WO2017174847A1 - NUEVOS VEHÍCULOS PARA LA TRANSFECCIÓN DE miRNAs - Google Patents

NUEVOS VEHÍCULOS PARA LA TRANSFECCIÓN DE miRNAs Download PDF

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Inés FERNÁNDEZ PIÑEIRO
Iker BADIOLA
Joana MÁRQUEZ
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Definitions

  • the present invention relates to new systems comprising miRNAs for application in the pharmaceutical, cosmetic or nutritional fields, among others. These systems allow more efficient administration of different miRNAs, for example, in applications for cancer treatment.
  • MicroRNAs also commonly referred to as miRNAs, are short RNA sequences that have the ability to interfere with cellular processes. This capacity has aroused interest in its potential for medical, cosmetic or nutritional applications, among others. It has been possible to verify the potential of many of these miRNAs in biological tests, and to date approximately one thousand of these natural substances with potential in various applications have been identified.
  • the miRNAs are especially sensitive to exonuclease attack and have a half-life of minutes in the biological environment. This has triggered interest in the search for means of administration that allow transport of miRNAs efficiently, avoiding their rapid degradation in vivo.
  • miRNAs are deregulated in cancerous tissues and surrounding tissues, and in the ability of miRNAs to regulate multiple genes (for example, siRNAs are specific and allow action on a single gene), since they can bind to multiple RNA messengers (mRNA) (GARZON, R., MARCUCCI, G. and CROCE, CM, 2010. Targeting microRNAs in cancer: rationale, strategies and challenges. Nature reviews.Drug discovery, 9 (10) , pp. 775-789).
  • mRNA RNA messengers
  • LSECs hepatic sinusoid
  • non-viral vectors for example, liposomes, peptides, antibodies and other ligands, such as chitosan.
  • liposomes for example, liposomes, peptides, antibodies and other ligands, such as chitosan.
  • the improvement in the transfection of different miRNAs with the usual agents such as those of the lipofectamine ® family (DOTAP, DOTMA or DOPE) or Smarticles ® (amphoteric derivatives) has been sought.
  • miR-34a is now in clinical phases in the form of Smarticles ® liposomes for the treatment of liver cancer, and miR-16 in the form of EnGenelC nanoparticles (minicell; EP2386640) for the treatment of malignant pleural mesothelioma .
  • This situation contrasts with that of drugs based on siRNAs, another different family of RNAs that have double strands, which are not finding so many problems in the search for suitable vehicles for transfection, and for which there are already many clinical trials underway .
  • RES reticuloendothelial system
  • Kupffer cells are central in the removal of nanoparticles from the organism. Particle and fiber toxicology, 4, pp. 10).
  • the RES comprises phagocytic cells such as monocytes or macrophages, for example, Kupffer cells.
  • the present invention solves the aforementioned problems, improving the stability of miRNAs in vivo.
  • researchers have been able to verify that the systems of the present invention surprisingly improve the in vivo transport of miRNAs, and their effectiveness is surprisingly increased. It has been found that prevents degradation by the RES, and in particular prevents phagocytization by Kupffer cells.
  • a first aspect of the invention is a nanoparticle comprising (i) between 60% and 99% by weight, with respect to the total weight of the nanoparticle, of a sorbitan ester; (ii) a positively charged substance; and (iii) a miRNA.
  • An additional aspect is the use of a nanoparticle of the invention for the preparation of a medicament. Also a further aspect is a nanoparticle of the invention for use as a medicament.
  • An additional aspect is the use of a nanoparticle of the invention for the manufacture of a medicament for the treatment of an indication that is selected from the group consisting of cancer, diabetes and neurodegenerative diseases.
  • a nanoparticle of the invention is also an aspect for use in the treatment of an indication that is selected from the group consisting of cancer, diabetes and neurodegenerative diseases.
  • Another advantage of the invention is that the nanoparticles are easily prepared, and the incorporation of the miRNAs can be performed simultaneously to the formation of the nanoparticle itself or at a later stage of incubation, depending on the nature of the components , thus providing flexibility to its preparation.
  • a further aspect of the invention is a process for the preparation of a nanoparticle of the invention comprising (i) the step of adding an organic solution comprising an organic solvent and a sorbitan ester onto an aqueous solution; wherein said organic solution or said aqueous solution or both comprise a positively charged substance; and (ii) the step of evaporating organic solvent and water; and (iii) the optional step of incubating the nanoparticle resulting from step (ii) in the presence of other substances; wherein a miRNA is incorporated (a) during stage (i) as part of the aqueous solution, (b) in the incubation stage (iii), or in both stages (i) and (ii).
  • a further aspect of the invention is a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising the nanoparticle of the invention and a pharmaceutically acceptable excipient.
  • FIG. 1 Electrophoresis gel confirming the existence of an effective association between a miRNA and the nanoparticles prepared in example 1.
  • A band corresponding to the free miR-20a (5 ⁇ g / ml).
  • B band in which free miR-20a is not observed, corresponding to SP80-OA-CS-miR-20a (50 ⁇ g / ml miR-20a).
  • Figure 2 Demonstration of the therapeutic effect in vivo.
  • Clinical regulation of metastasis of liver by using nanoparticles according to the invention SP80-OA-CS-m ⁇ R-20a.
  • C26 murine colorectal cancer cell lines (200,000 cells / animal) were injected into mice. The animals were treated from day 3 after tumor inoculation, and subsequently every 3 days until day 21. On day 21 the animals were sacrificed and their livers were processed for histological analysis. The mice were separated into 5 treatment groups.
  • Group 1 was treated with placebo (glucose); group 2 (according to the invention) with SP80-OA-CS-miRNA-20a; group 3 with free miRNA-20a, without any specific vehicle; group 4 with an SP80-OA-CS nanoparticle associated with a miRControl (a miRNA that does not attack any target); Group 5 with SP80-OA-CS nanoparticles without any miRNA.
  • group 2 group 2 (according to the invention) with SP80-OA-CS-miRNA-20a
  • group 3 with free miRNA-20a, without any specific vehicle
  • group 4 with an SP80-OA-CS nanoparticle associated with a miRControl (a miRNA that does not attack any target)
  • Group 5 with SP80-OA-CS nanoparticles without any miRNA.
  • the macroscopic evaluation of the livers confirmed the therapeutic effect in terms of clinical regulation in animals treated with SP80-OA-CS-miRNA-20a (group 2).
  • Figure 3 Demonstration of the therapeutic effect in vivo. Histological Analysis Sections of the livers evaluated in Figure 2 were stained with hematoxylin-eosin, and the area occupied by the tumor was quantified under the microscope. The different groups were related to the control group (group 1 treated with placebo) using the T-test. Significant statistical differences (p ⁇ 0.05) are marked with *. Group 2 (treated with SP80-OA-CS-miRNA-20a) was also compared with group 5 (treated with SP80-OA-CS without miRNA) and its significant statistical difference (p ⁇ 0.05) indicated with +.
  • FIG. 4 Electrophoresis gel confirming the existence of an effective association between a miRNA or a plasmid (pEGFP), and the nanoparticles prepared in example 2.
  • Figure 5 TEM images of nanoparticles. 1) Blank SP-OA-CS nanoparticles, 2) NEGparticles loaded with pEGFP, 3) nanoparticles loaded with miR-20a.
  • Figure 6 LSEC migration capacity (Example 3). * reflects the statistical significance, the difference between healthy LSEC compared to liver LSEC colonized by the tumor; and + indicates the statistical significance of the difference between liver LSCE colonized by the tumor and liver LSCE colonized by the tumor but transfected with miR-20a. In both cases a threshold of p ⁇ 0.05 was used.
  • FIG. 7 Demonstration of the therapeutic effect in vivo for the second proof of concept (Example 4). Histological Analysis Sections of the livers evaluated were stained with hematoxylin-eosin and the area occupied by the tumor was quantified under the microscope. The different groups were related to the control group (group 1 treated with placebo) using the T-test. Significant statistical differences (p ⁇ 0.05) are marked with *. Group 2 (treated with SP80-OA-CS-miRNA-20a) was also compared with group 5 (treated with SP80-OA-CS without miRNA) and its significant statistical difference (p ⁇ 0.05) indicated with +.
  • Figure 8 Western blot analysis of ARHGAP1 and E2F1 validates the role of miR-20a in the expression pattern of two of the predicted targets. Analyzes were performed in 5 different conditions: i) LSEC of healthy livers, ii) LSEC of livers colonized by the tumor, iii) LSEC of livers colonized by the tumor and treated with the Mirus transfection vehicle, iv) LSEC of livers colonized by the tumor and transfected with non-specific miRNA control and v) LSEC of livers colonized by the tumor and transfected with miR-20a.
  • the formula [sorbitan ester] - [positively charged substance] is used. If the nanoparticle has other components, for example, a negatively charged substance, it is indicated below separated by a hyphen. In some cases the name of the miRNA used is indicated at the end. In addition, the following abbreviations are used:
  • Span-80 ® is a substance that results from esterifying sorbitan with c / s-9-octadecenoic acid (commonly known as oleic acid): that is, a molecule with the following formula: (CH,) 5 CH j . CH - CHCH j (CH, ⁇ e .CH 3
  • OA oleylamine, that is, (Z) -octadec-9-enylamine.
  • Chondroitin innate Its structure and properties are explained below in more detail.
  • HA hyaluronic acid. Its structure and properties are explained below in more detail.
  • a nanoparticle abbreviated OA-SP80-HA-m ⁇ R-20o will be one that incorporates Span-80 ®, oleylamine, hyaluronic acid ym ⁇ R-20o, prepared according to the procedures described herein.
  • the prefix "miR-” includes all, mature miRNAs, pre-miRNAs and the genes that encode them. After the number, some miRNAs incorporate a letter that allows to distinguish miRNAs with very similar sequences.
  • Alkyl is understood to mean a linear or branched hydrocarbon chain that does not contain any setting, of 1 to 40 carbon atoms unless otherwise indicated, optionally substituted with one, two or three substituents selected from -ORb, -SRb, - N RaRb, -C (0) Rb, -C0 2 Rb, -C (0) N RaRb, -N RaC (0) Rb, NRaC (0) ORb, -N RaC (0) NRaRb, -CF 3 , -OCF 3 ; wherein Ra and Rb are independently selected from hydrogen, CC 6 alkyl, alkenyl and C2 - C6 alkynyl C2 - C6.
  • Alkenyl means a linear or branched hydrocarbon chain containing at least one double bond, from 2 to 40 carbon atoms unless otherwise indicated, optionally substituted with one, two or three substituents selected from -ORb, - SRb, - NRaRb, -C (0) Rb, -C0 2 Rb, -C (0) N RaRb, -NRaC (0) Rb, -NRaC (0) ORb, -N RaC (0) N RaRb, -CF 3 , -OCF 3 ; wherein Ra and Rb are independently selected from hydrogen, CC 6 alkyl, alkenyl and C2 - C6 alkynyl C2 - C6.
  • Alkynyl means a linear or branched hydrocarbon chain containing at least one triple bond, from 2 to 40 carbon atoms unless otherwise indicated, optionally substituted with one, two or three substituents selected from -ORb, - SRb, - NRaRb, -C (0) Rb, -C0 2 Rb, -C (0) N RaRb, -NRaC (0) Rb, -NRaC (0) ORb, -N RaC (0) N RaRb, -CF 3 , -OCF 3 ; wherein Ra and Rb are independently selected from hydrogen, CC 6 alkyl, alkenyl and C2 - C6 alkynyl C2 - C6.
  • the weight percentages indicated herein are calculated with reference to the sum of all components added to the mixture in the formation of the nanoparticle, with the exception of solvents.
  • the weight percentage of SP80 will be the grams of SP80 added for the preparation of the nanoparticle, multiplied by one hundred, and divided by the sum of grams of SP80, OA, HA and m ⁇ R -20o additives for the preparation of the nanoparticle.
  • the nanoparticles of the invention comprise sorbitan esters.
  • Sorbitan is a mixture of cyclic sorbitol anhydrides, such as 1,4-anhydrosorbitol, 1,5-anhydrosorbitol and 1,4,3,6-dianhydrosorbitol.
  • Sorbitan esters are considered non-ionic surfactants because they contain two localized regions, one hydrophilic and one hydrophobic.
  • “Sorbitan esters” means esterified derivatives of sorbitan where the ester groups have a substituent selected from alkyl, alkenyl and alkynyl. Sorbitan esters include derivatives in which one, two, three or four hydroxyl groups are esterified, and even include esterified derivatives in which one ester molecule is present for every two sorbitan molecules (in which case they are named with the prefix "sesqui-").
  • sorbitan monooleate is the sorbitan ester resulting from the esterification of a hydroxyl group with oleic acid
  • Sorbitan trioleate is the sorbitan ester resulting from the esterification of three sorbitan hydroxyl groups with oleic acid.
  • sorbitan esters There are many different types of sorbitan esters based on the number of esterified hydroxyls, the structure of the ester, the mixture of anhydrosorbitol, and other factors. The person skilled in the art can choose between different types within the scope of the invention and is not limited to a specific type.
  • Commonly used sorbitan esters are, for example, those sold under the name Span ® (without polyoxyethylene blocks) or Tween ® (with polyoxyethylene blocks).
  • common Span ® sorbitan esters can be Span-80 ® (sorbitan monooleate), Span-20 ® (sorbitan monolaurate), Span-40 ® (sorbitan monopalmitate), span-65 (sorbitan tristearate) or the span-85 ® (sorbitan trioleate).
  • Sorbitan esters of the common Tween ® families are Tween ® 20 (Polyoxyethylene sorbitan monolaurate), Tween ® 40 (Polyoxyethylene sorbitan monopalmitate), Tween ® 60 (Polyoxyethylene sorbitan monostearate) or Tween ® 80 (Polyoxyethylene sorbitan monooleate).
  • the formation of the nanoparticles of the invention may comprise mixtures of two or more different sorbitan esters.
  • the person skilled in the art can then choose various sorbitan esters to combine with the positively charged substance, and by way of example, it can be selected from the group comprising sorbitan monooleate, sorbitan dioleate, trioleate sorbitan, sorbitan sesqui-oleate, sorbitan monolaurate, sorbitan dilaurate, sorbitan trilaurate, sorbitan sesqui-laurate, sorbitan monostearate, sorbitan distearate, sorbitan trytearate, sorbitan sesqui-stearate, sorbitan monopalmitate, sorbitan monopalmitate of sorbitan, sorbitan tripal
  • the sorbitan ester used in the nanoparticles of the invention can be a compound of formula I
  • each of a, b, c and d is independently a number between 0 and 100.
  • Those most common are commercially available and usually correspond to a linear alkyl comprising between 2 and 20 carbon atoms, for example, one with 9, 11, 13, 15 or 17 carbon atoms, or a linear alkenyl group comprising between 4 and 25 carbon atoms.
  • One commonly used is one in which n is 7 and m is 7, corresponding to oleic acid.
  • the polyoxyethylene blocks are optional, and each of a, b, c and d can be 0.
  • the sum of a, b, c and d can be, for example, of between 10 and 50 or between 10 and 30 or between 15 and 30.
  • Tween ® 80 Polyoxyethylene sorbitan monooleate
  • 6 , R 7 and R 8 are -H. That is, it is a sorbitan monoester, for example, one that is selected from the group consisting of sorbitan monooleate, sorbitan monolaurate, sorbitan monostearate, sorbitan monopalmitate, and combinations thereof.
  • This group of sorbitan monoesters can be represented by formula II
  • b is a number between 0 and 100, preferably 0.
  • the proportion of sorbitan esters in the nanoparticles is between 60% and 99% by weight with respect to the total weight of the nanoparticle. Typical proportions in which Sorbitan esters found are between 80% and 98% by weight with respect to the total weight of the nanoparticle, for example, between 85% and 95%. The proportion of sorbitan esters is usually greater than 87% by weight with respect to the total weight of the nanoparticle.
  • a positively charged substance means a molecule with a positive electrical charge.
  • these substances are used to modulate the properties of the particles formed, and a person skilled in the art has at their disposal a wide variety of them.
  • Non-limiting examples are ammonium salts, cationic polymers and fatty or lipophilic amines.
  • the cationic polymer can be selected from the group consisting of protamine, polyglutamic, cationized dextran, cationized pululane, polyamino acids, cationized proteins, and salts thereof.
  • Polyamino acids are another family of positively charged substances that can be used in the nanoparticles of the invention and that can be selected from the group consisting of polylysine and polyarginine.
  • Cationized proteins can be selected from the group consisting of gelatin, albumin, collagen, atelocollagen, and their cationized derivatives.
  • the ammonium salts may be substances comprising an ammonium or amine group attached to one, two or three moieties that are independently selected from the group consisting of C Qo alkyl, C 2 -C 40 alkenyl, C2-C40 alkynyl, for example , selected from the group consisting of cetyl trimethyl ammonium bromide (CTAB) and benzalkonium chloride (BZC).
  • CTAB cetyl trimethyl ammonium bromide
  • BZC benzalkonium chloride
  • the fatty amine can be oleylamine.
