • the sample tube 160 may be formed of a material (eg, a resin material) having excellent fire resistance and heat resistance, and may implement a sound insulation effect as the sample tube holder 170 surrounds the sample holder.
  • the sample tube holder 170 is preferably provided as a closed space for detecting cell contamination, and preferably includes a soundproof function that can block noise due to ultrasonic waves.
  • the sample tube holder 170 may be provided to perform a function of a temperature control device (for example, a hot wire).
  • FIGS. 8 and 10 show the culture flask 180 constituting the cell reprogramming apparatus 300. Drawing.
  • the cell reprogramming apparatus 100 described with reference to FIGS. 1 to 4 may be applied to a large automated facility.
  • the cell reprogramming apparatus 300 includes an auto sampler 500 and an auto sampler 500 provided to mount a plurality of sample tubes 160. It includes an ultrasonic generator 400 provided to generate ultrasonic waves to any one of the sample tube mounted on.
  • the auto sampler 500 is provided to be rotatable.
  • the ultrasonic generator 400 includes the ultrasonic generator 410, the ultrasonic transducer 420 and the transfer unit 430, as in the first embodiment.
  • the ultrasonic transducer 420 may be provided to be elevated.
  • the ultrasonic wave generator 400 may be in an elevated state.
  • the cell reprogramming apparatus 300 includes a culture medium tank 330 in which a culture medium sonicated is stored, one or more culture flasks 180 to which the culture medium in the culture medium tank 330 is supplied, and a culture flask ( It may further include an injection tube (312) for fluidly connecting the 180 and the sample tube (160).
  • the cells in the sample tube 160 to which the ultrasound is applied may be provided to be moved to the culture flask 180 by the injection tube (312).
  • the cell reprogramming apparatus 300 may further include a transfer belt 320 for transferring the plurality of culture flasks 180.
  • the cell reprogramming apparatus 300 includes an incubator 600 in which the culture flask 180 is accommodated, a recovery tank 610 in which the culture medium of the culture flask 180 in the incubator 600 is recovered, and an incubator 600. Supplying the culture medium to the culture flask 180 in the), and may further include a circulator 620 for recovering the culture medium in the culture flask 180 to the recovery tank 610.
  • the culture flask 180 may be provided with flow passages on both sides, and both flow passages of the culture flask may be located at different heights. Additionally, each flow passage may be equipped with stoppers 181 and 182. In addition, the at least one stopper 182 may be provided to be equipped with an injector (191) for culture medium flow.
  • the automatic cell reprogramming apparatus 300 includes an auto sampler on which a plurality of sample tubes can be mounted.
  • the auto sampler is rotatably provided.
  • the ultrasonic generator 400 described above is provided.
  • the ultrasonic generator 400 is disposed to generate ultrasonic waves inside any one of the sample tubes mounted on the auto sampler 500.
  • the position of the ultrasonic generator 400 may be fixed.
  • the ultrasonic generator 400 may be provided to be raised and lowered along the height direction through the transfer unit 430.
  • the ultrasonic generator 400 (specifically, the ultrasonic transducer) may be in an elevated state, and generates ultrasonic waves to the sample tube 160 located therein. In the process, the ultrasonic generator 400 (specifically, the ultrasonic transducer) may be in a lowered state.
  • the plurality of sample tubes 160 is moved toward the ultrasonic transducer 420, and the ultrasonic transducer 420 generates ultrasonic waves to the sample tube 160 located. That is, when a user mounts a plurality of sample tubes on the auto sampler 500, each sample tube 160 is moved by the auto sampler 500 to the ultrasonic transducer 420, in turn, and the sample tube 160. Ultrasound may be applied to the cells in the stomach.
  • the ultrasonically applied cells may be transferred to the culture flask 180 through an injection tube 312 (also referred to as a 'second injection tube'). That is, during the rotation of the auto sampler 500, an ultrasonic wave may be applied to any one of the sample tubes 160, and the cells in the sample tube 160 to which the ultrasonic waves are applied are injected into the culture flask 180 by the injection tube 312. Can be moved.
  • an injection tube 312 also referred to as a 'second injection tube'
  • the internal temperature, gas, and humidity may be controlled, and may be implemented as an externally sealed device (sterile facility).
  • the ultrasonic transducer 420 may also be repurposed into a heat stick that can be subjected to a laser or heat shock.
  • the automatic cell reprogramming device 300 is provided with a culture medium tank 330 (media tank) in which the cultured medium sonicated is stored.
  • the culture medium in the culture medium tank 330 is supplied to the culture flask 180 through the first injection tube (311). Meanwhile, the plurality of culture flasks 180 are transferred from the auto sampler 500 side to the incubator 600 side by a transfer unit such as a moving belt 320.
  • one or more ultrasonic transducers 420 are provided in the culture medium tank 330.
  • the automatic cell reprogramming apparatus 300 may be further provided with a recovery tank 610 (waste tank) in which the culture medium in the culture flask 180 is recovered.
  • a recovery tank 610 waste tank
  • an ultrasonic treatment device 400 is provided in the culture medium tank 330 and generates ultrasonic waves to the culture medium in the culture medium tank 330 through one or more ultrasonic transducers 420.
  • a display unit 150 (refer to FIG. 1) for setting and adjusting the intensity and time of the ultrasonic wave may be provided.
  • a timer may be provided to count the time for which the ultrasound is applied.
  • the culture medium is supplied to the culture flask 180 in the incubator 600, when the medium exchange time, the circulator 620 for recovering the culture medium in the culture flask 180 to the recovery tank 610 (Circulator) ) May be provided.
  • the circulator 620 is provided to recover the culture medium in the culture flask 180 to the recovery tank 610 when the medium exchange time set in the timer 621 is elapsed.
  • Ultrasonic treated culture medium was provided to supply the circulator 620 (Circulator) from the culture medium tank 330 to each culture flask 180.
  • the incubator 600 may be provided with a shaker 601 for shaking the seated culture flask.
  • the shaker 601 may be provided to shake the culture flask like a seesaw.
  • the incubator 600 like the culture chamber 110 described in the first embodiment, the internal temperature, gas, humidity can be set and adjusted, it can be implemented as a device (sterile facility) sealed to the outside. .
  • the culture flask 180 may have a dockable structure on each side so that the medium can be automatically injected and recovered from the injection tube side and the incubator 600 side.
  • flow passages may be provided at both sides (eg, front / rear) of the culture flask 180, respectively.
  • Each flow passage may be provided with rubber or resin stoppers 181 and 182.
  • the portion to be docked may be provided so that the culture medium does not come out as it is formed of a rubber material.
  • the height of the docked portion is adjusted to recover only the proper amount during the medium recovery. For example, in the medium wastewater, the medium up to the height of the rear flow passage can be recovered.
  • at least one stopper may be provided to engage the injector 191 for flow of the culture medium.
  • a new type of pluripotent cells having pluripotent properties by applying energy such as ultrasound, laser or heat treatment to differentiated cells or any different from the phenotype of the differentiated cells Has the effect of inducing reprogramming into differentiated cells.

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Sustainable Development (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

발명은 환경 유입을 촉진할 수 있는 에너지를 이용한 세포 리프로그래밍 장치에 관한 것으로, 보다 상세하게는 분화된 세포에 초음파, 레이저 또는 열 처리 등의 에너지를 가하여 다능성 특성을 가진 새로운 타입의 다능성 세포 또는 상기 분화된 세포와 표현형이 상이한 임의의 분화세포로의 리프로그래밍을 유도하는 효과를 갖는다.

