WO2017187661A1 - 電気化学測定方法、電気化学測定装置及びトランスデューサ - Google Patents

電気化学測定方法、電気化学測定装置及びトランスデューサ Download PDF

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林　泰之
亮太 國方
篤史 須田
浩介 伊野
久美 井上
末永　智一
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Tohoku University NUC
Japan Aviation Electronics Industry Ltd
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Tohoku University NUC
Japan Aviation Electronics Industry Ltd
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    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/483—Physical analysis of biological material
    • G01N33/487—Physical analysis of biological material of liquid biological material
    • G01N33/48707—Physical analysis of biological material of liquid biological material by electrical means
    • G01N33/48735—Investigating suspensions of cells, e.g. measuring microbe concentration

Definitions

  • the present invention relates to a chemical substance (chemical reaction product) derived from a non-biological sample (hereinafter, simply referred to as “biological sample” in the present application) containing cells, cell masses, tissue fragments and other biological samples and biological substances.
  • biological sample a non-biological sample
  • the present invention relates to an electrochemical measurement method, an electrochemical measurement apparatus, and a transducer used for electrochemical measurement.
  • Quantifying substances produced by chemical reactions that occur in biological samples such as cells, cell clumps, and tissue fragments is a necessary technique for life / death determination and functional evaluation of biological samples in the field of medicine, drug discovery, etc. .
  • One method of quantifying chemical reaction products released from a biological sample is electrochemical measurement. For example, in Non-Patent Document 1, observation of the progress of hepatocyte differentiation is performed by electrochemical measurement.
  • an object to be measured in an electrolyte solution in which two or more electrodes connected to an external power source are inserted is deprived of electrons from the object to be measured through the electrodes, or electrons are transferred to the object to be measured.
  • This is a method for detecting the presence or absence of a redox reaction, that is, the presence or absence of an object to be measured by measuring the current flowing between the electrodes at the same time as causing the oxidation or reduction reaction.
  • a general electrochemical measurement device is a working electrode that exchanges electrons with a measurement object to cause an oxidation-reduction reaction. It is made up of an electrolyte for allowing electrons to move through ions in the inside, and a reference electrode for taking a voltage standard, for example, to make the entire measurement system a closed circuit.
  • Non-Patent Document 1 an embryonic body (EB), which is an ES cell mass prepared from mouse embryonic stem cells (embryonic cells), is an undifferentiated marker present on the cell membrane of ES cells.
  • EB embryonic body
  • ALP alkaline phosphatase
  • ⁇ ⁇ A reaction in which a stem cell whose function is not limited to a somatic cell whose function is limited is generally called differentiation, and a substance showing that differentiation has not occurred is called an undifferentiated marker.
  • ALP is an undifferentiated marker for cells and has the property of hydrolyzing phosphate ester compounds under alkaline conditions.
  • ALP functions as an enzyme for the reaction of changing the phosphate compound p-aminophenyl phosphate (PAPP) to p-aminophenol (PAP).
  • PAPP p-aminophenyl phosphate
  • PAP p-aminophenol
  • PAP produced by the enzymatic reaction is an electrochemically active substance, and is oxidized to p-quinone imine (PQI) by applying a voltage to the working electrode with reference to the reference electrode. That is, the presence of ALP is detected as a current value in the electrochemical measurement by two reactions of the enzyme reaction and the oxidation-reduction reaction.
  • PQI p-quinone imine
  • the reaction state of a biological sample of several ⁇ m to several hundred ⁇ m is imaged two-dimensionally and with time by using electrode current values obtained from 400 electrodes.
  • Non-Patent Document 1 The measurement in Non-Patent Document 1 described above is as follows. ⁇ Mouse EB was put into an electrolyte solution containing 4.7 ⁇ 10 ⁇ 3 mol / L of PAPP. Enzymatic reaction started immediately after the addition, and PAPP changed to PAP by ALP in the cell membrane. Diffusion and reach the electrode surface ⁇ Waiting for the diffusion to stabilize and applying voltage to the electrode ⁇ PAP changes to PQI ⁇ Acquiring the current value between electrodes is shown in FIG. Is shown as time.
  • the time A from the moment when the EB is introduced into the electrolyte and the enzyme reaction is started until the voltage is applied assumes the time when the PAP starts to diffuse from the surface of the EB and the PAP concentration distribution in the electrolyte is stabilized.
  • the time B from the voltage application until the current value is taken in is set on the assumption that the change in the PAP concentration distribution near the electrode is stabilized by the oxidation-reduction reaction occurring at the electrode.
  • the timing at which the EBs touch the PAPP is different if the EBs are arranged in multiple times.
  • the time A from the start of the enzyme reaction to the voltage application was different for each EB, and the PAP concentration distribution and current value around the EB all had the same activity (PAP release rate per unit time). Shows a different value. That is, both the difference in the magnitude of the ALP activity possessed by the EB and the difference due to the length of the time A from the start of the enzyme reaction to the voltage application are mixed in the measured current value.
  • the measurement result of the EB group performed at one time and the measurement result of the EB group performed at a different time are, for example, how to put the worker at the time of EB charging. It is considered that it is difficult to compare the measurement results between the EB groups due to the difference in liquid shaking caused by the cause.
  • An object of the present invention is to make it possible to make the measurement conditions uniform between each sample in a case where a plurality of samples are measured at each time and a plurality of samples that are repeated a plurality of times, thereby enabling accurate measurement. It is an object of the present invention to provide an electrochemical measurement method, an electrochemical measurement device, and a transducer used for the electrochemical measurement that can accurately compare the measurement results between each measurement and each sample in one measurement.
  • the working electrode that exchanges electrons with the measurement object to cause an oxidation-reduction reaction, and the counter electrode that is connected to the working electrode via the external power source are provided.
  • the electrolytic solution containing the electrolytic solution A working electrode is provided on the bottom surface of the tank, and the object to be measured is made up of a thin line that extends from one point on the bottom surface to a space in the upper electrolyte tank and returns to the other point on the bottom surface.
  • Measurement object cancellation step of providing a thin wire electrode for application and applying a cancellation voltage of the same polarity as the measurement voltage between the thin wire electrode for measuring object cancellation and the counter electrode to oxidize or reduce the measurement object. And a new measurement after the application of the canceling voltage is stopped.
  • a measurement object diffusion step of diffusing the object executes an electrochemical measurement step of measuring a current by applying a measurement voltage between the working electrode and the counter electrode after to diffuse the new object to be measured.
  • the electrolytic solution is placed on the bottom surface of the electrolytic solution tank containing the electrolytic solution and the biological sample that generates the measurement target in the electrolytic solution, and exchanges electrons with the measurement target.
  • a working electrode that causes an oxidation-reduction reaction, a counter electrode provided in the electrolyte bath, a measuring voltage applying means that applies a measuring voltage between the working electrode and the counter electrode, and a measuring voltage being applied In an electrochemical measurement apparatus comprising current measurement means for measuring a current flowing between a working electrode and a counter electrode according to the amount of a measurement object, the space in the electrolyte bath above the bottom surface from one point on the bottom surface A thin wire electrode for canceling the object to be measured is formed by transferring the electron to and from the object to be subjected to oxidation-reduction reaction, and the working electrode and the counter electrode.
  • a cancellation voltage application means for applying a cancellation voltage for measuring the voltage of the same polarity between the constant object retirement for
  • an electrolytic solution tank capable of accommodating an electrolytic solution and a biological sample immersed in the electrolytic solution is mounted on the LSI chip, and the electric power of the measurement object generated from the biological sample is obtained.
  • the transducer used for the chemical measurement has a plurality of first electrodes arranged in an array and provided on the LSI chip in a sensor region defined on the bottom surface of the electrolytic bath, and a first thin line formed on the sensor region. Two electrodes are provided, and the second electrode extends from one point of the sensor region to a space in the upper electrolyte bath and is extended to a shape that returns to the other point of the sensor region again.
  • the electrochemical measurement method according to the present invention is such that after the measurement object generated and diffused in the electrolytic solution is once canceled, the measurement object is generated and diffused again, and the measurement is performed.
  • the electrochemical measuring apparatus according to can perform such a measurement. Therefore, according to the electrochemical measurement method and the electrochemical measurement apparatus according to the present invention, the measurement object can be generated and the diffusion conditions can be made uniform, that is, the measurement conditions can be made uniform and accurate measurement can be achieved. Is possible.