  • Positively charged substances suitable for the present invention may be ammonium salts or fatty amines, for example CTAB, BZC, oleylamine or mixtures thereof.
  • said positively charged substance may have the formula ( 10 ) p (R) (R 12 ) NR 9 , wherein
  • each of R 10, R u and R 12 are independently fenilalq selected from the group consisting of -H, C1-C4 alkyl, alkenyl C 2 -C 4 alkynyl , C 2 -C 4, and L7-L ONE 5;
  • R 9 is selected from the group consisting of Ci-C 40 alkyl, alkenyl C 2 -C 40 alkynyl , C 2 - 4 or c; p is 0 or 1;
  • the counter-anion is not critical and can be, for example, a halide (F, CI " , Br " or ⁇ ).
  • the negatively charged substance can be added in proportions ranging from 1% to 39% by weight with respect to the total weight of the nanoparticles. Preferred amounts range between 2% and 20%, typically between 3% and 12% or between 2% and 9% or between 3% and 8%, by weight with respect to the total weight of the nanoparticle.
  • An optional component of the nanoparticles of the invention is a negatively charged substance.
  • These substances are known to those skilled in the art and in the case of the present invention, those capable of forming a coating layer in the nanoparticle are preferred.
  • the family of negatively charged substances can be an anionic polymer according to the present invention, an anionic polymer being understood as a polymer with a negative charge.
  • the anionic polymers are preferably polysaccharides. There is a wide variety of these polysaccharides available to the person skilled in the art, and they are frequently used in this field. A preferred variety are those that contain a carboxyl group (-COOH) or sulfate (-SO3H) in the repeating monomer. Polysaccharides having at least one glucuronic acid in the repeating structure have been shown to be particularly suitable for the present invention.
  • said negatively charged substance may comprise a polysaccharide whose repetitive unit has the formula [XY- (Z) n ] wherein n is 0 or 1; X, Y and Z are each independently selected from the group consisting of monosaccharides, disaccharides and polysaccharides; with the proviso that at least one of X, Y and Z comprises an acid sugar and wherein the groups X, Y and Z join each other through -O-glycosidic bonds.
  • said acid sugar is selected from the group consisting of aldonic acids, ulosonic acids, uronic acids, aldaric acids and mixtures thereof.
  • Y may comprise an acid sugar, for example, a uronic acid.
  • a non-limiting example of said uric acid may be one of the formula III
  • each of 1 , R 2 and R 3 is independently selected from the group consisting of - H, -OH, -O-, -OR 4 , N (H) -R 4 and -0-S0 3 , with the condition of that at least one of R 1 , R 2 and R 3 be -O-,
  • Non-limiting examples of negatively charged substances having this formula are selected from the group consisting of hyaluronic acid, chondroitin sulfate and xanthan gum.
  • the negatively charged substances that can be incorporated into the nanoparticles of the present invention may also be those that are selected from the group consisting of hyaluronic acid, colominic acid, polysalic acid, chondroitin, queratane, dextrans, heparin, carrageenans, furcelerans, alginates, agar agar , glucomannan, gellan gum, garrof ⁇ n gum, guar gum, tragacanth gum, arabic gum, xanthan gum, karaya gum, pectins, celluloses, starches, their salts, fragments, derivatives and mixtures thereof.
  • Hyaluronan is a linear polymer that comprises the repetition of a disaccharide structure formed by the alternate addition of D-glucuronic acid and DN-acetylglucosamine, linked alternating beta-1,4 and beta-1,3 glucosidic bonds.
  • hyaluronic acid with a wide range of molecular weights can be used. High molecular weight hyaluronic acid is commercially available, while lower molecular weight can be obtained by fragmentation of high molecular weight hyaluronic acid, using, for example, a hyaluronidase enzyme.
  • hyaluronic acid, hyaluronic acid, hyaluronan includes either hyaluronic acid or a conjugate base thereof (hyaluronate).
  • This conjugate base may be an alkali salt of hyaluronic acid including inorganic salts such as, for example, sodium, potassium, calcium, ammonium, magnesium, aluminum and lithium salts, organic salts such as basic amino acid salts at neutral pH, preferably said salts are pharmaceutically acceptable.
  • the alkaline salt is the sodium salt of hyaluronic acid.
  • the family of polysalic acids is composed of linear polymers consisting of residues of N-acetylneuraminic acid (Neu5Ac; also known as sialic acid), a natural constituent of cells and tissues, linked by glycosidic bonds ct- (2-> 8).
  • N-acetylneuraminic acid residue has a carboxyl group, responsible for the negative charge of colominic acid. It is a biocompatible and biodegradable, non-immunogenic material, whose degradation products are not toxic (Gregoriadis G et al. Cell. Mol. Life Sci. 2000, 57, 1964-1969).
  • Dextran sulfate is a complex glucan (polysaccharide) consisting of units of glucose molecules, each of which contains approximately two sulfate groups. Dextran sulfate is prepared by dextran sulfation and subsequent purification by methods known to a person skilled in the art.
  • Heparin is a substance of natural origin from the family of glycosaminoglycans whose chemical structure includes the repetition of monomeric disaccharide units of 2- O sulfo-L-iduronic acid and 2-deoxy-2-sulfamido - D-glucopyranosyl-6- 0-sulfate.
  • Traditional or unfractionated heparin is clearly distinguished from fractionated or low molecular weight heparin.
  • the first one is a natural substance present in all vertebrates. Both types of heparin can be used in the form of a free base or in the form of salt, such as its sodium or calcium salt.
  • Heparin derivatives can also be employed in the composition of the nanoparticular systems of the present invention. These derivatives are known in the state of the art and originate as a result of the reactivity of the different functional groups present in the molecule. Thus, N-acetylated, O-decarboxylated, oxidized or reduced heparins are widely known.
  • Chondroitin sulfate is a sulfated glucosaminoglycan (GAG) composed of a chain of alternating sugars. It is normally bound to proteins as part of a proteoglycan.
  • GAG glucosaminoglycan
  • chondroitin sulfate includes all its different isomers and derivatives, as well as combinations thereof. For example, it is selected from the following substances and combinations thereof, summarized in formula IV
  • - Chondroitin B sulfate which is also called dermatan sulfate.
  • This substance is composed of linear repeating units containing N-acetylgalactosamine and either L-iduronic acid or glucuronic acid, and each disaccharide can be sulfated once or sulfated twice. It is present mostly in the skin, but it is also found in blood vessels, heart valves, tendons and lungs.
  • chondroitin sulfate also includes organic and inorganic salts thereof.
  • such salts are prepared, for example, by reacting the basic form of this compound with a stoichiometric amount of the appropriate acid in water or in an organic solvent or in a mixture of both.
  • non-aqueous media such as ether, ethyl acetate, ethanol, isopropanol or acetonitrile are preferred.
  • inorganic salts include sodium, potassium, calcium, ammonium, magnesium, aluminum and lithium salts
  • organic salts include, for example, ethylenediamine, ethanolamine, ⁇ , ⁇ -dialkylene ethanolamine, triethanolamine, glucamine and amino acids salts.
  • the salts are pharmaceutically acceptable.
  • Keratane sulfate is a sulfated glucosaminoglycan similar to chondroitin sulfate in which the sulfate group is found in glucuronic acid. Specifically, it is constituted by galactose and GlcNAc-6-sulfate, linked by a ⁇ -1,4 bond.
  • the carrageenan or carrageenan is formed by galactose and / or anhydrogalactose units, sulfated or not, joined by alternate bonds -1.3 and -1.4. Depending on the degree of sulphation, the positions of the sulfate groups and the presence of anhydrogalactose groups, various types of carrageenan are distinguished, all included in the scope of the present invention.
  • Glucomannan is a water-soluble polysaccharide of natural origin.
  • the chemical structure of this compound consists of a linear polymer chain with a small proportion of branches. Specifically, it consists of D-mannose and D-glucose units linked by -1.4 bonds in a ratio of 1.6: 1, respectively.
  • the glucomannan used is a negatively charged glucomannan derivative selected from the phosphorylated, carboxymethyl and dicarboxy-glucomannan derivatives.
  • Gellan gum is a water-soluble polysaccharide of natural origin.
  • the chemical structure of this compound consists of a polymer chain consisting of units of ⁇ -L-rhamnosium, ⁇ -glucuronic acid and two units of ⁇ -D-glucose.
  • the polymer may be in a partially acetylated form.
  • gellan gum provides gels with different mechanical properties.
  • the term "gellan gum” includes all its different derivatives, as well as combinations thereof.
  • liposomes or vesicles that is, lipid bilayer structures that enclose an aqueous phase inside.
  • the miRNAs are bound to the solid structure formed by the sorbitol esters and the positively charged substance.
  • the average size of the nanoparticles of the invention is between 1 and 999 nanometers. And they may have a negative or positive potential, depending on the components added, for example, whether or not they comprise a negatively charged substance, or the concentration of the added miRNA (s).
  • the nanoparticle of the invention has a positive potential between +1 and +100 mV.
  • the nanoparticle of the invention has a negative potential between -25 and -40 mV.
  • the nanoparticles of the invention may include other auxiliary substances, for example, an ethylene oxide derivative, a compound in which a unit -CH 2 CH 2 0- is repeated.
  • Said ethylene oxide derivative can be a compound of formula R 16 0 [CH2-CH 2 -0] f -C (H) (R 17 ) (R 18 ), wherein R 17 is a carbonyl or hydrogen group; R 18 is an alkyl, alkenyl or alkynyl group, of between 2 to 24 carbon atoms; R 16 is hydrogen or an alkyl group of 1 to 6 carbon atoms; f is a value of between 1 and 100, for example, between 1 and 50, or between 1 and 24.
  • ethylene oxide derivatives examples include polyethylene glycol dodecyl ether (Brij 30), polyethylene glycol hexadecyl ether ( Brij 56), polyethylene glycol 2- octadecyl ether (Brij 72), polyethylene glycol 8-octadecyl ether (Brij 78), polyethylene glycol 8-stearate (Myrj 45), 2-hydroxyethyl octadecanoate (Myrj 52), ethylene glycol monostearate.
  • Brij 30 polyethylene glycol dodecyl ether
  • Brij 56 polyethylene glycol 2- octadecyl ether
  • Brij 72 polyethylene glycol 8-octadecyl ether
  • Myrj 45 2-hydroxyethyl octadecanoate
  • Myrj 52 2-hydroxyethyl octadecanoate
  • the ethylene oxide derivatives can be incorporated in proportions that vary between 0.1% and 20% by weight with respect to the total weight of the nanoparticle. Depending on the applications, the proportions may vary and be, for example, between 0.1% and 15% or between 5% and 15% or between 7 and 13% by weight, based on weight Total nanoparticle.
  • the other essential component of the nanoparticles of the invention is a miRNA or a mixture of miRNAs, which are usually found in proportions below 25% by weight with respect to the total weight of the nanoparticle.
  • the proportion in which they are found in each case can be adjusted and can be, for example, between 0.01 and 10% or between 0.2% and 3% by weight with respect to the total weight of the nanoparticle.
  • the miRNAs that are used in the nanoparticles of the invention are RNA molecules that typically comprise between 5 and 30 bases or between 15 and 25 bases.
  • the miRNAs have multiple applications, and therefore also the nanoparticles of the invention, for example, in the pharmaceutical, cosmetic or nutrition field.
  • the therapeutic application of various miRNAs in fields such as cancer (miRNA-20a, miR-29, miR-652 miR-34a, miR-16), diabetes or neurodegenerative diseases is currently being studied.
  • cancer cancer
  • a preferred embodiment is the nanoparticles of the invention for use in the treatment of a cancer that is selected from the group consisting of colorectal, malignant pleural mesothelioma, liver, pancreas, colon and liver and lung metastases.
  • the ARHGAP1 and E2F1 proteins have been identified as targets of the miR-20a, and therefore another aspect of the invention is the use of the nanoparticles of the invention for the manufacture of a medicament for the treatment of a disease mediated by ARHGAPl. and / or E2F1.
  • Overexpression of E2F1 is performed with glioblastoma, melanoma pancreatic cancer and testicular cancer and that of ARHGAP with breast cancer. Therefore, the particles of the invention are also useful for the manufacture of a medicament for the treatment of a condition that is selected from the group consisting of glioblastoma, pancreatic cancer, melanoma, testicular cancer and breast cancer.
  • treatment means administering the nanoparticles of the invention to prevent, reduce or eliminate one or more of the symptoms or causes or effects (metastases) of a disease or condition. It also covers the prevention, reduction or elimination of the sequelae of said disease or condition, or of the side or adverse effects caused by another medication used. It also covers the administration to maintain health in subjects at risk of suffering from such disease.
  • reduce is understood as any improvement in the patient's situation, either measured by subjective parameters (for example, patient perception) or objectives (measurement of physiological, biochemical, histopathological, microbiological-analytical parameters).
  • the nanoparticles of the invention for use in the treatment of liver metastases is an embodiment of the invention, and it has been found that it is possible to reduce or eliminate the metastases and effects of said liver metathesis that often accompanies the colorectal cancer, which also constitutes an embodiment of the invention.
  • the nanoparticles of the invention comprise m ⁇ -20a, miR-29, miR-652 or mixtures thereof, preferably m ⁇ RNA-20a, for use in the treatment of colorectal cancer and / or its liver metastasis. associated.
  • Another aspect of the invention is a method for the treatment of an individual in need of treatment comprising the administration of a therapeutically effective amount of nanoparticles of the invention.
  • therapeutically effective amount refers to the amount of active ingredient calculated to produce the desired effect and will generally be determined, among other reasons, by the characteristics of the active ingredient used and the therapeutic effect that is going to get.
  • the dose of active ingredient administered to a subject for the treatment or prophylaxis of the aforementioned conditions is in the range of 10 "10 to 10 10 mg / kg body weight, usually between 10 " 3 and 10 3 mg / kg or between 10 "2 and 50 mg / Kg body weight.
  • the nanoparticles of the invention can form pharmaceutical compositions together with a pharmaceutically acceptable excipient.
  • pharmaceutically acceptable refers to molecular entities and compositions that are physiologically tolerable and do not normally produce an allergic or similar unwanted reaction, such as gastric discomfort, dizziness and the like, when administered to a human being.
  • pharmaceutically acceptable means approved by a federal or state regulatory agency or listed in the US Pharmacopoeia. or other pharmacopoeia generally recognized for use in animals and more particularly in humans.
  • excipient refers to a diluent, adjuvant, or vehicle with which the nanoparticles of the invention are administered. They are substances that, for example, are added to the active ingredients or their associations to serve as a vehicle, enable their preparation and stability, modify their organoleptic properties or determine the physicochemical properties of the drug and its bioavailability.
  • Such pharmaceutical vehicles may be sterile liquids, such as water or oils, including those of petroleum, animal, vegetable or synthetic origin, such as peanut oil, soybean oil, mineral oil, sesame oil and the like.
  • Water or saline solutions of aqueous solution and aqueous solutions of dextrose and glycerol are preferably used as vehicles, or of glucose and glycerol, particularly for injectable solutions.
  • Suitable pharmaceutical vehicles are described in "emington's Pharmaceutical Sciences” by EW Martin.
  • the pharmaceutical composition or medicament can be in any form suitable for administration to humans and / or animals, preferably humans, including infants, children and adults and can be prepared by standard procedures known to those skilled in the art.
  • the medicament can be prepared by standard procedures known to those skilled in the art, for example, reflected in "Pharmaceutics: The Science of Dosage Forms, second edition, Aulton, ME (ed.) Churchill Livingstone, Edinburgh (2002);” Encyclopedia of Pharmaceutical Technology ", second edition, Swarbrick, J. and Boylan JC (eds.), Marcel Dekker, Inc. New York (2002);” Modern Pharmaceutics ", fourth edition, Banker GS and Rhodes CT (eds.) Marcel Dekker, Inc.
  • composition of the medicament may vary depending on the route of administration
  • Illustrative non-limiting examples of said pharmaceutical forms of administration of the pharmaceutical composition of the invention include oral formulations ob ucals (liquids, solution, suspension, emulsion, gel, paste, powder, oral lyophilisate, tablets, capsules, pills, emulsions); sublingual formulations; ophthalmic formulations; ear formulations (otics); topical formulations; nasal formulations; rectal formulations; vaginal formulations; intrauterine formulations; inhalation or pulmonary formulations; parenteral formulations, for example, injectable formulation, for example, for intravenous injections or for subcutaneous injections.
  • Preparation Procedure for example, injectable formulation, for example, for intravenous injections or for subcutaneous injections.
  • the process comprises (i) the step of adding an organic solution comprising an organic solvent and a sorbitan ester over an aqueous solution; (ii) the step of evaporating the solvent, that is, the organic solvent, and the water; and (iii) an optional incubation step.
  • the positively charged substance can be incorporated into the organic solution or the aqueous solution.
  • the mi NA or the miRNAs is incorporated (n), either during stage (i) as part of the aqueous solution, either in the incubation stage (iii), or in both stages (i) and (iii).
