WO2017170342A1 - 細胞シート包埋剤、細胞シート含有組成物およびキット - Google Patents

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WO2017170342A1
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cell sheet
amino acid
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embedding agent
polypeptide
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中村　健太郎
進弥 佐野
陽介 車
鮫島　正
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Terumo Corp
Fujifilm Corp
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Terumo Corp
Fujifilm Corp
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    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12M25/00—Means for supporting, enclosing or fixing the microorganisms, e.g. immunocoatings
    • C12M25/02—Membranes; Filters
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology

Definitions

  • the present invention relates to a cell sheet embedding agent containing a polypeptide whose molecular weight distribution satisfies a predetermined condition.
  • the present invention further relates to a cell sheet-containing composition and kit containing the cell sheet embedding agent.
  • a cell sheet is formed without substantially proliferating for the purpose of providing a production method using a cell culture solution that does not contain an impurity component derived from a production process that impedes clinical application.
  • a method for producing a cell sheet is described that comprises culturing cells of a resulting density in a cell culture medium that does not contain an effective amount of growth factors.
  • Patent Document 2 describes a genetically modified gelatin that is particularly useful for several applications involving cell attachment, such as cell culture work, and applications involving cell culture of anchorage-dependent cells, and various medical applications. Has been.
  • JP 2010-81829 A International Publication WO2008 / 103041
  • the cell sheet is very fragile and is fragile during transportation, which is a problem when transporting to hospital facilities. In hospital facilities or the like, it is desirable that the cell sheet can be easily transplanted after the cell sheet is transported. In the transplantation of cell sheets, it is desired to solve the above problems.
  • the present invention provides a cell sheet embedding agent that can stably transport a cell sheet during transportation at low temperature and can easily recover the cell sheet from the cell sheet embedding agent after transportation. It is a problem to be solved. It is another object of the present invention to provide a cell sheet-containing composition containing the cell sheet embedding agent and a kit containing the cell sheet embedding agent.
  • the inventors of the present invention have a polypeptide having a specific sequence, and the area of the maximum molecular weight peak in the molecular weight distribution measurement is 80% of the total area of all molecular weight peaks.
  • the cell sheet embedding agent containing the polypeptide as described above the cell sheet can be stably transported at the time of transport at a low temperature, and the cell sheet can be easily embedded at room temperature when transplanting the cell sheet after transport. It was found that the cell sheet can be recovered from the agent.
  • the present invention has been completed based on these findings. According to the present invention, the following inventions are provided.
  • a cell sheet embedding agent comprising a polypeptide represented by the following formula 1 and having a molecular weight distribution satisfying the following condition X:
  • Formula 1 A-[(Gly-XY) n ] m -B
  • each of n X independently represents any of amino acids
  • each of N Y independently represents any of amino acids
  • m is an integer of 2 to 10
  • n is an integer of 3 to 100
  • A represents any amino acid or amino acid sequence
  • B represents any amino acid or amino acid sequence.
  • Condition X The area of the maximum molecular weight peak in the molecular weight distribution measurement by gel permeation chromatography is 80% or more of the total area of all molecular weight peaks.
  • the polypeptide has (1) the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 or (2) an amino acid sequence having 80% or more sequence identity with the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 and having biocompatibility
  • [6] A cell sheet containing a cell sheet and the cell sheet embedding agent according to any one of [1] to [5], wherein the cell sheet is embedded with the cell sheet embedding agent Composition.
  • a kit comprising a cell sheet and the cell sheet embedding agent according to any one of [1] to [5].
  • Formula 1 A-[(Gly-XY) n ] m -B
  • each of n X independently represents any of amino acids
  • each of N Y independently represents any of amino acids
  • m is an integer of 2 to 10
  • n is an integer of 3 to 100
  • A represents any amino acid or amino acid sequence
  • B represents any amino acid or amino acid sequence.
  • Condition X The area of the maximum molecular weight peak in the molecular weight distribution measurement by gel permeation chromatography is 80% or more of the total area of all molecular weight peaks.
  • a method for embedding a cell sheet comprising embedding a cell sheet with a polypeptide represented by the following formula 1 and having a molecular weight distribution satisfying the following condition X:
  • Formula 1 A-[(Gly-XY) n ] m -B
  • each of n X independently represents any of amino acids
  • each of N Y independently represents any of amino acids
  • m is an integer of 2 to 10
  • n is an integer of 3 to 100
  • A represents any amino acid or amino acid sequence
  • B represents any amino acid or amino acid sequence.
  • Condition X The area of the maximum molecular weight peak in the molecular weight distribution measurement by gel permeation chromatography is 80% or more of the total area of all molecular weight peaks.
  • the cell sheet can be stably transported at the time of transportation at a low temperature, and after the transportation, the cell sheet can be simply transferred from the cell sheet embedding agent. Can be recovered
  • FIG. 1 shows the molecular weight distribution of recombinant gelatin.
  • FIG. 2 shows the molecular weight distribution of natural animal gelatin.
  • FIG. 3 shows the shapes of the CBE3-embedded cell sheet and the cell sheet not containing CBE3 before and after shaking.
  • FIG. 4 shows the results of staining the CBE3-embedded cell sheet before and after shaking.
  • the cell sheet embedding agent of the present invention is a cell sheet embedding agent comprising a polypeptide represented by the following formula 1 and having a molecular weight distribution satisfying the following condition X.
  • Formula 1 A-[(Gly-XY) n ] m -B
  • each of n X independently represents any of amino acids
  • each of N Y independently represents any of amino acids
  • m is an integer of 2 to 10
  • n is an integer of 3 to 100
  • A represents any amino acid or amino acid sequence
  • B represents any amino acid or amino acid sequence.
  • Condition X The area of the maximum molecular weight peak in the molecular weight distribution measurement by gel permeation chromatography is 80% or more of the total area of all molecular weight peaks.
  • the cell sheet embedding agent referred to in this specification is a substance capable of embedding a cell sheet.
  • the embedding process is a process in which a cell sheet embedding agent is brought into contact with a part or all of the surface of the cell sheet by dipping or the like, and then a part or all of the surface of the cell sheet is coated with the cell sheet embedding agent. is there.
  • polypeptide The polypeptide represented by the above formula 1 gels and becomes suitable for transportation by embedding a cell sheet in a solution state (conditions that are not low temperature) and lowering the temperature. From the viewpoint of cell preservation, it is necessary to lower the temperature during transportation.
  • the polypeptide satisfies the condition X (the area of the maximum molecular weight peak in the molecular weight distribution measurement by gel permeation chromatography is 80% or more of the total area of all molecular weight peaks)
  • Gelation at low temperature (4 ° C.) and dissolution at room temperature (25 ° C.) become sharp, and at the time of cell sheet transplantation, the cell sheet can be easily recovered from the cell sheet embedding agent. .
  • the maximum molecular weight peak area in the molecular weight distribution measurement by gel permeation chromatography is 80% or more of the total area of all molecular weight peaks, more preferably 85% or more, particularly Preferably it is 90% or more.
  • the molecular weight distribution measurement by gel permeation chromatography is performed using high performance liquid chromatography (HPLC) (Waters AQUITY UPLC system Empower2), and the buffer is 100 mmol / L phosphate buffer (pH 6.8). be able to.
  • HPLC high performance liquid chromatography
  • Empower2 Waters AQUITY UPLC system Empower2
  • m is an integer of 2 to 10, preferably an integer of 3 to 5.
  • n is an integer of 3 to 100, preferably an integer of 15 to 70, and more preferably an integer of 50 to 65.
  • the polypeptide represented by Formula 1 used in the present invention may be any of a recombinant polypeptide, a chemically synthesized polypeptide, or a natural polypeptide.
  • Chemically synthesized polypeptide means an artificially synthesized polypeptide.