Description

세포 리프로그래밍 장치
본 발명은 초음파, 레이저 또는 열 처리 등을 통해 환경 유입을 촉진할 수 있는 세포 리프로그래밍 장치 및 방법에 관한 것이다. 본 발명을 지원한 국가연구개발사업은 보건복지부 첨단의료기술개발사업으로서, 과제 고유번호 HI14C3297, 허혈성 뇌손상 모델에서 마이크로 RNA 추적시스템을 이용한 생체 내 줄기세포 분포 및 신경분화 모니터링법 개발 사업이며, 주관기관인 가톨릭관동대학교 산학협력단이 지원하였다. 또한, 본 발명을 지원한 국가연구개발사업은 미래창조과학부 중견연구자지원사업으로서, 과제 고유번호 2013R1A2A2A01068140, 마이크로 RNA 기반 줄기세포분화 추적 방사선 생체분자영상법 개발 사업이며, 주관기관인 가톨릭관동대학교 산학협력단이 지원하였다.
체세포를 다른 종류의 세포, 전구세포 및 줄기세포 등으로 리프로그래밍하는 방법은 세포 치료, 질환 모델 및 이식에서 임상적으로 중요한 기술이다. 이러한 기술들은 현재 몇몇 다능성 유전자 및 다양한 분화 특이적 발현 유전자 등을 표적으로 하는 분자 및 화학 방법들을 통해 시도되었다. 그러나 기존의 방법은 안정성과 효율성에 있어서 지적을 받고 있으며, 과정이 복잡한 단점을 가지고 있다.
세포는 다양한 환경에 노출되어 있으며, 이러한 환경은 세포가 세대를 거쳐 감에 따라 짧거나 혹은 긴 시간 동안에 세포의 유전자 발현에 영향을 미치며, 환경 변화에 의한 스트레스로 인해 세포의 유전자 발현 프로그램이 조절된다. 세포 배양 환경에서 배지 성분은 다양한 물질과 이온을 포함하고 있으며, 이러한 환경의 세포내 유입은 세포 변화를 촉진시킬 수 있는 획기적인 방법이 될 수 있다. 그러나 세포는 인지질로 구성된 세포막에 의해 세포 배지의 다양한 성분들 중에 극성 정도 및 크기의 다양성 때문에 세포 전달 및 유입이 잘 이루어지지 못 하고 있다. 최근에 초음파에 의해 발생된 마이크로버블과 공동현상(cavitation) 효과로 인한 외부 환경의 세포내 유입 가능성이 보고되었으며, 초음파 자극이 세포 발달에 긍정적인 효과를 미친다는 보고가 있다. 또한 초음파로 인해 ATP가 유발되며 이러한 ATP가 세포막의 수용체와 반응하여 물질 수송을 유발한다는 보고도 있다.
이러한 측면에서, 본 발명자들은 초음파와 같은 물리적 자극을 이용하여 체세포 막에 일시적인 손상을 줌과 동시에 초음파로 인한 배지의 공동현상 효과를 이용하여 다양한 물질들을 세포 내로 전달시키는 방법을 고안하여 물리적 자극에 의한 환경유입을 이용한 세포 리프로그래밍 방법, 일명 “Physical stimulation-mediated permeation of Environmental transition guided cellular reprogramming, ENTER 세포”를 개발함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 분화된 세포에 초음파, 레이저 또는 열 처리 등을 통하여 환경 유입을 촉진할 수 있는 세포 리프로그래밍 장치를 제공하는 것을 해결하고자 하는 과제로 한다.
상기한 과제를 해결하기 위하여, 본 발명의 일 측면에 따르면, 세포 및 배양배지를 수용하도록 마련된 배양챔버, 및 배양챔버 내의 세포 및 배양배지에 초음파, 레이저 및 열 중 적어도 하나의 물리적 자극을 가함으로써 에너지를 제공할 수 있도록 마련된 하나 이상의 기구를 포함하는 세포 리프로그래밍 장치가 제공된다.
또한, 상기 기구는, 초음파를 조사하는 초음파 발생장치, 레이저를 조사하는 레이저 조사장치 및 온도조절장치 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
또한, 세포 리프로그래밍 장치는 배양챔버 내의 습도를 조절하기 위한 습도조절장치 및 배양챔버 내의 이산화탄소량을 조절하기 위한 가스조절장치 중 하나 이상을 추가로 포함할 수 있다.
또한, 세포 리프로그래밍 장치는 배양챔버 내의 온도, 습도, 이산화탄소량 중 하나 이상을 조절하기 위한 입력부를 갖는 디스플레이부를 추가로 포함할 수 있다.
또한, 기구가 초음파 발생장치를 포함하고, 디스플레이부는 초음파 주파수, 및 시간을 설정할 수 있도록 마련될 수 있다.
또한, 배양 챔버에는 세포를 수용하는 샘플 튜브가 배치되며, 초음파 발생장치는 샘플 튜브를 향하여 승강 가능하게 마련될 수 있다.
또한, 배양 챔버에는 샘플 튜브를 지지하기 위한 샘플 튜브 홀더가 마련될 수 있다.
또한, 샘플 튜브는 이중 튜브 구조를 가질 수 있다
또한, 초음파 발생장치는 초음파 트랜스듀서가 교체 가능하게 마련될 수 있다.
또한, 온도 조절 장치는 배양 챔버 주변으로 마련된 열선을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 복수 개의 샘플 튜브가 장착될 수 있도록 마련된 오토 샘플러 및 오토 샘플러에 탑재된 어느 한 샘플 튜브로 초음파를 발생시키도록 마련된 초음파 발생장치를 포함하는 세포 리프로그래밍 장치가 제공된다.
또한, 오토 샘플러는 회전 가능하게 마련되고, 초음파 발생장치는 승강 가능하게 마련될 수 있다.
또한, 오토 샘플러가 회전하는 경우, 초음파 발생장치는 상승된 상태일 수 있다.
또한, 세포 리프로그래밍 장치는 초음파 처리된 배양배지가 저장된 배양배지 탱크와, 상기 배양배지 탱크 내의 배양배지가 공급되는 하나 이상의 배양 플라스크, 및 배양 플라스크와 샘플 튜브를 유체 이동 가능하게 연결하는 인젝션 튜브를 추가로 포함할 수 있다.
또한, 초음파가 가해진 샘플 튜브 내의 세포는 인젝션 튜브에 의해 배양 플라스크로 이동되도록 마련될 수 있다.
또한, 세포 리프로그래밍 장치는 복수 개의 배양 플라스크를 이송시키기 위한 이송 벨트를 추가로 포함할 수 있다.
또한, 세포 리프로그래밍 장치는 배양 플라스크가 수용되는 인큐베이터와, 인큐베이터 내의 배양 플라스크의 배양 배지가 회수되는 회수 탱크, 및 인큐베이터 내의 배양 플라스크로 배양 배지를 공급하고, 배양 플라스크 내의 배양 배지를 회수 탱크로 회수하기 위한 서큘레이터를 추가로 포함할 수 있다.
또한, 배양 플라스크는 양 측에 유동 통로가 각각 마련될 수 있다.
또한, 배양 플라스크의 양 측 유동 통로는 서로 다른 높이에 위치할 수 있다.
또한, 각각의 유동 통로에는 마개가 장착될 수 있다.
또한, 적어도 하나의 마개는 배양 배지 유동을 위한 인젝터(injector)가 장착되도록 마련될 수 있다.
또한, 인큐베이터에는 안착된 배양 플라스크를 흔들기 위한 셰이커(shaker)가 마련될 수 있다.
이상에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 일 실시예와 관련된 세포 리프로그래밍 장치는 다음과 같은 효과를 갖는다.
분화된 세포에 초음파, 레이저 또는 열 처리 등의 에너지를 가하여 다능성 특성을 가진 새로운 타입의 다능성 세포 또는 상기 분화된 세포와 표현형이 상이한 임의의 분화세포로의 리프로그래밍을 유도하는 효과를 갖는다.
도 1 및 도 2는 본 발명의 제1 실시예와 관련된 세포 리프로그래밍 장치를 나타내는 개념도들이다.
도 3은 도 1에 도시된 세포 리프로그래밍 장치를 구성하는 초음파 트랜스듀서의 다양한 실시예를 나타내는 개념도이다.
도 4는 도 1에 도시된 세포 리프로그래밍 장치를 구성하는 샘플 튜브를 나타내는 개념도이다.
도 5 내지 도 7은 본 발명의 제2 실시예와 관련된 세포 리프로그래밍 장치를 나타내는 개념도들이다.
도 8은 도 5에 도시된 세포 리프로그래밍 장치를 구성하는 배양 플라스크를 나타내는 도면이다.
도 9는 배양 플라스크에 장착되는 인젝터를 나타내는 도면이다.
도 10은 배양 플라스크에 인젝터가 장착된 상태를 나타내는 도면이다.
이하, 본 발명의 일 실시예에 따른 세포 리프로그래밍 장치를 첨부된 도면을 참고하여 상세히 설명한다.
또한, 도면 부호에 관계없이 동일하거나 대응되는 구성요소는 동일 또는 유사한 참조번호를 부여하고 이에 대한 중복 설명은 생략하기로 하며, 설명의 편의를 위하여 도시된 각 구성 부재의 크기 및 형상은 과장되거나 축소될 수 있다.
본 발명은 분화된 세포 및 배양 배지의 혼합물에 환경유입(environmental influx)을 촉진할 수 있는 물리적 자극을 제공하고, 상기 물리적 자극을 제공받은 혼합물을 일정 시간 배양하여 리프로그래밍된 세포를 수득하는 것을 포함하는, 세포의 리프로그래밍 방법에 관한 것이다.