  • an alternative is a process comprising (i) the step of adding a solution comprising an organic solvent, a sorbitan ester and a positively charged substance on an aqueous solution comprising a miRNA; and (ii) the step of evaporating the solvent, that is, the organic solvent, and the water.
  • Another alternative comprises (i) the step of adding a solution comprising an organic solvent, a sorbitan ester and a positively charged substance on an aqueous solution; (ii) the step of evaporating the solvent, that is, the organic solvent, and the water; and (iii) the step of incubating the nanoparticle resulting from step (ii) in the presence of a miRNA.
  • a solution comprising an organic solvent, a sorbitan ester and a positively charged substance on an aqueous solution
  • the step of evaporating the solvent that is, the organic solvent, and the water
  • step of incubating the nanoparticle resulting from step (ii) in the presence of a miRNA Suitable procedures are described, for example, in WO2013 / 068625.
  • the organic phase is preferably added under stirring of the aqueous phase.
  • the components that the system can additionally comprise, such as a negatively charged substance, can be added to the organic phase or the aqueous phase, depending on the characteristics of the substance incorporated into the system.
  • the aqueous solution further comprises a negatively charged substance.
  • the additional components may be incorporated at a later stage, for example, step (iii) of incubation of the dispersion of nanoparticles formed with a solution comprising any of these substances.
  • the organic phase further comprises an ethylene oxide derivative, for example, one of formula 16 0 [CH2-CH 2 -0] f -C (H) (R 17 ) (R 18 ) as the described above.
  • the solvent of the organic phase is a hydromiscible solvent, for example, an aliphatic alcohol, such as ethanol, easy to evaporate, more harmless and stable against the components of the nanoparticles.
  • the concentrations of the different components is not critical.
  • the sorbitan ester is dissolved in the organic phase in a concentration that can be between 0.1 and 10 mg / ml, or between 2 and 7 mg / ml.
  • the positively charged substance may be in a concentration of between 0.01 and 5.0 mg / mL, for example, between 0.1 and 2.0 mg / mL preferably between 0.2 and 0.5 mg / mL
  • the negatively charged substance may be in a concentration of between 0.01 and 5.0 mg / mL, for example, between 0.05 and 2.0 mg / mL preferably between 0.1 and 0.3 mg / mL.
  • the mixing of the aqueous and organic phases can be done at room temperature or by heating one or both phases.
  • the process may comprise an additional stage of total or partial dehydration (lyophilization or drying, respectively). In this way it is possible to preserve them during storage so that they retain their initial characteristics and reduce the volumes of product to be handled.
  • the lyophilization or drying process leads, respectively, to a totally or partially dehydrated product.
  • the process comprises an additional step in which the partially dehydrated or lyophilized nanoparticles are regenerated. In this way it is possible to dehydrate the nanoparticles to obtain a more stable product during storage and subsequently regenerate or recover the nanoparticles by means of a re-suspension process in an aqueous medium.
  • a final aspect of the invention is directed to obtainable nanoparticles as described above.
  • the components described above can be combined so that in each case the resulting nanoparticle of the invention adapts to the specific situation, and the present invention encompasses different combinations of sorbitan esters, positively charged substances, my NAs, as well as negatively charged substances and other optional components if used.
  • one embodiment of the present invention is a nanoparticle comprising (i) one or more miRNAs (eg, mR-20a, miR-29, miR-652 or mixtures thereof); (ii) a sorbitan ester of formula I, as defined above; (iii) a positively charged substance of formula (R 10 ) p (R U ) (R 12 ) NR 9 , as described above; and (iv) a negatively charged polysaccharide.
  • miRNAs eg, mR-20a, miR-29, miR-652 or mixtures thereof
  • a sorbitan ester of formula I as defined above
  • a positively charged substance of formula (R 10 ) p (R U ) (R 12 ) NR 9 as described above
  • a negatively charged polysaccharide e.g, a negatively charged polysaccharide.
  • the present invention comprises (i) one or more miRNAs (eg, mR-20a, miR-29, miR-652 or mixtures thereof, or also miR-93 or mixtures thereof with one or more more than the previous ones); (ii) a sorbitan ester of formula I, as defined above; (iii) a positively charged substance that is selected from the group consisting of CTAB, BZC, oleylamine and mixtures thereof; and (iv) a negatively charged polysaccharide.
  • miRNAs eg, mR-20a, miR-29, miR-652 or mixtures thereof, or also miR-93 or mixtures thereof with one or more than the previous ones
  • a sorbitan ester of formula I as defined above
  • a positively charged substance that is selected from the group consisting of CTAB, BZC, oleylamine and mixtures thereof
  • a negatively charged polysaccharide e.g, mR-20a, miR-29, miR-652
  • Another embodiment of the present invention is a nanoparticle comprising (i) one or more miRNAs; (ii) a sorbitan ester of formula I, as defined above; (iii) a positively charged substance of formula (R 10 ) p (R 11 ) (R 12 ) NR 9 , as described above; and (iv) a negatively charged polysaccharide wherein at least one of its monomers comprises a group -COOH 0 -SO3H.
  • Another embodiment of the present invention is a nanoparticle comprising (i) one or more miRNAs; (ii) a sorbitan ester; (iii) a positively charged substance; and (iv) a positively charged polysaccharide wherein at least one of its monomers comprises a -COOH or -S0 3 H group.
  • Another embodiment of the present invention is a nanoparticle comprising (i) one or more miRNAs; (ii) a sorbitan ester of formula I, as defined above; (iii) a positively charged substance of formula (R 10 ) p (R U ) (R 12 ) NR 9 , as described above; and (iv) a negatively charged polysaccharide.
  • the above combinations and others that are not explicitly described are also part of the scope of protection.
  • the nanoparticles of the invention may comprise other components such as, for example, other active ingredients of interest, for which it would be sufficient to add them, to the organic solution or to the aqueous solution or both during the nanoparticle preparation It would also be possible to add them during the additional stage (iii) of incubation.
  • the size of the nanoparticles was determined by the photonic correlation spectroscopy (PCS) technique and using a Zeta Sizer (Zeta Sizer, Nano Series, Nano-ZS, Malvern Instruments, .U.), Obtaining the average population size and the polydispersion index thereof.
  • the process comprises diluting the samples in Milli-Q water to a 1:19 ratio. Each analysis was carried out at 25 ° C with a detection angle of 173 °.
  • the zeta potential of the nanoparticles was detected by the laser dispersion anemometry (LDA) technique using a Zeta Sizer (Zeta Sizer, Nano series, Nano-ZS, Malvern Instruments, R.U.).
  • LDA laser dispersion anemometry
  • Zeta Sizer Zeta Sizer, Nano series, Nano-ZS, Malvern Instruments, R.U.
  • the process comprises diluting the samples in millimolar KCI solution.
  • the efficacy of the association of miRNAs with nanoparticles was determined by the agarose gel electrophoresis technique.
  • the process comprises preparing a 2% agarose gel in TAE buffer (Tris-Acetate-EDTA, 40 mM Tris, 1% acetic acid, 1 mM EDTA), pH 8 with SYBR ® . Gel staining of gold and glycerol nucleic acids was used as filler. A potential difference of 25 mV was applied for 30 minutes and free miRNA was used as a control.
  • the following polymers were purchased from different commercial establishments: hyaluronic acid (Bioibérica, Spain), chondroitin sulfate (Calbiochem, USA). Span ® 80 and oleylamine were purchased from Sigma (Spain). The different miRNAs used were purchased from Exiqon (Denmark). The other products indicated in the examples below were purchased from Sigma (Spain).
  • Example 1 In vivo proof of concept of the therapeutic effect in terms of clinical regulation of liver metastases provided Preparation and characterization of nanoparticles
  • a solution of sorbitan monooleate (Span * 80, SP80) and oleylamine (OA) in 3 ml of ethanol (organic phase) was prepared at a concentration of 6.6 and 0.33 mg / ml respectively.
  • This organic phase was then added to 6 ml of a stirred aqueous phase containing chondroitin sulfate (CS) at a concentration of 0.125 mg / ml, thereby giving rise to the spontaneous formation of NPs.
  • the ethanol was finally removed under reduced pressure on a rotary evaporator.
  • the mi NA was included in the aqueous phase at a concentration of 8.33 ⁇ g / ml during the preparation of the nanoparticles.
  • miR-20a was selected.
  • the size and zeta potential of the nanoparticles was measured by photon correlation spectroscopy and laser Doppler anometry (Doppler anemometry laser), respectively.
  • mice Males, 8 weeks old were obtained from Charles River Laboratories Espa ⁇ a, SA The mice were housed in the Biological Resources Unit of the University of the Basque Country and kept in an environment of controlled temperature (21 ⁇ 1 ° C), relative humidity of 55 ⁇ 5%, light / dark cycle from 08h00-20h00 and conventional mouse feed and water ad libitum were supplied.
  • a model of liver metastases and clinical evaluation A model of liver metastases was developed by injecting in mice a c26 murine colorectal cancer cell line (200,000 cells / animal). The animals were anesthetized with isofluorane (5% and 1.5% maintenance) and the cells were injected into the spleen. After the intervention, the incisions were sutured. Animals were treated on day 3 after tumor inoculation and subsequently every 3 days until day 21 with a total dose of 25 ⁇ g of my NA per animal. The mice were separated into 5 different groups depending on the treatment.
  • Group 1 was treated with placebo (glucose); group 2, according to the invention, was treated with SP80-OA-CS nanoparticles associated with m ⁇ R-20o with a fluorescent label (6-carboxyfluorescein) (FAM); group 3 was treated with free or naked miR-20a (without any specific vehicle); group 4 was treated with SP80-OA-CS nanoparticles associated with a miRControl (this miR does not attack any mRNA); Group 5 was treated with blank SP80-OA-CS nanoparticles (without associated mRNA). On day 21 after inoculation the animals were sacrificed and the livers were observed and subsequently processed for histological analysis.
  • FAM fluorescent label
  • livers were rapidly removed and fixed in paraformaldehyde (4% PFA) in PBS, overnight at 4 ° C.
  • the fixed livers were processed for inclusion in paraffin.
  • Serial sections 10 ⁇ thick were mounted in five parallel series and processed for hematoxylin-eosin. Microscopic images were captured on a Zeiss microscope.
  • LSEC hepatic sinusoidal endothelial cells
  • the sections of the livers of Figure 2 were stained with hematoxylin-eosin and the area occupied by the tumor under the microscope.
  • the different groups were related to the control group (treated with glucose as a placebo) using the T-test.
  • Statistically significant differences (p ⁇ 0.05) were indicated with a *.
  • the group treated with SP80-OA-CS nanoparticles associated with mi -20a and blank SP80-OA-CS nanoparticles (without associated mRNA) and the statistically significant difference (p ⁇ 0.05) were indicated. with a +.
  • the area occupied by the tumor was surprisingly smaller in mice treated with SP80-OA-CS nanoparticles associated with miR-20a (according to the invention) than in mice treated only with m ⁇ R - 20 a.
  • Example 2 In vivo and in vitro additional concept test of the therapeutic effect and behavior of the nanoparticles of the invention
  • C26 murine colorectal cancer cell lines (ATCC, Manassas, VA, USA) with Balb / c mice were used.
  • the cells were grown under standard conditions in RPMI medium (Sigma-Aldrich; St. Louis, MO, USA), supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS), penicillin (100 U / ml), streptomycin (100 ⁇ g / ml) and amphotericin B (0.25 ⁇ g / ml), all purchased from Life technologies, Carlsbad, CA, USA)
  • FBS fetal bovine serum
  • penicillin 100 U / ml
  • streptomycin 100 ⁇ g / ml
  • amphotericin B (0.25 ⁇ g / ml
  • mice were anesthetized with isoflurane, and a small incision was made on their left side. Then, the cut was inoculated with 50 ⁇ of the C26 cancer cells at a concentration of 2 x 10 6 cells / ml. Next, the peritoneum and skin were sutured. Control mice were inoculated with PBS. Fourteen days later, all mice were sacrificed and cancer-activated and control cell lines were isolated by differential gradient centrifugation (25% to 50%) of Percoll (Sigma-Aldrich; St. Louis, MO, USA). .). Cell lines were seeded with RPMI 1640 medium with 10% FBS, and the RNA purification following the protocol of a Purelink RNA minikit (Gibco Life Technologies Inc., Gaithersburg, MD, USA).
  • the ethanol was removed under reduced pressure on a rotary evaporator.
  • this was included in the aqueous phase during the construction of the nanoparticles at concentrations of 33.3 ⁇ g / ml for plasmid of Enhanced Fluorescent Green Protein (pEGFP) (Elim Biopharmaceutics, USA) and 8 , 33 ⁇ g / ml and 16.7 ⁇ g / ml for miRNA (miR-20 or miR-control) (Exiqon, Denmark).
  • the final formulations obtained were 200 ⁇ g / ml of NP loaded with pEGFP, 50 and 100 ⁇ g / ml of NP loaded with miRNA.
  • the formulations were administered in a 5% glucose solution for in vivo studies.
  • the efficacy of the association of plasmid DNA and miRNAs was determined by agarose gel electrophoresis, with results similar to those of example 1, confirming that the migration of nucleic acids to the gel was avoided by association with the nanoparticles; no free genetic material was observed in these formulations (see figure 4).
  • the morphology of the nanoparticles was examined with transmission electron microscopy (CM 12 Philips, Eindhoven, The Netherlands) after staining with 2% w / v phosphotungstic acid solution. For this purpose, the samples were placed on copper grids (400 mesh) coated with a Formvar ® film .
  • the blank nanoparticles (without incorporated genetic material) and the nanoparticles associated with pEGFP or miR-20a had nanometric sizes of 133 nm, 143 nm and 143 nm and negative surface charges of -38 mV, -36 mV and -33 mV, respectively.
  • the morphology of the nanosystems was observed using transmission electron microscopy (TEM).
  • TEM transmission electron microscopy
  • the TEM images confirmed the nanometric size of the formulations ( Figure 5).
  • Table 2 Physicochemical characterization of SP-OA-CS nanoparticles associated with pEGFP or with miR-20a that are capable of targeting LSEC in vitro and in vivo
  • a plasmid DNA encoding GFP was incorporated during its preparation. GFP expression was evaluated 24 h after transfection using fluorescence microscopy. At this experimental time, the LSECs expressed GFP, which indicates the internalization of nanoparticles and supply of successful plasmids, that is, the effective release of genetic material to said cells by the nanoparticles.
  • the nanoparticles of the invention were systemically injected into SP-OA-CS mice containing EGFP plasmid.
  • Hepatic sinuosides expressed GFP indicating a successful plasmid supply, that is, the effective release of genetic material to said cells by the nanoparticles.
  • the sections were immunostained with anti-mannose receptor and F4 / 80 antibodies.
  • GFP positive cells were hepatic sinusoid endothelial cells.
  • the fluorescence signal of miR-20a was detected in LSEC when nanoparticles associated with miRNA were injected into the mice. At the same time, the fluorescent signal was wider when miR-20a was injected in the naked form.
  • Example 3 The increased migratory capacity of LSEC activated by tumor signals is avoided by miR-20a
  • Example 4 Analysis of development of liver metastases from colorectal cancer in vivo and histological liver tissue
  • mice were anesthetized with isoflurane (Esteve, Spain), and a small cut was made on their left side.
  • the spleen was exposed to perform an intra-splenic inoculation of 50 ⁇ of C26 colon carcinoma cells at a concentration of 2 x 6 6 cells / ml for each mouse.
  • the animals were divided into 5 groups, and the treatments were performed every 3 days from the day of inoculation of cancer cells.
  • Group 1 was treated with placebo (glucose); group 2, according to the invention, was treated with SP80-OA-CS nanoparticles associated with miR-20a; group 3 was treated with free or naked miR-20a (without any specific vehicle); group 4 was treated with SP80-OA-CS nanoparticles associated with a miRControl (this miR does not attack any mRNA); Group 5 was treated with blank SP80-OA-CS nanoparticles (without associated mRNA).
  • the livers were included in paraffin and frozen for histological analysis. To quantify the occupied tumor area, sections of 7 ⁇ were cut with 500 ⁇ between them in livers included in paraffin.
  • the miRBASE database (www - i; bose.org) was used to identify 713 proteins as possible targets of m ⁇ R-20a.
  • 174 proteins were identified that were positively regulated in tumor-activated LSEC compared to control LSEC.
  • 5 proteins expressed in coincidence were discovered: E2F1, JAKl, ARHGAPl, ACSL4 and DECR1.
  • a Western blot analysis was then performed with tumor activated LSEC and tumor activated LSEC grown with exogenous mR20a.
  • LSEC cultures were lysed with RIPA buffer, separated through 8% SDS-PAGE electrophoresis and transferred to a nitrocellulose membrane (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA).
  • E2F1 Santa Cruz Biotechnology, Dallas, Texas, USA
  • ARHGAPl Abcam, Cambridge, United Kingdom
  • Bands were visualized using a Femto Super Signal Substrate kit (Pierce Chemical Co, Rockford, IL, USA).