  • Polypeptide synthesis may be either solid phase synthesis or liquid phase synthesis, but is preferably solid phase synthesis.
  • Solid-phase synthesis of polypeptides is known to those skilled in the art. For example, Fmoc group synthesis using Fmoc group (Fluorenyl-Methoxy-Carbonyl group) as amino group protection, and Boc group (tert- Boc group synthesis method using Butyl Oxy Carbonyl group).
  • the polypeptide is preferably a recombinant polypeptide.
  • the recombinant polypeptide represented by Formula 1 is referred to as recombinant gelatin. Recombinant gelatin will be described later in this specification.
  • the hydrophilicity value “1 / IOB” value of the polypeptide used in the present invention is preferably 0 to 1.0. More preferably, it is 0 to 0.6, and still more preferably 0 to 0.4.
  • IOB is an index of hydrophilicity / hydrophobicity based on an organic conceptual diagram representing the polarity / non-polarity of an organic compound proposed by Satoshi Fujita. Details thereof can be found in, for example, “Pharmaceutical Bulletin”, vol.2, 2, pp .163-173 (1954), “Area of Chemistry” vol.11, 10, pp.719-725 (1957), “Fragrance Journal”, vol.50, pp.79-82 (1981), etc. Yes.
  • methane (CH 4 ) is the source of all organic compounds, and all other compounds are all methane derivatives, with certain numbers set for the number of carbon atoms, substituents, transformations, rings, etc. Then, the score is added to obtain an organic value (OV) and an inorganic value (IV), and these values are plotted on a diagram with the organic value on the X axis and the inorganic value on the Y axis. It is going.
  • the IOB in the organic conceptual diagram refers to the ratio of the inorganic value (IV) to the organic value (OV) in the organic conceptual diagram, that is, “inorganic value (IV) / organic value (OV)”.
  • hydrophilicity / hydrophobicity is represented by a “1 / IOB” value obtained by taking the reciprocal of IOB. The smaller the “1 / IOB” value (closer to 0), the more hydrophilic it is.
  • the hydrophilicity / hydrophobicity index represented by the Grand average of hydropathicity (GRAVY) value is preferably 0.3 or less and minus 9.0 or more, preferably 0.0 or less, minus 7.0. More preferably, it is the above.
  • Grand average of hydropathicity (GRAVY) values are based on Gasteiger E., Hoogland C., Gattiker A., Duvaud S., Wilkins MR, Appel RD, Bairoch A .; Protein Identification and Analysis Tools on the ExPASy Server; (In) John M. Walker (ed): The Proteomics Protocols Handbook, Humana Press (2005) .pp.
  • the polypeptide used in the present invention is preferably recombinant gelatin.
  • the recombinant gelatin for example, those described in EP1014176, US Pat. No. 6,992,172, International Publication WO2004 / 85473, International Publication WO2008 / 103041, and the like can be used, but the invention is not limited thereto.
  • a preferable example of the recombinant gelatin used in the present invention is the recombinant gelatin of the following embodiment.
  • Recombinant gelatin has excellent biocompatibility due to the inherent performance of natural gelatin, and is not naturally derived, so there is no concern about bovine spongiform encephalopathy (BSE) and excellent non-infectivity.
  • BSE bovine spongiform encephalopathy
  • the molecular weight of the recombinant gelatin is not particularly limited, but is preferably 2000 or more and 100000 or less (2 kDa (kilo dalton) or more and 100 kDa or less), more preferably 2500 or more and 95000 or less (2.5 kDa or more and 95 kDa or less), and further preferably. Is from 5,000 to 90,000 (5 kDa to 90 kDa), and most preferably from 10,000 to 90,000 (10 kDa to 90 kDa).
  • Recombinant gelatin preferably has a repeating sequence represented by Gly-XY characteristic of collagen.
  • the plurality of Gly-XY may be the same or different.
  • Gly-XY Gly represents glycine
  • X and Y represent any amino acid (preferably any amino acid other than glycine).
  • the sequence represented by Gly-XY, which is characteristic of collagen, is a very specific partial structure in the amino acid composition and sequence of gelatin / collagen compared to other proteins. In this part, glycine accounts for about one third of the whole, and in the amino acid sequence, it is one in three repeats.
  • Glycine is the simplest amino acid, has few constraints on the arrangement of molecular chains, and greatly contributes to the regeneration of the helix structure upon gelation.
  • the amino acids represented by X and Y are rich in imino acids (proline, oxyproline), and preferably account for 10% to 45% of the total.
  • 80% or more, more preferably 95% or more, and most preferably 99% or more of the amino acid sequence of the recombinant gelatin is a Gly-XY repeating structure.
  • polar amino acids are charged and uncharged at 1: 1.
  • the polar amino acid specifically refers to cysteine, aspartic acid, glutamic acid, histidine, lysine, asparagine, glutamine, serine, threonine, tyrosine and arginine, and among these polar uncharged amino acids are cysteine, asparagine, glutamine, serine. Refers to threonine and tyrosine.
  • the proportion of polar amino acids is 10 to 40%, preferably 20 to 30%, of all the constituent amino acids.
  • the proportion of uncharged amino acids in the polar amino acid is preferably 5% or more and less than 20%, more preferably 5% or more and less than 10%. Furthermore, it is preferable that any one amino acid, preferably two or more amino acids among serine, threonine, asparagine, tyrosine and cysteine are not included in the sequence.
  • the minimum amino acid sequence that acts as a cell adhesion signal in a polypeptide is known (for example, “Pathophysiology”, Vol. 9, No. 7 (1990), page 527, published by Nagai Publishing Co., Ltd.).
  • the recombinant gelatin used in the present invention may have two or more of these cell adhesion signals in one molecule.
  • Specific sequences include RGD sequences, LDV sequences, REDV sequences, YIGSR sequences, PDSGR sequences, RYVVLPR sequences, LTITIPG sequences, RNIAEIIKDI sequences, which are represented by one-letter amino acid notation in that there are many types of cells that adhere.
  • IKVAV, LRE, DGEA, and HAV sequences are preferred. More preferred are RGD sequence, YIGSR sequence, PDSGR sequence, LGTIPG sequence, IKVAV sequence and HAV sequence, and particularly preferred is RGD sequence. Of the RGD sequences, an ERGD sequence is preferred.
  • the number of amino acids between RGDs is not uniform between 0 and 100, preferably between 25 and 60.
  • the content of the minimum amino acid sequence is preferably 3 to 50, more preferably 4 to 30, and particularly preferably 5 to 20 per protein molecule. Most preferably, it is 12.
  • the ratio of the RGD motif to the total number of amino acids is preferably at least 0.4%.
  • each stretch of 350 amino acids contains at least one RGD motif.
  • the ratio of the RGD motif to the total number of amino acids is more preferably at least 0.6%, even more preferably at least 0.8%, even more preferably at least 1.0%, particularly preferably at least 1.2%. %, Most preferably at least 1.5%.
  • the number of RGD motifs in the recombinant peptide is preferably at least 4, more preferably 6, more preferably 8, even more preferably 12 or more and 16 or less per 250 amino acids.
  • a ratio of 0.4% of the RGD motif corresponds to at least one RGD sequence per 250 amino acids. Since the number of RGD motifs is an integer, a gelatin of 251 amino acids must contain at least two RGD sequences to meet the 0.4% feature.
  • the recombinant gelatin of the present invention comprises at least 2 RGD sequences per 250 amino acids, more preferably comprises at least 3 RGD sequences per 250 amino acids, more preferably at least 4 per 250 amino acids. Contains the RGD sequence. As a further aspect of the recombinant gelatin of the present invention, it contains at least 4 RGD motifs, preferably 6, more preferably 8, more preferably 12 or more and 16 or less.
  • Recombinant gelatin may be partially hydrolyzed.