  • the transducer according to the present invention is suitable for use in such electrochemical measurements.
  • FIG. 1 is a chart showing a specific example of a conventional measurement process of electrochemical measurement.
  • FIG. 2 is a graph showing differences in calculation results of current values caused by differences in enzyme reaction time A in the electrochemical measurement shown in FIG.
  • FIG. 3 is a perspective view showing an example of a thin wire electrode for canceling a measurement object in the present invention.
  • FIG. 4 is a plan view of the fine wire electrode for canceling the measurement object shown in FIG.
  • FIG. 5A is a partially enlarged view of FIG.
  • FIG. 5B is a front view corresponding to FIG. 5A.
  • FIG. 6 is a perspective view showing an example of a thin wire electrode for canceling a measurement object and a bottom electrode for canceling the measurement object in the present invention.
  • FIG. 1 is a chart showing a specific example of a conventional measurement process of electrochemical measurement.
  • FIG. 2 is a graph showing differences in calculation results of current values caused by differences in enzyme reaction time A in the electrochemical measurement shown in FIG.
  • FIG. 3
  • FIG. 7 is a chart showing the measurement process of the electrochemical measurement according to the present invention together with the conventional measurement process.
  • FIG. 8 is a graph showing the calculation result of the current value when the measurement object cancellation step by the measurement object cancellation thin wire electrode shown in FIG. 3 is executed.
  • FIG. 9 is a graph showing a calculation result of a current value when the measurement object cancellation step is performed by the measurement object cancellation thin wire electrode and the measurement object cancellation bottom electrode shown in FIG. 6.
  • FIG. 10 is a graph showing the difference in the calculation result of the current value depending on whether or not the measurement object cancellation step is performed when there is convection.
  • FIG. 11 is a perspective view showing another example of the thin wire electrode for canceling the measurement object in the present invention.
  • FIG. 12 is a view for explaining an example of continuous formation of a thin wire electrode for canceling a measurement object.
  • FIG. 13 is a diagram for explaining the configuration of an embodiment of the electrochemical measurement apparatus according to the present invention.
  • FIG. 14A is a plan view showing an embodiment of a transducer according to the present invention.
  • 14B is a cross-sectional view of the transducer shown in FIG. 14A.
  • FIG. 15 is a perspective view of the transducer shown in FIG. 14A.
  • a substrate PAPP having a concentration of 4.7 ⁇ 10 ⁇ 3 mol / L is set as an initial value of the concentration in the space, and the wall and ceiling on the four sides of the analysis space have a concentration of 4.7 ⁇ 10 ⁇ outside the analysis space.
  • the EB surface (spherical surface) was used as a model for an enzyme reaction, with PAP being released depending on the concentration of PAPP in the vicinity of the surface according to Michaelis-Menten's equation (1) shown below.
  • the PAP concentration was set to zero on the electrode when voltage was applied, and the current value was calculated from the PAP concentration gradient.
  • the current value is proportional to the concentration gradient in the direction perpendicular to the electrode and follows equation (2).
  • an electrode for measuring object cancellation is provided in an electrolytic solution, and a measuring voltage is applied between the electrode for measuring object cancellation and a counter electrode to apply a canceling voltage having the same polarity as the measuring voltage to oxidize or reduce the object to be measured.
  • a measuring voltage is applied between the electrode for measuring object cancellation and a counter electrode to apply a canceling voltage having the same polarity as the measuring voltage to oxidize or reduce the object to be measured.
  • Configuration 1 A thin wire electrode for canceling a measurement object having the same polarity as the working electrode is provided on the bottom surface (analysis space bottom surface) where the working electrode is installed.
  • 3, 4, 5 A and 5 B show the arrangement and configuration of the thin wire electrode for canceling the measurement object.
  • 11 indicates a working electrode of ⁇ 40 ⁇ m
  • 21 indicates the measurement.
  • the thin wire electrode for object cancellation is shown.
  • Reference numeral 31 denotes an EB having a diameter of 300 ⁇ m. The EB 31 is located immediately above the working electrode 11.
  • the thin wire electrode 21 for canceling the measuring object consists of a thin wire (wire) having a thickness of 33 ⁇ m extending from one point of the bottom surface 10 to the upper space (Z direction) and returning to the other point of the bottom surface 10 again. It was assumed to be U-shaped. The distance between the opposite U-shaped leg portions was 120 ⁇ m, and the height of the center of the thin line at the center of the inverted U shape from the bottom surface 10 was 300 ⁇ m.
  • the thin electrode 21 for canceling the measurement object is disposed so as to be positioned between the adjacent working electrodes 11 in every other row of the working electrodes 11 (1, 3, 5, and 7 rows). Further, the working electrodes 11 are arranged so as to be positioned between the adjacent working electrodes 11 in every other row (2, 4, 6, 8 rows). In this way, a total of 56 measuring object canceling thin wire electrodes 21 were provided on the bottom surface 10.
  • Such a thin wire electrode 21 for canceling the measurement object can be formed by wire bonding, for example. 3, 4, 5 ⁇ / b> A, and 5 ⁇ / b> B also show a bonding pad 22 that is necessary when the thin wire electrode 21 for canceling the measurement object is actually installed.
  • Configuration 2 As shown in FIG. 6, in addition to the 56 measuring object canceling thin wire electrodes 21 of the configuration 1, the bottom electrode 23 for canceling the measuring object having the same polarity as the working electrode 11 is arranged on the bottom surface 10.
  • the bottom electrode 23 for canceling the measurement object was disposed on the entire bottom surface 10 with a 20 ⁇ m gap concentrically around the working electrode 11 of ⁇ 40 ⁇ m.
  • the pad 22 shown in FIG. 3 is not required, and the measuring object canceling thin wire electrode 21 having an inverted U shape is bonded (bonded) to both ends of the measuring object canceling bottom electrode 23. Can be installed at.
  • the measurement object cancellation electrode is composed of the measurement object cancellation fine wire electrode 21, and in the configuration 2, both of the measurement object cancellation thin wire electrode 21 and the measurement object cancellation bottom electrode 23. It was supposed to be.
  • the electrode for measuring object cancellation reproduced the voltage application to the electrode for measuring object cancellation by setting the analysis boundary condition so that the PAP concentration becomes zero when the voltage is applied.
  • P1 in FIG. 7 shows the process of the calculation result shown in FIG. 2, and P2 in FIG. 7 shows the process including the step of canceling the measuring object by the electrode for canceling the measuring object, that is, the electrochemical according to the present invention.
  • the process of the measurement method is shown.
  • a cancel voltage having the same polarity as the measurement voltage is applied to the working electrode and the electrode for canceling the target object, and the target object cancellation step (PAP) for 10 seconds.
  • the application of the voltage for cancellation is stopped, and after passing through the measurement object diffusion step in which a new measurement object is diffused by causing an enzyme reaction again for 3 seconds, the working electrode is used for measurement.
  • a voltage was applied to perform the electrochemical measurement step, and the current value after 0.1 seconds was calculated.
  • FIG. 8 and FIG. 9 show the calculation results of the current values when the measurement object extinguishing electrode has the configuration 1 and the configuration 2, respectively.
  • the reaction (measurement object generation, diffusion ... measurement object diffusion step) after the measurement object cancellation step is performed regardless of whether the time before the measurement object cancellation step is 3 seconds or 20 seconds. Therefore, it is desirable that the results before the measurement object cancellation step match in both the results of 3 seconds and 20 seconds.
  • the results of configurations 1 and 2 are sufficiently close to the results of 3 seconds and 20 seconds than the results shown in FIG.
  • Case 1 Time from start of enzyme reaction to voltage application 10 seconds, current value 0.1 seconds after voltage application
  • Case 2 Case of parallel to the arrangement of working electrodes (Y direction) at the start of enzyme reaction When the convection is 50 ⁇ m / s, the time from the start of the enzyme reaction to the voltage application is 10 seconds, the current value 0.1 seconds after the voltage application
  • Case 3 Parallel to the working electrode array at the start of the enzyme reaction
  • a measuring object cancellation step of 10 seconds is performed using the working electrode and a measuring object cancellation electrode having the same polarity as the working electrode.
  • FIG. 10 shows the calculation results of the current values in these cases 1-3. If there is no measurement object cancellation step, the result is distorted by convection as in case 2, and the original position (position where EB exists). It can be seen that a current value peak occurs at a position deviated from), whereas in case 3 where the measurement object cancellation step is executed, a current value close to the current value that should have been obtained in case 1 can be obtained. It can be seen that the influence of liquid shaking can be removed.
  • the working electrode that causes an oxidation-reduction reaction by exchanging electrons with the measuring object in the electrolyte containing the measuring object is connected to the working electrode via an external power source.
  • the electrochemical measurement in which a measuring voltage is applied between the working electrode and the counter electrode, and the current flowing between the working electrode and the counter electrode is measured according to the amount of the object to be measured, as described above.