  • GAPDH was used as a protein loading control.
  • Example 1 The nanoparticles developed in Example 1 were successfully evaluated for their ability to maintain association with miRNA after a lyophilization process.

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Abstract

La presente invención se refiere a una nanopartícula que comprende (i) entre un 60% y un 99% en peso, con respecto al peso total de la nanopartícula, de un éster de sorbitán; (ii) una sustancia cargada positivamente; y (iii) un miRNA; a sus métodos de fabricación, y sus usos, especialmente en usos terapéuticos, como el tratamiento del cáncer.

Description

NUEVOS VEHÍCULOS PARA LA TRANSFECCIÓN DE miRNAs
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere a nuevos sistemas que comprenden miRNAs para su aplicación en los campos farmacéutico, cosmético o nutricional, entre otros. Estos sistemas permiten la administración más eficiente de distintos miRNAs, por ejemplo, en aplicaciones para el tratamiento del cáncer.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
Los microRNAs, también comúnmente denominados miRNAs, son secuencias cortas de RNA que tienen la capacidad de interferir en procesos celulares. Esta capacidad ha despertado el interés en su potencial para aplicaciones médicas, cosméticas o nutricionales, entre otras. Se ha podido comprobar el potencial de muchos de estos miRNAs en ensayos biológicos, y hasta la fecha se han identificado aproximadamente un millar de estas sustancias naturales con potencial en diversas aplicaciones.
Hasta el momento, el principal problema para su uso es su corta vida cuando son administrados. Los miRNAs son especialmente sensibles al ataque de exonucleasas y tienen una semivida de minutos en el medio biológico. Esto ha disparado el interés por la búsqueda de medios de administración que permitan transportar los miRNAs de forma eficaz, evitando su rápida degradación in vivo.
Una de las primeras estrategias contempladas fue la modificación estructural de los miRNAs. Una de las variaciones más extendidas ha sido la modificación del grupo 2' -OH de la ribosa (Wu SY, Yang X, Gharpure KM, Hatakeyama H, Egli M, et al. (2014) 2'-OMe-phosphorodithioate- modified siRNAs show increased loading into the RISC complex and enhanced anti-tumour activity. Nat Commun 5: 3459.). Ejemplos de estas modificaciones son la sustitución en esta posición por 2'-fluoro, 2'-0-metil o 2'-0-metoximetil, solo por mencionar algunos ejemplos. Otra estrategia seguida ha sido el uso de vectores virales, por ejemplo, lentivirus o adenovirus, tal y como se explica en Kasar S, Salerno E, Yuan Y, Underbayev C, Vollenweider D, et al. (2012) Systemic in vivo lentiviral delivery of miR-15a/16 reduces malignancy in the NZB de novo mouse model of chronic lymphocytic leukemia. Genes Immun 13: 109-119; o en Brandt MR, Kirste AG, Pozzuto T, Schubert S, Kandolf R, et al. (2013) Adenovirus vector-mediated RNA interference for the inhibition of human parvovirus B19 replication. Virus Res 176: 155-160. Sin embargo, y pese a que se han modificado genéticamente para eliminar su carga virulenta, la seguridad de estos vectores siempre despierta preocupación.
El campo de la oncología es donde posiblemente los miRNAs han recibido más atención hasta el momento. Este interés deriva del descubrimiento de que los miRNAs están desregulados en tejidos cancerosos y los tejidos que los rodean, y en la habilidad de los miRNAs para regular múltiples genes (por ejemplo, los siRNA son específicos y permiten la acción sobre un único gen), ya que se pueden unir a múltiples RNA mensajeros (mRNA) (GARZON, R., MARCUCCI, G. and CROCE, C.M., 2010. Targeting microRNAs in cáncer: rationale, strategies and challenges. Nature reviews.Drug discovery, 9(10), pp. 775-789).
Un ejemplo es el caso del cáncer colorectal y la metástasis de hígado, una de sus regiones más frecuentes de metástasis. Las células endoteliales del sinusoide hepático (LSECs) juegan un papel clave en el desarrollo y regulación de la metástasis de hígado. Se ha encontrado que algunos miRNAs (miR-20a; miR-29 y miR-652) están desregulados en las LSECs, y la recuperación de sus niveles normales se presenta como una alternativa terapéutica prometedora.
En vista del potencial de los miRNAs y sus dificultades en la administración, se ha probado la utilización de vectores no virales, por ejemplo, liposomas, péptidos, anticuerpos y otros ligandos, como el quitosano. Así, se ha buscado la mejora en la transfección de diferentes miRNAs con los agentes habituales como, por ejemplo, los de la familia lipofectamine® (DOTAP, DOTMA o DOPE) o Smarticles® (derivados amfotéricos). Por ejemplo, el miR-34a se encuentra ahora en fases clínicas en forma de liposomas Smarticles® para el tratamiento del cáncer de hígado, y el miR-16 en forma de nanopartículas de EnGenelC (minicell; EP2386640) para el tratamiento de mesotelioma pleural maligno. Esta situación contrasta con la de medicamentos basados en siRNAs, otra familia diferente de RNAs que tienen doble cadena, los cuales no están encontrando tantos problemas en la búsqueda de vehículos adecuados para su transfección, y para los cuales existen ya multitud de ensayos clínicos en marcha.
Dado el reciente interés despertado por los miRNAs como agentes terapéuticos, existe una necesidad en encontrar y desarrollar nuevos vehículos para una administración más efectiva (LAM, J.K., CHOW, M.Y., ZHANG, Y. and LEUNG, S.W., 2015. siRNA Versus miRNA as Therapeutics for Gene Silencing. Molecular therapy.Nucleic acids, 4, pp. e252). Sin embargo, los esfuerzos en el caso de los miRNAs se está viendo especialmente dificultados por ser moléculas de naturaleza hidrofílica, alto peso molecular y carga negativa, que impiden su paso a través de la membrana celular.
El uso de vectores no virales mencionados arriba reduce estos problemas, sin embargo, especialmente en el caso de sistemas nanométricos, crea otras dificultades. El sistema reticuloendotelial (RES) absorbe rápidamente los sistemas nanométricos, y es la causa de la escasa estabilidad in vivo (y por tanto, escasa eficacia) de muchos de ellos (RINKENAUER, A.C., PRESS, A.T., RAASCH, M., PIETSCH, C, SCHWEIZER, S., SCHWORER, S., RUDOLPH, K.L, MOSIG, A., BAUER, M., TRAEGER, A. y SCHUBERT, U.S., 2015. Comparison of the uptake of methacrylate-based nanoparticles in static and dynamic in vitro systems as well as in vivo. Journal of controlled reléase : official journal of the Controlled Reléase Society, 216, pp. 158- 168; SADAUSKAS, E., WALLIN, H., STOLTENBERG, M., VOGEL, U., DOERING, P., LARSEN, A. y DANSCHER, G., 2007. Kupffer cells are central in the removal of nanoparticles from the organism. Particle and fibre toxicology, 4, pp. 10). El RES comprende células fagocitarias como los monocitos o los macrófagos, por ejemplo, las células de Kupffer. Aunque es generalmente aceptado que existe una correlación entre la carga superficial positiva de la nanopartícula y una menor absorción por parte de las células fagocitarias, no se conoce con exactitud qué factores influyen en esta absorción, lo que dificulta la predicción sobre el tipo de sistemas nanométricos que tendrán una estabilidad adecuada in vivo.
El desarrollo de vehículos con propiedades mejoradas para la administración de miRNAs resulta por tanto de gran interés.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
La presente invención resuelve los problemas mencionados anteriormente descritos, mejorando la estabilidad de los miRNAs in vivo. Los investigadores han podidio comprobar que los sistemas de la presente invención mejoran sorprendentemente el transporte in vivo de los miRNA, y su eficacia se ve sorprendentemente incrementada. Se ha podido comprobar que evita su degradación por parte del RES, y en particular evita la fagocitación por parte de las células de Kupffer.
Por tanto, un primer aspecto de la invención es una nanopartícula que comprende (i) entre un 60% y un 99% en peso, con respecto al peso total de la nanopartícula, de un éster de sorbitán; (ii) una sustancia cargada positivamente; y (iii) un miRNA. La estabilidad de estos sistemas y la mejora en la transfección de mi NAs que aportan hacen las nanopartículas de la invención adecuadas para, por ejemplo, aplicaciones en el ámbito de la farmacia, la cosmética o la nutrición.
Un aspecto adicional es el uso de una nanopartícula de la invención para la preparación de un medicamento. También es un aspecto adicional una nanopartícula de la invención para su uso como medicamento.
Un aspecto adicional es el uso de una nanopartícula de la invención para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una indicación que se selecciona del grupo que consiste en cáncer, diabetes y enfermedades neurodegenerativas. También es un aspecto una nanopartícula de la invención para su uso en el tratamiento de una indicación que se selecciona del grupo que consiste en cáncer, diabetes y enfermedades neurodegenerativas. Otra de las ventajas de la invención es que las nanopartículas son de fácil preparación, y la incorporación de los miRNAs se puede realizar de forma simultánea a la formación de la propia nanopartícula o en una etapa posterior de incubación, dependiendo de la naturaleza de los componentes, proporcionando así flexibilidad a su preparación. Así, un aspecto adicional de la invención es un procedimiento para la preparación de una nanopartícula de la invención que comprende (i) la etapa de añadir una solución orgánica que comprende un disolvente orgánico y un éster de sorbitán sobre una solución acuosa; en donde dicha solución orgánica o dicha solución acuosa o ambas comprenden una sustancia cargada positivamente; y (ii) la etapa de evaporar disolvente orgánico y agua; y (iii) la etapa opcional de incubar la nanopartícula resultante de la etapa (ii) en presencia de otras sustancias; en donde un miRNA se incorpora (a) durante la etapa (i) como parte de la solución acuosa, (b) en la etapa de incubación (iii), o en ambas etapas (i) y (ii).
Un aspecto adicional de la invención es una composición farmacéutica que comprende la nanopartícula de la invención y un excipiente farmacéuticamente aceptable.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Figura 1. Gel de electroforesis que confirma la existencia de una asociación efectiva entre un miRNA y las nanopartículas preparadas en el ejemplo 1. A: banda correspondiente al miR-20a libre (5 μg/ml). B: banda en la que no se observa miR-20a libre, correspondiente al SP80-OA- CS-miR-20a (50 μg/ml miR-20a).
Figura 2. Demostración del efecto terapéutico in vivo. Regulación clínica de la metástasis de hígado mediante el uso de nanopartículas según la invención SP80-OA-CS-m¡R-20a. Se inyectaron en ratones líneas celulares de cáncer colorectal murino c26 (200.000 células/animal). Los animales se trataron a partir del día 3 tras la inoculación del tumor, y subsiguientemente cada 3 días hasta el día 21. En el día 21 los animales se sacrificaron y sus hígados se procesaron para el análisis histológico. Los ratones se separaron en 5 grupos de tratamiento. El grupo 1 se trató con placebo (glucosa); el grupo 2 (según la invención) con SP80-OA-CS-miRNA-20a; el grupo 3 con miRNA-20a libre, sin ningún vehículo específico; el grupo 4 con una nanopartícula SP80-OA-CS asociada a un miRControl (un miRNA que no ataca ninguna diana); el grupo 5 con nanopartículas SP80-OA-CS sin ningún miRNA. La evaluación macroscópica de los hígados confirmó el efecto terapéutico en términos de regulación clínica en los animales tratados con SP80-OA-CS-miRNA-20a (grupo 2).
Figure 3. Demostración del efecto terapéutico in vivo. Análisis histológico. Se tiñeron con hematoxilin-eosin secciones de los hígados evaluados en la figura 2, y se cuantificó bajo el microscopio el área ocupada por el tumor. Los distintos grupos se relacionaron con el grupo control (grupo 1 tratado con placebo) mediante el test-T. Las diferencias estadísticas significativas (p < 0,05) se marcan con *. También se comparó el grupo 2 (tratados con SP80- OA-CS-miRNA-20a) con el grupo 5 (tratados con SP80-OA-CS sin miRNA) y su diferencia estadística significativa (p < 0.05) indicada con +.
Figura 4. Gel de electroforesis que confirma la existencia de una asociación efectiva entre un miRNA o un plásmido (pEGFP), y las nanopartículas preparadas en el ejemplo 2. 1) banda correspondiente a pEGFP libre (200 μg/ml), 2) banda correspondiente a Nanopartículas asociadas con pEGFP 200 μg/ml, 3) banda correspondiente a miR-20a libre (5 μg/ml), 4) banda correspondiente Nanopartículas asociadas con miR-20a 50 μg/ml (según la invención, 5) banda de la mezcla de Nanopartículas y miR-20a 100 μg/ml (no asociados).
Figura 5: Imágenes de TEM de nanopartículas. 1) Nanopartículas SP-OA-CS en blanco, 2) Nanopartículas cargadas con pEGFP, 3) nanopartículas cargadas con miR-20a.
Figura 6: Capacidad de migración de LSEC (Ejemplo 3). * refleja la significación estadística, la diferencia entre LSEC sanas en comparación con LSEC de hígado colonizado por el tumor; y + indica la significación estadística de la diferencia entre LSCE de hígado colonizado por el tumor y LSCE de hígado colonizado por el tumor pero transfectado con miR-20a. En ambos casos se usó un umbral de p < 0,05.
Figura 7. Demostración del efecto terapéutico in vivo para la segunda prueba de concepto (Ejemplo 4). Análisis histológico. Se tiñeron con hematoxilin-eosin secciones de los hígados evaluados y se cuantifico bajo el microscopio el área ocupada por el tumor. Los distintos grupos se relacionaron con el grupo control (grupo 1 tratado con placebo) mediante el test-T. Las diferencias estadísticas significativas (p < 0,05) se marcan con *. También se comparó el grupo 2 (tratados con SP80-OA-CS-miRNA-20a) con el grupo 5 (tratados con SP80-OA-CS sin miRNA) y su diferencia estadística significativa (p < 0.05) indicada con +.
Figura 8: El análisis de transferencia de Western de ARHGAP1 y E2F1 valida el papel de miR- 20a en el patrón de expresión de dos de las dianas predichas. Se realizaron análisis en 5 condiciones diferentes: i) LSEC de hígados sanos, ii) LSEC de hígados colonizados por el tumor, iii) LSEC de hígados colonizados por el tumor y tratadas con el vehículo de transfección Mirus, iv) LSEC de hígados colonizados por el tumor y transfectados con miRNA no específico de control y v) LSEC de hígados colonizados por el tumor y transfectados con miR-20a.
DESCRIPCIÓN DETALLADA
Definiciones
Para la nomenclatura de las nanopartículas de la invención se utiliza la fórmula [éster de sorbitán]-[sustancia cargada positivamente]. Si la nanopartícula tiene otros componentes, por ejemplo, una sustancia cargada negativamente, se indica a continuación separado por un guión. En algunos caso se indica al final el nombre del miRNA utilizado. Además se utilizan las siguientes abreviaturas:
SP80: se entiende como Span-80®. El span-80® es una sustancia que resulta de esterificar el sorbitán con ácido c/s-9-octadecenoico (comúnmente conocido como ácido oleico):, es decir, una molécula con la siguiente fórmula: (CH,)5 CHj. CH - CHCHj(CH,}e.CH3
Figure imgf000007_0001
Span-80'
OA: oleilamina, es decir, (Z)-octadec-9-enilamina.
Ifato de condroitina. Su estructura y propiedades se explica abajo con mayor detalle.
HA: ácido hialurónico. Su estructura y propiedades se explica abajo con mayor detalle. Así, por ejemplo, una nanopartícula que se abrevia SP80-OA-HA-m¡R-20o, será una que incorpora Span-80®, oleilamina, ácido hialurónico y m¡R-20o, preparada de acuerdo con los procedimientos descritos aquí.
En el presente documento se ha seguido para los miRNAs su nomenclatura estándar. Se ha utilizado el prefijo "miR-" seguido por un guión y un número. De acuerdo con la nomenclatura estándar el prefijo "miR" con "R" mayúscula se reserva para los miRNAs maduros, mientras que el prefijo "mir-" con "r" minúscula suele reservarse para los pre-miRNAs, y el prefijo "M IR" para el gen que los codifica. Para los propósitos de la presente invención, el prefijo "miR-" los incluye todos, los miRNAs maduros, los pre-miRNAs y los genes que los codifican. Tras el número algunos miRNAs incorporan una letra que permite distinguir miRNAs con secuencias m uy similares.
Se entiende por "alquilo" una cadena hidrocarbonada lineal o ramificada que no contiene ninguna instauración, de 1 a 40 átomos de carbono a menos que se indique lo contrario, opcionalmente sustituidos con uno, dos o tres sustituyentes seleccionados entre -ORb, -SRb, - N RaRb, -C(0)Rb, -C02Rb, -C(0)N RaRb, -N RaC(0)Rb, NRaC(0)ORb, -N RaC(0)NRaRb, -CF3, -OCF3; donde Ra y Rb se seleccionan independientemente entre hidrógeno, alquilo C C6, alquenilo C2-C6 y alquinilo C2-C6.