본 발명은 분화된 세포에 초음파, 레이저 또는 열처리 등 환경 유입을 촉진할 수 있는 물리적 자극을 제공하면서 목적하는 리프로그래밍된 세포를 유도할 수 있는 임의의 배지에서 분화된 세포를 배양하여 다능성(pluripotency) 세포; 또는 상기 분화된 세포와 표현형이 상이한 임의의 분화세포, 예컨대, 간세포, 조골세포, 지방세포, 근육세포, 신경세포, 성상세포, 각질세포, 모근세포, 췌장 베타세포 또는 심근세포 등으로 세포의 리프로그래밍을 유도할 수 있는 것을 특징으로 한다.
일 예로, 리프로그래밍된 세포로 다능성 세포를 목적으로 하는 경우 분화된 세포와 줄기세포 배양 배지를 혼합하고, 물리적 자극을 제공하여 일정 시간 배양함으로써 분화된 세포는 다능성 세포로 리프로그래밍될 수 있다.
다른 예로, 리프로그래밍된 세포로 분화된 세포와 표현형이 상이한 임의의 분화세포를 목적으로 하는 경우, 분화된 세포와 목적하는 분화세포의 분화유도배지를 혼합하고, 물리적 자극을 제공하여 일정 시간 동안 배양함으로써 분화된 세포는 표현형이 상이한 임의의 분화세포로 리프로그래밍될 수 있다.
본 발명의 세포의 리프로그래밍 방법은 분화된 세포에의 물리적 자극을 통해 세포 외의 환경유입에 따라 분화된 세포의 리프로그래밍이 유도되는 것으로 보인다. 이러한 환경유입은 물리적 자극을 제공받은 분화된 세포에서 배출되는 유전물질, 화학물질, 소분자 또는 엑소좀; 또는 배양 배지 성분 등의 이웃하는 분화된 세포로의 유입을 의미한다.
본 발명의 세포의 리프로그래밍 방법에 따르면, 분화된 세포로의 환경유입은 다능성 마커와 3배엽 마커를 안정적으로 발현하는 다능성 세포와 상기 분화된 세포와 표현형이 상이한 분화세포로의 리프로그래밍 방향성을 결정할 수 있는 것으로 보인다.
덧붙여, 리프로그래밍 방향성은 배양 배지의 종류에 의해 결정될 수 있는 것으로 보인다.
즉, 상술한 바와 같이 분화된 세포에서 다능성 세포로의 리프로그래밍은 분화된 세포와 줄기세포 배양 배지의 혼합물에 물리적 자극을 제공한 경우 유도될 수 있고, 분화된 세포에서 표현형이 상이한 임의의 분화세포로의 리프로그래밍은 분화된 세포와 임의의 분화세포의 분화유도배지의 혼합물에 물리적 자극을 제공한 경우 유도될 수 있다.
분화된 세포로의 환경유입과 관련하여, 본 발명자들은 특히 물리적 자극에 의한 세포막 손상과 세포 분비 물질(엑소좀)을 고려하였다. 즉, 초음파, 레이저, 또는 열 처리는 에너지에 의한 온도 상승, 초음파에 의해 생성되는 마이크로버블의 진동, 액체의 흐름 생성 유도 즉, 세포막을 따라 마이크로스트림 생성을 유도하여 이러한 효과로 인해 세포막에 미세한 손상을 가하고, 구멍 생성을 유도함으로써 외부 물질의 흡수가 증가하도록 하는데, 이는 세포 내 Ca2 + 농도 변화 즉, 세포 내 Ca2 + 농도 변화 분석은 세포막에 손상이나 막의 유동성이 증가될 경우 순간적으로 세포 내(cytosol) Ca2+ 농도가 증가함을 반영하여 세포막 유동성의 증가를 확인하는 것으로, 본 발명의 일 구체 예에 따르면, 초음파 처리 직후 Ca2 + 농도가 빠르게 증가하다가 점차 감소하여 초음파를 처리하지 않는 대조군의 수준으로 감소함을 통해 세포막의 손상이 유도된 후 회복됨을 알 수 있었다. 또한, 초음파로 인한 ATP 발생 및 증가가 다양한 세포성 스트레스에 대한 반응 및 세포막내 ATP 수용체와 반응하여 엔도사이토시스를 유도하는 것으로 알려져 있다. 즉 ATP 농도와 세포 손상 및 세포내 물질 유입과의 연관성이 있고, 이를 확인하기 위해, 초음파 처리 후 세포에서의 ATP 농도를 분석한 결과, 미처리 대조군에 비해 높은 수준으로 ATP를 농도가 높게 나타났다. 아울러, ATP 의해 영향을 받는 세포막내 이온성 P2X 수용체와 대사성 P2Y 수용체 발현 역시 초음파 처리된 세포에서 대조군 대비 활성화되었다. 이와 같은 결과는 초음파로 세포내 손상뿐만 아니라 세포 외부환경의 유입 가능성을 나타낸다.
한편, 엑소좀은 내부에 유전정보 물질(DNA, mRNA, microRNA, protein)을 포함하고 있는 것으로 알려져 있는데, 세포막 손상을 통해 세포막 밖으로 빠져 나온 엑소좀이 주변 다른 세포에 다시 들어가는 과정을 통해 엑소좀 내부에 존재하는 유전정보 물질이 전달될 수 있다. 따라서, 초음파 처리에 의한 자극으로 인해 세포 내 저발현되거나 발현이 억제된 상태로 유지되었던 다능성 마커들의 발현이 유도 내지 촉진됨과 동시에 세포막에 손상이 생김에 따라, 상기 발현이 유도 내지 촉진된 다능성 마커들을 포함하는 세포 내부에 존재하는 엑소좀이 외부로 배출되어 주변 세포에 전달되는데 주변 세포 역시 세포막이 부분적으로 손상된 상태이기 때문에 세포막 유동성이 증가되어 세포 내부로 엑소좀이 들어가는 효율이 정상 상태에 비해 더 높을 것으로 추정되며, 이러한 엑소좀 내부에 존재하는 상기 발현 유도 내지 촉진된 다능성 관련 유전정보가 전달되어 다능성 세포가 만들어지는 것으로 생각되었다. 본 발명의 일구체예에서 다능성 세포 유도 과정 중 배양 배지를 회수하고, 배지 내 엑소좀을 추출하여 엑소좀 내부에 다능성 세포 관련 다능성 마커가 존재하는 지 확인한 결과, 알려진 다능성 마커들이 높은 발현 정도를 보이면서 확인되어 본 발명자들의 이러한 가설을 뒷받침하는 것으로 사료된다. 또한, 이러한 초음파, 레이저, 또는 열 처리에도 핵형 기형이 없이 정상인 것으로 나타났다.
이러한 가설은 세포막 손상에 의한 엑소좀 방출 유도를 통해 다능성 세포를 제조할 수 있음을 가능케 한다.
상기 분화된 세포로, 포유류 유래의 진피섬유아세포, 피부섬유아세포 등을 포함하는 체세포; 자궁암세포(HeLa), 간암세포(Hep3B) 등을 포함하는 암세포; 또는 폐 상피세포(L132 cell)를 포함하는 기관 내 조직세포 등을 사용할 수 있다.
본 명세서에서, 용어 "체세포"란 성체를 구성하는 세포로서 분화능 및 자가생산능이 제한된 세포를 의미한다. 일 구현예에 따르면, 상기 체세포는 포유류의 피부, 모발, 지방을 구성하는 체세포일 수 있고, 바람직하게는 포유류 유래의 섬유아세포일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
본 명세서에서, 용어 "다능성 세포"는 물리적 자극, 엄격한 의미에서 초음파, 레이저, 또는 열 처리 후 다능성을 획득한 세포를 말한다. 본 명세서에서 상기 다능성은 포괄적으로 줄기세포에서 발현되는 다능성 마커를 안정적으로 발현하는 상태를 의미한다. 아울러, 세 종류의 내배엽, 외배엽 및 중배엽의 3배엽 마커를 발현하는 상태를 의미한다. 상기 다능성 세포는 "Embryonic stem cell media-based En vironmental t ransition-guided c e llular r eprogramming(es/ENTER) 세포 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 다능성 세포는 외부 환경에 따라 분화 유도가 잘되며, 줄기세포의 속성 대비 분화속성이 강한 전구세포(progenitor cell)의 속성이 더 강하다는 점에서 공지의 유도 만능 줄기세포와 차별화된 특징을 갖는다. 즉, 유도 만능 줄기세포와 같은 배아줄기세포를 세포 치료제로 사용하는 경우, 어느 정도 분화 과정을 거치는 준비 단계가 요구되며, 암으로 변할 수 있는 위험 요소를 내포하고, 역분화 유도인자 도입을 위해 바이러스 벡터를 사용함에 따른 안전성 문제가 대두되나, 본 발명의 다능성 세포는 유전자 변이를 위한 역분화 유도인자 또는 화학물질 등의 역분화 유도 물질을 별도로 도입하지 않고 유도되므로 다른 종류의 세포와 공동 배양을 통한 배양이 필요 없어 세포 오염(다른 세포가 섞이는 문제점) 문제점이 없고 인 비보 실험에서 암세포와 유사한 테라토마를 형성하지 않아 암 발생의 문제점이 없어 안전성이 확보되어 있다. 다시 말해, 본 발명의 다능성 세포는 유도 과정이 단순하고 짧아 자가세포를 처리하여 이식 때까지 시간을 획기적으로 단축할 수 있는 장점을 가진다.
상기 다능성 세포는 OCT3/4, SOX2, NANOG, c-MYC, KLF4, TDGF1, SSEA4, TRA-1-60, PAX6, Nestin, Brachyury, SMA, GATA4, 또는 AFP 중 어느 하나의 다능성 마커 또는 중배엽 및 내배엽으로 이루어진 3배엽 마커 유전자를 안정적으로 발현하는 것을 특징으로 한다.
본 명세서에서, 용어 "리프로그래밍(reprogramming)"은 분화능이 없는 세포 또는 일정 부분 분화능이 있는 세포 등 서로 다른 양태로 존재하는 분화된 세포로부터 최종적으로 새로운 유형의 세포 또는 새로운 유형의 분화잠재력을 갖는 상태로 복원 또는 전환될 수 있는 프로세스를 의미한다. 본 발명에 따르면, 분화된 세포는 환경유입을 촉진할 수 있는 물리적 자극을 받을 시 다능성 세포 또는 분화된 세포와 표현형이 상이한 목적하는 임의의 분화세포로 리프로그래밍될 수 있다.