  • the measurement object cancellation step is performed, all the measurement objects in the electrolyte solution that are present in the range that affects the measurement are all oxidized or reduced, and the generation and diffusion processes are performed. It is initialized and the state in the electrolytic solution is reset.
  • the time of the subsequent measurement object diffusion step to be constant, generation of the measurement object between each sample when measuring a plurality of samples at each time of measurement repeated a plurality of times, and
  • the diffusion conditions can be made uniform, that is, the measurement conditions can be made uniform.
  • the measurement object cancellation step by executing the measurement object cancellation step in this way, it is possible to eliminate the influence of the electrolyte swaying, convection, and the like. After the input, it is possible to perform measurement at a timing desired by the measurer.
  • the voltage for canceling is applied to both the electrode for canceling the measuring object and the working electrode to execute the measuring object canceling step.
  • the voltage for canceling is applied only to the electrode for canceling the measuring object. It is good also as what performs and applies a measurement object cancellation step.
  • the measurement object incineration fine wire electrode 21 has an inverted U-shape, and a plurality of measurement object quenching thin wire electrodes 21 each having an independent inverted U-shape are arranged.
  • the canceling thin wire electrode may have a shape and configuration as shown in FIG.
  • the thin wire electrode 25 for canceling the measurement object has a waveform shape by repeating a U-shape and an inverted U-shape, that is, adjacent to each other in the array of the thin wire electrodes 21 for measurement object cancellation shown in FIGS. What is to be done is a configuration in which the thin lines are continuous with each other (the thin lines are extended).
  • the measuring object canceling thin wire electrodes 25 are arranged in the same row and column as the arrangement of the measuring object canceling thin wire electrodes 21 with respect to the arrangement of the working electrodes 11, that is, four measurements extending in the X direction.
  • the object-removing fine wire electrodes 25 and the four measurement object-removing fine wire electrodes 25 extending in the Y direction are arranged so as to cross each other.
  • a bottom electrode 23 for canceling the measurement object is disposed on the bottom surface 10, and the thin wire electrode 25 for canceling the measurement object is located between the adjacent working electrodes 11 in the center part of the U shape, and the center part of the inverted U shape is located in the bottom part 10.
  • a U-shaped central portion that is provided so as to be positioned above the working electrode 11 and is in contact with the measurement object cancellation bottom electrode 23 is bonded (bonded) to the measurement object cancellation bottom electrode 23.
  • the repetition pitch of the waveform of the thin wire electrode 25 for canceling the measurement object is not limited to this example, and may be enlarged, for example, and a portion connecting adjacent inverted U-shapes according to the pitch is not one point but two points. Bonding may be performed. Further, in FIG. 11, the measurement object canceling thin wire electrodes 25 intersecting each other at the upper side (upper side from the measurement object canceling bottom electrode 23) are crossed on the bottom surface 10. You may make it make it.
  • FIG. 12 schematically shows an example of the formation, and FIG. 12 shows a case where a thin wire electrode for canceling a measurement object having a waveform shape so as to form a 4-row, 4-column lattice is formed.
  • -Wire is drawn from the path indicated by the solid line a from a 1 to a 2 and bonded.
  • the wire is drawn from the path indicated by the broken line b from b 1 to b 2 and bonded.
  • -The broken line c from c 1 to c 2
  • the wire is stretched in the path shown and bonded.
  • the wire is stretched and bonded in the path indicated by the solid line d from d 1 to d 2. If the wire is stretched in this way, a waveform shape is formed. It is possible to prevent the crossing of the thin wire electrodes for canceling the measurement object.
  • Fig. 13 schematically shows the configuration of the electrochemical measuring device.
  • the electrochemical measurement device includes an electrolytic solution 41 and an electrolytic solution tank 40 that houses a biological sample 30 that generates a measurement object in the electrolytic solution 41.
  • the electrolytic solution tank 40 includes a working electrode 11 and a thin wire for canceling the measurement object.
  • the electrode 21, the counter electrode 50, and the reference electrode 60 are provided.
  • the working electrode 11 and the thin electrode 21 for canceling the measurement object are shown in a simplified manner in FIG. 13, as described above, the working electrode 11 is configured in a large number in an array at a predetermined pitch.
  • the canceling thin wire electrode 21 has the structure shown in FIG. In addition, it is good also as a structure which has the bottom electrode 23 for measuring object cancellation, and it is good also considering the thin wire electrode 21 for measuring object cancellation as the thin wire electrode 25 for measuring object cancellation shown in FIG. In FIG. 13, 90 indicates a salt bridge.
  • the working electrode 11, the measurement object canceling thin wire electrode 21, the counter electrode 50, and the reference electrode 60 are connected to a potentiostat 70 as shown in FIG. 13.
  • the potentiostat 70 includes a variable power source 71, a voltmeter 72, and an ammeter 73.
  • the potentiostat 70 applies a measurement voltage between the working electrode 11 and the counter electrode 50 and applies a measurement voltage.
  • the measurement of the interelectrode current flowing between the working electrode 11 and the counter electrode 50 is performed according to the amount of the measurement object during application.
  • an application of a cancellation voltage having the same polarity as the measurement voltage between the measurement object cancellation thin wire electrode 21 and the counter electrode 50 is applied. Is also performed by the potentiostat 70.
  • the application of the measurement voltage to the working electrode 11 is performed by turning on the switch 81 and turning off the switches 82 and 83, and the application of the canceling voltage to the measuring object canceling thin wire electrode 21 is performed by switching the switches 82 and 83. This is done by turning on the switch 81 and turning it off. Note that the switch 81 may be turned on to apply a canceling voltage to the working electrode 11 as well.
  • the measurement object canceling thin wire electrode 21 is applied with a canceling voltage from the potentiostat 70, but the application of the canceling voltage is not limited to this, and a power source different from that of the potentiostat 70 is used. May be used.
  • FIG. 14A the configuration of the transducer according to the present invention used for electrochemical measurement of a measurement object generated from a biological sample will be described with reference to FIGS. 14A, 14B, and 15.
  • FIG. 14A the configuration of the transducer according to the present invention used for electrochemical measurement of a measurement object generated from a biological sample will be described with reference to FIGS. 14A, 14B, and 15.
  • FIG. 14A the configuration of the transducer according to the present invention used for electrochemical measurement of a measurement object generated from a biological sample.
  • This transducer is called a bio LSI chip, and has a configuration in which an electrolytic solution tank 40 capable of accommodating an electrolytic solution 41 and a biological sample immersed in the electrolytic solution 41 is mounted on the LSI chip 100. ing. A hole 42 is formed in the center of the electrolytic solution tank 40, and the LSI chip 100 is disposed so as to close the hole 42 at the lower end of the hole 42.
  • LSI The LSI chip 100 and the electrolyte bath 40 are mounted and fixed on the substrate 110, and the substrate 110 is formed with a large number of wiring patterns 111 for connection to an external device that controls the transducer.
  • reference numeral 120 denotes a bonding wire that connects the LSI chip 100 and the wiring pattern 111.
  • a sensor area 101 is formed on the upper surface of the LSI chip 100.
  • the sensor region 101 is shown with hatching, and the sensor region 101 is defined at the position of the hole 42 on the bottom surface of the electrolytic solution tank 40.
  • 20 ⁇ 20 400 working electrodes (first electrodes) of ⁇ 40 ⁇ m are arranged in an array in the sensor region 101 at a pitch of 250 ⁇ m.
  • a thin line for canceling the measurement object is formed of a thin line extending from one point of the sensor area 101 to a space in the upper electrolyte bath 40 and returning to the other point of the sensor area 101 again.
  • An electrode (second electrode) is formed.
  • the measurement object canceling thin wire electrode has, for example, the configuration of the measuring object canceling thin wire electrode 21 shown in FIG.
  • the measurement object canceling thin wire electrode 21 and the measurement object canceling bottom electrode 23 shown in FIG. 6 are used, and the above-described FIG.
  • the LSI chip 100 has a function of applying a voltage to each working electrode and the electrode for canceling the object to be measured, a function of detecting and amplifying a reaction at each working electrode as a current value, and a switching function.
  • the electrode pad provided in the LSI chip is generally formed of an Al alloy containing Cu, but in this example, there is no working electrode located in the sensor region 101, a bottom electrode for measuring object cancellation, and a bottom electrode for measuring object cancellation.
  • the pads for bonding the thin wire electrode for canceling the object to be measured are all formed by plating any one of Ti / Pt, Ti / Pt / Au, and Cr / Au on the Al alloy.
  • Au wire for the thin wire constituting the thin wire electrode for measuring object cancellation.
  • the counter electrode and the reference electrode are separate parts from the transducer, and are put into the electrolyte 41 during measurement (during use).