Se entiende por "alquenilo" una cadena hidrocarbonada lineal o ramificada que contiene al menos un doble enlace, de 2 a 40 átomos de carbono a menos que se indique lo contrario, opcionalmente sustituidos con uno, dos o tres sustituyentes seleccionados entre -ORb, -SRb, - NRaRb, -C(0)Rb, -C02Rb, -C(0)N RaRb, -NRaC(0)Rb, -NRaC(0)ORb, -N RaC(0)N RaRb, -CF3, -OCF3; donde Ra y Rb se seleccionan independientemente entre hidrógeno, alquilo C C6, alquenilo C2-C6 y alquinilo C2-C6.
Se entiende por "alquinilo" una cadena hidrocarbonada lineal o ramificada que contiene al menos un triple enlace, de 2 a 40 átomos de carbono a menos que se indique lo contrario, opcionalmente sustituidos con uno, dos o tres sustituyentes seleccionados entre -ORb, -SRb, - NRaRb, -C(0)Rb, -C02Rb, -C(0)N RaRb, -NRaC(0)Rb, -NRaC(0)ORb, -N RaC(0)N RaRb, -CF3, -OCF3; donde Ra y Rb se seleccionan independientemente entre hidrógeno, alquilo C C6, alquenilo C2-C6 y alquinilo C2-C6.
Salvo que se indique lo contrario, los porcentajes en peso que se indican en el presente texto se calculan con referencia a la suma de todos los componentes añadidos a la mezcla en la formación de la nanopartícula, con excepción de los disolventes. Por ejemplo, para una nanopartícula SP80-OA-HA-miR-20o, el porcentaje en peso de SP80 serán los gramos de SP80 añadidos para la preparación de la nanopartícula, multiplicado por cien, y dividido entre la suma de gramos de SP80, OA, HA y m¡R-20o añadidos para la preparación de la nanopartícula. Cuando se utiliza la párticula "un" o "una" se debe entender como "al menos un(a)" o "un(a) o más". Por ejemplo, "un miRNA" indica que el número de miRNAs presentes es al menos 1, pero que pueden existir mezclas de 2 o más miRNAs.
Componentes de las nanopartículas de la invención
Las nanopartículas de la invención comprenden ásteres de sorbitán. El sorbitán está constituido por una mezcla de anhídridos cíclicos del sorbitol, como, por ejemplo, el 1,4- anhidrosorbitol, 1,5-anhidrosorbitol y 1,4,3,6-dianhidrosorbitol. Los ásteres de sorbitán se consideran tensioactivos no iónicos debido a que contienen dos regiones localizadas, una de naturaleza hidrófila y otra hidrófoba.
Se entiende por "ásteres de sorbitán" los derivados esterificados del sorbitán donde los grupos éster poseen un sustituyente seleccionado de entre alquilo, alquenilo y alquinilo. Los ásteres de sorbitán incluyen derivados en los que uno, dos, tres o cuatro grupos hidroxilo están esterificados, e incluso incluyen derivados esterificados en los que una molécula de éster está presente por cada dos moléculas de sorbitán (en cuyo caso se nombran con el prefijo "sesqui- "). Así, por ejemplo, el monooleato de sorbitán es el éster de sorbitán resultado de la esterificación de un grupo hidroxilo con el ácido oleico; el trioleato de sorbitán es el éster de sorbitán resultante de la esterificación de tres grupos hidroxilo del sorbitán con el ácido oleico. Existen muchos tipos distintos de ésteres de sorbitán atendiendo al número de hidroxilos esterificados, la estructura del éster, la mezcla de anhidrosorbitol, y otros factores. El experto en la materia puede elegir entre distintos tipos dentro del ámbito de la invención y no está limitado a un tipo específico.
Ésteres de sorbitán comúnmente utilizados son, por ejemplo, los comercializados con el nombre Span® (sin bloques de polioxietileno) o Tween® (con bloques de polioxietileno). Por mencionar algunos ejemplos, ésteres de sorbitán de la familia Span® comunes pueden ser el Span-80® (monooleato de sorbitán), el Span-20® (monolaurato de sorbitán), el Span-40® (monopalmitato de sorbitán), el Span-65 (triestearato de sorbitán), o el Span-85® (trioleato de sorbitán). Ésteres de sorbitán de la familias Tween® comunes son el Tween® 20 (Polioxietilensorbitan monolaurato), Tween® 40 (Polioxietilensorbitan monopalmitato), Tween® 60 (Polioxietilensorbitan monoestearato) o Tween® 80 (Polioxietilensorbitan monooleato).
La formación de las nanopartículas de la invención puede comprender mezclas de dos o más ásteres de sorbitán diferentes. Por ejemplo, una mezcla de un éster de sorbitán sin bloques de polioxietileno con otro éster de sorbitán con bloques de polioxietileno. En la preparación de las nanopartículas de la invención el experto en la materia puede elegir pues diversos ásteres de sorbitán para combinar con la sustancia cargada positivamente, y a modo de ejemplo, se puede seleccionar del grupo que comprende monooleato de sorbitán, dioleato de sorbitán, trioleato de sorbitán, sesqui-oleato de sorbitán, monolaurato de sorbitán, dilaurato de sorbitán, trilaurato de sorbitán, sesqui-laurato de sorbitán, monoestearato de sorbitán, diestearato de sorbitán, triestearato de sorbitán, sesqui-estearato de sorbitán, monopalmitato de sorbitán, dipalmitato de sorbitán, tripalmitato de sorbitán, sesqui-palmitato de sorbitán y combinaciones de los mismos.
Teniendo en cuenta que dichos ásteres de sorbitán opcionalmente comprenden bloques de polioxietileno, el éster de sorbitán utilizado en las nanopartículas de la invención puede ser un compuesto de fórmula I
Figure imgf000010_0001
Fórmula I
donde
cada uno de 5, R6, R7 y R8 se selecciona independientemente del grupo que consiste en -H, -(C=0)-alquilo Ci-C40, -(C=0)-alquenilo C2-C40, -(C=0)-alquinilo C2-C40, con la condición de que al menos uno de R5, R6, R7 y R8 no es -H; y
cada uno de a, b, c y d es independientemente un número entre 0 y 100. Aquellos más habituales son los comercialmente disponibles y suelen corresponder a un alquilo lineal que comprende entre 2 y 20 átomos de carbono, por ejemplo, uno con 9, 11, 13, 15 o 17 átomos de carbono, o a un grupo alquenilo lineal que comprende entre 4 y 25 átomos de carbono. Así, un ejemplo puede ser un grupo alquenilo de fórmula -(CH2)n-CH=CH-(CH2)m- CH3, en donde n es un número entero comprendido entre 1 y 10, y m es un número entero comprendido entre 1 y 10. Uno habitualmente utilizado aquél en el que n es 7 y m es 7, correspondiente al ácido oleico. Como se puede ver, los bloques de polioxietileno son opcionales, y cada uno de a, b, c y d pueden ser 0. En el caso de incluir dichos bloques de polioxietileno, la suma de a, b, c y d puede ser, por ejemplo, de entre 10 y 50 o de entre 10 y 30 o de entre 15 y 30. Por ejemplo, en el caso del Tween® 80 (Polioxietilensorbitan monooleato) a, b, c y d suman 20.
De acuerdo con una realización preferida, 6, R7 y R8 son -H. Es decir, se trata de un monoéster de sorbitán, por ejemplo, uno que se selecciona del grupo que consiste en monooleato de sorbitán, monolaurato de sorbitán, monoestearato de sorbitán, monopalmitato de sorbitán, y combinaciones de los mismos. Este grupo de monoésteres de sorbitán puede representarse mediante la fórmula II
Figure imgf000011_0001
Fórmula II
en donde
R5 se selecciona del grupo que consiste en -(C=0)-alquilo C Qo y -(C=0)-alquenilo C2- c40; y
b es un número entre 0 y 100, preferiblemente 0.
De nuevo, se prefiere uno en donde R5 es un alquenilo de la fórmula -(CH2)n-CH=CH-(CH2)m- CH3, en donde n es un número entero comprendido entre 1 y 10, y m es un número entero comprendido entre 1 y 10.
La proporción de ásteres de sorbitán en las nanopartículas se sitúa entre el 60% y el 99% en peso con respecto al peso total de la nanopartícula. Proporciones típicas en las que se encuentran los ásteres de sorbitán son entre el 80% y el 98% en peso con respecto al peso total de la nanopartícula, por ejemplo, entre el 85% y el 95%. La proporción de los ásteres de sorbitán suele ser mayor del 87% en peso con respecto al peso total de la nanopartícula.
Otro componente esencial de la invención es la inclusión de una sustancia cargada positivamente. En el contexto de la presente invención, se entiende por "sustancia cargada positivamente" aquella molécula dotada de carga eléctrica positiva. En el campo de la presente invención se utilizan estas sustancias para modular las propiedades de las partículas formadas, y el experto en la materia tiene a su disposición una amplia variedad de las mismas. Estas sustancias se discuten ampliamente en numerosos libros de referencia, por ejemplo, en "Dekker Encyclopedia of Nanoscience and Nanotechnology, Volumen 4", James A. Schwarz, Cristian I. Contescu, Karol Putyera, Editor: Marcel Dekker, 2004, o en "Encyclopedia of Polymer Science and Technology, Concise", Hermán F. Mark, tercera edición, Editor: Wiley, 2007. Ejemplos no-limitativos son las sales de amonio, polímeros catiónicos y las aminas grasas o lipofílicas.
El polímero catiónico puede seleccionarse del grupo que consiste en protamina, poliglutámico, dextrano cationizado, Pululano cationizado, poliaminoácidos, proteínas cationizadas, y sus sales. Los poliaminoácidos son otra familia de sustancias cargadas positivamente que se pueden utilizar en las nanopartículas de la invención y que pueden seleccionarse del grupo que consiste en polilisina y poliarginina. Las proteínas cationizadas pueden seleccionarse del grupo que consiste en gelatina, albúmina, colágeno, atelocolágeno, y sus derivados cationizados.
Las sales de amonio pueden ser sustancias que comprenden un grupo amonio o amina unido a uno, dos o tres restos que se seleccionan independientemente del grupo que consiste en alquilo C Qo, alquenilo C2-C40, alq uinilo C2-C40, por ejemplo, seleccionadas del grupo que consiste en bromuro de cetil trimetil amonio (CTAB) y cloruro de benzalconio (BZC). La amina grasa puede ser oleilamina. Sustancias cargadas positivamente adecuadas para la presente invención pueden ser las sales de amonio o las aminas grasas, por ejemplo CTAB, BZC, oleilamina o mezclas de las mismas. Así, dicha sustancia cargada positivamente puede tener la fórmula ( 10)p (R )(R12)NR9, en donde
cada uno de R10, Ru y R12 se selecciona independientemente del grupo que consiste en -H, alquilo C1-C4, alquenilo C2-C4, alquinilo C2-C4, y fenilalq UNO L7-L 5;
R9 se selecciona del grupo que consiste en alquilo Ci-C40, alquenilo C2-C40, alquinilo C2- c4o; p es 0 o 1;
y en donde también comprende un contraanión en el caso en el que p es 1. Cuál es el contraanión no es crítico y puede ser, por ejemplo, un halogenuro (F, CI", Br" o Γ).
La sustancia cargada negativamente se puede añadir en proporciones que van desde el 1% hasta el 39% en peso con respecto al peso total de las nanopartículas. Cantidades preferidas oscilan entre el 2% y 20%, típicamente entre el 3% y el 12% o entre el 2% y 9% o entre el 3% y el 8%, en peso con respecto al peso total de la nanopartícula.
Un componente opcional de las nanopartículas de la invención es una sustancia cargada negativamente. Estas sustancias son conocidas por el experto en la materia y en el caso de la presente invención se prefieren aquellas capaces de formar una capa de recubrimiento en la nanopartícula. La familia de sustancias cargadas negativamente puede ser de acuerdo con la presente invención un polímero aniónico, entendiendo polímero aniónico un polímero con una carga negativa.
Los investigadores han comprobado que la incorporación de una o más sustancias cargadas negativamente proporcionan ventajas sorprendentes. En contra de lo que cabría esperar de un sistema con una carga superficial negativa, soportan los ataques del RES (no se observó fagocitación por las células de Kupffer) y las nanopartículas mejoran la capacidad de transfección del miRNA transportado. Esto es contrario a las observaciones descritas en la literatura en la que se establece una correlación positiva entre la carga negativa y una mayor fagocitación por las células de Kupffer.
Los polímeros aniónicos son preferiblemente polisacáridos. Existe una gran variedad de estos polisacáridos a disposición del experto en la materia, y que se utilizan frecuentemente en este campo. Una variedad preferida son aquellos que contienen un grupo carboxilo (-COOH) o sulfato (-SO3H) en el monómero que se repite. Se han mostrado especialmente adecuados para la presente invención aquellos polisacáridos que tienen al menos un ácido glucurónico en la estructura que se repite. Por ejemplo, dicha sustancia cargada negativamente puede comprender un polisacárido cuya unidad repetitiva tiene la fórmula [X-Y-(Z)n] en donde n es 0 o 1; X, Y y Z se seleccionan cada uno independientemente del grupo que consiste en monosacáridos, disacáridos y polisacáridos; con la condición de que al menos uno de X, Y y Z comprende un azúcar ácido y en donde los grupos X, Y y Z se unen entre sí a través de enlaces -O-glucosídicos. De acuerdo con una realización de la invención, dicho azúcar ácido se selecciona del grupo formado por los ácidos aldónicos, ácidos ulosónicos, ácidos urónicos, ácidos aldáricos y mezclas de los mismos. Por ejemplo, Y puede comprender un azúcar ácido, por ejemplo, un ácido uronico. Un ejemplo no limitativo de dicho ácido uránico puede ser uno de la fórmula III
Figure imgf000014_0001
Fórmula III
en donde
cada uno de 1, R2 y R3 se selecciona independientemente del grupo que consiste en - H, -OH, -O-, -OR4, N(H)-R4 y -0-S03, con la condición de que al menos uno de R1, R2 y R3 sea -O-,
en donde los -O- forman los enlaces glucosídicos, y
en donde R4 se selecciona del grupo que consiste en alquilo Ci-C4, alquenilo C2-C4, alquinilo C2-C4, -(C=0)-alquilo C Q, -(C=0)-alquenilo C2-C4, -(C=0)-alquinilo C2-C4. Ejemplos no limitativos de sustancias cargadas negativamente que tienen esta fórmula se seleccionan del grupo que consiste en ácido hialuronico, sulfato de condroitina y goma xantana.
Las sustancias cargadas negativamente que pueden incorporarse a las nanopartículas de la presente invención también pueden ser aquellas que se seleccionan del grupo que consiste en ácido hialuronico, ácido colomínico, polisiálico, condroitina, queratano, dextranos, heparina, carragenanos, furceleranos, alginatos, agar agar, glucomanano, goma gelano, goma garrofín, goma guar, goma tragacanto, goma arábiga, goma xantano, goma karaya, pectinas, celulosas, almidones, sus sales, fragmentos, derivados y mezclas de los mismos.
El hialuronano es un polímero lineal que comprende la repetición de una estructura de disacárido formada por la adición alterna de ácido D-glucurónico y D-N-acetilglucosamina, unidos alternando enlaces beta-1,4 y beta-1,3 glucosídicos. En el contexto de la presente invención, se puede emplear ácido hialuronico con un amplio intervalo de pesos moleculares. El ácido hialuronico de elevado peso molecular es comercialmente disponible, mientras que el de peso molecular inferior puede obtenerse mediante la fragmentación del ácido hialuronico de elevado peso molecular, utilizando, por ejemplo, una enzima hialuronidasa. El término "hialurónico, ácido hialurónico, hialuronano" tal como se utiliza en la presente descripción incluye o bien el ácido hialurónico o bien una base conjugada del mismo (hialuronato). Esta base conjugada puede ser una sal alcalina del ácido hialurónico que incluyen sales inorgánicas tales como, por ejemplo, sales de sodio, potasio, calcio, amonio, magnesio, aluminio y litio, sales orgánicas tales como sales de aminoácidos básicos a pH neutro, preferiblemente dichas sales son farmacéuticamente aceptables. En una realización preferida de la invención, la sal alcalina es la sal de sodio del ácido hialurónico.
La familia de los ácidos polisiálicos, término que incluye al ácido colomínico, se encuentra integrada por polímeros lineales constituidos por residuos de ácido N-acetilneuraminico (Neu5Ac; también conocido como ácido siálico), un constituyente natural de células y tejidos, unidos por enlaces glicosídicos ct-(2->8). Cada residuo de ácido N-acetilneuraminico posee un grupo carboxilo, responsable de la carga negativa del ácido colomínico. Se trata de un material biocompatible y biodegradable, no inmunogénico, cuyos productos de degradación no son tóxicos (Gregoriadis G et al. Cell. Mol. Life Sci. 2000, 57, 1964-1969).