상기 분화세포는 예시로, PAX6, Nestin, MAP2, TuJ1, GFAP 또는 O4 중 어느 하나를 발현하는 신경세포("neuronal stem cell media-based ENTER, n/ENTER"라고 함); Desmin, Actinin, SMA, GATA4 또는 NKX2-5 중 어느 하나를 발현하는 근육세포("muscle differentiation media-based ENTER, m/ENTER"라고 함); AFP, HNF4a, CK18 또는 ALB 중 어느 하나를 발현하는 간세포("hepatocyte differentiation media-based ENTER, h/ENTER"라고 함); 또는 Pparc2, C/ebpa, aP2 또는 Fabp4 중 어느 하나를 발현하는 지방세포("adipocyte differentiation media-based ENTER, a/ENTER"라고 함)를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
본 명세서에서, "배양 배지"는 포괄적 의미에서 인 비트로 세포 배양에 사용되는 배지로, 본 발명에서는 줄기세포 배양 배지 또는 분화유도배지를 의미하며, 상기 줄기세포 배양 배지는 더 구체적으로 배아줄기세포 배양 배지를 의미한다. 또한, "분화유도배지"는 통상의 줄기세포의 분화세포로의 유도에 사용하는 배지로, 예를 들어, 간세포 분화유도배지, 골형성 분화유도배지, 지방세포 분화유도배지, 근육세포 분화유도배지, 성상세포 분화유도배지, 신경세포 분화유도배지, 각질세포 분화유도배지, 췌장 베타세포 분화유도배지 또는 심근세포 분화유도배지 등을 사용할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 세포의 리프로그래밍 방법은 도 1을 참고하여 구체적으로 설명하면 다음과 같다.
우선, 배양 배지와 분화된 세포를 혼합하고, 상기의 혼합물에 물리적 자극을 제공한다.
분화된 세포의 혼합물에 물리적 자극을 제공하기 전에 배양 배지에 물리적 자극을 제공하여 세포의 리프로그래밍 효율을 높일 수 있다.
상기 물리적 자극은 초음파, 레이저 또는 열처리 중 어느 하나일 수 있다.
상기 배양 배지에 대한 초음파 처리는 출력강도 1W/cm2 내지 20W/cm2의 초음파를 1 내지 20 분, 구체적으로, 출력강도 2W/cm2 내지 10W/cm2의 초음파를 5 내지 15 분, 더 구체적으로, 출력강도 3W/cm2 내지 7W/cm2의 초음파를 7 내지 13 분 동안 동안 동안 수행하는 것일 수 있다.
배양 배지에 대한 레이저 처리는 300 내지 900 nm 파장 대역의 펄스형 레이저 빔을 1분 내지 20분, 더 구체적으로, 상기 파장 대역의 펄스형 레이저 빔을 3분 내지 15분, 보다 구체적으로, 상기 파장 대역의 펄스형 레이저 빔을 5분 내지 10분 동안 조사하는 것일 수 있다. 상기 파장 대역은 예를 들어 400 nm, 808 nm, 880 nm의 파장을 사용할 수 있다.
배양 배지에 대한 열 처리는 40 내지 50 ℃의 온도 조건에서 5분 내지 20분 동안 수행할 수 있다.
분화된 세포에 물리적 자극을 제공할 경우, 일정 세기로 노출시키는 것이 좋고, 이 범위를 벗어날 경우 세포 생존율이 감소할 수 있다.
따라서, 배양 배지와 분화된 세포의 혼합물에 대한 초음파 처리는 출력강도 0.5W/cm2 내지 3W/cm2로 1 내지 5초 동안, 더 구체적으로, 출력강도 0.7W/cm2 내지 2W/cm2로 1 내지 5초 동안, 보다 구체적으로, 출력강도 0.8W/cm2 내지 1.5W/cm2로 1 내지 5초 동안 수행하는 것일 수 있다.
배양 배지와 분화된 세포의 혼합물에 대한 레이저 처리는 300 내지 900 nm 파장 대역의 펄스형 레이저 빔을 1초 내지 20초, 더 구체적으로, 상기 파장 대역의 펄스형 레이저 빔을 3초 내지 10초, 보다 구체적으로, 상기 파장 대역의 펄스형 레이저 빔을 4초 내지 6초 동안 조사하는 것일 수 있다. 상기 파장 대역은 예를 들어 400 nm, 808 nm, 880 nm의 파장을 사용할 수 있다.
배양 배지와 분화된 세포의 혼합물에 대한 열 처리는 40 내지 50 ℃의 온도 조건에서 1분 내지 10분 동안 노출한 후 0℃ 내지 4℃의 온도 조건에서 5 내지 10초간 노출하여 수행하는 것일 수 있다.
다음으로, 물리적 자극이 제공된 혼합물을 일정 시간 동안 배양하여 리프로그래밍된 세포를 수득한다.
물리적 자극이 제공된 혼합물의 배양은 부유 배양(suspended culture) 또는 부착 배양(monolayer culture) 방식을 통해 다능성 마커 또는 분화 마커를 안정적으로 발현하는 스페로이드가 형성되는 기간, 즉, 2일 내지 10일 동안 수행하는 것일 수 있으나, 이에 특별히 제한하는 것은 아니다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 부유 배양은 부착 배양에 비해 더 높은 스페로이드 형성 효율을 나타낸다. 또한, 부유 배양은 부착 배양에 비해 스페로이드의 수와 크기가 더 크며, 일정한 크기 분포를 나타낸다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 초음파 또는 레이저 처리된 사람 피부 섬유아세포의 부유 배양 시 대략 3일째부터 다능성 마커 또는 분화 마커의 발현이 증가하거나 안정화되어 이 시기부터 리프로그래밍이 시작되는 것으로 보인다. 또한, 열 처리된 사람 피부 섬유아세포의 부유 배양 시 대략 8일째부터 다능성 마커의 발현이 증가하거나 안정화되어 이 시기부터 리프로그래밍이 시작되는 것으로 보인다.
상기 다능성 마커, 예컨대, OCT3/4, SOX2, NANOG, c-MYC, KLF4, TDGF1, SSEA4, TRA-1-60 등이 발현됨을 통해 스페로이드가 다능성을 가짐을 확인할 수 있다. 다능성 마커의 확인은 RT-PCR 또는 면역세포화학법을 통해 분석할 수 있으나, 이에 특별히 제한하는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 다능성 세포는 3배엽 마커, 즉 외배엽(PAX6, Nestin), 중배엽(Brachyury, SMA), 내배엽(GATA4, AFP) 마커들을 높은 수준으로 발현하는 특징을 나타낸다.
다른 구체예에서, 분화유도배지에서 피부 섬유아세포에 대해 물리적 자극을 제공하는 경우, 배양 후 약 2일 내지 6일 사이에 스페로이드가 형성될 수 있다.
분화 마커는, 신경세포로 리프로그래밍되는 경우, PAX6, Nestin, MAP2, TuJ1, GFAP 또는 O4 중 하나 이상일 수 있다.
근육세포로 리프로그래밍되는 경우, Desmin, Actinin, SMA, GATA4 또는 NKX2-5 중 하나 이상일 수 있다.
간세포로 리프로그래밍되는 경우, AFP, HNF4a, CK18 또는 ALB 중 하나 이상일 수 있다.
지방세포 리프로그래밍되는 경우, oil red O 염색이 되며, Pparc2, C/ebpa, aP2 또는 Fabp4 중 어느 하나일 수 있다.
또한, 본 발명의 다능성 세포는 증식 마커 단백질인 Ki-67를 발현하여 증식능을 가지는 특징이 있다.
또한, 상기의 리프로그래밍된 다능성 세포를 영양세포와 공배양할 경우 다능성 세포의 증식이 증가될 수 있다.
또한, 본 발명의 세포의 리프로그래밍 방법은 상기 다능성 세포를 분화유도배지에서 배양하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 분화유도배지의 종류에 따라 다능성 세포는 목적하는 분화세포로 분화될 수 있다.
상기 분화유도배지로, 간세포 분화유도배지, 골형성 분화유도배지, 지방세포 분화유도배지, 근육세포 분화유도배지, 성상세포 분화유도배지, 신경세포 분화유도배지, 각질세포 분화유도배지, 췌장 베타세포 분화유도배지 또는 심근세포 분화유도배지 등을 사용할 수 있으나, 이에 특별히 제한하는 것은 아니다.
이하, 전술한 세포 리프로그래밍 방법을 수행할 수 있는 세포 리프로그래밍 장치를 첨부된 도면을 참조하여 구체적으로 설명한다.
전술한 바와 같이, 세포에 가해지는 물리적 자극은 초음파, 레이저 또는 열처리 중 어느 하나일 수 있다.
도 1 및 도 2는 본 발명의 제1 실시예와 관련된 세포 리프로그래밍 장치(100)를 나타내는 개념도들이고, 도 3은 도 1에 도시된 세포 리프로그래밍 장치를 구성하는 초음파 트랜스듀서(220-1, 220-2, 220-3)의 다양한 실시예를 나타내는 개념도이며, 도 4는 도 1에 도시된 세포 리프로그래밍 장치를 구성하는 샘플 튜브(160)를 나타내는 개념도이다.