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Abstract

測定対象物を含む電解液中に測定対象物と電子の授受を行って酸化還元反応をさせる作用極と対極が設けられ、作用極と対極の間に測定用電圧を印加して測定対象物の量に応じて作用極と対極の間に流れる電流を測定する電気化学測定方法において、電解液槽の底面に作用極を設け、前記底面の一点から電解液槽内の空間に延びて底面の他点に帰還する形状に延伸された細線よりなる測定対象物消却用細線電極を設け、測定対象物消却用細線電極と対極の間に測定用電圧と同極性の消却用電圧を印加して測定対象物を酸化もしくは還元することで消却する測定対象物消却ステップと、消却用電圧の印加停止後に新しい測定対象物を拡散させる測定対象物拡散ステップと、新しい測定対象物を拡散させた後に作用極と対極の間に測定用電圧を印加して電流を測定する電気化学測定ステップを実行する。

Description

電気化学測定方法、電気化学測定装置及びトランスデューサ
 　この発明は細胞や細胞塊、組織片その他の生体試料及び生体関連物質を含む非生体試料（以下、本願では一括して単に「生体試料」という。）に由来する化学物質（化学反応生成物）を測定する電気化学測定方法、電気化学測定装置及び電気化学測定に用いるトランスデューサに関する。
 　細胞や細胞塊、組織片等の生体試料で起こる化学反応によって生成される物質を定量することは、医療、創薬等の現場において生体試料の生死判定、機能性評価等に必要な技術である。生体試料から放出される化学反応生成物の定量方法の１つに電気化学測定があり、例えば非特許文献１では肝細胞の分化の進行状態の観察を電気化学測定によって行っている。
 　電気化学測定は、外部電源とつながった２つ以上の電極が挿入されている電解液内の測定対象物に対し、電極を介して測定対象物から電子を奪うか、もしくは測定対象物へ電子を供与することで、酸化もしくは還元反応をおこさせると同時に、電極間を流れる電流を測定して酸化還元反応の有無、即ち測定対象物の有無を検出する方法である。
 　一般的な電気化学測定装置は、測定対象物と電子の授受を行って酸化還元反応をさせる作用極、作用極と外部電源を介してつながり、作用極で生じる電子移動を補償する対極、測定系内のイオンを介した電子の移動を可能とし、測定系全体を閉回路とするための電解液、電圧の基準を取るための参照極等で構成される。
 　非特許文献１では、マウスの胚性幹細胞（embryonic stem cell：ＥＳ細胞）より作製したＥＳ細胞塊である胚様体（embryoid body：ＥＢ）に対し、ＥＳ細胞の細胞膜に存在する未分化マーカーであるアルカリホスファターゼ（Alkaline Phosphatase:ＡＬＰ）を電気化学測定にて間接的に測定している。
 　機能が限定されていない幹細胞が、機能が限定された体細胞に変化する反応は、一般に分化とよばれており、分化が起こっていないことを示す物質は未分化マーカーと呼ばれている。
 　ＡＬＰは細胞の未分化マーカーであると同時に、アルカリ性条件下でリン酸エステル化合物を加水分解する性質をもつ。ＡＬＰは例えば、リン酸エステル化合物ｐ－アミノフェニルホスフェート（p-aminophenyl phosphate：ＰＡＰＰ）をｐ－アミノフェノール（p-aminophenol：ＰＡＰ）へ変化させる反応の酵素として働く。酵素反応によって生成されたＰＡＰは電気化学的活性のある物質であり、参照極を基準として作用極へ電圧印加することによって、ｐ－キノンイミン(p-quinone imine:ＰＱＩ)へ酸化される。即ち、酵素反応、酸化還元反応の２回の反応によって、ＡＬＰの存在は電気化学測定における電流値として検出される。
 　非特許文献１では、φ４０μｍの作用極を２５０μｍピッチで２０×２０＝４００個、アレイ状に備えた多点電極電流測定装置を用いて測定している。この装置は４００個の電極から得られる電極電流値により数μｍ－数百μｍの生体試料の反応の様子を２次元的かつ経時的にイメージングしている。
Ｍ．Ｓｅｎ，ｅｔ　ａｌ．，"Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ　ａｎｄ　Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ"　２０１３年，４８巻，ｐ．１２－１８
 　上述した非特許文献１における測定は、
 　・ＰＡＰＰを４．７×１０－３ｍｏｌ／Ｌ含有した電解液にマウスＥＢを投入
 　・投入直後から酵素反応が開始し、細胞膜内ＡＬＰによってＰＡＰＰはＰＡＰへ変化
 　・ＰＡＰはＥＢ表面から電極付近まで拡散し、電極表面に到達
 　・拡散が安定するのを待ち、電極に電圧を印加
 　・ＰＡＰはＰＱＩへ変化
 　・電極間電流値を取得
といった過程で行われており、図１はこの過程を横軸を時間として示したものである。
 　図１において、ＥＢを電解液に投入し、酵素反応が始まった瞬間から電圧印加までの時間Ａは、ＥＢ表面からＰＡＰが拡散を開始し、電解液内のＰＡＰ濃度分布が安定する時間を想定して設けられており、電圧印加から電流値を取り込むまでの時間Ｂは、電極でおこる酸化還元反応によって電極付近のＰＡＰ濃度分布の変化が安定する時間を想定して設けられている。
 　ところで、このような過程を経るＥＢのＡＬＰ活性測定では、測定の不確かさが生じうるものとなっている。
 　例えば、複数のＥＢを同時測定する場合において、ピペット等でアレイ状の電極上へＥＢを配置する際、複数回に分けて配置を行った場合にはＥＢがＰＡＰＰに触れるタイミングに違いが生じるため、酵素反応開始から電圧印加までの時間Ａは、各々のＥＢで違い、ＥＢまわりのＰＡＰ濃度分布及び電流値は仮に全てのＥＢが同様の活性（単位時間あたりのＰＡＰ放出速度）を持っていたとしても違う値を示す。即ち、測定電流値には、ＥＢの持つＡＬＰ活性の大きさの違いと、酵素反応開始から電圧印加までの時間Ａの長さによる違いの双方が混在することになる。
 　また、仮に、複数のＥＢを同時にＰＡＰＰ溶液に入れたとしても、ある時に行ったＥＢ群の測定結果と、違う時に行ったＥＢ群の測定結果は、例えばＥＢ投入時の作業者の入れ方に基因する液揺れの違いなどにより、それらＥＢ群間の測定結果の比較が難しいことが考えられる。
 　この発明の目的は、複数回繰り返される測定の各回間及び１回で複数のサンプルを測定する場合の各サンプル間において、測定条件の均一化を図れるようにし、よって正確な測定を可能とし、複数回測定の各回間及び１回の測定の各サンプル間の測定結果の比較を正確に行えるようにした電気化学測定方法、電気化学測定装置及びその電気化学測定に用いるトランスデューサを提供することにある。
 　この発明によれば、測定対象物を含む電解液中に、測定対象物と電子の授受を行って酸化還元反応をさせる作用極と、作用極と外部電源を介してつながった対極とが設けられ、作用極と対極との間に測定用電圧を印加して測定対象物の量に応じて作用極と対極との間に流れる電流を測定する電気化学測定方法において、電解液を収容する電解液槽の底面に作用極を設け、前記底面に、前記底面の一点から上方の電解液槽内の空間に延びて再び前記底面の他点に帰還する形状に延伸された細線よりなる測定対象物消却用細線電極を設け、測定対象物消却用細線電極と対極との間に測定用電圧と同極性の消却用電圧を印加して測定対象物を酸化もしくは還元することで消却する測定対象物消却ステップと、消却用電圧の印加停止後に新しい測定対象物を拡散させる測定対象物拡散ステップと、新しい測定対象物を拡散させた後に作用極と対極との間に測定用電圧を印加して電流を測定する電気化学測定ステップとを実行する。
 　また、この発明によれば、電解液と電解液中で測定対象物を発生させる生体試料とを収容する電解液槽と、電解液槽の底面に設けられ、測定対象物と電子の授受を行って酸化還元反応をさせる作用極と、電解液槽に設けられた対極と、作用極と対極との間に測定用電圧を印加する測定用電圧印加手段と、測定用電圧を印加している時に測定対象物の量に応じて作用極と対極との間に流れる電流を測定する電流測定手段とを備える電気化学測定装置において、前記底面に、前記底面の一点から上方の電解液槽内の空間に延びて再び前記底面の他点に帰還する形状に延伸された細線よりなり、測定対象物と電子の授受を行って酸化還元反応をさせる測定対象物消却用細線電極を設け、作用極と対極との間に測定用電圧を印加していない時に、測定対象物消却用細線電極と対極との間に測定用電圧と同極性の消却用電圧を印加する消却用電圧印加手段を有するものとされる。
 　さらに、この発明によれば、電解液と電解液中に浸漬される生体試料とを収容することができる電解液槽がＬＳＩチップ上に搭載されてなり、生体試料から発生する測定対象物の電気化学測定に用いるトランスデューサは、アレイ状に配列されてＬＳＩチップに設けられている複数の第１の電極が電解液槽の底面に画定されたセンサ領域に位置し、センサ領域上に細線よりなる第２の電極が設けられ、第２の電極はセンサ領域の一点から上方の電解液槽内の空間に延びて再びセンサ領域の他点に帰還する形状に延伸されているものとされる。
 　この発明による電気化学測定方法は、電解液中に生成、拡散した測定対象物を一旦、消却した後に、再度、測定対象物を生成、拡散させて測定を行うものとなっており、またこの発明による電気化学測定装置はこのような測定を行えるものとなっている。よって、この発明による電気化学測定方法、電気化学測定装置によれば、測定対象物の生成、拡散条件の均一化を図ることができ、即ち測定条件の均一化を図ることができ、正確な測定が可能となる。
 　これにより、例えば複数回繰り返される測定の各回間や１回で複数のサンプル（生体試料）を測定する場合の各サンプル間の測定結果の比較を正確に行うことが可能となる。
 　また、この発明によるトランスデューサはこのような電気化学測定に用いて好適なものとなる。