  • the polypeptide used in the present invention is represented by the following formula 2.
  • Formula 2 Gly-Ala-Pro-[(Gly-XY) 63 ] 3 -Gly
  • 63 Xs each independently represent any amino acid
  • 63 Ys each independently represent any amino acid.
  • the 63 Gly-XY may be the same or different.
  • the naturally occurring collagen referred to here may be any naturally occurring collagen, but is preferably type I, type II, type III, type IV, or type V collagen. More preferred is type I, type II, or type III collagen.
  • the collagen origin is preferably human, bovine, porcine, mouse or rat, more preferably human.
  • the isoelectric point of the recombinant gelatin used in the present invention is preferably 5 to 10, more preferably 6 to 10, and further preferably 7 to 9.5.
  • the measurement of the isoelectric point of recombinant gelatin was described in the isoelectric focusing method (see Maxey, CR (1976; Phitogr. Gelatin 2, Editor Cox, PJ Academic, London, Engl.). Thus, it can be carried out by measuring the pH after passing a 1% by mass gelatin solution through a mixed crystal column of cation and anion exchange resin.
  • the recombinant gelatin is not deaminated.
  • the recombinant gelatin has no telopeptide.
  • the recombinant gelatin is a substantially pure polypeptide prepared with a nucleic acid encoding an amino acid sequence.
  • Recombinant gelatin is particularly preferably (1) the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1; or (2) 80% or more (preferably 90% or more, more preferably 95% or more, particularly preferably 98% or more) with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • Recombinant gelatin most preferably has the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1.
  • sequence identity between two amino acid sequences can be determined by any method known to those skilled in the art, and the BLAST ((Basic Local Alignment Search Tool)) program (J. Mol. Biol. 215: 403-410, 1990) Etc. can be used to determine.
  • Recombinant gelatin may be composed of an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 and have an amino acid sequence having biocompatibility.
  • amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added is preferably 1 to 20, more preferably 1 to 10, and further preferably 1 to 5. Means, particularly preferably 1 to 3.
  • Recombinant gelatin can be produced by genetic recombination techniques known to those skilled in the art. For example, the method described in EP1014176A2, US Pat. No. 6,992,172, International Publication WO2004 / 85473, International Publication WO2008 / 103041, etc. It can be manufactured similarly. Specifically, a gene encoding the amino acid sequence of a predetermined recombinant gelatin is obtained, and this is incorporated into an expression vector to produce a recombinant expression vector, which is introduced into an appropriate host to produce a transformant. . Recombinant gelatin is produced by culturing the obtained transformant in an appropriate medium. Therefore, the recombinant gelatin used in the present invention can be prepared by recovering the recombinant gelatin produced from the culture. .
  • the form of the cell sheet embedding agent of the present invention is not particularly limited, and can be any form as long as it includes a polypeptide represented by Formula 1 and having a molecular weight distribution satisfying the condition X.
  • a solution such as an aqueous solution
  • a suspension such as a powder
  • a gel may be used.
  • powder or gel it can be used by dissolving in a solvent such as water at the time of use.
  • the content of the polypeptide in the cell sheet embedding agent of the present invention is not particularly limited, but is generally 0.1% by mass to 100% by mass, preferably 0.5% by mass to 100% by mass. .
  • the cell sheet to which the cell sheet embedding agent of the present invention is applied will be described later in this specification.
  • the present invention further relates to a cell sheet-containing composition comprising a cell sheet and the cell sheet embedding agent of the present invention, wherein the cell sheet is embedded with the cell sheet embedding agent.
  • Cell sheet The cell sheet in the present invention means a sheet mainly composed of cells.
  • the cell sheet is a sheet formed by connecting cells to each other, and the configuration is not particularly limited as long as it is in a sheet shape, a single-layer cell sheet, a sheet formed of two or more layers of cells, or Any of the sheets formed of the three-dimensionally cultured cells may be used.
  • the cells may be connected to each other directly and / or via an intervening substance.
  • the intervening substance is not particularly limited as long as it is a substance capable of mechanically connecting cells to each other, and examples thereof include an extracellular matrix.
  • the intervening substance is preferably derived from cells, particularly derived from cells constituting the cell sheet.
  • the cells are at least mechanically linked, but may be further functionally, eg, chemically or electrically linked.
  • the cell sheet in the present invention includes any cell that can form a cell sheet.
  • the cells are not particularly limited, and include cardiomyocytes, myoblasts (for example, skeletal myoblasts), fibroblasts, synoviocytes, epithelial cells, and endothelial cells. Among these, cardiomyocytes and skeletal myoblasts are preferable.
  • the cells cells derived from any organism that can be treated with a cell sheet can be used.
  • the organism is not particularly limited, and examples thereof include humans, non-human primates (such as monkeys), dogs, cats, pigs, horses, goats, sheep, rats, mice and hamsters. Further, only one type of cell may be used, but two or more types of cells can also be used.
  • the cell sheet can be produced by a known cell sheet production method or a method analogous thereto.
  • the cells are cultured in a culture dish, and when the cells become a sheet, the sheet may be recovered from the culture dish.
  • the method for producing the cell sheet is not particularly limited, but as an example, the cell sheet can be produced by the method described in JP 2010-81829 A.
  • the cell sheet is typically produced by a step of seeding cells in a culture solution and a step of culturing cells to form a cell sheet.
  • Cell culture can be carried out under conditions usually used in this technical field.
  • typical culture conditions include culture at 37 ° C. and 5% CO 2 .
  • a cell sheet-containing composition can be produced by embedding the above-described cell sheet with the cell sheet embedding agent of the present invention.
  • the embedding method is not particularly limited, but the solution is prepared by adding the embedding agent (preferably a solution) of the present invention to a container containing a cell sheet and cooling at a low temperature (eg, 2 to 12 ° C.). It can be gelled.
  • a low temperature eg, 2 to 12 ° C.
  • kits comprising the above cell sheet and the cell sheet embedding agent of the present invention. Details and preferred embodiments of the cell sheet and the cell sheet embedding agent are as described above in the present specification.
  • the kit may further include a container for performing an embedding process, an instruction manual, and the like.
  • CBE3 Recombinant gelatin
  • CBE3 Molecular weight: 51.6 kD Structure: GAP [(GXY) 63 ] 3 G Number of amino acids: 571 RGD sequence: 12 Imino acid content: 33% Almost 100% of amino acids are GXY repeating structures.
  • the amino acid sequence of CBE3 does not include serine, threonine, asparagine, tyrosine and cysteine.
  • CBE3 has an ERGD sequence.
  • Isoelectric point 9.34 GRAVY value: -0.682 1 / IOB value: 0.323 Amino acid sequence (SEQ ID NO: 1 in the sequence listing) (same as SEQ ID NO: 3 of International Publication WO2008 / 103041; however, the suffix X is corrected to “P”)
  • GAP GAPGLQGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGPAGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGAPG
  • the natural animal gelatin of Comparative Example 1 was gelled by moving to 4 ° C., but its rate was slower and slower than that of CBE3.
  • the natural animal gelatin of Comparative Example 1 returns to liquid compared to CBE3 of Example 1. It was late. Specifically, in natural animal gelatin, gelation started after 60 minutes by moving to 4 ° C., but it became only a loose gel after 90 minutes. After that, it did not shift to a strong gel, but remained in a loose gel form that could easily be crushed when pressed by hand. When the gel was returned to room temperature of 25 ° C., it took 70 minutes for the natural animal gelatin to return to a complete liquid.