도 1 및 도 2를 참조하면, 본 발명의 일 실시예와 관련된 세포 리프로그래밍 장치(100)는 세포 및 배양배지를 수용하도록 마련된 배양챔버(110), 및 배양챔버(110) 내의 세포 및 배양배지에 초음파, 레이저 및 열 중 적어도 하나의 물리적 자극을 가함으로써 에너지를 제공할 수 있도록 마련된 하나 이상의 기구를 포함한다.
또한, 상기 기구는, 초음파를 조사하는 초음파 발생장치(200), 레이저를 조사하는 레이저 조사장치 및 온도조절장치(120) 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
또한, 세포 리프로그래밍 장치(100)는 배양챔버(110) 내의 습도를 조절하기 위한 습도조절장치(130) 및 배양챔버(110) 내의 이산화탄소량을 조절하기 위한 가스조절장치(140) 중 하나 이상을 추가로 포함할 수 있다.
또한, 세포 리프로그래밍 장치(100)는 배양챔버(110) 내의 온도, 습도, 이산화탄소량 중 하나 이상을 조절하기 위한 입력부를 갖는 디스플레이부(150)를 추가로 포함할 수 있다.
또한, 기구가 초음파 발생장치(200)인 경우, 디스플레이부(150)는 초음파 주파수, 및 시간을 설정할 수 있도록 마련될 수 있다.
구체적으로, 본 발명은 세포 및 배양 배지를 수용할 수 있는 배양챔버(110) 및 상기 배양챔버(110)의 일측에 배치되고, 상기 세포 및 배양 배지에 환경 유입(environmental influx)을 촉진할 수 있는 에너지를 제공할 수 있는 기구를 포함한다. 또한, 리프로그래밍된 세포는 분화된 세포 및 배양 배지의 혼합물에 환경 유입을 촉진할 수 있는 에너지를 제공하고, 상기 에너지를 제공받은 혼합물을 일정 시간 배양하여 분화된 세포에서 유도된 것인, 분화된 세포에서 리프로그래밍된 세포의 유도 장치를 제공한다.
상기 배양챔버(110)는 통상 세포 배양에 사용 가능한 챔버를 의미할 수 있다. 또한, 배양챔버(110)는 세포 배양이 가능하도록 온도, 습도, 및/또는 가스 등이 조절 가능한 챔버일 수 있다. 예를 들어, 배양챔버(110)는 온도 제어부와 이산화탄소 제어부를 구비하고, 배양챔버(110) 내 세포 배양 조건은 목적과 세포의 종류에 따라 당업자 수준에서 적절히 조절될 수 있다.
또한, 상기 배양챔버(110)는 세포의 부유 배양 또는 단층 배양 방식을 사용할 수 있어, 이러한 배양이 가능한 구조로 되어 있는 것이 좋다. 예컨대 부유 배양을 위한 교반기가 구비된 배양챔버일 수 있다.
상기 환경 유입 촉진할 수 있는 에너지를 제공할 수 있는 장치는 초음파를 조사할 수 있는 초음파 발생장치(200), 레이저를 조사할 수 있는 레이저 발생장치(미도시), 또는 온도조절장치(120)를 포함할 수 있다. 또한, 상기 온도조절장치(120)는 후술할 샘플 튜브 홀더(170)를 통해 그 기능이 구현될 수도 있다.
상기 초음파 발생장치(200)는 주파수가 10kHz 내지 100MHz인 초음파를 발생하는 공지의 초음파 장치라면 제한 없이 사용할 수 있다. 상기 초음파 발생장치는 초음파 발생부(Ultrasonic generator)(210) 및 초음파 트랜스듀서(Ultrasonic transducer)(220: 220-1, 220-2, 220-3)를 포함할 수 있다. 또한, 초음파 발생장치(200)는 초음파 트랜스듀서(220)가 교체 가능하게 마련될 수 있다. 또한, 초음파 발생장치(200)는 초음파 챔버(201) 내에 마련될 수 있다.
상기 레이저 발생장치는 300 내지 900 nm 파장 대역의 펄스형 레이저 빔을 발생하고, 1 내지 15W 출력으로, 펄스 지속 시간이 1ms 내지 900ms이고, 주파수가 1 내지 100Hz인 레이저 장치를 사용할 수 있으나, 이에 특별히 제한하는 것은 아니다.
온도조절장치(120)는 -40℃ 내지 99.9℃ 범위의 온도 조절이 가능한 공지의 온도조절장치를 사용할 수 있으나, 이에 특별히 제한하는 것은 아니다. 예를 들어, 상기 온도조절장치(120)는 배양 챔버 주변으로 마련된 열선일 수도 있다.
본 발명의 분화된 세포에서 리프로그래밍된 세포의 유도 장치는 배양 배지와 분화된 세포의 혼합물에 상기 초음파 발생장치, 레이저 발생장치, 또는 온도조절장치를 이용하여 초음파, 레이저, 또는 열 처리하고 일정 시간 배양하여 다능성 세포 또는 분화세포로의 리프로그래밍을 유도할 수 있다. 이때, 리프로그래밍 효율을 높이기 위해 배양 배지를 분화된 세포와 혼합하기 전에 배양 배지에 초음파, 레이저, 또는 열 처리를 미리 수행할 수 있다.
또한, 세포 리프로그래밍 장치(100)는, 배양 챔버의 습도를 조절하기 위한 습도조절장치(130)를 포함할 수 있다. 전술한, 온도조절장치(120)와 습도조절장치(130) 및 가스조절장치(이산화탄소 제어부)(140)를 통해, 배양 챔버(110) 내의 온도, 습도, 및 이산화탄소량을 적절히 조절할 수 있다.
또한, 상기 세포 리프로그래밍 장치(100)는, 전술한 온도, 습도, 및 이산화탄소량을 조절하기 위한 디스플레이부(150)를 포함할 수 있다. 사용자는 디스플레이부를 조작함으로써, 배양챔버(110) 내의 온도, 습도, 및 이산화탄소량을 조절할 수 있다. 상기 디스플레이부(150)는 터치 입력 방식 또는 버튼 입력 방식의 입력부를 포함할 수 있다.
또한, 초음파 챔버(201)에는 세포를 수용하는 샘플 튜브(160)가 배치되며, 초음파 발생장치(200)는 샘플 튜브(160)를 향하여 승강 가능하게 마련될 수 있다. 또한, 초음파 챔버(201) 에는 샘플 튜브(160)를 지지하기 위한 샘플 튜브 홀더(170)가 마련될 수 있다. 또한, 샘플 튜브(160)는 이중 튜브 구조를 가질 수 있다. 또한, 샘플 튜브 홀더(170)는 온도 조절 기능을 가질 수 있고, 예를 들어, 히트(haet) 블록으로 마련될 수 있다.
구체적으로, 배양 챔버(110)는, 초음파가 가해지는 세포를 수용하는 샘플 튜브(sample tube)(160)를 포함할 수 있다. 또한, 상기 초음파 발생장치(200)는 상기 샘플 튜브(160) 내로 초음파를 발생하도록 배치되며, 이에 따라 초음파 챔버(201)에는 샘플 튜브(160)를 지지하기 위한 샘플 튜브 홀더(sample tube holder)(170)가 마련된다. 한편, 샘플 튜브(160)의 입/출입 및 다양한 크기의 샘플 튜브(160)에 대응할 수 있도록, 상기 초음파 발생장치(200), 구체적으로 초음파 트랜스듀서(220)는 승강 가능하게 마련될 수 있다. 또한, 상기 디스플레이부(150)를 조작함으로써, 초음파 발생장치(200), 특히, 초음파 트랜스듀서(220)를 상승 또는 하강시킬 수 있다.
또한, 상기 초음파 트랜스듀서(220)가 승하강 가능하게 장착되는 이송부(230)는, 하강시 샘플 튜브(160)의 입구를 막도록 마련될 수 있다. 또한, 초음파 챔버(201) 내의 온도, 습도, 및 가스 수준을 유지시키기 위하여, 상기 초음파 발생장치(200) 및 샘플 튜브(160)를 둘러싸는 뚜껑(111)이 마련될 수 있다. 상기 뚜껑(111)은 개폐 가능하게 장착될 수 있으며, 유리 또는 투명 수지와 같은 투명한 재질로 형성될 수 있다.
도 3을 참조하면, 초음파 발생장치(200)는 샘플 튜브의 크기 및 초음파의 방사 특성에 따라 다양한 종류의 초음파 트랜스듀서(220-1, 220-2, 220-3)가 교체 가능하게 장착될 수 있다.
도 4를 참조하면, 샘플 튜브(160)는 이중 튜브(161, 162) 구조를 가질 수 있다. 또한, 샘플 튜브 홀더(170) 내부에 샘플 튜브(160)가 삽입될 수 있다. 이때, 샘플 튜브(160)는 내화성 및 내열성이 우수한 재질(예를 들어, 수지 재질)로 형성될 수 있고, 샘플 튜브 홀더(170)가 샘플 홀더를 둘러쌈에 따라 방음 효과를 구현할 수 있다. 구체적으로, 상기 샘플 튜브 홀더(170)는 세포 오염 발지를 위해 밀폐된 공간으로 마련되는 것이 바람직하며, 초음파로 인한 소음이 차단될 수 있는 방음 기능이 포함되는 것이 바람직하다. 한편, 샘플 튜브 홀더(170)는 온도 조절 장치(예를 들어, 열선)의 기능을 수행하도록 마련될 수도 있다.
도 5 내지 도 7은 본 발명의 제2 실시예와 관련된 세포 리프로그래밍 장치(300)를 나타내는 개념도들이고, 도 8 및 도 10은 세포 리프로그래밍 장치(300)를 구성하는 배양 플라스크(180)를 나타내는 도면이다.
도 5를 참조하면, 도 1 내지 도 4를 설명한 세포 리프로그래밍 장치(100)는 대형 자동화 설비에 적용이 가능하다.