図１は電気化学測定の従来の測定過程の一具体例を示すチャートである。 図２は図１に示した電気化学測定における酵素反応の時間Ａの違いによって生じる電流値の計算結果の違いを示すグラフである。 図３はこの発明における測定対象物消却用細線電極の一例を示す斜視図である。 図４は図３に示した測定対象物消却用細線電極の平面図である。 図５Ａは図４の部分拡大図である。図５Ｂは図５Ａに対応する正面図である。 図６はこの発明における測定対象物消却用細線電極の一例及び測定対象物消却用底面電極を示す斜視図である。 図７はこの発明による電気化学測定の測定過程を従来の測定過程と共に示したチャートである。 図８は図３に示した測定対象物消却用細線電極による測定対象物消却ステップを実行した場合の電流値の計算結果を示すグラフである。 図９は図６に示した測定対象物消却用細線電極及び測定対象物消却用底面電極による測定対象物消却ステップを実行した場合の電流値の計算結果を示すグラフである。 図１０は対流がある場合の測定対象物消却ステップの実行有無による電流値の計算結果の違いを示すグラフである。 図１１はこの発明における測定対象物消却用細線電極の他の例を示す斜視図である。 図１２は測定対象物消却用細線電極の連続形成例を説明するための図である。 図１３はこの発明による電気化学測定装置の一実施例の構成を説明するための図である。 図１４Ａはこの発明によるトランスデューサの一実施例を示す平面図である。図１４Ｂは図１４Ａに示したトランスデューサの断面図である。 図１５は図１４Ａに示したトランスデューサの斜視図である。
 　最初に、マウスＥＢのＡＬＰ活性測定を例として、有限要素法による数値解析を行った結果について説明する。数値解析ソフトとして、ＣＯＭＳＯＬ　Ｍｕｌｔｉｐｈｙｓｉｃｓ　Ｖｅｒ４．４を用いた。以下に、解析モデル形状、境界条件を示す。
 ＜解析モデル形状＞
 　２．３ｍｍ×２．３ｍｍ×１．３ｍｍの解析空間を用意し、φ４０μｍの電極（作用極）を解析空間底面にアレイ状に設置した。
 　２．３ｍｍ×２．３ｍｍの解析空間底面の中心に原点を置き、電極アレイ全体の中心と解析空間底面の中心を合わせて電極を２５０μｍピッチで８×８＝６４個設置し、そのうち中心付近の４行目５列目の電極上へ中心を合わせてφ３００μｍのＥＢを模した球体を配置した。球体と直下の電極の間隔は解析メッシュの切りやすさを考慮し、３μｍの距離をとった。
 ＜境界条件＞
 　解析空間内は濃度４．７×１０－３ｍｏｌ／Ｌの基質ＰＡＰＰを設定して空間内濃度初期値とし、解析空間４辺の壁と天井は、解析空間外が濃度４．７×１０－３ｍｏｌ／Ｌの解放境界として設定した。ＥＢ表面（球体表面）は下記に示すミカエリス・メンテンの式（１）に従って、表面付近のＰＡＰＰの濃度に依存してＰＡＰが放出される境界とし、酵素反応のモデルとした。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000001
 　　ｖ：ＰＡＰ放出速度［ｍｏｌ／ｓ］
 　　［Ｓ］：基質ＰＡＰＰ濃度（４．７×１０－３ｍｏｌ／Ｌ）
 　　Ｖｍａｘ：ＰＡＰＰ濃度最大時反応速度（３．３３×１０－１２ｍｏｌ／ｓ）
 　　Ｋｍ：ミカエリス・メンテン定数（１．７×１０－３ｍｏｌ／Ｌ）
 　ＰＡＰの酸化還元反応を表現する為、電極上では電圧印加時にＰＡＰ濃度をゼロとして設定し、ＰＡＰ濃度勾配より電流値を計算した。電流値は電極に垂直な方向の濃度勾配に比例し、式（２）に従う。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000002
 　　ｉ：電極上の任意の点（ｘ，ｙ，ｚ）における電流密度［Ａ／ｍ２］
 　　Ｃ：任意の点（ｘ，ｙ，ｚ）におけるＰＡＰ濃度［ｍｏｌ］
 　　ｚ：電極に垂直な成分
 　　ｘ，ｙ：電極に水平な成分
 　　Ｆ：ファラデー定数（９６４８５Ｃ／ｍｏｌ）
 　　Ｄ：酸化還元種ＰＡＰ拡散係数（６．４７×１０－１０ｍ２／ｓ）
 　　ｎ：反応電子数（ｎ＝２）
 　なお、ＰＡＰ濃度分布の影響を視覚的に分かりやすく評価するため、６４個の電極の内、ＥＢが載っている電極と同じ列の７個（Ｙ軸に沿う７個）の電極の電流値を評価に使用した。
 　最初に、図１に示した過程に従うものとし、酵素反応開始から電圧印加までの時間Ａが３秒、電圧印加から電流値を取り込むまでの時間Ｂが０．１秒の場合の電流値と、時間Ａが２０秒、時間Ｂが０．１秒の場合の電流値を計算した。結果を図２に示す。図２に示すように酵素反応開始から電圧印加までの時間Ａの違いが電流値に違いとなって現れた。なお、図２はＥＢ直下の電極位置をｙ＝０μｍとし、ＥＢ直下の電極と両側３個ずつの電極からの電流値をプロットしている（後述する図８－１０のグラフも同様）。
 　この発明は、電解液中に測定対象物消却用電極を設け、測定対象物消却用電極と対極との間に測定用電圧と同極性の消却用電圧を印加して測定対象物を酸化もしくは還元することで消却する測定対象物消却ステップと、消却用電圧の印加停止後に新しい測定対象物を拡散させる測定対象物拡散ステップと、新しい測定対象物を拡散させた後に作用極と対極との間に測定用電圧を印加して電流を測定する電気化学測定ステップとを実行するものであり、以下、数値解析に用いた測定対象物消却用電極の２つの構成（構成１，２）について説明する。
・構成１：作用極と同極性の測定対象物消却用細線電極を作用極が設置されている底面（解析空間底面）上に設ける。図３，４，５Ａ及び５Ｂはこの測定対象物消却用細線電極の配置、構成を示したものであり、図３，４，５Ａ及び５Ｂ中、１１はφ４０μｍの作用極を示し、２１は測定対象物消却用細線電極を示す。また、３１はφ３００μｍのＥＢを示す。ＥＢ３１は作用極１１の直上に位置している。
 　測定対象物消却用細線電極２１は底面１０の一点から上方（Ｚ方向）の空間に延びて再び底面１０の他点に帰還する形状に延伸された太さ３３μｍの細線（ワイヤ）よりなり、逆Ｕ字形状をなすものとした。逆Ｕ字の両脚部の間隔は１２０μｍとし、底面１０からの逆Ｕ字の中央部の細線中心の高さは３００μｍとした。
 　測定対象物消却用細線電極２１は図４に示したように、作用極１１の１行置きの配列（１，３，５，７行）において隣接する作用極１１間にそれぞれ位置するように配置し、さらに作用極１１の１列置きの配列（２，４，６，８列）において隣接する作用極１１間にそれぞれ位置するように配置した。これにより、計５６本の測定対象物消却用細線電極２１を底面１０上に設けた。
 　なお、このような測定対象物消却用細線電極２１は例えばワイヤボンディングによって形成することができる。図３，４，５Ａ及び５Ｂには測定対象物消却用細線電極２１を実際に設置する際に必要なボンディング用のパッド２２も併せて示している。
・構成２：図６に示したように、構成１の５６本の測定対象物消却用細線電極２１に加え、作用極１１と同極性の測定対象物消却用底面電極２３を底面１０に配置。測定対象物消却用底面電極２３はφ４０μｍの作用極１１のまわりに同心の環状に２０μｍの隙間をあけて底面１０に全面配置した。
 　なお、この構成では図３に示していたパッド２２は不要となり、逆Ｕ字形状をなす測定対象物消却用細線電極２１はその両端を測定対象物消却用底面電極２３に接合（ボンディング）することで設置することができる。
 　上記したように、測定対象物消却用電極は構成１では測定対象物消却用細線電極２１よりなるものとし、構成２では測定対象物消却用細線電極２１と測定対象物消却用底面電極２３の両者よりなるものとした。
 　測定対象物消却用電極は、作用極と同じく、電圧印加時にＰＡＰ濃度がゼロとなるように解析境界条件を設定することで測定対象物消却用電極への電圧印加を再現した。
 　図７のＰ１は上述の図２に示した計算結果の過程を示したものであり、図７のＰ２は測定対象物消却用電極による測定対象物消却ステップを含む過程、即ちこの発明による電気化学測定方法の過程を示したものである。
 　酵素反応開始から３秒後と２０秒後の状態に対し、作用極と測定対象物消却用電極に測定用電圧と同極性の消却用電圧を印加して１０秒の測定対象物消却ステップ（ＰＡＰ濃度分布消却ステップ）を実行した後に、消却用電圧の印加を停止し、再度、酵素反応を３秒起こさせて新しい測定対象物を拡散させる測定対象物拡散ステップを経た後に、作用極に測定用電圧を印加し、電気化学測定ステップを実行するものとし、０．１秒後の電流値を計算した。
 　図８及び９は測定対象物消却用電極が構成１及び構成２の場合の電流値の計算結果をそれぞれ示したものである。
 　測定対象物消却ステップ後の反応（測定対象物の生成、拡散・・・測定対象物拡散ステップ）は、測定対象物消却ステップ前の時間が３秒であるか、２０秒であるかに関わらず、一定であるので、測定対象物消却ステップ前の時間が３秒、２０秒の双方の結果が一致することが望ましい。構成１，２各々の結果は、図２に示した結果よりも十分に３秒と２０秒の結果が近いものとなっている。
 　次に、例えば電解液に対流が存在する場合、電解液の流れはＥＢの形成するＰＡＰ濃度分布を乱してしまい、測定に影響を与えることが考えられる。この点に関し、電解液に対流がある場合のこの発明による電気化学測定方法の効果について計算した結果について説明する。なお、測定対象物消却用電極の構成は構成２とした。
 　計算は下記３つのケース（ケース１－３）について行った。
・ケース１：酵素反応開始から電圧印加までの時間が１０秒、電圧印加後０．１秒後の電流値
・ケース２：酵素反応開始時に作用極の並びに対して平行な方向（Ｙ方向）に対流が５０μｍ／ｓ存在する場合において、酵素反応開始から電圧印加までの時間が１０秒、電圧印加後０．１秒後の電流値