El sulfato de dextrano es un glucano (polisacárido) complejo constituido por unidades de moléculas de glucosa, cada una de las cuales contiene aproximadamente dos grupos sulfato. El sulfato de dextrano se prepara mediante sulfatación de dextrano y posterior purificación mediante procedimientos de sobra conocidos por un experto en la materia.
La heparina es una sustancia de origen natural de la familia de los glicosaminoglicanos cuya estructura química comprende la repetición de unidades monoméricas disacáridas de ácido 2- O sulfo-L-idurónico y 2-deoxi-2-sulfamido--D-glucopiranosil-6-0-sulfato. En el contexto de la presente invención, es posible emplear tanto la heparina fraccionada como la no fraccionada. La heparina tradicional o no fraccionada se distingue claramente de la heparina fraccionada o de bajo peso molecular. La primera de ellas es una sustancia natural presente en todos los vertebrados. Ambos tipos de heparina se pueden utilizar en forma de base libre o en forma de sal, como por ejemplo su sal sódica o cálcica. La heparina fraccionada o de bajo peso molecular se produce por despolimerización química o enzimática de heparinas convencionales. Ejemplos de este tipo de heparinas son enoxaparina, parnaparina, dalteparina y nadroparina, así como sus sales tales como las sales de sodio y calcio. Los derivados de heparina también pueden ser empleados en la composición de los sistema nanoparticulares de la presente invención. Estos derivados son conocidos en el estado de la técnica y se originan como consecuencia de la reactividad de los diferentes grupos funcionales presentes en la molécula. Así, heparinas N-acetiladas, O-descarboxiladas, oxidadas o reducidas son ampliamente conocidas.
El sulfato de condroitina es un glucosaminoglucano (GAG) sulfatado compuesto por una cadena de azúcares alternados. Se encuentra normalmente unido a proteínas como parte de un proteoglucano. En el contexto de la presente invención, el término "sulfato de condroitina" incluye todos sus diferentes isómeros y derivados, así como combinaciones de los mismos. Por ejemplo, se selecciona entre las siguientes sustancias y combinaciones de las mismas, resumidas en la fórmula IV
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IV
- sulfato de condroitina A que está sulfatado predominantemente en el carbono 4 del azúcar N-acetilgalactosamina (GalNAc) y que también se conoce como sulfato de 4- condroitina ( 13=H, R14=S03H y R15=H)
- sulfato de condroitina B que se denomina también sulfato de dermatano. Esta sustancia está compuesta por unidades de repetición lineales que contienen N- acetilgalactosamina y o bien ácido L-idurónico o bien ácido glucurónico, y cada disacárido puede estar sulfatado una vez o sulfatado dos veces. Está presente mayoritariamente en la piel, pero también se encuentra en vasos sanguíneos, válvulas cardíacas, tendones y pulmones.
- sulfato de condroitina C que está sulfatado predominantemente en el carbono 6 del azúcar GalNAc y que se conoce también como sulfato de 6-condroitina (R13=S03H, 14=H y R15=H);
- sulfato de condroitina D que está sulfatado predominantemente en el carbono 2 del ácido glucurónico y en el carbono 6 del azúcar GalNAc y se conoce también como sulfato de 2,6condroitina (R13=S03H, R14=H y R15= S03H); - sulfato de condroitina E que está sulfatado predominantemente en los carbonos 4 y 6 del azúcar GalNAc y se conoce también como sulfato de 2,6-condroitina ( 13=S03H, R14= S03H y R15=H); y
en donde "e" representa el número de repeticiones del monómero, es decir, su grado de polimerización.
El término "sulfato de condroitina" también incluye sales orgánicas e inorgánicas del mismo. Generalmente, tales sales se preparan, por ejemplo, mediante reacción de la forma básica de este compuesto con una cantidad estequiométrica del ácido apropiado en agua o en un disolvente orgánico o en una mezcla de los dos. Generalmente, se prefieren medios no acuosos tales como éter, acetato de etilo, etanol, isopropanol o acetonitrilo. Ejemplos de sales inorgánicas incluyen, sales de sodio, potasio, calcio, amonio, magnesio, aluminio y litio, y las sales orgánicas incluyen, por ejemplo, sales de etilendiamina, etanolamina, Ν,Ν-dialquileno- etanolamina, trietanolamina, glucamina y aminoácidos básicos. Preferiblemente las sales son farmacéuticamente aceptables.
El sulfato de queratano es un glucosaminoglicano sulfatado similar al sulfato de condroitina en el que el grupo sulfato se encuentra en el glucurónico. Concretamente, se encuentra constituido por galactosa y GlcNAc-6-sulfato, unidos mediante un enlace β-1,4.
La carragenina o carragenano está formada por unidades de galactosa y/o de anhidrogalactosa, sulfatadas o no, unidas por enlaces alternos -1,3 y -1,4. Dependiendo del grado de sulfatación, de las posiciones de los grupos sulfato y de la presencia de grupos de anhidrogalactosa se distinguen varios tipos de carragenano, todos incluidos en el ámbito de la presente invención.
El glucomanano es un polisacárido soluble en agua de origen natural. La estructura química de este compuesto consiste en una cadena polimérica lineal con una pequeña proporción de ramificaciones. En concreto, está formado por unidades de D-manosa y D-glucosa unidas por enlaces -1,4 en una proporción de 1.6:1, respectivamente. En una realización particular de la invención, el glucomanano empleado es un derivado de glucomanano con carga negativa seleccionado entre los derivados fosforilados, carboximetil y dicarboxi-glucomananos.
La goma gelano es un polisacárido soluble en agua de origen natural. La estructura química de este compuesto consiste en una cadena polimérica formada por unidades de α-L-ramnosio, β- Dácido glucurónico y dos unidades de β-D-glucosa. El polímero puede encontrarse en forma parcialmente acetilada. Dependiendo de su grado de acetilación, la goma gelano proporciona geles con propiedades mecánicas distintas. En el contexto de la presente invención, el término "goma gelano" incluye todos sus diferentes derivados, así como combinaciones de los mismos. Sin querer estar limitado por la teoría, pensamos que las nanopartículas de la invención son estructuras sólidas homogéneas en las que los miRNAs son adsorbidos. Esto es contrario a los sistemas utilizados para transportas miRNAs que se han venido utilizando hasta ahora. Como ya se ha mencionado arriba, los que se están utilizando ahora para la realización de ensayos clínicos de miRNAs utilizan liposomas o vesículas, es decir, estructuras de bicapa lipídica que encierran en su interior una fase acuosa. Los miRNAs quedan unidos a la estructura sólida que forman los ésteres de sorbitol y la sustancia cargada positivamente.
El tamaño medio de las nanopartículas de la invención es de entre 1 y 999 nanómetros. Y pueden tener un potencial negativo o positivo, dependiendo de los componentes añadidos, por ejemplo, si comprenden o no una sustancia cargada negativamente, o de la concentración del o de los miRNA(s) añadido(s). De acuerdo con una realización preferida, la nanopartícula de la invención tienen un potencial positivo comprendido entre +1 y +100 mV. De acuerdo con otra realización preferida, la nanopartícula de la invención tienen un potencial negativo comprendido entre -25 y -40 mV.
Las nanopartículas de la invención pueden incluir otras sustancias auxiliares, por ejemplo, un derivado de óxido de etileno, un compuesto en el que se repite una unidad -CH2CH20-. Dicho derivado de óxido de etileno puede ser un compuesto de fórmula R160[CH2-CH2-0]f- C(H)(R17)(R18), en donde R17 es un grupo carbonilo o hidrógeno; R18 es un grupo alquilo, alquenilo o alquinilo, de entre 2 a 24 átomos de carbono; R16 es hidrógeno o un grupo alquilo de entre 1 a 6 átomos de carbono; f es un valor de entre 1 y 100, por ejemplo, entre 1 y 50, o entre 1 y 24. Ejemplos de derivados de óxido de etileno, sin limitarse a éstos, son polietilenglicol dodecil éter (Brij 30), polietilenglicol hexadecil éter (Brij 56), polietilenglicol 2- octadecil éter (Brij 72), polietilenglicol 8-octadecil éter (Brij 78), polietilenglicol 8-estearato (Myrj 45), 2-hidroxietil octadecanoato (Myrj 52), monoestearato de etilen glicol.
Los derivados de óxido de etileno se pueden incorporar en proporciones que varían entre el 0,1% y el 20% en peso con respecto al peso total de la nanopartícula. Dependiendo de las aplicaciones, las proporciones pueden variar y ser de, por ejemplo, entre el 0,1% y el 15% o entre el 5% y el 15% o entre el 7 y el 13% en peso, con respecto al peso total de la nanopartícula. Aplicaciones y miRNAs
El otro componente esencial de las nanopartículas de la invención es un miRNA o una mezcla de miRNAs, los cuales se suelen encontrar en proporciones por debajo del 25% en peso con respecto al peso total de la nanopartícula. La proporción en la que se encuentran en cada caso puede ajustarse y puede ser, por ejemplo de entre 0,01 y 10% o entre 0,2% y 3% en peso con respecto al peso total de la nanopartícula. Los miRNAs que se utilizan en las nanopartículas de la invención son moléculas de RNA que típicamente comprenden entre 5 y 30 bases o entre 15 y 25 bases.
Los miRNAs tienen múltiples aplicaciones, y por tanto también las nanopartículas de la invención, por ejemplo, en el campo farmacéutico, cosmético o de la nutrición. Así, por ejemplo, se estudia en la actualidad la aplicación terapéutica de diversos miRNAs en campos como el cáncer (miRNA-20a, miR-29, miR-652 miR-34a, miR-16), la diabetes o las enfermedades neurodegenerativas. Uno de los campos en los que más se ha desarrollado el uso de los miRNAs es el del cáncer. Por tanto, una realización preferida son las nanopartículas de la invención para su uso en el tratamiento de un cáncer que se selecciona del grupo que consiste en colorectal, mesotelioma pleural maligno, de hígado, páncreas, colon y las metástasis hepática y de pulmón.
Por otro lado, se han identificado las proteínas ARHGAPl y E2F1 como dianas del miR-20a, y constituye pues otro aspecto de la invención el uso de las nanopartículas de la invención para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad mediada por ARHGAPl y/o E2F1. La sobreexpresión de E2F1 está realcionada con glioblastoma, cáncer de páncreas melanoma y cáncer de testículos y la de ARHGAP con el cánce de mama. Por tanto, las partículas de la invención también son útiles para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una condición que se selecciona del grupo que consiste en glioblastoma, cáncer de páncreas, melanoma, cáncer de testículos y cáncer de mama.
El término "tratamiento" o "tratar" en el presente documento significa administrar las nanopartículas de la invención para prevenir, reducir o eliminar uno o más de los síntomas o causas o efectos (metástasis) de una enfermedad o condición. También abarca la prevención, reducción o eliminación de las secuelas de dicha enfermedad o condición, o de los efectos secundarios o adversos provocados por otra medicación utilizada. También abarca la administración para mantener la salud en sujetos en riesgo de padecer dicha enfermedad. El término "reducir" se entiende como cualquier mejora en la situación del paciente, bien medido por parámetros subjetivos (por ejemplo, percepción del paciente) u objetivos (medición de parámetros fisiológicos, bioquímicos, histopatológicos, microbiológicos- analíticos).
Por ejemplo, las nanopartículas de la invención para su uso en el tratamiento de la metástasis de hígado es una realización de la invención, y se ha podido comprobar que permiten reducir o eliminar la metástasis y los efectos dicha metátesis de hígado que acompaña muchas veces al cáncer colorectal, lo cual también constituye una realización de la invención. En una realización las nanopartículas de la invención comprenden m¡ -20a, miR-29, miR-652 o mezclas de las mismas, preferiblemente m¡RNA-20a, para su uso en el tratamiento del cáncer colorectal y/o su metástasis de hígado asociado.
Otro aspecto de la invención es un método para el tratamiento de un individuo en necesidad de tratamiento que comprende la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de nanopartículas de la invención. En el sentido utilizado en esta descripción "cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a la cantidad de principio activo calculada para producir el efecto deseado y estará determinada generalmente, entre otros motivos, por las propias características del principio activo utilizado y el efecto terapéutico que va a obtenerse. En una realización particular, la dosis de principio activo administrada a un sujeto para el tratamiento o la profilaxis de los estados mencionados anteriormente está en el intervalo de 10"10 a 1010 mg/kg de peso corporal, normalmente entre 10"3 y 103 mg/kg o entre 10"2 y 50 mg/Kg de peso corporal.
Por tanto, las nanopartículas de la invención pueden formar composiciones farmacéuticas junto con un excipiente farmacéuticamente aceptable. De hecho, se prefiere que todos los componentes sean farmacéuticamente aceptables. El término "farmacéuticamente aceptable" se refiere a entidades moleculares y composiciones que son fisiológicamente tolerables y no producen normalmente una reacción no deseada alérgica o similar, tal como molestias gástricas, mareos y similares, cuando se administra a un ser humano. Preferiblemente, tal como se utiliza en el presente documento, el término "farmacéuticamente aceptable" significa aprobado por una agencia reguladora del gobierno federal o de un estado o enumerado en la Farmacopea de los EE.UU. u otra farmacopea reconocida generalmente para su uso en animales y más particularmente en seres humanos.
El término "excipiente" se refiere a un diluyente, adyuvante, o vehículo con el que se administran las nanopartículas de la invención. Son sustancias que, por ejemplo, se añaden a los principios activos o a sus asociaciones para servirles de vehículo, posibilitar su preparación y estabilidad, modificar sus propiedades organolépticas o determinar las propiedades fisicoquímicas del medicamento y su biodisponibilidad. Tales vehículos farmacéuticos pueden ser líquidos estériles, tales como agua o aceites, incluyendo los de origen petrolífero, animal, vegetal o sintético, tales como aceite de cacahuete aceite de soja, aceite mineral, aceite de sésamo y similares. Se emplean preferiblemente agua o soluciones salinas de disolución acuosa y disoluciones acuosas de dextrosa y glicerol como vehículos, o de glucosa y glicerol, particularmente para disoluciones inyectables. Se describen vehículos farmacéuticos adecuados en " emington's Pharmaceutical Sciences" por E.W. Martin.
La composición farmacéutica o medicamento puede hallarse en cualquier forma adecuada para su administración a humanos y/o animales, preferentemente humanos, incluyendo bebés, niños y adultos y puede prepararse por procedimientos estándar conocidos por los expertos en la materia. El medicamento puede prepararse por procedimientos estándar conocidos por los expertos en la materia, por ejemplo, reflejado en "Pharmaceutics: The Science of Dosage Forms, segunda edición, Aulton, M.E. (ed.) Churchill Livingstone, Edinburgo (2002); "Encyclopedia of Pharmaceutical Technology", segunda edición, Swarbrick, J. y Boylan J.C. (eds.), Marcel Dekker, Inc. Nueva York (2002); "Modern Pharmaceutics", cuarta edición, Banker G.S. y Rhodes C.T. (eds.) Marcel Dekker, Inc. Nueva York 2002 y "The Theory and Practice of Industrial Pharmacy", Lachman L, Lieberman H. y Kanig J. (eds.), Lea & Febiger, Filadelfia (1986). Las descripciones respectivas se hallan incorporadas en este documento por referencia y forman parte de la descripción. La composición del medicamento puede variar dependiendo de la vía de administración. Ejemplos ilustrativos no limitantes de dichas formas farmacéuticas de administración de la composición farmacéutica de la invención incluyen formulaciones orales o bucales (líquidas, disolución, suspensión, emulsión, gel, pasta, polvo, liofilizado oral, comprimidos, cápsulas, pildoras, emulsiones); formulaciones sublinguales; formulaciones oftálmicas; formulaciones para el oído (óticas); formulaciones tópicas; formulaciones nasales; formulaciones rectales; formulaciones vaginales; formulaciones intrauterinas; formulaciones para inhalación o pulmonares; formulaciones parenterales, por ejemplo, formulación inyectables, por ejemplo, para inyecciones intravenosas o para inyecciones subcutáneas. Procedimiento de preparación
Otra de las ventajas de la presente invención es la facilidad con la que se preparan las nanopartículas, procedimiento que no requiere inyección u homogeneización. En términos generales el procedimiento comprende (i) la etapa de añadir una solución orgánica que comprende un disolvente orgánico y un éster de sorbitán sobre una solución acuosa; (ii) la etapa de evaporar el disolvente, es decir, el disolvente orgánico,y el agua; y (iii) una etapa opcional de incubación. La sustancia cargada positivamente puede incorporarse a la solución orgánica o a la solución acuosa. Por otro lado, el mi NA (o los miRNAs) se incorpora(n), bien durante la etapa (i) como parte de la solución acuosa, bien en la etapa de incubación (iii), o bien en ambas etapas (i) y (iii). En caso de que no se incorpore ningún miRNa durante la etapa (i), es necesario proceder a la incubación (etapa (iii)) para incorporar el miRNAs (o los miRNAs). Así, una alternativa es un procedimiento que comprende (i) la etapa de añadir una solución que comprende un disolvente orgánico, un éster de sorbitán y una sustancia cargada positivamente sobre una solución acuosa que comprende un miRNA; y (ii) la etapa de evaporar el disolvente, es decir, el disolvente orgánico, y el agua. Otra alternativa comprende (i) la etapa de añadir una solución que comprende un disolvente orgánico, un éster de sorbitán y una sustancia cargada positivamente sobre una solución acuosa; (ii) la etapa de evaporar el disolvente, es decir, el disolvente orgánico, y el agua; y (iii) la etapa de incubar la nanopartícula resultante de la etapa (ii) en presencia de un miRNA. Procedimientos adecuados se describen, por ejemplo, en WO2013/068625.