도 5 및 도 6을 참조하면, 본 발명의 제2 실시예와 관련된 세포 리프로그래밍 장치(300)는 복수 개의 샘플 튜브(160)가 장착될 수 있도록 마련된 오토 샘플러(500) 및 오토 샘플러(500)에 탑재된 어느 한 샘플 튜브로 초음파를 발생시키도록 마련된 초음파 발생장치(400)를 포함한다.
또한, 오토 샘플러(500)는 회전 가능하게 마련된다. 또한, 상기 초음파 발생장치(400)는 제1 실시예에서와 마찬가지로, 초음파 발생부(410)와 초음파 트랜스듀서(420) 및 이송부(430)를 포함한다. 이때, 초음파 트랜스듀서(420)는 승강 가능하게 마련될 수 있다.
또한, 오토 샘플러(500)가 회전하는 경우, 초음파 발생장치(400)는 상승된 상태일 수 있다.
또한, 세포 리프로그래밍 장치(300)는 초음파 처리된 배양배지가 저장된 배양배지 탱크(330)와, 상기 배양배지 탱크(330) 내의 배양배지가 공급되는 하나 이상의 배양 플라스크(180), 및 배양 플라스크(180)와 샘플 튜브(160)를 유체 이동 가능하게 연결하는 인젝션 튜브(312)를 추가로 포함할 수 있다.
또한, 초음파가 가해진 샘플 튜브(160) 내의 세포는 인젝션 튜브(312)에 의해 배양 플라스크(180)로 이동되도록 마련될 수 있다.
또한, 세포 리프로그래밍 장치(300)는 복수 개의 배양 플라스크(180)를 이송시키기 위한 이송 벨트(320)를 추가로 포함할 수 있다.
또한, 세포 리프로그래밍 장치(300)는 배양 플라스크(180)가 수용되는 인큐베이터(600)와, 인큐베이터(600) 내의 배양 플라스크(180)의 배양 배지가 회수되는 회수 탱크(610), 및 인큐베이터(600) 내의 배양 플라스크(180)로 배양 배지를 공급하고, 배양 플라스크(180) 내의 배양 배지를 회수 탱크(610)로 회수하기 위한 서큘레이터(620)를 추가로 포함할 수 있다.
또한, 배양 플라스크(180)는 양 측에 유동 통로가 각각 마련될 수 있고, 또한, 배양 플라스크의 양 측 유동 통로는 서로 다른 높이에 위치할 수 있다. 또한, 각각의 유동 통로에는 마개(181, 182)가 장착될 수 있다. 또한, 적어도 하나의 마개(182)는 배양 배지 유동을 위한 인젝터(injector)(191)가 장착되도록 마련될 수 있다.
구체적으로, 제2 실시예와 관련된 자동 세포 리프로그래밍 장치(300)는, 복수 개의 샘플 튜브가 장착될 수 있는 오토 샘플러(auto sampler)를 포함한다. 상기 오토 샘플러는 회전 가능하게 마련된다.
또한, 전술한 초음파 발생장치(400)가 마련된다. 여기서 상기 초음파 발생장치(400)는 오토 샘플러(500)에 탑재된 어느 한 샘플 튜브 내부에 초음파를 발생시킬 수 있도록 배치된다. 예를 들어, 초음파 발생장치(400)의 위치는 고정적일 수 있다. 물론, 전술한 바와 같이, 초음파 발생장치(400)는 이송부(430) 등을 통해, 높이 방향을 따라 상승 및 하강 가능하도록 마련될 수 있다.
예를 들어, 상기 오토 샘플러(500)가 회전하는 과정에서, 상기 초음파 발생장치(400)(구체적으로, 초음파 트랜스듀서)는 상승된 상태일 수 있고, 위치된 샘플 튜브(160)로 초음파를 발생하는 과정에서, 상기 초음파 발생장치(400)(구체적으로, 초음파 트랜스듀서)는 하강된 상태일 수 있다.
이때, 오토 샘플러(500)가 회전함에 따라, 복수 개의 샘플 튜브(160)가 초음파 트랜스듀서(420) 측으로 이동되고, 초음파 트랜스듀서 (420)는 위치된 샘플 튜브(160)로 초음파를 발생시킨다. 즉, 사용자가 오토 샘플러(500)에 복수 개의 샘플 튜브를 탑재시키면, 각각의 샘플 튜브(160)는 오토 샘플러(500)에 의해, 차례로 초음파 트랜스듀서(420)로 이동되고, 샘플 튜브(160)의 내의 세포에 초음파가 가해질 수 있다.
또한, 초음파가 가해진 세포는 인젝션 튜브(injection tube)(312)('제2 인젝션 튜브'라고도 함)를 통해 배양 플라스크(180)(Culture flask) 측으로 이송될 수 있다. 즉, 오토 샘플러(500)의 회전 과정에서, 어느 한 샘플 튜브(160)에는 초음파가 가해질 수 있고, 초음파가 가해진 샘플 튜브(160) 내의 세포는 인젝션 튜브(312)에 의해 배양 플라스크(180) 측으로 이동될 수 있다.
제1 실시예에서 설명한 바와 같이, 제2 실시예와 관련된 자동 세포 리프로그래밍 장치(300)에서도, 내부 온도, 가스, 습도 들이 조절될 수 있으며, 외부와 밀폐된 장치(무균 시설)로 구현될 수 있다. 또한, 초음파 트랜스듀서(420) 역시, 레이저 또는 열 충격(heat shock)를 가할 수 있는 히트 스틱(heat stick)으로 용도 변경이 가능하다.
또한, 상기 자동 세포 리프로그래밍 장치(300)에는 초음파 처리된 배양배지가 저장된 배양배지 탱크(330)(media tank)가 마련된다. 상기 배양배지 탱크(330) 내의 배양 배지는 제1 인젝션 튜브(311)를 통해 배양 플라스크(180)로 공급된다. 한편, 복수 개의 배양 플라스크(180)는 이송 벨트(moving belt)(320)와 같은 이송부에 의해 오토 샘플러(500) 측에서 인큐베이터(600) 측으로 이송된다. 또한, 배양배지 탱크(330) 내에는 하나 이상의 초음파 트랜스듀서(420)가 마련된다.
또한, 상기 자동 세포 리프로그래밍 장치(300)에는 배양 플라스크(180) 내의 배양 배지가 회수되는 회수 탱크(610)(waste tank)가 추가로 마련될 수 있다. 배양 배지의 초음파 처리와 관련하여, 초음파 처리 장치(400)가 배양배지 탱크(330)에 마련되고, 하나 이상의 초음파 트랜스듀서(420)를 통해 배양배지 탱크(330) 내의 배양 배지로 초음파를 발생시킨다. 이때, 초음파의 강도 및 시간을 설정 및 조절하기 위한 디스플레이부(150, 도 1 참조)가 마련될 수 있다. 또한, 초음파가 인가되는 시간을 카운트하기 위한 타이머가 마련될 수 있다.
이때, 인큐베이터(600) 내의 배양 플라스크(180)로 배양 배지를 공급하고, 배지 교환시간이 되면, 배양 플라스크(180) 내의 배양 배지를 회수 탱크(610)로 회수하기 위한 서큘레이터(620)(Circulator)가 마련될 수 있다. 상기 서큘레이터(620)는, 타이머(621)에 설정된 배지 교환시간이 경과하면, 배양 플라스크(180) 내의 배양배지를 회수 탱크(610)로 회수시키도록 마련되고, 초음파 트랜스듀서(420)에 의해 초음파가 처리된 배양배지를 배양배지 탱크(330)에서부터 각각의 배양 플라스크(180)로 서큘레이터(620)(Circulator)로 공급하도록 마련되었다.
또한, 인큐베이터(600)에는 안착된 배양 플라스크를 흔들기 위한 셰이커(shaker)(601)가 마련될 수 있다. 예를 들어, 셰이커(601)는 배양 플라스크를 시소와 같이 흔들도록 마련될 수 있다.
한편, 상기 인큐베이터(600)는 제1 실시예에서 설명한 배양 챔버(110)와 마찬가지로, 내부 온도, 가스, 습도들이 설정 및 조절될 수 있으며, 외부와 밀폐된 장치(무균 시설)로 구현될 수 있다.
도 8 내지 도 11을 참조하면, 배양 플라스크(180)는 인젝션 튜브 측 및 인큐베이터(600) 측에서 자동적으로 배지 주입 및 회수가 가능하도록 양 측에서 각각 도킹 가능한 구조를 가질 수 있다. 도 8 및 도 10을 참조하면, 배양 플라스크(180)의 양 측(예를 들어, 앞/뒤)에는 각각 유동 통로가 마련될 수 있다. 각각의 유동 통로에는 고무 또는 수지 재질의 마개(181, 182)가 마련될 수 있다. 특히, 도킹되는 부분은 고무 재질로 형성됨에 따라 배양 배지가 밖으로 나오지 않게 마련될 수 있다. 특히, 배지 회수 시 적정량만을 회수할 수 있도록 도킹되는 부분의 높이가 조절되어 있다. 예를 들어, 배지 폐수 시에는 뒤쪽 유동 통로의 높이까지의 배지가 회수될 수 있다. 또한, 도 9 및 도 10을 참조하면, 적어도 하나의 마개는 배양 배지 유동을 위해, 인젝터(191)와 결합하도록 마련될 수 있다.
위에서 설명된 본 발명의 바람직한 실시예는 예시의 목적을 위해 개시된 것이고, 본 발명에 대한 통상의 지식을 가지는 당업자라면 본 발명의 사상과 범위 안에서 다양한 수정, 변경, 부가가 가능할 것이며, 이러한 수정, 변경 및 부가는 하기의 특허청구범위에 속하는 것으로 보아야 할 것이다.
본 발명의 일 실시예와 관련된 세포 리프로그래밍 장치는, 분화된 세포에 초음파, 레이저 또는 열 처리 등의 에너지를 가하여 다능성 특성을 가진 새로운 타입의 다능성 세포 또는 상기 분화된 세포와 표현형이 상이한 임의의 분화세포로의 리프로그래밍을 유도하는 효과를 갖는다.