・ケース３：酵素反応開始時に作用極の並びに対して平行な方向（Ｙ方向）に対流が５０μｍ／ｓ存在する場合で、１０秒の対流の後、作用極及び作用極と同極性の測定対象物消却用電極を用いて１０秒の測定対象物消却ステップを実行し、その後、消却用電圧の印加を停止して、再度、酵素反応をおこさせ、１０秒の測定対象物拡散ステップを経た後に作用極に電圧を印加、電圧印加後０．１秒の電流値
 　図１０はこれらケース１－３の電流値の計算結果を示したものであり、測定対象物消却ステップがなければ、対流によってケース２のように結果が歪み、本来の位置（ＥＢが存在する位置）からずれた位置に電流値のピークが生じるのに対し、測定対象物消却ステップを実行したケース３ではケース１の本来得られるはずの電流値に近い電流値が得られることがわかり、対流や液揺れの影響を除去することが可能であることがわかる。
 　以上数値解析を行った結果について説明したが、測定対象物を含む電解液中に、測定対象物と電子の授受を行って酸化還元反応をさせる作用極と、作用極と外部電源を介してつながった対極とを設け、作用極と対極との間に測定用電圧を印加して測定対象物の量に応じて作用極と対極との間に流れる電流を測定する電気化学測定において、上述したように測定対象物消却ステップを実行すれば、電解液中の少なくとも測定に影響を与える範囲内に存在していた測定対象物はすべて酸化又は還元されることで消却され、その生成及び拡散の過程は初期化されて電解液中の状態がリセットされることになる。よって、後続する測定対象物拡散ステップの時間を一定に制御することで、複数回繰り返される測定の各回間及び１回で複数のサンプルを測定する場合の各サンプル間において、測定対象物の生成、拡散の条件を均一化することができ、つまり測定条件の均一化を図ることが可能となる。
 　また、このように測定対象物消却ステップを実行することにより、電解液の液揺れや対流等の影響を排除することができ、さらには測定対象物を発生させるサンプル（生体試料）を電解液に投入した後、測定者の望むタイミングで測定を行うことが可能である。
 　なお、上記においては測定対象物消却用電極及び作用極の双方に消却用電圧を印加して測定対象物消却ステップを実行するものとしているが、例えば消却用電圧を測定対象物消却用電極だけに印加して測定対象物消却ステップを実行するものとしてもよい。
 　上述した例では測定対象物焼却用細線電極２１は逆Ｕ字形状をなし、個々に独立した逆Ｕ字形状をなす測定対象物消却用細線電極２１を多数配置する構成としているが、測定対象物消却用細線電極は図１１に示したような形状、構成としてもよい。
 　図１１では測定対象物消却用細線電極２５はＵ字と逆Ｕ字の繰り返しによる波形形状を有するものとされ、即ち図３及び６に示した測定対象物消却用細線電極２１の配列において互いに隣接するものが細線によって（細線が延長されて）相互に連続された構成となっている。
 　測定対象物消却用細線電極２５は作用極１１の配列に対し、前述した測定対象物消却用細線電極２１の配置と同じ行、列に配置されており、即ちＸ方向に延伸する４本の測定対象物消却用細線電極２５とＹ方向に延伸する４本の測定対象物消却用細線電極２５が互いに交差するように配置されている。
 　底面１０には測定対象物消却用底面電極２３が配置されており、測定対象物消却用細線電極２５はＵ字の中央部分が隣接する作用極１１間に位置し、逆Ｕ字の中央部分が作用極１１の上方に位置するように設けられ、測定対象物消却用底面電極２３に接するＵ字の中央部分がそれぞれ測定対象物消却用底面電極２３に接合（ボンディング）される。
 　なお、測定対象物消却用細線電極２５の波形の繰り返しピッチはこの例に限らず、例えば拡大してもよく、それに応じて隣接する逆Ｕ字形状をつなぐ部分を１点ではなく、２点でボンディングしてもよい。また、図１１では底面１０と離間した上方（測定対象物消却用底面電極２３と離間した上方）で、互いに直交する測定対象物消却用細線電極２５は交差しているが、底面１０上で交差させるようにしてもよい。
 　一方、このように波形形状をなす測定対象物消却用細線電極の直交２方向の形成において、交差を生じないように形成することもできる。図１２はその形成例を模式的に示したものであり、図１２では４行、４列の格子をなすように波形形状をなす測定対象物消却用細線電極を形成する場合を示している。
 　図１２中、×印はワイヤボンディング箇所を示し、矢印はワイヤの延伸方向（＝ボンディングの順序）を示す。この例では、
　・ａ１からａ２まで実線ａで示した経路でワイヤを延伸し、ボンディング
　・ｂ１からｂ２まで破線ｂで示した経路でワイヤを延伸し、ボンディング
　・ｃ１からｃ２まで破線ｃで示した経路でワイヤを延伸し、ボンディング
　・ｄ１からｄ２まで実線ｄで示した経路でワイヤを延伸し、ボンディング
するものとなっており、このようにワイヤを延伸すれば、波形形状をなす測定対象物消却用細線電極の交差が生じないようにすることができる。
 　次に、この発明による電気化学測定装置の構成について説明する。
 　図１３は電気化学測定装置の構成を模式的に示したものである。電気化学測定装置は電解液４１と電解液４１中で測定対象物を発生させる生体試料３０とを収容する電解液槽４０を備え、電解液槽４０には作用極１１と測定対象物消却用細線電極２１と対極５０と参照極６０とが設けられた構成となっている。作用極１１及び測定対象物消却用細線電極２１は図１３では簡略化して示しているが、前述したように作用極１１は所定のピッチでアレイ状に多数配列された構成とされ、測定対象物消却用細線電極２１は図３に示した構成を有するものとされる。なお、測定対象物消却用底面電極２３を合わせ持つ構成としてもよく、また測定対象物消却用細線電極２１を図１１に示した測定対象物消却用細線電極２５としてもよい。図１３中、９０は塩橋を示す。
 　作用極１１、測定対象物消却用細線電極２１、対極５０及び参照極６０はこの例では図１３に示したようにポテンショスタット７０に接続されている。ポテンショスタット７０は可変電源７１と電圧計７２と電流計７３とを含んで構成されており、このポテンショスタット７０により作用極１１と対極５０との間への測定用電圧の印加及び測定用電圧を印加している時に測定対象物の量に応じて作用極１１と対極５０との間に流れる電極間電流の測定が行われる。
 　また、作用極１１と対極５０との間に測定用電圧を印加していない時に、測定対象物消却用細線電極２１と対極５０との間への測定用電圧と同極性の消却用電圧の印加もポテンショスタット７０により行われる。作用極１１への測定用電圧の印加はスイッチ８１をＯＮ，スイッチ８２，８３をＯＦＦにすることに行われ、測定対象物消却用細線電極２１への消却用電圧の印加はスイッチ８２，８３をＯＮ，スイッチ８１をＯＦＦにすることにより行われる。なお、スイッチ８１をＯＮとして作用極１１にも消却用電圧を印加するようにしてもよい。
 　図１３では測定対象物消却用細線電極２１はポテンショスタット７０から消却用電圧が印加されるものとなっているが、これに限らず、消却用電圧の印加はポテンショスタット７０とは別の電源を用いて行うようにしてもよい。
 　次に、生体試料から発生する測定対象物の電気化学測定に用いるこの発明によるトランスデューサの構成について図１４Ａ，１４Ｂ及び１５を参照して説明する。
 　このトランスデューサはバイオＬＳＩチップと称されるもので、電解液４１と電解液４１中に浸漬される生体試料とを収容することができる電解液槽４０がＬＳＩチップ１００上に搭載された構成となっている。電解液槽４０の中央には穴４２が形成されており、ＬＳＩチップ１００はこの穴４２の下端に穴４２を塞ぐように配置されている。
 　ＬＳＩチップ１００及び電解液槽４０は基板１１０上に搭載固定されており、基板１１０にはトランスデューサの制御を行う外部装置との接続用の多数の配線パターン１１１が形成されている。図１４Ｂ中、１２０はＬＳＩチップ１００と配線パターン１１１とを接続するボンディングワイヤを示す。
 　ＬＳＩチップ１００の上面にはセンサ領域１０１が構成されている。図１４Ａではセンサ領域１０１をハッチングを付して示しており、電解液槽４０の底面の穴４２の位置にセンサ領域１０１は画定されている。詳細図示を省略しているが、この例ではセンサ領域１０１にφ４０μｍの作用極（第１の電極）が２５０μｍピッチで２０×２０＝４００個、アレイ状に配列されて形成されている。また、センサ領域１０１上にはセンサ領域１０１の一点から上方の電解液槽４０内の空間に延びて再びセンサ領域１０１の他点に帰還する形状に延伸された細線よりなる測定対象物消却用細線電極（第２の電極）が形成されている。測定対象物消却用細線電極は例えば前述の図３に示した測定対象物消却用細線電極２１の構成を有するものとされる。
 　さらに、測定対象物消却用細線電極（第２の電極）に加え、測定対象物消却用底面電極（第３の電極）が作用極（第１の電極）のまわりに位置するようにセンサ領域１０１に全面形成されている構成としてもよく、この場合は前述の図６に示した測定対象物消却用細線電極２１及び測定対象物消却用底面電極２３の構成を有するものとなり、また前述の図１１に示した測定対象物消却用細線電極２５及び測定対象物消却用底面電極２３の構成を有するものとしてもよい。
 　ＬＳＩチップ１００は各作用極及び測定対象物消却用電極への電圧印加機能、各作用極での反応を電流値として検出し、増幅する機能、さらにはスイッチング機能を備えている。
 　ＬＳＩチップが備える電極パッドは一般にＣｕを含むＡｌ合金によって形成されているが、この例ではセンサ領域１０１に位置する作用極、測定対象物消却用底面電極さらには測定対象物消却用底面電極がない場合に測定対象物消却用細線電極をボンディングするためのパッドは、いずれもＡｌ合金の上に、Ｔｉ／Ｐｔ、Ｔｉ／Ｐｔ／Ａｕ、Ｃｒ／Ａｕの何れかのメッキを施して形成される。また、測定対象物消却用細線電極を構成する細線にはＡｕ線を用いるのが好ましい。
 　なお、対極及び参照極はトランスデューサとは別部品とされ、測定時（使用時）に電解液４１中に投入される。