  • CBE3-embedded cell sheet 6.0 ⁇ 10 7 human skeletal myoblasts were suspended in 10 mL of DMEM / F12 medium containing 20% (v / v) human serum, and a 10 cm dish temperature-responsive culture dish. (UpCell (registered trademark): Cell Seed Co., Ltd.). The cells were cultured overnight at 37 ° C. and 5% CO 2 to form cell sheets, which were detached at room temperature. 10 mL of HBSS + (Thermo Fisher Scientific) containing 1% by mass CBE3 was added to a temperature-responsive culture dish at room temperature and cooled to 2 to 8 ° C. for 1 hour to form a CBE3-embedded cell sheet. . HBSS is an abbreviation for Hanks' Balanced Salt solution.
  • the cell sheet after shaking is a cell sheet in which the cells inside are alive as in the production and can fully demonstrate its performance. It was confirmed that.

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Abstract

本発明の課題は、低温での輸送時に安定して細胞シートを輸送することができ、輸送後、簡便に細胞シート包埋剤から細胞シートを回収することができる細胞シート包埋剤、並びに細胞シート含有組成物およびキットを提供することである。本発明によれば、下記式１で示され、かつ分子量分布測定における最大の分子量ピークの面積が、全ての分子量ピークの合計面積の８０％以上であるポリペプチドを含む、細胞シート包埋剤が提供される。 式１：　Ａ－［（Ｇｌｙ－Ｘ－Ｙ）ｎ］ｍ－Ｂ 式中、ＸおよびＹはそれぞれ独立にアミノ酸を示し、ｍは２～１０の整数であり、ｎは３～１００の整数であり、ＡおよびＢは任意のアミノ酸またはアミノ酸配列を示す。

Description

細胞シート包埋剤、細胞シート含有組成物およびキット
　本発明は、分子量分布が所定の条件を満たすポリペプチドを含む細胞シート包埋剤に関する。本発明はさらに、上記細胞シート包埋剤を含む細胞シート含有組成物およびキットに関する。
　近年、多くの再生医療および細胞移植治療が実施されている。特に、細胞を細胞シートとして、細胞のみをシート状にして移植する治療が多く検討されている。個々の細胞を懸濁液として投与することに比べて、細胞シートは構造物として維持されることから、体内での生着が良く有効性が向上するとされている。特許文献１には、臨床への適用に障害となる製造工程由来不純物成分を含まない細胞培養液を用いた製造方法を提供することを目的として、実質的に増殖することなく細胞シートを形成し得る密度の細胞を、有効量の成長因子を含まない細胞培養液中で培養することを含む、細胞シートの製造方法が記載されている。
　一方、シート状でない個々の細胞については、細胞の支持体となる足場材料と細胞を組み合わせて移植することが検討されている。細胞の支持体となる足場材料としては、遺伝子組換えゼラチンが知られている。特許文献２には、細胞付着を伴う幾つかの用途、例えば、細胞培養作業、および足場依存性細胞の細胞培養を伴う用途、ならびに多様な医療用途にも特に有用な、遺伝子組換えゼラチンが記載されている。
特開２０１０－８１８２９号公報 国際公開ＷＯ２００８／１０３０４１号公報
　細胞シートは非常にもろく、輸送時に壊れやすいという問題があり、病院施設等に輸送する際の問題になる。また、病院施設等では、細胞シートの輸送後に、簡便に細胞シートを移植できることが望ましい。細胞シートの移植においては上記の問題を解決することが望まれている。本発明は、低温での輸送時に安定して細胞シートを輸送することができ、輸送後、簡便に細胞シート包埋剤から細胞シートを回収することができる細胞シート包埋剤を提供することを解決すべき課題とする。本発明はさらに、上記細胞シート包埋剤を含む細胞シート含有組成物、および上記細胞シート包埋剤を含むキットを提供することを解決すべき課題とする。
　本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、特定の配列を有するポリペプチドであって、分子量分布測定における最大の分子量ピークの面積が、全ての分子量ピークの合計面積の８０％以上であるポリペプチドを含む細胞シート包埋剤によれば、低温での輸送時に安定して細胞シートを輸送することができ、さらに輸送後の細胞シート移植時に、室温において簡便に細胞シート包埋剤から細胞シートを回収することができることを見出した。本発明はこれらの知見に基づいて完成したものである。本発明によれば以下の発明が提供される。
［１］　下記式１で示され、かつ分子量分布が下記条件Ｘを満たすポリペプチドを含む、細胞シート包埋剤。
式１：　Ａ－［（Ｇｌｙ－Ｘ－Ｙ）ｎ］ｍ－Ｂ
式中、ｎ個のＸはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、ｎ個のＹはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、ｍは２～１０の整数であり、ｎは３～１００の整数であり、Ａは任意のアミノ酸またはアミノ酸配列を示し、Ｂは任意のアミノ酸またはアミノ酸配列を示す。
条件Ｘ：ゲル浸透クロマトグラフィーによる分子量分布測定における最大の分子量ピークの面積が、全ての分子量ピークの合計面積の８０％以上である。
［２］　ポリペプチドがリコンビナントゼラチンである、［１］に記載の細胞シート包埋剤。
［３］　ポリペプチドが、下記式２で示されるポリペプチドである、［１］または［２］に記載の細胞シート包埋剤。
式２：　Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｐｒｏ－［（Ｇｌｙ－Ｘ－Ｙ）６３］３－Ｇｌｙ
式中、６３個のＸはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、６３個のＹはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示す。なお、６３個のＧｌｙ－Ｘ－Ｙはそれぞれ同一でも異なっていてもよい。
［４］　ポリペプチドが、（１）配列番号１に記載のアミノ酸配列、または（２）配列番号１に記載のアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有し、生体親和性を有するアミノ酸配列を有する、［１］～［３］のいずれか一に記載の細胞シート包埋剤。
［５］　ポリペプチドが、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する、［１］～［４］のいずれか一に記載の細胞シート包埋剤。
［６］　細胞シートと、［１］～［５］のいずれか一に記載の細胞シート包埋剤とを含み、上記細胞シートが上記細胞シート包埋剤により包埋されている、細胞シート含有組成物。
［７］　細胞シートと、［１］～［５］のいずれか一に記載の細胞シート包埋剤とを含む、キット。
［８］　細胞シートの包埋において使用するための、下記式１で示され、かつ分子量分布が下記条件Ｘを満たすポリペプチド。
式１：　Ａ－［（Ｇｌｙ－Ｘ－Ｙ）ｎ］ｍ－Ｂ