A continuación se hace una descripción detallada que se complementará con los ejemplos. La adición de la fase orgánica se realiza preferiblemente bajo agitación de la fase acuosa. Los componentes que adicionalmente puede comprender el sistema, como por ejemplo una sustancia cargada negativamente, pueden añadirse a la fase orgánica o a la fase acuosa, dependiendo de las características de la sustancia que se incorpore al sistema. Así, en una realización particular, la disolución acuosa además comprende una sustancia cargada negativamente.
Alternativamente, los componentes adicionales pueden incorporarse en una etapa posterior, por ejemplo, la etapa (iii) de incubación de la dispersión de nanopartículas formadas con una disolución que comprende alguna de estas sustancias.
Alternativamente, es posible obtener nanopartículas pegiladas o modificadas con derivados de óxido de etileno. Estas nanopartículas pegiladas o modificadas con derivados de óxido de etileno se pueden preparar en una única etapa y además tiene la ventaja de que no es necesario ninguna reacción química a fin de anclar las cadenas de óxido de etileno a la superficie de las nanopartículas. Así, en otra realización particular la fase orgánica comprende además un derivado de óxido de etileno, por ejemplo, uno de fórmula 160[CH2-CH2-0]f- C(H)(R17)(R18) como los descritos más arriba.
Para la preparación de las nanopartículas de la invención normalmente es preferible que el disolvente de la fase orgánica sea un solvente hidromiscible, por ejemplo, un alcohol alifático, tal como el etanol, fácil de evaporar, más inocuo y estable frente a los componentes de las nanopartículas.
Las concentraciones de los diferentes componentes no es crítica. Por ejemplo, el éster de sorbitán se disuelve en la fase orgánica en una concentración que puede ser de entre 0,1 y 10 mg/ml, o entre 2 y 7 mg/ml. Por otro lado, las sustancia cargada positivamente puede estar en una concentración de entre 0,01 y 5,0 mg/mL, por ejemplo, entre 0,1 y 2,0 mg/mL preferiblemente entre 0,2 y 0,5 mg/mL. La sustancia cargada negativamente puede estar en una concentración de entre 0,01 y 5,0 mg/mL, por ejemplo, entre 0,05 y 2,0 mg/mL preferiblemente entre 0,1 y 0,3 mg/mL.
La mezcla de las fases acuosas y orgánica puede hacerse a temperatura ambiente o bien calentando una o ambas fases.
Se ha comprobado que las nanopartículas de la invención aguantan sin degradación la liofilización y otros procesos de deshidratación. Por tanto, el procedimiento puede comprender una etapa adicional de deshidratación total o parcial (liofilización o desecación, respectivamente). De este modo es posible preservarlas durante su almacenamiento para que conserven sus características iniciales y se reduzcan los volúmenes de producto que van a manipularse. El proceso de liofilización o desecación conduce, respectivamente, a un producto deshidratado total o parcialmente. En caso deshidratación, el procedimiento comprende una etapa adicional en la que se regeneran las nanopartículas deshidratadas parcialmente o liofilizadas. De este modo es posible deshidratar las nanopartículas para obtener un producto más estable durante el almacenamiento y posteriormente regenerar o recuperar las nanopartículas mediante un proceso de re-suspensión en un medio acuoso.
De este modo, un último aspecto de la invención se dirige a nanopartículas obtenibles como se describió anteriormente. Los componentes descritos arriba se pueden combinar para que en cada caso la nanopartícula de la invención que resulta se adapte a la situación concreta, y la presente invención abarca distintas combinaciones de ásteres de sorbitán, sustancias cargadas positivamente, mi NAs, así como sustancias cargadas negativamente y otros componentes opcionales en caso de ser usados. Por ejemplo, una realización de la presente invención es una nanopartícula que comprende (i) uno o más miRNAs (por ejemplo, m¡R-20a, miR-29, miR-652 o mezclas de los mismos); (ii) un éster de sorbitán de fórmula I, tal y como se ha definido anteriormente; (iii) una sustancia cargada positivamente de fórmula (R10)p (RU)(R12)NR9, tal y como se ha descrito más arriba; y (iv) un polisacárido cargado negativamente. En otra realización, la presente invención comprende (i) uno o más miRNAs (por ejemplo, m¡R-20a, miR-29, miR-652 o mezclas de los mismos, o también miR-93 o mezclas de este con uno o más de los anteriores); (ii) un éster de sorbitán de fórmula I, tal y como se ha definido anteriormente; (iii) una sustancia cargada positivamente que se selecciona del grupo que consiste en CTAB, BZC, oleilamina y mezclas de las mismas; y (iv) un polisacárido cargado negativamente. Otra realización de la presente invención es una nanopartícula que comprende (i) uno o más miRNAs; (ii) un éster de sorbitán de fórmula I, tal y como se ha definido anteriormente; (iii) una sustancia cargada positivamente de fórmula (R10)p (R11)(R12)NR9, tal y como se ha descrito más arriba; y (iv) un polisacárido cargado negativamente en donde al menos uno de sus monómeros comprende un grupo -COOH 0 -SO3H.
Otra realización de la presente invención es una nanopartícula que comprende (i) uno o más miRNAs; (ii) un éster de sorbitán; (iii) una sustancia cargada positivamente; y (iv) un polisacárido cargado positivamente en donde al menos uno de sus monómeros comprende un grupo -COOH o -S03H. Otra realización de la presente invención es una nanopartícula que comprende (i) uno o más miRNAs; (ii) un éster de sorbitán de fórmula I, tal y como se ha definido anteriormente; (iii) una sustancia cargada positivamente de fórmula (R10)p (RU)(R12)NR9, tal y como se ha descrito más arriba; y (iv) un polisacárido cargado negativamente. Las anteriores combinaciones y otras que no se describen explícitamente forman también parte del ámbito de protección.
Hay que tener en cuenta que, además del miRNA, las nanopartículas de la invención pueden comprender otros componentes como, por ejemplo, otros principios activos de interés, para lo cual bastaría con añadirlos, a la solución orgánica o a la solución acuosa o a ambas durante la preparación de la nanopartícula. También sería posible añadirlas durante la etapa adicional (iii) de incubación.
EJEMPLOS
Para la descripción de algunos de los siguientes ejemplos se hace referencia a resultados obtenidos mediante las siguientes técnicas:
El tamaño de las nanopartículas se determinó mediante la técnica de espectroscopia de correlación fotónica (PCS) y usando un Zeta Sizer (Zeta Sizer, Nano Series, Nano-ZS, Malvern Instruments, .U.), obteniendo el tamaño medio de la población y el índice de polidispersión del mismo. El procedimiento comprende diluir las muestras en agua Milli-Q a una proporción 1:19. Cada análisis se llevó a cabo a 25°C con un ángulo de detección de 173°.
El potencial zeta de las nanopartículas se detectó mediante la técnica de anemometría de dispersión de láser (LDA) usando un Zeta Sizer (Zeta Sizer, Nano series, Nano-ZS, Malvern Instruments, R.U.). El procedimiento comprende diluir las muestras en solución de KCI milimolar.
La eficacia de la asociación de los miRNAs con las nanopartículas se determinó mediante la técnica de electroforesis en gel de agarosa. El procedimiento comprende preparar un gel de agarosa al 2% en tampón TAE (Tris-Acetato-EDTA, Tris 40 mM, ácido acético al 1%, EDTA 1 mM), pH 8 con SYBR®. Como sustancia de carga se usó tinción de gel de ácidos nucleicos de oro y glicerol. Se aplicó una diferencia de potencial de 25 mV durante 30 minutos y se usó miRNA libre como control.
Tal y como se usan en los siguientes ejemplos, se adquirieron los siguientes polímeros de diferentes establecimientos comerciales: ácido hialurónico (Bioibérica, España), sulfato de condroitina (Calbiochem, EE.UU.). El Span® 80 y la oleilamina se adquirieron de Sigma (España). Los diferentes miRNAs usados se adquirieron de Exiqon (Dinamarca). Los demás productos indicados en los ejemplos a continuación se adquirieron de Sigma (España).
Para confirmar la validez de las nanopartículas de la invención en una prueba de concepto se realizaron los ensayos in vitro e in vivo que se describen a continuación. Con estos ensayos se buscaba, entre otros, confirmar la correcta asociación de los miRNAs en las nanopartículas, su correcta distribución a las células diana relevantes, y su efecto terapéutico mejorado
Ejemplo 1: Prueba de concepto In vivo del efecto terapéutico en términos de regulación clínica de las metástasis hepáticas proporcionadas Preparación y caracterización de nanopartículas
Para la elaboración de las nanopartículas, se preparó una solución de monooleato de sorbitán (Span* 80, SP80) y oleilamina (OA) en 3 mi de etanol (fase orgánica) a una concentración de 6,6 y 0,33 mg/ml respectivamente. Después, esta fase orgánica se añadió a 6 mi de una fase acuosa agitada que contenía sulfato de condroitina (CS) a una concentración de 0,125 mg/ml, dando lugar de este modo a la formación espontánea de NPs. El etanol se retiró finalmente a presión reducida en un evaporador rotatorio. El mi NA se incluyó en la fase acuosa a una concentración de 8,33 μg/ml durante la elaboración de las nanopartículas. Para este propósito se seleccionó miR-20a. Estas proporciones corresponden a porcentajes en peso con respecto al peso total de la nanopartícula de 91,67% de SP80, 4,63% de OA, 3,47% de CS y 0,23% de m¡R-20o.
Se midió el tamaño y potencial zeta de las nanopartículas mediante espectroscopia de correlación fotónica (photon correlation spectroscopy) y anometría Doppler láser (láser Doppler anemometry), respectivamente.
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Tabla 1. Características físico-químicas de las nanopartículas de la invención
Eficiencia de la asociación entre el miRNA y la nanopartícula
La eficiencia de la carga del microRNA a las nanopartículas se confirmó mediante la técnica de electroforesis en gel de agarosa, tal como se ilustra en la Figura 1.
Manejo de animales:
Todos los experimentos descritos en este trabajo se han llevado a cabo de acuerdo con las leyes españolas y europeas relativas al cuidado de animales para experimentación. La manipulación de animales y los métodos experimentales de nuestro laboratorio se han analizado y aprobado por el Comité de Experimentación Animal de la Universidad del País Vasco, España. Se llevaron a cabo todos los esfuerzos para minimizar el número de animales empleados y su sufrimiento. Se obtuvieron ratones C57 BL/6NCH (hembras, 8 semanas de edad) a través de Charles River Laboratories España, S.A. Se alojó a los ratones en la Unidad de Recursos Biológicos de la Universidad del País Vasco y se los mantuvo en un ambiente de temperatura controlada (21 ± 1 °C), humedad relativa del 55 ± 5%, ciclo de luz/oscuridad de 08h00-20h00 y se les suministró alimento para ratón convencional y agua ad libitum.
Modelo de metástasis hepática y evaluación clínica: Se desarrolló un modelo de metástasis hepática inyectando en los ratones una línea celular de cáncer colorrectal murino c26 (200.000 células/animal). Se anestesió a los animales con isofluorano (5% y 1,5% de mantenimiento) y se inyectaron las células en el bazo. Después de la intervención se suturaron las incisiones. Se trató a los animales en el día 3 después de la inoculación del tumor y posteriormente cada 3 días hasta el día 21 con una dosis total de 25 μg de mi NA por animal. Los ratones se separaron en 5 grupos diferentes dependiendo del tratamiento. El grupo 1 se trató con placebo (glucosa); el grupo 2, según la invención, se trató con nanopartículas de SP80-OA-CS asociadas con m¡R-20o con un marcador fluorescente (6-carboxifluoresceína) (FAM); el grupo 3 se trató con miR-20a libre o desnudo (sin ningún vehículo específico); el grupo 4 se trató con nanopartículas de SP80-OA-CS asociadas con un miRControl (este miR no ataca a ningún mRNA); el grupo 5 se trató con las nanopartículas SP80-OA-CS en blanco (sin mRNA asociado). En el día 21 después de la inoculación se sacrificó a los animales y se observaron los hígados y se procesaron posteriormente para análisis histológico.
Histología:
Después de la dislocación cervical se extirparon rápidamente los hígados y se fijaron en paraformaldehído (PFA al 4%) en PBS, durante toda la noche a 4°C. Los hígados fijados se procesaron para su inclusión en parafina. Se montaron secciones seriadas de 10 μιη de grosor en cinco series paralelas y se procesaron para hematoxilina-eosina. Se capturaron imágenes microscópicas en un microscopio Zeiss.
Algunas secciones de hígado se observaron 48 horas después de la última inyección. Las secciones se incubaron con marcador de receptor anti-manosa y anticuerpo Alexa 593 anti- ratón. El marcador verde del miR-20a (FAM) se observó dentro de las células endoteliales marcadas en rojo, lo que confirma el ataque endotelial o la distribución específica a las células endoteliales del sinusoide hepático ("LSEC" de acuerdo con sus siglas en inglés) que proporcionan las nanopartículas al miR-20a.
Después de la evaluación macroscópica de los hígados, se confirmó el efecto terapéutico en términos de regulación clínica de las metástasis hepáticas en el grupo de animales tratados con SP80-OA-CS asociadas con miR-20a (Figura 2).
Las secciones de los hígados de la Figura 2 se tiñeron con hematoxilina-eosina y se cuantificó el área ocupada por el tumor bajo el microscopio. Los diferentes grupos se relacionaron con el grupo de control (tratado con glucosa como placebo) usando del test-T. Las diferencias estadísticamente significativas (p < 0,05) se indicaron con un *. Asimismo, se compararon el grupo tratado con nanopartículas de SP80-OA-CS asociadas con mi -20a y con nanopartículas de SP80-OA-CS en blanco (sin mRNA asociado) y la diferencia estadísticamente significativa (p < 0,05) se indicó con un +. Tal como puede apreciarse en la Figura 3, el área ocupada por el tumor fue sorprendentemente más pequeña en los ratones tratados con nanopartículas de SP80-OA-CS asociadas con miR-20a (según la invención) que en ratones tratados solo con m¡R- 20a.
Esto confirma una mejora imposible de anticipar a priori de las nanopartículas según la invención en la vehiculización de miRNAs in vivo. Más aún, resulta sorprendente el efecto terapéutico proporcionado por estas nanopartículas en términos de regulación clínica de metástasis hepáticas.
Ejemplo 2: Prueba de concepto adicional In vivo e In vitro del efecto terapéutico y del comportamiento de las nanopartículas de la invención
Células de Cáncer Colorectal
Se utilizaron líneas celulares de cáncer colorectal murino c26 (ATCC, Manassas, VA, EE.UU.) singénicas con ratones Balb/c. Las células se cultivaron en condiciones standard en medio RPMI (Sigma-Aldrich; St. Louis, MO, EE.UU.), complementado con 10% suero bovino fetal (FBS), penicilina (100 U/ml), estreptomicina (100 μg/ml) and amfotericina B (0.25 μg/ml), todos adquiridos de Life technologies, Carlsbad, CA, EE.UU.)
Células de control y activadas por tumor
Se anestesiaron los ratones con isoflurano, y se practicó una pequeña incisión en su costado izquierdo. Después, se inoculó el corte con 50 μΙ de las células cancerígenas C26 en una concentración de 2 x 106 células/ml. A continuación, se suturó el peritoneo y la piel. Los ratones de control se inocularon con PBS. Catorce días más tarde todos los ratones fueron sacrificados y las líneas celulares activadas por cáncer y las de control se aislaron mediante centrifugación diferencial de gradiente (25% a 50%) de Percoll (Sigma-Aldrich; St. Louis, MO, EE.UU.). Las líneas celulares se sembraron con medio RPMI 1640 con 10% FBS, y se realizó la purificación de ARN siguiendo el protocolo de un minikit Purelink RNA (Gibco Life Technologies Inc., Gaithersburg, MD, EE.UU.).