Claims (10)

  1.  　測定対象物を含む電解液中に、前記測定対象物と電子の授受を行って酸化還元反応をさせる作用極と、前記作用極と外部電源を介してつながった対極とが設けられ、前記作用極と前記対極との間に測定用電圧を印加して前記測定対象物の量に応じて前記作用極と前記対極との間に流れる電流を測定する電気化学測定方法であって、
     　前記電解液を収容する電解液槽の底面に前記作用極を設け、
     　前記底面に、前記底面の一点から上方の前記電解液槽内の空間に延びて再び前記底面の他点に帰還する形状に延伸された細線よりなる測定対象物消却用細線電極を設け、
     　前記測定対象物消却用細線電極と前記対極との間に前記測定用電圧と同極性の消却用電圧を印加して前記測定対象物を酸化もしくは還元することで消却する測定対象物消却ステップと、
     　前記消却用電圧の印加停止後に新しい測定対象物を拡散させる測定対象物拡散ステップと、
     　前記新しい測定対象物を拡散させた後に前記作用極と前記対極との間に前記測定用電圧を印加して前記電流を測定する電気化学測定ステップとを実行する。
  2.  　請求項１の電気化学測定方法において、
     　前記測定対象物消却ステップでは前記作用極にも前記消却用電圧を印加する。
  3.  　請求項１又は２の電気化学測定方法において、
     　前記底面における前記作用極のまわりに前記測定対象物消却用細線電極と共に前記消却用電圧が印加される測定対象物消却用底面電極が全面配置され、
     　前記測定対象物消却用細線電極は前記一点及び前記他点において前記測定対象物消却用底面電極に接合されている。
  4.  　請求項３の電気化学測定方法において、
     　前記測定対象物消却用細線電極は複数設けられており、そのうちの少なくとも２つの互いに隣接する前記測定対象物消却用細線電極は前記測定対象物消却用底面電極の上で細線によって相互に連続している。
  5.  　電解液と前記電解液中で測定対象物を発生させる生体試料とを収容する電解液槽と、前記電解液槽の底面に設けられ、前記測定対象物と電子の授受を行って酸化還元反応をさせる作用極と、前記電解液槽に設けられた対極と、前記作用極と前記対極との間に測定用電圧を印加する測定用電圧印加手段と、前記測定用電圧を印加している時に前記測定対象物の量に応じて前記作用極と前記対極との間に流れる電流を測定する電流測定手段とを備える電気化学測定装置であり、
     　前記底面に、前記底面の一点から上方の前記電解液槽内の空間に延びて再び前記底面の他点に帰還する形状に延伸された細線よりなり、前記測定対象物と電子の授受を行って酸化還元反応をさせる測定対象物消却用細線電極が設けられ、
     　前記作用極と前記対極との間に前記測定用電圧を印加していない時に、前記測定対象物消却用細線電極と前記対極との間に前記測定用電圧と同極性の消却用電圧を印加する消却用電圧印加手段を有する。
  6.  　請求項５の電気化学測定装置において、
     　前記底面における前記作用極のまわりに前記測定対象物消却用細線電極と共に前記消却用電圧が印加される測定対象物消却用底面電極が全面配置され、
     　前記測定対象物消却用細線電極は前記一点及び前記他点において前記測定対象物消却用底面電極に接合されている。
  7.  　請求項６の電気化学測定装置において、
     　前記測定対象物消却用細線電極は複数設けられており、そのうちの少なくとも２つの互いに隣接する前記測定対象物消却用細線電極は前記測定対象物消却用底面電極の上で細線によって相互に連続している。
  8.  　電解液と前記電解液中に浸漬される生体試料とを収容することができる電解液槽がＬＳＩチップ上に搭載されてなり、前記生体試料から発生する測定対象物の電気化学測定に用いるトランスデューサであり、
     　アレイ状に配列されて前記ＬＳＩチップに設けられている複数の第１の電極が前記電解液槽の底面に画定されたセンサ領域に位置し、
     　前記センサ領域上に細線よりなる第２の電極が設けられ、
     　前記第２の電極は前記センサ領域の一点から上方の前記電解液槽内の空間に延びて再び前記センサ領域の他点に帰還する形状に延伸されている。
  9.  　請求項８のトランスデューサにおいて、
     　前記複数の第１の電極のそれぞれのまわりに位置するように第３の電極が前記ＬＳＩチップに形成され、
     　前記第３の電極は前記第１の電極と導通することなく、前記センサ領域に全面配置され、
     　前記第２の電極は前記一点及び前記他点において前記第３の電極に接合されている。
  10.  　請求項９のトランスデューサにおいて、
     　前記第２の電極は複数設けられており、そのうちの少なくとも２つの互いに隣接する前記第２の電極は前記第３の電極の上で細線によって相互に連続している。
     