式中、ｎ個のＸはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、ｎ個のＹはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、ｍは２～１０の整数であり、ｎは３～１００の整数であり、Ａは任意のアミノ酸またはアミノ酸配列を示し、Ｂは任意のアミノ酸またはアミノ酸配列を示す。
条件Ｘ：ゲル浸透クロマトグラフィーによる分子量分布測定における最大の分子量ピークの面積が、全ての分子量ピークの合計面積の８０％以上である。
［９］　細胞シート包埋剤の製造のための、下記式１で示され、かつ分子量分布が下記条件Ｘを満たすポリペプチドの使用。
式１：　Ａ－［（Ｇｌｙ－Ｘ－Ｙ）ｎ］ｍ－Ｂ
式中、ｎ個のＸはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、ｎ個のＹはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、ｍは２～１０の整数であり、ｎは３～１００の整数であり、Ａは任意のアミノ酸またはアミノ酸配列を示し、Ｂは任意のアミノ酸またはアミノ酸配列を示す。
条件Ｘ：ゲル浸透クロマトグラフィーによる分子量分布測定における最大の分子量ピークの面積が、全ての分子量ピークの合計面積の８０％以上である。
［１０］　細胞シートを、下記式１で示され、かつ分子量分布が下記条件Ｘを満たすポリペプチドで包埋することを含む、細胞シートの包埋方法。
式１：　Ａ－［（Ｇｌｙ－Ｘ－Ｙ）ｎ］ｍ－Ｂ
式中、ｎ個のＸはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、ｎ個のＹはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、ｍは２～１０の整数であり、ｎは３～１００の整数であり、Ａは任意のアミノ酸またはアミノ酸配列を示し、Ｂは任意のアミノ酸またはアミノ酸配列を示す。
条件Ｘ：ゲル浸透クロマトグラフィーによる分子量分布測定における最大の分子量ピークの面積が、全ての分子量ピークの合計面積の８０％以上である。
　本発明の細胞シート包埋剤、細胞シート含有組成物およびキットによれば、低温での輸送時に安定して細胞シートを輸送することができ、輸送後、簡便に細胞シート包埋剤から細胞シートを回収することができる
図１は、リコンビナントゼラチンの分子量分布を示す。 図２は、天然動物ゼラチンの分子量分布を示す。 図３は、ＣＢＥ３包埋細胞シートとＣＢＥ３を含まない細胞シートの振とう前および振とう後の形状を示す。 図４は、振とう前および振とう後のＣＢＥ３包埋細胞シートの染色の結果を示す。
　以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
＜細胞シート包埋剤＞
　本発明の細胞シート包埋剤は、下記式１で示され、かつ分子量分布が下記条件Ｘを満たすポリペプチドを含む、細胞シート包埋剤である。
式１：　Ａ－［（Ｇｌｙ－Ｘ－Ｙ）ｎ］ｍ－Ｂ
式中、ｎ個のＸはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、ｎ個のＹはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、ｍは２～１０の整数であり、ｎは３～１００の整数であり、Ａは任意のアミノ酸またはアミノ酸配列を示し、Ｂは任意のアミノ酸またはアミノ酸配列を示す。
条件Ｘ：ゲル浸透クロマトグラフィーによる分子量分布測定における最大の分子量ピークの面積が、全ての分子量ピークの合計面積の８０％以上である。
　本明細書で言う細胞シート包埋剤とは、細胞シートを包埋処理することができる物質である。包埋処理とは、細胞シートの表面の一部又は全部に、細胞シート包埋剤を浸漬等により接触させ、次いで細胞シートの表面の一部又は全部を細胞シート包埋剤で被覆する処理である。
［ポリペプチド］
　上記式１で示されるポリペプチドは、溶液の状態で（低温度ではない条件）細胞シートを包埋し、温度を低下させることにより、ゲル化し、輸送に適した状態となる。なお、細胞の保存の観点でも、輸送の際には低温とする必要がある。また、本発明においては、ポリペプチドが、条件Ｘ（ゲル浸透クロマトグラフィーによる分子量分布測定における最大の分子量ピークの面積が、全ての分子量ピークの合計面積の８０％以上である）を満たすことにより、低温（４℃）でのゲル化と室温（２５℃）での溶解とがシャープになり、細胞シート移植時に、室温において簡便に、細胞シート包埋剤から細胞シートを回収することが可能になる。
　上記の通り、本発明において、ゲル浸透クロマトグラフィーによる分子量分布測定における最大の分子量ピークの面積は、全ての分子量ピークの合計面積の８０％以上であるが、より好ましくは８５％以上であり、特に好ましくは９０％以上である。
　ゲル浸透クロマトグラフィーによる分子量分布測定は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）（Waters社製AQUITY UPLCシステムEmpower2）を使用し、緩衝液には１００ｍｍｏｌ／Ｌリン酸バッファー（ｐＨ６．８）を用いて測定することができる。
　上記式１において、ｍは２～１０の整数であるが、好ましくは３～５の整数を示す。
　上記式１において、ｎは３～１００の整数であり、好ましくは１５～７０の整数であり、より好ましくは５０～６５の整数である。
　本発明で用いる式１で示されるポリペプチドは、分子量分布が上記条件Ｘを満たす限り、リコンビナントポリペプチド、化学合成ポリペプチド、または天然ポリペプチドの何れでもよい。
　化学合成ポリペプチドとは、人工的に合成したポリペプチドを意味する。ポリペプチドの合成は、固相合成でも液相合成でもよいが、好ましくは固相合成である。ポリペプチドの固相合成は当業者に公知であり、例えば、アミノ基の保護としてＦｍｏｃ基（Fluorenyl-Methoxy-Carbonyl基）を使用するＦｍｏｃ基合成法、並びにアミノ基の保護としてＢｏｃ基（tert-Butyl Oxy Carbonyl基）を使用するＢｏｃ基合成法などが挙げられる。
　ポリペプチドは好ましくは、リコンビナントポリペプチドである。本明細書においては、式１で示されるリコンビナントポリペプチドのことを、リコンビナントゼラチンと称する。リコンビナントゼラチンについては本明細書中において後記する。
　本発明で用いるポリペプチドの親水性値「１／ＩＯＢ」値は、０から１．０が好ましい。より好ましくは、０から０．６であり、さらに好ましくは０から０．４である。ＩＯＢとは、藤田穆により提案された有機化合物の極性/非極性を表す有機概念図に基づく、親疎水性の指標であり、その詳細は、例えば、"Pharmaceutical Bulletin", vol.2, 2, pp.163-173（1954）、「化学の領域」vol.11, 10, pp.719-725（1957）、「フレグランスジャーナル」, vol.50, pp.79-82（1981）等で説明されている。簡潔に言えば、全ての有機化合物の根源をメタン（ＣＨ４）とし、他の化合物はすべてメタンの誘導体とみなして、その炭素数、置換基、変態部、環等にそれぞれ一定の数値を設定し、そのスコアを加算して有機性値（ＯＶ）、無機性値（ＩＶ）を求め、この値を、有機性値をＸ軸、無機性値をＹ軸にとった図上にプロットしていくものである。有機概念図におけるＩＯＢとは、有機概念図における有機性値（ＯＶ）に対する無機性値（ＩＶ）の比、すなわち「無機性値（ＩＶ）／有機性値（ＯＶ）」をいう。有機概念図の詳細については、「新版有機概念図－基礎と応用－」（甲田善生等著、三共出版、２００８）を参照されたい。本明細書中では、ＩＯＢの逆数をとった「１／ＩＯＢ」値で親疎水性を表している。「１／ＩＯＢ」値が小さい（０に近づく）程、親水性であることを表す表記である。
　本発明で用いるポリペプチドの「１／ＩＯＢ」値を上記範囲とすることにより、親水性が高く、かつ吸水性が高くなる。