Preparación y caracterización de SP-OA-CS de control, SP-OA-CS asociada con pEGFP y SP- OA-CS asociada con miRNA Siguiendo un esquema análogo al del ejemplo 1, se prepararon las nanopartículas que se describen a continuación. Se preparó una solución de sorbitán monooleato (Span 80, SP) y oleilamina (OA) (Sigma-Aldrich; St. Louis, MO, Estados Unidos) en etanol a una concentración de 6,6 y 0,33 mg/ml, respectivamente. Después, esta fase orgánica se añadió con agitación magnética a una fase acuosa que contenía condroitín sulfato (CS) (Calbiochem, Estados Unidos) a una concentración de 0,125 mg/ml, en una relación de volumen de 1:2, respectivamente. Se retiró el etanol bajo presión reducida en un evaporador rotatorio. Para la encapsulación de material genético, este se incluyó en la fase acuosa durante la construcción de las nanopartículas a concentraciones de 33,3 μg/ml para plásmido de Proteína Verde Fluorescente Potenciada (pEGFP) (Elim Biopharmaceutics, EE.UU.) y 8,33 μg/ml y 16,7 μg/ml para miRNA (miR-20 o miR-control) (Exiqon, Dinamarca). Las formulaciones finales obtenidas fueron 200 μg/ml de NP cargadas con pEGFP, 50 y 100 μg/ml de NP cargadas con miRNA. Las formulaciones se administraron en una solución de glucosa al 5 % para los estudios in vivo. La eficacia de la asociación del ADN plasmídico y los miRNA se determinó mediante la electroforesis en gel de agarosa, con resultados análogos a los del ejemplo 1, confirmándose que la migración de los ácidos nucleicos al gel se evitó mediante su asociación con las nanopartículas; no se observó ningún material genético libre en estas formulaciones (ver figura 4). La morfología de las nanopartículas se examinó con microscopía electrónica de transmisión (CM 12 Philips, Eindhoven, Países Bajos) después de teñir con solución de ácido fosfotúngstico 2 % p/v. Para este fin, las muestras se colocaron en rejillas de cobre (malla 400) recubiertas con una película de Formvar®.
Las nanopartículas en blanco (sin material genético incorporado) y las nanopartículas asociadas a pEGFP o a miR-20a tuvieron tamaños nanométricos de 133 nm, 143 nm y 143 nm y cargas de superficies negativas de -38 mV, -36 mV y -33 mV, respectivamente. La morfología de los nanosistemas se observó usando microscopía electrónica de transmisión (TEM). Las imágenes de TEM confirmaron el tamaño nanométrico de las formulaciones (Figura 5). Formulación Tamaño (nm) Pdl Potencial ζ (mV)
SP-OA-CS 132,9 ± 4,2 0,069 -38,2 ± 1,6
SP-OA-CS-pEGFP 142,7 ± 13,8 0,091 -36,4 ± 8,6
SP-OA-CS-m¡R-20a 142,6 ± 1,4 0,065 -33,3 ± 3,0
Tabla 2: Caracterización fisicoquímica de nanopartículas SP-OA-CS asociadas con pEGFP o con miR-20a que son capaces de dirigirse a LSEC in vitro e in vivo
Correcta distribución de las nanopartículas de la invención a las células diana relevantes
Para demostrar la captación celular y capacidad de transfeccion de nanopartículas SP-OA-CS por LSEC se incorporó un ADN plasmídico que codificaba GFP durante su preparación. La expresión de GFP se evaluó 24 h después de la transfeccion usando microscopía de fluorescencia. En este momento experimental, las LSEC expresaban GFP, lo que indica la internalización de nanopartículas y suministro de plásmidos exitosos, es decir, la eficaz liberación de material genético a dichas células por parte de las nanopartículas. Para evaluar si las nanopartículas de la invención podrían ser eficaces en LSEC in vivo, se inyectaron sistémicamente en ratones SP-OA-CS que contenían plásmido EGFP. Los sinuosides hepáticos expresaron GFP, lo que indica un suministro de plásmido exitoso, es decir, la eficaz liberación de material genético a dichas células por parte de las nanopartículas. Además, las secciones se inmunotiñeron con receptor anti-manosa y anticuerpos F4/80. Las células positivas para GFP fueron células endoteliales del sinusoide hepático. La señal de fluorescencia de miR-20a se detectó en LSEC cuando se inyectaron en los ratones nanopartículas asociadas con miRNA. Al mismo tiempo, la señal fluorescente era más amplia cuando se inyectó miR-20a en la forma desnuda.
Ejemplo 3: La capacidad migratoria aumentada de LSEC activadas por señales tumorales se evita por miR-20a
Para verificar si la anulación de miR-20a en el LSEC de hígados colonizados por tumores tuvo alguna consecuencia en el comportamiento fisiológico de estas células, se cultivaron en insertos de poro de 8 μιη recubiertos con colágeno para medir su capacidad de migración. Las LSEC activadas por tumores se trataron con m¡R-20a, con control de miR o con el vehículo de transfección sin carga Myrus®. Se descubrió que la capacidad de migración LSEC aumentó aproximadamente dos veces cuando las células se activaron mediante el tumor, pero esto se invirtió casi a niveles básales cuando las células se transfectaron con m¡R-20a exógeno (p<0,05). Por lo tanto, la restauración de la expresión de m¡R-20a celular en LSECs fue suficiente para evitar el aumento de capacidad migratoria asociado con activación inducida por tumor (Figura 6).
Ejemplo 4: Análisis de desarrollo de metástasis hepática de cáncer colorrectal in vivo y tejido hepático histológico
Siguiendo una metodología análoga a la del ejemplo 1, se anestesiaron ratones Balb/c con isoflurano (Esteve, España), y se realizó un pequeño corte en su lado izquierdo. A continuación, el bazo se expuso para realizar una inoculación intra-esplénica de 50 μΙ de células de carcinoma de colon C26 a una concentración de 2 xlO6 células/ml para cada ratón. Los animales se dividieron en 5 grupos, y los tratamientos se realizaron cada 3 días desde el día de la inoculación de células cancerosas. El grupo 1 se trató con placebo (glucosa); el grupo 2, según la invención, se trató con nanopartículas de SP80-OA-CS asociadas con miR-20a; el grupo 3 se trató con miR-20a libre o desnudo (sin ningún vehículo específico); el grupo 4 se trató con nanopartículas de SP80-OA-CS asociadas con un miRControl (este miR no ataca a ningún mRNA); el grupo 5 se trató con las nanopartículas SP80-OA-CS en blanco (sin mRNA asociado). Finalmente, los hígados se incluyeron en parafina y se congelaron para análisis histológicos. Para cuantificar el área tumoral ocupada, se cortaron secciones de 7 μιη consecutivas con 500 μιη entre ellas en hígados incluidos en parafina. A continuación, se realizó tinción con hematoxilina y eosina, y el área tumoral se cuantificó usando Software ImageJ. Además, para analizar las LSEC infiltradoras potencialmente activadas en el área metastatizada, se realizó inmunotinción con dilución 1:100 de anticuerpo monoclonal anti- CD31 (BD Pharmingen, EE.UU.), seguido del anticuerpo fluorescente secundario Alexa 594 (1:1000) apropiado. Se cuantificaron las imágenes usando el programa AnalySIS V3.2 (Olympus Software Imagine Solutions GMBH, Munster, Alemania). Los resultados se expresan como un porcentaje de área tisular coloreada específicamente con respecto al área analizada completa. Los resultados se muestran en la Figura 7. Ejemplo 5: Las proteínas diana de miR-20a E2F1 y ARHGAPl estaban reguladas negativamente en LSEC colonizadas por el tumor en relación con LSEC sanas
Se usó la base de datos miRBASE (www - i; bose.org) para identificar 713 proteínas como posibles dianas de m¡R-20a. En paralelo, en un estudio proteómico, se identificaron 174 proteínas que estaban reguladas positivamente en LSEC activadas por tumores en comparación con LSEC de control. Cuando se compararon ambos conjuntos de datos, se descubrieron 5 proteínas expresadas de forma coincidente: E2F1, JAKl, ARHGAPl, ACSL4 y DECR1. Se realizó a continuación un análisis de transferencia de Western con LSEC activadas por tumores y LSEC activadas por tumores cultivadas con m¡R20a exógeno. Brevemente, se lisaron cultivos de LSEC con tampón de RIPA, se separaron a través de electroforesis de SDS-PAGE 8 % y se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, EE.UU.). Se detectaron E2F1 (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, Texas, EE.UU.) y ARHGAPl (Abcam, Cambridge, Reino Unido) (1:1000) usando proteína A conjugada con peroxidasa de rábano rusticano (1:5.000) (Sigma-Aldrich; St. Louis, MO, EE.UU.). Las bandas se visualizaron usando un kit de Sustrato Femto Super Signal (Pierce Chemical Co, Rockford, IL, EE.UU.). Se usó GAPDH como un control de carga de proteínas.
En condiciones de control, E2F1 y ARHGAPl mostraron baja expresión. Sin embargo, después de la activación de LSEC con el tumor, tanto E2F1 como ARHGAPl se regularon en gran medida positivamente. Cuando las células se transfectaron in vitro con miR-20a, la expresión de proteínas se redujo en ambos casos a niveles básales (ver Figura 8).
Ejemplo 6: Liofilización
Las nanopartículas desarrolladas en el ejemplo 1 se evaluaron con éxito respecto de su capacidad para mantener la asociación al miRNA después de un proceso de liofilización.

Claims

REIVINDICACIONES
1. Una nanopartícula que comprende (i) entre un 60% y un 99% en peso, con respecto al peso total de la nanopartícula, de un éster de sorbitán; (¡i) una sustancia cargada positivamente; y (iii) un mi NA.
2. La nanopartícula según la reivindicación 1, caracterizada por que dicha sustancia cargada positivamente comprende un grupo amonio o amina unido a uno, dos o tres restos que se seleccionan independientemente del grupo que consiste en alquilo Ci-C40, alquenilo C2- C40, alquinilo C2-C40.
3. La nanopartícula según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada por que dicha sustancia cargada positivamente tiene la fórmula (R10)p (R11)(R12)NR9, en donde cada uno de R10, Ru y R12 se selecciona independientemente del grupo que consiste en -H, alquilo C C4, alquenilo C2-C4, alq uinilo C2-C4, y fenilalquilo C7-C15;
R9 se selecciona del grupo que consiste en alquilo C Qo, alquenilo C2-C40, alquinilo C2-
p es 0 o 1; y en donde también comprende un contranión en el caso en el que p es 1.
4. La nanopartícula según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada por que dicha sustancia cargada positivamente se selecciona del grupo que consiste en oleilamina, cloruro de benzalconio y bromuro de cetil trimetil amonio.
5. La nanopartícula según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada por que dicho éster de sorbitán comprende un compuesto de fórmula I
Figure imgf000034_0001
Fórmula I en donde cada uno de 5, R6, R7 y R8 se selecciona independientemente del grupo que consiste en -H, -(C=0)-alquilo C Qo, -(C=0)-alquenilo C2-C40, -(C=0)-alquinilo C2-C40, con la condición de que al menos uno de R5, R6, R7 y R8 no es -H; cada uno de a, b, c y d es independientemente un número entre 0 y 100.
6. La nanopartícula según la reivindicación 5, caracterizada por que dicho grupo alquilo es lineal y comprende entre 2 y 20 átomos de carbono.
7. La nanopartícula según cualquiera de las reivindicaciones 5 ó 6, caracterizada por que dicho grupo alquilo tiene 9, 11, 13, 15 o 17 átomos de carbono.
8. La nanopartícula según cualquiera de las reivindicaciones 5, 6 ó 7, caracterizada por que dicho grupo alquenilo es lineal y comprende entre 4 y 25 átomos de carbono.
9. La nanopartícula según cualquiera de las reivindicaciones 5, 6, 7 u 8, caracterizada por que dicho grupo alquenilo tiene la fórmula -(CH2)n-CH=CH-(CH2)m-CH3, en donde n es un número entero comprendido entre 1 y 10, y m es un número entero comprendido entre 1 y 10.
10. La nanopartícula según la reivindicación 9, caracterizada por que n es 7 y m es 7.
11. La nanopartícula según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 10, caracterizada por que a, b, c y d son 0.
12. La nanopartícula según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 10, caracterizada por que la suma de a, b, c y d se encuentra entre 10 y 30.
13. La nanopartícula según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 12, caracterizada por que R6, R7 y R8 son -H.
14. La nanopartícula según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizada por que dicho éster de sorbitán tiene la fórmula II
Figure imgf000035_0001
Fórmula II en donde
R5 se selecciona del grupo que consiste en -(C=0)-alquilo Ci-C40 y -(C=0)-alquenilo C2- c40; y b es un número entre 0 y 100.
15. La nanopartícula según la reivindicación 14, caracterizada por que b es 0; y R5 tiene la fórmula -(CH2)n-CH=CH-(CH2)m-CH3, en donde n es un número entero comprendido entre 1 y 10, y m es un número entero comprendido entre 1 y 10.
16. La nanopartícula según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada por que tiene un potencial positivo comprendido entre +1 y +100 mV.
17. La nanopartícula según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, caracterizada por que comprende una sustancia cargada negativamente.
18. La nanopartícula según la reivindicación 17, caracterizada por que dicha sustancia cargada negativamente comprende un polisacárido cuya unidad repetitiva tiene la fórmula [X-Y-(Z)n] en donde n es 0 o 1; X, Y y Z se seleccionan cada uno independientemente del grupo que consiste en monosacáridos, disacáridos y polisacáridos; con la condición de que al menos uno de X, Y y Z comprende un azúcar ácido y en donde los grupos X, Y y Z se unen entre sí a través de enlaces -O-glucosídicos.
19. La nanopartícula según la reivindicación 18, caracterizada por que dicho azúcar ácido se selecciona del grupo formado por los ácidos aldónicos, ácidos ulosónicos, ácidos urónicos, ácidos aldáricos y mezclas de los mismos.
20. La nanopartícula según la reivindicación 18, caracterizada por que Y comprende un azúcar ácido.
21. La nanopartícula según la reivindicación 20, caracterizada por que Y comprende un ácido urónico.
22. La nanopartícula según cualquiera de las reivindicaciones 19 ó 21, caracterizada por que dicho ácido urónico tiene la fórmula III
Figure imgf000036_0001
Fórmula III en donde cada uno de 1, R2 y R3 se selecciona independientemente del grupo que consiste en - H, -OH, -O-, -OR4, N(H)-R4 y -0-S03, con la condición de que al menos uno de R1, R2 y R3 sea -O-, en donde -O- es el átomo de oxígeno que forma el enlace glucosídico, y en donde 4 se selecciona del grupo que consiste en alquilo C C4, alquenilo C2-C4, alquinilo C2-C4, -(C=0)-alquilo C C4, -(C=0)-alquenilo C2-C4, -(C=0)-alquinilo C2-C4.
23. La nanopartícula según la reivindicación 17, caracterizada por que dicha sustancia cargada negativamente es un polisacárido que comprende uno o más grupos carboxílicos.
24. La nanopartícula según la reivindicación 23, caracterizada por que dicha sustancia cargada negativamente comprende ácido glucurónico en su estructura repetitiva.
25. La nanopartícula según cualquiera de las reivindicaciones 17 a 24, caracterizada por que dicha sustancia cargada negativamente se selecciona del grupo que consiste en ácido hialurónico, sulfato de condroitina y goma xantana.
26. La nanopartícula según cualquiera de las reivindicaciones 17 a 25, caracterizada por que tiene un potencial negativo comprendido entre -25 y -40 mV.
27. La nanopartícula según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que dicho miRNA se selecciona del grupo que consiste en miR-20a, miR-29, miR-652 miR-34a, miR- 16 y mezclas de los mismos.
28. La nanopartícula según la reivindicación 27, caracterizada por que dicho miRNA es miR- 20a.
29. Una composición farmacéutica que comprende la nanopartícula tal y como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 28, y un excipiente farmacéuticamente aceptable.
30. Uso de la nanopartícula tal y como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 28, para la fabricación de un medicamento.
31. Uso de la nanopartícula tal y como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 28, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una indicación que se selecciona del grupo que consiste en cáncer, diabetes, enfermedades neurodegenerativas, enfermedades del sistema respiratorio, alteraciones metabólicas y enfermedades vasculares.
32. Uso según la reivindicación 31 para el tratamiento del cáncer.
33. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 31 ó 32 para el tratamiento del cáncer colorectal.
34. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 31, 32 ó 33 para el tratamiento de la metástasis en hígado.
35. Un procedimiento para la preparación de la nanopartícula tal y como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 28, caracterizado por que comprende (i) la etapa de añadir una solución orgánica que comprende un disolvente orgánico y un éster de sorbitán sobre una solución acuosa; en donde dicha solución orgánica o dicha solución acuosa o ambas comprenden una sustancia cargada positivamente; (ii) la etapa de evaporar disolvente orgánico y agua; y (iii) la etapa opcional de incubar la nanopartícula resultante de la etapa (ii) en presencia de otras sustancias; en donde un mi NA se incorpora (a) durante la etapa (i) como parte de la solución acuosa, (b) en la etapa de incubación (iii), o en ambas etapas (i) y (ii).
36. El procedimiento según la reivindicación 35, caracterizado por que dicha solución acuosa comprende una sustancia cargada negativamente.
37. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 35 ó 36, caracterizado por que dicho disolvente orgánico es total o parcialmente soluble en agua.
38. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 35, 36 ó 37, caracterizado por que dicho disolvente es un alcohol.
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