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Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP6116075B1 (ja) * 2015-11-20 2017-04-19 日本航空電子工業株式会社 電気化学測定方法、電気化学測定装置及びトランスデューサ
JP6218199B1 (ja) 2016-10-06 2017-10-25 日本航空電子工業株式会社 電気化学測定装置及びトランスデューサ
JP7219919B2 (ja) 2019-05-20 2023-02-09 日本航空電子工業株式会社 触媒反応生成物の電気化学的測定方法及びトランスデューサ
JP7201178B2 (ja) 2019-06-13 2023-01-10 日本航空電子工業株式会社 触媒反応生成物の電気化学的測定方法、電気化学測定装置及びトランスデューサ
TWI768561B (zh) * 2020-11-25 2022-06-21 五鼎生物技術股份有限公司 生化試片
CN113624933A (zh) * 2021-08-13 2021-11-09 辽宁科技学院 一种分布式氮磷监测系统及其使用方法

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2005148058A (ja) * 2003-10-20 2005-06-09 Arkray Inc 血液試料における特定成分の濃度測定方法および濃度測定装置
JP2010014558A (ja) * 2008-07-03 2010-01-21 Tohoku Univ 電気化学測定装置
JP2010227089A (ja) * 2009-03-27 2010-10-14 Industry-Univ Cooperation Foundation Sogang Univ 電気検出に基づいた幹細胞分化測定用センサー
JP2013092437A (ja) * 2011-10-25 2013-05-16 Tohoku Univ 複数の電極を備えたｉｃチップ
WO2014073195A1 (ja) * 2012-11-06 2014-05-15 パナソニック株式会社 生体由来物の検査デバイス
WO2015151395A1 (ja) * 2014-03-31 2015-10-08 パナソニックＩｐマネジメント株式会社 電気化学測定デバイス

Family Cites Families (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
USRE37977E1 (en) * 1997-12-25 2003-02-04 Matsushita Electric Industrial Co., Ltd. Cell potential measuring electrode and measuring apparatus using the same
WO2001038873A2 (en) * 1999-11-24 2001-05-31 Biotronic Technologies, Inc. Devices and methods for detecting analytes using electrosensor having capture reagent
WO2001043870A2 (en) * 1999-12-15 2001-06-21 Motorola Inc. Column and row addressable high density biochip array
WO2001075149A2 (de) * 2000-03-30 2001-10-11 Infineon Technologies Ag Biosensor, biosensor-array und verfahren zum ermitteln makromolekularer biopolymere mit einem biosensor
US20040110277A1 (en) * 2002-04-12 2004-06-10 Seiko Epson Corporation Sensor cell, bio-sensor, capacitance element manufacturing method, biological reaction detection method and genetic analytical method
CA2493101C (en) * 2002-07-20 2012-05-08 Acea Biosciences, Inc. Impedance based apparatuses and methods for analyzing cells and particles
US7112433B2 (en) * 2003-04-24 2006-09-26 Hewlett-Packard Development Company, L.P. Electrical analysis of biological membranes
WO2008004476A1 (en) * 2006-07-06 2008-01-10 Panasonic Corporation Device for cellular electrophysiology sensor, cellular electrophysiology sensor using the device, and method for manufacturing the cellular electrophysiology sensor device
WO2011142117A1 (ja) * 2010-05-11 2011-11-17 パナソニック株式会社 細胞培養基材及びそれを用いた細胞培養方法
CN102226779B (zh) * 2011-03-28 2013-10-02 中国人民解放军第三军医大学第三附属医院 一种电化学免疫检测方法
JPWO2013073074A1 (ja) * 2011-11-18 2015-04-02 株式会社村田製作所 物質の測定方法
EP2840389B1 (en) * 2012-04-19 2017-08-16 Panasonic Healthcare Holdings Co., Ltd. Biological information measurement device, and biological information measurement method using same
JP6116075B1 (ja) * 2015-11-20 2017-04-19 日本航空電子工業株式会社 電気化学測定方法、電気化学測定装置及びトランスデューサ
JP6086412B1 (ja) 2015-12-22 2017-03-01 日本航空電子工業株式会社 電気化学測定方法、電気化学測定装置及びトランスデューサ
JP6344775B2 (ja) 2016-05-20 2018-06-20 国立大学法人東北大学 電気化学イメージング方法、電気化学測定装置及びトランスデューサ

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2005148058A (ja) * 2003-10-20 2005-06-09 Arkray Inc 血液試料における特定成分の濃度測定方法および濃度測定装置
JP2010014558A (ja) * 2008-07-03 2010-01-21 Tohoku Univ 電気化学測定装置
JP2010227089A (ja) * 2009-03-27 2010-10-14 Industry-Univ Cooperation Foundation Sogang Univ 電気検出に基づいた幹細胞分化測定用センサー
JP2013092437A (ja) * 2011-10-25 2013-05-16 Tohoku Univ 複数の電極を備えたｉｃチップ
WO2014073195A1 (ja) * 2012-11-06 2014-05-15 パナソニック株式会社 生体由来物の検査デバイス
WO2015151395A1 (ja) * 2014-03-31 2015-10-08 パナソニックＩｐマネジメント株式会社 電気化学測定デバイス

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
KOSUKE INO ET AL.: "Electrochemical Device with Interdigitated Ring Array Electrodes for Investigating the Relationship between Cardiomyocyte Differentiation from Embryonic Stem Cells and Alkaline Phosphatase Activity", ELECTROCHEMISTRY, vol. 81, no. 9, September 2013 (2013-09-01), pages 682 - 687, XP055397248 *
MUSTAFA SEN ET AL.: "LSI-based amperometric sensor for real-time monitoring of embryoid bodies", BIOSENSORS AND BIOELECTRONICS, vol. 48, 15 October 2013 (2013-10-15), pages 12 - 18, XP055397247 *
See also references of EP3435076A4 *
YUSUKE KANNO ET AL.: "Simulation Analysis of Positional Relationship between Embryoid Bodies and Sensors on an LSI-based Amperometric Device for Electrochemical Imaging of Alkaline Phosphatase Activity", ANALYTICAL SCIENCES, vol. 31, no. 7, 10 July 2015 (2015-07-10), pages 715 - 719, XP055397245 *

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