　本発明で用いるポリペプチドは、Grand average of hydropathicity（GRAVY）値で表される親疎水性指標が、０．３以下、マイナス９．０以上であることが好ましく、０．０以下、マイナス７．０以上であることがさらに好ましい。Grand average of hydropathicity（ＧＲＡＶＹ）値は、『Gasteiger E., Hoogland C., Gattiker A., Duvaud S., Wilkins M.R., Appel R.D., Bairoch A.;Protein Identification and Analysis Tools on the ExPASy Server;(In) John M. Walker (ed): The Proteomics Protocols Handbook, Humana Press (2005). pp. 571-607』および『Gasteiger E., Gattiker A., Hoogland C., Ivanyi I., Appel R.D., Bairoch A.; ExPASy: the proteomics server for in-depth protein knowledge and analysis.; Nucleic Acids Res. 31:3784-3788(2003).』の方法により得ることができる。
　本発明で用いるポリペプチドのＧＲＡＶＹ値を上記範囲とすることにより、親水性が高く、かつ、吸水性が高くなる。
［リコンビナントゼラチン］
　本発明で用いるポリペプチドは、好ましくはリコンビナントゼラチンである。
　リコンビナントゼラチンとしては、例えばＥＰ１０１４１７６、米国特許６９９２１７２号、国際公開ＷＯ２００４／８５４７３、国際公開ＷＯ２００８／１０３０４１等に記載のものを用いることができるが、これらに限定されるものではない。本発明で用いるリコンビナントゼラチンとして好ましいものは、以下の態様のリコンビナントゼラチンである。
　リコンビナントゼラチンは、天然のゼラチン本来の性能から、生体親和性に優れ、且つ天然由来ではないことで牛海綿状脳症（ＢＳＥ）などの懸念がなく、非感染性に優れている。
　リコンビナントゼラチンの分子量は、特に限定されないが、好ましくは２０００以上１０００００以下（２ｋＤａ（キロダルトン）以上１００ｋＤａ以下）であり、より好ましくは２５００以上９５０００以下（２．５ｋＤａ以上９５ｋＤａ以下）であり、さらに好ましくは５０００以上９００００以下（５ｋＤａ以上９０ｋＤａ以下）であり、最も好ましくは１００００以上９００００以下（１０ｋＤａ以上９０ｋＤａ以下）である。
　リコンビナントゼラチンは、コラーゲンに特徴的なＧｌｙ－Ｘ－Ｙで示される配列の繰り返しを有することが好ましい。ここで、複数個のＧｌｙ－Ｘ－Ｙはそれぞれ同一でも異なっていてもよい。Ｇｌｙ－Ｘ－Ｙ において、Ｇｌｙはグリシンを表し、ＸおよびＹは、任意のアミノ酸（好ましくは、グリシン以外の任意のアミノ酸）を表す。コラーゲンに特徴的なＧｌｙ－Ｘ－Ｙで示される配列とは、ゼラチン・コラーゲンのアミノ酸組成および配列における、他のタンパク質と比較して非常に特異的な部分構造である。この部分においてはグリシンが全体の約３分の１を占め、アミノ酸配列では３個に１個の繰り返しとなっている。グリシンは最も簡単なアミノ酸であり、分子鎖の配置への束縛も少なく、ゲル化に際してのヘリックス構造の再生に大きく寄与している。ＸおよびＹで表されるアミノ酸はイミノ酸（プロリン、オキシプロリン）が多く含まれ、全体の１０％～４５％を占めることが好ましい。好ましくは、リコンビナントゼラチンの配列の８０％以上、さらに好ましくは９５％以上、最も好ましくは９９％以上のアミノ酸が、Ｇｌｙ－Ｘ－Ｙの繰り返し構造である。
　一般的なゼラチンは、極性アミノ酸のうち電荷を持つものと無電荷のものが１：１で存在する。ここで、極性アミノ酸とは具体的にシステイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ヒスチジン、リジン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシンおよびアルギニンを指し、このうち極性無電荷アミノ酸とはシステイン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニンおよびチロシンを指す。本発明で用いるリコンビナントゼラチンにおいては、構成する全アミノ酸のうち、極性アミノ酸の割合が１０～４０％であり、好ましくは２０～３０％である。且つ上記極性アミノ酸中の無電荷アミノ酸の割合が好ましくは５％以上２０％未満であり、より好ましくは５％以上１０％未満である。さらに、セリン、スレオニン、アスパラギン、チロシンおよびシステインのうちいずれか１アミノ酸、好ましくは２以上のアミノ酸を配列上に含まないことが好ましい。
　一般にポリペプチドにおいて、細胞接着シグナルとして働く最小アミノ酸配列が知られている（例えば、株式会社永井出版発行「病態生理」Ｖｏｌ．９、Ｎｏ．７（１９９０年）５２７頁）。本発明で用いるリコンビナントゼラチンは、これらの細胞接着シグナルを一分子中に２以上有するものでもよい。具体的な配列としては、接着する細胞の種類が多いという点で、アミノ酸一文字表記で表される、ＲＧＤ配列、ＬＤＶ配列、ＲＥＤＶ配列、ＹＩＧＳＲ配列、ＰＤＳＧＲ配列、ＲＹＶＶＬＰＲ配列、ＬＧＴＩＰＧ配列、ＲＮＩＡＥＩＩＫＤＩ配列、ＩＫＶＡＶ配列、ＬＲＥ配列、ＤＧＥＡ配列、およびＨＡＶ配列の配列が好ましい。さらに好ましくはＲＧＤ配列、ＹＩＧＳＲ配列、ＰＤＳＧＲ配列、ＬＧＴＩＰＧ配列、ＩＫＶＡＶ配列およびＨＡＶ配列、特に好ましくはＲＧＤ配列である。ＲＧＤ配列のうち、好ましくはＥＲＧＤ配列である。
　本発明で用いるリコンビナントゼラチンにおけるＲＧＤ配列の配置としては、ＲＧＤ間のアミノ酸数が０～１００の間、好ましくは２５～６０の間で均一でないことが好ましい。
　この最小アミノ酸配列の含有量は、タンパク質１分子中３～５０個が好ましく、さらに好ましくは４～３０個、特に好ましくは５～２０個である。最も好ましくは１２個である。
　本発明で用いるリコンビナントゼラチンにおいて、アミノ酸総数に対するＲＧＤモチーフの割合は少なくとも０．４％であることが好ましい。リコンビナントゼラチンが３５０以上のアミノ酸を含む場合、３５０のアミノ酸の各ストレッチが少なくとも１つのＲＧＤモチーフを含むことが好ましい。アミノ酸総数に対するＲＧＤモチーフの割合は、より好ましくは少なくとも０．６％であり、さらに好ましくは少なくとも０．８％であり、さらに一層好ましくは少なくとも１．０％であり、特に好ましくは少なくとも１．２％であり、最も好ましくは少なくとも１．５％である。リコンビナントペプチド内のＲＧＤモチーフの数は、２５０のアミノ酸あたり、好ましくは少なくとも４、より好ましくは６、さらに好ましくは８、特に好ましくは１２以上１６以下である。ＲＧＤモチーフの０．４％という割合は、２５０のアミノ酸あたり、少なくとも１つのＲＧＤ配列に対応する。ＲＧＤモチーフの数は整数であるので、０．４％の特徴を満たすには、２５１のアミノ酸からなるゼラチンは、少なくとも２つのＲＧＤ配列を含まなければならない。好ましくは、本発明のリコンビナントゼラチンは、２５０のアミノ酸あたり、少なくとも２つのＲＧＤ配列を含み、より好ましくは２５０のアミノ酸あたり、少なくとも３つのＲＧＤ配列を含み、さらに好ましくは２５０のアミノ酸あたり、少なくとも４つのＲＧＤ配列を含む。本発明のリコンビナントゼラチンのさらなる態様としては、少なくとも４つのＲＧＤモチーフ、好ましくは６つ、より好ましくは８つ、さらに好ましくは１２以上１６以下のＲＧＤモチーフを含む。
　リコンビナントゼラチンは部分的に加水分解されていてもよい。
　より好ましくは、本発明で用いるポリペプチドは、下記式２で示される。
式２：　Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｐｒｏ－［（Ｇｌｙ－Ｘ－Ｙ）６３］３－Ｇｌｙ
式中、６３個のＸはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、６３個のＹはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示す。なお、６３個のＧｌｙ－Ｘ－Ｙはそれぞれ同一でも異なっていてもよい。