Claims (20)

  1. 세포 및 배양배지를 수용하도록 마련된 배양챔버; 및
    배양챔버 내의 세포 및 배양배지에 초음파, 레이저 및 열 중 적어도 하나의 물리적 자극을 가함으로써 에너지를 제공할 수 있도록 마련된 하나 이상의 기구를 포함하는 세포 리프로그래밍 장치.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 기구는, 초음파를 조사하는 초음파 발생장치, 레이저를 조사하는 레이저 조사장치 및 온도조절장치 중 하나 이상을 포함하는 세포 리프로그래밍 장치.
  3. 제 2 항에 있어서,
    배양챔버 내의 습도를 조절하기 위한 습도조절장치 및 배양챔버 내의 이산화탄소량을 조절하기 위한 가스조절장치 중 하나 이상을 추가로 포함하는 세포 리프로그래밍 장치.
  4. 제 3 항에 있어서,
    배양챔버 내의 온도, 습도, 이산화탄소량 중 하나 이상을 조절하기 위한 입력부를 갖는 디스플레이부를 추가로 포함하는 세포 리프로그래밍 장치.
  5. 제 4 항에 있어서,
    기구가 초음파 발생장치를 포함하고,
    디스플레이부는 초음파 주파수, 및 시간을 설정할 수 있도록 마련된 세포 리프로그래밍 장치.
  6. 제 2 항에 있어서,
    배양 챔버에는 세포를 수용하는 샘플 튜브가 배치되며,
    초음파 발생장치는 샘플 튜브를 향하여 승강 가능하게 마련된 세포 리프로그래밍 장치.
  7. 제 6 항에 있어서,
    배양 챔버에는 샘플 튜브를 지지하기 위한 샘플 튜브 홀더가 마련된 세포 리프로그래밍 장치.
  8. 제 6 항에 있어서,
    샘플 튜브는 이중 튜브 구조를 갖는 세포 리프로그래밍 장치.
  9. 제 2 항에 있어서,
    초음파 발생장치는 초음파 트랜스듀서가 교체 가능하게 마련된 세포 리프로그래밍 장치.
  10. 제 2 항에 있어서,
    온도 조절 장치는 배양 챔버 주변으로 마련된 열선을 포함하는 세포 리프로그래밍 장치.
  11. 복수 개의 샘플 튜브가 장착될 수 있도록 마련된 오토 샘플러; 및
    오토 샘플러에 탑재된 어느 한 샘플 튜브로 초음파를 발생시키도록 마련된 초음파 발생장치를 포함하는 세포 리프로그래밍 장치.
  12. 제 11 항에 있어서,
    오토 샘플러는 회전 가능하게 마련되고,
    초음파 발생장치는 승강 가능하게 마련된 세포 리프로그래밍 장치.
  13. 제 12 항에 있어서,
    오토 샘플러가 회전하는 경우, 초음파 발생장치는 상승된 상태인 세포 리프로그래밍 장치.
  14. 제 11 항에 있어서,
    초음파 처리된 배양배지가 저장된 배양배지 탱크;
    상기 배양배지 탱크 내의 배양배지가 공급되는 하나 이상의 배양 플라스크; 및
    배양 플라스크와 샘플 튜브를 유체 이동 가능하게 연결하는 인젝션 튜브를 추가로 포함하는 세포 리프로그래밍 장치.
  15. 제 14 항에 있어서,
    초음파가 가해진 샘플 튜브 내의 세포는 인젝션 튜브에 의해 배양 플라스크로 이동되도록 마련된 세포 리프로그래밍 장치.
  16. 제 14 항에 있어서,
    복수 개의 배양 플라스크를 이송시키기 위한 이송 벨트를 추가로 포함하는 세포 리프로그래밍 장치.
  17. 제 15 항에 있어서,
    배양 플라스크가 수용되는 인큐베이터;
    인큐베이터 내의 배양 플라스크의 배양 배지가 회수되는 회수 탱크; 및
    인큐베이터 내의 배양 플라스크로 배양 배지를 공급하고, 배양 플라스크 내의 배양 배지를 회수 탱크로 회수하기 위한 서큘레이터를 추가로 포함하는 세포 리프로그래밍 장치.
  18. 제 14 항에 있어서,
    배양 플라스크는 양 측에 유동 통로가 각각 마련된 세포 리프로그래밍 장치.
  19. 제 18 항에 있어서,
    배양 플라스크의 양 측 유동 통로는 서로 다른 높이에 위치하는 세포 리프로그래밍 장치.
  20. 제 17 항에 있어서,
    인큐베이터에는 안착된 배양 플라스크를 흔들기 위한 셰이커(shaker)가 마련된 세포 리프로그래밍 장치.
PCT/KR2016/008755 2016-03-11 2016-08-09 세포 리프로그래밍 장치 Ceased WO2017155167A1 (ko)