　繰り返し単位には天然に存在するコラーゲンの配列単位を複数結合することが好ましい。ここで言う天然に存在するコラーゲンとは天然に存在するものであればいずれでも構わないが、好ましくはＩ型、II型、III型、IV型、またはV型コラーゲンである。より好ましくは、I型、II型、またはIII型コラーゲンである。別の形態によると、上記コラーゲンの由来は好ましくは、ヒト、ウシ、ブタ、マウスまたはラットであり、より好ましくはヒトである。
　本発明で用いるリコンビナントゼラチンの等電点は、好ましくは５～１０であり、より好ましくは６～１０であり、さらに好ましくは７～９．５である。リコンビナントゼラチンの等電点の測定は、等電点電気泳動法（Ｍａｘｅｙ，Ｃ．Ｒ．（１９７６；Ｐｈｉｔｏｇｒ．Ｇｅｌａｔｉｎ ２，Ｅｄｉｔｏｒ Ｃｏｘ，Ｐ．Ｊ．Ａｃａｄｅｍｉｃ，Ｌｏｎｄｏｎ，Ｅｎｇｌ．参照）に記載されたように、１質量％ゼラチン溶液をカチオンおよびアニオン交換樹脂の混晶カラムに通したあとのｐＨを測定することで実施することができる。
　好ましくは、リコンビナントゼラチンは脱アミン化されていない。
　好ましくは、リコンビナントゼラチンはテロペプタイドを有さない。
　好ましくは、リコンビナントゼラチンは、アミノ酸配列をコードする核酸により調製された実質的に純粋なポリペプチドである。
　リコンビナントゼラチンは、特に好ましくは、
（１）配列番号１に記載のアミノ酸配列；または
（２）配列番号１に記載のアミノ酸配列と８０％以上（好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上）の配列同一性を有し、生体親和性を有するアミノ酸配列：
を有する。
　なお、生体親和性とは、生体に接触した際に、長期的かつ慢性的な炎症反応などのような顕著な有害反応を惹起しないことを意味する。
　リコンビナントゼラチンは、最も好ましくは、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する。
　本発明における配列同一性は、以下の式で計算される値を指す。
％配列同一性＝［（同一残基数）／（アラインメント長）］×１００
　２つのアミノ酸配列における配列同一性は当業者に公知の任意の方法で決定することができ、ＢＬＡＳＴ（(Basic Local Alignment Search Tool)）プログラム（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０，１９９０）等を使用して決定することができる。
　リコンビナントゼラチンは、配列番号１に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ生体親和性を有するアミノ酸配列を有するものでもよい。
　「１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列」における「１若しくは数個」とは、好ましくは１～２０個、より好ましくは１～１０個、さらに好ましくは１～５個、特に好ましくは１～３個を意味する。
　リコンビナントゼラチンは、当業者に公知の遺伝子組み換え技術によって製造することができ、例えばＥＰ１０１４１７６Ａ２号公報、米国特許第６９９２１７２号公報、国際公開ＷＯ２００４／８５４７３号、国際公開ＷＯ２００８／１０３０４１号等に記載の方法に準じて製造することができる。具体的には、所定のリコンビナントゼラチンのアミノ酸配列をコードする遺伝子を取得し、これを発現ベクターに組み込んで、組み換え発現ベクターを作製し、これを適当な宿主に導入して形質転換体を作製する。得られた形質転換体を適当な培地で培養することにより、リコンビナントゼラチンが産生されるので、培養物から産生されたリコンビナントゼラチンを回収することにより、本発明で用いるリコンビナントゼラチンを調製することができる。
［細胞シート包埋剤の形態］
　本発明の細胞シート包埋剤の形態は特に限定されず、式１で示され、かつ分子量分布が条件Ｘを満たすポリペプチドを含む限り、任意の形態とすることができる。例えば、溶液（水溶液など）、懸濁液、粉末、またはゲルなどの何れでもよい。粉末、またはゲル等の場合には使用時に、水などの溶媒に溶解して使用することができる。
　本発明の細胞シート包埋剤における上記ポリペプチドの含有量は特に限定されないが、一般的には０．１質量％から１００質量％であり、好ましくは０．５質量％から１００質量％である。
　本発明の細胞シート包埋剤を適用する細胞シートについては、本明細書中後記する。
＜細胞シート含有組成物＞
　本発明はさらに、細胞シートと、本発明の細胞シート包埋剤とを含み、上記細胞シートが上記細胞シート包埋剤により包埋されている、細胞シート含有組成物に関する。
［細胞シート］
　本発明における細胞シートとは、細胞を主成分とするシートを意味する。細胞シートは、細胞が互いに連結してシート状になったものであり、シート形状である限り、その構成は特に限定されず、単層細胞シート、二層以上の細胞で形成されたシート、または三次元培養された細胞で形成されたシートの何れでもよい。
　細胞同士は、直接および／または介在物質を介して、互いに連結していてもよい。介在物質としては、細胞同士を少なくとも機械的に連結し得る物質であれば特に限定されないが、例えば、細胞外マトリックスなどが挙げられる。介在物質は、好ましくは細胞由来のもの、特に、細胞シートを構成する細胞に由来するものである。細胞は少なくとも機械的に連結されるが、さらに機能的、例えば、化学的、電気的に連結されてもよい。
　本発明における細胞シートには、細胞シートを形成し得る任意の細胞が含まれる。細胞の例としては、特に限定されず、心筋細胞、筋芽細胞（例えば、骨格筋芽細胞）、線維芽細胞、滑膜細胞、上皮細胞、および内皮細胞などが含まれる。上記の中でも好ましくは、心筋細胞、および骨格筋芽細胞である。細胞としては、細胞シートによる治療が可能な任意の生物に由来する細胞を使用することができる。生物は、特に限定されず、例えば、ヒト、非ヒト霊長類（サルなど）、イヌ、ネコ、ブタ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ラット、マウスおよびハムスターなどが挙げられる。また、用いる細胞は１種類のみであってもよいが、２種類以上の細胞を用いることもできる。
　細胞シートは、公知の細胞シートの製造方法またはそれに準ずる方法で製造することができる。例えば、細胞を培養皿で培養し、細胞がシート状になったら、シートを培養皿から回収すればよい。上記の通り、細胞シートの製造方法は特に限定されないが、一例としては、特開２０１０－８１８２９号公報に記載の方法により細胞シートを製造することができる。
　細胞シートは、典型的には、細胞を培養液に播種する工程、および細胞を培養して細胞シートを形成させる工程により製造される。
　細胞の培養は、本技術分野で通常なされている条件で行うことができる。例えば、典型的な培養条件としては、３７℃、５％ＣＯ２での培養が挙げられる。
［細胞シート含有組成物の製造］
　上記した細胞シートを本発明の細胞シート包埋剤により包埋することによって、細胞シート含有組成物を製造することができる。包埋の方法は特に限定されないが、細胞シートを含む容器に、本発明の包埋剤（好ましくは溶液）を添加して、低温（例えば、２～１２℃）で冷却することによって、溶液をゲル化させることができる。上記により、細胞シートが細胞シート包埋剤により包埋されている細胞シート含有組成物を製造することができる。
＜キット＞
　本発明によればさらに、上記した細胞シートと、本発明の細胞シート包埋剤とを含む、キットが提供される。細胞シートおよび細胞シート包埋剤の詳細、好ましい態様は本明細書中上記した通りである。キットにはさらに、包埋処理を行うための容器、および取扱説明書などが含まれていてもよい。
　以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
（１）リコンビナントゼラチン
　リコンビナントゼラチンとして以下のＣＢＥ３を用意した（国際公開ＷＯ２００８／１０３０４１号公報に記載）。
ＣＢＥ３：
分子量：５１．６ｋＤ
構造：　ＧＡＰ［（ＧＸＹ）６３］３Ｇ
アミノ酸数：５７１個
ＲＧＤ配列：１２個
イミノ酸含量：３３％
ほぼ１００％のアミノ酸がＧＸＹの繰り返し構造である。ＣＢＥ３のアミノ酸配列には、セリン、スレオニン、アスパラギン、チロシンおよびシステインは含まれていない。ＣＢＥ３はＥＲＧＤ配列を有している。