Priority Applications (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201680084455.3A CN109089424A (zh) 2016-03-11 2016-08-09 细胞重编程装置
EP16893681.3A EP3428276A4 (en) 2016-03-11 2016-08-09 CELL REPROGRAMMING DEVICE
JP2018567551A JP2019508069A (ja) 2016-03-11 2016-08-09 細胞のリプログラミング装置
US16/082,928 US20190106669A1 (en) 2016-03-11 2016-08-09 Cell reprogramming apparatus

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR10-2016-0029707 2016-03-11
KR20160029707 2016-03-11
KR10-2016-0098754 2016-08-03
KR1020160098754A KR102050852B1 (ko) 2016-03-11 2016-08-03 세포 리프로그래밍 장치

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2017155167A1 true WO2017155167A1 (ko) 2017-09-14

Family

ID=59789509

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/KR2016/008755 Ceased WO2017155167A1 (ko) 2016-03-11 2016-08-09 세포 리프로그래밍 장치

Country Status (1)

Country Link
WO (1) WO2017155167A1 (ko)

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7052720B1 (en) * 1999-06-17 2006-05-30 University Of Wales College Of Medicine Spheroid preparation
KR20090080390A (ko) * 2008-01-21 2009-07-24 전남대학교산학협력단 다중 세포배양기를 구비한 인큐베이터
US20140038257A1 (en) * 2012-08-01 2014-02-06 Anuradha Subramanian Methods of using ultrasound in tissue culture and tissue engineering
KR20150045935A (ko) * 2012-04-24 2015-04-29 더 브리검 앤드 우먼즈 하스피털, 인크. 다능성 세포를 다시 생성하는 방법

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7052720B1 (en) * 1999-06-17 2006-05-30 University Of Wales College Of Medicine Spheroid preparation
KR20090080390A (ko) * 2008-01-21 2009-07-24 전남대학교산학협력단 다중 세포배양기를 구비한 인큐베이터
KR20150045935A (ko) * 2012-04-24 2015-04-29 더 브리검 앤드 우먼즈 하스피털, 인크. 다능성 세포를 다시 생성하는 방법
US20140038257A1 (en) * 2012-08-01 2014-02-06 Anuradha Subramanian Methods of using ultrasound in tissue culture and tissue engineering

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
LV , YONGGANG ET AL.: "Effects of Low-intensity Pulsed Ultrasound on Cell Viability, Proliferation and Neural Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells-derived Neural Crest Stem Cells", BIOTECHNOLOGY LETTERS, vol. 35, no. 12, 28 September 2013 (2013-09-28), pages 2201 - 2212, XP055551630 *
See also references of EP3428276A4 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR102050852B1 (ko) 세포 리프로그래밍 장치
US20240101998A1 (en) Cell reprogramming method using imposition of physical stimulation-mediated environmental transition
Sheng et al. Direct reprogramming of Sertoli cells into multipotent neural stem cells by defined factors
Dell’Anno et al. Remote control of induced dopaminergic neurons in parkinsonian rats
JP6986968B2 (ja) エネルギーを利用した多能性細胞誘導装置及び方法
Ofenbauer et al. Strategies for in vivo reprogramming
Mohamed et al. Generation of human midbrain organoids from induced pluripotent stem cells [version 2; peer review: 3 approved, 1 approved with reservations]
Kirwan et al. Generation and characterization of functional human hypothalamic neurons
WO2021112638A1 (ko) 신경에 대한 효능 및 독성평가를 위한 생체모방 신경칩 및 이의 용도
WO2017155166A1 (ko) 물리적 자극에 의한 환경유입을 이용한 세포 리프로그래밍 방법
CN108368486A (zh) 鉴定神经肌肉接头活动的调节剂的体外方法
WO2021086063A1 (ko) 3차원 뇌 오가노이드를 이용한 뇌신경계질환 치료용 줄기세포 스크리닝 방법
Matsumura et al. Establishment of integration-free induced pluripotent stem cells from human recessive dystrophic epidermolysis bullosa keratinocytes
Leal et al. Modeling hypothalamic pathophysiology in vitro for metabolic, circadian, and sleep disorders
Ullah et al. Generating and characterizing human telencephalic brain organoids from stem cell-derived single neural rosettes
Elder et al. Diseased, differentiated and difficult: Strategies for improved engineering of in vitro neurological systems
US20200248139A1 (en) Methods for generating and using organoids and cells thereof
WO2017155167A1 (ko) 세포 리프로그래밍 장치
WO2025037879A1 (ko) 다중세포 배양 플랫폼으로서 역-미세둑 구조가 포함된 다중장기모사칩 및 이의 용도
Göksu A review article on the development of dopaminergic neurons and establishment of dopaminergic neuron–based in vitro models by using immortal cell lines or stem cells to study and treat Parkinson's disease
Xie et al. Reprogramming of adult human neural stem cells into induced pluripotent stem cells
Pruszak et al. Molecular and cellular determinants for generating ES-cell derived dopamine neurons for cell therapy
Boström et al. Neural network and" ganglion" formations in vitro: a video microscopy and scanning electron microscopy study on adult cultured spiral ganglion cells
WO2016089178A1 (ko) 에너지를 이용한 다능성 세포 유도 장치 및 방법
Wenker et al. Cell reprogramming and neuronal differentiation applied to neurodegenerative diseases: Focus on Parkinson’s disease

Legal Events

Date Code Title Description
ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2018567551

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2016893681

Country of ref document: EP

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2016893681

Country of ref document: EP

Effective date: 20181011

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 16893681

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1