等電点：９．３４
ＧＲＡＶＹ値：－０．６８２
１／ＩＯＢ値：０．３２３
アミノ酸配列（配列表の配列番号１）（国際公開ＷＯ２００８／１０３０４１号公報の配列番号３と同じ。但し末尾のＸは「Ｐ」に修正）
GAP(GAPGLQGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGPAGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPP)3G
（２）リコンビナントゼラチンの分子量分布の測定
　上記（１）に記載のリコンビナントゼラチンＣＢＥ３（実施例１）について、ゲル浸透クロマトグラフ（ＧＰＣ）を用いて分子量分布の測定を実施した。分子量分布の測定はＨＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ社製ＡＱＵＩＴＹ　ＵＰＬＣシステムＥｍｐｏｗｅｒ２）を使用し、緩衝液には１００ｍｍｏｌ／Ｌリン酸バッファー（ｐＨ６．８）を用いた。これらを用いてリコンビナントゼラチンの分子量分布の相対性を測定した。
　その結果を図１に示す。ＣＢＥ３の分子量ピークは２つ存在していた。それら２つのピークについて面積比から全ピーク中の占有率を計算したところ、１つ目のピークが９２．１％、２つ目のピークが７．９％となっていた。このことから、ＣＢＥ３は占有率の高いピークとして、９２％占有する分子量ピークを有することが分かった。
（３）天然動物ゼラチンの分子量分布の測定
　比較として、天然動物ゼラチン（比較例１）について、上記（２）と同様にＧＰＣを用いて分子量分布の測定を実施した。結果を図２に示す。天然動物ゼラチンの分子量ピークが２つ存在していた。それら２つのピークについて面積比から全ピーク中の占有率を計算したところ、１つ目のピークが４７．６％、２つ目のピークが５２．４％となっていた。このことから、天然動物ゼラチンは占有率の高いピークとして、５２％の分子量ピークを有することが分かった。
（４）包埋剤性能試験（ゲル化速度）
　細胞シートを輸送する際の包埋剤として使うためには、低温でのゲル化速度が速く、逆に可逆反応である常温下では素早く液体に戻る性能が重要となる。そこで１質量％濃度で、低温でのゲル化速度、常温での液体へ戻る速さを試験した。
　その結果、実施例１のＣＢＥ３では４℃に移すことで速やかにゲル化し、液の流動性が素早く低下し、完全にゲル化させた試料を２５℃の室温環境下へ移すと、早期に液体へと戻る現象が観察された。
　具体的には、ＣＢＥ３では４℃に移すことで４０分後からゲル化が始まり５０分後にはほぼ安定なゲルになった。また、そのゲルは強度があり、手で押してもつぶれることのないゲルであった。そのゲルを２５℃の室温に戻すと、４０分で完全な液体に戻った。
　一方で、比較例１の天然動物ゼラチンは、４℃に移すことでゲル化は起こるものの、その速度がＣＢＥ３の時よりも緩やかであり遅かった。また、完全にゲル化させた試料を２５℃の室温環境下へ移して、再度液体へ戻る速さを試験した結果、実施例１のＣＢＥ３に比べて比較例１の天然動物ゼラチンは液体に戻るのが遅かった。
　具体的には、天然動物ゼラチンでは、４℃に移すことで６０分後からゲル化が始まるが、９０分後でもゆるいゲル状にしかならなかった。その後も強度のあるゲルには移行せず、手で押すと簡単に潰れる程度のゆるいゲル状でとどまった。ゲル状のものを２５℃の室温に戻した場合、天然動物ゼラチンでは完全な液体に戻るまでに、７０分要した。
（５）ＣＢＥ３包埋細胞シートの作製
　ヒト骨格筋芽細胞６．０×１０７個を２０％（ｖ／ｖ）ヒト血清を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地　１０ｍＬに懸濁し、１０ｃｍ　ｄｉｓｈ温度応答性培養皿（ＵｐＣｅｌｌ（登録商標）：株式会社セルシード）に播種した。３７℃、５％ＣＯ２下で一晩培養して細胞シート化し、室温で剥離させた。室温にて１質量％ＣＢＥ３を含むＨＢＳＳ＋（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）１０ｍＬを温度応答性培養皿に添加し，２～８℃で１時間冷却してゲル化させ、ＣＢＥ３包埋細胞シートを作製した。ＨＢＳＳは、Ｈａｎｋｓ’　Ｂａｌａｎｃｅｄ　Ｓａｌｔ　ｓｏｌｕｔｉｏｎの略称である。
（６）振動評価
（６－１）
　上記（５）で作製したＣＢＥ３包埋細胞シートを卓上シェイカー（ＮＲ－３，タイテック社製）に載せ、回転数１００ｒｐｍ（回転毎分：ｒｏｔａｔｉｏｎ　ｐｅｒ　ｍｉｎｕｔｅ）に設定し２～８℃で２日間振とうさせた。対照として、１０ｃｍｄｉｓｈ温度応答性培養皿で調製した細胞シートにＣＢＥ３を含まないＨＢＳＳ＋を添加して、同様に振とうさせた。振とう後，ＣＢＥ３包埋細胞シートを室温に静置し、ゲルを融解して細胞シートを回収した。振とう前および振とう後の形状を図３に示す。
　ＣＢＥ３を含まないＨＢＳＳ＋を添加した場合、振とう後の細胞シートが壊れたのに対し、１質量％ＣＢＥ３を含むＨＢＳＳ＋を用いて細胞シートを包埋した場合、振とう後でも細胞シートが壊れなかった。
（６－２）
　シート化直後の細胞シートおよび１質量％ＣＢＥ３を含むＨＢＳＳ＋を添加して、振とうさせた後に回収した細胞シートを１０質量％中性緩衝ホルマリンで一晩固定し，パラフィン包埋した。包埋サンプルは薄切して脱パラフィン後，カラッチのヘマトキシリンとエオジンで染色した。結果を図４に示す。
　１質量％ＣＢＥ３を含むＨＢＳＳ＋を添加して、細胞シートを包埋した場合、振とう後の細胞シートは、内部の細胞が作製時同様に生存しており、十分にその性能を発揮できる細胞シートであることが確認された。

Claims (7)

  1. 下記式１で示され、かつ分子量分布が下記条件Ｘを満たすポリペプチドを含む、細胞シート包埋剤。
    式１：　Ａ－［（Ｇｌｙ－Ｘ－Ｙ）ｎ］ｍ－Ｂ
    式中、ｎ個のＸはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、ｎ個のＹはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、ｍは２～１０の整数であり、ｎは３～１００の整数であり、Ａは任意のアミノ酸またはアミノ酸配列を示し、Ｂは任意のアミノ酸またはアミノ酸配列を示す。
    条件Ｘ：ゲル浸透クロマトグラフィーによる分子量分布測定における最大の分子量ピークの面積が、全ての分子量ピークの合計面積の８０％以上である。
  2. ポリペプチドがリコンビナントゼラチンである、請求項１に記載の細胞シート包埋剤。
  3. ポリペプチドが、下記式２で示されるポリペプチドである、請求項１または２に記載の細胞シート包埋剤。
    式２：Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｐｒｏ－［（Ｇｌｙ－Ｘ－Ｙ）６３］３－Ｇｌｙ
    式中、６３個のＸはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、６３個のＹはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示す。なお、６３個のＧｌｙ－Ｘ－Ｙはそれぞれ同一でも異なっていてもよい。
  4. ポリペプチドが、（１）配列番号１に記載のアミノ酸配列、または（２）配列番号１に記載のアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有し、生体親和性を有するアミノ酸配列を有する、請求項１～３のいずれか一項に記載の細胞シート包埋剤。
  5. ポリペプチドが、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する、請求項１～４のいずれか一項に記載の細胞シート包埋剤。
  6. 細胞シートと、請求項１～５のいずれか一項に記載の細胞シート包埋剤とを含み、前記細胞シートが前記細胞シート包埋剤により包埋されている、細胞シート含有組成物。
  7. 細胞シートと、請求項１～５のいずれか一項に記載の細胞シート包埋剤とを含む、キット。
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